PT1909759E - Libertação controlada de agentes anti-infeciosos - Google Patents

Description

ΡΕ1909759 1 DESCRIÇÃO "LIBERTAÇÃO CONTROLADA DE AGENTES ANTI-INFECIOSOS"

Introdução

Determinadas tecnologias de libertação controlada adequada para administração por inalação utilizam lipossomas e complexos lipidicos para proporcionar um efeito terapêutico prolongado do fármaco no pulmão e sistemicamente através da libertação controlada e a capacidade de atingir e aumentar a absorção de fármacos no local da doença. A presente invenção compreende um anti-infecioso lipossómico, e, métodos para o tratamento de infeções pulmonares, utilizando o agente anti-infecioso complexado com lípido ou lipossoma.

Conforme referido no Goodman e Gilman 's The Pharmaceutical Basis of Therapeutics, Oitava Edição, "Uma vez que a incidência de nefrotoxicidade e ototoxicidade está relacionada com a concentração à qual se acumula um aminoglicósido, é fundamental reduzir a dosagem de manutenção destes fármacos em doentes com função renal deficiente." Como os aminoglicósidos podem produzir disfunção vestibular ou auditiva e nefrotoxicidade, independentemente da deficiência do doente, geralmente é importante reduzir a posologia de manutenção. A presente 2 ΡΕ1909759 invenção proporciona significativas reduções na toxicidade permitindo assim doses mais elevadas do que o habitual.

Os doentes com fibrose quistica (FQ) têm muco espesso e/ou secreções de expectoração ao nivel pulmonar, frequentes infeções subsequentes e biopeliculas resultantes das colonizações bacterianas. Todos estes fluidos e materiais criam barreiras para se atingir efetivamente as infeções com agentes anti-infeciosos. A presente invenção ultrapassa essas barreiras, e ainda, permite redução da posologia (em quantidade ou frequência) , reduzindo assim a quantidade de fármaco a administrar aos doentes. Para as infeções pulmonares em geral, o esquema posológico proporcionado pela invenção proporciona um meio de redução da quantidade de fármaco.

Para um sistema de distribuição do fármaco lipossómico, é frequentemente desejável reduzir, tanto quanto possível, a proporção lípido-para-fármaco (L/F), para minimizar a carga lipídica para evitar os efeitos de saturação no organismo. Para a distribuição pulmonar por inalação, isto pode ser particularmente pertinente, porque para utilização crónica, a dosagem dos lipossomas pode superar a depuração, limitando assim a administração e, desta forma, a eficácia do medicamento. Uma relação L/F mais baixa permite a administração de maior quantidade de fármaco antes de se atingir o limite da administração /depuração. 3 ΡΕ1909759

Sumário da Invenção A invenção é tal como estabelecida nas reivindicações.

Através de métodos de infusão aqui descritos, foram criados lipossomas substancialmente isentos de lipidos aniónicos de pequena dimensão (<1 pm) que aprisionam agentes anti-infeciosos numa relação de peso lipido/anti-infecioso tipicamente de cerca de 4:1 até cerca de 0,5:1. Foram determinados os volumes captados de lipossomas, e, a partir destes valores é capaz de se calcular qual o valor de encapsulamento teórico que deve ser, se o agente anti-infecioso se comportar como um soluto ideal (ou seja, não interagir com a membrana do lipossoma, mas idealmente aprisiona juntamente com a água) . A partir desta comparação, são observados os números de encapsulamento que são de 3-5X superior ao esperado, indicando que existe uma interaçao especial que está a ocorrer o que permite encapsulamento maior do que o esperado e proporções lipido/anti-infecioso menores do que as esperadas. A solução na qual se formam os lipossomas contém uma concentração anti-infeciosa, a concentração do agente anti-infecioso dentro dos lipossomas deve ser aproximadamente a mesma concentração da solução. No entanto, é calculada a concentração anti-infeciosa interna de modo a ser pelo menos cerca de 3X superior.

Está descrita uma formulação anti-infeciosa de 4 ΡΕ1909759 lipossomas compreendendo uma formulação lipídica e um agente anti-infecioso, em que a formulação lipídica está substancialmente isenta de lípidos aniónicos, e, em que, a proporção em peso do lípido em relação ao agente anti-inf ecioso é desde cerca de 4:1 a cerca de 1:1. A proporção em peso do lípido para o anti-inf ecioso pode ser desde cerca de 3:1 a cerca de 1:1, de 2:1 a cerca de 1:1, ou cerca de 1:1. A presente invenção refere-se a uma formulação lipídica compreendendo um agente anti-infecioso, em que a proporção do lípido em relação ao agente anti-infecioso é de cerca de 0,75:1 ou inferior, por exemplo de cerca de 0,5:1 ou menos, e o agente anti-infecioso é um aminoglicósido.

Em certas formas de realização, a formulação compreende um anti-infecioso lipídico que compreende um lipossoma com um diâmetro médio desde cerca de 0,2 pm a cerca de 1,0 pm. Noutras determinadas formas de realização, o diâmetro médio é desde cerca de 0,2 pm até cerca de 0,5 pm. Ainda noutras formas de realização, o diâmetro médio é de cerca de 0,2 pm a cerca de 0,3 . O agente anti-infecioso é um aminoglicósido incluindo, mas não limitado a amicacina, tobramicina, gentamicina ou um seu sal farmaceuticamente aceitável. A formulação lipídica compreende um fosfolípido e 5 ΡΕ1909759 um esteróide. Em certas formas de realização, uma formulação lipídica compreende um lípido neutro. Ainda em certas formas de realização, a formulação lipídica está isenta de lípidos aniónicos. Noutras determinadas formas de realização, o fosfolípido incluí, mas não está limitado a uma fosfatidilcolina, tais como, dipalmitoilfosfatidilco-lina ou dioleoilfosfatidilcolina; ou o esteróide incluí mas não está limitado a colesterol, ou o lípido pode ser uma sua associação.

Em parte, a presente invenção caracteriza um método de preparação da formulação anti-infeciosa lipídica descrita anteriormente, compreendendo a infusão de uma mistura ou solução aquosa ou alcoólica do agente anti-infecioso com uma mistura ou solução de lípido-álcool a uma temperatura inferior à transição de fase de pelo menos um dos componentes lipídicos do lípido neutro, em que a infusão é efetuada a partir da anterior. Em certas formas de realização, o álcool é etanol.

Em certas formas de realização, a concentração da solução ou mistura de lípido-álcool é de cerca de 10 a cerca de 30 mg/mL. Em certas formas de realização, a concentração da solução ou da mistura aquosa ou alcoólica anti-infecciosa é de cerca de 20 a cerca de 70 mg/mL. Em certas formas de realização, a concentração da solução ou da mistura de lípido-álcool neutra é de cerca de 10 a cerca de 30 mg/mL, e a concentração da solução ou mistura aquosa ou alcoólica anti-infeciosa é de cerca de 20 a cerca de 70 6 ΡΕ1909759 mg/mL. No entanto, uma pessoa com conhecimentos correntes da matéria irá reconhecer que as concentrações podem variar ou de outro modo ser optimizadas dependendo do lípido e/ou do agente anti-infecioso envolvido. A presente invenção refere-se à formulação lipidica mencionada anteriormente, em que, o agente anti-infecioso é um aminoglicósido. Uma forma de realização adicional, o agente anti-infecioso é um aminoglicósido selecionado a partir do seguinte: amicacina, gentamicina ou tobramicina. Numa outra forma de realização, o agente anti-inf ecioso é a amicacina. Ainda numa outra forma de realização, o agente anti-infecioso é a gentamicina. Numa forma de realização adicional, o agente anti-infecioso é a tobramicina.

Em determinadas formas de realização, a presente invenção refere-se a uma formulação lipidica mencionada anteriormente, em que a formulação lipidica é um lipossoma. A presente invenção relaciona-se com a formulação lipidica anteriormente mencionada, em que, a formulação lipidica compreende um fosfolípido e um esteróide. Em certas formas de realização, a formulação lipidica compreende dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC). Em certas formas de realização, a formulação lipidica compreende colesterol. Ainda em certas formas de realização, a formulação lipidica compreende DPPC e colesterol. Em certas formas de realização a presente invenção relaciona-se com a formulação 7 ΡΕ1909759 mencionada anteriormente, em que a formulação lipídica compreende DPPC, dioleoilfosfatidilcolina (DOPC) e colesterol .

Em certas formas de realização, a formulação lipídica compreende DPPC e colesterol numa proporção molar de cerca de 20:1, 10:1, 5:1, 2:1 ou 1:1.

Em determinadas formas de realização, a formulação lipídica compreende DPPC, DOPC e colesterol numa proporção molar de cerca de 5-20:1-20:0,5-1.

Em certas formas de realização, a presente invenção refere-se à formulação lipídica mencionada anteriormente, em que a formulação lipídica é um lipossoma e o agente anti-infecioso é a amicacina.

Em certas formas de realização, a presente invenção relaciona-se com a formulação lipídica mencionada anteriormente, em que a formulação lipídica é um lipossoma, o agente anti-infecioso é a amicacina e a formulação lipídica compreende um fosfolípido e um esteróide.

Em certas formas de realização, a presente invenção refere-se à formulação lipídica mencionada anteriormente, em que a formulação lipídica é um lipossoma, o agente anti-infecioso é a amicacina e a formulação lipídica compreende um DPPC e um colesterol. ΡΕ1909759

Numa outra forma de realização, a presente invenção refere-se a um método de preparação de uma formulação lipidica compreendendo um agente anti-infecioso que compreende: a mistura de um fluxo de uma mistura ou solução de lípidos, com um fluxo de uma mistura ou solução de agente anti-infecioso, em que, os dois fluxos são misturados em linha. Em certas formas de realização, os dois fluxos entram num dispositivo de ligação em Y antes da mistura em linha.

Em certas formas de realização, a presente invenção refere-se ao método referido anteriormente, em que o fluxo de uma mistura ou solução de lípidos e o fluxo de uma mistura ou solução do agente anti-infecioso são misturados com um caudal total de cerca de 700 a até cerca de 900 mL/min. Em certas formas de realização, o fluxo de uma mistura ou solução de lípidos e o fluxo de uma mistura ou solução de anti-infecioso são misturados num caudal total de cerca de 800 mL/min. Em certas formas de realização, o fluxo de uma mistura ou solução de lípidos é adicionada a um caudal de cerca de 200 a cerca de 400 mL/min. Em certas formas de realização, o fluxo de uma mistura ou solução de lípidos é adicionada a um caudal de cerca de 300 mL/min. Em certas formas de realização, o fluxo de uma mistura ou solução anti-infeciosa é adicionada a um caudal de cerca de 400 até cerca de 600 mL/min. Em certas formas de realização, o fluxo de uma mistura ou solução anti-infeciosa é adicionada a um caudal de cerca de 500 mL/min. Em certas formas de realização, o fluxo de uma 9 ΡΕ1909759 mistura ou solução de lípidos é adicionada a um caudal de cerca de 300 mL/min, e o fluxo de uma mistura ou solução de anti-infecioso é adicionada a um caudal de cerca de 500 mL/min.

Em determinadas formas de realização, a presente invenção refere-se ao método mencionado anteriormente, em que, a temperatura dos fluxos associados é de cerca de 30-40°C. Em certas formas de realização, a temperatura da mistura ou solução de lipido é de cerca de 30°C, e a temperatura da mistura ou solução do agente anti-infecioso é de cerca de 30°C. Em certas formas de realização, a temperatura da mistura ou solução de lípidos é de cerca de 50°C, e a temperatura da mistura ou da solução de agente anti-infecioso é à temperatura ambiente.

Em certas formas de realização, a presente invenção refere-se à aplicação do referido método, em que o método de preparação de uma formulação lipídica compreendendo um agente anti-infecioso compreende ainda o passo de diluição da mistura dos fluxos com água, pelo menos, cerca de 20 segundos após a mistura.

Em certas formas de realização, a presente invenção diz respeito à aplicação do referido método, em que a concentração da mistura ou solução do agente anti-infecioso é de cerca de 30 a cerca de 50 mg/mL. Em certas formas de realização, a concentração da mistura ou solução do agente anti-inf ecioso é de cerca de 40 até cerca de 50 mg/mL. 10 ΡΕ1909759

Em certas formas de realização, a presente invenção refere-se à aplicação do referido método, em que o fluxo de uma mistura ou solução de lípidos é adicionada a um caudal de cerca de 300 mL/min, e o fluxo de uma mistura ou solução do agente anti-infecioso é adicionada a um caudal de cerca de 500 mL/min; a temperatura da mistura dos fluxos é de cerca de 30-40°C, os fluxos associados são diluídos com água, pelo menos cerca de 20 segundos após a mistura; e a concentração da mistura ou solução do agente anti-infecioso é de cerca de 40 a cerca de 50 mg/mL.

Em certas formas de realização, a presente invenção refere-se à aplicação do referido método, em que as soluções ou misturas são aquosas ou alcoólicas. Em certas formas de realização, a presente invenção refere-se à aplicação do referido método, em que a formulação lipídica é um lipossoma. A presente invenção refere-se à aplicação do referido método, em que o anti-infecioso é um aminoglicósido. Em certas formas de realização, o agente anti-infecioso é um aminoglicósido selecionado a partir dos seguintes: amicacina, gentamicina ou tobramicina. Em certas formas de realização, o agente anti-infecioso é a amicacina. Em certas formas de realização, o agente anti-infecioso é gentamicina. Em certas formas de realização, o agente anti-infecioso é tobramicina. 11 ΡΕ1909759

Em certas formas de realização, a presente invenção refere-se à aplicação do referido método, em que o lipido compreende um fosfolipido e um esteróide. Em certas formas de realização, o lipido compreende DPPC. Em certas formas de realização, o lipido compreende colesterol. Em certas formas de realização, o lipido compreende DPPC e colesterol.

Em certas formas de realização, a presente invenção refere-se à aplicação do referido método, em que a formulação lipídica é um lipossoma e o anti-infecioso é a amicacina.

Em certas formas de realização, a presente invenção refere-se à aplicação do referido método, em que a formulação lipídica é um lipossoma, o anti-infecioso é a amicacina e o lipido compreende um fosfolipido e um esteróide.

Em certas formas de realização, a presente invenção refere-se à aplicação do referido método, em que a formulação lipídica é um lipossoma, o anti-infecioso é a amicacina, e o lipido compreende DPPC e colesterol. A presente invenção refere-se à aplicação do referido método, em que a formulação lipídica tem uma proporção do lipido em relação ao agente anti-infecioso de cerca de 0,75:1 ou inferior. 12 ΡΕ1909759

Em certas formas de realização, a presente invenção relaciona-se com a aplicação do referido método, em que a formulação lipidica tem um lipossoma, o anti-infecioso é a amicacina, o lípido compreende a DPPC e colesterol e a proporção do lípido em relação ao anti-infecioso é de cerca de 0,75:1 ou inferior.

Numa outra forma de realização, a presente invenção refere-se à formulação lipidica mencionada anteriormente para ser utilizada no tratamento de infeções pulmonares num doente com essa necessidade, em que a quantidade terapeuticamente eficaz de uma formulação lipossómica anti-infeciosa que compreende uma formulação lipidica e de um agente anti-infecioso, é para administrar a um doente, em que a dosagem de agente anti-infecioso é de cerca de 100 mg/dia ou inferior. Numa outra forma de realização, a quantidade de dosagem do agente anti-infecioso é de cerca de 30 mg a cerca de 50 mg em dias alternados. Numa outra forma de realização, a quantidade de dosagem de agente anti-infecioso é de cerca de 30 mg a cerca de 50 mg de três em três dias.

Numa outra forma de realização, a presente invenção relaciona-se com o método de tratamento mencionado anteriormente, em que o lipossoma tem um diâmetro médio de cerca de 0,2 pm a cerca de 1,0 pm. Ainda numa outra forma de realização, o lipossoma tem um diâmetro médio de cerca de 0,2 pm até cerca de 0,5 pm ou cerca de 0,2 pm a cerca de 0,3 pm. 13 ΡΕ1909759

Numa outra forma de realização, a presente invenção relaciona-se com o método de tratamento acima mencionado, em que a infecção pulmonar é um resultado de fibrose quística.

Numa outra forma de realização, a presente invenção relaciona-se com o método de tratamento acima mencionado, em que a proporção em peso de lipido em relação ao anti-infecioso é de cerca de 0,75:1 ou inferior. A presente invenção relaciona-se com o método de tratamento acima mencionado, em que o agente anti-infecioso é um aminoglicósido. Numa outra forma de realização, o anti-infecioso é a amicacina.

Numa outra forma de realização, a presente invenção relaciona-se com o método de tratamento acima mencionado, em que a formulação lipidica compreende lipidos neutros. Noutra forma de realização, os lipidos que formam a formulação lipidica são todos lipidos neutros. Numa outra forma de realização, o lipossoma está isento de lipidos aniónicos. A formulação lipidica compreende um fosfolípido e um esteróide. Numa outra forma de realização, a formulação lipidica compreende DPPC e colesterol.

Numa outra forma de realização, a presente invenção relaciona-se com o método de tratamento acima mencionado, em que o anti-infecioso é a amicacina e a formulação lipidica compreende DPPC e colesterol. 14 ΡΕ1909759

Numa outra forma de realização, a presente invenção relaciona-se com o método de tratamento acima mencionado, em que o anti-infecioso é a amicacina, a proporção em peso do lipido em relação ao agente anti-infecioso é de 0,75:1 ou inferior, e a formulação lipidica compreende DPPC e colesterol.

Noutra forma de realização, a presente invenção relaciona-se com o método de tratamento acima mencionado, em que o agente anti-infecioso é a amicacina, a proporção em peso do lipido em relação ao agente anti-infecioso é de cerca de 0,75:1 ou inferior, e a formulação lipidica compreende DPPC e colesterol, e a infeção pulmonar é o resultado de fibrose quística.

Numa outra forma de realização, a presente invenção relaciona-se com o método de tratamento acima mencionado, em que o agente anti-infecioso é a amicacina, a proporção em peso do lipido em relação ao agente anti-infecioso é de 0,75:1 ou inferior, e a formulação lipidica compreende DPPC e colesterol, e o lipossoma tem um diâmetro médio de cerca de 0,2 pm até cerca de 1,0 pm. Numa outra forma de realização, o diâmetro médio é de cerca de 0,2 pm até cerca de 0,5 pm, ou cerca de 0,2 pma até cerca de 0,3 pm.

Numa outra forma de realização, a presente invenção relaciona-se com o método de tratamento acima 15 ΡΕ1909759 mencionada, em que o agente anti-infecioso é a amicacina, a proporção em peso do lípido em relação ao agente anti-infecioso é de 0,75:1 ou inferior, a formulação lipídica compreende DPPC e colesterol, a infecção pulmonar é o resultado de fibrose quística, e o lipossoma tem um diâmetro médio de cerca de 0,2 pm até cerca de 1,0 pm. Ainda numa outra forma de realização, o diâmetro médio é de cerca de 0,2 pm até cerca de 0,5 pm ou cerca de 0,2 pm até cerca de 0,3 pm.

Estas formas de realização da presente invenção, outras formas de realização e as suas funcionalidades e caracteristicas será evidente a partir da descrição, esquemas e reivindicações que se seguem.

Breve Descrição dos Esquemas

Figura 1 representa o diagrama de um corte transversal da expectoração/biopelícula observada em doentes com fibrose quística.

Figura 2 ilustra a representação gráfica do efeito do direcionamento e da deposição do fármaco da presente invenção.

Figuras 3 e 4 apresentam representações gráficas da bacteriologia da amicacina em várias formas.

Figura 5 apresenta uma representação gráfica da 16 ΡΕ1909759 libertação controlada dos complexos tobramicina/lipossoma e amicacina/lipossoma.

Figura 6 representa os resultados da ciproflo-xacina livre ou complexada.

Figura 7 apresenta uma representação gráfica da permacência do fármaco nos pulmões administrado em vários esquemas posológicos.

Figura 8 representa graficamente o processo de infusão em linha de dois fluxos para a preparação de formulações anti-infeciosas com lipossomas.

Figura 9 ilustra a miscibilidade do sulfato de amicacina em etanol/água. As linhas representam a concentração máxima de amicacina (base) miscivel com uma solução de etanol à temperatura ambiente (RT) e a 40°C. A concentrações mais elevadas da amicacina forma uma fase liquida separada (coacervados), que depois precipita na forma de cristais. As linhas verticais representam a concentração de etanol na mistura de infusão de lípid-o/amicacina (300/500 partes) e, após a adição de água de 200 partes.

Descrição Detalhada em que o A presente invenção descreve uma formulação lipidica compreendendo um agente anti-infecioso, 17 ΡΕ1909759 tamanho e a proporção do lípido em relação ao fármaco é menor do que era anteriormente conhecido. A presente invenção também descreve um método para preparar essas formulações lipídicas. 1. Definições

Por conveniência, antes da descrição detalhada da presente invenção, são aqui reunidos determinados termos utilizados na descrição, nos exemplos e nas reivindicações anexas. Estas definições devem ser lidas tendo em consideração a restante descrição e assim compreendidas por um especialista na matéria. Salvo definição em contrário, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que vulgarmente entendido por uma pessoa com conhecimentos correntes da técnica.

Os artigos "um" e "uns" são aqui utilizados para se referir a um ou a mais do que um (ou seja, a pelo menos um) do objecto gramatical do artigo. A título de exemplo, "um elemento" significa um elemento ou mais do que um elemento. 0 termo "biodisponível" é reconhecido na técnica e refere-se a uma forma da presente invenção, que permite à quantidade administrada, ou a uma sua parte, seja absorvida por, incorporada a, ou de uma outra forma fisiologicamente disponível, a um indivíduo ou doente a quem é administrada. 18 ΡΕ1909759

Os termos "compreende" e "compreendendo" são utilizados inclusivé num sentido amplo, o que significa que os elementos adicionais podem ser incluídos.

Os termos "encapsulado", e "encapsular" refere-se à adsorção dos agentes anti-infeciosos na superfície da formulação à base de lípidos, à associação de agentes anti-infeciosos na região intersticial das bicamadas ou entre duas monocamadas, à captura de anti-infeciosos no espaço entre duas bicamadas, ou à captura de agentes anti-infeciosos no espaço rodeado por duas camadas ou monocamada mais interna. 0 termo "incluindo" é aqui utilizado para significar "incluindo mas não limitado a" e "Incluindo" e "incluindo mas não limitado a" são utilizados alternadamente . 0 termo "formulação anti-infeciosa lipídica", ou "Lip-anti-infecioso" ou "Lip-An" aqui referido é qualquer forma de composição anti-infeciosa em que pelo menos cerca de 1% em peso do agente anti-infecioso está associada ao lípido quer seja como parte de um complexo com o lípido, ou como um lipossoma em que o antibiótico pode estar na fase aquosa ou na fase hidrofóbica da bicamada ou da região do grupo livre interfacial da bicamada lipossómica. Preferencialmente, pelo menos cerca de 5%, ou, pelo menos, cerca de 10%, ou pelo menos cerca de 20%, ou pelo menos cerca de 25%, podem ser assim associados. A associação pode 19 ΡΕ1909759 ser determinada por separação por meio de um filtro, em que são retidos o lipido e o agente anti-infecioso associado ao lipido e o agente anti-infecioso livre fica no filtrado. A "formulação anti-infeciosa lipossómica" é uma formulação anti-infeciosa lipidica em que a formulação lipidica está na forma de um lipossoma. 0 termo "mamifero" é conhecido no estado da técnica e os mamíferos exemplificativos incluem os seres humanos, primatas, bovinos, suínos, caninos, felinos e roedores (por exemplo, ratinhos e ratos).

Um "doente", "indivíduo" ou "hospedeiro" a ser tratado pelo método descrito pode significar um animal humano ou não-humano. 0 termo "sais farmaceuticamente aceitáveis" é reconhecido no estado da técnica e refere-se aos sais de adição de ácido orgânicos e inorgânicos dos compostos, relativamente não-tóxicos, incluindo, por exemplo, aqueles contidos nas composições da presente invenção. 0 termo "infusão de solvente" é um processo que inclui a dissolução de um ou mais lípidos numa pequena quantidade, preferencialmente, mínima quantidade de um solvente compatível com o processo, para formar uma suspensão ou uma solução de lípidos (preferencialmente uma solução) e depois adicionar a solução a um meio aquoso contendo agentes bioactivos. Tipicamente, um solvente 20 ΡΕ1909759 compatível com o processo é aquele que pode ser lavado num processo aquoso, tal como a diálise. A composição que tem ciclos de frio/quente é formada preferencialmente por infusão de solventes, sendo preferido com infusão de etanol. Os álcoois são preferidos como solventes. A "Infusão de Etanol", um tipo de infusão de solvente, é um processo que inclui a dissolução de um ou mais lípidos numa pequena quantidade, preferencialmente numa quantidade mínima de etanol para formar uma solução de lípidos e, em seguida, adicionar a solução a um meio aquoso contendo agentes bioactivos. Uma quantidade "pequena" de solvente é uma quantidade compatível com a formação de lipossomas ou complexos lipídicos no processo de infusão. O termo "infusão de solvente" pode também incluir um processo de infusão em linha, onde dois fluxos dos componentes da formulação são misturados em linha primeiro. 0 termo "substancialmente livre" é reconhecido no estado da técnica e refere-se a uma quantidade insignificante ou quantidade menor. O termo "agente terapêutico" é reconhecido no estado da técnica e refere-se a qualquer unidade química que é uma substância activa biologicamente, fisiologica-mente ou farmacologicamente activa que actua localmente ou sistemicamente num indivíduo. Exemplos de agentes terapêuticos, também conhecidos como "fármacos", estão descritos em referências bibliográficas bem conhecidas, tais como o Merck Index, o Physicians Desk Reference e The Pharmacological Basis of Therapeutics, e que incluem, sem 21 ΡΕ1909759 limitação, medicamentos; vitaminas; suplementos minerais; substâncias utilizadas no tratamento, prevenção, diagnóstico, cura ou mitigação de uma doença ou enfermidade; substâncias que afetam a estrutura ou função do organismo; ou pró-fármacos, que se tornam biologicamente ativos ou mais ativo depois de terem sido colocados num ambiente fisiológico. A frase "quantidade terapeuticamente eficaz", tal como aqui é utilizado, significa que a quantidade de um composto, material ou composição compreendendo uma formulação anti-infeciosa lipidica, de acordo com a presente invenção, que é eficaz para produzir algum efeito terapêutico desejado, através da inibição de infeções pulmonares. 0 termo "tratar" é reconhecido no estado da técnica e refere-se à cura, bem como, melhoria, em pelo menos, um dos sintomas de qualquer patologia ou doença. 0 termo "tratar" refere-se também ao tratamento profilático, que actua na defesa ou prevenção contra uma patologia ou doença. 2. Anti-infeciosos

Os anti-infeciosos são agentes anti-infeciosos que actuam contra infeções, tais como, infeções bacte-rianas, microbacterianas, fúngicas, virais, ou por protozoários. Os agentes anti-infeciosos abrangidos pela 22 ΡΕ1909759 invenção são aminoglicósidos (por exemplo, estreptomicina, gentamicina, tobramicina, amicacina, netilmicina, canami-cina, e outros semelhantes). As tetraciclinas (tais como clorotetraciclina, oxitetraciclina, metaciclina, doxicicl-ina, minociclina e outras semelhantes), sulfonamidas (por exemplo, sulfanilamida, sulfadiazina, sulfametaoxazol, sul-fisoxazol, sulfacetamida, e outros semelhantes), ácido para-aminobenzóico, diaminopirimidinas (tais como trime-toprim, frequentemente utilizado em conjugação com o sulfametoxazol, pirazinamida e outros semelhantes), quino-lonas (tais como, ácido nalidixico, cinoxacina , cipro-floxacina e norfloxacina e outros semelhantes), penicilinas (tais como penicilina G, penicilina V, ampicilina, amoxi-cilina, bacampicilina, carbenicilina, indanilo de carbeni-cilina, ticarcilina, azlocilina, mezlocilina, piperacilina, e outros semelhantes), penicilina resistente à penicilinase (tais como, meticilina , oxacilina, cloxacilina, dicloxa-cilina, nafcilina e outros semelhantes), cefalosporinas de primeira geração (tais como, cefadroxil, cefalexina, cefra-dina, cefalotina, cefapirina, cefazolina, e outros semelhantes), cefalosporinas de segunda geração (tais como, cefaclor, cefamandol, cefonicida, cefoxitina, cefotetano, cefuroxima, cefuroxima axetil, cefmetazol, cefprozil, lora-carbef, ceforanida, e outros semelhantes), cefalosporinas de terceira geração (tais como, cefepima, cefoperazona, cefotaxima, ceftizoxima, ceftriaxona, ceftazidima, cefixi-ma, cefpodoxima, ceftibuteno, e outras semelhantes), outros beta-lactâmicos (tais como, imipenem, meropenem, aztreonam, ácido clavulânico, sulbactam, tazobactam, e outros seme- 23 ΡΕ1909759 lhantes), inibidores das beta-lactamases (tal como, ácido clavulânico), cloranfenicol, macrólidos (tais como, eritro-micina, azitromicina, claritromicina, e outros semelhantes), lincomicina, clindamicina, espectinomicina, polimi-xina B, polimixinas (tais como, polimixina A, B, C, D, EI (colistina A), ou E2, colistina B ou C, e outras semelhantes) colistina, vancomicina, bacitracina, isoniazida, rifampicina, etambutol, etionamida, ácido aminossalicilico, cicloserina, capreomicina, sulfonas (tais como, dapsona, sulfoxona de sódio, e outras semelhantes), clofazimina, a talidomida, ou qualquer outro agente anti-bacteriano que pode ser encapsulado no lípido. Anti-infeciosos podem incluir agentes antifúngicos, incluindo antifúngicos polienos (tais como anfotericina B, nistatina, natamicina, e outros semelhantes), flucitosina, imidazóis (tal como n-ticonazol, clotrimazol, econazol, cetoconazol, e outros semelhantes), triazóis (tais como, o itraconazol , flucon-azol, e outros semelhantes), estão também descritos, a griseofulvina, terconazol, butoconazol ciclopirax, ciclo-pirox olamina, haloprogina, tolnaftato, naftifma, terbma-fma, ou qualquer outro antifúngico que possa ser complexado ou encapsulado no lipido. A discussão e os exemplos são dirigidos principalmente para a amicacina, mas no âmbito do pedido não se pretende estar limitado a este agentes anti-infecioso. Podem ser utilizadas associações de fármacos.

Descritos também como agentes anti-infeciosos adequados utilizados nas formulações anti-infeciosas lipí-dicas são os sais de adição e complexos de anti-infeciosos - 24 - ΡΕ1909759 farmaceuticamente aceitáveis. Nos casos em que os compostos podem ter um ou mais centros quirais, excepto se descrito o contrário, está incluído cada composto racémico único, assim como, cada composto não-racémico único.

Nos casos em que os agentes anti-infeciosos têm duplas ligações carbono-carbono insaturadas, estão incluídos ambos os isómeros cis (Z) e trans (E). Nos casos em que os agentes anti-infeciosos podem existir nas formas tautoméricas, tais como tautómeros ceto-enólicos, tais como

e OR* t cada forma tautomérica está prevista como estando incluída, existindo em equilíbrio ou bloqueado numa forma por substituição apropriada com R' . 0 significado de qualquer substituinte em qualquer uma das ocorrência é independente do seu significado, ou de qualquer outro significado do substituinte, em qualquer outra ocorrência.

Também estão incluídos, como agentes anti-infeciosos adequados, os pró-fármacos de compostos de platina. Os pró-fármacos estão considerados como sendo quaisquer veículos ligados covalentemente os quais libertam o composto activo de origem in vivo. ΡΕ1909759 25 3. Infeções Pulmonares

De entre as infeções pulmonares (tais como, em doentes com fibrose quística) que podem ser tratados de acordo com a invenção são infeções a Pseudomonas (por exemplo, P. aeruginosa, P. paucimobilis, P. putida, P. fluorescens, e P. acidovorans) , estafilococos, Staphy-lococcus aureus resistentes à meticilina (MRSA), estreptococos (incluindo Streptococcus pneumoniae) , Esche- ri chia coli, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Haemo- philus, Yersinia pesos, Burkholderia pseudomallei, B. cepacia, B. gladiolos, B multivorans, B. vietnamiensis,

Mycobacterium tuberculosis, M. avium complex (MAC) (M. avium e M. intracellulare), M. kansasii, M. xenopi, M. marinum, M. ulcerans, ou M. fortuitum complex (M. fortuitum e M. chelonae) . 4. Métodos de Tratamento

Numa forma de realização da presente invenção compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma formulação anti-infeciosa de lipidos para a utilização em medicina.

Em que não é proporcionada seguidamente nenhuma dosagem especifica, a dosagem preferida da invenção é de 50% ou inferior, 35% ou inferior, 20% ou inferior, ou 10%, ou inferior, do mínimo de fármaco livre (que, naturalmente, pode ser um sal) , a quantidade que é eficaz é distribuída 26 ΡΕ1909759 nos pulmões por meio de um nebulizador, para reduzir a contagem de CFU nos pulmões numa ordem de grandeza ao longo do decorrer de um tratamento de 14 dias. A quantidade de fármaco livre comparativa é a quantidade cumulativa que seria utilizada na administração dos fármacos da invenção no período de tratamento aplicado. 0 fármaco livre mínimo comparativo definido neste parágrafo é uma "quantidade de fármaco livre comparativa."

As formas de realização de tratamento sem FQ da invenção podem ser utilizadas em qualquer animal, embora, preferencialmente, com seres humanos. As quantidades relativas de um determinado animal são determinadas em relação a esse animal. O regime posológico é preferencialmente, de uma vez por dia ou menos. Em formas de realização preferidas, o regime posológico é de uma vez de dois em dois dias, de três em três dias, e semanalmente ou inferior. Por exemplo, o regime posológico pode ser de dois em dois dias ou menos, utilizando 50% ou menos da quantidade de fármaco livre comparativa. Ou, por exemplo, a posologia diária pode ser utilizando 35% ou menos da quantidade de fármaco livre comparativa. Ver Figuras 3 e 4 para os resultados observados em animais que demonstraram que as formulações anti-infeciosas lipídicas da presente invenção são mais eficazes do que o fármaco livre.

Para o tratamento de infeções, a quantidade 27 ΡΕ1909759 eficaz do agente anti-infecioso será reconhecido pelos clínicos mas inclui a quantidade eficaz para tratar, reduzir, aliviar, eliminar ou prevenir um ou mais sintomas da doença que se pretende tratar ou a patologia a ser evitada ou tratada, ou para de qualquer outro modo produzir uma alteração clinicamente reconhecida na patogenia da doença ou patologia. Melhoria inclui a redução da incidência ou gravidade de infeções em animais profilaticamente tratados. Em certas formas de realização, a quantidade eficaz é uma quantidade eficaz para tratar ou melhorar os sintomas da infeção pulmonar após terem surgido. Numa outras formas de realização, a quantidade eficaz é uma quantidade eficaz para tratar ou melhorar a média da incidência ou gravidade das infeções em animais tratados profilaticamente (tal como determinado através de estudos estatísticos).

Os lipossomas ou outros sistemas de distribuição lipídica podem ser administrados por inalação, quer como uma pulverização nebulizada, pó ou aerossol, ou por administração intratecal. São preferidas as administrações por inalação. 0 resultado global é uma menor frequência na administração e um índice terapêutico melhorado em comparação com o fármaco livre ou na forma parentérica do fármaco. Os lipossomas ou outras formulações lipídicas são particularmente vantajosas devido à sua capacidade para proteger a fármaco sendo ao mesmo tempo compatível com o revestimento pulmonar ou surfatante pulmonar. 28 ΡΕ1909759 A presente invenção inclui a formulação referida anteriormente para utilização no tratamento de infeções pulmonares a bactérias gram-negativas. Uma infeção tratada de forma eficaz é a infeção crónica a pseudomonas em doentes com fibrose quistica. Os tratamentos conhecidos com aminoglicósido nas infeções pulmonares (tais como em doentes com FQ) compreendem geralmente a administração de cerca de 200-600 mg de amicacina ou tobramicina por dia por via inalatória. A presente invenção permite, numa forma de realização preferida, o tratamento através da administração de 100 mg ou menos de amicacina por dia (ou normalizada para 100 mg por dia ou menos, se a posologia for menos frequente). Adicionalmente, numa outra forma de realização, é realizada a administração de 60 mg ou menos de amicacina por dia. E ainda noutra forma de realização, é realizada a administração de aproximadamente de 30 a 50 mg e não mais do que uma vez de dois em dois dias. A forma de realização mais preferida compreende a administração de cerca de 30 a 50 mg de dois em dois dias ou de três em três dias. 5. Lipidos e Lipossomas

Os lipidos utilizados nas composições da presente invenção podem ser lipidos sintéticos, semi-sintéticos ou naturais, incluindo os fosfolipidos, tocoferóis, esterói-des, ácidos gordos, glicoproteinas, tais como, a albumina, os lipidos aniónicos e lipidos catiónicos. Os lipidos podem ser aniónicos, catiónicos ou neutros. Numa forma de realização, a formulação lipídica é substancialmente isenta 29 ΡΕ1909759 de lípidos aniónicos. Numa forma de realização, a formulação lipídica compreende apenas lípidos neutros. Numa outra forma de realização, a formulação lipídica é isenta de lípidos aniónicos. A formulação lipídica da invenção compreende um fosfolípido e um esteróide. Os fosfolípidos incluem fosfatidilcolina de ovo (EPC), fosfatidilglicerol do ovo (EPG), fosfatidilinositol do ovo (EPI), fosfa-tidilserina do ovo (EPS), fosfatidiletanolamina (EPE), e ácido fosfático do ovo (EPA), homólogos da soja, fosfati-dilcolina de soja (SPC); SPG , SPS, SPI, SPE e SPA, o ovo hidrogenado e homólogos da soja (por exemplo, HEPC, HSPC), outros fosfolípidos compostos por ligações éster de ácidos gordos nas posições 2 e 3 do glicerol contendo cadeias de 12 a 26 átomos de carbono e diferentes grupos de cabeça na posição 1 do glicerol, que inclue colina, glicerol, inosi-tol, serina, etanolamina, bem como os ácidos fosfatídicos correspondentes. As cadeias nesses ácidos gordos podem ser saturadas ou insaturadas, e o fosfolípido pode ser constituído por ácidos gordos com cadeia de diferentes comprimentos e diferentes graus de insaturação. Em particular, as composições de formulações podem incluir dipalmi-toilfosfatidilcolina (DPPC), um dos principais constituintes de ocorrência natural do surfatante pulmonar, bem como, dioleoilfosfatidilcolina (DOPC). Outros exemplos incluem dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC) e dimiristoilfosfati-dilglicerol (DMPG) dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) e dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG) distearoilfosfatidilcolina (DSPC) e distearoilfosfatidilglicerol (DSPG), di-oleilfosfatidiletanolamina (DOPE) e fosfolípidos mistos como palmitoilestearoilfosfatidilcolina (PSPC) e palmi- 30 ΡΕ1909759 toilestearoilfosfatidilglicerol (PSPG) driacilglicerol, di-acilglicerol, seranida, esfingosina, esfingomielina e fos-folipídos acilados simples como a mono-oleoil-fosfati-diletanol amina (MOPE).

Os lípidos utilizados podem incluir sais de amónio de ácidos gordos, fosfolipidos, e glicéridos, esteróides, fosfatidilgliceróis (PGs), ácidos fosfatídicos (PAs), fosfotidilcolinas (PCs), fosfatidilinositóis (Pis) e os fosfatidilserinas (PSs). Os ácidos gordos incluem os ácidos gordos de comprimentos de cadeia de carbono com 12 a 26 átomos de carbono, que são saturados ou insaturados. Alguns exemplos específicos incluem: miristilamina, palmitilamina, laurilamina e estearilamina, dilauroil etilfosfocolina (DLEP), dimiristoiletilfosfocolina (DMEP), dipalmitoiletilfosfocolina (DPEP) e diestearoiletilfosfocolina (DSEP), cloridrato de N-(2,3-di-(9(Z)-octadeceniloxi)-prop-l-il-N,N,N-trimetilamónio (DOTMA) e 1,2-bis(oleoilo-xi)-3-(trimetilamónio)propano (DOTAP). Exemplos de esteróides incluem colesterol e ergosterol. Exemplos de PGs, PAs, Pis, PCs e PSs incluem DMPG, DPPG, DSPG, DMPA, DPPA, DSPA, DMPI, DPPI, DSPI, DMPS, DPPS e DSPs, DSPC, DPPG, DMPC, DOPC e PC do ovo.

As formulações anti-infeciosas lipídicas ou lipossómicas, constituídas por fosfatidilcolinas, tais como, DPPC, auxilia na absorção pelas células do pulmão, tais como, os macrófagos alveolares e ajuda a libertação controlada do agente anti-infecioso ao nível do pulmão 31 ΡΕ1909759 (Gonzales-Rothi et al.(1991)). Os lípidos carregados negativamente, tais como os PGs, PAs, PSs e PIS, para além de reduzir a agregação das partículas, podem desempenhar um papel nas características de libertação controlada da formulação para inalação, bem como, no transporte da formulação através do pulmão (transcitose) para a absorção sistémica. Pensa-se que os compostos esteróis afectam as características de libertação e de fuga da formulação.

Os lipossomas são membranas lipídicas de bicamada completamente fechadas contendo um volume aquoso encapsulado. Os lipossomas podem ser vesículas unilamelares (possuindo uma só bicamada de membrana) ou vesículas multilamelares (estruturas tipo cebola caracterizadas por bicamadas membranares múltiplas, cada uma separada da seguinte por uma camada aquosa). A bicamada é composta por duas monocamadas lipídicas possuindo uma região hidrofóbica na "cauda" e uma região hidrófila na "cabeça". A estrutura da membrana de bicamada é tal que as "caudas" (não polar) hidrofóbicas de monocamadas lipídicas orientam-se para o centro da bicamada, enquanto a "cabeça" hidrófila orienta-se em direcção à fase aquosa. As formulações anti-infeciosas lipídicas são associações de lipídos e de agente anti-infecioso. Esta associação pode ser covalente, iónica, eletrostática, não covalente, ou estérica. Estes complexos não são lipossomas e são incapazes de aprisionar outros solutos solúveis em água. Exemplos desses complexos incluem complexos lipídicos de amfotencina B (Janoff et al., Proc. Nat. Acad. SCI, 85:6122 6126, 1988) e cardiolipina complexada com doxorrubicina. 32 ΡΕ1909759

Um clatrato lipídico é uma estrutura tridimensional, tipo gaiola utilizando um ou mais lípidos, em que, a estrutura aprisiona um agente bioactivo. Esses clatratos estão incluídos no âmbito da presente invenção. Os prolipossomas são formulações que podem tornar-se lipossomas ou complexos lipídicos após entrarem em contacto com um líquido aquoso. Pode ser necessário agitação ou outra mistura. Tais prolipossomas estão incluídos no âmbito da presente invenção.

Os lipossomas podem ser produzidos por uma variedade de métodos (por exemplo, ver, Bally, Cullis et al, Biotechnol Adv.5(1):194, 1987). Processos de Bangham (J. Mol. Biol., J Mol Biol. 13(1):238-52, 1965) produz vesículas multilamelares normais (MLVs). L enk et al.(Patentes dos EUA N°s 4 522 803, 5 030 453 e 5 169 637), Fountain et al. (Patente dos EUA. N° 4 588 578) e Cullis et al. (Patente dos EUA. N°. 4 975 282) descrevem métodos para produzir lipossomas multilamelares que têm a distribuição do soluto interlamelar substancialmente igual em cada um dos seus compartimentos aquosos. Paphadjopoulos et al., Patente dos EUA. No. 4 235 871, descrevem a preparação de lipossomas oligolamelares por evaporação de fase inversa.

As vesículas unilamelares podem ser produzidas a partir de MLVs por uma série de técnicas, por exemplo, a extrusão de Cullis et al. (Patente dos EUA. N°. 5 008 050) e Loughrey et al. (Patente dos EUA. N° . 5 059 421) . A 33 ΡΕ1909759 sonicação e homogeneização podem ser utilizadas para produzir lipossomas unilamelares mais pequenos a partir de lipossomas maiores (ver, por exemplo, Paphadjopoulos et al. Biochim. Biophys. Acta, 135:624-638, 1967;. Deamer, Patente dos EUA N°. 4 515 736, e Chapman et al, Liposome Technol., 1984, p.1-18). A preparação de lipossomas originais de Bangham et al. (J. Mol Biol, 1965, 13:238-252) envolve a suspensão de fosfolipidos num solvente orgânico que é então evaporado até à secura deixando uma película de fosfolípido no recipiente reacional. Em seguida, é adicionada uma quantidade apropriada de fase aquosa, a mistura é deixada a "intumescer" e os lipossomas resultantes que são constituídos por vesículas multilamelares (MLVs) são dispersas por meios mecânicos. Esta preparação proporciona a base para o desenvolvimento de pequenas vesículas unilamelares submetidas a sónico descritas por Papahadjopoulos et al. (Biochim. Biophys, Acta, 1967, 135:624-638), e de grandes vesículas unilamelares.

As técnicas para produzir vesículas unilamelares grandes (LUVs), tais como, evaporação da fase inversa, procedimentos de infusão, e diluição de tensioativo, podem ser utilizados na produção de lipossomas. Uma revisão destes e de outros métodos para produzir lipossomas podem ser encontrados no texto, Liposomes, Marc Ostro, ed., Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, 1983, Capítulo 1. Ver também Szoka, Jr. et al., (1980, Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9:467). 34 ΡΕ1909759

Outras técnicas que são utilizadas para preparar as vesículas incluem aqueles que formam vesículas de evaporação de fase inversa (REVJ, Papahadjopoulos et al., Patente dos EUA. N°. 4 235 871. Outra classe de lipossomas que podem ser utilizados são os caracterizados como tendo uma distribuição de soluto lamelar substancialmente idêntica. Esta classe de lipossomas é denominada como vesículas plurilamelares estáveis (SPLV), conforme definido nas Patentes dos EUA N°. 4 522 803 de Lenk, et al. e inclui vesículas monofásicas como descritas na Patente dos EUA. N°. 4 588 578 de Fountain et al. e vesículas multilamelares congeladas e descongeladas (FATMLV) , como descrito anteriormente.

Uma variedade de esteróides e os seus derivados solúveis em água, tais como hemissuccinato de colesterol têm sido utilizados para formar lipossomas; ver especificamente Janoff et al., Patente dos EUA N°. 4 721 612, emitida em 26 de Janeiro de 1988, intitulada "Steroidal Liposomes". Mayhew et al., que descreveram um método para reduzir a toxicidade de agentes antibacterianos e agentes antivirais, através da sua encapsulação em lipossomas compreendendo o alfa-tocoferol e alguns dos seus derivados. Além disso, uma variedade de tocoferóis e seus derivados solúveis em água têm sido utilizados para formar lipossomas, ver Janoff et al., Patente dos EUA N°. 5 041 278. 35 ΡΕ1909759 6. Métodos de Preparação

Um processo para a formação de lipossomas ou formulações anti-infeciosas de lipídos envolve um processo de "infusão de solvente". Este é um processo que inclui a dissolução de um ou mais lípidos numa quantidade pequena, de preferência mínima, de um solvente compatível com o processo, para formar uma suspensão de lípidos ou uma solução (preferencialmente uma solução) e depois a infusão da solução num meio aquoso contendo o agente anti-infecioso. Tipicamente, um solvente compatível com o processo é aquele que pode ser lavado por um processo aquoso, tal como a diálise ou diafiltração. A "Infusão de etanol", um tipo de infusão de solvente, é um processo que inclui a dissolução de um ou mais lípidos numa pequena quantidade, de preferência num mínimo, de etanol para formar uma solução de lípidos e, em seguida, a infusão da solução num meio aquoso contendo o anti-infecioso. Uma quantidade "pequena" de solvente é uma quantidade compatível com a formação de lipossomas ou complexos lipídicos no processo de infusão. Tais processos estão descritos em Lee et al., Pedido de Patente dos EUA 10/634 144, depositado em 4 de Agosto de 2003, Pilkiewicz et al, Pedido de Patente dos EUA 10/383 173, depositado em 5 de Março de 2003, e Boni et al., Pedido de Patente dos EUA 10/383 004, depositado em 5 de Março de 2003. O passo de infusão da solução lípido-álcool na solução ou mistura aquosa ou alcóolica contendo o agente anti-infecioso pode ser realizada acima ou abaixo da 36 ΡΕ1909759 superfície da solução ou da mistura aquosa ou alcoólica contendo o agente anti-infecioso. Preferencialmente, o passo é realizado por cima da superfície da solução ou da mistura.

Os lipossomas podem também ser preparados pelos métodos descritos nos pedidos co-pendentes de Patentes dos E.U.A. 10/383 004, depositado em 5 de Março de 2003; 10/634 144, depositado em 4 de Agosto de 2003; 10/224 293, depositado em 20 de Agosto de 2002; e 10/696 389, depositado em 29 de Outubro de 2003. A dimensão do lipossoma ou da formulação lipídica pode ser conseguida por uma série de métodos, tais como as técnicas de extrusão, sonicação e homogeneização, que são bem conhecidas, e facilmente postas em prática, por técnicos com conhecimentos correntes na matéria. A extrusão envolve a passagem de lipossomas, sob pressão, uma ou mais vezes através de filtros com tamanhos de poro definidos. Os filtros são geralmente constituídos por policarbonato, mas os filtros podem ser feitos de qualquer material durável que não interaja com os lipossomas e que seja suficientemente forte para permitir a extrusão sob suficiente pressão. Os filtros preferidos incluem filtros em "linha recta" porque podem geralmente suportar a pressão mais elevada dos processos de extrusão preferidos da presente invenção. Podem também ser utilizados filtros de "trajecto tortuoso". A extrusão pode também utilizar filtros assimétricos, tais como filtros Anopore(TM), que envolve a 37 ΡΕ1909759 extrusão de lipossomas através de um tipo de filtro poroso de óxido de alumínio de poro ramificado.

Os lipossomas ou formulações de lípidos também podem ser de tamanho reduzido por sonicação, que utiliza energia sónica para romper ou cisalhamento de lipossomas, que se vão reformar espontaneamente em lipossomas mais pequenos. A sonicação é realizada por imersão de um tubo de vidro contendo a suspensão de lipossoma no epicentro sónico produzido num sonicador de tipo banho. Alternativamente, um tipo de sonda de ultra-sons pode ser utilizado, onde a energia sónica é gerada por vibração de uma sonda de titânio em contacto directo com a suspensão do lipossoma. 0 aparelho de homogeneização e de trituração, tal como o homogeneizador de Gifford Wood, Polytron(TM) ou Micro-fluidizer, também podem ser utilizados para quebrar as lipossomas maiores ou formulações de lípidos em lipossomas menores ou formulações lipídicas.

As formulações de lipossomas resultantes podem ser separadas em populações homogéneas utilizando métodos bem conhecidos no estado da técnica; tais como filtração de fluxo tangencial. Neste procedimento, uma população de lipossomas ou formulações lipídicas de tamanho heterogéneo é passada através de filtros de fluxo tangencial, resultando daí numa população de lipossomas com um limite de tamanho superior e/ou inferior. Quando são utilizados dois filtros de tamanhos diferentes, isto é, são utilizados com diferentes diâmetros de poros, os lipossomas menores do 38 ΡΕ1909759 que o diâmetro dos poros passam primeiro através do filtro. Este filtrado pode estar sujeito a filtração de fluxo tangencial através de um segundo filtro, possuindo um tamanho de poro menor do que o do primeiro filtro. 0 filtrado retido neste filtro é uma população de lipos-somas/complexado com limites de tamanho inferior e superior definidas pelas dimensões dos poros, respectivamente, do primeiro e segundo filtros.

Mayer et al. observaram que os problemas associados com o aprisionamento eficaz de agentes bioacti-vos ionizáveis lipofilicos, tais como, agentes anti-neo-plásicos, por exemplo, alcaloides de vinca, ou antra-ciclinas, podem ser aliviados pela utilização de um gradiente de iões transmembranares. Além da indução de uma maior absorção, tais gradientes de transmembrana pode também actuar no aumento da retenção do agente anti-infecioso na formulação lipossómica.

As formulações anti-infeciosas lipídicas têm um efeito anti-infecioso controlado e menor toxicidade permitindo uma administração menos frequente e um aumento no índice terapêutico. Em estudos pré-clínicos realizados em animais e em comparação com a tobramicina inalada (não lipossómica, ou à base de lípidos) no nível de dose equivalente, a amicacina lipossómica demonstrou ter, os níveis de fármaco no pulmão durante o período de tempo imediatamente após a administração até mais de 24 horas depois, variando de dois até várias centenas de vezes 39 ΡΕ1909759 superior à da tobramicina. Além disso, a amicacina com lipossoma manteve esses níveis durante muito mais de 24 horas. Num modelo animal concebido para imitar a infecção a pseudomonas observada em doentes com FQ, a amicacina lipossómica demonstrou eliminar significativamente a infecção nos pulmões dos animais, quando comparada com os aminoglicósidos livres. 0 surfatante pulmonar permite a expansão e a compressão dos pulmões durante a respiração. Isto é conseguido através do revestimento pulmonar com uma associação lipídica e proteica. 0 lípido é apresentado como uma monocamada com as cadeias hidrofóbicas dirigidas para o exterior. 0 lípido representa 80% do surfatante pulmonar, sendo a maior parte do lípido, fosfatidilcolina, 50% das quais é dipalmitoílfosfatidilcolina (DPPC) (Veldhuizen et al, 1998) . As proteínas do surfatante (SP), que têm as funções de manter a estrutura e facilitar tanto a expansão como a compressão do surfatante pulmonar tal como ocorre durante a respiração. Destes, SP-B e SP-C têm um comportamento especificamente lítico e podem lisar lipossomas (Hagwood et al, 1998;. Johansson, 1998). Este comportamento lítico poderia facilitar a dissolução gradual de lipossomas. Os lipossomas também podem ingerir directamente pelos macrófagos através da fagocitose (Couveur et al, 1991; Gonzales-Roth et al, 1991; Swenson et al, 1991). A absorção de lipossomas pelos macrófagos alveolares é outro meio através do qual a fármaco pode ser colocado no local enfermo. 40 ΡΕ1909759

Os lípidos utilizados preferencialmente para formar lipossomas ou formulações lipídicas para inalação são comuns nos lípidos endógenos observados no surfatante pulmonar. Os lipossomas são constituídos por camadas duplas que aprisionam o fármaco desejado. Estes podem ser configurados como vesículas multilamelares de bicamadas concêntricas com o fármaco encapsulado dentro ou do lípido das diferentes camadas ou no espaço aquoso entre as camadas. A presente invenção utiliza processos originais para criar formulações de lipossomas ou formulações anti-infeciosas lipídicas. Ambos os processos e os produtos destes processos fazem parte da presente invenção. 6.1 Método de infusão em linha

Numa forma de realização particularmente preferida, as formulações anti-infeciosas de lipossomas da presente invenção são preparadas através de um método de infusão em linha em que um fluxo de solução lipídica é misturado com um fluxo de solução do agente anti-infecioso em linha. Por exemplo, as duas soluções podem ser misturadas em linha dentro de um tubo de mistura precedido por um dispositivo de ligação em Y, conforme apresentado na Figura 8. Desta forma, o método de infusão em linha difere do método de infusão descrito anteriormente, onde a solução lipídica está infunsa como um fluxo numa solução com agente anti-infecioso a granel. Surpreendentemente, este método de infusão resulta em proporções inferiores de lípido em 41 ΡΕ1909759 relação ao fármaco e com eficácia de encapsulação mais elevada. O processo pode ser ainda melhorado através da optimização de parâmetros tais como, a taxa do fluxo, a temperatura, a concentração em agente anti-infecioso, e a adição de sal após o passo de infusão. 6.1.a Efeito do caudal

Os caudais individuais foram variados, enquanto se mantinha o caudal total a 800 mL/min. Para isso, foram utilizadas duas bombas separadas e reguladas para bombear a diferentes taxas. As soluções foram misturadas e colocadas em infusão durante 10 seg. num matraz contendo uma solução de NaCl de modo que a concentração final de NaCl foi de 1,5% e a concentração de etanol final não excedeu 30%. Após a mistura, fez-se passar uma alíquota de 1 mL por uma coluna de filtração em gel Sephadex G-75 para separar a amicacina livre da amicacina encapsulada. Uma fracção de 1 mL com maior densidade (determinado pela turbidez visual) foi recolhida para análise posterior. Os resultados estão apresentados na Tabela 1. Aumentando a proporção do caudal do lipido/amicacina resultou numa relação de L/F quase constante até 300/500 mL/min. Com outro aumento da taxa de lipidos, a relação L/F começou a aumentar e o tamanho de partícula também começou a ficar maior. Ao mesmo tempo, caudais de lipidos mais elevados resultou numa melhor recuperação de amicacina (eficácia de encapsulação), à medida que se adicionava maior massa de lípido. 42 ΡΕ1909759

Tabela 1. Efeito dos caudais na encapsulaçao da amicacina* (exemplos comparativos)

Caudais iriL/min Total de ΛΜΚ Lípido L/F να. AMK Recu- Lote AMC Lípido AMK mg/mL Livre % mg/mL Tamanho perada % 1 600 200 1,38 5,3 1,25 0,91 289 14,7 2 550 250 1,80 5,1 1,90 1,06 305 17,2 3 500 300 2,18 5,2 2,29 1,05 314 22,8 4 450 350 1,27 5,8 1,47 1,16 388 26,8 5 400 400 1,05 6,1 1,69 1,61 471 24,9 *Soluções de lípido e amicacina (AMK) foram mantidas a 40 °C. Solução de reserva de amicacina foi de 50 mg/mL. Foi adicionada a solução de NaCl a 10% antes da infusão para se obter 1,5% no final. O tempo de infusão foi fixado em 10 seg. Tubo de mistura de 10 cm; misturador em linha de 6 elementos posicionado a 0 cm,_ 0 Lote 3 com os caudais de lípido/amicacina de 300/500mL/min apresentou a melhor relação L/F e tamanho de partícula, associado à recuperação razoavelmente elevada de amicacina. Assim, optou-se por utilizar este caudal para todos os outros ensaios experimentais. A fim de reproduzir os resultados nas condições escolhidas foi preparado um lote adequadamente lavado (lote 6), utilizando a diafiltração, tal como apresentado na Tabela 2. Foi adicionado, antes da infusão, solução de NaCl a 10% ao matraz para preparar a concentração final de 2% (em comparação com 1,5% nos lotes da tabela 1). A relação L/F resultante (1,71), não foi tão boa como no lote 3 da Tabela 1 e o tamanho da partícula foi mais elevado. Este facto, pode ser devido a um efeito adverso devido à concentração elevada de NaCl em contacto com os lipossomas nas fases iniciais de formação de lipossomas. As amostras 43 ΡΕ1909759 separadas (lavadas), utilizando colunas de filtração em gel tendem a ter melhor relação L/F do que as lavadas por diaf iltração. Isso pode ter a ver com os diferentes graus de tensão aplicados nos ensaios de lipossomas, ou simplesmente as amostras separadas sobre a coluna de gel de filtração contendo uma fracção de lipossomas com melhor relação L/F, o que não representam o conjunto da população.

Tabela 2. Resumo dos lotes totalmente lavados. A variação dos parâmetros do processo foram: temperatura, concentração da solução de reserva de amicacina e outros (ver a Tabela 3 seguinte). Todos os lotes foram concentrados a concentrações praticamente no máximo, até atinjir a pressão de entrada de 10 PSI.

Lote Tarp.sc l/amc/p Beserva de J»fí mg/iriL Total de IMU mg/iriL JMC Livre % Lípido L/F VOL. de Tamanho SD de Tamanho % 6 40/40/30 50 36,1 2,7 61,8 1,71 392 43,4 8 50/RT/30 50 48,5 9,6 49,3 1,02 332 32,0 9 50/RT/30 50 41,6 5,1 43,2 1,04 359 34,4 10 50/RT/30 50 53,1 10,2 34,4 0,65 350 28,6 11 50/RT/30 40 20,7 4,8 46,9 2,27 407 35,9 12 50/RT/30 40 81,0 1,9 49,4 0,61 341 33,0 13 50/RT/30 30 68,6 1,7 62,5 0,91 311 22,4 14 50/RT/30 40 79,6 1,6 47,8 0,60 346 37,2 15 50/RT/30 40 71,3 2,0 42,3 0,59 353 33,4 16 30/30/30 40 61,9 6,1 51,5 0,83 369 28,4 17 30/30/30 40 73,8 2,4 57,2 0,77 362 32,6 18 30/30/30 40 74,4 2,3 54,0 0,73 549 61,7 *A 3 a coluna representa as temperaturas das soluções de Lípido e Amicacina imediatamente antes da infusão e a temperatura durante a lavagem (diafiltração). ΚΓ = temperatura ambiente. "VOL de Tamanho" é o volume de tamanho de partícula ponderada. 44 ΡΕ1909759

Tabela 3. Condições do processo para os lotes de 1-18.* *As soluções de lípidos e amicacina estiveram em infusão numa proporção de 300/500 mL/min durante 30 s (exemplos 6-10) ou 20 s (exarplos 11-18). Foi adicionada, solução aquosa adicional (NaCl ou água) (ccmo partes relativas a 500 partes do volume de amicacina)._ lote Tiiao de mistura em cm Posição do misturador em cm 1S6C1 adicionado Perdições de lavagem reserva % Partes em Volume Taipo de infusão N=d % Ia lavagem 1-5 10 0 VHR VAR antes 1,5 (Coluna de Seph) 6 10 0 10 200 antes 1,5 diafiltração 7 10 5 10 100 antes 1,5 (Coluna de Seph) 8 10 5 10 150 durante 1,5 diafiltração 9 10 5 10 150 durante 1,5 diluição 2x 10 10 5 10 100 após 5' 1,5 diluição 2x 11 10 5 10 150 inediatamente depois 1,5 diluição 2x 12 10 5 HO 180 após 20" 1,5 diluição 2x 13 10 5 HáO 180 após 30" 1,5 diluição 2x 14 10 5 H£> 180 após 30" 1,5 diafiltração 15 10 5 1,5 180 após 30" 1,5 diafiltração 16 60 NO 0,9 180 durante 0,9 diafiltração 17 60 NO 1,5 180 durante 1,5 diafiltração 18 60 0 1,5 180 durante 1,5 diafiltração 6.1.b Efeitos da temperatura do processo.

Foram mantidas as mesmas condições utilizadas no lote 3, excepto que a quantidade de solução de NaCl adicionada foi menor, originando a concentração final de 1,0%. A solução foi novamente adicionada antes do inicio da infusão, porque era difícil fazer a adição durante a infusão devido ao curto período de tempo da infusão. Além 45 ΡΕ1909759 disso, durante a infusão o misturador em linha foi deslocado para a extremidade do tubo de mistura sob a pressão do fluxo. A posição do misturador foi de 5 cm desde a extremidade dianteira do tubo em vez dos 0 cm para o lote 3. Este facto pode ser importante, quando a proporção de L/F obtida nas mesmas condições de temperatura a 40/40°C no lote 20 foi de 0,55, quase metade do que no lote 3. Comparando o encapsulamento de amicacina a diferentes temperaturas de infusão, pode verificar-se, surpreendentemente, que as temperaturas mais baixas deram a melhor proporção L/F. Nas temperaturas ensaiadas, as temperaturas das proporção de lípido/amicacina, a 30/30°C e 50/RT deram proporções semelhante de L/F, de 0,32 e 0,37. Mais uma vez, tal como nos lotes 1-5, os números a partir dessas amostras lavadas por filtração em gel foram baixas, talvez menores do que se os lotes tivessem sido lavados por diafiltração.

Tabela 4. Efeito da temperatura na encapsulação da amicacina . *

Lote Tsrp.2C Totalde AMK Livre Lípido L/F VOL. de Lípido JMK AMK nçr/nfL % irg/iriL Tamanho 19 30 30 4,88 2,8 1,54 0,32 278 20 40 40 3,62 1,5 1,98 0,55 335 21 50 50 3,50 1,8 2,74 0,78 309 22 50 RT 5,27 2,9 1,93 0,37 342 * As soluções de lípidos e amicacina estiveram em infusão numa proporção de 300/500 mL/min durante 10 s. A solução de reserva de amicacina foi de 50 rrrj/rriL. A solução de NaCl a 10% foi adicionada antes da infusão para obter uma concentração final de 1,0%. O tubo de mistura ccm 10 cm, misturador gn linha de 6 elementos posicionado a 5 cm._ 46 ΡΕ1909759

Em experiências separadas, verificou-se que a mistura de etanol a 90% e água a qualquer uma das temperaturas de 30°C e 30°C ou 50°C e 22°C, respectivamente, resultou numa temperatura final semelhante próxima dos 36°C. Este resultado sugere que a temperatura da mistura final, ao contrário da dos componentes individuais é importante para a encapsulação da amicacina. As temperaturas de 50°C/RT foram utilizadas nos exemplos 6-15. Nos exemplos 16-18 foram utilizadas temperaturas de 30°C e 30°C para os dois fluxos com resultados comparáveis, embora se tenha observado a encapsulação da amicacina um pouco menor. 6.1.c. Efeito da adição do volume aquoso após a infusão

Em seguida focou-se a atenção nos passos para a adição da solução de NaCl e o processo de lavagem. Os parâmetros do processo foram variadas em várias direcções. Logo após o passo de infusão com caudais de 300/500, a concentração de etanol na mistura atingiu 34%. A amicacina tem solubilidade limitada a esta concentração (ver Figura 9) .

No caso de se começar com solução de reserva de amicacina de 50 mg/mL, em seguida, após se misturar com a solução de lipido não haverá mais do que 30 mg/mL de amicacina totais, em que, pelo menos metade (15 mg/mL) é amicacina livre, assumindo que a eficácia de encapsulação é 47 ΡΕ1909759 de 50%. Que é superior ao limite de solubilidade, que é de 34% em etanol. Uma solução possível para este problema é adicionar mais água ao reactor com a mistura lípido/amicacina, reduzindo, assim, tanto o etanol como a concentração de amicacina. Por exemplo, a adição de 200 partes de água (ou solução de NaCl) para 800 partes de lípido/amicacina reduziria o etanol para 27% (Figura 9). O que faz com que a amicacina seja solúvel a 15 mg/mL ou mesmo superior, dependendo da temperatura.

Além disso, a adição de NaCl pode estabilizar as condições osmóticas. Quando os lipossomas são formados e a amicacina é encapsulada a uma concentração interna de 200-300 mg/mL, existe apenas cerca de mais ou menos 15 mg/mL de amicacina não encapsulada. Na ausência de soro fisológico que iria criar um desequilíbrio osmótico, a qual por sua vez pode levar a fugas de amicacina. A adição de 150 partes de NaCl a 10% para 800 partes de lípido/amicacina irá resultar em cerca de 1,5% de concentração final de NaCl (lipossomas externos).

Uma série de lotes foram produzidos onde foram adicionadas diferentes quantidades de solução de NaCl (ou água em alguns lotes) a tempos diferentes em relação à infusão (ver Tabela 5, compilada a partir das Tabelas 2 e 3). A partir da tabela, pode ser observada uma tendência geral, que conduz às seguintes conclusões: São necessários alguns intervalos de tempo 48 ΡΕ1909759 entre a infusão e a adição do volume aquoso para obter proporções de L/F inferiores (no caso de se utilizar um tubo de mistura curto). Os lotes 6- 15 que tiveram um intervalo de 20 s ou mais, tiveram menor proporção L/F. Uma explicação possível é que os lipossomas não são totalmente formados imediatamente após a mistura dos fluxos. Quando é utilizado um tubo de mistura mais longo (lotes 16-18), o que permite um tempo de mistura superior, não é necessário intervalo de tempo. - Adicionar uma solução de NaCl com concentração elevada para obter o equilíbrio osmótico, na verdade, não ajuda a reter a amicacina. De facto, a adição de água pura, com um intervalo de tempo adequado resultou numa menor L/F e menor concentração total de amicacina. - Adicionar 100 partes de NaCl a 10% (lote 9) 5 minutos após a infusão forneceu uma proporção competitiva de L/F mas não forneceu uma boa concentração de amicacina total. Pode ser porque o NaCl, quando presente nas fases iniciais, com concentrações relativamente elevadas de etanol, conduz a um aumento da agregação e da viscosidade.

Tabela 5. Papel do volume aquoso e da concentração de NaCl adicionados à mistura de lípido/amicacina para ajustar a concentração de etanol. Nem todas as variáveis estão apresentadas; ver Tabelas 2 e 3. 49 ΡΕ1909759 lote Solução de NaCl adicionado Total de L/F V3L. de reserva de AMC mg/mL Stock % Partes em Volixne Taipo para a infusão AMC mg/mL Tamanho rm 6 50 10 200 antes 36,1 1,71 392 8 50 10 150 durante 48,5 1,02 332 9 50 10 150 durante 41,6 1,04 359 10 50 10 100 após 5' 53,1 0,65 350 11 40 10 150 imediatamen te após 20,7 2,27 407 12 40 h2o 180 após 20" 81,0 0,61 341 13 30 h2o 180 após 30" 68,6 0,91 311 14 40 h2o 180 após 30" 79,6 0,60 346 15 40 1,5 180 após 30" 71,3 0,59 353 16 40 0,9 180 durante 61,9 0,83 369 17 40 1,5 180 durante 73,8 0,77 362 18 40 1,5 180 durante 74,4 0,73 549 6.1.d. Efeito da solução de reserva do agente anti-infeccioso

Foi verificado anteriormente, que a utilização de 50 mg/mL da solução de reserva de amicacina produziu o melhor encapsulamento. A redução da concentração da solução de reserva de amicacina para 40 mg/mL aumentou a relação L/F quando utilizado em processos convencionais. Com o processo de infusão em linha de dois fluxos, a concentração de etanol atinge níveis mais elevados, de modo que a actual concentração de 50 mg/mL de amicacina pode não ser a concentração óptima.

A Tabela 6 resume o efeito da utilização de várias concentrações da solução de reserva de amicacina. A 50 ΡΕ1909759 concentração de 40 mg/mL originou valores de L/F comparáveis ou superiores e até melhorou a recuperação de amicacina. Utilizando menos amicacina em relação a uma quantidade constante de lipido, e proporcionando uma L/F semelhante, resultou numa percentagem de encapsulação superior (lote 12). Reduções ainda maiores da concentração da solução de reserva de amicacina até 30 mg/ml resultou num ligeiro aumento da L/F, embora a recuperação ainda seja impressionante (lote 13).

Tabela 6. Concentração da solução de reserva de amicacina pode ser reduzida, enquanto melhora a eficácia. A recuperação de amicacina é calculada com base na L/F obtida e assumindo que a recuperação de lipido é 100%.

Lcte Solução de reserva de AMK nig/nfL Total de AMK irg/iriL Mfí Livre % Lipido mg/iriL L/F V3L. Tamanho JMí Recuperada % 10 50 53,1 10,2 34,4 0,65 350 37,0 12 40 81,0 1,9 49,4 0,61 341 51,2 13 30 68,6 1,7 62,5 0,91 311 45,7 14 40 79,6 1,6 47,8 0,60 346 52,0 A redução da concentração da solução de reserva de amicacina tem outra implicação. Reduz a concentração da amicacina livre numa mistura de lípido/amicacina após a infusão, permitindo que permaneça solúvel em concentrações superior de etanol. Assumindo que os lipidos e a amicacina estão misturados na proporção de 300/500, a solução de reserva de amicacina é de 50 mg/mL, e a eficácia da encapsulação é de 37%, depois, a amicacina livre inicial 51 ΡΕ1909759 seria de cerca de 20 mg/mL. Da mesma forma, 40 mg/mL de solução de reserva de amicacina com 52% de encapsulados resultaria em cerca de 12 mg/mL de amicacina livre. 30 mg/mL de solução de reserva de amicacina, com 46% de encapsulação resultaria em cerca de 10 mg/mL de amicacina livre. 7. Relação do Lípido/Fármaco Há várias formas de aumentar a retenção dos agentes anti-infeciosos (por exemplo, aminoglicósidos, tais como, a amicacina, tobramicina, gentamicina) em lipossomas. Uma maneira é preparar lipossomas muito grandes(>lpm), quando é grande o volume retido por quantidade de lípidos. Esta abordagem para alcançar uma proporção menor de L/F não é utilizada para inalação (nebulização) de lipossomas, porque 1) tensão de cisalhamento durante a nebulização tende a romper os lipossomas de uma forma dependente do tamanho em que os lipossomas maiores (>0,5pm) sofrem maior liberação e 2) as dimensões das gotas menores necessárias para uma boa deposição pulmonar são em si menores do que cerca de 3 pm. Assim, para inalação, é desejável manter o tamanho dos lipossomas tão pequeno quanto possível para evitar excesso de libertação. Actualmente, o diâmetro médio dos lipossomas aqui descritos é inferior a cerca de 0,4 μm (ver Tabela 4).

Outra abordagem para diminuir a L/F é a utilização de lípidos carregados negativamente. Os aminoglicó- 52 ΡΕ1909759 sidos listados anteriormente são altamente carregados positivamente com 4-5 aminas por composto. Normalmente, os sais de sulfato destes aminoglicósidos são utilizados em formulações terapêuticas. Em conjunto com o caráter multi-catiónico surgem fortes ligação com lipossomas carregados negativamente. Isto resulta numa maior retenção durante a formação de lipossomas. 0 objectivo das formulações anti-infeciosas é proporcionar libertação prolongada para o ambiente pulmonar. A eliminação rápida dos lipossomas por absorção de macrófagos seria contrária a isso. Tem sido bem documentado que os lipossomas carregados negativamente têm um grau de absorção por macrófagos muito mais elevado do que os lipossomas neutros. Portanto, é desejável a utilização de lipossomas neutros.

Um grupo de técnicas que permitem a retenção muito elevada de fármacos em pequenos lipossomas estão baseadas na carga de gradiente onde um gradiente de pH, gradiente de sulfato de amónio ou gradiente de sulfato de magnésio são utilizados para carregar a fármaco de aminas em lipossomas: ver Patentes dos EUA N.°s: 5 578 320; 5 736 155; 5 837 279; 5 922 350 (gradiente de pH); 5 837 282; 5 785 987 (gradiente de sulfato de Mg-) e 5 316 771 (gradiente de sulfato de amónio). Estas técnicas só funcionam para membrana permeáveis a aminas (mono-aminas, onde a forma neutra é permeável tal como a doxorrubicina e daunorrubicina). A carga de gradiente não irá funcionar para certos agentes anti-infeciosos, tais como, aminoglicósidos uma vez que são impermeáveis (demasiado grandes e também altamente carregados). 53 ΡΕ1909759

Todos os processos aqui descritos podem ser facilmente adaptados para grande escalas, produção asséptica. 0 tamanho final dos lipossomas pode ser ajustado, modificando a concentração da composição lipídica, excipientes, e os parâmetros de processo. A relação do lipido em relação ao fármaco utilizando os processos da presente invenção é de cerca de 0,75:1 ou inferior, ou cerca de 0,5:1 ou inferior. Além disso, é reduzida a percentagem de anti-infecioso livre, após o presente produto ser dialisado, durante um período específico. 8. Resultados 8.1. Barreiras de Biopelículas nas Infeções

Pulmonares

Um obstáculo no tratamento de doenças infeciosas, tais como a infeções a Pseudomonas aeruginosa, a principal causa de doença crónica em doentes com fibrose quística é a penetração do fármaco no interior da expectoração/barreira de biopelícula à superfície das células epiteliais (Figura 1). Na Figura 1, as formas de rosca representam uma formulação lipossómica anti-infeciosa, o símbolo "+" representa o agente anti-infecioso livre, o símbolo a mucina, alginato e DNA, e o símbolo de barra a cheio representa a Pseudomonas aeruginosa. Esta barreira é 54 ΡΕ1909759 composta tanto por colónias de P. aeruginosa como por planctónico incorporado em alginato ou exopolissacárido de bactérias, assim como, ADN a partir de leucócitos danificados e mucina a partir de células epiteliais do pulmão, todos possuindo uma carga liquida negativa (Costerton et al., 1999) . Esta carga negativa liga-se e impede a penetração de fármacos carregados positivamente, tais como, aminoglicósidos, tornando-os biologicamente ineficazes (Mendelman et al., 1985). A encapsulação dos agentes anti-infeciosos nas formulações de lipossomas ou lipidos poderia proteger ou proteger parcialmente os agentes anti-infeciosos da ligação não especifica à expectoração/biopelicula, permitindo as formulações de lipidos ou de lipossomas (com aminoglicósido encapsulado) penetrarem (Figura 1). A amicacina tem demonstrado possuir um elevado grau de resistência às enzimas bacterianas, proporcionando, assim, uma maior percentagem de isolados clínicos susceptíveis, em relação ao encontrado noutros aminoglicósidos, incluindo a tobramicina e gentamicina (Price et al., 1976) . Em particular, os isolados de P. aeruginosa são muito mais sensíveis à amicacina do que outros aminoglicósidos, sem apresentarem resistência cruzada (Damaso et al., 1976). A libertação prolongada e o efeito de depósito das formulações lipossómicas de amicacina é claramente observado na Figura 2. Neste estudo os ratos receberam 55 ΡΕ1909759 tobramicina por administração intratraqueal e intravenosa. Os ratos receberam também formulações de lipossomas contendo amicacina por via intratraqueal na mesma dose (4 mg/rato). Os resultados apresentados demonstram que é apenas com a formulação lipossómica de amicacina que é atingida uma libertação prolongada e o efeito de depósito. De facto, 24 horas após a administração, apenas as formulações lipossómicas de amicacina demonstram níveis significativos de fármaco ao nível dos pulmões do animal, enquanto que, as duas formulações de tobramicina revelaram níveis insignificantes, acredita-se que seja devido principalmente, à absorção sistémica rápida. Esta, se for maior do que um aumento de cem vezes de aminoglicósido no pulmão para as formulações lipossómicas anti-infeciosas apoia a ideia de uma formulação lipossómica anti-infeciosa de libertação prolongada que pode ser administrada com uma frequência significativamente menor do que formulação actualmente aprovada, TOBI®, a (uma solução de tobramicina por inalação fabricada por Chiron Corporation, Ameryville, CA) .

Além disso, a presença de uma expectoração/bio-película impede a penetração de aminoglicósidos livres devido à ligação dos agentes anti-infeciosos à sua superfície (Figura 1) . Portanto, são necessárias doses em excesso de 1 000 mg de tobramicina/grama de tecido pulmonar para demonstrarem um efeito terapêutico em doentes com Fibrose quística. Este facto é ultrapassado com formulações lipossómicas de amicacina. Assim, o nível terapêutico do 56 ΡΕ1909759 fármaco é mantido durante um período de tempo mais longo, nas formulações lipossómicas de amicacina quando comparado com a tobramicina livre. Este facilitação da ligação e penetração, também poderia ser um meio pelo qual as formulações lipossómicas de amicacina poderiam reduzir significativamente a resistência bacteriana habitualmente observada a ser desenvolvida quando os agentes antibacte-rianos estão presentes in vivo a níveis abaixo da concentração mínima de inibição. 8.2. Farmacocinética A farmacocinética de amicacina foi determinada em ratos após administração intratraqueal (IT) de tobramicina livre ou de formulações lipossómicas de amicacina. Estes dados foram comparados com a distribuição obtida nos pulmões após uma injecção de tobramicina livre na veia da cauda. Em todos os casos, foi administrada uma dose de 4 mg/rato. Como pode ser observado na Figura 2, um depósito muito maior de aminoglicósido pode ser administrado por TI em comparação com a via injectável. 0 efeito de depósito da tecnologia lipossómica anti-infeciosa também é demonstrada na medida em que, em comparação com a tobramicina administrada por IT ou IV, um aumento superior a cem vezes do fármaco nas formulações lipossómicas de amicacina permanece ainda nos pulmões 24 horas após a administração. Assim, o nível terapêutico do fármaco é mantido durante um período de tempo mais longo, nas formulações lipossómicas de amicacina em comparação com a tobramicina livre. 57 ΡΕ1909759 A ligação de aminoglicósidos à expectoração de doentes com fibrose quística é uma preocupação, particularmente se essa ligação reduzir a bioactividade do agente anti-infecioso (Hunt et al., 1995). Para determinar se as formulações lipossómicas de amicacina podem reter a actividade biológica ao longo de um período prolongado de tempo, foram administradas, a ratos normais, formulações lipossómicas de amicacina por instilação intratraqueal. Seguiu-se a sua remoção às 2 ou 24 horas por meio de uma lavagem brônquica alveolar (BAL) para determinar a actividade biológica. As amostras foram concentradas por ultrafiltração, seguida por filtração (0,2 microns), para remover a contaminação de micróbios pulmonares. A concentração de amicacina foi determinada utilizando um instrumento TDX e determinada a actividade biológica utilizando um ensaio de diluição em meio líquido de Mueller Hinton (Pseudomonas aeruginosa) . Os resultados estão apresentados na Tabela 7.

Tabela 7. Os resultados apresentam as formulações lipossómicas de amicacina que mantêm a actividade biológica ao longo de um prolongado período de tempo.

Tempo Amicacina em Amicacina no MIC (horas) BAL (pg/mL) filtrado (pg/mL) (pg/mL) 2 160 119 1,9 24 73 32 4,0 58 ΡΕ1909759

Tal como apresentado na tabela anterior, o filtrado recuperado da formulação lipossómica de amicacina foi capaz de eliminar a P. aeruginosa num ensaio em meio liquido de Mueller Hinton, mesmo depois de 24 horas com uma MIC (contagem microbiológica) de 4. Às 2 horas foi obtido uma MIC de 2, o qual é similar ao obtido com a amicacina complexada com lipossomas de reserva filtrada. Assim, a formulação lipossómica de amicacina ainda estava activa no pulmão após 24 horas. Às 24 horas a tobramicina livre na mesma dose não foi detectável numa BAL. Isto indica que não só a formulação lipossómica anti-infeciosa é retida no pulmão, mas também está livremente disponível para penetrar numa expectoração/biopelícuia ao longo do tempo. Estes resultados associados aos factos evidenciados nas Figuras 2 e Tabela 9 (seguinte), de que as formulações lipossómicas de amicacina libertam o agente anti-infecioso livre ao longo do tempo, mantendo níveis elevados de agente anti-infecioso nos pulmões, apoia o raciocínio de que este sistema pode produzir um efeito anti-infecioso prolongado ao longo do tempo. Este efeito deveria revelar-se significativo na redução da bio-carga de Pseudomonas e ainda no desenvolvimento de resistência devido aos níveis mínimos de agente anti-infecioso.

Como uma demonstração in vitro da liberação lenta da formulação lipossómica de amicacina e o seu efeito anti-infecioso prolongado, a formulação foi incubada na expecto-ração de doentes com Doença Pulmonar Obstrutiva Crónica (DPOC), contendo Pseudomonas mucóides PA01. A formulação 59 ΡΕ1909759 lipossómica de amicacina foi também incubada em alginato contendo Pseudomonas mucóides PA01. Em ambos os casos foi observado o aumento da eliminação prolongada de Pseudomonas ao longo do tempo, conforme apresentado na Tabela 8.

Tabela 8. A eliminação de Pseudomonas, in vitro, ao longo do tempo.

Ensaio na Ejqpectoração/ALginato in vitro (% da scbrevivência de Pseudcmonas nucóides PA01) Tatpo de incubação a 37% 1 h 3 h 6 h 24 h Cone. de Amicacina (pg/iriL) Lip-An-15 Expectoração 81 15 22 <1 8 Lip-An-15 Alginato 100 59 1 <1 10

As curvas de eliminação clássicas não se aplicam na tecnologia de formulação lipossómica anti-infeciosa, porque as formulações de lipossomas apresentam uma libertação lenta do agente anti-infecioso, com um efeito anti-infecioso aumentado. A formulação lipossómica protege a amicacina da expectoração e/ou alginato até à sua liberação. Com o tempo, é observada a eliminação total, de acordo com o modelo do efeito anti-infecioso de libertação prolongada sem interferência ou inativação do agente anti-inf ecioso . A eficácia das formulações lipossómicas de amicacina foi estudada utilizando um modelo de infecção pulmonar crónica (Cash et al., 1979), onde a P. aeruginosa, 60 ΡΕ1909759 incorporada numa matriz de grânulos de agarose foi instilado na traqueia de ratos. Este modelo animal de Pseudomonas mucóide foi desenvolvido para se assemelhar às infeções a Pseudomonas observadas em doentes com FQ. Algumas das correlações clinicas para FQ incluem: uma patologia pulmonar semelhante, o desenvolvimento de doenças complexas auto-imunes, e uma conversão para o fenótipo mucóide da estirpe P. aeruginosa (Cantin e Woods, 1999). Os pulmões de ratos foram infectados com mais de 107 CFU de Pseudomonas mucóide (estirpe PA01) obtida a partir de isolado de um doente com FQ, e subsequentemente tratado com (a) aminoglicósido livre, (b) o veiculo lipidico sozinho como controlo sem fármaco, e (c) a formulação lipossómica de amicacina. Além disso, as formulações foram testadas primeiro em relação à capacidade de eliminar a P. aeruginosa in vitro em placas de Kirby-Bauer modificadas. também foi Várias formulações lipossómicas de amicacina foram ensaiadas com base tanto em diferentes composições de lípidos ou parâmetros de fabrico, resultando em diferentes zonas de eliminação em experiências realizadas in vitro. Esta experiência foi desenvolvida para determinar o aumento da eficácia obtida com as formulações lipossómicas de aminoglicósidos sobre o aminoglicósido livre. As composições lipídicas do branco de controlo, foram comparadas duas formulações lipossómicas de amicacina diferentes e de amicacina livre e de tobramicina livre com as mesmas concentrações de aminoglicósido em relação às formulações lipossómicas anti-infeciosas. Além disso, 61 ΡΕ1909759 administrado uma dose 10 vezes superior de amicacina livre e uma dose 10 vezes mais elevada de tobramicina livre. Foi administrada diariamente por via IT durante sete dias. Os resultados (Figura 3) indicam que a amicacina lipossómica nas duas formulações (que diferem na composição lipidica) apresentaram uma redução significativa nos níveis de CFU e foram melhores na redução de CFU do que a amicacina livre ou a tobramicina livre em doses 10 vezes mais elevadas. Na Figura 3, lip-An-14 é DPPC/Colesterol/DOPC/DOPG (42:45:4:9) e 10 mg/mL de amicacina, Lip-An-15 é DDPC/Colesterol (1:1) também a 10 mg/ml. Todas as proporções lipído-fármaco e lipído-lipído aqui referidas estão em peso por peso. A experiência seguinte (Figura 4), foi realizada para demonstrar as capacidades anti-infeciosas prolongadas e libertação lenta das formulações lipossómica amicacina. A posologia foi de dois em dois dias durante 14 dias, ao contrário da posologia diária durante sete dias como nas experiências anteriores. Os resultados indicam que a amicacina lipossómica nas duas formulações (que diferem na composição lipidica) eram de 10 a 100 vezes mais potentes (maior capacidade para reduzir os níveis de CFU) do que a amicacina livre ou tobramicina livre. Uma dose diária no ser humano de 600 mg de TOBI® (uma solução de inalação de tobramicina produzida por Chiron Corporation, Ameryville, CA), ou cerca de 375 mg/m2, corresponde a uma dose diária em ratos de 9,4 mg. Assim, os resultados podem estar directamente correlacionados com uma melhoria de 10 a 100 vezes na eficácia no ser humano. Deve notar-se que uma 62 ΡΕ1909759 redução de dois log é o melhor que pode ser observado neste modelo. Uma redução de 100 vezes na P. aeruginosa nos ensaios de expectoração tem sido correlacionada com a melhoria da função pulmonar (Ramsey et al., 1993). A libertação prolongada das formulações lipossómicas de amicacina indicam que pode ser utilizada uma dose mais baixa e/ou a posologia menos frequente para se obter uma grande redução no crescimento bacteriano em comparação com o que pode ser obtido com o aminoglicósido livre. A eficácia da formulação lipossómica de amicacina foi estudada num modelo de infecção pulmonar crónica em que a P. aeruginosa foi incorporada numa matriz de agarose em grânulos, que foi instilado por via traqueal em ratos Sprague/Dawley. Três dias depois a amicacina livre ou amicacina lipossómica foi doseada diariamente (Figura 3) ou em dia sim dia não (Figura 4) a 1 mg/rato ou 10 mg/rato de um determinado aminoglicósido ou 1 mg/rato de amicacina lipossómica, bem como, com os lipossomas do branco (veiculo lipidico) como o controlo, com cinco ratos por grupo.

Foram analisados os pulmões de ratos homogeneizados (congelados), após o ensaio de 14 dias para determinar o teor de aminoglicósidos e a atividade. As análises química e clínica foram realizadas utilizando um instrumento TDX enquanto o bioensaio foi realizado através da medição das zonas de inibição sobre placas de agar incorporadas com Bacillus subtilis. Os resultados estão apresentados na Tabela 9: 63 ΡΕ1909759

Tabela 9: Resultados dos pulmões de ratos, tratados com a formulação lipossómica de amicacina, infectados com P. aeruginosa.

Etornulação Bioensaio (micrograma/mL) Ensaio clínico (ndcrograma/mL) Lin-An-14 (1 mg/rato) 9,5 9,1 Lin-An-15 (1 mg/rato) 21,5 18,4 Amicacina livre (10 mg/rato) nd 2,0 Tobramicina livre (10 mg/rato) nd 1,4

Os pesos do fármaco são para o fármaco normalizado na ausência de qualquer forma de sal.

Os resultados da Tabela 10 indicam que o aminoglicósido está presente e activo nas duas formulações lipossómicas anti-infeciosas, enquanto que praticamente o aminoglicósido livre não é detectado, mesmo em doses 10 vezes mais elevadas. Estes novos resultados estabelecem as características de libertação prolongada de formulações lipossómicas anti-infeciosas, e também confirma que o agente anti-infecioso que permanece, ainda está ativo. Das formulações anteriores apenas a tobramicina livre (0,1 micrograma/mL) não apresentou quaisquer níveis detectáveis de aminoglicósido ao nível renal. A libertação prolongada e o efeito de depósito da formulação lipossómica de amicacina está ainda demonstrada na Figura 5. Os ratos foram infectados com uma infeção 64 ΡΕ1909759 pulmonar crónica onde a P. aeruginosa estava incorporada numa matriz de agarose em grânulos, que foi instilado por via traqueal, utilizando os mesmos grânulos utilizados nos estudos de eficácia. Foi em seguida administrada aos ratos a tobramicina livre ou a amicacina lipossómica (formulação Lip-An-14), por administração intratraqueal com a mesma dose (2 mg/rato). Os resultados, medidos em microgramas de agente anti-infecioso por grama de tecido pulmonar ao longo do tempo, demonstraram que o agente anti-infecioso lipos-sómico apresenta uma libertação prolongada e efeito de depósito, enquanto a tobramicina livre não apresentou quaisquer níveis detectáveis nos pulmões depois de 24 horas, acredita-se que é devido principalmente, à absorção sistémica rápida. Esta, se for maior do que um aumento de cem vezes de agente anti-infecioso no pulmão para as formulações lipossómicas de amicacina num rato infectado apoia a ideia de um anti-infecioso lipossómico de libertação prolongada que pode ser administrada com uma frequência significativamente menor do que formulação actual-ente aprovada, TOBI®, a (uma solução de tobramicina por inalação fabricada por Chiron Corporation, Ameryville, CA) . A farmacocinética de amicacina foi determinada em ratos após a administração intratraqueal (IT) de tobramicina livre ou de amicacina lipossómica. Foi administrada uma dose de 2 mg/rato. 0 efeito de depósito da tecnologia lipossómica anti-infeciosa é demonstrada na medida em que, em comparação com a tobramicina livre administrada por IT, 65 ΡΕ1909759 um aumento maior do que cem vezes no fármaco em relação à amicacina lipossómica ainda permanece nos pulmões infectados 24 horas após a administração. Assim, o nível terapêutico da fármaco é mantido durante um longo período de tempo, nas formulações de lipossomas, em comparação com a tobramicina livre. A Figura 7 apresenta notáveis tempos de permanência e acumulação de quantidades eficazes do agente anti-infecioso nos pulmões, um resultado que estabelece que podem ser utilizadas posologias com administrações relativamente pouco frequentes. Cada dose é de 4 horas através da inalação (no rato, 3 ratos por grupo, como anteriormente) das formulações de amicacina lipossómica nebulizadas (DPPC/Colesterol, 1:1) a 15 mg/mL de amicacina. As doses foram administradas no dia um; no dia um, três e cinco; ou dia um, dois, três, quatro e cinco. Os ratos fornecendo uma determinada barra de dados foram sacrificados após a dosagem respectiva da barra de dados. A formulação é preparada como no Exemplo.

Agentes anti-infeciosos semelhantes podem ser utilizados no tratamento de infeções intracelulares, tais como o carbúnculo pulmonar e tularémia. No carbúnculo pulmonar os esporos do carbúnculo atingem os alvéolos num aerossol. Os esporos inalados são ingeridos por macrófagos nos alvéolos pulmonares e transportados para os nódulos linfáticos da região traqueobrônquica ou nódulos linfáticos 66 ΡΕ1909759 mediastínicos através dos vasos linfáticos (Pilha et al, 1998, Gleiser et al, 1968). 0 macrófago é central em ambos os padrões de infeção e o principal contribuinte de autodestruição do hospedeiro no carbúnculo sistémico (por inalação). Adicionalmente às suas propriedades de libertação prolongada e direcionamento, a tecnologia de formulação lipossómica anti-infeciosa pode aumentar a absorção celular, e pode utilizar os macrófagos alvéolares e células epiteliais do pulmão na orientação e distribuição de fár-macos. Acredita-se que a posse destas características vai facilitar o tratamento destas infeções intracelulares, cujas infeções ocorrem nos pulmões e são transportadas pelos macrófagos. Mais importante, estas caracteristicas deveriam tornar o agente anti-infecioso mais eficaz do que o agente anti-infecioso lipossómico deveria ser fagocitado pelas próprias células contendo a doença. 0 agente anti-infecioso seria libertado intracelularmente de uma forma direcionada, atacando assim a infecção antes que ela seja disseminada. 0 fármaco encapsulado pode ser um medicamento já aprovado como a ciprofloxacina, tetraciclina, eritromi-cina ou amicacina. Têm sido desenvolvidas formulações li-possómicas de ciprofloxacina.

Num estudo, este composto foi administrado a ratinhos e comparada a ciprofloxacina livre administrada por via intratraqueal e a ciprofloxacina livre administrada por via oral, com todos os três compostos administrados na mesma dose (Figura 6) . A dose para cada ratinho foi de 15 67 ΡΕ1909759 mg/kg, com três ratinhos por grupo. A ciprofloxacina lipossómica estava em DPPC/Colesterol (9:1), a 3 mg/mL, de ciprofloxacina, sendo a formulação produzida como no

Exemplo. A proporção lipido-fármaco foi de 12,5:1 em peso. Em comparação com a ciprofloxacina administrada por via oral, a ciprofloxacina lipossómica estava presente nos pulmões dos ratinhos numa quantidade acima das duas ordens de grandeza superior à ciprofloxacina livre. Além disso, apenas a ciprofloxacina lipossómica apresentou níveis de fármaco no pulmão após 24 horas, enquanto que o fármaco administrado por via oral não era detectado num período inferior a duas horas. Estes dados apoiam a utilização de formulações lipossómicas de ciprofloxacina e outros agentes anti-infeciosos, tal como aminoglicósidos, tetraciclinas e macrólidos para o tratamento e para a prevenção profiláctica de doenças intracelulares utilizadas por bioterroristas. 8.3. Parâmetros de Llpossomas

Os lípidos para ser utilizados são dissolvidos em etanol para formar uma solução lípido-etanol. A solução lípido-etanol infunde-se numa solução aquosa ou etanólica contendo a molécula do agente bioactivo a ser encapsulado. Os lípidos formam espontaneamente vesículas. A Tabela 10 descreve os parâmetros da formulação lipossómica anti-infeciosa onde os lípidos são DPPC e colesterol. 68 ΡΕ1909759

Tabela 10. Parâmetros adicionais da formulação lipossómica anti-infeciosa.

Amicacina Liposscmica (DPPC/Colesterol) Lote n° [Amicacina Total] mg/mL [Lipido Total]* mg/mL % da Amicacina Total que está encapsulada L/F (w/w) ** Diâmetro médio do Lipossama (pm) 1 14,7 44,8 96,7 3,2 — 2 21,4 71,3 98,1 3,4 0,36 3 18,5 46,6 90,2 2,8 0,27 4 9,4 40,6 95,0 4,5 0,34 5 15,8 52,3 97,7 3,4 0,27 6 20,7 31,8 95,5 1,6 0,25 7 20,6 40,0 98,6 2,0 0,25 8 19,9 40,7 98,3 2,1 0,28 9 20,9 40,5 98,1 2,0 0,28 * Liposscma de DPPC/colesterol ara que a razao molar de EEFC/Golesterol é aproximadarnente 1:1. ** Apenas a quantidade encapsulada de amicacina foi considerada no cálculo L/F.

Outras informações sobre a formação de formulações lipossómicas anti-infeciosas podem ser encontradas no PCT/US03/06847, submetido em 5 de Março de 2003. O volume encapsulado é uma característica fundamental de uma formulação lipossómica e é determinada como o volume de fase aquosa intralipossómica por unidade de lipido. Geralmente é expressa em unidades de plitros/pmol. Frequentemente é assumido que, quando os lipossomas são formados a concentração do soluto no interior dos lipossomas é igual à exterior da solução a granel. Um volume de encapsulamento maior, conduziria então a uma proporção maior de fármaco/lipido, ou seja, uma concentração de fármaco em geral mais elevada na formulação final. 69 ΡΕ1909759

Na formulação lipossómica de amicacina, no entanto, verificou-se que a proporção real de fármaco/lipido que pode ser produzida foi mais de três vezes superior do que seria de esperar com base no volume encapsulado. A Tabela 11 apresenta os resultados de quatro preparações de amostras diferentes de formulações de lipidos anti-infeciosas (ver Exemplo 2 na secção de Exemplificação).

Tabela 11. Carga de amicacina em lipossomas preparada por diferentes métodos.

Parâmetro medido Amostra n2 1 2 3 4 Concentração de lipidos (mg/rriL) 35,1 39,5 50,4 45,0 Concentração de Amicacina (mg/rriL) 19,9 20,7 10,5 5,0 Lípido/Fármaco real (p/p) 1,8 1,9 4,8 9,0 Volume encapsulado (pL/pmol) 2,4 2,5 2,9 1,6 Lípido/Fármaco esperado (p/p) 5,6 6,0 4,1 8,1 Relação de Lípido/Fármaco Esperado/Real 3,19 3,17 0,85 0,90 Tamanho do lipossama (μτη) 0,230 0,217 4,65 3,96

As Amostras 1 e 2 foram preparadas pelo processo de infusão em etanol aqui descrito e as Amostras 3 e 4 foram preparadas através de técnicas de formação de lipossomas conhecidas no estado da técnica.

As concentrações de amicacina foram determinadas por ensaio de imuno-fluorescência utilizando conjunto de 70 ΡΕ1909759 reagentes INNOFLUO Seradyn no analizador TDx. Os lípidos foram determinados por HPLC de fase inversa utilizando uma coluna C-8 e detector de dispersão luminosa. 0 volume lipossómico (volume ocupado pelos lipos-somas por unidade do volume total) nas amostras n°s 1 -3 foi determinado medindo a concentração da sonda fluorescente (Sulforodamina 101 ou carboxifluoresceína), em que o volume total e o volume do filtrado da formulação, obtida por centrifugação num dispositivo de filtração CentriSart. A concentração de sonda no filtrado é superior à média devido à exclusão da sonda em relação ao volume ocupado por lipossomas.

Na amostra n° 4, o volume lipossómico foi determinado medindo a concentração do ião de potássio, numa amostra após adicionar a quantidade fixa, 250 pL de KC1 (Vad) em 10 mL de suspensão lipossómica (Vo) . As amostras foram depois centrifugadas 30 minutos a 4 000 rpm e o sobrenadante foi retirado para determinar os iões de potássio (K) por eléctrodo Cole-Parmer sensível ao potássio. A concentração determinada de potássio foi sempre superior ao esperado devido à exclusão dos iões de potássio do volume ocupado por lipossomas. No controlo, foi adicionada uma quantidade igual de KC1 em 10 mL de soro fisiológico. Foi determinada a concentração de potássio no controlo Kc. Depois os volumes aquosos e lipossómicos foram calculados da seguinte forma: ΡΕ1909759 71 κ y, s» 1 — V . t * ** *

Conhecendo o volume lipossómico e a concentração de lípidos pode-se determinar o volume encapsulado (vent)‘ y , em que Lp e Lm são respectivamente o peso e as concentrações molares do lípido. A densidade lipídica é assumida como sendo cerca de 1 mg/mL. Por conseguinte, pode-se estimar a relação esperada de Lípido/Fármaco que a amostra teria se o medicamento fosse idealmente distribuído pelos espaços aquosos no interior e exterior dos lipos-somas:ÍJLj .........,....4............ em que D é a concentração do 4) 4V*·,; produto a granel do fármaco durante a formação de lipos-somas, ML é o peso molecular médio de lípidos.

Tal como se pode verificar a proporção L/F real para as amostras n°s 1 e 2 (1,8 e 1,9) são consistentemente inferiores ao que seria esperado até mesmo de uma distribuição uniforme de amicacina (5,6 e 6,0), enquanto a L/F para as amostras n°s 3 e 4 estão mais próximas dos valores teóricos.

Foi realizada uma comparação semelhante entre duas preparações de amostra de uma formulação anti-infeciosa de lípido em que o sulfato de gentamicina foi o agente anti-infecioso (ver o Exemplo 3 na seção dos Exemplos). Os resultados da Tabela 12 indicam que o método aqui descrito proporciona encapsulamento de gentamicina 72 ΡΕ1909759 inesperadamente elevado. Em ambas as amostras n°s 5 e n°6, as proporções reais de Lípidos/Fármacos eram quase duas vezes o valor teórico.

Tabela 12. Carga de gentamicina nos lipossomas preparados por diferentes métodos.

Parâmetro medido Amostra n2 5 6 Concentração de lípidos (mg/rriL) 44,8 41,8 Concentração de Fármaco (mg/rriL) 14,2 14,9 Lípido/Fármaco real (p/p) 3,2 2,8 Volume encapsulado (pL/pmol) 2,3 2,7 Lípido/Fármaco esperado (p/p) 5,7 5,4 Relação de Lípido/Fármaco Esperado/Real 1,82 1,92 Tamanho do lipossoma (μτη) 0,226 0,236 8.4. Libertação do Fármaco Mediada pela Infeção a P. aeruginosa A libertação do fármaco numa forma activa na proximidade das infeções é um aspecto importante da acção da formulação lipossómica de fármaco da presente invenção. 0 potencial para essa libertação específica foi ensaiada através da monitorização da libertação do fármaco após incubação com expectoração de um doente com FQ, a libertação nos pulmões de ratos inoculados previamente com P. aeruginosa, bem como, a actividade de contra culturas de P. aeruginosa. 73 ΡΕ1909759 A libertação de amicacina por incubação directa de uma cultura de P. aeruginosa com uma formulação lipossómica de amicacina da presente invenção já foi previamente mencionada. Para investigar mais detalhadamente este fenómeno, uma formulação lipossómica de amicacina foi incubada com uma preparação de expectoração de um doente com fibrose quistica com infecção a P. aeruginosa. A expectoração foi liquefeita com DNase I de bovino e liase alginato durante 2 horas a 37°C. Uma formulação lipossómica de amicacina ou amicacina solúvel (1 mg/mL de amicacina) foi misturada numa proporção de 1:1 com a expectoração liquefeita ou com o controlo e incubadas com agitação suave a 37°C. Foram analisadas as aliquotas para determinação da concentração de amicacina por Analyzer TDx Abbott. Os Lipossomas intactos foram lisados numa alíquota separada de cada uma das amostra, utilizando um tensioactivo, 1% de Triton X-l0 0. Os sobrenadantes de cada amostra foram utilizados para análise. Ao longo do período de 48 horas, (80 - 90%) da amicacina foi libertada de uma forma dependente do tempo a partir da composição de lipido sob estas condições, indicando que a libertação do fármaco pode ocorrer nos locais de infecção no pulmão sofrendo de CF. A libertação do fármaco livre de lipossomas in vivo foi comparado em ratos que tinham sido instilados com ágar em grânulos contendo P. aeruginosa (3,5xl04 CFU/rato) versus aqueles que não tinham. Três dias após a instilação dos grânulos, os ratos foram deixados a inalar as formulações lipossómica de amicacina da presente invenção 74 ΡΕ1909759 (aproximadamente a dose diária de 6 mg/kg) diariamente (no grupo sem bactérias) ou dia sim dia não durante 14 dias (grupo instilado com grânulos). 24 Horas após o último tratamento, a amicacina total e a amicacina livre foram determinadas conforme descrito anteriormente. Em ratos que receberam bactérias, com uma média de cerca de 50-70% da amicacina foi detectada na forma livre, isto é, liberta do lipossoma. Nos ratos que não receberam bactérias cerca de 20-25% do fármaco estava na forma livre. Estes resultados, in vivo, sugerem fortemente que a libertação de amicacina livre de lipossoma podem ser mediados pela presença da P. aeruginosa.

Um ensaio de libertação e actividade foi realizado in vitro nas condições semelhantes às da farmacocinética no pulmão, onde foi previamente demonstrado que o antibiótico livre é eliminado num intervalo de tempo de algumas horas. A amicacina livre ou uma formulação lipossómica de amicacina foi incubada com P. aeruginosa PA01 (~108/mL) em 0,5 mL de cartuchos Slide-A-Lyzer estéreis em várias concentrações de fármaco. O fármaco livre dialisa fora dos cartuchos no intervalo de tempo de horas sob estas condições. Após 24 horas, as amostras foram retiradas dos cartuchos e semeadas para determinar CFU. Em experiências preliminares a amicacina livre, destas amostras, apenas tinha reduzido ligeiramente CFU, enquanto que a amicacina nas composições de lípido compreendendo amicacina na mesma concentração de amicacina (50 pg/mL) foi observada uma redução de dois log CFU. Estes resultados 75 ΡΕ1909759 sugerem que a amicacina é realmente libertada numa forma activa na presença de bactérias, e que a libertação lenta proporcionada pela formulação origina uma utilização mais eficaz do fármaco. A interacção das formulações lipossómicas de amicacina da presente invenção com P. aeruginosa ou os seus factores de virulência conduz à libertação de amicacina possivelmente dirigindo a libertação para o local da infeção. Quando a amicacina é libertada é ativa contra P. aeruginosa, e a libertação lenta na proximidade das bactérias pode ter uma vantagem sobre a distribuição não-específica e depuração rápida do fármaco livre inalado. 8.5. Efeito das Formulações Lipossómicas de Fármacos Inaladas ao Nível da Função dos Macrófagos Alveolares

As formulações lipossómicas de amicacina da presente invenção encontram-se numa forma de realização de uma nano escala (200-300 nm), forma encapsulada de lipossoma de amicacina que é formulado para tratar infeções crónicas a P. aeruginosa em doentes com fibrose quística. Foi concebida para inalação com liberação prolongada de amicacina no pulmão. Uma vez que os macrófagos alveolares sao conhecidos por tomar avidamente partículas nesta gama de tamanho, o efeito das formulações de lipossomas nestas células é de particular interesse. As funções basal e estimulada de macrófagos alveolares de rato obtidos por 76 ΡΕ1909759 lavagem foram estudadas com e sem a administração de formulações lipossómicas de amicacina e comparadas com vários controlos.

Os aerossoles das formulações lipossómicas de amicacina, amicacina, lipossomas placebo e soro fisiológico foram gerados com um nebulizador PARI LC Star e inalado por ratos fémeas CD®IGS uma câmara de inalação de único nariz. A terapia de inalação foi realizada durante 4 horas e em 14 dias consecutivos, de tal forma que a dose pulmonar diária estimada de lípido total foi de aproximadamente 12 mg/kg para o grupo de lipossómica de amicacina e 11 mg/kg para o grupo de lipossomas placebo. Metade dos ratos foram sacrificados no dia 15. Os restantes animais foram sacrificados no dia 43. 0 fluido da lavagem brônquica alveolar (BAL) foi recolhido de cada rato e armazenado a -80°C ensaio posterior de óxido nítrico (conforme representado pelo total de nitratos) e o factor de necrose tumoral alfa (TNF-α). As células de BAL foram recolhidas por centrifugação, contadas e semeadas em meio com e sem lipopolissacárido (LPS) durante 24 horas. Os sobrenadantes destas culturas foram recolhidos por centrifugação e doseado o óxido nítrico e TNF-α. A função fagocítica dos macrófagos BAL ((106)/mL) foi ensaiada medindo a absorção de um dia para o outro das microesferas fluorescentes opsonizadas (0,2 pm, 2(109)/mL). A inalação da formulação lipossómica de amicacina, lipossomas vazios, amicacina solúvel ou soro 77 ΡΕ1909759 fisiológico durante 14 dias consecutivos, não produziu uma resposta inflamatória significativa aguda ou retardada nos pulmões dos ratos, como é evidente através dos níveis de óxido nítrico (nitratos) e TNF-α em BAL que eram insignificantemente diferente dos controlos, embora houvesse uma tendência precoce na direção dos níveis de NO mais elevados em todos os grupos que receberam inalação, incluindo os controlos. A recuperação total de células foi insignificantemente diferente em todos os grupos, com uma tendência inicial para mais leucócitos polimorfonucleares em todos os grupos que receberam inalação. Os macrófagos alveolares de rato tinham funções normais após a exposição aos aerossoles dos artigos de teste mencionado anteriormente, apesar do facto de terem aparecido aumentados no dia 15 nos grupos que inalaram lipossomas. As concentrações de nitrato e TNF-α detectadas após a cultura de macrófagos alveolares no meio no dia 15 ou 43 do estudo foram insignificantemente diferentes dos controlos. Os macrófagos responderam normalmente quando estimuladas por LPS, produzindo concentrações substanciais de óxido nítrico (20-40 nmol/106 células) e TNF-a (5-20 ng/106 células). Estes macrófagos também tinham funções fagocíticas normais, como demonstrado pela absorção idêntica das partículas fluorescentes em relação aos controlos não tratados. A inalação das formulações lipossómicas de amicacina durante 14 dias consecutivos, não afectaram substancialmente a função dos macrófagos alveolares em termos de fagocitose dos grânulos opsonizadas, a produção de mediadores inflamatórios TNF e NO. ΡΕ1909759 78 9.Posologia A posologia de qualquer das composições da presente invenção variará dependendo dos sintomas, idade e peso corporal do doente, a natureza e gravidade do distúrbio a ser tratado ou prevenido, a via de administração e da forma da composição do objecto. Qualquer uma das formulações em questão podem ser administradas numa dose única ou em doses divididas As posologias das composiçoes da presente invenção podem ser facilmente determinadas por técnicas conhecidas dos especialistas na técnica ou conforme é aqui ensinado.

Em determinadas formas de realização, a dosagem dos compostos da presente invenção estará geralmente na gama de cerca de 0,01 ng a cerca de 10 g por kg de peso corporal, mais especificamente na gama de cerca de 1 ng a cerca de 0,1 g por kg, e mais especif icamente na gama de cerca de 100 ng a cerca de 50 mg por kg.

Uma dose ou quantidade eficaz, e quaisquer possíveis feitos sobre o tempo da administração da formulação, podem precisar de ser identificados para qualquer composição particular da presente invenção. Pode ser conseguido por meio de experiências de rotina, tal como aqui descrito, utilizando um ou mais grupos de animais (de preferência, pelo menos cinco animais por grupo), ou em ensaios em humanos, se apropriado. A eficácia de qualquer 79 ΡΕ1909759 composição de matéria e método de tratamento ou prevenção pode ser avaliada por administração da composição e avaliar o efeito da administração através de determinação de um ou mais índices aplicáveis, e por comparação dos valores desses índices no pós-tratamento com os valores do mesmos índices antes do tratamento. 0 tempo exacto de administração e a quantidade de qualquer composição do indivíduo em particular que vai proporcionar o tratamento mais eficaz num determinado doente dependerá da actividade, da farmacocinética e biodisponibilidade de uma composição em causa, estado fisiológico do doente (incluindo idade, o sexo, o tipo e estádio da doença, da condições físicas gerais, da capacidade de resposta para uma determinada dose e tipo de medicamento), a via de administração, e outros semlhantes. As orientações aqui apresentadas podem ser utilizadas para optimizar o tratamento, por exemplo, a determinação do tempo óptimo e/ou a quantidade de administração, o que irá exigir não mais do que a experiência de rotina, que consiste em monitorizar o indivíduo e ajustar a dose e/ou os tempos.

Enquanto que o indivíduo está a ser tratado, a saúde do doente pode ser monitorizada por medição de um ou mais dos índices relevantes em tempos pré-definidos durante o período de tratamento. 0 tratamento, incluindo a composição, quantidades, tempos de administração e da formulação, podem ser optimizadas de acordo com os 80 ΡΕ1909759 resultados dessa monitorização. O doente pode ser reavaliado periodicamente para determinar a extensão da melhoria através da medição dos mesmos parâmetros. Os ajustes das quantidades da composição administrada ao indivíduo e possivelmente para o tempo de administração podem ser efectuados com base nestas reavaliações. O tratamento pode ser iniciado com doses mais pequenas que são menores do que a dose óptima do composto. Depois disso, a dose pode ser aumentada em pequenos incrementos até que o efeito terapêutico óptimo é atingido. A utilização das composições da invenção pode reduzir a dose requerida para qualquer agente individual contido nas composições (por exemplo, o agente anti-infecioso), porque o início e a duração do efeito dos diversos agentes podem ser complementares. A toxicidade e eficácia terapêutica das composições em causa podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padrão em culturas celulares ou modelos animais, por ex., para determinar a DL50 e a DE5o·

Os resultados obtidos a partir dos ensaios com cultura de células e estudos em modelos animais podem ser utilizados em formulações numa gama de dose para utilização em seres humanos. A dose de qualquer composição em causa reside preferencialmente numa gama de concentrações circulantes que incluem a DE50 com pouca ou nenhuma 81 ΡΕ1909759 toxicidade. A dose pode variar dentro desta gama dependendo da forma farmacêutica e da via de administração utilizadas. Para as composições da presente invenção, a dose terapeuticamente eficaz pode ser inicialmente calculada a partir de ensaios com cultura celulares. 10. Formulação

As formulações lipidicas anti-infeciosas da presente invenção podem compreender uma dispersão aquosa de lipossomas. A formulação pode conter excipientes lipídicos para formar os lipossomas, e os sais/tampões para fornecer a osmolaridade e pH adequados. A formulação pode compreender um excipiente farmacêutico. 0 excipiente farmacêutico pode ser um líquido diluente, solvente ou material de encapsulamento, envolvido em veicular e no transporte de qualquer composição em causa ou seu componente a partir de um órgão, ou porção do corpo, para outro órgão, ou porção do corpo. Cada excipiente tem de ser "aceitável" no sentido de serem compatíveis com a composição em causa e os seus componentes e não ser prejudicial para o doente. Os excipientes adequados incluem trealose, rafinose, manitol, sacarose, leucina, trileucina e cloreto de cálcio. Exemplos de outros excipientes adequados incluem: (1) açúcares, tais como lactose e glucose; (2) amidos, tais como amido de milho e amido de batata; (3) celulose, e seus derivados, tais como carboximetilcelulose de sódio, etilcelulose e acetato de celulose; (4) tragacanto em pó; (5) malte; (6) gelatina; (7) talco; (8) excipientes, tais como, manteiga 82 ΡΕ1909759 de cacau e ceras para supositório; (9) óleos, tais como óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de açafrão, óleo de sésamo, azeite, óleo de milho e óleo de soja; (10) glicóis, tais como, propilenoglicol; (11) polióis, tais como glicerina, sorbitol e polietilenoglicol; (12) ésteres, tais como oleato de etilo e laurato de etilo; (13) agar; (14) agentes tampão, tais como hidróxido de magnésio e hidróxido de aluminio; (15) ácido alginico; (16) água apirogénica; (17) soro fisiológico isotónico; (18) solução de Ringer; (19 ) de álcool etilico; (20) soluções tampão fosfato; e (21) outras substâncias compatíveis não-tóxicas utilizadas em formulações farmacêuticas.

Exemplificação

Exemplo 1

Seguidamente faz-se uma descrição detalhada da produção de 150 mL de Lipossoma/amicacina complexada. 0 volume Inicial total = 1,5 L Conteúdo em etanol = 23,5% (v/v)

Composição lipídica: DPPC/Colesterol (proporção molar 1:1)

Inicial [Lípido] =7,6 mg/mL

Inicial [sulfato de amicacina] = 57,3 mg/mL

Volume do produto Final = 150 mL 83 ΡΕ1909759 I) Composição e Infusão:

Foram dissolvidos, 7,47 g de DPPC e 3,93 g de colesterol, directamente em 352,5 mL de etanol num banho de água a 50°C. Foi dissolvido 85,95 g de sulfato de amicacina directamente em 1 147,5 ml de tampão PBS. A solução é então titulada com KOH ou NaOH ION para atingir o pH de aproximadamente 6,8.

Foram adicionados ou infundidos 352,5 mL de etanol/lípido em 1 147,5 mL de amicacina/tampão para dar um volume total inicial de 1,5 L. 0 etanol/lípido foi bombeado @-30 mUmin (também designado por taxa de infusão) com uma bomba peristáltica numa solução de amicacina/tampão que estava a ser agitada rapidamente, a 150 rpm num reactor sobre uma placa de agitação à temperatura ambiente. 0 produto foi agitado à temperatura ambiente durante 20-30 minutos. II) Diafiltração ou Passo de "Lavagem": O recipiente de mistura estava ligado a uma bomba peristáltica e cartucho de diafiltração. O cartucho de diafiltração é uma fibra de membrana oca com um peso molecular de corte de 500 kilodaltons. O produto foi bombeado do reactor através do cartucho de diafiltração e depois retornou para o recipiente de mistura à temperatura ambiente. É criada ao longo do cartucho uma contra-pressão de aproximadamente 7 psi. A amicacina livre e etanol foram 84 ΡΕ1909759 forçados a passar através da membrana de fibra oca por contra-pressão deixando para trás a amicacina lipossómica (produto). 0 produto foi lavado 8 vezes à temperatura ambiente. Foi adicionado tampão PBS fresco (através de uma outra bomba peristáltica) para o reactor para compensar a remoção do permeado e para manter um volume constante do produto. 0 produto foi concentrado.

Exemplo 2

Encapsulamento lipossómico da amicacina elevado.

Foram preparadas quatro amostras de formulações lipídicas anti-infeciosas a várias concentrações de lípidos e agente anti-infecioso de acordo com os seguintes procedimentos.

Amostra n° 1. Foi dissolvido 1,72 kg de sulfato de amicacina em 23 litros de soro fisiológico (NaCl a 0,9%) e o pH foi ajustado a 6,5 por adição da quantidade necessária de NaOH. Lípidos - foram dissolvidos 98,2 g de DPPC e 51,8 g de colesterol em 7 litros de etanol. Os lipossomas foram formados por infusão da solução de lípido na solução de amicacina, a uma taxa de ~ 600 mL/min e sob agitação constante. A suspensão resultante foi em seguida lavada para remover o etanol e a amicacina não encapsulada por diafiltração utilizando um cartucho de Hollow Fiber Amersham com tamanho de poro de 500 kD. A suspensão foi concentrada até um volume final de aproximadamente 3,5 L. 85 ΡΕ1909759

Amostra n° 2, 0 procedimento foi semelhante ao da amostra n° 1 com todas as quantidades de materiais reduzidas em 100 vezes. Foi dissolvido 17,2 g de sulfato de amicacina em 230 mL de soro fisiológico (NaCl a 0,9%) e o pH foi ajustado a 6,6 por adição da quantidade necessária de NaOH. Lipidos - foram dissolvidos 0,982 g de DPPC e 0,518 g de colesterol em 70 mL de etanol. Os lipossomas foram formados por infusão da solução lipídica na solução de amicacina, a uma taxa de 300 mL/minuto e sob agitação constante. A suspensão resultante foi em seguida lavada para remover o etanol e amicacina não encapsulada por diafiltração utilizando um cartucho de Hollow Fiber Amersham. A suspensão foi concentrada até um volume final de ~ 35 mL.

Amostra n° 3. Os lipossomas foram preparados através de um processo conhecido como SPLV. Foram dissolvidos 1,4 g de sulfato de amicacina em 20 mL de soro fisiológico (NaCl a 0,9%), até pH 3,3. Lipidos - foram dissolvidos 0,666 g de DPPC e 0,333 g de colesterol em 40 mL de diclorometano. As soluções de lipidos e amicacina foram misturados num balão redondo de 500 mL e colocados por um período breve no sónico para formar uma emulsão. O balão foi depois ligado a um sistema de rotavapor BUCHI para remover o diclorometano a vácuo reduzido (-5 polegadas de Hg) e a temperatura de 50°C e rotação constante até a mistura de amicacina-lípido ter formado um gel. Quando o gel, eventualmente, entrou em colapso, o vácuo foi 86 ΡΕ1909759 gradualmente aumentado para -20 polegadas de Hg e a secagem continuou por mais 30 minutos. O volume final da suspensão de lipossomas formada era de 22 mL.

Amostra n° 4. O procedimento foi semelhante ao da amostra n°3. Foi dissolvido 1,3 g de sulfato de amicacina em 20 ml de soro fisiológico, e o pH foi ajustado a 6,5 pela adição de NaOH. Lípidos - foram dissolvidos 0,583 g de DPPC e 0,291 g de colesterol em 35 mL de diclorometano. Não foi efectuado o passo de sónico. O passo da remoção do solvente no sistema Rotavapor foi efectuado a 40°C durante 2 horas. O volume final foi de 20 mL.

Exemplo 3

Encapsulamento lipossómico de Gentamicina elevado.

Amostra n° 5. Foram dissolvidos 20,0 g de sulfato de gentamicina em 230 mL de soro fisiológico (NaCl a 0,9%) e o pH foi ajustado a 6,5 por adição da quantidade necessária de ácido sulfúrico. Lípidos - foram dissolvidos 0,982 g de DPPC e 0,518 g de colesterol em 70 mL de etanol. Os lipossomas foram formados por infusão da solução lipídica na solução de gentamicina, a uma taxa de aproximadamente 500 mL/min, sob agitação constante. A Gentamicina não encapsulada e o etanol foram removidos por diafiltração utilizando um cartucho de Hollow Fiber Amersham. A suspensão foi concentrada até um volume final de ~35 mL. 87 ΡΕ1909759

Amostra n° 6. 0 procedimento foi semelhante ao da amostra n°5, com excepção: Foram dissolvidos 17,0 g de sulfato de gentamicina em 230 mL de solução de Na2S04 a 100 mM e o pH foi ajustado a 6,5 por adição de quantidade necessária de H2S04. Lipidos - foram dissolvidos 0,982 g de DPPC e 0,518 g de colesterol em 75 mL de etanol.

Exemplo 4

Encapsulamento de outras formas de sais de amicacina.

Amostra n° 7. O procedimento foi semelhante ao da amostra n° 2 no Exemplo 2. Foram dissolvidos, 10,7 g de amicacina base e 4,2 g de ácido cítrico em 230 mL de soro fisiológico (NaCl a 0,9%) . 0 pH da solução resultante de amicacina-citrato era de 6,2. Lipidos - foram dissolvidos 0,982 g de DPPC e 0,518 g de colesterol em 70 mL de etanol. Os lipossomas foram formados por infusão de solução de lípido na solução de amicacina, a uma taxa de aproximadamente 500 mL/min, sob agitação constante. A amicacina não encapsulada e o etanol foram removidos por diafiltração através de um cartucho de Hollow Fiber Amersham. A suspensão foi concentrada até um volume final de ~35 mL. A proporção real de Lípido/Fármaco foi semelhante à da amostra n°2 e também mais baixa do que o esperado (Fármaco encapsulado superior ao esperado). Considerando o facto de que o volume encapsulado na amostra n° 7 foi de 88 ΡΕ1909759 apenas 1,5 (em comparação com 2,5 para a amostra n° 2), a proporção de L/F Esperado/Real foi tão elevada como 5,2. Assim, o citrato de amicacina lipossómico, assim como o sulfato de amicacina, podem também ser formulados com encapsulamento elevado.

Tabela 13. Resumo dos Parâmetros das Amostras 5-7 (exemplos comparativos).

Parâmetro medido Amostra n2 5 6 7 Concentração de lípidos (mg/mL) 44,8 41,8 41,7 Concentração de Amicacina (mg/mL) 14,2 14,9 17,8 Lípido/Fármaco real (p/p) 3,2 2,8 2,3 Volume encapsulado (pL/pmol) 2,3 2,7 1,5 Lípido/Fármaco esperado (p/p) 5,7 5,4 12,2 Relação de Lípido/Fármaco Esperado/Real 1,82 1,92 5,20 Tamanho do liposscma (pm) 0,226 0,236 0,234

Exemplo 5

Biodisponibilidade da amicacina a partir de formulações lipossómicas de amicacina inaladas no rato. A taxa de libertação da amicacina a partir de lipossomas de foi determinado após a inalação por ratos e comparado ao de amicacina solúvel inalada.

Os itens ensaiados foram submetidos a aerossol através de um nebulizador Pari LC Star ligado a apenas um nariz da câmara de inalação. Os ratos CD®IGS receberam uma 89 ΡΕ1909759 dose depositada no pulmão estimada em 6 mg/kg de amicacina, sob a forma de uma formulação lipossómica ou 5 mg/kg de amicacina solúvel, numa dose única ou em doses diárias durante 14 dias consecutivos. Os pulmões e outros tecidos foram homogeneizados com um aparelho Polytron. A cinética de depuração de amicacina a partir do pulmão foi examinado por análise de homogeneizados pulmonares em diferentes pontos do tempo após o tratamento de dose única ou 1 dia ou 28 dias após a administração de doses múltiplas. Os níveis de amicacina foram determinados por polarização por imunofluorescência num analyzer TDx® da Abbott na ausência ou na presença de 1% de Triton X-100, que liberta amicacina dos lipossomas. As amostras de pulmão inteiro foram misturadas com os lipossomas, antes da homogeneização para testar a libertação de amicacina sob estas condições. A amicacina livre e total foram medidas com e sem 1% de Triton X-100 para avaliar a libertação do fármaco. A amicacina lipossómica, enriquecida em amostras de pulmão inteiro, não apresentou qualquer libertação significativa de amicacina como um resultado da homogeneização do tecido com o homogeneizador Polytron, na ausência deste tensioactivo. No entanto, a adição de 1% de Triton X-100 conduz à recuperação de todo o fármaco pretendido. Assim uma comparação directa pode ser efetuada do nível total de amicacina (com tensioactivo) versus os níveis livremente disponíveis no tecido pulmonar.

Uma concentração total elevada de amicacina 90 ΡΕ1909759 (aprox. 500-600 pg/g de tecido pulmonar) foi observada imediatamente após a dose única de 6 mg/kg de amicacina lipossómica, que diminuiu lentamente em cerca de 50% ao longo de um período de 7 dias. O perfil temporal da libertação de amicacina livre a partir destes lipossomas mostraram uma concentração inicial elevada de fármaco livre, provavelmente resultante de amicacina libertada como um resultado da nebulização. Este passo foi seguido por um ponto mais baixo a cerca de 24 horas e um aumento subsequente, atingindo um máximo de 279 pg/g em 96 horas após a administração. No final da experiência de 7 dias, uma porção substancial do fármaco remanescente no pulmão estava na forma livre (aproximadamente 50-70%). Verificou-se que uma pequena porção da fármaco solúvel administrada por inalação também permaneceu durante um longo período de tempo no pulmão. No entanto, a maior parte da amicacina administrada na forma solúvel foi eliminada durante várias horas, e a AUC aparente da amicacina livre durante 7 dias foi de pelo menos 2x superior para os animais que receberam amicacina lipossómica do que para os que receberam amicacina solúvel. Alguns aspectos desse comportamento pode ser qualitativamente modelados com taxas constantes apropriadas para a eliminação e liberação lenta de fármacos a partir de lipossomas.

Depois dos 14 dias consecutivos de administração (24 horas depois da última dose), mais de 20% do total de amicacina nos pulmões dos ratos que receberam amicacina lipossómica estava presente como fármaco livre (cerca de 91 ΡΕ1909759 650 pg/g. O nível de fármaco livre total foi ainda superior e relação à quantidade nos ratos que inalou a amicacina solúvel (aprox. 500 pg/g). A amicacina livre é libertada lentamente a partir dos lipossomas das formulações de amicacina lipossómica nos pulmões de animais saudáveis ao longo de um intervalo de tempo de dias. 0 fármaco livre que é libertado tem um tempo de permanência relativamente longo no pulmão conforme observado por um depósito substancial de fármaco livre nos pulmões.

Exemplo 6

Processo de infusão em linha A essência do processo de infusão em linha é que um fluxo da solução de lípido é misturado com um fluxo de solução do agente anti-infecioso através de "em linha", por exemplo, uma ligação em Y, que se liga a um comprimento de tubo, denominado tubo de mistura, onde pode ocorrer a mistura adicional. Assim, este novo processo difere do processo de infusão "convencional" de etanol, em que a solução de lípido é infundido como um fluxo numa solução a granel de amicacina.

Preparação de soluções de amicacina e lipidos.

Foram dissolvidos 12,0 g de sulfato de amicacina em 200 ml de água e o pH foi ajustado a 6,5 por adição da 92 ΡΕ1909759 quantidade necessária de solução de NaOH a 25%. Lipidos, foram dissolvidos 1,480 g de DPPC e 0,520 g de colesterol, numa mistura de 60 mL de etanol e 10 mL de água. Estas quantidades resultam num lote de 300 mL após a infusão, a um caudal de lípido/amicacina de 300/500 mL/min, respectivamente. Os volumes podem ser proporcionalmente ajustados para escala maior ou se forem requeridos caudais diferentes. A solução de amicacina preparada de acordo com os resultados anteriores numa solução de cerca de 40 mg/mL de amicacina (por base). A solução de lípido foi apresentada como DPPC/Colesterol (proporção molar de 60/40) com um lipido total de aproximadamente 20 mg/mL (etanol a 90%). Os lipidos foram aquecidos até ~40°C, para dissolução mais rápida.

As quantidades exactas necessárias para um lote de 300 mL são: 150 mL de amicacina, 90 mL de lipido, e 60 mL de soro fisiológico adicional (ou água) , o que é adicionado após ou durante a infusão para ajustar a concentração final de etanol.

Processo de fabrico.

Uma forma de realização do sistema de infusão é apresentado na Figura 8.

As soluções de lipidos e amicacina são misturadas em linha, utilizando um dispositivo de ligação em Y (ID 93 ΡΕ1909759 3,2 mm, OD 6,4 mm) com caudais de -300/500 mL/min (ou seja, uma proporção em volume de -1/1,67 em vez de -1/3,35 no processo convencional). Um tubo Masterflex L/S 25 (ID 4,8 mm) foi utilizado para distribuir a solução de lípido e um tubo de L/S 17 (ID 6,4 mm) foi utilizado para distribuir a solução de amicacina. Para obter caudais sincronizados, foram utilizadas duas cabeças de bomba com uma unidade Masterflex. De acordo com as áreas de seção transversal do tubo, a proporção de caudal teórico deve ser de 4,82/6,42 = 0,562 = 1/1,78. Quando o funcionamento da bomba foi ajustado para 500 mL/min para o tubo L/S 17 de Amicacina, os caudais medidos foram ~300/500 = 1/1,67.

Uma vez que a solução lipídica contém 90% de etanol, então a mistura em linha tinha ~34% de etanol. Para evitar a precipitação de amicacina, pode ser adicionada solução de NaCl durante ou após a infusão, num caudal de 100-200 mL/min (supõe-se que os lipossomas já estão formados neste ponto). Assim, a mistura final teria -27% de etanol, dos quais toda a amicacina livre deverá ser solúvel. A taxa do fluxo do liquido de infusão total, 800-1 000 mL/min, é comparável ao caudal do permeado quando se utiliza dois cartuchos grandes de diafiltração. Isto faz com que seja possível fazer simultaneamente a infusão e concentração por diafiltração. A suspensão de lipossomas resultante foi lavada 94 ΡΕ1909759 para remover a amicacina livre por diafiltração através de um cartucho UFP-500-C-3MA de fibras ocas de Amersham (área da membrana 140 cm2, fibra ID 0,5 mm). No primeiro passo, a suspensão foi concentrada até cerca de metade do volume original (150 mL). Em seguida, durante a diafiltração para lavar, a suspensão foi re-circulada e soro fisiológico fresco foi alimentado na mistura a uma velocidade de ~6 mL/min, de modo a coincidir com a taxa de permeabilidade e assim, manter um volume constante. A diafiltração continuou até serem dispensados quatro vezes o volume da suspensão de alimentação de soro fisiológico (ou seja, 4*150 mL = 600 mL) . Este procedimento de diaf iltração/lavagem será referido como 4 "lavagens". Finalmente, a suspensão foi concentrada (sem entrada de soro fisiológico na diafiltração) para se obter o Produto Final a uma concentração desejada de amicacina de lipido. O caudal de recirculação durante o passo de diafiltração foi ~350 mL/min, e durante o passo de concentração final, foi gradualmente reduzido para ~150mL/min, de modo a manter a pressão de entrada inferior a 10 PSI.

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Lisboa, 3 de dezembro de 2013

Claims (38)

1. ΡΕ1909759 1 REIVINDICAÇÕES 1. Formulação anti-infeciosa lipídica compreendendo um agente anti-infecioso e uma formulação lipídica, em que o agente anti-infecioso é um aminoglicósido, a proporção em peso do lípido em relação ao aminoglicósido é de 0,75:1 ou inferior, e a formulação lipídica compreende um fosfolípido e um esteróide.
2. 2. Formulação anti-infeciosa lipídica da reivindicação 1, em que a formulação lipídica é substancialmente isenta de lípidos aniónicos.
3. 3. Formulação anti-infeciosa lipídica da reivindicação 1, em que a proporção do lípido em relação ao aminoglicósido é de 0,5:1 ou inferior.
4. 4. Formulação anti-infeciosa lipídica de qualquer das reivindicações anteriores, em que a formulação lipídica é um lipossoma.
5. 5. Formulação anti-infeciosa lipídica da reivindicação 4, em que o lipossoma tem um diâmetro médio de 0,1 ym até 1,0 ym, 0,2 ym até 0,5 ym, 0,2 ym até 0,4 ym ou de 0,2 ym até 0,3 ym.
6. 6. Formulação anti-infeciosa lipídica de qualquer das reivindicações anteriores, em que o aminoglicósido 2 ΡΕ1909759 é amicacina, gentamicina, tobramicina, estreptomicina, ne-tilimicina ou canamicina.
7. 7. Formulação anti-infeciosa lipídica da reivindicação 6, em que o aminoglicósido é amicacina.
8. 8. Formulação anti-infeciosa lipídica de qualquer das reivindicações anteriores, em que a formulação lipídica compreende lípidos neutros.
9. 9. Formulação anti-infeciosa lipídica da reivindicação 8, em que os lípidos que constituem a formulação lipídica são todos lípidos neutros.
10. 10. Formulação anti-infeciosa lipídica de qualquer das reivindicações anteriores, isenta de lípidos ani-ónicos.
11. 11. Formulação anti-infeciosa lipídica de qualquer das reivindicações anteriores, em que o fosfolípido é diapalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) e o esteróide é colesterol.
12. 12. Formulação anti-infeciosa lipídica de qualquer das reivindicações anteriores para utilização em medicina.
13. 13. Formulação anti-infeciosa lipídica da rei- 3 ΡΕ1909759 vindicação 12, para o tratamento de um doente com uma infeção pulmonar.
14. 14. Formulação anti-infeciosa lipídica da reivindicação 13, em que a infeção pulmonar é uma infeção a Pseudomonas, P. aeruginosa, P. paucimobilis, P. putida, P. fluorescens e P. acidovorans, estafilococos, Staphylococcus aureus resistentes à Meticilina (MRSA), estreptococos, Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Haemophilus, Yersinia pesos, Burkholderia pseudomallei, B. cepacia, B. gladioli, B. multivorans, B. vietnamiensis, Mycobacterium tuberculosis, M. avium complex (MAC), M. avium, M. intracellulare, M. kansasii, M. xenopi, M. marinum, M. ulcerans, M. fortuitum complex, M. fortuitum ou M. chelonae.
15. 15. Formulação anti-infeciosa lipídica da reivindicação 13 ou reivindicação 14, em que o doente sofre de fibrose quística.
16. 16. Método para a preparação da formulação anti-infeciosa lipídica de qualquer das reivindicações anteriores, compreendendo a infusão de uma mistura ou solução aquosa ou alcóolica de aminoglicósido com solução ou mistura de lípido-álcool a uma temperatura inferior à fase de transição de pelo menos um dos lípidos, em que a infusão da mistura ou solução aquosa ou alcóolica de aminoglicósido é preparada conforme referido anteriormente. 4 ΡΕ1909759
17. 17. Método da reivindicação 16, em que a mistura ou solução lipido-álcool tem uma concentração de 10 a 30 mg/mL.
18. 18. Método da reivindicação 16 ou da reivindicação 17, em que a mistura ou solução aquosa ou alcóolica do aminoglicósido tem uma concentração de 20 a 70 mg/mL.
19. 19. Método de preparação de uma formulação anti-infeciosa lipídica de qualquer uma das reivindicações 1 a 15 compreendendo: a mistura de um fluxo da mistura ou solução de lípido, com um fluxo de uma mistura ou solução aquosa ou alcóolica de aminoglicósido, em que os dois fluxos são misturados em linha.
20. 20. Método da reivindicação 19, em que os dois fluxos entram numa dispositivo de mistura em Y antes da mistura em linha.
21. 21. Método da reivindicação 19 ou da reivindicação 20, em que as soluções ou misturas são aquosas ou alcóolicas.
22. 22. Método das reivindicações 19, 20 ou 21, em que a formulação lipídica é um lipossoma.
23. 23. Método de qualquer uma das reivindicações de 5 ΡΕ1909759 19 a 22, em que o aminoglicósido é amicacina, gentamicina, tobramicina, estreptomicina, netilimicina ou canamicina.
24. 24. Método da reivindicação 23, em que o aminoglicósido é amicacina.
25. 25. Método de qualquer uma das reivindicações de 19 a 24, em que o fluxo de uma mistura ou solução lipidica e o fluxo de uma mistura ou solução de aminoglicósido são misturadas a um caudal total de 700 a 900 mL/minuto.
26. 26. Método da reivindicação 25, em que o caudal total é de 800 mL/minuto.
27. 27. Método de qualquer uma das reivindicações de 19 a 26, em que o fluxo de uma mistura ou solução lipidica é adicionado a um caudal de 200 a 400 mL/minuto.
28. 28. Método da reivindicação 27, em que o fluxo de uma mistura ou solução lipidica é adicionado a um caudal de 300 mL/minuto.
29. 29. Método de qualquer uma das reivindicações de 19 a 28, em que o fluxo de uma mistura ou solução de aminoglicósido é adicionado a um caudal de 400 a 600 mL/minuto.
30. 30. Método da reivindicação 27, em que o fluxo 6 ΡΕ1909759 de uma mistura ou solução de aminoglicósido é adicionado a um caudal de 500 mL/minuto.
31. 31. Método de qualquer uma das reivindicações de 19 a 30, em que a temperatura dos fluxos misturados é de 30-40 °C.
32. 32. Método de qualquer uma das reivindicações de 19 a 31, em que a temperatura da mistura ou solução lipídica é de 30°C e a temperatura da mistura ou solução de aminoglicósido é de 30°C.
33. 33. Método de qualquer uma das reivindicações de 19 a 31, em que a temperatura da mistura ou solução lipidica é de 50°C e a temperatura da mistura ou solução de aminoglicósido está à temperatura ambiente.
34. 34. Método de qualquer uma das reivindicações de 19 a 33, que compreende ainda o passo de diluição dos fluxos misturados com água, pelo menos, 20 segundos após a mistura.
35. 35. Método de qualquer uma das reivindicações de 19 a 34, em que a concentração da mistura ou solução de aminoglicósido é de 30 a 50 mg/mL.
36. 36. Método da reivindicação 35, em que a concentração da mistura ou solução de aminoglicósido é de 40 a 50 mg/mL. 7 ΡΕ1909759
37. 37. Método das reivindicações 19-36, em que o fosfolipido é DPPC e o esteróide é colesterol.
38. 38. Método de qualquer uma das reivindicações de 19 a 37, em que a proporção de lipido em relação ao aminoglicósido é de 0,5:1 ou inferior. Lisboa, 3 de dezembro de 2013 1/6 PE1909759 Figura 1 EXPECTORAÇÃO /BIOPELÍCULA DE DOENTES COM FIBROSE QUISTICA

    Células Epiteliais Θ antibiótico no CORTE + aminoglicósido livre - Mucina, alginato, DNA - Pseudomonas aeruginosa Figura 2 Antibiótico em pg/lteritío pulmonar emg

    ΡΕ1909759 2/6 Figura 3

    Figura 4

    ΡΕ1909759 3/6 Figura 5

    ΡΕ1909759 4/6Figura 7

    ΡΕ1909759 5/6 Figura 8

    v : VA V. :<F

    ΑΜΚ 40 mg/mt em água Tubo l/S 17,10 0,25“ |Sr4 mmj Taxe de Fluxo# SOO ml/mio

    ..·· 'í: Ri \ 4 * < s 1 t R? ( I i Solução de NaCI 200 ml/min Dispositivo de ligação em ¥ tD 3,2 mm s/ & *

    h$istu redor em linha PE1909759 6/6 Figura 9 Solubilidade da Amícacma (mg/ml)

    1 ΡΕ1909759 REFERENCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento da patente Europeia. Ainda que tenha sido tomado o devido cuidado ao compilar as referências, podem não estar excluídos erros ou omissões e o IEP declina quaisquer responsabilidades a esse respeito. Documentos de patentes citadas na Descrição US 38388483 A, 8ora US 10834144 A U:S 10224283 4 US 1Q8SS8S8 A US 5578323 A US 5736155 A US 5837278 A US 5822356 A US 5807232 A US S7Ô53S7 A US 5318771A US ©30684? W * ϋ8 4£22:803ΑΛβ^ * US S08MS3 A * US51SS637A US 4S88S7S A, Fcsjntefe * US 4S7S2B2 A, Cu#ss US 4235871 A, PapíiasÇapoutes us somm a, cuíh» » US 5059421 Â, * US 451573® A, Dwunar * US 4771812 .A, iajfflff * US 5841278 A, Jsntfff « USS3414403A,L»e * US 38317303 A, PSIsswlcz Literatura que não é de patentes citada na Descrição * Stoc» fífi ílBssdssics oí risptetoxtóiy and etotesxssiy is reisted to 8» {sonsofânto is Aísdi m smfewgly-cosíd® assctítísaiaies, 8 ss erSteíâ So tschicelhe fsstst-tesaBoe dosage <sf tisese sfrsigs x> psOents «siSs ím-paírad renai AsncSon. βΟΟΟΜΛΝ ? OilMAirSvTt» Pií3mscsalk:aS Sssss <of T^stapsí.áics « M»QFF «1 ai Pms, mt Asstó, Ss., 19¾ ¥& 85, 6122-6126 « BALLY; CULLiS et «f. Sktieebnai Aàf, 1987, «oi. 5 fU, 194 * JMsâ. SM JAto/SM, 1965, vsí. 13^),238-52 » PAPHABIOPOULOS et aí. Shdtém Bophy&. Acía, 1867, sot 135, 624-638 CHAPMAJ4 et ai Uftossxm Teetewl, 1884, 1-18 . BAfct® HÂM at aí, J Afci S&C, 1S8S* Yd 13, 266-252 * PAPAMASJOPOULOS etai Sssefssi, Ae- ÍS,, 186?, Yd 135, S24-SM Lsposomss, lassei Dsfekar, ins, 1983 * 5ZOKA UR, «t si Am Rsv B&pbys. Bia^sig. 1880, Yd. 8,487 * VEUBHUÍZEM. R,; N*G, fí.; OR43EJ®, S,; POS-SftlAYER, 7, fie Rd» of Llptdls in Rutavanar? Susr-tectant. SfccftôB. Bic&tys. Ae&t, 1998, woL 1488, 9^168 « HA6WOOD, S.; SERR5CK, lf.; POULAttt, F. Sta*u« má Propeles dSutfactart Psotefev S. »-odm. SfcíJftjssL Ãsts, 1SS®, vd 1466, 150-160 * JGíMMSSCM, U. Síraduns anã Píspgfítss sf Sar-U PasteSaC. BtosMm. Smphfs. Acis, 1998, vd 1406, 161-172 - StESASH, 8,; JOBE, Â.H.. SíífSadssií Psdsn Ms-isfedísírs srs vivo. Btesçfmt.. Beaspíçs. Acis. 1898, ¥d 1466, 21S-225 » commm, p.; fattel, e. ; ατ«^»«ιτλ u- pssffi!r®s and ^ajíopssiiicies irs 8?« TisaS55«ii ef te-taceíÍÈíias· Badieiisi tóectfoas. Pímm. fies., 1881, vai. S. 1078-1086 - SOMZAtES-ROTHÍ, RU.; CASACE. J,; STRAUB , t. j SCMSEfER, H. Uposssmes aml PíteBRasy Aivs-ste· Fusiciissial sskí Mo?plidogte M tsfasftm, Exp. Lmg R&s., 1891, vcá, 17, SSS-705 * SWENSUfá, ε.Ε.; ΡΕ.ΚϊΕ«?ί02, F,Q.; CYNAMOtt, Mit LSposomsí Aírsiaaglycosides snd TLC -65 . .443¾ PaBef&QsfSj Desetíbear 1881,230-296 * COSTERT©», J.W.; STEWART, P,S,; OREEN-BESS, EJ. Sarôertst BMirns: AGemston Csm»Qt Pm&stoxà inraoBcm- ScMss, 1SS8, voí. 284, 1318-1322 * C&8K, MJt? WD003, e,E,; SSeeULLOUSH, W.«, j JSSAMSOtí, J,R.; 8ASSs JΛ. A Rst fc1o0®i of Ci5ro£5fe Rssprsfejíy Msdsos Fsslsíoísosss sssjgsKsa. fimmsm f&vlMr of Ras&tòs&xy fl&-«as», 1879, wi. 118,453-459 * CAiTTIN, A,*L ? WO-ODS, B.E. Asfosoised Rrotesín SÍÇip?sss&s Bacisilai FícSMstiaí? fe-í s Moslsl: of Cíhuhíc Psesi^sn^nso serugiooss Lung iiieetMí. Αϊ75, J, ftespà: C(». &m &feaL 1938, vol 1®, 1130-1135 2 ΡΕ1909759 » ΜΚΜΒϋΥ, B>W.;; OOSSiSM H.L.; EISEKBERG» m; mmm, rjl ; harwqqd, m,; kravítz» RM. ESteaeyítf AeKssofeed Toferaírereta isi Psítoís vwíh cysSfe Ffesss. $te»· Eíjg&KSf J*. of Aíes#.. 1S83, vdL 328, t?4S-174ô * KENQELMAN, FJtL; SffiTH, A.L· ; LEVY„ J,; W&-BE8, A,; RAMSEYs 8,; DAMS, Rl. Ar^Dg^t®-skàs Pejístraíson, teastesaftea» «te Egicassj·- te CysSte Ffeoste S^iiksm,. Ãmwkm Ratâm ef Rssptmktry D&eam, 1985, w& 132, 7Í1-7S5 • PRiCE, fUL·; DERÍSM, HUB.i PURSIAll©, TJL AínSleacte, sn 8snteog&ycsosfci& wste msffcsd acífítjf sgstesS. afítfcfolK-fsstetaní círísssS isoíaios. J írsifecí Bis, 1S7S, voi 134, S249281 * BAMAS0, δ.; MQRSÍ04OPEZ, SL; ΙΙΛΗΤΜ- EZ*8EkTRAM,. 4, ; 6AKOA4SLE8ÍAS, M,C. Síís-cspMly síaifírssií diirísss^ tesMss οϊ FsmKtomsTas senigssisss sod entese graiMega&v® &asá$ te A??'j-Isacfc5 assd o§w ai^ii-íssglycssid» artttotíos. J Msst Bis, 187¾ VíSL 1M;. 3S4-9G * PILE, 4Λ.; MALOBE» 4,δ,;: EITZEK, E.M.; FRKO-LANOER,AM Aslfcfaxssspoíejtísai biategfcahv®·'-faps sgsrst, Arch Mem. Med.s S8SS, vel 158. 429-434 » «LEISER,C, A-; BERBJÍS:, ©C; fflURMAM, Η, A.; ®LOUCIiE:KOLíR5 W.S, PaÉsotogy of mpmtfíwM fespirafory asfcax ín klasses snsdstte. St\i. J. Exp. PstSJ., 1568,^:.44,41:8^26