JPH09502700A - リポソームの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 この発明は、有機相と水性相を、３：１未満の容量比で一緒にすることにより、リポソームを製造する方法を提供する。この方法は、予め選択された平均粒径を含むリポソームの単一モード母集団分布を得る条件下で行うことができる。この方法において得られる新規な中間生成物をも提供するものであり、この中間生成物は、それ自体、生物活性剤の局所搬送に用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】 リポソームの製造方法 本出願は、１９９３年４月２日出願の米国特許出願番号第０８／０４１，８７ ０号の一部継続出願である。 本発明は、従来の方法よりも溶剤が少なくてすむ、リポソームの製造方法に関 する。本発明の方法により作られた新規な中間生成物も記載されている。本発明 は、リポソームの目的とする平均粒径が予め選択されており、適当な混合速度、 不活性ガス流量及び反応温度を選択することにより、目的とする平均粒径の好ま しい分布が得られるような二相系で、リポソームを製造する方法に関するもので もある。 リポソームは、水と混合しない有機相と水性相を用いる二相混合法により製造 することができる。この方法では、両親媒性脂質又は脂質混合物を、エチルエー テル、塩化メチレン、フッ素化炭化水素、それらの混合物等の、水と混合しない 有機溶剤に溶解する。この溶液に、水又は溶解された塩若しくは緩衝液を含む水 などの水性相を加え、必要に応じて、リポソームの内部水性スペースと結合する 親水性薬剤（例えば、ゲンタマイシン）などの生物活性剤を添加する。リポソー ムの製造中に形成されるリン脂質二重層（bilayer）は、水性内部空間と外部水 性環境との間の障壁として働くので、種々の水溶性生物活性剤を内部水性空間内 に隔離することができる。リポソームの疎水性部分と結合することにより、親油 性薬剤（例えば、プロスタグランジン）は隔離されることもでき、この場合は、 親油性薬剤は有機相内に含まれることができる。 二相混合物は、有機溶剤を蒸発させながら水性相を有機相内で分散させること により、リポソームに変わる。溶剤を除去する適当な蒸発技術としては、混合物 上又は混合物中に不活性ガスを流すこと、混合物を加 熱すること、真空により混合物上の圧力を低下させることなどを挙げることがで きる。 いくつかの従来法では、脂質を溶解するのに用いられる溶剤の容量が、水性物 質を完全に乳化するのに十分な量だけ、水性容量を上回ることが多い。例えば、 米国特許第４，５２２，８０３号に示されているいくつかの実施例では、１容量 の水性相に対して、最小限３容量の有機溶剤が使用されている。形成工程におい て、このように比較的多量の溶剤を使用すると、リポソーム製造のコストを著し く増加させることになる。これは、溶剤のコストがかかること及び処理中溶剤を 除去するのに必要な時間が増えることによるものである。従って、もっと低濃度 の溶剤を用いるリポソームの製造法を工夫することは、有益であろう。 リポソームを製造する一つの方法では、代表的には混合装置を備えた反応器中 で、有機相と水性相を一緒にする(combined)。この一緒にした相を、加熱下に有 機溶剤を除去しながら混合する。これは、代表的には、不活性ガス（例えば、窒 素ガス）を混合物中に泡立てて通気すること、しばしばスパージング（sparging ）と呼ばれる方法、により行われる。 得られたリポソームは、通常は、比較的小さいリポソーム（例えば、１００〜 ２００ｎｍ）から非常に大きいリポソーム（例えば、５０００ｎｍより大）まで 、サイズが広く変化する。かくして、得られたリポソーム母集団の平均粒径も、 バッチによって広く変化し得る。従って、水と混合しない有機溶剤を用いて作ら れたリポソームは、広い範囲にわたって変化する粒径分布を有していることが多 く、多モード（multi-modal）、即ち、異なる粒径の２つ以上の別個の母集団を 有していることがあり得る。 いくつかの用途では、より狭い粒径範囲のリポソーム母集団を有することが望 ましい。特に、リポソームの有効割合が同様な粒径である単一モード（single-m odal）母集団分布を有していることが望ましい。 通常は、リポソームを指定サイズのフィルターに数回通して、異なるリポソー ム母集団を単一モード母集団分布にする。フィルターの孔径は、目的とする平均 粒径とほぼ等しい。濾過操作中、大きいリポソームのなかには、フィルターを通 過しながら粒径が小さくなるものがあり、ほぼ目的とする平均粒径を有する母集 団が増加することになるであろう。 しかし、目的とする狭い粒径分布を有するリポソームの母集団を得るには、フ ィルターに数回通すことが多い。このように、濾過操作に時間がかかり、リポソ ーム製造のコストを著しく増加させることになる。 従って、リポソーム製造後（post-production）多数回の濾過操作を行うこと なく、リポソーム母集団、特に単一モード母集団分布を有するリポソーム母集団 を得ることができる方法が提供できれば、当該技術分野における顕著な進歩とな るであろう。 平均粒径が選択されたリポソームを製造する方法で、予め選択された平均粒径 を含む単一モード母集団分布を生ずるように行われる方法が提供できれば、当該 技術分野におけるいっそうの進歩となるであろう。 リポソームが、６カ月よりも長い間、カプセル化された剤をカルシウムイオン のように小さい分子から隔離できることは望ましい。リポソームによる生物活性 剤の取込安定性は、相当の期間にわたって、生物活性剤がどのくらい漏れるかに よって測定される。例えば、中性ｐＨで、等張生理食塩水を含む緩衝液中に入れ た場合、生物活性剤（例えば、親水性又は親油性薬剤）を含むリポソームは、長 時間の貯蔵安定性を示さなければならない。 少なくとも、２つの要因が、長時間にわたるリポソームの外部環境からの閉鎖 スペース隔離能に著しく影響を及ぼすことがある。一つの要因は、脂質がそのま ま残っている間に、膜が細孔を生じるように、二重層組織を破壊する剤が、外部 環境に存在するということである。もう一つの要因は、脂質の自己酸化であり、 これによって、脂質の炭化水素鎖が、二重層を不安定にする過酸化物を形成する 。酸化速度、従って二重層の不安定化は、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ ）などの酸化防止剤をリポソーム製剤に添加することにより、低減されることが できる。 自己酸化の速度は、リポソームを製造するのに用いられる媒体のｐＨによって も影響を受ける。従来法における処理媒体のｐＨは、一般に、リポソームの水性 区画（aqueous compartment）内に隔離されている生物活性剤に最も適合した範 囲内にある。しかし、生物活性剤の中には、脂質に悪影響を与え、二重層を不安 定にするｐＨ範囲（例えば、４．４〜４．６）で、懸濁液中に典型的に存在する もの（例えば、ゲンタマイシン）もある。 従って、自己酸化速度を低下させ、それによって、長時間にわたりリポソーム 内の生物活性剤の高濃度を保持することにより、リポソームの安定性を向上させ るように、脂質二重層に適合したｐＨで処理を行うことは、リポソームの製造に おいて著しい進歩となるであろう。 発明の要旨 本発明は、一般に、従来法よりも少ない溶剤を用いるリポソームの製造法に関 する。この方法は、水性相を有機相内に完全に乳化させる必要が無いという発見 を前提とするものである。一緒にされた相は、完全に乳化する代わりに、濁った 懸濁液の形であることができ、その後、リポソームへと加工されるものである。 本発明による水性相に対する溶剤の 容量比は、広く言えば、一般に３：１よりも小さく、好ましくは、約０．２：１ から約１．０：１までである。一緒にされた相は、大部分の脂質について、脂質 物質に最も適合した範囲内、好ましくは５．５から７．５までの範囲内のｐＨ、 最も好ましくは約６．５のＰＨで処理されることができる。一緒にされた水性及 び有機相中の脂質の濃度は、好ましくは、少なくとも約１０ｍｇ／ｍｌである。 製造されるリポソームは、好ましくは、その水性区画のそれぞれに取り込まれ た溶質を含むマルチラメラ（multilamellar）リポソームであり、各水性区画の 溶質濃度は実質的に等しく、即ち、実質的に等しいラメラ間溶質分布を有するマ ルチラメラリポソームである。 一緒にされた相の処理中、粘稠なゲルの形をした中間生成物が作られてもよい 。このゲルは、脂質二重層を形成する過程に在る脂質物質からなる。この中間生 成物は、アミノグリコシド抗生物質、その類似物質又は誘導体などの種々の感染 症の治療及び／又は予防用生物活性剤を、局所投与するための賦形剤として、用 いることができる。 本発明の他の態様においては、この製造法は、予め選択された平均粒径を含む 単一モード母集団分布を有するリポソームを製造することに一般に用いられてい る。ここで用いられる“単一モード母集団分布”という用語は、大部分のリポソ ームが、平均粒径を含む粒径の連続した範囲内の粒径を有していることを意味す るものとする。“平均粒径”という用語は、母集団の各リポソームの直径の合計 を、リポソームの全数で除したものを意味するものとする。 製造方法が始まる前に、平均粒径を選ぶことができ、この平均粒径を含むリポ ソーム母集団を製造するように、方法を構成することができる。このように、本 発明のこの態様によれば、このリポソーム製造方法によ り、予め選択された平均粒径を含むリポソームの単一モード母集団分布が得られ る。この方法は、この種のリポソーム製造法（scheme）でしばしば要求される製 造後のサイジング操作の必要性を大きく低減させることができるか、あるいは完 全に排除することができる。 本発明のこの態様に先立って、上記リポソームの製造法における多くの変数の うちの３つのものが、この方法により製造されるリポソームの粒径分布を決定す るのに高度に影響を及ぼすという発見が為された。これらの３つの主変数とは、 １）混合装置の相対速度、２）有機相と水性相の混合物から溶剤を除去するため の不活性ガスの流量（即ち、スパージ（sparge）速度）、及び３）混合温度（即 ち、反応温度）である。本発明者らは、これらの変数を適当に選択することによ り、予め選択された平均粒径を含む単一モード母集団分布を有するリポソーム母 集団を得ることができるような関係が、これら３つの変数の間にあることを把握 した。リポソームの粒径分布は、一般に、これらの３つの主変数により、次のよ うに影響を受ける。混合速度又は反応温度が高くなるにつれて、リポソームの径 は、一般に小さくなるであろう。逆に、スパージ速度が高くなるにつれて、リポ ソームの径は、一般に大きくなるであろう。従って、最も広い態様における本発 明のリポソーム製造法は、目的とする平均リポソーム径を選択し、水と混合しな い溶剤中の両親媒性脂質からなる有機相を、生物活性剤を含んでいてもよい水性 相と合わせ、リポソームの目的とする平均粒径に応じて予め選択された混合速度 、スパージ速度及び反応温度で、合わされた相を混合することからなる。特定の 実施態様では、成分の水性相に対する溶剤の容量比が、３：１よりも小さく、こ の方法は、脂質物質に最も適合した範囲内、代表的には５．５から７．５までの 範囲内のｐＨで行われる。 本発明の方法は、製造されたリポソームに生物活性剤を結合させることを含む ことができる。生物活性剤（例えば、親油性及び／又は親水性薬剤）が、リポソ ームの製造中か、あるいはリポソームが形成された後に、リポソームに装填され ることは、当業者により理解されるところであろう。生物活性剤は、好ましくは アミノグリコシド抗生物質であり、その類似物質、混合物及び誘導体を含むもの である。アミノグリコシドは、好ましくはゲンタマイシン、ストレプトマイシン 、ジヒドロストレプトマイシン、トブラマイシン、ネオマイシン、パロマイシン 、リボスタマイシン、リビドマイシン、カナマイシン、バイオマイシン、シソマ イシン、ネチルマイシン及びアミカシンからなる群から選ばれる。より好ましく は、アミノグリコシドはゲンタマイシンである。 一緒にされた有機溶剤と水性相は、反応容器内にて、リポソームを製造するの に十分な混合速度、不活性ガス流量及び反応温度を含む処理条件下で処理される 。予め選択された混合速度、スパージ速度及び反応温度は、下記の式に従って選 ぶことができる。 ｙ＝Ｂ₀＋Ｂ₁Ｘ₁＋Ｂ₂Ｘ₂＋Ｂ₃Ｘ₃＋Ｂ₁₂Ｘ₁Ｘ₂＋Ｂ₁₃Ｘ₁Ｘ₃＋Ｂ₂₃Ｘ₂Ｘ₃＋ Ｂ₁₁Ｘ² ₁＋Ｂ₂₂Ｘ² ₂＋Ｂ₃₃Ｘ² ₃ （１） ここで、 ｙ＝目的とする平均粒径 Ｘ₁＝混合速度 Ｘ₂＝不活性ガス流量 Ｘ₃＝反応温度 Ｂ₀＝定数 Ｂ₁、Ｂ₂、Ｂ₃、Ｂ₁₂、Ｂ₁₃、Ｂ₂₃、Ｂ₁₁、Ｂ₂₂及びＢ₃₃は、表１による回帰 係数を示す。 好ましくは、不活性ガス流量は、約０．４リットル／分から約１．２リットル ／分、反応温度は、約２０℃から約８０℃、混合速度は、約２０００ｒｐｍまで の範囲内である。本方法は、目的とするリポソームの平均粒径を選択すること、 式（１）による処理条件の関係に基づく各処理条件についての値を選択すること 、工程（ｂ）で選択された値に基づく式（１）から計算平均粒径を求めること、 計算平均粒径と目的とする平均粒径を比較すること、これらが十分に近似してい れば、水性相と有機相を合わせること、及び工程（ｂ）で選択された処理条件下 で、一緒にされた水性相と有機相を処理することからなることもできる。計算平 均粒径と目的とする平均粒径とが十分に近似していない場合は、式（１）で規定 される処理条件の少なくとも一つを、残りの条件を一定に保ちながら、十分に近 似した新しい計算平均粒径が得られるまで変更すること により、新しい計算平均粒径を得ることができる。混合速度と反応温度を一定水 準に保ちながら、不活性ガス流量を変更するのが好ましい。しかし、計算平均粒 径と目的とする平均粒径とが依然として十分に近似していない場合は、反応温度 を一定に保ちながら、不活性ガス流量と混合速度との両方を変更するのが好まし い。好ましくは、水性相に対する有機相の比（容量／容量）は、約０．２：１か ら約１．０：１であり、合わされた水性相と有機相のｐＨは、約５．５から約７ ．５である。 これらの処理条件下で製造されるリポソームは、その水性区画のそれぞれに取 り込まれた溶質を含むマルチラメラリポソームであり、各水性区画の溶質濃度は 実質的に等しいものであることが好ましい。生物活性剤、最も好ましくはアミノ グリコシド抗生物質ゲンタマイシン、をリポソームに結合させることができる。 本発明は、ここで提供される方法により製造されるリポソームを提供するもので もある。 反応容器内での処理において、一緒にされた水性相及び有機相が粘稠ゲルを形 成した時点で、処理を終了することができる。生物活性剤、好ましくはアミノグ リコシド抗生物質、最も好ましくはゲンタマイシンを、ゲルの形成前、形成中あ るいは形成後に、このゲルと結合させることができる。このような方法で作られ たゲルも、ここで提供され、抗感染有効量の抗生物質を含むゲルを用いて、温血 動物、好ましくはヒトに局所的に適用して、動物の感染を治療又は予防すること ができる。抗生物質は、好ましくはゲンタマイシンである。 生物活性剤と、安定性を高めるｐＨを有する水溶液を含む区画及び脂質を含む 脂質二重層とを含有する貯蔵安定性リポソームが、ここで更に提供され、この脂 質は、実質的に純粋な脂質である。リポソームは、マルチラメラリポソームであ ることが好ましく、このマルチラメラリポソ ームは、その水性区画内に取り込まれた溶質を含んでいることが好ましく、各水 性区画内の溶質の濃度は、実質的に等しい。現在、好ましい生物活性剤は、アミ ノグリコシド抗生物質であり、ゲンタマイシン、アミカシン、ストレプトマイシ ン、ジヒドロストレプトマイシン、トブラマイシン、ネオマイシン、カナマイシ ン、リビドマイシン、パロマイシン、リボスタマイシン、バイオマイシン、シソ マイシン及びネチルマイシンからなる群から選ばれることができる。より好まし くは、アミノグリコシド抗生物質は、ゲンタマイシン、アミカシン又はトブラマ イシンである。現在の所、アミノグリコシド抗生物質は、ゲンタマイシンである ことが最も好ましい。 実質的に純粋な脂質は、純度が少なくとも約８５％であることが好ましく、更 に好ましくは、純度が少なくとも約９０％であり、最も好ましくは、純度が約９ ５％以上である。典型的なものでは、実質的に純粋な脂質は、実質的にリソリピ ド（lysolipid）を含んでいない。リソリピドは脂質の約５％未満であることが 好ましく、脂質の約２％未満であることが更に好ましい。実質的に純粋な脂質は 、リン脂質を含んでいることが好ましく、そのリン脂質は、卵ホスファチジルコ リン（ＥＰＣ）であることが好ましい。本発明の貯蔵安定性リポソームにおける 脂質に対する生物活性剤の比（ｗ／ｗ）は、代表的には少なくとも約１：２０で あり、約１：５〜約１：１５であることが望ましく、約１：１０であることが更 に望ましい。 代表的には、貯蔵安定性リポソームにおける水溶液は、生理的食塩水である。 水溶液の安定性を高めるｐＨは、約５．５〜約７．５であることが望ましい。現 在の所、安定性を高めるｐＨは、約６．５であることが更に望ましい。 従って、本発明の好ましい態様においては、貯蔵安定性リポソームは、アミノ グリコシド抗生物質、実質的に純粋な卵ホスファチジルコリン及びｐＨが約６． ５の生理的食塩水溶液からなり、リポソームが、その水性区画に取り込まれた溶 質を含むマルチラメラリポソームであり、マルチラメラリポソームの各区画内の 溶質の濃度が実質的に等しく、卵ホスファチジルコリンは、純度が少なくとも約 ８５％であり、実質的にリソリピドを含まず、ＥＰＣに対するゲンタマイシンの 比（ｗ／ｗ）は、約１：１５〜約１：５である。アミノグリコシド抗生物質は、 ゲンタマイシン、アミカシン又はトブラマイシンであることが好ましい。更に好 ましくは、アミノグリコシド抗生物質は、ゲンタマイシンである。 図面の簡単な説明 図１ リポソーム形成用容器の斜視図 図２ 図１の容器で用いるインペラーの平面図 図３ 粘稠ゲル中間生成物の電子顕微鏡写真 図４ リポソーム母集団の単一モード径分布 図５ リポソーム母集団の単一モード径分布 図６ リポソーム母集団の単一モード径分布 図７ 全ゲンタマイシン血漿濃度を示す。白ぬき四角：ｐＨを調整（ｐＨ約６． ５）；黒四角：低ｐＨ製剤投与 図８ 遊離ゲンタマイシン血漿濃度 図９ 全及び遊離ゲンタマイシン血漿濃度 図１０ ｐＨ調整対低ｐＨ製剤のＡＵＣ比（遊離／全） 図１１ ゲンタマイシンの累積尿排泄 図１２ 中間の時間に対するゲンタマイシン尿排泄速度 図１３ 試験管内ゲンタマイシン漏洩試験 発明の詳細な説明 本発明によれば、従来法よりも少ない溶剤、有利なｐＨ条件を用い、予め選択 された平均粒径に基づいてマルチラメラリポソームが形成される。本発明の方法 は、約３：１よりも小さい水性相に対する有機相の比（容量／容量）で、好まし くは約１：１よりも小さい容量比で、二相性混合物を形成するように、有機相と 水性相とを一緒にすることを含む。有機溶剤の除去を容易にするためには、最少 量の有機溶剤を用いるのが望ましい。しかし、適当な薬剤取込を達成するために は、約０．１３：１の最小容量比が必要であり、０．２０：１の最小比が好まし いことが見出された。一般には、目的とするリポソーム生成物を製造することが できる最少量の有機溶剤が用いられる。前述の方法よりも少ない溶剤を用いる結 果、使用される不活性ガスの全体量及びスパージング操作の時間の長さが低減さ れるであろう。 次いで、リポソームを製造するのに十分な条件下で、二相性混合物を処理する 。水溶液のｐＨは、リポソームを調製するために用いられる一つ又はそれ以上の 脂質に適合したｐＨに調節されることができる。ここでいう“適合”とは、溶液 をリポソームに取り込み、リポソームを長時間貯蔵した場合、脂質酸化が最少に なる水溶液ｐＨを意味するのに用いられる。水性相のｐＨは、代表的には約５． ５から約７．５までであり、約６．５であることが好ましい。それぞれ、水酸化 ナトリウムや塩酸のような塩基や酸を初めとするｐＨ調整剤を適当量加えること により、水性相のｐＨを目的とする範囲内に保持することができる。 マルチラメラリポソームは、その水性区画のそれぞれに取り込まれた溶質を含 み、各水性区画の溶質濃度が実質的に等しいものであること、即ちマルチラメラ リポソームが実質的に等しいラメラ間溶質分布を有し ているものであることが好ましい。このようなリポソームの製造には、有機相内 で水性相が完全に分散している必要がないことが見出されている。これらのリポ ソームは、“通常の”マルチラメラリポソーム、即ち実質的に等しいラメラ間溶 質分布を有していないリポソームよりも、水性区画間の浸透ストレスが低いため 、一般に、より安定である。 本発明で用いられる脂質物質は、その特性が両親媒性である。親水特性は、ホ スファト、カルボキシル、スルファト、アミノ、スルフヒドリル、ニトロ及び他 の同様な基を介して、分子に付与される。疎水性は、好ましくは長鎖飽和、不飽 和脂肪族炭化水素基であるが、一つ又はそれ以上の芳香族、脂環族又は複素環で 置換されたそのような基であることもできる基を含むことによって、与えられる 。好ましい両親媒性化合物としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエ タノールアミン、リソホスファチジルコリン、リソホスファチジルエタノールア ミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸 、ホスファチジルグリセロールなどのホスホグリセリドがある。ジミリストイル ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイル ホスファチジルコリンなどの合成飽和化合物、ジオレオイルホスファチジルコリ ン、ジリノレオイルホスファチジルコリンなどの不飽和化合物を用いることがで きる。例えば、糖脂質及びグリコスフィンゴリピドを用いることもできる。 リポソームを形成するには、種々のコレステロール、その他のステロール及び それらの水溶性誘導体を用いることができる（例えば、ここに、共に参照のため に記載した米国特許第４，８９１，２０８号及び５，１００，５６９号参照）。 このグループの好ましいものは、米国特許第４，８９１，２０８号で論じられて いるように、コレステロールヘミスクシ ネートである。米国特許第５，０４１，２７８号で論じられているように、リポ ソームを形成するのに、トコフェロールヘミスクシネートのようなある種の水溶 性トコフェロール誘導体を用いることができる。 “水性相”は、懸濁液又はその他の混合形態の他の成分と共に、水溶性成分を 溶液で含んでもよい、水をベースにした混合物である。“有機相”は、懸濁液又 はその他の混合形態の他の成分と共に、親油性生物活性剤などの溶剤可溶性の成 分を含んでもよい、水と混合しない有機溶剤の混合物である。一般に、リポソー ムを形成するのに用いられる脂質は、有機相に溶解される。 脂質を溶解するのに用いられる溶剤は、一般に水と混合しない。このような溶 剤としては、塩化メチレン、クロロホルム、ジエチルエーテル、フルオロカーボ ン、クロロフルオロカーボンなどを挙げることができるが、これらに限定される ものではない。 一緒にされた有機相と水性相に含まれる脂質の量は、広い範囲にわたって異な ってもよいが、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌであることが好ましく、少なくとも１ ５ｍｇ／ｍｌであることが更に好ましい。使用される脂質物質が多ければ多いほ ど、水性相を取り込む脂質の有効性が高くなる。一緒にされた有機／水性相中の 脂質の量は、一緒にされた相が粘稠ゲル中間生成物を形成するかどうかを決定す るのにも重要である。 リポソーム形成処理を行う前に、代表的には、どういう剤をリポソーム内に導 入しようとしているか、あるいはリポソームの最終用途に応じて、目的とする平 均粒径を選択する。例えば、ゲンタマイシンをリポソーム内に導入する場合は、 代表的な平均粒径は約２００ｎｍである。リポソーム又は粘稠ゲル中間生成物を 形成するのに必要な成分は、次のようにして組み合わされる。両親媒性脂質又は 脂質の混合物を、水と混合 しない有機溶剤に溶解して、有機相を形成する。目的とする平均粒径を選択した 後、有機相を水性相に添加する。次いで、代表的には反応容器内、例えば図１に 示した種類の反応容器内で、混合物を処理する。図１は、本発明により有機相と 水性相を混合する処理空間６を改定する容器４を含む処理系２を示す。この容器 には、混合系８、スパージ系１０及び加熱／冷却系１２が設けられている。 容器４は、リポソームを形成するのに必要な水性相と有機相を合わせ、成分を リポソーム又は粘稠ゲル中間生成物にする実際の処理が行われる処理空間６を設 定する。この容器は、水性相及び有機相を容易に吸着せず、容易に掃除、殺菌で きる材質で作られていなければならない。適当な材質としては、ガラス及びステ ンレススチールを挙げることができる。 容器４には、容器４の縁１６と密封係合して置かれるように用いられるカバー １４が設けられている。このカバーは、容器４に対するカバー１４の着脱を容易 にするために、向かい合ったハンドル１８を有している。 また、カバー１４には、容器４内に混合系８及びスパージ系１０を吊り下げる ための開口１９及び２０がそれぞれ設けられている。サーモウエル（thermowell ）５０のような熱測定装置を吊り下げて、処理空間６内の反応温度を監視するた めに、他の開口２２が設けられる。 混合系８は、カバー１４の開口１９から処理空間６内に吊り下げられたシャフ ト２４を有している。このシャフト２４は、モーター（図示せず）と作動的に連 結されている。このモーターは、シャフトが本発明による目的とする速度で回転 するように、十分な力をシャフトに与えることができる。 シャフト２４の底部には、混合インペラー２６が作動的に結合されて いる。このインペラーは、シャフトによって回転させられ、それにより、目的と するリポソームを形成するのに必要な程度に、水性相と有機相とを混合する。混 合インペラー２６は、図１及び２に示した特定の形状の他に、異なる形のブレー ド、異なるブレード数のように種々の形状をとることができる。インペラー２６ は、水性相と有機相との完全な混合を確実にするように、容器４の内容物に対し て軸方向又は半径方向の流れを生成するのが好ましい。本発明では、その他の混 合装置、例えば、容器壁にもっと近接して延在するブレードを有するアンカーミ キサーなどを用いてもよい。 図２によく示されているように、インペラー２６は、シャフト２４を受容する ための開口３２を有するハブ３０に取り付けられた１対又はそれ以上の対の向か い合ったブレード２８ａ〜２８ｄを有している。インペラー２６は、止めネジ（ 図示せず）などのような通常の手段によりシャフト２４に固着されており、それ により回転することができる。 図２に具体的に示されているインペラーは、２対のブレード２８ａ、２８ｂと ２８ｃ、２８ｄを有している。一つ又はそれ以上のブレード２８を、シャフト２ ４の長さ方向の軸と平行に位置させてもよく、あるいは、ある角度で傾斜させて もよい。図２の実施態様に示すように、各ブレード２８は、特に粘稠ゲル形成（ 即ち、前リポソーム段階）中、ブレードが容器４内の内容物を通過するのを容易 にし、容器内容物の軸方向の流れを生ぜしめる（図１の矢印で示すように）４５ 度の角度で傾斜している。 ブレード２８ａ〜２８ｄは、必要であれば、もっと鋭角（即ち、シャフト２４ の軸に対して測定して４５度よりも小さい角度）に設置されてもよい。角度が鋭 角になればなるほど、インペラー２６に対する容器内 容物の抵抗は大きくなる。この抵抗は、シャフト２４のトルクを高めることによ り、例えば、もっと大きい力を出すことができるモーターを用いることにより、 容易に克服される。更に、角度を変えると、インペラーによって生ずる流れを、 軸方向の流れ（４５度）から半径方向の流れ（シャフトに平行）に変えることが できるようになる。インペラー２６は、シャフト２４に固定されているので、シ ャフト２４の回転により、１分間当たり同じ回転速度でインペラーブレード２８ が回転することになる。 図１に示すスパージ系１０は、一端が不活性ガス源（窒素ガス、アルゴンガス 等、図示せず）に連結されたチューブ３４を有している。このチューブ３４は、 処理空間６の底部に向かって下方に延びる中央部３６を有している。このチュー ブのテール部３８は、中央部３６に対して直角に、処理空間６の底部中央に向か って延びている。図１に示す実施態様では、テール部３８には、不活性ガスを、 分散した気泡の形で、容器内容物の中に分配するための一個又はそれ以上の開口 ４２を有する上方に延びるノズル４０を設けている。チューブ３４のテール部３ ８には、ノズル４０に加えて、あるいはそれに代えて、不活性ガスを分配するた めの一個又はそれ以上の開口４５を設けてもよい。 不活性ガスを、容器４の内容物の中に泡立てて通気することで、有機溶剤の除 去が促進される。不活性ガスは、溶剤を取り込み、出口ポート５４を有するチュ ーブ５２を介して、容器から揮発性溶剤を除去するように、容器４内の蒸気圧を 変える。 加熱／冷却系１２は、逆止め弁４６を介して供給源（図示せず）から加熱／冷 却流体（例えば水）を受け入れるジャケット４４を有している。このジャケット ４４は、容器４の実質的な部分を取り囲み、容器内容物 の加熱／冷却を制御している。流体は、ジャケット４４から逆止め弁４８を介し て排出され、再循環されても廃棄されてもよい。 容器内の温度は、温度計を含む普通のサーモウエル５０、又は、好ましくは、 表示手段（図示せず）に接続された熱電対（図示せず）を用いて測定すればよい 。熱電対は、反応温度に対応する信号を中継して伝える感熱性プローブであり、 その信号は、その後、デジタル表示スクリーンのような表示手段で見ることがで きる電気信号に変換される。加熱／冷却系に供給される流体の温度は、目的とす る反応温度に基づいて選択される。 反応容器は、目的とする予め選択された平均粒径が得られると思われる処理条 件、特に混合速度、スパージ速度及び温度を選択することにより操作される。図 １及び２に示した装置に関しては、混合速度は、インペラー２６の回転速度であ り、シャフト２４の１分間当たりの回転数（ｒｐｍ）に相当する。スパージ速度 は、単位時間当たり、容器の内容物中に泡立てて通気される不活性ガスの容量と 定義され、代表的には、リットル／分で測定される。容器温度は、図１に示すよ うに、サーモウエル５０で測定したときの処理空間６内の温度である。 これらの変数のそれぞれについて一旦値を選択すると、式（１）を用いて平均 粒径が計算される。 ｙ＝Ｂ₀＋Ｂ₁Ｘ₁＋Ｂ₂Ｘ₂＋Ｂ₃Ｘ₃＋Ｂ₁₂Ｘ₁Ｘ₂＋Ｂ₁₃Ｘ₁Ｘ₃＋Ｂ₂₃Ｘ₂Ｘ₃＋ Ｂ₁₁Ｘ² ₁＋Ｂ₂₂Ｘ² ₂＋Ｂ₃₃Ｘ² ₃ （１） ここで、 ｙ＝目的とする平均粒径 Ｘ₁＝混合速度 Ｘ₂＝不活性ガス流量 Ｘ₃＝反応温度 Ｂ₀＝定数 Ｂ₁、Ｂ₂、Ｂ₃、Ｂ₁₂、Ｂ₁₃、Ｂ₂₃、Ｂ₁₁、Ｂ₂₂及びＢ₃₃は、表１による回帰 係数を示す。 好ましくは、不活性ガス流量は、約０．４リットル／分から約１．２リットル ／分、反応温度は、約２０℃から約８０℃、混合速度は、約２０００ｒｐｍまで の範囲内である。 選択された平均粒径を、目的とする平均粒径と比較する。計算値と目的値とが 同一か、あるいは十分に近似していれば、主変数について選択された値で、処理 系を操作する。“十分な近似”とは近似の度合、即ち同一性であり、これはリポ ソームの最終用途だけに限らないが最終用途を包含する因子によって決定される ものであり、本発明の教示に従って 当業者が選択する範囲内に入るものである。計算値と目標とする平均粒子サイズ とが十分近似していない場合は、主たる変数の内の少なくとも１つに対して調整 が行なわれる。これは、他の変数を一定に保ちながら、変数のうちの一つを選択 された範囲内で変更することにより、行うことができる。変更範囲は、これに関 して用いられる方法と装置の限界によって決まる。 本発明の好ましい方法においては、はじめに反応温度と混合速度を一定に保ち 、スパージ速度を変更して、その値を式（１）に入れる。第二の変数を変えなけ ればならないときは、反応温度を一定に保って、混合速度を変更するのが好まし い。しかし、混合系は、代表的には最大混合速度で制限されている。従って、混 合速度を混合系の最大限界まで変更しても、計算平均粒径と目的とする平均粒径 が目的とする程度まで近似しない場合は、反応温度を変更すればよい。計算平均 粒径が、目的とする平均粒径と同一になるか、あるいは近似するまで、変数の変 更を続ける。 目的とする平均粒径を算出したら、二相性混合物を形成するように、水性相と 有機相を合わせる。例えば、３リットルの反応容器を用いて、次のように処理を 行う。これよりも大きいか、あるいは小さい容器を用いる場合は、主変数に通常 の変更を加えてもよいものと理解されるべきである。任意に用いられる生物活性 剤と共に、あるいはそれを伴わずに、水性相（例えば、クエン酸緩衝液）を反応 容器に加える。混合装置を、代表的には２，０００ｒｐｍまでの範囲内の予め選 択された混合速度で起動する。有機溶剤（例えば、塩化メチレン）に溶解された 脂質（例えば、卵ホスファチジルコリン）からなる有機相を、混合装置による撹 拌下に、水性相に添加する。チューブ３４から不活性ガスを送り、代表的 には約０．０４から１．２リットル／分の予め選択されたスパージ速度で、反応 容器内に泡立てて通気する。スパージングが始まると、ジャケット４４に加熱水 を通して、反応容器の温度を、代表的には２０〜８０℃に高める。しかし、ジャ ケット４４に冷却水を通して、より冷たい温度を用いてもよいことは理解される べきである。 本発明の方法は、生物活性剤をマルチラメラリポソームと結合させる工程を含 むことができる。“生物活性剤”は、動物内で、あるいは試験管内の動物細胞に 生物活性を有する化合物又は物質組成物である。生物活性剤としては、核酸、ポ リヌクレオチド、抗菌性化合物、抗生物質、抗ウイルス性化合物、抗真菌性化合 物、駆虫性化合物、殺腫瘍性化合物、蛋白質、トキシン、酵素、ホルモン、神経 伝達物質、グリコペプチド、免疫グロブリン、免疫調節薬、染料、放射線標識剤 、放射線造影化合物、蛍光化合物、ポリサッカライド、細胞受容体結合分子、抗 炎症剤、抗緑内障薬（antiglaucomic agents）、散瞳性化合物、局所麻酔薬など が挙げられるが、これらに限定されるものではない（例えば、Lenk 等、米国特 許第４，５２２，８０３号、Fountain 等、米国特許第４，５８８，５７８号、J anoff 等、米国特許第４，８６１，５８０号及び４，８９７，３８４号、Lenk 等、米国特許第５，０８２，６６４号参照、これらは、それぞれ、ここに参照の ために記載している）。 本発明の方法によって、粘稠ゲル中間生成物を製造することもできる。この方 法では、通常は、有機相と水性相を一緒にした時、溶剤を除去する前に、濁った 脂質懸濁液が製造される。リポソームが生成するために、十分な溶剤が除去され る前で、脂質物質と結合する水の量が未だ少なすぎてリポソームが形成できない が、残留している溶剤に溶解することができる過剰の脂質が存在するように十分 な溶剤が除去された場合には、 通常は、脂質が、ゲルの形で、はっきりしない（ill-defined）二重層となる。 得られた粘稠ゲルは、リポソームの確かな前駆体である。 有機相と水性相を３：１よりも小さい容量比で合わせたとき、粘稠ゲルの形成 が生ずる。約０．１３：１のような低い容量比で、粘稠ゲルが容易に形成するこ とが見出されている。容量比が０．１３：１よりも低いと、脂質が、球状の小球 体を形成する傾向があり、粘稠ゲルを形成するにはこの小球体を特別に処理しな ければならず、そうでなければ、ゲルが全く形成しないことになる。例えば、小 球体を分断するために、混合速度を高めることにより、小球体を処理すればよい 。約０．１３：１よりも小さい容量比で、粘稠ゲルを形成することができるが、 少なくとも約０．１３：１の水性相に対する有機相の容量比を用いることが望ま しく、好ましくは、約０．２：１から１：１である。 処理前又は処理中に、生物活性剤を有機相又は水性相に添加すると、粘稠ゲル が、この生物活性剤と結合するであろう。粘稠ゲルは、その特徴的なはっきりし ない脂質二重層のために、生物活性剤の一部を取り込み、一方、生物活性剤の一 部は、脂質物質に結合したままで、脂質物質によって取り込まれないであろう。 この状態を、ここでは“ゲル結合（gel-associated）”と呼ぶこととし、これは 、生物活性剤がゲルの一部であることを意味し、リポソームの外表面に吸着され ること、リポソームの水性又は脂質部分内にカプセル化されることが挙げられる が、これらに限定されるものではない。これによって、感染治療用の生物活性剤 を局所投与するのに望ましい生成物が得られる。 本発明により製造された粘稠ゲルの電子顕微鏡写真を、図３に示す。この写真 の下部中央に、不十分に水和された脂質二重層を表す脂質物質の連続同心層があ る。 この粘稠ゲルは、温血動物、特にヒトにおける感染を治療又は予防する方法に 用いることができ、ここで、ゲルは抗感染有効量の抗生物質を含み、投与は局所 投与を含む。例えば、傷の上に塗ることにより、粘稠ゲルを傷に適用することが できる。次いで、必要に応じ、外科的処置により傷を閉じることができる。ゲン タマイシン（ゲンタマイシンＣ₁、Ｃ_1a及びＣ₂を含む）、ストレプトマイシン、 ジヒドロストレプトマイシン、トブラマイシン、ネオマイシンＢ、パロマイシン 、リボスタマイシン、リビドマイシン、カナマイシン（カナマイシンＡ及びＢを 含む）、バイオマイシン、シソマイシン、ネチルマイシン及びアミカシンなどの アミノグリコシド抗生物質、並びにその類似物質及び誘導体が、粘稠ゲルとの結 合に特に適当である。ゲンタマイシンは、本発明で使用するのに好ましいアミノ グリコシドである。 傷が感染した場合、傷の部位に、好中球、マクロファージ及び免疫系の他の細 胞が大量に浸潤すると信じられている。これらの細胞タイプは、脂質物質を分解 するように働くと思われる種々の酵素を分泌して、傷の部位で、ゲルに結合した アミノグリコシドを徐々に放出させる。更に、浸潤好中球及びマクロファージは 、粘稠ゲルを吸い込み、アミノグリコシドを細胞内に放出させて、免疫系が局所 感染をやっつけるのを助ける。粘稠ゲルは、典型的なリポソームの構造組織を持 っていないため、ゲル結合生物活性剤が、より容易に傷の部位へ利用できるので あろう。 製剤の投与様式によって、化合物が搬送されることになる生体内の部位及び細 胞が決まるであろう。粘稠ゲルは、単独で投与することができるが、一般には、 意図した投与経路及び標準的な製薬プラクティスによって選択される、生理食塩 水のような医薬担体と混合して投与されるであろう。本発明の製剤は、通常の外 科的処置により傷を閉じる前に、傷 の部位に局所的に投与される。粘稠ゲルは、粘度調整剤（例えば、ポリサッカラ イド）などの添加剤と組み合わせて、その投与を改善してもよい。製剤の特定の 性質によるその他の使用は、当業者の想到しうるところであろう。 抗生物質の抗感染有効量は、抗生物質の治療有効量、即ち、感染の定着、成長 又は拡大を抑制するのに十分な量であり、それによって、物理的又は生理的応答 を行う。投与されるアミノグリコシドの有効量は、投与の様式、レシピエントの 特性、標的とするバクテリアの感受性及び当該技術分野においてよく知られてい る因子によって変わるであろう。ゲル結合している生物活性剤の量は、ある程度 、その剤の水性又は有機相への溶解度に依存する。例えば、ゲンタマイシンの水 性相への溶解度は、約８５０ｍｇ／ｍｌ以下である。 病状の治療処置におけるヒトへの投与については、処方する医師は、与えられ た対象となるヒトへの適当な投与量を最終的に決定するであろう。そして、これ は、患者の病気の性質及び重症度と共に、個人の年齢、体重及び反応によって変 わるものと考えることができる。粘稠ゲルでの薬剤の投与量は、一般に、遊離の 薬剤で用いられる投与量とほぼ同じである。しかし、これらの限界外の量を投与 する必要がある場合もある。 更に、生物活性剤と、安定性を高めるｐＨを有する水溶液を含む区画及び脂質 を含む脂質二重層とからなる貯蔵安定性リポソームが、ここで提供され、この脂 質は、実質的に純粋な脂質である。“貯蔵安定性”リポソームとは、脂質の加水 分解及び酸化を最小限にとどめることをはじめ、リポソーム構造又は性質の劣化 を最小限にとどめ、リポソームに取り込まれるか、あるいはリポソームと結合し た生物活性剤の漏洩をはじめ、リポソームの内容物の漏洩を最少限にとどめて、 長期間貯蔵できる リポソームのことである。このリポソームは、２年まで、あるいはそれ以上の期 間の貯蔵中、安定である。リポソームは、通常は、約４〜５℃の冷蔵条件下で貯 蔵されるが、もし必要であれば、その他の条件下で貯蔵されることもできる。貯 蔵安定性リポソームを形成するのに使用され、得られたリポソームに取り込まれ る水溶液のｐＨは、貯蔵中のリポソームの安定性並びに脂質の加水分解及び酸化 を抑制することによる実体の維持に寄与しているものと信じられている。 リポソームは、マルチラメラリポソームであることが好ましい。マルチラメラ リポソームは、その水性区画に取り込まれた溶質を含み、各水性区画の溶質濃度 が実質的に等しいものであること、即ちマルチラメラリポソームが実質的に等し いラメラ間溶質分布を有しているものであることが好ましい。このようなリポソ ームは、Lenk 等（米国特許第４，５２２，８０３号、５，０３０，４５３号及 び５，１６９，６３号）Fountain 等（米国特許第４，５８８５，５７８号）並 びにCullis 等（米国特許第４，９７５，２８２号）に記載の方法により形成す ることができ、これらの内容は、ここに参照のために記載している。ラメラ間溶 質分布が実質的に等しいと、これはそう信じられているのであるが、水性区画間 の浸透バランスが促進され、浸透ストレスが低くなるため、マルチラメラリポソ ームの安定性が増大する。“通常の”ＭＬＶ、即ち実質的に等しいラメラ間溶質 分布を有していないものは、水性区画間の浸透ストレスが高く、従って、安定性 が低い。 本発明の貯蔵安定性リポソームは、リポソームに取り込まれるか、あるいはリ ポソームと結合した生物活性剤を含む。生物活性剤は、動物内で、あるいは試験 管内の動物細胞に生物活性を有する化合物又は物質組成物であり、核酸、ポリヌ クレオチド、抗菌性化合物、抗生物質、抗ウ イルス性化合物、抗真菌性化合物、駆虫性化合物、抗腫瘍性化合物、蛋白質、ト キシン、酵素、ホルモン、神経伝達物質、グリコペプチド、免疫グロブリン、免 疫調節薬、染料、放射線標識剤、放射線造影化合物、蛍光化合物、ポリサッカラ イド、細胞受容体結合分子、抗炎症剤、抗緑内障薬、散瞳性化合物、局所麻酔薬 などが挙げられるが、これらに限定されるものではない（例えば、Lenk 等、米 国特許第４，５２２，８０３号、Fountain 等、米国特許第４，５８８，５７８ 号、Janoff 等、米国特許第４，８６１，５８０号及び４，８９７，３８４号、L enk 等、米国特許第５，０８２，６６４号参照、これらは、それぞれ、ここに参 照のために記載している）。ここで用いられる“取り込み”及び“結合”は、リ ポソームの水性区画内への生物活性剤の取り込み、又は脂質二重層の内側若しく は外側表面との結合をいうものである。現在の所、好ましい生物活性剤は、アミ ノグリコシド抗生物質であり、ゲンタマイシン、アミカシン、ストレプトマイシ ン、ジヒドロストレプトマイシン、トブラマイシン、ネオマイシン、カナマイシ ン、リビドマイシン、パロマイシン、リボスタマイシン、バイオマイシン、シソ マイシン及びネチルマイシンからなる群から選ばれることができる。本発明の一 つの好ましい実施態様においては、アミノグリコシド抗生物質がゲンタマイシン である。本発明の他の好ましい実施態様においては、アミノグリコシド抗生物質 がアミカシンである。本発明のもう一つ他の好ましい実施態様においては、アミ ノグリコシド抗生物質がトブラマイシンのものである。 ここで用いられる“実質的に純粋な脂質”は、代表的には、純度が少なくとも 約８５％である。即ち、少なくとも約８５％の脂質と、高々約１５％のこの脂質 の分解生成物及び他の脂質から構成されている。この実質的に純粋な脂質は、純 度が少なくとも約９０％であることが好まし い。更に好ましくは、この実質的に純粋な脂質は、純度が少なくとも約９５％で ある。脂質純度は、２０５ｎｍでの紫外線検出を用いる高速液体クロマトグラフ ィー、リン特異性測定法（phosphorous specific assay）を用いるリン脂質の薄 層クロマトグラフィー、水素炎イオン化を用いる高圧又は薄層クロマトグラフィ ー（例えば、１９９０年４月１２日出願の米国特許出願番号第07/512,557号の継 続出願である、１９９４年３月１４日出願の米国特許出願番号第０８／ 号 及びリポソームテクノロジー（Liposome Technology）、第１巻、リポソームの 調製、G.Gregoriadis 編、第２４７〜２５８頁、CRC Press，Boca Raton，FL(19 84)の S．Frφkjaer 等、“貯蔵中のリポソームの安定性テスト”参照）などの 、当業者によく知られている種々の方法で測定することができ、必要以上の実験 を行わなくても容易に実施することができる。 実質的に純粋な脂質は、実質的にリソリピドを含んでいない。リソリピドは、 ヘッドグループ（headgroup）と１つのアシル鎖を有する両親媒性脂質であり、 ジアシル脂質の加水分解の結果として、脂質二重層中に存在することができる。 従って、リソリピドの形成は、脂質、従って脂質安定性の指標とすることができ る。リソリピドは、ゲル中の方が安定であるため、ゲルを形成しようとするので 、リポソームを不安定にすると考えられている。脂質二重層内でジアシル脂質か らリソリピドが形成されると、透過性などの二重層の性質に変化が生じ得る。従 って、実質的にリソリピドを含まないリポソーム二重層は、一般に、相当割合の そのような脂質を含む二重層よりも安定である。“実質的にリソリピドを含まな い”とは、リソリピドが脂質の約５％未満であるものを意味し、好ましくは、リ ソリピドが約２％未満であることを意味する。 実質的に純粋な脂質は、リン脂質を含んでいることが好ましく、その リン脂質は、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）であることが好ましい。この脂 質は、他の種類の脂質のなかでも、その他のリン脂質、リン脂質以外の両親媒性 脂質、コレステロールなどのステロール、コレステロールヘミスクシネート（Ｃ ＨＳ）などのステロール誘導体及びアルファトコフェロール又はその誘導体を含 むことができる。 実質的な脂質純度は、脂質加水分解及び酸化をはじめとする脂質分解を抑制す ることにより、貯蔵中の貯蔵安定性リポソーム内で維持される。リポソームによ って取り込まれた水溶液のｐＨは、この分解抑制に寄与しているものと考えられ ている。脂質加水分解は、両親媒性脂質のヘッドグループとその脂肪酸鎖の一つ との間の結合、例えば、リン脂質のヘッドグループとその脂肪酸鎖の一つとの間 のエステル結合が破断した時に起こり、リソリピド、即ちヘッドグループと２つ のアシル鎖の代わりに１つのアシル鎖を有する脂質を形成することになる。この ように、リソリピドの形成は、リン脂質の化学的安定性の指標となる。酸化は、 熱や光のような因子によって開始される反応であり、分子酸素を用いて、遊離ラ ジカルを形成する。脂質酸化は、不飽和脂肪酸の二重結合を破断することがあり 、それによって、脂質を分解することになる。脂質酸化は、当業者によく知られ ている種々の方法で監視することができ、必要以上の実験を行わなくても容易に 実施することができる。脂質加水分解及び酸化は、リポソーム脂質成分の初期純 度を測定すること、及びリソリン脂質と、リポソームを調製するのに用いられた 脂質に対応する遊離脂肪酸の初期含有量を測定することにより分析することがで きる。貯蔵後、脂質純度及びリソリン脂質と遊離脂肪酸の含有量を測定し、初期 値と比較して、脂質酸化を求めることができる。リポソーム製剤において、脂質 純度及びリソリン脂質と遊離脂肪酸の含有量を測定する方法は、当 業者によく知られており、必要以上の実験を行わなくても容易に実施することが できる。 “最少脂質加水分解”及び“最少脂質酸化”は、貯蔵安定性リポソームを形成 するのに用いられた脂質の実質的にすべてが、貯蔵中そのまま残ることを意味す る。加水分解及び酸化を最小限にとどめるということは、貯蔵中に脂質の純度水 準が実質的に低下せず、貯蔵中にリソリン脂質と遊離脂肪酸の含有量が実質的に 増加しないことを意味する。代表的には、貯蔵安定性リポソーム内の純粋脂質の 約１５％未満が加水分解又は酸化され、望ましくは、脂質の約１０％以下が加水 分解又は酸化され、更に望ましくは、約５％未満が加水分解又は酸化される。 例えば、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）とｐＨが約６．５の水溶液を用い て、下記方法（実施例の項参照）によりリポソームを形成することができる。得 られたリポソームにおいて、はじめには、ＥＰＣ純度は、代表的には約９６．５ ％であり（下記表７〜１６参照）、リソホスファチジルコリン含有量は、約０． ４％である。ＥＰＣ純度は、半年、１年、１年半又は２年間、リポソームを貯蔵 した後でもほぼ等しく、リソリン脂質含有量が、著しく増加することはない。 代表的には、これらの貯蔵安定性リポソームの少なくとも約７５％が、１．２ 〜９．６ミクロンの範囲内の径を有し、望ましくは、リポソームの少なくとも約 ９５％が、この範囲内の径を有する。９．６ミクロンよりも大きい径を有するリ ポソームの割合は、代表的には約１０％未満であり、望ましくは約５％未満、更 に望ましくは約２％以下である。約１．２ミクロンよりも小さい径を有するリポ ソームの割合は、約１０％未満であり、望ましくは約５％未満である。この径分 布は、２年まで又はそれ以上の期間のリポソームの貯蔵中でも保持される。 これらの貯蔵安定性リポソームは、通常は、安定性を高めないｐＨで形成され たリポソームよりも漏洩が少なく、その結果、当初、取り込まれるかあるいは結 合した生物活性剤の多くが、リポソーム内に取り込まれたまま保持される。脂質 加水分解、酸化及びその他の脂質分解を最少にして、二重層の完全さを保つこと により、貯蔵安定性リポソームにおいて、生物活性剤漏洩が最少にになる。例え ば、ＥＰＣ、ゲンタマイシン及び約６．５のｐＨを用いて、上記方法により形成 されたリポソームでは、遊離ゲンタマイシンの量は１５％未満である。即ち、当 初、リポソーム内に取り込まれたゲンタマイシンの量の約１５％未満が、貯蔵中 に漏洩し、ゲンタマイシンの８５％以上が、貯蔵中、リポソーム内に保持される 。 ｐＨが約４．５の水溶液内で形成されたＥＰＣ含有リポソームは、はじめのう ちは一般に同様のＥＰＣ純度を示した（下記表１７〜２０参照）。しかし、上記 と同様の時間、貯蔵した後は、これらのリポソームは、ＥＰＣの低下及びリソリ ン脂質含有量の顕著な増加を示した。更に、このｐＨで形成されたリポソームは 、約１．２ミクロンより小さい径を有するリポソームの割合が、約６．５の安定 性を高めるｐＨで形成されたリポソームよりも大きく、約１．２ミクロンと約９ ．６ミクロンの間の径を有するリポソームの割合が、それよりも小さい。また、 このようなリポソームは、代表的には、安定性を高めるｐＨで形成されたリポソ ームよりも多くの生物活性剤漏洩を示す。即ち、当初、リポソームに取り込まれ るかあるいは結合した生物活性剤が、貯蔵後その中に残る量が、安定性を高める ｐＨを有する水溶液で形成されたリポソームの場合よりも少なくなる。 更に、独立したモデル評価に基づく研究によると、貯蔵安定性リポソ ームの排泄半減期、即ちリポソームの２分の１が排泄されるのに要する時間量が 、低ｐＨ（約４．５）で形成されたリポソームの場合よりも著しく長いことが分 かった（例えば、貯蔵安定性リポソームの母集団は、低ｐＨ製剤についての４． １０±１．１５時間とは異なり、約５．０４±１．９１時間の循環半減期（circ ulatory half-time）を有することが見出された。また、尿中に排泄された投与 ゲンタマイシンのパーセンテージは、低ｐＨリポソーム及び貯蔵安定性リポソー ムについて、それぞれ８１．５８±１０．９６及び７６．１６±１１．８１であ った。）。遊離血漿ゲンタマイシン濃度は、低ｐＨグループが貯蔵安定性リポソ ームよりも高かった（Ｃｍａｘ及びＡＵＣ最終値は、低ｐＨリポソーム及び貯蔵 安定性リポソームについて、それぞれ１１５．６７±５１．４２マイクログラム ／ｍｌ及び９０．８４２±５１．４１マイクログラム−時間／ｍｌ、５７．３１ ±２９．００マイクログラム／ｍｌ及び４４．３９±６．７７８マイクログラム −時間／ｍｌであった。）。低ｐＨグループがゲンタマイシンを含まない割合は 、貯蔵安定性リポソームの約２倍であった。 従って、貯蔵安定性リポソームは、リポソーム分解を最小限にとどめながら長 期間貯蔵することができる。従って、例えば、製剤を大量に製造し、貯蔵し、そ の後、長期間にわたって安全に分配できるので、生物活性剤を含むリポソーム製 剤及びそのような製剤の治療投与に関して、特に有用である。この製剤は、被治 療者に大量に投与することができ、その増加分を被治療者が長期間にわたって安 全に使用することができる。 本発明の貯蔵安定性リポソームにおける脂質に対する生物活性剤の比（ｗ／ｗ ）は、代表的には少なくとも約１：２０であり、約１：５〜約１：１５であるこ とが望ましく、約１：１０であることが更に望ましい。 代表的には、貯蔵安定性リポソームにおける水溶液は、生理食塩水であるが、ク エン酸緩衝液のような水性緩衝液をはじめとして、リポソーム形成に関して使用 するのに適していると当業者に知られている、安定性を高めるｐＨを有する他の 水溶液でもよい。 “安定性を高めるｐＨ”とは、脂質加水分解及び酸化をはじめとする脂質分解 が抑制される水溶液のｐＨを言うものである。貯蔵安定性リポソームで用いられ る水溶液の安定性を高めるｐＨは、約５．５〜約７．５であることが望ましい。 現在の所、安定性を高めるｐＨは、約６．５であることが更に望ましい。 従って、本発明の好ましい態様においては、貯蔵安定性リポソームは、アミノ グリコシド抗生物質、実質的に純粋な卵ホスファチジルコリン及びｐＨが約６． ５の生理食塩水溶液からなり、リポソームが、その水性区画に取り込まれた溶質 を含むマルチラメラリポソームであり、マルチラメラリポソームの各区画内の溶 質の濃度が実質的に等しく、実質的に純粋な卵ホスファチジルコリンは、純度が 少なくとも約８５％であり、実質的にリソリピドを含まず、ＥＰＣに対するゲン タマイシンの比（ｗ／ｗ）は、約１：１５〜約１：５である。アミノグリコシド 抗生物質は、ゲンタマイシン、アミカシン又はトブラマイシンであることが好ま しい。更に好ましくは、アミノグリコシド抗生物質は、ゲンタマイシンである。 次の実施例は、本発明を説明するものであり、この出願の一部を形成する請求 範囲によって規定される本発明を限定しようとするものではない。 実施例 実施例１ ８５０ｇ（３００ｍＭ）のクエン酸緩衝液（ｐＨ４）を、シャフトの 底部に３インチのライトニン（Lightnin）Ａ−２００インペラーを取り付けた磁 気的に連結された混合装置モデル＃Ｐ３１０を備えた３リットルのガラス反応容 器に入れた。このシャフトの回転は、ベンチ−トップ型モータコントローラ＃Ｚ ５１０１２２Ｒ２０によって制御されており、すべて、Applikon Dependable In strument,Inc.，Foster City，California によって販売されている。反応容器 は、基本的には図１に示した反応容器に対応する構造を有していた。混合装置を 起動し、シャフトを１，０００ｒｐｍで回転させ、インペラーを同一速度で回転 させた。 ６８．８ｇの卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）と２７．６ｇのコレステロー ルをビーカーに加えた。１９１．８ｇの塩化メチレンをに加え、この脂質混合物 を溶けるまでかき混ぜた。水性相に対するこの溶媒の容積比は、１８：１であり 、脂質量は１１７ｍｇ／ｍｌである。得られた有機相を反応容器に加えた。 窒素ガスを、図１に示すタイプのスパージ装置のチューブを通して、０．０４ リットル／分の割合で泡立てて通気した。その後、反応容器の温度を、温水をジ ャケットに通して循環させることにより、徐々に３０℃まで上げた。 少なくとも３時間後に、ほとんど全ての塩化メチレンが窒素ガスにより除去さ れ（０．１％未満、即ち０．２グラム未満が残留）、反応容器中にリポソーム母 集団が形成された。このリポソームを、上述した同じクエン酸緩衝液で１０００ ｍｌ容量にした。 得られたリポソームの粒径は、約１２００ｎｍより小さいリポソームについて は、ＮＩＣＯＭＰモデル２７０極微粒子サイザー（submicron particle sizer） を用い、また直径が約１２００ｎｍより大きいリポソームについては、マルバー ン（Malvern）３６００Ｅレーザー回折粒子 サイザー（laser diffraction particle sizer）を用いる従来方法で測定した。実施例２〜８ 実施例２〜８については、混合速度、不活性ガス流量及び反応温度を表２に示 すように変更して、実施例１と同一の実験操作を繰り返した。実施例１〜８のそ れぞれについて、平均粒径を前述の方法で測定した。その結果も表２に示す。 表２のデータの検討からわかるように、混合速度、不活性ガスの流量（スパー ジ速度）及び／又は反応温度を変更することが、リポソームの平均粒径に影響を 及ぼすであろう。実施例１と２とを比較してみると、スパージ速度及び反応温度 を一定に保ちながら、混合速度を（１０００ ｒｐｍから２０００ｒｐｍへ）速くすることによって、平均粒径が低下すること がわかる。実施例１と３とを比較してみると、混合速度及び反応温度を一定に保 ちながら、スパージ速度を（０．０４リットル／分から０．８リットル／分へ） 速くすると、リポソームの径が大きくなることがわかる。反応温度を上昇させる と（実施例１と５とを比較）、リポソームの径は、一般に低下する。 本発明以前には、目的とする平均粒径のリポソーム母集団を得るためには、多 くの、費用と時間がかかる濾過工程が必要であった。これは、粒径に最も影響を 及ぼすこれらの処理変数の選択が、ランダムに行われていたためである。本発明 によれば、粒径に最も影響を及ぼす主変数が特定され、その主変数の値をランダ ムでないやり方で選択する方法が開発された。式（１）は、平均粒径（Ｙ）に最 も影響を及ぼすこれらのの主変数とその組み合わせを、係数Ｂ₀からＢ₃₃で表さ れるように、関連させている。 Ｂ₀からＢ₃₃の係数を決定するデータ分析は、ＳＴＡＴ−ＥＡＳＥ，Ｉｎｃ． の応答表面及び混合実験のためのソフトウエアパッケージであるデザイン−エク スパート（Design−Expert）を使用して行った。式（１）で提案される２次モデ ルに対して良好な一致を得るために、表２に表された実施例１〜８の平均粒径デ ータの対数１０（log 10）変換を行った。係数の値を表３に示す。 表３に示される係数から、いくつかの傾向がわかるであろう。負の係数を持つ 項は全て、その因子（例えば、混合速度）が大きくなるにつれて、粒径を小さく するように作用する。即ち、その因子が大きくなると、リポソームの粒径は、一 般的に小さくなる。正の係数については、逆のことが言える。負の係数の最も大 きな二つのものは、混合速度（Ｂ₁）と、混合速度と不活性ガス流量間の相互作 用（Ｂ₁₂）に関係する。正の係数の最も大きなものは不活性ガス流量（Ｂ₂）に 関係する。また、混合速度についての二次項（Ｂ₁₁）に関係する比較的大きい正 の係数がある。この正の二次項は、混合速度が速くなるにつれて、負の一次項（ Ｂ₁）のために、平均粒径が小さくなる代わりに大きくなる点が現れることを意 味している。不活性ガス流量及び反応温度の二次項も表３に示す。実施例９〜１６ 表４に示す混合速度、不活性ガス流量及び反応温度を用いて、実施例１〜８と 同一の操作及び装置で実験を繰り返した。データを式（１）に入れて、予測平均 粒径を得た。実際の粒径は、実施例１〜８に関して記載されたものと同じ方法で 測定した。条件並びに予測及び実際の平均粒径を表４に示す。 表４に示されるように、実施例９〜１６のそれぞれについての予測平均粒径は 、実際の平均粒径と密接な関係がある。実験データは、本発明が、予め選択され た平均粒径に相当するリポソーム母集団を得る信頼できる方法であることを示し ている。 実施例１３、１４及び１６により製造されたリポソーム母集団の径分布は、実 施例１〜８で述べた粒径測定装置を用いて測定した。その結果を、それぞれ図４ 〜６に示す。 図４〜６は、それぞれ、ほとんど全てのリポソームが連続した粒径の範囲内に ある粒径を有している単一モード母集団分布のリポソーム母集団を示している。 例えば、図４は、大部分のリポソームが、２０４ｎｍの平均粒径と同一であるか あるいはそれと類似の粒径を有し、約３８．４ｎｍから７８６ｎｍまでの範囲内 の粒径を有している単一モード母集団分布を示している。 図５及び６は、図４に示す結果と一致している。図５は、平均粒径が２０８ｎ ｍで、５３．９ｎｍから５８３ｎｍまでの範囲内の単一モードリポソーム母集団 分布を示している。図６は、平均粒径が２５０ｎｍで、２５ｎｍから１５５３ｎ ｍまでの範囲内の単一モードリポソーム母集団分布を示している。 図４〜６で示されるように、ほとんど全てのリポソームは、目的とする平均粒 径を包含する単一モード母集団分布内にある。大部分のリポソームが、相対強度 値によって示されるように、目的とする平均粒径と同一か又はそれに類似した粒 径を有している。実施例１７ １４．０ｇの卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）を３０ｍｌの塩化メチレンに 溶解して、有機相を形成した。この溶液を、図１に示すタイプの反応容器に入れ 、混合装置を２００ｒｐｍで回転させた。 ８．１８ｇの硫酸ゲンタマイシンを０．９％生理食塩水１５０ｍｌ中に溶解し た。得られた溶液を、２００ｒｐｍの連続混合速度下で、反応容器に加えた。反 応混合物中の脂質の量は、７７８ｍｇ／ｍｌであり、 水性相に対する溶媒の容量比は、０．２：１であった。合わされた相のｐＨは４ ．４であった。 加熱ジャケット４４に温水を供給し、反応容器の内容物の温度を３５℃に上昇 させた。 加熱された反応混合物は、窒素ガスにより約１．０リットル／分の流量でスパ ージされた。２分経過しないうちに、顕微鏡によって観察すると図３の顕微鏡写 真で示されているものと類似の外観を有する粘稠ゲルが形成された。この操作を 、塩化メチレン量が０．１容量％以下の水準に減少し、リポソームが形成される まで続けた。 ５℃で保存されている間に水性区画から漏出したゲンタマイシンの量を測定す ることによって、得られたリポソームの安定性を試験した。その結果を表５に示 す。”％純度”は、所定期間中、リポソーム内に残存していたゲンタマイシンの 平均量を意味する。 実施例１８ 一緒にされた有機相と水性相のｐＨ値を、１Ｎの水酸化ナトリウムを５ｍｌ加 えることにより６．５まで上げたこと以外は、実施例１７の操作を繰り返した。 得られたリポソームの安定性を実施例１７と同じ方法で試験し、その結果も表５ に示す。 表５に示されるように、水性相に対する溶媒の比が０．２：１で、少 量の溶媒を使用すると、安定性の優れたリポソームが得られた。実施例１７は、 ２００日経過後、９１％純度を示した。脂質材料に更に適合する水準までｐＨを 上げると、生成物は更に優れた安定性を示し、２００日経過後、９６％純度で表 された。実施例１９〜２５ 水性相に対する溶媒の比を表６に示すように変更した以外は、実施例１７の操 作を繰り返した。リポソーム中のゲンタマイシンの量を測定し、その結果を表６ に示す。 表６に示されるように、リポソーム中に残存するゲンタマイシンの量は、統計 的に近似しており、一般的な製品仕様を満足する生成物が得られた。水性相に対 する溶媒の比が０．１３：１では、リポソーム生成物は形成されたが、生成物中 に残存するゲンタマイシン量は少なかった。実施例２６ 外科的な傷の感染を予防する際のゲル結合組成物の効力は、組成物を、通常の 創傷治癒、回復過程におけるその効果について評価する以下のプロトコルによっ て測定することができる。 全ての操作は、外科器具、掛け布（drape）、手袋を使用してクリーン処置ル ームで行われる。使用される動物モデルは、背中の外科的な切開から病毒細菌株 を接種されたモルモットかウサギのどちらかである。あるいは、健康なモルモッ ト又はウサギの研究結果による場合は、免疫抑制されたマウスを使用してもよい 。本試験は、モルモットを用いて行った。 粘稠ゲルの形成時に、実施例１７に記載した操作を終了することによって得た ゲル結合製剤から、試験サンプルを用意した。対照として、未装填ゲル結合製剤 も試験した。 モルモットは、背中の毛を剃り、短く剃った毛を脱毛クリームにより取り除き 、その後、露出した皮膚を石鹸と水で洗い、ベータジン（Betadine）（登録商標 ）溶液で十分にふき、最後にイソプロピルアルコールでふいて、外科手術の準備 をした。この動物は、この準備過程の間中、メトファン（Metofane）（登録商標 ）（メトキシフルラン）で麻酔をかけられていた。 各モルモットの背中の毛を剃った領域内の中央線の両側に、それぞれ２ｃｍの 長さの２つの切開口を作った。切開口は、筋膜まで切り込むが、筋膜を通らない ようにし、横方向にも拡げて、およそ２ｃｍ四方の袋を作った。各処置は、重複 して行われ、袋は、動物の両側に対をなして配置された。 この動物に、一般的な外科的創傷分離株の細菌懸濁液を接種した。主な細菌株 は、黄色ブドウ球菌であるが、緑膿菌及び／又は大腸菌を含ん でもよい。２つの異なる方法で、薬剤サンプルを試験した。一つの方法では、直 接接種後、直ちに薬剤サンプルを適用した。接種後、傷を閉じた。 これらの動物及び傷を毎日観察した。動物が不適当なストレスの徴候を示した 場合は、直ちに殺した。外科手術の７日後に、これらの動物を二酸化炭素室で殺 した。傷感染の目に見える徴候について、それぞれの傷を調べ、定量的な細菌計 数のために、組織サンプルを取り出した。修復組織の組織学的分析のために、更 に追加して、組織サンプルを取り出した。それぞれの場合、処置した傷を、未処 置対照動物のもの、ゲンタマイシンを含まない粘稠ゲルで処置したもの及びゲル 結合ゲンタマイシンで処置したものと比較した。実施例２７ リポソーム製剤の安定性は、次のようにして試験した。ゲンタマイシンを含有 するリポソームを、ゲンタマイシン濃度４．５〜６．７５ｍｇ／ｍｌ、全リン脂 質濃度を約４０〜６０ｍｇ／ｍｌで、上述のようにして調製した。リポソーム製 剤の成分は、すべて、現在のアメリカ薬局方の要求を満たしていた。生殖不能性 及び発熱物質含有量について、製剤を試験したが、現在のアメリカ薬局方の要求 を満たしていた。調製中の残留溶媒（塩化メチレン）は、はじめは約０．００７ ８％（ｖ／ｖ）であった。製剤は、調製後、又は５℃の直立型冷蔵庫に貯蔵し、 調製後種々の時間間隔（日数）をおいて試験した。リポソーム製剤の下記の規準 を試験した：モル浸透圧濃度（ｍｍｏｌｅ／ｋｇ）；製剤ｐＨ（約６．５）；外 観（白から灰色がかった白色までの不透明分散規格への一致）；過酸化物含有量 （ｍＥｑ／ｋｇ）；粒径（ミクロン）；遊離（取り込まれなかった）ゲンタマイ シン（有効ゲンタマイシンの％）；卵ホスファ チジルコリン（ＥＰＣ）純度；ヘッドスペース酸素含有量（リポソーム製剤を含 むバイアル中のヘッドスペース、つまり空間、における酸素％）；脂質完全性（ 加水分解生成物又は非ＥＰＣ脂質としての全リン脂質の％）。結果を表７，８， ９，１０，１１，１２，１３，１４，１５及び１６に示す（以下参照）；それぞ れの表には、リポソームの異なるロットから得られたデータ、つまり同一の仕様 及び条件のもとで異なる時に調製されたリポソーム、から得られたデータが示さ れている。表１７，１８，１９及び２０には、製剤ｐＨが約４．５で他は同一条 件のもとで調製されたリポソームの規準が示されている。 実施例２８ ２３匹のオスのSprague−Dawleyラット（３５０〜４００ｇ）を無作為に二つ の処置グループに割り当てた。それぞれのグループを、ゲンタマイシン〔尾静脈 へ巨丸剤として（ｉ．ｖ．（tail bolus）〕のｉ．ｖ．投与量２０ｍｇ／ｋｇで 処置した。一方のグループには、ｐＨが約４．５（低ｐＨ製剤；ロット＃ＣＯ３ ４１、ゲンタマイシン４．８ｍｇ／ｍｌ、全リン脂質５３．１ｍｇ／ｍｌ）であ るリポソームゲンタマイシンを与えた。第２のグループには、ｐＨが約６．５（ 高ｐＨ製剤；ロットＮｏ．Ｓ０２６６、ゲンタマイシン６．０ｍｇ／ｍｌ、全リ ン脂質４３．７ｍｇ／ｍｌ）であるリポソームゲンタマイシンを与えた。 使用した装置及び試薬、薬品投与及びサンプル収集、ゲンタマイシン分析並び に薬物動態学評価は以下の通りであった。 ２．４ 装置及び試薬 ２．４．１ ＴＤｘアナライザー（Serial #17734，Abbott Laboratories，Ch icago，IL） ２．４．２ ＴＤｘゲンタマイシンアッセイキット、対照、キャリブレータ及 び緩衝液（Abbott Laboratories，Chicago，ILから取得） ２．４．３ ペントバルビタールナトリウム（Fort Dodge Laboratories，INC .，Fort Dodge，Iowa） ２．４．４ AMICON Corporation Scientific System Division，Danvers，MA からのセントリコン−３０（Centricon-30）マイクロコンセントレーター（３ ０，０００ＭＷカットオフ）製品、＃４２０９ ２．５ 薬剤投与及びサンプル採取 薬剤投与に先立ち、基線になる血漿と尿を各ラットから採取した。一つのラッ ト群（グループＢ）には、２０ｍｇ／ｋｇの静脈（尾静脈）内 巨丸剤投与量のＧ−６５低塩化メチレン製剤（Ｌｏｔ＃ＣＯ３４１）を投与し、 一方、第２のグループ（グループＢ）には、同量のＧ−６５ｐＨ調整製剤（Ｌｏ ｔ＃ＳＯ２６６）を投与した。各ラットにおける薬剤投与の後、０．０８３、０ ．２５、０．５０、１．００、２．００、４．００、６．００、８．００、１０ ．００、１２．００、１６．００、２０．００、２４．００、３６．００及び４ ８．００時間において、クエン酸塩で洗浄した１ｃｃの注射器を用いて、１００ から５００μｌの血液を抜き取った。採取した血液サンプルを、マイクロ遠心分 離器で２分間遠心分離した。血漿を集め、処理して、２．６項に記載されている ように、全ゲンタマイシン及び遊離ゲンタマイシンを測定した。 ＴＤｘ希釈緩衝液（TDx Dilution Buffer）で代謝ケージを洗った後、４．０ ０、８．００、１２．００、２４．００、３６．００、４８．００、６０．００ 、７２．００、９６．００及び１２０時間に、各ラットが排泄した尿を採取した 。採取した尿の量を、各ラット及び採取期間ごとに記録した。尿サンプルを５分 間遠心分離して、粒状破片を除去した。次いで、２．６項に記載されているよう に、尿サンプルを測定して、ゲンタマイシン濃度を求めた。 サンプル採取が終了した時点で、二酸化炭素（ドライアイス）により動物を安 楽死させた。 ２．６ ゲンタマイシンアッセイ 血漿及び尿サンプル中のゲンタマイシンの濃度を、ＴＤｘシステムの蛍光偏光 イムノアッセイ技術（Abbott Diagnostic Laboratories）を用いて、生物科学レ ポート（Biological Sciences Report）Ｇ６５−００９に記載されているように 測定した。 ２．７ 薬物動態学評価 ゲンタマイシンの薬物動態学は、モデルインデペンデント（model-independen t）法を用いて求めた。パラメーターは、血漿濃度−時間曲線（ＡＵＣ）及び台 形法（trapezoidal method）により算出されたそれらの一次モーメント（ＡＵＭ Ｃ）によって、面積から求めた。排泄半減期（ｔ1/2β）、平均滞留時間（ＭＲ Ｔ）、ボディクリアランス（body clearance）（Ｃｌｔ）及び定常状態における 分布量（Ｖｓｓ）は、次の関係から算出された。 ｔ1/2β＝０．６９３／β ＭＲＴ＝ＡＵＭＣ／ＡＵＣ Ｃｌｔ＝投与量／ＡＵＣ Ｖｓｓ＝投与量（ＡＵＭＣ）／（ＡＵＣ）² 尿データからゲンタマイシン狩性を評価するに際しては、累積ゲンタマイシン 尿排泄と採取時間の各中間点における排泄速度を使用した。腎臓クリアランス（ renal clearance）（Ｃｌｒ）及び排泄半減期（ｔ1/2β）は、下記の関係から計 算した。 Ｃｌｒ＝ＸＵ^∞／ＡＵＣ ｔ1/2β＝０．６９３／β ここで、ＸＵ^∞は、ＸＵ^∞＝ＸＵ¹²⁰＋（ｄｘｕ／ｄｔ）／βから算出された 、無限大における尿排泄量である。ここで、ＸＵ¹²⁰は、５日間の累積尿排泄量 、ｄｘｕ／ｄｔは、１２０時間における排泄速度、βは、排泄中間点における対 数ｄｘｕ／ｄｔ対時間の最終勾配である。 ２つの処置グループ間のゲンタマイシン薬物動態学パラメーターの差違を求め るに際しては、General Linear Model（SAS Institute Inc.，NC）を使用した。 薬品投与の後、連続血液（基線、．０８３、．２５、．５０、１、２、４、６ 、８、１０、１２、１６、２０、２４、３０、３６及び４８時間）及び尿サンプ ル（基線、４、８、１２、２４、３６、４８、６０、７２、 ９６及び１２０時間）を、蛍光偏光イムノアッセイ（TDx，Abbor Labs.）を用い て測定した。結果を表２１，２２，２３及び２４並びに図７〜１３に示す。 全ゲンタマイシン及び遊離ゲンタマイシンについて、平均薬物動態学パラメー ターを評価するために血漿濃度を用いた。高ｐＨ製剤では、ＡＵＣ、Ｃｌｔ及び Ｖｓｓが、それぞれ８０９．０２±３７７．２５マイクログラム−時間／ｍｌ、 ２９．３９±１２．１５ｍｌ／時間／ｋｇ、０．１３２±０．０２９ ｌ／ｋｇ であるのに比較して、低ＰＨ製剤では、ＡＵＣ、Ｃｌｔ及びＶｓｓが、それぞれ ７９５．３４±２７８．７８マイクログラム−時間／ｍｌ、２７．８０±８．６ ５ｍｌ／時間／ｋｇ、０．１１０±０．０３５ ｌ／ｋｇであった。高ｐＨグル ープにおける全ゲンタマイシンのＭＲＴ及びＴ１／２は、低ｐＨグループのもの よりも長かった（Ｐ＜０．０５）（それぞれ、４．７９±１．３９時間及び５． ０４±１．９１時間対３．７２±０．７９時間及び４．１０±１．１５時間）。 遊離ゲンタマイシン画分は、高ｐＨグループでは、Ｃｍａｘ及びＡＵＣｌａｓｔ 値が、それぞれ５７．３１及び２９．００マイクログラム／ｍｌ、４４．３９± ６．７７８マイクログラム−時間／ｍｌであるのに比較して、低ｐＨグループで は、それぞれ１１５．６７±５１．４２マイクログラム／ｍｌ、９０．８４２± ５１．４２マイクログラム−時間／ｍｌであり、低ｐＨグループの方が多かった 。尿中に排泄された投与ゲンタマイシンの割合（％）は、低ｐＨ、高ｐＨグルー プで、それぞれ８１．５８±１０．９６、７６．１６±１１．８１であった。最 終排泄速度（β）は、高ｐＨ処置グループの方が著しく低く（高ｐＨ製剤と低ｐ Ｈ製剤では、それぞれ０．０１７±０．００４／時間対０．０２１±０．００５ ／時間）、これに対応して半減期も長かっ た（高ｐＨグループと低ｐＨグループでは、それぞれ４３．３１±１３．２６時 間対３５．１１±９．９６時間）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 エドガリー−プフルグ，ローラ アメリカ合衆国 ニュージャージー州 08884，スポッツウッド，ワイオミングア ベニュー 266 (72)発明者 ボニ，ローレンス アメリカ合衆国 ニュージャージー州 08852，モンマウスジャンクション，ヘム ロックコート 1010

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）脂質及び水と混合しない溶剤を含む有機相と水性相とを、水性相に対 する有機相の容量比が３：１より小さくなるように一緒にすること、及び （ｂ）一緒にされた相を、リポソームを製造するのに十分な混合速度、不活性ガ ス流量及び反応温度を含む処理条件下にて、反応容器内で処理すること からなるリポソームの製造方法。 ２．水性相に対する有機相の容量比が、０．２：１から１．０：１である特許請 求の範囲１の方法。 ３．一緒にされた相のｐＨを、脂質に適合した水準に調整することを含む特許請 求の範囲１の方法。 ４．一緒にされた相のｐＨが、５．５から７．５である特許請求の範囲３の方法 。 ５．一緒にされた相のｐＨが、６．５である特許請求の範囲４の方法。 ６．リポソームが、マルチラメラリポソームである特許請求の範囲１の方法。 ７．その水性区画に取り込まれた溶質を含み、マルチラメラリポソームの各区画 内の溶質の濃度が実質的に等しい特許請求の範囲６のマルチラメラリポソーム。 ８．生物活性剤をリポソームに結合させることを更に含む特許請求の範囲１の方 法。 ９．生物活性剤が、アミノグリコシド抗生物質である特許請求の範囲１の方法。 １０．アミノグリコシド抗生物質が、ゲンタマイシン、ストレプトマイシン、ジ ヒドロストレプトマイシン、トブラマイシン、ネオマイシンＢ、パロマイシン、 リボスタマイシン、リビドマイシン、カナマイシン、バイオマイシン、シソマイ シン、ネチルマイシン及びアミカシンからなる群から選ばれる特許請求の範囲９ の方法。 １１．アミノグリコシド抗生物質が、ゲンタマイシンである特許請求の範囲１０ の方法。 １２．合わされた相を、式（１）による混合速度、不活性ガス流量及び反応温度 を含む処理条件下にて、反応容器内で処理することを更に含む特許請求の範囲１ の方法。 ｙ＝Ｂ₀＋Ｂ₁Ｘ₁＋Ｂ₂Ｘ₂＋Ｂ₃Ｘ₃＋Ｂ₁₂Ｘ₁Ｘ₂＋Ｂ₁₃Ｘ₁Ｘ₃＋Ｂ₂₃Ｘ₂Ｘ₃＋ Ｂ₁₁Ｘ² ₁＋Ｂ₂₂Ｘ² ₂＋Ｂ₃₃Ｘ² ₃ （１） ここで、 ｙ＝目的とする平均粒径 Ｘ₁＝混合速度 Ｘ₂＝不活性ガス流量 Ｘ₃＝反応温度 Ｂ₀＝定数 Ｂ₁＝混合速度の主効果の回帰係数 Ｂ₂＝不活性ガス流量の主効果の回帰係数 Ｂ₃＝反応温度の主効果の回帰係数 Ｂ₁₂＝混合速度と不活性ガス流量との間の相互作用の回帰係数 Ｂ₁₃＝混合速度と反応温度との間の相互作用の回帰係数 Ｂ₂₃＝不活性ガス流量と反応温度との間の相互作用の回帰係数 Ｂ₁₁＝混合速度の二次効果の回帰係数 Ｂ₂₂＝不活性ガス流量の二次効果の回帰係数 Ｂ₃₃＝反応温度の二次効果の回帰係数 １３．不活性ガス流量が、０．４リットル／分から１．２リットル／分である特 許請求の範囲１２の方法。 １４．反応温度が、２０℃から８０℃である特許請求の範囲１２の方法。 １５．混合速度が、２，０００ｒｐｍまでの範囲内である特許請求の範囲１２の 方法。 １６．（ａ）リポソームの目的とする平均粒径を選択すること、 （ｂ）式（１）による処理条件の関係に基づく処理条件のそれぞれの値を選択す ること、 （ｃ）工程（ｂ）で選択された値に基づいて、式（１）から計算された平均粒径 を求めること、 （ｄ）計算された平均粒径と目的とする平均粒径とを比較し、十分に近似してい れば、有機相と水性相を一緒にすること、及び （ｅ）工程（ｂ）で選ばれた処理条件下で、一緒にされた相を処理すること を更に含む特許請求の範囲１２の方法。 １７．残りの処理条件を一定に保ちながら、式（１）による該処理条件の少なく とも一つを変更することにより新しく計算された平均粒径を得ることを更に含む 特許請求の範囲１６の方法。 １８．混合速度と反応温度を一定に保ちながら、不活性ガス流量を変更すること を含む特許請求の範囲１７の方法。 １９．反応温度を一定に保ちながら、不活性ガス流量と混合速度を変更すること を更に含む特許請求の範囲１８の方法。 ２０．脂質の量が、一緒にされた相に対して、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌである 特許請求の範囲１の方法。 ２１．一緒にされた相が粘稠ゲルを形成した時点で、工程（ｂ）を終了すること を含む特許請求の範囲１の方法。 ２２．生物活性剤を粘稠ゲルと結合させることを更に含む特許請求の範囲２１の 方法。 ２３．特許請求の範囲２１の方法により製造されたゲル。 ２４．温血動物に特許請求の範囲２３のゲルを投与することからなる温血動物の 感染を治療又は予防する方法において、該ゲルが抗感染有効量の抗生物質を含み 、該投与が局所投与を含む方法。 ２５．抗生物質が、ゲンタマイシンである特許請求の範囲２４の方法。 ２６．生物活性剤、脂質を含む脂質二重層及び安定性を高めるｐＨを有する水溶 液を含む区画を含み、脂質が実質的に純粋な脂質である貯蔵安定性リポソーム。 ２７．リポソームが、マルチラメラリポソームである特許請求の範囲２６の貯蔵 安定性リポソーム。 ２８．マルチラメラリポソームが、その水性区画に取り込まれた溶質を含み、マ ルチラメラリポソームの各水性区画内の溶質の濃度が実質的に等しい特許請求の 範囲２７の貯蔵安定性リポソーム。 ２９．生物活性剤が、アミノグリコシド抗生物質である特許請求の範囲２６の貯 蔵安定性リポソーム。 ３０．アミノグリコシド抗生物質が、ゲンタマイシン、アミカシン、ストレプト マイシン、ジヒドロストレプトマイシン、トブラマイシン、ネオマイシン、カナ マイシン、リビドマイシン、パロマイシン、リボスタマイシン、バイオマイシン 、シソマイシン及びネチルマイシンからなる 群から選ばれる特許請求の範囲２９の貯蔵安定性リポソーム。 ３１．アミノグリコシド抗生物質が、ゲンタマイシンである特許請求の範囲３０ の貯蔵安定性リポソーム。 ３２．アミノグリコシド抗生物質が、アミカシンである特許請求の範囲３０の貯 蔵安定性リポソーム。 ３３．アミノグリコシド抗生物質が、トブラマイシンである特許請求の範囲３０ の貯蔵安定性リポソーム。 ３４．実質的に純粋な脂質は、純度が少なくとも８５％である特許請求の範囲２ ６の貯蔵安定性リポソーム。 ３５．実質的に純粋な脂質は、純度が少なくとも９０％である特許請求の範囲３ ４の貯蔵安定性リポソーム。 ３６．実質的に純粋な脂質は、純度が少なくとも９５％である特許請求の範囲３ ５の貯蔵安定性リポソーム。 ３７．脂質が、実質的にリソリピドを含まない特許請求の範囲２６の貯蔵安定性 リポソーム。 ３８．脂質が、５％未満のリソリピドを含む特許請求の範囲３７の貯蔵安定性リ ポソーム。 ３９．脂質が、２％未満のリソリピドを含む特許請求の範囲３８の貯蔵安定性リ ポソーム。 ４０．実質的に純粋な脂質が、リン脂質を含む特許請求の範囲２６の貯蔵安定性 リポソーム。 ４１．リン脂質が、卵ホスファチジルコリンである特許請求の範囲４０の貯蔵安 定性リポソーム。 ４２．脂質に対する生物活性剤の比（ｗ／ｗ）が、少なくとも１：２０である特 許請求の範囲２６の貯蔵安定性リポソーム。 ４３．脂質に対する生物活性剤の比（ｗ／ｗ）が、１：５から１：１５である特 許請求の範囲４２の貯蔵安定性リポソーム。 ４４．脂質に対する生物活性剤の比（ｗ／ｗ）が、１：１０である特許請求の範 囲４３の貯蔵安定性リポソーム。 ４５．水溶液が、生理食塩水である特許請求の範囲２６の貯蔵安定性リポソーム 。 ４６．安定性を高めるｐＨが、５．５から７．５である特許請求の範囲２６の貯 蔵安定性リポソーム。 ４７．安定性を高めるｐＨが、６．５である特許請求の範囲４６の貯蔵安定性リ ポソーム。 ４８．アミノグリコシド抗生物質、実質的に純粋な卵ホスファチジルコリン及び ｐＨが６．５の食塩水溶液を含有し、リポソームが、その水性区画に取り込まれ た溶質を含むマルチラメラリポソームであり、マルチラメラリポソームの各区画 内の溶質の濃度が実質的に等しく、実質的に純粋な卵ホスファチジルコリンが、 少なくとも８５％純度であり、実質的にリソホスファチジルコリンを含まず、Ｅ ＰＣに対するアミノグリコシド抗生物質の比（ｗ／ｗ）が、１：１５〜１：５で ある特許請求の範囲２６の貯蔵安定性リポソーム。 ４９．アミノグリコシド抗生物質が、ゲンタマイシンである特許請求の範囲４８ の貯蔵安定性リポソーム。 ５０．アミノグリコシド抗生物質が、アミカシンである特許請求の範囲４８の貯 蔵安定性リポソーム。 ５１．アミノグリコシド抗生物質が、トブラマイシンである特許請求の範囲４８ の貯蔵安定性リポソーム。