ES2225094T3

ES2225094T3 - Procedimiento para controlar el tamaño de liposomas.

Info

Publication number: ES2225094T3
Application number: ES00907183T
Authority: ES
Inventors: James L. Slater; Adam A. Zetter; George Z. Zhu
Original assignee: Alza Corp
Current assignee: Alza Corp
Priority date: 1999-02-08
Filing date: 2000-02-03
Publication date: 2005-03-16
Anticipated expiration: 2020-02-03
Also published as: ATE272392T1; WO2000045791A2; AU2871800A; CN1338923A; DE60012693D1; KR20010101837A; HUP0200421A3; AU773515B2; WO2000045791A3; IL144756A0; EP1150658B1; DE60012693T2; ZA200106444B; NO20013862D0; CN1198589C; HUP0200421A2; HK1040642A1; IL144756A; JP2002536316A; EP1150658A2

Abstract

Procedimiento para preparar una composición liposómica que comprende liposomas que tienen un tamaño deseado, comprendiendo el procedimiento (i) determinar una cantidad de disolvente lipídico requerida para lograr el tamaño deseado de liposomas a partir de un perfil de tamaño de liposomas como una función de la cantidad de disolvente lipídico en una mezcla de hidratación del disolvente lipídico y un segundo disolvente con el que el disolvente lipídico es miscible, y (ii) hidratar un lípido formador de vesículas disuelto en dicha cantidad determinada de disolvente lipídico con el segundo disolvente para formar la mezcla de hidratación, estando dicha cantidad determinada de disolvente lipídico comprendida entre 10 y 50 por ciento en peso.

Description

Procedimiento para controlar el tamaño de los liposomas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para preparar una composición liposómica, el cual proporciona control sobre el tamaño de los liposomas resultantes. La invención se refiere además a composiciones preparadas según dicho procedimiento.

Antecedentes de la invención

Los liposomas son partículas acuosas esféricas que están rodeadas por al menos una bicapa lipídica totalmente cerrada, y que tienen típicamente un diámetro de alrededor de 70 nm hasta 1.000 nm. Durante la última década los liposomas se han hecho importantes como vesículas para transportar agentes farmacéuticos y cosméticos. Tales agentes están encerrados en el compartimiento acuoso, o se integran en la bicapa lipídica de los liposomas, dependiendo de la hidrofilia del agente.

Los procedimientos para preparar liposomas ya son conocidos en la técnica. Las vesículas de múltiples laminillas, esto es, los liposomas que tienen más de una bicapa lipídica, se preparan de la forma más simple depositando el lípido o lípidos formadores de vesículas a partir de un disolvente orgánico en una película delgada sobre la pared de un matraz mediante evaporación giratoria a presión reducida. Se añade un tampón acuoso, y los lípidos se hidratan a una temperatura por encima de la temperatura de fusión cristalina del lípido, o por encima de la temperatura de fusión cristalina más elevada del componente con el punto de fusión más alto en la mezcla lipídica. La adición del tampón acuoso está acompañado con agitación, por ejemplo, agitación mecánica, ultrasonidos, movimiento de remolino, para obtener una suspensión de liposomas.

Después de la formación de los liposomas, éstos se reducen al tamaño debido para obtener una distribución más pequeña y/o más uniforme del tamaño de partículas. Un procedimiento habitual para reducir el tamaño es la extrusión de la suspensión liposómica a través de una serie de filtros con dimensiones determinadas. Como alternativa, los liposomas se reducen de tamaño sometiendo a ultrasonidos a la suspensión para romper los liposomas en partículas más pequeñas.

Las vesículas de una única laminilla pequeñas y grandes (SUV y LUV) son liposomas con una bicapa lipídica, y se pueden preparar mediante un número de técnicas. Las SUV tienen típicamente diámetros en el intervalo de 20-50 nm, y se pueden formar mediante inyección rápida de una disolución diluida de lípido en etanol en una fase acuosa, el denominado procedimiento de inyección en etanol. Otra técnica para formar las SUV es sometiendo vigorosamente a ultrasonidos a las vesículas de múltiples laminillas. Las vesículas grandes de una sola laminilla pueden tener un tamaño de varios cientos de nanometros hasta varios micrómetros, y se forman típicamente mediante un procedimiento de evaporación de fase inversa, en el que el disolvente orgánico de una emulsión de agua en aceite de lípido, tampón y orgánico, se elimina a presión reducida.

El documento WO 91/16039 describe un procedimiento para la preparación de suspensiones liposómicas acuosas que contienen sustancias activas, preparándose las suspensiones a partir de una disolución de una sustancia formadora de liposomas, o una mezcla de tales sustancias, en un alcohol inferior con un máximo de tres átomos de carbono y una fase acuosa. Los ingredientes activos se disuelven o suspenden en la disolución lipídica y/o la fase acuosa. El procedimiento se caracteriza porque la fase acuosa se incorpora, por mezclamiento, en la disolución alcohólica, y el alcohol inferior se elimina por destilación a vacío. Si es necesario, la suspensión liposómica se liofiliza.

Sumario de la invención

En consecuencia, es un objetivo de la invención proporcionar un procedimiento para preparar liposomas con un diámetro deseado.

Es otro objetivo de la invención proporcionar un procedimiento para obtener liposomas que tienen un tamaño seleccionado.

Es un objetivo adicional de la invención proporcionar un procedimiento para controlar el tamaño de liposomas mediante la selección de la composición de la composición de hidratación.

Según la presente invención, se proporciona un procedimiento para preparar una composición liposómica que comprende liposomas que tienen un tamaño deseado, comprendiendo el procedimiento (i) determinar una cantidad de disolvente lipídico requerida para lograr el tamaño deseado de liposomas a partir de un perfil de tamaño de liposomas como una función de la cantidad de disolvente lipídico en una mezcla de hidratación del disolvente lipídico y un segundo disolvente con el cual el disolvente lipídico es miscible, y (ii) hidratar un lípido formador de vesículas disuelto en dicha cantidad determinada de disolvente lipídico con el segundo disolvente para formar la mezcla de hidratación, estando dicha cantidad determinada de disolvente lipídico entre 10-50 por ciento en peso.

En una realización, el disolvente lipídico es un alcohol, tal como metanol, etanol o butanol.

El lípido formador de vesículas es, en otra realización, un lípido formador de vesículas cargado, tal como el lípido catiónico DODAC o el lípido aniónico DSPE. En otra realización, el lípido formador de vesículas es un lípido de vesículas neutro.

En aún otra realización, la hidratación incluye además hidratar un lípido formador de vesículas derivatizado con una cadena de polímero hidrófobo, tal como polietilenglicol.

El segundo disolvente en el procedimiento de la invención, en una realización preferida, es agua.

En otra realización, la hidratación incluye hidratar un agente terapéutico con el segundo disolvente. Como alternativa, la hidratación puede incluir además hidratar un agente terapéutico con el disolvente lipídico.

En una realización preferida, el agente terapéutico es un radiosensibilizador con una o más cadenas acílicas. Un radiosensibilizador derivatizado preferido es dipalmitoil-5-yodo-2-desoxiuridina.

En otra realización, el agente terapéutico es un ácido nucleico.

La invención incluye un procedimiento para obtener liposomas que tienen un tamaño mínimo de partículas, mezclando un lípido formador de vesículas en un disolvente lipídico, y añadiendo un segundo disolvente para lograr una cantidad de disolvente lipídico mayor que 10 por ciento en peso y menor que alrededor de 50 por ciento en peso, en el que la cantidad de disolvente lipídico se selecciona para obtener liposomas más pequeños en tamaño que los liposomas que se preparan a partir de una formulación similar excepto que tienen una cantidad de disolvente lipídico menor que 10 por ciento en peso o mayor que 50 por ciento en peso.

En una realización preferida, el perfil del tamaño de los liposomas como función del contenido de disolvente lipídico en la mezcla de hidratación se obtiene midiendo el diámetro de los liposomas en la mezcla de hidratación, y repitiendo las etapas de hidratación y de medición a diferentes cantidades de disolvente lipídico para obtener el perfil. Basándose en el perfil, se selecciona la cantidad de disolvente lipídico requerida para lograr un diámetro seleccionado de partículas de liposomas.

Estos y otros objetivos y características de la invención se pondrán más claramente de manifiesto a partir de la lectura de la siguiente descripción detallada de la invención, considerada conjuntamente con los dibujos adjuntos.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1A-1B corresponden a suspensiones liposómicas preparadas con fosfatidilcolina de huevo, colesterol, cloruro de N,N-dioleoil-N,N-dimetilamonio (DODAC) y ceramida derivatizada con polietilenglicol de peso molecular 2000 daltons (PEG C_{10}-ceramida) con un oligonucleótido atrapado, en las que la composición de cada suspensión se indica en el diagrama de fases de la Fig. 1A, y el diámetro medio de partículas, en nm, de los liposomas en cada suspensión se representa gráficamente en la Fig. 1B como función tanto del porcentaje en peso de lípido como del porcentaje en peso de etanol;

las Figuras 2A-2B corresponden a suspensiones liposómicas preparadas con fosfatidilcolina de soja parcialmente hidrogenada, colesterol, DODAC y un lípido neutro derivatizado con mPEG (mPEG-DS), y que contienen un oligonucleótido atrapado, en las que la composición de cada suspensión se indica en el diagrama de fases de la Fig. 2A, y el diámetro medio de partículas, en nm, de los liposomas en cada suspensión se representa en la Fig. 2B como una función tanto del porcentaje en peso de lípido como el porcentaje en peso de etanol;

las Figuras 3A-3B corresponden a suspensiones liposómicas preparadas con fosfatidilcolina de soja parcialmente hidrogenada, colesterol, DODAC y un lípido aniónico (diestearoilfosfatidil-etanolamina, DPSE) derivatizado con metoxi-polietilenglicol (mPEG-DSPE), y que tienen un oligonucleótido atrapado, en las que la composición de cada suspensión se indica en el diagrama de fases de la Fig. 3A, y el diámetro medio de partículas, en nm, de los liposomas en cada suspensión se representa gráficamente en la Fig. 3B, como una función tanto del porcentaje en peso del lípido como del porcentaje en peso de etanol;

las Figuras 4A-4B corresponden a suspensiones liposómicas preparadas con fosfatidilcolina de soja parcialmente hidrogenada, colesterol y mPEG-DSPE, en las que la composición de cada suspensión se indica en el diagrama de fases de la Fig. 4A, y el diámetro medio de partículas, en nm, de los liposomas de cada suspensión se representa en la Fig. 4B como una función tanto del porcentaje en peso de lípido como del porcentaje en peso de etanol;

las Figuras 5A-5B corresponden a suspensiones liposómicas preparadas con fosfatidilcolina de soja parcialmente hidrogenada y colesterol, en las que la composición de cada suspensión se indica en el diagrama de fases de la Fig. 5A, y el diámetro medio de partículas, en nm, de los liposomas de cada suspensión se representa en la Fig. 5B como una función tanto del porcentaje en peso de lípido como del porcentaje en peso de etanol;

las Figuras 6A-6B corresponden a suspensiones liposómicas preparadas con fosfatidilcolina de soja parcialmente hidrogenada, colesterol y mPEG-DSPE, en las que la composición de cada suspensión se indica en el diagrama de fases de la Fig. 6A, y el diámetro medio de partículas, en nm, de los liposomas de cada suspensión se representa en la Fig. 6B como una función tanto del porcentaje en peso de lípido como del porcentaje en peso de etanol;

las Figuras 7A-7B corresponden a suspensiones liposómicas preparadas con fosfatidilcolina de soja parcialmente hidrogenada y colesterol, en las que la composición de cada suspensión se indica en el diagrama de fases de la Fig. 7A, y el diámetro medio de partículas, en nm, de los liposomas de cada suspensión se representa en la Fig. 7B como una función tanto del porcentaje en peso de lípido como del porcentaje en peso de etanol;

la Fig. 8 es un esquema de reacción sintético para la síntesis de 3',5'-dipalmitoil-5-yodo-2'-desoxiuridina;

la Fig. 9 es un gráfico del tamaño de liposomas, en nm, como función del porcentaje en peso de etanol durante la hidratación de lípidos liposómicos compuestos de HSPC, mPEG-DSPE y dpIUdR; y

la Fig. 10 es un diagrama de fases para la formación de liposomas que incluyen dpIUdR en etanol, agua, y muestra una región preferida de operación.

Descripción detallada de la invención I. Definiciones y abreviaturas

"Lípido formador de vesículas" se refiere a cualquier lípido capaz de formar parte de una composición micelar o liposómica estable, e incluye típicamente una o dos cadenas hidrocarbonadas acílicas hidrófobas o un grupo esteroide, y puede contener un grupo químicamente reactivo, tal como una amina, ácido, éster, aldehído o alcohol, en su grupo de cabeza polar.

"Disolvente lipídico" se refiere a cualquier disolvente capaz de disolver a un líquido formador de vesículas, a cualquier temperatura.

"Segundo disolvente" se refiere a un disolvente que es completa o parcialmente miscible, en alguna proporción, con el disolvente lipídico.

"dpIUdR" se refiere a 3',5'-dipalmitoil-5-yodo-2'-desoxiuridina.

"DODAC" se refiere al lípido catiónico cloruro de N,N-dioleoil-N,N-dimetilamonio.

"mPEG-DSPE" se refiere a diestearoilfosfatidil-etanolamina (DPSE) derivatizada con metoxi-polietilenglicol
(mPEG). El mPEG puede tener un peso molecular entre 500-20.000 daltons, preferiblemente entre 1.000-5.000 daltons.

"mPEG-DS" se refiere a un lípido neutro formador de vesículas derivatizado con mPEG.

II. Procedimiento de la invención

En un aspecto, la invención incluye un procedimiento para preparar liposomas en el que se controla el tamaño de partículas de los liposomas. En otro aspecto, el procedimiento proporciona un medio para obtener liposomas que tienen un tamaño deseado de partículas, y un medio para obtener una suspensión liposómica que tiene un tamaño mínimo de partículas. Estos aspectos se describirán ahora por medio de los Ejemplos 1-8.

El Ejemplo 1 describe la preparación de una suspensión de liposomas en la que los lípidos que forman los liposomas estaban compuestos de fosfatidilcolina de huevo (EPC), colesterol, DODAC y PEG C_{20}-ceramida, en una relación molar 50:25:15:10. Los lípidos se disolvieron en etanol. Se hidrataron partes alícuotas de la mezcla de lípidos con una disolución acuosa que contiene 20 mg/ml de un oligonucleótido de 34 bases de longitud, para formar seis suspensiones liposómicas con concentraciones variables de etanol. Las composiciones de las suspensiones se indican en el diagrama de fases de la Fig. 1A, y, como se puede ver, tienen aproximadamente 0,6 por ciento en peso de lípido o aproximadamente 6 por ciento en peso de lípido. Los porcentajes en peso de etanol en el lípido de 0,6% fueron 9,5, 19,3 y 39. Los porcentajes en peso de etanol en el lípido de 6% fueron 5,9, 15,8 y 35,5. La Tabla 1 en el Ejemplo 1 resume la composición de cada suspensión liposómica.

El diámetro medio de partículas de cada suspensión se midió mediante dispersión de luz cuasiestática, justo después de la hidratación. Los resultados se dan en la Tabla 1 (véase Ejemplo 1 a continuación), y se representan gráficamente en la Fig. 1B frente al porcentaje en peso de lípido y el porcentaje en peso de etanol. Como se observa en la Figura, para cada una de las composiciones en los dos niveles de lípidos (0,6% en peso y 6% en peso), hay un intervalo de disolvente lipídico en el que se minimiza el diámetro de los liposomas. Para los liposomas que tienen aproximadamente 0,6% en peso de lípidos, desde alrededor de 12-35% en peso de etanol el tamaño de partículas de los liposomas es menor que 100 nm. Para los liposomas que tienen aproximadamente 6% en peso de lípidos, el efecto de un tamaño mínimo de partículas a un intervalo seleccionado de etanol es más evidente, puesto que el tamaño de los liposomas se minimiza entre 6-35 por ciento en peso de etanol.

El Ejemplo 2 proporciona un ejemplo adicional del procedimiento de la invención, en el que se controla el tamaño de partículas de los liposomas mediante la composición de la mezcla de hidratación, por ejemplo, mediante la cantidad de disolvente lipídico y de segundo disolvente. En este ejemplo, se prepararon liposomas compuestos de fosfatidilcolina de soja parcialmente hidrogenada (PHSPC), colesterol, DODAC y mPEG-DS, en una relación molar 50:25:15:10. Los lípidos se disolvieron en etanol y se hidrataron con una disolución acuosa que contiene un oligonucleótido de 34 bases de longitud. Se prepararon nueve suspensiones liposómicas de composición variable de la mezcla de hidratación, y cada composición se muestra en el diagrama de fases en la Fig. 2A.

El diámetro medio de las partículas de los liposomas en cada suspensión se midió justo después de la hidratación, y nuevamente después del almacenamiento durante toda la noche a 5ºC. Los resultados se muestran en la Tabla 2 a continuación, y los diámetros medidos justo después de la hidratación se representan gráficamente en la Fig. 2B como una función del porcentaje en peso de etanol y del porcentaje en peso de lípido. Como se observa en la figura, hay una fuerte relación entre la cantidad de disolvente lipídico y el tamaño de los liposomas. Más específicamente, hay un intervalo en el que se minimiza el diámetro de los liposomas. Este intervalo, para esta mezcla lipídica particular, cae entre 5-30 por ciento en peso de etanol. El tamaño más pequeño de los liposomas se obtuvo con 12,9 por ciento en peso de etanol, aumentando el tamaño de los liposomas a medida que la cantidad de etanol aumenta o disminuye desde 12,9 por ciento en peso.

En consecuencia, en un aspecto, la invención incluye un procedimiento para obtener liposomas que tienen un diámetro mínimo llevando a cabo un estudio como se establece en el Ejemplo 2. Esto es, un lípido formador de vesículas, o mezcla de lípidos, se solvata con un disolvente lipídico y se hidrata con un segundo disolvente para formar los liposomas. Se varía el porcentaje de disolvente lipídico en la mezcla de hidratación resultante, y se determinan los tamaños de los liposomas. Se establece un perfil de tamaño de liposomas como función del contenido de disolvente lipídico, para determinar la composición de la mezcla de hidratación que da como resultado el diámetro mínimo de los liposomas. Se apreciará que el perfil se puede usar para determinar el diámetro mínimo de los liposomas a una concentración particular de disolvente lipídico, y también para determinar el contenido de disolvente lipídico en la composición de hidratación para lograr cualquier tamaño deseado de liposomas.

Se realizaron estudios adicionales en apoyo de la invención para examinar el efecto de la composición lipídica en el procedimiento. En el Ejemplo 3, se formaron liposomas usando un conjugado de lípido PEG monoaniónico, cargado, mPEG-DSPE. Se prepararon nueve suspensiones liposómicas, y la composición de cada una se muestra en el diagrama de fases de la Fig. 3A. Se determinó el tamaño de partículas en cada suspensión mediante dispersión de luz, y los valores se dan en la Tabla 3, más abajo, y se representan gráficamente en la Fig. 3B. Al observar la Fig. 3B es fácilmente manifiesta la correlación entre el tamaño de los liposomas y el contenido de disolvente lipídico, en la que, a los porcentajes de etanol entre alrededor de 15-35, se minimiza el diámetro de los liposomas.

En los Ejemplos 1-3, las composiciones liposómicas incluyeron un lípido neutro formador de vesículas, o un lípido aniónico formador de vesículas, y un lípido catiónico formador de vesículas. Para uso en la invención, son adecuados cualquiera de los lípidos formadores de vesículas conocidos por los expertos en la técnica, e incluyen aquellos lípidos que pueden formar espontáneamente vesículas bicapas en agua, como se ejemplifica mediante los fosfolípidos, con el resto hidrófobo en contacto con la región hidrófoba interior de la membrana bicapa, y el resto del grupo de cabeza orientado hacia la superficie polar exterior de la membrana.

Los lípidos formadores de vesículas de este tipo son preferiblemente aquellos que tienen dos cadenas hidrocarbonadas, típicamente cadenas acílicas, y un grupo de cabeza, ya sea polar o no polar. Hay una variedad de lípidos sintéticos formadores de vesículas y lípidos de origen natural formadores de vesículas, incluyendo los fosfolípidos, tales como fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, ácido fosfatídico, fosfatidilinositol, y esfingomielina, en los que las dos cadenas hidrocarbonadas tienen típicamente entre alrededor de 14-22 átomos de carbono de longitud, y tienen grados variables de insaturación. Los lípidos y fosfolípidos anteriormente descritos cuyas cadenas acílicas tienen grados variables de saturación se pueden obtener comercialmente o se pueden preparar según procedimientos publicados. Otros lípidos adecuados incluyen glicolípidos, cerebrósidos y esteroles, tales como colesterol.

Los lípidos catiónicos también son adecuados para uso en los liposomas de la invención, en los que el lípido catiónico se puede incluir como un componente minoritario de la composición lipídica, o como un componente mayoritario o como el único componente. Tales lípidos catiónicos tienen típicamente un resto lipófilo, tal como un esterol, una cadena acílica o diacílica, y en los que el lípido tiene una carga global neta positiva. Preferiblemente, el grupo de cabeza del lípido tiene la carga positiva. Ejemplos de lípidos catiónicos incluyen cloruro de N,N-dioleoil-N,N-dimetilamonio (DODAC); 1,2-dioleoiloxi-3-(trimetilamino)propano (DOTAP); bromuro de N-[1-(2,3-ditetradeciloxi)propil]-N,N-dimetil-N-hidroxietilamonio (DMRIE); bromuro de N-[1-(2,3-dioleoiloxi)propil]-N,N-dimetil-N-hidroxietilamonio (DORIE); cloruro de N-[1-(2,3-dioleoiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA); 3-[N-(N',N'-dimetilaminoetano)carbamoil]colesterol (DC-Chol); y bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDAB).

El lípido catiónico formador de vesículas también puede ser un lípido neutro, tal como dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), o un lípido anfipático, tal como un fosfolípido, derivatizado con un lípido catiónico, tal como polilisina u otros lípidos poliamínicos. Por ejemplo, el lípido neutro (DOPE) se puede derivatizar con polilisina para formar un lípido catiónico.

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También se contemplan otros lípidos que se incorporan establemente en bicapas lipídicas, e incluyen esteroides, tales como colesterol.

También en los Ejemplos 1-3 se incluyó un lípido formador de vesículas derivatizado con un polímero hidrófilo en la mezcla lipídica. Como se ha descrito, por ejemplo en la Patente U.S. nº 5.013.556, la inclusión de tal lípido derivatizado en la composición liposómica forma un revestimiento en la superficie de cadenas poliméricas hidrófilas alrededor del liposoma. El revestimiento de superficie de las cadenas poliméricas hidrófilas es eficaz para aumentar el tiempo de vida de la circulación sanguínea in vivo de los liposomas, cuando se compara con los liposomas que carecen de tal revestimiento. Son adecuados otros polímeros hidrófilos conjugados con cualquiera de los lípidos citados anteriormente, e incluyen polivinilpirrolidona, polivinilmetiléter, polimetiloxazolina, polietiloxazolina, polihidroxipropiloxazolina, polihidroxipropilmetacrilamida, polimetacrilamida, polidimetilacrilamida, poli(metacrilato de hidroxipropilo), poli(acrilato de hidroxietilo), hidroximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, polietilenglicol, poliaspartamida y secuencias de péptidos hidrófilos. Los polímeros se pueden emplear como homopolímeros o como copolímeros de bloques o aleatorios, como se describe en las Patentes U.S. nº 5.395.619 y nº 5.631.018. Una cadena polimérica hidrófila preferida es polietilenglicol (PEG), preferiblemente como una cadena de PEG que tiene un peso molecular entre 500-10.000 daltons, más preferiblemente entre 1.000-5.000 daltons. También se prefieren como polímeros hidrófilos los análogos de PEG terminados en sus extremos con grupos metoxi o etoxi, comercialmente disponibles en una variedad de tamaños de polímeros, por ejemplo, 120-20.000 daltons.

La preparación de lípidos formadores de vesículas derivatizados con polímeros hidrófilos se ha descrito, por ejemplo, en la Patente U.S. nº 5.395.619. También se ha descrito la preparación de liposomas que incluyen tales lípidos derivatizados, en los que se incluye en la formulación liposómica entre 1-20 por ciento en moles de tal lípido derivatizado.

El lípido formador de vesículas, o mezcla de lípidos, seleccionado se solvata en un "disolvente lipídico". Como se usa aquí, "disolvente lipídico" se refiere a un disolvente orgánico en el que son solubles los componentes lipídicos del liposoma, a cualquier temperatura. Los ejemplos de disolventes lipídicos incluyen alcoholes, tales como metanol, etanol, butanol, etc., y polioles de bajo peso molecular, tales como glicerol, propilenglicol, y etilenglicol. Los lípidos se añaden al disolvente en la relación molar deseada, y se mezclan hasta que se disuelven, con calentamiento si es necesario. Entonces se añade una cantidad de un segundo disolvente a la mezcla de disolvente lipídico para formar una mezcla de hidratación. El segundo disolvente, como se usa aquí, se refiere a un disolvente que es miscible con el disolvente lipídico en alguna proporción, y preferiblemente es miscible con el disolvente lipídico en la mezcla de hidratación resultante. El segundo disolvente se añade a la mezcla de disolvente lipídico en una cantidad suficiente para llevar al porcentaje en peso del disolvente lipídico hasta un punto seleccionado entre alrededor de 10-50 por ciento en peso, más preferiblemente en un intervalo de porcentaje en peso de disolvente lipídico de 15-45, lo más preferible en un intervalo de porcentaje en peso de disolvente lipídico de 20-40, para obtener liposomas que tienen un tamaño deseado, como se describe anteriormente.

Los Ejemplos 4-8 describen estudios adicionales que usan mezclas lipídicas de liposomas sin lípido catiónico (DODAC) y sin polinucleótido. En el Ejemplo 4, se prepararon mezclas lipídicas de HSPC, colesterol y mPEG-DSPE, en una relación molar de 50,6:40,3:5,1. Las mezclas se hidrataron con un disolvente acuoso para formar nueve suspensiones liposómicas con un contenido variable de etanol a las tres concentraciones lipídicas (0,9, 3,1 y 4,7% en peso). Las composiciones se muestran en el diagrama de fases de la Fig. 4A, y se dan en la Tabla 4 más abajo. Los tamaños de los liposomas se midieron y se representaron gráficamente en la Fig. 4B como función del contenido de lípido y de etanol. A los tres porcentajes de lípidos, el tamaño de los liposomas se minimiza a concentraciones de etanol entre alrededor de 5-35 por ciento en peso de etanol.

El Ejemplo 5 proporciona una mezcla lipídica que no incluye un lípido derivatizado con un polímero hidrófilo. En el Ejemplo 5, se usó la mezcla lipídica del Ejemplo 4, excepto el mPEG-DSPE (relación molar HSPC:colesterol de 53,1:46,9), para preparar nueve suspensiones liposómicas a porcentajes en peso de lípido de 0,9, 2,9 y 4,3. El contenido de etanol varió entre 4-39 por ciento en peso, y la composición de cada suspensión preparada se indica en el diagrama de fases de la Fig. 5A. En la Fig. 5B se muestran los tamaños de partículas como una función del contenido de lípido y de etanol, y, como se puede observar, el procedimiento de la invención para controlar el tamaño de los liposomas mediante la composición de la mezcla de hidratación, y especialmente mediante el contenido del disolvente lipídico, es evidente incluso en ausencia del lípido derivatizado. Como antes, entre 5-35 por ciento en peso de disolvente lipídico, el tamaño de los liposomas se correlaciona con el contenido de disolvente lipídico.

El Ejemplo 6 describe la preparación de suspensiones liposómicas que usan una mezcla lipídica de HSPC, colesterol y mPEG-DSPE, en una relación molar de 65,4:38,3:5,3. La composición de cada suspensión se muestra en el diagrama de fases de la Fig. 6A, y los diámetros de los liposomas se representan gráficamente en la Fig. 6B como una función de los contenidos de lípido y de etanol. El tamaño de los liposomas se minimiza cuando el contenido de etanol en la mezcla de hidratación está entre alrededor de 5-35 por ciento en peso. El tamaño mínimo de los liposomas a cada concentración de lípidos cae entre alrededor de 15-20 por ciento en peso de etanol, aumentando el tamaño de los liposomas a medida que aumenta o disminuye el contenido de etanol de este intervalo.

El Ejemplo 7 describe la preparación de suspensiones liposómicas como las del Ejemplo 6, excepto que se omite el mPEG-DSPE (relación molar de HSPC:Chol de 59:41). El diagrama de fases de la Fig. 7A muestra la composición de cada suspensión, y el tamaño de los liposomas se representa gráficamente en la Fig. 7B, con resultados similares a los obtenidos cuando mPEG-DSPE estaba presente en la mezcla lipídica. Estos resultados, y los resultados del Ejemplo 5, muestran que el control sobre el tamaño de los liposomas se proporciona independientemente del tipo de lípidos presentes.

El procedimiento de la invención se puede usar para preparar liposomas que atrapan una variedad de agentes terapéuticos. El agente terapéutico se puede mezclar con los lípidos y con el disolvente lipídico o con el segundo disolvente, dependiendo de la naturaleza del agente, y de su solubilidad en los disolución empleados. Los agentes contemplados varían ampliamente, e incluyen tanto aplicaciones terapéuticas como aquellos para uso en aplicaciones de diagnóstico. Los agentes terapéuticos incluyen compuestos naturales y sintéticos que tienen las siguientes actividades terapéuticas: antiangiogénica, antienvejecimiento, antiartrítica, antiarrítmica, antibacteriana, anticolinérgica, anticoagulante, antidiurética, como antídoto, antiepiléptica, antifúngica, antiinflamatoria, antimetabólica, antimigraña, antineoplásica, antiparasitaria, antipirética, antiataques, antisérica, antiespasmódica, analgésica, anestésica, beta-bloqueante, modificadora de la respuesta biológica, reguladora del metabolismo óseo, cardiovascular, diurética, enzimática, potenciadora de la fertilidad, promotora del crecimiento, hemostática, hormonal, supresora hormonal, reductora de hipercalcemia, reductora de hipocalcemia, reductora de hipoglicemia, reductora de hiperglicemia, inmunosupresora, inmunopotenciadora, relajante muscular, neurotransmisora, parasimpaticomimética, simpaticomimética, extensora del plasma, expansora del plasma, psicotrópica, trombolítica y vasodilatadora.

En una realización preferida, el agente atrapado es un fármaco citotóxico, esto es, un fármaco que tiene un efecto perjudicial o tóxico sobre las células. Los ejemplos citotóxicos ejemplares incluyen los antibióticos antraciclínicos tales como doxorrubicina, daunorrubicina, epirrubicina e idarrubicina, y análogos de estos, tales como epirrubicina y mitoxantrona; compuestos del platino, tales como cisplatino y carboplatino.

El agente atrapado también puede ser un ácido nucleico, incluyendo ácido ribonucleico o análogos sintéticos, análogos derivatizados a péptidos o que contienen una o más bases sintéticamente modificadas o análogos de bases, o que contienen un ligando incorporado como parte de la secuencia que incluye ADN plásmido, oligonucleótidos sintéticos u otros oligoanálogos.

Se apreciará además que los liposomas pueden incluir un ligando para seleccionar dianas, unido covalentemente al extremo distante libre de la cadena polimérica hidrófila, que está unida a su extremo próximo a un lípido formador de vesículas. Como alternativa, para la composición que carece de un lípido derivatizado con un polímero hidrófilo, los ligandos que seleccionan dianas se pueden unir directamente a la superficie externa de los liposomas uniéndose a un componente lipídico de la superficie. Hay una amplia variedad de técnicas para unir un polímero hidrófilo seleccionado a un lípido seleccionado y activar el extremo libre, no unido del polímero para reacción con un ligando seleccionado, y en particular se ha estudiado ampliamente el polímero hidrófilo polietilenglicol (PEG) (Allen, T.M., et al., Biochemicia et Biophysica Acta 1237:99-108 (1995); Zalipsky, S., Bioconjugate Chem., 4(4):296-299 (1993); Zalipsky, S., et al., FEBS Lett. 353:71-74 (1994); Zalipsky et al., Bioconjugate Chemistry, 705-708 (1995); Zalipsky, S., en STEALTH LIPOSOMES (D. Lasic y F. Martin, Eds.) Capítulo 9, CRC Press, Boca Raton, FL (1995)).

Generalmente, las cadenas de PEG se funcionalizan para que contengan grupos reactivos adecuados para acoplamiento con, por ejemplo, grupos sulfhidrilo, amino, y aldehídos o cetonas (típicamente derivados de la oxidación suave de porciones de hidratos de carbono de un anticuerpo), presentes en una amplia variedad de ligandos, tales como los expuestos en la Solicitud PCT nº 98/16202 y que se incorpora aquí como referencia. Los ejemplos de tales grupos reactivos terminales de PEG incluyen maleimida (para la reacción con grupos sulfhidrilo), N-hidroxisuccinimida (NHS) o éster de carbonato con NHS (para reacción con aminas primarias), hidrazida o hidrazina (para la reacción con aldehídos o cetonas), yodoacetilo (preferentemente reactivo con grupos sulfhidrilo) y ditiopiridina (reactivo con grupos tiol). Los esquemas de reacción sintéticos para activar PEG con tales grupos se exponen en las Patentes U.S. nº 5.631.018, nº 5.527.528, nº 5.395.619, y las secciones pertinentes que describen los procedimientos de reacciones sintéticas se incorporan expresamente aquí como referencia.

El Ejemplo 8 describe la preparación de una composición liposómica que contiene el radiosensibilizador dpIUdR. Se derivatizó 5-yodo-2'-desoxiuridina, denominado aquí como IUdR, con un ácido graso de 16 carbonos, ácido palmítico, en dos posiciones en el azúcar de ribosa de IUdR, como se muestra en la Fig. 8. en el esquema de reacción mostrado en la figura, y detallado en el Ejemplo 8A, se hizo reaccionar IUdR con un pequeño exceso de cloruro de palmitoilo y catalizador de 4-dimetilpiridina en piridina o en piridina/cloroformo como el disolvente para producir 3',5'-dipalmitoil-5-yodo-2'-desoxiuridina, denominado aquí como dpIUdR.

Como se describe en el Ejemplo 8B, se disolvieron los lípidos HSPC, mPEG-DSPE y dpIUdR en etanol, en una relación molar de 89:5:6. Esta disolución madre de lípidos se usó para preparar suspensiones liposómicas hidratando una cantidad de la disolución lipídica con un segundo disolvente, un tampón acuoso. Las suspensiones lipídicas se prepararon por triplicado a porcentajes en peso finales de etanol de 8,1, 10,1, 12,2, 14,3, 16,5, 20,8, 25,3 y 44,1. El tamaño medio de los liposomas en cada muestra se midió mediante dispersión de luz cuasiestática, y los resultados se muestran en la Tabla 8.

TABLA 8

1

A la vista de la última fila de la Tabla 8, es manifiesto que hay un mínimo en el tamaño de partículas de los liposomas a 16,5 por ciento en peso de etanol. Este dato se muestra gráficamente en la Fig. 9, y es manifiesta la depresión en el tamaño de los liposomas que comienza a alrededor de 10 por ciento en peso y que termina a alrededor de 25 por ciento en peso. Un perfil tal como aquél en la Fig. 9 del tamaño de lípidos como función del contenido de etanol se puede emplear para determinar la cantidad de etanol necesaria para obtener un tamaño particular de liposomas. Por ejemplo, el tamaño mínimo de partículas de 106 nm se obtiene hidratando la mezcla de lípido y etanol hasta 16,5 por ciento en peso de etanol. Se obtiene un tamaño más grande de partículas hidratando para lograr más o menos etanol, según el perfil. Al establecer tal perfil, se determina la cantidad diana de disolvente lipídico para lograr un tamaño mínimo de partículas o un tamaño seleccionado de partículas para cualquier mezcla de lípidos y disolventes, como se ilustrará posteriormente más abajo.

La Fig. 10 es un diagrama de fases que muestra la región de operación para la formación de los liposomas según la invención. En el diagrama, la región sombreada corresponde a la formación de liposomas en la que la cantidad de disolvente lipídico está entre alrededor de 10-50 por ciento en peso, y el porcentaje en peso de los lípidos está entre 0,1-15. Dependiendo de la mezcla lipídica y del disolvente lipídico, se puede determinar el punto en el que aparece un mínimo en el tamaño de partículas de los liposomas dentro de la región de operación. Las suspensiones liposómicas en la región de operación son visualmente claras y contienen liposomas de tamaños submicrométricos. Se apreciará que la región de operación variará ligeramente según los componentes lipídicos, los disolventes y los componentes de los fármacos. El experto en la técnica puede realizar fácilmente un estudio como el expuesto en el Ejemplo 8B y en la Tabla 8 para determinar la cantidad de disolvente lipídico que produce un mínimo en el tamaño de los liposomas.

Los liposomas formados por el procedimiento anteriormente descrito pueden tener, dependiendo de la cantidad de disolvente lipídico en la mezcla de hidratación, un tamaño mínimo de partículas. De este modo, en algunos casos, puede ser que no sea necesario dimensionar posteriormente los liposomas vía extrusión u otra técnica. En algunos casos, puede ser deseable procesar posteriormente los liposomas, por ejemplo mediante extrusión. El procedimiento de preparación es particularmente útil para la incorporación de fármacos derivatizados con lípidos en liposomas, a una relación de fármaco a lípido elevada, en la que la obtención de un tamaño de partículas farmacéuticamente útil de entre 90-150 nm es difícil debido a la incapacidad para extruir la mezcla, como se expone anteriormente. La formación de liposomas según la invención supera esta limitación, puesto que los liposomas tienen o están próximos al tamaño deseado de partículas con la hidratación con el segundo disolvente, y se minimiza cualquier procesamiento posterior del tamaño. De este modo, se puede emplear una mayor carga de fármaco derivatizado con lípido, a la vez que aún es posible lograr el tamaño deseado de los liposomas.

Esta característica de la invención se ilustra mediante el estudio descrito en el Ejemplo 8C. Los liposomas se prepararon usando los lípidos HSPC, mPEG-DSPE y dpIUdR, en los que las cantidades molares de las formulaciones fueron 89/5/6, 85/5/10, 80/5/15, 70/5/25 y 55/5/40. Los lípidos, incluyendo el dpIUdR, se disolvieron en etanol, y después se hidrataron con suficiente agua para llevar la concentración de etanol en cada mezcla hasta 16,5 por ciento en peso (20 por ciento en volumen). Cada suspensión liposómica se extruyó entonces como se describe en el Ejemplo, y, después de la extrusión, se midió el tamaño medio de partículas de los liposomas en cada suspensión. Los resultados se muestran en la Tabla 9.

TABLA 9

2

* la composición no se pudo extruir

Se dimensionaron fácilmente liposomas que contienen 6, 10 y 15 por ciento en moles de dpIUdR hasta alrededor de 100 nm cuando se preparan según el procedimiento de la invención, hidratando la mezcla lipídica hasta una cantidad de disolvente lipídico que da un tamaño mínimo de partículas. De forma importante, los lípidos se forman a un tamaño mínimo de partículas con una relación de fármaco a lípido entre alrededor de 1,5 y 5, más preferiblemente entre 2-4. En una realización preferida de la invención, los liposomas que tienen el tamaño deseado de partículas se preparan usando el procedimiento a una relación de fármaco a lípido mayor que alrededor de 4, como se logra con la composición lipídica que tiene 15 por ciento en moles de dpIUdR.

A partir de lo anterior se puede apreciar cómo se cumplen diversos objetos y características de la invención. La preparación de los liposomas según el procedimiento proporciona un medio para controlar el tamaño de las partículas en la suspensión. Más específicamente, hay una relación entre el tamaño de los liposomas y la composición de la mezcla de hidratación, es decir, la cantidad de disolvente lipídico en la mezcla de hidratación, a un porcentaje mayor que alrededor de 10 por ciento en peso y menor que 50 por ciento en peso de disolvente lipídico. En esta región, existe un mínimo en el tamaño de partículas de los liposomas.

III. Ejemplos

Los siguientes ejemplos ilustran el procedimiento para controlar el tamaño de partículas de los liposomas vía la composición de la mezcla de hidratación. Los ejemplos de ninguna forma pretenden limitar el alcance y espíritu de la invención.

Materiales

Los siguientes materiales se obtuvieron a partir de la fuente indicada: fosfatidilcolina de huevo (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL); fosfatidilcolina de soja parcialmente hidrogenada (Vernon Walden Inc., Green Village, NJ); colesterol (Solvay Pharmaceuticals, Holanda); cloruro de N,N-dioleoil-N,N-dimetilamonio (DODAC) (Northern Lipids, Canadá); conjugado de PEG (Pm 2000)-ceramida (PEG C_{20}-ceramida) (Northern Lipids, Canadá); histidina (Seltzer Chemicals; Carlsbad, CA); etanol (Quantum Chemical Co. Tuscola, IL). el mPEG-DSPE se preparó como se describe en la bibliografía (por ejemplo, Zalipsky, S., et al, Bioconjugate Chem., 4:296-299 (1993)).

Procedimientos

La QUELS, dispersión cuasielástica de la luz, se realizó usando un Coulter modelo N4MD (Coulter Corporation, Miami, FL) para el Ejemplo 1, y un Brookhaven Instruments Modelo B1-200SM (Brookhaven Instruments Corporation, Holtsville, NY) para los Ejemplos 2-7.

Ejemplo 1

Se mezclaron 1975 mg de fosfatidilcolina de huevo, 483,8 mg de colesterol, 436,9 mg de DODAC y 1337,5 mg de PEG C_{20}-ceramida, con 5 ml de etanol, y se calentó hasta alrededor de 65-70ºC hasta disolución. La composición de esta disolución madre lipídica fue 51,7 por ciento en peso de lípido y 48,3 por ciento en peso de etanol. La concentración total de lípido fue 496 mmoles/ml.

Se disolvió un oligonucleótido que tiene aproximadamente 34 bases en 10 mmolar de histidina, 0,9% de NaCl (pH 6,5) hasta una concentración de 20 mg/ml.

Se formaron suspensiones liposómicas inflando alícuotas de la disolución lipídica con alícuotas de la disolución madre de oligonucleótido. Ambas disoluciones madre se diluyeron según fue necesario con sus respectivos disolventes justo antes del mezclamiento, a fin de variar la concentración de etanol de la mezcla mientras se mantiene una concentración fija de oligonucleótido y de lípido. Se formaron seis suspensiones liposómicas a partir de las disoluciones madre, y la composición de cada mezcla se indica en el diagrama de fases de la Fig. 1A.

Después de mezclar, se determinó mediante dispersión cuasielástica de la luz los diámetros medios de las partículas de los liposomas en la suspensión. Los resultados se muestran en la Tabla 1.

TABLA 1

3

La Fig. 1B es un gráfico que muestra el diámetro medio de partículas, en nm, como una función tanto del porcentaje en peso de lípido como del porcentaje en peso de etanol.

Ejemplo 2

Se mezclaron 1183 mg de fosfatidilcolina de soja parcialmente hidrogenada, 290 mg de colesterol, 262 mg de DODAC y 795 mg de mPEG-DS con 0,47 ml de etanol, y se calentó hasta que se disolvió. La composición de esta disolución madre lipídica fue 87,2 por ciento en peso de lípido y 12,8 por ciento en peso de etanol.

Se preparó una disolución madre que contiene 20 mg/ml de un oligonucleótido de 34 bases, en disolución acuosa de 10 mmolar de histidina y 0,9% de NaCl, pH 6,5.

Las alícuotas de la disolución madre lipídica, diluidas según fuera necesario con etanol, se hidrataron con alícuotas de la disolución acuosa oligonucleotídica, diluida según fuera necesario con la fase acuosa, y se tomaron para preparar suspensiones de liposomas a las composiciones indicadas en la Fig. 2A.

Cada suspensión liposómica se caracterizó midiendo el diámetro medio de partículas usando QELS justo después de la hidratación y después de la incubación toda la noche a 5ºC. Los resultados se muestran en la Tabla 2.

TABLA 2

4

La Fig. 2B es un gráficO que muestra el diámetro medio de partículas, en nm, como una función tanto del porcentaje en peso de lípido como del porcentaje en peso de etanol.

Ejemplo 3

Se mezclaron 394 mg de fosfatidilcolina de soja parcialmente hidrogenada, 96,6 mg de colesterol, 87,4 mg de DODAC y 275 mg de mPEG-DSPE con 2,147 ml de etanol, y se calentó hasta que se disolvió. La composición de esta disolución madre lipídica fue 33,5 por ciento en peso de lípido y 66,5 por ciento en peso de etanol.

Se preparó una disolución madre, que contiene 6,7 mg/ml de un oligonucleótido de 34 bases, en disolución acuosa de 10 mmolar de histidina y 0,9% de NaCl, pH 6,5.

Se tomaron alícuotas de la disolución madre lipídica, diluida según sea necesario con etanol, e hidratadas con alícuotas de la disolución acuosa oligonucleotídica, diluida según sea necesario con la fase acuosa, para preparar suspensiones de liposomas a las composiciones indicadas en la Fig. 3A.

Cada suspensión liposómica se caracterizó midiendo el diámetro medio de partículas usando QELS justo después de la hidratación. Los resultados se muestran en la Tabla 3.

TABLA 3

5

La Fig. 3B es un gráfico que muestra el diámetro medio de partículas, en nm, como una función tanto del porcentaje en peso de lípido como del porcentaje en peso de etanol.

Ejemplo 4

Se mezclaron 599,6 mg de fosfatidilcolina de soja parcialmente hidrogenada, 257,2 mg de colesterol, y 214,2 mg de mPEG-DSPE con 1 ml de etanol, y se calentó hasta que se disolvió. La composición de esta disolución madre lipídica fue 57,6 por ciento en peso de lípido total en etanol.

Se preparó una fase acuosa para hidratación, y contenía disolución acuosa 10 mmolar de histidina, y 0,9% de NaCl, pH 6,5.

Se hidrataron alícuotas de la disolución madre lipídica, diluida según sea necesario con etanol, con alícuotas de la disolución acuosa, para preparar suspensiones de liposomas a las composiciones indicadas en la Fig. 4A. Cada una de las composiciones se preparó por triplicado.

Cada suspensión liposómica se caracterizó midiendo el diámetro medio de partículas usando QELS justo después de la hidratación. Los resultados se muestran en la Tabla 4.

TABLA 4

6

La Fig. 4B es un gráfico que muestra el diámetro medio de partículas, en nm, como una función tanto del porcentaje en peso de lípido como del porcentaje en peso de etanol.

Ejemplo 5

Se prepararon liposomas como se describe en el Ejemplo 4, excepto que se omitió mPEG-DSPE para la mezcla lipídica de liposomas. De este modo, se mezclaron 629,8 mg de fosfatidilcolina de soja parcialmente hidrogenada y 272 mg de colesterol con 1 ml de etanol, y se calentó hasta que se disolvió. La composición de esta disolución madre lipídica fue 53,3 por ciento en peso de lípido total en etanol.

Se hidrataron alícuotas de la disolución madre lipídica, diluidas según sea necesario con etanol, con alícuotas de la disolución acuosa (10 mmolar de histidina, 0,9% de NaCl, pH 6,5), para preparar suspensiones de liposomas a las composiciones indicadas en la Fig. 5A. Cada una de las composiciones se preparó por triplicado.

Cada composición liposómica se caracterizó midiendo el diámetro medio de partículas usando QELS justo después de la hidratación. Los resultados se muestran en la Tabla 5.

TABLA 5

7

La Fig. 5B es un gráfico que muestra el diámetro medio de partículas, en nm, como una función tanto del porcentaje en peso de lípido como del porcentaje en peso de etanol.

Ejemplo 6

Se mezclaron 668,3 mg de fosfatidilcolina de soja parcialmente hidrogenada, 222,3 mg de colesterol y 222,6 mg de mPEG-DSPE con 1 ml de etanol, y se calentó hasta que se disolvió. La composición de esta disolución madre lipídica fue 55,5 por ciento en peso de lípido total en etanol.

Se preparó una fase acuosa para hidratación, y contenía disolución acuosa 10 mmolar de histidina y 0,9% de NaCl, pH 6,5.

Se hidrataron alícuotas de la disolución madre lipídica, diluida según sea necesario con etanol, con alícuotas de la disolución acuosa, para preparar suspensiones de liposomas a las composiciones indicadas en la Fig. 6A. Cada una de las composiciones se preparó por triplicado.

Cada composición liposómica se caracterizó midiendo el diámetro medio de partículas usando QELS justo después de la hidratación. Los resultados se muestran en la Tabla 6.

TABLA 6

8

La Fig. 6B es un gráfico que muestra el diámetro medio de partículas, en nm, como una función tanto del porcentaje en peso de lípido como del porcentaje en peso de etanol.

Ejemplo 7

Se prepararon liposomas como se describe en el Ejemplo 6, excepto que se omitió mPEG-DSPE para la mezcla lipídica de liposomas. De este modo, se mezclaron 629,8 mg de fosfatidilcolina de soja parcialmente hidrogenada y 272 mg de colesterol con 1 ml de etanol, y se calentó hasta que se disolvió. La composición de esta disolución madre lipídica fue 54,3 por ciento en peso de lípido total en etanol.

Se hidrataron alícuotas de la disolución madre lipídica, diluidas según sea necesario con etanol, con alícuotas de la disolución acuosa (10 mmolar de histidina, 0,9% de NaCl, pH 6,5), para preparar suspensiones de liposomas a las composiciones indicadas en la Fig. 7A. Cada una de las composiciones se preparó por triplicado.

Cada composición liposómica se caracterizó midiendo el diámetro medio de partículas usando QELS justo después de la hidratación. Los resultados se muestran en la Tabla 7.

TABLA 7

9

La Fig. 7B es un gráfico que muestra el diámetro medio de partículas, en nm, como una función tanto del porcentaje en peso de lípido como del porcentaje en peso de etanol.

Ejemplo 8 Liposomas que contienen dpIUdR A. Síntesis de 3',5'-dipalmitoil-5-yodo-2'-desoxiuridina (dpIUdR)

Se añadió lentamente cloruro de palmitoilo a una disolución de desoxiuridina en piridina o en piridina/cloroformo y 4-dimetilpiridina como catalizador. La disolución se mezcló hasta que se puso de color amarillo, y después se dejó reposar toda la noche para precipitarla. La mezcla se disolvió en cloroformo, y se lavó con disolución al 10% acuosa de ácido cítrico y disolución saturada de bicarbonato de sodio. Se eliminó el cloroformo, y se añadió metanol para producir un precipitado blanco, identificado como 3',5'-dipalmitoil-5-yodo-2'-desoxiuridina (rendimiento de 66%). El esquema de reacción sintética se muestra en la Fig. 8

B. Preparación de liposomas con contenidos variables de etanol

Se disolvieron los lípidos fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC) y diestearoilfosfatidilcolina derivatizada con metoxi-polietilenglicol (DSPE-mPEG) y dpIUdR, en una relación molar de 89/5/6, en etanol a 70ºC hasta que se logró la disolución total (alrededor de 1 hora). Esta disolución madre lipídica, después de diluirla según sea necesario para mantener una concentración fija de lípido, se hidrató con una disolución al 10% de sacarosa a 70ºC para variar la concentración de 8-44 por ciento en peso. Cada una de las mezclas liposómicas se agitó durante una hora para formar suspensiones liposómicas. El tamaño de partículas de los liposomas de cada mezcla se determinó usando dispersión cuasielástica de la luz, y los resultados se muestran en la Tabla 8.

C. Preparación de liposomas a 16,5 por ciento en peso de etanol

Se disolvieron los lípidos fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC) y diestearoilfosfatidilcolina derivatizada con metoxi-polietilenglicol (DSPE-mPEG) y dpIUdR, en una relación molar de 89/5/6, 85/5/10, 80/5/15, 70/5/25 y 55/5/40 en etanol a 70ºC hasta que se logró la disolución total (alrededor de 1 hora). Las mezclas lipídicas se hidrataron con suficiente disolución al 10% de sacarosa, a 70ºC, para lograr un contenido de etanol de 16,5 por ciento en peso en la mezcla de hidratación (20% (v/v) de etanol). Las mezclas se agitaron durante una hora antes de extruirlas.

Las suspensiones liposómicas se extruyeron a través de membranas de policarbonato para lograr un tamaño uniforme de 100 nm. Las suspensiones se diafiltraron entonces frente a disolución al 10% de sacarosa para reducir la concentración de etanol por debajo de 400 ppm. Las suspensiones se ultrafiltraron entonces hasta una concentración por encima de la concentración del fármaco diana, se analizaron para determinar la concentración del fármaco y se diluyeron para conseguir el objetivo añadiendo tampón de histidina 10 mM y ajustando el pH hasta 6,5.

Los tamaños de partículas de los liposomas se midieron mediante dispersión cuasielástica de la luz, y los resultados se muestran en la Tabla 9.

Claims

1. Procedimiento para preparar una composición liposómica que comprende liposomas que tienen un tamaño deseado, comprendiendo el procedimiento (i) determinar una cantidad de disolvente lipídico requerida para lograr el tamaño deseado de liposomas a partir de un perfil de tamaño de liposomas como una función de la cantidad de disolvente lipídico en una mezcla de hidratación del disolvente lipídico y un segundo disolvente con el que el disolvente lipídico es miscible, y (ii) hidratar un lípido formador de vesículas disuelto en dicha cantidad determinada de disolvente lipídico con el segundo disolvente para formar la mezcla de hidratación, estando dicha cantidad determinada de disolvente lipídico comprendida entre 10 y 50 por ciento en peso.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el perfil de tamaño de liposomas como una función del contenido de disolvente lipídico en la mezcla de hidratación se obtiene midiendo el diámetro de los liposomas en la mezcla de hidratación, y repitiendo las etapas de hidratación y de medición a diferentes cantidades de disolvente lipídico para obtener el perfil.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que el disolvente lipídico es un alcohol.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que el disolvente lipídico es metanol, etanol o butanol.

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el lípido formador de vesículas es un lípido cargado formador de vesículas, o un lípido neutro formador de vesículas, y/o se derivatiza con una cadena de polímero hidrófilo.

6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que el lípido formador de vesículas se derivatiza con una cadena de polímero hidrófilo, en el que la cadena de polímero hidrófilo es polietilenglicol.

7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el segundo disolvente es agua.

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se hidrata un agente terapéutico con el disolvente lipídico o el segundo disolvente.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que el agente terapéutico es un ácido nucleico o un radiosensibilizador derivatizado con una o más cadenas acílicas.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que el agente terapéutico es dipalmitoil-5-yodo-2-desoxiuridina.