MX2008012684A - Elevadas tasas de entrega de formulaciones medicinales a base de lipidos, y metodos de tratamiento de estas. - Google Patents

Abstract

Se proporciona un método para preparar formulaciones medicinales a base de lípidos con proporciones bajas lípido/fármaco utilizando técnicas de coacervación. También se proporcionan los métodos de entrega de tales formulaciones medicinales a base de lípidos a elevadas tasas de entrega, y los métodos de tratamiento a pacientes con enfermedades pulmonares que consisten en administrar las formulaciones medicinales a base de lípidos.

Description

ELEVADAS TASAS DE ENTREGA DE FORMULACIONES MEDICINALES A BASE DE LIBIDOS, Y MÉTODOS DE TRATAMIENTO DE ÉSTAS Solicitudes relacionadas Esta solicitud reclama el beneficio de prioridad ante la solicitud de Patente de Estados Unidos serie No. 11/398/859, presentada el 6 de abril de 2006, y la solicitud del PCT Serie No. US06/027859, presentada el 19 de julio de 2006, la cual se incorpora por este medio para referencia en su totalidad.

Antecedente de la invención Cierta tecnología de liberación sostenida apropiada para administración por inhalación emplea formulaciones a base de lípidos como liposomas para proporcionar el efecto terapéutico prolongado del medicamento en el pulmón y sistémicamente por liberación sostenida y la capacidad para dirigir y mejorar la captación del medicamento en los sitios de la enfermedad.

Para un sistema de entrega del fármaco basado en lípidos muchas veces es deseable reducir la proporción lípido a fármaco (L/F) tanto como sea posible para llevar al mínimo la carga de lípidos para evitar efectos de saturación en el cuerpo. Para entrega en el pulmón por inhalación, esto puede ser particularmente cierto porque para uso crónico, la dosificación del lípido podría dejar atrás el aclaramiento o eliminación limitando así la administración y de este modo la eficacia del producto medicinal. Una menor proporción L/F permitiría administrar más fármaco antes de que se cumpla el umbral de dosificación/aclaramiento .

Compendio de la invención Un objetivo de la presente invención es proporcionar formulaciones medicinales basadas en lípidos con bajas proporciones de lípido a fármaco.

También es un objetivo de la presente invención proporcionar un método de preparación de formulaciones medicinales basadas en lípidos con bajas proporciones lípido a fármaco.

También es un objetivo de la presente invención proporcionar un método de entrega de las formulaciones medicinales basadas en lípidos a mayores tasas de entrega, como se mide por mg/min del fármaco.

También es un objetivo de la presente invención proporcionar un método de tratamiento a un paciente para una infección pulmonar, que consiste en administrar al paciente que necesite de éste una cantidad terapéutica eficaz de una formulación medicinal basada en lipido que contenga una baja proporción L/F, en donde el fármaco es un anti-infeccioso .

La presente invención resulta de la observación que las formulaciones medicinales basadas en lipidos con bajas proporciones L/F se logran preparándolas utilizando técnicas de coacervación.

A través de los métodos que se describen en la presente, se crean liposomas de tamaño moderado (<1 µp?) que contienen atrapado fármaco en proporciones en peso L/F comúnmente alrededor de 0.40-0.49: 1. Los volúmenes capturados de liposomas han sido medidos, y a partir de estos números es posible calcular lo que el atropamiento teórico debe ser si el fármaco considerado como un soluto ideal (es decir, no interacciona con la membrana del liposoma si no atrapa teóricamente junto con agua) . A partir de esta comparación, se observan números de atropamiento que son 3-5X mayores que el esperado, indicando que está ocurriendo una interacción especial que permite atropamiento mayor que el esperado, y proporciones L/F menores que las esperadas. Las soluciones en las cuales se forman los liposomas tienen una determinada concentración de fármaco. La concentración de fármaco dentro de los liposomas debe ^er aproximadamente la misma concentración que en la solución. Sin embargo, concentraciones internas del fármaco se calculan por lo menos alrededor de 3X mayor. Ahora se ha descubierto que este fenómeno puede explicarse por la formación de un coacervado de fármaco que inicia la formación de la bicapa lipidica alrededor del coacervado del fármaco.

En parte, la presente invención se refiere a un método de preparación de una formulación de agente activo a base de lipido que consiste en mezclar un lipido y un agente activo con un coacervado. En otra modalidad, el coacervado se forma antes del mezclado con el lipido. En otra modalidad, el coacervado se forma durante el mezclado con un lipido. En otra modalidad, el coacervado se forma después del mezclado con un lipido. En otra modalidad, el coacervado es un coacervado del agente activo. En otra modalidad, el coacervado es un coacervado de un tercer componente que no es el lipido y el agente activo. En otra modalidad, el tercer componente consiste en un contraión con la capacidad de intercambio con el agente activo.

En otra modalidad, el tercer componente es un polímero con carga. En otra modalidad, el polímero con carga es un acrilato y el contraión es un contraión de amonio. En otra modalidad, el agente activo se adiciona después del mezclado del lípido con el coacervado y el agente activo se intercambia con el contraión.

En otra modalidad, el tercer componente es un ión capaz de acomplejarse con el agente activo. En otra modalidad, el ión es un ión metálico. En otra modalidad, el ión metálico es Mg2+. En otra modalidad, el agente activo se adiciona después del mezclado del lípido con el coacervado y el agente activo coordina al ión.

En otra modalidad, el lípido se adiciona como una solución con un disolvente orgánico. En otra modalidad, el lípido se adiciona como una suspensión micelar acuosa con un agente tensoactivo. En otra modalidad, el lípido es inducido a precipitar diluyendo la suspensión micelar con una solución acuosa a una concentración por debajo de la concentración micelar crítica (CMC) del agente tensoactivo .

En otra modalidad, el lípido es inducido a precipitar cambiando el pH.

En parte, la presente invención se refiere a un método de preparación de una formulación medicinal basada en lipidos que consiste en mezclar un lipido con un coacervado medicinal. En otra modalidad, el lipido se disuelve en un disolvente orgánico que forma una dilución lipidica, y el coacervado medicinal se forma a partir del mezclado de una solución acuosa del f rmaco con la solución lipidica. En otra modalidad, la solución lipidica y la solución medicinal acuosa se mezclan a partir de dos corrientes diferentes en un modo en linea. En otra modalidad, las dos corrientes entran en un conector en Y o T antes del mezclado en linea. En otra modalidad, una tercera corriente de agua o agua salada se adiciona para diluir la mezcla lipido y fármaco resultante. En otra modalidad, el disolvente orgánico es etanol .

En otra modalidad, la presente invención se refiere al método antes mencionado en donde la solución lipidica se adiciona en una proporción de 1 L/min y la solución medicinal acuosa se adiciona a una tasa de 1.5 L/min. En otra modalidad, la solución lipidica se adiciona a una tasa de 1 L/min, la solución medicinal acuosa se adiciona a una tasa de 1.5 L/min, y el agua o agua salada se adiciona a una tasa de 1 L/min.

En otra modalidad, la presente invención se refiere al método antes mencionado, en donde el lipido es una mezcla de un fosfolipido y un esterol. En otra modalidad, el fosfolipido es dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) y el esterol es colesterol. En otra modalidad, la proporción DPPC: colesterol es 2:1 en peso. En otra modalidad, la solución lipidica es de 20 mg/mL y la solución medicinal acuosa es de 75 mg/mL.

En otra modalidad, la presente invención se refiere al método antes mencionado, en donde el fármaco es un anti-infeccioso . En otra modalidad, el anti-infeccioso se selecciona de lo siguiente: un aminoglucósido, una tetraciclina, una sulfonamida, ácido p-aminobenzóico, una diaminopirimidina, una quinolona, una ß-lactama y un inhibidor de ß-lactamasa, cloranfenicol, un macrólido, penicilinas, cefalosporinas, corticosteroides , prostaglandina, linomicina, clindamicina, espectinomicina, polimixina B, colistina, vancomicina, bacitracina, isoniazid, rifampin, etambutol, etionamida, ácido aminosalicilico, cicloserina, capreomicina, una sulfona, clofazimina, talidomida, un polieno antimicótico, flucitosina, imidazol, triazol, griseofulvina, terconazol, butoconazol ciclopirax, ciclopirox olamina, haloprogin, tolnaftato, naftifina, terbinafina o combinaciones de éstos. En otra modalidad, el anti-infeccioso es un aminoglucósido . En otra modalidad, el aminoglucósido es amikacina. En otra modalidad, el aminoglucósido es tobramicina. En otra modalidad, el aminoglucósido es gentamicina.

En otra modalidad, la presente invención se refiere a una formulación medicinal basada en lipidos, en donde la relación lipido a fármaco es 0.40-0.49:1 en peso. En otra modalidad, la formulación basada en lipido es un liposoma. En otra modalidad, el fármaco es un antiinfeccioso. En otra modalidad, el anti-infeccioso se selecciona de lo siguiente: un aminoglucósido, una tetraciclina, una sulfonamida, ácido p-aminobenzóico, una diaminopirimidina, una quinolona, una ß-lactama y un inhibidor de ß-lactamasa, cloranfenicol, un macrólido, penicilinas, cefalosporinas, corticosteroides, prostaglandina, linomicina, clindamicina, espectinomicina, polimixina B, colistina, vancomicina, bacitracina, isoniazid, rifampin, etambutol, etionamida, ácido aminosalicilico, cicloserina, capreomicina, una sulfona, clofazimina, talidomida, un polieno antimicótico, flucitosina, imidazol, triazol, griseofulvina, terconazol, butoconazol ciclopirax, ciclopirox olamina, haloprogin, tolnaftato, naftifina, terbinafina o combinaciones de éstos. En otra modalidad, el anti-infeccioso es un aminoglucósido . En otra modalidad, el aminoglucósido es amikacina. En otra modalidad, el aminoglucósido es tobramicina. En otra modalidad, el aminoglucósido es gentamicina.

En otra modalidad, el lipido consiste en una mezcla de un fosfolipido y un esterol. En otra modalidad, el fosfolipido es DPPC y el esterol es colesterol. En otra modalidad, el DPPC y el colesterol están en una relación 2:1 en peso .

En otra modalidad, la presente invención se refiere a un método de entrega de una formulación medicinal basada en lipido en una tasa de 10 a 25 mg/min del fármaco, cuyo método consiste en nebulizar las formulaciones medicinales basadas en lipido antes mencionadas de la presente invención utilizando una presión de compresor de 20 a 40 psi. En otra modalidad, la retención del fármaco atrapado es mayor de 25%. En otra modalidad, la formulación medicinal basada en lipidos tiene una proporción L/F de menos que 0.49.

En otra modalidad, la presente invención se refiere a un método de tratamiento de un paciente para infección pulmonar, que consiste en administrar al paciente una cantidad terapéutica eficaz de las formulaciones medicinales basadas en lipido antes mencionadas. En otra modalidad, la formulación medicinal basada en lipidos tiene una proporción L/F de menos de 0.49. En otra modalidad, la infección pulmonar es una infección de pseudomonas, P. aeruginosa , P. pauci obilis, P. putida, P. fluorescens, y P. acidovorans, estafilocócicas , Staphylococcus aureus Meticilin resistentes (MRSA) , estreptocócicas, Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Haemophilus, Yersinia pesos, Burkholderia pseudomallei , B. cepacia, B. gladioli , B. multivorans, B. vietnamiensis, Mycobacterium tuberculosis, M. avium complex (MAC), M. avium, M. intracellular, M. kansasii , M. xenopi, M. marinum, M. ulcerans, M.fortuitum complex, M. fortuitum o M. chelonei .

En otra modalidad, la presente invención se refiere a un método de tratamiento de un paciente para una infección pulmonar causada por fibrosis quistica (FQ) , que consiste en administrar a un paciente una cantidad terapéutica eficaz de las formulaciones medicinales basadas en lipidos antes mencionadas.

Estas modalidades de la presente invención, otras modalidades y sus peculiaridades y características, serán evidentes a partir de la descripción, los dibujos y las reivindicaciones que siguen.

Breve descripción de los dibujos La Figura 1 representa el diagrama de la sección transversal del esputo/biopelicula observado en pacientes con fibrosis quística.

La Figura 2 representa la gráfica de la elección y efecto de depósito del fármaco de la presente invención.

Las Figuras 3 y 4 son representaciones gráficas de la bacteriología de amikacina en diferentes formas.

La Figura 5 representa una gráfica de la liberación sostenida para amikacina y tobramicina liposomal/acomple ada.

La Figura 6 representa datos sobre ciprofloxacino libre o acomplejado.

La Figura 7 representa una gráfica de la residencia del fármaco en el pulmón luego de administrar dos diferentes programas de dosificación.

La Figura 8 representa gráficamente el proceso de infusión en linea de dos corrientes para la preparación de las formulaciones anti-infecciosas liposomales. Las velocidades de flujo representadas son ejemplos no limitativos de las velocidades de flujo objeto de cambio según sea necesario. Asimismo, una tercera linea de solución de NaCl está representada pero esta puede estar ausente o suministrar solo agua.

La Figura 9 representa la miscibilidad de sulfato de amikacina con etanol/agua. Las lineas representan la concentración máxima de amikacina (base) miscible con solución de etanol a temperatura ambiente (TA) y 40°C. A concentraciones superiores amikacina forma una fase liquida diferente (coacervados) que después precipita como cristales. Las lineas verticales muestran la concentración de etanol en la mezcla para infusión lipido/amikacina (300/500 partes) y después de adicionar 200 partes de agua.

La Figura 10 representa una gráfica de la tasa de entrega de fármaco contra la proporción L/F mostrando que a menor proporción de L/F se puede lograr la mayor tasa de entrega de fármaco.

La Figura 11 representa un diagrama de fases ternario del sistema sulfato de amikacina-agua-etanol .

La Figura 12 representa el efecto de la concentración iónica y pH sobre la coacervación inducida por etanol de BSA. Una muestra de BSA a 10 mg/mL en una cubeta óptica fue titulada con un flujo de etanol desgasificado con agitación constante. Se midió la señal de la dispersión de la luz en el ángulo recto a 600 nm de longitud de onda utilizando un fluorimetro PTI (Photon Technology International, NJ) . La temperatura fue fijada a 25°C.

La Figura 13 representa el efecto de MgCl2 sobre la coacervación inducida por etanol de BSA. EtOHcrit es la concentración de etanol al inicio del aumento en la dispersión de luz. BSA 10 mg/mL se disolvió en NaCl 10 mM a pH 7.0.

La Figura 14 representa el efecto del policatión de peso molecular bajo (PM 800) polietilenimina (PEI) sobre la coacervación inducida por etanol de BSA. BSA 10 mg/mL se disolvió en NaCl 10 mM a pH 7.0.

Descripción detallada- La presente invención describe una formulación medicinal basada en lipidos preparada formando un coacervado medicinal que induce la formación de la bicapa lipidica alrededor del fármaco. El método da como resultado bajas proporciones de lipido a fármaco para la formulación medicinal basada en lipidos resultante y las concentraciones internas del fármaco que son 3 a 5X mayores que la concentración medicinal externa utilizada. La presente invención también describe un método de preparación de estas formulaciones de lipidos utilizando técnicas de coacervación, elevadas tasas de entrega para la administración de estas formulaciones medicinales basadas en lipidos por nebulización, y los métodos de tratamiento de infecciones pulmonares, que consiste en administrar estas formulaciones medicinales basadas en lipidos a un paciente que necesite de éste. 1. Definiciones Por conveniencia, antes de continuar con la descripción de la presente invención, en la presente se recopilan ciertos términos que se emplean en la especificación, los ejemplos y las reivindicaciones anexas. Estas definiciones deben leerse a la luz del resto de la descripción y entenderse como por una persona experta en la técnica. A menos que se defina de otro modo, los términos técnicos y científicos que se utilizan en la presente tienen el mismo significado comúnmente comprendido por un experto en la técnica.

Los artículos "un" y "uno" cuando se utilizan en la presente se refieren a uno o más de uno (es decir, por lo menos uno) del objeto gramatical del artículo. Por medio de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento.

El término "biodisponible" es reconocido en la técnica y se refiere a una forma del objeto de la invención que tiene en cuenta ésta, o una parte de la cantidad administrada, para ser absorbida por, incorporada a o de otro modo fisiológicamente disponible para un individuo o paciente a quien se administra.

Los términos "contiene" y "comprende" se utilizan en el sentido incluyente, abierto, significando que pueden incluirse otros elementos.

El término "fármaco" es reconocido en la técnica y se refiere a cualquier porción química que sea una sustancia biológica, fisiológica o farmacológicamente activa que actúe en forma local o sistémica en un individuo. Los ejemplos de fármacos, también mencionados como "agentes terapéuticos", están descritos en las referencias de la literatura bien conocidas como el Merck Index, el Physicians Desk Reference y el Pharmacological Basis of Therapeutics, y estos incluyen, sin limitación, anti-infecciosos, medicamentos; vitaminas; suplementos minerales; sustancias que se utilicen para el tratamiento, prevención, diagnóstico, curación o alivio de una enfermedad; sustancias que afectan la estructura o función del cuerpo; o profármacos, los cuales se vuelven biológicamente activos o más activos después de que han sido colocados en el entorno fisiológico.

Los términos "encapsulado" y "encapsulante" se refieren a la adsorción de los fármacos en la superficie de la formulación a base de lipidos, la asociación de los fármacos en la región intersticial de las bicapas o entre dos monocapas, la captura de los fármacos en el espacio entre dos capas o la captura de los fármacos en el espacio rodeado por la bicapa más interna o monocapa.

El término "que incluye" se utiliza en la presente para entender "que incluye, más no se limita a". "Que incluye" y "que incluye, más no se limita en forma indistinta.

El término "formulación anti-infecciosa basada en lipidos" ó "anti-infeccioso-Lip" ó "an-lip" descrito en la presente es cualquier forma de composición antiinfecciosa donde por lo menos aproximadamente 1% en peso del anti-infeccioso está asociado con el lípido como parte de un complejo con el lipido, o como un liposoma donde el antibiótico puede estar en fase acuosa o la fase bicapa hidrofóbica o en la región headgroup interfacial de la bicapa liposomal. Preferentemente, es posible asociar asi por lo menos aproximadamente 5%, o por lo menos aproximadamente 10%, o al menos aproximadamente 10%, o al menos aproximadamente 20% o al menos aproximadamente 25%. La asociación puede medirse por separación a través de un filtro donde el lipido y el anti-infeccioso asociado al lipido es retenido y el antiinfeccioso libre está en el filtrado. Una "formulación anti-infecciosa liposomal" es una formulación antiinfecciosa a base de lipido donde la formulación lipidica es la forma de un liposoma.

El término "mamífero" es conocido en la técnica, los mamíferos ejemplares pueden ser humanos, primates bovinos, porcinos, caninos, felinos y roedores (por ejemplo ratones y ratas) .

Un "paciente", "individuo" u "hospedero" para ser tratado por el método presente puede significar un animal humano o no humano .

El término "sales aceptadas para uso farmacéutico'" es reconocido en la técnica y se refiere a las sales de adición ácida inorgánicas y orgánicas, relativamente no tóxicas de los compuestos, que incluyen, por ejemplo, aquellas contenidas en las composiciones de la presente invención .

El término "infusión en disolvente" es un proceso que incluye la disolución de uno o más lipidos en una cantidad pequeña, preferentemente mínima, de un disolvente compatible con el proceso para formar una suspensión o solución (preferentemente una solución) lipídica y luego la adición de la solución a un medio acuoso que contenga agentes bioactivos. Por lo regular, un disolvente compatible con el proceso es uno que puede ser lavado en un proceso acuoso como diálisis. La composición que se somete a un ciclo frío/tibio preferentemente se forma por infusión en disolvente, siendo preferida la infusión en etanol. Los alcoholes se prefieren como disolventes. "Infusión en etanol", un tipo de infusión en disolvente, es un proceso que consiste en la disolución de uno o más lipidos en una cantidad pequeña, preferentemente mínima, de etanol para formar una solución lipídica y luego la adición de la solución a un medio acuoso que contenga los agentes bioactivos. Una cantidad "pequeña" de disolvente es una cantidad compatible con la formación de liposomas o complejos lipidíeos en el proceso de infusión. El término "infusión en disolvente" también puede incluir un proceso de infusión en línea donde dos componentes de la formulación se mezclan en línea.

El término "considerablemente libre" es bien conocido en la técnica y se refiere a una cantidad insignificante o menos.

El término "agente tensoactivo" cuando se utiliza en la presente se refiere a un compuesto que reduce la tensión superficial del agua por adsorción en la interfaz aire-agua. Muchos agentes tensoactivos pueden acumularse en la solución a granel en agregados que son conocidos como micelas. La concentración a la que los agentes tensoactivos comienzan a formar micelas es conocida como la "concentración micelar critica" ó CMC. Los lipidos útiles para la aplicación actual pueden también ser agentes tensoactivos como CMC extremadamente baja. Los agentes tensoactivos formadores de micelas útiles para la aplicación actual deben tener una CMC mayor que la CMC del lipido. A concentraciones por encima de la CMC, los agentes tensoactivos formadores de micelas pueden formar micelas mixtas compuestas de agentes tensoactivos y moléculas lipidicas. Tras la dilución por debajo de la CMC, los agentes tensoactivos formadores de micelas se disociarán en una solución verdadera dejando asi a las moléculas lipidicas expuestas al medio acuoso. Esto conduce a la precipitación espontánea de los lipidos, preferentemente en una forma de bicapas.

La frase "cantidad terapéutica eficaz", cuando se utiliza en la presente, significa aquella cantidad de un compuesto, materia o composición que contiene una formulación medicinal a base de lipidos de acuerdo con la presente invención que es eficaz para producir algún efecto terapéutico deseado inhibiendo las infecciones pulmonares .

El término "tratamiento" es bien conocido en la técnica y se refiere a la curación asi como la mejoría por lo menos de un síntoma o cualquier enfermedad o estado. El término "tratamiento" también se refiere al tratamiento profiláctico que actúa para defender contra o prevenir un estado o enfermedad. 2. Coacervación La coacervación en su forma más sencilla puede pensarse como un amontonamiento o acumulación. En términos más técnicos, la coacervación es la separación en dos fases líquidas en sistemas coloidales. La fase más concentrada en el componente coloide (fármaco) se denomina el coacervado, y la otra fase es la solución en equilibrio .

El término coloidal se refiere a un estado de subdivisión, entendiéndose que las moléculas o partículas polimoleculares dispersadas en un medio tienen al menos en una dirección una dimensión aproximada entre 1 nm y 1 µ??, y que en un sistema se encuentran discontinuidades en distancias de ese orden. IUPAC Compendium of Chemical Terminology 1972, 31, 605.

Una solución de macromoléculas es un sistema coloidal sencillo y el más común. Las moléculas pequeñas también pueden formar coloides de asociación como agregados reversibles. Un coloide de asociación es una combinación química reversible debido a las fuerzas de unión química débiles en donde hasta cientos de moléculas o iones se agregan para formar estructuras coloidales con tamaños desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 2000 nanómetros o más grandes.

La clasificación actual del fenómeno de coacervación se basa en el mecanismo que conduce a la separación de las dos fases. Gander B, Blanco-Prieto M. J., Thomasin C, Wandrey Ch. and Hunkeler D., Coacervation/Phase Separation, In: Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, Vol.l, Swarbrick J, Boylan J.C., Eds . , Marcel Dekker, 2002, p. 81-497).

Estos incluyen: 1. Coacervación inducida por desolvatación parcial. Esta a su vez puede incluir un sistema binario de un disolvente y un polímero, donde los factores que inducen la coacervación son temperatura o pH. O puede ser un sistema ternario que incluye un disolvente un polímero y un agente coacervador (no disolvente para el polímero o electrolito (sal) ) . Este tipo de coacervación se denomina con frecuencia Coacervación Sencilla. Un ejemplo tradicional de Coacervación Sencilla es la coacervación de la solución de gelatina por adición de alcohol (no disolvente para la gelatina) . Otros no disolventes útiles para inducir coacervación en sistemas acuosos pueden incluir propanol, isopropanol, acetona, dioxano. Cuando se utilizan electrolitos para desolvatación del polímero, el fenómeno es denominado salificación. En sistemas acuosos, la capacidad de los iones para provocar deshidratación sigue la serie de Hofmeister o liotrópica NH4++ < K+ < Na+ < Ca2+ < Mg2+ < Al3+ para cationes, y Cl" < S042" < tartrato2-, fosfato2- < citrato3", en el orden de aumentar la capacidad de salificación.

Coacervación inducida por repulsión polímero-polímero. En este tipo, el segundo polímero adicionado a la solución del primer polímero induce separación de fases siendo el primer polímero en la fase del coacervado suspendido en una parte del segundo polímero. Un ejemplo de repulsión polímero-polímero es la coacervación PLA en disolvente diclorometano inducido por aceite de silicona. 3. Coacervación inducida por reticulación no covalente del polímero ("Coacervación compleja") . El agente reticulador puede ser un polímero de carga contraria al polímero coacervante, o contraión di o trivalente al polímero, como puede ser Ca¿+, Mg2+, Al3+, Zn2+, tartrato2- y otros. Los polímeros comunes que se utilizan en la coacervación compleja incluyen: los polianiones alginato, carragenina, carboximetilcelulosa, sulfato de condroitina, sulfato de celulosa, gelano, ácido hialurónico, poli (ácido acrílico) , xantano; policationes quitosan, poli (cloruro de dialil dimetilamonio) , poli (L-lisina) , poli (vinilamina) . En general, la interacción polianión-policatión es controlada por diversos parámetros, como la densidad de la carga, el tipo de grupo iónico, la arquitectura de la cadena. Además, influyen en la formación del complejo el pH, concentración iónica, concentraciones, temperatura.

Desde luego, para controlar la coacervación es posible utilizar una combinación de los tipos antes enlistados. Particularmente, adición de no disolvente en combinación con agentes reticuladores, o no disolvente y agentes desaladores.

La Figura 10 representa un diagrama de fase ternaria para un sistema sulfato de amikacina-agua-etanol . El área de dos fases bajo la curva binodial [sic] es una zona donde el sistema se separa en dos fases, una fase del coacervado y una fase en equilibrio. El área por encima de la curva binodial es una zona donde existe un sistema sencillo de fase liquida de sulfato de amikacina disuelto en mezcla de agua-etanol. Cuando tres partes de la solución de sulfato de amikacina en agua a 70 mg/mL (punto 1) se mezclan con 2 partes de etanol, la mezcla resultante tiene composición (punto 2), el cual se separa espontáneamente en dos fases: fase del coacervado rica en amikacina (punto C) y la fase en equilibrio sobre amikacina (punto E) . La fase del coacervado consiste solamente en aproximadamente 4.5% del volumen total y originalmente se forma como gotitas pequeñas suspendidas en la fase en equilibrio. Si los lípidos están presentes en la solución circundante cuando los coacervados recién se forman, estos pueden formar espontáneamente bicapas alrededor de estas gotitas. Durante la fabricación muchas veces se desea limitar la exposición del producto a la alta concentración de etanol. Por ejemplo, otras tres partes de salina o solución amortiguadora pueden ser adicionadas consecuentemente a la mezcla, lo cual desplaza la composición a la zona de fase única (punto 3) . Puesto que en ese punto los liposomas ya están formados encapsulando la mayor parte del material de la fase del coacervado, la amikacina permanecerá encapsulada dentro de los liposomas.

Es importante que los métodos y formulaciones de lipidos de la presente invención no se preparen pasivamente, es decir, que la encapsulacion no se lleve a cabo solo por equilibrio. La formación del coacervado conduce a mayores concentraciones internas del fármaco en relación con concentraciones externas del fármaco y menores proporciones L/A [sic] . 3. Fármaco El coacervado medicinal puede prepararse con cualquier tipo de fármaco. Preferentemente, el fármaco es un anti-infeccioso soluble en agua. Los antiinfecciosos son agentes que actúan contra las infecciones, como las infecciones bacterianas, micobacterianas, micóticas, virales o de protozoarios . Los anti-infecciosos que cubren la invención incluye, más no se limitan a, aminoglucósidos (por ejemplo estreptomicina, gentamicina, tobramicina, amikacina, metilmicina, canamicina y similares) , tetraciclinas (como clortetraciclina, oxitetraciclina, metaciclina, doxiciclina, minociclina y similares), sulfonamidas (por ejemplo sulfanilamida, sulfadiazina, sulfametoxazol, sulfisoxazol, sulfacetamida y similares) , ácido para aminobenzóico, diaminopirimidinas (como trimetoprim, muchas veces utilizado con sulfametoxazol , pirazinamida y similares) , quinolonas (como ácido nalidixico, cinoxacina, ciprofloxacino y norfloxacino y similares), penicilinas (como penicilina G, penicilina V, ampicilina, amoxicilina, bacampicilina, carbenicilina, carbenicilina indanilo, ticarcilina, azlocilina, mezlocilina, piperacilina y similares) , penicilina resistente a penilicinasa (como puede ser meticilina, oxacilina, cloxacilina, dicloxacilina, nafcilina y similares, cefalosporinas de primera generación (como puede ser cefadroxil, cefalexina, cefradina, cefalotina, cefapirina, cefazolina y similares) , cefalosporinas de segunda generación (como puede ser cefaclor, cefamando1, cefonicid, cefoxitin, cefotetan, cefuroxima, cefuroxima axetil; cefmetazol, cefprozil, loracarbef, ceforanida y similares) , cefalosporinas de tercera generación (como puede ser cefepime, cefoperazona, cefotaxime, ceftizoxima, ceftriaxona, ceftazidima, cefixima, cefpodoxima, ceftibuten y similares) , otras beta-lactamas (como puede ser imipenem, meropenem, aztreonam, ácido clavulánico, sulbactam, tazobactam y similares) , inhibidores de betalactamasa (como puede ser el ácido clavulánico) , cloranfenicol , macrólidos (como eritromicina, azitromicina, claritromicina y similares) , lincomicina, clindamicina, espectinomicina, polimixina B, polimixinas (como puede ser polimixina A, B, C, D, El (colistin A), ó E2 (colistin B ó C, y similares), colistin, vancomicina, bacitracina, isoniazid, rifampin, etambutol, etionamida, ácido aminosalicilico, cicloserina, capreomicina, sulfotas (como puede ser dapsone, sulfoxona de sodio y similares) , clofazimina, talidomida o cualquier otro agente antibacteriano que pueda ser encapsulado con lipidos. Los anti-infecciosos pueden incluir agentes antimicóticos que incluyen antimicóticos polieno (como puede ser anfotericina B, nistatina, natamicina y similares) , flucitosina, imidazoles (como n-ticonazol, clotrimazol, econazol, ketoconazol y similares) , triazoles (como itraconazol, fluconazol y similares), griseofulvina, terconazol, butoconazol ciclopirax, ciclopirox olamina, haloprogina, tolnaftato, naftifina, terbinafina o cualquier otro antimicótico que pueda ser encapsulado o acomplejado con lipidos. La discusión y los ejemplos se dirigen principalmente hacia amikacina, pero el alcance de la aplicación no está destinado a ser limitada a este anti-infeccioso . También es posible utilizar combinaciones de fármacos.

Los anti-infecciosos particularmente preferidos incluyen los aminoglucósidos, las quinolonas, los antimicóticos polieno y las polimixinas. Los aminoglucósidos particularmente preferidos incluyen amikacina, gentamicina y tobramicina.

También incluidas como anti-infecciosos apropiados utilizados en las formulaciones medicinales a base de lipidos de la presente invención son las sales de adición aceptadas para uso farmacéutico y los complejos de los fármacos. En casos en donde los compuestos pueden tener uno o más centros quirales, a menos que se especifique, la presente invención comprende cada compuesto racémico único, asi como cada compuesto no racémico único.

En casos en los cuales los fármacos tienen dobles enlaces carbono-carbono insaturados, los isómeros cis (Z) y trans (E) están dentro del alcance de esta invención.

En casos en donde los fármacos pueden existir en formas tautoméricas, como los tautómeros ceto-enol, como puede O OR' ser ^-^. ^ - s. cada forma tautomérica está considerada incluida dentro de la invención, bien sea que exista en equilibrio o bloqueado en una forma por sustitución apropiada con R' . El significado de cualquier sustituyente en cualquier presencia es independiente de su significado, o cualquier otro significado de sustituyente en cualquier incidencia.

También incluidos como fármacos apropiados utilizados en las formulaciones anti-infecciosas a base de lipidos de la presente invención son los profármacos de los compuestos medicinales. Se considera a los profármacos cualquiera de los portadores unidos covalentemente que liberan el compuesto precursor activo in vivo. 4. Infecciones pulmonares Las formulaciones medicinales a base de lipidos de la presente invención con sus proporciones L/F son particularmente útiles para tratar infecciones pulmonares cuando el fármaco es un anti-infeccioso . Entre las infecciones pulmonares (como pueden ser pacientes de fibrosis quistica) que pueden ser tratadas con los métodos de la invención son infecciones por Pseudomonas (por ejemplo, P. aeruginosa, P. paucimobilis, P. putida, P. fluorescens, y P. acidovorans) , estafilocócicas , Staphylococcus aureus metilcilin resistentes (MRSA) , estreptocócicas (incluido por Streptococcus pneumoniae) , por Escherichia coli, Klebsiella, Enterobacter, Serratia , Haemophilus, Yersinia pesos, Burkholderia pseudomallei , B. cepacia, B. gladioli , B. multivorans, B. vietnamiensis, Mycobacterium tuberculosis, M. avium complex (MAC), M. avium, M. intracellular, M. kansasii, M. xenopi , M. marinum, M. ulcerans, M.fortuitum complex, M. fortuitum o M. chelonei) . 5. Métodos de tratamiento En una modalidad, la presente invención consiste en un método de tratamiento a un paciente para infección pulmonar, que consiste en administrar al paciente que necesita de éste, una cantidad terapéutica eficaz de una formulación medicinal basada en lipidos con una proporción L/F baja, en donde el fármaco es un antiinfeccioso .

Donde no se proporciona más adelante una dosis especifica, la dosis preferida de la invención es 50% o menos, 35% o menos, 20% o menos ó 10% o menos, de la cantidad mínima de fármaco libre (el cual, desde luego, puede ser una sal) que sea eficaz, si se suministra a los pulmones a través de un nebulizador, para reducir la cuenta de UFC en los pulmones en un orden de magnitud en el transcurso de un tratamiento de 14 días. La cantidad comparativa del fármaco libre es la cantidad acumulada que se utilizaría en el periodo de dosificación aplicado con la administración del fármaco de la invención. El fármaco libre mínimo comparativo en este párrafo es una "cantidad comparativa del fármaco libre".

Las modalidades que no tratan FQ de la invención pueden utilizarse con cualquier animal, aunque preferentemente con humanos. Las cantidades relativas en un animal determinado se miden con respecto a tales animales .

El programa de dosificación preferentemente es una vez al día o menos. En las modalidades preferidas, el programa de dosificación es una vez en días alternos, cada tercer día, cada semana o menos. Por ejemplo, el programa de dosificación puede ser en días alternos o menos, utilizando 50% o menos de la cantidad comparativa del fármaco libre. Por ejemplo, la dosificación puede ser diaria utilizando 35% o menos de la cantidad comparativa de fármaco libre. Véase las Figuras 3 y 4 para los datos en animales que muestran que las formulaciones antiinfecciosas a base de lipidos son más eficaces que el fármaco libre.

Para tratar infecciones, la cantidad eficaz del anti-infeccioso será reconocida por los clínicos pero incluye una cantidad eficaz para tratar, reducir, mejorar, eliminar o prevenir uno o más síntomas de la enfermedad que busca ser tratada o el estado que busca ser evitado o tratado, o para producir de otro modo un cambio clínicamente reconocible en la patología de la enfermedad o estado. Una mejoría incluye la reducción de la incidencia o gravedad de las infecciones en los animales tratados en forma profiláctica. En algunas modalidades, la cantidad eficaz es eficaz para tratar o mejorar los síntomas de la infección pulmonar después de que hayan surgido. En algunas otras modalidades, la cantidad eficaz es eficaz para tratar o mejorar la incidencia promedio o gravedad de las infecciones en los animales tratados en forma profiláctica (medidos por estudios estadísticos) .

Los liposomas u otro sistema de suministro de lipidos pueden administrarse por inhalación como rocío nebulizado, polvo o aerosol, o por administración intratecal . Se prefiere la administración por inhalación. El resultado general es una administración menos frecuente y un índice terapéutico mejorado en comparación con el fármaco libre o la forma parenteral del medicamento. Los liposomas u otras formulaciones lipídicas son particularmente ventajosas debido a su capacidad para proteger el fármaco aunque siendo compatibles con el revestimiento pulmonar o surfactante pulmonar.

La presente invención consiste en los métodos para el tratamiento de infecciones pulmonares gram negativas. Una infección útilmente tratada es infección pseudomonadal crónica en pacientes con FQ. Los tratamientos conocidos de infecciones pulmonares (como puede ser en pacientes FQ) con aminoglucósido generalmente consiste en administrar aproximadamente 200-600 mg de amikacina o tobramicina por día por inhalación. La presente invención toma en cuenta el tratamiento administrando, en una modalidad preferida, 100 mg o menos de amikacina por día (o normalizado a 100 g por día o menos si la dosificación es menos frecuente) . En todavía otra modalidad, se realiza una administración de 60 mg o menos de amikacina por día. Y en todavía otra modalidad, se hace una administración de aproximadamente 30 a 50 mg, no más de una vez cada dos días. La modalidad más preferida consiste en la administración de aproximadamente 30 a 50 mg en días alternos o cada tercer día . 6. Lipidos y liposomas Los lipidos que se utilizan en las composiciones de la presente invención pueden ser lipidos sintéticos, semisintéticos o de origen natural, incluidos los fosfolipidos, tocoferoles, esteroides, ácidos grasos, glucoproteinas cono albúmina, lipidos aniónicos y lipidos catiónicos. Los lipidos pueden ser aniónicos, catiónicos o neutros. En una modalidad, la formulación lipidica es prácticamente libre de lipidos aniónicos. En una modalidad, la formulación lipidica consiste solo en lipidos neutros. En una modalidad, la formulación lipidica está libre de lipidos aniónicos. En otra modalidad, el lipido es un fosfolipido. Los fosfolipidos incluyen fosfatidilcolina de huevo (EPC) , fosfatidilglicerol de huevo (EPG) , fosfatidilinositol de huevo (EPI), fosfatidilserina de huevo (EPS), fosfatidiletanolamina (EPE) y ácido fosfatidico de huevo (EPA) , las contrapartes de soya, fosfatidilcolina de soya (SPC) ; SPG, SPS, SPI, SPE y SPA; las contrapartes hidrogenadas de huevo y soya (por ejemplo, HEPC, HSPC) , otros fosfolipidos preparados de enlaces éster de ácidos grasos en las posiciones 2 y 3 del glicerol que contienen cadenas de 12 a 26 átomos de carbono y diferentes grupos cabeceros en la posición 1 del glicerol que incluyen colina, glicerol, inositol, serina, etanolamina, asi como los ácidos fosfatidicos correspondientes. Las cadenas en estos ácidos grasos pueden estar saturadas o insaturadas, y el fosfolipido puede prepararse de ácidos grasos de diferentes longitudes de cadena y diferentes grados de insaturación. En particular, las composiciones de las formulaciones pueden incluir dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) , un constituyente importante del surfactante pulmonar de origen natural asi como dioleoilfosfatidilcolina (DOPC) . Otros ejemplos pueden ser dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC) y dimiristoilfosfatidilglicerol (DMPG) , dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) y dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG) , diestearoilfosfatidilcolina (DSPC) y diestearoilfosfatidilglicerol (DSPG) , dioleilfosfatidiletanolamina (DOPE) y fosfolipidos mixtos como palmitoilestearoilfosfatidilcolina (PSPC) y palmitoilestearoilfosfatidilglicerol (PSPG) , driacilglicerol, diacilglicerol, seranida, esfingosina, esfingomielina y fosfolípidos acilados únicos como mono-oleoil-fosfatidiletanol amina (MOPE) .

Los lipidos que se utilizan pueden incluir sales de amonio de ácidos grasos, fosfolípidos y glicéridos, esteroides, fosfatidilgliceroles (los PG) , ácidos fosfatídicos (los PA) , fosfatidilcolinas (PC) , fosfatidilinositoles (los PI) y los fosfatidilserinas (PS) . Los ácidos grasos incluyen ácidos grasos de longitudes de cadena de carbono de 12 a 26 átomos de carbono que son saturados o insaturados. Algunos ejemplos específicos pueden ser: miristilamina, palmitilamina, laurilamina y estearilamina, dilauroil etilfosfocolina (DLEP) , dimiristoil etilfosfocolina (DMEP) , dipalmitoil etilfosfocolina (DPEP) y diestearoil etilfosfocolina (DSEP) , cloruro de N- (2, 3-di- (9 (Z) -octadeceniloxi) -prop-l-il-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA) y 1 , 2-bis (oleoiloxi ) -3-(trimetilamonio) propano (DOTAP) . Los ejemplos de los esteroides incluyen colesterol y ergosterol . Los ejemplos de los PG, PA, PI, PC y PS incluyen DMPG, DPPG, DSPG, DMPA, DPPA, DSPA, DMPI, DPPI, DSPI, DMPS, DPPS y DSPS, DSPC, DPPG, DMPC, DOPC, PC de huevo.

Las formulaciones anti-infecciosas liposomales compuestas de fosfatidilcolinas, como puede ser DPPC, ayudan en la captación por las células en el pulmón como pueden ser los macrofagos alveolares y ayuda a la liberación sostenida del agente anti-infeccioso en el pulmón (Gonzales-Rothi et al. (1991)). Los lípidos con carga negativa como los PG, PA, PS y PI, además de reducir la agregación de las partículas, pueden desempeñar una función en las características de liberación sostenida de la formulación para inhalación así como en el transporte de la formulación a través del pulmón (transcitosis) para captación sistémica. Se considera que los compuestos esterol afectan las características de liberación y fuga de la formulación.

Los liposomas son membranas bicapa lipídicas completamente cerradas que contienen un volumen acuoso atrapado. Los liposomas pueden ser vesículas unilamelares (que poseen una bicapa de membrana sencilla) o vesículas multilamelares (estructuras tipo cebolla caracterizadas por múltiples bicapas de membrana, cada una separada de la siguiente por una capa acuosa) . La bicapa está compuesta de dos monocapas lipídicas que tienen una región "cola" hidrofóbica y una región "cabeza" hidrofílica. La estructura de la membrana bicapa es tal que las "colas" hidrofóbicas (no polares) de las monocapas lipídicas se orientan hacia el centro de la bicapa mientras las "cabezas" hidrofilicas se orientan hacia la fase acuosa. Las formulaciones anti-infecciosas lipidicas son asociaciones lipido y el agente antiinfeccioso. Esta asociación puede ser covalente-iónica, electrostática, no covalente o estérica. Estos complejos son no liposomales y son incapaces de atrapar solutos solubles en agua 'adicionales. Los ejemplos de estos complejos incluyen complejos lipidíeos de anfotericina B (Janoff et al., Proc. Nat Acad. Sci., 85: 6122 6121, 1988) y cardiolipina acomplejada con doxorubicina .

Un clatrato lipido es una estructura tridimensional tipo jaula que emplea uno o más lípidos, en donde la estructura atrapa un agente bioactivo. Tales clatratos están incluidos en el alcance de la presente invención. Los proliposomas son formulaciones que puedan convertirse en liposomas o lípidos complejos tras el contacto con un líquido acuoso. La agitación u otro mezclado pueden ser necesarios. Tales proliposomas están incluidos en el alcance de la presente invención. 7. Métodos de preparación El proceso para formar formulaciones medicinales lipidicas consiste en un proceso de "infusión en disolvente". Este es un proceso que consiste en disolver uno o más lípidos en una cantidad pequeña, preferentemente mínima, de un disolvente compatible con el proceso para formar una suspensión o solución lipídica (preferentemente una solución) y luego realizar la infusión de la solución con un medio acuoso que contenga el fármaco. Normalmente un disolvente compatible con el proceso es aquel que puede ser lavado en un proceso acuoso como diálisis o diafiltración . "Infusión en etanol", un tipo de infusión en disolvente, es un proceso que consiste en disolver uno o más lípidos en una cantidad pequeña, preferentemente mínima de etanol para formar una solución lipídica y luego realizar la infusión de la solución con un medio acuoso que contenga el fármaco. Una cantidad "pequeña" de disolvente es una cantidad compatible con los liposomas o complejos lipidíeos formadores en el proceso de infusión. Es importante que las condiciones para el proceso de infusión den origen a la formación del coacervado. Las condiciones finales para la infusión de una determinada solución lipídica con una solución acuosa determinada el agente activo tiene que determinarse con base en los ejemplos presentados en la presente, y el efecto de los diversos parámetros que se enseñan más adelante. También útiles para algunos expertos en la técnica son las técnicas para formar coacervados como se describe en referencias tales como Bunderberg de Jong, H. G., Kruyt, H. R. Koazevation (Entmischung in Kolloidalen Systemen) , Koll. Zeitsch. 1930, 50(10), 39-48; Gander B, Blanco-Prieto MJ., Thomasin C, Wandrey Ch. and Hunkeler D., Coacervation/Phase Separation. En: Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, Vol. 1, Swarbrick J, Boylan J. C., Eds., Marcel Dekker, 2002, p.481-497; Newton D. W. Coacervation : Principies and Applications. En: Polymers for Controlled drug delivery. Tarcha P. J., Ed., CRC Press, Boca Ratón, 1991, 67-81; Scott P. W., Williams A. C., Barry B. W., Characterization of complex coacervates of Some Tricyclic Antidepressants and evaluation of their potential for Enhancing Transdermal Flux. J. Controlled Reléase 1996, 41 (3), 215-227; Thomasin C, Merkle H. P., Gander B. Drug microencapsulation by PLA/PLGA Coacervation in the Light of Thermodynamics . 2. Parameters determining Microsphere Formation. J. Pharm Sci . 1998, 87 (30), 269-275; Ball V., Winterhalter M. , Schwinte P., Lavalle Ph., Voegel J.-C, Schaal P. Complexation mechanism of Bovine Serum Albumin and Poly (allylamine hydrochloride) . J. Phys . Chem. B. 2002, 106, 2357-2364; Mohanty B., Bohidar H. B. Systematic of Alcohol-Induced Simple Coacervation in Aqueous Gelatin Solutions.

Biomacromolecules 2003, 4, 1080-1086, todas las cuales se incorporan en la presente para referencia en su totalidad. Preferentemente, el paso se hace por un proceso de infusión en linea.

El dimensionamiento de los liposomas y la formulación lipidica puede lograrse por diversos métodos, como extrusión, sonicación y técnicas de homogeneización las cuales son bien conocidas, y fácilmente practicadas por los expertos en la técnica. La extrusión consiste en pasar los liposomas, a presión, una o más veces a través de filtros que tengan tamaños de poro definidos. Los filtros generalmente se fabrican de policarbonato, pero los filtros pueden prepararse de cualquier material durable que no interaccione con los liposomas y que sea suficientemente fuerte para permitir la extrusión a presión suficiente. Los filtros preferidos incluyen filtros "continuos" porque estos generalmente pueden soportar las presiones superiores de los procesos de extrusión preferidos de la presente invención. También es posible utilizar filtros de "camino sinuoso". Las extrusión también puede utilizar filtros asimétricos, como los filtros Anopore™, los cuales incluyen extruir liposomas a través de un filtro poroso de óxido de aluminio tipo poro ramificado.

Los liposomas o formulaciones lipidicas también puede ser reducidas de tamaño por sonicación, la cual emplea energía sónica para romper o cortar los liposomas, los cuales se reformarán espontáneamente en liposomas más pequeños. La sonicación se realiza sumergiendo el tubo de vidrio que contiene la suspensión de liposomas en el epicentro sónico producido en un sonicador tipo baño. De otro modo, es posible utilizar un sonicador tipo sonda en el cual la energía sónica es generada por vibración de una sonda de titanio en contacto directo con la suspensión de liposomas. Aparatos de homogeneización y trituración, como el homogeneizador Giffor ood, Polytron™ o Microfluidizer, también pueden utilizarse para romper liposomas o formulaciones lipidicas más grandes en liposomas o formulaciones lipidicas más pequeñas .

Las formulaciones liposomales resultantes pueden separarse en poblaciones homogéneas utilizando los métodos bien conocidos en la técnica; como puede ser la filtración de flujo tangencial. En este procedimiento, una población de tamaño homogéneo de los liposomas o formulaciones lipidicas se pasa a través de filtros de flujo tangencial, dando como resultado con ello una población de liposomas con un límite de tamaño superior y/o inferior. Cuando se emplean dos filtros de diferente tamaño, es decir, teniendo diferentes diámetros de poro, liposomas más pequeños que el primer diámetro de poro pasan a través del filtro. Este filtrado puede ser objeto de filtración de flujo tangencial a través de un segundo filtro, teniendo un tamaño de poro más pequeño que el primer filtro. El retenido de este filtro es una población liposomal/acomplejada que tiene limites de tamaño superior e inferior definidos por los tamaños de poro del primero y segundo filtros, respectivamente.

Mayer et al., encontraron que los problemas asociados con el atrapamiento eficiente de los agentes bioactivos ionizables, lipofilicos como los agentes antineoplásicos , por ejemplo, antracilinas o alcaloides del vinca, pueden ser paliados empleando gradientes iónicos transmembranales . Además de inducir mayor captación, tales gradientes transmembranales también pueden actuar para aumentar la retención del fármaco en la formulación liposomal.

Las formulaciones medicinales lipidicas tienen un efecto sostenido y menor toxicidad permitiendo administración menos frecuente y un índice terapéutico mejorado. En estudios preclínicos en animales y en comparación con tobramicina inhalada (no liposomal o basada en lipidos) al nivel de dosis equivalente, la amikacina liposomal demostró tener, durante el periodo poco después de la administración durante 24 horas después, niveles de fármaco en el pulmón que abarcaron desde 2 hasta varios cientos de veces que el de tobramicina. Además, amikacina liposomal mantuvo estos niveles durante más de 24 horas. En un modelo animal diseñado para imitar la infección de pseudomonas observado en pacientes con FQ, amikacina liposomal demostró eliminar significativamente la infección en los pulmones de los animales cuando se comparó con aminoglucósidos libres.

El surfactante pulmonar permite la expansión y compresión de los pulmones durante la respiración. Esto se logra recubriendo el pulmón con una combinación de lipido y proteina. El lipido está presente como una monocapa con las cadenas hidrofóbicas dirigidas hacia fuera. El lipido representa 80% del surfactante pulmonar, la mayor parte de lipido siendo fosfatidilcolina, 50% del cual es dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC) (Veldhuizen et al., 1998). Las proteínas surfactantes (SP) que están presentes funcionan para mantener la estructura y facilitan la expansión y compresión del surfactante pulmonar como ocurre durante la respiración. De estos, SP-B y SP-C específicamente tienen comportamiento lítico y pueden lisar los liposomas (Hagwood et al., 1998; Johansson, 1998) . Este comportamiento lítico facilitaría la f agmentación gradual de los liposomas. Los liposomas también pueden ser ingeridos directamente por los macrofagos mediante la fagocitosis (Couveur et al., 1991; Gonzales-Roth et al., 1991; Swenson et al, 1991). La captación de los liposomas por los macrofagos alveolares es otro medio por el cual los fármacos pueden ser suministrados al lugar enfermo.

Los lípidos preferentemente utilizados para formar formulaciones liposomales o lipídicas para inhalación son comunes a los lípidos endógenos que se encuentran en el surfactante pulmonar. Los liposomas están compuestos de bicapas que atrapan el fármaco deseado. Estos pueden ser configurados como vesículas multilamelares de bicapas concéntricas con el fármaco atrapado dentro del lípido de las diferentes capas o el espacio acuoso entre las capas. La presente invención utiliza procesos únicos para crear formulaciones medicinales liposomales o lipídicas únicas. Los procesos y el producto de estos procesos son parte de la presente invención.

En una modalidad particularmente preferida, las formulaciones medicinales lipidicas de la presente invención se preparan por un método de infusión en linea donde una corriente de solución de lipidos se mezcla con una corriente de la solución del fármaco en linea. Por ejemplo, las dos soluciones pueden ser mezcladas en linea dentro de un tubo de mezclado precedido por un conector Y ó T. En esta forma, el método de infusión en linea crea las mejores condiciones para formar un coacervado medicinal. Este método de infusión da como resultado menores proporciones de lipido a fármaco y mayores eficiencias de la encapsulación.

En otra modalidad particularmente preferida, las formulaciones medicinales lipidicas de la presente invención se preparan mezclando con vórtice una solución de lipido-disolvente orgánico con una solución medicinal acuosa en un nivel de turbulencia adecuado. Otro método novedoso para preparar las formulaciones medicinales lipidicas de la presente invención consiste inicialmente en encapsular un polímero con carga por medio de la formación de un coacervado con el polímero con carga en presencia de un lipido. Se considera que esta técnica conducirá a bajas proporciones del lipido al polímero con carga en la misma forma que se obtienen bajas proporciones de lipido a fármaco. El fármaco se introduce en el interior de la formulación lipidica a través de intercambio iónico a través de la membrana lipidica entre el fármaco con carga y los contraiones del polímero con carga. Esta técnica, no incluida la formación de la coacervación, se conoce como "carga remota". Los ejemplos de la carga remota están descritos en las Patentes US Nos. 5,316,771 y 5,192,549, las cuales se incorporan en la presente para referencia en su totalidad.

El proceso antes descrito además puede ser mejorado optimizando los parámetros como la velocidad de flujo, temperatura, concentración del agente de activación y la adición salina después del paso de infusión. Los siguientes experimentos no representan necesariamente los métodos de la presente invención como se indica por las proporciones superiores de lipido a fármaco. Más bien representan una serie de experimentos para probar el efecto de los parámetros antes mencionados. Las múltiples variables dan una idea de la novedad detrás de utilizar las técnicas de coacervación para formar formulaciones medicinales a base de lípidos con bajas proporciones L/F. 7.1 Efecto de las velocidades de flujo Se variaron las velocidades de flujo individuales manteniendo la velocidad de flujo total a 800 mL/min. Para hacerlo asi se utilizaron dos bombas ajustadas a diferentes velocidades de bombeo. Las soluciones mixtas fueron infundidas durante 10 s a un vaso de precipitados que contenia solución de NaCl de modo que la concentración final de NaCl fue 1.5% y la concentración final de etanol no superó 30%. Después del mezclado una alícuota de 1 mL fue corrida a través de una columna de filtración en gel Sephadex G-75 para separar la amikacina libre de la encapsulada. Una fracción de 1 mL con la densidad más alta (determinada por turbidez visual) fue recolectada para análisis posterior. Los resultados se presentan en la Tabla 1. El incremento de la proporción de la velocidad de flujo lipido/amikacina dio como resultado una L/F casi constante hasta 300/500 mL/min. Con otro aumento de la tasa de lípidos, la L/F comenzó a aumentar y el tamaño de partícula también comenzó a hacerse más grande. Al mismo tiempo, mayores velocidades de flujo de lípidos dieron mejor recobro de amikacina (eficiencia de encapsulación) a medida que se adicionaba más masa de lípidos .

Tabla 1. Efecto de las velocidades de flujo sobre la encapsulacion de amikacina* *Las soluciones de lipidos y amikacina se mantuvieron a 40°C. La solución madre de amikacina fue 50 mg/mL. La solución de NaCl al 10% fue adicionada antes de la infusión para obtener 1.5% final. El tiempo de infusión fue establecido a 10 s. El tubo de mezclado 10 cm; mezclador en linea de 6 elementos colocado a 0 cm.

El lote 3 con las velocidades de flujo de lípidos/amikacina de 300-500 mL/min mostró la mejor L/F y tamaño de partícula, combinado con recobro de amikacina razonablemente elevado. Así pues, se decidió utilizar estas velocidades de flujo para todos los demás experimentos.

Para reproducir los resultados en las condiciones elegidas, un lote completamente lavado (lote 6) utilizando diafiltración se preparó como se presenta en la Tabla 2. La solución de NaCl al 10% fue adicionada al vaso de precipitados antes de la infusión para preparar la concentración final 2% (comparado con 1.5% en los lotes de la Tabla 1) . La proporción L/F resultante (1.71) no fue tan buena como en el lote 3 de la Tabla 1, y el tamaño de partícula fue mayor. Esto puede deberse a un efecto adverso de la alta concentración de NaCl en contacto con los liposomas en las primeras etapas de la formación de los liposomas. Las muestras separadas (lavadas) utilizando columnas de filtración en gel tienden a tener mejor L/F que las lavadas por diafiltración . Esto puede tener que ser con el diferente grado de experiencia de los liposomas en estrés, o simplemente muestras separadas en la columna de filtración en gel contenía una fracción de liposomas con mejor proporción L/F que no representa la población entera.

Tabla 2. Resumen de los lotes completamente lavados . Los parámetros del proceso que variaron fueron: temperaturas, concentración solución madre de amikacina y otros (ver la Tabla 3 siguiente) . Todos los lotes fueron concentrados a casi un grado máximo, hasta que la presión de entrada alcanzó 10 PSI .

*La tercera columna representa las temperaturas de las soluciones lipido y amikacina j usto antes de la infus ión, y la temperatura durante el lavado ( diaf iltración) . RT = temperatura ambiente . "Tamaño VOL" es el tamaño de partícula ponderado a volumen .

Tabla 3. Condiciones del procesamiento para los lotes 1-18* * Soluciones de lipido y amikacina fueron infundidas a velocidades de 300/500 mL/min durante 30 s (ejemplos 6-10) o 20 s (ejemplos 11-18) . Más solución acuosa (NaCl o agua) fue adicionada (como partes en relación con 500 partes de volumen de amikacina) . 7.2 Efectos de la temperatura del proceso Los parámetros fueron mantenidos igual que en el lote 3, con excepción de que la cantidad de solución de NaCl adicionada fue menos, haciendo la concentración final 1.0%. La solución fue adicionada otra vez antes de que la infusión fuera iniciada porque con el tiempo de infusión corto fue difícil hacer la adición durante la infusión. Asimismo, durante la infusión, el mezclador en línea se desplazó al final del tubo de mezclado bajo la presión del flujo. La posición del mezclado fue 5 cm a partir del extremo frontal del tubo en lugar de 0 cm para el lote 3. Esto puede ser importante, en vista de que la proporción L/F obtenida a la misma condición de temperatura 40/40°C en el lote 20 fue 0.55, casi la mitad que la del lote 3. Al comparar la encapsulación de amikacina a diferentes temperaturas de infusión, se puede observar que, sorprendentemente, menores temperaturas dieron mejor proporción L/F. De las temperaturas probadas, las temperaturas de lípido/amikacina 30/30°C y 50/RT dieron proporciones de L/F semejantes de 0.32 y 0.37. De nuevo, como en los lotes 1-5, los números de estas muestras lavadas por filtración en gel fueron bajos, tal vez menos que si los lotes hubieran sido lavados por diafiltración .

Tabla 4. Efecto de la temperatura sobre la encapsulación de amikacina* * Las soluciones de lípido y amikacina fueron infundidas a velocidades de 300/500 mL/min durante 10 s. La solución madre de amikacina fue 50 mg/mL. La solución de NaCl al 10% fue adicionada antes de la infusión para obtener una concentración final de 1.0%. El tubo de mezclado 10 cm, mezclador en línea de 6 elementos colocado a 5 cm.

En otros experimentos se encontró que el mezclado de etanol al 09% y agua a 30°C y 30°C ó 50°C y 22°C, respectivamente, dio como resultado una temperatura final semejante de casi 36°C. Esto sugiere que la temperatura de la mezcla final en lugar de la de los componentes individuales es importante para la encapsulación de amikacina. Las temperaturas 50°C/RT fueron utilizadas en los ejemplos 6-15. En los ejemplos 16-18 se utilizaron temperaturas de 30°C y 30°C para las dos corrientes, con resultados comparables, aunque se observó un poco menos encapsulación de amikacina. 7.3 Efecto de la adición posterior a la infusión del volumen acuoso Luego se centró la atención en los pasos de adición de la solución de NaCl y el proceso de lavado. Los parámetros del proceso se variaron en diferentes direcciones. Justo después del paso de infusión a velocidades de flujo de 300/500, la concentración de etanol en la mezcla alcanza 34%. A esta concentración la amikacina tiene solubilidad limitada (ver la Figura 9) .

Si se comienza con 50 mg/mL del stock de amikacina, entonces después del mezclado con la solución de lípidos habrá más de 30 mg/mL de amikacina total donde al menos la mitad (15 mg/mL) es amikacina libre, suponiendo eficiencia de encapsulación de 50%. Esto es mayor que el límite de solubilidad a 34% de etanol. Una solución posible a este problema es adicionar más agua al recipiente con la mezcla de lípido/amikacina, reduciendo así la concentración de etanol y amikacina. Por ejemplo, la adición de 200 partes de agua (ó solución de NaCl) a 800 partes de lípido/amikacina reduciría el etanol a 27% (Figura 9) . Esto hace la amikacina soluble a 15 mg/mL o incluso mayor dependiendo de la temperatura.

Además, la adición de NaCl puede estabilizar las condiciones osmóticas. Cuando se forman los liposomas y la amikacina se encapsula a una concentración interna de 200-300 mg/mL, solo hay ~15 mg/mL o más de amikacina no encapsulada. En ausencia de salina esto crearía un desequilibrio osmótico, el cual a su vez podría dar origen a una fuga de amikacina. La adición de 150 partes de NaCl al 10% a 800 partes de lípido/amikacina daría como resultado aproximadamente 1.5% de concentración final de NaCl (liposomas de afuera) .

Se produjeron algunos lotes donde diferentes cantidades de solución de NaCl (o agua en algunos lotes) fueron adicionadas a diferentes tiempos en relación con el suceso de infusión (ver la Tabla 5, recopilada de las Tablas 2 y 3) . A partir de la tabla se puede observar una tendencia general, dando origen a las siguientes conclusiones : Algún intervalo de tiempo entre la infusión y adición del volumen acuoso se requiere para obtener la proporción menor de L/F (si se utiliza un tubo mezclador corto) . De los lotes 6-15, aquellos con un intervalo de 20 s o mayor tuvieron L/F menor. Una explicación posible es que los liposomas no se forman completamente poco después del mezclado de las corrientes. Cuando se utiliza un tubo mezclador más largo (lotes 16-18) , lo cual permite un tiempo de mezclado más prolongado, no se requiere el intervalo de tiempo.

La adición de una solución de NaCl a alta concentración para desequilibrar la osmolalidad no ayuda realmente a retener la amikacina. De hecho, la adición de agua pura en un intervalo de tiempo apropiado dio como resultado la L/F y concentración total de amikacina más bajas.

La adición de 100 partes de NaCl al 10% (lote 9) 5 minutos después de la infusión dio una proporción L/F competitiva pero no dio una buena concentración total de amikacina. Puede ser que NaCl, cuando está presente en las primeras etapas con concentraciones de etanol relativamente altas, conduce a agregación y viscosidad aumentada.

Tabla 5. Función del volumen acuoso y concentración de NaCl adicionados a la mezcla lipido/amikacina para ajustar la concentración de etanol. No se muestran todas las variables; ver las Tablas 2 y 3. 7.4 Efecto de la solución madre anti-infecciosa Anteriormente se encontró que el uso de 50 mg/mL de solución madre (stock) de amikacina producía el mejor atrapamiento. La reducción de la concentración del stock de amikacina a 40 mg/mL aumentó la L/F cuando se utilizó en los procesos tradicionales. Con el proceso de infusión en línea con dos corrientes, la concentración de etanol alcanza mayores niveles, de modo que los 50 mg/mL de amikacina actual no puede ser la concentración óptima.

La Tabla 6 resume el efecto de utilizar diferentes concentraciones del stock de amikacina. 40 mg/mL proporcionaron valores L/F comparables o mejores, e incluso mejoraron el recobro de amikacina. El uso de menos amikacina en relación con una cantidad constante de lipido y proporcionando una L/F semejante, dio como resultado un mayor porcentaje de encapsulación (lote 12) . Otra disminución de la concentración del stock de amikacina a 30 mg/mL dio como resultado una L/F ligeramente aumentada, aunque el recobro todavía fue sorprendente (lote 13) .

Tabla 6. Concentración del stock de amikacina puede reducirse mejorando la eficiencia. El recobro de amikacina se calcula con base en la L/F obtenida y suponiendo 100% de recobro de lípidos.

La reducción de la concentración del stock de amikacina tiene otra consecuencia. Esta reduce la concentración de amikacina libre en una mezcla lipido/amikacina posterior a la infusión, permitiéndole permanecer soluble a mayor concentración de etanol. Suponiendo que el lipido y a mikacina se mezclan en una proporción 300/500, el stock de amikacina es 50 mg/mL y la eficiencia de la encapsulación es de 37%, entonces la amikacina libre inicial seria ~20 mg/mL. Del mismo modo, 40 mg/mL del stock de amikacina con 52% de encapsulación daría como resultado ~12 mg/mL de amikacina libre. 30 mg/mL del stock de amikacina con 46% de encapsulación daría como resultado ~10 mg/mL de amikacina libre. 8. Proporción de lipido a fármaco Existen varias formas para aumentar el atrapamiento del fármaco (por ejemplo aminoglucósidos como amikacina, tobramicina, gentamicina) en liposomas. Una manera es preparar liposomas muy grandes (>1 |im) donde sea grande el volumen atrapado por cantidad de lipido. Este método no es práctico para inhalación (nebulización) de los liposomas porque: 1) el esfuerzo de cizallamiento durante la nebulización tiende a romper los liposomas en una forma que depende del tamaño, donde liposomas más grandes (> 0.5 µp?) sufren mayor liberación, y 2) los tamaños más pequeños de las gotas necesarios para buena depositación en el pulmón son menores que ~3 µp?. De modo que para inhalación, es deseable mantener el tamaño de los liposomas tan pequeño como sea posible para evitar demasiada liberación. En la actualidad, el diámetro medio para los liposomas descritos en la presente es menor que aproximadamente 0.4 µp? (ver la Tabla 4).

Otro enfoque para disminuir la L/F es utilizar lipidos con carga negativa. Los aminoglucósidos enlistados antes tienen carga altamente positiva con 4 a 5 aminas por compuesto. En estas formulaciones terapéuticas normalmente se utilizan las sales sulfato de estos aminoglucósidos. Junto con el carácter multicatiónico viene la unión fuerte a los liposomas con carga negativa. Esto da como resultado mayor atrapamiento durante la formación del liposoma. El propósito de las formulaciones anti-infecciosas es proporcionar liberación sostenida al entorno del pulmón. El aclaramiento rápido de los liposomas por la captación de los macrofagos iría en contra de esto. Ha sido bien documentado que los liposomas con carga negativa experimentan un grado mucho mayor de captación por los macrofagos que los liposomas neutros. Por tanto, se desea utilizar liposomas neutros.

Un grupo de técnicas que permiten atrapamiento muy alto del fármaco en liposomas pequeños se basa en la carga en gradiente, donde se utiliza un gradiente de pH, un gradiente de sulfato de amonio o un gradiente de sulfato de Mg para cargar los fármacos amino en los liposomas: ver las Patentes US Nos.: 5,578,320, 5, 736, 155, 5, 837, 279, 5, 922, 350 (gradiente de pH) ; 5, 837, 282, 5, 785,987 (gradiente de sulfato de Mg) ; y 5,316,771 (gradiente de sulfato de amonio). Estas técnicas solo funcionan para aminas permeables en la membrana (monoaminas donde la forma neutra es permeable como doxorubicina y daunorubicina) . La carga en gradiente no funcionará para algunos anti-infecciosos como los aminoglucósidos, en vista de que estos son impermeables (demasiado grandes y carga demasiado alta) .

Todos los procesos que se describen en la presente pueden adaptarse fácilmente para la fabricación aséptica a gran escala. El tamaño final de los liposomas puede ajustarse modificando la composición de los lipidos, concentración, excipientes y parámetros del proceso.

La proporción lipido a fármaco que se obtiene por los procesos de la presente invención es aproximadamente 0.40 a 0.49:1. Además, se disminuye el porcentaje del fármaco libre presente después de que el producto se dializa durante un tiempo especifico. Cuando el fármaco es una macromolécula, como una proteina, la proporción L/F puede ser tan alta como aproximadamente 1.2, lo cual es bajo en comparación con la literatura (por ejemplo, ver la Patente US No. 6,843,942, donde la encapsulación de superóxido dismutasa humana recombinante (rh-SOD) en una formulación de DPPC-colesterol-estearilamina se preparó con una proporción L/F de ~5) . 9. Tasa de entrega del fármaco Para un tratamiento farmacéutico por inhalación es importante establecer una elevada tasa de entrega para obtener una dosis deseada en un tiempo de dosificación mínimo. Para una formulación liposomal, también es deseable llevar al máximo la retención del fármaco atrapado durante la nebulización. La velocidad de flujo de la nebulización es el volumen (o peso) de la solución acuosa que se pulveriza y vuela del nebulizador en una unidad de tiempo (por ejemplo, g/min, mL/min) . La tasa de entrega del fármaco es definida como la cantidad de fármaco que es suministrada por el nebulizador en una unidad de tiempo (por ejemplo mg/min) .

La eficacia de entrega del fármaco puede aumentarse haciendo mejoramientos en dos aspectos: 1) mejoramientos en el dispositivo de entrega del fármaco, y 2) aumentando la concentración del fármaco en la formulación medicinal. Cuando el dispositivo de entrega del fármaco es un nebulizador de chorro, factores importantes que afectan la tasa de entrega del fármaco incluyen: el modelo del nebulizador, es decir, la estructura del nebulizador, la cual determina la velocidad de flujo del aire que sale del dispositivo y el tamaño de gota del aerosol; y la presión de aire que se utiliza para impulsar la formulación medicinal. Para las formulaciones medicinales, la concentración del fármaco puede aumentarse disminuyendo la cantidad de agua. Al hacer esto, empero, la viscosidad y tensión superficial aumentan, lo cual tiene el efecto de disminuir la tasa de nebulización.

Para mejorar la tasa de entrega del fármaco para un determinado nebulizador de chorro, la concentración del fármaco debe aumentarse manteniendo al mismo tiempo la viscosidad y tensión superficial relativamente constantes. Cuando se hace esto, la tasa de entrega del fármaco aumenta, aunque la tasa de nebulización permanece igual de acuerdo con la fórmula: tasa de entrega de fármaco (mg/min) = concentración del fármaco (mg/mL) x tasa de nebulización (mL/min) .

La presente invención, en parte, se dirige a las formulaciones medicinales basadas en lipidos, de dosis alta, concentrada, que proporcionan máxima salida del aerosol con tamaños de partícula que abarcan dentro del intervalo óptimo de 1-5 µ?t? del diámetro aerodinámico mediano de la masa (MMAD) .

La Tabla 7 presenta los datos de la tasa de entrega y % de retención del fármaco para diferentes pruebas de nebulización. La nebulización se llevó a cabo por un nebulizador de chorro durante 20 minutos a una presión del compresor de 30 psi.

Tabla 7 . Composiciones y características de las tasas de entrega de amikacina liposomal mayores que 10 mg/min y retención de fármaco atrapado mayor que 45%.

Se puede observar que la relación L/F disminuye de os lotes A y B a las proporciones L/F de la presente invención obtenidas en los lotes I, J y K, la concentración del fármaco también aumenta. A una velocidad de flujo casi constante, un aumento en la concentración del fármaco da la tasa de entrega de fármaco más alta de ~19 a 22 mg/min. Estos resultados se grafican en la Figura 10. 10. Resultados 10.1 Barreras biopeliculares de infecciones pulmonares Un impedimento para tratar enfermedades infecciosas como Pseudomonas aeruginosa, la principal causa de enfermedad crónica en pacientes con FQ es la penetración del fármaco dentro del esputo/barrera biopelicular en las células epiteliales (Figura 1) . En la Figura 1, las formas de dona representan una formulación antiinfecciosa liposomal, el símbolo representa el antiinfeccioso libre, el símbolo "-" mucina, alginato y DNA, y el símbolo de barra sólida representa Pseudomonas aeruginosa. Esta barrera está compuesta de P. aeruginosa colonizada y planctónica incrustada en alginato o exopolisacáridos de bacterias, así como DNA de leucocitos dañados, y mucina de células epiteliales de pulmón, todas con una carga negativa neta (Costerton, et al., 1999) .

Esta carga negativa los une y evita la penetración de fármacos con carga positiva como los aminoglucósidos, haciéndolos biológicamente ineficaces ( endelman et al., 1985) . El atrapamiento de los anti-infecciosos dentro de las formulaciones liposomales o lipidicas protegería o parcialmente protegería los anti-infecciosos contra unión no específica al esputo/biopelícula, permitiendo que las formulaciones liposomales o lipidicas (con el aminoglucósido atrapado) penetren (Figura 1).

Se ha demostrado que amikacina tiene un elevado grado de resistencia a las enzimas bacterianas, proporcionando así un mayor porcentaje de aislados clínicos susceptibles que los encontrados en otros aminoglucósidos incluida tobramicina y gentamicina (Price et al., 1976). En particular, los aislados de P. aeruginosa son mucho más sensibles a amikacina que otros aminoglucósidos mostrando ninguna resistencia cruzada (Dámaso et al., 1976).

La liberación sostenida y efecto de depósito de las formulaciones liposomales de amikacina se observa claramente en la Figura 2. En este estudio, se dio a ratas tobramicina por administración intratraqueal e intravenosa. Las ratas también recibieron formulaciones liposomales de amikacina por vía intratraqueal a la misma dosis (4 mg/rata) . Los datos muestran que solo con la formulación liposomal de amikacina se obtiene una liberación sostenida y efecto de depósito. De hecho, 24 horas después de la dosificación, solo las formulaciones liposomales de amikacina muestran niveles significativos del fármaco en los pulmones de los animales, mientras que las formulaciones de tobramicina revelaron niveles insignificantes, debido principalmente, según se cree, a la absorción sistémica rápida. Este aumento mayor que un céntuplo del aminoglucósido en el pulmón para las formulaciones anti-infecciosas liposomales apoya la idea de una formulación anti-infecciosa liposomal de liberación sostenida que pueda ser tomada con mucho menos frecuencia que la formulación TOBI® actualmente aprobada (una solución de tobramicina para inhalación preparada por the Chiron Corporation, Ameryville, CA) .

Además, la presencia de un esputo/biopelícula impide la penetración de los aminoglucósidos libres debido a la unión de los anti-infecciosos a su superficie (Figura 1) . Por tanto, en pacientes con FQ son necesarias dosis mayores de 1,000 g de tobramicina/g de tejido pulmonar para mostrar un efecto terapéutico. Esto se soluciona con formulaciones liposomales de amikacina. Así pues, el nivel terapéutico del fármaco se mantiene durante un periodo más prolongado en las formulaciones liposomales de amikacina comparadas con tobramicina libre. Esta facilitación de la unión y penetración también puede ser un medio por el cual las formulaciones liposomales de amikacina podrían reducir significativamente la resistencia bacteriana que comúnmente se observa cuando están presentes antibacterianos in vivo a niveles por debajo de la concentración mínima inhibitoria. 10.2 Farmacocinética Se determinó la farmacocinética de amikacina en ratas luego de administración intratraqueal (IT) de tobramicina libre o formulaciones liposomales de amikacina. Estos datos fueron comparados con la distribución obtenida en los pulmones luego de una inyección en la vena de la cola de tobramicina libre. En todos los casos se administró una dosis de 4 mg/rata. Como se puede observar en la Figura 2, una depositación mucho más grande de aminoglucósido puede ser entregada por IT comparado con inyección. El efecto de depósito de la tecnología liposomal anti-infecciosa también se demuestra en que, en comparación con tobramicina administrada por IT ó IV, un aumento mayor que un céntuplo en el fármaco para las formulaciones liposomales de amikacina todavía permanece en los pulmones 24 horas después de la administración. Así pues, el nivel terapéutico del fármaco es mantiene durante un tiempo más prolongado en las formulaciones liposomales de amikacina en comparación con tobramicina libre.

La unión de los aminoglucósidos al esputo de pacientes FQ es un problema, particularmente si esta unió reduce la bioactividad del anti-infeccioso (Hunt et al., 1995) . Para determinar si las formulaciones liposomales de amikacina pueden conservar la actividad biológica durante un tiempo prolongado, ratas normales fueron administradas con formulaciones liposomales de amikacina por instilación intratraqueal . Esto fue seguido por su eliminación a las 2 ó 24 horas a través de un lavado bronquioalveolar (BAL) para determinar la actividad biológica. Las muestras fueron concentradas por ultrafiltración seguido por filtración (0.2 micrones) para eliminar microbios pulmonares contaminantes. Se determinó la concentración de amikacina empleando un instrumento TDX y se determinó la actividad biológica utilizando un ensayo de dilución en caldo Mueller Hinton (Pseudomonas aeruginosa) . En la Tabla 7 se muestran los resultados .

Tabla 7. Resultados que muestran que las formulaciones liposomales de amikacina conservan la actividad biológica durante un periodo de tiempo prolongado Como se muestra en la tabla anterior, la formulación liposomal filtrada, recuperada, de amikacina fue capaz de matar P. aeruginosa en el ensayo del caldo de Mueller Hinton incluso después de 24 horas con una MIC de 4. A las 2 horas se obtuvo una MIC de 2, lo cual es semejante a la obtenida para el stock de amikacina liposomal/acomplej ada, filtrada. Asi pues, la formulación liposomal de amikacina todavía fue activa después de 24 horas en el pulmón. A las 24 horas, la tobramicina libre a la misma dosis fue no detectable en un BAL. Esto indica que no solo la formulación anti-infecciosa liposomal es retenida en el pulmón, sino también está libremente disponible para penetrar un esputo/biopelícula con el tiempo. Estos datos combinados con los hechos como es evidente en las Figuras 2 y la Tabla 9 (más adelante) , que las formulaciones liposomales de amikacina liberan el anti-infeccioso libre con el tiempo manteniendo elevados niveles de anti-infeccioso en los pulmones. Sustenta el razonamiento que este sistema puede producir un efecto anti-infeccioso sostenido con el tiempo. Este efecto debe comprobar significación para reducir la biocarga de las Pseudomonas y el desarrollo de resistencia debido a los niveles del anti-infeccioso .

Como una demostración in vitro de la liberación lenta de la formulación liposomal de amikacina y su efecto anti-infeccioso sostenido, la¾ formulación fue incubada en esputo de pacientes con Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica (COPD) que contenia PAOl mucoid Pseudomonas. La formulación liposomal de amikacina también fue incubada en alginato que contenia PAOl mucoid Pseudomonas . En ambos casos se observó la aniquilación sostenida y mejorada de las Pseudomonas con el tiempo, como se muestra en la Tabla 8.

Las curvas de mortalidad clásicas no son aplicables para la tecnología de la formulación anti-infecciosa liposomal debido a que las formulaciones liposomales presentan una liberación lenta del anti-infeccioso con un efecto anti-infeccioso mejorado. La formulación liposomal protege la amikacina contra el esputo y/o alginato hasta su liberación. Con el tiempo se observa aniquilación completa, consistente con el modelo de efecto antiinfeccioso sostenido de liberación lenta sin interferencia ni inactivación del anti-infeccioso .

La eficacia de las formulaciones liposomales de amikacina fue estudiada utilizando un modelo para infección pulmonar crónica . (Cash et al., 1979) donde P. aeruginosa, incrustada en una matriz de perlas de agarosa, fue instilada en la tráquea de las ratas. Este modelo animal con Pseudomonas mucoid fue desarrollado para asemejar las infecciones por Pseudomonas observadas en pacientes con FQ. Algunas de las correlaciones clínicas con FQ incluyen: una patología pulmonar semejante; el desarrollo de trastornos del complejo inmune; y una conversión al fenotipo mucoide por cepas de P. aeruginosa (Cantin and Woods, 1999) . Los pulmones de rata fueron infectados con aproximadamente 107 UFC de Pseudomonas fenotipo mucoide (cepa PAOl) tomadas de un aislado de paciente con FQ, y posteriormente tratadas con: (a) aminoglucósido libre, (b) el vehículo lipídico solo como testigo sin fármaco, y (c) la formulación liposomal de amikacina. Además, las formulaciones fueron primero tamizadas sobre la capacidad para matar P. aeruginosa in vitro en placas Kirby-Bauer modificadas.

Algunas formulaciones liposomales de amikacina fueron analizadas con base en diferentes composiciones de lipidos o parámetros de fabricación, dando como resultado diferentes zonas de aniquilación en experimentos in vitro. Este experimento fue diseñado para determinar el aumento en la eficacia obtenido con formulaciones liposomales del aminoglucósido sobre el aminoglucósido libre. Se compararon las composiciones lipídicas testigo blanco, dos formulaciones liposomales de amikacina diferentes y amikacina libre y tobramicina libre a la misma concentración del aminoglucósido como las formulaciones liposomales anti-infecciosas . Además, también se dio una dosis 10 veces mayor de amikacina libre y una dosis 10 veces mayor de tobramicina libre. La dosificación fue IT diario durante siete días. Los resultados (Figura 3) indican que amikacina liposomal en las dos formulaciones (difiriendo en la composición lipídica) mostraron una reducción significativa en los niveles de UFC y fueron mejor para reducir las UFC que amikacina libre o tobramicina libre en dosificaciones 10 veces superior. En la Figura 3, Lip-An-14 es DPPC/Col/DOPC/DOPG (42:45:4:9) y 10 mg/mL de amikacina, Lip-An-15 es DDPC/col (1:1) también a 10 mg/mL. Todas las proporciones lipido-lipido y lipido-fármaco en la presente son peso a peso.

El siguiente experimento (Figura 4) fue diseñado para demostrar la liberación lenta y capacidades antiinfecciosas sostenidas de las formulaciones liposomales de amikacina. La dosificación fue cada día alterno durante 14 días, contrario a diario durante 7 días como en los experimentos anteriores. Los resultados indican que amikacina liposomal en las dos formulaciones (difiriendo en la composición lipidica) fue de 10 a 100 veces más potente (mayor capacidad para reducir los niveles de UFC) que amikacina libre o tobramicina libre. Una dosis diaria en humano de 600 mg de TOBI® (una solución para inhalación de tobramicina preparada por the Chiron Corporation, Ameryville, CA) , o aproximadamente 375 mg/m2, corresponde a una dosis diaria en rata de 9.4 mg. Asi pues, los datos pueden correlacionarse directamente a un mejoramiento de 10 a 100 veces en la eficacia en humanos. Debe señalarse que una reducción 2 log es la mejor que puede observarse en este modelo. Una reducción céntuple en P. aeruginosa en ensayos de esputo ha sido correlacionada con función pulmonar mejorada (Ramsey et al., 1993). La liberación sostenida de las formulaciones liposomales de amikacina indica que una dosis menor y/o dosificación menos frecuente puede emplearse para obtener una mayor reducción en el crecimiento bacteriano que el que se puede observar con el aminoglucósido libre.

La eficacia de la formulación liposomal de amikacina fue estudiada en un modelo para infección pulmonar crónica donde P. aeruginosa fue incrustada en una matriz de perlas de agarosa que fue instilada a través de la tráquea de ratas Sprague/Dawley . Tres días después, amikacina libre o amikacina liposomal fue dosificada diario (Figura 3) o en días alternos (Figura 4) a una dosis de 1 mg/rata ó 10 mg/rata del determinado aminoglucósido o 1 mg/rata de amikacina liposomal, así como con liposomas blanco (vehículo lipídico) como el testigo, con cinco ratas por grupo.

Los pulmones homogeneizados (congelados) de rata, luego de los 14 días del experimento, fueron analizados para el contenido y la actividad del aminoglucósido. Se hicieron ensayos clínico químicos utilizando un instrumento TDX mientras que el bioensayo fue realizado midiendo las zonas de inhibición sobre placas de agar incrustadas con Bacillus subtilis . Los resultados se muestran en la Tabla 9: Tabla 9. Resultados de los pulmones de rata tratados con la formulación liposomal de amikacina, infectados con P. aeruginosa Los pesos del fármaco son para el fármaco normalizado para la ausencia de cualquier forma salina.

Los resultados de la Tabla 10 indican que el aminoglucósido está presente y activo para las formulaciones anti-infecciosas liposomales, mientras que poco puede detectarse del aminoglucósido libre incluso en la dosis 10 veces mayor. Estos otros resultados establecen las características de la liberación sostenida de las formulaciones anti-infecciosas liposomales, y también confirman que el anti-infeccioso que permanece es todavía activo. De las formulaciones anteriores solo la tobramicina libre (0.1 microgramo/mL) presentó algún nivel detectable del aminoglucósido en los ríñones.

La liberación sostenida y el efecto de depósito de la formulación de amikacina liposomal además se demuestra en la Figura 5. Las ratas recibieron una infección pulmonar crónica donde P. aeruginosa fue incrustada en una matriz de perlas de agarosa que fue instilada a través de la tráquea, utilizando las mismas perlas que se emplearon en los estudios de eficacia. Luego las ratas recibieron tobramicina libre o amikacina liposomal (formulación Lip-An-14) a través de administración intratraqueal a la misma dosis (2 mg/rata) . Los datos, medidos en microgramo de anti-infeccioso por gramo de tejido pulmonar con el tiempo, muestran que el antiinfeccioso liposomal presenta una liberación sostenida y efecto de depósito mientras que la tobramicina libre reveló niveles insignificantes en los pulmones a las 24 horas, principalmente debido, según se cree, a la rápida absorción sistémica. Este aumento mayor que 100 veces del anti-infeccioso en el pulmón para las formulaciones de amikacina liposomal en una rata infectada apoya la idea de un anti-infeccioso liposomal de liberación sostenida que puede tomarse con mucho menos frecuencia que la formulación TOBI® actualmente aprobada (una solución de tobramicina para inhalación fabricada por Chiron Corporation, Ameryville, CA) .

La farmacocinética de amikacina fue determinada en ratas luego de administración intratraqueal (IT) de tobramicina libre o amikacina liposomal. Se administró una dosis de 2 mg/rata. El efecto de depósito de la tecnología del anti-infeccioso liposomal se demuestra en que, en comparación con tobramicina libre administrada IT, un aumento mayor que un céntuplo en el fármaco para amikacina liposomal todavía queda en los pulmones infectados 24 horas después de la administración. Así pues, se mantiene el nivel terapéutico del fármaco durante un tiempo más prolongado en las formulaciones liposomales en comparación con tobramicina libre.

La Figura 7 muestra tiempo de permanencia notable y acumulación de las cantidades eficaces del antiinfeccioso en los pulmones, un resultad que determina que es posible utilizar dosificaciones relativamente poco frecuentes. Cada dosis es 4 h por inhalación (en rata, 3 ratas por grupo, como en lo anterior) de formulaciones de amikacina liposomal nebulizada (DPPC/Col, 1:1) a una concentración de 15 mg/mL de amikacina. La dosificación fue en el día uno; el día uno, tres y cinco; o el día uno, dos, tres, cuatro y cinco. Las ratas que proporcionaron una barra de datos determinada fueron sacrificadas después de la dosificación respectiva de la barra de datos.

Anti-infecciosos similares pueden utilizarse para el tratamiento de infecciones intracelulares como ántrax pulmonar y tularemia. En ántrax pulmonar, las esporas de ántrax llegan a los alvéolos en un aerosol. Las esporas inhaladas son ingeridas por macrofagos pulmonares en los alvéolos y llevadas a los ganglios linfáticos traqueobronquiales regionales o los ganglios linfáticos del mediastino a través de los linfáticos (Pile et al., 1998; Gleiser et al., 1968). El macrofago es centra en la vía infecciosa y es el contribuyente principal de la autodestrucción del hospedero en ántrax sistémico (inhalación) . Además de sus atributos de liberación sostenida y orientación, la tecnología de la formulación de anti-infecciosos liposomales puede mejorar la captación celular y puede utilizar los macrofagos alveolares y las células epiteliales del pulmón en la orientación y entrega del fármaco. Se piensa que la posesión de estas características facilita el tratamiento de estas infecciones intracelulares, cuyas infecciones se presentan en los pulmones y son transportadas por los macrofagos. Más importante, estas características deben hacer al infeccioso más eficaz en que el anti-infeccioso liposomal debe ser fagocitado por las mismas células que contienen la enfermedad. El anti-infeccioso se liberaría intracelularmente en una forma orientada, atacando con ello la infección antes de que ésta se propague. El fármaco encapsulado puede estar en un farmacéutico ya aprobado como ciprofloxacino, tetraciclina, eritromicina o amikacina. Se han desarrollado formulaciones de ciprofloxacino liposomal.

En un estudio, este compuesto fue administrado a ratones y se comparó con ciprofoxacino libre administrado por vía intratraqueal y ciprofloxacino libre administrado por vía oral, los tres compuestos administrados a la misma dosis (Figura 6) . La dosis para cada ratón fue de 15 mg/kg, con tres ratones por grupo. El ciprofloxacino liposomal fue en DPPC/colesterol (9:1) a una concentración de 3 mg/mL de ciprofloxacino . La relación lípido a fármaco fue 12:5:1 en peso. En comparación con ciprofloxacino administrado por vía oral, el ciprofloxacino liposomal estuvo presente en los pulmones de los ratones en cantidades de dos órdenes de magnitud superior al ciprofloxacino libre.

Además, solo ciprofloxacino liposomal mostró niveles de fármaco en el pulmón después de 24 horas, mientras que el fármaco administrado por vía oral no pudo ser detectado en menos de 2 horas. Estos datos apoyan el uso de formulaciones de ciprofloxacino liposomal y otros anti-infecciosos como aminoglucósidos, tetraciclinas y macrólidos para el tratamiento y para la prevención profiláctica de enfermedades intracelulares utilizadas por bioterroristas . 10.3 Liberación del medicamento mediada por infección de P. aeruginosa La liberación del fármaco en una forma activa en las cercanías de las infecciones es un aspecto importante de la acción de la formulación medicinal liposomal de la presente invención. El potencial de tal liberación dirigida fue probado monitorizando la liberación del fármaco tras la incubación con esputo de un paciente FQ, la liberación en los pulmones de ratas pre-inoculadas con P. aeruginosa, así como la actividad contra cultivos de P. aeruginosa.

La liberación de amikacina por incubación directa de un cultivo de P. aeruginosa con una formulación de amikacina liposomal de la presente invención ya se discutió en lo anterior. Para investigar más este fenómeno, una formulación de amikacina liposomal fue incubada con una preparación de esputo de un paciente de fibrosis quistica con infección de P. aeruginosa . El esputo expectorado fue licuado con DNasa I bovina y alginato liasa durante 2 h a 37°C. Una formulación de amikacina liposomal o amikacina soluble (1 mg/mL de amikacina) se mezcló 1:1 con el esputo licuado o testigo y se incubó a 37°C con agitación suave. En alícuotas se analizó la concentración de amikacina mediante el analizador Abbott TDx. Los liposomas intactos fueron lisados en una alícuota diferente de cada muestra utilizando un detergente, 1% de Tritón X-100. Para el análisis se utilizaron los sobrenadantes de cada muestra. Durante el periodo de 48 horas, (80-90%) de amikacina fue liberada en una forma dependiente del tiempo de la composición lipídica bajo estas condiciones, indicando que la liberación del fármaco puede ocurrir en los lugares de la infección en el pulmón FQ.

La liberación del fármaco libre de los liposomas in vivo fue comparada en ratas que habían sido instiladas con perlas de agar que contenían P. aeruginosa (3.5xl04 ufe/rata) contra aquellas que no habían sido instiladas. Tres días después de la instilación de las perlas, las ratas inhalaron formulaciones de amikacina liposomal de la presente invención (aproximadamente 6 mg/kg dosis diaria) cada día (sin grupo de bacterias) o cada día alterno durante 14 días (grupo instilado con perlas) . 24 horas después del último tratamiento, la amikacina total y la amikacina libre fueron medidas como se describe antes. En ratas que habían recibido bacterias, un promedio de aproximadamente 50-70% de la amikacina detectada estaba en la forma libre, es decir, liberada de los liposomas. En las ratas que no habían recibido bacterias, aproximadamente 20-25% del fármaco estaba en forma libre. Estos datos sugieren que la liberación de amikacina libre a partir del liposoma puede ser mediada por la presencia de P. aeruginosa in vivo .

Una prueba in vitro de la liberación y actividad se hizo en condiciones semejantes a la farmacocinética en el pulmón, donde se ha demostrado anteriormente que el antibiótico libre se aclara en la escala de tiempo de algunas horas. Amikacina libre o una formulación de amikacina liposomal se incubó con P. aeruginosa PA 01 (~10 /mL) en cartuchos Slide-A-Lyzer de 0.5 mL en diferentes concentraciones del fármaco. Bajo estas condiciones, el fármaco libre se dializa del cartucho en la escala de tiempo de horas. Después de 24 horas, las muestras fueron retiradas de los cartuchos y sembrada para medir las ufe. En los experimentos preliminares, la amikacina libre solo redujo ligeramente la ufe de las muestras, mientras que se observó una reducción dos log de las ufe en las composiciones lipidicas que contenían amikacina a la misma concentración de amikacina (50 g/mL) . Estos datos sugieren que amikacina es en realidad liberada en una forma activa en presencia de bacterias y que la liberación lenta producida por la formulación hace más eficaz el uso del fármaco.

La interacción de las formulaciones de amikacina liposomal de la presente invención con P. aeruginosa o sus factores de virulencia conduce a la liberación de amikacina, posiblemente dirigiendo la liberación al lugar de la infección. Cuando la amikacina se libera, es activa contra P. aeruginosa, y la liberación lenta en las cercanías de las bacterias puede tener una ventaja sobre la distribución no específica y el aclaramiento rápido del fármaco libre inhalado. 10.4 Efecto de las formulaciones medicinales liposomales inhaladas sobre la función de los macrofagos alveolares Las formulaciones de amikacina liposomal de la presente invención están en una modalidad en una forma de amikacina encapsulada en liposomas en nanoescala (200-300 nm) que se formulan para tratar infecciones crónicas de P. aeruginosa en pacientes con fibrosis quistica. Esta se diseña para inhalación con liberación sostenida de amikacina en el pulmón. Debido a que se sabe que los macrofagos alveolares toman ávidamente las partículas de este intervalo de tamaño, el efecto de las formulaciones liposomales en estas células es particularmente interesante. Las funciones básales y estimuladas de los macrofagos alveolares de rata obtenidos por lavado fueron estudiadas con y sin administración de formulaciones de amikacina liposomal y se compararon con diferentes testigos .

Los aerosoles de las formulaciones de amikacina liposomal, amikacina, liposomas placebo y salina fueron producidos con un nebulizador PARI LC Star e inhalados por ratas hembra CD® IGS en una cámara de inhalación solo para la nariz. El tratamiento por inhalación se hizo durante 4 durante 14 días consecutivos, de modo que la dosis diaria estimada en el pulmón del lípido total fue aproximadamente 12 mg/kg para el grupo de amikacina liposomal, y de 11 mg/kg para el grupo de liposomas placebo. El 50% de las ratas fue sacrificado el día 15. Las ratas restantes fueron sacrificadas el día 43. El fluido del lavado bronquioalveolar (BALF) fue recolectado de cada rata y almacenado a -80°C para el ensayo posterior del óxido nítrico (como se representa por los nitratos totales) y el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a) . Las células del BAL fueron recolectadas por centrifugación, contadas . y cultivadas en medio con y sin lipopolisacárido (LPS) durante 24 h. Los sobrenadantes de estos cultivos fueron recolectados por filtración y ensayados para el óxido nítrico y el TNF-a. Se analizó la función fagocítica de los macrofagos del BAL (106/mL) midiendo la captación durante la noche de las microesferas fluorescentes opsonizadas (0.2 µp?, 2 (109) /mL) .

La inhalación de la formulación de amikacina liposomal, liposomas vacíos, amikacina soluble o salina durante 14 días consecutivos no produjo una respuesta inflamatoria aguda o retardada significativa en los pulmones de ratas, como es evidente por los niveles de óxido nítrico (nitratos) y el TNF-a en BALF, los cuales fueron insignificativamente diferentes de los testigos, aunque hubo una tendencia temprana a mayores niveles de NO en todos los grupos que recibieron inhalantes, incluidos los testigos. El recobro total de las células fue insignificativamente diferente en todos los grupos con una tendencia temprana hacia más leucocitos polimorfonucleares en todos los grupos que recibieron inhalantes. Los macrofagos alveolares de rata tuvieron funciones normales después de la exposición a los aerosoles de los artículos experimentales anteriores a pesar del hecho de que estos parecían más grandes en el día 15 en grupos que inhalaron liposomas. Las concentraciones de nitratos y TNF-a detectados tras el cultivo de los macrofagos alveolares en medio durante el día 15 ó 43 del estudio fueron insignificativamente diferentes de los testigos. Los macrofagos respondieron normalmente cuando se estimularon por LPS, produciendo concentraciones considerables de óxido nítrico (20-40 nmol/106 células) y TNF-a (5-20 ng/106 células) . Estos macrofagos también tuvieron funciones fagocíticas normales, como se muestra por la captación idéntica de las perlas fluorescentes en comparación con los testigos no tratados.

La inhalación de las formulaciones de amikacina liposomal durante los 14 días consecutivos no afectó considerablemente la función de los macrofagos alveolares en términos de fagocitosis de las perlas opsonizadas, la producción de mediadores inflamatorios TNF y NO. 11. Dosificación La dosificación de cualquiera de las composiciones de la presente invención variará dependiendo de los síntomas, edad y peso corporal del paciente, el tipo y gravedad del trastorno que se va a tratar o prevenir, la vía de administración y la forma de la composición. Cualquiera de las formulaciones puede ser administrada en una sola dosis o en dosis divididas. Las dosificaciones para las composiciones de la presente invención pueden determinarse fácilmente por las técnicas conocidas para el trabajador experto o como se enseña en la presente.

En ciertas modalidades, la dosificación de los compuestos generalmente será en el intervalo de aproximadamente 0.01 ng a aproximadamente 10 g por kg de peso corporal, específicamente en el intervalo de aproximadamente 1 ng a aproximadamente 0.1 g por kg, y más específicamente, en el intervalo de aproximadamente 100 ng a aproximadamente 50 mg por kg.

Para cualquier composición especifica de la presente invención puede ser necesario identificar una dosis o cantidad eficaz, y cualquier efecto posible en el tiempo de la administración de la formulación. Esto se puede lograr por experimentación de rutina como se describe en la presente, utilizando uno o más grupos de animales (preferentemente al menos 5 animales por grupo) , o en pruebas en humanos, si es apropiado. La eficacia de cualquier composición y método de tratamiento o prevención puede evaluarse administrando la composición y evaluando el efecto de la administración al medir uno o más índices pertinentes, y comparando los valores posteriores al tratamiento de estos índices con los valores de los mismos índices antes del tratamiento.

El tiempo de administración y cantidad precisas de cualquier composición específica que producirá el tratamiento más eficaz en un determinado paciente dependerá de la actividad, farmacocinética y biodisponibilidad de una composición, el estado fisiológico del paciente (incluido la edad, sexo, tipo y estadio de la enfermedad, estado físico general, respuesta a una dosis determinada y el tipo de medicación), la vía de administración y similares. Las pautas que se dan en la presente pueden utilizarse para optimizar el tratamiento, por ejemplo, para determinar el tiempo óptimo y/o la cantidad de administración, lo cual requerirá no más que experimentación de rutina consistente en la monitorización del individuo y el ajuste de la dosis y/o el tiempo.

Mientras el individuo esté siendo tratado, la salud del paciente puede ser monitorizada midiendo uno o más de los índices pertinentes en tiempos predeterminados durante el periodo de tratamiento. El tratamiento, incluida la composición, cantidades, tiempos de administración y formulación, pueden ser optimizados de acuerdo con los resultados de tal monitorización. El paciente puede ser periódicamente reevaluado para determinar el grado de mejoramiento midiendo los mismos parámetros. Con base en estas reevaluaciones es posible hacer ajustes a la cantidad o cantidades de la composición que se administre y posiblemente el tiempo de administración. El tratamiento puede iniciarse con dosis más pequeñas que sean menores que la dosis óptima del compuesto. Después, la dosis puede ser aumentada por incrementos pequeños hasta que se llegue al efecto terapéutico óptimo.

El uso de las composiciones presentes puede reducir la dosis requerida para cualquier agente individual contenido en las composiciones (por ejemplo, el antiinfeccioso) porque el inicio y duración del efecto de los diferentes agentes puede ser provechoso.

La toxicidad y eficacia terapéutica de las composiciones puede determinarse por procedimientos farmacéuticos normales en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar la LD50 y la ED50.

Los datos que se obtengan de los ensayos en cultivos celulares y estudios en animales pueden utilizarse para formular un intervalo de dosificación para uso en humanos. La dosis de cualquier composición se encuentra preferentemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluye la ED50 con poca o ninguna toxicidad. La dosis puede variar dentro de este intervalo, dependiendo de la forma de dosificación que se emplee y la vía de administración que se utilice. Para composiciones de la presente invención, la dosis terapéutica eficaz puede estimarse al principio a partir de ensayos en cultivos celulares. 12. Formulación Las formulaciones anti-infecciosas lipidicas de la presente invención pueden comprender una dispersión acuosa de liposomas. La formulación puede contener excipientes lipidos para formar los liposomas, y sales/soluciones amortiguadoras para proporcionar la osmolaridad apropiada y pH. La formulación puede contener un excipiente farmacéutico. El excipiente farmacéutico puede ser un liquido, diluyente, disolvente o material encapsulante, implicado en llevar o transportar alguna composición o componente de éste desde un órgano, o parte del cuerpo, a otro órgano, o parte del cuerpo. Cada excipiente debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con la composición presente y sus componentes y no lesionar al paciente. Los excipientes apropiados incluyen trealosa, rafinosa, manitol, sacarosa, leucina, trileucina y cloruro de calcio. Los ejemplos de otros excipientes apropiados incluyen: (1) azúcares, como lactosa y glucosa; (2) almidones como almidón de maíz y almidón de papa; (3) celulosa y sus derivados, como carboximetilcelulosa de sodio, etilcelulosa y acetato de celulosa; (4) tragacanto en polvo; (5) malta; (6) gelatina; (7) talco; (8) excipientes como manteca de cacao y ceras para supositorios; (9) aceites como aceite de cacahuate, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de ajonjolí, aceite de olivo, aceite de maíz y aceite de frijol de soya; (10) glicoles como propilen glicol; (11) polioles como glicerina, sorbitol, y polietilen glicol; (12) ásteres como oleato de etilo y laurato de etilo; (13) agar; (14) agentes amortiguadores como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; (15) ácido algínico; (16) agua libre de pirógenos; (17) salina isotónica; (18) solución de Ringer; (19) alcohol etílico; (20) soluciones amortiguadoras de fosfatos; y (21) otras sustancias compatibles no tóxicas que se emplean en las formulaciones farmacéuticas.

Ejempllficación Ejemplo 1 Proceso de infusión en linea Aproximadamente 20 mg/mL de lípido total (DPPC: colesterol = 2:1 en peso) en etanol y aproximadamente 75 mg/mL de sulfato de amikacina (aproximadamente 50 mg/mL de amikacina) en agua, se mezclaron entre sí en un recipiente del reactor por un método de infusión en línea de dos corrientes. Dos soluciones fueron alimentadas en el conector en forma de Y a una tasa de aproximadamente 1.0 L/min y aproximadamente 1.5 L/min, respectivamente. Durante la infusión de las dos corrientes, agua fue adicionada por separado hacia el recipiente del reactor a una velocidad de flujo semejante (aproximadamente 1.0 L/min) como la velocidad de flujo de la solución lipidica. La suspensión amikacina-lipido infundida en el recipiente del reactor se diluye instantáneamente por la alimentación continua de agua. Esta agua adicional ayuda a sellar la membrana diluyendo el etanol y también reduce la viscosidad de la suspensión, reduciendo en consecuencia la presión de entrada del cartucho de diafiltración. Después de la infusión, la suspensión se concentra reduciendo el volumen a la mitad utilizando diafiltración. La suspensión concentrada se lava por diafiltración durante un suministro nuevo de solución de NaCl al 3.0%. La suspensión lavada se concentra más por diafiltración hasta la concentración deseada de amikacina total. Los resultados se dan en la Tabla 10.

Tabla 10 *Temperatura ambiente (19~23°C) Ejemplo 2 Encapsulación de albúmina sérica de bovino (BSA por técnica de coacervación) La BSA es una proteína que tiene un punto isoeléctrico pl = 4.9. A pH por encima de este punto, puede considerarse como un coloide con carga negativa neta. Se ha mostrado que forma coacervados complejos con diferentes polielectrolitos, como puede ser poli (clorhidrato de alilamina) , que a su vez es afectado por la fuerza iónica del medio, pH y temperatura. Se encontró que la adición de no disolvente a albúmina (etanol) puede también inducir coacervación. Cuando la BSA se disuelve en agua a pH 7.0 y la concentración de etanol adicionado es mayor que ~45% en peso, las moléculas de BSA se agregan para formar gotas de fase coacervadas conduciendo así a un aumento fuerte en la dispersión de luz. La adición de NaCl (fuerza iónica creciente) da como resultado menos etanol necesario para inducir la coacervación. La reducción del pH tiene un efecto semejante (Figura 12) . Los iones divalentes (por ejemplo, Mg2+) tienen un efecto incluso más fuerte en la reducción de la concentración crítica de etanol necesaria para inducir la coacervación de BSA (Figura 13) . El efecto más evidente fue encontrado cuando el policatión de peso molecular bajo PEI fue adicionado a la solución de BSA (Figura 14). Asi pues, 0.05 mg/mL de PEI en términos molares es una concentración de ~60 µ?, lo cual representa solo aproximadamente una molécula de PEI por 3 moles de BSA.

Para encapsular BSA en liposomas se utiliza una solución acuosa de BSA en una concentración de 10 mg/mL en NaCl 20 mM, pH 5.5. Se prepara una solución lipidica por separado a una concentración de 10 mg/mL, y una proporción molar DPPC/DPPG/colesterol de 60:5:40 en etanol al 95%. Todas las soluciones fueron precalentadas a 30°C. La solución lipidica (0.4 mL) fue adicionada con pipeta a una solución 1 mL de BSA en un tubo de ensaye e inmediatamente mezclada con vórtice para garantizar el mezclado completo. 20 segundos después, 0.6 mL de una solución de sacarosa al 5% fue adicionada y se repitió el mezclado con vórtice. Para determinar la encapsulación de BSA, 0.8 mL de la suspensión liposomal resultante fue colocada en un gradiente de sacarosa 5-20% y se centrifugó 30 minutos a 30,000 RPM. Los liposomas con carga formaron un pelet más pesado que sacarosa al 20%. El pelet fue recolectado y cuantificado para los lípidos y BSA. Los lipidos fueron medidos por HPLC (Cromatografía líquida de alta resolución) en fase inversa y la BSA fue medida por fluorescencia (excitación 280 nm, emisión 320 nm) . Se encontró que el pelet contenía 1.6 mg de lípido y 1.3 mg de BSA, dando asi la proporción L/F de 1.2, la cual es menor que la normalmente observada para proteínas (por ejemplo, ver la Patente US No. 6, 843, 942 donde la encapsulación de superóxido dismutasa humana recombinante (rh-SOD) en la formulación de DPPC-colesterol-estearilamina fue preparada con una proporción L/F de Citas bibliográficas 1. Veldhuizen, R., Nag, K., Orgeig, S. and Possmayer, F., The Role of Lipids in Pulmonary Surfactant, Biochim. Biophys. Acta 1408:90-108 (1998).

Hagwood, S., Derrick, M. and Poulain, and Properties of Surfactant Protein Biophys. Acta 1408:150-160 (1998).

Johansson, J., Structure and Propert Surfactant ProteinC, Biochim. Biophys 1408:161-172 (1998) .

Ikegami, M. and Jobe, A.H., Surfactant Protein Metabolism in vivo, Biochim. Biophys. Acta 1408:218- 225 (1998) .

Couveur, P., Fattel, E. and Andremont, A. , Liposomes and Nanoparticles in the Treatment of Intracellular Bacterial Infections, Pharm. Res. 8:1079-1085 (1991) .

Gonzales-Rothi, R.J., Casace, J., Straub, L., and Schreier, H., Liposomes and Pulmonary Alveolar Macrophages: Functional and Morphologic Interactions, Exp. Lung Res. 17:685-705 (1991).

Swenson, CE., Pilkiewicz, F.G., and Cynamon, M.H., Liposomal Aminoglycosides and TLC-65 Aids Patient Care 290-296 (Dec, 1991) .

Costerton, J.W., Stewart, P. S., and Greenberg, E.P., Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections, Science 284: 1318-1322 (1999) .

Cash, H.A., Woods, D.E., McCulloug , W.G., Johanson, J.R., and Bass, J. A., A Rat Model of Chronic Respiratory Infection with Pseudomonas aeruginosa, American Review of Respiratory Disease 119:453-459 (1979) .

Cantin, A.M. and Woods, D.E. Aerosolized Prolastin Suppresses Bacterial Proliferation in a Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Lung Infection, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 160:1130-1135 (1999).

Ramsey, B.W., Dorkin, H.L., Eisenberg, J.D., Gibson, R.L., Harwood, I.R., Kravitz, R.M., Efficacy of Aerosolized Tobramycin in Patients with cystic Fibrosis. New England J. of Med. 328:1740-1746 (1993). 12. Mendelman, P.M., Smith, A.L., Levy, J., Weber, A., Ramsey, B., Davis, R.L., Aminoglycoside Penetration, Inactivation, and Efficacy in Cystic Fibrosis Sputum, American Review of Respiratory Disease 132:761-765 (1985).

Price, K.E., DeFuria, M.D., Pursiano, T. A. Amikacin, an aminoglycoside with marked activity against antibiotic-resistant clinical isolates. J Infect Dis 134 : S249261 (1976) .

Dámaso, D., Moreno-Lopez, M., Martinez-Beltran, J., Garcia-Iglesias, M.C. Susceptibility of current clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa and enteric gram-negative bacilli to Amikacin and other aminoglycoside antibiotics. J Infect Dis 134:S394-90 (1976). 15. Pile, J.C., Malone, J.D., Eitzen, E.M., Friedlander, A.M., Anthrax as a potential biological warfare agent. Arch. Intern. Med. 158:429-434 (1998). 16. Gleiser, C.A., Berdjis, C.C., Hartman, H.A., & Glouchenour, W.S., Pathology of experimental respiratory anthrax in Macaca mulatta. Brit. J. Exp. Path., 44:416-426 (1968) .

Incorporación para referencia Las publicaciones y referencias, que incluye pero no se limitan a las patentes y solicitudes de patentes, citadas en esta especificación se incorporan en la presente para referencia en su totalidad en la parte completa mencionada como si cada publicación individual o referencia fuera especifica o individualmente indicada como incorporada para referencia en la presente como siendo completamente indicado. Cualquier solicitud de patente a la cual esta solicitud reclama prioridad también se incorpora para referencia en la presente en la forma antes descrita para publicaciones y referencias.

Equivalentes Aunque esta invención ha sido descrita con énfasis en las modalidades preferidas, será evidente para los expertos en la técnica que variaciones en los dispositivos y métodos preferidos pueden utilizarse y que se pretende que la invención puede ser practicada de un modo distinto al que se describe específicamente en la presente. Por consiguiente, esta invención incluye todas las modificaciones comprendidas dentro del espíritu y alcance de la invención como se define por las reivindicaciones siguientes.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Un método para entregar una formulación medicinal a base de lipidos a una tasa de 10 a 25 mg/min de fármaco que consiste en nebulizar una formulación medicinal a base de lipidos con una proporción lipido a fármaco (L/F) de 0.40 a 0.49 utilizando una presión de compresor de 20 a 40 psi. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la retención del fármaco atrapado es mayor que 45%. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el lipido es una mezcla de un fosfolipido y un esterol. El método de la reivindicación 3, caracterizado porque el fosfolipido que es dipalmitoilfosfatidil colina (DPPC) y el esterol es colesterol. El método de la reivindicación 4, caracterizado porque la proporción DPPC : colesterol es 2:1 en peso. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el fármaco es un anti-infeccioso . El método de la reivindicación 6, caracterizado porque anti-infeccioso se selecciona de lo siguiente: un aminoglucósido, una tetraciclina, una sulfonamida, ácido p-aminobenzóico, una diaminopirimidina, una quinolona, una ß-lactama, una ß-lactama y un inhibidor de ß-lactamasa, cloranfenicol , un macrólido, penicilinas, cefalosporinas , corticosteroide, prostaglandina, linomicina, clindamicina, espectinomicina, polimixina B, colistina, vancomicina, bacitracina, isoniazid, rifampina, etambutol, etionamida, ácido aminosalicí lico, cicloserina, capreomicina, una sulfona, clofazimina, talidomida, un antimicótico polieno, flucitosina, imidazol, triazol, griseofulvina, terconazol, butoconazol ciclopirax, ciclopirox olamina, haloprogina, tolnaftato, naftifina, terbinafina o una combinación de éstos. El método de la reivindicación 7, caracterizado porque el anti-infeccioso es un aminoglucósido. El método de la reivindicación 8, caracterizado porque el aminoglucósido es amikacina. El método de la reivindicación 8, caracterizado porque el aminoglucósido es tobramicina. El método de la reivindicación 8, caracterizado porque el aminoglucósido es gentamicina. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la formulación a base de lipidos es un liposoma . Un método de tratamiento a un paciente para infección pulmonar, que consiste en administrar al paciente que necesite de éste una cantidad terapéutica eficaz de una formulación medicinal a base de lipidos que tenga una proporción L/F de 0.40 a 0.49, y en donde el fármaco es un anti-infeccioso . El método de la reivindicación 13, caracterizado porque el anti-infeccioso es un aminoglucósido. El método de la reivindicación 13, caracterizado porque el anti-infeccioso es amikacina. El método de la reivindicación 13, caracterizado porque el anti-infeccioso es tobramicina . El método de la reivindicación 13, caracterizado porque el anti-infeccioso es gentamicina. El método de la reivindicación 13, caracterizado porque la formulación a base de lipidos es un liposoma . El método de la reivindicación 13, caracterizado porque la infección pulmonar es una infección de pseudomonas, P. aeruginosa, P. paucimobilis, P. putida, P. fluorescens, y P. acidovorans, estafilocócicas , Staphylococcus aureus Meticilin resistentes (MRSA) , estreptocócicas, Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli, Klebsiella , Enterobacter, Serratia, Haemophilus, Yersinia pesos, Burkholderia pseudomallei , B. cepacia, B. gladioli , B. multivorans, B. vietnamienses, Mycobacterium tuberculosis, M. avium complex (MAC), M. avium, M. intracellular, M. kansasii , M. xenopi , M. marinum, M. ulcerans, M.fortuitum complex, M. fortuitum o M. chelonei . El método de la reivindicación 13, caracterizado porque la infección pulmonar es causada por fibrosis quistica . El método de la reivindicación 14, caracterizado porque la infección pulmonar es causada por fibrosis quistica . El método de la reivindicación 15, caracterizado porque la infección pulmonar es causada por fibrosis quistica . El método de la reivindicación 16, caracterizado porque la infección pulmonar es causada por fibrosis quistica . El método de la reivindicación 17, caracterizado porque la infección pulmonar es causada por fibrosis quistica . El método de la reivindicación 18, caracterizado porque la infección pulmonar es causada por fibrosis quistica .