CN105722506A - 用于癌症化学治疗剂的亲脂性药物和酸不稳定性亲脂性前体药物的靶向递送的纳米颗粒组合物及它们的制备 - Google Patents

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詹姆斯·D·麦克切斯尼
尹戈尔·尼科乌林
史蒂文·J·班尼斯特
道格拉斯·L·罗登伯格
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Abstract

在一个实施方式中，本申请公开了合成LDL纳米颗粒，其包含选自由磷脂、甘油三酯、胆固醇酯和游离胆固醇所组成的组的成分的混合物；可选地还包含选自由以下所组成的组中的试剂：天然抗氧化剂、泛醇和维生素E，和用于制备所述合成纳米颗粒的方法。在静脉内注射后，所公开的合成LDL纳米颗粒能够将亲脂性药物和前体药物选择性递送至表达LDL受体的细胞靶标。

Description

用于癌症化学治疗剂的亲脂性药物和酸不稳定性亲脂性前体药物的靶向递送的纳米颗粒组合物及它们的制备
相关申请
本申请主张2013年9月13日提交的美国临时专利申请号61/877,521的权益。
发明内容
本发明描述了用于产生适合于药物递送的结构化亚微细粒(纳米颗粒)的组合物和方法。根据本文所公开的方法制备的颗粒结构导致了所期望的生物和物理性能。在一个方面，通过选择用于产生颗粒的制剂成分和处理步骤确定颗粒结构。决定颗粒性能的结构因素包括粒径(和群体中的颗粒尺寸分布)、颗粒形状、颗粒电荷和颗粒中各个组分的分布，特别是颗粒表面上的那些。
颗粒性能
在肠胃外药物递送中，纳米颗粒具有特别的优势。纳米颗粒比血细胞小，并且可以悬浮并通过血液输送至身体的多个组织。由于它们小于微生物，因此它们将穿过用于最终对肠胃外产物灭菌的过滤器。由于肿瘤快速扩增的脉管系统本身是渗漏的，因此纳米颗粒离开毛细血管并保留在肿瘤冲洗较差的细胞间隙。
包括在本申请中的纳米颗粒具有独特的生物性能。在一个方面，本申请的纳米颗粒被称为合成低密度脂蛋白(LDL)纳米颗粒、LDL样纳米颗粒或者脂质乳剂(LDE)，这部分是因为未使用任何蛋白制备所述纳米颗粒。一旦施用，这些颗粒不会被识别为外源的，即它们未涂覆在网状内皮系统组织中引起清除过程的蛋白质。此外，这些颗粒涂覆有抑制调理素作用和噬菌作用(吞噬作用，phagocytosis)的成分。事实上，这些颗粒被认为是内源成分并接收需要胆固醇的细胞表面上表达的受体识别的载脂蛋白涂层。涂覆后，这些颗粒优先通过脂蛋白受体介导的胞吞作用被具有高胆固醇需要的细胞吸收。这些细胞包括快速分化组织，特别是实体和液体肿瘤组织的那些。
在一个实施方式中，将本申请的结构化纳米颗粒设计为在肠胃外施用的药物产品中携带有用的载药量。对于该递送系统，特别关心的药物是由于高亲脂性而在水中具有低或极低溶解度的那些药物。在一个实施方式中，可以通过形成高亲脂性衍生物(其可以用作待递送药物的前体药物)来适合地制备不足够亲脂以适合于在本申请的纳米颗粒中递送要递送的药物。将这些颗粒设计为在生产的药物产品中是足够化学和物理稳定的，从而使得在商业上具有足够的货架期。
必要的颗粒特性：
在一个方面，这些颗粒的有利配置可以归因于颗粒尺寸、形状、组成和电荷。在一个方面，该颗粒可以是基本球形的以平稳移动通过毛细血管并且可以具有平均60nm的窄颗粒尺寸分布。在一个方面，尺寸分布范围为约40至80nm。所述组成可以包括胆固醇、其它脂质(lipid)和表面活性剂，并且添加或不添加用于限定颗粒结构的聚合物。在一个实施方式中，通过使用阳离子表面活化剂实现了正表面电荷。小颗粒的基本特性导致固有的不稳定性。随着颗粒尺寸的降低，单位质量的分散系统的界面面积提高，并且界面能也提高。这种提高的能量会驱使颗粒合并，从而形成较大的颗粒并具有较低的总能量。
颗粒尺寸的极度减小可以导致药物溶解度的显著提高。与相同组成的较大颗粒相比，纳米颗粒中的材料离开颗粒并进入周围溶液的倾向要高的多。这种现象可以提高药物输送通过生物膜的可用性，但是它还可以导致纳米颗粒本身的物理不稳定性。在奥氏熟化中观察到了这种不稳定性，其中由于材料转移到大颗粒中，小颗粒消失。通过以正确水平使用适当的表面活性剂和赋形剂降低界面能，可以改善纳米颗粒的物理稳定性，从而控制颗粒的表面电荷以维持分散体系并产生窄颗粒尺寸分布的颗粒以降低奥氏熟化。
在一个实施方式中，通过产生亲脂性惰性成分的颗粒核心实现了本申请的颗粒中的高载药量，亲脂性惰性成分将溶解药物或其亲脂性前体药物并降低其离开纳米颗粒的倾向直至在靶标位点胞内释放。
颗粒生产：
在具有适合尺寸、结构、电荷和稳定性的颗粒生产中存在非常显著的问题。可以通过从溶液中沉淀纳米颗粒材料或降低较大颗粒的尺寸产生均匀的纳米颗粒。由于单一物理系统不大可能将所有成分沉淀为必要结构，因此通过沉淀技术不易制得非均匀结构的纳米颗粒。
颗粒尺寸减小需要能量；这种能量是破坏将整体组分分子保持在一起的作用力以及增加颗粒和周围介质之间的界面接触面积所必需的。该能量必须来自用于产生纳米颗粒的过程。为了能够有用，通过降低尺寸来产生纳米颗粒的任何方法(即用于赋予整体制剂能量的系统)必需是可控制的和可放大的。在纳米颗粒生产中证明有用的技术包括超声和高压均质化。已将大于20,000Hz的机械振荡的形式的超声能用于降低液体中的颗粒尺寸。液体中高频机械振荡导致显微空泡(空洞)快速形成和挤毁。该方法中的高速局部传质赋予液体和悬浮颗粒极高的剪切力。还可以在流动系统中通过以极高压力迫使液体通过孔口或进入极狭窄通道来产生高剪切力。不同的处理设备在本领域中是已知的并且是可用的，其通过优化方法的足够的控制参数，使用了对流动的处理流体流作用的超声或高压均质。
合成的LDL纳米颗粒(sLDL)：
在一个实施方式中，本发明提供了合成的LDL纳米颗粒，其包含足够类似于正常人LDL颗粒组成从而被身体识别为“天然”的脂质组分。通过被身体识别为“天然”，这些合成的LDL纳米颗粒对于亲脂性药物或前体药物向LDL受体表达组织(特别是过表达LDL受体的肿瘤组织)的选择性递送是有效的。如本文所述产生了合成的LDL纳米颗粒，或者可以通过本领域技术人员已知的方法制备合成的LDL纳米颗粒。如本文所使用的，“合成的”表示通过化学合成制备。
在一个实施方式中，平均LDL纳米颗粒尺寸为60nm，但是可以是40nm至100nm。在一些实施方式中，LDL纳米颗粒尺寸为50nm至60nm。要递送的药物或前体药物可以与具有特定重量比的磷脂(PL)、甘油三酯(TG)和胆固醇酯(CE)的微乳剂复合。在一个实施方式中，PL:TG:CE的比率为36:5:1。在一些实施方式中，所述磷脂为蛋黄磷脂酰胆碱(PC)或1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酰胆碱(DMPC)。可以使用的适合的甘油三酯包括(但不限于)豆油(SO)、三油酸甘油酯(TO)和三棕榈酸酯及其混合物。可以使用的适合的胆固醇酯包括(但不限于)胆固醇油酸酯(CO)或胆固醇棕榈酸酯(CP)或其混合物。在另一个实施方式中，改变核心脂质CE和TG的组成以改变乳剂的尺寸。在另一个实施方式中，脂质的比例为PL:TG:CE的30:6:1重量比。可以使用的其它比例包括37:7:1的PL:TG:CE和20:3:0.5的PL:TG:CE。在一些实施方式中，在微乳剂中省略了胆固醇酯。在一些实施方式中，药物或前体药物可以与比率为7:1的PL和TG的微乳剂复合。
可以通过将脂质挤出通过纳米过滤器如30nm过滤器来制备微乳剂。例如，在存在20μMBHT和N2的情况下，在40℃将脂质超声足够的时间(例如，约1小时)，然后挤出通过过滤器或一系列过滤器以获得具有适合尺寸的脂质颗粒。在一个实施方式中，将微乳剂挤出通过0.1μm(100nm)过滤器，然后通过0.03μm(30nm)过滤器并分离。在另一个实施方式中，可以使用微射流机装置制备组合物。
背景技术
可以选择性杀死癌细胞而不伤害体内其它细胞的靶向癌症疗法将代表癌症临床治疗中较大的改善。在癌症治疗方案中，非常希望开发用化疗剂直接靶向癌细胞的策略。这可以导致毒副作用的降低或消除，导致更有效地将药物递送至靶标位点并减少所施用药物的剂量并导致对健康细胞的毒性以及化疗方案成本的降低。从1958年开始，在文献中出现了使用抗体的靶向化疗药物的报道。由于抗体尺寸大(MW＝125-150千道尔顿或KD)以及因此它们相对不能透过实体瘤，因此通过与选择性递送至癌细胞的抗体缀合的靶向药物获得了有限的成功。替代策略包括使用较小的靶向配体和肽，其作为靶向载体识别肿瘤细胞唯一的或过表达的特异性受体。这些构建体具有2-6KD的分子量，其使得能够方便地透过整个实体瘤。
细胞增殖和生长的提高是癌症的标志。细胞增殖的提高与高细胞胆固醇循环有关。需要胆固醇用于膜合成和生长的细胞可以通过受体介导的血浆低密度脂蛋白(LDL，血液中主要的胆固醇转运蛋白)的胞吞作用或通过从头合成获得胆固醇。LDL通过被称为LDL受体(LDLR)的受体被吸收到细胞中；LDL与受体一起被内吞并在内含体中被转运到细胞。内含体酸化，并且这使得从LDL释放LDL受体；LDL受体再循环到表面，在此它可以参与LDL颗粒的额外的吸收。大量证据表明多种组织中的肿瘤对LDL具有高要求，其程度使得血浆LDL枯竭。认为LDL向癌性细胞输入的增加是由于这些肿瘤中LDL受体(LDLR)的增加引起的。已知表达高数目LDLR的一些肿瘤包括某些形式的白血病、肺肿瘤、结肠直肠肿瘤和卵肿瘤巢癌。体内研究显示在脑恶性肿瘤中的确出现了LDLR。Leppala等人使用PET成像并且表明99mTc_LDL体内定位于人脑肿瘤中，但是不存在于正常脑中。
这表明在GBM及其它恶性肿瘤中，LDL受体是通过LDL颗粒递送抗肿瘤药物的潜在唯一分子靶标。及同事进行了这种可能性的测试。在代谢研究中，在大鼠中使用了脂质组成类似于低密度脂蛋白(LDL)的无蛋白质微乳剂(LDE)以将LDE与天然脂蛋白相比较。培育研究还显示LDE引入多种脱脂蛋白，包括载脂蛋白E，它是通过特异性受体用于识别脂蛋白的配体。
癌症化疗剂的亲脂性衍生物：
ArborTherapeutics已发展了癌症化疗剂的独特亲脂性衍生物，其在正常体循环中具有高稳定性并且保留在LDL颗粒的脂质核心中，但是在内含体的酸性环境中其容易释放活性化疗剂。参见美国专利No.8,440,714，该专利的公开内容以其全部内容并入本文。
在另一个实施方式中，提供了式3a或3b所表示的活性化疗化合物：
其中：R1为氢、C1-C4烷基或C5-C22烷基；R2为C5-C22烷基；Y选自O、NR'或S，其中R'为氢或C1-C6烷基；Z选自O或S；Q为O或S；并且T为O或S。在一个方面的化合物，R1为氢或C1-C4烷基；R2为C5-C22烷基；Y为O或S；Z为O；Q为O；和T为O。当活化的化合物与具有羟基的癌症化疗剂(HBCCA)缩合时，式3a或3b所表示的活化的化合物可以用于制备酸不稳定的亲脂性结合物。如本文所定义的，例如，在式1、1a、1b、1.1、2和2a中，通过残基或基团“R”属类地表示HBCCA，并且当HBCCA不偶联以形成酸不稳定的亲脂性分子结合物时，HBCCA还可以属类地表示为具有式“R-OH”，这是因为可以通过一个或多个羟基(-OH)基团官能化HBCCA。
在一个实施方式中，提供了式1、1.1或者式2所表示的酸不稳定的亲脂性分子结合物(ALLMC)：
其中：R为具有羟基的癌症化疗剂；对于式1或1.1，R1为氢、C1-C4烷基或C5-C22烷基；R2为C5-C22烷基；Y选自O、NR'或S，其中R'为氢或者C1-C6烷基；Z为O或S；Q为O或S；和T为O或S；对于式2：R2为C1-C22烷基；T为O或S；和X为氢或离去基团，其选自甲磺酸酯基、磺酸酯基和卤素(Cl、Br和I)；和它们的分离的对映异构体、非对映异构体或其混合物或其药用盐。化合物1.1包括纯的顺式异构体、纯的反式异构体以及顺式和反式异构体的混合物以及它们的非对应异构体。
在另一个实施方式中，提供了式1或1.1所表示的上述酸不稳定的亲脂性分子结合物，其中：R为具有羟基的癌症化疗剂；R1为氢、C1-C4烷基或C5-C22烷基；R2为C5-C22烷基；Y为O或S；Z为O；Q为O；并且T为O。在式2所示的酸不稳定的亲脂性分子结合物的一个方面，其中：R2为C5-C22烷基；T为O；并且X为氢或选自Cl、Br和I所组成的组中。在另一种变体中，R2为C9-C22。在以上酸不稳定的亲脂性分子结合物的另一个方面，其包含式1a、1b或式2a：
其中：R为具有羟基的癌症化疗剂(HBCCA)；对于式1a或1b，R1为氢、C1-C4烷基或C5-C22烷基；并且R2为C5-C22烷基；并且对于式2a，R2为C1-C22烷基；和X为氢或选自Cl、Br和I所组成的组中。在式1a或1b所示的碳酸酯(即，-OC(O)O-)的化合物的一种变体中，所述化合物是式1a所表示的相应磺酸酯(即-OS(O)O-)，其中所述碳酸酯基被磺酸酯基替代。化合物1b包括纯的顺式异构体、纯的反式异构体以及顺式和反式异构体的混合物以及它们的非对应异构体。
在式1、2、1a和2a所示的化合物的另一种变体中，R1为氢或C1-C4烷基或C5-C22烷基，并且R2为不饱和脂肪酸的碳残基，如选自下列组成的组的碳残基：二十烯酸(包括顺式异构体、反式异构体和异构体的混合物)的C19残基、油酸的C17残基和反油酸的C17残基。如本文所使用的，脂肪酸的“碳残基”(例如，C17残基、C19残基等…)表示羧基碳以外的脂肪酸的碳链。
在以上酸不稳定的亲脂性分子结合物的另一个方面，具有羟基的癌症化疗剂选自由以下所组成的组中：紫杉烷、abeo-紫杉烷、喜树碱、埃博霉素、葫芦素、苦木苦味素、蒽环类以及它们的类似物和衍生物。在以上酸不稳定的亲脂性分子结合物的另一个方面，具有羟基的癌症化疗剂选自由以下所组成的组中：阿柔比星、喜树碱、马索罗酚、紫杉醇、喷司他丁、氨柔比星、克拉屈滨、阿糖胞苷、多西他赛、吉西他滨、依利醋铵、表柔比星、依托泊苷、福美司坦、氟维司群、伊达比星、吡柔比星、拓扑替康、戊柔比星和长春碱。
在一个实施方式中，提供了式1、1.1或者式2的酸不稳定的亲脂性分子结合物(ALLMC)：
其中：R为具有羟基的癌症化疗剂；对于式1或1.1，R1为氢、C1-C4烷基或C5-C22烷基；R2为C5-C22烷基；Y选自O、NR'或S，其中R'为氢或者C1-C6烷基；Z为O或S；Q为O或S；和T为O或S；对于式2：R2为C1-C22烷基；T为O或S；和X为氢或离去基团，离去基团选自由以下所组成的组中：甲磺酸酯基、磺酸酯基和卤素(Cl、Br和I)；和它们的分离的对映异构体、非对映异构体或其混合物或其药用盐。化合物1.1包括纯的顺式异构体、纯的反式异构体以及顺式和反式异构体的混合物以及它们的非对应异构体。
在另一个实施方式中，提供了式1或1.1的上述酸不稳定的亲脂性分子结合物，其中：R为具有羟基的癌症化疗剂；R1为氢、C1-C4烷基或C5-C22烷基；R2为C5-C22烷基；Y为O或S；Z为O；Q为O；并且T为O。在式2的酸不稳定的亲脂性分子结合物的一个方面，其中：R2为C5-C22烷基；T为O；并且X为氢或选自由以下所组成的组中：Cl、Br和I。在另一种变体中，R2为C9-C22。在以上酸不稳定的亲脂性分子结合物的另一个方面，其包含式1a、1b或式2a：
其中：R为具有羟基的癌症化疗剂(HBCCA)；对于式1a或1b，R1为氢、C1-C4烷基或C5-C22烷基；并且R2为C5-C22烷基；并且对于式2a：R2为C1-C22烷基；和X为氢或选自由以下所组成的组中：Cl、Br和I。在式1a或1b的作为碳酸酯(即，-OC(O)O-)的化合物的一种变体中，所述化合物是式1a的相应磺酸酯(即-OS(O)O-)，其中碳酸酯基被磺酸酯基替代。化合物1b包括纯的顺式异构体、纯的反式异构体以及顺式和反式异构体的混合物以及它们的非对应异构体。
在式1、2、1a和2a的化合物的另一种变体中，R1为氢或C1-C4烷基或C5-C22烷基，并且R2为不饱和脂肪酸的碳残基，如选自下列所组成的组的碳残基：二十烯酸(包括顺式异构体、反式异构体和异构体的混合物)的C19残基、油酸的C17残基和反油酸的C17残基。如本文所使用的，脂肪酸的“碳残基”(例如，C17残基、C19残基等…)表示除羧基碳以外的脂肪酸的碳链。在以上酸不稳定的亲脂性分子结合物的另一个方面，具有羟基的癌症化疗剂选自由以下所组成的组中：紫杉烷、abeo-紫杉烷、喜树碱、埃博霉素、葫芦素、苦木苦味素、蒽环类以及它们的类似物和衍生物。在以上酸不稳定的亲脂性分子结合物的另一个方面，具有羟基的癌症化疗剂选自由以下所组成的组中：阿柔比星、喜树碱、马索罗酚、紫杉醇、喷司他丁、氨柔比星、克拉屈滨、阿糖胞苷、多西他赛、吉西他滨、依利醋铵、表柔比星、依托泊苷、福美司坦、氟维司群、伊达比星、吡柔比星、拓扑替康、戊柔比星和长春碱。在以上酸不稳定的亲脂性分子结合物的另一个方面，所述结合物选自图18、19和20中的化合物。在一种变体中，基团-ALL1、-ALL2、-ALL3…至-ALLn中仅有一个是ALL基团并且其它为氢。在另一种变体中，基团-ALL1、-ALL2、-ALL3…至-ALLn中有两个是-ALL基团。
在另一个实施方式中，提供了药物组合物，包含：a)治疗有效量的处于单一非对映异构体形式的上述化合物；和b)药用赋形剂。在另一个方面，所述药物组合物适合于口服给药；或作为液体制剂适合于肠胃外给药。在另一个方面，所述组合物适合于通过选自以下所组成的组的途径给药：口服、肠胃外、腹膜内、静脉内、动脉内、经皮、肌内、直肠、鼻内、脂质体、皮下和鞘内。在另一个实施方式中，提供了用于治疗患者中癌症的方法，其包括给予需要这种治疗的患者治疗有效量的以上化合物或组合物中任一种的化合物或组合物。在该方法的一个方面，癌症选自由以下所组成的组中：白血病、成神经细胞瘤、成胶质细胞瘤、宫颈癌、结肠直肠癌、胰腺癌、肾癌和黑素瘤。在该方法的另一个方面，癌症选自由以下所组成的组中：肺癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌和头颈癌。在该方法的另一个方面，当与具有非结合的羟基的癌症化疗剂相比时，该方法提供了至少10％、20％、30％、40％或至少50％的癌细胞所表现的耐受程度降低。
在另一个实施方式中，提供了用于减少或基本消除与给予患者癌症化疗剂有关的化疗副作用的方法，该方法包括给予患者治疗有效量的式1、1.1或式2的酸不稳定的亲脂性分子结合物：
其中：R为具有羟基的癌症化疗剂；对于式1或1.1：R1为氢、C1-C4烷基或C5-C22烷基；R2为C5-C22烷基；Y选自O、NR'或S，其中R'为氢或者C1-C6烷基；Z为O或S；Q为O或S；和T为O或S；对于式2：R2为C1-C22烷基；T为O或S；和X为氢或离去基团，离去基团选自由以下所组成的组中：甲磺酸酯基、磺酸酯基和卤素(Cl、Br和I)；和它们的分离的对映异构体、非对映异构体或其混合物。化合物1.1包括纯的顺式异构体、纯的反式异构体以及顺式和反式异构体的混合物以及它们的非对应异构体。在以上的一种变体中，R2为C9-C22烷基。在一个方面，该方法在患者癌细胞中提供了较高浓度的癌症化疗剂。在另一个方面，当与给予患者非结合癌症化疗剂相比时，该方法在癌细胞中递送的癌症化疗剂的浓度高至少5％、10％、20％、30％、40％或至少50％。
在另一个实施方式中，提供了式3a或3b的化合物：
其中：R1为氢、C1-C4烷基或C5-C22烷基；R2为C5-C22烷基；Y选自O、NR'或S，其中R'为氢或C1-C6烷基；Z选自O或S；Q为O或S；并且T为O或S。在该化合物的一个方面，R1为氢或C1-C4烷基；R2为C5-C22烷基；Y为O或S；Z为O；Q为O；和T为O。当活化的化合物与具有羟基的癌症化疗剂(HBCCA)缩合时，式3a或3b的活化的化合物可以用于制备酸不稳定的亲脂性结合物。如本文所定义的，例如，在式1、1a、1b、1.1、2和2a中，一般通过残基或基团“R”表示HBCCA，并且当HBCCA不结合以形成酸不稳定的亲脂性分子结合物时，HBCCA还可以表示为具有式“R-OH”，因为可以通过一个或多个羟基(-OH)基团官能化HBCCA。
类似地，可以与HBCCA缩合以形成酸不稳定的亲脂性分子结合物的酸不稳定的亲脂基团(即，活化的化合物的“-ALL”基团)一般表示为“R-O-ALL”。因此，当多于一个-ALL基团与HBCCA基团缩合或结合时，每个-ALL基团可以独立地表示为-ALL1、-ALL2、-ALL3…至-ALLn，其中n为癌症化疗剂上可以与-ALL基团结合或偶联的可用羟基数目。例如，如对式1和2的化合物举例说明的，所表示的HBCCA和-ALL基团如下所示。
以下描述了酸不稳定的亲脂性分子结合物(ALLMC)的实例，其中HBCCA基团为具有两个-ALL基团的紫杉醇：
在紫杉醇的酸不稳定的分子结合物的上述代表性实例中，每个-ALL1和-ALL2独立地为氢或如本文所定义的-ALL基团。对于具有多于一个羟基基团的HBCCA基团、其中不能形成酸不稳定的亲脂基团的难接近的羟基，则表示为ALL基团的基团为氢。
在以上酸不稳定的亲脂性分子结合物的另一个方面，具有羟基的癌症化疗剂选自由以下所组成的组中：紫杉烷、abeo-紫杉烷、喜树碱、埃博霉素、葫芦素、苦木苦味素、蒽环类以及它们的类似物和衍生物。在以上酸不稳定的亲脂性分子结合物的另一个方面，具有羟基的癌症化疗剂选自由以下所组成的组中：阿柔比星、喜树碱、马索罗酚、紫杉醇、喷司他丁、氨柔比星、克拉屈滨、阿糖胞苷、多西他赛、吉西他滨、依利醋铵、表柔比星、依托泊苷、福美司坦、氟维司群、伊达比星、吡柔比星、拓扑替康、戊柔比星和长春碱。
在图A、B和C中公开了可以在本发明的组合物或制剂中使用的代表性化疗剂。在以上的一个方面，化疗剂为ART-207。
通过它们对LDL受体的过表达向癌症组织选择性和特异性递送化疗化合物以及后续从体循环中对LDL颗粒的高吸收，要获得较大可能的上述情况就要求癌症化疗剂具有高亲脂性，从而使它们保持在LDL颗粒的脂质核心中并且不会扩散到血浆中以导致将正常组织暴露于试剂的毒副作用。此外，一旦具有化疗药物加载的LDL颗粒通过LDL受体介导进入内含体酸性环境的吸收而进入癌细胞，则LDL受体与LDL颗粒分离并再循环至细胞表面，而LDL颗粒将其脂质内容物及其亲脂性化疗剂释放到内含体的酶和酸性环境中。
及其同事进一步证明了这种预期的正确性，他们表明在注射到血流中后，富含胆固醇的微乳剂或纳米颗粒制剂(LDE)在癌症组织中浓缩。将结合至LDE的紫杉醇亲脂性衍生物的细胞毒性、药物动力学、对动物的毒性以及治疗作用与商品化紫杉醇进行比较。结果显示LDE-紫杉醇油酸酯是稳定的。由于商品化制剂中使用的载体CremophorEL的细胞毒性，与商品化紫杉醇相比，复合物中药物的细胞抑制活性减弱。肿瘤培养细胞中的竞争实验显示，通过LDL受体途径将紫杉醇油酸酯和LDE一起内化。小鼠耐受性显著，从而致死剂量(LD50)是商品化制剂的9倍大(LD50分别为326μM和37μM)。相对于正常相邻组织，LDE在肿瘤中将紫杉醇油酸酯浓缩大致4倍。当与商品化紫杉醇相比时，在等摩尔剂量下，紫杉醇油酸酯与LDE的结合导致药物动力学参数的显著改变(分别地，t1/2＝218分钟和184分钟，AUC＝1,334μg-h/mL和707μg-h/mL，并且CL＝0.125mL/min和0.236mL/min)。如肿瘤生长减小、存活率以及小鼠治愈百分比的提高所示，复合物的治疗效力显著大于商品化紫杉醇。等人证明LDE-紫杉醇油酸酯是稳定的复合物，并且与紫杉醇相比，毒性显著降低并且活性提高，这可以在临床使用中导致治疗指数改善。及其同事在他们的初步动物研究后，在乳腺癌患者中进行了试验性临床研究。在乳腺癌患者中进行临床研究以评估结合至LDE纳米乳剂的紫杉醇的肿瘤吸收、药物动力学和毒性。乳房切除术前24小时，将与14C-胆固醇油酸酯-纳米乳剂结合的3H-紫杉醇油酸酯或CremophorEL中的3H-紫杉醇注入5位患者用于收集血液样品以及肿瘤和正常乳腺组织的片段。在4位患有难治性晚期疾病的乳腺癌患者中进行175和220mg/m2剂量水平的3周间隔施用的紫杉醇-纳米乳剂的试验性临床研究。结合至纳米乳剂的紫杉醇油酸酯的半衰期(t1/2)比紫杉醇更长(分别地，t1/2＝15.4±4.7和3.5±0.80h)。乳腺恶性组织对14C-胆固醇酯纳米乳剂以及3H-紫杉醇油酸酯的吸收是正常乳腺组织的3倍大，并且在两种剂量水平，毒性最低。他们的结果表明紫杉醇-纳米乳剂制剂可以有利地用于乳腺癌的治疗，这是因为药物动力学参数得到改善，药物在肿瘤组织中浓缩并且紫杉醇毒性降低。实验室有关使用LDL-样脂质乳剂的小型人试验的其它报道显示掺入到乳剂核心的亲脂性药物靶向肿瘤组织并且副作用显著降低。制备乳剂的困难，包括通过长时间超声处理进行生产以及延长的离心作用以用于颗粒尺寸选择，使它们无法进行进一步的临床研究和开发。
我们已发现如何制备作为充分亲脂性的化疗剂(包括我们独特的癌症化疗剂的酸不稳定的亲脂性前体药物衍生物)的递送制剂的纳米颗粒“假LDL”脂质微乳剂。在一个实施方式中，亲脂性化疗剂所具有的测量或计算的LogP大于4。我们在动物肿瘤模型中进一步证明当以纳米颗粒LDL-样脂质乳剂计量时，癌症化疗剂的酸不稳定的亲脂性分子结合物由于毒性降低而对肿瘤减小更有用并且由于选择性递送至瘤/肿瘤组织而具有更大的效力。
在一个实施方式中，本申请公开了稳定的合成低密度脂蛋白(LDL)纳米颗粒，其包含：a)亲脂性抗癌剂；b)磷脂(PL)；和c)甘油三酯(TG)；其中LDL纳米颗粒具有小于100nm、小于90nm或者小于80nm的颗粒尺寸。如本文所提及的，稳定的合成低密度脂蛋白(LDL)纳米颗粒是如本文所定义的纳米颗粒，当在密封容器中并且避光保存时，该纳米颗粒在约25℃的货架期大于90天、大于120天、大于180天或大于1年。在另一个方面，当在密封容器中并且避光保存时，该纳米颗粒在约25℃的货架期大于1年或约2年以上。在一个方面，如果是LDL纳米颗粒，则颗粒尺寸分布在40至80nm之间。在另一个方面，颗粒尺寸分布在50至60nm之间。在以上的一个方面中，LDL纳米颗粒的平均尺寸分布为60nm。在另一个方面，LDL纳米颗粒的平均尺寸分布为约50nm。在另一个方面，磷脂选自由以下所组成的组中：磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、对称或不对称的1,2-二酰基-sn-甘油基-3-磷酰胆碱、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酰胆碱、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺、蛋黄磷脂(eggphospholipids)、卵磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、蛋黄卵磷脂(egglecithin)、大豆卵磷脂、卵磷脂(NOS)及其混合物。
在另一个方面，LDL纳米颗粒还包含胆固醇酯(CE)或胆固醇(C)或者胆固醇酯和胆固醇的混合物。在另一个方面，胆固醇酯选自由胆固醇的C16-22酯、胆固醇及其混合物所组成的组中；并且甘油三酯选自由豆油、三油酸甘油酯、三棕榈酸甘油酯及其混合物所组成的组中。在以上的一个方面，胆固醇酯选自由胆固醇油酸酯、胆固醇棕榈酸酯、胆固醇硬脂酸酯和胆固醇亚油酸酯所组成的组中。在另一个方面，LDL纳米颗粒还包含选自由以下所组成的组中的试剂：三油酸甘油酯、天然抗氧化剂、BHT、泛醇、泛醇10、维生素E、α-生育酚、γ-生育酚、番茄红素、视黄基衍生物和β胡萝卜素或其混合物。在另一个方面，亲脂性抗癌剂是抗癌剂或抗癌剂的前体药物。在以上的一个方面，PL:TG的比率可以在8:1至3:1的范围内。在另一个方面，PL:TG:CE的比率可以在8:1:0.5至3:1:0.1的范围内。在另一个方面，亲脂性抗癌剂:PL:TG的比率可以在1:10:3至1:3:0.5的范围内。在另一个方面，亲脂性抗癌剂:PL:TG:CE的比率可以在1:10:3:1至1:3:0.5:0.1的范围内。
在另一个方面，抗癌剂选自由紫杉烷、abeo-紫杉烷、喜树碱、埃博霉素、葫芦素、苦木苦味素和蒽环所组成的组中。在另一个方面，抗癌剂选自由以下所组成的组中：阿柔比星、喜树碱、马索罗酚、紫杉醇、喷司他丁、氨柔比星、克拉屈滨、阿糖胞苷、多西他赛、吉西他滨、依利醋铵、表柔比星、依托泊苷、福美司坦、氟维司群、伊达比星、吡柔比星、拓扑替康、戊柔比星和长春碱。在另一个方面，抗癌剂的前体药物是酸不稳定的亲脂性分子结合物并且如本文在图A、B和C中所公开的。在一个具体方面，酸不稳定的亲脂性分子结合物为ART-207。
在以上的另一个方面，亲脂性抗癌剂的logP大于4.0、6.0或8.0。在一个方面，PL:TG:CE:C的重量比在73:12:2:1至78:12:2:1的范围内；其任选地还包含添加剂，所述添加剂选自由以下所组成的组中：三油酸甘油酯、天然抗氧化剂、BHT、泛醇、泛醇10、维生素E、α-生育酚、γ-生育酚、番茄红素、视黄基衍生物和β胡萝卜素或其混合物。在一种变体中，PL:TG:CE:C的重量比为77:10:2:1。在一个方面，天然抗氧化剂选自辅酶Q10、白藜芦醇、紫檀芪及其混合物。在另一个方面，亲脂性抗癌剂与甘油三酯的比率为1:1至0.6:1。在另一个方面，LDL纳米颗粒含有6.0至8％wt/wt的总固体含量。在另一个方面，LDL纳米颗粒含有5.0至7.0％wt/wt的总脂质含量。在一种变体中，LDL纳米颗粒还包含选自由P188、P237、P338、P407、SYNPERONICS、PLURONICS和KOLLIPHOR或其混合物所组成的组中的泊洛沙姆。
在另一个实施方式中，提供了用于制备稳定的合成低密度脂蛋白(LDL)纳米颗粒的方法，所述纳米颗粒包含：a)亲脂性抗癌剂；b)磷脂(PL)；和c)甘油三酯(TG)；该方法包括：1)将亲脂性抗癌剂、磷脂和甘油三酯混合以形成混合物；2)通过在挥发性溶剂中溶解使混合物变均匀；3)除去溶剂；4)通过将混合物在缓冲液中共混形成乳剂混合物来形成粗乳剂；5)将乳剂混合物在微射流装置中微射流足量的时间以产生100nm或更小的颗粒制剂；和6)将纳米颗粒制剂通过0.22微米过滤器除菌以获得40nm至80nm范围内的合成LDL纳米颗粒。在一种变体中，合成低密度脂蛋白(LDL)纳米颗粒混合物，其中磷脂选自由以下所组成的组中：磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、对称或不对称的1,2-二酰基-sn-甘油基-3-磷酰胆碱、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酰胆碱、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺、蛋黄磷脂、卵磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、卵磷脂(NOS)及其混合物。在另一个方面，LDL纳米颗粒还包含胆固醇(C)或胆固醇酯(CE)或者胆固醇和胆固醇酯的混合物，胆固醇酯选自胆固醇的C16-22酯、胆固醇及其混合物；并且甘油三酯选自由豆油、三油酸甘油酯、三棕榈酸甘油酯及其混合物所组成的组中。在以上的一个方面，以200至800rpm、约200rpm、400rpm、600rpm或800rpm的速度进行低速共混。在另一个方面，在约45至65℃的处理温度下进行温热粗乳剂混合物的微射流。在上述方法的另一个方面，真空除去溶剂。在另一个实施方式中，提供了通过如本文所公开的方法制备的稳定的合成低密度脂蛋白(LDL)纳米颗粒，其包含：a)亲脂性抗癌剂；b)磷脂(PL)；和c)甘油三酯(TG)；在以上的一个实施方式中，通过任何公开方法制备了合成LDL纳米颗粒，其中当静脉内注射时，LDL纳米颗粒涂覆有载脂蛋白，并且LDL纳米颗粒被细胞LDL受体识别并内化。
在另一个实施方式中，提供了用于治疗患者中癌症的方法，其包括给予需要这种治疗的患者治疗有效量的根据以上实施方式、方面和变体中任一种所述的稳定的合成低密度脂蛋白(LDL)纳米颗粒。在该方法的另一个方面，癌症选自由以下所组成的组中：白血病、成神经细胞瘤、成胶质细胞瘤、宫颈癌、结肠直肠癌、胰腺癌、肾黑素瘤、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌和头颈癌。
具体实施方式
脂质基药物和前体药物制剂的开发：
药物/前体药物掺入量、颗粒尺寸和稳定性的优化。用于制备纳米颗粒脂质基“假LDL”制剂的一般步骤可见于ArborTherapeutics,LLC标准操作程序；ART001粗乳剂制备Rev.1、ART002微射流模型110PGenII(MF)Rev1(ART002MicrofluidicsModel110PGenII(MF)Rev1)和ART003Nicomp380ZLS颗粒尺寸分析Rev.1。注明了这些SOP的例外情况。
缩写：PC-磷脂酰胆碱，TG-甘油三酯，TC-总胆固醇，FC-游离胆固醇，CE-酯化胆固醇，U-泛醇，VitE-维生素E(混合维生素E)，P188-泊洛沙姆188，DMPC-1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酰胆碱，PS-磷脂酰丝氨酸；MFP-微射流处理，IC-相互作用室，ICJ-相互作用室夹套；TSPM-总固体预混合物；REM-所得乳剂；％-总固体百分比，TL,％-总脂质百分比，W/V-重量比体积；回收率，％-微射流处理和无菌0.22um过滤后制剂中回收的ART-207的百分比；mfg-生产；Pre-mix-预混合物；ND-未确定；BDL-低于检测限。R-阻力(resistance)。
在www.chemicalize.org在线进行下表中提及的抗癌剂的所有logP计算，其使用了来自ChemAxon的logP预测软件(predictor)。ChemAxon算法基于：VellarkadN.Viswanadhan等人,JournalofChemicalInformationandComputerSciences198929(3),163-172。
所使用的材料：
所使用的设备：
ART-207的分析定量：
用于LDL样脂质乳剂纳米颗粒中ART-207浓度定量的分析方法的建立是约18个月的演变过程。
所使用的方法和方法改变的总结：
Taxane_Prodrug.M-可变尺寸的净乳剂注射剂：
13AUG2012校准曲线/响应线性度
17JAN2013用IPA以1:10稀释乳剂样品
紫杉醇测试.M-用IPA以1:10稀释乳剂样品，1μL注射剂：
用于定量在以下研究所制备的乳剂中的ART-207的方法：
所使用的三种HPLC方法是类似的。此时，注射纯乳剂样品。所有方法使用Phenomenex4.6×50mmLuna5μC18(2)100A，部件号00B-4252-E0柱，流速：1.5ml/分钟，检测：230nm，柱温：40℃，以及进样体积：不同的。
这三种方法中每一种的梯度表和进样体积如下所示：
Taxane_Prodrug.M用于确定响应的线性度，其在0.6至5.2mg/mL，对ART-207显示R2＝0.9997。
Taxane_Prodrug.M还用于定量为体外细胞毒性研究所制备的乳剂。
所有Taxane_Prodrug.M方法显示前一次进样的乳剂成分残留到下一次进样。该残留的部分与ART-207峰共洗脱。样品间的缓冲液空白稍有帮助。使用100μL50/50氯仿/甲醇进样的3分钟柱冲洗方法显著降低了残留。用于MTD研究的无药物制剂的分析显示所分析样品中不存在药物，这是使用以上分析方法不可能证明的。由于乳剂具有与ART-207同时洗脱的峰，因此减去空白(Blanksubtractions)是不适合的。
建立了解决乳剂成分残留问题的新方法。较高的柱温(55℃对40℃)可以帮助更好地液化和溶解乳剂颗粒，从而使它们能够在柱冲洗中从柱上洗掉。梯度以较高乙腈浓度开始，并且梯度较缓以分辨任何杂质。可以在结果的“低于检测限”声明中自信地进行无药物乳剂分析。
用于定量脂质乳剂中ART-207的HPLC分析方法为TAXANETEST.M,Rev.0，其在Agilent1100四元泵和单波长系统上进行。色谱柱为Phenomenex4.6×50mmLuna5μC18(2)100A，部件号00B-4252-E0。方法条件为：流速：1.5ml/分钟，检测：230nm，柱温：55℃和进样体积：1μL。梯度表如下所示：
在该方法中，ART-207的典型保留时间为±5.8分钟。脂质乳剂样品制备为将1部分乳剂加入到9部分异丙醇中(1:10)。在类似的乙腈/水C18方法中，响应线性度在0.6至5.2mg/mL，对ART-207显示为R2＝0.9997。使用从外标计算获得的响应因数完成定量。下表中显示了数据。在对于该MTD研究的脂质乳剂制备期间，观察并研究了ART-207浓度不可解释的波动。使用溶于1mL溶剂的约1mgART-207制备外标。当将外标制剂更换为溶于100mL溶剂的100mgART-207时(TaxaneTest.M,Rev.1)，改善了准确性和一致性。TaxaneTest.M,Rev.1方法用于再次确定和修正制备用于MTD研究的乳剂中ART-207的浓度。下表显示了初始报告值(TaxaneTest.M,Rev.0)和更准确的再次确定值(TaxaneTest.M,Rev.1)。
2013年3月11日，将进样体积从1μL提高至3μL以降低进样间差异对用于确定响应因数的标准品面积计数以及样品面积计数的影响，TaxaneTest.M,Rev.2。
在ART-207的分析定量中使用定标外标(Bracketingexternalstandards)和样品的重复分析，并在标准操作程序-ART005，配制的ART-20的7HPLC分析，TaxaneTest.M,Rev.3中进行限定。
287的分析定量(批次#ISI-30052013-1)。
将TaxaneTest.M,Rev3”分析方法用于LDL样脂质乳剂纳米颗粒中ART287浓度的定量。在如下所述的实验中，将所得乳剂通过无菌0.22um过滤不会显著影响ART-207的含量。所有制备的粗悬浮液的颗粒尺寸总是处于400-800nm的范围，并且在MF处理期间，不会影响颗粒尺寸降低率。除非另外指明，否则MF处理体积为100ml。对于所有以下所述的实施例，还参见主表1、2和3。
实验1.使用原始制剂制备无药物脂质乳剂。
研究了不连续通过与循环模式(材料返回到供料槽)和受控(≤60℃)ICJ温度对颗粒尺寸的影响。
表1a.制剂组成。
表1b.主要制剂成分的比率。
TG/ART-207 PC/ART-207 PC/TG FC/CE
N/A N/A 1.88 1.35
制备并MF处理了粗悬浮液(批次#002.103.1)。
表1c.所得乳剂的粒径、ART-207含量和颗粒稳定性。
MFP。图1显示在40次不连续通过(等于处理20分钟，一次不连续通过为～30秒)后，颗粒尺寸达到55-60nm的稳定水平。在80次通过后，停止MFP并过滤材料。在0.22μm过滤后，颗粒尺寸从55稍微提高至63nm。相对于先前研究中产生的脂质制剂，通过在～60-65℃(IC夹套的温度)的不连续通过处理不会导致颗粒尺寸的改善。
颗粒尺寸分析和稳定性。所得乳剂是不稳定的。在图2和表1c中，在36天内，颗粒尺寸从63提高至79nm。
实验2.使用原始制剂制备无药物脂质乳剂。
研究较低(<30℃)ICJ温度对所得颗粒尺寸的影响(即IC夹套“局部”冷却的影响)。
表2a.制剂组成。
表2b.主要制剂成分的比率。
TG/ART-207 PC/ART-207 PC/TG FC/CE
N/A N/A 1.87 1.34
制备并MF处理了粗乳剂(批次#002.104.1)。以循环模式进行MF处理。
表2c.所得乳剂的颗粒尺寸、ART-207含量和颗粒稳定性。
2a.将冰块放置在IC夹套周围。MF处理10分钟后，颗粒尺寸从439nm(粗乳剂)降低至66nm，并且在20分钟，它达到～58nm的稳定水平。再处理30min没有降低颗粒尺寸(图3)。
2b.为了实现冷却剂与IC更好的接触并且为了进一步降低其温度，从下层托盘中除去冰并使用设置为10℃的乙二醇浴将相互作用室(具有环绕管道和背压室)浸没在10℃的乙二醇中。这些冷却条件允许颗粒尺寸进一步降低至43nm(图3)。
无药物制剂的颗粒尺寸分析。在图4、表1c和2c中，与60℃的处理相比，在<30℃温度处理后，所得颗粒尺寸显著较小。两种处理条件导致不稳定的颗粒。在批次#002.103.1和002.104.1中分别观察到了63至79和45至82nm的颗粒尺寸增加。
实验3.使用原始制剂的含ART-207的脂质乳剂的制备。研究原始制剂的ART-207(批次#AW-001-243)掺入量和ART-207对颗粒尺寸和稳定性的影响。
表3a.制剂组成。
表3b.主要制剂成分的比率。
TG/ART-207 PC/ART-207 PC/TG FC/CE
3.58 6.80 1.90 1.30
制备并MF处理了粗悬浮液(批次#002.105.1)。
表3c.所得乳剂的颗粒尺寸、ART-207含量和颗粒稳定性。
MFP。在图5中，在10-20℃处理30min后，颗粒尺寸达到～130nm的稳定水平或阻力(resistance)(阻力1-R1)。将温度升高至50-60℃导致颗粒尺寸降低至100nm并达到R2。将温度降低回到10-20℃导致颗粒尺寸进一步降低至77nm。停止MFP并过滤材料。过滤后观察到颗粒尺寸从77稍微提高至82nm。
HPLC分析。通过HPLC(Taxane_Prodrug.M)测定的所得乳剂中的ART-207含量为3.14mg/ml。数据表明98％用于制备该制剂的药物引入到了脂质颗粒中(表3c)。
含ART-207的制剂的颗粒尺寸分析。所得含ART-207的乳剂是不稳定的。图6和表3c显示在35天内颗粒尺寸从82nm增加至196nm。
向制剂加入ART-207显著降低了所得乳剂的稳定性。
实验4.含有ART-207(批次#AW-001-243)的脂质乳剂的制备。研究了提高磷脂含量和降低FC/CE比率同时保持TC的量不变(表4b和4a)对药物掺入量和所得纳米颗粒的稳定性的影响。
表4a.制剂组成。
表4b.主要制剂成分的比率。
TG/ART-207 PC/ART-207 PC/TG FC/CE
2.16 6.42 2.98 0.20
制备并MF处理了粗悬浮液(批次#002.108.1)。
表4c.所得乳剂的颗粒尺寸、ART-207含量和颗粒稳定性。
MFP。在图7中，在～60℃处理40min后，颗粒尺寸达到～125nm的R1。将温度降低至～20℃导致颗粒尺寸降低至80nm并达到R2。将温度升高至50℃导致颗粒尺寸增加到～108nm。停止MFP并过滤。过滤后观察到颗粒尺寸从108nm增加至129nm。
HPLC分析。通过HPLC(Taxane_Prodrug.M)测定的所得乳剂中的ART-207含量为4.81mg/ml。数据表明74％用于制备该制剂的药物引入到了脂质颗粒(表4c)。含ART-207的制剂的颗粒尺寸分析。所得含ART-207的乳剂是不稳定的。在图8和表4c中，在14天内颗粒尺寸从129nm增加至184nm。
增加的磷脂含量和降低的FC/CE比率导致更高的ART-207颗粒含量，但是不会改善所得乳剂的稳定性。
实验5.含有ART-207(批次#AW-001-243)的脂质乳剂的制备。
研究进一步提高磷脂浓度和降低CE对药物掺入量以及所得纳米颗粒的稳定性的影响；和B.为了优化温度控制策略：在实验#4中将温度从20℃升高至60℃导致颗粒尺寸不希望的增加。
表5a.制剂组成。
表5b.主要制剂成分的比率。
TG/ART-207 PC/ART-207 PC/TG FC/CE
2.16 7.75 3.60 0.33
制备并MF处理了粗悬浮液(批次#002.109.1)。
表5c.所得乳剂的颗粒尺寸、ART-207含量和颗粒稳定性。
MFP。在图9中，在～60℃处理30min后，颗粒尺寸达到～105nm的R1。将温度降低至～20℃导致将颗粒尺寸降低至73nm并达到R2。停止MFP并过滤。过滤后，未观察到颗粒尺寸增加。
HPLC分析。通过HPLC(Taxane_Prodrug.M)测定的所得乳剂中的ART-207含量为5.5mg/ml。数据表明85％用于制备该制剂的药物引入到了脂质颗粒中(表5c)。颗粒的所得药物含量高于之前的实验，这表明涂层材料(磷脂)的增加有利于药物掺入(参见表3a、3c、4a和4c)。
含ART-207的制剂的颗粒尺寸分析。尽管与之前实验(表4c)相比，所得颗粒尺寸显著较小(表5c)，但是该乳剂极其不稳定。在图10和表5c中，在14天内颗粒尺寸从74nm增加至149nm，并且在33天内从74nm增加至169nm。
进一步提高磷脂和降低CE以及随后降低TC含量导致较小的颗粒和更高(相对于以上实验#4)的制剂掺入ART-207的量，但是不改善所得乳剂的稳定性。重复该实验提供了类似的结果，其表明处理参数是可重复的并且提供了可重复的结果。
实验6.含有ART-207(批次#AW-001-243)的脂质乳剂的制备。提高ART-207含量导致所得颗粒稳定性的降低，实施实验#6以确定降低ART-207浓度对颗粒尺寸和稳定性的影响。
表6a.制剂组成。
表6b.主要制剂成分的比率。
TG/ART-207 PC/ART-207 PC/TG FC/CE
6.54 24.27 3.71 0.33
制备并MF处理了粗悬浮液(批次#002.111.1)。
表6c.所得乳剂的颗粒尺寸、ART-207含量和颗粒稳定性。
MFP。在图11中，在～60℃处理20分钟后，颗粒尺寸达到～66nm的R1。将温度降低至～20℃导致将颗粒尺寸降低至42nm。停止MFP并过滤。过滤后观察到颗粒尺寸从42nm增加至47nm。
HPLC分析。通过HPLC(Taxane_Prodrug.M)测定的所得乳剂中的ART-207含量为1.86mg/ml。数据表明87％用于制备该制剂的药物引入到了脂质颗粒中(表6c)。含ART-207的制剂的颗粒尺寸分析。相对于之前的制剂，所得的含ART-207的乳剂更稳定。在图12和表6c中，在24天内颗粒尺寸从47nm增加至66nm。
降低ART-207并维持高磷脂含量(表6a和b)导致：a)与先前在实验#5中达到的尺寸相比，显著较小的颗粒尺寸(还参见表5a、b、c和6a、b、c)，和b)更稳定的颗粒(相对于之前实验所获得的乳剂)。
实验7.含有ART-207(批次#AW-001-243)的脂质乳剂的制备。
降低甘油三酯含量对ART-207掺入、颗粒尺寸和稳定性的影响。
表7a.制剂组成。
表7b.主要制剂成分的比率。
TG/ART-207 PC/ART-207 PC/TG FC/CE23 -->
1.01 9.10 9.05 0.46
制备并MF处理了粗悬浮液(批次#002.111.2)。
表7c.所得乳剂的颗粒尺寸、ART-207含量和颗粒稳定性。
MFP。在图13中，在～60℃处理20分钟后，颗粒尺寸达到～105nm的R1。将温度降低至～20℃并进一步降低至10℃导致颗粒尺寸从105nm进一步增加至118nm并达到R2。将温度提高回到50-60℃导致颗粒尺寸降低至90nm并达到94nm的下一个阻力点(失跌点，resistancepoint)。在～25℃额外处理30min，颗粒尺寸从94nm降低至84nm。停止MFP并过滤。过滤后观察到颗粒尺寸从84nm降低至66nm。
HPLC分析。通过HPLC(Taxane_Prodrug.M)测定的所得乳剂中的ART-207含量为3.88mg/ml。数据表明60％用于制备该制剂的药物引入到了脂质颗粒(表7c)。颗粒的ART-207掺入量随甘油三酯含量的降低而降低。含ART-207的制剂的颗粒尺寸分析。与实验#3-6中处理的具有更高甘油三酯的制剂相比，含ART-207的乳剂更稳定。在图14和表7c中，在38天内，颗粒尺寸未从66nm增加至75nm。对于下一个30天(总计68天)，颗粒尺寸提高至92nm。
因此，降低甘油三酯含量并维持高磷脂含量导致了显著小并且相当稳定的颗粒。低甘油三酯乳剂的ART-207掺入量显著降低。磷脂的提高导致较小的颗粒和提高的ART-207含量；磷脂的提高不会改善颗粒稳定性；ART-207含量的降低导致颗粒尺寸的减小和稳定性的改善；TG含量的减少以及因此TG/ART-207比率从～2降低至1导致颗粒尺寸降低、稳定性改善，但是制剂的ART-207掺入量较低。
TG/ART-207比率似乎是决定制剂ART-207掺入量的重要前提；较高的TG/ART-207比率导致制剂ART-207掺入量提高，但是损害了颗粒稳定性，而较低的比率导致改善的制剂稳定性但降低了ART-207掺入量。存在至少两种可能的优化ART-207掺入、颗粒尺寸和乳剂制剂稳定性的途径：优化主要制剂成分的比率。
实验8.含有ART-207(批次#AW-001-243)的乳剂的制备。
研究泊洛沙姆P188(1％v/w)加入对ART-207掺入、颗粒尺寸和稳定性的影响。泊洛沙姆是非离子聚(环氧乙烷)(PEO)-聚(环氧丙烷)(PPO)共聚物。泊洛沙姆在临床应用中广泛使用(1)。P188插入脂质单层并密封膜的能力(2)表明它们可能通过降低表面张力在改善脂质颗粒稳定性中是有用的。纳米颗粒的P188涂层降低了它们通过血清蛋白和巨噬细胞吸收的调理素作用(3)，这对体内应用是特别相关的。P188对该应用最相关的特征之一是脂质纳米颗粒的P188涂层不会防止载脂蛋白E的结合(4)。
参考文献：
1.HiteshR.Pateletal.“Poloxamers:Apharmaceuticalexcipientwiththerapeuticbehaviors”.2009.InternationalJournalofPharmTechResearch,Vol.1,No.2,pp299-303.2.GuohuiWuetal.“InteractionbetweenLipidMonolayersandPoloxamer188:AnX-RayReflectivityandDiffractionStudy”.2005.BiophysicalJournalVolume89November20053159–3173.3.Zhang,Wen-lietal.“StealthtanshinoneIIA-loadedsolidlipidnanoparticles:effectsofpoloxamer188coatingoninvitrophagocytosisandinvivopharmacokineticsinrats”.2009.ActaPharmSin,44:1421-1428.4.ParagAggarwaletal.“Nanoparticleinteractionwithplasmaproteinsasitrelatestoparticlebiodistribution,biocompatibilityandtherapeuticefficacy”.2009.AdvancedDrugDeliveryReviews61,428–437.
表8a.制剂组成。
表8b.主要制剂成分的比率。
TG/ART-207 PC/ART-207 PC/TG FC/CE
2.15 7.91 3.69 0.33
制备并MF处理了粗悬浮液(批次#002.116.1)。
表8c.所得乳剂的颗粒尺寸、ART-207含量和颗粒稳定性。
MFP。在图15中，在～60℃处理30分钟后，颗粒尺寸达到～60nm。此时，将温度降低至～20℃以确定是否可以在较低的温度进一步有利于颗粒尺寸的降低。额外处理20分钟导致颗粒尺寸从60nm显著增加至73nm。将温度提高回到～60℃导致颗粒尺寸降低至56nm并达到阻力点(R2)。停止MFP并过滤。过滤后观察到颗粒尺寸从56nm增加至62nm。
HPLC分析。通过HPLC(Taxane_Prodrug.M)测定的所得乳剂中的ART-207含量为6.07mg/ml。数据表明93.7％用于制备该制剂的药物引入到了脂质颗粒中(8c)。含ART-207的制剂的颗粒尺寸分析。所得含ART-207的乳剂是不稳定的。在图16和表8c中，仅四天后颗粒尺寸从62nm增加至146nm。
加入1％(v/w)的P188对所得乳剂具有去稳定影响。制备脂质基无药物和含ART-207的制剂用于最大耐受量(MTD)研究。
实验9.无药物脂质乳剂的制备。
表9a.制剂组成。
表9b.主要制剂成分的比率。
TG/ART-207 PC/ART-207 PC/TG FC/CE
N/A N/A 3.75 0.33
制备并MF处理了粗悬浮液(批次#002.118.0)。
表9c.所得乳剂的颗粒尺寸、ART-207含量和颗粒稳定性。
MFP。在图17中，在～60℃处理35分钟后，颗粒尺寸达到45nm。停止MFP并过滤材料。过滤后观察到颗粒尺寸从45nm增加至47nm。
HPLC分析。通过HPLC(Taxane_Prodrug.M)测定的所得乳剂中的ART-207含量低于检测限。
无药物制剂的颗粒尺寸分析。所得乳剂稳定至少13天。在图18和表9c中，颗粒尺寸持续13天不增加。对于随后的47天(总计60天)，颗粒尺寸增加至79nm(图18和表9c)。
数据显示无药物的含高PC和TG的制剂的处理导致小且相对稳定的颗粒。
实验10.含有ART-207(批次#AW-001-243)的脂质乳剂的制备。生产含ART-207的乳剂用于最大耐受量研究。
表10a.制剂组成。
表10b.主要制剂成分的比率。
TG/ART-207 PC/ART-207 PC/TG FC/CE
2.07 7.73 3.74 0.33
制备并MF处理了150ml粗悬浮液(批次#002.119.4)。
表10c.所得乳剂的颗粒尺寸、ART-207含量和颗粒稳定性。
MFP。在图19中，在～60℃处理45min后，颗粒尺寸达到～106nm的R1。将温度降低至～20℃导致颗粒尺寸降低至72nm。停止MFP并过滤。过滤后观察到颗粒尺寸从72nm增加至78nm。
HPLC分析。通过HPLC(Taxane_Test.M,Rev0)测定的所得乳剂中的ART-207含量为6.13mg/ml。数据表明91％用于制备该制剂的药物引入到了脂质颗粒(表10c)。含ART-207的制剂的颗粒尺寸分析。所得含ART-207的乳剂是不稳定的。在图20和表10c中，在22天内颗粒尺寸从78nm增加至218nm。
该实验的结果类似于实验#5的结果，其表明：a)粗乳剂制备和处理的一致性，和b)对含ART-207的制剂仍未解决的稳定性问题。ART-207的目标剂量。配制用于MTD研究的ART-207的计划剂量如下所示：64.4、46、34和22mg/kg(mpk)。通过静脉内(iv)注射向小鼠施用所有测试制品。表11a显示了实现计划剂量的注射体积。
表11a.ART-207含量、计划剂量和注射体积。
制备稀释乳剂以实现ART-207的目标浓度。配制用于MTD研究的ART-207的计算目标浓度如下所示：6.13、4.38、3.22和2.11mg/ml。为了实现ART-207的4.38、3.22和2.11mg/ml的目标浓度，用乙酸缓冲盐水(pH5.5)将通过HPLC(Taxane_Test.M,Rev0)测定的批次#002-119-4的乳剂(6.13mg/mlART-207)分别稀释1.4、1.9和2.9倍至计算浓度：4.38mg/ml(批次#002-119-3)、3.22mg/ml(批次#002-119-2)和2.11mg/ml(批次#002-119-1)。将所有制剂过滤并通过HPLC分析未稀释批次及其稀释获得制剂的ART-207含量(表11b)。
表11b.
DF*-稀释系数，TSPM**-总固体预混合物。
将起始批次#002-119-4(6.13mg/mlART-207)稀释至ART-207的目标浓度将导致后续所得批次002-119-3、002-119-2和002-119-1中脂质含量的降低。“稀释对独立制剂”基于以下基本原则：a)使用相同脂质配方的不同浓度ART-207的独立制剂产生具有显著不同的颗粒尺寸的乳剂，而稀释不影响颗粒尺寸(表11d)；该方法提供了引入到类似大小颗粒中的ART-207的目标浓度，和b)如果发生脂质毒性作用，则通过系列中具有最高脂质含量的载体对照来很好地表示，并且该对照与批次#002-119-4(6.13mg/mlART-207)的脂质含量相同(表11c)。
表11c.
DF*-稀释系数，TSPM**-总固体预混合物；REM***-所得乳剂
表11d.所得乳剂制剂的颗粒尺寸。
DF*-稀释系数，TSPM**-总固体预混合物；REM***-所得乳剂
将约20ml的以下批次运送到研究地点：批次#002-118-00，无药物制剂(载体对照)；批次#002-119-4，配制的ART-207(6.13mg/ml)；批次#002-119-3，配制的ART-207(3.98mg/ml)；批次#002-119-2，配制的ART-207(3.02mg/ml)；批次#002-119-1，配制的ART-207(2.01mg/ml)。每个批次保留10ml样品。乳剂制剂中ART-207的定量导致获得了改善的“Taxane_Test.M,Rev1”方法(参见上文“分析建立”节)。表11f显示了运送的样品中修正的ART-207浓度。表11f显示在所有测试批次中，通过Taxane_Test.M,Rev1方法测定的ART-207的浓度显著更高。
表11f.
在2013年1月22日至2013年1月26日进行动物治疗。表11g中显示了动物研究中使用的2013年2月9日修正的剂量。
表11g.修正的ART-207剂量。
由两个主要阶段组成的MTD研究：
连续治疗5天(Q1Dx5)：通过静脉注射施用紫杉醇、配制的ART-207和载体对照(无药物制剂)；评估肿瘤大小和小鼠体重；评估生命体征；在治疗结束后，监控动物2周；评估肿瘤大小和小鼠体重；和评估生命体征。在治疗阶段结束后，将剂量施用乳剂溶液中剩余的材料运送回ArborTherapeutics。对MTD研究中使用的所有制剂评估ART-207含量。对运送回的材料的评估与保留材料一起进行。
表11h显示通过Taxane_Test.MRev.1方法评估的从MTD研究地点运送回的材料，并且在所有测试批次中保留的材料具有类似的药物含量。数据显示了配制的ART-207的良好稳定性以及在研究地点正确的材料处理。
表11h.
在其送达当天评估了MTD研究剩余的并且运送回Arbor的材料的颗粒尺寸。对运送回的材料的评估与保留材料一起进行。表13k提供了稳定性数据，并且这些数据反映了从第0天至MTD治疗阶段结束时对颗粒尺寸的监控。从研究地点运送回的乳剂的颗粒尺寸稍高于保留的材料。从第0天(生产日期)开始，载体对照的颗粒尺寸未变化。对含ART-207的颗粒观察到了尺寸的显著提高(表11i)。
表11i.
我们延长了对MTD研究中使用的乳剂颗粒尺寸的监控，包括从MTD研究地点运送回的和从生产当天开始保留23天的材料。图21显示在监控期间，载体对照的颗粒尺寸未改变，而对含ART-207的颗粒观察到尺寸显著增加。
尽管，当前的脂质制剂和处理技术使得能够引入目标量的药物并降低至可接受的颗粒尺寸，但是所得颗粒的稳定性仍有问题。对所有含药物脂质制剂均观察到了尺寸随时间的显著增加。配制的ART-207在MTD(ATL-1和2)研究中显示了有效性、选择性和没有明显的毒副作用(正式报告“当静脉内施用于非肿瘤和肿瘤无胸腺裸鼠时，配制的ART-207的耐受性评估(EVALUATIONOFTHETOLERABILITYOFFormulatedART-207WHENADMINISTEREDINTRAVENOUSLYTONONTUMOREDANDTUMOREDATHYMICNUDEMICE)”，SouthernResearchInstitute,Birmingham,AL35255-5305)。
当静脉内给予非肿瘤雌性无胸腺NCr-nu/nu小鼠和皮下植入人MDA-MB-231乳腺肿瘤异种移植的雌性无胸腺NCr-nu/nu小鼠(实验ATL-2)时，评估配制的ART-207的有效性和耐受性。作为对照化合物包括了紫杉醇。
肿瘤模型:
将来自体内传代的人MDA-MB-231乳腺肿瘤片段植入46只小鼠。在治疗开始当天植入肿瘤片段后的第13天，30只动物的个体肿瘤生长至108-600mg重(尺寸为108-600mm3)。将所选30只具有肿瘤的动物分成6个处理组，使得在第13天，所有组中的平均肿瘤重量彼此尽可能接近(平均肿瘤重量在305至313mg的范围内，肿瘤中值重量在245至294mg的范围内)。在治疗第一天(第1天)，研究ATL-1和ATL-2分别包括6个组，每组5只非肿瘤小鼠，总计30只小鼠。从第1天开始，静脉内(IV)给予所有治疗剂，每天1次，连续5天(Q1Dx5)。基于配制的ART-207分子量1219.6和紫杉醇分子量853.9，72.6、47.1、35.7和23.7mg/kg的配制的ART-207剂量分别是紫杉醇15mg/kg剂量的3.4x、2.2x、1.7x和1.1x摩尔当量。
实验ATL-1
分别以72.6、47.1、35.7和23.7mg/kg/注射的剂量，用配制的ART-207治疗组1-4中的动物，通过各个动物每天准确的体重向小鼠施用，并且注射体积为0.21mL/20g体重。用无药物制剂(注射体积0.21mL/20g体重)治疗组5中的动物(乳剂对照)。用15mg/kg/注射(注射体积0.1mL/10g体重)剂量的紫杉醇治疗组6中的动物。
实验ATL-2
分别以72.6、47.1、35.7和23.7mg/kg/注射的剂量，用配制的ART-207治疗组1-4中的动物，通过各个动物准确的体重向小鼠施用，并且注射体积为0.21mL/20g体重。用无药物制剂(注射体积0.21mL/20g体重)治疗组5中的动物(乳剂对照)。用15mg/kg/注射(注射体积0.1mL/10g体重)剂量的紫杉醇治疗组6中的动物。
实验ATL-1
用配制的ART-207的IV治疗是耐受的，无死亡。当分别以72.6、47.1、35.7和23.7mg/kg/注射的剂量给予配制的ART-207时，治疗导致最大平均体重降低1％(0.3g)、5％(1.1g)、1％(0.3g)和3％(0.6g)。在本实验中(测试的紫杉醇剂量的3.4x当量)，对配制的ART-207的最大耐受剂量(MTD，定义为治疗期间以及治疗结束14天内不引起死亡或大于20％体重降低的剂量)高于72.6mg/kg/注射。
在Q1Dx5计划表上乳剂对照的IV治疗(组5)是耐受的，无死亡或体重降低。在Q1Dx5计划表上以15mg/kg/注射剂量的紫杉醇IV治疗是耐受的，无死亡并且导致6％的最大平均体重降低(1.3-1.5g)。在本实验中，紫杉醇的MTD高于15mg/kg/注射。图22显示了所有组中实验过程中的平均体重变化。
图22。将小鼠分成6组(每组5只小鼠)。连续5天通过静脉内(iv)注射给予小鼠所有测试制品。组#5接受无药物脂质制剂(黑色虚线，空心正方形)，组1-4接受23.7、35.7、47.1和72.6mg/kg配制的ART-207(实心正方形)。组#6接受15mg/kg紫杉醇(蓝色虚线，空心圆)。曲线上每个点表示评估当天每个Rx和载体治疗组的小鼠平均体重。组平均截止值为每组2只动物。在图中，将第13天定义为第0天或第一次治疗日。
实验ATL-2
在乳剂对照组(组5)中，所有5只小鼠中人MDA-MB-231乳腺肿瘤异种移植物逐渐生长。动物体重增加。然而，研究过程中对肿瘤重量修正的小鼠体重未显著改变(图23)。由于肿瘤溃疡，在第26天对1只动物(动物1)安乐死。
以Q1Dx5计划表上72.6、47.1、35.7和23.7mg/kg/注射的剂量(分别为组1-4)，用配制的ART-207IV治疗是耐受的，无死亡。在第26天和28天观察到以72.6mg/kg/注射的剂量给予配制的ART-207导致4％(0.9g)的最大平均体重降低。在实验过程中，用3个较低剂量配制的ART-207治疗的组中动物体重增加。值得提及的是研究过程中对肿瘤重量修正的小鼠体重未显著改变(图23)。本实验中，配制的ART-207的MTD高于72.6mg/kg/注射(测试紫杉醇剂量的3.4x当量)。
用配制的ART-207治疗对肿瘤生长抑制是非常有效的。用所有4个测试剂量给予配制的ART-207导致人MDA-MB-231乳腺肿瘤异种移植生长的剂量依赖性、统计学显著性抑制。用72.6mg/kg/注射的剂量治疗产生了两个完全肿瘤消退，其中一只动物在研究结束当天(第47天)仍保持无肿瘤。当比较各个动物达到两倍肿瘤质量倍增的时间时，肿瘤生长在统计学上不同于乳剂对照组中肿瘤的生长(还参见正式SRI报告)。在治疗结束后，肿瘤生长继续被抑制。在用72.6mg/kg/注射的剂量治疗的组中，5个肿瘤中有3个继续消退直至研究结束，而其余组中的肿瘤以剂量响应方式在治疗后的不同时间开始再次生长，更高的剂量使再次生长的时间延长的更长。
使用Q1Dx5计划表上15mg/kg/注射的剂量的紫杉醇的IV治疗(组6)是毒性的，导致5只动物中2只死亡(两只均在第19天发生死亡)，并且由于垂死，将另外两只动物安乐死(第20和21天)。在最后一次治疗当天(第17天)，治疗导致平均体重降低1％(0.3g)，但是在死亡前个体动物体重降低更多。在本实验中，紫杉醇的MTD低于15mg/kg/注射。存活动物的肿瘤响应治疗并且重量从第13天的180mg消退至第47天的32mg。图23中图示了所有组中在实验期间的平均体重变化。
图23。将小鼠分成6组(每组5只小鼠)。连续5天通过静脉内(iv)注射给予小鼠所有测试制品。组#5接受无药物脂质制剂(黑色虚线，空心正方形)，组1-4接受23.7、35.7、47.1和72.6mg/kg配制的ART-207(实心正方形)。组#6接受15mg/kg紫杉醇(蓝色虚线，空心圆)。曲线上每个点表示评估当天每个Rx和载体治疗组的小鼠平均体重。对肿瘤重量修正肿瘤小鼠体重。组平均截止值为每组2只动物。在图中，将第13天定义为第0天或第一次治疗日。
在图24中，以平均肿瘤重量变化图示了SC植入人MDA-MB-231乳腺肿瘤异种移植对使用配制的ART-207、乳剂对照和紫杉醇治疗的反应。
图24。将小鼠分成6组(每组5只小鼠)。连续5天通过静脉内(iv)注射给予小鼠所有测试制品。组#5接受无药物脂质制剂(黑色虚线，空心正方形)，组1-4接受23.7、35.7、47.1和72.6mg/kg配制的ART-207(实心正方形)。组#6接受15mg/kg紫杉醇(蓝色虚线，空心圆)。“第0天”(虚线)表示在治疗第1天评估的所有组的平均肿瘤重量。曲线上每个点表示相应评估日每个Rx和载体治疗组的平均肿瘤重量。组平均截止值为每组2只动物。在图中，将第13天定义为第0天或第一次治疗日。
动物存活(图25)。在用紫杉醇处理的组中，由于药物明显的毒性，5只动物中有4只在第11天前死亡。在载体治疗组中，由于肿瘤尺寸极大，因此必须在第18天将4只动物安乐死。在用最低(23.7mpk)剂量配制的ART-207治疗的组中，由于肿瘤较大，将4只动物安乐死，但是在第30天进行。用35.7、47.1和72.6mpk的ART-207治疗的动物存活并且活跃，在整个研究过程中，与计量施用紫杉醇的动物相比，未观察到体重减轻。72.6mpkART-207组中的一些小鼠在计量施用后的11天肿瘤消失，并且保持无肿瘤直至研究结束(图25)。
图25。将小鼠分成6组(每组5只小鼠)。从第0天开始，连续5天通过静脉内(iv)注射给予小鼠所有测试制品。组#5接受无药物脂质制剂(黑色虚线，空心正方形)，组1-4接受23.7、35.7、47.1和72.6mg/kg配制的ART-207(实心正方形)。组#6接受15mg/kg紫杉醇(蓝色虚线，空心圆)。本原理循证体内研究的结果表明了我们的化合物的靶向递送和效力，并且无明显毒副作用。这是在本研究中未达到最大耐受剂量的主要原因。
实验12.含有ART-207(批次#AW-001-243)的乳剂的制备。
测试加入的P188(0.25％，v/w)对颗粒尺寸和稳定性的影响。将P188加入先前处理的乳剂批次#002.121.4(参见主表3)至最终浓度0.25％(V/W)，同时在磁力搅拌板上搅拌。在微射流机中进一步处理混合物。
表12a.制剂组成。
表12b.主要制剂成分的比率。
TG/ART-207 PC/ART-207 PC/TG FC/CE
2.07 7.72 3.72 0.33
制备并MF处理了粗悬浮液(批次#002.122.0)。
表12c.所得颗粒尺寸、ART-207含量和颗粒稳定性。
MFP。在图26中，在～60℃处理30min后，颗粒尺寸达到～71nm的R1。停止MFP并无菌过滤材料。过滤后观察到颗粒尺寸从71nm增加至80nm。
HPLC分析。通过HPLC(Taxane_Test.M,Rev0)测定的所得乳剂中的ART-207含量为5.63mg/ml。这些数据表明83.9％用于制备该制剂的药物引入到了脂质颗粒(表12c)。所得乳剂中较低的ART-207浓度可以由额外的MF处理以及处理前用于平衡MF的缓冲液的可能稀释。含ART-207的制剂的颗粒尺寸分析。所得含ART-207的乳剂是不稳定的。图27和表12c显示在57天内颗粒尺寸从80nm增加至197nm。
结果表明在后粗乳剂步骤加入0.25％的P188不会改善所得制剂的稳定性。
实验13.含有ART-207(批次#AW-001-243)的乳剂的制备。测试P188(0.25％，V/W)、降低的TG/ART-207比率以及进一步降低CE并随后降低TC对所得颗粒尺寸和稳定性的影响。将P188加入至TSPM。
表13a.制剂组成。
表13b.主要制剂成分的比率。
TG/ART-207 PC/ART-207 PC/TG FC/CE
1.00 10.17 10.15 0.47
制备并MF处理了粗悬浮液(批次#002.123.11)。
表13c.所得颗粒尺寸、ART-207含量和颗粒稳定性。
MFP。在图28中，在～60℃处理20分钟后，颗粒尺寸达到～68nm的R1。停止MFP，收集并过滤样品(表13c)。过滤不影响颗粒尺寸。将剩余材料在～20℃进一步处理10min(图28)。这导致颗粒尺寸降低至64nm并且将其视为R2。停止MFP，收集并过滤样品(表13c)。过滤导致颗粒尺寸显著降低至57nm。将温度升高至60℃并将剩余材料处理20min。进一步处理导致颗粒尺寸增至66nm并达到R3。停止MFP，收集并过滤剩余材料(表13c)。过滤后，未观察到尺寸显著增加。
HPLC分析。仅测定了乳剂批次#002.123.13(Taxane_Test.M,Rev0)中的ART-207含量，并且该含量等于3.71mg/ml。数据显示74.2％用于制备该制剂的药物引入到了脂质颗粒(表13c)。含ART-207的制剂的颗粒尺寸分析。图29和表13c显示56天内，批次#002.123.11的颗粒尺寸从68nm增加至73nm，并且56天内批次#002.123.13从69nm增加到70nm。在30天内，乳剂批次#002.123.12的颗粒尺寸从57nm增加到67nm。a)通过降低TG含量降低TG/ART-207比率并随后升高PC/TG比率；b)降低CE并随后降低总胆固醇含量；和c)在TSPM步骤加入P188(0.25％，V/W)导致相当稳定的乳剂。不加P188时，TG/ART-207和PC/TG比率(实验#7)的类似操作导致产生了不稳定的乳剂。向具有较高的TG/ART-207和较低的PC/TG比率的TSPM加入P188(实验#8和12)也不能产生稳定的乳剂。
在图28和29中，在60℃终止MF处理(批次#002.123.11和002.123.13)导致产生了稳定的乳剂，其颗粒尺寸68-69nm，而20℃的终点(批次#002.123.12)导致产生了～57nm的开始较小的颗粒，但不久后其尺寸提高至～66nm并在该水平稳定。所得乳剂批次#002.123.13中测量的ART-207含量比用较高的TG/ART-207和较低的PC/TG比率(实验#4-5和10-12)的制剂(4.8-6.1mg/ml)显著更低(3.7mg/ml)。与实验#4-5和10-12中的制剂相反，在该实验(批次#002.123.13)中获得的所得材料极稳定。
ART-207可以对脂质颗粒具有去稳定作用，并因此批次#002.123.13中实现的稳定性是由于较低的药物含量。批次#002.123.13的稳定性与实验#3、6和7(具有类似或甚至更低的药物含量)获得的乳剂的稳定性的比较清楚地显示了当前材料改善的稳定性。
实验表明TG/ART-207和PC/TG比率、在TSPM步骤加入0.25％的P188和处理温度在决定所得乳剂制剂的稳定性中是重要的，但是显示这些操作导致了较低的药物掺入。为了实现脂质制剂的高药物含量和稳定性两者，可以考虑将TG/ART-207比率逐渐提高至高于1.0和加入短链磷脂。
实验14.含有ART-207(批次#AW-001-243)的乳剂的制备。
测试DMPC和降低的TG/ART-207比率对含P188制剂的ART-207掺入、所得颗粒尺寸和稳定性的影响。将DMPC加入至TSPM来代替质量相等的PC。
表14a.制剂组成。
表14b.主要制剂成分的比率。
TG/ART-207 PC/ART-207 PC/TG FC/CE
1.02 10.21 10.05 0.47
制备并MF处理了粗悬浮液(批次#002.125.2)。
表14c.所得颗粒尺寸、ART-207含量和颗粒稳定性。
MFP。在图30中，在～60℃处理10-20分钟后，颗粒尺寸达到～99nm的R1。将温度降低至～20℃。在较低温度进一步处理导致颗粒尺寸增加至～119nm(R2)。在处理60分钟后，将温度逐渐升高至～60℃导致颗粒尺寸降低至84nm并达到R3。收集并过滤样品(表14c)。过滤导致颗粒尺寸从84nm显著降低至67nm。为了研究P188浓度升高对处理和稳定性的影响，将P188加入至剩余材料至最终浓度0.5％(V/W)。在～60℃进一步处理30分钟不会导致颗粒尺寸变化。停止MFP，收集并过滤样品(还参见表14c)。过滤导致颗粒尺寸从83nm降低至66nm。
HPLC分析。仅测定乳剂批次#002.125.22(Taxane_Test.M,Rev0)中的ART-207含量，并且该含量等于3.97mg/ml。数据表明79％用于制备该制剂的药物引入到了脂质颗粒(表14c)。含ART-207的制剂的颗粒尺寸分析。在图31和表14c中，在54天内对批次#002.125.21或批次#002.125.22未观察到颗粒尺寸增加。
短链磷脂(DMPC)以及P188的加入和TG/ART-207比率的降低导致产生了稳定的乳剂。将P188提高至0.5％(V/W)不影响所得乳剂的稳定性。所得乳剂批次#002.123.22中测量的ART-207含量较高并且等于3.97mg/ml，相比之下在制剂中不加入DMPC的实验#13中观察到的为3.7mg/ml。
实验15。无药物乳剂的制备。研究P188对无药物高磷脂乳剂的颗粒尺寸和稳定性的影响。
表15a.制剂组成。
表15b.主要制剂成分的比率。
TG/ART-207 PC/ART-207 PC/TG FC/CE
N/A N/A 7.40 0.47
制备并MF处理了粗悬浮液(批次#002.131.2)。
表15c.所得乳剂的颗粒尺寸、ART-207含量和颗粒稳定性。
MFP。在图32中，在～60℃处理20分钟后，颗粒尺寸达到41nm。停止MFP并过滤。过滤后，未观察到颗粒尺寸变化。
HPLC分析。通过HPLC(Taxane_Test.M,Rev1)测定的所得乳剂中的ART-207含量低于检测限。无药物制剂的颗粒尺寸分析。所得乳剂稳定持续39天(图33和表15c)。在图33中，在前两天内，颗粒尺寸从42nm增加到45nm。从第3天至第39天，颗粒从45nm增加至49nm。
在前2-3天，对几乎所有制剂观察到初始颗粒尺寸的增加，并且可以反映在高压和通常不同于环境温度的处理后乳剂制剂的平衡和稳定。
实验16.含有ART-207(批次#AW-004-13)的乳剂的制备。
测试TG/ART-207比率逐渐升高(从1至1.35)对制剂的ART-207掺入、颗粒尺寸和稳定性的影响。
表16a.制剂组成。
表16b.主要制剂成分的比率。
TG/ART-207 PC/ART-207 PC/TG FC/CE
1.32 9.87 7.49 0.46
制备并MF处理了粗悬浮液(批次#002.134.2)。
表16c.所得颗粒尺寸、ART-207含量和颗粒稳定性。
MFP。在图34中，在～60℃处理30min后，颗粒尺寸达到～81nm的R1，并将温度降低至～20℃。在较低温度进一步处理导致颗粒尺寸增加至～84nm(R2)。在处理50分钟后，将温度升高至～60℃导致颗粒尺寸降低至76nm并达到R3。收集并过滤样品。过滤后，未观察到颗粒尺寸的变化。
HPLC分析。测定所得乳剂(Taxane_Test.M,Rev1)中的ART-207含量，并且该含量等于4.71mg/ml。数据表明89％用于制备该制剂的药物引入到了脂质颗粒(表16c)。含ART-207的制剂的颗粒尺寸分析。在图35中，在前2天，颗粒尺寸从76初始升高至82nm，而在随后的37天，颗粒尺寸无变化。
因此，将TG/ART-207比率从1增加至1.35导致制剂ART-207掺入量提高，同时不影响其稳定性。所得颗粒比较低TG/ART-207比率下形成的颗粒大。
实验17.含有ART-207(批次#AW-004-13)的乳剂的制备。
测试DMPC和TG/ART-207比率提高(从1至1.34)对所得乳剂的ART-207掺入、颗粒尺寸和稳定性的影响。将DMPC加入至TSPM来代替质量相等的PC。
表17a.制剂组成。
表17b.主要制剂成分的比率。
TG/ART-207 PC/ART-207 PC/TG FC/CE45 -->
1.34 10.05 7.49 0.46
制备并MF处理了粗悬浮液(批次#002.136.2)。
表17c.所得颗粒尺寸、ART-207含量和颗粒稳定性。
MFP。在图36中，在～60℃处理10分钟后，颗粒尺寸达到～70nm。停止MFP，收集并过滤样品(表17c)。无菌过滤后，观察到颗粒尺寸从70nm降低至58nm。尽管未达到第一阻力点(R1)，但是颗粒尺寸足够小以收集用于稳定性测定的样品。在60℃进一步处理剩余材料不会导致颗粒尺寸变化(R1)。将温度降低至～20℃。在较低的温度再处理30分钟不会导致颗粒尺寸变化(R2)。停止MFP，收集并过滤样品(参见表17c)。过滤导致颗粒尺寸从68nm显著降低至42nm。将温度升高至60℃并将剩余材料处理额外的20min。额外的处理导致颗粒尺寸从68nm降低至66nm并达到R3。停止MFP，收集并过滤剩余材料(表17c)。过滤后观察到颗粒尺寸从66nm降低至59nm。
HPLC分析。确定所得乳剂中ART-207含量(Taxane_Test.M,Rev1)，并且所述含量等于4.3mg/ml(批次#002.136.21)、4.22mg/ml(批次#002.136.22)和4.5mg/ml(批次#002.136.23)。数据表明81.9、80.4和85.7％的用于制备该制剂的药物分别掺入到了批次#002.136.21、002.136.22和002.136.23的脂质颗粒(表17c)。
含ART-207的制剂的颗粒尺寸分析。在图37中，在前2天，对批次#002.136.21和002.136.23观察到颗粒尺寸初始提高1-3nm后，在随后的34天，颗粒尺寸不变化。在储存前2天，乳剂批次#002.136.22的颗粒尺寸增加7nm，并且在34天内，从49nm增至55nm。所有所得乳剂可以表征为稳定的。
尽管相对于低温处理材料，高温处理导致产生了较大的颗粒，但是在～60℃处理的材料的稳定性高于～20℃处理的乳剂。在整个监控过程中，在60℃处理的批次#002.136.21和002.136.23明显更稳定，而在第1天，批次#002.136.22(在～20℃处理)的颗粒尺寸开始从42nm增加至53nm，并且仅在第10天稳定(图37)。相对于实验#16中所得的乳剂，TG/ART-207比率从1增加至1.34和DMPC的加入导致产生了较小的颗粒以及所得制剂基本相同的ART-207掺入量和稳定性。
实验18.无药物脂质乳剂的制备。
研究磷脂酰丝氨酸(PS)对无药物制剂的颗粒尺寸和稳定性的影响。PS可以用作制剂成分来代替DMPC和P188。
表18a.制剂组成。
表18b.主要制剂成分的比率。
TG/ART-207 PC/ART-207 PC/TG FC/CE
N/A N/A 3.95 0.47
制备并MF处理了粗悬浮液(批次#002.137.3)。
表18c.所得乳剂的颗粒尺寸、ART-207含量和颗粒稳定性。
MFP。在图38中，在～60℃处理20分钟后，颗粒尺寸达到49nm。停止MFP并过滤材料。过滤后，未观察到颗粒尺寸变化。
HPLC分析。通过HPLC(Taxane_Test.M,Rev1)测定的所得乳剂中的ART-207含量低于检测限。无药物制剂的颗粒尺寸分析。所得乳剂是稳定的。33天内，颗粒尺寸无显著增加(图39和表18c)。
实验19.含有ART-207(批次#AW-004-13)的脂质乳剂的制备。研究磷脂酰丝氨酸(PS)对含ART-207的制剂的颗粒尺寸和稳定性的影响。在实验#17中使用了P188和DMPC的组合以及较低的(1.34)TG/ART-207比率以实现所得乳剂的稳定性和目标颗粒尺寸。我们还将PS加入到不含P188和DMPC并且具有较高(2.7)TG/ART-207比率的TSPM中。
表19a.制剂组成。
表19b.主要制剂成分的比率。
TG/ART-207 PC/ART-207 PC/TG FC/CE
2.65 10.67 4.02 0.47
制备并MF处理了粗悬浮液(批次#002.137.4)。
表19c.所得乳剂的颗粒尺寸、ART-207含量和颗粒稳定性。
MFP。在图40中，在～60℃处理30min后，颗粒尺寸达到～86nm的R1。由于颗粒尺寸与目标相差较远，因此未收集样品，并将温度降低至～20℃。在～20℃进一步处理期间，观察到颗粒尺寸从86nm降低至50nm。停止MFP，收集并过滤样品(表19c)。过滤后，未观察到颗粒尺寸的变化。尽管未达到第一阻力点(R1)，但是颗粒尺寸足够小以收集用于稳定性测定的样品(R2)。将温度升高至60℃并将剩余材料再处理20分钟。颗粒尺寸从50nm增加至82nm并达到R3。停止MFP，收集并过滤样品(图43和表19c)。过滤后，未观察到颗粒尺寸的变化。将温度降低至～25℃并将剩余材料进一步处理20分钟导致颗粒尺寸从82nm降低至53nm并达到R4。停止MFP，收集并无菌过滤样品(图40和表19c)。过滤后，未观察到颗粒尺寸的变化。
HPLC分析。测定所有所得乳剂中ART-207含量(Taxane_Test.M,Rev1)，并且所述含量等于4.79mg/ml(批次#002.137.41)、5.01mg/ml(批次#002.137.42)和4.89mg/ml(批次#002.137.43)。数据表明91.2％、95.4％和93.1％的用于制备该制剂的药物分别掺入到了批次#002.137.41、002.137.42和002.137.43的脂质颗粒(表19c)。
含ART-207的制剂的颗粒尺寸分析。图41和表19c显示不考虑高ART-207掺入量，所有所得乳剂不稳定。33天后，在所有处理批次中颗粒尺寸增加。
尽管相对于低温处理，高温处理导致产生了较大的颗粒，但是在～60℃处理的材料的稳定性高于～20℃处理的乳剂。例如，在60℃处理的批次#002.137.42存储18天是相对稳定的，而批次#002.137.41和002.137.43从第1天开始颗粒尺寸增加(图41)。可能由于高(2.7)TG/ART-207比率，该含PS的制剂的药物掺入量较高。向高TG/ART-207比率的材料中加入2.5％(W/W)的带负电荷的PS不会改善所得乳剂的稳定性。
实验20.无药物乳剂的制备。研究P188、DMPC和低TG对无药物制剂的颗粒尺寸和稳定性的影响。
表20a.制剂组成。
表20b.主要制剂成分的比率。
TG/ART-207 PC/ART-207 PC/TG FC/CE
N/A N/A 7.53 0.47
制备并MF处理了粗悬浮液(批次#002.137.3)。
表20c.所得乳剂的颗粒尺寸、ART-207含量和颗粒稳定性。
MFP。图42显示～60℃处理20分钟后，颗粒尺寸达到39nm。停止MFP并过滤。过滤后，未观察到颗粒尺寸变化。
HPLC分析。通过HPLC(Taxane_Test.M,Rev1)测定的所得乳剂中的ART-207含量低于检测限。无药物制剂的颗粒尺寸分析。所得乳剂是稳定的。27天内，观察到颗粒尺寸从38nm不显著地增加至42.5nm(图43和表20c)。
实验21.含有ART-207(批次#AW-004-13)的乳剂的制备。重复实验#17以确认DMPC/P188和1.34的TG/ART-207比率对所得乳剂的ART-207掺入、颗粒尺寸和稳定性的有利影响。
表21a.制剂组成。
表21b.主要制剂成分的比率。
TG/ART-207 PC/ART-207 PC/TG FC/CE
1.33 10.08 7.55 0.47
制备并MF处理了粗悬浮液(批次#002.140.2)。
表21c.所得乳剂的颗粒尺寸、ART-207含量和颗粒稳定性。
MFP。在图44中，在～60℃处理20分钟后，颗粒尺寸达到～68nm的R1。停止MFP，收集并过滤样品(还参见表21c)。过滤后注意到颗粒尺寸从68nm降低至58nm。将温度降低至～23℃并将剩余材料再处理20分钟。这导致颗粒尺寸降低至65nm并达到R2。停止MFP，收集并过滤样品(图44和表21c)。过滤后注意到颗粒尺寸从65nm降低至46nm。然后，将温度升高到～60℃并将剩余材料进一步处理20分钟会导致颗粒尺寸增加至68nm并达到R3。停止MFP，收集并过滤样品(图44和表21c)。过滤后观察到颗粒尺寸从68nm降低至59nm。将温度降低至～20℃并将剩余材料再处理20分钟。这不会改变达到R4的颗粒尺寸。停止MFP，收集并过滤样品(图44和表21c)。过滤后，颗粒尺寸从67nm降低至49nm。
HPLC分析。测定所有所得乳剂中ART-207含量(Taxane_Test.M,Rev1)，并且所述含量等于4.42mg/ml(批次#002.140.21)、4.1mg/ml(批次#002.140.22)、4.5mg/ml(批次#002.140.23)和4.35mg/ml(批次#002.140.24)。数据表明84.2％、78.1％、85.7％和82.9％的用于制备该制剂的药物分别掺入到了批次002.140.21、002.140.22、002.140.23和002.140.24的脂质颗粒(表21c)。
含ART-207的制剂的颗粒尺寸分析。在图45中，在60℃处理的乳剂批次#002.140.21和002.140.23高度稳定。在批次#002.140.22和002.140.24中观察到了初始～5-7nm的颗粒尺寸增加(储存前5天)。到第6天，两批次稳定在～53-55nm。
相对于低温处理，高温处理导致产生了较大的颗粒，在～60℃处理的材料的稳定性高于～20℃处理的乳剂。就颗粒尺寸和稳定性而言，该结果类似于实验#17的结果。批次#002.140.2制剂的药物掺入量类似于具有类似TG/ART-207比率的其它实验中获得的结果。TG/ART-207比率的范围(～1.3-1.4)导致所得乳剂可重复的ART-207掺入量和稳定性。
制备用于效力和稳定性研究的无药物和含ART-207的制剂。
实验22.无药物乳剂-载体对照的制备。制备用于效力研究的无药物乳剂。
表22a.制剂组成。
表22b.主要制剂成分的比率。
TG/ART-207 PC/ART-207 PC/TG FC/CE
N/A N/A 7.74 0.47
制备并MF处理了粗悬浮液(批次#002.151.5)。
表22c.所得乳剂的颗粒尺寸、ART-207含量和颗粒稳定性。
MFP。在图46中，在～60℃处理20分钟后，颗粒尺寸达到41nm。停止MFP并过滤材料。过滤后观察到颗粒尺寸从41nm降低至37nm。
HPLC分析。通过HPLC(Taxane_Test.M,Rev2)测定的所得乳剂中的ART-207含量低于检测限。无药物制剂的颗粒尺寸分析。所得乳剂稳定持续33天。在图50中，颗粒尺寸持续33天保持不变。在接下来的9天(总计42天)，颗粒尺寸增至47nm(图47和表22c)。
实验23.含有ART-207(批次#AW-004-24)的乳剂的制备。
生产用于效力研究的含ART-207的乳剂制剂。
表23a.制剂组成。
表23b.主要制剂成分的比率。
TG/ART-207 PC/ART-207 PC/TG FC/CE
1.31 9.94 7.56 0.47
制备并MF处理了150ml粗悬浮液(批次#002.151.8)。
表23c.所得乳剂的颗粒尺寸、ART-207含量和颗粒稳定性。
MFP。在图48中，在～60℃处理30分钟后，颗粒尺寸达到78nm。在～60℃处理额外的30分钟不会显著降低颗粒尺寸并将其视为R2。将温度降低至20℃并处理额外45分钟。在20℃处理导致颗粒尺寸增加并视为R2。停止MFP并无菌过滤材料。过滤后观察到颗粒尺寸从76降低至61nm。
HPLC分析。通过HPLC(Taxane_Test.M,Rev2)测定的所得乳剂中的ART-207含量为5.26mg/ml。数据表明98.9％用于制备该制剂的药物掺入到了脂质颗粒(表23c)。含ART-207的制剂的颗粒尺寸分析。所得含ART-207的乳剂是稳定的。在图49和表23c中，颗粒尺寸在33天内不改变。在接下来的9天内(总计42天)，观察到～3.5-4nm的增加。
用MF处理具有比率为1.31的TG/ART-207的制剂导致产生稳定的乳剂，并且ART-207掺入量为98.9％。
实验24.制备含有ART-207(批次#AW-004-24)的储备乳剂用于效力研究。生产TG/ART-207比率提高至1.4的含ART-207的乳剂作为效力研究的候选。
表24a.制剂组成。
表24b.主要制剂成分的比率。
TG/ART-207 PC/ART-207 PC/TG FC/CE
1.39 10.67 7.66 0.47
制备并MF处理了130ml粗悬浮液(批次#002.153.1)。
表24c.所得乳剂的颗粒尺寸、ART-207含量和颗粒稳定性。
MFP。图50显示～60℃处理39分钟后，颗粒尺寸达到78nm。将温度降低至～20℃并将材料再处理39分钟。在20℃MF处理不会导致颗粒尺寸降低并将其视为R2。停止MFP并过滤。过滤后注意到颗粒尺寸从78nm降低至66nm。
HPLC分析。通过HPLC(Taxane_Test.M,Rev2)测定的所得乳剂中的ART-207含量为4.68mg/ml。数据表明93.5％用于制备该制剂的药物掺入到了脂质颗粒(表24c)。
含ART-207的制剂的颗粒尺寸分析。所得含ART-207的乳剂是稳定的。图51和表24c显示颗粒尺寸在41天内未显著改变。
MF处理具有比率为1.39的TG/ART-207的制剂导致产生了稳定的乳剂，并且ART-207掺入量为93.5％。
实验25.制备含有ART-207(批次#AW-004-24)的储备乳剂用于效力研究。生产TG/ART-207比率进一步提高至1.5的含ART-207的乳剂作为效力研究的候选。
表25a.制剂组成。
表25b.主要制剂成分的比率。
TG/ART-207 PC/ART-207 PC/TG FC/CE
1.47 11.54 7.85 0.47
制备并MF处理了130ml粗悬浮液(批次#002.153.2)。
表25c.所得乳剂的颗粒尺寸、ART-207含量和颗粒稳定性。
MFP。在图52中，在～60℃处理52分钟后，颗粒尺寸达到72nm。然后，将温度降低至20℃并将材料再处理26分钟。在20℃MF处理导致颗粒尺寸稍微降低至66nm并达到R2。停止MFP并无菌过滤材料。过滤后观察到颗粒尺寸从66nm降低至53nm。
HPLC分析。通过HPLC(Taxane_Test.M,Rev2)测定的所得乳剂中的ART-207含量为4.38mg/ml。92.2％用于制备该制剂的药物引入到了脂质颗粒(表25c)。含ART-207的制剂的颗粒尺寸分析。所得含ART-207的乳剂相当稳定。图53和表25c显示在49天内颗粒尺寸从53nm增加至62nm。
MF处理具有比率为1.47TG/ART-207的制剂混合物导致产生了稳定的乳剂，并且ART-207掺入量为92.2％。用于效力研究的乳剂的选择。基于颗粒尺寸(62nm)和ART-207含量(5.26mg/ml)，选择用于效力研究的含ART-207的乳剂批次#002.151.8。选择无药物乳剂批次#002.151.5作为效力研究的载体对照(表25a和25d)。
表25d.生产当天所得的乳剂。
颗粒尺寸、ART-207含量、总固体和脂质浓度(W/V)。
ART-207的目标剂量。配制用于效力研究的ART-207的计划剂量如下所示：105.2、78.9和52.6mg/kg(mpk)。通过静脉内(iv)注射向小鼠施用所有测试制品。实现计划剂量的注射体积如表25e所示。
表25e.ART-207含量、计划剂量和注射体积。
将约45ml的批次#002.151.5和～(≥)80ml的批次#002.151.8运送到研究地点：批次#002.151.5-无药物制剂(载体对照)；批次#002.151.8-配制的ART-207(5.26mg/ml)。每个批次保留～10ml样品。
效力研究由与以上对MTD研究所述的那些类似的两个主要阶段组成：治疗阶段结束后，将剩余材料运送回ArborTherapeutics。对效力研究中使用的所有制剂评估ART-207含量(taxane_test.m,Rev2)。对运送回的材料的评估与保留材料一起进行。表25e显示在所有测试批次中生产当天评估的材料、从研究地点运送回的材料和保留的材料具有类似的药物含量。数据显示了配制的ART-207的良好稳定性以及在研究地点正确的材料处理。
表25e.
评估了效力研究剩余的材料和运送回的材料的颗粒尺寸。对运送回的材料的评估与保留材料一起进行。表25f提供了稳定性数据，并且数据反映了42天内对颗粒尺寸的监控。从研究地点运送回的无药物乳剂的颗粒尺寸与保留材料的相同。从研究地点运送回的含ART-207的乳剂的颗粒尺寸比保留材料大10nm。
表25f.
我们延长了对效力研究中使用的乳剂颗粒尺寸的监控，包括从研究地点运送回的和在Arbor保留55天的材料。图54显示在该阶段内载体对照的颗粒尺寸未显著改变，而含ART-207的乳剂稳定持续42天。从第42天开始，对含ART-207的乳剂观察到了颗粒尺寸的增加。ART-207乳剂可能的细菌污染。(当由于处理而被污染时，先前监控的乳剂显示了颗粒尺寸类似的快速增加)。
不考虑从第42天开始对含ART-207的乳剂观察到的颗粒尺寸变化，运送到研究地点/从研究地点运送回的乳剂以及保留的样品在动物治疗阶段是稳定的。在生产日期后22天完成了用含ART-207的乳剂对动物的治疗。在研究ATL-3中，与紫杉醇治疗的动物相比，配制的ART-207明显地表明了类似或更高的肿瘤抑制效果，导致显著较少的重量减轻并且使动物存活率提高两倍(还参见正式报告“当静脉内施用于皮下植入人MDA-MB-231乳腺肿瘤异种移植的无胸腺裸鼠时，配制的ART-207的抗肿瘤效力评估(EVALUATIONOFTHEANTITUMOREFFICACYOFFORMAULTEDART-207WHENADMINISTEREDINTRAVENOUSLYTOATHYMICNUDEMICEIMPLANTEDSUBCUTANEOUSLYWITHHUMANMDA-MB-231MAMMARYTUMORXENOGRAFTS)”，SouthernResearchInstitute,Birmingham,AL35255-5305)。
实施实验ATL-3以评估当根据两种不同的时间表对皮下植入(SC)人MDA-MB-231乳腺肿瘤异种移植的雌性无胸腺NCr-nu/nu小鼠施用时，配制的ART-207的静脉内(IV)治疗的抗肿瘤活性。作为对照化合物包括了紫杉醇。
肿瘤模型：
将体内传代的人MDA-MB-231乳腺肿瘤片段植入158只小鼠。在治疗开始当天植入肿瘤片段后的第10天，90只动物的个体肿瘤生长至88-216mg重(大小88-216mm3)。将所选90只具有肿瘤的动物分成9个处理组，使得在第10天，所有组中的平均肿瘤重量彼此尽可能接近(平均肿瘤重量在147至154mg的范围内，肿瘤中值重量在144至153mg的范围内)。通过施用不同注射体积的5.26mg/mL的制剂实现不同的配制的ART-207剂量。基于配制的ART-207分子量1219.6和紫杉醇分子量853.9，105.2、78.9和52.6mg/kg的配制的ART-207剂量分别是紫杉醇15mg/kg剂量的4.9x、3.7x、2.5x摩尔当量。所示时间点从用配制的ART-207、载体对照和紫杉醇治疗的第1天开始。
研究设计：
研究由9组组成，每组10只小鼠，总计90只具有人MDA-MB-231乳腺肿瘤的小鼠，在治疗第1天(第0天)，对组1中的小鼠不处理，直至从第11天开始加入配制的ART-207治疗：在第11-15天，静脉内(IV)给予78.9mg/kg/注射的剂量的配制的ART-207，一天一次，连续5天(Q1Dx5)。用配制的ART-207治疗组2、3和4中的动物，从第0天开始(第0-4天)，根据Q1Dx5时间表分别以105.2、78.9和52.6mg/kg/注射的剂量IV施用配制的ART-207。根据Q1Dx5时间表，从第0天开始，用无药物制剂IV治疗组5中的动物(乳剂对照)。根据Q1Dx5时间表，从第0天开始，用15mg/kg/注射剂量的紫杉醇IV治疗组6中的动物。用配制的ART-207治疗组7中的动物，以78.9mg/kg/注射的剂量IV施用，每4天1次，总共注射3次(Q4Dx3)，从第0天开始(第0、4和8天)。根据Q4Dx3时间表，从第0天开始，用无药物制剂IV治疗组8中的动物(乳剂对照)。根据Q4Dx3时间表，从第0天开始，用18.9mg/kg/注射剂量的紫杉醇IV治疗组9中的动物。
Q1Dx5时间表，根据Q1Dx5时间表，以105.2mg/kg/注射的剂量用配制的ART-207IV治疗(组2)是致死的，导致10只动物中8只死亡(死亡发生在第5和6天)并且由于垂死，在第5天将另外1只动物安乐死。治疗与第4天观察到的8％的最大平均体重降低(1.9g)有关。组中唯一存活的小鼠在第56天无肿瘤(图55-57)。
根据Q1Dx5时间表，以78.9mg/kg/注射的剂量用配制的ART-207IV治疗(组3)是有毒的，导致10只动物中6只死亡(死亡发生在第5和6天)并且在第4天观察到7％的最大平均体重降低(1.5g)。通过配制的ART-207治疗抑制了4只存活小鼠的肿瘤生长，其中两只在第56天是无肿瘤的并且另外2只在第56天肿瘤重量为32-40mg(图55-57)。
根据Q1Dx5时间表，以52.6mg/kg/注射的剂量用配制的ART-207IV施用是耐受的，无死亡并且与第4天观察到的2％的最大平均体重降低(0.4g)有关。以52.6mg/kg/注射的剂量用配制的ART-207的治疗在抑制MDA-MB-231乳腺肿瘤异种移植的生长中是非常有效的。治疗产生了9例完全肿瘤消退，其中6只动物在第56天保持无肿瘤。当比较个体动物达到肿瘤质量加倍3倍的时间时，在以52.6mg/kg/注射的剂量用配制的ART-207治疗的组中，肿瘤的生长在统计学上不同于对照组中肿瘤的生长(组1对组4：P<0.001)(图55-57)。
根据Q1Dx5时间表，用乳剂对照的IV治疗(组5)是耐受的，无死亡或平均体重降低。中值肿瘤达到肿瘤质量加倍3倍为9.2天，并且在第11天重量达到1,680mg。当比较个体动物达到肿瘤质量加倍3倍的时间时，未处理的对照组和根据Q1Dx5时间表用乳剂对照处理的组中，肿瘤的生长在统计学上是不同的(组1对组5：P＝0.810)(图55-57)。
根据Q1Dx5时间表，以15mg/kg/注射的剂量用紫杉醇的IV治疗(组6)导致10只动物中1只死亡(死亡发生在第2天)。由于共济失调，在第12天将另外1只动物安乐死。治疗导致在第6天观察到10％的平均体重降低(2.2g)。以15mg/kg/注射的剂量用紫杉醇治疗在抑制MDA-MB-231乳腺肿瘤异种移植的生长中是有效的。治疗产生了五例完全肿瘤消退，其中4只动物在第56天保持无肿瘤。当比较个体动物达到肿瘤质量加倍3倍的时间时，在根据Q1Dx5时间表以15mg/kg/注射的剂量用紫杉醇治疗的组中，肿瘤的生长在统计学上不同于对照组中肿瘤的生长(组1vs.组6：P<0.001)(图55-57)。当均根据Q1Dx5时间表IV施用时，以52.6mg/kg/注射的剂量用配制的ART-207治疗的组(组4)中的肿瘤的再生长比以15mg/kg/剂量的剂量用紫杉醇治疗的组(组6)中的更慢(组4中值肿瘤生长延缓>45.9天，在第56天，6只小鼠无肿瘤，对组6中值肿瘤生长延缓为31.8天，在第56天，4只小鼠无肿瘤)；当比较个体动物达到肿瘤质量加倍3倍的时间时，两组间肿瘤生长的差异是统计学不同的(组4对组6：P＝0.133)(图55)。
图55。将小鼠分成5组(每组10只小鼠)。从第0天开始，通过静脉内(iv)注射向小鼠连续5天施用所有测试制品。组#2-4接收105.2(绿色实心)、78.9(红色实心)和52.6(黄色实心)mg/kg的配制ART-207。组#5接收无药物脂质制剂(黑色虚线，空心正方形)。组#6接受15mg/kg紫杉醇(蓝色虚线，空心圆)。曲线上每个点表示相应评估日每个药物和载体治疗组的平均肿瘤重量。组平均截止值为每组2只动物。
图56。将小鼠分成5组(每组10只小鼠)。从第0天开始，通过静脉内(iv)注射向小鼠连续5天施用所有测试制品。组#2-4接收105.2(绿色实心)、78.9(红色实心)和52.6(黄色实心)mg/kg的配制ART-207。组#5接收无药物脂质制剂(黑色虚线，空心正方形)。组#6接受15mg/kg紫杉醇(蓝色虚线，空心圆)。曲线上每个点表示评估当天每个药物和载体治疗组的平均小鼠重量。对肿瘤重量修正肿瘤小鼠体重。组平均截止值为每组2只动物。
图57。将小鼠分成6组(每组10只小鼠)。从第0天开始，通过静脉内(iv)注射向小鼠连续5天施用所有测试制品。组#2-4接收105.2(绿色实心)、78.9(红色实心)和52.6(黄色实心)mg/kg的配制ART-207。组#5接收无药物脂质制剂(黑色虚线，空心正方形)。组#6接受15mg/kg紫杉醇(蓝色虚线，空心圆)。曲线上每个点表示相应评估日每个药物和载体治疗组的平均肿瘤重量。组平均截止值为每组2只动物。
为了阐明肿瘤大小对高(78.9mg/kg)ART-207剂量的毒性的影响并且为了测试配制的ART-207抑制晚期肿瘤生长的能力，对平均肿瘤大小～1460mg的小鼠进行实验。未处理对照组(组1)中，在所有10只小鼠中，人MDA-MB-231乳腺肿瘤异种移植逐渐生长直至第11天。动物体重增加直至第11天。肿瘤达到肿瘤质量加倍3倍的中值为10.1天，并且在第11天重量达到1,461mg(平均组肿瘤重量)(参见正式报告)。由于肿瘤溃疡，在第11天将3只动物安乐死。从第11天开始，根据Q1Dx5时间表，以78.9mg/kg/注射的剂量用配制的ART-207IV治疗剩余7只小鼠。7只动物中2只死亡(死亡发生在第18天)并且在第18天观察到动物经受15％的最大平均体重降低(3.5g)(图58)。在该组中与配制的ART-207的施用有关的死亡率(7只小鼠中2只死亡，29％)比组5中以相同剂量施用配制的ART-207有关的死亡率(10只小鼠中6只死亡，60％)低(表25g)。
表25g.配制的ART-207的毒性对肿瘤大小的依赖性。
肿瘤大小，mg 剂量，mpk 毒性导致的死亡率，％
150 78.9 60
1461 78.9 33
图58。将小鼠分成2组(每组10只小鼠)。从第0天开始，通过静脉内(iv)注射连续5天给予小鼠所有测试制品。从第0天至第11天，组#1未注射(黑色实线，空心正方形)，然后以78.9mg/kg开始新的Q1Dx5序列。组#5接收无药物脂质制剂(黑色虚线，空心正方形)。曲线上每个点表示评估当天每个药物和载体治疗组的平均小鼠重量。对肿瘤重量修正肿瘤小鼠体重。组平均截止值为每组2只动物。配制的ART-207治疗导致肿瘤生长的有效抑制：中值肿瘤重量从第11天的1,029mg(基于7只小鼠)降低至第60天的104mg(图59)。
图59。将小鼠分成2组(每组10只小鼠)。从第0天开始，通过静脉内(iv)注射连续5天给予小鼠所有测试制品。从第0天至第11天，组#1未注射(黑色实线，空心正方形)，然后以78.9mg/kg开始新的Q1Dx5序列。组#5接收无药物脂质制剂(黑色虚线，空心正方形)。曲线上每个点表示相应评估日每个药物和载体治疗组的平均肿瘤重量。组平均截止值为每组2只动物。
所得数据显示了通过配制的ART-207对晚期肿瘤的有效抑制，同时其毒性作用显著降低。与给予患晚期肿瘤动物高剂量ART-207有关的死亡率的降低支持了肿瘤组织对配制的ART-207选择性细胞吸收的结论并且提供了在不同肿瘤尺寸患者中安全调节剂量的机会。在单个剂量施用过程后，肿瘤的持续消退表明假LDL(pseudoLDL)纳米颗粒配制的ART-207显示出延长的效力。在使用单一Q1Dx5过程的初始ATL3研究(图55)和在其中对具有大得多的肿瘤的动物剂量施用的第二研究中，用配制的ART-207治疗的肿瘤的再生长缓慢(图59)。这可以通过进入到未主动分裂但仍生长的肿瘤细胞中的前体药物/药物的肿瘤吸收和多价螯合来解释。当那些细胞达到进入细胞分裂时，螯合的药物发挥其毒性作用。(紫杉醇仅在经历分裂的细胞中有效)。
Q4Dx3时间表，根据Q4Dx3时间表，以78.9mg/kg/注射的剂量IV给予配制的ART-207(组7)是耐受的，无死亡并且与第8天观察到导致2％的平均体重降低(0.4g)。以78.9mg/kg/注射的剂量用配制的ART-207的治疗在抑制MDA-MB-231乳腺肿瘤异种移植的生长中是非常有效的。治疗产生了3例完全肿瘤消退，其中所有3只动物在第56天保持无肿瘤。当比较个体动物达到肿瘤质量加倍3倍的时间时，在以78.9mg/kg/注射的剂量用配制的ART-207治疗的组中，肿瘤的生长在统计学上不同于未处理对照组中肿瘤的生长(组1对组7：P<0.001)并且不同于乳剂对照组(组7对组8：P<0.001)(图60a和60b)。
根据Q4Dx3时间表，乳剂对照的IV治疗(组8)是耐受的，无死亡或平均体重降低。肿瘤达到肿瘤质量加倍3倍的中值为10.7天，并且在第11天重量达到1,163mg。当比较个体动物达到肿瘤质量加倍3倍的时间时，未处理对照组和根据Q4Dx3时间表给予的乳剂对照处理的组中，肿瘤的生长在统计学上是不同的(组1对组8：P＝0.252)两乳剂对照组中肿瘤的生长也是不同的(当根据Q1Dx5和Q4Dx3时间表给予时，组5对组8：P＝0.348)(图60a和60b)。
根据Q4Dx3时间表，以18.9mg/kg/注射的计量用紫杉醇IV治疗(组9)是耐受的，无死亡或平均体重降低(图60b)。以18.9mg/kg/注射的剂量用紫杉醇治疗在抑制MDA-MB-231乳腺肿瘤异种移植的生长中是非常有效的(图60a)。治疗产生1例完全肿瘤消退。当比较个体动物达到肿瘤质量加倍3倍的时间时，在根据Q4Dx3时间表以18.9mg/kg/注射的剂量用紫杉醇治疗的组中，肿瘤的生长在统计学上不同于未处理对照组中肿瘤的生长(组1对组9：P<0.001)并且不同于乳剂对照组(组8对组9：P<0.001)。
图60a。将小鼠分成3组(每组10只小鼠)。在第0、5和9天，通过静脉内(iv)注射给予小鼠所有测试制品。组#7接收78.9mg/kg配制的ART-207(红色实线，实心正方形)。组#8接收无药物脂质制剂(黑色虚线，空心正方形)。组#9接受18.9mg/kg紫杉醇(蓝色虚线，空心圆)。曲线上每个点表示相应评估日每个药物和载体治疗组的平均肿瘤重量。组平均截止值为每组2只动物。
图60b。将小鼠分成3组(每组10只小鼠)。在第1、5和9天，通过静脉内(iv)注射给予小鼠所有测试制品。组#7接收78.9mg/kg配制的ART-207(红色实线，实心正方形)。组#8接收无药物脂质制剂(黑色虚线，空心正方形)。组#9接受18.9mg/kg紫杉醇(蓝色虚线，空心圆)。曲线上每个点表示评估当天每个药物和载体治疗组的平均小鼠重量。对肿瘤重量修正肿瘤小鼠体重。组平均截止值为每组2只动物。MTD(ATL-1,2)和效力(ATL-3)研究清楚地显示出在低于MTD的浓度，与紫杉醇相比，配制的ART-207类似或更高的肿瘤抑制效果。与紫杉醇相反，配制的ART-207的肿瘤抑制效果不伴有任何显著的体重减轻。相对于紫杉醇，用配制的ART-207治疗一致地导致了动物存活率的显著提高和更高的无肿瘤动物数(表25h)。
表25h。配制的ART-207和紫杉醇对研究结束时动物存活率和无肿瘤动物数的比较效果。
实验26.含有ART-207(批次#AW-004-24)的乳剂的制备。
目的：系统研究TG/ART-207比率对制剂的颗粒尺寸、稳定性和ART-207掺入量的影响。
表26a.制剂组成。
表26b.主要制剂成分的比率。
TG/ART-207 PC/ART-207 PC/TG FC/CE
0.97 10.72 11.03 0.47
制备并MF处理了粗悬浮液(批次#002.156.1)。
表26c.所得乳剂的颗粒尺寸、ART-207含量和颗粒稳定性。
MFP。图61显示在～60℃处理30min后，颗粒尺寸达到69nm的R1。停止MFP并无菌过滤材料。过滤后观察到颗粒尺寸从69nm降低至62nm。
HPLC分析。通过HPLC(Taxane_Test.M,Rev2)测定的所得乳剂中的ART-207含量为4.05mg/ml。数据显示83％用于制备该制剂的药物掺入到了脂质颗粒(表26c)。含ART-207的制剂的颗粒尺寸分析。所得含ART-207的乳剂高度稳定。在图62和表26c中，在42天内颗粒不增大。
TG/ART-207比率为0.97的制剂的MF处理导致产生了高度稳定的～60nm颗粒。该制剂的ART-207掺入量为83％。基于TG/ART-207比率为1，预期药物掺入量较低。
用于PK/PD研究的含ART-207的制剂的制备。
实验27。含有ART-207(批次#AW-004-24)的乳剂的制备。制备用于PK/PD研究的含ART-207的制剂并且系统研究TG/ART-207比率对制剂的颗粒尺寸、稳定性和ART-207掺入量的影响。
表27a.制剂组成。
表27b.主要制剂成分的比率。
TG/ART-207 PC/ART-207 PC/TG FC/CE
1.17 10.70 9.11 0.47
制备并MF处理了粗悬浮液(批次#002.156.3)。
表27c.所得乳剂的颗粒尺寸、ART-207含量和颗粒稳定性。
MFP。图63显示在～60℃处理50min后，颗粒尺寸达到75nm的R1。将温度降低至20℃并将材料再处理20分钟。在20℃MF处理导致颗粒尺寸稍微增加至78nm并达到R2。停止MFP并无菌过滤材料。过滤后观察到颗粒尺寸从78nm降低至62nm。
HPLC分析。通过HPLC(Taxane_Test.M,Rev2)测定的所得乳剂中的ART-207含量为4.8mg/ml。数据表明94％用于制备该制剂的药物掺入到了脂质颗粒(表27c)。含ART-207的制剂的颗粒尺寸分析。含ART-207的乳剂高度稳定。在图64和表27c中，颗粒尺寸在43天内未变化。
TG/ART-207比率为1.17的制剂的TMF处理导致产生了高度稳定的～60nm颗粒。该制剂的ART-207掺入量为94％。基于较高的TG/ART-207比率，预期药物掺入量(相对于实验26中所述的制剂)较高。将≥30ml的批次#002.156.3的样品运送至研究地点；保留批次#002.156.3的～10ml样品。
运送当天表征材料。表27d中提供了数据。
表27d.配制的ART-207。含量和颗粒尺寸。
批次# 材料 ART-207，mg/ml 颗粒尺寸，nm
002.156.3 配制的ART-207 4.49 61.9
表27d显示与生产当天相比，通过HPLC测定的ART-207含量稍低，而颗粒尺寸未变化。通过单次静脉注射进行动物治疗。
表27e.ART-207含量和剂量。
在治疗结束后，将对于动物剂量施用未使用的材料运送回ArborTherapeutics。评估ART-207含量。对运送回的材料的评估与保留材料一起进行。表27f显示通过Taxane_Test.MRev.2方法评估的从PK/PD研究地点运送回的材料和保留的材料具有类似的药物含量。与运送当天相比，ART-207含量未显著较低。相对于生产当天，观察到ART-207含量的降低(表27c和27f)。
表27f.
在其送达当天评估了PK/PD研究剩余的和运送回Arbor的材料的颗粒尺寸。对运送回的材料的评估与保留材料一起进行。表27g提供了数据，并且数据反映了从第0天至PK/PD治疗阶段结束时对颗粒尺寸的监控。相对于保留材料，从研究地点运送回的乳剂的颗粒尺寸稍(不显著)高。从其生产之日至PK/PD研究的剂量施用日，配制的ART-207的颗粒尺寸未变化(表27c和27g)。运送回的和保留的材料的颗粒尺寸也无显著差异。
表27g
配制的ART-207表明了在PK/PD研究中的选择性(ATL-4和5)。数据表明主动表达LDL-受体的器官对配制的ART-207的选择性细胞吸收(参见正式报告“DETERMINATIONOFPLASMAANDTISSUECONCENTRATIONSOFART-207ANDPACLITAXELINNONTUMOREDANDTUMOREDMICEAFTERASINGLEINTRAVENOUSINJECTIONWITHFormulatedART-207ORPACLITAXEL”，SouthernResearchInstitute,Birmingham,AL35255-5305)。
实验ATL-4和ATL-5：确定对无肿瘤雌性无胸腺NCr-nu/nu小鼠和具有皮下(SC)人MDA-MB-231乳腺肿瘤的雌性无胸腺NCr-nu/nu小鼠单次静脉内(IV)注射剂配制的紫杉醇或ART-207后，血浆、脑、心脏、肝、肺和肿瘤(仅实验ATL-5)中紫杉醇和ART-207来源的紫杉醇的浓度。
肿瘤模型；实验ATL-4。动物为无肿瘤的。
实验ATL-5：将体内传代的人MDA-MB-231乳腺肿瘤片段植入小鼠。将肿瘤片段植入当天指定为第0天。在肿瘤片段植入(治疗日前1天)后的第23天，30只动物的个体肿瘤生长至908-1,437mg重(大小908-1,437mm3)。将所选30只动物分成10个处理组，从而在第23天，所有组中的平均肿瘤重量彼此尽可能接近(平均肿瘤重量在1,056至1,178mg的范围内，肿瘤中值重量在908至1,152mg的范围内)。在同一天施用实验ATL-4和ATL-5中的治疗。
实验ATL-4：研究包括在第1天(治疗前1天)，10个小组，每组3只无肿瘤小鼠，总计30只小鼠。在第2天，作为单次IV注射施用所有治疗。以70mg/kg的剂量用配制的ART-207治疗组1-5中的动物。以18.9mg/kg的剂量用紫杉醇治疗组6-10中的动物。基于配制的ART-207分子量1219.6和紫杉醇分子量853.9，70mg/kg的配制的ART-207的剂量是18.9mg/kg的紫杉醇剂量的2.6x摩尔当量。
实验ATL-5
研究包括在肿瘤片段植入后的第23天(治疗前1天)，10个小组，每组3只小鼠，总计30只具有人MDA-MB-231乳腺肿瘤的小鼠。在第24天，作为单次IV注射施用所有治疗。以70mg/kg的剂量用配制的ART-207治疗组1-5中的动物。以18.9mg/kg的剂量用紫杉醇治疗组6-10中的动物。70mg/kg剂量的配制的ART-207是18.9mg/kg剂量的紫杉醇的2.6x摩尔当量。
紫杉醇、ART-207和ART-207来源的紫杉醇的血浆水平。对于施用了单次IV剂量的配制的ART-207的小鼠，在剂量施用(最早时间点)后的5分钟(0.083小时)观察到了640μg/mL的ART-207的平均峰值血浆浓度(Cmax)；此时血浆中紫杉醇的平均浓度为2.248μg/mL(2237ng/mL)。随后，ART-207从血浆中消除，其表观终末消除半衰期为2.8hr；对于施用配制的ART-207的动物，血浆中紫杉醇的表观终末消除半衰期较缓慢，为11.5hr。ART-207的低清除速率(22.0mL/hr/kg)和ART-207稳态分布的小容量(88.0mL/kg)是化合物有限的代谢/消除/组织分布的指示。血浆中ART-207的AUClast为2794hr·μg/mL，而紫杉醇的为14.4hr·μg/mL，表明全身暴露于ART-207比暴露于紫杉醇大约200倍(图65)。对于施用单次IV剂量紫杉醇的小鼠，在剂量施用(最早时间点)后5分钟(0.083小时)观察到了32.9μg/mL的紫杉醇的平均峰值血浆浓度；此后，紫杉醇从血浆中消除，其表观终末消除半衰期为1.0小时。血浆中紫杉醇的AUClast为37.7hr·μg/mL。紫杉醇的总身体清除(500mL/hr/kg)和紫杉醇稳态分布容量(658mL/kg)高于对ART-207确定的相应值。尽管紫杉醇的相对组织分布与对施用配制的ART-207的小鼠所观察到的类似，但是对于施用紫杉醇的小鼠，紫杉醇的平均峰值组织浓度比施用2.6倍更高摩尔当量剂量的配制的ART-207的小鼠更高。
血浆中ART-207和紫杉醇的平均浓度随时间的变化
图65。将肿瘤和/或非肿瘤小鼠再分成5组(每组3只小鼠)。所有小鼠静脉内注射70mg/kg的配制的ART-207。在单次弹丸注射后5、30、60、240和480分钟，收集血液样品。每个时间点表示3只小鼠。将血浆浓度表示为每个分析时间点的浓度曲线下面积(AUC)。基于AUClast值(从0至最后一个可定量样品，相对于时间曲线的平均浓度下面积)，对于非肿瘤和肿瘤小鼠，注射紫杉醇的小鼠中对紫杉醇的全身暴露是类似的。注射紫杉醇的非肿瘤和肿瘤小鼠的紫杉醇水平间差异不显著(图66)。数据表明肿瘤存在与否不影响血浆紫杉醇含量，并因此紫杉醇不能选择性靶向肿瘤组织。
图66。将非肿瘤小鼠再分成5组(每组3只小鼠)。所有小鼠静脉内注射18.9mg/kg的紫杉醇。在单次弹丸注射后5、30、60、240和480分钟，收集血液样品。每个时间点表示3只小鼠。组织浓度表示为从0至最后一个时间点的可定量分析物(8hr)的浓度曲线下面积(AUC)。使用线性/log梯形法则计算从0至最后一个可定量样品的时间的相对于时间曲线的平均浓度下面积(AUClast)。在ART-207治疗的肿瘤动物中，ART-207来源的紫杉醇的血浆水平显著低于ART-207治疗的非肿瘤小鼠(图67)。数据表明了肿瘤对ART-207来源的紫杉醇的血浆水平的显著影响，表明相对于紫杉醇，配制的ART-207的靶向能力得到改善。
图67。将肿瘤小鼠再分成5组(每组3只小鼠)。所有小鼠静脉内注射70mg/kg的配制的ART-207。在单次弹丸注射后5、30、60、240和480分钟，收集血液样品。每个时间点表示3只小鼠。组织浓度表示为从0至最后一个时间点的可定量分析物(8hr)的浓度曲线下面积(AUC)。使用线性/log梯形法则计算从0至最后一个可定量样品的时间的相对于时间曲线的平均浓度下面积(AUClast)。注射配制的ART-207的非肿瘤和肿瘤小鼠的紫杉醇血浆水平间差异显著。当iv剂量施用后评估配制的ART-207和紫杉醇的分布容量时，配制的ART-207的分布容量显著低于(6倍)紫杉醇，表明配制的ART-207保留在血管系统内，而不是分布到组织中。长循环的假LDL纳米颗粒制剂可以持续浓缩至肿瘤组织中。这与ATL2和ATL3研究中观察到的配制的ART-207延长的效力一致。另外，生长但不分裂的肿瘤细胞中对制剂的肿瘤组织细胞吸收将提供前体药物/药物的贮器，从而一旦细胞开始细胞分裂，则发挥细胞毒作用。紫杉烷的细胞毒作用仅对于分裂细胞。生长但不分裂的细胞中药物的贮器是所期望的，这是因为并非所有的肿瘤细胞在任何给定时间分裂，从而当这些休眠细胞开始分裂从而导致肿瘤复发时，通过存在药物的贮器杀死它们。
注射紫杉醇和ART-207的小鼠中紫杉醇的器官分布。收获器官，然后在未先前灌注或在PBS或盐水中清洗的情况下进行分析。通过对配制的ART-207所观察和报道的小分布容量，我们将我们的数据分析集中在作为配制的ART-207组织分布特异性更强的指示的ART-207来源的紫杉醇的分布和导致紫杉醇部分局部释放的处理上。相对于注射紫杉醇的小鼠，注射ART-207的小鼠中紫杉醇的非肿瘤小鼠组织水平显著较低(图68)。
图68。将非肿瘤小鼠再分成5组(每组3只小鼠)。所有小鼠静脉内注射70mg/kg的配制ART-207或18.9mg/kg的紫杉醇。在单次弹丸注射后5、30、60、240和480分钟，收集血液样品和器官。每个时间点表示3只小鼠。组织浓度表示为从0至最后一个时间点的可定量分析物(8hr)的浓度曲线下面积(AUC)。使用线性/log梯形法则计算从0至最后一个可定量样品的时间的相对于时间曲线的平均浓度下面积(AUClast)。对于所有评估的组织，注射紫杉醇或配制的ART-207的非肿瘤小鼠的紫杉醇水平间差异显著(p<0.05)。相对于注射紫杉醇的小鼠，注射ART-207的小鼠的所有非靶向器官中肿瘤小鼠紫杉醇水平较低，而在注射配制的ART-207的小鼠中，肿瘤组织中紫杉醇浓度显著较高(图69，70)。结果与紫杉醇血浆浓度数据一致并且表明了通过配制的ART-207对肿瘤位点的选择性靶向。
图69。将肿瘤小鼠再分成5组(每组3只小鼠)。所有小鼠静脉内注射70mg/kg的配制ART-207或18.9mg/kg的紫杉醇。在单次弹丸注射后5、30、60、240和480分钟，收集血液样品和器官。每个时间点表示3只小鼠。组织浓度表示为从0至最后一个时间点的可定量分析物(8hr)的浓度曲线下面积(AUC)。使用线性/log梯形法则计算从0至最后一个可定量样品的时间的相对于时间曲线的平均浓度下面积(AUClast)。对于所有评估的组织，注射紫杉醇或配制的ART-207的非肿瘤小鼠的紫杉醇水平间差异显著(p<0.05)。
图70。将肿瘤小鼠再分成5组(每组3只小鼠)。所有小鼠静脉内注射70mg/kg的配制ART-207或18.9mg/kg的紫杉醇。在单次弹丸注射后5、30、60、240和480分钟，收集肿瘤。每个时间点表示3只小鼠。组织浓度表示为从0至最后一个时间点的可定量分析物(8hr)的浓度曲线下面积(AUC)。使用线性/log梯形法则计算从0至最后一个可定量样品的时间的相对于时间曲线的平均浓度下面积(AUClast)。在用配制的ART-207治疗的非肿瘤和肿瘤小鼠中，在肝脏、肺和肿瘤组织中观察到了紫杉醇最高和相当的浓度(图68，69)，这些组织是主要的LDL-受体表达位点。所获得的数据表明主动表达LDL-受体的器官对配制的ART-207的选择性细胞吸收并且支持配制的ART-207细胞内化的LDL-受体依赖性机制。PK/PD数据与效力和毒性研究结果一致，其显示了与紫杉醇相比，配制的ART-207类似或更高的效力，同时对配制的ART-207观察到了较低的毒性。
实验28。含有ART-207(批次#AW-004-24)的乳剂的制备。系统研究TG/ART-207比率(表28b)对制剂的颗粒尺寸、稳定性和ART-207掺入量的影响。
表28a.制剂组成。
表28b.主要制剂成分的比率。
TG/ART-207 PC/ART-207 PC/TG FC/CE
1.32 10.35 7.84 0.47
制备并MF处理了粗悬浮液(批次#002.158.2)。
表28c.所得乳剂的颗粒尺寸、ART-207含量和颗粒稳定性。
MFP。在图71中，在～60℃处理10分钟后，颗粒尺寸达到102nm。停止MFP并无菌过滤材料。过滤后观察到颗粒尺寸从102nm降低至81nm。
HPLC分析。通过HPLC(Taxane_Test.M,Rev2)测定的所得乳剂中的ART-207含量为4.74mg/ml。数据表明89.6％用于制备该制剂的药物掺入到了脂质颗粒(表28c)。含ART-207的制剂的颗粒尺寸分析。含ART-207的乳剂是稳定的。在图72和表28c中，颗粒尺寸在37天内不增加。
TG/ART-207比率为1.32的制剂的MF处理导致产生了高度稳定的～70nm颗粒。该制剂的ART-207掺入量为89.6％。与TG/ART-207比率为1.17的制剂相比(实验27)，药物掺入量未提高。
实验29.含ART-207的乳剂的制备。系统研究TG/ART-207比率(表33b)对制剂的颗粒尺寸、稳定性和ART-207掺入量的影响。
表29a.制剂组成。
表29b.主要制剂成分的比率。
TG/ART-207 PC/ART-207 PC/TG FC/CE
1.60 10.32 6.44 0.47
制备并MF处理了粗悬浮液(批次#005.1.2)。
表29c.所得乳剂的颗粒尺寸、ART-207含量和颗粒稳定性。
MFP。在图73中，在～60℃处理10分钟后，颗粒尺寸达到77nm。停止MFP并过滤。过滤后，未观察到颗粒尺寸的变化。
HPLC分析。通过HPLC(Taxane_Test.M,Rev2)测定的所得乳剂中的ART-207含量为4.74mg/ml。数据表明89.5％用于制备该制剂的药物掺入到了脂质颗粒(表29c)。含ART-207的制剂的颗粒尺寸分析。所得含ART-207的乳剂相当稳定。在图74和表29c中，颗粒尺寸在35天内增加了4nm。
TG/ART-207比率为1.6的制剂的MF处理导致产生了相对稳定的～75nm颗粒。监控期间对批次#005.1.2所观察到的颗粒尺寸的稍微提高表明了伴随较高TG/ART比率的不稳定性的初始迹象。该制剂的ART-207掺入量为89.5％，并且与TG/ART-207比率为1.17和1.32的制剂(分别为实验27和28)相比未提高。数据表明最佳TG/ART-207比率在1.2-1.3的范围内。
实验30.含有ART-207(批次#AW-004-24)的乳剂的制备。产生～90-100nm含ART-207的颗粒并评估它们的药物掺入量和稳定性。由于实验28和29中得到的颗粒尺寸显著低于目标(～90-100nm)，因此将MF处理压力降低至10,000PSI。TG/ART比率为1.35。
表30a.制剂组成。
表30b.主要制剂成分的比率。
TG/ART-207 PC/ART-207 PC/TG FC/CE
1.35 9.90 7.31 0.47
制备并MF处理了粗悬浮液(批次#005.2.2)。
表30c.所得乳剂的颗粒尺寸、ART-207含量和颗粒稳定性。
MFP。在图75中，在～60℃处理10分钟后，颗粒尺寸达到105nm。停止MFP并过滤材料。过滤后，未观察到颗粒尺寸的显著变化。
HPLC分析。通过HPLC(Taxane_Test.M,Rev2)测定的所得乳剂中的ART-207含量为4.85mg/ml。该数据表明89.3％用于制备该制剂的药物引入到了脂质颗粒(表30c)。含ART-207的制剂的颗粒尺寸分析。所得含ART-207的乳剂高度稳定。图76和表30c显示在35天内颗粒尺寸未变化。
TG/ART-207比率为1.35的制剂的MF处理导致产生了高度稳定的～105nm颗粒。如所期望的，对于该TG/ART-207比率，该制剂的ART-207掺入量为89.3％。所得数据表明当前制剂具有产生至少40-100nm范围内的稳定颗粒的能力。
组成和比率。生产40至100nm范围内的稳定的无药物和含药物纳米颗粒的具有制剂成分特定比率的唯一组成。作为重量/体积(W/V)百分比计算的总固体的最佳范围为6.5-7.5％(TS，％)。作为重量/体积(W/V)百分比计算的总脂质的最佳范围为5.5-6.5％(TL，％)。表30d给出了主要组成的比率。
表30d.主要制剂成分的比率。
TG/ART-207 PC/ART-207 PC/TG FC/CE PC/TC TG/TC
0.97-1.6 7.5-12 3.5-11 0.3-0.6 17-25 2-7
对于准确的组成和细节，参见附录、主表2和3。
TG/ART-207比率。TG浓度和具体的TG/ART-207比率是确定含药物乳剂稳定性的主要因素。TG/ART-207比率的最佳范围为0.97-1.4。图77显示将TG/ART-207比率提高至0.97以上有利于ART-207掺入，同时导致产生了稳定颗粒。在TG/ART-207比率～1.3-1.4，ART-207掺入达到最大和稳定水平。进一步提高TG/ART-207比率不会提高制剂的药物掺入量，并且此外导致产生了不稳定的纳米颗粒。
图77。TG/ART-207比率对制剂的ART-207掺入量(黑色实线，左轴)和颗粒尺寸提高(黑色虚线，右轴)的影响。ART-207掺入量(即所得乳剂的药物含量)表示为用于制备该乳剂所称量的药物量的百分比。颗粒尺寸提高表示为相对于生产当天，颗粒尺寸随时间变化的百分比。
处理温度。尽管在较低的温度(～20℃)处理材料获得了较小的颗粒，但是在60℃处理导致产生了更稳定的乳剂。图78显示在～20℃处理导致产生了～55nm的含药物纳米颗粒，而60℃处理获得了～65nm的含药物纳米颗粒。储存期间仅在～20℃处理的材料中观察到了～15％的颗粒尺寸提高(图78)。“较小”和“较大”的纳米颗粒含有类似量的ART-207。
图78。储存期间，颗粒尺寸(黑色实线，左轴)和颗粒尺寸提高百分比(黑色虚线，右轴)对处理温度的依赖性。
用于287掺入的脂质基制剂的开发。287掺入量、颗粒尺寸和稳定性的优化。对于所有如下所述的实施例，还参见主表1、2和3(附录II)。
实验31.含有287(批次#ISI-30052013-1)的脂质乳剂的制备。研究对于制备含ART-207的纳米颗粒所开发的制剂掺入结构不同的287(亲脂性药物，非前体药物衍生物)的能力。
表31a.制剂组成。
表31b.主要制剂成分的比率。
TG/ART 287 PC/ART 287 PC/TG FC/CE
1.19 10.57 8.86 0.47
制备并MF处理了粗悬浮液(批次#005.16.2)。缓冲液：10mMTris-HClpH7.4。
表31c.所得乳剂的287含量和稳定性。
回收1，％-相对于用于制剂的287的量；回收2，％-相对于生产当天在乳剂中测定的287含量；
表31d.所得乳剂的颗粒尺寸和稳定性。
MFP。在图79中，在55-65℃处理100min后，颗粒尺寸达到～80.6nm的R1。停止MFP并过滤。过滤后观察到颗粒尺寸从80.6降低至56.4nm(图79)。
HPLC分析。通过HPLC(Taxane_Prodrug.M)测定的所得乳剂中的287含量为2.81mg/ml。数据表明仅有55.3％用于制备该制剂的药物掺入到了脂质颗粒(表31c)。HPLC测定的未过滤乳剂的药物含量为4.40mg/ml。数据表明86.6％用于制备该制剂的药物掺入到了脂质颗粒，并且表明大部分(～36％)的配制的287在MF处理结束时的最终过滤步骤期间丧失。HPLC数据与过滤后颗粒尺寸的显著降低一致。数据表明了所得乳剂的颗粒尺寸非均一性和过滤器上大的含287的颗粒的保留。在室温下储存28天后，在所得乳剂中未观察到287含量从2.81至2.64mg/ml的降低(6％)(表31c)。含287的制剂的颗粒尺寸分析。图85和表39d显示在6天内颗粒尺寸从53.2增加至72.6.4nm，然后稳定在67nm的范围内。在至多达28天，观察到颗粒尺寸不再变化(图80)。
颗粒尺寸分析数据与HPLC数据一致，表明：a)最终过滤步骤后，纳米颗粒尺寸和287含量降低；和b)所得乳剂和配制的287相对稳定。在10mMTris-HCl缓冲液，pH7.4中制备乳剂。
实验32。含287的脂质乳剂的制备。研究对于制备含ART-207的稳定纳米颗粒所开发的含DMPC制剂掺入结构不同的287的能力。
表32a.制剂组成。
表32b.主要制剂成分的比率。
TG/ART 287 PC/ART 287 PC/TG FC/CE
1.19 10.75 9.05 0.47
制备并MF处理了粗悬浮液(批次#005.14.2)。缓冲液：乙盐酸(10mM)缓冲盐水，pH5.5。
表32c.所得乳剂的287含量和稳定性。
回收1，％-相对于用于制剂的287的量。回收2，％-相对于生产当天在乳剂中测定的287含量。
表32d.所得乳剂的颗粒尺寸和稳定性。
MFP。在图81中，在～60℃处理30min后，颗粒尺寸达到～99nm的R1。将温度降低至～20℃导致颗粒尺寸增加至161.7nm。将温度升高至60℃并处理30分钟导致颗粒尺寸降低至97nm并达到R2(图81)。停止MFP并过滤材料。过滤后观察到颗粒尺寸从97.7nm降低至47.5nm(图81)。
HPLC分析。通过HPLC(Taxane_Prodrug.M)测定的所得乳剂中的287含量为2.81mg/ml。数据表明仅55.4％用于制备该制剂的药物掺入到了脂质颗粒(表32c)。HPLC测定的未过滤乳剂的药物含量为4.56mg/ml。数据表明89.9％用于制备该制剂的药物掺入到了脂质颗粒，并且表明大部分(～38％)的配制的287在最终过滤步骤期间丧失。HPLC数据与过滤后颗粒尺寸的显著降低一致。数据表明了所得乳剂的颗粒尺寸非均一性和过滤器上大的含287的颗粒的保留。在室温下储存26天后，在所得乳剂中未观察到287含量或颗粒尺寸的变化(表32c)。含287的制剂的颗粒尺寸分析。在26天期间，未观察到显著的颗粒尺寸变化(图82和表32c)。数据表明了当用相同的脂质制剂时与含ART-207的乳剂类似的所得乳剂的高稳定性。
颗粒尺寸分析数据与HPLC数据一致，表明：a)最终过滤步骤后，纳米颗粒尺寸和287含量显著降低；和b)所得乳剂和配制的287高度稳定。在10mMTris-HCl缓冲液，pH7.4中制备乳剂。DMPC的加入显著改善了含287乳剂的稳定性。对含ART-207的乳剂观察到了类似的DMPC作用。
组成和比率。生产40至100nm范围内的稳定的无药物和含药物纳米颗粒的具有制剂成分特定比率的唯一组成。作为重量/体积(W/V)百分比计算的总固体的最佳范围为6.9-7.1％(TS，％)。作为重量/体积(W/V)百分比计算的总脂质的最佳范围为6.1-6.3％(TL，％)。数据表明对ART-207优化的脂质制剂适合于产生含有广泛亲脂性结构多样的化合物的稳定纳米颗粒乳剂。表32e提供了主要成分的比率的实例。
表32e.主要制剂成分的比率。
TG/287 PC/287 PC/TG FC/CE PC/TC TG/TC
0.97-1.6 7.5-12 3.5-11 0.3–0.6 17-25 2-7
对于准确的组成和细节，参见主表5和6。
主表1.总固体预混合物(TSPM)和相应的所得乳剂。
材料 制备日期 批次# 材料 处理日期 批次#
TSPM 17-Dec-12 002.102.1 乳剂 18-Dec-12 002.103.1
TSPM 17-Dec-12 002.102.2 乳剂 19-Dec-12 002.104.1
TSPM 18-Dec-12 002.103.2 乳剂 19-Dec-12 002.105.1
TSPM 9-Jan-13 002.107.2 乳剂 9-Jan-13 002.108.1
TSPM 9-Jan-13 002.108.2 乳剂 9-Jan-13 002.109.1
TSPM 10-Jan-13 002.109.2 乳剂 10-Jan-13 002.110.1
TSPM 10-Jan-13 002.109.3 乳剂 11-Jan-13 002.111.1
TSPM 11-Jan-13 002.110.4 乳剂 11-Jan-13 002.111.2
TSPM 15-Jan-13 002.115.4 乳剂 16-Jan-13 002.116.1
TSPM 15-Jan-13 002.115.1 乳剂 19-Jan-13 002.118.0
TSPM 15-Jan-13 002.118.1 乳剂 19-Jan-13 002.118.00
TSPM 15-Jan-13 002.115.2 乳剂 20-Jan-13 002.119.4
TSPM 15-Jan-13 002.115.3 乳剂 21-Jan-13 002.121.4
TSPM 15-Jan-13 002.115.3 乳剂 22-Jan-13 002.122.0
TSPM 22-Jan-13 002.122.1 乳剂 23-Jan-13 002.123.11
TSPM 22-Jan-13 002.122.1 乳剂 23-Jan-13 002.123.12
TSPM 22-Jan-13 002.122.1 乳剂 23-Jan-13 002.123.13
TSPM 24-Jan-13 002.125.1 乳剂 25-Jan-13 002.125.21
TSPM 24-Jan-13 002.125.1 乳剂 25-Jan-13 002.125.22
TSPM 8-Feb-13 002.131.1 乳剂 9-Feb-13 002.131.2
TSPM 9-Feb-13 002.134.1 乳剂 9-Feb-13 002.134.2
TSPM 11-Feb-13 002.135.1 乳剂 12-Feb-13 002.136.21
TSPM 11-Feb-13 002.135.1 乳剂 12-Feb-13 002.136.22
TSPM 11-Feb-13 002.135.1 乳剂 12-Feb-13 002.136.23
TSPM 14-Feb-13 002.137.1 乳剂 15-Feb-13 002.137.3
TSPM 14-Feb-13 002.137.2 乳剂 15-Feb-13 002.137.41
TSPM 14-Feb-13 002.137.2 乳剂 15-Feb-13 002.137.4284 -->
TSPM 14-Feb-13 002.137.2 乳剂 15-Feb-13 002.137.43
TSPM 21-Feb-13 002.139.1 乳剂 21-Feb-13 002.139.2
TSPM 21-Feb-13 002.140.1 乳剂 21-Feb-13 002.140.21
TSPM 21-Feb-13 002.140.1 乳剂 21-Feb-13 002.140.22
TSPM 21-Feb-13 002.140.1 乳剂 21-Feb-13 002.140.23
TSPM 21-Feb-13 002.140.1 乳剂 21-Feb-13 002.140.24
TSPM 13-Mar-13 002.150.1 乳剂 14-Mar-13 002.151.5
材料 制备日期 批次# 材料 处理日期 批次#
TSPM 13-Mar-13 002.150.2 乳剂 14-Mar-13 002.151.6
TSPM 13-Mar-13 002.150.3 乳剂 14-Mar-13 002.151.7
TSPM 13-Mar-13 002.150.4 乳剂 14-Mar-13 002.151.8
TSPM 15-Mar-13 002.152.1 乳剂 15-Mar-13 002.153.1
TSPM 15-Mar-13 002.152.2 乳剂 15-Mar-13 002.153.2
TSPM 21-Mar-13 002.155.1 乳剂 22-Mar-13 002.156.1
TSPM 25-Mar-13 002.156.2 乳剂 25-Mar-13 002.156.3
TSPM 26-Mar-13 002.158.1 乳剂 27-Mar-13 002.158.2
TSPM 28-Mar-13 005.1.1 乳剂 29-Mar-13 005.1.2
TSPM 29-Mar-13 005.2.1 乳剂 29-Mar-13 005.2.2
TSPM 1-Apr-13 005.2.1 乳剂 1-Apr-13 005.2.3
主表2.TSPM(总固体预混合物)的组成。
主表3.主要成分比率。所得乳剂的颗粒尺寸、稳定性和ART-207含量。
以下主表4和5提供了掺入287的制剂的主要成分的示例组成和比率：
主表4.总固体预混合物(TSPM)和相应的所得乳剂。
材料 制备日期 批次# 材料 处理日期 批次#87 -->
TSPM 30-May-13 005.14.1 乳剂 31-May-13 005.14.2
TSPM 04-Jun-13 005.16.1 乳剂 04-Jun-13 005.16.2
TSPM 05-Jun-13 005.17.1 乳剂 06-Jun-13 005.18.1
主表5.TSPM(总固体预混合物)的组成。
主表6.主要成分比率。所得乳剂的颗粒尺寸、稳定性和287含量。
除了本文所公开的以上代表性实验以及ART-207和化合物的制剂，还对在本申请中公开的所选化合物进行了上述程序，并且结果与上述结果基本一致。
尽管本文已提供了一些示例性的实施方式、方面和变化，但是本领域技术人员将认识到某些改变、替换、加入和组合以及实施方式、方面和变化的某些子组合。意欲将以下权利要求理解为将所有这些改变、替换、加入和组合以及实施方式、方面和变化的某些子组合包括在它们的范围内。在整个本申请中引用的所有文档的全部公开内容作为参考并入本文。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种稳定的合成低密度脂蛋白(LDL)纳米颗粒，包含：
a)具有大于4.0的logP的亲脂性抗癌剂；
b)磷脂(PL)；和
c)甘油三酯(TG)；
其中，LDL纳米颗粒具有40-80nm的颗粒尺寸。
2.根据权利要求1所述的LDL纳米颗粒，其中，所述LDL纳米颗粒具有60nm的平均尺寸分布。
3.根据权利要求1所述的LDL纳米颗粒，其中，所述磷脂选自由以下所组成的组中：磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、对称或不对称的1,2-二酰基-sn-甘油基-3-磷酰胆碱、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酰胆碱、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺、蛋黄磷脂、卵磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、卵磷脂(NOS)及它们的混合物。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的LDL纳米颗粒，还包含胆固醇酯(CE)或胆固醇(C)或者胆固醇酯和胆固醇的混合物。
5.根据权利要求4所述的LDL纳米颗粒，其中，所述胆固醇酯选自由以下所组成的组中：胆固醇的C16-22酯、胆固醇及它们的混合物；并且所述甘油三酯选自由以下所组成的组中：豆油、三油酸甘油酯、三棕榈酸甘油酯及它们的混合物。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的LDL纳米颗粒，还包含选自由以下所组成的组中的试剂：三油酸甘油酯、天然抗氧化剂、BHT、泛醇、泛醇10、维生素E、α-生育酚、γ-生育酚、番茄红素、视黄基衍生物和β胡萝卜素或它们的混合物。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的LDL纳米颗粒，其中，所述亲脂性抗癌剂为抗癌剂。
8.根据权利要求7所述的LDL纳米颗粒，其中，所述抗癌剂选自由紫杉烷、abeo-紫杉烷、喜树碱、埃博霉素、葫芦素、苦木苦味素和蒽环所组成的组中。
9.根据权利要求7所述的LDL纳米颗粒，其中，所述抗癌剂选自由以下所组成的组中：阿柔比星、喜树碱、马索罗酚、紫杉醇、喷司他丁、氨柔比星、克拉屈滨、阿糖胞苷、多西他赛、吉西他滨、依利醋铵、表柔比星、依托泊苷、福美司坦、氟维司群、伊达比星、吡柔比星、拓扑替康、戊柔比星和长春碱。
10.根据权利要求7所述的LDL纳米颗粒，其中，所述抗癌剂的前体药物是酸不稳定的亲脂性分子结合物(ALLMC)，所述亲脂性分子结合物选自由以下所组成的组中：
以及它们的分离的对映异构体、非对映异构体或它们的混合物；
其中，-ALL1、-ALL2、-ALL3和-ALL4各自独立地为氢或下式的酸不稳定的亲脂基团：
其中：
R为具有羟基的癌症化疗剂；
对于式1或1.1：
R1为氢、C1-C4烷基或C5-C22烷基；
R2为C5-C22烷基；
Y选自O、NR'或S，其中R'为氢或C1-C6烷基；
Z为O或S；
Q为O或S；和T为O或S；
对于式2：
R2为C1-C22烷基；
T为O或S；和
X为氢或离去基团，所述离去基团选自由甲磺酸酯基、磺酸酯基和卤素(Cl、Br和I)所组成的组中。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的LDL纳米颗粒，其中，所述亲脂性抗癌剂具有大于4.0、大于6.0或大于8.0的logP。
12.根据权利要求4所述的LDL纳米颗粒，其中，PL:TG:CE:C的重量比在73:12:2:1至78:12:2:1的范围内；任选地还包含选自由以下所组成的组中的添加剂：三油酸甘油酯、天然抗氧化剂、BHT、泛醇、泛醇10、维生素E、α-生育酚、γ-生育酚、番茄红素、视黄基衍生物和β胡萝卜素或它们的混合物。
13.根据权利要求12所述的LDL纳米颗粒，其中，PL:TG:CE:C的重量比为77:10:2:1。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的LDL纳米颗粒，还包含选自由P188、P237、P338、P407、SYNPERONICS、PLURONICS和KOLLIPHOR或它们的混合物所组成的组中的泊洛沙姆。
15.一种用于制备稳定的合成低密度脂蛋白(LDL)纳米颗粒的方法，所述纳米颗粒包含：a)具有大于4.0的logP的亲脂性抗癌剂；b)磷脂(PL)；和c)甘油三酯(TG)；
所述方法包括：
1)将所述亲脂性抗癌剂、磷脂和甘油三酯混合以形成混合物；
2)通过在挥发性溶剂中溶解使所述混合物变均匀；
3)除去所述溶剂；
4)通过将所述混合物在缓冲液中共混以形成乳剂混合物来形成粗乳剂；
5)将所述乳剂混合物在微射流装置中微射流足量的时间以产生100nm或更小的颗粒制剂；和
6)将纳米颗粒制剂通过0.22微米过滤器除菌以获得具有40nm至80nm范围内的平均颗粒尺寸的合成LDL纳米颗粒。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，合成低密度脂蛋白(LDL)纳米颗粒混合物，其中所述磷脂选自由以下所组成的组中：磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、对称或不对称的1,2-二酰基-sn-甘油基-3-磷酰胆碱、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酰胆碱、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺、蛋黄磷脂、卵磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、卵磷脂(NOS)及它们的混合物。
17.根据权利要求15或16所述的方法，其中，所述LDL纳米颗粒还包含胆固醇(C)或胆固醇酯(CE)或者胆固醇和胆固醇酯的混合物，所述胆固醇酯选自由胆固醇的C16-22酯、胆固醇及它们的混合物所组成的组中；并且所述甘油三酯选自由豆油、三油酸甘油酯、三棕榈酸甘油酯及它们的混合物所组成的组中。
18.通过权利要求15-17中任一项所述的方法制备的稳定的合成低密度脂蛋白(LDL)纳米颗粒，包含：a)具有大于4.0的logP的亲脂性抗癌剂；b)磷脂(PL)；和c)甘油三酯(TG)。
19.一种用于治疗患者中癌症的方法，包括给予需要这种治疗的患者治疗有效量的权利要求1-14和权利要求18中任一项所述的稳定的合成低密度脂蛋白(LDL)纳米颗粒。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述癌症选自由以下所组成的组中：白血病、成神经细胞瘤、成胶质细胞瘤、宫颈癌、结肠直肠癌、胰腺癌、肾黑素瘤、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌和头颈癌。

Claims (20)

1.一种稳定的合成低密度脂蛋白(LDL)纳米颗粒，包含：
a)亲脂性抗癌剂；
b)磷脂(PL)；和
c)甘油三酯(TG)；
其中，LDL纳米颗粒具有小于100nm、小于90nm或小于80nm的颗粒尺寸。
2.根据权利要求1所述的LDL纳米颗粒，其中，所述LDL纳米颗粒具有60nm的平均尺寸分布。
3.根据权利要求1所述的LDL纳米颗粒，其中，所述磷脂选自由以下所组成的组中：磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、对称或不对称的1,2-二酰基-sn-甘油基-3-磷酰胆碱、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酰胆碱、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺、蛋黄磷脂、卵磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、卵磷脂(NOS)及它们的混合物。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的LDL纳米颗粒，还包含胆固醇酯(CE)或胆固醇(C)或者胆固醇酯和胆固醇的混合物。
5.根据权利要求4所述的LDL纳米颗粒，其中，所述胆固醇酯选自由以下所组成的组中：胆固醇的C16-22酯、胆固醇及它们的混合物；并且所述甘油三酯选自由以下所组成的组中：豆油、三油酸甘油酯、三棕榈酸甘油酯及它们的混合物。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的LDL纳米颗粒，还包含选自由以下所组成的组中的试剂：三油酸甘油酯、天然抗氧化剂、BHT、泛醇、泛醇10、维生素E、α-生育酚、γ-生育酚、番茄红素、视黄基衍生物和β胡萝卜素或它们的混合物。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的LDL纳米颗粒，其中，所述亲脂性抗癌剂为抗癌剂或所述抗癌剂的前体药物。
8.根据权利要求7所述的LDL纳米颗粒，其中，所述抗癌剂选自由紫杉烷、abeo-紫杉烷、喜树碱、埃博霉素、葫芦素、苦木苦味素和蒽环所组成的组中。
9.根据权利要求7所述的LDL纳米颗粒，其中，所述抗癌剂选自由以下所组成的组中：阿柔比星、喜树碱、马索罗酚、紫杉醇、喷司他丁、氨柔比星、克拉屈滨、阿糖胞苷、多西他赛、吉西他滨、依利醋铵、表柔比星、依托泊苷、福美司坦、氟维司群、伊达比星、吡柔比星、拓扑替康、戊柔比星和长春碱。
10.根据权利要求7所述的LDL纳米颗粒，其中，所述抗癌剂的前体药物是酸不稳定的亲脂性分子结合物，所述亲脂性分子结合物选自由以下所组成的组中：
以及它们的分离的对映异构体、非对映异构体或它们的混合物；
其中，-ALL1、-ALL2、-ALL3和-ALL4各自独立地为氢或下式的酸不稳定的亲脂基团：
其中：
R为具有羟基的癌症化疗剂；
对于式1或1.1：
R1为氢、C1-C4烷基或C5-C22烷基；
R2为C5-C22烷基；
Y选自O、NR'或S，其中R'为氢或C1-C6烷基；
Z为O或S；
Q为O或S；和T为O或S；
对于式2：
R2为C1-C22烷基；
T为O或S；和
X为氢或离去基团，所述离去基团选自由甲磺酸酯基、磺酸酯基和卤素(Cl、Br和I)所组成的组中。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的LDL纳米颗粒，其中，所述亲脂性抗癌剂具有大于4.0、大于6.0或大于8.0的logP。
12.根据权利要求4所述的LDL纳米颗粒，其中，PL:TG:CE:C的重量比在73:12:2:1至78:12:2:1的范围内；任选地还包含选自由以下所组成的组中的添加剂：三油酸甘油酯、天然抗氧化剂、BHT、泛醇、泛醇10、维生素E、α-生育酚、γ-生育酚、番茄红素、视黄基衍生物和β胡萝卜素或它们的混合物。
13.根据权利要求12所述的LDL纳米颗粒，其中，PL:TG:CE:C的重量比为77:10:2:1。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的LDL纳米颗粒，还包含选自由P188、P237、P338、P407、SYNPERONICS、PLURONICS和KOLLIPHOR或它们的混合物所组成的组中的泊洛沙姆。
15.一种用于制备稳定的合成低密度脂蛋白(LDL)纳米颗粒的方法，所述纳米颗粒包含：a)亲脂性抗癌剂；b)磷脂(PL)；和c)甘油三酯(TG)；
所述方法包括：
1)将所述亲脂性抗癌剂、磷脂和甘油三酯混合以形成混合物；
2)通过在挥发性溶剂中溶解使所述混合物变均匀；
3)除去所述溶剂；
4)通过将所述混合物在缓冲液中共混以形成乳剂混合物来形成粗乳剂；
5)将所述乳剂混合物在微射流装置中微射流足量的时间以产生100nm或更小的颗粒制剂；和
6)将纳米颗粒制剂通过0.22微米过滤器除菌以获得40nm至80nm范围内的合成LDL纳米颗粒。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，合成低密度脂蛋白(LDL)纳米颗粒混合物，其中所述磷脂选自由以下所组成的组中：磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、对称或不对称的1,2-二酰基-sn-甘油基-3-磷酰胆碱、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酰胆碱、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺、蛋黄磷脂、卵磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、卵磷脂(NOS)及它们的混合物。
17.根据权利要求15或16所述的方法，其中，所述LDL纳米颗粒还包含胆固醇(C)或胆固醇酯(CE)或者胆固醇和胆固醇酯的混合物，所述胆固醇酯选自由胆固醇的C16-22酯、胆固醇及它们的混合物所组成的组中；并且所述甘油三酯选自由豆油、三油酸甘油酯、三棕榈酸甘油酯及它们的混合物所组成的组中。
18.通过权利要求15-17中任一项所述的方法制备的稳定的合成低密度脂蛋白(LDL)纳米颗粒，包含：a)亲脂性抗癌剂；b)磷脂(PL)；和c)甘油三酯(TG)。
19.一种用于治疗患者中癌症的方法，包括给予需要这种治疗的患者治疗有效量的权利要求1-14和权利要求18中任一项所述的稳定的合成低密度脂蛋白(LDL)纳米颗粒。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述癌症选自由以下所组成的组中：白血病、成神经细胞瘤、成胶质细胞瘤、宫颈癌、结肠直肠癌、胰腺癌、肾黑素瘤、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌和头颈癌。
CN201480062013.XA 2013-09-13 2014-09-13 用于癌症化学治疗剂的亲脂性药物和酸不稳定性亲脂性前体药物的靶向递送的纳米颗粒组合物及它们的制备 Pending CN105722506A (zh)

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