MX2008000425A

MX2008000425A - Liberacion sostenida de anti-infectivos.

Info

Publication number: MX2008000425A
Application number: MX2008000425A
Authority: MX
Inventors: Lawrence T Boni; Brian S Miller; Vladimir Malinin; Xingong Li
Original assignee: Transave Inc
Priority date: 2005-07-19
Filing date: 2006-07-19
Publication date: 2008-03-10
Also published as: SI1909759T1; KR20080027888A; JP5415759B2; IL188406A0; IL216401A; CN103263387B; KR101437338B1; EP2649988A1; AU2006270008B2; HN2008000084A; CY1114685T1; IL216401A0; ES2437866T5; EP1909759B1; EP1909759A2; EP1909759A4; NZ565300A; JP2019052170A; JP2017082015A; AU2006270008A1

Abstract

1.- Se proveen formulaciones anti-infectivas de lipidos sustancialmente libres de lipidos anionicos con una relacion de lipidos a anti-infectivos es de aproximadamente 1:1 a alrededor de 4:1, y un diametro promedio de medio de menos de aproximadamente 1 ??m. Tambien se provee un metodo para preparar una formulacion anti-infectiva de lipidos que comprende un proceso de infusion. Tambien se proveen formulaciones anti-infectivas de lipidos en donde la relacion de lipido a farmaco es de aproximadamente 1:1 o menos, de aproximadamente 0.75:1 o menos, o de aproximadamente 0.50:1 o menos preparado por un proceso de fusion en linea. La presente invencion tambien se refiere a un metodo para tratar a un paciente con una infeccion pulmonar que comprende administrar al paciente una cantidad terapeuticamente efectiva de una formulacion anti-infectiva de lipidos de la presente invencion. La presente invencion tambien se refiere a un metodo para tratar a un paciente para fibrosis cistica comprendiendo administrar al paciente una cantidad terapeuticamente efectiva de una formulacion anti-infectiva de lipidos de la presente invencion.

Description

LIBERACIÓN SOSTENIDA DE ANTI-INFECTIVOS Solicitudes Relacionadas Esta solicitud es una continuación en parte de la Solicitud de Patente de Estados Unidos Serie No. 11/023,971, presentada el 28 de diciembre de 2004, que es una continuación en parte de la Solicitud de Patente de Estados Unidos Serie No. 10/696,389, presentada el 29 de octubre de 2002.

Introducción Cierta tecnología de liberación sostenida adecuada para la administración por inhalación emplea liposomas y complejos de lípidos para proveer efecto terapéutico prolongado de fármaco en el pulmón y sistemáticamente por liberación sostenida y la capacidad para dirigir y aumentar la absorción de fármaco en sitios de enfermedad. La presente invención comprende un anti-infectivo liposomal y métodos para el tratamiento de infecciones pulmonares usando anti-infectivo liposomal o formando complejo con lípidos. Como se reporta en Goodman and Gilman 's The Pharmaceutical Basis of Therapeutics, Octava edición, "Since the incidence of nephrotoxicity and ototoxicity is related to the concentration to which an aminoglicoside accumulates, it is critical to reduce the maintenance dosage of these drugs in patients with impaired renal function". Dado que los aminoglicosidos pueden producir disfunción vestibular o auditorial y nefrotoxicidad sin importar discapacidades de pacientes, es importante reducir generalmente las dosis de mantenimiento. La presente invención provee reducciones dramáticas en toxicidad permitiendo así las dosis superiores que las usuales. Los pacientes con fibrosis cística (FC) tienen secreciones de mucosa espesa y/o esputo en los pulmones, infecciones consecuenciales frecuentes, y biopelículas que resultan de colonizaciones bacterianas. Todos estos fluidos y materiales crean barreras para dirigirse efectivamente a infecciones con anti-infecciosos. La presente invención supera estas barreras y aún permite la dosificación reducida (en cantidad o frecuencia) , reduciendo así la carga de fármaco en pacientes. Para infecciones de pulmón generalmente, el programa de dosificación siempre y cuando la invención provee un medio para reducir la carga de fármaco. Para un sistema de suministro de fármaco liposomal, con frecuencia es conveniente disminuir la relación de lípido a fármaco (D/F) tanto como sea posible para reducir al mínimo la carga de lípidos para evitar los efectos de saturación en el cuerpo. Para suministro de pulmón por inhalación, puede ser particularmente cierto debido al uso crónico, la dosificación de liposomas podría superar el despeje limitando así la administración y por lo tanto la efectividad del producto del fármaco. Una relación de L/F podrían permitir que se de más fármaco antes de que se llegue al umbral de dosificación/eliminación.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Los métodos de infusión de vía descritos en la presente, los liposomas sustancialmente libres de lípidos aniónicos de tamaño modesto (<1 µm) que atrapa antiinfecciosos a una relación de peso de lípidos/anti-infectivo normalmente se han creado de aproximadamente 4:1 a alrededor de 0.5:1. Se han medido los volúmenes capturados de liposomas, y de estos números uno puede calcular lo que podría ser el atrapamiento teórico si se comportara el antiinfectivo como un soluto ideal (es decir, no interactúan con la membrana de liposomas pero se atrapa idialmente junto con agua) . Por esta comparación, se observan números atrapados que son superiores 3-5x de lo esperado, indicando que ocurre la interacción especial que permite más atrapamiento esperado y las relaciones de lípidos/anti-infectivos esperados. La solución en la cual la forma de liposomas contiene una concentración de anti-infectivos, la concentración de antiinfecciosos dentro de los liposomas deberán ser de aproximadamente la misma concentración que en la solución.

Sin embargo, la concentración anti-infectiva interna se calcula para ser por lo menos aproximadamente 3 x superior. En parte, la presente invención caracteriza una formulación anti-infectiva liposomal comprendiendo una formulación de lípidos y un anti-infectivo en donde la formulación de lípidos es sustancialmente libre de lípidos aniónicos, y en donde la relación en peso de lípidos a antiinfectivo es de aproximadamente 4:1 a alrededor de 1:1. En ciertas modalidades, la relación en peso de lípido a anti-infectivo es de aproximadamente 3:1 a alrededor de 1:1, de 2:1 a alrededor de 1:1 o aproximadamente 1:1. En otra modalidad, la presente invención se refiere a una formulación de lípidos que comprende un anti-infectivo en donde la relación de lípido a anti-infectivo es de aproximadamente 1:1 o menos, aproximadamente 0.75:1 o menos o aproximadamente 0.5:1 o menos. En ciertas modalidades, la formulación antiinfectiva comprende un liposoma que tiene un diámetro medio de aproximadamente 0.2 µm a alrededor de 0.5 µm. En otras modalidades, el diámetro medio es de aproximadamente 0.2 µm a alrededor de 0.3 µm. En ciertas modalidades, el anti-infectivo puede ser cualquier anti-infectivo comúnmente conocido. En ciertas modalidades, el anti-infectivo puede ser un amino-glicósido incluyendo, pero no limitado a, amicacina, tobramicina, o gentamicina, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En ciertas modalidades, la formulación de lípidos comprende un lípido neutro. En ciertas modalidades, el lípido es un fosfolípido, incluyendo pero no limitado a, una fosfatidil colina tal como dipalmitolilfosfatidil colina o dioleoilfosfatidil colina; o el lípido puede ser un esteroide tal como un esterol, incluyendo, pero no limitado a, colesterol; o el lípido puede ser una combinación de los mismos. En parte, la presente invención caracteriza un método para preparar la formulación anti-infectiva de lípidos descrita antes ' comprendiendo la infusión de una solución acuosa o alcohólica o mezcla del anti-infectivo con una solución de lípidos-alcohol o mezcla a una temperatura por debajo de la transición de fases de por lo menos uno de los componentes de lípidos del lípido neutro, en donde la infusión se realiza del anterior. En ciertas modalidades, el alcohol es etanol. En ciertas modalidades, la concentración de la solución de lípidos-alcohol o mezcla es de aproximadamente 10 a alrededor de 30 mg/ml. En ciertas modalidades, la concentración del anti-infectivo acuoso o solución alcohólica o mezcla es de aproximadamente 20 a alrededor de 70 mg/ml. En ciertas modalidades, la concentración de la solución de lípidos-alcohol neutro o mezcla es de aproximadamente 10 a alrededor de 30 mg/ml y la concentración de la solución o mezcla anti-infectiva acuosa o alcohólica es de aproximadamente 20 a alrededor de 70 mg/ml. Sin embargo, alguien con experiencia ordinaria en a la materia apreciará que las concentraciones variarán o de alguna manera serán optimizadas dependiendo del lípido y/o anti-infectivo implicado. En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a la formulación de lípidos mencionada antes, en donde el anti-infectivo se selecciona de los siguientes: un aminoglicósido, una tetraciclina, una sulfonamida, ácido p- aminobenzoico, una diaminopirimidina, una quinolona, una ß- lactama, una ß-lactama y un inhibidor de ß-lactamasa, cloranfenicol, un macrólido, linomicina, clindamicina, espectinomicina, polimixina B, colistina, vancomicina, bacitracina, isoniazida, rifampina, etambutol, etionamida, ácido aminosalicílico, cicloserina, capreomicina, una sulfona, clofazimina, talidomida, un antifúngico de polieno, flucitosina, imidazol, triazol, griseofulvina, terconazol, butoconazol ciclopirax, ciclopirox olamina, haloprogina, tolnaftato, naftifina, terbinafina, o combinación de los mismos. En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a la formulación de lípidos mencionados antes, en • donde el antiinfectivo es un aminoglicósido. En una modalidad adicional, el antiinfectivo es un aminoglicosido seleccionado de los siguientes: amicacina, gentamicina, o tobramicina. En una modalidad adicional, el anti-infectivo es amicacina. En una modalidad adicional, el anti-infectivo es gentamicina. En una modalidad adicional, el antiinfectivo de tobramicina. En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a la formulación de lípidos mencionada antes, en donde la formulación de lípidos es un liposoma. En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a la formulación de lípidos mencionada antes, en donde la formulación de lípidos comprende un esteroide. En ciertas modalidades, la formulación de lípidos comprende un esterol. En ciertas modalidades, la formulación de lípidos comprende dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) . En ciertas modalidades, la formulación de lípidos comprende un fosfolípido y un esteroide. En ciertas modalidades, la formulación de lípidos comprende un fosfolípido y un esterol. En ciertas modalidades, la formulación de lípidos comprende DPPC y colesterol. En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a la formulación mencionada antes, en donde la formulación de lípidos comprende DPPC, dieleoilfosfatidilcolina (DOPC), y colesterol. En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a la formulación mencionada antes, en donde la formulación de lípidos comprende DPPC y colesterol en una relación molar de aproximadamente 20:1, 10:1, 5:1, 2:1, o 1:1. En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a la formulación mencionada antes, en donde la formulación de lípidos comprende DPPC, DOPC, y colesterol en una relación molar de aproximadamente 5-20 : 1-20 : 0.5-1. En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a la formulación de lípidos mencionada antes, en donde la formulación - de lípidos es un liposoma y el antiinfectivo es amicacina. En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a la formulación de lípidos mencionada antes, en donde la formulación de lípidos es un liposoma, el antiinfectivo es amicacina, y la formulación de lípidos comprende un fosfolípido y un esterol. En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a la formulación de lípidos mencionada antes, en donde la formulación de lípidos es un liposoma, el antiinfectivo es amicacina, y la formulación de lípidos comprende un DPPC en un colesterol. En otra modalidad, la presente invención se refiere a un método para preparar una formulación de lípidos que comprende un anti-infectivo que comprende: mezclar una corriente de una solución de lípidos o mezcla, con una corriente de una solución de anti-infectivo o mezcla en donde las dos corrientes se mezclan en línea. En ciertas modalidades, las dos corrientes entran a un conector en Y antes de mezclarse en línea. En ciertas modalidades, la presente invención se refiere al método mencionado antes, en donde la corriente de una solución de lípidos o mezcla, y la corriente de una solución o mezcla anti-infectiva se mezclan a un régimen de flujo total de aproximadamente 800 mg/min. En ciertas modalidades, la corriente de una solución de lípidos o mezcla se agrega a un régimen de flujo de aproximadamente 700 a alrededor de 900 ml/min. En ciertas modalidades, la corriente de una solución de lípidos o mezcla y la corriente de una solución anti-infectiva o mezcla se mezclan a un régimen de flujo total de aproximadamente 800 ml/min. En ciertas modalidades, la corriente de una solución de lípidos o mezcla se agrega a un régimen de flujo de aproximadamente 200 a alrededor de 400 ml/min. EN ciertas modalidades, la corriente de una solución de lípidos o mezcla se agrega a un régimen de flujo de aproximadamente 300 ml/min. En ciertas modalidades, la corriente de una solución o mezcla anti-infectiva se agrega a un régimen de flujo de aproximadamente 400 a alrededor de 600 ml/min. En ciertas modalidades, la corriente de una solución o mezcla anti-infectiva se agrega a un régimen de flujo de aproximadamente 500 ml/min. En ciertas modalidades, la corriente de una solución o mezcla de lípidos se agrega a un régimen de flujo de aproximadamente 300 ml/min, y la corriente de una solución o mezcla antiinfectiva se agrega a un régimen de flujo de aproximadamente 500 ml/min. En ciertas modalidades, la presente invención se refiere al método mencionado antes, en donde la temperatura de las corrientes combinadas es de aproximadamente 30-40 °C. En ciertas modalidades, la temperatura de la solución o mezcla de lípidos es de aproximadamente 30°C, y la temperatura de la solución o mezcla anti-infectiva es de aproximadamente 30 °C. En ciertas modalidades, la temperatura de la solución o mezcla de lípidos es de aproximadamente 50 °C, y la temperatura de la solución o mezcla de antiinfectiva es a temperatura ambiente. En ciertas modalidades, la presente invención sé refiere al método antes mencionado, en donde el método para preparar la formulación de lípidos comprende un 'antiinfectivo además comprende el paso de diluir las corrientes combinadas con agua por lo menos aproximadamente 20 segundos después del mezclado. En ciertas modalidades, la presente invención se refiere al método mencionado antes, en donde la concentración de la solución o mezcla anti-infectiva es de aproximadamente 30 a alrededor de 50 mg/ml. En ciertas modalidades, la concentración de la solución o mezcla anti-infectiva es de aproximadamente 40 a alrededor de 50 mg/ml. • En ciertas modalidades, la presente invención se refiere al método mencionado antes, en donde la corriente de una solución o mezcla de lípidos se agrega a un régimen de flujo de aproximadamente 300 ml/min, y la corriente de una solución o mezcla de anti-infectiva se agrega a un régimen de flujo de aproximadamente 500 ml/min; la temperatura de las corrientes combinadas es de aproximadamente 30-40 °C; las corrientes combinadas se diluyeron con agua por lo menos aproximadamente 20 segundos después del mezclado; y la concentración de la solución o mezcla anti-infectiva es de aproximadamente 40 a alrededor de 50 mg/ml. En ciertas modalidades, la presente invención se refiere al método mencionado antes, en donde la soluciones son mezclas son acuosas o alcohólicas. En ciertas modalidades, la presente invención se refiere al método mencionado antes, en donde la formulación de lípidos es un liposoma. En ciertas modalidades, la presente invención se refiere al método mencionado antes, en donde el antiinfectivo se selecciona de los siguientes: un aminoglicósido, una tetraciclina, una sulfonamida, ácido p-aminobenzoico, una diaminopirimidina, una quinolona, una ß-lactama, una ß-lactama y un inhibidor de ß-lactamasa, cloranfenicol, un macrolido, linomicina, clindamicina, espectinomicina, polimixina B, colistina, vancomicina, bacitracina, isoniazida, rifampina, etambutol, etionamida, ácido aminosalicílico, cicloserina, capreomicina, una sulfona, clofazimina, talidomida, un antifúngico de polieno, flucitosina, imidazol, triazol, griseofulvina, terconazol, butoconazol ciclopirax, ciclopirox olamina, haloprogina, tolnaftato, naftifina, terbinafina, o combinación de los mismos. En ciertas modalidades, el anti-infectivo es un aminoglicósido. En ciertas modalidades, el anti-infectivo es un aminoglicósido seleccionado de los siguientes: amicacina, gentamicina o trobamicina. En ciertas modalidades, el antiinfectivo es amicacina. En ciertas modalidades, el antiinfectivo es gentamicina. En ciertas modalidades, el anti-infectivo es tobramicina. En ciertas modalidades, la presente invención se refiere al método mencionado antes, en donde 'el lípido comprende un fosfolípido. En ciertas modalidades, el lípido comprende un esteroide. En ciertas modalidades, el lípido comprende un esterol. En ciertas modalidades, el lípido comprende DPPC. En ciertas modalidades, el lípido comprende colesterol. En ciertas modalidades el lípido comprende un fosfolípido y un esterol. En ciertas modalidades, el lípido comprende DPPC y colesterol.

En ciertas modalidades, la presente invención se refiere al método mencionado antes, en donde la formulación de lípidos es un liposoma y el anti-infectivo es amicacina. En ciertas modalidades, la presente invención se refiere al método mencionado antes, en donde la formulación de lípidos es un liposoma, el anti-infectivo es amicacina, y el lípido comprende un fosfolípido y un esterol. En ciertas modalidades, la presente invención se refiere al método mencionado antes, en donde la formulación de lípidos es un liposoma, el anti-infectivo es amicacina, y el lípido comprende DPPC y colesterol. En ciertas modalidades, la presente invención se refiere al método mencionado antes, en donde la formulación de lípidos tiene una relación de lípido a anti-infectivo de aproximadamente 1:1 o menos. En ciertas modalidades, la presente invención se refiere al método mencionado antes, en donde la formulación de lípidos tiene una relación de lípido a anti-infectivo de aproximadamente 0.75:1 o menos. En ciertas modalidades, la presente invención se refiere la método mencionado antes en donde la formulación de lípidos tiene una relación a lípido a anti-infectivo de aproximadamente 0.5:1 o menos. En ciertas modalidades, la presente invención se refiere al método mencionado antes en donde la formulación de lípidos es un liposoma, el anti-infectivo es amicacina, el lípido comprende DPPC y colesterol, y la relación de lípido a anti-infectivo es de aproximadamente 1:1 o menos. En otra modalidad, la presente invención se refiere a un método para tratar infecciones pulmonares en un paciente que necesita del mismo comprendiendo administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de una formulación anti-infectiva liposomal que comprende una formulación de lípidos y un anti-infectivo, en donde la dosis de anti-infectivo es de aproximadamente 100 mg/día o menos. En una modalidad adicional, la cantidad de dosis de anti-infectivo es de aproximadamente 30 mg a alrededor de 50 mg cada otro día. En una modalidad adicional, la cantidad de dosis de anti-infectivo es de aproximadamente 30 mg a alrededor de 50 mg cada tercer día. En otra modalidad, la presente invención se refiere al método mencionado antes de tratamiento, en donde el liposoma tiene un diámetro medio de aproximadamente 0.2 µm a alrededor de aproximadamente 1.0 µm. En una modalidad adicional, el liposoma tiene un diámetro medio de aproximadamente 0.2 µm a alrededor de 0.5 µm, o de aproximadamente 0.2 µm a alrededor de 0.3 µm. En otra modalidad, la presente invención se refiere al método de tratamiento mencionado antes, en donde la infección pulmonar es un resultado de fibrosis cística.

En otra modalidad, la presente invención se refiere al método de tratamiento mencionado antes, en donde la relación en peso de lípido a anti-infectivo es de aproximadamente 4:1 a alrededor de 0.5:1, de aproximadamente 3:1 a alrededor de 0.5:1, de aproximadamente 2:1 a alrededor de 0.5:1, o de aproximadamente 1:1 a alrededor de 0.5:1. En otra modalidad, la presente invención se refiere al método de tratamiento mencionado antes, en donde el antiinfectivo se selecciona de lo siguiente: un aminoglicósido, una tetraciclina, una sulfonamida, ácido p-aminobenzoico, una diaminopirimidina, una quinolona, una ß-lactama, una ß-lactama y un inhibidor de ß-lactamasa, cloranfenicol, un macrolido, linomicina, clindamicina, espectinomicina, polimixina B, colistina, vancomicina, bacitracina, isoniazida, rifampina, etambutol, etionamida, ácido aminosalicílico, cicloserina, capreomicina, una sulfona, clofazimina, talidomida, un antifúngico de polieno, flucitosina, imidazol, triazol, griseofulvina, terconazol, butoconazol ciclopirax, ciclopirox olamina, haloprogina, tolnaftato, naftifina, terbinafina, o combinación de los mismos. En ciertas modalidades, el anti-infectivo es un aminoglicósido. En ciertas modalidades, el anti-infectivo es amicacina. En otra modalidad, la presente invención se refiere al método de tratamiento mencionado antes, en donde la formulación de lípidos comprende lípidos neutros. En otra modalidad, los lípidos que conforman la formulación de lípidos todos son lípidos neutros. En otra modalidad, el liposoma está libre de lípidos aniónicos. En otra modalidad, la formulación de lípidos comprende un fosfolípido. En otra modalidad, la formulación de lípidos comprende un esterol. En otra modalidad, la formulación de lípidos comprende DPPC y colesterol . En otra modalidad, la presente invención se refiere al método de tratamiento mencionado antes, en donde el antiinfectivo es amicacina, y la formulación de lípidos comprende DPPC y colesterol. En otra modalidad, la presente invención se refiere al método de tratamiento mencionado antes, en donde el anti-infectivo es amicacina, la relación en peso de lípido a antiinfectivo es de aproximadamente 4:1 a alrededor de 1:1, y la formulación de lípidos comprende DPPC y colesterol. En una modalidad adicional, la relación en peso es de aproximadamente 3:1 a alrededor de 1:1, 2:1 a alrededor de 1:1 o de aproximadamente 1:1. En otra modalidad, la presente invención se refiere al método de tratamiento mencionado antes, en donde el antiinfectivo es amicacina, la relación den peso de lípido a anti-infectivo es de aproximadamente 4:1 a alrededor de 1:1, la formulación de lípidos comprende DPPC y colesterol, y la infección pulmonar es un resultado de fibrosis cistica. En una modalidad adicional, la relación en peso es de aproximadamente 3:1 a alrededor de 1:1, 2:1 a alrededor de 1:1, o de aproximadamente 1:1. En otra modalidad, la presente invención se refiere al método de tratamiento mencionado antes, en donde el antiinfectivo es amicacina, la relación en peso del lípido a anti-infectivo es de aproximadamente 4:1 a alrededor de 0.5:1, la formulación de lípidos comprende DPPC y colesterol, y el liposoma tiene un diámetro medio de aproximadamente 0.1 µm a aproximadamente 0.5 µm. En una modalidad adicional, el diámetro medio es de aproximadamente 0.2 µm a alrededor de 0.4 µm, o de aproximadamente 0.2 µm a alrededor de 0.3 µm. En otra modalidad, la presente invención se refiere al método de tratamiento mencionado antes, en donde el antiinfectivo es amicacina, la relación en peso del lípido a anti-infectivo es de aproximadamente 4:1 a alrededor de 0.5:1, la formulación de lípidos comprende DPPC y colesterol, la infección pulmonar es el resultado de fibrosis cistica, y el liposoma tiene un diámetro medio de aproximadamente 0.1 µm a aproximadamente 1.0 µm. En una modalidad adicional, el diámetro medio es de aproximadamente 0.2 µm a alrededor de 0.5 µm, o de aproximadamente 0.2 µm a alrededor de 0.3 µm. Estas modalidades de la presente invención, otras modalidades y sus aspectos y características, serán evidentes a partir de la descripción, los dibujos y reivindicaciones siguientes .

Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 describe el diagrama en sección transversal del esputo/biopelícula observado en pacientes con fibrosis cistica. La Figura 2 describe la representación gráfica del blanco y efecto de depósito del fármaco de la presente invención. Las Figuras 3 y ' 4 describen representaciones gráficas de bacteriología de amicacina en varias formas. La Figura 5 describe una represtación gráfica de la liberación sostenida para amicacina liposomal/formando complejo y tobramicina. La Figura 6 describe datos en ciprofloxacina libre o formando complejo. La Figura 7 escribe una representación gráfica de residencia del fármaco en el pulmón dados varios programas de dosificación. La Figura 8 describe gráficamente el proceso de infusión en línea de dos corrientes para preparar las formulaciones anti-infectivas liposomales.

La Figura 9 describe miscibilidad de sulfato de amicacina con etanol/agua. Las líneas representan concentración de amicacina máxima (base) miscible con solución de etanol a temperatura ambiente (TA) y 40 °C. En formas de amicacina de concentraciones superiores una fase líquida separada (coacervados) que al final se precipita como cristales. Las líneas verticales muestran la concentración de etanol en la mezcla de infusión de lípidos/amicacina (300/500 partes) y después agregando 200 partes de agua.

Descripción Detallada La presente invención describe una formulación de lípidos que comprende un anti-infectivo en donde el tamaño y relaciones de lípido a fármaco son más pequeñas que la previamente conocida. La presente invención también describe un método para preparar estas formulaciones de lípidos. 1. Definiciones Por conveniencia, en la descripción adicional anterior de la presente invención, ciertos términos empleados en la especificación, ejemplos y reivindicaciones anexas se recopilan en la presente. Estas definiciones deberán leerse en vista del resto de la descripción y ser entendidos por alguien experto en la materia. A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado como se enciende comúnmente por alguien con experiencia ordinaria en la materia . Los artículos "un" u "uno" se usan en la presente para referirse a uno o más de uno (es decir, por lo menos uno) del objeto gramatical del artículo. A manera de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento. El término "biodisponible" se reconoce en la materia y se refiere a una forma del sujeto de la invención que lo permite, o una porción de la cantidad administrada para ser absorbida por, incorporada a, o de alguna manera fisiológicamente disponible para un sujeto o paciente a quien se le administra. Los términos "comprenden" y "comprendiendo" se usan en el sentido abierto inclusivo, significando que pueden incluirse los elementos adicionales. Los términos "encapsulado" y "encapsulante" se refiere a la adsorción de anti-infectivos en la superficie de la formulación basada en lípidos, asociación de anti-infectivos en la región intersticial de bicapas o entre dos monocapas, captura de anti-infectivos en el espacio entre dos bicapas, o captura de anti-infectivos en el espacio rodeado por la bicapa o monocapa más interna. El término "incluyendo" se usa en la presente por significar "incluyendo peo no limitado a", "incluyendo" e "incluyendo pero no limitado a" como se usa intercambiablemente . El término "formulación de lípidos anti-infectivo" o "anti infectivo de Lip" o "An-Lip" tratado en la presente es cualquier forma de composición anti-infectiva en donde por lo menos aproximadamente 1% en peso del anti-infectivo se asocia con el lípido por lo menos como parte de un complejo con el lípido, o como un liposoma en donde el antibiótico puede estar en la fase acuosa o la fase de dos capas hidrofóbicas o en la región de grupo superior interfacial de la bicapa liposomal. Preferiblemente, por lo menos aproximadamente 5% o por lo menos aproximadamente 10%, o por lo menos aproximadamente 20%, o por lo menos aproximadamente 25% pueden asociarse. La asociación puede medirse por separación a través de un filtro en donde el lípido y el anti-infectivo asociado con lípido se retiene y el antiinfectivo libre está en el filtrado. Una "formulación de anti-infectivo liposomal" es una formulación de antiinfectivo de lípidos en donde la formulación de lípidos es de la forma de un liposoma. El término "mamífero" se conoce en la materia, y los mamíferos ilustrativos incluyen seres humanos, primates, bovinos, porcinos, caninos, felinos, y roedores (v.gr., ratones y ratas) .

Un "paciente", "sujeto" o huésped" que será tratado por el método presente puede significar un ser humano o animal no humano. El término "sales farmacéuticamente aceptables" se reconoce en la materia y se refiere a las sales de adición de ácido inorgánico y orgánico, relativamente no tóxico, incluyendo, por ejemplo, los contenidos en las composiciones de la presente invención. El término "infusión de solventes" es un proceso que incluye disolver uno o más lípidos en una cantidad pequeña, preferiblemente mínima, de un solvente compatible con el proceso para formar una suspensión o solución de lípidos (preferiblemente una solución) y luego agregando la solución a un medio acuoso que contiene agentes bioactivos. Normalmente un solvente compatible con el proceso para formar una suspensión o solución de lípidos (preferiblemente una solución) y luego agregando la solución a un medio acuoso que contiene agentes bioactivos. Normalmente un solvente compatible con el proceso es uno que puede lavarse en un proceso acuoso tal como diálisis. La composición que tienen ciclos de frío/caliente preferiblemente se forma por infusión de solventes, prefiriéndose la infusión con etanol. Se prefieren alcoholes como solventes. "Infusión de etanol", un tipo de infusión de solvente, es un proceso que incluye disolver uno o más lípidos en una cantidad pequeña, preferiblemente mínima, de etanol para formar una solución de lípidos y luego agregar la solución a un medio acuoso que contiene agentes bioactivos. Una cantidad "pequeña" de solvente es una cantidad compatible con la formación de liposomas o complejos de lípidos en el proceso de infusión. El término "infusión de solvente" puede incluir también un proceso de infusión en línea en donde primero se mezclan en línea dos corrientes de los componentes de formulación. El término "sustancialmente libre" es reconocido en la materia y se refiere a una cantidad trivial o menos. El término "agente terapéutico" se reconoce en la materia y se refiere a cualquier porción química que es una sustancia biológica, fisiológica, o farmacológicamente activa que actual localmente o sistemáticamente en un sujeto. Ejemplos de agentes terapéuticos, también denominados como "fármacos", se describen en referencias de literatura bien conocidas tales como Merck Index, The Physicians Desk Reference, y The Pharmacological Basis of Therapeutics, e incluyen, sin limitación, medicamentos; vitaminas; suplementos minerales; sustancias usadas para el tratamiento, prevención, diagnóstico, cura o mitigación de una enfermedad o padecimiento; sustancias que afectan la estructura o función del cuerpo; o profármacos, que se vuelven biológicamente activos o más activos después de que se han colocado en un ambiente fisiológico.

La frase "cantidad terapéuticamente efectiva" como se usa en la presente significa que la cantidad de un compuesto, material o composición que comprende una formulación anti-infectiva de lípidos de acuerdo con la presente invención que es efectiva para producir algún efecto terapéutico deseada inhibiendo infecciones pulmonares. El término "tratamiento" se reconoce en la técnica y se refiere a la curación así como disminución de por lo menos un síntoma de cualquier condición o enfermedad. El término "tratamiento" también se refiere al tratamiento profiláctico que actúa para defender contra o prevenir una condición o enfermedad. 2. Anti-infectivos Los anti-infectivos son agentes que actúan contra infecciones, tales como infecciones bacterianas, microbacteriales, fúngicas, virales o de protozoarios. Los anti-infectivos cubiertos por la invención incluyen, pero no se limitan a aminoglicósidos (v.gr., estreptomicina, gentamicina, tobramicina, amicacina, netilmicina, canamicina, y similares) , tetraciclinas (tales como clortetraciclina, oxitraciclina, metaciclina, doxiciclina, minociclina y similares), sulfonamidas (v.gr., sulfanilamina, sulfadiazina, sulfametoxazol, sulfisoxazol, sulfacetamida, y similares) , ácido paraminobenzoico, diaminopirimidinas (tales como trimetoprim, con frecuencia usado junto con sulfametoxazol, pirazinamida, y similares) , quinolonas (tales como ácido nalidixico, cinoxacina, ciprofloxacina y norfloxacina y similares) , penicilinas (tales como penicilina G, penicilina V, ampicilina, amoxocilina, bacampicilina, carbenicilina, carbenicilina indanilo, ticarcilina, azlocilina, mezlocilina, piperacilia, y similares) , penicilina resistente a penicilinasa (tal como meticilina, oxacilina, cloxacilina, dicloxacilina, nafcilina y similares) , cefalosporina de la primera generación (tal como cefadroxilo, cefalexina, cefradina, cefalotina, cefapirina, cefazolina y similares) , cefalosporinas de la segunda generación (tales como cefaclor, cefamandol, cefonicida, cefoxitina, cefotetano, cefuroxima, cefuroxima axetilo; cefmetazol, cefprozilo, loracarbef, ceforanida, y similares), cefalosporinas de la tercera generación, (tales como cefepima, cefoperazona, cefotaxina, ceftizoxima, ceftriaxona, ceftazidima, cefixima, defpodoxima, ceftibuteno, y similares), otras beta-lactamas (tales como imipenema, meropenema, aztreonam, ácido clavulanico, sulbactama, tazobactama y similares), inhibidores de betalactamsa (tales como ácido clavulanico) , cloranfenicol, macrolidos (tales como eritromicina, azitromicina, claritromicina y similares)', lincomicina, clindamicina, espectinomicina, polimixina B, polimixinas (tales como polimixina A, B, C, D, El (colistina A) , o E2, colistina B o C, y similares) , colistina, vancomicina, bacitracina, isoniazida, rifampina, etambutol, etionamida, ácido aminosalicílico, cicloserina, capreomicina, sulfonas (tales como dapsona, sulfoxona de sodio y similares) , clofazimina, talidomida, o cualquier otro agente antibacteriano que puede ser encapsulado por lípidos. Anti-infectivos pueden incluir agentes antifungicos, incluyendo antifungicos de polieno (tales como anfotericina B, nistatina, natamicina, y similares) , flucitosina, imidazoles (teles cono n-ticonazol, clotrimazol, econazol, cetoconazol, y similares) , triazoles (tales como itraconazol, fluconazol, y similares), griseofulvina, terconazol, butoconazol ciclopirax, ciclopirox olamina, haloprogina, tolnaftato, naftifina, terbinafina, o cualquier otro antifungico que puede ser encapsulado o formado complejo con lípidos. La discusión y los ejemplos se dirigen principalmente a amicacina pero no se pretende limitar el alcance de la solicitud a este anti-infectivo. Se pueden usar combinaciones de fármacos. Los anti-infectivos particularmente preferidos incluyen los aminoglicósidos, las quinolonas, los antifúngicos de polieno y la polimixina. También se incluyen anti-infectivos adecuados usados en las formulaciones anti-infectivas de lípidos de la presente invención son las sales de adición farmacéuticamente aceptable y complejos de anti-infectivos. En los casos en donde los compuestos pueden tener uno o más centros quirales, a menos que se especifique, la presente invención comprende cada compuesto racémico único, así como cada compuesto no racémico único. En los casos en los cuales los anti-infectivos tienen dobles ligaduras de carbono-carbono, ambos isómeros cis (Z) y trans (E) están dentro del alcance de esta invención. En casos en donde los anti-infectivos pueden existir en formas tautoméricas, tales como tautómeros ceto- 0 OR' enol, tales como -^ y --*=* fin, cada forma tautomérica se contempla por incluirse dentro de esta invención, siempre que exista en equilibrio o cerrada en una forma por sustitución apropiada con R1. El significado de cualquier sustituyente en cualquier presentación es independiente de este significado, o cualquier otro significado de sustituyente, en cualquier otra presentación. También se incluyen anti-infectivos adecuados en las formulaciones anti-infectivas de lípidos de la presente invención son los profármacos de los compuestos de platino. Los profármacos se consideran cualquier vehículo unido covalentemente que liberan el compuesto madre activo in vivo. 3. Infecciones Pulmonares Entre las infecciones pulmonares (tales como en paciente de fibrosis cistica) que pueden tratarse con los métodos de la invención son infecciones por Pseudomonas (v.gr., P. aeruginosa, P. paucimobilis, P. putida, P. fluorescens, y P. acidovorans) , staphylococcal, resistente a Meticilina Staphylococcus aerus (MRSA) , streptococcal (incluido por Streptococcus pnemoniae) , Escherichia coli, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Haemophilus, Yersinia pesos, Burkholderia pseudomallei, B cepacia, B gladioloi, B.multivorans, B. vietnamiensis, Mycobacterium tuberculosis, M. marinum, ulcerans, o complejo de M. fortuitum (M. fortuitum y chelonei) .

. - Métodos de Tratamiento En una modalidad, la presente invención comprende un método de tratamiento que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de una formulación anti-infectiva de lípidos. En donde no se provee una dosis específica, la dosis preferida de la invención es de 50% o menos, 35% o menos, 20% o menos, o 10% o menos, del fármaco libre mínimo (que desde luego puede ser una sal) cantidad que es efectiva, si se suministra a los pulmones vía un nebulizador, para reducir el contenido de CFU en los pulmones por una orden de magnitud sobre el transcurso de un tratamiento de 14 días. La cantidad de fármaco libre comparativa es la cantidad acumulativa que podría usarse en el período de dosificación aplicado con la administración de fármaco de la invención. El fármaco libre mínimo comparativo definido en este párrafo es una "cantidad de fármaco libre comparativa". Las modalidades que no tratan FC de la invención se pueden usar con un animal, aunque preferiblemente con seres humanos. Las cantidades relativas en un animal dado se midieron con respecto a dicho animal. El programa de dosificación preferiblemente una vez al día o menos. En modalidades preferidas, el programa de dosificación es una vez cada día, cada tercer día, cada semana, o menos. Por ejemplo, el programa de dosificación puede ser una vez al día, o menos, usando 50% o menos de la cantidad de fármaco libre comparativo. O, por ejemplo, la dosificación puede ser 35% de uso diario o menos de la cantidad de fármaco libre comparativo. Véase Figuras 3 y 4 para datos animales que muestran que las formulaciones antiinfectivas de lípidos de la presente invención son más eficaces que el fármaco libre. Para tratar infecciones, la cantidad del anti-infectivo será reconocida por médicos pero incluye una cantidad efectiva para tratar, reducir, disminuir, eliminar o prevenir uno o más síntomas de enfermedad que se busca que sean tratados o la condición que se busca que sea evitada o tratada, o de alguna manera produzcan un cambio clínicamente reconocible en la patología de la enfermedad o condición. La disminución incluye reducir la incidencia o severidad de infecciones en animales tratados profilácticamente. En ciertas modalidades, la cantidad efectiva es una efectiva para tratar o disminuirse después de que surgen los síntomas de infección por pulmón. En otras ciertas modalidades, la cantidad efectiva es efectiva para tratar o disminuir la incidencia promedio o severidad de infecciones en animales tratados profilácticamente (como se midió por estudios estadísticos) . Los liposomas u otros sistemas de suministro de lípidos pueden administrarse para inhalación ya sea como un rocío nebulizado, polvo, o aerosol, o por administración intratecal. Se prefieren administraciones de inhalación. El resultado global es una administración menos frecuente y un índice terapéutico incrementado comparado con el fármaco libre o forma parenteral del fármaco. Los liposomas u otras formulaciones de lípidos son particularmente ventajosas debido a su capacidad de proteger el fármaco mientras es compatible con el forro de pulmón o agente tensioactivo de pulmón La presente invención incluye métodos para tratamiento de infecciones gram-negativos pulmonares. Una infección útilmente tratada es infección pseudomonal crónica en pacientes con CF. Los tratamientos conocidos de infecciones de pulmón (tales como pacientes con CF) con aminoglicosido comprende generalmente administrar aproximadamente 200 - 600 mg de amicacina o tobramicina por día vía inhalación. La presente invención permite el tratamiento administrando, en una modalidad preferida, 100 mg o menos de amicacina por día (o normalizado a 100 mg por día o menos si la dosificación es menos frecuente) . En aún otra modalidad, se realiza la administración de 60 mg o menos de amicacina por día. Y en aún otra administración de modalidad de aproximadamente 230 a 50 mg se realiza no más de una vez cada 2 días.. La mayoría de las modalidades preferidas comprende de aproximadamente 30 a 50mg cada día o cada tercer día. 5. Lipidos o Liposomas Los lípidos usados en las composiciones de la presente invención pueden ser lípidos sintéticos, semisintéticos o presentes en la naturaleza, incluyendo fosfolípidos, tocoferoles, esteroides, ácidos grasos, glicoproteínas tales como albúmina, lípidos aniónicos y lípidos catiónicos. Los lípidos pueden ser aniónicos, catiónicos o neutros. En una modalidad, la formulación de lípidos es sustancialmente libre de lípidos aniónicos. En una modalidad, la formulación de lípidos comprende solo lípidos neutros. En otra modalidad, la formulación de lípidos está libre de lípidos aniónicos. En otra modalidad, el lípido es un fosfolípido. Los fosfolípidos incluyen fosfatidilcolina de huevo (EPC) , fosfatidilglicerol de huevo (EPG) , fosfatidilinositol de huevo (EPI), fosfatidilserina de huevo (EPS) , dosfatidiletanolamina de huevo (EPE) , y ácido fosfatídico de huevo (EPA) ; las contrapartes de soya, fosfatidilcolina de soya (SPC); SPG, SPS, SPI, SPE, y SPA; el huevo hidrogenado y contrapartes de soya (v.gr., HEPC, HSPC) , otros fosfolípidos constituidos de ligaduras de ester de ácidos grasos en las posiciones 2 y 3 de glicerol conteniendo las cadenas de 12 a 26 átomos de carbono y diferentes grupos superiores en la posición 1 del glicerol que incluye colina, glicerol, inositol, serina, etanolamina, así como los ácidos fosfatidicos correspondientes. Las cadenas de estos ácidos grasos pueden ser saturadas o insaturadas y el fosfolípido puede estar constituido de ácidos grasos de diferentes longitudes de cadenas y diferentes grados de insaturación. En particular, las composiciones de las formulaciones pueden incluir dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) , un constituyente principal de agente tensioactivo de pulmón presente en la naturaleza así como dioleoilfosfatidilcolina (DOPC) . Otros ejemplos incluyen dimirsitoilfosfatidilcolina (DMPC) y dimiristoilfosfatidilglicerol (DMPG) , dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) y dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG) , diestearoilfosfatidilcolina (DOPE) y fosfolípidos mixtos como palmitoilestearilfosfatidilcolina (PSPC) y palmitoilestaroilfosfatidilglicerol (PSPG) , diacilglicerol, diacilglicerol, seranida, esfingosina, esfingomielina y fosfolípidos acilados solos como mono-oleoil-fosfatidiletanol amina (MOPE) . Los lípidos usados pueden incluir sales de amonio de ácidos grasos, fosfolípidos y . glicéridos, esteroides, fosfatidilgliceroles (PIs) y las fosfatidilserinas (PSs) . Los ácidos grasos incluyen ácidos grasos de longitudes de cadena de carbono de 12 a 26 átomos de carbono que son saturados o insaturados. Algunos ejemplos específicos incluyen: miristilamina, palmitilamina, laurilamina y estearilamina, dilauroil etilfosfocolina (DLEP) , dimiristoil etilfosfocolina (DMEP), dipalmitoil etilfosfocolina (DPEP) y distearoil etilfosfocolina (DSEP) , cloruro de N- (2, 3-di- (9 (Z)-octadeceniloxi) -prop-l-il-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA) y 1,2-bis (oleoiloxi) -3- (trimetilamonio) propano (DOTAP). Ejemplos de esteroides incluyen colesterol y ergoesterol. Ejemplos de PGs, PAs, PIs, y PSs incluyen DMPG, DPPG, DSPG, DMPA, DPPA, DSPA, DMPI, DPPI, DSPI, DMPS, DPPS y DSPS, DSPC, DPPG, DMPC, DOPC, PC de huevo. Los liposomas o formulaciones anti-infectivas de lípidos compuestos de fosfatidilcolinas, tales como DPPC, auxiliar en la absorción por las células en el pulmón tal como los macrófagos alveolares y ayuda a sostener la liberación del agente anti-infectivo en el pulmón (Gonzales-Rothi y otros (1991)). Los lípidos cargados negativamente tales como PGs, PAs, PSs y PIs, además de reducir la agregación de partículas, pueden jugar un papel en las características de libración sostenida de la formulación de inhalación así como en el transporte de la formulación a través del pulmón (transcitosis) para la absorción sistémica. Se piensa que los compuestos de esteróles afectan las características de liberación y fugas de la formulación. Los liposomas son membranas de dos capas de lípidos completamente cerradas que contienen un volumen acuoso atrapado. Los liposomas pueden ser vesículas unilaminares (teniendo una bicapa de una sola membrana) o vesículas multilaminares (estructuras similares a cebollas caracterizadas por bicapas de membranas múltiples, cada uno separado del siguiente por una capa acuosa) . La bicapa está compuesta de dos monocapas de lípidos que tienen una región "final" hidrofóbica y una región "superior" hidrofílica. La estructura de la bicapa de membranas es tal que la parte "final" (no polar) hidrofóbica de las monocapas de lípidos se orientan hacia el centro de la bicapa mientras las partes "superiores" hidrofílicas se orientan hacia la fase acuosa. Las formulaciones anti-infectivas de lípidos son asociaciones de lípidos y el agente anti-infectivo. Esta asociación puede ser covalente, iónico, electrostático, no covalente, o estérico. Estos complejos son no liposomales y son incapaces de atrapar solutos solubles de agua adicional. Ejemplos de dichos complejos incluyen complejos de lípidos de anfotencina B (Janoff y otros, Proc. Nat. Acad. Sci., 85:6122 6126, 1988) y la cardiolipina formada en complejo con doxorubicina. Un caltrato de lípidos es una estructura similar a jaula, tridimensional, empleando uno o más lípidos en donde la estructura atrapa un agente bioactivo. Dichos caltratos se incluyen en el alcance de la presente invención. Los proliposomas son formulaciones que pueden volverse liposomas o complejos de lípidos al formar granos en contacto con un líquido acuoso. La agitación u otra mezcla puede ser necesaria. Dichos proliposomas se incluyen en el alcance de la presente invención. Los liposomas puede producirse por una variedad de métodos (por ejemplo, véase, Bally, Cullis y otros, Biotechnol Adv. 5(1): 194, 1987). El procedimiento de Bangham (J. Mol. Biol., J Mol Biol. 13(1) :238-52, 1965) produce vesículas multilaminares ordinarios (MLV) . Lenk y otros, (Las Patentes de E.U.A. 4,522,803, 5,030,453 y 5,169,637), Fountain y otros (Patente de E.U.A. No. 4,588,578) y Cullis y otros (Patente de E.U.A. No. 4,975,282) describen métodos para producir liposomas multilaminares que tienen distribución de solutos interlaminares sustancialmente iguales en cada uno de sus compartimientos acuosos.

Paphadjopoulos y otros, la Patente de E.U.A. No. 4,235,871, describe la preparación de liposomas oligolaminares por evaporación de fase inversa. Las vesículas unilaminares pueden producirse de MLV por un número de técnicas, por ejemplo, la extrusión de Cullis y otros (Patente de E.U.A. No. 5,008,050) y Loughrey y otros (Patente de E.U.A. No. 5,059,421). El tratamiento con sonido y homogenización se pueden usar para producir liposomas unilaminares de liposomas más grandes (véase, por ejemplo, Paphadjopoulos y otros, Biochim. Biophys. Acta., 135:634-638, 1967; Deamer, Patente de E.U.A. No. 4,515,736; y Chapman y otros, Liposome Technol, 1984, pág. 1-18) . La preparación de liposomas originales de Bangham y otros (J. Mol. Biol., 1965, 13:238-252) implica suspender los fosfolípidos en un solvente orgánico que luego se evapora a sequedad que sale de una película de fosfolípidos en el recipiente de reacción. En seguida, se agrega una cantidad apropiada de fase acuosa, la mezcla se deja "hinchar", y los liposomas resultantes que consisten de vesículas multilaminares (MVL) se dispersan por medios mecánicos. Esta preparación provee la base para el desarrollo de las vesículas unilaminares tratadas con sonido pequeñas descritas por Papahadjopoulos y otros (Biochim. Biophys, Acta., 1967, 135:624-638), y vesículas unilaminares grandes.

Las técnicas para producir vesículas unilaminares grandes (VUL) , tales como, evaporación de fase inversa, procedimientos de infusión, y dilución de detergente pueden usarse para producir liposomas. Una revisión de estos y otos métodos para producir liposomas puede encontrarse en el texto de Liposomes, Marc Ostro, ed., Marcel Dekker, Inc, New York, 1983, Capítulo 1, las porciones pertinentes de las cuales se incorporan aquí por referencia. Véase también Szoka, Jr., y otros (1980, Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9:467), las porciones pertinentes de las cuales también se incorporan aquí por referencia. Otras técnicas que se usan para preparar vesículas incluyen aquellas que forman vesículas de evaporación de fase inversa (VEI), Papahadjopoulos y otros, Patente de E.U.A. No. 4,235,871. Otra clase de liposomas que se pueden usar son aquellos caracterizados teniendo distribución de solutos laminares sustancialmente iguales. Esta clase de liposomas se denomina como vesículas plurilaminares estables (VPLE) como se definió en la Patente de E.U.A. No. 4,522,803 de Lenk, y otros, e incluye vesículas monofásicas como se describió en la Patente de E.U.A. No. 4,588,578, de Fountain y otros, y vesículas multilaminares congeladas y descongeladas (VMTCYD) como se describió antes. Una variedad de esteróles y sus derivados solubles en agua tales como hemisuccinato de colesterol se han usado para formar liposomas; véase específicamente Janoff y otros, Patente de E.U.A. No. 4,721,612, expedida el 26 de enero de 1988, titulada "Steroidal Liposomes" Mayhew y otros, describió un método para reducir la toxicidad de agentes antibacterianos y agentes antivirales encapsulándolos en liposomas comprendiendo alfa-tocoferol y ciertos derivados de los mismos. También, una variedad de tocoferoles y sus derivados solubles en agua se han usado para formar liposomas, véase Janoff y otros, Patente de E.U.A. No. 5,041,278. 6. Métodos de Preparación Un proceso para formar liposomas o formulaciones anti-infectivas de lípidos implica un proceso de "infusión de solventes". Este es un proceso que incluye disolver uno o más lípidos en una cantidad pequeña, preferiblemente mínima, de un solvente compatible con el proceso para formar una suspensión o solución de lípidos (preferiblemente una solución) y luego someter a infusión la solución en un medio acuoso conteniendo un anti-infectivo. Normalmente un solvente compatible con el proceso es uno que puede lavarse en un proceso acuoso tal como diálisis o diafiltración. "Infusión de etanol", un tipo de infusión de solventes, es un proceso que incluye disolver uno o más lípidos en una cantidad pequeña, preferiblemente mínima, de etanol para formar una solución de lípidos y luego someter a infusión la solución en un medio acuoso conteniendo el anti-infectivo. Una cantidad "pequeña" de solvente en una cantidad compatible con la formación de liposomas o complejos de lípidos en el proceso de infusión. Dichos procesos se describieron en Lee otros, Solicitud de Patente de E.U.A. 10/634,144, presentada el 4 de agosto de 2003, Pilkiewicz y otros, Solicitud de Patente de E.U.A. 10/282,173, presentada el 5 de marzo de 2003, y Boni y otros, Solicitud de Patente de E.U.A. 10/383,004, presentada el 5 de marzo de 2003, dichas solicitudes se incorporan aquí por referencia en su totalidad. El paso para someter la infusión la solución de lípido-alcohol en la solución acuosa o alcohólica o mezcla que contiene el anti-infectivo puede realizarse por arriba o debajo de la superficie de la solución acuosa o alcohólica o mezcla que contiene el anti-infectivo. Preferiblemente, el paso se realiza por arriba de la superficie de la solución o mezcla. Los liposomas también se pueden preparar por los métodos descritos en las Solicitudes de Patentes de E.U.A. copendientes: 10/383,004, presentada el 5 de marzo de 12003; 10/634,144, presentada el 4 de agosto de 2003; 10/2004,293, presentada el 20 de agosto de 2002; y 10/696,389, presentada el 29 de octubre de 2003, las especificaciones de las cuales se incorporan aquí en su totalidad.

El dimensionamiento de formulación de liposomas o lípidos puede lograrse por un número de métodos, tales como técnicas de extrusión, tratamiento con sonido y homogenización que son bien conocidos, y se practican fácilmente conocidos por los expertos. La extrusión implica pasar liposomas, bajo presión, una o más veces a través de filtros que tienen tamaños de poro definidos. Los filtros generalmente están hechos de policarbonato, pero los filtros pueden hacerse de cualquier material durable que no interactúa con los liposomas y que son suficientemente fuertes para permitir la extrusión bajo presión suficiente. Los filtros preferidos incluyen "filtros" de paso recto" debido a que generalmente pueden soportar la presión superior de los procesos de extrusión preferidos de la presente invención. También ,se pueden usar los filtros de "trayectoria tortuosa", que implican extruir liposomas a través de un filtro poroso de óxido de aluminio del tipo de poro ramificad. Las formulaciones de liposomas o lípidos también pueden tener un tamaño reducido por tratamiento reducido, que emplea energía sónica para alterar o rasgar os liposomas, que se reformarán espontáneamente en liposomas más pequeños. El tratamiento con sonido se lleva acabo sumergiendo un tubo de vidrio conteniendo la suspensión de liposomas en el epicentro sónico producido en un tratador con sonido del tipo de baño.

Alternativamente, un tratador con sonido del tipo de sonda se puede usar, en el cual se genera energía sónica por vibración de una sonda de titanio en contacto directo con la suspensión de liposomas. La homogenización o aparatos de molido, tales como homogenizador de Madera Gifford, Polytron™ o Microfluidizante, también se pueden usar para romper los liposomas más grandes o formulaciones de lípidos en liposomas más pequeños o formulaciones de lípidos. Las formulaciones liposomales resultantes pueden separarse en poblaciones homogéneas usando métodos bien conocidos en la materia; tales como filtración de flujo tangencial. En este procedimiento, una población de tamaño heterogéneo de liposomas o formulaciones de lípidos se pasa a través de filtros de flujo tangenciales, dando como resultado así una población de liposomas con un límite de tamaño superior y/o inferior. Cuando se emplean dos filtros de diferentes tamaños, es decir, que tienen diferentes diámetros de poro, los liposomas más pequeños que el primer diámetro de poro pasa través del filtro. Este filtrado puede ser sujeto a filtración de flujo tangencial a través de un segundo filtro, que tiene un tamaño de poro más pequeño que el primer filtro. El retentato de este filtro es una población liposomal/formada en complejo que tiene límites de tamaño superior e inferior definidos por los tamaños del poro de los primero y segundo filtros, respectivamente.

Mayer y otros, encontraron que los problemas asociados con atrapamiento eficiente de agentes bioactivos ionizables lipofílicos tales como agentes antineoplásticos, por ejemplo, antraciclinas o vinca alcaloides, se pueden aliviar empleando gradientes de iones de transmembrana. Además de inducir la absorción superior, dichos gradientes de transmembrana también pueden actúan para incrementar la retención anti-infectiva en la formulación liposomal. Las formulaciones anti-infectivas de lípidos tienen un efecto anti-infectivo sostenido y toxicidad inferior permitiendo la administración menos frecuente y un índice terapéutico incrementado. En estudios de animales preclínicos y en comparación con tobramicina inhalada (no liposomal o basada en lípidos) al nivel de dosis equivalente, se mostró que la amicacina liposomal tiene, durante el tiempo más corto después de la administración a más de 24 horas después, niveles de fármaco en el pulmón que varió de dos a varios cientos de veces que el de tobramicina. Adicionalmente, la amicacina liposomal mantuvo estos niveles durante más de 24 horas. En un modelo animal diseñado para imitar la infección de pseudomonas observadas en paciente de CF, la amicacina liposomal se mostró que limita significativamente la infección en los pulmones de animales cuando se compare para liberar aminoglicosidos.

El agente tensioactivo de pulmones permite la expansión y compresión de los pulmones durante la respiración. Esto se logró revistiendo el pulmón con una combinación de lípido y proteína. El lípido se presentó como una monocapa con las cadenas hidrofóbicas dirigidas hacia afuera. El lípido representa el 80% del agente tensioactivo del pulmón, la mayoría del lípido que es fosfatidilcolina, 50% del cual es fosfafatidilcolina de dipalmitoilo (DPPC) (Veldhuizen y otras, 1998) . Las proteínas de agentes tensioactivos (PA) que son una función presentes para mantener la estructura y facilita la expansión y compresión del agente tensioactivo de pulmón como ocurre durante la respiración. De estos, PA-B y PA-C tienen específicamente el comportamiento lítico y pueden lisar los liposomas (Hagwood y otros, 1998; Johansson, 1998) . Este comportamiento lítico podría facilitar la ruptura gradual de liposomas. Los liposomas también pueden ingerirse directamente por macrófagos a través de fagocitosis (Couveur y otros, 1991; Gonzales-Roth y otros, 1991; Swenson y otros, 1991) . La absorción de liposomas por macrófagos alveolares es otro medio por el cual los fármacos pueden suministrarse al sitio enfermo. Los lípidos usados preferiblemente de otras formulaciones liposomales o de lípidos para la inhalación son comunes para los lípidos endógenos encontrados en el agente tensioactivo de pulmones. Los liposomas están compuestos de bicapas que atrapan el fármaco deseado. Estos pueden configurarse como vesículas multilaminares de bicapas concéntricas con el fármaco atrapado dentro del lípido de diferentes capas o el espacio acuoso entre las capas. La presente invención usa proceso únicos para crear formulaciones anti-infectivas liposomales o de lípidos únicas. Tanto los procesos como el producto de estos procesos son parte de la presente invención. 6.1 Método de Infusión En-Linea En una modalidad particularmente preferida de las formulaciones anti-infectivas liposomales de la presente invención se preparar por un método de infusión en línea en donde una corriente de solución de lípidos se mezcla con una corriente de solución anti-infectiva en línea. Por ejemplo, las dos soluciones pueden mezclarse en línea dentro de un tubo de mezcla precedido por un conector en Y como se describió en la Figura 8. De esta forma, el método de infusión en línea difiere del método de infusión descrito antes, en donde 1 a solución de lípidos se infusiona a una corriente en un volumen de solución anti-infectiva. Sorprendentemente, este método de infusión da como resultado relaciones de lípido a fármaco inferiores y eficiencias de encapsulación superiores. El proceso además puede mejorarse optimizando los parámetros tales como régimen de flujo, temperatura, concentración anti-infectiva y adición de sales después del paso de infusión. 6.1.a. Efecto de regímenes de flujo Los regímenes de flujo individuales variaron mientras mantuvieron el régimen de flujo total a 800 ml/min. Para hacerlo, se usaron dos bombas separadas usadas establecidas a diferentes regímenes de bombeo. Las soluciones mezcladas se infusionaron durante 10 s en un agitador que contiene solución de NaCl de manera que la concentración final de NaCl fue de 1.5% y la concentración de etanol final no excedió el 30%. Después del mezclado, una alícuota de 1 ml se operó a través de la columna de filtración de gel Sephadex G-75 para separar la amicacina libre de encapsulado. Una fracción de 1 ml con densidad superior (determinada por turbidez visual) se recuperó para análisis adicional. Los resultados se presentan en la Tabla 1. Incrementando la relación de régimen de flujo de lípidos/amicacina dio como resultado una L/D casi constante hasta 300/500 l/min. Con incremento adicional de régimen de lípidos, L/D inició el incremento y el tamaño de partículas también inició haciéndose más grande. Al mismo tiempo, los orígenes de flujo de lípidos superiores dieron mejor recuperación de amicacina (eficiencia de encapsulación) a medida que se agregó más masa de lípidos.

Tabla 1. Efecto de régimen es de flujo sobre encapsulación de amicacina. * *. Las soluciones de lípidos y amicacina se mantuvieron a 40°C. La solución de choque de amicacina fue de 50 mg/ml. La solución de NaCl 10% se agregó antes de que la infusión obtuviera 1.5% final. El tiempo de infusión se fijó a lOs. El tubo de mezclado 10 cm; mezclador en línea 'de 6 elementos colocado a 0 cm. El lote 3 con los regímenes de flujo de lípidos/amicacina de 2300/500 ml/min mostraron el mejor tamaño de L/D y partículas, combinado con recuperación de amicacina razonablemente alta Por lo tanto se decidió para usar estos regímenes de flujo para todos los experimentos adicionales. Con el fin de reproducir los resultados a condiciones elegidas un lote completamente lavado (lote 6) usando diafiltración se preparó como se presentó en la Tabla 2. La solución de NaCl al 10% se agregó en el agitador antes de la infusión para formar la concentración final del 2% (comparado con 1.5% en los lotes en la Tabla' 1). El L/D resultante (1.71) no fue bueno como en el lote 3 en la Tabla 1 y el tamaño de partícula fue superior. Esto se debe a un efecto adverso de concentración de NaCl alto poniendo en contacto los liposomas en las etapas tempranas de formación de liposomas. La muestras separadas (lavadas) usando las columnas de filtración de gel tienden a tener L/D mejores que los lavados por diafiltración. Esto puede haberse hecho con diferente grado de experiencia de liposomas de tensión, o simplemente las muestras separadas en la columna de filtración de gel contuvieron una fracción de liposomas con mejor L/D que no representa toda la población.

Tabla 2. Sumario de los lotes completamente lavados. Los parámetros del proceso variados fueron: temperaturas, concentración de materia prima de amicacina, y otros (véase Tabla 3 siguiente) . Todos los lotes se concentraron a un grado casi máximo, hasta que la presión de entrada alcanzó 0.703 kg/cm2.

* La tercera columna representa las temperaturas de soluciones de Lípidos y Amicacina justo antes de la infusión, y la temperatura durante el lavado (diafiltración) . TA= Temperatura ambiente. "tamaño de VOL" es el tamaño de partículas pesado en volumen.

Tabla 3. Condiciones de procesamiento para los lotes 1-18*.

* Soluciones de lípido y amicacina se sometieron a infusión a regímenes de 300/500 ml/min durante 30 s (ejemplos 6 - 10) o 20 s (ejemplos 11-18) . La solución acuosa adicional (NaCl o agua) se agregó (como partes relativas a 500 partes de amicacina por volumen) . 6.1.b. Efectos de temperatura de proceso Se mantuvieron ajustes iguales en el lote 3 excepto que la cantidad de solución de NaCl añadida fue menor, formando la concentración final 1.0%. La solución se agregó de nuevo antes de que se iniciara la infusión debido a que con el tiempo de infusión más corto fue difícil de realizar la adición durante la infusión. También, durante la infusión la mezcladora en línea cambió al final del tubo de mezclado bajo la presión del flujo. La posición de la mezcladora fue de 5 cm desde el extremo frontal al tubo en lugar de 0 cm para el lote 3. Esto puede ser importante como la relación de L/D obtenida a la misma condición de temperatura de 40/40°C en el lote 20 fue de 0.55, casi la mitad del lote 3. En comparación a la encapsulación de amicacina a diferentes temperaturas de infusión, se puede observar que, sorprendentemente, las temperaturas inferiores dieron mejor L/D. De las temperaturas probadas, las temperaturas de lípido/amicacina 30/30°C y 50/TA dio relaciones de L/D similares de 0.32 y 0.37. De nuevo, como en los lotes 1-5, los números de estas muestras lavadas por filtración de gel fueron bajas, tal vez menores a aquellas si los lotes se lavaron por diafiltración. Tabla 4. Efecto de temperatura en encapsulación de amicacina.* *Las soluciones de lípidos y amicacina se sometieron a infusión a regímenes de 300/500 ml/min durante lOs. La solución madre de amicacina fue de 50 mg/ml. La solución de NaCl al 10% se agregó antes de la infusión para obtener una concentración final de 1.0%. El tubo de mezclado de 10 cm, mezcladora en línea de 10 elementos se colocaron a 5 cm. En los experimentos separados se encontró que el mezclado de 90% de etanol y agua a 30°C y 30°C o 50°C y 22°C, respectivamente, dio como resultado una temperatura final similar de casi 36°C. Esto sugiere que la temperatura de la mezcla final en lugar de la de los componentes individuales se importante • para encapsulación de amicacina. Las temperaturas de 50°C/TA se usaron en los ejemplos 6-15. En los ejemplos 16-18 se usaron temperaturas de 30°C y 30°C para las dos corrientes se usaron con resultados comparables, aunque se observó un poco menos encapsulación de amicacina. 6.1. c. Efecto de adición post-infusión de volumen acuoso La atención después se enfocó en los pasos de adición de solución de NaCl y el proceso de lavado. Los parámetros del proceso se variaron en varias direcciones.

Justo después del paso de infusión a regímenes de flujo de 300/500, la concentración de etanol en la mezcla alcanza el 34%. La amicacina ha limitado la solubilidad a esta concentración (véase la Figura 9) . Si se inicia con choque de amicacina de 50 mg/ml, después de mezclarse con la solución de lípidos aún hubo más de 30 mg/ml de amicacina total en donde por lo menos la mitad de (15 mg/ml) es amicacina libre, suponiendo que la eficiencia de encapsulación del 50%. Esto es superior al límite de solubilidad a 34% de etanol. Una posible solución a este problema es agregar más agua al recipiente con la mezcla de lípidos/amicacina, reduciendo así la concentración de tanto etanol como amicacina. Por ejemplo, agregando 200 partes de agua (o solución de NaCl) a 800 partes de lípido/amicacina podría reducir etanol al 27% (Figura 9) . Esto hace que la amicacina sea soluble a 15 mg/ml o aún superior dependiendo de la temperatura. Además, la adición de NaCl puede estabilizar las condiciones osmóticas. Cuando los liposomas se forman y se encapsula la amicacina a una concentración interna de 200-300 mg/ml, solo hay -15 mg/ml de amicacina no encapsulada. La ausencia de solución salina esto podría crear un desequilibrio osmótico, que a su vez podría conducir a la fuga de amicacina. Agregando 150 partes de 10% de NaCl a 800 partes de lípido/amicacina dará como resultado una concentración final de aproximadamente 1.5% NaCl (liposomas externos) .

Se generó un número de lotes cuando diferentes cantidades de solución de NaCl (o agua en algunos lotes) se agregaron en diferentes tiempos en relación al evento de infusión (véase la Tabla 5, recopilado de las Tablas 2 y 3) . A partir de la tabla se puede observar una tendencia general, conduciendo a las siguientes conclusiones: - Algún tiempo entre la infusión y adición del volumen acuoso se requiere para obtener L/D inferior (si se usa un tubo de mezclado corto) . De los lotes 6-15, aquellos con un intervalo de 20 s o más tuvo L/D inferior. Una explicación posible es que los liposomas no se forman completamente de manera inmediata después del mezclado de las corrientes. Cuando se usa un tubo de mezclado más largo (lotes 16-18), que permite un tiempo de mezclado más largo, no se requiere el intervalo de tiempo. Agregando una solución de NaCl de alta concentración para equilibrar la osmolalidad no ayuda realmente a retener amicacina. De hecho, agregando agua pura a un intervalo de tiempo apropiado da como resultado L/D inferior y concentración de amicacina total. - Agregando 100 partes de NaCl al 10% (lote 9) 5 minutos después de la infusión dio una relación de L/D competitiva pero no dio una concentración de amicacina tan buena como el total. Puede ser que NaCl, cuando está presente en etapas tempranas con concentraciones de etanol relativamente alteas, conduce a la agregación y viscosidad incrementada. Tabla 5. Papel de volumen acuoso y concentración de NaCl agregada a la mezcla de lípido/amicacina para ajustar la concentración de etanol. No todas las variables mostradas; véase Tablas 2 y 3. ß.l.d. Efecto de solución de choque anti-infectiva Previamente se -encontró que la solución de choque de amicacina de 50 mg/ml produjo el mejor atrape. Reduciendo la concentración de materia prima de amicacina a 40 mg/ml incrementó la L/D cuando se usó en procesos convencionales. Con el proceso de infusión en línea de dos corrientes, la concentración de etanol alcana niveles superiores, de manera que la corriente de 50 mg/ml de amicacina no puede ser la concentración óptima. La Tabla 6 resume el efecto de usar varias concentraciones de materia prima de amicacina. 40 mg/ml suministrado comparable o valores de L/D mejores y recuperación de amicacina aún mejorada. Usando menos amicacina en relación con una cantidad constante de lípido, y proporcionando una L/D similar, da como resultado un porcentaje superior de encapsulación (lote 12) . Además disminuyó la concentración de materia primera de amicacina a 30 mg/ml dio como resultado una L/D ligeramente incrementada, aunque la recuperación aún fue imprevista (lote 13) . Tabla 6. La concentración madre de amicacina puede reducirse mientras mejora la eficiencia. La recuperación de amicacina se calcula con base en L/D obtenida y con recuperación de lípidos supuesta de 100%.

La reducción de la concentración de materia prima de amicacina tiene otra implicación. Reduce la concentración de amicacina libre en una mezcla de lípidos/amicacina después de la infusión, permitiendo que permanezca soluble a concentración de etanol superior. Suponiendo que el lípido y amicacina se mezclan a relación de 300/500, la materia prima de amicacina es de 50 mg/ml, y la eficiencia de encapsulación es de 37%, entonces la amicacina libre inicial podría ser de ~20 mg/ml. Similarmente, 40 mg/ml de materia prima de amicacina con 52% de encapsulación podría dar como resultado ~12 mg/ml de amicacina libre. 30 mg/ml de materia prima de amicacina con 46% de encapsulación podría dar como resultado ~10 mg/ (ml de amicacina libre. 7. Relación de Lipido a Fármaco Hay varias formas de incrementar el atrapamiento de anti-infectivos (v.gr., aminoglicósidos tales como amicacina, tobramicina, gentamicina) en liposomas. Una manera es formar liposomas muy grandes (>1 µm) en donde el volumen atrapado por cantidad de lípido es grande. Este enfoque para lograr una relación de L/D no es práctico para la inhalación (nebulización) de liposomas debido a 1) la tensión de esfuerzo cortante durante nebulización tiende a la ruptura de liposomas en un tamaño que depende de la manera en donde los liposomas más grandes (>0.5 µm) sufren de liberación mayor y 2) los tamaños de gota más pequeños necesarios para buen depósito de pulmón por sí mismos son menores que aproximadamente ~3 µm. Por lo tanto para inhalación, es conveniente mantener el tamaño del liposoma tan pequeño como sea posible para evitar mucha liberación. Actualmente, el diámetro medio para los liposomas descritos en la presente es menor que aproximadamente 0.4 µm (véase Tabla 4). Otro enfoque para disminuir L/D es usar lípidos cargados negativamente. Los aminoglicósidos litados antes están cargados altamente de manera positiva con 4 a 5 aminas por compuestos. Usualmente las sales de sulfato de estos aminoglicósidos se usan en formulaciones terapéuticas. Junto con el carácter multicatiónico viene una fuerte unión con los liposomas cargados negativamente. Esto da como resultado un atrape mayor durante la formación de liposomas. El propósito de formulaciones anti-infectivas es proveer liberación sostenida al ambiente del pulmón. El espacio libre rápido de los liposomas por absorción de macrófagos podría operar contrario a esto. Se ha documentado bien que los liposomas cargados negativamente experimentan un grado bastante superior de absorción por los macrófagos que los liposomas neutros. Por lo tanto, es conveniente usar liposomas neutros. Un grupo de tecnologías que permiten el atrape de fármaco muy alto en liposomas pequeños se basa en la carga de gradiente en donde un gradiente de pH, gradiente de sulfato de amonio, o gradiente de sulfato de MG se usan para cargar fármacos de amina en liposomas: véase las Patentes de E.U.A. Nos.: 5,578,320, 5,736,155, 5,837,279, 5,922,350 (gradiente de pH) ; 5,837,282, 5,785,987 (gradiente de Mg-sulfato) ; y 5,316,771 (gradiente de sulfato de amonio). Estas técnicas solo trabajan para aminas permeables en su membrana (las monoaminas en donde la forma neutra es permeable similar a doxorubicina y daunorubicina) . La carga de gradiente no trabajará para ciertos anti-infectivos tales como aminoglicosidos dado que son impermeables (muy grandes y cargados muy altamente) . Todos los procesos descritos en la presente se puede adaptar para manufactura aséptica harán escala. El tamaño de liposoma fina puede ajustarse modificando la composición de lípidos, concentración, excipientes y parámetros de procesamiento. La relación de lípido a fármaco usando los procesos de la presente invención es de aproximadamente 4:1 a alrededor de 1:1. En otra modalidad, la relación de lípido a fármaco es de aproximadamente 3:1 a alrededor de 1:1, 2:1 a alrededor de 1:1/ de aproximadamente 1:1 o menos, de aproximadamente 0.75:1 o menos o aproximadamente 0.5:1 o menos. Además, el porcentaje de anti-infectivo libre, presente después de que se dializa el producto para una duración particular, se disminuyó. 8. Resultados 8.1. Barreras de Biopelicula de Infecciones Pulmonares Un obstáculo para tratar enfermedades infeccionas tales como Pseudomonas aeruginosa, la causa principal de enfermedad crónica en pacientes con fibrosis cistica es la penetración de fármaco dentro de la barrera de esputo/biopelícula en células epiteliales (Figura 1) . En la Figura 1, las formas de dona representan una formulación anti-infectiva liposomal, el símbolo "+" representa antiinfectivo libre, el símbolo "-" mucina, alginato y ADN, y el símbolo de barra sólida representa Pseudomonas aeruginosa. La barrera está compuesto de: aeruginosa colonizada y planctónica embebida en alginato o exopolisacáridos de bacterias, así como ADN de leucocitos dañados, y mucina de células epiteliales de pulmón, todos teniendo una carga negativa neta (Costerton, y otros, 1999) . Esta carga negativa se une y evita la penetración de fármacos cargados positivamente tales como aminoglicósidos, haciendo los biológicamente inefectivos (Mendelman y otros, 1985) . El atrape de anti-infectivos dentro de las formulaciones liposomales o de lípidos podría proteger o proteger parcialmente los anti-infectivos de la unión no específica al esputo/biopelícula, permitiendo que penetren las formulaciones liposomales o de lípidos (con aminoglicósido atrapado) (Figura 1) . Se ha mostrado que la amicacina tiene un alto grado de resistencia a enzimas bacterianas proporcionando así un porcentaje mayor de aislados clínicos susceptibles que se encuentran para otros aminoglicósidos incluyendo tobramicina y gentamicina (Price y otros, 1976). En particular, aislados de P. aeruginosa son mucho más sensibles a amicacina que otros aminoglicósidos mientras no exhiben resistencia cruzada (Dámaso y otros, 1976) . La liberación sostenida y efecto de depósito de formulaciones liposomales de amicacina se observa claramente en la Figura 2. En este estudio se les dio a las ratas formulaciones liposomales de amicacina intratraquealmente a la misma dosis (4 mg/rata) . Los datos muestran que solo con la formulación liposomal de amicacina que se logra un efecto de liberación sostenida y de depósito. De hecho, 24 horas después de la dosificación, solo las formulaciones liposomales de amicacina muestran niveles significativos del fármaco en los pulmones de los animales, mientras ambas formulaciones de tobramicina revelaron niveles insignificantes, principalmente debido a que se piensa que es una absorción sistémica rápida. Este incremento mayor a cien veces de aminoglicósido en el pulmón para las formulaciones anti-infectivas liposomales soporta la idea de una formulación liposomal de liberación sostenida anti-infectiva que puede tomarse significativamente menos frecuente que la formulación de TOBI® (una solución de inhalación de tobramicina hecha por Chiron Corporation, Ameryville, CA) . Además, la presencia de un esputo/biopelícula evita la penetración de los aminoglicosidos libres debido a la unión de los anti-infectivos a su superficie (Figura 1) . Por lo tanto, las dosis en exceso de 1,000 gm de tobramicina/gramo de tejido de pulmón son necesarios para mostrar un efecto terapéutico en pacientes con FC. Esto se supera con formulaciones liposomales de amicacina. Por lo tanto, el nivel terapéutico de fármaco se mantuvo durante un largo período en las formulaciones liposomales de amicacina comparado con tobramicina libre. Esta facilitación de unión y penetración también podría ser un medio mediante el cual las formulaciones liposomales de amicacina podría reducir significativamente la resistencia bacteriana observada comúnmente para desarrollarlo cuando los antibacterianos están presentes in vivo a niveles debajo de la concentración inhibidora mínima. 8.2. Farmacocinética La farmacocinética de amicacina se determinó en ratas después de la administración intratraqueal (IT) de formulaciones libres de tobramicina o liposomales de amicacina. Estos datos se compararon a la distribución obtenida en los pulmones después de una inyección en la vena de la cola de tobramicina libre. En todos los casos, se administró una dosis de 4 mg/rata. Como se puede observar en la Figura 2, un depósito mucho más grande de aminoglicósido puede suministrarse por IT comparado con la inyección. El efecto de depósito de tecnología anti-infectiva liposomal también se demostró en que en comparación con la tobramicina dada ya sea IT o IV, mayor que un incremento de cien veces en el fármaco para las formulaciones liposomales de amicacina aún sigue estando en los pulmones veinticuatro horas después de la administración Por lo tanto, el nivel terapéutico de fármaco se mantuvo durante un tiempo más largo en las formulaciones liposomales de amicacina comparado con tobramicina libre. La unión de aminoglicósidos a esputo de pacientes con CF es una preocupación, particularmente si esta unión reduce la bioactividad del anti-infectivo (Hunt y otros, 1995) . Para determinar si las formulaciones liposomales de amicacina pueden retener la actividad biológica durante un tiempo prolongado, a las ratas normales se les administró formulaciones liposomales de amicacina por instilación intratraqueal. Esto siguió por su remoción a 2 o 24 horas vía un lavado alveolar bronquial (LAB) para determinar la actividad biológica. Las muestras se concentraron por ultrafiltración después de filtración (0.2 mieras) para remover los microbios de pulmón contaminantes. La concentración de amicacina se determinó empleando un instrumento de TDX y la actividad biológica determinada usando un análisis de dilución de caldo Mueller Hinton (Pseudomonas aeruginosa) . Los resultados se muestran en la Tabla 7. Tabla 7. Los resultados que muestran que las formulaciones liposomales de amicacina retienen actividad biológica durante un tiempo prolongado.

Como se muestra por la tabla anterior, la formulación liposomal filtrada recuperada de amicacina fue capaz de manera P. aeruginosa en un análisis de Mueller Hinton aún después de 24 horas con un MIC de 4. A las 2 horas se obtuvo un MIC de 2, que es similar al obtenido para la materia prima de amicacina liposomal/formada en complejo filtrada. Por lo tanto, la formulación liposomal de amicacina aún fue activa después de 24 horas en el pulmón. A 24 horas libre de tobramicina a la misma dosis fue indetectable en un BAL. Esto indica que no solo se retuvo la formulación antiinfectiva liposomal en el pulmón, sino también libremente disponible para penetrar un esputo/biopelícula con el tiempo.

Estos datos combinados con los hechos como es evidente en las Figuras 2 y Tabla 9 (siguiente) , que las formulaciones liposomales de amicacina liberan el anti-infectivo libre con el tiempo mientras mantiene niveles superiores del anti-infectivo en los pulmones, soporta racionalmente que este sistema puede producir un efecto anti-infectivo sostenido con el tiempo. Este efecto podrá proveer importante para reducir la carga biológica de las Pseudomonas y el desarrollo de resistencia debido a los niveles de depresión de anti-infectivo. Como una demostración in vito de liberación lenta de formulación liposomal de amicacina y su efecto antiinfectivo sostenido, la formulación se incubó en esputo de pacientes con Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica (EPOC) que contiene Pseudomonas mucoides de PAOl. La formulación liposomal de amicacina también se incubó en alginato conteniendo Pseudomona mucoide PAOl. En ambos casos se observó con el tiempo la muerte sostenida y aumentada de Pseudomonas, como se muestra en la Tabla 8.

Tabla 8. Muerte in vitro de Pseudomonas con el tiempo, Las curvas clásicas no se pueden aplicar a tecnología de formulación anti-infectiva liposomal debido a que las formulaciones liposomales exhiben una liberación lenta de anti-infectivo con un efecto anti-infectivo mejorado. La formulación liposomal protege la amicacina del esputo y/o alginato hasta su liberación. Con el tiempo se observó la muerte completa, concordante con el modelo del efecto anti-infectivo de liberación sostenida sin interferencia o inactivación de anti-infectivo. La eficacia de formulaciones de amicacina liposomales se estudió usando un modelo para infección pulmonar crónica (Cash y otros, 1979) en donde P. aeruginosa, embebido en una matriz de perlas de agarosa, se instiló en la traquea de ratas. Este modelo animal de Pseudomonas mucoides se desarrolló para asemejarse a la infecciones de Pseudomonas observadas en pacientes con FC. Algunas de las correlaciones clínicas con FC incluyen: una patología de pulmón similar; el desarrollo de trastornos de complejo inmune; y una conversión al fenotipo de mucoides por cepas de P. aeruginosa (Cantin y Woods, 1999) . Los pulmones de ratas se infectaron con más de 107 CFU de una Pseudomonas mucoide (cepa PAOl) tomada de un aislado de pacientes con FC, y se trató subsiguientemente con (a) aminoglicósido libre, (b) el vehículo de lípidos solo como control sin fármaco, y (c) formulación de amicacina liposomal. Además, las formulaciones se tamizaron primero en la capacidad de matar P. aeruginosa in vitro en placas modificadas de Kirby-Bauer. Varias formulaciones de amicacina liposomales se probaron con base en cualquier composición de lípidos diferente o parámetros de manufactura que dan como resultado diferentes zonas de muerte en experimentos in vitro. Este experimento se diseñó para determinar el incremento en eficacia obtenida con formulaciones de aminoglicósidos liposomales sobre aminoglicosido libre. Las composiciones de lípidos de control blanco, se compararon dos diferentes formulaciones de amicacina liposomales y amicacina libre y tobramicina libre a las mismas concentraciones de aminoglicósido que las formulaciones anti-infectivas liposomales. Además, también se dieron una dosis 10 veces superior de amicacina libre y una dosis 10 veces superior de tobramicina libre. La dosificación fue IT diaria durante siete días. Los resultados (Figura 3) indican que la amicacina liposomal en las dos formulaciones (difiriendo en la composición de lípidos) reveló una educción importante en niveles de CFU y fueron mejores para reducir CFU que la amicacina libre o tobramicina libre a dosis 10 veces superiores. En la Figura 3, Lip-An-14 es DPPC/Col (DOPC/DOPG (42:45:4:9) y 10 mg/ml de amicacina, Lip-An-15 es DDPC/Col (1:1) también a 10 m/ml . Todas las relaciones de lípido-lípido y lípido-fármaco en la presente son de peso a peso. El siguiente experimento (Figura 4) se diseñó para demostrar las capacidades anti-infectivas de liberan lenta y sostenida de formulaciones de amicacina liposomal. La dosificación fue diaria durante 14 días, opuesto a cada día durante siete días como loen los experimentos previos. Los resultados indican que la amicacina liposomal en las dos formulaciones (difiriendo en la composición de lípidos) tuvo de 10 a 100 veces más potencia (mayor capacidad de reducir los niveles de CFU) que la amicacina libre o tobramicina libre. Una dosis diaria en seres humanos de 600 mg TOBI® (una solución de inhalación de tobramicina hecha por Chiron Corporation, Ameryville, CA) , o aproximadamente 375 mg/m2, corresponde a una dosis diaria en ratas de 9.4 mg. Por lo tanto los datos pueden correlacionarse directamente a una mejora de 10 a 100 veces en eficacia humana. Deberá observarse que una reducción de dos registros es lo mejor que puede observarse en este modelo. Una reducción de 100 veces en P. aeruginosa en análisis de esputo se correlacionó con la función pulmonar mejorada (Ramsey y otros, 1993) . La liberación sostenida de las formulaciones de amicacina liposomales indican que una dosis inferior y/o dosificación menos frecuente puede emplearse para obtener una reducción mayor en desarrollo de bacterias de lo que se puede obtener con aminoglicosido libre. La eficacia de formulación de amicacina liposomal se estudió en un modelo para infección pulmonar crónica en donde p. aeruginosa se bebió en una matriz de perlas de agarosa que se instiló vía la traquea de ratas Spragye/Dawley. Tres días después se dosificó amicacina libre o amicacina liposomal cada día (Figura 3) o un día si y uno no (Figura 4) a l mg/rata o 10 mg/rata del aminoglicosido dado o 1 mg/rata de amicacina liposomal, así como con liposomas blanco (vehículo de lípidos) como el control con cinco ratas por grupo. Los pulmones de ratas homogenizadas (congeladas) después de un experimento de 14 días se analizaron para contenido de aminoglicósido y actividad. El análisis químico clínico se llevó a cabo usando un instrumento de TDX mientras se realizó el bioanálisis midiendo las zonas de inhibición en placas de agar embebidas con Bacillus subtilis. Los resultados se muestran en la Tabla 9: Tabla 9. Resultado de pulmones de ratas infectados con P. aeruginosa tratados con la formulación de amicacina liposomal .

Los pesos de fármaco son para el fármaco normalizado por la ausencia de cualquier forma de sal. Los resultados de la Tabla 10 indican que el aminoglicósido está presente y activo para las formulaciones anti-infectivas liposomales, mientras se puede detectar poco para el aminoglicosido libre aún a la dosis superior de 10 veces. Estos resultados adicionales establecen las características de liberación sostenida de formulaciones anti-infectivas liposomales, y también confirman que el antiinfectivo que aún permanece activo. De las formulaciones anteriores solo la tobramicina libre (0.1 microgramo/ml) exhibió cualquier nivel detectable de aminoglicosido en los riñones. La liberación sostenida y efecto de depósito de formulación de amicacina liposomal además se demostró en la Figura 5. A las ratas que se les provocó una infección pulmonar crónica se embebió con P. aeruginosa en una matriz de perlas de agarosa que se instiló vía la traquea, usando las mismas perlas empleadas en los estudios de eficacia. A las ratas se les dio tobramicina libre o amicacina liposomal (formulación Lip-An-14) vía administración intratraqueal a la misma dosis (2 mg/rata) . Los datos, medidos en anti-infectivo de microgramos por gramo de tejido de pulmón con el tiempo, muestra que el anti-infectivo liposomal exhibe una liberación sostenida y efecto de depósito mientras la tobramicina libre reveló niveles insignificantes en los pulmones durante 24 horas, principalmente debido a que se piensa que es una absorción sistémica rápida. Este incremento mayor a cien veces de anti-infectivo en pulmón para formulaciones de amicacina liposomales en una rata infectada, soporta la idea de que un anti-infectivo liposomal de liberación sostenida puede tomarse significativamente menos frecuente que la formulación de TOBI® aprobado actualmente (una solución de inhalación de tobramicina hecha por Chiron, Corporation, Ameryville, CA) . La farmacocinética de amicacina se determinó en ratas después de la administración intratraqueal (IT) de tobramicina libre o amicacina liposomal. Se administró una dosis de 2 mg/rata. El efecto de depósito de tecnología antiinfectiva liposomal se demostró en comparación con la tobramicina libre dada IT, un incremento mayor a cien veces en el fármaco para amicacina liposomal permanece aún en los pulmones infectados veinticuatro horas después de la administración. Por lo tanto, el nivel terapéutico de fármaco se mantuvo durante un periodo más largo en las formulaciones liposomales comparado con tobramicina libre. La Figura 7 muestra el tiempo de residencia notorio y la acumulación de cantidades efectivas de anti-infectivo en los pulmones, un resultado que establece que pueden usarse dosificaciones relativamente no frecuentes. Cada dosis es de 4 hr. por inhalación (en ratas, 3 ratas por grupo como antes) de formulaciones de amicacina liposomal nebulizada (DPPC/Col, 1;1) a 15 mg/ml amicacina. La dosificación fue en el día uno; día uno, tres y cinco; o día uno, dos, tres, cuatro y cinco. Las ratas proporcionando una barra de datos dada se sacrificaron después de la dosificación respectiva de la barra de datos. La formulación se hace como en el Ejemplo. Los anti-infectivos similares se pueden utilizar para el tratamiento de infecciones intracelulares como ántrax pulmonar y tularemia. En el ántrax pulmonar las esporas de ántrax alcanzas a los alveolos en un aerosol. Las esporas inhaladas se ingirieron por macrófagos pulmonares en los alvéolos y se llevaron a los nodos linfáticos traqueobronquial regional o nodos linfáticos mediastinales vía los linfáticos (Pile, y otros, 1998; Gleiser y otros, 1968) . El macrófago es central en la ruta infectiva y es el contribuyente principal de auto-destrucción de huésped en el ántrax sistémico (inhalación) . Además de estos atributos de liberación sostenida y dirección al blanco, la tecnología de formulación anti-infectiva liposomal puede aumentar la absorción celular y puede usar los macrófagos alveolares y las células epiteliales en la dirección al blanco del fármaco y suministro. La posesión, de estas características se piensa que ' facilita el tratamiento de estas infecciones intracelulares, dichas infecciones ocurren en los pulmones y se transportan por macrófagos. De manera más importante, estas características deberán hacer que sea más efectivo el anti-infectivo dado que el anti-infectivo liposomal puede fagocitarse por cada célula que contiene la enfermedad. El anti-infectivo podría liberarse intracelularmente en una forma dirigida, atacando así la infección antes de que se disemine. El fármaco encapsulado puede ser un fármaco ya aprobado como ciprofloxacina, tetracilina, eritromicina o amicacina. Se pueden desarrollar las formulaciones de ciprofloxacina liposomales. En un estudio, este compuesto se administró a ratones y se comparó con ciprofloxacina libre administrada intratraquealmente y ciprofloxacina libre administrada oralmente con los tres compuestos dados a la misma dosis (Figura 6) . La dosis para cada ratón fue de 15 mg/kg, con tres ratones por grupo. La ciprofloxacina liposomal fue en DPPC/colesterol (9:1), a 3 mg/ml de ciprofloxacina, con la formulación producida como en el Ejemplo, la relación de lípido a fármaco fue de 125. :1 en peso. En comparación con ciprofloxacina administrada oralmente, la ciprofloxacina liposomal estuvo presente en los pulmones de ratones en cantidades de más de dos órdenes de magnitud superior a la de ciprofloxacina libre. Además, solo la ciprofloxacina liposomal mostró niveles de fármaco en el pulmón después de 24 horas, mientras que el fármaco administrado oralmente fue indetectable en menos de dos horas. Estos datos soportan el uso de formulaciones de cirprofloxacina liposomal y otros anti-infectivos como aminoglicósidos, tetraciclinas y macrólidos para el tratamiento y para la prevención profiláctica de enfermedades iptracelulares usadas por bioterroristas . 8.3. Parámetros de Liposomas Los lípidos que serán empleados se disolvieron en etanol para formar una solución de lípidos-etanol. La solución de lípidos-etanol se infusionó en una solución acuosa o etanólica conteniendo la molécula del agente bioactivo que será atrapado. Los lípidos forman espontáneamente vesículas. La Tabla 10 describe parámetros de formulación anti-infectiva liposomal en donde los lípidos son DPPC y colesterol.

Tabla 10. Parámetros de formulación anti-infectiva liposomal adicional * Los liposomas de DPPC/colesterol en donde la relación molar de DPPC/Col es de aproximadamente 1:1. ** Solo la cantidad atrapada de amicacina se consideró para calcular L/D. La información adicional para formar formulaciones anti-infectivas liposomales se puede encontrar en PCT/US03/06847, presentada el 5 de marzo de 1003, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad. El volumen atrapado es una característica básica de una formulación liposomal y se determina como el volumen de fase acuosa intraliposomal por unida de lípido. Generalmente se expresa en las unidades de µlitros/µmol. Con frecuencia se supone qué cuando se forman los liposomas la concentración de los liposomas internos del soluto es igual al exterior en la solución de volumen. Un volumen superior atrapado luego podría conducir a la relación de fármaco/lípido superior, es decir, una concentración de fármaco global superior para la formulación final. Sin embargo, para formular la amicacina liposomal, se ha encontrado que la relación de fármaco/lípido actual que puede producirse fue mayor a 3 veces superior de lo que se podría esperar con base en el volumen atrapado. La Tabla 11 muestra los resultados para 4 preparaciones de muestras diferentes de formulaciones de anti-infectivos de lípidos (véase Ejemplo 2 en la sección de Ejemplificación) .

Tabla 11. Carga de amicacina en liposomas preparados por métodos diferentes.

Las Muestras 1 y 2 se hicieron por el procedimiento de infusión de etanol descritas en la presente, y Las Muestras 3 y 4 se hicieron por técnicas de formación de liposomas conocidas en la materia. Las concentraciones de amicacina se midieron por análisis inmuno-fluorescentes usando reactivo de INNOFLUO Seradyn establecidas en el analizador de TDx. Los lípidos se midieron por CLAR de fase inversa usando columna de C-8 detector de barrido luminoso. El volumen liposomal (volumen ocupado por liposomas por unidad de volumen total) en las muestras # 1 - 3 se determinó midiendo la concentración de la sonda fluorescente (Sulforhodamine 101 o Carboxifluoresceina) en el volumen total y en el volumen filtrado de la formulación obtenida en el filtrado es superior que el promedio uno debido a la oclusión de la sonda del volumen ocupado por liposomas. En la muestra #4, el volumen liposomal se determinó midiendo la concentración de iones potasio en una muestra después de agregar la cantidad fija del mismo, 250 ul de KCl (Va ) en 10 ml de suspensión liposomal (V0) . Las muestras se centrifugaron 30 minutos a 4000 rpm y se tomó un sobrenadante para medir iones potasio (K) por los electrodos sensibles a potasio de Cole-Parmer. La concentración de potasio medida siempre fue superior a lo esperado debido a la exclusión de iones potasio del volumen ocupado por liposomas. En el control, una cantidad igual de KCl se agregó en la solución salina de 10 ml. La concentración de potasio en Kc de control se midió. Los volúmenes acuosos y liposomales se estimaron como: Conociendo el volumen liposomal y la concentración v, - L de lípidos se pede determinar el volumen atrapado: vtl„ - r—~ en donde Lw y Lm son las concentraciones de lípidos en peso y molar, respectivamente. La densidad de lípidos se asumió que está cerca de 1 mg/ml. Consecuentemente, se puede estimar la relación de lípidos/fármaco esperada que la muestra podría tener si el fármaco se distribuyó idealmente en los espacios acuosos dentro y fuera de los liposomas: en donde D0 es la concentración de volumen del fármaco durante la formación de liposomas, ML es el peso molecular promedio de lípidos. Como se puede observar, las relaciones de L/D actuales para las muestras #1 y #2 (1.8 y 1.9) son consistentemente inferiores a los que se podría esperar de la distribución uniforme de amicacina (5.6 y 6.0), mientras la L/D para las muestras #3 y #4 son más cercanos a los valores teóricos.

Una comparación similar se hizo entre 2 preparaciones de muestras de formulaciones anti-infectivas en donde el sulfato de gentamicina fue el anti-infectivo (véase Ejemplo 3 son la sección de Ejemplificación) . Los datos en la Tabla 12 indican que el método descrito en la presente provee atrape de gentamicina inesperadamente alto. En ambas muestras #5 y #6, las relaciones reales de Lípido/Fármaco casi fueron del doble del valor teórico esperado.

Tabla 12. Carga de gentamicina en liposomas preparados por diferentes métodos. 8.4. Liberación de Fármaco Mediada por Infección por P. aeruginosa La liberación del fármaco en una forma activa en la cercanía de las infecciones es un aspecto importante de la acción de formulación de fármaco liposomal de la presente invención. El potencial de dicha liberación dirigida se probó monitoreando la libración de fármaco al incubar con esputo de un paciente de FC, liberación en los pulmones de ratas pre-inoculadas con P. aeruginosa, así como la actividad contra cultivos de P. aeruginosa. La liberación de amicacina por incubación directa de un cultivo de p. aeruginosa con una formulación de amicacina liposomal de la presente invención se trató previamente. Para investigar a demás este fenómeno, una formulación de amicacina liposomal se incubó con una preparación de esputo de un paciente con fibrosis cística con infección de P. aeruginosa. El esputo expectorado se licuó con DNasa I de bovinos y alginato liasa durante 2 horas a 37 °C. Una formulación de amicacina liposomal o amicacina soluble (1 mg/ml de amicacina) se mezcló 1:1: con esputo licuado o control y se incubó a 37 °C con agitación moderada. Las alícuotas se analizaron para concentración de amicacina por Analizador TDx de Abbott. Los liposomas intactos se lisaron en una alícuota separada de cada muestra usando un detergente, 1% Tritón X-100. Los sobrenadantes de cada muestra se usaron para análisis. Durante el período de 48 horas, 880-90%) de amicacina se liberó en una forma dependiente de tiempo de la composición de lípidos bajo estas condiciones, indicando que la liberación de fármaco puede ocurrir en los sitios de infección del pulmón de CF.

La liberación del fármaco libre de los liposomas in vivo se comparó para ratas que se instilaron con perlas de agar conteniendo P. aeruginosa (3.5 x 104 CFU/rata) contra los que no. Tres días después de la instilación de perlas, se permitió que las ratas inhalaran formulaciones de amicacina liposomales de la presente invención (aprox. 6 mg/kg de dosis diaria) cada día (sin grupo de bacterias) o un día si y uno no durante 14 días (el grupo instilado con perlas) . 24 hors después del último tratamiento, la amicacina tota y amicacina libre se midió como se describió antes. En las ratas que tuvieron bacterias recibidas, un promedio de aproximadamente 50-70% de la amicacina detectada en la forma libre, es decir, liberada del liposoma. En las ratas que no tuvieron bacterias recibidas de aproximadamente 20-25% del fármaco estuvieron en forma libre. Estos datos sugieren fuertemente que la liberación de amicacina libre del liposoma puede mediarse por la presencia de P. aeruginosa in vivo. Una prueba in vitro de la liberación y actividad se realizó bajo condiciones similares a la farmacocinética en el pulmón, en donde se mostró previamente que el antibiótico libre se aclaró en la escala de tiempo de unas cuantas horas. La amicacina libre de una formulación de amicacina liposomal se incubó con P. aeruginosa PAOl (~108/ml) en los cartuchos de Slide-A-Lyzr 0.5 ml estériles a concentraciones de fármaco variables. Las diálisis de fármaco libres fuera de los cartuchos en la escala de tiempo de horas bajo estas condiciones. Después de 24 horas, las muestras se retiraron de los cartuchos y se sembraron en placas para medir CFU. En los experimentos preliminares la amicacina libre solo redujo ligeramente el CFU de estas muestras, mientras se observó una reducción de dos registros de CFU para amicacina comprendiendo composiciones de lípidos a la misma concentración de amicacina (50 µg/ml) . Estos datos sugieren que la amicacina se libera además en una forma activa en presencia de bacteria y que la liberación lenta dada por la formulación hace más efectivo el uso del fármaco. La interacción de las formulaciones de amicacina liposomal de la presente invención con P. aeruginosa o sus factores de virulencia conduce a la liberación de amicacina que dirige posiblemente la liberación al sitio de infección. Cuando la amicacina se libera es activa contra P. aeruginosa, y la liberación lenta en la cercanía de las bacterias puede tener una ventaja sobre la distribución no específica y despeje rápido de fármaco libre inhalado. 8.5. Efecto de Formulaciones de Fármaco Liposomales inhalados de la Función de macrófagos Alveolares Las formulaciones de amicacina liposomales de la presente invención están en una modalidad de un liposoma en forma encapsulada en nanoescalas (200-300 nm) de amicacina que se formuló para tratar P. aeruginosa crónica en pacientes con fibrosis cistica. Se diseña para inhalación con liberación sostenida de amicacina en el pulmón. Debido a que se sabe que los macrófagos alveolares son conocidos para absorber ávidamente las partículas en esta escala de tamaño, el efecto de las formulaciones liposomales en estas células es de interés particular. Las funciones básales y estimuladas de los macrófagos alveolares de ratas obtenidos por lavado se estudiaron con y sin administración de formulaciones de amicacina liposomales y se compararon con varios controles. Los aerosoles de las formulaciones de amicacina liposomales, amicacina, liposomas de placebo y solución salina se generaron con un nebulizador LC Star PARÍ y se inhalaron por ratas hembra de CD®IGS en una cámara de inhalación solo con la nariz. La terapia de inhalación se condujo durante 4 hr durante 14 días consecutivos, de manera que la dosis de pulmón diaria estimada de lípidos totales fue de aproximadamente 12 mg/kg para el grupo de amicacina liposomal y de 11 mg/kg para el grupo de liposoma de placebo. La mitad de las ratas se sacrificaron en el día 43. El fluido de lavado alveolar Bronquial (FLAB) se recuperó de cada rata y se almacenó a -80°C durante el análisis subsiguiente de óxido nítrico, (representado por nitratos totales) y el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a) . Las células de BALF se recuperaron por centrifugación, se contaron y cultivaron en medio con y sin lipopolisacárido (LPS) durante 24 hr. Los sobrenadantes de estos cultivos se recuperaron por centrifugación y analizaron para óxido nítrico y TNF-a. La función fagocítica de macrófagos de BAL ((106)/ml) se probó midiendo la absorción durante la noche de microesferas fluorescentes opsonizadas (0.2µm, 2(109)/ml). La inhalación de la formulación de amicacina liposomal, los liposomas vacíos, amicacina soluble, o solución salina durante 14 días consecutivos no produjo una respuesta inflamatoria agua o retardada importante en los pulmones de ratas como es evidente por niveles de óxido nítrico (nitratos) y TNF-a en BALF que fueron insignificantes diferentes de controles, aunque hubo una tendencia temprana hacia los niveles de NO superiores en todos los grupos que reciben inhalantes, incluyendo controles. La recuperación total de células que insignificantemente diferente en todos los grupos con una tendencia temprana hacia más leucocitos polimorfonucleares en todos los grupos recibiente inhalantes. Los macrófagos alveolares de ratas tuvieron funciones normales después de la exposición a los aerosoles de los artículos de prueba anteriores a pesar del hecho que parecen más grandes en el día 15 en los grupos que inhalan liposomas. Las concentraciones de nitratos y TNF-a detectados al cultivar los macrófagos alveolares en el medio en el día 15 o 43 del estudio fueron insignificantemente diferentes de los controles. Los macrófagos respondieron normalmente cundo se estimularon por LPS, produciendo concentraciones sustanciales de óxido nítrico (20-40 nmol/106 células) y TNF-a (5-20 ng/106 células) . Estos macrófagos también tuvieron funciones fagocíticas normales, como se muestra por la absorción idéntica de las perlas fluorescentes comparado con los controles no tratados. La inhalación de las formulaciones de amicacina liposomales durante 14 días consecutivos no afectan sustancialmente la función de macrófagos alveolares en términos de fagocitosis de perlas opsonizadas, la producción de mediadores inflamatorios TNF y NO. 9. Dosis La dosis de cualquier composición de la presente invención variará dependiendo de los síntomas, edad y peso corporal del paciente, la naturaleza y severidad del trastorno para tratarse o prevenirse, la ruta de administración y la forma de la presente composición. Cualquiera de las presentes formulaciones pueden administrarse en una sola dosis o en dosis divididas. Las dosis para las composiciones de la presente invención pueden determinarse fácilmente por técnicas conocidas por aquellas con experiencia en la materia o como se enseña en la presente.

En ciertas modalidades, la dosis de los presentes compuestos generalmente estarán en la escala de aproximadamente 0.01 ng a alrededor de 10 g por kg de peso corporal, específicamente en la escala de aproximadamente 1 ng a alrededor de 0.1 g por kg, y más específicamente en la escala de aproximadamente 100 ng a alrededor de 50 ng por kg. Una dosis efectiva o cantidad y cualquier afectación posible en el tiempo de administración de la formulación, puede necesitar ser identificado por cualquier composición particular de la presente invención. Esto se puede lograr por experimento de rutina como se describió en la presente usando uno o más grupos de animales (preferiblemente por lo menos 5 animales por grupo) , o en ensayos en seres humanos si es apropiado. La efectividad de cualquier composición y método presentes de tratamiento o prevención puede evaluarse administrando la composición y evaluando el efecto de la administración midiendo uno o más •índices aplicables, y comparando los valores después del tratamiento de éstos índices son valore de los mismos índices antes del tratamiento. El tiempo preciso de administración y cantidad de cualquier composición presente particular que dará el tratamiento más efectivo en un paciente dado dependerá de la actividad, farmacocinética y biodisponibilidad de una composición presente, la condición fisiológica del paciente (incluyendo edad, sexo, tipo de enfermedad y etapa, condición física general, respuesta a una dosis dada y tipo de medicamento), ruta de administración y similares. Los lineamientos presentados en la presente se pueden usar para optimizar el tratamiento, v.gr., determinando el tiempo y/o cantidad de administración óptimos, que requerirán no más que la experimentación de rutina que consiste de monitorear al sujeto y ajustando la dosis y/o tiempo. Mientras el sujeto está siendo tratado, la salud del paciente puede monitorearse midiendo uno o más de los índices relevantes a tiempos predeterminados durante el período de tratamiento. El tratamiento, incluyendo la composición, cantidades, tiempos de administración y la formulación, puede optimizarse de acuerdo con los resultados de dicho monitoreo. El paciente puede volverse a evaluar periódicamente para determinar el grado de mejoría midiendo los mismos parámetros. Los ajustes a las cantidades de la composición administrada y posiblemente al tiempo de administración se puede hacer con base en estas reevaluaciones. El tratamiento pueden iniciarse con dosis más pequeñas que son menores a la dosis óptima del compuesto. Después, la dosis puede incrementarse por pequeños incrementos hasta que se obtiene el efecto terapéutico óptimo.

El uso de las presentes composiciones pueden reducir la dosis requerida para cualquier agente individual contenida en las composiciones (v.gr., el anti-infectivo) debido al inicio y duración de efecto de los diferentes agentes pueden ser complementarios. La toxicidad y eficacia terapéutica de composiciones presentes pueden determinarse por procedimientos farmacéuticos normales en cultivos celulares o animales experimentales, v.gr., para determinar LD50 y ED50. Los datos obtenidos de los análisis de cultivo celular y estudios de animales se pueden usar para formular una escala de dosis para usarse en seres humanos. La dosis de cualquier composición yace preferiblemente dentro de un a escala de concentraciones circulantes que incluyen la ED50 con poca o ninguna toxicidad. La dosis puede variar dentro de esta escala dependiendo de la forma de dosis empleada y la ruta de administración usada. Para las composiciones de la presente invención, la dosis terapéuticamente efectiva puede estimarse inicialmente del análisis de cultivo celular. 10. Formulación Las formulaciones anti-infectivas de lípidos de la presente invención pueden comprender una dispersión acuosa de liposomas. La formulación puede contener recipientes de lípidos para formar los liposomas, y sales/reguladores para proveer la osmolaridad apropiada y pH. La formulación puede comprender un excipiente farmacéutico. El excipiente farmacéutico puede ser un líquido, diluyente, solvente o material encapsulante, implicado para portar o transportar cualquier composición o componente del mismo de un órgano, o porción del cuerpo, a otro órgano, o porción del cuerpo. Cada excipiente deberá ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con la presente composición y sus componentes y no perjudicial para el paciente. Los excipientes adecuados incluyen trehalosa, rafinosa, manitol, sucrosa, leucina, trileucina, y cloruro de calcio. Ejemplos de otros excipientes adecuados incluyen (1) azúcares, tales como lactosa, y glucosa; (2) almidones, tales como almidón de maíz y almidón de papa; (3) celulosa, y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa de sodio, etilcelulosa y acetato de celulosa; (4) tragacanto en polvo; (5) malta; (6) gelatina; (7) talco; (8) excipientes, tales como manteca de cacao y ceras de supositorios; (9) aceites, tales como aceite de cacahuate, aceite de semilla de algodón, aceite de girasol, aceite de ajonjolí, aceite dé oliva, aceite de maíz y aceite de soya; (10) glicoles, tales como propilenglicol; (11) polioles, tales como glicerina, sorbitol, y polietilenglicol; (12) esteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; (13) agar; (14) agentes reguladores; (16) agua libre de pirógeno; (17) solución salina isotónica; (18) solución de Ringer; (19) alcohol etílico; (20) soluciones reguladoras de fosfato; y (21) otras sustancias compatibles no tóxicas empleadas en formulaciones farmacéuticas.

Ejemplificación Ejemplo 1 La siguiente es una descripción detallada de la manufactura de 150 ml de amicacina liposomal/formada en complejo. Volumen Inicial Total = 1.5 L Contenido de Etanol = 23.5% (v/v) Composición de lípidos: DPPC/col (relación molar 1:1) Inicial [Lípido] = 57.3 mg/ml Volumen de producto final = 150 ml | I) Formación de Compuestos e Infusión: 7.47 g DPPC y 3.93 g de colesterol se disolvieron directamente en 352.5 ml de etanol en un baño de agua a 50 °C. 85.95 g de sulfato de amicacina se disolvió directamente en 1147.5 ml de solución reguladora de PBS. La solución luego se tituló con ION NaOH o KOH para llevar el pH a aproximadamente 6.8. 352.5 ml de etanol/lípido se agregó o infusionó a 1147.5 ml de amicacina/solución reguladora para dar un volumen inicial total de 1.5 1. El etanol/lípido se bombeó @ - 30 mUmin (también se llamó régimen de infusión) con una bomba peristáltica en la solución de amicacina/reguladora que se agitó rápidamente a 150 RPM en un recipiente de reacción en una placa de agitación a temperatura ambiente. El producto se agitó a temperatura ambiente durante 20-30 minutos. II) Diafiltración o Paso de "Lavado": El recipiente de mezclado se enganchó a una bomba peristáltica y cartucho de diafiltración. El cartucho de diafiltración es una fibra de membrana hueca con un corte de peso molecular de 500 kilodaltons. El producto se bombeó del recipiente de reacción a través del cartucho de diafiltración y luego de nuevo en el recipiente de mezclado a temperatura ambiente. Una presión posterior de aproximadamente 0.492 kg/cm2 se crea a través del cartucho. Se forzó amicacina libre y etanol a través de la membrana de fibras hueca por la presión posterior saliendo desde atrás de la amicacina liposomal (producto) . El producto se lavó 8 veces a temperatura ambiente. Se agregó solución reguladora de PBS fresca (vía otra bomba peristáltica) al recipiente de reacción para compensar la remoción de permeado y mantiene un volumen de producto constante. El producto se concentró.

Ejemplo 2 Alto atrape liposomal de amicacina. Cuatro muestras de formulaciones de anti-infectivo de lípidos se preparó a varias concentraciones de anti-infectivo de acuerdo con los siguientes procedimientos. Muestra # 1. Se disolvió sulfato de amicacina 1.72 kg, en 23 litros de solución salina (0.9% NaCl) y el pH se ajustó a 6.5 agregando la cantidad necesaria de NaOH. Los lípidos, 98.2 g DPPC y 51.8 g de colesterol se disolvieron en 7 litros de etanol. Se formaron liposomas por infusión de solución de lípidos en solución de amicacina a un régimen de '600 ml/min y bajo agitación constante. La suspensión resultante se lavó luego para remover etanol y amicacina suelta por diafiltración usando un cartucho de Fibras Huecas de Amersham con tamaño de por de 500 kD. La suspensión se concentró a un volumen final de ~3.5 L. Muestra # 2. El procedimiento fue similar a aquel para la muestra # 1. Con todas las cantidades de material aumentadas 100 veces. El sulfato de amicacina 17.2 g se disolvió en 230 ml de solución salina (0.9% NaCl) y el pH se ajustó a 6.6 agregando cantidad necesaria de NaOH. Los lípidos, 0.983 g DPPC y 0.518 g de colesterol, se disolvieron en 70 ml de etanol. Los liposomas se formaron por infusión de la solución de lípidos en la solución de amicacina a un régimen de ~300 ml/min y bajo agitación constante. La suspensión resultante se lavó luego para remover etano y amicacina suelta por diafiltración usando un cartucho de Fibras Huecas de Amersham. La suspensión se concentró a un volumen final de ~35 ml. Muestra #3. Los liposomas se hicieron por un procedimiento conocido como VPLE. El sulfato de amicacina 1.4 g se disolvió en 20 ml de solución salina (0.9 % NaCl) formando un pH de 3.3. Los lípidos, 0.666 g DPPC y 0.333 g de Colesterol se disolvieron en 40 ml de diclorometano. Se mezclaron soluciones de amicacina y lípidos en un matraz redondo de 500 ml y se trataron con sonido brevemente para formar una emulsión. El matraz luego se conectó a un sistema de Rotovapor BUCHI para remover diclorometano a bajo vacío (-127 mm Hg) y temperatura de 50°C y la rotación constante hasta que la mezcla de amicacina-lípidos formó un gel. Cuando se colapso eventualmente el gel, se incrementó gradualmente el vacío a -508 mm Hg y continuó el secado durante 30 minutos más. El volumen final de suspensión liposomal formada fue de 22 ml. Muestra #4. El procedimiento fue similar a aquel para la muestra #3. El sulfato de amicacina 1.3 g se disolvió en 20 ml de solución salina, y el pH se ajustó a 6.5 agregando NaOH. Los lípidos, 0.583 g DPPC y 0.291 g de colesterol se disolvieron en 35 ml de diclorometano. Se saltó el paso de tratamiento con sonido. El paso de remoción de solvente en el sistema de Rotovapor se llevó a cabo a 40°C durante 2 hr. El volumen final fue de 20 ml .

Ejemplo 3 Atrape liposomal alto de Gentamicina. Muestra #5. El sulfato de gentamicina 20.0 g se disolvió en 230 ml de solución salina (0.9% NaCl) y el pH se ajustó a 6.5 agregando cantidad necesaria de ácido sulfúrico. Los lípidos, 0.982 g DPPC y 0.518 g de colesterol se disolvieron en 70 ml de etanol. Los liposomas se formaron por infusión de solución de lípidos en solución de gentamicina a un régimen de ~500 ml/min y bajo agitación constante. La gentamicina suelta y etanol se removieron por diafiltración usando un cartucho de Fibras Huecas Amersham. La suspensión se concentró a un volumen final de ~35 ml. Muestra #6. El procedimiento fue similar al de la muestra #5 excepto que: el sulfato de getamicina 17.0 g se disolvió en 230 ml de Na2S04 100 nM de solución y el pH se ajustó a 6.5 agregando la cantidad necesaria de H2S04. Lípidos - 0.0982 g DPPC y 0.518 g de colesterol se disolvieron en 75 ml de etanol.

Ejemplo 4 Atrape de otras formas de sal de amicacina. Muestra #7. El procedimiento fue similar a aquel para la muestra #2 bajo el Ejemplo 2. Base de amicacina 10.7 g y 4.2 g de ácido cítrico se disolvieron en 230 ml de solución salina 8(0.9 % NaCl) . -El pH de la solución de amicacina-citrato resultante fue de 6.2. Lípidos - 0.982 g DPPC y 0.518 g. El colesterol se disolvió en 70 ml de etano. Los liposomas se formaron por infusión de solución de lípidos en solución de amicacina a un régimen de ~500 ml/min y bajo agitación constante. Se retiraron la amicacina suelta y etanol por diafiltración usando un cartucho de fibra hueca Amersham. La suspensión se concentró a un volumen final de ~35 ml. La relación de Lípido/Fármaco real fue similar a aquella para la muestra #2 y de nuevo inferior a lo esperado (Atrape de fármaco superior a lo esperado) . Considerando el hecho de que el volumen atrapado en la muestra #7 solo fue de 1.5 (comparado con 2.5 para la muestra -32), la relación de L/D esperada/real fue tan alta como de 5.2. Por lo tanto, el citrato de amicacina liposomal, como sulfato de amicacina, también puede formularse con alto atrape.

Tabla 13. Muestras 5-7 sumario de parámetro, Ejemplo 5 Biodisponibilidad de amicacina de formulaciones de amicacina liposomales inhaladas en la rata. El régimen de liberación de amicacina de los liposomas se midió después de la inhalación por ratas comparado con amicacina soluble inhalada. Los artículos de pruebas se aerosolizaron vía un nebulizador Pari LC Star conectado a una cámara de inhalación solo por la nariz. Las ratas CD®IGS recibió una dosis depositada de pulmón calculada de 6 mg/kg de amicacina en la forma de una formulación liposomal o 5 mg/kg de amicacina soluble como una sola dosis o una dosis diaria durante 14 días consecutivos. El pulmón otro tejido se homogenizó con un aparto Polytron La cinética de eliminación de amicacina del pulmón se examinó mediante el análisis -de homogenados de pulmón a puntos de tiempo variables después del tratamiento de una sola dosis o 1 día y 28 días después de la administración de las dosis múltiples. Los niveles de amicacina se midieron por polarización de inmunofluorescencia en un analizador Abbott TDx® en ausencia o presencia de 1% Tritón X-100, que libera amicacina de liposomas. Las muestras de pulmón completas se picaron con liposomas antes de la homogenización para probar la liberación de amicacina bajo estas condiciones. La amicacina libre y total se midió con y sin 1% de Tritón X-100 para evaluar la fuga de fármaco. La amicacina liposomal, picada en las muestras de pulmón completas, no mostró liberación importante de amicacina como resultado de homogenización con el homogenizádor de politron en ausencia de esta detergente. Sin embargo, la adición de 1% Tritón X-100 condujo a la recuperación de todo el fármaco esperado. Por lo tanto, una comparación directa podría hacerse del nivel total de amicacina (con detergente) contra los niveles libremente disponibles en tejido de pulmón. Una concentración total alta de amicacina (aproximadamente 500-600 µg/kd de tejido de pulmón) se observó inmediatamente después de la dosis única de 6mg/kg de la amicacina liposomal, que disminuyó lentamente por aproximadamente 50% durante un período de 7 días. El perfil temporal para la liberación de amicacina libre de estos liposomas mostró una concentración alta inicial del fármaco libre, probablemente resultando de amicacina liberada como resultado de nebulización. Esta fase siguió por una depresión de aproximadamente 24 horas y un incremento subsiguiente, alcanzando un máximo de 279 µg/g de 96 horas después de la administración. Al final del experimento de 7 días, una porción sustancial de fármaco restante en el pulmón estuvo en la forma libre (aproximadamente 50-70%) . Parecía que una pequeña porción del fármaco soluble administrando por inhalación también permaneció durante un largo tiempo en el pulmón. Sin embargo, la mayor parte de la amicacina administrada en forma soluble se aclaró dentro de varias horas, y la amicacina libre aparente AUC durante 7 días por lo menos fue 2x superior para los animales de amicacina liposomal que para aquellos que recibieron amicacina soluble. Algunos aspectos de este comportamiento puede modelarse cualitativamente con constantes de régimen apropiado para aclaramiento y liberación lenta de fármaco de liposomas. Después de 14 días consecutivos de administración (24 horas después de la última dosis) , más del 20% de la amicacina total en los pulmones de ratas que recibieron amicacina liposomal estuvo presente como fármaco libre (aproximadamente 650 µg/g) . El nivel de fármaco libre total aún fue mayor que la cantidad en ratas que inhalaron amicacina soluble (aproximadamente 500 µg/g) . La amicacina libre se liberó lentamente de los liposomas de las formulaciones de amicacina liposomal en los pulmones de animales saludables con una escala en tiempo de días. El fármaco libre que se libera tiene un tiempo de residencia relativamente largo en el pulmón como se observa por un depósito sustancial del fármaco libe en los pulmones.

Ejemplo 6 Proceso de Infusión En Linea La esencia en el proceso de infusión En Línea es que una corriente de solución de lípidos se mezcla con una corriente de solución anti-infectiva "en línea" vía, por ejemplo, un conector en Y que se conecta a una longitud de tubería, llamado un tubo de mezclado, en donde puede ocurrir mezclado adicional. A este respecto, este nuevo proceso difiere del proceso de infusión de etanol "convencional", en donde la solución de lípidos se infusiona como una corriente en un volumen de solución de amicacina. Preparación de Soluciones de amicacina y lipidos . El sulfato de amicacina 12.0 g se disolvió en 200 ml de agua y el pH se ajustó a 6.5 agregando cantidades necesarias de solución de NaOH al 25%. Los lípidos, 1.480 g DPPC y 0.520 g de colesterol, se disolvieron en una mezcla de 60 ml de etanol y 10 ml de agua. Estas cantidades dieron como resultado un lote de 300 ml después de la infusión a un régimen de flujo de lípido/amicacina de 300/500 ml/min, respectivamente. Los volúmenes pueden ajustarse proporcionalmente a gran escala o si se desean diferentes regímenes de flujo. La solución de amicacina preparada de acuerdo con los resultados anteriores en aproximadamente 40 mg/ml de solución de amicacina (por base). La. solución de lípidos como se presente fue de DPPC/col /relación molar de 60/40) con un lípido total de solución de aproximadamente 20 mg/ml (90% etanol) . Los lípidos se calentaron a ~40°C para disolución más rápida. Las cantidades exactas requeridas para un lote de 300 ml son: amicacina 150 ml, lípido 90 ml, y 60 ml de solución salina adicional (o agua) que se agregó después do durante la infusión para ajustar la concentración de etanol final. Proceso de manufactura. Una modalidad del sistema de infusión se muestra en la Figura 8. Las soluciones de lípidos y amicacina se mezclaron en línea usando un conector en Y (ID 3.2 mm, OD 6.4 mm) a regímenes de flujo ~ 300/500 ml/min (es decir, relación de volumen de ~ 1/1.67 en lugar de ~l/3.35 en el proceso convencional). Un tubo Master Flex L/S 25 (D 4.8 mm) se usó para suministrar la solución de lípidos y un tubo de L/S 17 (ID 6.4 mm) se usó para suministrar la solución de amicacina. Para obtener regímenes de flujo sincrónico, se usaron dos cabezas de bomba con un motor MasterFlex. De acuerdo con las áreas en sección transversal de tubos, la relación de régimen de flujo teórica deberá ser de 4.82/6.42 = 0.562=1/1.78. Cuando la impulsión de bomba se ajustó a 500 ml/min para el tubo de amicacina L/S 17, los regímenes de flujo medidos fueron de -300/500 = 1/1.67. Dado que la solución de lípidos contiene 90% de etanol, la mezcla en línea tuvo ~34% de etanol. Para evitar la precipitación de amicacina, la solución de NaCl puede agregarse después o durante infusión a un régimen de flujo de 100 - 200 ml/min (se supone que los liposomas ya se formaron en este punto) . Por lo tanto la mezcla final deberá tener ~27% etano, del cual se espera que toda la amicacina libre sea soluble. El régimen de flujo de infusión de líquidos total, 800 - 1000 ml/min, se compara con el régimen de flujo permeado cuando se usan dos cartuchos de diafiltración grandes. Esto hace posible realizar la infusión simultánea y concentración por diafiltración. La suspensión de liposomas resultantes se lavó para remover amicacina libre por diafiltración usando un cartucho de fibras huecas Amersham UFP-500-C-3MA (área de membrana de 140 cm2, ID de fibra 0.5 mm=. En el primer paso, la suspensión se concentró a casi la mitad del volumen original (150 ml) . Luego, durante la diafiltración para lavar, la suspensión se recirculó y la solución salina fresca se alimentó en la mezcla a un régimen de ~6 ml/min con el fin de igualar el régimen permeado y así mantener un volumen constante. La diafiltración continuó hasta que se dispensaron 4 veces el volumen de suspensión de la solución salina (es decir, 4*150 ml = 600 ml) . Este proceso de diafiltracion/lavado será denominado como 4 "lavados". Finalmente la suspensión se concentró (diafiltración sin entrada de solución salina) para obtener el producto Final a una concentración deseada de amicacina y lípidos. El régimen de flujo de recirculación durante el paso de diafiltración fue de ~350 ml/min, y durante el paso de concentración final se redujo gradualmente a ~150 ml/min con el fin de mantener la presión de entrada por debajo de 0.703 kg/cm2.

Referencias 1. Veldhuizen, R., Nag, K., Orgeig, S. and Possmayer, F. , The Role of Lipids in Pulmonary Surfactant, Biochim. Biophys. Acta 1408:90-108 (1998). 2. Hagwood, S., Derrick, M. and Poulain, F. , Structure and Properties of Surfactant Protein B, Biochim. Biophys. Acta 1408:150-160 (1998). 3. Johansson, J. , Structure and Properties of Surfactant ProteinC, Biochim. Biophys. Acta 1408:161-172 (1998) . 4. Ikegami, M. and Jobe, A.H., Surfactant Protein Metabolism in vivo, Biocrum. Biophys. Acta 1401: : 218-225 (1998) . 5. Couveur, P., Fattel, E. and Andremont, A., Liposomes and Nanoparticles in the Treatment of Intracellular Bacterial Infections, Pharm. Res. 8: 1079-1085 (1991). ' 6. Gonzales-Rothi, R. J. , Casace, J., Straub, L., and Schreier, H., Liposomes and Pulmonary Alveolar Macrophages: Functional and Morphologic Interactions, Exp.

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Incorporación por Referencia Las publicaciones y referencias, incluyendo pero no limitado a patentes y solicitudes de patentes, citadas en esta especificación se incorporan aquí por referencia en su totalidad en la porción completa citada como si cada publicación individual o referencia se indicaran especifica e individualmente para incorporarse aquí por referencia para exhibirse completamente. Cualquier solicitud de patente para la cual esta solicitud reclama prioridad también se incorpora aquí por referencia en la forma descrita antes para publicaciones y referencias.

Equivalentes Mientras esta invención se ha descrito con un énfasis sobre las modalidades preferidas, será obvio para los que tienen experiencia ordinaria en la materia que se pueden usar las variaciones en los dispositivos y métodos preferidos y que se pretende que la invención pueda practicarse de otr amanera que la descrita específicamente en la presente. Consecuentemente, esta invención incluye todas las modificaciones abarcadas dentro del espíritu y alcance de la invención como se definió por las siguientes reivindicaciones .

Claims

REIVINDICACIONES 1.- Una formulación infectiva de lípidos que comprende una formulación de lípidos y una anti-infecciosa, en donde la formulación de lípidos es sustancialmente libre de lípidos aniónicos y en donde la relación de peso de lípidos a infectivo es de 4:1 a 1:1, 3:1 a 1:1, 2:1 a 1:1 o 1:1. 2.- La formulación anti-infecciosa de lípidos de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la formulación de lípidos es un liposoma. 3.- La formulación anti-infecciosa de lípidos de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el liposoma tiene un diámetro promedio de 0.1 µm a 1.0 µm, de 0.2 µm a 0.5 µm, de 0.2 µm a 0.4 µm o de 0.2 µm a 0.3 µm. 4.- La formulación anti-infectiva de lípidos de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anti-infectivo es seleccionado de los siguientes: una aminoglicosida, una tetraciclina, una sulfonamida, ácido p-aminobenzoico, una diaminopirimidina, una quinolona, una ß-lactama, una ß-lactama y un inhibidor ß-lactamasa, clorafenicol, una macrolida, penicilinas, cefalosporinas, corticoesteroide, prostaglandina, linomicina, clindamicina, espectinomicina, polimicina B, colistina, vancomicina, bacitracina, isoniasida, rifampina, etambutol, etionamida, ácido aminosalicílico, cicloserina, capreomicina, un sulfano, clofazimida, talidomida, un polieno antifungal, flucitosina, imidazol, triazol, griseofulvina, terconazol, butoconazol ciclopirax, ciclopirox olamina, haloprogina, tolfanato, naftifina, terbinafina o combinación de los mismos. 5.- La formulación anti-infectiva de lípidos de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anti-infectivo es una aminoglicosida. 6.- La formulación anti-infectiva de lípidos de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anti-infectivo es amicacina. 1 . - La formulación anti-infectiva de lípidos de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anti-infectivo es tobramicina. 8.- La formulación anti-infectiva de lípidos de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anti-infectivo es gentamicina. 9.- La formulación anti-infectiva de lípidos de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la formulación de lípidos comprende lípidos neutrales. 10.- La formulación anti-infectiva de lípidos de acuerdo con la reivindicación 1, en donde los lípidos que conforman la formulación de lípidos todos son lípidos neutros. 11.- La formulación anti-infectiva de lípidos de acuerdo con la reivindicación 1, libre de lípidos aniónicos. 12.- La formulación anti-infectiva de lípidos de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la formulación de lípidos comprende un fosfolípido. 13.- La formulación anti-infectiva de lípidos de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la formulación de lípidos comprende un esteroide. 14.- La formulación ánti-infectiva de lípidos de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la formulación de lípidos comprende un esterol. 15.- La formulación anti-infectiva de lípidos de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la formulación de lípidos comprende un fosfolípido y un esteroide. 16.- La formulación anti-infectiva de lípidos de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la formulación de lípidos comprende un fosfolípido y un esterol. 17.- La formulación anti-infectiva de lípidos de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la formulación de lípidos comprende dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) y colesterol. 18.- La formulación anti-infectiva de lípidos de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la formulación de lípidos es un liposoma con un diámetro promedio de 0.1 µm a 1.0 µm, de 0.2 µm a 0.5 µm, de 0.2 µm a 0.4 µm o de 0.2 µm a 0.3 µm; el anti-infectivo es amicacina; y la formulación de lípidos comprende un fosfolípido y un esteroide. 19.- La formulación anti-infectiva de lípidos de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la formulación de lípidos es un liposoma con un diámetro promedio de 0.1 µm a 1.0 µm, de 0.2 µm a 0.5 µm, de 0.2 µm a 0.4 µm o de 0.2 µm a 0.3 µm; el anti-infectivo es amicacina; y la formulación de lípidos comprende un fosfolípido y un esterol. 20.- La formulación anti-infectiva de lípidos de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la formulación de lípidos es un liposoma con un diámetro promedio de 0.1 µm a 1.0 µm, de 0.2 µm a 0.5 µm, de 0.2 µm a 0.4 µm o de 0.2 µm a 0.3 µm; el anti-infectivo es amicacina; y la formulación de lípidos comprende DPPC y colesterol. 21.- Un método de preparación de la formulación anti-infectiva de lípidos de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende la infusión de una solución o mezcla acuosa o alcohólica de el anti-infectiva con una solución o mezcla lípidos-alcohol a una temperatura menor a la fase de transición de por lo menos uno de los lípidos, en donde la infusión de solución o mezcla acuosa o alcohólica del antiinfectivo es hecha del anterior. 22.- El método de acuerdo con la reivindicación 21, en donde la solución o mezcla de lípidos-alcohol tiene una concentración de 10 a 30 mg/mL. 23.- El método de acuerdo con la reivindicación 21, en donde la solución o mezcla acuosa o alcohólica del antiinfectivo tiene una concentración de 20 a 70 mg/mL. 24.- El método de acuerdo con la reivindicación 21, en donde la solución o mezcla de lípidos alcohol tiene una concentración de 10 a 30 mg/mL, y la solución o mezcla acuosa o alcohólica del anti-infectivo tiene una concentración de 20 a 70 mg/ml. 25.- El método de acuerdo con la reivindicación 21, en donde el anti-infectivo es seleccionado de las siguientes: una aminoglicosida, una tetraciclina, una sulfonamida, ácido p-aminobenzóico, una diaminopirimidina, una quinolona, una ß-lactama, una ß-lactama y una ß-lactamasa inhibidora, clorafenicol, una macrolida, penicilinas, cepalosporinas, corticoesteroide, prostaglandina, linomicina, clindamicina, spectinomicina, polimixina B, colistina, vancomicina, bacitracina, isoniasida, rifampina, etambutol, etionamida, ácido aminosalicílico, cicloserina, capreomicina, un sulfano, clofasimina, talidomida, un polieno antifungal, flucitosina, imidazola, triasola, griseofulvina, terconazola, butoconazol ciclopirax ciclopirox olamina, haloprogina, tolnaftato, naftifina, terbinafina o combinaciones de las mismas. 26.- El método de acuerdo con la reivindicación 21, en donde el anti-infectivo es un aminoglicosido. 27.- El método de acuerdo con la reivindicación 21, en donde el anti-infectivo es amicacina. 28.- El método de acuerdo con la reivindicación 21, en donde el anti-infectivo es tobramicina. 29.- El método de acuerdo con la reivindicación 21, en donde el anti-infectivo es gentamicina. 30.- El método de acuerdo con la reivindicación 21, en donde la solución o mezcla lípidos-alcohol comprende un fosfolípido. 31.- El método de acuerdo con la reivindicación 21, en donde la solución o mezcla lípidos-alcohol comprende un esterol. 32.- El método de acuerdo con la reivindicación 21, en donde la solución o mezcla lípidos-alcohol comprende DPPC y colesterol. 33.- Una formulación anti-infectiva de lípidos que comprende una formulación de lípidos y una anti-infectiva en donde los lípidos a una relación anti-infectiva es 1:1 o menor. 34.- La formulación anti-infectiva de lípidos de acuerdo con la reivindicación 33, en donde los lípidos a una relación anti-infectiva es menor de 0.75:1. 35.- La formulación anti-infectiva de lípidos de acuerdo con la reivindicación 33, en donde los lípidos a una relación anti-infectiva es menor de 0.5:1. 36.- La formulación anti-infectiva de lípidos de acuerdo con la reivindicación 33, en donde el anti-infectivo es un aminoglicosido. 37.- La formulación anti-infectiva de lípidos de acuerdo con la reivindicación 33, en donde la anti-infectiva es un aminoglicosido seleccionada de las siguientes: amicacina, gentamicina o tobramicina. 38.- La formulación anti-infectiva de lípidos de acuerdo con la reivindicación 33, en donde la anti-infectiva es amicacina. 39.- La formulación anti-infectiva de lípidos de acuerdo con la reivindicación 33, en donde la anti-infectiva es gentamicina. 40.- La formulación anti-infectiva de lípidos de acuerdo con la reivindicación 33, en donde la anti-infectiva es tobramicina. 41.- La formulación anti-infectiva de lípidos de acuerdo con la reivindicación 33, en donde la formulación de lípidos es un liposoma. 42.- La formulación anti-infectiva de lípidos de acuerdo con la reivindicación 33, en donde la formulación de lípidos comprende un fosfolípido. 43.- La formulación anti-infectiva de lípidos de acuerdo con la reivindicación 33, en donde la formulación de lípidos comprende un asteroide. 44.- La formulación anti-infectiva de lípidos de acuerdo con la reivindicación 33, en donde la formulación de lípidos comprende un esterol. 45.- La formulación anti-infectiva de lípidos de acuerdo con la reivindicación 33, en donde la formulación de lípidos comprende dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) . 46.- La formulación anti-infectiva de lípidos de acuerdo con la reivindicación 33, en donde la formulación de lípidos comprende colesterol. 47.- La formulación anti-infectiva de lípidos de acuerdo con la reivindicación 33, en donde la formulación de lípidos comprende un fosfolípido y un esteroide. 48.- La formulación anti-infectiva de lípidos de acuerdo con la reivindicación 33, en donde la formulación de lípidos comprende un fosfolípido y un esterol. 49.- La formulación anti-infectiva de lípidos de acuerdo con la reivindicación 33, en donde la formulación de lípidos comprende DPPC y colesterol. 50.- La formulación anti-infectiva de lípidos de acuerdo con la reivindicación 33, en donde la formulación de lípidos es un liposoma y el anti-infectivo es amicacina. 51.- La formulación anti-infectiva de lípidos de acuerdo con la reivindicación 33, en donde la formulación de lípidos es un liposoma, el anti-infectivo es amicacina, y la formulación de lípidos comprende un fosfolípido y un esterol. 52.- La formulación anti-infectiva de lípidos de acuerdo con la reivindicación 33, en donde la formulación de lípidos es un liposoma, el anti-infectivo es amicacina, y la formulación de lípidos comprende un DPPC y un colesterol. 53.- Un método para preparar una formulación antiinfectiva de lípidos que comprende una formulación de lípidos y una anti-infectiva que comprende: mezclar una corriente de una solución o mezcla de lípidos con una corriente o una solución o mezcla anti-infectiva, en donde las dos corrientes se mezclan en línea. 54.- El método de acuerdo con la reivindicación 53, en donde las dos corrientes entran de un primer conector en Y a una mezcla en línea. 55.- El método de acuerdo con la reivindicación 53, en donde las soluciones o mezclas son acuosas o alcohólicas. 56.- El método de acuerdo con la reivindicación 53, en donde la formulación de lípidos es un liposoma. 57.- El método de acuerdo con la reivindicación 53, en donde el anti-infectivo es una aminoglicosida. 58.- El método de acuerdo con la reivindicación 53, en donde el anti-infectivo es una aminoglicosida seleccionada de las siguientes: amicacina, gentamicina o tobramicina. 59.- El método de acuerdo con la reivindicación 53, en donde el anti-infectivo es amicacina. 60.- El método de acuerdo con la reivindicación 53, en donde el anti-infectivo es gentamicina. 61.- El método de acuerdo con la reivindicación 53, en donde el anti-infectivo es tobramicina. 62. -El método de acuerdo con la reivindicación 53, en donde la corriente de una solución o mezcla de lípidos y la corriente de una solución anti-infectiva o mezcla se mezclan a un régimen de flujo total de 700 a 900 mL/min. 63.- El método de acuerdo con la reivindicación 53, en donde la corriente de una solución o mezcla de lípidos y la corriente de una solución anti-infectiva o mezcla se mezclan a un régimen de flujo total de 800 mL/min. 64.- El método de acuerdo con la reivindicación 53, en donde la corriente de una solución o mezcla de lípidos se agrega a un régimen de flujo de 200 a 400 mL/min. 65.- El método de acuerdo con la reivindicación 53, en donde la corriente de una solución o mezcla de lípidos se agrega a un régimen de flujo de 300 mL/min. 66.- El método de acuerdo con la reivindicación 53, en donde la corriente de una solución o mezcla se agrega a un régimen de flujo de 400 a 600 mL/min. 67.- El método de acuerdo con la reivindicación 53, en donde la corriente de una solución o mezcla se agrega a un régimen de flujo de 500 mL/min. 68.- El método de acuerdo con la reivindicación 53, en donde la corriente de una solución o mezcla de lípidos se agrega a un régimen de flujo de 300 mL/min, y la corriente de una solución o mezcla se agrega a un régimen de flujo de 500 mL/min. 69.- El método de acuerdo con la reivindicación 53, en donde la temperatura de las corrientes combinadas es 30-40°C. 70.- El método de acuerdo con la reivindicación 53, en donde la temperatura de la solución o mezcla de lípidos es de 30 °C, y la temperatura de la solución o mezcla antiinfectiva es de 30°C. 71.- El método de acuerdo con la reivindicación 53, en donde la temperatura de la solución o mezcla de lípidos es de 30°C, y la temperatura de la solución o mezcla antiinfectiva es a temperatura ambiente. 72.- El método de acuerdo con la reivindicación 53, comprende además el paso de diluir las corrientes combinadas con agua a por lo menos 20 segundos después de mezclar. 73.- El método de acuerdo con la reivindicación 53, en donde la concentración de la solución o mezcla antiinfectiva' es de 30 a 50 mg/mL. 74.- El método de acuerdo con la reivindicación 53, en donde la concentración de la solución o mezcla anti-infectiva es de 40 a 50 mg/mL. 75.- El método de acuerdo con la reivindicación 53, en donde la corriente de una solución o mezcla de lípidos se agrega a un régimen de flujo de 300 mL/min, y la corriente de una solución o mezcla se agrega a un régimen de flujo de 500 mL/min; la temperatura de las corrientes combinadas es de 30-40 °C; las corrientes combinadas se diluyen con agua a por lo menos 20 segundos después de mezclar; y la concentración de la solución o mezcla anti-infectiva es de 40 a 50 mg/mL. 76.- El método de acuerdo con la reivindicación 53, en donde el lípido comprende un fosfolípido. 77.- El método de acuerdo con la reivindicación 53, en donde el lípido comprende un esteroide. 78.- El método de acuerdo con la reivindicación 53, en donde el lípido comprende un esterol. 79.- El método de acuerdo con la reivindicación 53, en donde el lípido comprende DPPC. 80.- El método de acuerdo con la reivindicación 53, en donde el lípido comprende colesterol. 81.- El método de acuerdo con la reivindicación 53, en donde el lípido comprende un fosfolípido y un esterol. 82.- El método de acuerdo con la reivindicación 53, en donde el lípido comprende DPPC y colesterol. 83.- El método de acuerdo con la reivindicación 53, en donde la formulación de lípidos es un liposoma y el anti-infectivo es amicacina. 84.- El método de acuerdo con la reivindicación 53, en donde la formulación de lípidos es un liposoma, el antiinfectivo es amicacina, y el lípido comprende un fosfolípido y un esterol. 85.- El método de acuerdo con la reivindicación 53, en donde la formulación de lípidos es un liposoma, el antiinfectivo es amicacina, y el lípido comprende DPPC y colesterol. 86.- El método de acuerdo con la reivindicación 53, en donde la relación de lípido a anti-infectivo es 1:1 o menor. 87.- El método de acuerdo con la reivindicación 53, en donde la relación de lípido a ahti-infectivo es 0.75:1 o menor. 88.- El método de acuerdo con la reivindicación 53, en donde la relación de lípido a anti-infectivo es 0.5:1 o menor. 89.- El método de acuerdo con la reivindicación 53, en donde la formulación de lípidos es uh liposoma y el anti-infectivo es amicacina, el lípido comprende DPPC y colesterol y la relación del lípido a anti-infectivo es de 1:1 o menor. 90.- Un método para tratar un paciente para una infección pulmonar que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de la formulación antiinfectiva de lípidos de acuerdo con la reivindicación 1 o 33. 91.- El método de acuerdo con la reivindicación 90, en donde la infección pulmonar es una pseudomona, P. aeruginosa, P. paucimobilis, P. putida, P. fluorescens y P. acidovorans, stafilococcal, Staphilococcus aureus (MRSA) resistente a meticilina, estreptococal, Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Haemophilus, Yersinia pesos, Burkholderia pseudomallei, B. cepacia, B. gladioli, B multivorans, B. Vietnamiensis, Mycobacterium tuberculosis, M. Avium complex (MAC) , M. Avium, Mintracellulare, M. kansasii, M. xepoxi, M. Marinum, M. Ulcerans, M. Fortuitum complex, M. Fortuitum, o infección de M. Chelonei. 92.- Un método para tratar un paciente por una infección pulmonar causada por fibrosis cística que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de una formulación ánti-infectiva de lípidos de acuerdo con la reivindicación 1 o 33. V