JP2009536612A - 脂質を用いた薬物製剤の高速送達とその処置方法 - Google Patents

Abstract

コアセルベーション技術を用いた、低脂質/薬物比を有する、脂質を用いた薬物製剤の調製の方法を提供する。そのような脂質を用いた薬物製剤を高速で送達する方法、およびそのような脂質を用いた薬物製剤を投与するステップを含む肺疾患患者の処置方法も提供する。

Description

関連出願
本出願は、引用をもってその内容全体を本願明細書に援用する2006年4月6日に提出された米国特許出願第11/398,859号、および2006年7月19日に提出されたPCT特許出願US06/027859号の優先権の利益を主張する。

発明の背景
吸入による投与に好適な徐放技術では、リポソームなどの脂質を用いた薬物製剤を用いて、徐放による肺および全身における薬物の持続的な治療効果と疾患部位への薬物取り込みの標的および促進能力を得ている。

脂質による薬物送達システムのために、脂質対薬物（L/D）比をできるだけ低下させて脂質負荷を最小化し、体内の飽和効果を回避することが望ましいことが多い。吸入による肺送達の場合、これは特に真実かもしれない。慢性使用のせいで、脂質の投与がクリアランスを上回り、製剤の投与を制約するために有効性も限定されることがあるからだ。低L/D比であれば、投与／クリアランス閾値に到達する前にさらに薬物を投与することができる。

発明の概要
本願発明の目的は、脂質対薬物比が低い脂質を用いた製剤を提供することである。

本願発明の目的はさらに、脂質対薬物比が低い脂質を用いた薬物製剤を調製する方法を提供することでもある。

本願発明の目的はさらに、薬物の送達速度をmg/分で測定した速度が高速で、脂質を用いた薬物剤を送達する方法を提供することでもある。

本願発明の目的はさらに、肺感染症の患者を治療する方法であって、低L/D比を含む脂質を用いた薬物製剤を、その必要のある患者に治療上有効な量投与するステップであって、当該薬物が抗感染性であるステップを含む方法も提供する。

本願発明は、低L/D比を有する脂質を用いた薬物製剤を、コアセルベーション（液滴形成）技術を用いて調製することによって実現できるという発見に起因する。

本願明細書に開示される方法によって、典型的には約0.40− 0.49 : 1のL/D重量比で封入された薬物を含む、中程度の大きさ（1μm未満）のリポソームを作成する。リポソームに封入された体積を測定し、その薬物が理想的な溶質としてふるまった（つまりリポソーム膜と相互作用せず、水とともに理想的に封入される）と仮定して、その数値から、理論的な封入量がどれくらいかを計算することができる。この比較から、予想よりも3-5倍の封入値が認められ、予測された封入量よりも大きく、予測されたL/D比よりも低くなるような特別な相互作用が生じていることが示唆される。リポソームが形成される溶液は、一定の薬物濃度を有する。リポソーム内部の薬物濃度は、溶液中の濃度とほぼ同一であるべきである。しかし、内部の薬物濃度の計算値は少なくとも約3倍大きい。現在、この現象は、薬物コアセルベートの周囲に脂質二重層の形成を開始する、薬物コアセルベートの形成によって説明することができるということがわかっている。
本願発明は一部、脂質と活性剤をコアセルベートと混合するステップを含む脂質を用いた活性物質製剤を調製する方法に関連する。さらなる実施態様では、前記コアセルベートは脂質と混合する前に形成する。さらなる実施態様では、前記コアセルベートは脂質と混合している間に形成する。さらなる実施態様では、前記コアセルベートは脂質と混合した後に形成する。さらなる実施態様では、前記コアセルベートは前記活性物質のコアセルベートである。さらなる実施態様では、前記コアセルベートは前記脂質および活性物質以外の第三の成分のコアセルベートである。さらなる実施態様では、前記第三の成分には、前記活性物質と交換可能な対イオンが含まれる。

さらなる実施態様では、前記第三の成分は荷電ポリマーである。さらなる実施態様では、前記荷電ポリマーはアクリレートであって、前記対イオンはアンモニウム対イオンである。さらなる実施態様では、前記脂質とコアセルベートを混合した後に前記活性物質を加え、活性物質が前記対イオンと交換される。

さらなる実施態様では、前記第三の成分は、前記活性物質と複合体化することができるイオンである。さらなる実施態様では、前記イオンは金属イオンである。さらなる実施態様では、前記金属イオンはMg²⁺である。さらなる実施態様では、前記脂質とコアセルベートを混合した後に前記活性物質を加え、その活性物質に前記イオンが配位する。

さらなる実施態様では、前記脂質を有機溶媒に加えて溶液とする。さらなる実施態様では、前記脂質を界面活性物質に加えて水性ミセル懸濁液とする。さらなる実施態様では、前記ミセル懸濁液を水溶液で希釈して前記脂質の沈殿を誘発し、界面活性物質の臨界ミセル濃度（CMC）以下にする。

さらなる実施態様では、pHを変化させることによって前記脂質の沈殿を誘発する。

本願発明は一部、脂質と薬物コアセルベートを混合するステップを含む脂質を用いた製剤を調製する方法に関連する。さらなる実施態様では、前記脂質を有機溶媒に溶解して脂質溶液をつくり、前記薬物の水溶液と脂質溶液を混合して薬物コアセルベートを作成する。さらなる実施態様では、前記脂質溶液と薬物水溶液を、2つの別々のストリームからインラインで混合する。さらなる実施態様では、2つの別々のストリームは、ライン内で混合される前にYまたはT字型連結器に入るさらなる実施態様では、水または食塩水の第三のストリームを加えて、得られた資質と薬物の混合物を希釈する。さらなる実施態様では、前記有機溶媒はエタノールである。

さらなる実施態様では、本願発明は、前記脂質溶液を1L/分の速度で添加し、前記薬物水溶液を1.5L/分で添加する、前述の方法に関連する。さらなる実施態様では、前記脂質溶液を1L/分の速度で添加し、薬物水溶液を1.5L/分の速度で添加し、水または食塩水を1L/分の速度で添加する。

さらなる実施態様では、本願発明は、前記脂質がリン脂質とステロールの混合物である、前述の方法に関連する。さらなる実施態様では、前記リン脂質はジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）であって、前記ステロールはコレステロールである。さらなる実施態様では、DPPC:コレステロールの重量比が2:1である。さらなる実施態様では、前記脂質溶液は20mg/mlであって、薬物水溶液は75mg/mlである。

さらなる実施態様では、本願発明は、前記薬物が抗感染物質である、前述の方法に関連する。さらなる実施態様では、前記抗感染物質は、以下の、アミノグリコシド、テトラシクリン、スルホンアミド、p-アミド安息香酸、ジアミノピリミジン、キノロン、β-ラクタム、β-ラクタムおよびβ-ラクタマーゼ阻害物質、クロラフェニコール、マクロリド、ペニシリン、セファロスポリン、コルチコステロイド、プロスタグランジン、リノマイシン、クリンダマイシン、スペクチノマイシン、ポリミキシンB、コリスチン、バンコマイシン、バシトラシン、イソニアジド、リファンピン、エタムブトール、エチオンアミド、アミノサリチル酸、シクロセリン、カプレオマイシン、スルホン、クロファジミン、タリドミド、ポリエン抗真菌物質、フルシトシン、イミダゾール、トリアゾール、グリセオフルビン、テルコナゾール、ブトコナゾールシクロピラクス、シクロピロクスオラミン、ハロプロギン、トルナフタート、ナフチフィン、テルビナフィン、またはそれらの組み合わせから選択される。さらなる実施態様では、前記抗感染薬はアミノグリコシドである。さらなる実施態様では、前記アミノグリコシドはアミカシンである。さらなる実施態様では、前記アミノグリコシドはトブラマイシンである。さらなる実施態様では、前記アミノグリコシドはゲンタマイシンである。

別の実施態様では、本願発明は、前記脂質対薬物の重量比が0.40-0.49:1である、脂質を用いた薬物製剤に関連する。さらなる実施態様では、脂質を用いた薬物製剤はリポソームである。さらなる実施態様では、前記薬物は抗感染物質である。さらなる実施態様では、前記抗感染物質は、以下の、アミノグリコシド、テトラシクリン、スルホンアミド、p-アミド安息香酸、ジアミノピリミジン、キノロン、β-ラクタム、β-ラクタムおよびβ-ラクタマーゼ阻害物質、クロラフェニコール、マクロリド、ペニシリン、セファロスポリン、コルチコステロイド、プロスタグランジン、リノマイシン、クリンダマイシン、スペクチノマイシン、ポリミキシンB、コリスチン、バンコマイシン、バシトラシン、イソニアジド、リファンピン、エタンブトール、エチオンアミド、アミノサリチル酸、シクロセリン、カプレオマイシン、スルホン、クロファジミン、タリドミド、ポリエン抗真菌物質、フルシトシン、イミダゾール、トリアゾール、グリセオフルビン、テルコナゾール、ブトコナゾール、シクロピラクス、シクロピロクス、ハロプロギン、トルナフタート、ナフチフィン、テルビナフィン、またはそれらの組み合わせから選択される。さらなる実施態様では、前記抗感染物質はアミノグリコシドである。さらなる実施態様では、前記アミノグリコシドはアミカシンである。さらなる実施態様では、前記アミノグリコシドはトブラマイシンである。さらなる実施態様では、前記アミノグリコシドはゲンタマイシンである。

さらなる実施態様では、前記脂質にはリン脂質とステロールの混合物が含まれる。さらなる実施態様では、前記リン脂質はDPPCであって、前記ステロールはコレステロールである。さらなる実施態様では、DPPCとコレステロールの重量比は2:1である。

別の実施態様では、本願発明は脂質を用いた薬物製剤を速度10乃至25 mg/分で送達する方法であって、前述の本願発明の脂質を用いた薬物製剤を20乃至40psiの圧縮機圧力を用いて噴霧するステップを含む方法に関連する。さらなる実施態様では、封入された薬物の保持率は45%超である。さらなる実施例では、脂質を用いた薬物製剤は0.49未満のL/D比を有する。

別の実施態様では、本願発明は、肺感染症患者を治療する方法であって、当該患者に前述の脂質を用いた薬物製剤を治療上有効な量投与するステップを含む、方法に関連する。さらなる実施例では、脂質を用いた製剤は0.49未満のL/D比を有する。さらなる実施態様では、肺感染症は、以下の、シュードモナス属の、緑膿菌（P. aeruginosa）、 P.パウチモビリス（,
P. paucimobilis）、P.プチダ（P. putida）,蛍光菌（P. fluorescens）、および P.アシドボランス（P. acidovorans）、ブドウ球菌属のメシチリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）、レンサ球菌属の肺炎レンサ球菌（Streptococcus pneumoniae）、大腸菌（Escherichia coli）、クレブシエラ（Klebsiella）、 エンテロバクター（Enterobacter）、セラチア（Serratia）、ヘモフィルス（Haemophilus）、 ペスト菌（Yersinia pesos）、類鼻祖菌 （Burkholderia pseudomallei）、セパシア菌（B. cepacia）、首腐病菌（B.
gladioli）、B.マルチボランス（B. multivorans）、B.ベトナミエンシス（B. vietnamiensis）、結核菌（Mycobacterium
tuberculosis）、トリ結核菌複合体（M. avium complex (MAC)）、トリ結核菌 （M. avium）、M. イントラセルラーレ（M. intracellulare）、カンサシ菌（M. kansasii）、M. ゼノピ（M. xenopi）、M.マリナム（M. marinum）、M. ウルセランス（M. ulcerans）、M. フォーチュイタム（M. fortuitum）複合体、M. フォーチュイタム（M. fortuitum）、またはM.ケロネイ（M. chelonei）の感染症である。

別の実施態様では、本願発明は、嚢胞性線維症（CF）が原因の肺感染症患者を治療する方法であって、当該患者に前述の脂質を用いた製剤を治療上有効な量投与するステップを含む、方法に関連する。

本願発明のこれらの実施態様、そのほかの実施態様、およびその性質や特徴は、後述の詳細な説明、図、および請求の範囲から明らかになるであろう。

発明の詳細な説明
本願発明は、薬物周辺に脂質の二重層形成を誘発する、薬物コアセルベートの形成によって調製される、脂質薬物製剤を開示する。本願方法によって低い脂質対薬物比が得られ、その結果、脂質製剤と、外部の薬物濃度よりも3乃至5倍高い内部の薬物濃度を得ることができる。本願発明はまた、コアセルベーション技術を用いたこの脂質製剤の調製方法、この脂質製剤を噴霧によって投与するための高送達速度、およびこの脂質製剤をその必要がある患者に投与するステップを含む肺感染症の治療の方法を開示する。

1. 定義
便宜上、本願発明の詳細な説明の前に、本願明細書、実施例、および添付される特許請求の範囲に用いられる特定の用語をここにまとめる。これらの定義は本願開示の残余の観点から読まれ、当業者に理解されるべきである。他に定義のない限り、本願明細書に用いられたすべての技術および科学用語は、当業者によって普通に理解されるものと同じ意味を有する。

本願明細書で用いられる冠詞「a」および「an」は、その冠詞の文法上の物体1つまたは1つより多い（すなわち少なくとも1つ）を意味する。例として、「an element」は1つの要素または1つより多い要素を意味する。

「生物学的に利用可能な」という用語は当業に知られており、それを可能にする本願発明の形態、または投与される被験体または患者に吸収されるか、取り込まれるか、またはその他の形で生理学的に利用可能な投与量の一部分を意味する。

「含む(comprise)」および「含む(comprising)」は、包含的でオープンな意味での、さらなる要素が含まれるかもしれないという意味で用いられる。

「薬物」という用語は当業に知られており、被験体の局部的または全身的に作用する生物学的、生理学的または薬理学的活性物質である化学部分を意味する。「治療物質」ともよばれる薬物の例は、メルクインデックス、Physicians Desk Reference、およびThe Pharmacological Basis of Therapeuticsなどの公知の参考文献に記述されており、それらには、薬剤、ビタミン、ミネラルサプリメント、疾患の処置、予防、診断、治癒、または緩和に用いられる物質、身体の構造または機能に作用する物質、または生物学的に活性であるか、もしくは生理学的環境に置かれた後にさらに活性になるプロドラッグがそれらに限定されずに含まれる。

「カプセル封入した」および「カプセル封入する」という用語は、脂質を用いた製剤の表面上への薬物の吸着、二重層の内部領域または2つの単層の間における薬物の結合、2つの二重層の間の空間への薬物の捕捉、または最も内部の二重層または単層によって囲まれた空間内への薬物の捕捉を意味する。

本願明細書に用いられる「含まれる(including)」という用語は、「含まれるがそれらに限定されない」という意味で用いられる。「含まれる(including)」および「含まれるがそれらに限定されない」は、交換可能に用いられる。

本願明細書において検討される「脂質抗感染症製剤」または「Lip-抗感染症物質」または「Lip-An」という用語は、抗感染症物質の重量の少なくとも約1％が、脂質との複合体の部分、または抗生物質が水相か疎水性二重層の相かリポソーム二重層の界面頭部領域に存在する可能性のあるリポソームとして、脂質と結合している、いずれかの形状の抗感染症組成物である。好ましくは、少なくとも約5%、または少なくとも約10%、または少なくとも約20%、または少なくとも約25%がそのように結合していてよい。結合は、脂質および脂質に結合した抗感染薬が保持されて遊離した抗感染薬がフィルターに残るように、フィルターで分離して測定することができる。「リポソーム抗感染製剤」は、脂質製剤がリポソームの状態である脂質抗感染製剤である。

「哺乳類」という用語は当業に知られており、例示的な哺乳類にはヒト、霊長類、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、および齧歯類（たとえばマウスおよびラット）が含まれる。

本願発明の方法で処置される「患者」、「被験体」、または「宿主」は、ヒトまたは非ヒト動物のいずれかを意味してよい。

この場合の「薬学的に許容な塩」という用語は当業に知られており、たとえば本願発明の組成物に含有されるものを含む、比較的無毒な無機および有機酸付加塩を意味する。

「溶媒注入」という用語は、少量、好ましくは最少量のプロセスに適合する溶媒に1種類以上の脂質を溶解し、脂質の懸濁液または溶液（好ましくは溶液）を作成するステップと、その後、生活性剤を含有する水性溶媒にその溶液を加えるステップを含むプロセスである。典型的には、プロセスに適合する溶媒は、透析などのように水性プロセスで洗浄することができるものである。冷温を循環させる組成物は、好ましくは溶媒注入によって作成し、エタノール注入が好ましい。アルコールが溶媒として好ましい。溶媒注入の一種である「エタノール注入」は、少量、好ましくは最少量のエタノールで1種類以上の脂質を溶解し、脂質の溶液を作成するステップと、その後、生活性物質を含有する水性溶媒にその溶液を加えるステップを含むプロセスである。「少量」の溶媒とは、注入プロセスにおいてリポソームまたは脂質複合体に適合する量である。「溶媒注入」という用語は、製剤組成物の2つのストリームをインラインで混合する、インライン注入プロセスも含んでよい。

「実質的に含まれない」という文言は当業に知られており、微少量以下を意味する。

本願明細書に用いられる「界面活性物質」という用語は、空気と水の界面に吸着することによって水の表面張力を低下させる化合物を意味する。多くの界面活性物質が、バルク溶液中で集合してミセルとして知られる凝集体になることができる。界面活性物質がミセルを形成し始める濃度は、「臨界ミセル濃度」またはCMCとして知られる。本出願に有用な脂質は、極端に低いCMCを有する界面活性物質であってもよい。本出願に有用なミセル形成界面活性物質は、当該脂質のCMCよりも高いCMCを有するべきである。CMCを超える濃度では、ミセル形成界面活性物質は、表面活性剤と脂質分子からなる混合ミセルを形成することができる。CMC未満での希釈の場合、ミセル形成界面活性物質は、真の溶液に溶解して、水性溶媒に暴された液体分子を残す。これにより、脂質が好ましくは二重層の状態で自然に沈殿する。

本願明細書に用いられる「治療上有効な量」という用語は、肺感染症を阻害することによっていくらかの望ましい治療効果を生じるのに有効な、本願発明に従った脂質製剤を含む化合物、物質、または組成物の量を意味する。

「処置する」という用語は当業に知られており、任意の症状または疾患の少なくとも一つの症状を治癒および軽減することを意味する。「処置する」という用語は、症状または疾患から守るかまたは予防するように作用する、予防的処置も意味する。

2. コアセルベーション
一番単純な形のコアセルベーションは凝集塊であると考えることができる。さらに技術的な意味としては、コアセルベーションはコロイド系の中の2種類の液相への分離である。コロイド成分（薬物）の中で密度の高い方の相をコアセルベートといい、もう片方の相を平衡溶液という。

「コロイドの」という用語は、細分化された状態を意味し、媒質の中に分散している分子または多分子粒子は少なくとも一方向に約1nm乃至1μmの大きさであるか、またはそれくらいの距離のシステム連続性がみとめられることを示唆する。IUPAC Compendium of Chemical Terminology
1972, 31, 605。

高分子の溶液は、単純で最も一般的なコロイド系である。低分子は、可逆性凝集体として会合コロイドを形成することもできる。会合コロイドは、弱い化学結合力による可逆的な化学結合体で、最高で数百個の分子またはイオンが集合して約1乃至約2000ナノメータ以上の大きさのコロイド構造を形成する。

最近のコアセルベーション現象の分類は、2相を分離させるメカニズムに基づいている。 (Gander B,
Blanco-Prieto M.J., Thomasin C, Wandrey Ch. and Hunkeler D., Coacervation/Phase
Separation, In: Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, Vol.1, Swarbrick J,
Boylan J.C., Eds., Marcel Dekker, 2002, p.481-497) それには、以下のものが含まれる。

1. 部分的溶解によって誘発されるコアセルベーション。これは、溶媒とポリマーの二成分系に関与してもよく、その場合、コアセルベーションを誘発する因子は温度とpHである。または、溶媒、ポリマー、およびコアセルベート化物質（ポリマーまたは電解質（塩）の非溶剤）を含む三成分系であってもよい。このタイプのコアセルベーションは単純コアセルベーションと呼ばれることが多い。単純コアセルベーションの古典的な例は、アルコール（ゼラチンの非溶剤）添加によるゼラチン溶液のコアセルベーションである。水溶液系においてコアセルベーションを誘導するのに有用なその他の非溶剤には、プロパノール、イソプロパノール、エセトン、ジオキサンが含まれてよい。ポリマーの溶解に電解質が用いられる場合、その現象は塩析と呼ばれる。水溶液系では、イオンが脱水を生じる能力は、塩析力に従って、カチオンの場合はNH4⁺
< K⁺ < Na⁺ < Ca²⁺ < Mg²⁺
< Al³⁺、Cl^-
< SO4^2- < 酒石酸^2-、リン酸^2- < クエン酸^3-のホフマイスターまたは離液順列に従う。

2. ポリマー-ポリマー反発によって誘発されるコアセルベーションこのタイプの場合、最初のポリマーの溶液に添加される第２のポリマーは相分離を誘発し、第２のポリマー相に懸濁させたコアセルベート相の中に第１のポリマーがある。ポリマー-ポリマー反発の例は、シリコーン油によって誘発されたジクロロメタン溶媒の中のPLAコアセルベーションである。

3. 非共有結合ポリマー架橋結合により誘発されたコアセルベーション（複合コアセルベーション）。架橋剤はコアセルベーションポリマーと反対の電荷か、Ca²⁺、Mg²⁺、Al³⁺、Zn²⁺、および酒石酸 ^2-などの二または三価対イオンのポリマーであってよい。複合コアセルベーションに用いられる典型的なポリマーには、ポリアニオンのアルギナート、カラギーナン、カルボキシメチルセルロース、硫酸コンドロイチン、硫酸セルロース、ゲラン、ヒアルロン酸、ポリ（アクリル酸）、キサンタン、ポリカチオンのキトサン、ポリ（塩化ジアリルジメチルアンモニウム）、ポリ（L-リシン）、ポリ（ビニルアミン）が含まれる。一般に、ポリアニオン-ポリカチオン相互作用は、電荷密度、イオン基のタイプ、鎖の構造など、たくさんのパラメータによって制御されている。さらに、pH、イオン強度、濃度、温度が複合体の形成に影響する。

明らかに、上述のタイプの組み合わせを用いてコアセルベーションを制御することができる。特に、架橋剤、または非溶剤および脱塩剤と組み合わせた非溶剤の添加である。

図１０は、硫酸アミカシン−水−エタノールシステムの三元状態図を示す。2項曲線下の2相領域は、この系が、コアセルベート相と平行相の2相に分かれている領域である。2項曲線上の領域は、水-エタノール混合物に溶解した硫酸アミカシンの一液相システムが存在する領域である。70mg/mLにおける硫酸アミカシン水溶液3パート（ポイント1）をエタノール2パートと混合する場合、得られた混合物は、自然にアミカシンが豊富なコアセルベート相（ポイントC）とアミカシンが少ない平衡相（ポイントE）の2相に分離する組成（ポイント2）となる。コアセルベート相は全体積の約4.5%しか含まれず、元来、平衡相に懸濁した小滴を形成する。コアセルベートが形成されたばかりのときに周囲の溶液に脂質が存在すると、その小滴のまわりに自然に二重相を形成することができる。作製中、その生成物の高濃度のエタノールへの暴露を制限することが好ましい場合が多い。たとえば、さらに3パートの生理食塩水またはバッファをその混合物に加えて、組成物を1相領域に移動させることもできる（ポイント3）。そのポイントでは、コアセルベート相物質の大半をカプセル封入したリポソームがすでに形成されているので、アミカシンはリポソームの内部にカプセル封入されたままであろう。

本願発明の方法および脂質製剤は受動的に調製されるものではなく、つまり、カプセル封入は平衡だけによって行われるわけではない。コアセルベートの形成は、外部の薬物濃度よりも高い内部薬物濃度と、低いL/A比とを生じる。

3. 薬物
薬物コアセルベートはおそらく、どのタイプの薬物にも生じうる。好ましくは、その薬物は水溶性抗感染物質である。抗感染物質は、細菌、マイコバクテリア、真菌、ウイルス、または原虫感染症などの感染症に対して作用する物質である。本願発明に包含される抗感染物質には、アミノグリコシド（たとえばストレプトマイシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、アミカシン、ネチルマイシン、およびカナマイシンなど）、テトラサイクリン（クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、メタサイクリン、ドキシサイクリン、およびミノサイクリンなど）、スルホンアミド（たとえばスルファニルアミド、スルファジアジン、スルファメタオキサゾール、スルフィソキサゾール、およびスルファセタミドなど）、パラアミノ安息香酸、ジアミノピリミジン（トリメトプリムなど、スルファメトキサゾール、およびピラジンアミドなどとともに用いることが多い）、キノロン（ナリジクス酸、シノキサシン、シプロフロキサシン、およびノルフロキサシンなど）、ペニシリン（ペニシリンG、ペニシリンV、アンピシリン、アモキシリン、バカンピシリン、カルベニシリン、カルベニシリンインダニル、チカルシリン、アズロシリン、メズロシリン、およびピペラシリンなど）、ペニシリナーゼ耐性ペニシリン（メチシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、およびナフシリン）、第一世代セファロスポリン（セファドロキシル、セファレキシン、セフラジン、セファロチン、セファピリン、およびセファゾリン）、第二世代セファロスポリン（セファクロール、セファマンドール、セフォニシド、セフォキシチン、セフォテタン、セフロキシム、セフロキシムアキセチル、セフメタゾール、セフプロジル、ロラカルベフ、およびセフォラニドなど）、第三世代セファロスポリン（セフェピム、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフタジジム、セフィキシム、セフポドキシム、およびセフチブテンなど）、そのほかのβラクタム（イミペネム、メロペネム、アズトレオナム、クラブラン酸、スルバクタム、およびタゾバクタムなど）、βラクタマーゼ阻害物質（クラブラン酸など）、クロラムフェリコール、マクロライド（エリスロマイシン、アジスロマイシン、およびクラリスロマイシンなど）、リンコマイシン、クリンダマイシン、スペクチノマイシン、ポリミキシンB、ポリミキシン（ポリミキシンA、B、C、D、E1（コリスチンA）またはE2、およびコリスチンBまたはCなど）、コリスチン、バンコマイシン、バシトラシン、イソニアジド、リファムピン、エタムブトール、エチオナミド、アミノサリチル酸、シクロセリン、カプレオマイシン、スルホン（ダプソン、およびスルホキソンナトリウムなど）、クロファジミン、タリドミド、またはその他の脂質カプセル封入できる抗菌剤が、それらに限定されずに含まれる。抗感染物質には、ポリエン抗真菌物質（アムホテリシンB、ニスタチン、およびナタマイシンなど）、フルシトシン、イミダゾール（n-チコナゾール、クロトリマゾール、エコナゾール、およびケトコナゾールなど）、トリアゾール（イトラコナゾール、およびフルコナゾール）、グリセオフルビン、テルコナゾール、ブトコナゾールシクロピラクス、シクロピロクスオラミン、ハロプロギン、トルナフタート、ナフチフィン、テルビナフィン、またはその他の脂質カプセル封入または複合体化できる抗真菌物質のいずれもを含む、抗真菌物質を含むことができる。考察および実施例は主にアミカシンを対象とするが、本願明細書の範囲はこの抗感染物質に限定されることを意図しない。薬物を組み合わせて用いてもよい。

特に好ましい抗感染物質には、アミノグリコシド、キノロン、ポリエン抗真菌物質およびポリミキシンが含まれる。特に好ましいアミノグリコシドには、アミカシン、ゲンタマイシン、およびトブラマイシンが含まれる。

さらに、本願発明の脂質製剤に用いられる好適な抗感染物質として、薬学的に許容の付加塩および薬物の複合体も含まれる。前記化合物が1つ以上のキラル中心を有してもよい場合、特に指定のない限り、本願発明には、それぞれ固有のラセミ化合物、およびそれぞれ固有の非ラセミ化合物を含む。

前記薬物が不飽和の炭素-炭素二重結合を有する場合、シス（Z）およびトランス（E）異性体は、本願発明の範囲内である。前記薬物に、たとえばケト-エノール互変異性体、

および

などの互変異性型があってよい場合、各互変異性型が、平衡状態か、またはR’で適切に置換された片方の型に固定されている状態のいずれかで存在して、本願発明の範囲内に含まれることが意図される。ある1つの場合における任意の置換基の意味は、他の任意の場合のその意味、または任意の他の置換基の意味とは独立である。

さらに、本願発明の脂質抗感染製剤に用いられる好適な薬物として、当該薬物化合物のプロドラッグも含まれる。プロドラッグは、in vivoにおいて活性親化合物を放出する共有結合した担体のいずれかであるとみなされている。

4. 肺感染症
低L/D比を有する本願発明の脂質製剤は、その薬物が抗感染物質である場合、肺感染症の処置に特に有用である。本願発明の方法で処置できる（嚢胞性線維症患者などにおける）肺感染症には、シュードモナス属（緑膿菌（P. aeruginosa）、 P.パウチモビリス（,
P. paucimobilis）、P.プチダ（P. putida）,蛍光菌（P. fluorescens）、および P.アシドボランス（P. acidovorans））、ブドウ球菌属のメシチリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）、レンサ球菌属（肺炎レンサ球菌（Streptococcus pneumoniae））、大腸菌（Escherichia coli）、クレブシエラ（Klebsiella）、 エンテロバクター（Enterobacter）、セラチア（Serratia）、ヘモフィルス（Haemophilus）、 ペスト菌（Yersinia pesos）、類鼻祖菌 （Burkholderia pseudomallei）、セパシア菌（B. cepacia）、首腐病菌（B.
gladioli）、B.マルチボランス（B. multivorans）、B.ベトナミエンシス（B. vietnamiensis）、結核菌（Mycobacterium
tuberculosis）、トリ結核菌複合体（M. avium complex (MAC)）、トリ結核菌 （M. avium）、M. イントラセルラーレ（M. intracellulare）、カンサシ菌（M. kansasii）、M. ゼノピ（M. xenopi ）、M.マリナム（M. marinum）、M. ウルセランス（M. ulcerans）、M. フォーチュイタム（M. fortuitum）複合体（M. フォーチュイタム（M. fortuitum）、およびM.ケロネイ（M. chelonei））感染症がある。

5. 処置方法
本願発明のある実施態様では、肺感染症の患者を治療する方法であって、低L/D比を有する脂質薬物製剤を、その必要のある患者に、治療上有効な量投与するステップであって、当該薬物が抗感染性であるステップを含む方法を含む。

以下、特定の投与量は提供しないが、本願発明の好ましい投与量は、噴霧器によって肺に送達した場合に14日間の治療期間に肺のCFUカウント数を1桁減少させるのに有効な量の最小の遊離薬物（もちろん塩も含んでよい）の50%以下、35%以下、20%以下、または10%以下である。相対的な遊離薬物の量は、本願発明の薬物投与に適用された投与期間に用いられる積算量である。この段落に定義される相対的な最少の遊離薬物が、「相対的な遊離薬物量」である。

本願発明の非CF処置の実施態様は、いずれの動物にも用いてよいが、好ましくはヒトに用いることができる。ある動物における相対量はそのような動物に対して測定する。

投与スケジュールは好ましくは１日1回以下である。好ましい実施態様では、投与スケジュールは2日に1回、3日に1回、週1回またはそれ以下である。たとえば、投与スケジュールは2日に1回、相対的な遊離薬物量の50%以下を用いてよい。または、たとえば、投与には相対的な遊離薬物量の35%以下を毎日用いてもよい。脂質抗感染製剤は遊離薬物よりも有効であることを示す動物データについては図3および4を参照。

感染症を処置するために有効な量の抗感染物質は、医師が認識しているであろうが、処置しようとしている疾患または回避もしくは処置しようとしている病状、または疾患もしくは病状の病理学の臨床的に認識できる変化を生じるその他の病状の1つ以上の症状を処置、軽減、緩和、除去、または予防するのに有効な量が含まれる。緩和には、予防的に処置された動物の感染症の発症率または重篤度を軽減するステップが含まれる。ある実施態様では、有効な量は肺感染症の症状が出現したあとに処置または緩和するのに有効な量である。その他のある実施態様では、有効な量は予防的に処置された動物における感染症の（統計学的研究により測定された）平均発症率または重篤度を処置または緩和するのに有効な量である。

リポソームまたはその他の脂質送達システムは、噴霧スプレー、粉末、またはエアロゾルのいずれかとして吸入するか、または髄腔内投与によって投与することができる。吸入投与が好ましい。総合的な成果は、頻度の低い投与と遊離薬物または薬物の非経口投与剤形と比較して向上した治療指数である。リポソームまたはその他の脂質製剤は、肺粘膜または肺表面に適合しながら薬物を保護する能力により、特に有益である。

本願発明には、肺グラム陰性感染症の治療の方法が含まれる。ある有用に治療された感染症は、CF患者の慢性緑膿菌性感染症である。アミノグリコシドの肺感染症（CF患者などにおける）の既知の治療は、一般に、アミカシンまたはトブラマイシンを約200− 600 mg、一日一回吸入で投与するステップを含む。ある好ましい実施態様では、本願発明は、100mg以下のアミカシンを毎日投与する（または投与頻度がそれより低い場合には100mg/日以下に正規化する）ことによる治療が可能となる。さらに別の実施態様では、60mg以下のアミカシンの毎日投与を行う。さらに別の実施態様では、約30乃至50mgを2日に1回以下投与するステップを行う。もっとも好ましい実施態様は、2日または3日に1回、約30乃至50mg投与するステップを含む。

6. 脂質とリポソーム
本願発明の組成物に用いられる脂質は、合成、半合成、または天然脂質であってよく、リン脂質、トコフェロール、ステロイド、脂肪酸、ならびにアルブミン、アニオン性脂質、およびカチオン性脂質が含まれる。脂質はアニオン性、カチオン性、または中性であってよい。ある実施態様では、脂質製剤は実質的にアニオン性脂質を含まない。ある実施態様では、脂質製剤は中性脂質だけを含む。別の実施態様では、脂質製剤はアニオン性脂質を含まない。ある実施態様では、脂質はリン脂質である。リン脂質には、卵黄ホスファチジルコリン（EPC）、卵黄ホスファチジルグリセロール（EPG）、卵黄ホスファチジルイノシトール（EPI）、卵黄ホスファチジルセリン（EPS）、ホスファチジルエタノールアミン（EPE）、および卵黄ホスファチジン酸（EPA）、その大豆対応物である大豆ホスファチジルコリン（SPC）、SPG、SPS、SPI、SPE、およびSPA、その水素化卵黄および大豆対応物（たとえばHEPC、HSPC）、脂肪酸のグリセロール2および3位のエステル結合からなり、12乃至26炭素原子鎖とコリン、グリセロール、イノシトール、セリン、エタノールアミンおよび対応するホスファチジン酸を含むグリセロールの1位に異なる頭部基を含む、その他のリン脂質が含まれる。これら脂肪酸上の鎖は飽和していても不飽和でもよく、リン脂質はさまざまな鎖長およびさまざまな不飽和度の脂肪酸からできていてもよい。特に、本製剤の組成物には、天然の肺界面活性物質物質の主成分であるジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）、およびジオレオイルホスファチジルコリン（DOPC）が含まれてもよい。その他の例には、ジミリストイルホスファチジルコリン（DMPC）およびジミリストイルホスファチジルグリセロール（DMPG）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（DSPC）、およびジステアロイルホスファチジルグリセロール（DSPG）、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）、ならびにパルミトイルステアロイルホスファチジルコリン（PSPC）およびパルミトイルステアロイルホスファチジルグリセロール（PSPG）などの混合リン脂質、ドリアシルグリセロール、ジアクリルグリセロール、セラニド、スフィンゴシン、スフィンゴミエリン、ならびにモノオレイルホスファチジルエタノールアミン（MOPE）などの一アクリル化リン脂質が含まれる。

使用する脂質には、脂肪酸、リン脂質およびグリセリド、ステロイド、ホスファチジルグリセロール（PG）、ホスファチジン酸（PA）、ホスホチジルコリン（PC）、ホスファチジルイノシトール（PI）、およびホスファチジルセリン（PS）のアンモニウム塩が含まれてよい。脂肪酸には、飽和または不飽和のいずれかの炭素鎖長12乃至26炭素原子の脂肪酸が含まれる。一部の具体的な例には、ミリスチルアミン、パルミチルアミン、ラウリルアミンおよびステアリルアミン、ジラウロイルエチルホスホコリン（DLEP）、ジミリストイルエチルホスホコリン（DMEP）、ジパルミトイルエチルホスホコリン（DPEP）、およびジステアロイルエチルホスホコリン（DSEP）、N-(2,3-ジ(9(Z)オクタデセニロキシ)-プロプ-1-イル-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド（DOTMA）、および1,2-ビス（オレオイロキシ）-3-（トリメチルアンモニオ）プロパン（DOTAP）が含まれる。ステロイドの例には、コレステロールおよびエルゴステロールが含まれる。PG、PAs, PIs, PCs およびPSの例には、DMPG、DPPG、DSPG、DMPA、DPPA、DSPA、DMPI、DPPI、DSPI、DMPS、DPPS およびDSPS、DSPC、DPPG、DMPC、DOPC、卵黄PCが含まれる。

DPPCなどのホスファチジルコリンからなるリポソーム抗感染製剤は、肺胞マクロファージなどの肺の細胞による取り込みを促し、肺における抗感染物質の徐放を促進する（Gonzales-Rothi et al.(1991)）。PG、PA、PSおよびPIなどのマイナス帯電した脂質は、粒子の凝集の低下に加えて、吸入製剤の徐放特性と全身取り込みのための肺全体への製剤の輸送（トランスサイトーシス）で役割を果たすことができる。ステロール化合物は、製剤の放出および漏出特性に影響を及ぼすと考えられている。

リポソームは、封入された水の塊を含む完全に閉鎖された脂質二重膜である。リポソームは、単層小胞（二重層の単一膜を有する）または多層小胞（二重層の多層膜であってそれぞれ水層によって次の膜から分離される特徴を有する、たまねぎ様構造）であってよい。この二重層は、疎水性の「尾部」領域と親水性の「頭部」領域を有する2つの脂質単層からなる。膜二重層の構造は、脂質単層の疎水性（非極性）「尾部」が二重層の中心に向かって並び、親水性の「頭部」が水相に向かって並んでいる。脂質抗感染製剤は、脂質と抗感染物質の結合体である。この結合は共有性、イオン性、静電性、非共有性または立体性であってよい。これらの複合体は非リポソーム性であって、さらなる水溶性溶質を封入することはできない。そのような複合体の例には、アンホテンシンB（Janoff et al., Proc.Nat Acad.Sci., 85:6122 6126, 1988）、およびカルジオリピンがドキソルビシンと複合体化した脂質複合体が含まれる。

脂質クラスレートは1つ以上の脂質を用いた3次元かご様構造であって、その構造によって生活性物質を封入する。そのようなクラスレートは本願発明の範囲内に含まれる。

プロリポソームは、水溶液と接触してコーニングしてからリポソームまたは脂質複合体になることができる製剤である。撹拌またはその他の混合が必要な場合がある。そのようなプロリポソームは本願発明の範囲内に含まれる。

7. 調製の方法
脂質薬物製剤のプロセスには「溶媒注入」プロセスが関与する。これは、少量、好ましくは最少量のプロセスに適合する溶媒に1種類以上の脂質を溶解し、脂質の懸濁液または溶液（好ましくは溶液）を作成するステップと、その後、薬物を含有する水性溶媒にその溶液を注入するステップを含むプロセスである。典型的には、プロセスに適合する溶媒は、透析またはダイアフィルトレーションなどのように水性プロセスで洗浄することができるものである。溶媒注入の一種である「エタノール注入」は、少量、好ましくは最少量のエタノールで1種類以上の脂質を溶解し、脂質の溶液を作成するステップと、その後、薬物を含有する水性溶媒にその溶液を注入するステップを含むプロセスである。「少量」の溶媒とは、注入プロセスにおいてリポソームまたは脂質複合体に適合する量である。注入プロセスのための条件はコアセルベート形成を生じさせなければならないという点は、重要である。活性物質の水溶液を脂質溶液に注入する基本的な条件は、本願明細書に提示する実施例と、以下に教示する各種パラメータの作用に基づいて決定されなければならない。さらに当業者に有用なのは、 Bunderberg de
Jong, H.G., Kruyt, H.R. Koazevation (Entmischung in Kolloidalen Systemen),
Koll. Zeitsch. 1930, 50(10), 39-48; Gander B, Blanco-Prieto M.J., Thomasin C,
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Tarcha P.J., Ed., CRC Press, Boca Raton, 1991, 67-81; Scott P.W., Williams
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Antidepressants and evaluation of their potential for Enhancing Transdermal
Flux. J. Controlled Release 1996, 41 (3), 215-227; Thomasin C., Merkle H.P.,
Gander B. Drug microencapsulation by PLA/PLGA Coacervation in the Light of
Thermodynamics. 2. Parameters determining Microsphere Formation. J. Pharm Sci.
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Voegel J.-C., Schaal P. Complexation mechanism of Bovine Serum Albumin and
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Gelatin Solutions、およびBiomacromolecules 2003, 4, 1080-1086などの、その内容全体を本願明細書に引用することにより援用する参考文献に記載されるコアセルベートの作成技術である。好ましくは、そのステップはインライン注入プロセスによって行われる。

リポソームまたは脂質製剤のサイジング（定寸）は、押し出し成型、超音波処理、およびホモジナイズ技術など、当業者に公知ですでに行われている多数の方法によって達成することができる。押し出し成型は、リポソームに1回以上圧力をかけ、所定の孔サイズを持つフィルターを通す。フィルターは一般にはポリカーボネート製だが、このフィルターはリポソームと相互作用せず、十分な圧力をかけて押し出しするのに十分な強度がある、耐久性のある物質でできているほうがよい。好ましいフィルターには「直線状」のフィルターが含まれる。そのようなフィルターは一般に、本願発明に好ましい押し出しプロセスの高い圧力に耐えることができるためである。「蛇行状」フィルターも使用してもよい。押し出し成型には、Anopore^TMフィルターなどの非対称フィルターを用いてもよい。このフィルターは、分岐孔タイプの酸化アルミニウム多孔性フィルタを通してリポソームを押し出し成型する。

リポソームまたは脂質製剤は、超音波処理によって小型化することもできる。超音波を用いてリポソームを破壊またはせん断すると、自然に小さいリポソームに変形する。超音波処理は、リポソーム懸濁液を入れたガラス製試験管を、バス型超音波処理器の中に生じる音波の中心点に沈めて行う。代替的には、プローブ型超音波処理器を使ってもよい。これは、チタンプローブを振動させることによって超音波エネルギーを発生させ、リポソーム懸濁液に直接接触させるものである。ギフォード・ウッド（Gifford Wood）ホモジナイザー、ポリトロン（Polytron^TM）、またはマイクロフルイダイザーなどのホモジナイズ化および製粉装置を用いて、大きいリポソームまたは脂質製剤を小さいリポソームまたは脂質製剤に壊すこともできる。

得られたリポソーム製剤は、接線流ろ過など、当業に公知の方法を用いて均質な集合体に分けることができる。 この手法では、不均一なサイズのリポソームまたは脂質製剤の集合体を接線流フィルターに通すことによって、その結果上限および／または下限のサイズのリポソーム集合体が得られる。異なるサイズつまり異なる孔直径の2つのフィルターを用いる場合、フィルターの孔直径よりも小さいリポソームがフィルターを通る。ろ液を、接線流ろ過装置の2つめのフィルタにかけることができる。このフィルタの孔サイズは1つめのフィルタよりも小さい。このフィルタに残った残留物が、1つめおよび2つめのフィルターの孔サイズによって決められた上限および下限のサイズを有するリポソーム／複合体化集合体である。

Mayer et al.は、たとえばアントラサイクリンまたはビンカ・アルカロイドなどの抗新生物物質などの脂溶性イオン性生活性剤の効率的な封入に関する問題点は、膜貫通イオン勾配を用いることによって多少解決できることを発見した。取り込み量の増加の誘発以外に、そのような膜貫通勾配はリポソーム製剤中の薬物の保持量を増加するように作用することもある。

脂質薬物製剤は作用が持続的で毒性が低く、そのため投与頻度が少なく治療指数が高い。前臨床動物研究において、同等の投与量の場合の吸入したトブラマイシン（非リポソームまたはリポソーム性の）を比較したところ、リポソーム性アミカシンは、投与直後から24時間以上経過後の間に、肺の薬物レベルがトブラマイシンの2乃至数百倍になることが明らかになった。さらに、リポソーム性アミカシンは24時間以上、このようなレベルを維持した。CF患者に見られるシュードモナス感染症に似るようにデザインされた動物モデルでは、リポソーム性アミカシンは、遊離アミノグリコシドと比較して、動物の肺の感染症を十分に除去することが明らかになった。

肺界面活性物質によって、肺が呼吸中に拡張および収縮することができる。これは、脂質とたんぱく質の組み合わせが肺をコーティングすることによって達成される。脂質は、外向きに並んだ疎水性鎖を有する単分子層として存在している。脂質は、肺界面活性物質の80%を占め、その脂質の大半はホスファチジルコリンであって、50%はジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）である（Veldhuizen
et al, 1998）。提示されている界面活性たんぱく質（SP）は、構造を維持し、呼吸中に生じる肺界面活性物質の拡張および収縮の両方を促進する働きをする。これらの中で、SP-BおよびSP-Cには特に溶解作用があり、リポソームを溶解することができる（Hagwood et al., 1998;
Johansson, 1998）。この溶解作用は、リポソームの緩やかな破壊を促進することができる。リポソームはマクロファージの貪食作用によって直接取り込まれることができる（Couveur et al., 1991;
Gonzales-Roth et al., 1991; Swenson et al, 1991）。肺胞マクロファージによるリポソームの取り込みは、薬物が患部に送達されうるもう一つの手段である。

吸入のためのリポソームまたは脂質製剤のいずれかを形成するのに好ましくは用いられる脂質は、肺界面物質に認められる内因性脂質に共通している。リポソームは、望ましい薬物を封入する二重層から成る。これらは、異なる層の脂質または層の間の水性空間のいずれかの中に封入された薬物を有する同心状の二重層の多重膜小胞として構成されていてよい。本願発明は、独自のプロセスを用いて独自のリポソームまたは脂質製剤を作製する。プロセスとこのようなプロセスの作製物のどちらも、本願発明の部分である。

ある好ましい実施態様では、本願発明の脂質薬物製剤はインライン注入法で調製し、脂質溶液のストリームを薬物溶液のストリームとインラインで混合する。たとえば、2つの溶液は、手前にY字またはT字連結器を付けた混合管の中で、インラインで混合してよい。このように、インライン注入法は薬物コアセルベートを作るための最良の条件を作り出す。この注入法によって、脂質対薬物の比が低くなり、封入効率が高くなる。

別の特に好ましい実施態様では、本願発明の脂質製剤は、脂質-有機溶媒溶液を薬物水溶液と好ましいレベルでボルテックスすることによって調製する。

本願発明の脂質製剤を調製するもう一つの新規の方法は、脂質の存在下で荷電ポリマーを有するコアセルベートを作ることによって、最初に荷電ポリマーをカプセル封入するステップが関与する。この技術によって、低脂質対薬物比が得られたのと同様に、低脂質対荷電ポリマー比が得られるだろうと考えられている。薬物は、荷電薬物と荷電ポリマーの対イオンの間の脂質膜全体に、イオン交換によって脂質製剤の内部に導入される。コアセルベーション形成を含まないこの技術は、「遠隔ロード」として知られる。遠隔ロードの例は、その内容全体を引用により本願明細書に援用する、米国特許第5,316,771号および第5,192,549号に開示される。

上述のプロセスは、流速、温度、活性化物質の濃度、および注入ステップ後の塩の添加など、パラメータを最適化することによって、さらに向上させることが可能である。以下の実験は、より高い脂質対薬物比によって示されるとおり、本願発明の方法を必ずしも代表するわけではない。むしろ、上述のパラメータの効果をテストするための一連の実験を表す。低L/D比の脂質を用いた製剤を作製するためにコアセルベーション技術を用いた場合のたくさんの可変項目から1つの新規的なアイディアが生まれる。

7.1 流速の影響
個々の流速は変化したが、全流速は800 mL/分に維持された。そのために、2つの別々のポンプを異なるポンプ速度に設定して使用した。混合溶液を10秒間NaCl溶液を入れたビーカーに注入し、最終NaCl濃度を1.5%にして、最終エタノール濃度が30%を超えないようにした。混合後、1mLのアリコートをセファデックスG-75ゲルろ過カラムにかけて、封入物から遊離アミカシンを分離した。最高密度の分画1mL（目視の濁度で決定）をさらなる分析用に収集した。表１に結果を示す。脂質／アミカシン流速比が上昇しても、L/Dは300/500mL/分までほぼ一定だった。脂質の速度をさらに上昇させたところ、L/Dは上昇し始め、粒子サイズも大きくなり始めた。同時に、脂質の流速が速く質量が増加するほど、アミカシンの回収（封入効率）がよくなった。

バッチ3は脂質／アミカシンの流速が300/500mL/分で、最良のL/Dおよび粒子サイズを示し、アミカシンの回収率も十分に高い。したがって、今後すべての実験にこの流速を使用することに決めた。

特定の条件において結果を再現するために、ダイアフィルトレーションを用いて完全に洗浄したバッチ（バッチ6）を表2に示すとおりに調製した。注入の前にNaCl 10%溶液をビーカーに加え、最終濃度を2%にした（表1のバッチの1.5%と比較して）。得られたL/D（1.71）は表1のバッチ3ほど良好ではなかったが、粒子サイズは大きかった。これは、リポソーム形成の初期段階で高濃度のNaClをリポソームに接触させたことによる有害事象のせいかもしれない。ゲルろ過カラムを用いて分離（洗浄）したサンプルは、ダイアフィルトレーションで洗浄したものよりも良いL/Dである傾向がある。これは、リポソームが経験するストレス度の差のせいか、または単にゲルろ過カラムで分離したサンプルが、集合体全体を代表していないより良好なL/Dを有するリポソームの分画を含んでいたせいかもしれない。

7.2 プロセス温度の影響
設定はバッチ3と同様に維持したが、加えたNaCl溶液の量は少なく、最終濃度は1.0%になった。注入時間が短いと注入中に添加することが難しいため、再び溶液を加えてから注入を開始した。さらに、注入中、流れの圧力で、混合管の末端にインラインミキサを移動させた。ミキサの位置は、バッチ3の場合には管の末端から0cmだったが、この場合は末端から5cmだった。これは、バッチ20の温度条件40/40℃において得られたL/D比が0.55で、バッチ3のほぼ半分であったことから、重要かもしれない。異なる注入温度におけるアミカシン封入を比較すると、驚くことに、低温のほうが良いL/Dを得られることがわかる。テストした温度のうち、脂質／アミカシン温度が30/30℃と50/室温の場合、L/D比は0.32と0.37で差がなかった。繰り返すが、バッチ1-5では、ゲルろ過によって洗浄したこれらのサンプルから得られる数値は低く、おそらく、バッチがダイアフィルトレーションで洗浄された場合よりも低いだろう。

別々の実験では、温度が30℃または50℃の90%エタノールと温度が22℃の水を混合すると、最終温度は同様のほぼ36℃となった。これは、最終混合物の温度がそれぞれの成分の温度よりもアミカシンカプセル封入には重要であることを示唆している。例6乃至15では、50℃/室温を使用した。例16乃至18では、2つのストリームの温度を30℃と30℃として同様の結果が得られたが、アミカシンの封入に若干の低下が認められた。

7.3 注入後の水性塊の添加の効果
次に、NaCl溶液の添加のステップと洗浄プロセスに注目した。プロセスのパラメータはさまざまな方向において変化した。流速300/500での注入ステップの直後、混合物のエタノール濃度は34%に達する。アミカシンはこの濃度において一定限度の溶解度を有する（図9）。

50mg/mL アミカシン原液から始めて脂質溶液と混合する場合、アミカシンの全量は30mg/mLを超え、少なくとも半分（15mg/mL）は遊離アミカシンで、50%の封入効率を見込む。これは、34%エタノールの溶解限度よりも高い。この問題を解決しうる方法のひとつは、脂質／アミカシン混合物を入れた容器にさらに水を加えることによって、エタノールとアミカシン両方の濃度を低下させることである。たとえば、200パートの水（またはNaCl溶液）を800パートの脂質／アミカシンに加えると、エタノールは27%まで低下する（図9）。これにより、温度によってアミカシンは15mg/mL以上溶解する。

さらに、NaClを加えると浸透圧条件を安定化できることもある。リポソームを作製してアミカシンを内部濃度200乃至300mg/mLでカプセル封入する場合、封入されないアミカシンは約15mg/mL程度でしかない。食塩水がない場合、これによって浸透圧のバランスが崩れ、アミカシンの漏れが生じるかもしれない。150パートの10%NaClを800パートの脂質／アミカシンに加えると、最終濃度が約1.5%になるだろう（リポソームの外側）。

さまざまな量のNaCl溶液（または一部のバッチでは水）を注入イベントに対してさまざまなタイミングで加えた、たくさんのバッチを作製した（表2および3を編集した表5を参照）。この表から、全般的な傾向が見られ、以下の結論に達する。

- 水性塊の注入と添加の間には、低L/Dを得るためのいくらかの時間間隔が必要である（短い混合管を用いる場合）。バッチ6-15のうち、20秒以上の間隔を持ったものはL/Dが低かった。可能性のある一つの解釈として、リポソームはストリームの混合直後に完全に形成されているわけではないと考えられる。長い混合管を用いる場合（バッチ16-18）、混合時間も長くかかり、時間の間隔は必要ない。

- 浸透圧のバランスをとるために高濃度のNaCl溶液を加えるのは、実際のところ、アミカシンの保持を促進していない。事実、適切な時間間隔で純粋を加えると、L/Dとアミカシンの総濃度は最も低くなる。

- 注入から5分後に100パートのNaCl 10%溶液（バッチ9）を加えると、競合するL/D比が得られるが、同じように良好なアミカシンの総濃度は得られなかった。NaClは、初期の段階で比較的高濃度のエタノールと一緒にすると、高い凝集性と粘性を生じるのかもしれない。

7.4 抗感染物質原液の効果
以前、50mg/mLアミカシン原液を使うと封入の状態が最良になることが明らかになった。従来のプロセスを用いた場合、アミカシンの原液の濃度を40mg/mLに減らすと、L/Dが上昇した。2ストリームインライン注入プロセスを用いると、エタノール濃度は高レベルに達するので、現在の50mg/mLアミカシンは最適な濃度ではないかもしれない。

表6には、さまざまなアミカシン原液濃度を用いた効果をまとめる。40mg/mLでは、同等またはそれ以上のL/D値が得られ、アミカシンの回収率が向上した。一定量の脂質と比較して少ないアミカシンを用い、同様のL/Dを提供することによって、高率にカプセル封入することができた（バッチ12）。アミカシンの原液濃度をさらに30mg/mLまで低下させたところ、L/Dが若干上昇したが、それでも回収率は非常に良好だった（バッチ13）。

アミカシンの原液濃度を低下させるのには別の意味もある。そうすることによって、注入後の脂質／アミカシン混合物における遊離アミカシンの濃度が低下し、高いエタノール濃度でも可溶性を維持できる。脂質とアミカシンを300/500の比率で混合すると仮定すると、アミカシン原液は50 mg/mLであり、封入効率は37%なので、初期の遊離アミカシンは約20mg/mLになるだろう。同様に、封入率52%の40mg/mLアミカシン原液であれば、約12mg/mLの遊離アミカシンが生じるだろう。封入率46%の30 mg/mLアミカシン原液であれば、約10 mg/mLの遊離アミカシンが生じるだろう。

8. 脂質対薬物比
リポソームへの薬物（たとえば、アミノグリコシド、アミカシン、トブラマイシン、ゲンタマイシンなどのアミノグリコシド）の注入量を増加するにはいくつか方法がある。一つの方法は、封入される脂質の体積／量が大きい非常に大きなリポソーム（＞1μm）の作製である。このアプローチは、リポソームの吸入用（噴霧用）には実用的ではない。なぜなら、1) 大きいリポソーム（> 0.5μm）ほど大きい放出を受けやすいので、リポソームの大きさに応じて噴霧中の剪断ストレスによって破壊されやすい、2) 肺への良好な沈着に必要な小滴のサイズは小さいほどよく、約3μm未満である、という理由からである。そのため、吸入用には、リポソームの大きさは、大きすぎる放出を避けるために、なるべく小さくすることが望ましい。現在、本願明細書に開示されるリポソームの平均直径は約0.4μm未満である（表4）。

L/Dを低下させる別のアプローチは、マイナス荷電脂質の使用である。上述のアミノグリコシドは、化合物1個当たり4乃至5個のアミンを有し、高度にプラス帯電している。これらのアミノグリコシドの硫酸塩は通常、治療用製剤に利用される。多カチオン性によって、マイナス荷電リポソームへの強い結合力が生じる。その結果、リポソーム形成中に大量の封入が生じる。抗感染製剤の目的は、肺環境への持続的な放出を提供することである。マクロファージの取り込みによるリポソームの急速なクリアランスは、この現象に反する。マイナス荷電リポソームは、中性リポソームよりもマクロファージによる取り込みの度合いがはるかに高いことが十分立証されている。したがって、中性リポソームを使用することが望ましい。

小さいリポソームに大量の薬物を封入することができる、あるグループの技術は、pH勾配、硫酸アンモニウム勾配、または硫酸マグネシウム勾配を使ってアミン薬物をリポソームに取り込む、勾配負荷法に基づいている。米国特許第5,578,320、5,736,155、5,837,279、5,922,350（pH勾配）、5,837,282、5,785,987（硫酸マグネシウム勾配）および5,316,771（硫酸アンモニウム勾配）号を参照のこと。これらの技術は、膜を透過するアミン（ドキソルビシンおよびダウノルビシンなどの中性形状が透過可能なモノアミン）にしか使うことができない勾配負荷法は、透過することができないアミノグリコシドなど一部の抗感染物質には使うことができないだろう（サイズが大きすぎ、電荷も高すぎる）。

本願明細書に記載のすべてのプロセスは、大規模無菌製造工程に容易に利用することができる。最終的なリポソームサイズは、脂質の組成、濃度、賦形剤、および処理パラメータを修正することによって調整することができる。

本願発明のプロセスによって得られた脂質対薬物の比は、約0.4乃至0.49:1である。さらに、生成物が一定時間透析された後に存在する遊離薬物の割合は低下している。薬物がたんぱく質などの高分子である場合、L/D比は1.2で、文献と比較して低い（たとえば、米国特許第6,843,942号では、DPPC-コレステロール-ステアリルアミン形成における組み換えヒト超酸化ジスムターゼ（rh-SOD）のカプセル封入を調製したところは、L/D比約5だった）。

9. 薬物送達速度
薬学的吸入療法のために、基本的には、最短の投与時間で望ましい投与量を達成するための高速の送達速度の確立が望ましい。リポソーム製剤のためには、噴霧中に封入された薬物の保持を最大化することも望ましい。噴霧流速は、単位時間（たとえば、g/分、ml/分）内にエアロゾル化して噴霧器から飛び出す水溶液の容量（または重量）である。薬物送達速度は、単位時間内（たとえばmg/分）に噴霧器によって送達される薬物の量と定義する。

薬物送達の有効性は、以下の2点を改善することによって上げることができる。その2領域とは、1} 薬物送達装置の改善、2} 薬物製剤における薬物濃度の上昇、である。薬物送達装置がジェット噴霧器である場合、薬物送達速度に作用する主要因には、噴霧器から排出される空気流速度とエアロゾルの小滴サイズを決定する噴霧器のモデル、つまり噴霧器の構造、および薬物製剤を加速するために用いる空気圧が含まれる。薬物製剤では、薬物濃度は水の量を減らすことによって上げることができる。だが、このようにすることによって、噴霧速度を低下させる作用がある粘性と表面張力が上昇する。

あるジェット噴霧器の薬物送達速度を向上させるために、薬物濃度を上げて、粘性と表面張力を比較的一定に維持しなければならない。このようにすることによって、薬物送達速度（mg/分）=薬物濃度（mg/ml）×噴霧速度（ml/分）という式にしたがうように噴霧速度を一定に維持しても、薬物送達速度は上昇する。

本願発明は、部分的には、空気動力学的中央粒子径（MMAD）が1乃至5μmの最適範囲内の粒子サイズを有し、最大のエアロゾル排出量を提供する、高濃度高投与量の脂質を用いた薬物製剤について記述する。

表7は、いくつかの噴霧試験の送達速度および薬物持続データ%を示す。噴霧は、ジェット噴霧器で圧縮圧力30psiで20分間行われた。

L/D比が、ロットAおよびBからロットI、JおよびKで得られた本願発明のL/D比へ減少すると、薬物濃度も上昇することがわかる。ほぼ一定の流速で、薬物濃度の上昇によって、最高の薬物送達速度である約19乃至22mg/分に達した。この結果を図10にグラフで示す。

10. 結果
10.1. 肺感染症のバイオフィルムバリア
CF患者の慢性疾患の主因である緑膿菌などの感染症の治療の障害は、上皮細胞上の痰／バイオフィルムバリア内での薬物透過である。図１で、ドーナツ型はリポソーム抗感染製剤を表し、＋印は遊離感染剤、−印はムチン、アルギン酸塩、およびDNAであって、実線は緑膿菌を表す。このバリアは、細菌由来のアルギン酸塩またはエキソ多糖類に埋包されたクローン化および植物性緑膿菌（P. aeruginosa）、および傷害された白血球に由来するDNA、および肺上皮細胞に由来するムシンから構成されており、すべて正味のマイナス電荷を有している（Costerton, et al., 1999）。このマイナス電荷は、アミノグリコシドなどプラス帯電している薬物に結合して透過を防ぎ、生物学的に無効にする（Mendelman et al., 1985）。リポソームまたは脂質製剤の中への抗感染物質の封入によって、抗感染物質を痰／バイオフィルムへの非特異的な結合から遮断、または部分的に遮断し、リポソームまたは脂質製剤を（封入したアミノグリコシドとともに）透過させることができる（図1）。

アミカシンは細菌酵素に高度な耐性を有し、トブラマイシンおよびゲンタマイシンを含むその他のアミノグリコシドに認められるよりも高い割合の感受性の臨床分離株を提供することが示されている。特に、P. aeruginosa分離株はアミカシンにほかのアミノグリコシドよりもはるかに高い感受性を示すのに、交差耐性を示さない（Damaso et al., 1976）。

アミカシンのリポソーム製剤の徐放およびデポー効果は、図２に明らかに見られる。この研究では、ラットにトブラマイシンを気管内および静脈内投与した。また、そのラットは同じ投与量（4mg/ラット）のアミカシンのリポソーム製剤も気管内投与された。データは、アミカシンのリポソーム製剤の場合のみ徐放およびデポー効果が達成されていることを示している。実際、投与から２４時間後、アミカシンのリポソーム製剤のみ動物の肺に有意なレベルの薬物が見られるが、どちらのトブラマイシン製剤も微量しか認められず、その原因は主に急速な全身吸収によると考えられる。リポソーム抗感染製剤用の肺内のアミノグリコシドが100倍以上増加したというこの現象は、現在認可されているTOBI製剤（シロン・コーポレーション社（カリフォルニア州アメリビル）製のトブラマイシン吸入溶液）よりも投与回数が著しく少なくできる徐放リポソーム抗感染製剤のアイディアを支持する。

さらに、痰／バイオフィルムがあると、抗感染物質が遊離アミノグリコシドの表面に結合して、遊離アミノグリコシドの浸透を防止する。したがって、CF患者に治療効果が認められるには、肺組織１gあたりトブラマイシン1,000gmを超える投与量が必要である。アミカシンのリポソーム製剤がこれを克服する。したがって、薬物の治療レベルは、アミカシンのリポソーム製剤の場合、遊離トブラマイシンと比較して長時間持続させることができる。結合と浸透の促進は、抗菌物質がin vivoにおいて最少阻害濃度未満のレベルで存在する場合、アミカシンのリポソーム製剤が一般的に生じやすいと考えられている細菌耐性を有意に低下させることができる手段にもなりうる。

10.2. 薬物動態
アミカシンの薬物動態は、ラットにおいて、遊離トブラマイシンかまたはアミカシンのリポソーム製剤のいずれかを気管内（IT）投与後に測定した。これらのデータを、遊離トブラマイシンの尾部静脈注射後に肺で得られた分布と比較した。すべての場合において、1回の投与につき、4mg/ラットを投与した。図２に見られるように、注射と比較して、はるかに大きなアミノグリコシドの沈着を、ITで送達することができる。リポソーム抗感染物質技術のデポー効果も、ITまたはIVで投与されたトブラマイシンとの比較すると、アミカシンのリポソーム製剤の場合、投与から24時間、肺の中の残留量が100倍を越えることから実証される。したがって、薬物の治療レベルは、アミカシンのリポソーム製剤の場合、遊離トブラマイシンと比較して長時間持続させることができる。

CF患者の痰へのアミノグリコシドの結合は、特にこの結合が抗感染物質の生物活性を低下させる場合には問題である（Hunt et al., 1995）。アミカシンのリポソーム製剤が長時間生物活性を維持できるかどうかを調べるために、正常ラットに気管内点滴によってアミカシンのリポソーム製剤を投与した。このあと、2または24時間経過時点に気管支肺胞洗浄（BAL）により除去を行い、生物学的活性を決定した。超ろ過でサンプルを濃縮した後、ろ過（0.2ミクロン）して混入している肺の微生物を除去した。アミカシンの濃度をTDX装置を用いて測定し、生物活性はミュラー・ヒントン液体希釈アッセイ（緑膿菌）を用いて測定した。結果は表7に示す。

上述の表に示されるように、回収しろ過したアミカシンのリポソーム製剤は、MICが4で24時間後でも、ミュラーヒントン液体希釈アッセイにおいて、緑膿菌を死滅されることができた。2時間経過時点でMIC 2が得られ、ろ過したリポソーム／複合体化アミカシン原液について得られた数値に類似する。したがって、アミカシンのリポソーム製剤は肺の中で、24時間後でもまだ活性だった。24時間経過後、同一の投与量の遊離トブラマイシンはBALでは検出できなかった。これは、リポソーム抗感染製剤が肺に保持されているだけでなく、時間の経過とともに痰／バイオフィルムを自由に透過できるようになることも示唆している。このデータを、図2と表9（後述）から明らかな、アミカシンのリポソーム製剤が時間の経過とともに遊離抗感染物質を放出する一方で肺の中に高レベルの抗感染物質を維持するという事実と併せて考慮すると、このシステムは時間の経過とともに持続的な抗感染作用を生じるのかもしれないという論理的解釈を裏付ける。この作用は、シュードモナスの生物負荷と抗感染物質のトラフ濃度による耐性の発生の両方を低減する上で重要であることを証明するはずである。

アミカシンのリポソーム製剤の徐放と持続的な抗感染作用をin vitroで実証するために、この製剤をPAOIムコイドシュードモナスを含む慢性閉塞性肺疾患（COPD）の患者から採取した痰の中でインキュベートした。アミカシンのリポソーム製剤はPAO1ムコイドシュードモナスを含むアルギン酸塩の中でもインキュベートした。表８に示すように、どちらのケースでも、時間の経過とともに持続的で高度なシュードモナスの死滅が観察された。

リポソーム製剤は抗感染物質の徐放とともに高い抗感染作用を示すため、従来の死滅曲線はリポソーム抗感染製剤技術に適用できない。リポソーム製剤は、アミカシンが放出されるまで、アミカシンを痰および／またはアルギン酸塩から保護する。そのうちに、完全な死滅が観察される。これは、抗感染製物質の阻害または不活性化がない徐放性抗感染作用モデルと一致する。

リポソームアミカシン製剤の有効性は、寒天ビーズ基質に埋め込んだ緑膿菌をラットの気管に注入した、慢性肺感染症モデル（Cash et al., 1979）を用いて調査した。このムコイドシュードモナス動物モデルは、CF患者に見られるシュードモナス感染症に似るように作られた。CFに関連する臨床要因の一部には、類似する肺の病理学、免疫複合体疾患、緑膿菌株によるおよびムコイド表現型への転換が含まれる（Cantin and Woods, 1999）。ラット肺に、CF患者の分離株から採取したムコイドシュードモナス（PAO1）を10⁷ CFU感染させてから、(a)遊離アミノグリコシド、(b)非薬物対照として脂質賦形剤のみ、および(c)リポソームアミカシン製剤で処理した。さらに、改良型カービー・バウアープレート上でin vitroにおいて緑膿菌を死滅させる能力について、製剤をまずスクリーニングした。

各種のリポソームアミカシン製剤を、異なる脂質組成物か、または製造パラメータのいずれかに基づいてテストした結果、in vitroにおけるさまざまな死滅ゾーンが生じた。この実験は、リポソームアミノグリコシド製剤で得られた有効性の向上を、遊離アミノグリコシドと比較して決定するようにデザインした。対照の脂質組成物、2種類のリポソームアミカシン製剤、および遊離アミカシンと遊離トブラマイシンをリポソーム抗感染製剤として同一のアミノグリコシド濃度で比較した。さらに、投与量が10倍の遊離アミカシンと投与量が10倍の遊離トブラマイシンも投与した。投与はITで7日間毎日行った。結果（図3）から、2種類の製剤（脂質組成が異なる）ではCFU値に有意な低下が明らかで、10倍投与量の遊離アミカシンまたは遊離トブラマイシンよりもCFUの低下が良好だったことが示唆される。図3では、Lip-An-14はDPPC/Chol/DOPC/DOPG (42:45:4:9)および10mg/mLアミカシンであって、Lip-An-15も10 mg/mL においてDDPC/Chol
(1:1) である。本願明細書のすべての脂質-脂質、および脂質-薬物比は重量対重量である。

次の実験（図4）はリポソームアミカシン製剤の徐放および持続的な抗感染力を実証するようにデザインした。投与は、前回の実験の7日間毎日ではなく、14日間2日に1回行った。結果から、2種類の製剤のリポソームアミカシンは、遊離アミカシンまたは遊離トブラマイシンよりも10乃至100倍強力（CFU値を低下させる能力が大きい）だったことが示唆される。ヒトにおけるTOBI^TM（シロン・コーポレーション社（カリフォルニア州アメリビル）製のトブラマイシン吸入溶液）の一日の投与量600mg、または約375mg/m²は、ラットの一日投与量9.4mgに相当する。したがって、データは、ヒトにおける有効性の10乃至100倍の向上に直接相関しうる。log2の減少は、このモデルで観察することができる最良である点は注目されるべきである。痰のアッセイにおける緑膿菌の1/100への減少は、肺機能の向上と相関している（Ramsey et al., 1993）。リポソームアミカシン製剤の徐放は、投与量が小さいほどおよび／または投与回数が少ないほど、細菌の増殖の減少が、遊離アミノグリコシドによる減少よりも大きいことを示唆している。

リポソームアミカシン製剤の有効性は、緑膿菌が埋め込まれたアガロースビーズの基質をスプラーグ/ドーリーラットの気管に注入した、慢性肺感染症モデルを用いて調査した。3日後、遊離アミカシンまたはリポソームアミカシンを毎日（図3）または1日おき（図4）に、アミノグリコシド1mg/ラットもしくは10mg/ラット、またはリポソームアミカシン1mg/ラット、ならびに対象として空のリポソーム（脂質賦形剤）を、ラット5匹を1グループとして投与した。

実験開始から14日後、ホモジナイズ化したラット肺（冷凍）をアミノグリコシドの含有量と活性について分析した。臨床化学アッセイをTDX装置を用いて行う一方で、枯草菌を埋め込んだ寒天板上で阻害ゾーンを測定することによってバイオアッセイを行った。結果を、表9に示す。

表10の結果は、アミノグリコシドは両方のリポソーム抗感染製剤に存在して活性であるが、遊離グリコアミノシドでは10倍の投与量でも少ししか検出することができない。このさらなる結果は、リポソーム抗感染製剤の徐放性を確立し、保持されている抗感染物質がまだ活性であることも裏付ける。上述の製剤のうち、遊離トブラマイシン（0.1mg/mL）だけが腎臓において検出可能なレベルのアミノグリコシドを示した。

リポソームアミカシン製剤の徐放およびデポー効果を図5にさらに示す。ラットに、上述の有効性研究に用いたものと同じビーズを使って、緑膿菌をアガロースビーズ基質に埋包して気管に注入し、慢性肺感染症を感染させた。そのラットに、遊離トブラマイシンかリポソームアミカシン（製剤Lip-An-14）を、同量（2mg/ラット）気管内投与した。抗感染物質mg／肺組織gの単位で経時的に測定したところ、データは、リポソーム抗感染物質が徐放およびデポー効果を示したのに対して、遊離トブラマイシンは24時間後までに肺の中には微量しか残っていないことが明らかになったことを示している。これは、主に、急速な全身性吸収のせいであると考えられる。感染ラットにおけるリポソームアミカシン製剤用の肺内の抗感染物質が100倍以上増加したというこの現象は、現在認可されているTOBI^TM製剤（シロン・コーポレーション社（カリフォルニア州アメリビル）製のトブラマイシン吸入溶液）よりも投与回数が著しく少なくできる徐放リポソーム抗感染製剤のアイディアを裏付けている。

アミカシンの薬物動態は、ラットにおいて、遊離トブラマイシンかまたはリポソームアミカシンのいずれかを気管内（IT）投与後に決定した。1回あたり2mg/ラットを投与した。リポソーム抗感染物質技術のデポー効果も、ITで投与された遊離トブラマイシンとの比較すると、リポソームアミカシンの場合、投与から24時間、感染した肺の中の残留量が100倍を越えることから実証される。したがって、薬物の治療レベルは、リポソーム製剤の場合、遊離トブラマイシンと比較して長時間持続させることができる。

図７は、著しい滞留時間と肺への有効量の抗感染物質の蓄積を示し、比較的少ない投与回数を用いることができるということが確立できる結果を示している。各投与は4時間で、アミカシンの濃度15mg/mLをリポソームアミカシン製剤（DPPC/Chol., 1:1）で噴霧吸入によって行う（上述のとおり、ラットで、1グループあたり3匹ずつ）。投与は、1日目、または1、3、5日目、または1、2、3、4、5日目のいずれかに行った。データバーのあるラットは、それぞれのデータバーの投与回後に安楽死させた。

類似の抗感染物質を、肺の炭疽病および野兎病などの細胞内感染症の治療にも用いることができる。肺炭疽病では、炭疽菌の胞子がエアロゾル状で肺胞に達する。吸入した胞子は肺胞内で肺マクロファージによって取り込まれ、リンパ管を通って局所の気管気管支内のリンパ節または縦隔リンパ節に運ばれる（Pile et al., 1998; Gleiser et
al., 1968）。マクロファージは両方の感染経路の中央で、全身性（吸入）炭疽病の宿主自己破壊の主な寄与因子である。リポソーム抗感染製剤技術は、徐放および標的化の性質に加えて、細胞取り込みを促進し、薬物標的および送達において、肺胞マクロファージおよび肺上皮細胞を使用することができる。このような性質があるために、このような細胞内感染症を促進し、感染症が肺に生じてマクロファージによって運ばれてしまうと考えられている。さらに重要なのは、このような性質によって抗感染製剤がさらに効果を発揮し、リポソーム抗感染物質は疾患を含有するまさにその細胞によって貪食されるはずという点である。抗感染製物質は、標的化されながら細胞内に放出され、広がる前に感染症を攻撃する。カプセル封入される薬物は、シプロフロキサシン、テトラサイクリン、エリスロマイシン、またはアミカシンなど、すでに認可された薬剤であってよい。リポソームシプロフロキサシン製剤はすでに作製されている。

ある研究では、この化合物をマウスに投与し、気管内投与した遊離シプロフロキサシンおよび経口投与した遊離シプロフロキサシンを同一の投与量で投与された3種類すべての化合物と比較した。各マウスの投与量は15 mg/kgで、1グループにつきマウス3匹とした。リポソームシプロフロキサシンは、シプロフロキサシン3 mg/mLをDPPC/Cholesterol (9:1)に入れた。脂質対薬物の重量比は12.5:1だった。経口投与したシプロフロキサシンと比較して、リポソームシプロフロキサシンは、遊離シプロフロキサシンよりも2桁以上多い量がマウス肺に存在した。さらに、リポソームシプロフロキサシンだけが24時間後に肺の中に一定量の薬物が認められたが、経口投与した薬物は2時間未満易以内に検出不可能になった。このデータは、リポソームシプロフロキサシン製剤とアミノグリコシド、テトラサイクリン、およびマクロリドなどほかの抗感染物質を、生物兵器テロリストが用いる細胞内疾患の治療および予防用に使用できることを裏付けている。

10.4. 緑膿菌感染症に媒介される薬物放出
感染症の近隣における活性な状態の薬物の放出は、本願発明のリポソーム薬物製剤の活性の重要な局面である。そのような標的化された放出の可能性を、CF患者から採取した痰でインキュベーションした場合の薬物放出、緑膿菌をあらかじめ摂取したラットの肺における放出、および緑膿菌の培養物に対する活性をモニターすることによってテストした。

緑膿菌の培養物を本願発明のリポソームアミカシン製剤で直接インキュベートしてアミカシンを放出させることは、前に考察した。この現象をさらに調べるために、リポソームアミカシン製剤を緑膿菌感染症の嚢胞性線維症患者から得た痰の調製物でインキュベートした。喀痰をウシDnase Iとアルギン酸ライセートで2時間かけて37℃で液体にした。リポソームアミカシン製剤または可溶性アミカシン（1 mg/mLアミカシン）を液体の痰または対照と1:1で混合し、緩やかに振盪させながら37℃でインキュベートした。アボットTDxアナライザーでアミカシン濃度についてアリコートを分析した。無処置のリポソームを、界面活性物質の1%トリトンX-100を用いて各サンプル別のアリコートに溶解した。各サンプルの上清を分析に使用した。48時間、このような条件下で液体組成物から時間依存的に(80-90%)のアミカシンが放出された。これは、CF肺の感染部位に薬物放出が生じている可能性を示唆している。

In vivoにおけるリポソームからの遊離薬物の放出を、緑膿菌を含有する寒天ビーズを注入したラットとそうでないラットとで比較した。ビーズの注入から3日後、ラットに本願発明のリポソームアミカシン製剤を、毎日（無細菌群）または1日おきに14日間（ビーズを注入した群）吸入させた。最後の処理から24時間後、上述のとおり、総アミカシンおよび遊離アミカシンを測定した。細菌を投与されたラットでは、検出されたアミカシンの平均約50-70%が遊離した状態、つまりリポソームから放出された状態だった。細菌を投与されなかったラットでは、薬物の約20-25%が遊離した状態だった。このデータから、in vivoにおけるリポソームからの遊離アミカシンの放出は、緑膿菌の存在に媒介されているかもしれないということが強く示唆される。

In vivoにおける放出および活性度テストを、肺における薬物動態に類似する条件下において行った。この条件において、以前、遊離抗生物質が数時間という時間単位で除去されることが示されている。さまざまな薬物濃度の遊離アミカシンまたはリポソームアミカシン製剤を、滅菌0.5mL スライド-A-ライザー（Slide-A-Lyzer）カートリッジの中で、緑膿菌PA01（~10⁸/mL）でインキュベートした。遊離薬物は、このような条件下で、時間単位でカートリッジから透析されて出てくる。24時間後、このサンプルをカートリッジから取り出し、播種してCFUを測定した。予備実験では、遊離アミカシンはこのサンプルのCFUを若干しか低下させなかったが、同じ濃度（50 μg/mL）の液体組成物からなるアミカシンでは2桁の低下が認められた。これらのデータから、アミカシンは細菌の存在下で活性な状態で放出され、この製剤による徐放によってこの薬物をより効率的に利用できるようになることが示唆される。

本願発明のリポソームアミカシン製剤と緑膿菌またはその毒性因子との相互作用によってアミカシンが放出されるが、その放出はおそらく感染部位に方向付けられている。アミカシンが放出される場合は緑膿菌に対して活性であり、この菌の付近での徐放は、吸入された遊離薬物の非特異的な分布と迅速なクリアランスに関して利点があるかもしれない。

10.5. 肺胞マクロファージの機能への吸入リポソーム薬物製剤の作用
ある実施態様では、本願発明のリポソームアミカシン製剤は、嚢胞性線維症患者の慢性緑膿菌感染症のために調合されたアミカシンのナノサイズ（200-300 nm）リポソームカプセル封入剤形である。それは、吸入してから肺内でアミカシンを徐放するようにデザインされている。肺胞マクロファージはこの大きさの範囲内の粒子を貪食することが知られているため、本リポソーム製剤がこの細胞に与える作用は特に興味深い。洗浄によって得られるラット肺胞マクロファージの基本および刺激された機能を、リポソームアミカシン製剤を投与して、および投与しないで、各種対照と比較して研究した。

リポソームアミカシン製剤、アミカシン、プラセボリポソームおよび食塩水のエアロゾルをPARI LC Star噴霧器で生成し、鼻のみの吸入チャンバの中でCD^TMIGSメスラットに吸入させた。吸入療法は4時間、14日間連続して行い、毎日肺に投与された脂質の総量の推定値は、リポソームアミカシン群では約12 mg/kg、プラセボリポソーム群では11mg/kgだった。半数のラットを15日目に安楽死させた。残りのラットは43日目に安楽死させた。気管支肺胞洗浄液（BALF）を各ラットから収集し、次に行う一酸化炭素（総硝酸塩量として表す）と腫瘍壊死因子α（TNF-α）のアッセイのために-80℃で保存した。BALFからの細胞を遠心分離によって収集し、計数して、リポ多糖体（LPS）とともに、または抜きで24時間培地で培養した。この培養物の上清を遠心分離で収集し、一酸化窒素およびTNF-αについてアッセイした。BALマクロファージ((10⁶)/mL)の貪食機能を、オプソニン化蛍光マイクロスフェア（0.2 μm, 2 (10⁹)/mL）の一晩の取り込み量の測定によってテストした。

リポソームアミカシン製剤、空のリポソーム、可溶性アミカシン、または食塩水を連続14日間吸入させたが、BALF中の一酸化窒素（硝酸塩）およびTNF-αの値から明らかなとおり、ラット肺に有意な急性または遅延性炎症応答は生じず、対照との差はわずかだったが、対象も含む吸入物質を投与されたすべての群において高いNO値に向かう初期傾向はあった。細胞の完全回復はすべての群でわずかの差しかなかったが、吸入物質を投与されたすべての群において多形核白血球の数が増える初期傾向はあった。ラット肺胞マクロファージは、上述の被験物質のエアロゾルに暴露された後に正常に機能したが、リポソーム吸入群では15日目に肥大化したようだった。培地での肺胞マクロファージの培養後、研究15日目および43日目に検出された硝酸塩およびTNF-αの濃度は、対照とは有意に異なった。LPSで刺激されるとマクロファージは正常に応答し、かなりの濃度の一酸化窒素（20-40 nmol/10⁶
細胞）およびTNF-α（5−20 ng/10⁶細胞）になった。蛍光ビーズの取り込みが未処理対照と同一であることからわかるように、これらのマクロファージも正常な貪食機能を有していた。

連続14日間、リポソームアミカシン製剤を吸入しても、オプソニン化ビーズの貪食作用、炎症媒介物質TNFおよびNOの生成に関して、肺胞マクロファージの機能には、実質的な影響はなかった。

11. 投与
本願発明のいずれの組成物の投与量も、症状、患者の年齢および体重、治療または予防する疾患の性質および重篤度、投与経路、および本願組成物の形状によって変化するだろう。いずれの本願製剤も、単回または分割して投与してもよい。本願発明の組成物の投与量は、当業に知られる技術によって、または本願明細書に教示されるとおり、容易に決定することができる。

ある実施態様では、本願化合物の投与量は一般に、体重1kgにつき約0.01 ng乃至約10 gの範囲内であって、具体的には1kgにつき約1 ng乃至約0.1 gの範囲内、およびより具体的には1kgにつき約100 ng乃至約50mgの範囲内であろう。

効果的な投与量または量、および本製剤の投与のタイミングへの考えられうる影響は、本願発明の特定の組成物について同定される必要があるかもしれない。これは、1つ以上の動物グループ（好ましくは1グループにつき少なくとも5匹）を用いて、または適切であればヒト試験において、本願明細書に記載のとおり通常の実験によって達成することができる。本組成物および治療または予防の方法のいずれの有効性も、本組成物を投与し、１つ以上の適用できる指標の測定と、これらの指標の治療後の値と同じ指標の治療前の値との比較によって、投与の効果を評価することによって評価することもできる。

ある患者においてもっとも有効な治療効果を得るであろういずれかの本組成物の投与の正確な時間および量は、本組成物の活性、薬物動態、およびバイオアベイラビリティ、患者の生理学的状態（年齢、性別、疾患のタイプおよび病期、一般的な全身状態、投与および薬物の種類への応答性を含む）、ならびに投与経路によって変化するだろう。本願明細書に記載の指針は、たとえば最適な投与時間および／または投与量の決定など、処置を最適化するために用いてもよく、対象を監視するステップと投与量および／またはタイミングを調節するステップからなる通常の実験しか必要ではないだろう。

対象が処置されている一方で、患者の健康は、処置期間中のあらかじめ決められた時点における1つ以上の関連する指標を測定することによって監視することができる。投与の組成物、量、時間、および剤形を含む処置は、そのような監視の結果にしたがって最適化してよい。患者は、同じパラメータを測定することによって改善度を決定するために、定期的に再評価されてもよい。投与された本組成物の量および投与時間の調節は、このような再評価を元に行われてよい。

処置は、当該化合物の最適な投与量よりも少量の、少ない投与量から開始してよい。その後、その投与量を最適な治療効果が得られるまで少しずつ増加してもよい。

本組成物を使用することによって、この組成物（たとえば本抗感染物質）に含有される個々の物質に必要な投与量を低減させてもよい。それは、異なる物質の効果の始まりと持続時間が相補的だからである。

本組成物の毒性および治療効果は、たとえばLD₅₀およびED₅₀を決定するために、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定してもよい。

細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータは、ヒトにおける使用のための用量の範囲を決定する際に用いてよい。いずれの本組成物の用量も、好ましくは毒性が小さいかまたは皆無のED₅₀を含む循環濃度の範囲内にある。前記用量は、用いられた投与剤形および使用された投与経路によって、この範囲内で変化させてもよい。本願発明の組成物の場合、治療上有効な投与量は、最初は細胞培養アッセイで推定してよい。

12. 調製
本願発明の脂質抗感染製剤は、リポソームの水性懸濁液を含んでもよい。本製剤は、リポソームを形成するための脂質賦形剤、および適切な浸透圧およびpHを得るための塩／バッファを含有してもよい。本製剤は、薬学的賦形剤を含んでもよい。薬学的賦形剤は、ある器官または体の部分から別の器官または体の部分へいずれの本組成物またはその成分をも輸送することに関与する、液体、希釈剤、溶媒、またはカプセル封入物質であってよい。各賦形剤は、対象の組成物とその成分と適合性があり患者に有害ではないという意味において「許容」でなければならない。好適な賦形剤には、トレハロース、ラフィノース、マンニトール、スクロース、ロイシン、トリロイシン、および塩化カルシウムが含まれる。その他の好適な賦形剤の例には、（１）ラクトース、およびグルコースなどの糖類、（２）トウモロコシデンプンおよびバレイショデンプンなどのデンプン、（３）カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロースなどのセルロースおよびその誘導体、（４）粉末状トラガカント、（５）モルト、（６）ゼラチン、（７）タルク、（８）カカオバター、および座剤用ロウなどの賦形剤、（９）ピーナツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、および大豆油などの油、（１０）プロピレングリコールなどのグリコール、（１１）グリセリン、ソルビトール、およびポリエチレングリコールなどのポリオール、（１２）オレイン酸エチルおよびラウリル酸エチルなどのエステル、（１３）寒天、（１４）水酸化マグネシウム、および水酸化アルミニウムなどの緩衝剤、（１５）アルギン酸、（１６）発熱物質を含まない水、（１７）等張生理食塩水、（１８）リンガー溶液、（１９）エチルアルコール、（２０）リン酸緩衝溶液、および（２１）薬学的製剤に用いられるその他の無毒性適合性物質、が含まれる。

実施例
例1
インライン注入プロセス
約20mg/mlの総脂質（重量比でDPPC:コレステロール = 2:1）のエタノール溶液と、約75 mg/mlの硫酸アミカシン（約50
mg/mlアミカシン）の水溶液を混合して、2ストリーム・インライン注入法によって反応容器に入れた。2つの溶液を、それぞれ約1.0 L/分と約1.5L/分の速度でY字型連結器に注入した。2ストリーム注入中、新たに水を、脂質溶液の流速と類似する流速（約1.0L/分）で反応容器に加えた。反応容器に注入したアミカシン脂質懸濁液を、瞬時に水を連続注入して希釈した。この加水によって、エタノールを希釈することによって膜の密封を促進し、懸濁液の粘性も低下させてダイアフィルトレーション・カートリッジの内圧を低下させる。注入後、この懸濁液を、ダイアフィルトレーションを使って体積を半分に減らすことによって濃縮した。新たに3.0% NaCl溶液を供給している間に、濃縮懸濁液をダイアフィルトレーションによって洗浄した。洗浄した懸濁液は、望ましい総アミカシン濃度になるまで、ダイアフィルトレーションによってさらに濃縮した。結果を表10に示す。

例2
コアセルベーション技術によるウシ血清アルブミン（BSA）のカプセル封入
BSAは等電点pI=4.9を有するたんぱく質である。その点より上のpHでは、正味のマイナス電荷を有するコロイドとしてみなすことができる。媒質のイオン強度、pHおよび温度に影響する、ポリ（アリルアミンヒドロクロリド）などの各種高分子電解質との複合体化コアセルベートを形成する。アルブミンへの非溶媒（エタノール）を加えると、コアセルベーションも誘発することができることが明らかになった。BSAをpH7.0の水に溶解し、加えたエタノール濃度が約45重量%を超えると、BSA分子が凝集してコアセルベート相の小滴を形成し、光散乱が大きく増大する。NaClを加えると（イオン強度が上昇）、コアセルベーションを誘発するのに必要なエタノールの量が少なくなる。pHを低くすると似たような効果がある（図12）。二価イオン（たとえばMg²⁺）は、BSAコアセルベーションを誘発するのに必要な臨界エタノール濃度を低くするよりさらに強い効果がある。もっとも劇的な効果は、低分子量ポリカチオンPEIをBSA溶液に加えたときに見つかった（図14）。したがって、0.05mg/mLのPEIはモル単位で約60μMの濃度であって、BSA 3分子につきPEI 約1分子でしかない。

BSAをリポソームに封入するために、20mM NaClに溶かした濃度10mg/mLのBSA水溶液、pH5.5を用いた。濃度10mg/mLの脂質溶液を別に調製し、95%エタノール中DPPC/DPPG/コレステロールのモル比は
60:5:40だった。すべての溶液を30℃に予熱した。試験管に入れた1mL BSAに脂質溶液（0.4mL）をピペットで加え、ただちにボルテックスして完全に混合した。20秒後、5%スクロース溶液0.6mLを加え、再びボルテックスした。BSAのカプセル封入を測定するために、得られたリポソーム懸濁液0.8mLを5-20%のスクロース勾配に置き、30分間、30,000RPMで遠心分離した。負荷されたリポソームは20%スクロースより重いペレットを形成した。そのペレットを収集し、脂質とBSAについて定量した。脂質を逆相HPLCで測定し、BSAを蛍光で測定した（励起280nm、発光320nm）。そのペレットは脂質1.6mgとBSA 1.3mgを含有し、L/D比は1.2で、通常たんぱく質で見られる値よりも低いことがわかった（たとえば、米国特許第6,843,942号では、DPPC-コレステロール-ステアリルアミン形成における組み換えヒト超酸化ジスムターゼ（rh-SOD）のカプセル封入を調製したところ、L/D比約5だった）。

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引用による援用
本願明細書に引用した特許および特許出願を限定せずに含む出版物および参考文献は、個々の出版物または参考文献が具体的かつ個別に完全に上述されたとおり本願明細書に援用をもって引用されることを示唆したように、引用部分全体のその全体を援用により本願明細書に引用する。本出願が優先権を主張するいずれの特許出願も、出版物および参考文献について上述のとおり、本願明細書に援用をもって引用される。

等価物
本願発明は好ましい実施態様を強調して記述されているが、好ましい装置および方法のバリエーションを用いることもでき、本願発明は具体的に本願明細書に記載されている以外の様式で行われてもよいことを意図していることは、当業者には明らかであろう。したがって、本願発明には、請求の範囲で規定されるとおりの本願発明の精神および範囲内に包含されるすべての変更が含まれる。

嚢胞性線維症患者に見られる痰／バイオフィルムの断面図。 本願発明の薬物の標的化およびデポー効果をグラフで表したもの。 各種状態のアミカシンの細菌学をグラフで表したもの。 各種状態のアミカシンの細菌学をグラフで表したもの。 リポソーム／複合体化アミカシンおよびトブラマイシンのための持続性放出をグラフで表したもの。 遊離または複合体化シプロフロキサシンのデータ。 各種投薬スケジュールの場合について、肺における薬物耐性をグラフで表したもの。 リポソーム抗感染症製剤を調製する、2ストリームインライン注入プロセスをグラフで表したもの。記載の流速は、必要に応じて変化する流速のこれに限定されない例である。さらに、第三のNaCl溶液ラインが記載されているが、なくてもよく、または水だけを輸送してもよい。 硫酸アミカシンのエタノール／水との混和性。直線は、室温（RT）と40℃におけるエタノール溶液に混和することができるアミカシンの最大濃度（塩基性）を示す。濃度が高い方が、アミカシンは別の液相（コアセルベート）を形成し、その後、結晶として沈殿する。垂線は、脂質／アミカシン注入混合物（300/500パート）と、水を200パート加えた後のエタノール濃度を示す。 薬物輸送比対L/D比のグラフ。L/D比が低いほど、達成できる薬物輸送比が高くなる。 硫酸アミカシン−水−エタノールシステムの三元状態図。 BSAのエタノール誘導コアセルベーションへのイオン強度とpHの影響。光学キュベットに入れた10mg/mLのBSAのサンプルを、常に撹拌しながら脱気エタノールを流して滴定した。光の散乱信号を、PTI蛍光光度計（フォトンテクノロジー・インターナショナル社、米ニュージャージー州）を使って波長600nmで直角に測定した。温度は25℃に固定した。 BSAのエタノール誘導コアセルベーションへのMgCl₂の影響。EtOH_critは光の散乱が増加し始めた時点でのエタノール濃度である。BSA 10 mg/mLをpH 7.0でNaCl 10 mM に溶解した。 BSAのエタノール誘導コアセルベーションへの低分子量（MW 800）ポリカチオン、ポリエチレンイミン（PEI）の影響。BSA 10mg/mLをpH 7.0でNaCl 10 mM に溶解した。

Claims (25)

1. 脂質を用いた薬物製剤を、10乃至25mg/分の薬物速度で送達する方法であって、脂質対薬物（L/D）比が0.40乃至0.49の脂質を用いた薬物製剤を圧縮圧力20乃至40psiを用いて噴霧するステップを含む、方法。
2. 封入された薬物の保持率が45%超である、請求項１に記載の方法。
3. 前記脂質がリン脂質とステロールの混合物である、請求項１に記載の方法。
4. 前記リン脂質がジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）であって、前記ステロールはコレステロールである、請求項３に記載の方法。
5. DPPC:コレステロールの重量比が 2:1である、請求項４に記載の方法。
6. 前記薬物が抗感染物質である、請求項１に記載の方法。
7. 前記抗感染物質が、以下の、アミノグリコシド、テトラシクリン、スルホンアミド、p-アミド安息香酸、ジアミノピリミジン、キノロン、β-ラクタム、β-ラクタムおよびβ-ラクタマーゼ阻害物質、クロラフェニコール、マクロリド、ペニシリン、セファロスポリン、コルチコステロイド、プロスタグランジン、リノマイシン、クリンダマイシン、スペクチノマイシン、ポリミキシンB、コリスチン、バンコマイシン、バシトラシン、イソニアジド、リファンピン、エタムブトール、エチオンアミド、アミノサリチル酸、シクロセリン、カプレオマイシン、スルホン、クロファジミン、タリドミド、ポリエン抗真菌物質、フルシトシン、イミダゾール、トリアゾール、グリセオフルビン、テルコナゾール、ブトコナゾールシクロピラクス、シクロピロクス、オラミン、ハロプロギン、トルナフタート、ナフチフィン、テルビナフィン、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項６に記載の方法。
8. 前記抗感染物質がアミノグリコシドである、請求項７に記載の方法。
9. 前記アミノグリコシドがアミカシンである、請求項８に記載の方法。
10. 前記アミノグリコシドがトブラマイシンである、請求項８に記載の方法。
11. 前記アミノグリコシドがゲンタマイシンである、請求項８に記載の方法。
12. 前記の脂質を用いた製剤がリポソームである、請求項１に記載の方法。
13. 肺感染症の患者を治療する方法であって、L/D比が0.40乃至0.49の脂質を用いた薬物製剤を、その必要のある患者に、治療上有効な量投与し、当該薬物が抗感染物質であるステップを含む、方法。
14. 前記抗感染物質がアミノグリコシドである、請求項13に記載の方法。
15. 前記アミノグリコシドがアミカシンである、請求項13に記載の方法。
16. 前記アミノグリコシドがトブラマイシンである、請求項13に記載の方法。
17. 前記アミノグリコシドがゲンタマイシンである、請求項13に記載の方法。
18. 前記の脂質を用いた製剤がリポソームである、請求項13に記載の方法。
19. 肺感染症が、以下の、シュードモナス属の、緑膿菌（P. aeruginosa）、 P.パウチモビリス（, P. paucimobilis）、P.プチダ（P. putida）,蛍光菌（P. fluorescens）、および P.アシドボランス（P. acidovorans）、ブドウ球菌属のメシチリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）、レンサ球菌属の肺炎レンサ球菌（Streptococcus pneumoniae）、大腸菌（Escherichia
    coli）、クレブシエラ（Klebsiella）、 エンテロバクター（Enterobacter）、セラチア（Serratia）、ヘモフィルス（Haemophilus）、 ペスト菌（Yersinia pesos）、類鼻祖菌 （Burkholderia
    pseudomallei）、セパシア菌（B. cepacia）、首腐病菌（B. gladioli）、B.マルチボランス（B. multivorans）、B.ベトナミエンシス（B. vietnamiensis）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、トリ結核菌複合体（M. avium
    complex (MAC)）、トリ結核菌 （M. avium）、M. イントラセルラーレ（M. intracellulare）、カンサシ菌（M. kansasii）、M. ゼノピ（M. xenopi, M. marinum）、M.
    ウルセランス（M. ulcerans）、M. フォーチュイタム（M. fortuitum）複合体、M. フォーチュイタム（M. fortuitum）、またはM.ケロネイ（M. chelonei）感染症である、請求項１３に記載の方法。
20. 前記肺感染症が嚢胞性線維症によって引き起こされる、請求項13に記載の方法。
21. 前記肺感染症が嚢胞性線維症によって引き起こされる、請求項14に記載の方法。
22. 前記肺感染症が嚢胞性線維症によって引き起こされる、請求項15に記載の方法。
23. 前記肺感染症が嚢胞性線維症によって引き起こされる、請求項16に記載の方法。
24. 前記肺感染症が嚢胞性線維症によって引き起こされる、請求項17に記載の方法。
25. 前記肺感染症が嚢胞性線維症によって引き起こされる、請求項18に記載の方法。
    
    
    
    

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