KR20110110086A

KR20110110086A - 리포솜의 제조방법 및 콜레스테롤의 용해방법

Info

Publication number: KR20110110086A
Application number: KR1020117003472A
Authority: KR
Inventors: 요시타카 시미즈; 야스히코 미베
Original assignee: 가부시키가이샤 바이오메드코어
Priority date: 2008-12-24
Filing date: 2009-12-24
Publication date: 2011-10-06
Also published as: JP4857392B2; JP2011256199A; US20110250262A1; AU2009331158A1; EP2368627A4; CA2735968A1; EP2368627A1; CN102137713A; WO2010074172A1; EA201170286A1; JPWO2010074172A1

Abstract

1종 이상의 지질과, 수혼화성 유기 용매를 포함하는 수용액을 혼합하는 제1혼합공정과, 상기 지질과 상기 수용액을 혼합한 혼합물을, 상기 지질이 상기 수용액 중에서 용해되는 온도까지 가열하는 가열공정과, 상기 가열공정 후에, 리포솜이 생성하는 온도까지 냉각하는 냉각공정을 포함하는 리포솜의 제조방법에 의해, 입자직경이 고른, 높은 봉입률의 리포솜을 용이하게 얻을 수 있다.

Description

리포솜의 제조방법 및 콜레스테롤의 용해방법{METHOD FOR PRODUCING LIPOSOME AND METHOD FOR DISSOLVING CHOLESTEROL}

본 발명은 리포솜의 제조방법 및 콜레스테롤의 용해방법에 관한 것이다.

리포솜은 지질분자에 의해 형성되는 적어도 하나의 지질 이중층에 의해 둘러싸인 대략 구형상의 중공 입자이다. 상기 지질분자는, 친수성을 갖는 친수기와 그 반대쪽에 있어서 친유성을 갖는 친유기를 구비하므로, 물에 접촉하면, 이중층을 형성해서, 친수기가 상기 이중층의 외측 및 상기 이중층에 의해 둘러싸인 내측을 향하고, 친유기가 상기 이중층의 층 내부를 향하여, 표면적을 최소한으로 하도록 구형상으로 된다.

리포솜을 형성하는 이중층은, 생체를 구성하는 세포막과 근사하기 때문에, 생체내 환경에 용이하게 받아들여진다. 최근, 이러한 성질을 이용해서, 리포솜은, 이중층으로 둘러싸인 영역에 봉입된 약제를, 생체내의 약제 필요부위까지 수송하는 약물 전달 시스템(Drug Delivery System: DDS)에 있어서의 약제용 소포(vesicle)로서 주목받아 있다. 그 밖의 용도로서, 리포솜은, 예를 들어, 화장료를 봉입하는 화장료용의 마이크로캡슐로서도 주목받아 있다.

리포솜의 제법에는, 역상 증발법, 초음파법, 압출법, 프렌치 프레스법, 균질화(homogenization)법, 에탄올 주입법, 탈수-재수화법 등의 각종 방법이 이용되고 있지만, 전형적인 제법의 하나에 Bangham법(박막법)이 있다. 이 제법은, 플라스크 등의 용기 내에 있어서 적어도 1종의 인지질을 클로로포름 등의 유기 용매에 용해시켜서, 해당 유기 용매를 휘발시켜서, 일단, 용기의 바닥부에 지질막을 형성한 후, 거기에 완충액 등의 수용액을 넣어 뒤섞어서, 리포솜을 포함하는 현탁액을 얻는 방법이다(A. D. Bangham et al., J. Mol. Biol., 13, 238-252(1965); A. D. Bangham and R. W. Horne, J. Mol. Biol., 8, 660-668(1964)).

또, 전형적인 리포솜의 공업적 제조법에 있어서, 수혼화성 유기 용매에 용해된 인지질 등의 지질성분을 교반하면서 수용액에 주입·첨가하는 방법이 있다. 여기서, 수혼화성 유기 용매에는, 메탄올, 에탄올, 아이소프로필알코올, 뷰탄올 등의 알코올류를 적합하게 채용할 수 있지만, 지질의 용해 상태를 유지하기 위해서 지질용액을 가온시키면서, 수용액에 첨가·혼합할 필요가 있고, 온도나 첨가 속도 혹은 교반 속도를 정밀하게 제어할 필요가 있다(일본국 특표2006-517594호 공보).

또한, 별도의 t-뷰탄올을 사용하는 프레리포솜의 제법도 보고되어 있다(일본국 특표평6-509547호 공보). 이 제법은 지질의 용해 용매로서, 20% 정도의 낮은 함유량으로 물을 함유하는 t-뷰탄올을 사용함으로써 실온 부근의 온도에서 지질을 용해시켜 둘 수 있기 때문에, 지질의 여과 멸균과 동결 건조를 행할 수 있다고 하는 이점이 있다.

그러나, 상기 종래의 제법 및 상기 제법에서 얻어진 리포솜에는, 다음과 같은 문제가 있다. 그것은, 리포솜의 입자직경이 균일한 것이 아니거나, 혹은 균일한 입자직경을 가지는 리포솜을 용이하게 제작하는 것이 어렵다는 것이다. 입자직경이 작은 것(Small Unilameller Vesicles: SUV)과 입자직경이 큰 것(Large Unilameller Vesicles: LUV)은, 각각 이용 가치가 있지만, 양자가 혼재하고 있으면, 이용 가치가 낮다. 따라서, 입도 분포를 보다 좁게 하기 위하여, 입도 분포가 넓은 리포솜을 세공을 가진 필터에 통과시키는 처리가 실시된다. 그러나, 이러한 처리를 채용하면, 특정한 필요 입도 분포를 갖는 리포솜의 수율이 저하한다고 하는 문제가 있다. 한편, 지질 이중막의 막강도를 높이기 위하여, 콜레스테롤을 지질 이중막에 편입시키는 방법이 알려져 있다. 그러나, 콜레스테롤은 일반적으로 수혼화성 유기 용매에 용해되기 어려운 지질이기 때문에, 콜레스테롤을 용해시키는 방법이 요구되고 있다.

본 발명은, 이러한 문제를 감안하여 이루어진 것으로서, 용이하게 입자 직경이 고른 리포솜을 얻을 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또, 본 발명은 콜레스테롤의 용해성을 높이는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들은, 예의 연구를 거듭한 결과, 1종 이상의 지질과, 수혼화성 유기 용매를 함유하는 수용액을 혼합하여, 그 혼합물을 가열하고 나서, 소정 온도까지 냉각시킴으로써, 입자직경이 고른 리포솜을 제조할 수 있다는 것을 발견하였다. 또, 콜레스테롤을, 인지질, 및 수혼화성 유기 용매를 포함하는 수용액과 혼합하고, 가열함으로써, 콜레스테롤을 상기 수용액 중에서 용이하게 용해시킬 수 있다는 것을 발견하였다. 이와 같이 해서, 본 발명자는 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명의 리포솜 제조방법은, 1종 이상의 지질과, 물과, 유기 용매를 함유하는 혼합물을 가열하는 가열공정과, 상기 가열공정 후에, 상기 혼합물을 냉각하는 냉각공정을 포함한다.

상기 혼합물은, 예를 들어, 상기 지질과, 수혼화성 유기 용매를 포함하는 수용액을 혼합한 혼합물이다.

상기 수용액은, 전체 용량에 대해서 5 내지 30체적%의 상기 수혼화성 유기 용매를 포함하는 것이 바람직하다.

상기 수혼화성 유기 용매로서는, t-뷰탄올, 1-프로판올, 2-프로판올 및 2-뷰톡시에탄올로부터 선택된 1 또는 2종 이상의 유기 용매 등을 이용할 수 있다.

또, 본 발명의 콜레스테롤의 용해방법은, 콜레스테롤을, 인지질, 물 및 유기 용매와 혼합한 혼합물을 가열하는 공정을 포함한다.

또한, 본 발명의 콜레스테롤의 용해방법은, 콜레스테롤을, 인지질, 및 수혼화성 유기 용매를 포함하는 수용액과 혼합한 혼합물을 가열하는 공정을 포함한다.

상기 수용액은 전체 용량에 대해서 5 내지 30체적%의 상기 수혼화성 유기 용매를 포함하는 것이 바람직하다.

또, 본 발명의 리포솜 제조에 이용이 가능한 유기 용매의 선택 방법은, 후보로 되는 유기 용매를 이용해서 상기 리포솜의 제조방법에 의해 리포솜을 제조하는 공정과, 상기 리포솜이 균일한지의 여부를 검사하는 공정을 포함한다.

<관련 출원에 대한 교차 참조>

본 출원은 2008년 12월 24일자로 출원한 일본국 특허출원 제2008-328724호에 의거하는 우선권을 주장한다. 이 문헌을 본 명세서에 원용한다.

본 발명에 의하면, 용이하게 입자직경이 고른 리포솜을 얻을 수 있는 방법을 제공할 수 있다. 또, 본 발명에 의하면, 콜레스테롤의 용해성을 높이는 방법을 제공할 수 있다.

도 1은 본 발명의 실험예에 있어서, t-BuOH(t-뷰탄올)의 농도가 16vol%인 조건에서 제작한 리포솜 현탁액의 입도분포차트;
도 2는 본 발명의 일 실시예에 있어서, DPPC(다이팔미토일포스파티딜콜린), 콜레스테롤 및 스테아릴 아민을 이용해서 각 수혼화성 유기 용매를 포함하는 수용액에서 리포솜 현탁액을 제작했을 때의 각 입도분포결과를 각각 나타낸 도면;
도 3은 본 발명의 일 실시예에 있어서, DPPC, 콜레스테롤 및 DPPG(다이팔미토일포스파티딜글라이세롤)를 이용해서 각 수혼화성 유기 용매를 포함하는 수용액에서 리포솜 현탁액을 제작했을 때의 각 입도분포결과를 각각 나타낸 도면.

다음에 본 발명의 리포솜의 제조방법 및 콜레스테롤의 용해방법의 바람직한 실시예에 대해서 설명한다. 또, 콜레스테롤의 용해방법의 실시예에 대해서는, 리포솜의 제조방법의 실시형태 중에서 설명한다.

(1) 리포솜

리포솜에는, 그 소포 내부에 약제 등의 생리활성물질을 포함하지 않는 빈 리포솜(Empty-Liposome) 및 생리활성물질을 내포하는 리포솜이 포함된다. 또, 리포솜에는, 한 겹의 지질 이중막으로 이루어진 비교적 입자가 작은 소포(Small Unilameller Vesicles: SUV), 한 겹의 지질 이중막으로 이루어진 비교적 입자가 큰 소포(Large Unilameller Vesicles: LUV) 외에, 복수의 막으로 이루어진 소포(Multi-Lameller Vesicles: MLV)도 포함된다. 리포솜은, 어떠한 크기의 것을 포함하고 있어도 되지만, 평균 입자직경이 50 내지 2000㎚인 것이 바람직하고, 평균 입자직경이 100 내지 700㎚인 것이 특히 바람직하다. 여기에 말하는 「입자직경」은, 동적 광산란에 의해서 측정된 입자의 직경을 의미한다. 또, 바람직한 다분산지수(PDI)는 0.3 이하이다.

리포솜의 내부에 봉입될 수 있는 생리활성물질로서는 각종 약제, 화장료 등을 채용할 수 있다. 그들의 일례를 들면, 시스플라틴이나 5-플루오로유라실 등을 포함하는 항암제 외에, 항산화제, 항균제, 항염증제, 혈행 촉진제, 노화방지제, 호르몬제, 비타민제, 헤모글로빈, DNA, RNA, 펩티드, 단백질, 백신, 발모제, 보습제, 색소류, 미백제, 안료, 생리식염수, 물의 1 또는 2종 이상의 조합 등이 있다. 단, 생리활성물질은 상기 예시한 것으로 한정되지 않는다. 또한, 리포솜의 표면을 작용기 등으로 수식해도 된다. 이러한 작용기에 의한 수식은, 인지질 등에 미리 작용기를 결합시키거나, 혹은 리포솜 형성 후에 작용기를 결합시킴으로써 실현된다.

(2) 리포솜의 제조방법

본 실시예에 따른 리포솜의 제조방법은, 1종 이상의 지질과, 수혼화성 유기 용매를 포함하는 수용액을 혼합한 혼합물을 가열하는 가열공정과, 가열공정 후에 혼합물을 냉각하는 냉각공정을 포함하는 한, 공지의 제조방법을 응용해도 된다. 보다 구체적으로는, 리포솜의 입자직경을 조절하기 위해서, 초음파 조사법, 압출법, 프렌치 프레스법, 균질화법 등을 본 발명의 방법에 조합시켜도 된다.

본 발명의 리포솜의 제조에 있어서는, 대두 레시틴, 수소 첨가 대두 레시틴, 난황 레시틴, 포스파티딜콜린류, 포스파티딜세린류, 포스파티딜에탄올아민류, 포스파티딜이노시톨류, 포스파스핑고미엘린류, 포스파티딘산류, 장쇄 알킬 인산염류, 강글리오사이드류, 당지질류, 포스파티딜글라이세롤류, 스테롤류 등의 1 또는 2종 이상의 지질을 이용할 수 있다. 포스파티딜콜린류로서는, 다이미리스토일포스파티딜콜린, 다이팔미토일포스파티딜콜린, 다이스테아로일포스파티딜콜린 등을 예시할 수 있다. 포스파티딜세린류로서는, 다이팔미토일포스파티딜세린, 다이팔미토일포스파티딜세린 나트륨, 소뇌 유래의 포스파티딜세린 나트륨 등을 예시할 수 있다. 포스파티딜에탄올아민류로서는, 다이미리스토일포스파티딜에탄올아민, 다이팔미토일포스파티딜에탄올아민, 다이스테아로일포스파티딜에탄올아민 등을 예시할 수 있다. 포스파티딜이노시톨류로서는, 소맥 유래의 포스파티딜이노시톨 나트륨 등을 예시할 수 있다. 포스파스핑고미엘린류로서는, 소뇌 유래의 스핑고미엘린 등을 예시할 수 있다. 포스파티딘산류나 장쇄 알킬 인산염류로서는, 다이미리스토일포스파티딘산, 다이팔미토일포스파티딘산, 다이스테아로일포스파티딘산, 다이세틸 인산 등을 포함한다. 강글리오사이드류는, 강글리오사이드 GM1, 강글리오사이드 GD1a, 강글리오사이드 GT1b 등을 예시할 수 있다. 당지질류로서는, 갈락토실세라마이드, 글루코실세라마이드, 락토실세라마이드, 포스파티드, 글로보시드 등을 예시할 수 있다. 포스파티딜글라이세롤류로서는, 다이미리스토일포스파티딜글라이세롤, 다이팔미토일포스파티딜글라이세롤, 다이스테아로일포스파티딜글라이세롤 등을 예시할 수 있다. 스테롤류로서는 콜레스테롤, 다이하이드로콜레스테롤, 라노스테롤, 다이하이드로라노스테롤, 시토스테롤, 칸페스테롤, 스티그마스테롤, 브라시카스테롤(brassicasterol), 엘고스테롤, 및 이들의 혼합물인 피토스테롤 및 수소 첨가 피토스테롤, 또한, 3β-[N-(다이메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤, N-(트라이메틸암모니오에틸)카바모일 콜레스테롤과 같은 양성 하전을 가진 스테롤류 등을 예시할 수 있다. 리포솜을 구성하는 지질로서 바람직한 것은, 인을 포함하는 인지질과, 콜레스테롤과의 조합이다. 특히, 인지질의 일종인 포스파티딜콜린류와 콜레스테롤과의 조합이 보다 바람직하다. 인지질과 콜레스테롤을 이용해서 리포솜을 제조할 경우, 인지질과 콜레스테롤과의 몰비는 1:0 내지 1:1.5의 범위 내인 것이 바람직하고, 1:0.5 내지 1:1.25의 범위 내인 것이 보다 바람직하다.

수혼화성 유기 용매는, 알코올류, 에터류, 에스터류, 케톤류, 아세탈류 등의 물에 혼합가능한 유기 용매를 의미한다. 수혼화성 유기 용매로서는, t-뷰탄올, 1-프로판올, 2-프로판올 및 2-뷰톡시에탄올로부터 선택된 1 또는 2종 이상의 유기 용매를 이용하는 것이 바람직하다. 혼합 방법은, 수동에 의한 요동, 교반자, 교반날개를 이용한 교반 외에, 초음파 진동기 등을 이용해서 행할 수 있다.

상기 수용액에 있어서의 수혼화성 유기 용매의 농도로서는, 지질조성과 지질농도에 의존한 최적의 농도영역을 선택하지 않으면 안된다. 수혼화성 유기 용매의 농도를 높게 하면 지질의 용해성이 높게 되지만, 리포솜은 형성되지 않게 되기 때문이다. 또, 동시에 수혼화성 유기 용매가 잔류하기 쉬워지므로, 생체 내에 리포솜을 공급했을 경우에 생체에 있어서 바람직하지 못하다. 따라서, 수혼화성 유기 용매는, 1종 이상의 지질과 수용액을 혼합한 혼합물을 가열했을 때 지질을 용해시킬 수 있는 최저농도인 것이 바람직하다. 구체적으로는, 수혼화성 유기 용매는, 수용액 전체 용량에 대해서 5 내지 30체적%로 하는 것이 바람직하다. 수혼화성 유기 용매가 t-뷰탄올일 경우, 수용액 전체 용량에 대해서 12 내지 18체적%인 것이 특히 바람직하다. 수혼화성 유기 용매가 1-프로판올일 경우, 수용액 전체 용량에 대해서 5 내지 19체적%인 것이 특히 바람직하다. 수혼화성 유기 용매가 2-프로판올일 경우, 수용액 전체 용량에 대해서 13 내지 26체적%인 것이 특히 바람직하다. 수혼화성 유기 용매가 2-뷰톡시에탄올일 경우, 수용액 전체 용량에 대해서 6 내지 9체적%인 것이 특히 바람직하다.

또한, 상기 수혼화성 유기 용매는 미리 상기 수혼화성 유기 용매 농도로 조제된 수용액을 지질에 첨가해도 되고, 지질에 수혼화성 유기 용매를 첨가해서 일단 지질성분을 용해시킨 후 상기 농도로 되도록 물 용매를 첨가해도 된다.

가열방법은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 용기를, 온수를 넣은 욕조 내에 넣는 온욕 외에, 용기 내에 혼합물을 넣은 상태에서 해당 용기를 직화로 가열하는 방법, 용기를 전열기 내에 넣는 방법 등을 채용할 수 있다. 가열온도는, 지질이 수혼화성 유기 용매를 포함하는 수용액에 용해되는 온도 혹은 해당 온도 이상으로서 수용액이 백탁되지 않는 온도이면, 특정 온도로 한정되는 것은 아니다. 가열온도로서는, 지질의 종류, 지질의 농도, 수혼화성 유기 용매의 종류 등에 따라서 다르지만, 일반적으로 62 내지 80℃의 범위, 특히 65 내지 72℃의 범위가 바람직하다. 단, 수혼화성 유기 용매로서 t-뷰탄올을, 지질로서 포스파티딜콜린 및 콜레스테롤을 각각 이용한 경우에는, 가열온도는 62 내지 72℃의 범위인 것이 바람직하다.

냉각 방법은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 용기를, 냉수를 넣은 욕조 내에 넣는 방법 외에, 용기 내에 혼합물을 넣은 상태에서 해당 용기를 냉장고 등에 넣는 방법 등을 채용할 수 있다. 냉각 온도는, 가열온도보다 낮고, 리포솜이 생성되는 온도이면 한정되는 것은 아니다. 일례를 들면, 지질에 포스파티딜콜린과 콜레스테롤을 이용했을 경우에는, 냉각 온도로서는, 62℃ 이하로 하는 것이 바람직하다. 특히, 72℃ 이상으로 가열한 후에, 62℃ 이하로 냉각하는 것이 바람직하다. 또한, 냉각 속도로서는 0.5℃/min 이상이 바람직하고, 또한, 1℃/min 이상이 바람직하다.

지질과 수혼화성 유기 용매를 포함하는 수용액을 혼합할 때, 침투압 조정제로서, 이당류, 다당류 등의 당을 가해도 된다. 바람직한 당은, 이당류의 수크로스이다. 수크로스는 수용액의 형태로 수혼화성 유기 용매를 포함하는 수용액과 섞어서 사용할 수도 있다. 그 경우, 수크로스 수용액의 바람직한 농도는 5 내지 70wt/vol%이며, 보다 바람직한 농도는 8 내지 50wt/vol%이다.

본 발명의 리포솜의 제조에 있어서, 리포솜 현탁액의 입도를 더욱 균일한 것으로 하기 위하여, 공지의 정립(整粒) 수단을 병용해도 된다. 예를 들어, 리포솜 현탁액을, 가스압에서 특정 구멍 직경의 막에 통과시키고, 바람직한 구멍 직경의 리포솜을 제작해도 된다. 상기 특정 구멍 직경의 막을 통과시키는 처리는 1회 혹은 복수회 행해도 된다.

(3) 콜레스테롤의 용해방법( 수혼화성 유기 용매를 함유하는 수용액에 대한 콜레스테롤의 용해량을 증대시키는 방법)

지질의 일종인 콜레스테롤은, 통상, 물에 녹기 어려워, 전술한 수혼화성 유기 용매에 용해되는 비율이 낮다. 그러나, 전술한 수혼화성 유기 용매를 함유하는 수용액에 인지질을 공존시키면, 가열에 의해 콜레스테롤이 용해되기 쉬워진다. 구체적으로는, 인지질과 콜레스테롤을, 전술한 수용액에 혼합한 혼합물을 가열하면, 콜레스테롤을 수용액 중에 용이하게 용해시킬 수 있다.

가열온도는, 콜레스테롤이 인지질, 수혼화성 유기 용매 등을 함유하는 수용액에 용해되는 온도 혹은 해당 온도 이상으로서 수용액이 백탁되지 않는 온도이면 된다. 예를 들어, 수혼화성 유기 용매로서 t-뷰탄올을, 인지질로서 L-α-다이팔미토일포스파티딜콜린을 각각 이용한 경우에는, 62 내지 72℃의 온도에서, 콜레스테롤을 수용액 중에 충분히 용해시킬 수 있다. 콜레스테롤은, 인지질 1몰(㏖)에 대해서 0.8 내지 1.5몰의 범위 내이면, 보다 용해되기 쉽다. 62 내지 72℃의 온도 범위에서는, 콜레스테롤은 t-뷰탄올을 함유하는 수용액에 용해되어, 액 전체가 투명하다. 그 온도보다 냉각하여, 혼합액의 온도가 62℃보다 낮아지면, 백탁되어서, 인지질과 콜레스테롤의 조성을 가지는 리포솜의 현탁액이 형성된다. 반대로, 72℃보다 온도가 높아도, 혼합액은 흰 현탁액으로 된다.

(4) 사용할 수 있는 유기 용매의 선택방법

이상과 같은 제조방법에 의해서, 입자직경이 고른 리포솜을 얻을 수 있다. 그러나, 유기 용매에 따라서는 적용할 수 없는 것도 있다. 그래서, 후보로 되는 유기 용매를 이용해서 상기의 리포솜의 제조방법에 의해서 리포솜을 제조하고, 제조된 리포솜이 균일한지의 여부를 검사함으로써, 이 제조방법에서 사용할 수 있는 유기 용매인지의 여부를 판정하여, 실제로 적용가능한 유기 용매를 선택할 수 있다.

실시예

이하에, 본 발명의 실시예에 대해서 설명하지만, 본 발명은 하기의 실시예로 하등 한정되는 것은 아니다.

1. 리포솜의 원료

a) 인지질

니찌유 주식회사(日油株式會社) 제품인 L-α-다이팔미토일포스파티딜콜린(DPPC)을 이용하였다.

b) 콜레스테롤

시그마(SIGMA)사 제품인 콜레스테롤(Chol.)을 이용하였다.

c) 안정화제

와코쥰야쿠코교 주식회사 제품의 수크로스를 이용하였다.

d) 수혼화성 유기 용매

와코쥰야쿠코교 주식회사 제품인 t-뷰탄올(t-BuOH: 특급), 와코쥰야쿠코교 주식회사 제품인 1-프로판올(특급), 와코쥰야쿠코교 주식회사 제품인 2-프로판올(특급), 와코쥰야쿠코교 주식회사 제품인 2-뷰톡시에탄올(특급)을 이용하였다.

e) a) 및 b) 이외의 지질

DPPG(다이팔미토일포스파티딜글라이세롤), DPPE(다이팔미토일포스파티딜에탄올아민) 및 HSPC(Hydrogenated soy phosphatidylcholine)은 니찌유 주식회사에서 구입하였다. 스테아릴아민(SA) 및 DCP(다이세틸포스페이트)는 와코쥰야쿠코교 주식회사 및 시그마사에서 각각 구입하였다.

2. 리포솜의 입도분포측정법

리포솜의 입도분포의 측정은 동적광산란에 의한 입도분포계(마루반사 제품, ZETA SIZER Nano-ZS)를 이용해서 행하였다. 후술하는 실험예에 있어서 조제된 리포솜은, 인산 완충화 생리식염수(PBS)로 희석하고 나서 측정하였다. 희석 배율은 5000 내지 10000배 정도로 하였다. ZETA SIZER Nano-ZS에 의한 측정치는, 평균 입자직경 Z-평균(d.㎚)으로서 산출되고, 동시에 산출되는 다분산지수(PDI)의 값을 지표로 해서 리포솜의 입도분포의 균일성을 평가하였다.

또한, 상기 입도분포계의 「결과 품질」에 표시되는 측정 결과를, 균일한 입도분포를 가지는 리포솜이 생성된 것인지의 여부의 판단 기준으로 하였다. 즉, 마루반사의 입자직경측정의 품질판정기준을 충족시킬 경우, 「결과 품질」은 「양호」로 표시된다. 측정 결과가 「양호」를 나타내지 않은 경우에는 동적광산란에 적합하지 않은 입도분포가 불균일한 샘플인 것으로 판단하였다.

3. 실험예

3.1: 인지질 및 콜레스테롤의 용해 온도범위의 검토

380㎎의 DPPC 및 200㎎의 콜레스테롤을 유리바이알 중에 칭량하고, 20㎖의 10wt/vol% 수크로스 및 4.25㎖의 t-BuOH의 혼합액을 첨가하였다. 이 바이알을 항온조 중에서 80℃로 보온하면서 10분간 교반하였다. 80℃에 있어서의 용액은 백탁 상태였다. 다음에, 교반을 계속하면서 항온조의 보온을 멈추고, 실온 하에서 자연냉각을 행하였다. 항온조의 수온은, 80℃부터 35℃까지 냉각되는 데 약 90분간을 요하였다. 80℃에 있어서의 용액은 백탁 상태였지만, 72℃ 부근에서 용액은 조금 옅은 투명 상태로 되어 62℃ 부근까지 그 투명상태를 유지하였다. 62℃ 부근에서부터 용액은 백탁되기 시작하여, 58℃에서 완전하게 백탁 상태로 되었다. 이상의 상태 변화는 가역적이며, 실온에서부터 단계적으로 승온시킨 경우에도 마찬가지 상태변화가 관찰되었다.

3.2: 인지질 단독 및 콜레스테롤 단독의 용해 유무의 검토

75.9㎎의 DPPC 혹은 40㎎의 콜레스테롤을 각각 유리 바이알 중에 칭량하고, 각각의 유리 바이알 중에 4㎖의 10 wt/vol% 수크로스와 0.85㎖의 t-BuOH의 혼합액을 첨가하고, 3.1과 마찬가지의 실험을 행하였다. DPPC만을 이용했을 경우에는, 80℃에서부터 50℃까지의 사이에 수용액은 투명상태였다. 48℃ 부근에서 조금 옅은 투명액 상태로 되어 약 35℃까지 그 상태를 유지하고, 약 35℃에서부터 급격하게 백탁 상태로 되었다. 한편, 콜레스테롤만을 이용했을 경우에는, 어느 쪽의 온도에 있어서도, 바이알 벽에 부착된 콜레스테롤의 응집 덩어리가 확인되어, 투명상태로는 되지 않았다.

3.3: t- BuOH 의 농도의 검토

유리 바이알 중에 32.7㎎의 DPPC와 17.2㎎의 콜레스테롤을 첨가하였다. 이 지질 혼합물에, 표 1에 나타낸 용량비로 t-BuOH과 2㎖의 50% 수크로스 용액을 혼합 후, 순수를 첨가해서 최종 용적 10㎖로 함으로써, t-BuOH의 농도를 여러 가지로 변화시킨 용액을 조제하였다.

각 바이알을 90℃의 온욕 중에서 10분간 교반 후, 온욕으로부터 꺼내어, 실온 하에서 교반 냉각하였다. 냉각 후, 생긴 리포솜 현탁액의 일부를 분취해서 PBS(혹은 10wt/vol% 수크로스)로 희석시키고, ZETA SIZER Nano-ZS에 의한 입도분포측정을 행하였다. 그 결과를 표 2에 나타낸다. 또, 일례로서, 도 1에 t-BuOH의 농도가 16vol%인 조건에서 제작한 리포솜 현탁액의 입도분포차트를 나타낸다. 표 2 중, 별표(*)는 마루반사의 입자직경측정의 품질판정기준을 충족시키지 않는 불균일한 입자인 것을 나타낸다.

표 2 및 도 1에 나타낸 바와 같이, t-BuOH의 농도 12 내지 18vol%의 범위에 있어서, 특히, 입자직경이 극히 균일한 리포솜을 제작할 수 있었다.

3.4: 1- 프로판올 , 2- 프로판올 , 2- 뷰톡시에탄올 등의 농도의 검토

t-BuOH을 1-프로판올, 2-프로판올 또는 2-뷰톡시에탄올로 변경한 이외에는, 3.3과 마찬가지 방법에 의해, 바람직한 수혼화성 용매의 농도 범위를 조사하였다. 그 결과를 표 3 내지 5에 나타낸다.

표 3 내지 표 5에 나타낸 바와 같이, 1-프로판올은 5 내지 19vol%의 범위 내에서, 2-프로판올은 13 내지 26vol%의 범위 내에서, 2-뷰톡시에탄올은 6 내지 9vol%의 범위 내에서, 입자직경이 극히 균일한 리포솜을 제작할 수 있었다.

3.5: 지질의 조성의 변화에 의한 검토(1)

75.9㎎의 DPPC, 40.0㎎의 콜레스테롤 및 14.3㎎의 스테아릴 아민 또는 0.772㎎의 DPPG를 각 바이알에 가하였다. 그 후, 각 바이알에, 17vol%의 t-BuOH을 포함하는 10wt/vol% 수크로스 용액, 17vol%의 1-프로판올을 포함하는 10wt/vol% 수크로스 용액, 25vol%의 2-프로판올을 포함하는 10wt/vol% 수크로스 용액, 또는 8vol%의 2-뷰톡시에탄올을 포함하는 10wt/vol% 수크로스 용액을 각각 4.85㎖ 첨가하였다. 각 바이알을 70℃의 온욕 중에서 30분간 교반하고, 교반하면서 실온 하에서 냉각하였다. 냉각 후, 리포솜 현탁액의 일부를 분취하여, PBS로 희석해서 ZETA SIZER Nano-ZS에 의한 입도분포측정을 행하였다. 그 결과를 표 6 내지 표 7 및 도 2 내지 도 3에 나타낸다. 또한, 리포솜 현탁액을 PBS로 희석하고, 원심분리에 의해 리포솜을 침전시켜서 상등액을 PBS로 치환하였다(원심세정). 원심세정을 3회 반복함으로써, 리포솜 분산액을 PBS로 치환하는 동시에, 수혼화성 유기 용매 및 리포솜 외의 수크로스를 제거하였다. 그것으로부터, 리포솜 현탁액의 콜레스테롤 정량을 행한 후, 리포솜 내에 봉입 유지된, 리포솜의 조제에 이용한 당(수크로스)의 함량을 페놀 황산법으로 측정하였다. 또한, 표 중의 당 봉입률은 식: (원심세정 후의 당농도와 콜레스테롤 농도의 비교)/(원심세정 전의 당농도와 콜레스테롤 농도의 비교)에 의해 구하였다.

표 6 내지 표 7 및 도 2 내지 도 3에 나타낸 바와 같이, t-BuOH과 2-뷰톡시에탄올을 수혼화성 유기 용매로서 이용한 경우, 리포솜은 같은 정도의 입자직경에서, 당 봉입률도 같은 정도였다. 특히 t-BuOH을 사용한 경우에는, 리포솜 조제 시 이용한 수크로스(당)가 40% 이상이라고 하는 매우 높은 효율로 리포솜에 봉입되어 있었다. 이것은, 리포솜 조제 시의 용액 중에 봉입해야 할 물질을 용해시켜 두면, 수크로스와 마찬가지로 매우 높은 효율로 리포솜 내에 물질이 봉입되는 것을 강하게 시사하고 있다.

3.6: 지질의 조성의 변화에 의한 검토(2)

76㎎의 DPPC 및 40㎎의 콜레스테롤을 바이알에 가한 후, 4㎖의 10wt/vol% 수크로스 용액과 0.85㎖의 t-BuOH을 가하여, 혼합액(1)을 조제하였다. 76㎎의 DPPC, 40㎎ 또는 30㎎의 콜레스테롤 및 0.77㎎의 DPPG을 바이알에 첨가한 후, 4㎖의 10wt/vol% 수크로스 용액과 0.85㎖의 t-BuOH을 가하여, 혼합액(2) 및 (3)을 조제하였다. 67.7㎎의 DPPC, 40.6㎎의 콜레스테롤, 9.1㎎의 DPPE 및 7.3㎎의 DCP를 바이알에 가한 후, 4㎖의 10wt/vol% 수크로스 용액과 0.85㎖의 t-BuOH을 가하여, 혼합액(4)를 조제하였다. 76㎎의 DPPC, 40㎎의 콜레스테롤 및 14.3㎎의 SA를 바이알에 가한 후, 4㎖의 10wt/vol% 수크로스 용액과 0.85㎖의 t-BuOH을 가하여, 혼합액(5)를 조제하였다. 76㎎의 HSPC 및 40㎎의 콜레스테롤을 바이알에 가한 후, 4㎖의 10wt/vol% 수크로스 용액과 0.85㎖의 t-BuOH을 가하여, 혼합액(6)을 조제하였다. 각 바이알을 70℃의 온욕 중에서 30분간 교반하고, 교반하면서 실온 하에서 냉각하였다. 냉각 후, 리포솜 현탁액의 일부를 분취하여, PBS로 희석해서 ZETA SIZER Nano-ZS에 의한 입도분포측정을 행하여, 리포솜의 평균 입도를 구하였다. 그 결과를 표 8에 나타낸다.

그 결과, 지질의 조성에 의해 평균 입도가 다른 것이 명확하게 되었다.

3.7: 냉각 속도의 검토

1.75㎖의 t-BuOH, 2㎖의 50% 수크로스 수용액, 최종 용량이 10㎖로 되도록 순수를 첨가하여, 17.5vol% 의 t-BuOH을 포함하는 용액을 조제하였다. 이어서, 유리바이알 중에 32.7㎎의 DPPC와 17.2㎎의 콜레스테롤을 가하였다. 이 지질혼합물에 17.5vol%의 t-BuOH을 함유하는 용액을 2㎖ 첨가하였다. 상기 바이알을 항온조(water bath) 중에서 70℃로 보온하면서 10분간 교반하였다. 그 후, 상기 바이알을 50℃, 40℃ 및 30℃의 항온조에 옮기고, 냉각 속도: 1℃/min 이상에서 냉각하였다. 50℃, 40℃ 및 30℃가 된 시점에서 리포솜 현탁액의 일부를 각각 분취하여, PBS로 희석해서, ZETA SIZER Nano-ZS에 의한 입도분포측정을 행하였다. 또, 비교를 위하여, 상기와 같은 지질혼합물에, 17.5vol%의 t-BuOH을 함유하는 용액을 2㎖ 첨가한 바이알을 항온조 중에서 80℃로 보온하면서 10분간 교반하고, 교반을 계속하면서 항온조의 보온을 멈추고, 실온 하에서 자연냉각을 행하였다. 80℃에서부터 35℃까지의 냉각에 90분을 요하였다(냉각 속도:0.5℃/min). 35℃로 된 시점에서 리포솜 현탁액의 일부를 분취해서, PBS로 희석하여, ZETA SIZER Nano-ZS에 의한 입도분포측정을 행하였다. 그 결과를 표 9에 나타낸다.

표 9에 나타낸 바와 같이, 급랭으로 50℃, 40℃ 및 30℃까지 냉각시킨 리포솜 현탁액 중의 리포솜은 평균 입자직경 약 500nm의 매우 균일한 입자직경을 지니고 있었다. 한편, 자연 냉각에서 처리를 행한 리포솜 현탁액 중의 리포솜은, 상기 3종의 리포솜에 비교하면, 입자직경의 균일성은 낮았다.

본 발명에 의해 제조된 리포솜은, 예를 들어, DDS, 화장료용의 마이크로캡슐 등에 이용가능하다.

Claims

1종 이상의 지질과, 물과, 유기 용매를 포함하는 혼합물을 가열하는 가열공정; 및
상기 가열공정 후에, 상기 혼합물을 냉각하는 냉각공정을 포함하는, 리포솜의 제조방법.

제1항에 있어서, 상기 혼합물은 상기 지질과, 수혼화성 유기 용매를 포함하는 수용액을 혼합한 혼합물인 것을 특징으로 하는, 리포솜의 제조방법.

제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 수용액은, 전체 용량에 대해서 5 내지 30체적%의 상기 수혼화성 유기 용매를 포함하는 것인, 리포솜의 제조방법.

제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수혼화성 유기 용매는 t-뷰탄올, 1-프로판올, 2-프로판올 및 2-뷰톡시에탄올로부터 선택된 1 또는 2종 이상의 유기 용매를 포함하는 것인, 리포솜의 제조방법.

콜레스테롤을, 인지질, 및 수혼화성 유기 용매를 포함하는 수용액과 혼합한 혼합물을 가열하는 공정을 포함하는, 콜레스테롤의 용해방법.

제5항에 있어서, 상기 수용액은, 전체 용량에 대해서 5 내지 30체적%의 상기 수혼화성 유기 용매를 포함하는 것인, 콜레스테롤의 용해방법.

제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 수혼화성 유기 용매는 t-뷰탄올, 1-프로판올, 2-프로판올 및 2-뷰톡시에탄올로부터 선택된 1 또는 2종 이상의 유기 용매를 포함하는 것인, 콜레스테롤의 용해방법.

리포솜 제조에 이용하는 것이 가능한 유기 용매의 선택방법으로서,
후보로 되는 유기 용매를 이용해서 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해서 리포솜을 제조하는 공정; 및
상기 리포솜이 균일한지의 여부를 검사하는 공정을 포함하는, 유기 용매의 선택방법.