CN114588125B - 靶向载药溶栓微泡及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及靶向载药溶栓微泡及其制备方法。本发明的靶向载药溶栓微泡具有包含处于最内层的第一脂质层、处于最外层的第二脂质层和处于第一脂质层和第二脂质层之间的药物水溶液层的复合结构，其中第一脂质层内密闭包裹有惰性气体，并且第二脂质层具有包含血栓靶向性分子的脂质双分子层结构。所述靶向载药溶栓微泡同时具有载药能力和靶向血栓能力。本发明还提供了简化的制备所述靶向载药溶栓微泡的方法。

Description

靶向载药溶栓微泡及其制备方法
技术领域
本发明涉及载药微泡领域，具体地涉及一种具有靶向血栓能力的靶向载药溶栓微泡以及制备该靶向载药微泡的方法。
背景技术
在世界范围内，血栓疾病已成为血管外科的常见病，严重影响人类生命健康。现有的治疗手段包括药物溶栓和机械血栓切除，后者虽然有着较高的再通率，但容易造成严重的血管损伤。使用传统药物(如尿激酶等)溶栓相对安全且适用病症更为广泛，但不可避免的问题是传统溶栓药物特异性差，会对正常组织器官造成损害，同时给药量有限且半衰期短，起到溶栓治疗效果的药物十分有限。所以，发展新型的给药辅助方法来解决传统药物的问题十分重要。
自1968年超声造影剂诞生，微泡作为辅助诊断手段进入了医疗领域，在随后的几十年中，通过将药物包裹于微泡内部或粘附于微泡表面，研发了辅助给药的治疗性微泡。靶向载药微泡是典型的治疗性微泡，并已被广泛应用于血栓治疗的研究中[2]。靶向载药微泡在装载溶栓药物的基础上，依据血栓形成过程中不同物质的表达，选择相应的配体定位血栓表面的受体，再将配体黏附于壳层表面，使得载药微泡具有血栓靶向性。靶向载药微泡可定向运输药物至血栓部位，减少溶栓药物在体内循环中的消耗，到达血栓部位后，在超声作用下可控破坏，释放药物，由于微泡破坏时会对周围的血栓块产生崩解作用，药物更易于向血栓内部渗透，从而加速血栓的溶解，加强局部作用。靶向载药微泡作为新型给药物辅助手段，避免了游离溶栓药物对正常组织的损害，延长了药物半衰期和病变部位药物浓度，有效的突破了传统药物治疗的局限性。
由于脂质具有良好的生物相容性及载药能力，溶栓微泡大多基于脂质壳层，通过在商用造影剂脂质微泡(例如SonoVue等)或自制的脂质微泡表面及壳层内修饰，实现药物载入微泡。目前的脂质溶栓微泡制作步骤都较为繁琐，且较少有制备同时靶向和载药的溶栓微泡。
膜乳化技术是近年来兴起的微泡制造技术，其主要通过多孔玻璃膜(SPG膜)将气液混合剪切，快速制得大量粒径均一的微泡。Melich等人使用SPG膜乳化法制备了以十二烷基硫酸钠(SDS)水溶液维持的无壳层全氟丙烷微泡，在孔径1.1μm的SPG膜上生成了尺寸约10μm的稳定微泡(Melich等，Preparation and Characterization of PerfluorocarbonMicrobubbles Using Shirasu Porous Glass(SPG)Membranes.Colloids andsurfaces.A,Physicochemical and engineering aspects,2019,560(1):233-243)。然而，该技术的缺点在于：使用十二烷基硫酸钠(SDS)表面活性剂来稳定微泡，SDS对人体有害，所以制备的微泡无法用于人体治疗；制造的微泡未装载药物，无法实现药物运输，该微泡也未经靶向修饰，无法实现与受体部位结合；该技术气体仅通过微孔一次剪切分散进入溶液，使得微泡单分散性较差，制造的微泡平均粒径10μm过大，易于引起人体毛细血管(约7μm)堵塞。
根据微泡与药物、靶向配体本身的结构属性如电荷特性等，通过静电吸附作用等可实现在微泡表面负载药物和结合靶向配体分子。李玲等将声诺维微泡(SonoVue)、尿激酶药物(UK)、RGDS肽段(靶向血栓分子)按照一定比列混入生理盐水中，制得靶向载药微泡(李玲等，“携尿激酶靶向微泡造影剂的体外溶栓实验研究”，《中国超声医学杂志》，2009,7(25):628-631)。声诺维的pH值(6.98)低于尿激酶的等电点(PI8.5)，故而带正电荷的尿激酶通过静电吸附作用实现与声诺维(平均电位-31mV)的结合；同时，声诺维的白色冻干粉末中含有高分子聚乙二醇4000，作为一个长分子中间链插入微泡和配体之间，从而实现两者的结合；再者，尿激酶和RGDS均为大分子物质，易于与声诺维的脂质体膜层结合。但是该技术中微泡的载药能力受其球形表面积限制，当外壳层覆满药物后便达到载药能力的峰值。另外，药物吸附在微泡表面，与外环境直接接触，也容易造成药物脱离微泡在环境中游离，导致正常组织出血。
薄膜水化法可以实现将脂质体均匀溶解于水，简单来说，就是将难溶于水的脂质体粉末溶于低沸点的有机溶剂(例如三氯甲烷、叔丁醇等)，利用旋蒸使有机溶剂完全挥发，脂质体在旋蒸瓶内壁上贴合形成薄膜，再加入水溶液(例如Tris、PBS、生理盐水等)，加热至脂质体相变温度，使之溶解在水溶液中。通过在水溶液中混入蛋白药物，可实现脂质体与药物蛋白的结合。陈逸寒等使用薄膜水化法制作了二硬脂酸磷酯酰胆碱(DSPC)、二棕榈酰磷酯酰甘油(DPPG)、聚乙二醇2000修饰二硬脂酸磷酯酰乙醇胺(DSPE-PEG2000)这三种脂质体与尿激酶的混合水溶液，并通过机械振荡器振荡，将混合水溶液与全氟丙烷气体制作成载尿激酶的脂质体微泡(陈逸寒等，“载尿激酶阴离子脂质微泡联合低频超声体外溶栓的效率研究”，《中华核医学与分子影像杂志》，2014,34(2):121-124)。但是机械振荡法难以控制微泡大小，易产生较多尺寸远大于10μm的微泡，而且该方法制作的载药脂质体微泡未经靶向修饰，无法与受体部位结合完成定向药物运输。
CN111886002A公开了一种用于递送药物的超声响应性脂质体微泡的制备方法。其制备过程包括以下步骤：(1)通过薄膜水合法制备脂质第一壳体溶液，再通过机械混合制备脂质体外壳包裹惰性气体的微泡，再通过30nm～1μm孔径过滤器对其剪切，形成尺寸均匀的第一壳体微泡；(2)通过薄膜水合法制备脂质第二壳体溶液，将其与第一壳体微泡以及药物混合，然后照射超声波产生具有内载药层的脂质体微泡，再通过挤出机均匀形成具有内载药层的脂质体微泡；(3)通过将靶向配体与第二壳体结合，实现载药微泡对病原体具备特异性结合能力。然而，该方法操作步骤繁琐，其中步骤(2)改变了第一壳体微泡外环境，且再次对其进行多次剪切易造成其破裂，导致最终靶向载药微泡浓度低。
因此，需要开发一种制备方法简便的能够靶向血栓的载药溶栓微泡。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明的主要目的在于提供一种同时具有载药能力和靶向血栓能力的靶向载药溶栓微泡。
本发明的目的还在于提供简化的制备同时具有载药能力和靶向血栓能力的靶向载药溶栓微泡的方法。
在一方面，本发明提供了一种靶向载药溶栓微泡，该靶向载药溶栓微泡具有包含处于最内层的第一脂质层、处于最外层的第二脂质层和处于第一脂质层和第二脂质层之间的药物水溶液层的复合结构，其中第一脂质层内密闭包裹有惰性气体，并且第二脂质层具有包含血栓靶向性分子的脂质双分子层结构。
在另一方面，本发明提供了一种制备靶向载药溶栓微泡的方法，该方法包括：
将包含脂质的溶液置于容器中，经处理得到脂质体膜；
将包含药物的溶液加入所述具有脂质体膜的容器，得到包含药物的脂质水溶液；和
将所述包含药物的脂质水溶液与惰性气体置于多孔膜两侧，使所述包含药物的脂质水溶液与所述惰性气体通过多孔膜的小孔剪切混合，从而制备靶向载药溶栓微泡；
其中，所述包含脂质的溶液中包含血栓靶向性分子。
与传统方法相比，本发明的靶向载药溶栓微泡制备方法简化了制备工艺，无需采用大型设备，实现了良好的对微泡尺寸的控制，从而避免大尺寸微泡引起毛细血管堵塞，并通过多次来回剪切强化了微泡壳层，从而使得微泡寿命延长。
本发明的靶向载药溶栓微泡同时具备载溶栓药物的能力和靶向血栓的能力，并且相较于传统药物溶栓具有更好的溶栓效果。
附图说明
图1是本发明的一个实施方式的靶向载药溶栓微泡的结构示意图。
图2是显示本发明的一个实施方式的靶向载药溶栓微泡的形态的图。(a)离心管中微泡泡沫上浮分层；(b)显微镜下微泡形貌；(c)载FITC绿色荧光尿激酶靶向微泡的荧光图片。
图3是示出本发明的一个实施方式的靶向载药溶栓微泡在不同的膜乳化剪切次数下的粒径和稳定性的图。(a)不同剪切次数后的微泡平均粒径；(b)不同剪切次数后微泡低温存储48小时内的浓度变化。
图4是尿激酶标准浓度曲线图。
图5是显示使用本发明的一个实施方式的靶向载药溶栓微泡在不同溶栓条件下处理血栓30分钟后的除栓率的图(sham：生理盐水；Drug：溶栓药物；US+MB：超声+非靶向载药微泡；US+TDMB：超声+靶向载药微泡)。
具体实施方式
在下文中，将更详细地描述本发明的实施方式以帮助理解本发明。应当理解，对于这些实施方式的描述仅出于说明性目的，而并非意在以任何方式对本发明所要求的的保护范围进行限制。
在一方面，本发明提供了一种靶向载药溶栓微泡，该靶向载药溶栓微泡具有包含处于最内层的第一脂质层、处于最外层的第二脂质层和处于第一脂质层和第二脂质层之间的药物水溶液层的复合结构，其中第一脂质层内密闭包裹有惰性气体，并且第二脂质层具有包含血栓靶向性分子的脂质双分子层结构。
图1示出了本发明的一个实施方式的靶向载药溶栓微泡的结构示意图。其中，第一脂质层2处于最内层，其中密闭包裹有惰性气体1。处于最外层的第二脂质层是包含脂质分子4、5、6的脂质双分子层，其中脂质分子6是血栓靶向性分子，脂质分子4和5是非血栓靶向性分子，脂质分子4和5可以相同或不同。包含药物的药物水溶液层3处于第一脂质层和第二脂质层之间。
在本发明的靶向载药溶栓微泡的一个实施方式中，第一脂质层和第二脂质层包含脂质分子。在一个具体实施方式中，所述脂质选自PC合成磷脂、PG合成磷脂和PEG修饰合成磷脂中的至少一种。在一个优选实施方式中，PC合成磷脂选自1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DPPC)、磷脂酰胆碱(HSPC)、1,2-二癸酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DDPC)、1,2-二(顺式-13-二芥酰)-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DEPC)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DOPC)和二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)中的至少一种。在一个优选实施方式中，PG合成磷脂优选选自二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二肉豆蔻酰磷酸甘油(DMPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)和二油酰磷酸甘油(DOPG)中的至少一种。在一个优选实施方式中，PEG修饰合成磷脂选自N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺钠盐(DSPE-mPEG2000-Na)和N-(羰基-甲氧基聚乙二醇5000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺钠盐(DSPE-mPEG5000-Na)中的至少一种。
在本发明的靶向载药溶栓微泡的一个实施方式中，第二脂质层包含血栓靶向性分子。在一个具体实施方式中，血栓靶向性分子选自精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸(RGDS多肽)、谷氨酸-色氨酸-缬氨酸-天冬氨酸-缬氨酸(EWVDV多肽)、半胱氨酸-精氨酸谷氨酸-赖氨酸-丙氨酸(CREKA多肽)和CREKA多肽修饰的磷脂(DSPE-mPEG-CREKA)中的至少一种。其中，RGDs多肽靶向血小板表面受体GPIIb/IIIa蛋白，EWVDV多肽靶向受体P选择素蛋白，CREKA多肽和CREKA多肽修饰的磷脂靶向血栓成分纤维蛋白。
在本发明的靶向载药溶栓微泡的一个实施方式中，血栓靶向性分子与第一脂质层和第二脂质层中的不具有血栓靶向能力的脂质分子的质量比为1:1至1:40，优选地为1:10至1:40、1:20至1:40、1:30至1:40。
在本发明的靶向载药溶栓微泡的一个实施方式中，药物水溶液层包含溶栓药物。在一个具体实施方式中，所述溶栓药物是纤维蛋白溶解剂。在一个优选实施方式中，纤维蛋白溶解剂包括选自第一代纤维蛋白溶解剂、第二代纤维蛋白溶解剂、第三代纤维蛋白溶解剂和其它纤维蛋白溶解剂中的至少一种。在一个优选实施方式中，第一代纤维蛋白溶解剂包括链激酶和尿激酶。在一个优选实施方式中，第二代纤维蛋白溶解剂包括组织型纤溶酶原激活剂。在一个优选实施方式中，第三代纤维蛋白溶解剂包括组组织型纤溶酶原激活剂、替奈普酶和瑞替普酶。在一个优选实施方式中，其它纤维蛋白溶解剂包括去氨普酶、重组人尿激酶原和重组葡激酶。
在本发明的靶向载药溶栓微泡的一个实施方式中，惰性气体包括氟硫基气体和全氟化碳气体。优选地，所述惰性气体包括选自六氟化硫、全氟甲烷、全氟丙烷、全氟乙烷、全氟丁烷、全氟戊烷中的至少一种。
在本发明的靶向载药溶栓微泡的一个实施方式中，所述靶向载药溶栓微泡还包括辅料。在一个具体实施方式中，所述辅料选自棕榈酸和PEG。优选地，所述PEG选自聚乙二醇4000(PEG4000)、聚乙二醇2000(PEG2000)、聚乙二醇1000(PEG1000)以及脂质体修饰的PEG4000、PEG2000、PEG1000中的至少一种。
在另一个方面，本发明提供了一种制备靶向载药溶栓微泡的方法，该方法包括：
将包含脂质的溶液置于容器中，经处理得到脂质体膜；
将包含药物的溶液加入所述具有脂质体膜的容器，得到包含药物的脂质水溶液；和
将所述包含药物的脂质水溶液与惰性气体置于多孔膜两侧，使所述包含药物的脂质水溶液与所述惰性气体通过多孔膜的小孔剪切混合，从而制备靶向载药溶栓微泡；
其中，所述包含脂质的溶液中包含血栓靶向性分子。
在本发明的靶向载药溶栓微泡制备方法的一个实施方式中，将包含脂质的溶液置于容器中之后可以进行真空旋蒸处理。在一个优选实施方式中，所述真空旋蒸处理可以在30℃～42℃进行。
在本发明的靶向载药溶栓微泡制备方法的一个实施方式中，在将包含药物的溶液加入所述具有脂质体膜的容器之后可以进行真空旋蒸处理。在一个优选实施方式中，所述真空旋蒸处理可以在45℃～70℃进行。
在本发明的靶向载药溶栓微泡制备方法的一个实施方式中，包含药物的脂质水溶液与惰性气体的体积比为1：1至120：1，优选为约10：1。
在本发明的靶向载药溶栓微泡制备方法的一个实施方式中，剪切混合可以进行5至40次，优选地进行10至31次。
在本发明的靶向载药溶栓微泡制备方法的一个实施方式中，脂质选自PC合成磷脂、PG合成磷脂和PEG修饰合成磷脂。在一个优选实施方式中，PC合成磷脂选自1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DPPC)、磷脂酰胆碱(HSPC)、1,2-二癸酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DDPC)、1,2-二(顺式-13-二芥酰)-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DEPC)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DOPC)和二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)中的至少一种。在一个优选实施方式中，PG合成磷脂优选选自二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二肉豆蔻酰磷酸甘油(DMPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)和二油酰磷酸甘油(DOPG)中的至少一种。在一个优选实施方式中，PEG修饰合成磷脂选自N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺钠盐(DSPE-mPEG2000-Na)和N-(羰基-甲氧基聚乙二醇5000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺钠盐(DSPE-mPEG5000-Na)中的至少一种。
在本发明的靶向载药溶栓微泡制备方法的一个实施方式中，血栓靶向性分子选自精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸(RGDS多肽)、谷氨酸-色氨酸-缬氨酸-天冬氨酸-缬氨酸(EWVDV多肽)、半胱氨酸-精氨酸谷氨酸-赖氨酸-丙氨酸(CREKA多肽)和CREKA多肽修饰的磷脂(DSPE-mPEG-CREKA)中的至少一种。其中，RGDs多肽靶向血小板表面受体GPIIb/IIIa蛋白，EWVDV多肽靶向受体P选择素蛋白，CREKA多肽和CREKA多肽修饰的磷脂靶向血栓成分纤维蛋白。
在本发明的靶向载药溶栓微泡制备方法的一个实施方式中，包含脂质的溶液中的血栓靶向性分子与不具有血栓靶向能力的脂质分子的质量比为1:1至1:40，优选地为1:10至1:40、1:20至1:40、1:30至1:40。
在本发明的靶向载药溶栓微泡制备方法的一个实施方式中，包含药物的溶液中包含溶栓药物。在一个具体实施方式中，所述溶栓药物是纤维蛋白溶解剂。在一个优选实施方式中，纤维蛋白溶解剂包括选自第一代纤维蛋白溶解剂、第二代纤维蛋白溶解剂、第三代纤维蛋白溶解剂和其它纤维蛋白溶解剂中的至少一种。在一个优选实施方式中，第一代纤维蛋白溶解剂包括链激酶和尿激酶。在一个优选实施方式中，第二代纤维蛋白溶解剂包括组织型纤溶酶原激活剂。在一个优选实施方式中，所述第三代纤维蛋白溶解剂包括组组织型纤溶酶原激活剂、替奈普酶和瑞替普酶。在一个优选实施方式中，其它纤维蛋白溶解剂包括去氨普酶、重组人尿激酶原和重组葡激酶。
在本发明的靶向载药溶栓微泡制备方法的一个实施方式中，惰性气体包括氟硫基气体和全氟化碳气体。优选地，所述惰性气体包括选自六氟化硫、全氟甲烷、全氟丙烷、全氟乙烷、全氟丁烷、全氟戊烷中的至少一种。
在本发明的靶向载药溶栓微泡制备方法的一个实施方式中，包含脂质的溶液中还包含辅料，所述辅料选自棕榈酸和PEG。优选地，所述PEG选自聚乙二醇4000(PEG4000)、聚乙二醇2000(PEG2000)、聚乙二醇1000(PEG1000)以及脂质体修饰的PEG4000、PEG2000、PEG1000中的至少一种。
在本发明中，通过改进的膜乳化技术简化了制备工艺，从而无需使用大型设备而制备载药微泡。此外，与采用传统机械搅拌法或超声乳化法相比，本发明的靶向载药溶栓微泡制备方法能够实现良好的对微泡尺寸的控制，从而避免了因存在大尺寸微泡而引起毛细血管堵塞。而且，通过在乳化期间进行多次来回剪切，强化了微泡壳层，提高了微泡的稳定性，从而得以延长所制备的微泡的寿命。本发明的靶向载药溶栓微泡同时具备载溶栓药物的能力和靶向血栓的能力，并且相较于传统药物溶栓具有更好的溶栓效果。
在下文中，将通过实施例更详细地说明本发明。然而，提供以下实施例仅出于说明性目的，而非意在限制本发明的保护范围。本领域技术人员可以在不脱离本发明的范围和精神的情况下可以进行各种修改和变化，并且所述修改和变化也落在本发明的范围之内。
实施例
实施例1.具有复合结构的靶向载药溶栓微泡的制备
将脂质(DPPG、DSPC、DSPE-mPEG2000-Na、DSPE-mPEG-CREKA分别为10mg、10mg、5mg、3mg)和辅料(PEG-4000和棕榈酸各10mg)溶于叔丁醇中，充分溶解后使用过滤膜滤去未溶解的脂质及辅料，将载有滤液的旋蒸瓶装入旋蒸仪，42℃水浴加热抽真空，转速24rpm条件下，旋蒸12小时，最终得到贴壁脂质体薄膜。将20ml其中混有10万单位溶栓药物尿激酶(UK)的水溶液加入瓶中，55℃水浴加热真空，36rpm旋转1小时后，制成具有靶向血栓能力并与药物结合的脂质水溶液。
将靶向载药脂质水溶液与惰性气体置于多孔膜(10μm)两侧，其体积比约10:1，使两者15次来回通过小孔剪切混合，制成复合结构溶栓微泡，其粒径约为4.2μm，于4℃低温保存48小时后仍稳定性良好。
实施例2.不同剪切次数对复合结构微泡粒径和稳定性的影响
将靶向载药脂质水溶液与六氟化硫气体以体积比10:1置于多孔膜(孔径约10μm)两侧，分别1次、5次、10次、20次、40次和100次来回通过小孔剪切制成靶向载药微泡。对这6组微泡显微镜图片进行图像二值化处理后，计算得到其粒径分布，如图3中(a)所示。结果表明，1次剪切所得微泡平均粒径约7.36±0.892μm，相较于人毛细血管内径(约7μm)，容易引发堵塞，当剪切次数大于5次时，微泡平均粒径降低至小于10μm的安全范围。剪切次数5～40次后可制得粒径较小的安全微泡。
将经过不同剪切次数后制成的微泡于4℃低温保存，统计其48小时内的浓度变化，统计结果如图3中(b)所示。结果表明，剪切次数增加后，微泡的稳定性提高。
实施例3.DSEP-PEG-CREKA与其他脂质的配比对微泡靶向能力的影响
制备DSEP-PEG-CREKA与其他脂质质量比分别为1:1、1:10、1:20、1:30、1:40和1:100的靶向载药溶栓微泡，分别以静脉流速(100s-1)通入富含纤维蛋白的血栓微通道中，记录60秒后血栓表面粘附的微泡数量，结果如表1所示。由表1中的结果表明，在DSEP-PEG-CREKA与其他脂质的质量比大于1:40时，微泡具有良好的血栓靶向能力。当DSEP-PEG-CREKA成分含量极少(与其他脂质质量比为1:100以下)时，微泡几乎无血栓靶向能力。
表1.流动条件下60秒后血栓表面微泡粘附数量与DSEP-PEG-CREKA占比关系
Figure BDA0003520270900000091
实施例4.水合过程中的温度对靶向载药微泡的包封率的影响
将脂质薄膜与尿激酶药物水溶液分别在25℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、100℃下加热水合一小时，得到的脂质体水溶液与六氟化硫气体通过多孔膜乳化形成8组微泡。将微泡离心，除去微泡下清液，再注入等量磷酸盐缓冲液(PBS)清洗，使用1MHz超声作用于微泡重悬液，使其完全破裂，在96孔板中使用蛋白浓度试剂盒对8组裂解液进行染色，再使用酶标仪对其检测，检测结果如表2所示。通过图4中尿激酶蛋白标准浓度拟合曲线公式计算，得到每组裂解液中的药物浓度，从而基于下式得到每组微泡的药物包封率：
包封率＝洗涤除去下清液游离药物后微泡裂解液中药物浓度÷总投入药物浓度
由结果可知，当水合温度范围为45～70℃时，制成的微泡具有较好的药物包封率(＞20％)。
表2 不同水合温度制成的微泡药物包封率
水合温度 45℃ 50℃ 55℃ 60℃ 65℃ 70℃ 25℃ 100℃
检测数值 1.517 1.567 1.640 1.697 1.609 1.585 1.262 1.328
包封率 20.3％ 24.3％ 30.5％ 34.56％ 27.6％ 25.7％ 0.059％ 5.30％
实施例5.复合结构溶栓微泡联合超声体外溶栓实验
将人全血与钙离子水溶液混合静置制备4组血栓，在溶栓处理前对血栓称重，对每组血栓施加不同条件处理：仅加入5ml生理盐水(Sham)；仅加入5ml溶栓药物水溶液(Drug)；加入5ml商用SonoVue造影剂微泡并施加1MHz超声(US+MB)；加入5ml采用实施例1的方法制备的复合结构溶栓微泡并施加1MHz超声(US+TDMB)。每组都处理30分钟后，取出剩余血栓块称重。根据下式计算除栓率：
除栓率＝(溶栓前血栓重量-溶栓后血栓重量)÷溶栓前血栓重量
实验结果如图5所示。结果表明，采用本发明的复合结构溶栓微泡联合超声，相较于其他对照组实现了显著更高的除栓率，除栓率达93.4％。

Claims (18)

1.一种靶向载药溶栓微泡，该靶向载药溶栓微泡具有包含处于最内层的第一脂质层、处于最外层的第二脂质层和处于第一脂质层和第二脂质层之间的药物水溶液层的复合结构，其中第一脂质层内密闭包裹有惰性气体，并且第二脂质层具有包含血栓靶向性分子的脂质双分子层结构，
其中，第一脂质层和第二脂质层包含脂质，所述脂质选自PC合成磷脂、PG合成磷脂和PEG修饰合成磷脂中的至少一种；
所述PC合成磷脂选自1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DPPC)、磷脂酰胆碱(HSPC)、1,2-二癸酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DDPC)、1,2-二(顺式-13-二芥酰)-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DEPC)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DOPC)和二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)中的至少一种；
所述PG合成磷脂选自二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二肉豆蔻酰磷酸甘油(DMPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)和二油酰磷酸甘油(DOPG)中的至少一种；且
所述PEG修饰合成磷脂选自N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺钠盐(DSPE-mPEG2000-Na)和N-(羰基-甲氧基聚乙二醇5000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺钠盐(DSPE-mPEG5000-Na)中的至少一种；
其中，所述血栓靶向性分子选自精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸(RGDS多肽)、谷氨酸-色氨酸-缬氨酸-天冬氨酸-缬氨酸(EWVDV多肽)、半胱氨酸-精氨酸谷氨酸-赖氨酸-丙氨酸(CREKA多肽)和CREKA多肽修饰的磷脂中的至少一种；
所述药物水溶液层中的药物是纤维蛋白溶解剂；
所述惰性气体包括氟硫基气体和全氟化碳气体；并且
所述靶向载药溶栓微泡还包括选自棕榈酸和PEG的辅料。
2.如权利要求1所述的靶向载药溶栓微泡，其中，所述血栓靶向性分子与第一脂质层和第二脂质层中的不具有血栓靶向能力的脂质分子的质量比为1:1至1:40。
3.如权利要求1或2所述的靶向载药溶栓微泡，其中，所述纤维蛋白溶解剂包括选自第一代纤维蛋白溶解剂、第二代纤维蛋白溶解剂、第三代纤维蛋白溶解剂和其它纤维蛋白溶解剂中的至少一种。
4.如权利要求3所述的靶向载药溶栓微泡，其中，所述第一代纤维蛋白溶解剂包括链激酶和尿激酶。
5.如权利要求3所述的靶向载药溶栓微泡，其中，所述第二代纤维蛋白溶解剂包括组织型纤溶酶原激活剂。
6.如权利要求3所述的靶向载药溶栓微泡，其中，所述第三代纤维蛋白溶解剂包括组织型纤溶酶原激活剂、替奈普酶和瑞替普酶。
7.如权利要求3所述的靶向载药溶栓微泡，其中，所述其它纤维蛋白溶解剂包括去氨普酶、重组人尿激酶原和重组葡激酶。
8.如权利要求1或2所述的靶向载药溶栓微泡，其中，所述惰性气体包括选自六氟化硫、全氟甲烷、全氟丙烷、全氟乙烷、全氟丁烷、全氟戊烷中的至少一种。
9.如权利要求1或2所述的靶向载药溶栓微泡，其中，所述PEG选自聚乙二醇4000(PEG4000)、聚乙二醇2000(PEG2000)和聚乙二醇1000(PEG1000)中的至少一种。
10.一种制备权利要求1至9中任一项所述的靶向载药溶栓微泡的方法，该方法包括：
将包含脂质的溶液置于容器中，经处理得到脂质体膜；
将包含药物的溶液加入所述具有脂质体膜的容器，得到包含药物的脂质水溶液；和
将所述包含药物的脂质水溶液与惰性气体置于多孔膜两侧，使所述包含药物的脂质水溶液与所述惰性气体通过多孔膜的小孔剪切混合，从而制备靶向载药溶栓微泡；
其中，所述包含脂质的溶液中包含血栓靶向性分子。
11.如权利要求10所述的方法，其中，将包含脂质的溶液置于容器中之后经真空旋蒸处理。
12.如权利要求10或11所述的方法，其中，将包含脂质的溶液置于容器中之后在30℃～42℃进行真空旋蒸处理。
13.如权利要求10或11所述的方法，其中，在将包含药物的溶液加入所述具有脂质体膜的容器之后进行真空旋蒸处理。
14.如权利要求10或11所述的方法，其中，在将包含药物的溶液加入所述具有脂质体膜的容器之后在45℃～70℃进行真空旋蒸处理。
15.如权利要求10或11所述的方法，其中，所述包含药物的脂质水溶液与惰性气体的体积比为1：1至120：1。
16.如权利要求10或11所述的方法，其中，所述包含药物的脂质水溶液与惰性气体的体积比为约10：1。
17.如权利要求10或11所述的方法，其中，所述剪切混合进行5至40次。
18.如权利要求10或11所述的方法，其中，所述剪切混合进行10至31次。
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