CN1198589C - 控制脂质体大小的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了一种制备所需大小脂质体颗粒的方法。该方法中，将成微泡脂质溶于某种溶脂溶剂，用第二种溶剂将其水合成含10-50重量%溶脂溶剂的水合混合物。通过选择溶脂溶剂中的目标溶脂溶剂量来获得所需的颗粒大小。

Description

控制脂质体大小的方法
发明领域
本发明涉及一种制备脂质体组合物的方法，由此可控制所得脂质体的大小。本发明还涉及用所述方法制得的组合物。
发明背景
脂质体是一种球形含水颗粒，至少包有一层全闭合的脂质双层，其粒径通常约70-1000nm。在最近十年中，脂质体已成为重要的药物和化妆品载体。根据这些试剂的亲水性，它们被包含在含水区室内或结合在脂质体的脂质双层中。
脂质体的制备方法是已知技术。多层微泡(即具有一层以上脂质双层的脂质体)的最简便的制备方法是通过减压旋转蒸发将成微泡脂质从有机溶剂中沉积到烧瓶壁上形成一层薄膜。加入水性缓冲液，进行脂质的水合，水合的温度高于脂质或混合脂质中晶体熔点最高组分的晶体熔点。在加入水性缓冲液的同时进行搅拌，例如搅动，超声处理，涡流搅拌，从而获得脂质体悬浮液。
脂质体形成后，对脂质体的大小进行处理，以获得较小且/或大小分布较均匀的颗粒。制定大小的常用方法之一是通过一系列选定大小的过滤器挤出脂质体悬浮液。也可用超声处理悬浮液，使脂质体碎裂成较小的颗粒，由此制定脂质体的大小。
大小单层微泡(LUV和SUV)是只有一层脂质双层的脂质体，可用许多方法来制备。SUV的粒径通常在20-50nm，可通过将脂质的乙醇稀溶液迅速注入水相来制备，这又称乙醇注射法。制备SUV的另一种方法是对多层微泡进行剧烈超声处理。较大的多层微泡的大小可能为几百纳米至数微米，通常用反相蒸发法制备，该方法中，由有机溶剂形成油包水脂质乳液，然后减压蒸发去除缓冲液和有机溶剂。
WO91/16039描述了一种制备含活性物质的含水脂质体悬浮液的方法，所述悬浮液是由成脂质体物质或此类物质的混合物在3碳以下低级醇和水相中所成的溶液制备的。活性成分溶解或悬浮在脂类溶液和/或水相中。该方法的特征在于通过混合在醇溶液中引入了水相，然后真空去除低级醇。然后根据需要将脂质体悬浮液冷冻干燥。
发明概述
本发明目的之一是提供一种制备所需粒径脂质体的方法。
本发明的目的还在于提供一种制备所需大小脂质体的方法。
本发明的目的还在于提供一种通过选择水合组合物的组成来控制脂质体大小的方法。
内容之一，本发明包括一种获得所需大小脂质体颗粒的方法。该方法包括用第二溶剂水合溶于溶脂溶剂中的成微泡脂质，形成含10-50重量％溶脂溶剂的水合混合物。溶脂溶剂的量根据所需颗粒大小来选择，水合混合物中该量的溶脂溶剂与所述第二溶剂可溶混。
实施例之一中，所述溶脂溶剂是醇，例如甲醇，乙醇和丁醇。
实施例之一中，所述成微泡脂质是带电的成微泡脂质，例如阳离子脂质DODAC和阴离子脂质DSPE。另一实施例中，成微泡脂质是中性的。
实施例之一中，水合还包括水合以亲水性聚合物链，例如聚乙二醇衍生的成微泡脂质。
优选实施例之一中，本发明方法中的第二溶剂以水为佳。
另一实施例中，水合包括用第二溶剂水合一种药物。水合还可以包括用溶脂溶剂水合药物。
在一优选实施例中，所述药物是以一条以上酰基链衍生的放射致敏剂。优选的放射致敏剂是二棕榈酰5-碘-2-脱氧尿苷。
一实施例中，所述药物是核酸。
本发明的内容还包括按以上方法制得的脂质体组合物，其中还包含药物。
本发明还包括获得最小粒径脂质体的方法：将成微泡脂质溶于溶脂溶剂；加入第二溶剂使得溶脂溶剂含量为10-50重量％，所述溶脂溶剂量的选择应使所得脂质体小于用类似配方但溶脂溶剂含量在所述范围之外的所得。
本发明还包括一种确定脂质体组合物组成从而获得选定大小脂质体的方法。该方法包括将成微泡脂质溶于溶脂溶剂；用一定量第二溶剂水合该脂质，形成脂质体悬浮液。测量悬浮液中脂质体的粒径，重复水合和测量步骤，得出脂质体粒径与溶脂溶剂量之间的关系曲线。根据这一关系曲线选择获得选定脂质体粒径所需的溶脂溶剂量。
以下是对本发明的详细描述，结合附图，将对本发明的以上及其他目的和特征有更全面的理解。
                                 附图简述
图1A-B是用鸡蛋卵磷脂，胆固醇，氯化N，N-二油酰基-N，N-二甲基铵(DODAC)和分子量2000Da聚乙二醇衍生的神经酰胺(C20PEG-神经酰胺)制备的脂质体悬浮液，并含包被寡核苷酸，各悬浮液的组成显示在相图1A，各悬浮液内脂质体的平均粒径(nm)显示在图1B中，表现为脂质重量％和乙醇重量％两者的函数关系。
图2A-B是用部分氢化的大豆卵磷脂，胆固醇，DODAC和mPEG衍生的中性脂质(mPEG-DS)制备的脂质体悬浮液，并含包被寡核苷酸，各悬浮液的组成显示在相图2A，各悬浮液内脂质体的平均粒径(nm)显示在图2B中，表现为脂质重量％和乙醇重量％两者的函数。
图3A-B是用部分氢化的大豆卵磷脂，胆固醇烯，DODAC和甲氧基-聚乙二醇衍生的阴离子脂质(二硬脂酰基磷脂酰-乙醇胺，DPSE)(mPEG-DPSE)制备的脂质体悬浮液，并含包被寡核苷酸，各悬浮液的组成显示在相图3A，各悬浮液内脂质体的平均粒径(nm)显示在图3B中，表现为脂质重量％和乙醇重量％两者的函数。
图4A-B是用部分氢化的大豆卵磷脂，胆固醇和mPEG-DPSE制备的脂质体悬浮液，各悬浮液的组成显示在相图4A，各悬浮液内脂质体的平均粒径(nm)显示在图4B中，表现为脂质重量％和乙醇重量％两者的函数。
图5A-B是用部分氢化的大豆卵磷脂和胆固醇制备的脂质体悬浮液，各悬浮液的组成显示在图5A，各悬浮液内脂质体的平均粒径(nm)显示在图5B中，表现为脂质重量％和乙醇重量％两者的函数。
图6A-B是用部分氢化的大豆卵磷脂，胆固醇和mPEG-DPSE制备的脂质体悬浮液，各悬浮液的组成显示在图6A，各悬浮液内脂质体的平均粒径(nm)显示在图6B中，表现为脂质重量％和乙醇重量％两者的函数。
图7A-B是用部分氢化的大豆卵磷脂和胆固醇制备的脂质体悬浮液，各悬浮液的组成显示在图7A，各悬浮液内脂质体的平均粒径(nm)显示在图7B中，表现为脂质重量％和乙醇重量％两者的函数。
图8是3′，5′-二棕榈酰基-5-碘-2′-脱氧尿苷的合成方案图。
图9是脂质体大小(nm)与HSPC、mPEG-DPSE和dpIUdR所构成的脂质体脂质水合过程中乙醇重量百分比的关系图。
图10是脂质体形成的相图，含有溶于乙醇的dpIUdR，水，并显示优选操作区。
                             详细描述
I. 定义与缩写
“成微泡脂质体”指各种可构成稳定的胶束或脂质体组合物的组分的脂质，一般具有1-2条疏水性酰基烃基链或甾体基团，其极性头部可含有诸如胺、酸、酯、醛或醇等化学反应性基团。
“溶脂溶剂”指在各温度可溶解成微泡脂质的各种溶剂。
“第二溶剂”指至少可按一定比例与溶脂溶剂完全或部分溶混的溶剂。
“dpIUdR”即3′，5′-二棕榈酰基-5-碘-2′-脱氧尿苷。
“DODAC”即氯化N，N-二油酰基-N，N-二甲基铵阳离子脂质。
“mPEG-DPSE”即甲氧基-聚乙二醇衍生的二硬脂酰基磷脂酰-乙醇胺(DPSE)(mPEG-DPSE)。mPEG的分子量在500-20,000Da，以1,000-5,000为佳。
“mPEG-DS”mPEG衍生的中性成微泡脂质。
II. 本发明方法
本发明包括一种制备脂质体的方法，可控制脂质体的大小。另一方面，本发明提供一种获得所需大小脂质体颗粒的方法，和制备含颗粒粒径最小脂质体的悬浮液的方法。以下通过实施例1-8对此进行描述。
实施例1描述了一种脂质体悬浮液的制备，其中，形成脂质体的脂质是鸡蛋卵磷脂(EPC)，胆固醇，DODAC和C20PEG-神经酰胺的50∶25∶15∶10摩尔比混合物。将这些脂质溶于乙醇。取各等份的所述脂质，用含20mg/ml 34碱基寡核苷酸的水溶液进行水合，形成6份不同乙醇浓度的脂质体悬浮液。这些悬浮液的组成表述在相图1A中，显示的是含约0.6重量％脂质或约6重量％脂质的组成。含0.6％脂质时，乙醇的重量％是9.5，19.3和39。含6％脂质时乙醇的重量％是5.9，15.8和35.5。实施例1中的表1概括了各脂质体悬浮液的组成。
水合后立即用准弹性光散射法测定各悬浮液中的平均粒径。结果见表1(实施例1)，并在图1B中绘制成与脂质和乙醇重量百分比的关系。从图中可见，对于两种脂质水平(0.6wt％和6wt％)时的组成，都有一个溶脂溶剂范围，在该范围内脂质体的粒径被最小化。对含0.6wt％脂质的，约12-35wt％乙醇脂质体来说，脂质体颗粒的粒径小于100nm。对于含6wt％脂质的脂质体来说，选定乙醇范围内粒径最小的现象更显著，因为，6-35wt％乙醇时的脂质体最小。
实施例2是本发明方法的另一个实施例，其中，脂质体的颗粒大小通过水合混合物的组成，即溶脂溶剂和第二溶剂的量来控制。该实施例制备了由部分氢化大豆卵磷脂(PHSPC)、胆固醇、DODAC和mPEG-DS按50∶25∶15∶10摩尔比组成的脂质体。将这些脂质溶于乙醇，用含34碱基寡核苷酸的水溶液水合。制备了9份不同水合混合物组成的脂质体悬浮液，每一份都表示在图2A中。
在水合后和在5℃放置过夜后两次测量各悬浮液中脂质体的平均粒径。结果记录在表2中，并将水合后立即测定的直径表示在图2B中，表现为乙醇和脂质重量百分比的函数。如图所示，溶脂溶剂量和脂质体大小之间存在着明显的关联性。更具体地说，存在着一个脂质体粒径最小的区间。该特定混合脂质的该区间为5-30wt％乙醇。12.9wt％乙醇时，脂质体最小，并随着乙醇从12.9％起的增加和减少而增大。
因此，本发明包括一种通过进行实施例2所述的试验获得最小脂质体的方法。即，将一种成微泡脂质或混合脂质用溶脂溶剂溶剂化，用第二溶剂水合形成脂质体。改变所成水合混合物中溶脂溶剂的量，并测量脂质体的大小。确立脂质体大小与溶脂溶剂含量之间的关系曲线，从而确定可得到最小粒径的水合混合物组成。可看出，该曲线可用于测定特定溶脂溶剂浓度下的最小脂质体粒径，也可用于测定为获得所需粒径所需的水合组合物中的溶脂溶剂含量。
为了检验脂质组成对于本发明的影响，还进行了支持本发明的其他研究。在实施例3中，脂质体由带电的一价阴离子PEG脂质偶联物mPEG-DSPE形成。制备了9份脂质体悬浮液，各自的组成如图3A所示。用光散射法测定各悬浮液中颗粒的大小，该值记录于表3，绘制于图3B。如图3B所示，脂质体大小与溶脂溶剂含量间的关系显而易见，当乙醇含量为15-35wt％时，脂质体粒径最小。
实施例1-3中，脂质体组合物包含中性或阴离子性和阳离子性成微泡脂质。就本发明用途而言，各种已知的成微泡脂质都适合，并包括在水中会自动形成双层微泡的那些，例如磷脂，所述双层中，疏水性基团与双层膜的内部疏水区接触，头部朝向膜的外部极性表面。
此类成微泡脂质宜具有两条烃链(通常指酰基链)，和一个极性或非极性的头部。合成的和天然的成微泡脂质有许多，包括磷脂类，例如卵磷脂，磷脂酰乙醇胺，磷脂酸，磷脂酰肌醇和神经鞘磷脂，其中，两条烃链一般长14-22个碳原子，并具有不同的饱和度。以上具有不同饱和度的酰基链的脂质和磷脂可购买或按已知方法制备得到。其他合适的脂质包括糖脂，脑苷脂类和甾醇类，例如胆固醇。
阳离子性脂质也可用于本发明的脂质体，其中，可将阳离子脂质用作脂质组合物的低含量组分，或作为主要或唯一组分。此类阳离子脂质通常具有一个亲脂性部分，例如甾醇、酰基或二酰基链，整个脂质的净电荷为正。较好的是，脂质的头基带有正电荷。阳离子脂质例如：氯化N，N-二油酰基-N，N-二甲基铵(DODAC)；1，2-二油酰基氧基-3-(三甲基氨基)丙烷(DOTAP)；溴化N-[1-(2，3-二(十四酰基氧基))丙基]-N，N-二甲基-N-羟基乙基铵(DMRIE)；溴化N-[1-(2，3-二油酰基氧基)丙基]-N，N-二甲基-N-羟基乙基铵(DORIE)；氯化N-[1-(2，3-二油酰基氧基)丙基]-N，N，N-三甲基铵(DOTMA)；3[N-(N′，N′-二甲基氨基乙烷)氨基甲酰基胆固醇(DC-Chol)；和二甲基二(十八基)铵(DDAB)。
阳离子成微泡脂质也可以是以阳离子脂质，例如聚赖氨酸或其他聚胺类脂质等阳离子脂质衍生的中性(例如二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE))或两性脂质，例如磷脂。例如，中性脂质(DOPE)可经聚赖氨酸衍生而形成阳离子脂质。
还可以使用可稳定包含在脂质双层中的其他脂质，包括甾体，例如胆固醇。
此外，在实施例1-3中，还将亲水性聚合物衍生的脂质包含在混合脂质中。如前所述，美国专利5,013,556的脂质体组合物中有这样一种衍生脂质，它在脂质体的外表形成一层亲水性聚合物链表面包衣。与无此包衣的脂质体相比，这样的亲水性聚合物链表面包衣可有效延长脂质体在体内血液循环中的寿命。其他各种可与上述脂质偶联的亲水性聚合物都适合，包括：聚乙烯吡咯烷酮，聚乙烯甲基醚，聚甲基噁唑啉，聚乙基噁唑啉，聚羟基丙基噁唑啉，聚羟基丙基甲基丙烯酰胺，聚甲基丙烯酰胺，聚二甲基丙烯酰胺，聚羟基丙基甲基丙烯酸酯，聚羟基乙基丙烯酸酯，羟甲基纤维素，羟乙基纤维素，聚乙二醇，聚天冬酰胺和亲水性肽序列。所用的聚合物可以是均聚物，或是嵌段或随机共聚物，参见美国专利5,395,619和5,631,018。优选的亲水性聚合物链是聚乙二醇(PEG)，尤其是分子量500-10,000Da的PEG，1,000-5,000Da的更好。甲氧基或乙氧基封端的PEG类似物也是优选的亲水性聚合物，有多种大小的聚合物可购，例如120-20,000Da。
亲水性聚合物衍生的成微泡脂质的制备方法是已知的，例如参见美国专利5,395,619。制备含此类衍生脂质的脂质体的方法也是已知的，通常，脂质体配方中含1-20mole％的此类衍生脂质。
用“溶脂溶剂”将选定的成微泡脂质或混合脂质溶剂化。“溶脂溶剂”在此指可在各种温度溶解脂质体内脂类组分的有机溶剂。例如醇类，如甲醇，乙醇和丁醇等，低分子量多元醇，如甘油，丙二醇和乙二醇。按所需的摩尔比加入脂质，然后混合至其溶解，必要时可加热。然后向该脂质溶剂混合物中加入一定量的第二溶剂，形成水合混合物。第二溶剂在此指在水合混合物中可按一定比例与溶脂溶剂溶混(更好的是完全溶混)的溶剂。第二溶剂的加量需足以使得溶脂溶剂的重量百分比达到10-50wt％之内的选定点，15-45wt％之间更好，20-40wt％最好，从而获得前述具有所需大小的脂质体。
实施例4-8描述了用不含阳离子脂质(DODAC)和聚核苷酸的脂质体脂质混合物进行的其他试验。实施例4制备了HSPC、胆固醇和mPEG-DSPE的50.6∶44.3∶5.1摩尔比混合脂质。用含水溶剂水合该混合物，得到9份3种脂质浓度(0.9，3.1和4.7wt％)的不同乙醇含量的脂质体悬浮液。这些悬浮液显示于相图4A，记录于表4。测量脂质体的大小，绘制在图4B中，表现为脂质和乙醇含量的函数。在这3种脂质水平，当乙醇含量为5-35wt％时，脂质体最小。
实施例5提供了一种不包括亲水性聚合物衍生脂质的混合脂质。实施例5中，用不含mPEG-DSPE的实施例4混合脂质(HSPC∶胆固醇53.1∶46.9摩尔比)制备脂质含量为0.9，2.9和4.3wt％的9份脂质体悬浮液。在4-39wt％之间改变乙醇含量，各悬浮液的组成显示在图5A中。如图5B所示，颗粒大小是脂质和乙醇含量的函数，而且，即使没有衍生脂质，本发明方法也显然可通过水合混合物的组成，尤其是溶脂溶剂量来控制脂质体的大小。如前所述，在溶脂溶剂5-35wt％的范围内，脂质体的大小与溶脂溶剂含量相关。
实施例6描述用HSPC、胆固醇和mPEG-DSPE按65.4∶38.3∶5.3摩尔比的混合脂质制备脂质体悬浮液。各悬浮液的组成显示在相图6A中，脂质体粒径绘于图6B，是脂质和乙醇含量的函数。当水合混合物中的乙醇含量为5-35wt％之间时，脂质体最小。对于各种脂质浓度，乙醇含量约15-20wt％时，脂质体最小，当乙醇含量超出此范围时，脂质体变大。
实施例7描述不含mPEG-DSPE(HSPC∶胆固醇的摩尔比为59∶41)的实施例6脂质体悬浮液。相图7A显示各悬浮液的组成，图7B显示脂质体大小，结果与混合脂质中含mPEG-DSPE时的相近。以上结果和实施例5的结果显示，对脂质体大小的控制与所含脂质的种类无关。
本发明方法可用于制备包裹多种药物的脂质体。可将所示的药物与脂质及溶脂溶剂混合，或与第二溶剂混合，这取决于药物的性质和在所用溶剂中的溶解性。可用的药物很多，包括治疗和诊断用的。治疗性药物包括具有以下疗效的天然及合成化合物：抗血管生成，抗衰老，抗关节炎，抗心律失常，抗菌，抗胆碱能，抗凝血，制尿，解毒，抗癫痫，抗真菌，消炎，抗代谢，抗偏头痛，抗瘤形成，抗寄生虫，退热，抗癫痫发作，抗血清，镇痉，镇痛，麻醉，β-阻滞，改变生物应答，调解骨代谢，心血管作用，利尿，酶，增强生育能力，促进发育，维持机体平衡，激素，激索抑制，缓解高钙血症，缓解缺钙，缓解低血糖，缓解高血糖，免疫抑制，免疫增强，肌肉松弛，神经传导，拟副交感神经，拟交感神经，原生质延伸，原生质扩增，影响神经，溶血栓，和扩展血管。
在优选实施例中，包裹的药物是细胞毒性药物，即，对细胞具有毒害作用的药物。例如炭疽菌素(anthracyeline)抗生素，例如阿霉素，柔红霉素，表柔比星和伊达比星，及其类似物，例如表柔比定和米托蒽醌；钯化合物，例如顺铂和卡铂。
所包裹的药物还可以是核酸，包括核糖核酸或合成的类似物，衍生成肽的类似物或含有一个或多个人工修饰碱基或碱基类似物，或内结合在例如质粒DNA内的合成寡核苷酸或其他寡聚类似物。
还可以看出，可在根部与成微泡脂质体相连的亲水性聚合物链的游离末端共价连接一个制导配体。或者，对于没有亲水性聚合物衍生脂质的组合物来说，可通过将制导配体与表面脂类组分连接而直接连在脂质体的外表面。有多种技术可用来将选定的亲水性聚合物与选定的脂质相连，并激活其游离的非连接末端，与选定的配体反应，研究最多的是亲水性的聚乙二醇(PEG)(Allen，T.M.等，生物化学与生物物理学学报 1237：99-108(1995)；Zalipsky，S.，生物偶联物化学，4(4)：296-299(1993)；Zalipsky，S.等，隐含脂质体(D.Lasic & F.Martin，编)第9章，CRCPress，Boca Raton，FL(1995))。
通常，将PEG链官能化，使之适合与许多配体中的反应性基团偶联，这些基团例如：巯基，氨基和醛基及酮基(通过对抗体的糖基部分温和氧化而得)，参见PCT申请98/16202。此类PEG末端的反应性基团包括顺丁烯二酰亚胺(用于与巯基反应)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或NHS-碳酸酯(用于与伯胺反应)，酰肼或肼(用于与醛或酮反应)，碘代乙酰基(适合与巯基反应)和二硫代吡啶(硫醇反应性)。用于活化带这些基团的PEG的合成反应方案可参见美国专利5,631,018，5,527,528，5,395,619，本文引述了其中有关合成反应的相关部分。
实施例8描述含放射致敏剂dpIUdR的脂质体组合物的制备。如图8所示，用16碳的脂肪酸棕榈酸在5-碘-2′-脱氧尿苷(在此称为IUdR)核糖上的两个位点进行衍生。在如图所示，如实施例8A所述的反应过程中，以吡啶或吡啶/氯仿为溶剂，IUdR与略为过量的棕榈酰氯和4-二甲基吡啶催化剂反应，得3′，5′-二棕榈酰基-5-碘-2′-脱氧尿苷，又称dpIUdR。
如实施例8B所述，将脂质HSPC，mPEG-DSPE和dpIUdR按89∶5∶6的摩尔比溶于乙醇。用该脂质储备液制备脂质体悬浮液，即用第二溶剂即缓冲水溶液水合一定量的脂质溶液。脂质体悬浮液中的乙醇最终含量分别为8.1，10.1，12.2，14.3，16.5，20.8，25.3和44.1wt％，一式三份。用准弹性光散射法测量各样品内脂质体的大小，结果记录于表8。
                                    表8
样品号                        该乙醇重量百分比时的脂质体大小(nm)
  8.1   10.1   12.2   14.3   16.5   20.8   25.3   44.1
  1   51200   1410   226   197   84   53700   1000000   12500
  2   71   46   78   119   149   27300   11000   10500
  3   405   78   157   1360   84   11400   21400   12500
  平均值   17225   511   154   559   106   30800   344133   11833
根据表8的最后一行，显然，在含16.5wt％乙醇时，脂质体的粒径最小。以上数据以图形的方式反映在图9中，其中脂质体大小的凹形线从10wt％乙醇开始，25wt％结束。如图9所示的此类脂质体大小与乙醇含量关系图可用来确定为获得特定脂质体大小所需的乙醇量。例如，将脂质-乙醇混合物水合至含16.5wt％乙醇时，所得粒径最小，为106nm。根据曲线，水合后乙醇含量高于或低于该值，则所得的粒径就略大。如后文所述，确立的这样的曲线，就可对各种脂质-溶剂混合物确定获得最小或选定粒径所需的溶脂溶剂量。
图10相图显示按本发明方法形成脂质体的操作区。该图中，阴影区即脂质体形成区，其中溶脂溶剂的量约为10-50wt％，脂质的量约为0.1-15wt％。根据脂质混合物和溶脂溶剂，可确定该区内哪一点时所得脂质体颗粒最小。操作区内的脂质体悬浮液外观澄清，含亚微米粒径的脂质体。可以看出，操作区会根据脂质，溶剂和药物组分而略有不同。本领域熟练技术人员不难按照实施例8A和表8进行类似试验，从而确定获得最小脂质体所需的溶脂溶剂量。
根据水合混合物中的溶脂溶剂量，用以上方法制备的脂质可以是最小粒径的。因此，在某些场合，就不必再通过挤出或其他技术筛选脂质体的大小。有时可能需要通过挤出法对脂质体进一步加工。以上制备方法尤其适合将脂质-衍生的药物包含在脂质体内，形成较高的药物/脂质比，而因为不能进行混合物的挤出，要获得90-150nm的药物粒径曾是十分困难的。按照本发明方法制备脂质体就可克服这一极限，因为，在用第二溶剂水合后，脂质体就已达到或接近所需的粒径，无需任何进一步加工。因此，在实施高脂质-衍生药物加载量的同时仍可获得所需的粒径。
本发明的这一特征表现在实施例8C中。用脂质HSPC，mPEG-DSPE和dpIUdR制备脂质体，各制剂的摩尔比是89/5/6，85/5/10，80/5/15，70/5/25和55/5/40。将这些脂质，包括dpIUdR，溶于乙醇，然后用足量的水水合，使得各混合物中的乙醇含量为16.5wt％(20体积％)。然后如实施例所述进行脂质体悬浮液挤出，然后测量各悬浮液中脂质体的平均粒径。结果见表9。
                                     表9
    dpIUdR摩尔％ DpIUdR浓度(mg/ml)     药物/脂质比     脂质体大小(nm)
    6     1.25     1.67     99
    10     2.32     3.17     95
    15     4.09     4.65     103
    25     6.90     8.91     142
    40     -     -     -*
按本发明方法，将脂质混合物水合成含最小粒径所需量的溶脂溶剂，如此可方便地将含6，10和15摩尔％dpIUdR的脂质体制备成约100nm大小。重要的是，制成的脂质体具有最小的粒径，药物-脂质之比约为1.5-5，2-4更好。在本发明优选实施例之一中，用该方法制备的脂质体具有所需的粒径和4以上的药物-脂质比，达到用含15摩尔％dpIUdR的脂质体组合物所得的结果。
综上所述，可看出本发明的各项特征如何实现了各项目标。本发明的脂质体制备方法提供了一种控制悬浮液中颗粒大小的方法。更具体地说，当水合混合物之内的溶脂溶剂在10-50wt％之间时，脂质体大小与水合混合物的组成相关。在该区域，存在着一个最小脂质体粒径。
III. 实施例
以下实施例说明利用水合混合物组成来控制脂质体粒径的方法。这些实施例不是为了限定本发明的范围和精神。
材料：
以下为所列物质的来源：鸡蛋卵磷脂(Avanti Polar Lipids，Alabaster，AL)；部分氢化的大豆卵磷脂(Vernon Walden Inc.，Green Village，NJ)；胆固醇(SolvayPharmaceuticals，The Netherlands)；氯化N，N-二油酰基-N，N-二甲基铵(DODAC)(Northern Lipids，Canada)；PEG(MW2000)-神经酰胺共轭物(C20PEG神经酰胺)(Northern Lipids，Canada)，组胺(Seltzer Chemicals，Carlsbad，CA)；乙醇(Quantum Chemical Co.Tuscola，IL)；mPEG-DSPE：按照现有技术制备(例如，Zalipsky，S.等，生物偶联物化学，4：296-299(1993))。
方法：
QUELS：在实施例1用Coulter N4MD型(Coulter Corporation，Miami，FL)进行准弹性光散射，实施例2-7用Brookhaven Instruments B1-200SM型(BrookhavenInstruments Corporation，Holtsville，NY)。
                             实施例1
将1975mg鸡蛋卵磷脂，483.8mg胆固醇，436.9mg DODAC和1337.5mgC20PEG神经酰胺与5ml乙醇混合，加热至约65-70℃，直至溶解。该脂质储备液含51.7wt％脂质，48.3wt％乙醇。总脂质浓度为496mmoles/ml。
将一段约34碱基的寡核苷酸溶于10mmole组胺，0.9％NaCl(pH6.5)，至20mg/ml。
将脂质溶液的各等份与寡核苷酸储备液的各等份混合，制成脂质体悬浮液。在混合前，两储备液分别用各自的溶剂进行必要的稀释，从而改变混合物中乙醇的浓度，同时保持寡核苷酸和脂质浓度恒定。由储备液形成6份脂质体悬浮液，各混合物的组成如图1A所示。
混合后，通过准弹性光散射法测量悬浮液中脂质体的平均粒径。结果见表1。
                           表1
    混合后的脂质wt％     混合后的乙醇wt％     平均粒径(nm)90°/30°散射
    4.6     35.5     628/681
    5.0     15.8     322/357
    5.9     5.9     932/767
    0.46     39.0     183/381
    0.50     19.3     87/161
    0.59     9.5     136/243
图1B显示，平均粒径(nm)是脂质wt％和乙醇wt％两者的函数。
                             实施例2
将1183mg部分氢化的大豆卵磷脂，290mg胆固醇，262mgDODAC和795mgmPEG-DS与0.47ml乙醇混合，加热至溶解。该脂质储备液含87.2wt％脂质和12.8wt％乙醇。
在10mmol组胺，0.9％NaCl(pH6.5)水溶液中制备含20mg/ml 34碱基寡核苷酸的储备液。
各等份脂质储备液用乙醇适当稀释，与以水相适当稀释的寡核苷酸水溶液等份水合，制备成组成如图2A所示的脂质体悬浮液。
在水合后和在5℃放置过夜后通过QELS测量各份脂质体悬浮液中的平均粒径。结果见表2。
                                        表2
  样品   水合后EtOH(wt％)  水合后脂质(wt％) 水合后寡核苷酸(wt％)   混合后的平均粒径90°/30°散射 5℃放置过夜后的平均粒径90°/30°散射
    1   32.6     7.2     1     425/534     1037/660
    2   28.7     7.2     1     200/258     275/421
    3   24.7     7.2     1     101/173     154/202
    4   20.8     7.2     1     84/167     100/165
    5   16.9     7.2     1     72/145     72/123
    6   12.9     7.2     1     66/129     67/127
    7   9.0     7.2     1     104/317     105/360
    8   7.0     7.2     1     172/406     177/430
    9   5.0     7.2     1     310/517     323/556
图2B显示，平均粒径(nm)是脂质wt％和乙醇wt％两者的函数。
                             实施例3
将394mg部分氢化的大豆卵磷脂，96.6mg胆固醇，87.4mgDODAC和275mgmPEG-DS与2.147ml乙醇混合，加热至溶解。该脂质储备液含33.5wt％脂质和66.5wt％乙醇。
在10mmol组胺，0.9％NaCl(pH6.5)水溶液中制备含6.7mg/ml 34碱基寡核苷酸的储备液。
各等份脂质储备液用乙醇适当稀释，与以水相适当稀释的寡核苷酸水溶液等份水合，制备成组成如图3A所示的脂质体悬浮液。
在水合后通过QELS测量各份脂质体悬浮液中的平均粒径。结果见表3。
                                       表3
  样品   水合后EtOH(wt％)   水合后脂质(wt％)   水合后寡核苷酸(wt％)   混合后的平均粒径90°散射   混合后的平均粒径30°散射
    1   36.9     2.96     0.33     814     596
    2   33.0     2.96     0.33     182.7     233
    3     29.0     2.96     0.33     114     140.3
    4     25.1     2.96     0.33     82.1     93.9
    5     21.2     2.96     0.33     92.6     149
    6     17.2     2.96     0.33     115.7     295
    7     13.2     2.96     0.33     209.7     311.3
    8     11.3     2.96     0.33     274.7     423.0
    9     9.3     2.96     0.33     334.7     524.7
图3B显示，平均粒径(nm)是脂质wt％和乙醇wt％两者的函数。
                             实施例4
将599.6mg部分氢化的大豆卵磷脂，257.2mg胆固醇，214.2mgmPEG-DSPE与1ml乙醇混合，加热至溶解。该脂质储备液为乙醇中含57.6wt％脂质。
制备用于水合的水相，内含10mmol组胺，0.9％NaCl，pH6.5。
各等份脂质储备液用乙醇适当稀释，与水溶液等份水合，制备成组成如图4A所示的脂质体悬浮液。每种组成一式三份。
在水合后通过QELS测量各份脂质体悬浮液中的平均粒径。结果见表4。
                              表4
  样品     EtOHwt％     脂质wt％     平均粒径(nm)     标准偏差
    1     7.0     0.94     413     91
    2     18.8     0.94     161     21
    3     38.5     0.94     537     227
    4     4.9     3.12     1084     135
    5     16.8     3.12     569     86
    6     36.5     3.12     705     192
    7     3.5     4.69     1435     76
    8     15.3     4.69     737     146
    9     35.0     4.69     735     108
图4B显示，平均粒径(nm)是脂质wt％和乙醇wt％两者的函数。
                             实施例5
按实施例4所述制备脂质体，但不用mPEG-DSPE。即，将629.8mg部分氢化的大豆卵磷脂和272mg胆固醇与1ml乙醇混合214.2mg加热至溶解。该脂质储备液为乙醇中含53.3wt％脂质。
各等份脂质储备液用乙醇适当稀释，与水溶液(10mmol组胺，0.9％NaCl，pH6.5)等份水合，制备成组成如图5A所示的脂质体悬浮液。每种组成一式三份。
在水合后通过QELS测量各份脂质体悬浮液中的平均粒径。结果见表5。
                              表5
  样品     EtOHwt％     脂质wt％     平均粒径(nm)     标准偏差
    1     7.1     0.87     365     150
    2     18.9     0.87     495     504
    3     38.7     0.87     1596     128
    4     5.2     2.88     2891     986
    5     17.0     2.88     305     68
    6     36.7     2.88     2116     407
    7     3.8     4.33     5710     516
    8     15.6     4.33     719     244
    9     35.4     4.33     2433     867
图5B显示，平均粒径(nm)是脂质wt％和乙醇wt％两者的函数。
                             实施例6
将668.3mg部分氢化的大豆卵磷脂，222.3mg胆固醇和222.6mgmPEG-DSPE与1ml乙醇混合，加热至溶解。该脂质储备液为乙醇中含55.5wt％脂质。
制备用于水合的水相，内含10mmol组胺，0.9％NaCl，pH6.5。
各等份脂质储备液用乙醇适当稀释，与水溶液等份水合，制备成组成如图6A所示的脂质体悬浮液。每种组成一式三份。
在水合后通过QELS测量各份脂质体悬浮液中的平均粒径。结果见表6。
                                   表6
  样品     EtOHwt％     脂质wt％     平均粒径(nm)     标准偏差
    1     7.0     0.95     411     57
    2     18.8     0.95     127     9
    3     38.6     0.95     1423     135
    4     4.9     3.2     961     97
    5     16.7     3.2     418     63
    6     36.4     3.2     634     41
    7     3.4     4.8     1725     127
    8     15.2     4.8     634     35
    9     35.0     4.8     837     74
图6B显示，平均粒径(nm)是脂质wt％和乙醇wt％两者的函数。
                             实施例7
按实施例6所述制备脂质体，但不用mPEG-DSPE。即，将629.8mg部分氢化的大豆卵磷脂和272mg胆固醇与1ml乙醇混合，加热至溶解。该脂质储备液为乙醇中含54.3wt％脂质。
各等份脂质储备液用乙醇适当稀释，与水溶液(10mmol组胺，0.9％NaCl，pH6.5)等份水合，制备成组成如图7A所示的脂质体悬浮液。每种组成一式三份。
在水合后通过QELS测量各份脂质体悬浮液中的平均粒径。结果见表7。
                                    表7
  样品     EtOHwt％     脂质wt％     平均粒径(nm)     标准偏差
    1     7.1     0.88     222     22
    2     18.9     0.88     219     24
    3     38.6     0.88     3180     331
    4     5.1     2.9     3993     1625
    5     17.0     2.9     516     299
    6     36.7     2.9     2619     1154
    7     3.7     4.4     7014     27
    8     15.5     4.4     604     106
    9     35.3     4.4     1879     322
图7B显示，平均粒径(nm)是脂质wt％和乙醇wt％两者的函数。
                      实施例8
                 含dpIUdR的脂质体
A.3′，5′-二棕榈酰基-5-碘-2′-脱氧尿苷(dpIUdR)的合成
脱氧尿苷溶于吡啶或吡啶/氯仿，向该溶液中缓慢加入棕榈酰氯，以4-二甲基吡啶为催化剂。混合溶液至呈黄色，静置过夜，让其沉淀。将混合物溶于氯仿，用10％柠檬酸水溶液和饱和碳酸氢钠溶液洗涤。去除氯仿，加入甲醇，生成白色沉淀，经鉴定是3′，5′-二棕榈酰基-5-碘-2′-脱氧尿苷(66％得率)。合成反应过程见图8。
B.不同乙醇浓度的脂质体制剂
将氢化大豆卵磷脂(HSPC)和甲氧基-聚乙二醇衍生的二硬脂酰基卵磷脂(DSPE-mPEG)和dpIUdR按89/5/6摩尔比溶解在乙醇中，70℃加热直至完全溶解(约1小时)。按需要稀释该脂质储备液，保持脂质浓度恒定，用10％蔗糖溶液在70℃水合，使得乙醇浓度8-44wt％间变化。搅拌各脂质体1小时以形成脂质体悬浮液。用准弹性光散射法测量各混合物中的脂质体粒径，结果见表8。
C.16.5wt％乙醇时的脂质体制剂
将氢化大豆卵磷脂(HSPC)和甲氧基-聚乙二醇衍生的二硬脂酰基卵磷脂(DSPE-mPEG)和dpIUdR按摩尔比89/5/6，80/5/10，80/5/15，70/5/25和55/5/40溶解在乙醇中，70℃加热直至完全溶解(约1小时)。脂质混合物用足量的10％蔗糖水溶液在70℃水合，达到水合物中乙醇含量为16.5wt％(20v/v％)乙醇。混合物搅拌1小时，然后进行挤出。
脂质体悬浮液通过聚碳酸酯滤膜挤出，得到100nm的均匀粒径。然后用10％蔗糖溶液对悬浮液进行渗滤，将乙醇降低至400ppm以下。然后进行悬浮液的超滤，使其超过目标药物浓度，测定药物的浓度，加入10mM组胺缓冲液将其稀释到目标浓度，并调解至pH6.5。
用准弹性光散射法测量脂质体粒径，结果见表9。
虽然，以具体实施方式对本发明进行了描述，但是本领域技术人员可以看出，本发明还包括多种改变和修改形式。

Claims (10)

1.一种获得所需大小脂质体颗粒的方法，包括：
将成微泡脂质与溶脂溶剂混合；
用可与所述溶脂溶剂混溶的水性溶剂水合所述成微泡脂质，形成脂质体悬浮液；
测量悬浮液中脂质体颗粒的粒径；
用不同量的溶脂溶剂重复上述水合和测量步骤，得出脂质体粒径与溶脂溶剂量之间的函数曲线；
根据脂质体大小与溶脂溶剂量之间的函数曲线确定获得所需大小脂质体颗粒所需的溶脂溶剂量；
用水性溶剂水合溶于溶脂溶剂的成微泡脂质，形成含10-50重量％溶脂溶剂的水合混合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中的溶脂溶剂是醇。
3.根据权利要求3所述的方法，其中的溶脂溶剂是甲醇，乙醇或丁醇。
4.根据权利要求1所述的方法，其中的成微泡脂质选自带电成微泡脂质，中性成微泡脂质或用亲水性聚合物链衍生的成微泡脂质。
5.根据权利要求4所述的方法，其中的成微泡脂质是用亲水性聚合物链衍生的成微泡脂质，所述亲水性聚合物链是聚乙二醇。
6.根据权利要求1所述的方法，其中的水性溶剂是水。
7.根据权利要求1所述的方法，其中的水合包括用水性溶剂水合药物。
8.根据权利要求7所述的方法，其中的药物是核酸。
9.根据权利要求7所述的方法，其中的药物是以一个或多个酰基链衍生的放射致敏剂。
10.根据权利要求9所述的方法，其中的放射致敏剂是二棕榈酰5-碘-2-脱氧尿苷。
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