CN102048688A - 以胆固醇复合物为中间载体的紫杉醇亚微乳 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种紫杉醇亚微乳剂。本发明的亚微乳剂包含紫杉醇胆固醇复合物、注射用油、注射用水、乳化剂、助乳化剂和等渗剂，所述的紫杉醇胆固醇复合物中紫杉醇与胆固醇的重量比例为1∶0.09～1∶0.90。本发明还公开了紫杉醇亚微乳剂的制备方法和用途。以胆固醇复合物为中间载体，利用胆固醇复合物对药物油溶性的改善，将紫杉醇胆固醇复合物溶于油相，制备平均粒径在600nm以下，pH为4-6的水包油亚微乳剂，用于恶性肿瘤的治疗，具有更高的安全性和有效性。

Description

以胆固醇复合物为中间载体的紫杉醇亚微乳
技术领域
本发明涉及一种以胆固醇复合物为中间载体的紫杉醇亚微乳剂及其制备方法，本发明还涉及该紫杉醇亚微乳剂的用途，属医药制剂技术领域。
背景技术
紫杉醇(paditaxel，Taxol)具有重要的抗肿瘤活性，临床上广泛用于卵巢癌、和乳腺癌、非小细胞肺癌、头癌和颈癌等的治疗。由于其几乎不溶于水(0.006μg/ml)，目前用于临床的紫杉醇注射剂
Figure B2009102369594D0000011
系采用Cremopher EL(聚氧乙基蓖麻油)/乙醇(50∶50，V/V)的混合溶液5ml溶解30mg的紫杉醇制成。由于处方中含有大量的Cremopher EL，易引起体内组胺释放，导致严重的过敏反应。为此，临床使用时需进行如下脱敏处理：治疗前12小时口服地塞米松10mg，治疗前6小时再口服地塞米松10mg，治疗前30～60分钟给予苯海拉明肌注20mg、静注西咪替丁300mg或雷尼替丁50mg。即使如此，临床上仍有5％～30％的病人出现不同程度的过敏反应。此外，以Cremopher EL/乙醇增溶的紫杉醇浓溶液，稀释后存在物理稳定性问题，如环境温度偏低或滴注时间过长，均有可能析出药物，存在安全性隐患。
针对紫杉醇注射剂存在的问题，近十余年来，国内外药剂学工作者开展了广泛的研究。如与环糊精制成包合物，可提高药物溶解度，但大量环糊精的引入临床应用量存在极高的肾毒性。将紫杉醇制成脂质体，单纯用磷脂有聚集现象，而采用磷脂和磷脂酰甘油酯(PC)，用氯仿做溶剂不聚集，但存在脂质体包封率低、易泄漏、有机溶剂不易除尽等问题，产业化发展受到限制。聚合物纳米粒包封率高，长期贮存稳定性良好，但同样存在载药量低、有机溶剂不易除尽的困扰。
利用药物的亲脂性，将药物溶于油中作为油相，以天然磷脂为乳化剂，经高压均质乳化，可制备粒径在600nm以下、满足静脉注射要求的水包油亚微乳。药物存在于乳滴的内油相及油水界面，避免与水及空气接触，在灭菌和贮存过程具有良好的稳定性。作为一种新型的药物传输系统，亚微乳克服了难溶性药物因溶解度低和稳定性差而不利于制成液体制剂的缺陷，与传统的增溶方法相比，处方中无需加入大量的表面活性剂，可避免因Cremopher EL而引发的过敏反应。
亚微乳为热力学不稳定体系，药物在油中溶解度的高低直接影响到亚微乳制备的可行性。紫杉醇不仅水溶性差，且在油中溶解度亦较低，仅为0.25mg/ml，如直接制备亚微乳，载药量极低，无法满足临床治疗的要求，且灭菌和贮存过程中药物易从油相转移至水相，导致破乳、聚集和沉淀。
为提高药物在油相中的溶解度、突破理化性质对紫杉醇亚微乳剂研究的限制，我们前期对“紫杉醇脂质复合物”及“以脂质复合物为中间载体的紫杉醇亚微乳剂”进行了研究，并申请了两项发明专利：申请号为200810168213.X的“紫杉醇脂质复合物”和申请号为200810168212.5的“以脂质复合物为中间载体的紫杉醇亚微乳剂”。
发明专利申请200810168213.X公开的紫杉醇脂质复合物是200810168212.5专利所述的紫杉醇亚微乳剂制备的物质基质。200810168213.X公开的紫杉醇脂质复合物优选的天然脂质材料为蛋黄卵磷脂、大豆磷脂和胆固醇，紫杉醇和脂质材料的重量比例为1∶1～19。由于200810168213.X公开的紫杉醇脂质复合物中脂质材料用量高达紫杉醇的1～19倍，使得200810168212.5公开的“以脂质复合物为中间载体的紫杉醇亚微乳剂”存在如下明显缺陷：
1)脂质摄入量过大：根据紫杉醇每次给药300mg计算，摄入的脂质材料相当于0.3g～5.7g。比如，对于其中作为脂质材料的胆固醇而言，一般认为健康成人每天胆固醇的摄入量最好不超过300mg(相当于1个鸡蛋黄中含的胆固醇量)，但现有专利涉及的复合物及其制剂，按照二者的比例1∶1-19计算，最高摄入量相当于19个鸡蛋黄，明显偏高，存在安全性隐患。
2)亚微乳制备成本高：亚微乳是以复合物为中间载体而制备的，由于复合物中脂质材料的用量高达紫杉醇的1～19倍，使得亚微乳的制备成本明显升高，不符合药物经济学原则；
3)亚微乳剂的包封率低、稳定性差：临床上紫杉醇的单药剂量为135～200mg/m2，即每人每次用药总量约为240-320mg。将紫杉醇脂质复合物作为中间载体溶解于油相制备亚微乳剂时，复合物中脂质材料用量越高，则亚微乳的内油相中所包裹的复合物总量就越多。由于内油相的油滴体积和油水界面的容量是有限的，投入的复合物总量越多，乳剂的包封率就越低，游离到外水相的药物也就越多，亚微乳剂长期贮存的稳定性也就越差。进一步研究表明，200810168212.5公开的“以脂质复合物为中间载体的紫杉醇亚微乳剂”，包封率均低于80％，冰箱贮存12个月含量下降，有关物质明显增加，无法满足临床用药需求。
为提供脂质材料含量低、包封率高、稳定性好的亚微乳剂，本申请经过大量的试验，采用脂质材料用量低的胆固醇复合物为中间载体制备亚微乳剂。胆固醇复合物中，紫杉醇/胆固醇重量比例为1∶0.09～1∶0.90，在胆固醇用量仅为紫杉醇重量0.09～1∶0.90倍的条件，紫杉醇与胆固醇即可完全复合，使药物在油中溶解度得到最大程度的提高。进一步增加胆固醇用量，溶解度趋于稳定，无进一步增加作用。利用复合物对药物油溶性的改善，将其溶解在油相中，通过选用乳化剂、助乳化剂，得到了包封率高、长期贮存质量稳定、胆固醇含量低的紫杉醇亚微乳，从而完成了本发明。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种紫杉醇亚微乳剂，其包含紫杉醇胆固醇复合物、注射用油、注射用水、乳化剂、助乳化剂和等渗剂，在所述紫杉醇胆固醇复合物中紫杉醇与胆固醇的重量比例为1∶0.09～1∶0.90。本发明的亚微乳剂的乳滴平均粒径在600nm以下，优选300nm以下；油相与水相比例为5∶95至35∶65，优选10∶90至30∶70；以紫杉醇计，载药量为0.25mg/ml～5mg/ml，优选0.5mg/ml～2mg/ml。
在本发明中，所述紫杉醇胆固醇复合物可以是按照如下方法1或2制备的，
方法1包括步骤：
a.将紫杉醇与胆固醇按比例混合，加入适量有机溶剂溶解，任选地加入抗氧化稳定剂；
b.在合适的温度条件下搅拌，通过旋转蒸发或喷雾干燥去除有机溶剂，真空干燥即得；
方法2包括步骤：
a.取一定比例的紫杉醇与胆固醇，分别加入适量的不同的有机溶剂溶解，将其混合，任选地加入抗氧化稳定剂；
b.在合适的温度条件下搅拌，通过旋转蒸发或喷雾干燥去除有机溶剂，真空干燥即得。
在上述紫杉醇胆固醇复合物或其制备方法中，紫杉醇与胆固醇的重量比例为1∶0.09～0.90，优选1∶0.15～0.60，更优选1∶0.23～0.45；相应地，紫杉醇与胆固醇的摩尔比为5∶1至0.5∶1，优选3∶1至0.75∶1，更优选2∶1至1∶1。
在上述紫杉醇胆固醇复合物的制备方法中，所述有机溶剂可选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、苯甲醇、丙酮、乙酸乙酯、四氢呋喃、叔丁醇中的一种或多种；优选地，可选自乙醇、丙酮、乙酸乙酯和四氢呋喃中的一种或多种。“适量的有机溶剂”中的“适量”是指本领域技术人员按照常规技术可确定用于溶解紫杉醇与胆固醇的混合物的量，具体地说，紫杉醇与胆固醇复合物在溶液中的浓度以紫杉醇计算，控制在0.5～16mg/ml，优选1.0～8.0mg/ml；“合适的温度条件”系指控制在10℃-70℃，优选35-55℃，例如25℃、35℃、45℃、55℃或70℃。搅拌反应的时间和真空干燥的时间都可以由本领域技术人员按照常规技术确定，比如搅拌反应的时间可以是0.5-3.0小时，例如0.5小时、1.0小时、1.5小时或2.0小时，真空干燥的时间可以是8小时-48小时，例如8小时、12小时、16小时或24小时。所述抗氧化稳定剂可以选自亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、维生素C、EDTA及其盐、维生素E及其衍生物中的至少一种，抗氧化稳定剂的用量是本领域在制备脂质复合物中通常采用的用量，一般不超过复合物总量的1％(重量)。
在本发明中，所述的注射用油选自长链油和中链油中的一种或它们的混合物。所述的长链油选自长链脂肪酸、长链脂肪酸酯和长链脂肪醇中的一种，具体可以选自大豆油、蓖麻油、亚油酸、玉米油、橄榄油、花生油、棉籽油、油酸、单硬脂酸甘油酯、单油酸甘油酯、十六醇；所述的中链油选自中链脂肪酸和中链脂肪酸酯中的一种。优选的长链油为长链脂肪酸酯，具体地为注射用大豆油；优选的中链油为中链脂肪酸甘油酯。
在本发明中，所述的乳化剂为非离子表面活性剂或天然表面活性剂。非离子表面活性剂选自脂肪酸甘油酯、聚氧乙烯脂肪醇醚类、聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯、山梨醇及失水山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯脂肪酸酯类、维生素E衍生物类和聚氧烯烃共聚物中的至少一种；所述的天然表面活性剂选自蛋黄卵磷脂、豆磷脂、胆甾醇和胆酸类、海藻酸钠和壳聚糖中的至少一种。优选的乳化剂为天然表面活性剂，最优选的乳化剂为天然的蛋黄卵磷脂和大豆磷脂。乳化剂在本发明的亚微乳剂中的含量为亚微乳剂组合物总量的0.5％-5％(g/ml)，优选地为1.0％-4.0％(g/ml)，最优选地为1.0％-2.0％(g/ml)。
在本发明中，所述的助乳化剂选自聚乙二醇(PEG)类和泊洛沙姆类。助乳化剂的含量为本发明亚微乳剂总量的0％-5％(g/ml)，优选地为0.5％-3％(g/ml)，最优选地为1.0％-2.0％(g/ml)。
在本发明中，紫杉醇亚微乳的渗透压调节剂(等渗剂)选自甘油、木糖醇、山梨醇(糖)醇和甘露醇中的一种或多种，优选甘油和葡萄糖，更优选甘油。甘油含量为本发明的紫杉醇亚微乳剂总量的1.0-3.0％(g/ml)，优选地为1.5-2.5％(g/ml)。
在本发明中，所述的紫杉醇亚微乳剂还可加入稳定剂，选自油酸、油酸钠和PEG类中的一种，优选的稳定剂为油酸和PEG，更优选地为油酸。油酸的含量为本发明的紫杉醇亚微乳剂总量的0.05-0.5％(g/ml)，优选地为0.1-0.2％(g/ml)。
本发明的紫杉醇亚微乳剂，还可包含抗氧剂，可以选自维生素E或维生素E酯衍生物，优选维生素E。
在本发明中，所述的“一种或其混合物”或“至少一种”是指可以为所选物质中的一种，或者两种的混合物，或者更多种的混合物。
本发明的另一个目的在于提供本发明所述的紫杉醇亚微乳剂的一种制备方法，其包括如下步骤：
Figure B2009102369594D0000051
取注射用水，加入乳化剂、助乳化剂和等渗剂，置组织捣碎机或剪切机中分散制成均匀水相，加热至40-80℃，保温；
另取紫杉醇胆固醇复合物，任选地和稳定剂一起溶于预热至40-80℃的注射用油中，置组织捣碎机或剪切机中分散制成均匀油相；
Figure B2009102369594D0000053
在搅拌条件下，将水相缓缓加入至油相中，10000-20000转/min剪切5-10min，使形成均匀初乳，迅速转移至高压均质机中均质乳化至粒径控制在600nm以下，优选300nm以下，收集全部乳液，用盐酸调节pH至4.0-6.0，优选5.0，并加水适量(至全量)，即得。
本发明还提供紫杉醇亚微乳剂的另一种制备方法，其包括如下步骤：
Figure B2009102369594D0000054
取注射用水，加入助乳化剂和等渗剂，搅拌制成水相，加热至40-80℃，保温；
Figure B2009102369594D0000055
另取紫杉醇胆固醇复合物、乳化剂和/或稳定剂，溶于预热至40-80℃的注射用油中，置组织捣碎机或剪切机中分散制成均匀油相；
Figure B2009102369594D0000056
在搅拌条件下，将水相缓缓加入至油相中，10000-20000转/min剪切5-10min，使形成均匀初乳，迅速转移至高压均质机中乳化，粒径控制在600nm以下，优选100-300nm，收集全部乳液，用盐酸调节pH至4.0-6.0，优选5.0，并加水适量(至全量)，即得。
在本发明的制备方法中，在高压均质机中乳化也可以采用其它乳化方法来实现，只要能够乳化均匀，并且达到所述的粒径即可；温度40-80℃可以为比如40℃、50℃、60℃、60℃或80℃等。
在本发明的制备方法中，调节pH的盐酸的浓度可以本领域常规采用调节PH的盐酸浓度，比如可以为0.1mol/L；其中注射用水、注射用油的用量，本领域技术人员根据本发明所给出的油相和水相的比例完全可以确定；“加水适量(至全量)”是指除了在制备水相时所采用的水的用量之外，本领域技术人员根据常规技术加入水以达到符合本发明所给出的载药量的水的用量。
本发明还提供一种制剂，其包含本发明所述的紫杉醇亚微乳剂，该制剂可以为临床上任何可以使用的剂型，包括输液剂或干乳剂的形式。其中的输液剂是通过如下方法制备的：将本发明所述的紫杉醇亚微乳剂灌装后，经流通蒸汽灭菌或热压灭菌无菌工艺处理，即得；其中的干乳剂是通过如下方法制备的：向本发明所述的紫杉醇亚微乳剂中加入适量支撑剂，经无菌过滤处理后，采用冷冻干燥工艺制成干乳剂。优选的支撑剂为甘露醇，比如5％(w/v)的甘露醇。
本发明还提供本发明的紫杉醇亚微乳剂在制备抗癌药物中的应用，所述的癌为实体瘤，包括卵巢癌、乳腺癌、宫颈癌、非小细胞肺癌、头癌或颈癌、食道癌、肾癌、肝癌和胃癌。
在本发明中，如果没有特别地指出，本文所用的科学和技术术语以及名称都具有与本发明所属领域普通技术人员常规理解相同的意思；并且，如果没有特别地指出，其中所采用的物质及其含量或比例、装置、仪器、制备条件等都是本领域技术人员所熟知的或者其根据本发明的描述可得知的。
本发明提供的紫杉醇亚微乳剂特别地具有如下的优点：
1)制备成本低、胆固摄入量少：本发明的紫杉醇亚微乳使用了脂质材料低的胆固醇复合物为中间载体，因复合物中的胆固醇用量仅为紫杉醇重量0.09～1∶0.90倍，与200810168212.5公开的“以脂质复合物为中间载体的紫杉醇亚微乳剂”的技术相比，本专利申请一方面大大降低了制备成本，另一方面使临床治疗时患者摄入的胆固醇量大大减少。
2)包封率高、稳定性好：临床上紫杉醇的单药剂量为135～200mg/m2，即每人每次约300mg。另根据人体每次可接受的亚微乳体积，紫杉醇亚微乳剂单剂量的体积应控制在100-500ml。由此计算，亚微乳剂中紫杉醇的浓度应控制在0.6mg/ml-3.0mg/ml。200810168212.5公开的“以脂质复合物为中间载体的紫杉醇亚微乳剂”，由于使用的复合物中脂质材料的用量高达紫杉醇的1～19倍，导致紫杉醇亚微乳剂中包裹的复合物总量高达1.2mg/ml--60mg/ml。而本专利申请的亚微乳剂中，因中间载体复合物中的胆固醇用量仅为紫杉醇重量的0.09～1∶0.90倍，则乳剂中包裹的复合物总量仅为1.14mg/ml-3.27mg/m，由此可见，本发明的制剂稳定性好且对人体相当安全。
对于水包油亚微乳剂，脂溶性药物是分布在油相和/或油水界面的，而内油相的油滴体积和油水界面的容量是有限的，投入的复合物总量越多，乳剂的包封率就越低，游离到外水相的药物就越多，亚微乳剂长期贮存的稳定性也就越差。与200810168212.5的公开技术相比，本专利因使用了脂质材料用量低的胆固醇复合物作为中间载体，油相中包裹的复合物总量大大减少，有利于提高亚微乳剂的包封率、降低水相中游离药物、提高制剂稳定性。
对比研究结果表明，200810168212.5公开的亚微乳剂包封率在70-80％范围内，冰箱贮存至12个月出现分层，含量明显下降，杂质由初始时的1％以下升高至3.5％以上；而本专利申请的亚微乳制剂包封率在90％以上，冰箱贮存12个月，外观、粒径及含量均无明显变化，杂质虽略有升高，但杂质总含量仍低于2.0％，质量稳定。
3)安全性好、耐受剂量大：与市售普通注射液相比，本发明提供的亚微乳剂，不含乙醇和Cremopher EL，降低了紫杉醇制剂的血管刺激性，避免了由Cremopher EL引发的过敏反应和毒副作用，安全性提高，耐受剂量增加，为提高用药剂量、改善治疗效果奠定了良好基础。此外，因中间载体的紫杉醇含量高、胆固醇用量低，使单位体积内的亚微乳中所含的胆固醇含量大幅下降，从而减少了临床应用时因胆固醇摄取量过大而可能引发的不良反应。
下面将参照附图说明和实施例进一步详细阐述本发明，但是本领域技术人员应当理解，但本发明并不限于这些实施例以及使用的制备方法。而且，本领域技术人员根据本发明的描述可以对本发明进行对其进行等同替换、组合、改良或修饰，但这些都将包括在本发明的范围内。
附图说明
附图1(图A、B、C、D和E)：试验例2亚微乳的稳定性HPLC考察图谱。(A)亚微乳4(初始)；(B)空白乳剂；(C)亚微乳4于4℃贮存6个月；(D)亚微乳4于4℃贮存12个月；(E)亚微乳26于4℃贮存12个月
附图2：试验例5药效学试验的动物体重变化曲线。
具体实施方式
实施例1紫杉醇胆固醇复合物
共制备6组复合物，其中复合物1和复合物2的胆固醇用量在本发明要求的范围内，即紫杉醇/胆固醇重量比例在1∶0.09～1∶0.90之间；复合物3至复合物6的胆固醇用量较高，超出本发明要求的范围，具体为1∶1.37～1∶9.06。复合物3至复合物6用于后续乳剂包封制备及包封的对比研究。上述6组紫杉醇/胆固醇复合物的组成参见下表。
表1：紫杉醇/胆固醇复合物的组成
  复合物编号   紫杉醇   胆固醇   紫杉醇/胆固醇(重量比)
  复合物1   8.0g   3.6g   1∶0.45
  复合物2   8.0g   7.2g   1∶0.90
  复合物3   3.0g   4.11g   1∶1.37
  复合物4   3.0g   6.78g   1∶2.26
  复合物5   3.0g   13.5g   1∶4.50
  复合物6   3.0g   27.18g   1∶9.06
上述6组紫杉醇/胆固醇复合物的制备方法：
分别按上述处方量称取紫杉醇和胆固醇，置于三角瓶中，加入丙酮2000ml将其溶解，在40℃温度条件下搅拌1小时，移至旋转蒸发仪中，旋转蒸发法去除溶剂，经40℃减压真空干燥24小时，得到复合物1-6。
实施例2：以紫杉醇胆固醇复合物为中间载体的紫杉醇亚微乳剂
[处方组成]
Figure B2009102369594D0000081
*复合物1为实施例1中制备得到的紫杉醇/胆固醇复合物1。
[制备方法]
Figure B2009102369594D0000092
取注射用水约130-140ml，按处方量加入蛋黄卵磷脂、泊洛沙姆(188)和甘油，置组织捣碎机中分散，制成均匀水相，加热至40℃，保温；
按处方量量取大豆油，预热至40℃，称取实施例1制备的紫杉醇胆固醇复合物1，溶于预热的大豆油中，置组织捣碎机中分散制成均匀油相；
Figure B2009102369594D0000094
在搅拌条件下，将水相缓缓加入至油相中，以10000转/min剪切5min，使形成均匀初乳，迅速转移至高压均质机中，均质6次，收集全部乳液，用0.1mol/L盐酸调节pH至4.0，并加水至200ml，摇匀，分装，115℃灭菌30分钟，即得。
亚微乳1-亚微乳4，乳化剂(蛋黄卵磷脂)用量分别为亚微乳剂总量的1.0％(g/ml)、1.2％(g/ml)、1.5％(g/ml)和1.5％(g/ml)，助乳化剂泊洛沙姆(188)用量为亚微乳剂总量的0.5％(g/ml)、1.0％(g/ml)、2.0％(g/ml)和3.0％(g/ml)，紫杉醇的载药量分别为0.5mg/ml，1.0mg/ml，2.0mg/ml，4.0mg/ml。激光粒度测定仪测定，4组乳剂平均粒径分别为225nm，233nm，245nm，230nm。
实施例3：以紫杉醇胆固醇复合物为中间载体的紫杉醇亚微乳剂
[处方组成]
Figure B2009102369594D0000095
*复合物2为实施例1中制备得到的紫杉醇/胆固醇复合物2。
[制备方法]
Figure B2009102369594D0000101
取注射用水约130-140ml，按处方量加入泊洛沙姆(188)和甘油，置组织捣碎机中分散，制成均匀水相，加热至80℃，保温；
Figure B2009102369594D0000102
按处方量量取大豆油，预热至80℃，按处方量称取复合物2和蛋黄卵磷脂，加至预热的大豆油中，置组织捣碎机中分散溶解制成均匀透明的油相；
Figure B2009102369594D0000103
在搅拌条件下，将水相缓缓加入至油相中，以20000转/min剪切10min，使形成均匀初乳，迅速转移至高压均质机中，均质6次，收集全部乳液，用0.1mol/L盐酸调节pH至6.0，并加水至200ml，摇匀，分装，115℃灭菌30分钟，即得。
亚微乳5-亚微乳8，乳化剂(蛋黄卵磷脂)用量分别为亚微乳剂总量的1.0％(g/ml)、1.2％(g/ml)、1.5％(g/ml)和1.5％(g/ml)，助乳化剂泊洛沙姆(188)用量为亚微乳剂总量的1.2％(g/ml)、2.0％(g/ml)、2.0％(g/ml)和3.0％(g/ml)，紫杉醇的载药量分别为0.5mg/ml，1.0mg/ml，2.0mg/ml，4.0mg/ml。激光粒度测定仪测定，4组乳剂平均粒径分别为246nm，262nm，231nm，242nm。
实施例4：以紫杉醇胆固醇复合物为中间载体的紫杉醇亚微乳剂
[处方组成]
Figure B2009102369594D0000104
*复合物1为实施例1中制备得到的紫杉醇/胆固醇复合物1。
[制备方法]
同实施例2。
亚微乳9-亚微乳12，乳化剂(蛋黄卵磷脂)用量分别为亚微乳剂总量的1.2％(g/ml)、1.2％(g/ml)、1.2％(g/ml)和1.5％(g/ml)，助乳化剂泊洛沙姆(188)用量均为亚微乳剂总量的2.0％(g/ml)，紫杉醇的载药量分别为0.5mg/ml，1.0mg/ml，2.0mg/ml和5.0mg/ml。激光粒度测定仪测定，4组乳剂平均粒径分别为165nm，153nm，127nm，138nm。
实施例5：以紫杉醇胆固醇复合物为中间载体的紫杉醇亚微乳剂
[处方组成]
Figure B2009102369594D0000111
*复合物1为实施例1中制备得到的紫杉醇/胆固醇复合物1。
**油混合物为大豆油/中链油(体积比1∶1)的混合物。
[制备方法]
同实施例3。
亚微乳13-亚微乳16，乳化剂(蛋黄卵磷脂)含量分别为亚微乳剂总量的1.0％(g/ml)、1.2％(g/ml)、1.2％(g/ml)和2.0％(g/ml)，助乳化剂泊洛沙姆(188)用量为亚微乳剂总量的1.5％(g/ml)、1.5％(g/ml)、2.0％(g/ml)和2.0％(g/ml)，紫杉醇的载药量分别为0.5mg/ml，1.0mg/ml，2.0mg/ml和5.0mg/ml。激光粒度测定仪测定，4组乳剂平均粒径分别为165nm，153nm，127nm，138nm。
实施例6：以紫杉醇胆固醇复合物为中间载体的紫杉醇亚微乳剂
[处方组成]
*复合物2为实施例1中制备得到的紫杉醇/胆固醇复合物2。
**油混合物为大豆油/中链油(体积比1∶1)的混合物。
[制备方法]
同实施例2。
亚微乳17-亚微乳20，乳化剂(蛋黄卵磷脂)含量分别为亚微乳剂总量的1.5％(g/ml)、1.5％(g/ml)、2.0％(g/ml)和3.0％(g/ml)，助乳化剂泊洛沙姆(188)用量为亚微乳剂总量的2.0％(g/ml)、2.0％(g/ml)、3.0％(g/ml)和3.0％(g/ml)，的紫杉醇的载药量分别为0.5mg/ml，1.0mg/ml，2.0mg/ml和5.0mg/ml。激光粒度测定仪测定，4组乳剂平均粒径分别为255nm，263nm，285nm，232nm。
实施例7：以紫杉醇胆固醇复合物为中间载体的紫杉醇亚微乳剂
[处方组成]
Figure B2009102369594D0000122
Figure B2009102369594D0000131
*复合物1为实施例1中制备得到的紫杉醇/胆固醇复合物1。
**油混合物为大豆油/中链油(体积比1∶1)的混合物。
[制备方法]
同实施例3。
亚微乳21和22中，脂肪酸甘油酯乳化剂的用量为亚微乳剂总量的1.5％(g/ml)和2.0％(g/ml)，亚微乳23和24使用聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯为乳化剂、用量为亚微乳剂总量的2.0％(g/ml)和3.0％(g/ml)。亚微乳21-亚微乳24中，助乳化剂泊洛沙姆(188)的用量为亚微乳剂总量的1.5％(g/ml)、2.0％(g/ml)、2.0％(g/ml)和3.0％(g/ml)，紫杉醇的载药量分别为0.5mg/ml，1.0mg/ml，2.0mg/ml和4.0mg/ml。激光粒度测定仪测定，4组乳剂平均粒径分别为145nm，133nm，126nm，158nm。
实施例8：以紫杉醇胆固醇复合物为中间载体的干乳剂
取实施例2-实施例7制备的24组亚微乳剂各50ml，加入3％(w/v)甘露醇，搅拌使溶解，经0.2μm微孔滤膜过滤，进行冷冻干燥，即得干乳剂。
试验例
试验例1：不同胆固醇用量的复合物对亚微乳剂包封率的影响考察
Figure B2009102369594D0000132
包封率测定方法：
亚微乳剂中药物总量测定：精密量取乳剂10mL，置250mL容量瓶中，加入无水乙醇破乳后稀释至刻度，摇匀，作为供试液；另精密称取紫杉醇对照品适量，用无水乙醇溶解并稀释成浓度为40μg/mL的溶液，作为对照液。精密量取供试液和对照液各20μL注入色谱仪，以Kromasil-C18(300mm×4.6mm，5μm)为色谱柱，乙腈-水(54∶46)为流动相，流速1.0mL/min，检测波长230nm，柱温为室温，进样量10μL。记录色谱图，根据峰面积按外标法计算乳剂中紫杉醇浓度和乳剂中的药物总量，记为W总。
水相中所含的药物测定：取乳剂10mL，以40,000r/min、16℃超速离心4.0h，使乳剂分层，自上到下依次为油层、乳化剂层和水溶液层。记录水溶液层的体积，小心地除去上层油层和乳化剂层后，小心吸取下层澄清水溶液，经0.22μm膜过滤，取续滤液直接进样，按上述HPLC法测定测定水相中药物浓度，并根据水相体积计算所含药物的量，记为W水相。
油相和油水界面所含的药物总量：W油相+油水界面＝W总-W水相，
Figure B2009102369594D0000141
亚微乳剂1～亚微乳剂24的包封率测定结果
取实施例2-实施例7制备的24组亚微乳剂，照上述方法测定并计算包封率，显示在下表2中。结果表明，当中间载体中的胆固醇用量为紫杉醇重量的0.09～0.90时，制得的不同载药量的亚微乳剂的包封率均在90％以上，表明游离在水相中的药物较少。
表2：24组亚微乳剂的包封率测定结果
  亚微乳样品号   包封率   亚微乳样品号   包封率
  亚微乳1   96.2％   亚微乳13   92.8％
  亚微乳2   95.1％   亚微乳14   95.1％
  亚微乳3   95.7％   亚微乳15   94.8％
  亚微乳4   93.5％   亚微乳16   90.8％
  亚微乳5   94.7％   亚微乳17   93.5％
  亚微乳6   93.8％   亚微乳18   93.8％
  亚微乳7   92.7％   亚微乳19   94.6％
  亚微乳8   96.3％   亚微乳20   95.2％
  亚微乳9   95.2％   亚微乳21   93.2％
  亚微乳10   91.9％   亚微乳22   96.1％
  亚微乳11   93.6％   亚微乳23   93.2％
  亚微乳12   93.5％   亚微乳24   94.6％
Figure B2009102369594D0000143
亚微乳剂25～亚微乳剂28的包封率测定结果
取实施例1项下制备的复合物3-复合物6，参照实施例2亚微乳剂制备方法，制备亚微乳剂25～亚微乳剂28，用于对比研究。具体处方、制备方法及测得的包封率结果如下：
[处方组成]
Figure B2009102369594D0000151
*复合物3、4、5、6分别为实施例1中制备得到的紫杉醇/胆固醇复合物3、4、5、6。
[制备方法]
取注射用水约130-140ml，按处方量加入蛋黄卵磷脂、泊洛沙姆(188)和甘油，置组织捣碎机中分散，制成均匀水相，加热至40-80℃，保温；
按处方量量取大豆油，预热至40-80℃，称取实施例1制备的紫杉醇胆固醇复合物1，溶于预热的大豆油中，置组织捣碎机中分散制成均匀油相；
在搅拌条件下，将水相缓缓加入至油相中，10000-20000转/min剪切5-10min，使形成均匀初乳，迅速转移至高压均质机中，均质6次，收集全部乳液，用0.1mol/L盐酸调节pH至4.0-6.0，并加水至200ml，摇匀，分装，115℃灭菌30分钟，即得。
[包封率测定]
取亚微乳剂25至亚微乳剂28，照上述包封率测定方法依法测定，结果表明，包封率都在80％以下，详见下表：
表3：亚微乳剂25～亚微乳剂28的包封率测定结果
  亚微乳样品号   包封率
  亚微乳25   79.1％
  亚微乳26   77.3％
  亚微乳27   75.5％
  亚微乳28   75.3％
试验例2：以紫杉醇胆固醇复合物为中间载体的亚微乳剂的稳定性考察
取实施例2-实施例7制备的24组亚微乳剂及上述试验例1中制备的亚微乳剂25-28，分别于25℃条件下贮存12个月，于3、6、12个月取样，照如下方法考察外观、粒径、含量及杂质变化。
性状：目视法，按实物描述亚微乳剂的颜色，记录表面是否有油滴或分层现象。
粒径：取亚微乳剂，采用MASTER SIZER 2000激光粒度测定仪(MALVERN)测定粒径。
含量及有关物质：精密量取紫杉醇亚微乳剂适量，加无水乙醇破乳，制备合适浓度的供试溶液。精密量取供试液20μL注入色谱仪，照HPLC法，以Kromasil-C18(300mm×4.6mm，5μm)为色谱柱，乙腈-水(54∶46)为流动相，流速1.0mL/min，检测波长230nm，柱温为室温，依法测定，记录色谱图，根据峰面积按外标法计算乳剂中药物含量，按归一化法计算杂质含量。
测定结果：详见下表。
表4以胆固醇复合物为中间载体的紫杉醇亚微乳剂的稳定性
Figure B2009102369594D0000161
Figure B2009102369594D0000171
结论：与初始相比，亚微乳1-亚微乳24的样品，在放置过程中外观无明显变化，均为均匀乳白色溶液，未见分层或油滴析出现象；平均粒径在300nm±100nm范围内，无明显变化；含量均为标示量的97.5％-102.2％，无明显变化；杂质虽略有增加，但贮存6个月的样品杂质总含量小于1.5％，12个月的样品杂质总含量小于2.0％，质量比较稳定。
与初始相比，亚微乳25-亚微乳28的样品放置6个月后，外观无明显变化，均为均匀乳白色溶液，未见明显分层或油滴析出现象；平均粒径在300nm±100nm范围内，无明显变化；含量为标示量的98％以上，无明显变化；杂质虽略有增加，但杂质总含量小于1.5％，比较稳定。但贮存至12个月后的样品，外观出现分层现象；含量为95.5％-96.2％，有明显下降趋势；杂质总含量明显增加，由初始时的小于1％增加至3.5％以上。
试验例3：紫杉醇亚微乳剂致敏性试验
试验药物：
受试药物溶液：实施例5制得的亚微乳剂15；
参比制剂溶液：市售紫杉醇注射液(规格为5ml∶30mg)，临用前用生理盐水稀释制成含紫杉醇浓度为2mg/ml的溶液；
阳性对照药溶液：1.0％的卵白蛋白；
空白乳剂溶液：根据实施例5的亚微乳剂15处方组成，不加入紫杉醇胆固醇复合物，制备空白乳剂；
空白溶媒：Cremophor EL与无水乙醇按1∶1(v/v)混合，即得(模拟市售紫杉醇注射液的处方，其中不加入紫杉醇，)，临用时用生理盐水稀释3倍；
试验方法：
取健康豚鼠30只，体重300g±20g，随机分成5组，每组6只，雌雄各半。试验开始前，动物预先饲养1周以观察其活动表现。各组豚鼠隔日腹腔注射受试药物溶液(亚微乳剂组)、参比制剂溶液(参比制剂组)、阳性对照溶液(阳性对照组)、空白乳剂(空白乳剂组)和空白溶媒(空白溶媒组)各0.3ml，共注射3次，使其致敏，其中受试药物组的紫杉醇剂量为2mg/kg；于最后一次次给药后第12d，各组动物分别静脉注射受试药物溶液、参比制剂溶液、阳性对照溶液、空白乳剂和空白溶媒各1.0ml，进行激发，其中受试药物组的紫杉醇激发剂量为6mg/kg。观察各组豚鼠在静脉注射后的动物的反应，结果见下表。
表5：紫杉醇亚微乳过敏性试验
Figure B2009102369594D0000191
结果表明，市售紫杉醇注射液及其空白溶媒组均出现强过敏反应，而紫杉醇亚微乳剂及空白亚微乳剂组均无明显的过敏反应症状。
试验例4：紫杉醇亚微乳剂急性毒性评价
试验药物：
亚微乳受试溶液：实施例5制得的亚微乳剂15；
参比制剂溶液：市售紫杉醇注射液(规格为5ml∶30mg)，临用前用生理盐水稀释制成含紫杉醇浓度为2mg/ml的溶液；
试验动物：
昆明种小鼠70只，♀，体重20±2g(中国医学科学院实验动物所提供)。
试验方法：
小鼠按体重随机分成7组，每组10只，各组分别按如下方案给药：
组1：参比制剂溶液，按25mg/kg剂量单次给药；
组2：参比制剂溶液，按29mg/kg剂量单次给药；
组3：参比制剂溶液，按29mg/kg剂量给药后间隔4天重复给药一次；
组4：亚微乳受试溶液：，按29mg/kg剂量连续2天给药；
组5：亚微乳受试溶液：，按29mg/kg剂量连续3天给药；
组6：亚微乳受试溶液：，按29mg/kg剂量给药后间隔4天重复给药一次；
组7：亚微乳受试溶液：，按44mg/kg剂量单次给药。
毒性结果见下表，体重变化曲线见附图2。
表6急性毒性试验结果
Figure B2009102369594D0000192
组1、组2和组3的结果显示，参比制剂给药后出现明显的毒性，其中组1和组2均有1只动物死亡，组3有2只动物死亡。组4-组7的亚微乳剂组，均无明显即时反应，无动物死亡。
组1和组7均为单次给药，但组7的剂量是组1的1.765倍，而组7出现的毒性明显低于组1，由此表明，紫杉醇制成亚微乳后，与参比制剂(市售注射液)相比，毒性降低、耐受剂量增加。
试验例5：紫杉醇亚微乳剂药效学考察
在耐受剂量条件下提高亚微乳剂的给药剂量，试验方案如下：
取人卵巢癌A2780异种移植瘤裸鼠36只，随机分为4组，按如下方案给药。
A.阴性对照1组：不给药，肿瘤自然生长组；
B.参比制剂组：市售紫杉醇注射液(规格为5ml∶30mg)，临用前用生理盐水稀释制成含紫杉醇浓度为2mg/ml的溶液；22.5mg/kg剂量间隔3日给药1次，共给药3次，总剂量为67.5mg/kg。
C.亚微乳受试组：实施例5制得的亚微乳剂15(载药量为2mg/ml)，分别按如下2种剂量给药：
41.1mg/kg剂量间隔3日给药1次、共给药3次，总剂量为124.2mg/kg；
22.5mg/kg剂量，连续3天给药后，停药7天重复1疗程，总剂量为135mg/kg。
给药后，每周测量动物肿瘤长、宽径及体重2～3次。计算肿瘤体积(TV)及相对肿瘤体积(RTV)，绘制肿瘤体积生长变化图。
抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率T/C(％)，按如下公式计算：
Figure B2009102369594D0000202
疗效评价标准：T/C(％)＞60为无效；
              T/C(％)≤60，并经统计学处理P＜0.05为有效。
药效学评价结果见下表。
表7不同方案的相对肿瘤增殖率
Figure B2009102369594D0000211
**：p＜0.05
结果显示，与阴性对照组比较，参比制剂(市售注射液)和亚微乳受试组均可明显抑制人卵巢癌A2780裸鼠异种移植瘤生长。
参比制剂组肿瘤相对增殖率T/C＝33.2，但出现2只动物死亡，已超出耐受剂量。
亚微乳受试组两种剂量组的肿瘤相对增殖率T/C分别为29.0和28.3，且无明显即时反应和小鼠死亡，安全性好。
综上所述，在耐受剂量允许范围内，增加紫杉醇亚微乳的剂量或增加疗程，可提高治疗效果。

Claims (16)

1.一种紫杉醇亚微乳剂，其特征在于，其包含紫杉醇胆固醇复合物、注射用油、注射用水、乳化剂、助乳化剂和等渗剂，在所述紫杉醇胆固醇复合物中紫杉醇与胆固醇的重量比例为1∶0.09～1∶0.90，优选1∶0.15～0.60。
2.根据权利要求1所述的亚微乳剂，其特征在于，所述亚微乳剂的乳滴平均粒径在600nm以下，油相与水相比例为5∶95至35∶65，以紫杉醇计，载药量为0.25mg/ml～5mg/ml；优选地，乳滴平均粒径在300nm以下，油相与水相比例为10∶90至30∶70，以紫杉醇计，载药量为0.5mg/ml～2mg/ml。
3.根据权利要求1或2的亚微乳剂，其特征在于，所述的注射用油选自长链油和中链油中的一种或其混合物；所述的长链油选自长链脂肪酸、长链脂肪酸酯和长链脂肪醇；所述的中链油选自中链脂肪酸和中链脂肪酸酯。
4.根据权利要求3的亚微乳剂，其特征在于，所述的注射用油为长链脂肪酸酯，所述的中链油为中链脂肪酸甘油酯。
5.根据权利要求1或2的亚微乳剂，其特征在于，所述的乳化剂为非离子表面活性剂或天然表面活性剂；所述的非离子表面活性剂选自脂肪酸甘油酯、聚氧乙烯脂肪醇醚类、聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯、山梨醇及失水山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯脂肪酸酯类、维生素E衍生物类和聚氧烯烃共聚物中的至少一种；所述的天然表面活性剂选自蛋黄卵磷脂、豆磷脂、胆甾醇和胆酸类、海藻酸钠和壳聚糖中的至少一种，优选蛋黄卵磷脂和大豆磷脂。
6.根据权利要求5所述的亚微乳剂，其特征在于，所述的乳化剂的含量为所述亚微乳剂总量的0.5％-5％(g/ml)，优选1.0％-4.0％(g/ml)，更优选1.0％-2.0％(g/ml)
7.根据权利要求1或2的亚微乳剂，其特征在于，所述的助乳化剂选自聚乙二醇(PEG)类和泊洛沙姆188中的至少一种，优选泊洛沙姆188。
8.根据权利要求7所述的亚微乳剂，其特征在于，所述的助乳化剂的含量为所述亚微乳剂总量的0％-5％(g/ml)，优选0.5％-3％(g/ml)，更优选1.0％-2.0％(g/ml)。
9.根据权利要求1或2的亚微乳剂，其特征在于，所述的等渗剂为甘油、木糖醇、山梨醇(糖)醇和甘露醇中的一种或多种，优选甘油。
10.根据权利要求1至9中任一项的亚微乳剂，其特征在于，其还可包含稳定剂，选自油酸、油酸钠和PEG中的一种，优选油酸。
11.根据权利要求1至9中任一项的亚微乳剂，其特征在于，其还可包含抗氧剂，选自维生素E或维生素E酯衍生物，优选维生素E。
12.根据权利要求1至11中任一项的亚微乳剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
Figure F2009102369594C0000021
取注射用水，加入乳化剂、助乳化剂和等渗剂，置组织捣碎机或剪切机中分散制成均匀水相，加热至40-80℃，保温；
Figure F2009102369594C0000022
另将紫杉醇与胆固醇，按所述比例混合，加入适量有机溶剂溶解，在合适的温度条件下搅拌，去除有机溶剂，真空干燥制得复合物。取紫杉醇胆固醇复合物，任选地和稳定剂一起溶于预热至40-80℃的注射用油中，置组织捣碎机或剪切机中分散制成均匀油相；
Figure F2009102369594C0000023
在搅拌条件下，将水相缓缓加入至油相中，以10000-20000转/分剪切5-10min，使形成均匀初乳，迅速转移至高压均质机中乳化，粒径控制在600nm以下，优选300nm以下，收集全部乳液，用盐酸调节pH至4.0-6.0，并加水适量，即得。
13.根据权利要求1至11中任一项的亚微乳剂的制备方法，其特征在于，可采用如下步骤：
Figure F2009102369594C0000024
取注射用水，加入助乳化剂和等渗剂，搅拌制成水相，加热至40-80℃，保温；
Figure F2009102369594C0000025
另将紫杉醇与胆固醇，按所述比例混合，加入适量有机溶剂溶解，在合适的温度条件下搅拌，去除有机溶剂，真空干燥制得复合物。取紫杉醇胆固醇复合物和乳化剂，溶于预热至40-80℃的注射用油中，置组织捣碎机或剪切机中分散制成均匀油相；
Figure F2009102369594C0000026
在搅拌条件下，将水相缓缓加入至油相中，高速搅拌剪切使形成均匀初乳，迅速转移至高压均质机中乳化，粒径控制在600nm以下，优选100-300nm，收集全部乳液，用盐酸调节pH至4.0-6.0，并加水至适量，即得。
14.一种制剂，其包含权利要求1至11中任一项的紫杉醇亚微乳剂，该制剂为输液剂或干乳剂的形式。
15.根据权利要求14所述的制剂的制备方法，其特征在于，其中的输液剂是通过如下方法制备的：将权利要求1至10中任一项的紫杉醇亚微乳剂经通蒸汽灭菌或热压灭菌无菌工艺处理，灌装，即得；其中的干乳剂是通过如下方法制备的：向权利要求1至10中任一项的紫杉醇亚微乳剂中加入适量支撑剂，经无菌过滤处理后，采用冷冻干燥工艺制成干乳剂。
16.根据权利要求1-11中任一项所述的紫杉醇亚微乳剂或权利要求14的制剂在用于制备治疗卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、头癌症或颈癌、肝癌和胃癌的药物中的应用。
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