JP2002536316A - リポソームサイズを調節する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 選択された粒径のリポソームの調製法。この方法において、脂質溶媒中に溶解させたベシクル形成脂質を第二溶媒で水和させて、１０重量％より多く、５０重量％より少ない脂質溶媒を有する水和混合物を形成する。脂質溶媒中の脂質溶媒の目標量は、所望の粒径が得られるように選択される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 技術分野 本発明は、リポソーム組成物を調製する方法に関し、この方法は、結果として
得られるリポソームサイズに対して調節を与える。本発明はさらに、その方法に
従って調製される組成物に関する。

【０００２】 背景技術 リポソームは、少なくとも１つの完全に閉ざされた脂質二重層で囲まれて、典
型的には、約７０nmから数１０００nmの直径を有する球状水性粒子である。この
１０年間で、リポソームは、医薬品および化粧料を輸送するためのビヒクルとし
て重要になってきた。そのような薬剤は、該薬剤の親水性に応じて、水性区画内
に封入されるか、またはリポソーム脂質二重層内に組み込まれる。

【０００３】 リポソームを調製する方法は、当業界では既に知られている。１つ以上の脂質
二重層を有するリポソームである多重膜ベシクルは、最も簡単には、減圧下での
回転蒸発によって、ベシクル形成脂質を有機溶媒からフラスコ壁面上の薄膜に析
出させることにより調製される。水性緩衝液を加えて、脂質の結晶融解温度以上
の温度、または脂質混合物中で最も融解する成分のより高い結晶融解温度以上の
温度で、脂質を水和させる。水性緩衝液の添加は、撹拌、例えば、かき混ぜ、超
音波処理、渦流を伴って、リポソームの懸濁液を得る。

【０００４】 リポソームを形成した後、リポソームをサイズ分けして、より小さなおよび／
またはより均一な粒径分布を得る。一般的なサイズ分け方法の１つは、一連のサ
イズ分けフィルターを通してのリポソームの押出しである。あるいはまた、懸濁
液を超音波処理して、リポソームをより小さな粒子へと破砕することにより、リ
ポソームをサイズ分けする。

【０００５】 小単層ベシクルおよび大単層ベシクル（ＳＵＶおよびＬＵＶ）は、１つの脂質
二重層をもつリポソームであって、多数の技術により調製することができる。Ｓ
ＵＶは、典型的には、２０−５０nmの範囲に直径を有して、脂質の希エタノール
溶液の水相への迅速な注入、いわゆるエタノール注入法により形成することがで
きる。ＳＵＶを形成する別の技術は、多重膜ベシクルの激しい音波処理によるも
のである。大単層ベシクルは、サイズが数百ナノメーターから数ミクロンとなり
得て、典型的には、逆相蒸発法により形成され、ここでは、脂質の油中水型エマ
ルジョン、緩衝液および有機物からの有機溶媒が減圧下に除去される。

【０００６】 発明の要約 従って、本発明の目的の１つは、所望の直径をもつリポソームを調製する方法
を提供することである。

【０００７】 本発明の別の目的は、選択された大きさを有するリポソームを得る方法を提供
することである。

【０００８】 本発明のさらなる目的は、リポソームの大きさを水和組成物の組成の選択によ
って調節する方法を提供することである。

【０００９】 一態様において、本発明には、所望のリポソーム粒径を得る方法が含まれる。
その方法には、脂質溶媒に溶解したベシクル形成脂質を第二溶媒で水和して、１
０−５０重量％の間の脂質溶媒量を含む水和混合物を形成することが含まれる。
脂質溶媒量は、所望の粒径を得るよう選択され、そして脂質溶媒量は、水和混合
物中の第二溶媒と混和性である。

【００１０】 一態様において、脂質溶媒は、メタノール、エタノールまたはブタノールとい
ったようなアルコールである。

【００１１】 一態様において、ベシクル形成脂質は、カチオン性脂質 ＤＯＤＡＣまたはア
ニオン性脂質 ＤＳＰＥといったような荷電ベシクル形成脂質である。別の態様
において、ベシクル形成脂質は、中性ベシクル形成脂質である。

【００１２】 さらに別の態様において、水和にはさらに、ポリエチレングリコールのような
親水性ポリマー鎖で誘導体化されたベシクル形成脂質を水和することが含まれる
。

【００１３】 好ましい一態様において、本発明の方法における第二溶媒は、水である。

【００１４】 別の態様において、水和には、治療薬を第二溶媒で水和することが含まれる。
あるいはまた、水和にはさらに、治療薬を脂質溶媒で水和することが含まれ得る
。

【００１５】 好ましい態様において、治療薬は、１つ以上のアシル鎖で誘導体化された放射
線増感剤である。好ましい誘導体化放射線増感剤の１つは、ジパルミトイル ５
−ヨード−デオキシウリジンである。

【００１６】 別の態様において、治療薬は、核酸である。

【００１７】 別の態様において、本発明には、治療薬がさらに含まれる、上記の方法に従っ
て調製されるリポソーム組成物が含まれる。

【００１８】 別の態様において、本発明には、ベシクル形成脂質を脂質溶媒中で混合するこ
と；そして第二溶媒を加えて、脂質溶媒量を１０重量％超かつ約５０重量％未満
とすること；により、最小粒径を有するリポソームを得る方法が含まれ、ここで
は、脂質溶媒量が、１０重量％未満または５０重量％超の脂質溶媒量を有するこ
とを除き、同様の処方から調製されるリポソームよりもサイズが小さいリポソー
ムサイズを得るよう選択される。

【００１９】 本発明のさらに別の態様において、リポソーム組成を決定して、選択されたサ
イズを有するリポソームを形成する方法を記載して、特許請求する。その方法に
は、ベシクル形成脂質を脂質溶媒中で混合すること；そして脂質を、リポソーム
の懸濁液を得るために第二溶媒量で水和すること；が含まれる。懸濁液のリポソ
ーム粒径を測定し、水和および測定工程を繰り返して、リポソーム粒径のプロフ
ィルを脂質溶媒量の関数として得る。プロフィルに基づいて、選択されたリポソ
ーム粒径とするのに必要な第二溶媒量を選択する。

【００２０】 本発明のこれらの目的および他の目的並びに特徴は、本発明の次の詳細な説明
を添付の図面と合わせて読むと、より完全に理解されるであろう。

【００２１】 図面の簡単な説明 図１Ａ−１Ｂは、卵ホスファチジルコリン、コレステロール、Ｎ,Ｎ−ジオレ
オイル−Ｎ,Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）および取り込ま
れたオリゴヌクレオチドをもつ分子量２０００ダルトンのポリエチレングリコー
ルで誘導体化されたセラミド（Ｃ_２０ＰＥＧ−セラミド）で調製されたリポソー
ム懸濁液に対応し、ここでは、各々の懸濁液の組成を図１Ａの相図に示し、そし
て各々の懸濁液中のリポソームの平均粒径（nm単位）を脂質の重量％およびエタ
ノールの重量％の両方の関数として図１Ｂにプロットする。

【００２２】 図２Ａ−２Ｂは、部分的に水素化された大豆ホスファチジルコリン、コレステ
ロール、ＤＯＤＡＣおよびmＰＥＧで誘導体化されて、取り込まれたオリゴヌク
レオチドを含む中性脂質（mＰＥＧ−ＤＳ）で調製されたリポソーム懸濁液に対
応し、ここでは、各々の懸濁液の組成を図２Ａの相図に示し、そして各々の懸濁
液中のリポソームの平均粒径（nm単位）を脂質の重量％およびエタノールの重量
％の両方の関数として図２Ｂにプロットする。

【００２３】 図３Ａ−３Ｂは、部分的に水素化された大豆ホスファチジルコリン、コレステ
ロール、ＤＯＤＡＣおよびメトキシ−ポリエチレングリコールで誘導体化されて
、取り込まれたオリゴヌクレオチドを有するアニオン性脂質（ジステアロイルホ
スファチジル−エタノールアミン、ＤＰＳＥ）（mＰＥＧ−ＤＳＰＥ）で調製さ
れたリポソーム懸濁液に対応し、ここでは、各々の懸濁液の組成を図３Ａの相図
に示し、そして各々の懸濁液中のリポソームの平均粒径（nm単位）を脂質の重量
％およびエタノールの重量％の両方の関数として図３Ｂにプロットする。

【００２４】 図４Ａ−４Ｂは、部分的に水素化された大豆ホスファチジルコリン、コレステ
ロールおよびmＰＥＧ−ＤＳＰＥで調製されたリポソーム懸濁液に対応し、ここ
では、各々の懸濁液の組成を図４Ａの相図に示し、そして各々の懸濁液中のリポ
ソームの平均粒径（nm単位）を脂質の重量％およびエタノールの重量％の両方の
関数として図４Ｂにプロットする。

【００２５】 図５Ａ−５Ｂは、部分的に水素化された大豆ホスファチジルコリンおよびコレ
ステロールで調製されたリポソーム懸濁液に対応し、ここでは、各々の懸濁液の
組成を図５Ａの相図に示し、そして各々の懸濁液中のリポソームの平均粒径（nm
単位）を脂質の重量％およびエタノールの重量％の両方の関数として図５Ｂにプ
ロットする。

【００２６】 図６Ａ−６Ｂは、部分的に水素化された大豆ホスファチジルコリン、コレステ
ロールおよびmＰＥＧ−ＤＳＰＥで調製されたリポソーム懸濁液に対応し、ここ
では、各々の懸濁液の組成を図６Ａの相図に示し、そして各々の懸濁液中のリポ
ソームの平均粒径（nm単位）を脂質の重量％およびエタノールの重量％の両方の
関数として図６Ｂにプロットする。

【００２７】 図７Ａ−７Ｂは、部分的に水素化された大豆ホスファチジルコリンおよびコレ
ステロールで調製されたリポソーム懸濁液に対応し、ここでは、各々の懸濁液の
組成を図７Ａの相図に示し、そして各々の懸濁液中のリポソームの平均粒径（nm
単位）を脂質の重量％およびエタノールの重量％の両方の関数として図７Ｂにプ
ロットする。

【００２８】 図８は、３',５'−ジパルミトイル−５−ヨード−２'−デオキシウリジンの合
成に関する合成反応スキームである。

【００２９】 図９は、ＨＳＰＣ、mＰＥＧ−ＤＳＰＥおよびdpＩＵdＲからなるリポソーム脂
質の水和の間のエタノールの重量％の関数としての、リポソームサイズ（nm単位
）のプロットである。

【００３０】 図１０は、エタノール、水中にdpＩＵdＲが含まれるリポソームの形成に関す
る相図であって、好ましい操作領域を示す。

【００３１】 発明の詳細な説明 Ｉ．定義および略語 「ベシクル形成脂質」とは、安定なミセルまたはリポソーム組成物を形成する
ことができるいずれかの脂質をいい、典型的には、１つまたは２つの疎水性アシ
ル炭化水素鎖またはステロイド基が含まれ、アミン、酸、エステル、アルデヒド
またはアルコールといったような化学的反応性基をその極性頭基に含み得る。

【００３２】 「脂質溶媒」とは、ベシクル形成脂質をいずれかの温度で溶解することができ
るいずれかの溶媒をいう。

【００３３】 「第二溶媒」とは、少なくとも幾らかの割合で、脂質溶媒と完全または部分的
に混和性である溶媒をいう。

【００３４】 「dpＩＵdＲ」とは、３',５'−ジパルミトイル−５−ヨード−２'−デオキシ
ウリジンをいう。

【００３５】 「ＤＯＤＡＣ」とは、カチオン性脂質 Ｎ,Ｎ−ジオレオイル−Ｎ,Ｎ−ジメチ
ルアンモニウムクロリドをいう。

【００３６】 「mＰＥＧ−ＤＳＰＥ」とは、メトキシ−ポリエチレングリコール（mＰＥＧ）
で誘導体化されたジステアロイルホスファチジル−エタノールアミン（ＤＳＰＥ
）をいう。mＰＥＧは、５００−２０,０００ダルトンの間、好ましくは１,００
０−５,０００ダルトンの間の分子量を有し得る。

【００３７】 「mＰＥＧ−ＤＳ」とは、mＰＥＧで誘導体化された中性のベシクル形成脂質を
意味する。

【００３８】 II．発明の方法 一態様において、本発明には、リポソームの粒径を調節する、リポソームを調
製する方法が含まれる。別の態様において、その方法は、所望の粒径を有するリ
ポソームを得る方法、および最小粒径を有するリポソーム懸濁液を得る方法を提
供する。此の度、これらの態様を実施例１−８によって記載する。

【００３９】 実施例１は、リポソームの懸濁液の調製を記載し、ここでは、リポソームを形
成する脂質が、５０：２５：１５：１０のモル比での、卵ホスファチジルコリン
（ＥＰＣ）、コレステロール、ＤＯＤＡＣおよびＣ_２０ＰＥＧ−セラミドからな
っていた。脂質をエタノールに溶解した。脂質の混合物からのアリコートを、長
さが３４塩基である２０mg／mLのオリゴヌクレオチドを含む水溶液で水和して、
エタノール濃度が異なる６つのリポソーム懸濁液を作製した。懸濁液の組成を図
１Ａの相図に示すことから分かるように、脂質は、約０.６重量％または約６重
量％のいずれかである。脂質０.６％でのエタノールの重量百分率は、９.５、１
９.３および３９であった。脂質６％でのエタノールの重量百分率は、５.９、１
５.８および３５.５であった。実施例１における表１は、各々のリポソーム懸濁
液の組成を要約する。

【００４０】 各々の懸濁液の平均粒径を水和直後の準弾性光散乱により測定した。その結果
を表１（以下の実施例１を参照されたい。）に報告し、図１Ｂでは、脂質の重量
％およびエタノールの重量％に対してプロットする。図から分かるように、２つ
の脂質レベル（０.６重量％および６重量％）での各々の組成物に関して、リポ
ソーム直径が最小となる脂質溶媒の範囲が存在する。約０.６重量％の脂質、約
１２−３５重量％のエタノールを有するリポソームに関しては、リポソーム粒径
が１００nm未満である。約６重量％の脂質を有するリポソームに関しては、リポ
ソームサイズが６〜３５重量％の間のエタノールで最小となるので、選択された
エタノールの範囲での最小粒径の効果がより明らかである。

【００４１】 実施例２は、本発明の方法のさらなる例を提供し、ここでは、リポソームの粒
径を、水和混合物の組成により、例えば、脂質溶媒および第二溶媒の量により調
節する。この例では、５０：２５：１５：１０のモル比での、部分的に水素化さ
れた大豆ホスファチジルコリン（ＰＨＳＰＣ）、コレステロール、ＤＯＤＡＣお
よびmＰＥＧ−ＤＳからなるリポソームを調製した。脂質をエタノールに溶解し
て、長さが３４塩基であるオリゴヌクレオチドを含む水溶液で水和した。水和混
合物の組成が異なる９つのリポソーム懸濁液を調製して、各々の組成を図２Ａに
相図で示す。

【００４２】 各々の懸濁液中のリポソームの平均粒径を水和直後に測定して、５℃で一晩保
存した後に再び測定した。その結果を以下の表２に示し、図２Ｂでは、水和直後
に測定した直径を、エタノールの重量％および脂質の重量％の関数としてプロッ
トする。図から分かるように、脂質溶媒量とリポソームサイズとの間には強い関
係がある。より具体的には、リポソーム直径が最小となる区間がある。この特定
の脂質混合物に関して、この区間は、エタノールが５−３０重量％の間にある。
リポソームサイズは、エタノールが１２.９重量％で最小となり、エタノール量
が１２.９重量％から増加または減少するにつれて、リポソームサイズが増加し
た。

【００４３】 従って、一態様において、本発明には、実施例２に示す研究を行うことにより
、最小直径を有するリポソームを得る方法が含まれる。すなわち、ベシクル形成
脂質、または脂質の混合物を脂質溶媒で溶媒和し、第二溶媒で水和して、リポソ
ームを形成する。結果として得られる水和混合物中の脂質溶媒の百分率（％）は
様々であって、リポソームサイズを決定する。リポソームサイズの脂質溶媒含量
の関数としてのプロフィルを確立して、リポソーム直径が最小となる水和混合物
の組成を決定する。そのプロフィルを使用して、最小リポソーム直径を特定の脂
質溶媒濃度で決定し、そしてまた、水和組成物中の脂質溶媒含量を決定して、い
ずれかの所望のリポソームサイズを得ることができることが認識されるであろう
。

【００４４】 さらなる研究を本発明に従って行い、その方法に対する脂質組成物の効果を調
べた。実施例３では、荷電したモノアニオン性ＰＥＧ脂質コンジュゲート、mＰ
ＥＧ−ＤＳＰＥを使用して、リポソームを形成した。９つのリポソーム懸濁液を
調製して、各々の組成を図３Ａの相図に示す。各々の懸濁液中の粒径を光散乱に
より測定し、値を以下の表３に報告して、図３Ｂにプロットする。リポソームサ
イズと脂質溶媒含量との間の相関関係は、図３Ｂを見ると容易に明らかであり、
ここでは、エタノール百分率が約１５−３５の間で、リポソーム直径が最小とな
る。

【００４５】 実施例１−３では、リポソーム組成物には、中性ベシクル形成脂質またはアニ
オン性ベシクル形成脂質およびカチオン性ベシクル形成脂質が含まれていた。本
発明での使用に関して、当業者に知られているベシクル形成脂質はいずれも適当
であって、内部と接触する疎水性部分、二重層膜の疎水性領域、および膜の外部
の極性表面に配向する頭基をもつ、リン脂質により例示されるように、水中で二
重層ベシクルを自発的に形成し得る脂質が含まれる。

【００４６】 このタイプのベシクル形成脂質は、２つの炭化水素鎖、典型的には、アシル鎖
、および極性または非極性のいずれかの頭基を有するものであるのが好ましい。
ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、
ホスファチジルイノシトールおよびスフィンゴミエリンといったようなリン脂質
を含め、様々な合成ベシクル形成脂質および天然に存在するベシクル形成脂質が
存在し、ここでは、２つの炭化水素鎖が、典型的には、長さが約１４個−２２個
の間の炭素原子であって、様々な不飽和度を有する。アシル鎖が様々な飽和度を
有する上記の脂質およびリン脂質は、商業的に得るか、または公開されている方
法に従って調製することができる。他の適当な脂質には、糖脂質、セレブロシド
、およびコレステロールのようなステロールが含まれる。

【００４７】 カチオン性脂質もまた、本発明のリポソームでの使用に適当であり、ここでは
、カチオン性脂質が、脂質組成物の微量成分として、または主成分もしくは単独
成分として含まれ得る。そのようなカチオン性脂質は、典型的には、ステロール
、アシルまたはジアシル鎖といったような親油性部分を有し、ここでは、脂質が
全体的に正の実効電荷を有する。好ましくは、脂質の頭基は、正電荷を持つ。例
示的なカチオン性脂質には、Ｎ,Ｎ−ジオレオイル−Ｎ,Ｎ−ジメチルアンモニウ
ムクロリド（ＤＯＤＡＣ）；１,２−ジオレイルオキシ−３−(トリメチルアミノ
)プロパン（ＤＯＴＡＰ）；Ｎ−[１−(２,３−ジテトラデシルオキシ)プロピル]
−Ｎ,Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ
）；Ｎ−[１−(２,３−ジオレイルオキシ)プロピル]−Ｎ,Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒ
ドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ）；Ｎ−[１−(２,３−ジオ
レイルオキシ)プロピル]−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴ
ＭＡ）；３[Ｎ−(Ｎ',Ｎ'−ジメチルアミノエタン)カルバモイル]コレステロー
ル（ＤＣ−Ｃhol）；およびジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）
が含まれる。

【００４８】 カチオン性ベシクル形成脂質はまた、ジオレオイルホスファチジルエタノール
アミン（ＤＯＰＥ）のような中性脂質、またはポリリシンもしくは他のポリアミ
ン脂質といったようなカチオン性脂質で誘導体化されたリン脂質のような両親媒
性脂質であってもよい。例えば、中性脂質（ＤＯＰＥ）をポリリシンで誘導体化
して、カチオン性脂質を形成することができる。

【００４９】 脂質二重層へと安定に組み込まれる他の脂質もまた意図されて、コレステロー
ルのようなステロイドが含まれる。

【００５０】 実施例１−３ではまた、親水性ポリマーで誘導体化されたベシクル形成脂質も
脂質混合物中に含まれていた。例えば、米国特許第５,０１３,５５６号において
記載されているように、そのような誘導体化脂質がリポソーム組成物中に含まれ
ることで、親水性ポリマー鎖の表面コーティングをリポソームの周囲に形成する
。親水性ポリマー鎖の表面コーティングは、そのようなコーティングを欠くリポ
ソームと比較すると、インビボでのリポソームの血液循環寿命を増加させるのに
有効である。上に列挙した脂質のいずれかにコンジュゲートした他の親水性ポリ
マーが適当であって、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリ
メチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサ
ゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポ
リジメチルアクリルアミド、ポリヒドロキシプロピルメタクリレート、ポリヒド
ロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルセルロール、ヒドロキシエチルセ
ルロース、ポリエチレングリコール、ポリアスパルトアミドおよび親水性ペプチ
ド配列が含まれる。米国特許第５,３９５,６１９号および同第５,６３１,０１８
号に記載されているように、ポリマーは、ホモポリマーとして、またはブロック
もしくはランダムコポリマーとして使用し得る。好ましい親水性ポリマー鎖は、
好ましくは５００−１０,０００ダルトンの間、より好ましくは１,０００〜５,
０００ダルトンの間の分子量を有するＰＥＧ鎖としての、ポリエチレングリコー
ル（ＰＥＧ）である。メトキシまたはエトキシでキャップしたＰＥＧのアナログ
もまた、好ましい親水性ポリマーであり、様々なポリマーサイズ、例えば、１２
０〜２０,０００ダルトンで商業的に入手可能である。

【００５１】 親水性ポリマーで誘導体化されたベシクル形成脂質の調製は、例えば、米国特
許第５,３９５,６１９号に記載されている。そのような誘導体化脂質が含まれる
リポソームの調製もまた記載されており、ここでは、典型的には、そのような誘
導体化脂質の１−２０モル％がリポソーム処方に含まれる。

【００５２】 選択されたベシクル形成脂質または脂質混合物を「脂質溶媒」中で溶媒和する
。本明細書中で使用する場合、「脂質溶媒」とは、リポソームの脂質成分がいず
れかの温度で可溶性である有機溶媒をいう。例示的な脂質溶媒には、メタノール
、エタノール、ブタノール等といったようなアルコール、並びにグリセロール、
プロピレングリコールおよびエチレングリコールといったような低分子量ポリオ
ールが含まれる。脂質を所望のモル比で溶媒に加えて、必要に応じて加熱しなが
ら、溶解するまで混合する。次いで、第二溶媒量を脂質溶媒混合物に加えて、水
和混合物を形成する。本明細書中で使用する場合、第二溶媒は、幾らかの割合で
脂質溶媒と混和性であり、好ましくは、結果として得られる水和混合物中の脂質
溶媒と混和性である溶媒をいう。脂質溶媒の重量百分率を約１０−５０重量％の
間で選択されるポイントとするのに、より好ましくは脂質溶媒重量％範囲を１５
〜４５とするのに、最も好ましくは脂質溶媒重量％範囲を２０−４０とするのに
十分な量で、第二溶媒を脂質溶媒混合物に加えて、上記のような所望のサイズを
有するリポソームを得る。

【００５３】 実施例４−８は、カチオン性脂質（ＤＯＤＡＣ）を含まず、そしてポリヌクレ
オチドを含まないリポソーム脂質混合物を使用しての研究をさらに記載する。実
施例４では、ＨＳＰＣ、コレステロールおよびmＰＥＧ−ＤＳＰＥの５０.６：４
４.３：５.１のモル比での脂質混合物を調製した。その混合物を水性溶媒で水和
して、３つの脂質濃度（０.９、３.１および４.７重量％）でのエタノール含量
が異なる９つのリポソーム懸濁液を形成した。その組成を図４Ａの相図に示して
、以下の表４に報告する。リポソームサイズを測定して、図４Ｂでは、脂質およ
びエタノール含量の関数としてプロットする。３つの脂質レベルでは、エタノー
ルが約５−３５重量％の間のエタノール濃度で、リポソームサイズが最小となる
。

【００５４】 実施例５は、親水性ポリマーで誘導体化された脂質が含まれない脂質混合物を
提供する。実施例５では、mＰＥＧ−ＤＳＰＥを除く実施例４の脂質混合物（Ｈ
ＳＰＣ：コレステロールのモル比 ５３.１：４６.９）を使用して、０.９、２.
９および４.３の脂質重量百分率で９つのリポソーム懸濁液を調製した。エタノ
ール含量は、４−３９重量％の間で異なり、調製された各々の懸濁液の組成を図
５Ａの相図に示す。脂質およびエタノール含量の関数としての粒径を図５Ｂに示
すことから分かるように、水和混合物の組成によって、具体的には、脂質溶媒の
含量により、リポソームサイズを調節する本発明の方法は、誘導体化された脂質
の不存在下でも明らかである。前記のように、脂質溶媒が５−３５重量％の間で
は、リポソームサイズが脂質溶媒含量と相関する。

【００５５】 実施例６は、ＨＳＰＣ、コレステロールおよびmＰＥＧ−ＤＳＰＥの６５.４：
３８.３：５.３のモル比での脂質混合物を使用してのリポソーム懸濁液の調製を
記載する。各々の懸濁液の組成を図６Ａの相図に示し、図６Ｂでは、リポソーム
直径を脂質およびエタノール含量の関数としてプロットする。リポソームサイズ
は、水和混合物中のエタノール含量が約５−３５重量％の間である場合に最小と
なる。各々の脂質濃度でのリポソームサイズは、エタノールが約１５−２０重量
％の間で最小となり、エタノール含量がこの範囲から増加または減少するにつれ
て、リポソームサイズが増加する。

【００５６】 実施例７は、mＰＥＧ−ＤＳＰＥを省略したことを除き、実施例６のものと同
様のリポソーム懸濁液（ＨＳＰＣ：Ｃholのモル比 ５９：４１）の調製を記載す
る。図７Ａの相図は、各々の懸濁液の組成を示し、図７Ｂでは、リポソームサイ
ズをプロットし、mＰＥＧ−ＤＳＰＥで得られるものと同様の結果が脂質混合物
において存在する。これらの結果および実施例５の結果は、存在する脂質のタイ
プに関係なく、リポソームサイズに対する調節が提供されることを示す。

【００５７】 本発明の方法を使用して、様々な治療薬を取り込むリポソームを調製すること
ができる。治療薬の性質および使用した溶媒中での溶解度に応じて、治療薬を脂
質および脂質溶媒と、または第二溶媒と混合することができる。意図する薬剤は
、広範囲にわたり様々であって、治療適用および診断適用での使用に関するもの
の両方が含まれる。治療薬には、次の治療活性を有する天然および合成化合物が
含まれる：抗血管形成、抗老化、抗関節炎、抗不整脈、抗菌、抗コリン作用、抗
凝血、抗利尿、解毒、抗てんかん作用、抗真菌、抗炎症、代謝拮抗、抗偏頭痛、
抗腫瘍、駆虫、下熱、抗発作、抗血清、抗痙攣、鎮痛、麻酔、ベータブロック、
生物学的反応の修飾、骨代謝の調節、心血管、利尿、酵素、受精率の向上、成長
促進、止血、ホルモン、ホルモン抑制、高カルシウム血症の軽減、低カルシウム
血症の軽減、低血糖症の軽減、高血糖症の軽減、免疫抑制、免疫増強、筋弛緩、
神経伝達、副交感神経類似作用、交感神経様血漿増量、血漿増量、向精神性、血
栓融解および血管拡張。

【００５８】 好ましい態様において、取り込まれた薬剤は、細胞毒性薬、すなわち、細胞に
対して有害または毒性効果を有する薬剤である。例示的な細胞毒性薬には、ドキ
ソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシンおよびイダルビシンといったような
アントラサイクリン抗生物質、並びにエピルビジンおよびミトザントロンといっ
たような、これらのアナログ；シスプラチンおよびカルボプラチンといったよう
な白金化合物が含まれる。

【００５９】 取り込まれた薬剤はまた、リボ核酸もしくは合成アナログ、ペプチドに誘導体
化されたアナログが含まれるか、または１つ以上の合成的に修飾された塩基もし
く塩基アナログを含むか、またはプラスミドＤＮＡ、合成オリゴヌクレオチドも
しくは他のオリゴアナログが含まれる配列の一部として組み込まれたリガンドを
含む、核酸でもあり得る。

【００６０】 さらに、リポソームには、その近位末端がベシクル形成脂質に結合する、親水
性ポリマー鎖のフリーな遠位末端に共有結合した標的リガンドが含まれ得ること
が認識されるであろう。あるいはまた、親水性ポリマーで誘導体化された脂質を
欠く組成物に関して、標的リガンドは、表面脂質成分に結合することにより、リ
ポソーム外表面に直接結合することができる。選択された親水性ポリマーを選択
された脂質に結合して、選択されたリガンドとの反応のために、ポリマーのフリ
ーな結合していない末端を活性化する技術は、広範囲にわたり様々に存在し、特
に、親水性ポリマーポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が広く研究されている（
Ａllen，Ｔ. Ｍ.ら，Ｂiochemicia et Ｂiophysica Ａcta １２３７：９９−１
０８（１９９５）；Ｚalipsky，Ｓ.，Ｂioconjugate Ｃhem.，４（４）：２９６
−２９９（１９９３）；Ｚalipsky，Ｓ.ら，ＦＥＢＳ Ｌett. ３５３：７１−７
４（１９９４）；Ｚalipsky，Ｓ.ら，Ｂioconjugate Ｃhemistry，７０５−７０
８（１９９５）；Ｚalipsky，Ｓ.，ＳＴＥＡＬＴＨ ＬＩＰＯＳＯＭＥＳ（Ｄ.
ＬasicおよびＦ. Ｍartin編）第９章にて，ＣＲＣ Ｐress，Ｂoca Ｒaton，ＦＬ
（１９９５））。

【００６１】 一般に、ＰＥＧ鎖は、例えば、ＰＣＴ出願第９８／１６２０２号（このＰＣＴ
出願に記載されている内容は、本発明の一部を構成する。）に示されているよう
な、様々なリガンド中に存在する、スルフヒドリル、アミノ基、およびアルデヒ
ドまたはケトン（典型的には、抗体の炭水化物部分の穏やかな酸化から誘導され
る。）とのカップリングに適当な反応性基を含むよう官能化される。そのような
ＰＥＧ−末端反応性基の例には、マレイミド（スルフヒドリル基との反応に関し
て）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）またはＮＨＳ−炭酸エステル（
第一級アミンとの反応に関して）、ヒドラジドまたはヒドラジン（アルデヒドま
たはケトンとの反応に関して）、ヨードアセチル（優先的には、スルヒドリル基
と反応性）およびジチオピリジン（チオール反応性）が含まれる。そのような基
をもつＰＥＧを活性化するための合成反応スキームは、米国特許第５,６３１,０
１８号、同第５,５２７,５２８号、同第５,３９５,６１９号に記載されており、
合成反応手順を記載する関連セクションに記載されている内容は、特に本発明の
一部を構成する。

【００６２】 実施例８は、放射線増感剤 dpＩＵdＲを含むリポソーム組成物の調製を記載す
る。図８に示すように、５−ヨード−２'−デオキシウリジン（本明細書中、Ｉ
ＵdＲと称する）を、ＩＵdＲのリボース糖上の２つの位置にて、炭素数１６の脂
肪酸であるパルミチン酸で誘導体化した。図に示して、実施例８Ａに詳述する反
応スキームでは、溶媒としてのピリジンまたはピリジン／クロロホルム中、ＩＵ
dＲを若干過剰の塩化パルミトイルおよび４−ジメチルピリジン触媒と反応させ
て、３',５'−ジパルミトイル−５−ヨード−２'−デオキシウリジン（本明細書
中、dpＩＵdＲと称する）を得た。

【００６３】 実施例８Ｂに記載するように、脂質 ＨＳＰＣ、mＰＥＧ−ＤＳＰＥおよびdpＩ
ＵdＲを８９：５：６のモル比でエタノールに溶解した。この脂質ストック溶液
を使用して、脂質溶液量を第二溶媒、水性緩衝液で水和することにより、リポソ
ーム懸濁液を調製した。リポソーム懸濁液を８.１、１０.１、１２.２、１４.３
、１６.５、２０.８、２５.３および４４.１の最終エタノール百分率で３回調製
した。各々のサンプル中のリポソームの平均サイズを準弾性光散乱により測定し
て、その結果を表８に示す。

【００６４】 表８

【表１】

【００６５】 表８の最終列を見ると、リポソーム粒径は、１６.５重量％のエタノールで最
小となることが明らかである。このデータを図９にグラフで示し、約１０重量％
で始まり、約２５重量％で終わるリポソームサイズのトラフが明らかである。エ
タノール含量の関数としての脂質サイズの図９でのようなプロフィルを使用して
、特定のリポソームサイズを得るのに必要なエタノール量を決定することができ
る。例えば、脂質−エタノール混合物を水和して、エタノールを１６.５重量％
にすることにより、最小粒径１０６nmを得る。プロフィルに従って、水和して、
エタノールをより多くまたはより少なくすることにより、より大きな粒径を得る
。そのようなプロフィルを確立して、以下でさらに説明するように、最小粒径ま
たは選択された粒径とするための脂質溶媒の目標量を脂質および溶媒のいずれの
混合物に関しても決定する。

【００６６】 図１０は、本発明に従ってのリポソームの形成に関する操作領域を示す相図で
ある。その図では、斜線部分は、脂質溶媒量が約１０−５０重量％の間であり、
脂質が０.１−１５重量％の間である、リポソームの形成に対応する。脂質混合
物および脂質溶媒に応じて、操作領域内でリポソーム粒径が最小となる点を決定
することができる。操作領域中のリポソーム懸濁液は、肉眼では透明であって、
ミクロン以下のサイズのリポソームを含む。操作領域は、脂質、溶媒および薬剤
成分により若干異なることが認識されるであろう。当業者は、実施例８Ｂおよび
表８に示すような実験を容易に行って、リポソームサイズが最小となる脂質溶媒
量を決定することができる。

【００６７】 上記の方法により形成されるリポソームは、水和混合物中の脂質溶媒量に応じ
て、最小粒径となり得る。従って、幾つかの場合には、押出しまたは他の技術に
よってリポソームをさらにサイズ分けする必要がない。幾つかの場合には、リポ
ソームを、例えば、押出しによりさらに加工するのが望ましいこともある。その
調製方法は、高い薬剤：脂質比での脂質誘導体化薬剤のリポソームへの組み込み
に特に有用であり、ここでは、上に論じたように、混合物を押出すことはできな
いので、９０−１５０nmの間の薬学的に有用な粒径を得るのは困難である。本発
明によるリポソームの形成法は、リポソームが第二溶媒での水和により所望の粒
径であるかまたはそれに近いものであり、さらにサイズ加工することが最小限に
おさえられるので、この限界を克服するものである。従って、所望のリポソーム
サイズを得ることができる状態でより多くの脂質誘導体化薬剤量を採用すること
ができる。

【００６８】 本発明のこの特性を実施例８Ｃに記載した実験により説明する。リポソームを
脂質ＨＳＰＣ、mＰＥＧ−ＤＳＰＥおよびdpＩＵdＲを用いて調製し、ここに処方
のモル比は８９／５／６、８５／５／１０、８５／５／１５、７０／５／２５お
よび５５／５／４０であった。dpＩＵdＲを含む脂質をエタノール中に溶解させ
、その後各混合物中のエタノール濃度を１６.５重量％（２０体積％）にするの
に十分な水で水和させた。各リポソーム懸濁液を実施例において記載したように
押し出し、押し出し後に各懸濁液中のリポソームの平均粒径を測定した。結果を
表９に示す。

【００６９】 表９

【表２】 ^＊ 組成物を押し出すことができなかった。

【００７０】 ６、１０および１５モル％のdpＩＵdＲを含むリポソームは本発明の方法に従
って最小粒径をもたらす量の脂質溶媒で脂質混合物を水和させることにより調製
した場合に約１００nmに容易にふりわけられた。とりわけ、リポソームは約１.
５から５の間、より好ましくは２から４の間の薬剤−脂質比で最小粒径に形成さ
れる。本発明の好ましい具体例において、該方法を用いて１５モル％のdpＩＵd
Ｒを有するリポソーム組成物について得られるのと同様に所望の粒径を有するリ
ポソームを約４より大きな薬−脂質比で調製する。

【００７１】 前記の内容から、本発明のさまざまな目的および特徴がどのようなものである
かを理解できる。該方法に従ったリポソームの調製は、懸濁液中の粒子のサイズ
を調節する手段を提供する。より詳細には、リポソームサイズと水和混合物の組
成、すなわち水和混合物中の脂質溶媒量の間には脂質溶媒が約１０重量％より多
く、５０％より少ない場合に相関関係がある。この領域中にリポソームサイズの
最小値が存在する。

【００７２】 III．実施例 後記の実施例は、水和混合物の組成によりリポソーム粒径を調節する方法を説
明する。実施例は本発明の範囲および精神を制限するものではない。

【００７３】 材料：以下の材料を表示した供給源から得た：卵ホスファチジルコリン（Ａvant
i Ｐolar Ｌipids，Ａlabaster，ＡＬ）；部分的に水素化された大豆ホスファチ
ジルコリン（Ｖernon Ｗalden Ｉnc.，Ｇreen Ｖillage，ＮＪ）；コレステロー
ル（Ｓolvay Ｐharmaceutials，Ｔhe Ｎetherlands）；Ｎ,Ｎ−ジオレオイル−
Ｎ,Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）（Ｎorhtern Ｌipids，Ｃ
anada）；ＰＥＧ（ＭＷ２０００）−セラミド複合体（Ｃ_２０ＰＥＧセラミド）
（Ｎothern Ｌipids，Ｃanada）；ヒスチジン（Ｓeltzer Ｃhemicals，Ｃarlsba
d，ＣＡ）；エタノール（Ｑuantum Ｃhemical Ｃo.，Ｔuscola，ＩＬ）。mＰＥ
Ｇ−ＤＳＰＥは文献に記載されたようにして調製した（例えば、Ｚalipsky，Ｓ.
ら，Ｂioconjugate Ｃhem.，４：２９６−２９９（１９９３））。

【００７４】 方法 ＱＵＥＬＳ：準弾性光散乱を、実施例１についてはＣoulter model Ｎ４ＭＤ（
Ｃoulter Ｃorporation，Ｍiami，ＦＬ）を用い、実施例２ないし７については
Ｂrookhaven Ｉnstruments Ｍodel Ｂ１−２００ＳＭ（Ｂrookhaven Ｉnstrumen
ts Ｃorporation，Ｈoltsville，ＮＹ)を用いて行った。

【００７５】 実施例１ １９７５mgの卵ホスファチジルコリン、４８３.８mgのコレステロール、４３
６.９mgのＤＯＤＡＣおよび１３３７.５mgのＣ_２０ＰＥＧを５mLのエタノールと
混合し、溶解するまで約６５〜７０℃まで加熱した。この脂質ストック溶液の組
成は、脂質５１.７重量％、エタノール４８.３重量％であった。全脂質濃度は４
９６ミリモル／mLであった。

【００７６】 約３４塩基を有するオリゴヌクレオチドを１０ミリモルヒスチジン、０.９％
ＮaＣl（pＨ ６.５）中に溶解させて濃度を２０mg／mLとした。

【００７７】 脂質溶液のアリコートをオリゴヌクレオチドストック溶液のアリコートと混合
することによりリポソーム懸濁液を調製した。オリゴヌクレオチドと脂質濃度を
一定に保ちながら混合物のエタノール濃度を変えるために、両ストック溶液を必
要に応じてそれぞれの溶媒で混合する直前に希釈した。６種のリポソーム懸濁液
をストック溶液から調製し、各混合物の組成を図１Ａの相図に示した。

【００７８】 混合後、懸濁液中のリポソームの平均粒径を準弾性光散乱により測定した。結
果を表１に示す。

【００７９】 表１

【表３】

【００８０】 図１Ｂは平均粒径（nm）を脂質の重量百分率およびエタノールの重量百分率の
両方の関数として表したプロットである。

【００８１】 実施例２ １１８３mgの部分的に水素化された大豆ホスファチジルコリン、２９０mgのコ
レステロール、２６２mgのＤＯＤＡＣおよび７９５mgのmＰＥＧ−ＤＳを０.４７
mLのエタノールと混合し、溶解するまで加熱した。この脂質ストック溶液の組成
は、脂質８７.２重量％およびエタノール１２.８重量％であった。

【００８２】 ２０mg／mLの約３４塩基オリゴヌクレオチドを含むストック溶液を、１０ミリ
モルヒスチジン、０.９％ ＮaＣl（pＨ ６.５）水溶液中で調製した。

【００８３】 脂質ストック溶液のアリコート（必要に応じてエタノールで希釈）を水性オリ
ゴヌクレオチド溶液のアリコートで水和し、必要に応じて水性相で希釈し、これ
を用いて図２Ａに示した組成でリポソームの懸濁液を調製した。

【００８４】 各リポソーム懸濁液を、水和直後および５℃で一晩インキュベーションした後
にＱＥＬＳを用いて平均粒径を測定することにより特徴づけた。結果を表２に示
す。

【００８５】 表２

【表４】

【００８６】 図２Ｂは平均粒径（nm）を脂質の重量百分率およびエタノールの重量百分率の
両方の関数として表したプロットである。

【００８７】 実施例３ ３９４mgの部分的に水素化された大豆ホスファチジルコリン、９６.６mgのコ
レステロール、８７.４mgのＤＯＤＡＣおよび２７５mgのmＰＥＧ−ＤＳＰＥを２
.１４７mLのエタノールと混合し、溶解するまで加熱した。この脂質ストック溶
液の組成は、脂質３３.５重量％、エタノール６６.５重量％であった。

【００８８】 ６.７mg／mLの３４塩基オリゴヌクレオチドを含むストック溶液を、１０ミリ
モルヒスチジン、０.９％ ＮaＣl（pＨ ６.５）水溶液中で調製した。

【００８９】 脂質ストック溶液のアリコートを、必要に応じてエタノールで希釈し、水性オ
リゴヌクレオチドストック溶液のアリコートで水和し、必要に応じて水性相で希
釈し、図３Ａに示す組成のリポソームの懸濁液を調製した。

【００９０】 各リポソーム懸濁液を、水和直後にＱＥＬＳを用いて平均粒径を測定すること
により特徴づけた。結果を表３に示す。

【００９１】 表３

【表５】

【００９２】 図３Ｂは、平均粒径（nm）を脂質の重量百分率およびエタノールの重量百分率
の両者の関数として表したプロットである。

【００９３】 実施例４ ５９９.６mgの部分的に水素化された大豆ホスファチジルコリン、２５７.２mg
のコレステロール、および２１４.２ｇのmＰＥＧ−ＤＳＰＥを１mLのエタノール
と混合し、溶解するまで加熱した。この脂質ストック溶液の組成は、エタノール
中全脂質が５７.６重量％であった。

【００９４】 水和用水性相を調製し、１０ミリモルヒスチジン、０.９％ ＮaＣl、pＨ ６.
５水溶液を含んでいた。

【００９５】 脂質ストック溶液のアリコートを必要に応じてエタノールで希釈し、水溶液の
アリコートで水和して、図４Ａに示した組成でリポソームの懸濁液を調製した。
組成物はそれぞれ三重複試験において調製した。

【００９６】 各リポソーム懸濁液を、水和直後にＱＥＬＳを用いて平均粒径を測定すること
により特徴づけた。結果を表４に示す。

【００９７】 表４

【表６】

【００９８】 図４Ｂは平均粒径（nm）を脂質の重量百分率およびエタノールの重量百分率の
両者の関数として表したプロットである。

【００９９】 実施例５ リポソーム脂質混合物についてmＰＥＧ−ＤＳＰＥを省略する以外は実施例５
に記載したようにしてリポソームを調製した。従って、６２９.８mgの部分的に
水素化された大豆ホスファチジルコリンおよび２７２mgのコレステロールを１mL
のエタノールと混合し、溶解するまで加熱した。この脂質ストック溶液の組成は
、エタノール中全脂質が５３.３重量％であった。

【０１００】 脂質ストック溶液のアリコートを、必要に応じてエタノールで希釈し、水溶液
（１０ミリモルヒスチジン、０.９％ ＮaＣl、pＨ ６.５）のアリコートで水和
して、図５Ａに示した組成のリポソームで懸濁液を調製した。組成物のそれぞれ
を三重複試験において調製した。

【０１０１】 各リポソーム懸濁液を、水和直後にＱＥＬＳを用いて平均粒径を測定すること
により特徴づけた。結果を表５に示す。

【０１０２】 表５

【表７】

【０１０３】 図５Ｂは平均粒径（nm）を脂質の重量百分率およびエタノールの重量百分率の
両方の関数として表したプロットである。

【０１０４】 実施例６ ６６８.３mgの部分的に水素化された大豆ホスファチジルコリン、２２２.３mg
のコレステロールおよび２２２.６mgのmＰＥＧ−ＤＳＰＥを１mLのエタノールと
混合し、溶解するまで加熱した。この脂質ストック溶液の組成は、エタノール中
全脂質が５５.５重量％であった。

【０１０５】 水和用水性相を調製し、１０ミリモルヒスチジン、０.９％ ＮaＣl、pＨ ６.
５水溶液を含んでいた。

【０１０６】 脂質ストック溶液のアリコートを、必要に応じてエタノールで希釈し、水溶液
のアリコートで水和し、図６Ａに示す組成のリポソームの懸濁液を調製した。組
成物のそれぞれを三重複試験において調製した。

【０１０７】 各リポソーム懸濁液を、水和直後にＱＥＬＳを用いて平均粒径を測定すること
により特徴づけた。結果を表６に示す。

【０１０８】 表６

【表８】

【０１０９】 図６Ｂは脂質の重量百分率とエタノールの重量百分率の両者の関数として平均
粒径（nm）を表したプロットである。

【０１１０】 実施例７ リポソーム脂質混合物についてmＰＥＧ−ＤＳＰＥを省略する以外は実施例６
に記載したようにしてリポソームを調製した。従って、６２９.８mgの部分的に
水素化された大豆ホスファチジルコリンおよび２７２mgのコレステロールを１mL
のエタノールと混合し、溶解するまで加熱した。この脂質ストック溶液の組成は
、エタノール中全脂質５４.３重量％であった。

【０１１１】 脂質ストック溶液のアリコートを、必要に応じてエタノールで希釈し、水溶液
（１０ミリモルヒスチジン、０.９％ ＮaＣl、pＨ ６.５）のアリコートで水和
して、図７Ａに示した組成でリポソームの懸濁液を調製した。組成物のそれぞれ
を三重複試験において調製した。

【０１１２】 各リポソーム懸濁液を、水和直後にＱＥＬＳを用いて平均粒径を測定すること
により特徴づけた。結果を表７に示す。

【０１１３】 表７

【表９】

【０１１４】 図７Ｂは、脂質重量百分率とエタノール重量百分率の両者の関数として平均粒
径（nm）を表したプロットである。

【０１１５】 実施例８ dpＩＵdＲを含有するリポソーム Ａ．３',５'−ジパルミトイル−５−ヨード−２'−デオキシウリジン（dpＩＵd
Ｒ）の合成 パルミトイルクロリドをデオキシウリジンのピリジン中溶液またはピリジン／
クロロホルム中溶液および触媒として４−ジメチルピリジンにゆっくり添加した
。黄色になるまで溶液を混合し、一晩放置して沈殿させた。混合物をクロロホル
ム中に溶解させ、１０％ 水性クエン酸溶液および飽和炭酸水素ナトリウム溶液
で洗浄した。クロロホルムを除去し、メタノールを添加して、白色沈殿を得、こ
れは３',５'−ジパルミトイル−５−ヨード−２'−デオキシウリジンと同定され
た（収率６６％）。合成反応スキームを図８に示す。

【０１１６】 Ｂ．さまざまなエタノール含量のリポソーム調製 ８９／５／６のモル比の脂質水素化大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）お
よびメトキシ−ポリエチレングリコールで誘導体化されたジステアロイルホスフ
ァチジルコリン（ＤＳＰＥ−mＰＥＧ）およびdpＩＵdＲを７０℃で完全に溶解す
るまでエタノール中で溶解させた（約１時間）。この脂質ストック溶液を、必要
に応じて脂質濃度を一定に維持するために希釈した後、１０％ シュクロース溶
液で７０℃で水和して、エタノール濃度を８重量％から４４重量％まで変化させ
た。リポソーム混合物のそれぞれを１時間撹拌して、リポソーム懸濁液を調製し
た。準弾性光散乱を用いて各混合物のリポソーム粒径を測定し、結果を表８に示
す。

【０１１７】 Ｃ．１６.５重量％ エタノールでのリポソームの調製 ８９／５／６、８５／５／１０、８０／５／１５、７０／５／２５および５５
／５／４０のモル比の脂質水素化大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）および
メトキシ−ポリエチレングリコールで誘導体化されたジステアロイルホスファチ
ジルコリン（ＤＳＰＥ−mＰＥＧ）およびdpＩＵdＲをエタノール中７０℃で完全
に溶解するまで溶解させた（約１時間）。脂質混合物を、水和混合物中エタノー
ル含量を１６.５重量％（２０％（ｖ／ｖ）エタノール）にするのに十分な１０
％ シュクロース溶液で７０℃で水和させた。混合物を押し出す前に１時間撹拌
した。

【０１１８】 ポリカーボネート膜を通してリポソーム懸濁液を押し出して、１００nmの均質
な大きさを得た。懸濁液を次に１０％ シュクロース溶液に対してダイアフィル
トレーションを行い、エタノール濃度を４００ppmより低くした。懸濁液を次に
限外ろ過して、目標薬剤濃度以上にし、薬剤濃度について分析し、１０mＭ ヒス
チジン緩衝液を添加することにより目的物を希釈し、pＨを６.５に調節した。

【０１１９】 リポソーム粒径を準弾性光散乱により測定し、結果を表９に示す。

【０１２０】 本発明を具体例に関して記載したが、本発明から逸脱することなくさまざまな
変更および修正が可能であることは当業者には明らかである。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１Ａ−１Ｂは、卵ホスファチジルコリン、コレステロール、Ｎ
,Ｎ−ジオレオイル−Ｎ,Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）およ
び取り込まれたオリゴヌクレオチドをもつ分子量２０００ダルトンのポリエチレ
ングリコールで誘導体化されたセラミド（Ｃ_２０ＰＥＧ−セラミド）で調製され
たリポソーム懸濁液に対応し、ここでは、各々の懸濁液の組成を図１Ａの相図に
示し、そして各々の懸濁液中のリポソームの平均粒径（nm単位）を脂質の重量％
およびエタノールの重量％の両方の関数として図１Ｂにプロットする。

【図２】 図２Ａ−２Ｂは、部分的に水素化された大豆ホスファチジルコリ
ン、コレステロール、ＤＯＤＡＣおよびmＰＥＧで誘導体化されて、取り込まれ
たオリゴヌクレオチドを含む中性脂質（mＰＥＧ−ＤＳ）で調製されたリポソー
ム懸濁液に対応し、ここでは、各々の懸濁液の組成を図２Ａの相図に示し、そし
て各々の懸濁液中のリポソームの平均粒径（nm単位）を脂質の重量％およびエタ
ノールの重量％の両方の関数として図２Ｂにプロットする。

【図３】 図３Ａ−３Ｂは、部分的に水素化された大豆ホスファチジルコリ
ン、コレステロール、ＤＯＤＡＣおよびメトキシ−ポリエチレングリコールで誘
導体化されて、取り込まれたオリゴヌクレオチドを有するアニオン性脂質（ジス
テアロイルホスファチジル−エタノールアミン、ＤＰＳＥ）（mＰＥＧ−ＤＳＰ
Ｅ）で調製されたリポソーム懸濁液に対応し、ここでは、各々の懸濁液の組成を
図３Ａの相図に示し、そして各々の懸濁液中のリポソームの平均粒径（nm単位）
を脂質の重量％およびエタノールの重量％の両方の関数として図３Ｂにプロット
する。

【図４】 図４Ａ−４Ｂは、部分的に水素化された大豆ホスファチジルコリ
ン、コレステロールおよびmＰＥＧ−ＤＳＰＥで調製されたリポソーム懸濁液に
対応し、ここでは、各々の懸濁液の組成を図４Ａの相図に示し、そして各々の懸
濁液中のリポソームの平均粒径（nm単位）を脂質の重量％およびエタノールの重
量％の両方の関数として図４Ｂにプロットする。

【図５】 図５Ａ−５Ｂは、部分的に水素化された大豆ホスファチジルコリ
ンおよびコレステロールで調製されたリポソーム懸濁液に対応し、ここでは、各
々の懸濁液の組成を図５Ａの相図に示し、そして各々の懸濁液中のリポソームの
平均粒径（nm単位）を脂質の重量％およびエタノールの重量％の両方の関数とし
て図５Ｂにプロットする。

【図６】 図６Ａ−６Ｂは、部分的に水素化された大豆ホスファチジルコリ
ン、コレステロールおよびmＰＥＧ−ＤＳＰＥで調製されたリポソーム懸濁液に
対応し、ここでは、各々の懸濁液の組成を図６Ａの相図に示し、そして各々の懸
濁液中のリポソームの平均粒径（nm単位）を脂質の重量％およびエタノールの重
量％の両方の関数として図６Ｂにプロットする。

【図７】 図７Ａ−７Ｂは、部分的に水素化された大豆ホスファチジルコリ
ンおよびコレステロールで調製されたリポソーム懸濁液に対応し、ここでは、各
々の懸濁液の組成を図７Ａの相図に示し、そして各々の懸濁液中のリポソームの
平均粒径（nm単位）を脂質の重量％およびエタノールの重量％の両方の関数とし
て図７Ｂにプロットする。

【図８】 図８は、３',５'−ジパルミトイル−５−ヨード−２'−デオキシ
ウリジンの合成に関する合成反応スキームである。

【図９】 図９は、ＨＳＰＣ、mＰＥＧ−ＤＳＰＥおよびdpＩＵdＲからなる
リポソーム脂質の水和の間のエタノールの重量％の関数としての、リポソームサ
イズ（nm単位）のプロットである。

【図１０】 図１０は、エタノール、水中にdpＩＵdＲが含まれるリポソー
ムの形成に関する相図であって、好ましい操作領域を示す。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年３月２７日（２００１．３．２７）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００５

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０００５】 小単層ベシクルおよび大単層ベシクル（ＳＵＶおよびＬＵＶ）は、１つの脂質
二重層をもつリポソームであって、多数の技術により調製することができる。Ｓ
ＵＶは、典型的には、２０−５０nmの範囲に直径を有して、脂質の希エタノール
溶液の水相への迅速な注入、いわゆるエタノール注入法により形成することがで
きる。ＳＵＶを形成する別の技術は、多重膜ベシクルの激しい音波処理によるも
のである。大単層ベシクルは、サイズが数百ナノメーターから数ミクロンとなり
得て、典型的には、逆相蒸発法により形成され、ここでは、脂質の油中水型エマ
ルジョン、緩衝液および有機物からの有機溶媒が減圧下に除去される。ＷＯ ９
１／１６０３９は、活性物質を含む水性リポソーム懸濁液の製造方法を記載して
おり、その懸濁液は、最大３個の炭素原子をもつ低級アルコールおよび水相中の
、リポソーム形成物質、またはそのような物質の混合物の溶液から製造される。
活性成分を脂質溶液および／または水相に溶解または懸濁させる。その方法は、
水相をアルコール性溶液中で混合することにより取り込んで、低級アルコールを
減圧蒸留により除去することを特徴とする。必要ならば、リポソーム懸濁液を凍
結乾燥させる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 7/00 Ａ６１Ｋ 7/00 Ｎ 31/7072 31/7072 31/711 31/711 45/00 45/00 47/04 47/04 47/10 47/10 47/18 47/18 47/24 47/24 47/26 47/26 47/28 47/28 47/32 47/32 47/34 47/34 47/38 47/38 47/42 47/42 48/00 48/00 51/00 Ａ６１Ｐ 3/10 Ａ６１Ｐ 3/10 3/14 3/14 5/00 5/00 7/02 7/02 7/04 7/04 7/06 7/06 7/10 7/10 7/12 7/12 9/06 9/06 9/08 9/08 9/10 9/10 9/14 9/14 15/08 15/08 19/02 19/02 19/08 19/08 21/02 21/02 23/00 23/00 25/04 25/04 25/06 25/06 25/08 25/08 25/18 25/18 25/28 25/28 29/00 29/00 31/04 31/04 31/10 31/10 33/00 33/00 33/10 33/10 35/00 35/00 37/04 37/04 37/06 37/06 39/02 39/02 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ａ６１Ｋ 43/00 Ｂ０１Ｊ 13/08 Ｂ０１Ｊ 13/02 Ｆ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ジョージ・ゼット・ジュ アメリカ合衆国95129カリフォルニア州サ ンノゼ、グレン・ヘイブン・コート5647番 Ｆターム(参考） 4C076 AA19 CC01 CC04 CC05 CC06 CC07 CC12 CC14 CC21 CC27 CC30 CC32 CC34 CC35 DD21F DD63F DD69F DD70F EE06F EE06Q EE10F EE10Q EE12F EE12Q EE13F EE13Q EE16F EE16Q EE30F EE30Q EE32F EE32Q EE41F EE41Q FF16 FF34 FF43 4C083 AB051 AB052 AB332 AC101 AC102 AC121 AC582 AC691 AC692 AD041 AD042 AD071 AD091 AD111 AD281 AD391 AD411 AD471 AD491 AD492 AD531 AD571 AD572 AD591 AD601 AD602 AD611 BB06 BB47 BB48 4C084 AA01 AA02 AA03 AA17 BA44 CA62 DA32 MA05 MA24 NA03 NA11 ZA032 ZA042 ZA062 ZA072 ZA082 ZA182 ZA232 ZA292 ZA392 ZA542 ZA832 ZA842 ZB082 ZB092 ZB112 ZB262 ZB322 ZB352 ZB392 ZC032 ZC192 ZC352 ZC372 ZC432 ZC502 4C086 AA01 AA02 EA16 EA17 MA03 MA05 MA24 NA03 NA11 ZA04 ZA06 ZA07 ZA08 ZA18 ZA23 ZA53 ZA54 ZA81 ZA83 ZA84 ZA94 ZB08 ZB09 ZB11 ZB26 ZB32 ZB35 ZB39 ZC03 ZC21 ZC35 ZC37 ZC43 ZC50 4G005 AA07 BA06 BB08 BB09 DB22X DC15W DD24W EA03

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 所望のリポソーム粒径を得る方法であって、脂質溶媒に溶解
   したベシクル形成脂質を第二溶媒で水和して、１０−５０重量％の間の脂質溶媒
   量を含む水和混合物を形成することを含んでなり、該脂質溶媒量が所望の粒径を
   得るよう選択され、そして該脂質溶媒量が水和混合物中の第二溶媒と混和性であ
   る方法。
2. 【請求項２】 脂質溶媒がアルコールである、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 脂質溶媒が、メタノール、エタノールまたはブタノールであ
   る、請求項２に記載の方法。
4. 【請求項４】 ベシクル形成脂質が荷電ベシクル形成脂質である、請求項１
   に記載の方法。
5. 【請求項５】 ベシクル形成脂質が中性ベシクル形成脂質である、請求項１
   に記載の方法。
6. 【請求項６】 該混合にはさらに、親水性ポリマー鎖で誘導体化されたベシ
   クル形成脂質を混合することが含まれる、請求項１に記載の方法。
7. 【請求項７】 親水性ポリマー鎖がポリエチレングリコールである、請求項
   ６に記載の方法。
8. 【請求項８】 第二溶媒が水である、請求項１に記載の方法。
9. 【請求項９】 該水和には、治療薬を第二溶媒で水和することが含まれる、
   請求項１に記載の方法。
10. 【請求項１０】 治療薬が核酸である、請求項９に記載の方法。
11. 【請求項１１】 該水和にはさらに、治療薬を脂質溶媒で水和することが含
    まれる、請求項１に記載の方法。
12. 【請求項１２】 治療薬が１つ以上のアシル鎖で誘導体化された放射線増感
    剤である、請求項１１に記載の方法。
13. 【請求項１３】 放射線増感剤がジパルミトイル ５−ヨード−２−デオキ
    シウリジンである、請求項１２に記載の方法。
14. 【請求項１４】 治療薬がさらに含まれる、請求項１に従って調製されるリ
    ポソーム組成物。
15. 【請求項１５】 脂質溶媒に加えた治療薬がさらに含まれる、請求項１に従
    って調製されるリポソーム組成物。
16. 【請求項１６】 最小粒径を有するリポソームを得る方法であって、 ベシクル形成脂質を脂質溶媒中で混合すること；そして 第二溶媒を加えて、脂質溶媒量を１０重量％超かつ約５０重量％未満とするこ
    と； を含んでなり、該脂質溶媒量が、別の脂質溶媒量で得るよりも小さいリポソーム
    サイズを得るよう選択される方法。
17. 【請求項１７】 リポソーム組成を決定して、選択されたサイズを有するリ
    ポソームを形成する方法であって、 ベシクル形成脂質を脂質溶媒中で混合すること；そして 該脂質を、リポソームの懸濁液を得るために第二溶媒量で水和すること； 懸濁液のリポソーム粒径を測定すること； 水和および測定工程を繰り返して、リポソーム粒径のプロフィルを第二溶媒量
    の関数として得ること；そして プロフィルに基づいて、選択されたリポソーム粒径とするのに必要な第二溶媒
    量を選択すること； を含んでなる方法。