JPH08505059A - 免疫抑制剤の製造方法およびそれに使用される新規微生物種 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、新規なトリポクラジウム種の株を、炭素源、窒素源およびミネラル塩を含有する栄養培地中で培養し、所望によりその結果生じたサイクロスポリンを単離し、精製することにより、サイクロスポリン、特にサイクロスポリンＡ、を産生する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 免疫抑制剤の製造方法およびそれに使用される新規微生物種 発明の分野 本発明はトリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）の新規な微生物種 および該種の株の好気性醗酵によるサイクロスポリン、特にサイクロスポリンＡ 、の製造方法を開示する。 従来技術の説明 サイクロスポリンは中性であり、変異性アミノ酸組成を有する親油性の高い環 化ウンデカペプチド（ｕｎｄｅｃａｐｅｐｔｉｄｅｓ）である。現在では２５の 異なった型のサイクロスポリン（Ａ−Ｚ）が知られている。前記Ａ−型は臨床的 に最も価値があることが判明している（レハセックおよびデークシュー（Ｒｅｈ ａｃｅｋ ａｎｄ Ｄｅ−ｘｉｕ）、プロセス・バイオケム（Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．）１９９１、２６、１５７−１６６）。 サイクロスポリンは最初に、米国およびノルウェーの土壌サンプルから単離さ れた真菌株シリンドロカルポン・ルシダム・ブース（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐ ｏｎ ｌｕｃｉｄｕｍ Ｂｏｏｔｈ）およびトリポクラジウム・インフラタム・ ガムズ（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ ｉｎｆｌａｔｕｍ Ｇａｍｓ）より１９ ７０年代に単離された。トリポクラジウム・インフラタム（ＮＲＲＬ８０４４、 ＡＴＣＣ３４９２１）という産生株は最初、トリコデルマ・ポリスポラム（Ｔｒ ｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｐｏｌｙｓｐｏｒｕｍ）（リンク・エクス・パーズ（Ｌｉ ｎｋ ｅｘ Ｐｅｒｓ））リファイ（Ｒｉｆａｉ）株であると同定された。該株 およびそれらにより産生される抗生物質は、例えば、ＦＩ特許第５４６０６号で 開示されている。該株の増殖条件および分類法もトルフュス（Ｄｒｅｙｆｕｓｓ ）等の記事、ユーロ・ジェイ・アプリ・マイクロバイオロ（Ｅｕｒ．Ｊ．Ａｐｐ ｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）、１９７６、３、１２５で報告されている。 上述のシリンドロカルポン・ルシダム・ブース（ＮＲＲＬ５７６０）株はＦＩ 特許第５２８５１号で開示されている。文献で見付けた、サイクロスポリンを産 生する他の微生物株には、例えば、ＤＤ特許第２９８２７６号で開示され、少な くともサイクロスポリンＡを産生するトリポクラジウム・インフラタム株ＳＦ１ ３６、およびＧＢ特許出願第２２２７４８９号で開示され、サイクロスポリンＡ 、ＢおよびＣの混合物等を産生するトリポクラジウム・バリウム（Ｔｏｌｙｐｏ ｃｌａｄｉｕｍ ｖａｒｉｕｍ）が含まれる。ＪＰ出願第８２６３０９３Ａ２号 では、サイクロスポリンを産生すると言及される２株のフサリウム（Ｆｕｓａｒ ｉｕｍ ）が開示されている。 総説記事で、アイザック（Ｉｓａａｃ）等（アンチミクロ・エージェンツ・ケ モーター（Ａｎｔｉｍｉｃｒ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｅｒ．）、１９９０ 、３４、１２１−１２７）は幾つかの既知のトリポクラジウム株のサイクロスポ リンの産生を比較している。 サイクロスポリンＡは最初は抗真菌性抗生物質として発見された。その免疫抑 制剤としての優れた効果は少し後で発見された（ボレル（Ｂｏｒｅｌ）等、イム ノロジー（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、１９７７、３２、１０１７）。こうして、 サイクロスポリンは現在、移植手術の術後処置で用いられており、この目的に対 し最適とさえいえる薬剤である。これは最初、腎臓（カルネ（Ｃａｌｎｅ）、ラ ンセット（Ｌａｎｃｅｔ）、１９７８、２、１３２３）および骨髄移植（パウレ ス（Ｐｏｗｌｅｓ）、ランセット、１９７８、２、１３２７）に関連して報告さ れた。サイクロスポリンは移植手術に加えて、例えば、リューマチおよび乾癬の ような様々な自己免疫性疾患の処置にも用いることができる。 文献に開示された微生物株によるサイクロスポリンＡの産生方法には、低い収 率や長い醗酵時間という幾つかの問題がある。たとえ高収率で得られたとしても 、サイクロスポリンＡの相対的な量はしばしば少なかった。より低収率の株が相 対的に多量のサイクロスポリンＡを産生することも示されている（デークシュー 等、 フォリア・マイクロバイオル（Ｆｏｌｉａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）、１９９１ 、３６（６）、５４９−５５６）。 発明の説明 我々の目的は、経済的な条件下、短時間の醗酵で最大の収量を提供する産生株 を見いだすことであった。 可能性のある産生株を選抜するうちに、きわめて迅速に産するトリポクラジウ ムという株を見つけた。この株はかなりの量のサイクロスポリンＡと相対的に少 量のその他の型のサイクロスポリンを産生し、従ってサイクロスポリンＡを容易 に精製することができる。該株はモスクワ近くのロシヤの土壌サンプルから単離 された。 発見されたその株をドクター・ダブリュー・ガムズ（Ｄｒ．Ｗ．Ｇａｍｓ）（ セントラールブロイ・フォーアー・シンメルカルチュレス（Ｃｅｎｔｒａａｌｂ ｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅs）、バーン（Bａａｒ ｎ）、オランダ）がオランダで試験した時、その微生物はトリポクラジウムの新 規な種であることが判明した。この株にトリポクラジウムｓｐ．ＬｅＡ３という コード名を与え、ブダペスト条約に従い１９９２年１２月７日にオランダの寄託 所セントラールブロイ・フォーアー・シンメルカルチュレスに寄託番号ＣＢＳ６ ３０．９２で寄託した。 このように本発明は迅速に高収率を提供するトリポクラジウムの新規な種に関 し、臨床的に重要なサイクロスポリンＡの産生のために該種を使用することに関 する。 トリポクラジウム属は１９７１年にダブリュー・ガムズにより初めて開示され た（ダブリュー・ガムズ、ペルソーニア（Ｐｅｒｓｏｏｎｉａ）、１９７１、６ 巻、パート（ｐａｒｔ）２、１８５−１９１）。３種のトリポクラジウム、Ｔ． インフラタム、Ｔ．ゲオデズ（Ｔ．ｇｅｏｄｅｓ）およびＴ．シリンドロスポラ ム（Ｔ．ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｏｒｕｍ）について文献で調べた。一般的にはト リポクラジウム種は増殖が遅く、白い、羊毛状のコロニー（ｆｌｏｃｋｙ ｃｏ ｌｏｎｉｅｓ）および多量の胞子を形成する。 本発明によるトリポクラジウムｓｐ．ＬｅＡ３株を上述の種と比較すると、そ れは逆に弱い胞子形成能、増えた細胞鎖（ｓｗｏｌｌｅｎ ｃｅｌｌ ｃｈａｉ ｎｓ）、および茶色がかった灰色（ｂｒｏｗｎｉｓｈ−ｇｒｅｙ）の顔料を形成 する傾向を有するダーカー・コロニー（ｄａｒｋｅｒ ｃｏｌｏｎｉｅｓ）を有 するという点で、明らかに異なっていた。従って、該トリポクラジウム株はトリ ポクラジウムの新しい種として分類された。 本発明によるトリポクラジウムｓｐ．ＬｅＡ３株を以下のように記述すること ができる：モルト抽出物（ｍａｌｔ ｅｘｔｒａｃｔ）／イースト抽出物プレー ト上で７日目のコロニーの直径は約１０ｍｍであり、胞子をほとんど含まない灰 色がかった菌糸体で覆われている。不規則な分生子（ｃｏｎｉｄｉａ）および増 えた細胞鎖はこの株には典型的である。トリポクラジウム・インフラタムと異な り、本発明による株はラフィノースを用いないが、ガラクトースを用いることが できる。トリポクラジウム・インフラタムおよびシリンドロカルポン・ルシダム の増殖特性と比較したトリポクラジウムｓｐ．ＬｅＡ３株のその特性を表Ｉに要 約する。 用いられた略号： ２ＫＧ＝２−ケト−Ｄ−グルコネート（ｇｌｕｃｏｎａｔｅ）、ＭＤＧ＝α−メ チル−Ｄ−グルコシド、ＮＡＧ＝Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン 培養時間は４日間であった。 ２５Ａ＝トリポクラジウムｓｐ．ＬｅＡ３（ＣＢＳ６３０．９２） ５１ ＝トリポクラジウム・インフラタム・ガムズ（ＡＴＣＣ３４９２１） ５２ ＝シリンドロカルポン・ルシダム・ブース サイクロスポリン、特にサイクロスポリンＡ、を産生するための本発明による 方法では、トリポクラジウムｓｐ．ＬｅＡ３ ＣＢＳ６３０．９２およびＬｅＡ ３ ＣＢＳ６３０．９２を同定する全ての性質を有する株から選択される新規の トリポクラジウム種の株は、炭素源、窒素源およびミネラル塩が含まれる増殖培 地中、温度２０〜３０℃で好気的に培養し、所望により、その結果生じたサイク ロスポリンを単離し、精製する。 好ましい具体例の説明 本発明による好ましい方法では、トリポクラジウムｓｐ．ＬｅＡ３ ＣＢＳ６ ３０．９２株を使用する。その株は２、３日の培養後すでに多量のサイクロスポ リンを産生しているため、本発明の目的のためには特に好ましい。そのうえ、そ れは比例して多量のサイクロスポリンＡを産生する。その株は他の型のサイクロ スポリン（Ｂ、Ｃ、ＤおよびＧ）も産生するけれども、これらの量はほとんどの 既知の株のそれよりかなり少ない量である（アイザック等、スプラ（ｓｕｐｒａ ）を見よ）。その株はＣ−型をほんの１０％、Ｂ−型を４％そしてＤおよびＧ型 を合わせて２％産生する。これは、Ａ−型の産生量が１．５ｇ／ｌという、高い 値という事実にもかかわらずのことである。 本発明による上述の株は、急速に増殖し、全く通常の増殖培地で増殖するとい う点でも都合がよい。その株は、ペプトン、あら碾き大豆粉、魚粉、粉末にした 綿実粕および（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄のような幾つかの有機および無機両窒素源と同様 に、炭素源として、例えば、グルコース、スクロース、アラビノース、キシロー スおよびガラクトース（表Ｉを見よ）を使用することができる。 これらに加えて通常用いられる栄養培地は、硫酸マグネシウムまたはリン酸二 水素カリウムのようなミネラル塩を含有する。 好ましくは、窒素源としてあら碾き大豆粉、炭素源として適度な価格の糖蜜（ ｍｏｌａｓｓｅｓ）を使用することができる。 本発明による好ましい方法では、胞子および菌糸体接種材料を前培養培地に接 種する。接種材料はトリポクラジウムｓｐ．ＬｅＡ３のスロープから採取した培 養物を水中で懸濁させることにより得られる。培養物を２〜４日間前培養し、産 生培地を前培養ブロス（ｂｒｏｔｈ）とともに接種する。本培養は約２０〜約３ ０℃、好ましくは２５〜３０℃、特に２５℃の温度で５〜７日間（すなわち、１ ２０〜１６８時間）、必要ならば１Ｍ ＮａＯＨまたは１Ｍ ＨＣｌを添加するこ とによりその培養物のｐＨを３から８、好ましくは４から７の間に維持しながら 行う。 好気性条件は、例えば、１体積／分（ｖｏｌ／ｍｉｎ）（１分あたり、培養物 の体積に対応する体積の空気）を通気して維持し、培養物は２００〜３００ｒｐ ｍの速度で攪拌する。 発酵中、サイクロスポリンの量は、例えば、アイザック等（スプラ）が述べて いるように、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で監視する。その発酵 は最大量のサイクロスポリンが形成されるまで継続する。本発明による株はサイ クロスポリンＡを６日以内で最高１５００ｍｇ／ｌまで産生し、サイクロスポリ ンＡの相対的割合は最高で８４％である。 数種の型のサイクロスポリン混合物は通常の方法により単離、精製することが できる。菌糸体は濾過または遠心分離どちらかにより培養ブロスから分離する。 サイクロスポリンは低級アルカノール、例えば、メタノール、エタノールまたは イソプロパノール、好ましくはメタノール、で菌糸体から抽出される。その抽出 液を濃縮し、水不溶性の有機溶媒、例えば、ブチルまたはエチルアセテート、好 ましくはエチルアセテート、で再抽出する。得られた抽出液のエバポレーション 残留物を適切な有機溶媒、例えば、トルエン、に溶解し、サイクロスポリンＡを カラムクロマトグラフィー、例えば、シリカゲルカラム、で分離する。所望のサ イクロスポリンＡを含有するフラクションを薄層クロマトグラフィーにより分析 し、そのフラクションを濃縮し、サイクロスポリンＡを適切な溶媒または混合溶 媒、例えば、エーテル−ヘキサン、から再結晶化する。 最後に、例えば、得られた生成物の融点や旋光性を測定することにより、その 特性を明らかにする。 以下の実施例により、本発明をさらに説明する。 実施例１ 培養物を無菌水５ｍｌに懸濁させることにより、胞子および菌糸体接種材料を トリポクラジウムｓｐ．ＬｅＡ３（ＣＢＳ６３０．９２）のスロープから作製し た。この懸濁液１ｍｌを用いて、２５０ｍｌ三角フラスコ中の栄養培地（Ｅ１） ５０ｍｌに接種した。 混合物を１２１℃で２０分間滅菌した。 培養物を振とう機（３４０ｒｐｍ）で２５℃にて２日間培養した後、前培養ブ ロス（５０ｍｌ）を１０ｌの発酵槽中の産生培地（Ｔ１）５ｌに無菌条件で移し た。 混合物を１２１℃で２０分間殺菌した。 ２００ｒｐｍの速度で攪拌しながら、通気１体積／分、２５℃にて培養を行っ た。培養培地中のサイクロスポリンの量を培養中ずっとＨＰＬＣで監視した（ア イザック等、スプラ）。醗酵は６日間（１４４時間）続けられ、その結果サイク ロスポリンＡの濃度は１５００ｍｇ／ｌであった。その他の型の濃度は以下のよ うであった：Ｃ：１５５ｍｇ／ｌ、Ｂ：６２ｍｇ／ｌ、Ｄ：２８ｍｇ／ｌおよび Ｇ：２９ｍｇ／ｌ。 数種の型のサイクロスポリン混合物を以下のようにして単離し、精製した：醗 酵ブロス４．５１を濾過し、培養物を１１のメタノールで２度抽出した。その抽 出物をプールし、減圧下で濃縮した。残留物からサイクロスポリンを３００ｍｌ のエチルアセテートで２度抽出した。そのエチルアセテート溶液を合わせ、硫酸 ナトリウムで乾燥させた。その溶液をさらに濃縮し、残留物を１００ｍｌのトル エンに溶解した。その溶液を、トルエン中シリカゲル（メルック（Ｍｅｒｃｋ） 、０．０６３〜０．２ｍｍ）２００ｇを充填したカラム（５ｃｍ×４０ｃｍ）に 適用した。そのカラムは混合比４：１のトルエンとアセトンの混合液で溶出した 。純粋なサイクロスポリンＡを含有するフラクションをさらなる処理（ＴＬＣプ レートでの分析、キーゼルゲル（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ）６０Ｆ２５４、展開溶媒 ヘキサン／アセトン（１：１）、ヨウ素気体での検出）のために採取した。プー ルしたフラクションを濃縮し、サイクロスポリンＡをエーテル−ヘキサンから結 晶化させた。収量は４．５ｇであった。サイクロスポリンＡの融点は１３９−１ ４０℃であり、旋光性は−１８９゜（０．５ＭｅＯＨ）であった。 実施例２ 胞子および菌糸体接種材料を実施例１のように作製した。この懸濁液１ｍｌを 用いて、２００ｍｌの三角フラスコ中の栄養培地（Ｅ２）５０ｍｌに接種した。 混合物を１２１℃で２０分間滅菌した。 培養物を振とう機（２３０ｒｐｍ）で２５℃にて２日間培養した後、前培養溶 液（５０ｍｌ）を１０ｌの発酵槽中の産生培地（Ｔ２）５ｌに無菌条件で移した 。 混合物を１２１℃で２０分間滅菌した。 ２００ｒｐｍの速度で攪拌しながら、通気１体積／分、２４℃にて培養を行っ た。醗酵は５日間（１２０時間）続けられ、その結果サイクロスポリンＡの濃度 は１４１０ｍｇ／ｌであった。培養溶液中のサイクロスポリンの量を培養中ずっ とＨＰＬＣで監視した（アイザック等、スプラ）。その他の型の濃度は以下のよ うであった：Ｃ：１３５ｍｇ／１、Ｂ：５０ｍｇ／ｌ、ＧおよびＤ：３０ｍｇ／ ｌ。 サイクロスポリンＡを実施例１のようにして精製した。 比較例 トリポクラジウム・インフラタム・ガムズ（ＡＴＣＣ３４９２１）真菌株と本 発明によるトリポクラジウムｓｐ．ＬｅＡ３（ＣＢＳ６３０．９２）のサイクロ スポリンＡの産生率を同じ条件で比較する実験を行った。 実施例Ａ．アガソス（Ａｇａｔｈｏｓ）、Ｓ．Ｎ．等（ジェイ・インダストリ アル・マイクロバイオロジー（Ｊ．Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ｏｇｙ）１、３９〜４８、１９８６）に従い、３％ソルボース（ｗ／ｖ）を用い たＳＳＭ培地中で培養を行った。参考文献に従い、前培養時間を３日間、産生培 養時間を１０日間とした。 結果を以下に示した： 増殖は良好であったが、産生されたサイクロスポリンＡはほとんど検出できな いままであった。 単位産生率の平均値は２９．８６ｍｇ／ｇであった。 実施例Ｂ．マルガリチス（Ｍａｒｇａｒｉｔｉｓ）、Ａ．等（バイオテック・レ ターズ（Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｌｅｔｔｅｒｓ）１１（１１）、７６５〜７６８、１ ９８９）に従い、３％フルクトース培地中で第２番目の培養を行った。参考文献 の教えに従い、株を３＋２日間、前培養し、８日間の産生培養をｐＨ制御下で行 った。 結果を以下に示した： 単位産生率の平均値は８．８１ｍｇ／ｇであった。 単位産生率の平均値は２４．３９ｍｇ／ｇであった。 実施例Ｃ．上述の実施例１と同様にして第３番目の培養を行い、前培養時間を２ 日間、産生培養時間を６日間（１４４時間）とした。 結果を以下に示した： 単位産生率の平均値は１．２６ｍｇ／ｇであった。 単位産生率の平均値は１８．１２ｍｇ／ｇであった。 平行して行った培養の結果は、平行して行った３回の測定の平均値として示し た。 結果として、培養培地１リットルあたりのＣｙＡをミリグラムで測定すると、 テストされた３つの全ての培地の中で、このトリポクラジウムｓｐ．ＬｅＡ３（ ＣＢＳ６３０．９２）株が多量のサイクロスポリンΛを産生するということが、 得られた結果によりはっきりと示されている。特に、第３番目の培養は、本発明 によるＬｅＡ３株は多量のサイクロスポリンＡを短時間で産生することを示して いる。トリポクラジウム・インフラタム・ガムズはテストされた全ての培地の中 でよく増殖するが、ＣｙＡの産生率は低いままである。乾燥重量生物量１ｇあた りのｍｇで表される単位産生率（ｍｇ／ｇ）も比較のために計算した。しかし、 サイクロスポリン産生株としての株の重要性を評価する場合、この値は特別な意 味はもたない。それぞれの培養において、ＬｅＡ３はＴ．インフラタム・ガムズ より高い単位産生率を示す。 寄託された微生物 以下の微生物はブダペスト条約に従い、寄託所セントラールブロイ・フォーア ー・シンメルカルチュレス（ＣＢＳ）、オーステルストラット（Ｏｏｓｔｅｒｓ ｔｒａａｔ）１、ピー・オー・ボックス（Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ）２７３、ＮＬ−３７ ４０エー・ジー・バーン（ＡＧ Ｂａａｒｎ）、オランダに寄託された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:645） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＺ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＶ，Ｍ Ｇ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 アンケロ、マッティ フィンランド国エフイーエン―23500 ウ ーシカウプンキ、ソプリティエ８番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．トリポクラジウムｓｐ．ＬｅＡ３ ＣＢＳ６３０．９２およびＬｅＡ３ ＣＢ Ｓ６３０．９２と同定する全ての性質を有する株から選択される新規なトリポク ラジウム種の株を栄養培地中にてサイクロスポリンＡが産生されるまで培養し、 所望により産生された該サイクロスポリンＡを単離し、精製することからなる、 サイクロスポリンＡの産生方法。 ２．培養が好気的に２０〜３０℃の温度で行われる、請求項１記載の方法。 ３．株がトリポクラジウムｓｐ．ＬｅＡ３ ＣＢＳ６３０．９２である、請求項 １記載の方法。 ４．栄養培地が糖蜜およびあら碾き大豆粉を含有する、請求項１記載の方法。 ５．栄養培地がスクロースおよび粉末にした綿実粕を含有する、請求項１記載の 方法。 ６．生物学的に純粋なトリポクラジウムｓｐ．ＬｅＡ３ ＣＢＳ６３０．９２株 の培養物。