KR100283503B1 - 면역억제제의 제조방법 및 이에 사용되는 신규 미생물 - Google Patents

면역억제제의 제조방법 및 이에 사용되는 신규 미생물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 탄소원, 질소원 및 미네랄염을 함유하는 영양배지 중에서 신규한 톨리포클라디움 (Tolypocladium) 종의 균주를 배양함으로써 사이클로스포린류, 특히 사이클로스포린 A를 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

면역억제제의 제조방법 및 이에 사용되는 신규 미생물
본 발명은 신규한 미생물인 톨리포클라디움 (Tolypocladium) 및 이 미생물 종의 균주를 호기적으로 발효시킴으로써 사이클로스포린류, 특히 사이클로스포린 A를 제조하는 방법에 관한 것이다.
사이클로스포린류는 중성의, 친유성(親油性)이 매우 높은 고리형 운데카펩티드로서 다양한 아미노산 조성을 갖는다. 현재, 25가지 서로 다른 형태의 사이클로스포린 (A-Z)이 알려져있다. 그 중에서도 A-형은 임상적으로 가장 가치있는 것으로 입증되었다 (Rehacek 및 Deziu, Process Biochem. 1991, 26, 157-166).
본래, 사이클로스포린은 1970년대,미국과 노르웨이의 토양시료로부터 분리된 곰팡이 균주인 실린드로카르폰 루시둠 부쓰 (Cylindrocarpon lucidum Booth) 및 톨리포클라디움 인플라룸 갬스 (Tolypocladium inflatum Gams)로부터 분리되었다. Tolypocladium inflatum (NRRL 8044, ATCC 34921)은 처음 트리코더마 폴리스포룸 (Trichoderma polysporum) (Link ex Pers) Rifai 균주인 것으로 동정되었다. 상기 균주와 그에 의해 생상되는 항생물질들은 예컨데, 핀란드 특허 54606호에 개시되어 있다. 이 균주의 생장 조건과 분류학 역시 Dreyfuss 외, Eur. J. Appl. Microbiol., 1987, 3, 125에 보고되어 있다.
상기 균주 실린드로카르폰 루시둠 Booth (Cylindrocarpon lucidum Booth) (NRRL 5760)는 핀란드 특허 52851호에 개시되어 있다. 여러 문헌들에서 발견되는 사이클로스포린 생산 미생물 균주로는 예컨대, DD 특허 298276호에 개시된, 적어도 사이클로스포린 A를 생산하는 톨리포클라디움 인플라툼 SF 136(Tolypocladium inflatum SF136)과, 영국특허출원 제 2 227 489호에 개시된, a.o. 사이클로스포린 A, B 및 C의 혼합물을 생산하는 톨리포클라디움 바리움 (Tolypocladium varium)을 들 수 있다. 일본특허출원 제 826,3093 A2에는, 사이클로스포린을 생산한다고 언급되어 있는 푸사리움 (Fusarium)의 두가지 균주가 개시되어 있다.
Isaac 등은 (Antimicr. Agents Chemoter., 1990, 34, 121-127) 톨리포클라디움의 몇가지 공지 균주의 사이클로스포린 생산성을 비교하였다.
사이클로스포린 A는 본래 항진균 항생제 화합물로서 발견된 것이었다. 이것의 면역억제제로서의 탁월한 효과는 그 후에 와서야 발견되었다 (Borel 외, Immunology, 1977, 32, 1017). 사이클로스포린은 현재 이식 수술의 수술후 처리에서 사용되고 있고, 이 목적을 위한 거의 유일한 약품인 실정이다. 이것은 처음 신장 (Calne, Lance, 1978, 2, 1323) 및 골수 (Powles, Lance, 1978, 2, 1327) 이식수술과 관련하여 보고된 것이다. 이식 수술에 더하여, 사이클로스포린은 예컨대 류머티즘 및 건선과 같은 여러가지 자기면역 질환의 치료에 사용될 수 있다.
문헌에 개시된 미생물 균주에 의한 사이클로스포린 A의 제조방법은 몇몇 경우, 수율이 낮고 발효기간이 길다는 등의 문제점을 안고 있다. 고수율로 얻어진다 하더라도, 사이클로스포린 A의 상대량은 종종 적기 일쑤였다. 또한 수율이 낮은 균주들은 사이클로스포린 A를 비교적 다량 생산하는 것으로 알려졌다. (De-xiu 외, Folia Microbiol., 1991, 35(6) 549-556).
본 발명자들은 짧은 발효기간 동안 경제적인 조건 하에서 최대의 수율을 내는 생산균주를 발견하고자 하였다.
가능한 생산균주들을 스크리닝 하는 동안, 매우 많은 양의 사이클로스포린 A와 비교적 소량의 다른 형태의 사이클로스포린을 매우 빠른 속도로 생산함으로써 사이클로스포린 A를 보다 쉽게 정제하는 것을 가능하게 하는 균주인 톨리포클라디움 (Tolypocladium)을 발견하게 되었다. 이 균주는 러시아의 모스크바 근처에서 채취된 토양 시료로부터 분리되었다.
발견된 이 균주를 네덜란드의 Dr. W. Gams (Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, Holland)가 실험하자, 이 미생물은 신규 종인 톨리포클라디움 (Tolypocladium)으로 표시될 수 있는 것임이 판명되었다. 이 균주에는 톨리포클라디움 sp.LeA3 (Tolypocladium sp. LeA3)이라는 코드가 부여되었으며, 부다페스트 조약에 따라 1992년 12월 7일자로 네덜란드에 소재하는 Centraalbureau voor Schimmelcultures에 기탁하여 기탁번호 CBS 630.92를 부여받았다.
따라서, 본 발명은 급속하게 고수율로 생성물을 생산하는 신규한 종인 톨리포클라디움 (Tolypocladium), 및 임상적으로 중요한 사이클로스포린 A의 생산에 있어서의 그의 용도에 관한 것이다.
톨리포클라디움 (Tolypocladium)속은 처음 1971년 W. Gams에 의해 개시되었다 (W. Gams, Persoonia, 1971, vol. 6, part 2, 185-191). 세가지 종의 톨리포클라디움 (Tolypocladium), 즉, T. inflatum, T. geodes 및 T. cylindrosporum이 문헌상으로 연구되고 있다. 일반적으로, 톨리포클라디움 (Tolypocladium) 종은 생장이 느리고, 백색의 솜털같은 집락을 형성하며, 대량의 포자를 형성한다.
본 발명에 따른 톨리포클라디움 sp. LeA3 (Tolypocladium sp. LeA3)을 상기 종들과 비교한 결과, 상기 종들과 달리, 포자 형성능이 더 약하고, 팽창된 세포 사슬을 가지며, 회갈색 안료를 형성하는 경향이 있는 더 어두운 집락을 형성하는 것에 의해 상기 종들과 명확히 다른 것이 분명하다.
본 발명에 따른 균주 톨리포클라디움 sp. LeA3 (Tolypocladium sp. LeA3)은 다음과 같이 설명될 수 있다:말트 추출물/효모 추출물 플레이트상의 7일된 집락은 직경이 약 10 mm이며 포자를 거의 함유하지 않는 회색 균사체로 덮여있다. 이 균주에 있어서는 불규칙한 분생자와 팽창된 세포 사슬이 전형적으로 발견된다. 톨리포클라디움 인플라툼 (Tolypocladium influtum)과 달리 본 발명에 따른 균주는 라피노스는 이용하지 않지만 갈락토스는 이용할 수 있다. 톨리포클라디움 인플라툼 (Tolypocladium influtum) 및 실린드로카르폰 루시둠 (Cylindrocarpon lucidum)과 본 발명에 따른 균주 톨리포클라디움 sp. LeA3 (Tolypocladium sp. LeA3)와의 생장 특성을 비교하여 표 1에 그 결과를 나타내었다.
사용된 약어:
2KG = 2-케토-D-글루코네이트, MDG = α-메틸-D-글루코시드,
NAG = N-아세틸-D-글루코사민
배양기간은 4일이었다.
25A = 톨리포클라디움 sp. LeA3 (Tolypocladium sp. LeA3) (CBS 630.92)
51 = 톨리포클라디움 인플라툼 Gams (Tolypocladium inflatum Gams) (ATCC 34921)
52 = 실린드로카르폰 루시둠 Booth (Cylindrocarpon lucidum Booth)
사이클로스포린, 특히 사이클로스포린 A를 생산하기 위한 본 발명에 따른 방법에 있어서는, 톨리포클라디움 sp. LeA3 (Tolypocladium sp. LeA3) (CBS 630.92)와 LeA3 CBS 630.92의 모든 동정특성을 갖는 균주들 중에서 선택된 신규한 톨리포클라디움 (Tolypocladium) 종 균주를 탄소원, 질소원 및 미네랄 염을 함유하는 생육 배지 중 20 - 30℃에서 호기적으로 배양시키며, 필요한 경우, 얻어진 사이클로스포린을 분리 및 정제한다.
본 발명에 따른 바람직한 방법에서는 균주 톨리포클라디움 sp. LeA3 (Tolypocladium sp. LeA3) (CBS 630.92)를 사용한다. 이 균주는 특히 본 발명에 바람직한데 그 이유는, 이것이 배양 후 불과 며칠만에 사이클로스포린을 대량으로 생산하기 때문이다. 그 밖에도, 이것은 사이클로포스포린 A를 비교적 대량으로 생산한다. 이 균주가 비록 다른 형태의 사이클로스포린 (B,C,D 및 G)를 생산하기도 하지만, 이들의 양은 대부분의 공지 균주의 그것에 비해 훨씬 낮은 것이다 (Isaac 외, 상기문헌 참조).이 균주는 단지 C-형을 10%, B-형은 4%, 그리고 D및 G형은 합쳐서 2%만을 생산한다. 이것은 A-형의 생산이 심지어 1.5g/l 정도로 높은 경우에도 그러하다.
상술한 본 발명에 따른 균주는 또한 신속히 성장할 뿐 아니라 매우 통상적인 생장 배지에서도 잘 자란다는데 또 다른 장점이 있다. 이 균주는 예컨대, 탄소원으로서 글루코스, 수크로스, 아라비노스, 자일로스 및 갈락토스 (표 I 참조)를 이용할 수 있으며, 질소원으로서 대두분(soya meal), 어분(fish meal), 면실분 (cottonseed meal) 및 (NH4)2S04를 사용할 수 있다.
이에 더하여, 사용되는 영양배지는 대개 황산마그네슘이나 인산이 수소칼륨과 같은 미네랄염을 함유한다.
바람직하게는, 적정한 가격의 당밀을 탄소원으로서 사용할 수 있고 질소원으로는 대두분을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 바람직한 방법에서는, 톨리포클라디움 sp. LeA3 (Tolypocladium sp. LeA3)의 사면배양체로부터 수집한 배양체를 물에 현탁시킴으로써 얻어진 포자와 균사체 접종물을 예비배양 배지 내로 접종한다. 이 배양체를 2 -일간 예비배양시키고 생산 배지를 예비배향 브로쓰에 접종한다. 실제 배양은 필요한 경우 1M NaOH 또는 1M HCl을 첨가함으로써 배양체의 pH를 약 3 내지 8, 바람직하게는 약 4 내지 7로 유지시키면서, 약 20 내지 약 30℃, 바람직하게는 25 - 30℃, 특히 25℃에서 5 - 7일간 (즉 120 내지 168시간)동안 수행한다.
호기적 조건은 예컨대, 1 vol/min (분당 배양체 체적 당 상응하는 공기의 체적)로 통기시킴으로써 유지하고, 배양체를 200 - 350ppm의 속도로 교반한다.
예컨대 Isaac 등 (상기문헌)이 설명한 바처럼 발효 중 사이클로스포린의 양을 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)로 모니터한다. 발효는 최대량의 사이클로스포린이 얻어질때까지 계속 진행시킨다. 본 발명에 따른 균주는 사이클로스포린을 6일이내에 1500mg/l까지 생산하며, 사이클로스포린 A의 상대적인 비율은 84%에 이른다.
여러가지 사이클로스포린의 혼합물은 통상적인 방법에 따라 분리 및 정제할 수 있다. 균사체를 여과와 원심분리 중 한가지 또는 두가지 모두에 의해 배양체로부터 분리해낸다. 사이클로스포린은 예컨대 메탄올, 에탄올 또는 이소프로판올, 바람직하게는 메탄올과 같은 저급 알칸올을 이용함으로써 균사체로부터 추출된다. 추출물을 물에 녹지않는 유기 용매, 예컨대, 부틸 또는 에틸 아세테이트, 바람직하게는 에틸 아세테이트로 농축 및 재추출한다. 얻어진 추출물의 증발 잔사를 예컨대 톨루엔과 같은 적절한 유기용매에 용해시키고, 사이클로스포린 A를 예컨대 실리카겔 컬럼을 이용하여 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리한다. 소망되는 사이클로스포린 A를 함유하는 분획들을 박층 크로마토그래피에 의해 분석하고 이 분획들을 농축시켜 사이클로스포린 A를 적절한 용매 또는 용매혼합물, 예컨대 에테르-헥산으로부터 재결정시킨다.
마지막으로, 얻어진 생성물을 예컨대, 융점 및 광회전을 측정함으로써 특성화시킨다.
다음 실시예들은 본 발명을 더욱 상세히 설명해준다.
톨리포클라디움 sp. LeA3 (Tolypocladium sp. LeA3) (CBS 630.92)의 사면배양체를 멸균수 5 mL에 현탁시킴으로써 포자 및 균사체 접종물을 얻었다. 이 현탁액 1mL를 이용하여 250mL들이 어얼렌마이어 플라스크 중 영양배지 (E1) 50mL에 접종하였다.
예비배양 배지 E1의 조성은 다음과 같았다.
글루코스 30g
대두분 15g
인산이수소칼륨 1g
황산마그네슘 0.5g
황산암모늄 5g
H2O 총 1L가 되도록 첨가
이 혼합물을 121℃에서 20분간 멸균시켰다.
배양체를 25℃, 와동기 (340rpm)중에서 2일간 접종한 후 예비배양 브로쓰 (50ml)를 10L 발효기 중에서 생산배지 (T1) 5L로 멸균 조건하에 옮겼다.
생산배지 T1의 조성은 다음과 같았다.
당밀 150g
대두분 17g
황산암모늄 5g
인산이수소칼륨 1g
황산마그네슘 0.5g
H20 총 1L가 되도록 첨가
이 혼합물을 121℃에서 20분간 멸균시켰다.
25℃에서 1vol/min의 비율로 통기시키면서, 200rpm으로 교반하면서 배양을 수행하였다. 배양배지 중의 사이클로스포린의 양을 HPLC를 통해 모니터하였다 (Isaac 외, 상기문헌). 6일 (144시간) 동안 발효를 계속한 후의 사이클로스포린 A의 농도는 1500mg/L였다. 다른 형의 사이클로스포린의 농도는 다음과 같았다: C 155 mg/L, B: 62 mg/L, D: 28 mg/L 및 G: 29 mg/L.
여러 형의 사이클로스포린들의 혼합물을 다응과 같이 분리 및 정제하였다: 4.5L의 발표 브로쓰를 여과하고 배양체를 메탄올 1L로 2회 추출하였다. 추출물을 수집하여 진공하에 농축시켰다. 잔사로부터, 에틸아세테이트 300mL로 사이클로스포린들을 2회 추출하였다. 용액을 더 농축시키고 잔사를 100mL 톨루엔에 용해시켰다. 이 용액을 톨루엔 중 실리카 겔 (Merck, 0.063-0.2mm) 200g이 충전된 컬럼 (5cm x 40cm) 상에 부하하였다. 이 컬럼을 톨루엔과 아세톤을 4:1의 비율로 함유하는 혼합물로 용출시켰다. 순수한 사이클로스포린 A를 함유하는 분획들을 추가 처리를 위해 수집하였다 (분석: TLC 플레이트, Kieselgel 60F 254, 헥산/아세톤 1:1 용액으로 전개, 요오드 증기로 검출). 수지모딘 분획들을 농축시켜 사이클로스포린 A를 에테르-헥산으로부터 결정화시켰다. 수율은 4.5g이었다. 사이클로스포린 A의 융점은 139 - 140℃였으며 광회전은 -189°였다 (0.5MeOH).
[실시예 2]
실시예 1에서와 마찬가지로 포자 및 균사체 접종물을 만들었다. 이 현탁액 1mL를 이용하여 200ml 들이 어얼렌마이어 플라스크 중 영양배지 (E2) 50mL에 접종하였다.
예비배양 배지 E2의 조성은 다음과 같았다.
말토스 40g
황산암모늄 5g
면실분 10g
인산이수소칼륨 1g
황산마그네슘 0.5g
H2O 총 1L가 되도록 첨가
이 혼합물을 121℃에서 20분간 멸균시켰다.
배양체를 25℃, 와동기 (230rpm)에서 2일간 접종시킨 후, 예비배양 용액 (50mL)을 10 L 발효기 중 생산배지 (T2) 5 L로 멸균조건 하에서 옮겼다.
생산배지 T2의 조성은 다음과 같았다.
글루코스 10g
말토스 10g
수크로스 60g
면실분 10g
면실유 5g
황산암모늄 5g
인산이수소칼륨 1g
황산마그네슘 0.5g
H20 총 1L가 되도록 첨가.
이 혼합물을 121℃에서 20분간 멸균시켰다.
24℃, 1vol/min의 비율로 통기시키면서 교반속도 200rpm으로 하여 배양을 수행하였다. 5일간 (120시간) 발효를 계속한 후 사이클로스포린 A의 농도는 1410mg/L이었다. 배양공액 중 사이클로스포린의 양을 HPLC를 이용하여 모니터하였다 (Isaac 외, 상기문헌). 다른 형태의 사이클로스포린들의 농도는 다음과 같았다: C: 135mg/L, B: 50mg/L, G 및 D: 30 mg/L.
사이클로스포린 A를 실시예 1에 설명된 바와 같이 정제하였다.
[비교예]
본 발명의 톨리포클라디움 sp. LeA3 (Tolypocladium sp. LeA3) (CBS 630.92)과 곰팡이 균주인 톨리포클라디움 인플라툼 Gams (Tolypocladium inflatum Gams) (ATCC 34921)와의 동일조건 하에서의 사이클로스포린 A 생산률을 비교하기 위한 실험을 행하였다.
실시예 A. Agathos, S. N 등의 방법 (J. Industrial Microbiology 1, 39-48, 1986)에 따라 3% 소르보스 (w/v)를 이용하여 SSM 배지 중에서 배양을 수행하였다. 이 참고문헌에 따라 예비배양 기간을 3일로 하고 생산배양 기간은 10일로 하였다.
결과는 다음과 같았다:
톨리포클라디움 인플라툼 Gams (Tolypocladium inflatum Gams)
생장은 좋았으나 사이클로스포린 A의 생산량은 거의 검색해낼 수 없는 정도였다.
톨리포클라디움 sp. LeA3 (Tolypocladium sp. LeA3)
비생산률의 평균치는 29.86 mg/g이었다.
실시예 B. Markaritis, A 등의 방법 (Bioteck. Lett. 11 (11), 765-768, 1989)에 따라 3% 프럭토스 배지 중에서 2차 배양을 수행하였다. 이 참고문헌의 지침에 따라 균주를 3 + 2일간 예비배양시키고 생산배양을 pH-통제하에 수행하였다.
결과는 다음과 같았다:
톨리포클라디움 인플라툼 Gams (Tolypocladium inflatum Gams)
비생산률의 평균치는 8.81 mg/g이었다.
톨리포클라디움 sp. LeA3 (Tolypocladium sp. LeA3)
비생산률의 평균치는 24.39 mg/g이었다.
실시예 C. 예비배양 기간을 2일로 하고 생산배양 기간을 6일 (144 시간)로 하여 실시예 1에서와 같이 3차 배양을 수행하였다.
결과는 다음과 같았다:
톨리포클라디움 인플라툼 Gams (Tolypocladium inflatum Gams)
비생산률의 평균치는 1.26 mg/g이었다.
톨리포클라디움 sp. LeA3 (Tolypocladium sp. LeA3)
비생산률의 평균치는 18.12 mg/g이었다.
각각의 대응하는 배양 결과는 세가지 대응하는 측정의 평균치로서 주어졌다.
결과적으로, 얻어진 결과들은 배양배지 리터 당 CyA의 밀리그램으로서 측정된 사이클로스포린 A의 양에 있어서 본 발명의 균주인 톨리포클라디움 sp. LeA3 (Tolypocladium sp. LeA3) (CBS 630.92)가 세가지 테스트 배지 모두에 있어서 가장 월등함을 명확히 보여준다. 특히 3차 배양 결과는 본 발명의 균주 LeA3이 단기간 동안 사이클로스포린 A를 대량 생산함을 보여준다. 톨리포클라디움 인플라툼 Gams (Tolypocladium inflatum Gams)는 시험된 모든 배지에서 잘 자랐지만, CyA의 생산량은 저조하였다. mg/g 건량 바이오매스로서의 비생산률 역시 비교를 위해 산출하였으나, 이 값은 사이클로스포린 생산자로서 균주의 중요성을 평가할 때에 있어서는 특별히 중요성을 갖는 값은 아니다.
미생물 기탁
부다페스트 조약 (Budapest Treaty)에 따라 다음 미생물을 The Netherlands, NL-3740 AG Baam, P.0. Box 273, Oosterstraat에 소재하는 국제기탁기관인 Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS)에 기탁하였다.
미생물 기탁번호 기탁일
톨리포클라디움 (sp.LeA3) CBS 630.92 1992년 12월 7일
(Tolypocladium sp. LeA3)

Claims (5)

  1. 톨리포클라디움 sp. LeA3 (Tolypoladium sp. LeA3) CBS 630.92를 사이클로스포린 A가 생산될 때까지 영양배지 중에서 배양하고, 필요한 경우, 생산된 사이클로스포린 A를 분리 및 정제하는 것으로 이루어지는 사이클로스포린 A의 생산방법.
  2. 제1항에 있어서, 20 - 30℃의 온도에서 호기적으로 배양을 수행하는 것이 특징인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 영양배지가 당밀과 대두분을 함유하는 것이 특징인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 영양배지가 수크로스와 면실분을 함유하는 것이 특징인 방법.
  5. 톨리포클라디움 sp. LeA3 (Tolypocladium sp. LeA3) CBS 630.92 균주.
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