BRPI0613865A2

BRPI0613865A2 - liberação sustentada de antiinfectivos

Info

Publication number: BRPI0613865A2
Application number: BRPI0613865-9A
Authority: BR
Inventors: Vladimir Malinin; Xingong Li; Lawrence T Boni; Brian S Miller
Original assignee: Transave Inc
Priority date: 2005-07-19
Filing date: 2006-07-19
Publication date: 2011-02-15
Also published as: SI1909759T1; KR20080027888A; JP5415759B2; IL188406A0; IL216401A; CN103263387B; KR101437338B1; EP2649988A1; AU2006270008B2; HN2008000084A; CY1114685T1; IL216401A0; ES2437866T5; EP1909759B1; EP1909759A2; EP1909759A4; NZ565300A; JP2019052170A; JP2017082015A; AU2006270008A1

Abstract

LIBERAçãO SUSTENTADA DE ANTIINFECTIVOS. A presente invenção refere-se a formulações antiinfectivas de lipídeo substancialmente livres de lipídeos anlónicos com uma razão de lipideo para antiinfectivo que é de cerca de 1:1 a cerca de 4:1 e um diâmetro médio de menos do que cerca de 1 pm. é também provido um método de preparação de uma formulação antiinfectiva de lipídeo compreendendo um processo de infusão. São também providas formulações antiinfectivas de lipídeo em que a razão de lipídeo para droga é cerca de 1:1 ou menos, cerca de 0,75:1 ou menos ou cerca de 0,50:1 ou menos preparadas através de um processo de fusão em linha. A presente invenção refere-se também a um método de tratamento de um paciente com uma infecção pulmonar compre- endendo administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma formulação antiinfectiva de lipídeo da presente invenção. A presente invenção refere-se também a um método de tratamento de um paciente parafibrose cística compreendendo administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma formulação antiinfectiva de lipídeo da presente invenção.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "LIBERAÇÃOCONTROLADA DE ANTIINFECTIVOS".

Pedidos Relacionados

Este pedido é uma continuação-em-parte do Pedido de Patentedos Estados Unidos No. de Série 11/023971, depositado em 28 de dezem-bro de 2004, que é uma continuação-em-parte do Pedido de Patente dosEstados Unidos No. de Série 10/696389, depositado em 29 de outubro de2003, que reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório U.S. No. deSérie 60/421923, depositado em 29 de outubro de 2002.Introdução

Certa tecnologia de liberação controlada adequada para a admi-nistração por inalação emprega Iipossomas e complexos lipídicos para for-necer efeito terapêutico prolongado do fármaco no pulmão e sistemicamentepela liberação controlada, e a capacidade de orientar e melhorar a absorçãodo fármaco nos sítios da doença. A presente invenção compreende um anti-infectivo lipossomal, e métodos para o tratamento de infecções pulmonaresutilizando antiinfectivo complexo lipossômico ou lipídico.

Como relatado em Goodman and GiIman1S The PharmaceuticalBasis of Therapeutics, Eighth Edition, "Visto que a incidência de nefrotoxici-dade e ototoxicidade está relacionada com a concentração em que um ami-noglicosídeo se acumula, é fundamental reduzir a dose de manutenção des-tes fármacos em pacientes com insuficiência renal". Visto que os aminogli-cosídeos podem produzir disfunção vestibular ou auditiva e a nefrotoxicidadeindependente de uma piora do paciente, é importante geralmente reduzir asdosagens de manutenção. A presente invenção fornece reduções drásticasna toxicidade permitindo assim doses mais elevadas do que a habitual.

Pacientes com fibrose cística (CF) possuem secreções mucosase / ou de saliva espessas nos pulmões, conseqüentes infecções freqüentes,e biopelículas resultantes das colonizações bacterianas. Todos estes fluidose materiais criam barreiras para eficazmente direcionar as infecções comantiinfectivos. A presente invenção supera estes obstáculos, e ainda permitea dosagem reduzida (em quantidade ou freqüência), reduzindo assim a car-ga de fármacos sobre os pacientes/Para infecções pulmonares em geral, oesquema de dosagem fornecido pela invenção fornece um meio de reduzir acarga de fármacos.

Para um sistema de liberação de fármaco lipossômico, é muitasvezes desejável diminuir a relação de lipídio para fármaco (L/D), tanto quan-to possível para minimizar a carga lipídica para evitar os efeitos de saturaçãono organismo. Para a liberação no pulmão por inalação, isso pode ser parti-cularmente verdade porque para uso crônico, a dosagem de Iipossomas po-de tomar a dianteira da liberação, assim limitando a administração e destamaneira a eficácia do fármaco. Uma relação L/D mais baixa permitiria maisfármaco ser dado antes do limiar de dosagem/liberação ser atingido.

Sumário da Invenção

Através dos métodos de infusão aqui descritos, Iipossomassubstancialmente livres de lipídios aniônicos de dimensão modesta (< 1 μιτι),que atraem antiinfectivos em uma relação de peso de lipídio/antiinfectivo detipicamente cerca de 4:1 a cerca de 0,5:1 foram criados. Os volumes captu-rados de Iipossomas foram medidos e, a partir destes números foi-se capazde calcular que o teórico envolvimento deve ser no caso do antiinfectivo pro-cedido como um soluto ideal (ou seja, não interage com a membrana Iipos-sômica, mas atrai de forma ideal juntamente com a água). A partir destacomparação, os números de envolvimento que são 3-5X mais elevados doque o esperado são observados, o que indica que uma interação especialestá ocorrendo o que permite um maior envolvimento do que o esperado, emais baixos do que as relações de lipídeo/antiinfectivo esperadas. A soluçãoem que os Iipossomas se formam contêm umçi concentração de antiinfectivo,cuja concentração de antiinfectivo dentro dos Iipossomas deve estar ao re-dor da mesma concentração como na solução. No entanto, a concentraçãode antiinfectivo interna é calculada para ser pelo menos cerca de 3X maior.

Em parte, a presente invenção caracteriza uma formulação Ii-possômica anitiinfectiva compreendendo uma formulação de lipídio e umantiinfectivo, em que a formulação de lipídio é substancialmente isenta delipídios aniônicos, e em que a relação de peso de lipídio para antiinfectivo éde cerca de 4:1 a cerca de 1:1. Em certas modalidades, a relação de pesode lipídio para antiinfectivo é de cerca de 3:1 a cerca de 1:1, 2:1 a cerca de1:1, ou cerca de 1:1.

Em outra modalidade, a presente invenção refere-se a uma for-mulação de lipídio que compreende um antiinfectivo em que a relação delipídio para antiinfectivo é de cerca de 1: 1 ou menos, cerca de 0,75:1 oumenos, ou cerca de 0,5:1 ou menos.

Em certas modalidades, a formulação antiinfectiva de lipídiocompreende um Iipossoma tendo um diâmetro médio de cerca de 0,2 pm acerca de 1,0 pm. Em algumas outras modalidades, o diâmetro médio é decerca de 0,2 pm a cerca de 0,5 pm. Em algumas outras modalidades, o diâ-metro médio é de cerca de 0,2 pm a cerca de 0,3 pm.

Em certas modalidades, o antiinfectivo pode ser qualquer antiin-fectivo comumente conhecido na técnica. Em certas modalidades, o antiin-fectivo pode ser um aminoglicosídeo incluindo, mas não limitado a eles, ami-cacina, tobramicina ou gentamicina, ou um sal farmaceuticamente aceitáveldestes.

Em certas modalidades, a formulação de lipídio compreende umlipídio neutro. Em certas modalidades, a formulação de lipídeo é livre de lipí-dios aniônicos. EM algumas outras modalidades, o lipídio é um fosfolipídeo,incluindo, mas não limitado a eles, uma fosfatidil colina tal como dipalmitoil-fosfatidil colina ou dioleoilfosfatidil colina; ou o lipídio pode ser um esteróidetal como um esterol, incluindo, mas não limitado a ele, colesterol; ou o lipídiopode ser uma combinação de todos.

Em parte, a presente invenção caracteriza um método de prepa-ração da formulação antiinfectiva de lipídio acima descrito compreendendo ainfusão de uma solução aquosa ou alcoólica ou mistura do antiinfectivo comuma solução de lipídio-álcool ou mistura em uma temperatura abaixo datransição de fase de pelo menos um dos componentes lipídicos do lipídioneutro, em que a infusão é feita de cima. Em certas modalidades, o álcool éetanol.

Em certas modalidades, a concentração da solução de lipídeo-álcool ou mistura é de cerca de 10 a cerca de 30 mg/ml. Em certas modali-dades, a concentração da solução aquosa ou alcoólica antiinfectiva ou mis-tura é de cerca de 20 a cerca de 70 mg/ml. Em certas modalidades, a con-centração da solução de lipídeo-álcool neutra ou mistura é de cerca de 10para cerca de 30 mg/ml, e a concentração da solução aquosa ou alcoólicaantiinfectiva ou mistura é de cerca de 20 a cerca de 70 mg/ml. No entanto,aquele de habilidade usual na técnica observará que as concentrações po-dem variar ou de outra maneira serem otimizadas dependendo do lipídioe/ou antiinfectivo envolvido.

Em certas modalidades, a presente invenção refere-se à formu-lação de lipídio supracitada, em que o antiinfectivo é selecionado entre osseguintes: um aminoglicosídeo, uma tetraciclina, uma sulfonamida, ácido p-aminobenzóico, uma diaminopirimidina, uma quinolona, um β-lactama, um β-Lactama e um inibidor de β-lactamase, clorafenicol, um macrólido, Iinomici-na, clindamicina, espectinomicina, polimixina B, colistina, vancomicina, baci-tracina, isoniazida, rifampicina, etambutol, etionamida, ácido aminossalicíli-co, ciclosserina, capreomicina, uma sulfona, clofazimina, talidomida, um anti-fúngico de polieno, flucitosina, imidazol, triazol, griseofulvina, terconazol, bu-toconazol ciclopirax, ciclopirox olamina, haloprogina, tolnaftato, naftifina, ter-binafina, ou combinação destes. Em certas modalidades, a presente inven-ção refere-se à formulação de lipídio supracitada, em que o antiinfectivo éum aminoglicosídeo. Em uma outra modalidade, o antiinfectivo é um amino-glicosídeo selecionado das seguintes: amicacina, gentamicina ou tobramici-na. Em uma outra modalidade, o antiinfectivo é amicacina. Em uma outramodalidaçjje, o antiinfectivo é gentamicina. Em uma outra modalidade, o anti-infectivo é tobramicina.

Em certas modalidades, a presente invenção refere-se à formu-lação de lipídeo anteriormente mencionada, em que a formulação de lipídeoé uma lipossoma.

Em certas modalidades, a presente invenção refere-se à formu-lação de lipídeo anteriormente mencionada, em que a formulação de lipídioinclui um fosfolipídeo. Em certas modalidades, a formulação de lipídeo com-preende um esteróide. Em certas modalidades, a formulação de lipídeocompreende um esterol. Em certas modalidades, a formulação de lipídeocompreende dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC). Em certas modalidades, aformulação de lipídeo compreende colesterol. Em certas modalidades, aformulação de lipídeo compreende um fosfolipídeo e um esteróide. Em cer-tas modalidades, a formulação de lipídeo compreende um fosfolipídeo e umesterol. Em certas modalidades, a formulação de lipídeo compreende DPPCe colesterol. Em certas modalidades, a presente invenção refere-se à formu-lação anteriormente mencionada, em que a formulação lipídio compreendeDPPC, dioleoilfosfatidilcolina (DOFC), e colesterol.

Em certas modalidades, a presente invenção refere-se à formu-lação anteriormente mencionada, em que a formulação de lipídio compreen-de DPPC e colesterol em uma relação molar de cerca de 20:1, 10:1, 5:1, 2:1ou 1:1.

Em certas modalidades, a presente invenção refere-se à formu-lação anteriormente mencionada, em que a formulação de lipídio compreen-de DPPC, DOFC e colesterol em uma relação molar de cerca de 5-20 : 1-200,5-1.

Em certas modalidades, a presente invenção refere-se à formu-lação de lipídio anteriormente mencionada, em que a formulação de lipídeo éum lipossoma e o antiinfectivo é amicacina.

Em certas modalidades, a presente invenção refere-se à formu-lação de lipídio anteriormente mencionada, em que a formulação de lipídio éum lipossoma, o antiinfectivo é amicacina, e a formulação de lipídio compre-ende um fosfolipídeo e um ésterol.

Em certas modalidades, a presente invenção refere-se à formu-lação de lipídeo anteriormente mencionada, em que a formulação de lipídio éum lipossoma, o antiinfectivo é amicacina, e a formulação de lipídeo com-preende uma DPPC e um colesterol.

Em outra modalidade, a presente invenção se refere a um méto-do de preparação de uma formulação de lipídio que compreende um antiin-fectivo compreendendo: misturar uma corrente de uma solução ou misturade lipídio, com uma corrente de uma solução ou mistura antiinfectiva, emque as duas correntes são misturados em linha. Em certas modalidades, asduas correntes entram em um Y-conector antes da mistura em linha.

Em certas modalidades, a presente invenção refere-se ao méto-do acima mencionado, em que a corrente de uma solução ou mistura lipídi-ca, e a corrente de uma solução ou mistura antiinfectiva são misturadas emuma taxa de fluxo total de cerca de 700 a cerca de 900 ml/min. Em certasmodalidades, a corrente de uma solução ou mistura lipídica, e a corrente deuma solução ou mistura antiinfectiva são misturadas em uma taxa de fluxototal de cerca de 800 ml/min. Em certas modalidades, a corrente de umasolução ou mistura lipídica é adicionada em uma taxa de fluxo de cerca de200 para cerca de 400 ml/min. Em certas modalidades, a corrente de umasolução ou mistura lipídica é adicionada em uma taxa de fluxo de cerca de300 ml/min. Em certas modalidades, a corrente de uma solução ou misturaantiinfectiva é adicionada em uma taxa de fluxo de cerca de 400 para cercade 600 ml/min. Em certas modalidades, a corrente de uma solução ou mistu-ra antiinfectiva é adicionada em um taxa de fluxo de cerca de 500 ml/min.Em certas modalidades, a corrente de uma solução ou mistura lipídica é adi-cionada em um taxa de fluxo de cerca de 300 ml/min, e a corrente de umasolução ou mistura antiinfectiva é adicionada em uma taxa de fluxo de cercade 500 ml/min.

Em certas modalidades, a presente invenção refere-se ao méto-do anteriormente mencionado, em que a temperatura das correntes combi-nadas é de cerca de 30 a 40 0C. Em certas modalidades, a temperatura dasolução ου mistura lipídica é ao redor de 30 0C, e a temperatura da soluçãoou mistura antiinfectiva é de cerca de 30 0C. Em certas modalidades, a tem-peratura da solução ou mistura lipídica é ao redor de 50 0C1 e a temperaturada solução ou mistura antiinfectiva é a temperatura ambiente.

Em certas modalidades, a presente invenção refere-se ao méto-do anteriormente mencionado, em que o método de preparação de uma for-mulação de lipídeo que compreende um antinfectivo ainda compreende aetapa de diluir as correntes combinadas com água pelo menos cerca de 20segundos após a mistura.

Em certas modalidades, a presente invenção refere-se ao méto-do acima mencionado, em que a concentração da solução ou mistura antiin-fectiva é de cerca de 30 á cerca de 50 mg/ml. Em certas modalidades, aconcentração da solução ou mistura antiinfectiva é de cerca de 40 a cercade 50 mg/ml.

Em certas modalidades, a presente invenção refere-se ao méto-do anteriormente mencionado, em que a corrente de uma solução ou misturalipídica é adicionada em uma taxa de fluxo de cerca de 300 ml/min, e a cor-rente de uma solução ou mistura antiinfectiva é adicionada em uma taxa defluxo de cerca de 500 ml / min; a temperatura das correntes combinadas éde cerca de 30 a 40 0C; as correntes combinadas são diluídas com água pe-lo menos cerca de 20 segundos após a mistura; e a concentração da solu-ção ou mistura antiinfectiva é de cerca de 40 a cerca de 50 mg/ml.

Em certas modalidades, a presente invenção refere-se ao méto-do anteriormente mencionado, em que as soluções ou misturas são aquosasou alcoólicas. Em certas modalidades, a presente invenção refere-se ao mé-todo anteriormente mencionado, em que a formulação de lipídeo é um Iipos-soma.

Em certas modalidades, a presente invenção refere-se ao méto-do anteriormente mencionado, em que o antiinfectivo é selecionado entre osseguintes: um aminoglicosídeo, uma tetraciclina, uma sulfonamida, ácido p-aminobenzóico, uma diaminopirimidina, uma quinolona, uma β-lactama, umaβ-lactama, um inibidor de β-lactama e β-lactamase, clorafenicol, um macróli-do, linomicina, clindamicina, espectinpmicina, polimixina B, colistina, varíco-micina, bacitracina, isoniazida, rifampicina, etambutol, etionamida, ácido a-minossalicílico, ciclosserina, capreomicina, uma sulfona, clofazimina, talido-mida, um antifúngico polieno, flucitossina, imidazol, triazol, griseofulvina, ter-conazol, butoconazol ciclopirax, ciclopirox olamina, haloprogin, tolnaftate,naftifine, terbinafina, ou a combinação destas. Em certas modalidades, oantiinfectivo é um aminoglicosídeo. Em certas modalidades, o antiinfectivo éum aminoglicosídeo selecionado dos que seguem: amicacina, gentamicinaou tobramicina. Em certas modalidades, o antiinfectivo é amicacina. Em cer-tas modalidades, o antiinfectivo é gentamicina. Em certas modalidades, oantiinfectivo é tobramicina.

Em certas modalidades, a presente invenção refere-se ao méto-do anteriormente mencionado, em que o lipídio compreende um fosfolipídeo.Em certas modalidades, o lipídio compreende um esteróide. Em certas mo-dalidades, o lipídio inclui um esterol. Em certas modalidades, o lipídio com-preende DPPC. Em certas modalidades, o lipídio compreende o colesterol.Em certas modalidades a lipídio inclui um fosfolipídeo e um esterol. Em cer-tas modalidades, o lipídio compreende DPPC e colesterol.

Em certas modalidades, a presente invenção refere-se ao méto-do anteriormente mencionado, em que a formulação de lipídio é um Iiposso-ma e o antiinfectivo é amicacina.

Em certas modalidades, a presente invenção refere-se ao méto-do anteriormente mencionado, em que a formulação de lipídio é um Iiposso-ma, o antiinfectivo é amicacina, e o lipídio compreende um fosfolipídeo e umesterol.

Em certas modalidades, a presente invenção refere-se ao méto-do anteriormente mencionado, em que a formulação de lipídio é um iiposso-ma, o antiinfectivo é amicacina, e o lipídio compreende DPPC e colesterol.

Em certas modalidades, a presente invenção refere-se ao méto-do anteriormente mencionado, em que a formulação de lipídio possui umarelação de lipídio para antiinfectivo de cerca de 1:1 ou menos.

Em certas modalidades, a presente invenção refere-se ao méto-do anteriormente mencionado, em que a formulaçãodè lipídio possui umarelação de lipídio para antiinfectivo de cerca de 0,75:1 ou menos.

Em certas modalidades, a presente invenção refere-se ao méto-do anteriormente mencionado, em que a formulação de lipídio possui umarelação de lipídio para antiinfectivo de cerca de 0.5:1 ou menos.

Em certas modalidades, a presente invenção refere-se ao méto-do anteriormente mencionado, em que a formulação de lipídio é um Iiposso-ma, o antiinfectivo é amicacina, o lipídio compreende DPPC e colesterol, e arelação de lipídio para antiinfectivo é de cerca de 1:1 ou menos.

Em uma outra modalidade, a presente invenção refere-se a ummétodo de tratamento de infecções pulmonares em um paciente com suanecessidade compreendendo a administração ao paciente de uma quantida-de terapeuticamente eficaz de uma formulação antiinfectiva lipossômica quecompreende uma formulação de lipídeo e um antiinfectivo, em que a dosa-gem de antiinfectivo é de cerca de 100 mg/dia ou menos. Em uma outra mo-dalidade, a quantidade de dosagem de antiinfectivo é de cerca de 30 mg acerca de 50 mg em dias alternados. Em uma outra modalidade, a quantidadede dosagem de antiinfectivo é de cerca de 30 mg a cerca de 50 mg a cadatrês dias.

Em outra modalidade, a presente invenção refere-se ao métodoanteriormente mencionado de tratamento, em que o Iipossoma possui umdiâmetro médio de cerca de 0,2 pm a cerca de 1,0 pm. Em uma outra moda-lidade, o Iipossoma possui um diâmetro médio de cerca de 0,2 pm a cercade 0,5 pm, ou cerca de 0,2 pm a cerca de 0,3 pm.

Em uma outra modalidade, a presente invenção refere-se o mé-todo anteriormente mencionado de tratamento, em que a infecção pulmonaré um resultado de fibrose cística.

Em outra modalidade, a presente invenção refere-se ao métodoanteriormente mencionado de tratamento, em que a relação de peso de lípi-do para antiinfectivo é de cerca de 4:1 a cerca de 0.5:1, cerca de 3:1 a cercade 0,5:1, cerca de 2:1 a cerca de 0,5:1, ou cerca de 1:1 a cerca de 0.5:1.

Em uma outra modalidade, a presente invenção refere-se aonjétodo anteriormente mencionado de tratamento, em que o antiinfectivo éselecionado aos seguintes: um aminoglicosídeo, uma tetraciclina, uma sulfo-namida, ácido p-aminobenzóico, uma diaminopirimidina, uma quinolona,uma β-lactama, um inibidor de β-lactama e β-lactamase, clorafenicol, penici-linas, cefalosporinas, um macrólido, linomicina, clindamicina, coricosteróides,prostaglandinas, espectinomicina, polimixina B, colistina, vancomicina, baci-tracina, isoniazida, rifampina, etambutol, etionamida, ácido aminossalicílico,ciclosserina, capreomicina, uma sulfona, clofazimina, talidomida, um polienoantifúngico, flucitossina, imidazol, triazol, griseofulvina, terconazol, butoco-nazol ciclopirax, ciclopirox olamina, haloprogina, tolnaftato, naftifina, terbina-fina, ou combinação destes. Em outra modalidade, o antiinfectivo é um ami-noglicosídeo. Em uma outra modalidade, o antiinfectivo é amicacina.

Em outra modalidade, a presente invenção refere-se ao métodoanteriormente mencionado de tratamento, em que a formulação de lipídiocompreende lipídios neutros. Em uma outra modalidade, os lipídeos quepreparam a formulação de lipídio são todos lipídios neutros. Em outra moda-lidade, o Iipossoma é livre de lipídios aniônicos. Em outra modalidade, a for-mulação de lipídeo compreende um fosfolipídeo. Em uma outra modalidade,a formulação de lipídeo compreende um esterol. Em outra modalidade, aformulação de lipídeo compreende DPPC e colesterol.

Em uma outra modalidade, a presente invenção refere-se aométodo anteriormente mencionado de tratamento, em que o antiinfectivo éamicacina, e a formulação de lipídio compreende DPPC e colesterol.

Em outra modalidade, a presente invenção refere-se ao métodoanteriormente mencionado de tratamento, em que o antiinfectivo é amicaci-na, a relação de peso do lípido para antiinfectivo é de cerca de 4:1 a cercade 1:1, e a formulação de lipídio compreende DPPC e colesterol. Em umaoutra modalidade, a relação de peso é de cerca de 3:1 a cerca de 1:1, 2:1 acerca de 1:1, ou ao redor de 1:1.

Em uma outra modalidade, a presente invenção refere-se aométodo anteriormente mencionado de tratamento, em que o antiinfectivo éamicacina, a relação de peso do lípido para antiinfectivo é de cerca de 4:1 acerca de 1:1, a formulação de lipídio compreende DPPC e colesterol, e ainfecção pulmonar é um resultado da fibrose cística. Em uma outra modali-dade, a relação de peso é de cerca de 3:1 a cerca de 1:1, 2:1 a cerca de 1:1,ou cerca de 1:1.

Em outra modalidade, a presente invenção refere-se ao métodoanteriormente mencionado de tratamento, em que o antiinfectivo é amicaci-na, a relação de peso do lipídio para antiinfectivo é de cerca de 4:1 a cercade 0,5:1, a formulação de lipídio compreende DPPC e colesterol, e o Iipos-soma possui um diâmetro médio de cerca de 0,1 pm a cerca de 0,5 μιη. Emuma outra modalidade, o diâmetro médio é de cerca de 0,2 μιτι a cerca de0,4 μm, ou cerca de 0,2 μπιβ a cerca de 0,3 μιτι.

Em outra modalidade, a presente invenção refere-se ao métodoanteriormente mencionado de tratamento, em que o antiinfectivo é amicaci-na, a relação de peso de lípido para antiinfectivo é de cerca de 4:1 a cercade 0.5:1, a formulação de lipídio compreende DPPC e colesterol, a infecçãopulmonar é o resultado de fibrose cística, e o Iipossoma possui um diâmetromédio de cerca de 0,1 μηΐ3 cerca de 1,0 μιτι. Em uma outra modalidade, odiâmetro médio é de cerca de 0,2 pm a cerca de 0,5 μιτι, ou cerca de 0,2 μιτιa cerca de 0,3 μηι.

Estás modalidades da presente invenção, outras modalidades, eseus aspectos e características, serão evidentes a partir da descrição, dese-nhos e reivindicações que se seguem.

Breve Descrição dos Desenhos

A Figura 1 descreve o diagrama em corte transversal da sali-va/biopelícula observada em pacientes com fibrose cística.

A Figura 2 descreve a representação gráfica do direcionamentoe efeito de depósito do fármaco da presente invenção.

As Figuras 3 e 4 descrevem a representação gráfica da bacterio-logia de amicacina em várias formas.

A Figura 5 descreve uma representação gráfica da liberaçãocontrolada para lipossoma/amicacina complexa e tobramicina.

A Figura 6 descreve os dados sobre a ciprofloxacina livre oucomplexa.

A Figura 7 descreve uma representação gráfica da permanênciado fármaco no pulmão fornecido em várias posologias de dosagem.

A Figura 8 descreve graficamente o processo de infusão em li-nha de duas correntes para preparação de formulações antiinfectivas Iipos-sômicas.

A Figura 9 descreve a miscibilidade de sulfato de amicacina cometanol/água. As linhas representam a concentração máxima de amicacina(base) miscível com solução de etanol na temperatura ambiente (RT) e40°C. Em altas concentrações a amicacina forma uma fase líquida separada(coacervações), que mais tarde se precipita como cristais. As linhas verticaismostram a concentração de etanol na mistura de infusão de lipí-dio/amicacina (300/500 partes), e após a adição 200 partes de água.

Descrição Detalhada

A presente invenção descreve uma formulação de lipídio quecompreende um antiinfectivo em que o tamanho e as relações de lipídio parafármaco são menores do que anteriormente conhecidas. A presente inven-ção também descreve um método de preparação destas formulações de li-pídio.

1. Definições

Por conveniência, antes de mais descrição da presente inven-ção, certos termos empregados no relatório descritivo, exemplos e reivindi-cações anexas são aqui coletados. Estas definições devem ser lidas à luz dorestante da descreveção e entendidas como por uma pessoa versada natécnica. A não ser que definidos de outra forma, todos os termos técnicos ecientíficos aqui usados possuem os mesmos significados que comumentecompreendidos por uma pessoa de habilidade na técnica.

Os artigos "um" e "uma" são aqui usados para referir-se a um oumais de um (isto é, a pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. Pormeio de exemplo, "um elemento" significa um elemento ou mais de um ele-mento.

O termo "biodispooível" é reconhecido na técnica e sè refere auma forma da invenção objeto que permite a ela, ou uma parte da quantida-de administrada, a ser absorvida por, incorporada a, ou de outra forma fisio-logicamente disponível a um indivíduo ou paciente a quem é administrada.

Os termos "compreender" e "compreendendo" são utilizados nainclusiva, sentido amplo, que significa que os elementos adicionais podemser incluídos.

Os termos "encapsulado" e "encapsulação" se referem à adsor-ção de antiinfectivos na superfície da formulação com base em lipídio, à as-sociação de antiinfectivos na região intersticial das bicamadas ou entre duasmonocamadas, à captura de antiinfectivos no espaço entre duas bicamadas,ou à captação de antiinfectivos no espaço cercado pelas bicamadas ou mo-nocamadas mais internas.

O termo "incluindo" é aqui usado para significar "incluindo masnão limitado a". "Incluindo" e "incluindo mas não limitado a" são utilizados demodo trocável.

O termo "formulação antiinfectiva de lipídeo", ou "Lip-antiinfectivo", ou "Lip-An" aqui debatido é qualquer forma de composiçãoantiinfectiva em que, pelo menos, cerca de 1% em peso do antiinfectivo éassociado com o lipídio, quer como parte de um complexo com o lipídio, ouquer como um Iipossoma em que o antibiótico pode estar na fase aquosa ouna fase de bicamada hidrofóbica ou na região de grupo livre interfacial dabicamada lipossômica. Preferivelmente, pelo menos cerca de 5%, ou pelomenos cerca de 10%, ou pelo menos cerca de 20%, ou pelo menos cerca de25%, pode ser deste modo associadas. A associação pode ser medida pelaseparação através de um filtro em que o antiinfectivo de lipídeo e associadocom lipídeo é retido e o antiinfectivo livre está no filtrado. Uma"formulação antiinfectiva lipossômica" é uma formulação antiinfectiva de lipí-deo em que a formulação de lipídeo é a forma de um lipossoma.

O termo "mamífero" é conhecido na técnica, e os mamíferos e-xemplares incluem seres humanos, primatas, bovinos, suínos, caninos, feli-nos e roedores (por exemplo, camundongos e ratos).

Um "paciente", "indivíduo" ou "hospedeiro" a ser tratado pelométodo objeto pode significar um animal ser humano ou não-humano.

O termo "sais farmaceuticamente aceitáveis" é reconhecido natécnica e refere-se aos sais de adição de ácido inorgânicos e orgânicos rela-tivamente não tóxicos de compostos, incluindo, por exemplo, aqueles conti-dos nas composições da presente invenção.

O termo "infusão de solvente" é um processo que inclui dissolverum ou mais lipídios em uma quantidade pequena, de preferência mínima, deum solvente compatível com o processo para formar uma suspensão ou so-lução de lipídio (de preferência uma solução) e depois adicionar a soluçãoem um meio aquoso contendo agentes bioativos. Tipicamente um solventecompatível com o processo é aquele que pode ser lavado em um processoaquoso tal como diálise. A composição que é passada por um ciclo fri-o/quente é preferencialmente formada pela infusão de solvente, com infusãode etanol sendo preferível. Os álcoois são preferidos como solventes. A "in-fusão de etanol", um tipo de infusão de solvente, é um processo que incluidissolver um ou mais lipídios em uma pequena, de preferência mínima,quantidade de etanol para formar uma solução de lipídio e depois adicionar asolução em um meio aquoso contendo agentes bioativos. Uma "pequena"quantidade de solvente é uma quantidade compatível com a formação delipossomas ou complexos lipídicos no processo de infusão. O termo "infusãode solvente" pode também incluir um processo de infusão em linha em queduas correntes de componentes de formulação são primeiro misturadas emlinha.

O termo "substancialmente livre" é reconhecido na técnica e re-fere-se a uma quantidade trivial ou menor.

O termo "agente terapêutico" é reconhecido na técnica e se refe-re a qualquer componente químico que é uma substância biológica, fisiológi-ca ou farmacologicamente ativa que atua local ou sistemicamente em umindivíduo. Exemplos de agentes terapêuticos, também referidos como "fár-macos", são descritos nas referências de literatura bem-conhecidas tais co-mo o Merck Index, o Physicians Desk Reference, e The PharmacologicalBasis of Therapeutics, e eles incluem, sem limitação, fármacos; vitaminas;,suplementos minerais; substâncias utilizadas para o tratamento, prevenção,diagnóstico, cura ou atenuação de uma doença ou enfermidade; substânciasque afetam a estrutura ou função do corpo; ou pro-fármacos, que se tornambiologicamente ativos ou mais ativos após eles terem sido colocados em umambiente fisiológico.

A frase "quantidade terapeuticamente eficaz", como aqui usadasignifica que a quantidade de um composto, material, ou composição quecompreende uma formulação antiinfectiva de lipídio de acordo com a presen-te invenção é eficaz para produzir algum efeito terapêutico desejado median-te a inibição de infecções pulmonares.

O termo "tratamento" é reconhecido na técnica e refere-se à cu-ra assim como melhora de pelo menos um sintoma de qualquer condição oudoença. O termo "tratamento" também se refere ao tratamento profiláticoque atua para defender contra ou prevenir uma condição ou doença.

2. Antiinfectivos

Os antiinfectivos são agentes que atuam contra infecções, taiscomo infecções bacterianas, micobacterianas, fúngicas, virais ou protozoá-rias. Os antiinfectivos abrangidos pela invenção incluem, mas não são limi-tados a eles, aminoglicosídeos (por exemplo, estreptomicina, gentamicina,tobramicina, amicacina, netilmicina, canamicina, e similares), tetraciclinas(tais como clortetraciclina, oxitetraciclina, metaciclina, doxiciclina, minociclinae similares), sulfonamidas (por exemplo, sulfanilamida, sulfadiazina, sulfa-metaoxazol, sulfisoxazol, sulfacetamida, e similares), ácido paraaminoben-zóico, diaminopirimidinas (tais como trimetoprim, muitas vezes usado emconjunto com sulfametoxazol, pirazinamida, e similares), quinolonas (tal co-mo ácido nalidíxico, cinoxacina, ciprofloxacina e norfloxacina e similares),penicilinas (tais como penicilina G, penicilina V, ampicilina, amoxicilina, ba-campicilina, carbenicilina, carbenicilina indanila, ticarcilina, azlocilina, mezlo-cilina, piperacilina, e outras mais), penicilina resistente a penicilinase (talcomo a meticilina, oxacilina, cloxacilina, dicloxacilina, nafcilina e similares),primeira geração de cefalosporinas (tal como cefadroxila, cefalexina, cefra-dina, cefglotina, cefapirina, cefazolina, e similares), a segunda geração cefa-losporinas (tal como cefaclor, cefamandol, cefonicid, cefoxitina, cefotètano,cefuroxima, cefuroxima axetila; cefmetazol, cefprozila, loracarbef, ceforanide,e similares), terceira geração de cefalosporinas (tal como cefepima, cefope-razona, cefotaxima, ceftizoxima, ceftriaxona, ceftazidima, cefixima, cefpodo-xima, ceftibuten, e similares), outros beta-lactamas (tal como imipenem, me-ropenem, aztreonam, ácido clavulânico, sulbactam, tazobactam, e similares),inibidores da betalactamase (tal como o ácido clavulânico), cloranfenicol,macrólidos (tais como eritromicina, azitromicina, claritromicina, e similares),lincomicina, clindamicina, espectinomicina, polimixina B, polimixinas (comopolimixina A, B, C, D , E1 (colistina A) ou E2, colistina B ou C, e similares)colistina, vancomicina, bacitracina, isoniazida, rifampicina, etambutol, etio-namida, ácido aminossalicílico, ciclosserina, capreomicina, sulfonas (taiscomo dapsona, sulfoxona sódio, e similares), clofazimina, talidomida, ouqualquer outro agente antibacteriano que possa ser lipídio encapsulado. Osantiinfectivos podem incluir agentes antifúngicos, incluindo antifúngicos depolieno (tais como a anfotericina B, nistatina, natamicina, e similares), fluci-tosina, imidazóis (tais como n-ticonazol, clotrimazol, econazol, cetoconazol,e similares), triazóis (tais como itraconazol, fluconazol, e similares), griseo-fulvina, terconazol, butoconazol ciclopirax, ciclopirox olamina, haloprogina,tolnaftato, naftifma, terbmafma, ou qualquer outro antifúngico que possa serlipídio encapsulado ou complexo. O debate e os exemplos são direcionadosprincipalmente para amicacina, mas o escopo do pedido não se destina aser limitado a este antiinfectivo. Combinações de fármacos podem ser usa-das.

Os antiinfectivos particularmente preferidos incluem os aminogli-cosídeos, as quinolonas, os antifúngicos de polieno e as polimixinas.

Também incluídos como antiinfectivos adequados nas formula-ções antiinfectivas de lipídio do presente invenção são os sais e complexosfarmaceuticamente aceitáveis de antiinfectivos. Nos casos em que os com-postos podem ter um ou mais centros de quiral, a menos que especificado, apresente invenção compreende cada composto racêmico único, assim comocada composto não racêmico único.

Nos casos em que os antiinfectivos possuem ligações duplascarbono-carbono insaturadas, os isômeros tanto eis (Z) quanto trans (E) es-tão dentro do escopo desta invenção. Nos casos em que os antiinfectivospodem existir em formas tautoméricas, tais como tautômeros ceto-enóis, taiscomo<formula>formula see original document page 18</formula>

cada forma tautomérica é contemplada como sendo incluída dentro destainvenção, quer existente em equilíbrio quer bloqueada em uma forma medi-ante a substituição apropriada com R'. O significado de qualquer substituinteem qualquer uma ocorrência é independente do seu significado, ou em qual-quer outro substituinte do significado, em qualquer outra ocorrência.

Também incluídos como antiinfectivos adequados utilizados nasformulações antiinfectivas de lipídio da presente invenção são os pro-fármacos dos compostos de platina. Os pro-fármacos são considerados deserem qualquer portador covalentemente ligado que libera o composto deorigem ativo in vivo.

3. Infeccões Pulmonares

Entre as infecções pulmonares (tais como em pacientes comfibrose cística), que podem ser tratadas com os métodos da invenção sãoPseudomonas (por exemplo, P. aeruginosa, P. paucimobilis, P. putida,P.fluorescens, e P. acidovorans), estafilococos, Staphylococcus aureus re-sistente a Meticillina (MRSA), estreptococos (incluindo Streptococcus pneu-moniae), infecções por Eseheriehia eoii, Kiebsiella, Enterobaeter, Serratia1Haemophilus, Yersinia pesos, Burkhoideria pseudomailei, B. eepaeia, B. gia-dioli, B. multivorans, B. vietnamiensis, Mycobacterium tubereulosis, M. aviumeompiex (MAC){M avium e M. intraeeliulare), M. kansasii, M. xenopi, M. ma-rinum, M. uieerans ou M. fortuitum eompiex (M. fortuitum e M. eheionei).

4. Métodos de Tratamento

Em uma modalidade a presente invenção compreende um mé-todo de tratamento que compreende a administração de uma quantidadeterapeuticamente eficaz de uma formulação antiinfectiva de lipídio.

Em que nenhuma dosagem específica é fornecida abaixo, a do-sagem preferida da invenção é de 50% ou menos, 35% ou menos, 20% oumenos, ou 10% ou menos, da quantidade de fármaco livre mínima (que ob-viamente pode ser um sal) que é eficaz, se liberado nos pulmões através deum nebulizador, para reduzir a contagem de CFU nos pulmões por uma or-dem de grandeza ao longo de uns 14 dias de tratamento. A quantidade defármaco livre comparativa é a quantidade acumulada que seria utilizada noperíodo de dosagem aplicado com a administração de fármaco da invenção.O fármaco livre mínimo comparativo definido neste parágrafo é uma "quanti-dade de fármaco livre comparativa".

As modalidades de tratamento não CF da invenção podem serusadas com qualquer animal, embora de preferência com os seres huma-nos. Quantidades relativas em um dado animal são medidas com respeito atal animal.

O esquema de dosagem é preferivelmente uma vez ao dia oumenos. Nas modalidades preferidas, o esquema de dosagem é uma vez diasim, dia não, a cada três dias, a cada semana, ou menos. Por exemplo, oesquema de dosagem pode ser dia sim, dia não ou menos, usando 50% oumenos da quantidade de fármaco livre comparativa. Ou, por exemplo, a do-sagem pode ser diariamente usando 35% ou menos da quantidade de fár-maco livre comparativa. Ver as Figuras 3 e 4 para os dados de animal quemostram que as formulações antiinfectivas de lipídio da presente invençãosão mais eficazes do que o fármaco livre.

Para tratar infecções, a quantidade eficaz do antiinfectivo seráreconhecido pelos médicos, mas inclui uma quantidade eficaz para tratar,reduzir, melhorar, eliminar ou evitar um ou mais sintomas da doença procu-rada ser evitada ou tratada ou a condição procurada de ser evitada ou trata-da, ou de outra forma produzir uma mudança clinicamente reconhecível napatogênese da doença ou condição. Melhora inclui redução da incidência ougravidade das infecções nos animais tratados profilaticamente. Em certasmodalidades, a quantidade eficaz é uma eficaz para tratar ou melhorar ossintomas de infecção pulmonar após ter se originado. Em algumas outrasmodalidades, a quantidade eficaz é uma eficaz para tratar ou melhorar amédia de incidência ou gravidade das infecções nos animais tratados profila-ticamente (como medido por estudos estatísticos).

O lipossoma ou outros sistemas de liberação de lípidio podemser administrados por inalação ou como uma pulverização nebulizada, pó,ou aerossol, ou por administração intratecal. As administrações por inalaçãosão preferidas. O resultado global é uma administração menos freqüente eum maior índice terapêutico em comparação com o fármaco livre ou formaparenteral do fármaco. Os Iipossomas ou outras formulações de lipídio sãoparticularmente vantajosas devido à sua capacidade para proteger o fárma-co enquanto está sendo compatível com a parte interna do pulmão ou ten-soativo pulmonar.

A presente invenção inclui métodos para o tratamento de infec-ções pulmonares gram-negativas. Uma infecção proveitosamente tratada é ainfecção pseudomonal crônica em pacientes CF. Os tratamentos conhecidosde infecções pulmonares (como em pacientes CF) com aminoglicosídeo ge-ralmente compreendem a administração de aproximadamente 200 a 600 mgde amicacina ou tobramicina por dia através de inalação. A presente inven-ção leva em conta o tratamento pela administração, em uma modalidadepreferida, de 100 mg ou menos de amicacina por dia (ou normalizado para100 mg por dia ou menos se dosagem menos freqüente). Em mais uma ou-tra modalidade, a administração de 60 mg ou menos de amicacina é realiza-da todos os dias. E em mais uma outra modalidade a administração de a-proximadamente 30 a 50 mg não mais do que uma vez a cada 2 dias é reali-zada. A modalidade mais preferida compreende a administração de aproxi-madamente 30 a 50 mg dia sim, dia não ou a cada três dias.

5. Lipídeos e Lipossomas

Os lipídios utilizados nas composições da presente invençãopodem ser sintéticos, semi-sintéticos ou lípidos de ocorrência natural, inclu-indo fosfolipídios, tocoferóis, esteróides, ácidos graxos, glicoproteínas taiscomo a albumina, lipídios aniônicos e lipídios catiônicos. Os lipídios podemser aniônicos, catiônicos ou neutros. Em uma modalidade, a formulação delipídeo é substancialmente isenta de lipídios aniônicos. Em uma modalidade,a formulação de lipídeo compreende apenas lipídios neutros. Em outra mo-dalidade, a formulação de lipídeo é livre de lipídios aniônicos. Em uma outramodalidade, o lipídio é um fosfolipídeo. Os fosfolipídeos incluem fosfatidilco-lina de ovo (EPC), fosfatidilglicerol de ovo (EPG), fosfatidilinositol de ovo (E-Pl), fosfatidilserina de ovo (EPS), fosfatidiletanolamina (EPE), e ácido fosfa-tídico (EPA)1 as contrapartes da soja, fosfatidicolina de soja (SPC); SPG ,SPS, SPI, SPE e SPA; as contrapartes de ovo e soja hidrogenadas (por e-xemplo, HEPC, HSPC), outros fosfolipídios preparados de ligações de ésterde ácidos graxos no 2 e 3 das posições de glicerol contendo cadeias de 12 a26 átomos dé carbono e grupos superiores diferentes na posição 1 de glice-rol que incluem colina, glicerol, inositol, serina, etanolamina, assim como osácidos fosfatídicos correspondentes. As cadeias sobre estes ácidos graxospodem ser saturadas ou insaturadas, e o fosfolipídio pode ser preparado deácidos graxos de comprimentos de cadeia diferentes e graus diferentes deinsaturação. Em particular, as composições das formulações podem incluirdipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), um dos principais constituintes de tensoa-tivo pulmonar de ocorrência natural assim como dioleoilfosfatidilcolina(DOFC). Outros exemplos incluem dimiristoilfosfatidil colina (DMPC) e dimi-ristoilfosfatidilglicerol (DMPG) dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) e dipalmitoil-fosfatidilglicerol (DPPG) diestearoilfosfatidilcolina (DSPC) e diestearoilfosfa-tidilglicerol (DSPG), dioleilfosfatidiletanolamina (DOPE) e fosfolipídios mistu-rados como palmitoilestearoilfosfatidilcolina (PSPC) e palmitoilestearoilfosfa-tidilglicerol (PSPG), driacilglicerol, diacilglicerol, seranida, esfingosina, esfin-gomielina e fosfolipídios acilados isolados como mono-oleoil-fosfatidiletanolamina (MOPE).

Os lipídios utilizados podem incluir sais de amônio de ácidosgraxos, fosfolipídeos e glicerídeos, esteróides, fosfatidilgliceróis (PGs), áci-dos fosfatídicos (PAs), fosfotidilcolinas (PCs), fosfatidilinositóis (PIs) e osfosfatidilserinas (PSs). Os ácidos graxos incluem ácidos graxos de compri-mentos de cadeia de carbono de 12 a 26 átomos Δ% carbono que são ousaturados ou insaturados. Alguns exemplos específicos incluem: miristilami-na, palmitilamina, Iaurilamina e estearilamina, dilauroil etilfosfocolina (DLEP),dimiristoil etilfosfocolina (DMEP), dipalmitoil etilfosfocolina (DPEP) e distea-roil etilfosfocolina (DSEP), cloreto de N-(2,3-di-(9(Z)-octadecenilóxi)-prop-1-il-N,N,N-trimetilamônio (DOTMA) e 1,2-bis(oleoilóxi)-3-(trimetilamônio) pro-pano (DOTAP). Exemplos de esteróides incluem colesterol e ergosterol. Exemplos de PGs, PAs1 Pis, PCs e PSs incluem DMPG, DPPG1 DSPG, DM-ΡΑ, DPPA1 DSPA1 DMPI1 DPPI1 DSPI, DMPS, DPPS e DSPS, DSPC1DPPG1 DMPC1 DOFC1 PC de ovo.

As formulações antiinfectivas de Iipossoma ou lipídio compostaspor fosfatidilcolinas, tal como DPPC1 ajudam na absorção pelas células nopulmão tais como os macrófagos alveolares e auxiliam a sustentar a libera-ção do agente antiinfectivo no pulmão (Gonzales-Rothi et al. (1991)). Os lipí-dios carregados negativamente tais como os PGs1 PAs1 PSs e Pls1 além dereduzir a agregação de partícula, podem desempenhar um papel na libera-ção controlada característica da formulação de inalação, assim como notransporte da formulação em todo o pulmão (transcitose) para absorção sis-têmica. Os compostos de esterol que são supostos de afetar as característi-cas de liberação e fuga da formulação.

Os Iipossomas são membranas de bicamada lipídicas comple-tamente fechadas contendo um volume aquoso aprisionado. Os Iipossomaspodem ser vesículas unilamelares (possuindo uma bicamada de membranaúnica) ou vesículas multilamelares (estruturas como cebola caracterizadaspor múltiplas bicamadas de membrana, cada um separada do outro por umacamada aquosa). A bicamada é composta por duas monocamadas de lipídiotendo uma região "inferior" hidrofóbica e uma região hidrófila "superior". Aestrutura da bicamada de membrana é tal que os "inferiores" hidrofóbicos(não polares) das monocamadas lipídicas orientam em direção ao centro dabicamada enquanto os "superiores" hidrófilos orientam para a fase aquosa.As formulações antiinfectivas de lipídio são associações de lipídio e o agenteantiinfectivo. Esta associação pode ser covalente, iônica, eletrostática, nãocovalente ou estérica. Estes complexos são não lipossômicas e são incapa-zes de atrair solutos hidrossolúveis adicionais. Exemplos de tais complexosincluem os complexos de lipídio de anfotencina B (Janoff et al., Proc. NatAcad. Sci1 85:6122 6126, 1988) e cardiolipina complexa com doxorrubicina.

Um clatrato de lipídio é uma estrutura semelhante a gaiola tridi-mensional que emprega um ou mais lipídios em que a estrutura atrai um a-gente bioativo. Tais clatratos são incluídos no escopo da presente invenção.

Prolipossomas são formulações que podem se tornar Iiposso-mas ou complexos lipídicos após entrar em contato com um líquido aquoso.Agitação ou outra mistura pode ser necessária. Tais prolipossomas estãoincluídos no escopo da presente invenção.

Os Iipossomas podem ser produzidos por uma variedade de mé-todos (por exemplo, ver, Bally, Cullis et al, Biotechnol Adv. 5(1): 194, 1987).O procedimento de Bangham (J. Mol. Biol., J Mol Biol. 13(l):238-52, 1965)produz vesículas multilamelares usuais (MLVs). Lenk et al. (Patentes U.S.n25 4.522.803, 5.030.453 e 5.169.637), Fountain et al. (Patente U.S. n24.588.578) e Cullis et al. (Patente U.S. n- 4.975.282) descrevem os métodospara a produção de Iipossomas multilamelares tendo distribuição de solutointerlamelar substancialmente igual em cada um de seus compartimentosaquosos. Paphadjopoulos et al.,, Patente U.S. n2 4.235.871, descreve a pre-paração de Iipossomas oligolamelares mediante a inversão da evaporaçãode fase.

As vesículas unilamelares podem ser produzidas a partir deMLVs por várias técnicas, por exemplo, a extrusão de Cullis. et al. (PatenteU.S. n2 5.008.050) e Loughrey et al. (Patente U.S. n2 5.059.421). Sonicaçãoe homogeneização podem ser usadas para produzir Iipossomas unilamela-res menores de Iipossomas maiores (ver, por exemplo, Paphadjopoulos etal., Biochim. Biophys. Acta., 135:624-638, 1967; Deamer1 Patente U.S. n24.515.736; e Chapman et al., Liposome Technol., 1984, pp. 1-18).

A preparação de Iipossoma original de Bangham et al. (J. Mol.Biol., 1965, 13:238 - 252) envolve a suspensão de fosfolipídios em um sol-vente orgânico que é depois evaporado para secura deixando ficar uma pelí-cula de fosfolipídio sobre o recipiente de reação. Em seguida, uma quantida-de apropriada de fase aquosa é adicionada, a mistura é deixada "intumes-cer", e os Iipossomas resultantes que consistem em vesículas multilamelares(MLVs) são dispersos por meios mecânicos. Esta preparação fornece a basepara o desenvolvimento das pequenas vesículas unilamelares submetidas asonicação descritas por Papahadjopoulos et al. (Biochim. Biophys, Acta.,1967, 135:624 - 638), e grandes vesículas unilamelar.

Técnicas para produzir grandes vesículas unilamelares (LUVs),tais como, inversão da evaporação de fase, procedimentos de infusão e dilu-ição de detergente, podem ser usadas para produzir lipossomas. Uma análi-se destes e outros métodos de produção de lipossomas pode ser observadano texto Liposomes, Marc Ostro, ed., Mareei Dekker, Inc., New York, 1983,capítulo 1, as partes pertinentes do qual são aqui incorporadas por referên-cia. Ver também Szoka, Jr. et al., (1980, Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9:467),cujas partes pertinentes também são aqui incorporadas por referência.

Outras técnicas que são utilizadas para preparar vesículas inclu-em aquelas que formam vesículas de evaporação de fase inversa (REV) 5Papahadjopoulos et al., Patente U.S. n2 4.235.871. Outra classe de liposso-mas que podem ser utilizadas são aquelas caracterizadas como tendo distri-buição de soluto Iamelar substancialmente igual. Esta classe de lipossomasé denominada como vesículas plurilamelares estáveis (SPLV) como definidona Patente U.S. n2 4.522.803 de Lenk, et al. E inclui vesículas monofásicasconforme descrito na Patente U.S. n2 4.588.578 de Fountain, et al. e vesícu-las multilamelares congeladas e descongeladas (FATMLV), como descritoacima.

Uma variedade de esteróis e seus derivados solúveis em águatais como colesterol hemissuccinato foi utilizada para formar lipossomas; verespecificamente Janoff et al., Patente U.S. n2 4.721.612, publicada em 26 deJan. de 1988, intitulado "Steroidal Liposomes." Mayhew et al, descreveramum método para reduzir a toxicidade dos agentes antibacterianos e agentesantivirais mediante a sua encapsulação em lipossomas compreendendo alfa-tocoferol e alguns dos seus derivados. Da mesma forma, uma variedade detocoferóis e seus derivados hidróssolúveis têm sido utilizados para formarlipossomas, ver Janoff et al., Patente U.S. n-5.041.278.

6. Métodos de Preparação

Um processo de formação de lipossomas ou formulações antiin-fectivas lipídicas envolve um processo de "infusão de solvente". Este é umprocesso que inclui dissolver um ou mais lipídios em uma quantidade pe-quena, de preferência mínima, de um solvente compatível com o processopara formar uma suspensão ou solução de lipídio (preferivelmente uma solu-ção) e depois infundir a solução em um meio aquoso contendo o antiinfecti-vo. Tipicamente, um solvente compatível com o processo é um que pode serlavado em um processo aquoso tal como diálise ou diafiltração. A "infusãode etanol", um tipo de infusão de solvente, é um processo que inclui dissol-ver um ou mais lipídios em uma quantidade pequena, de preferência míni-ma, de etanol para formar uma solução lipídica e, em seguida, infundir a so-lução em meio aquoso contendo o antiinfectivo. Uma quantidade "pequena"de solvente é uma quantidade compatível com a formação de Iipossomas oucomplexos lipídicos no processo de infusão. Tais processos estão descritosem Lee et al., Pedido de Patente U.S. 10/634.144, depositado em 4 de agos-to de 2003, Pilkiewicz et al, Pedido de Patente U.S. 10/383.173, depositadoem 5 de março de 2003, e Boni et al., Pedido de Patente U.S. 10/383004,depositado em 5 de março de 2003, cujos pedidos são por meio desta incor-porados por referência em sua totalidade.

A etapa de infusão da solução de lipídio-álcool na solução aquo-sa ou alcoólica ou mistura contendo o antiinfectivo pode ser realizada, acimaou abaixo da superfície da solução aquosa ou alcoólica ou mistura contendoo antiinfectivo. Preferivelmente, a etapa é realizada acima da superfície dasolução ou mistura.

Os lipossomas também podem ser preparados pelos métodosdescritos nos Pedidos de Patente U.S. copendentes: 10/383.004, depositadoem 5 de março de 2003; 10/634.144, depositado em 4 de agosto de 2003;10/224.293, depositado em 20 de agosto de 2002; e 10/696389, depositadoem 29 de outubro de 2003, cujos relatórios descritivos são aqui incirporadosna sua totalidade.

A formulação de Iipossoma ou lipídio produzida sob medida po-de ser concluída por vários métodos, tais como técnicas de extrusão, soni-cação e homogeneização que são bem-conhecidas, e facilmente praticadas,por artífices comumente versados. A extrusão envolve a passagem de Iipos-somas, sob pressão, uma ou mais vezes através de filtros tendo tamanhosde poro definidos. Os filtros são geralmente produzidos de policarbonato,mas os filtros podem ser produzidos de qualquer material durável que nãointeraja com os lipossomas e que seja suficientemente forte para permitir aextrusão sob pressão suficiente. Os filtros preferidos incluem filtros "comple-tamente retos" porque eles geralmente podem suportar a pressão mais ele-vada dos processos de extrusão preferidos da presente invenção. Filtros de"caminho tortuoso" também podem ser utilizados. A extrusão pode tambémusar filtros assimétricos, tais como filtros Anopore®, que envolve a extrusãode Iipossomas através de um filtro poroso de oxido de alumínio tipo poro ra-mificado.

As formulações de Iipossomas ou lipídios também podem serreduzidas em tamanho mediante a sonicação, que emprega energia sonorapara rompimento ou cisalhamento dos lipossomas, que espontaneamente sereformarão em lipossomas menores. A sonicação é conduzida mediante aimersão de um tubo de vidro contendo a suspensão de Iipossoma no epicen-tro sonoro produzido em uma sonicador tipo banheira. Alternativamente,uma sonicador tipo sonda pode ser utilizado em que a energia sonora é ge-rada por vibração de uma sonda de titânio em contato direto com a suspen-são de lipossoma. O mecanismo de homogeneização e moagem, tal como oGifford Wood homogenizer, Polytron® ou Microfluidizer, também pode serusado para quebrar os lipossomas ou formulações de lipídio maiores emlipossomas ou formulações lipídio menores.

As formulações lipossômicas resultantes podem ser separadasem populações homogêneas usando métodos bem-conhecidos na técnica,tal como a filtração de fluxo tangencial. Neste procedimento, uma populaçãoheterogeneamente feita sob medida de lipossomas ou formulações lipídicasé passada através de filtros de fluxo tangeneiais, desse modo resultando emuma população de lipossoma com um limite de tamanho superior e/ou inferi-or. Quando dois filtros de tamanhos diferentes, isto é, com diferentes diâme-tros dos poros, forem empregados, os lipossomas menores do que o primei-ro diâmetro de poro passam através do filtro. Este filtrado pode estar sujeitoà filtração de fluxo tangencial através de um segundo filtro, tendo um tama-nho de poro menor do que o primeiro filtro. O retentato deste filtro é uma po-pulação lipossômica/complexa tendo limites de tamanho superiores e inferio-res definidos pelos tamanhos do poro do primeiro e segundo filtros, respecti-vamente.

Mayer et al. observou que os problemas associados com o en-volvimento eficaz de agentes bioativos ionizáveis lipofílicos tais como agen-tes antineoplásticos, por exemplo, antraciclinas ou vinca alcalóides, podemser atenuados por empregar gradientes de íon da transmembrana. À partede induzir maior absorção, tais gradientes da transmembrana também po-dem atuar para aumentar a retenção antiinfectiva na formulação lipossômica.

As formulações antiinfectivas de lipídio possuem um efeito anti-infectivo controlado e toxicidade mais baixa permitindo menos administraçãofreqüente e um maior índice terapêutico. Em estudos de animal pré-clínicose em comparação com a tobramicina inalada (não lipossômica ou com baseem lipídioe), no nível de dose equivalente, a amicacina lipossômica foi mos-trada de ter, durante o período de tempo logo após a administração em maisde 24 horas posteriores, níveis de fármaco no pulmão que variaram de doisa várias centenas de vezes do que a tobramicina. Adicionalmente, a amica-cina lipossômica manteve estes níveis durante bem mais de 24 horas. Emum modelo animal projetado para imitar a infecção por pseudomonas obser-vada em pacientes CF, a amicacina lipossômica foi mostrada significativa-mente eliminar a infecção nos pulmões do animal quando comparada comos aminoglicosídeos livres.

O tensoativo pulmonar leva em conta a expansão e compressãodos pulmões durante a respiração. Isto é realizado mediante o revestimentodo pulmão com uma combinação de lipídio e proteína. O lipídio é apresenta-do como uma monocamada com as cadeias hidrofóbicas direcionadas parafora. O lipídio representa 80% do tensoativo pulmonar, a maioria do lipídiosendo fosfatidilcolina, 50% da qual é dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC) (Vel-dhuizen et al, 1998). As proteínas de tensoativo (SP), que estão presentesfuncionam para manter a estrutura e facilitar tanto expansão quanto a com-pressão do tensoativo pulmonar como ocorre durante a respiração. Destes,SP-B e SP-C especificamente possuem comportamento lítico e podem sub-meter a Iise os Iipossomas (Hagwood et al., 1998; Johansson, 1998). Estecomportamento Iftico pode facilitar a dissolução gradual dos lipossomas. Oslipossomas também podem ser diretamente ingeridos pelos macrófagos a-través da fagocitose (Couveur et al., 1991; Gonzales-Roth et al., 1991;Swenson et al, 1991). A absorção de lipossomas pelos macrófagos alveola-res é outro meio pelo qual os fármacos podem ser liberados ao sítio doentio.

Os lipídios preferivelmente usados para formar formulações Ii-possômicas ou lipídicas para inalação são comuns aos lipídios endógenosobservados no tensoativo do pulmão. Os lipossomas são compostos de bi-camadas que aprisionam o produto farmacêutico desejado. Estes podem serconfigurados como vesículas multilamelares de bicamadas concêntricas como produto farmacêutica aprisionado dentro do lipídio das diferentes camadasou do espaço aquoso entre as camadas. A presente invenção utiliza proces-sos únicos para criar formulações antiinfectivas lipossômicas ou lipídicasúnicas. Tanto os processos quanto o produto destes processos são parte dapresente invenção.

6.1 Método de Infusão em Linha

Em uma modalidade particularmente preferida, as formulaçõesantiinfectivas lipossômicas da presente invenção são preparadas por ummétodo de infusão em linha em que uma corrente de solução de lipídio émisturada com uma corrente de solução antiinfectiva em linha. Por exemplo,as duas soluções podem ser misturadas em linha dentro de um tubo de mis-tura precedido por um conector Y conforme ilustrado na Figura 8. Desta ma-neira, o método de infusão em linha difere do método de infusão acima des-crito, em que a solução de lipídio é infundida como uma corrente em um vo-lume devolução antiinfectiva. Surpreendentemente, este método de infusãoresulta em relações de lipídio para fármaco inferiores e eficiências encapsu-lamento superiores. O processo pode ser ainda melhorado pelos parâmetrosde otimização tais como a taxa de fluxo, a temperatura, a concentração deantiinfectivo, e a adição de sal após a etapa de infusão.

6.1. Efeito das taxas de fluxo

As taxas de fluxo individuais eram variadas enquanto se manti-nha a taxa de fluxo total em 800 ml/min. Para isso, duas bombas separadasforam usadas fixas em diferentes taxas de bombeamento. As soluções mis-turadas foram infundidas durante 10 s em uma proveta contendo solução deNaCI tal que a concentração final de NaCI foi de 1,5% e o concentração finalde etanol não ultrapassou a 30%. Após misturar, uma alíquota de 1 ml foipassada por uma coluna de filtração de gel Sephadex G-75 para separar aamicacina livre da encapsulada. Uma fração de 1 ml com densidade maiselevada (determinada pela turbidez visual) foi coletada para posterior análi-se. Os resultados são apresentados na Tabela 1. Aumentando a relação dataxa de fluxo de lipídio/amicacina resulta em uma L/D quase constante deaté 300/500 ml/min. Com outro aumento da taxa de lipídio, LVD começou aaumentar e o tamanho de partícula também começou a ficar maior. Aomesmo tempo, taxas de fluxo de lipídio mais elevadas fornecem melhor re-cuperação de amicacina.(eficiência de encapsulamento) quando mais volu-me de lipídio for adicionado.

Tabela 1. Efeito das taxas de fluxo sobre o encapsulamento de amicacina.*

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* Soluções de lipídio e amicacina foram mantidas em 40°C. Solução de es-toque de amicacina foi de 50 mg/ml. Solução de NaCI a 10% foi adicionadaantes da infusão para obter 1,5% final. O tempo de infusão foi fixado em 10s. Tubo de mistura 10 cm, misturador em linha de 6 elementos posicionado a0 cm.

A batelada 3 com as taxas de fluxo de lipídio/amicacina de300/500 ml/min apresentou a melhor L/D e tamanho de partícula, combinadacom a recuperação de amicacina razoavelmente elevada. Assim decidiu-seutilizar estas taxas de fluxo para todas as outras experiências.

A fim de reproduzir os resultados em condições selecionadasuma batelada completamente lavada (batelada 6) utilizando diafiltração foipreparada como apresentado na Tabela 2. Solução de NaCI a 10% foi adi-cionada no béquer antes da infusão para produzir a concentração final 2%(em comparação com 1,5% nas bateladas na Tabela 1). A L/D resultante(1.71) não foi tão boa como na batelada 3 na Tabela 1 e o tamanho de partí-cula foi superior. Isto pode ser devido a um efeito adverso da alta concentra-ção de NaCI que faz contato com os Iipossomas nos estágios iniciais de for-mação do lipossoma. Amostras separadas (lavadas) utilizando colunas defiltração de gel tendem a ter melhor LVD do que aquelas lavadas por diafiltra-ção. Isso pode ter a ver com o grau diferente de tensão da experiência delipossoma, ou simplesmente as amostras separadas na coluna de filtraçãode gel continham uma fração de Iipossomas com melhor L/D que não repre-senta o conjunto da população.

Tabela 2. Sumário das bateladas completamente lavadas. Os parâmetros deprocesso foram variados: temperaturas, concentração de estoque de amica-cina, e outros (ver Tabela 3 abaixo). Todas as bateladas estavam concen-tradas em quase um limite máximo, até que a pressão de entrada alcançou a69 KPA (10 PSI).

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* A 3â coluna representa as temperaturas das soluções de Iipfdio e amicaci-na pouco antes da infusão, e a temperatura durante a lavagem (diafiltração).RT = temperatura ambiente.

"Tamanho de VOL" é o tamanho de partícula pesado em volume.Tabela 3. Condições de processamento para as bateladas de 1 a 18.*

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* Soluções de lipídio e amicacina foram infundidas em taxas de 300/500ml/min durante 30 s (exemplos de 6 a 10) ou 20 s (exemplos de 11 a 18).Solução aquosa adicional (NaCI ou água) foi adicionada (como partes relati-vas à 500 partes de amicacina em volume).

6.1 .b Efeitos da temperatura do processo.

As definições foram mantidas as mesmas como na batelada 3exceto que a quantidade de solução de NaCI era menor, tornando a concen-tração final 1,0%. A solução foi adicionada novamente antes da infusão tersido iniciada porque com o tempo de infusão curto fica difícil fazer a adiçãodurante a infusão. Também, durante a infusão o misturador em linha foitransferido para o final do tubo de mistura sob a pressão do fluxo. A posiçãodo misturador era de 5 cm da extremidade dianteira do tubo em vez de 0 cmpara a batelada 3. Isso pode ser importante, quando a relação L/D obtida namesma condição de temperatura 40/40°C na batelada 20 foi 0,55, quasemetade do que na batelada 3. Comparando o encapsulamento de amicacinaem diferentes temperaturas de infusão, pode-se ver que, surpreendentemen-te, as temperaturas mais baixas deram melhor L/D. Das temperaturas testa-das, as temperaturas de lipídio/amicacina 30/30°C e 50/RT deram relaçõesde L/D similares de 0,32 e 0,37. Mais uma vez, como nas bateladas de 1 a 5,os números destas amostras lavadas por filtração de gel foram baixos, talvezmenos do que se as bateladas tivessem sido lavadas por diafiltração.

Tabela 4. Efeito da temperatura sobre o encapsulamento de amicacina.*

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* Soluções de lipídio e amicacina foram infundidas em taxas de 300/500ml/min durante 10 s. Solução de estoque de amicacina foi de 50 mg/ml. So-lução de NaCI a 10% foi adicionada antes da infusão para obter uma con-centração final de 1,0%. Tubo de mistura 10 cm, misturador em linha de 6elementos posicionado a 5 cm.

Nas experiências separadas verificou-se que a mistura de 90%etanol e água em 30°C e 30°C ou 50 0C e 22°C, respectivamente, resultouem uma temperatura final similar de quase 36°C. Isso sugere que a tempera-tura da mistura final em vez daquela dos componentes individuais é impor-tante para o encapsulamento de amicacina. As temperaturas 50°C/RT foramutilizadas nos exemplos de 6 a 15. Nos exemplos de 16 a 18 as temperatu-ras de 30°C e 30°C para as duas correntes foram utilizadas com resultadoscomparáveis, embora um pouco menos de encapsulamento de amicacina foiobservado.

6.1 .c. Efeito de adição pós-infusão do volume aauoso

Atenção foi logo depois focalizada nas etapas de adição de so-lução de NaCI e do processo de lavagem. Os parâmetros do processo eramvariados em várias direções. Logo após a etapa de infusão nas taxas de flu-xo de 300/500, a concentração de etanol na mistura chega a 34%. A amica-cina teve solubilidade limitada nesta concentração (ver figura 9).

No caso de se começar com 50 mg/ml de estoque de amicacina,depois após a mistura com a solução de lipídio, haverá mais do que 30mg/ml de amicacina total em que pelo menos metade (15 mg/ml) é amicaci-na livre, assumindo 50% de eficiência de encapsulamento. Isto é mais ele-vado do que o limite de solubilidade de 34% de etanol. Uma possível solu-ção para este problema é adicionar mais água ao recipiente com a misturade lipídio/amicacina, reduzindo assim a concentração tanto de etanol quantode amicacina. Por exemplo, adicionando 200 partes de água (ou solução deNaCI) à 800 partes de Lipídio/amicacina reduziria o etanol para 27% (Figura9). Isto torna a amicacina solúvel em 15 mg/ml ou ainda superior dependen-do da temperatura.

Além disso, acrescentando NaCI pode estabilizar as condiçõesosmóticas. Quando os Iipossomas forem formados e a amicacina for encap-sulada em uma concentração interna de 200 a 300 mg/ml, existe apenas-15 mg/ml mais ou menos de amicacina não encapsulada. Na ausência desalina isso iria criar um desequilíbrio osmótico, o qual, por sua vez, poderialevar à fuga de amicacina. Adicionando 150 partes de NaCI a 10% em 800partes de lipídio/amicacina resultará em cerca de 1,5% NaCI de concentra-ção final (foraos lipossomas).

Várias bateladas foram geradas em que diferentes quantidadesde solução de NaCI (ou água em algumas bateladas) foram adicionadas emmomentos diferentes em relação ao evento de infusão (ver Tabela 5, compi-lada a partir das Tabelas 2 e 3). A partir da tabela uma tendência geral podeser vista, levando às seguintes conclusões:

- Algum intervalo de tempo entre a infusão e a adição do volume aquoso érequerido para se obter L/D mais baixas (se um tubo de mistura curto forusado). Das bateladas 6-15, aqueles com um intervalo de 20 s ou mais lon-go tiveram L/D mais baixa. Uma possível explicação é que os lipossomasnão estão completamente formados imediatamente após a mistura das cor-rentes. Quando um tubo de mistura mais longo for utilizado (bateladas 16-18), a que permite um tempo de mistura mais longo, o intervalo de temponão é requerido.

- Adicionando uma solução de NaCI em concentração elevada para equili-brar osmolalidade realmente não ajuda reter a amicacina. De fato, a adiçãode água pura em um intervalo de tempo apropriado resultou na L/D e con-centração de amicacina total mais baixas.

- Adicionando 100 partes de NaCI a 10% (batelada 9) 5 min após a infusãoforneceu uma relação de L/D competitiva, mas não forneceu uma boa con-centração de amicacina total. Pode ser que o NaCI, quando presente nosestágios iniciais com concentrações de etanol relativamente elevadas, leva auma agregação aumentada e viscosidade.

Tabela 5. Papel do volume aquoso e da concentração de NaCI adicionadosà mistura de lipídio/amicacina para ajustar a concentração de etanol. Nemtodas as variáveis mostradas; ver as tabelas 2 e 3.

<table>table see original document page 34</column></row><table>Tabela 5 - continuação

<table>table see original document page 35</column></row><table>

6.1.d. Efeito da solução estoque antiinfectiva

Anteriormente verificou-se que utilizando 50 mg/ml de soluçãode estoque de amicacina produziria a melhor captura. A redução da concen-tração de estoque de amicacina para 40 mg/ml aumentou a L/D quando utili-zada em processos convencionais. Com o processo de infusão em linha deduas correntes, a concentração de etanol atinge níveis mais elevados, demodo que os 50 mg/ml correntes de amicacina podem não ser a concentra-ção ideal.

A Tabela 6 resume o efeito de utilizar várias concentrações deestoque de amicacina. 40 mg/ml liberaram valores de UD comparáveis oumelhores, e ainda melhoraram a recuperação de amicacina. Usando menosamicacina em relação a uma quantidade constante de lipídio, e fornecendouma l_/D similar, resultou em um encapsulamento percentual mais elevado(batelada 12). Outra diminuição da concentração de estoque de amicacinapara 30 mg/ml resultou num ligeiro aumento de LVD, emborâ a recuperaçãoainda era impressiva (batelada 13).

Tabela 6. Concentração de estoque de amicacina pode ser reduzida en-quanto melhora a eficiência. A recuperação de amicacina é calculada combase na l_/D obtida e adotada 100% de recuperação de lipídio.<table>table see original document page 36</column></row><table>

A Redução da concentração de estoque de amicacina possuiuma outra implicação. Reduz a concentração de amicacina livre em umamistura de lipídio/amicacina pós-infusão, que lhe permite permanecer solúvelem concentração de etanol mais elevada. Assumindo que o lipídio e a ami-cacina são misturados em relação de 300/500, o estoque de amicacina é de50 mg/ml, e a eficiência de encapsulamento é de 37%, então a amicacinalivre inicial seria -20 mg/ml. Do mesmo modo, 40 mg/ml de estoque de ami-cacina com 52% de encapsulamento resultaria em -12 mg/ml de amicacinalivre. 30 mg/ml de estoque de amicacina com 46% de encapsulamento resul-taria em -10 mg/ml de amicacina livre.

7. Relação de Lipídio para Fármaco

Existem várias formas de aumentar a captura dos antiinfectivos(por exemplo, aminoglicosídeos tais como amicacina, tobramicina, gentami-cina) nos lipossomas. Uma forma é produzir Iipossomas muito grandes (> 1pm), em que o volume de captura por quantidade de lipídio é grande. Estaabordagem de conseguir uma menor relação de l_/D não é prática para ina-lação (nebulização) de lipossomas porque 1) a tensão de cisalhamento du-rante a nebulização tende a romper os lipossomas em uma maneira depen-dente do tamanho em que maiores lipossomas (> 0,5 μιτι) sofrem maior libe-ração e 2), os tamanhos menores de gotícula necessários para uma boa de-posição no pulmão são em si menores do que cerca de -3 μιτι. Portanto,para inalação, é desejável manter o tamanho do Iipossoma tão pequenoquanto possível para evitar demasiada liberação. Correntemente, o diâmetromédio para os lipossomas aqui descritos é menor do que cerca de 0,4 μιτι(ver a Tabela 4).

Uma outra abordagem para diminuir a L/D é o uso de lipídiosnegativamente carregados. Os aminoglicosídeos listados acima são muitopositivamente carregados com 4 a 5 aminas per compostos. Geralmente ossais de sulfato destes aminoglicosídeos são utilizados em formulações tera-pêuticas. Juntamente com o caráter multicatiónico surge uma forte ligaçãoaos lipossomas negativamente carregados. Isto resulta em um maior envol-vimento durante a formação de lipossoma. O propósito das formulações anti-infectivas é fornecer liberação controlada no ambiente pulmonar. A liberaçãorápida dos lipossomas pela absorção macrófaga operaria ao contrário disto.Tem sido bem documentado que os Iipossomas negativamente carregadosexperimentam um grau muito mais elevado de absorção pelos macrófagosdo que os Iipossomas neutros. Por essa razão, é desejável utilizar Iiposso-mas neutros.

Um grupo de tecnologias que permite a captura de fármaco mui-to elevada em pequenos Iipossomas se baseia em carga de gradiente emque um pH gradiente, gradiente de sulfato de amônio, ou gradiente Mg-sulfato são utilizados para carregar os fármacos de amina em lipossomas:ver as Patentes U.S. n25: 5.578.320 5.736.155 5.837.279 5.922.350 (pH gra-diente); 5.837.282 5.785.987 (gradiente de Mg-sulfato) e 5.316.771 (gradien-te de sulfato de amônio). Estas técnicas só funcionam para aminas permeá-veis na membrana (mono-aminas em que a forma neutra é permeável comodoxorrubicina e daunorrubicina). Carga de gradiente não fará funcionar paracertos antiinfectivos tais como aminoglicosídeos quando eles forem imper-meáveis (também grandes e também altamente carregados).

Todos os processos aqui descritos podem ser facilmente adap-tados para § fabricação asséptica em grande escala. O tamanho de lipos-soma final pode ser ajustado mediante a modificação dos parâmetros decomposição, concentração, excipientes e processamento de lipídio.

A relação de lipídio para fármaco utilizando os processos dapresente invenção é de cerca de 4:1 a cerca de 1:1. Em outra modalidade, arelação de lipídio para fármaco é de cerca de 3:1 a cerca de 1:1, 2:1 a cercade 1:1, cerca de 1:1 ou menos, cerca de 0,75:1 ou menos, ou cerca de 0,5:1ou menos. Além disso, a percentagem de antiinfectivo livre, presente após oproduto ser dialisado para uma determinada duração, é diminuída.

8. Resultados

8.1. Barreiras de Biopelícula de infecções Pulmonares

Um obstáculo para tratar as doenças infecciosas tais como aPseudomonas aeruginosa, a principal causa de doença crônica em pacien-tes com fibrose cística é a penetração de fármaco dentro da saliva/barreirade biopelícula sobre as células epiteliais (Figura 1). Na Figura 1, as formastoroidais representam uma formulação lipossômica antiinfectiva, o símbolo"+" representa antiinfectivo livre, o símbolo "-" mucina, alginato e DNA, e osímbolo de barra sólida representa Pseudomonas aeruginosa. Esta barreiraé composta de P. aeruginosa tanto colonizada quanto planctônica incorpora-da em alginato ou exopolissacarídeos de bactérias, assim como DNA deleucócitos danificados, e mucina de células epiteliais pulmonares, todos pos-suindo uma carga negativa líquida (Costerton, et al., 1999). Esta carga nega-tiva liga-se e impede a penetração de fármacos positivamente carregadostais como aminoglicosídeos, tornando-os biologicamente ineficazes (Men-delman et al., 1985). A captura de antiinfectivos dentro das formulações Ii-possômicas ou lipídicas pode proteger ou parcialmente proteger os an-tiinfectivos da ligação não específica à saliva/biopelícula, levando em contaas formulações lipossômica ou lipídicas (com aminoglicosídeo capturado)para penetração (Figura 1).

Amicacina foi demonstrada de ter um grau elevado de resistên-cia às enzimas bacterianas, proporcionando assim uma maior porcentagemde isolados clínicos suscetíveis do que foi observado para outros aminogli-cosídeos incluindo tobramiçina e gentamicina (Price et al., 1976). Em parti-,·cular, os isolados ed P. aeruginosa são muito mais sensíveis à amicacina doque outros aminoglicosídeos embora não apresente nenhuma resistênciacruzada (Damaso et al., 1976).

O efeito de liberação controlada e depósito das formulações delipossoma de amicacina é claramente visto na figura 2. Neste estudo aosra-tos eram administrados tobramiçina através da administração intratraqueal eintravenosa. Aos ratos eram também administrados formulações lipossômi-cas de amicacina intratraquealmente na mesma dose (4 mg/rato). Os dadosmostram que é apenas com a formulação lipossômica de amicacina que umefeito de liberação controlada e depósito é alcançado. De fato, 24 horas a-pós a dosagem, apenas as formulações lipossômicas de amicacina mostramníveis significativos do fármaco nos pulmões do animal, enquanto ambas asformulações de tobramicina revelaram níveis insignificantes, principalmentedevido, acredita-se, à rápida absorção sistêmica. Esta superior do que umaumento de centena de vezes de aminoglicosídeo no pulmão para formula-ções antiinfectivas lipossômicas sustenta a idéia de um antiinfectivo de for-mulação lipossômica liberação sustentada que pode ser tomado significati-vamente menos vezes do que a formulação TOBI® correntemente aprovada(uma solução de inalação de tobramicina produzida pela Chiron Corporation,Ameryville, CA).

Além disso, a presença de uma saliva/biopelícula impede a pe-netração dos aminoglicosídeos livres devido à ligação dos antiinfectivos emsua superfície (Figura 1). Portanto, doses com excesso de 1000 g de tobra-micina/grama de tecido pulmonar são necessárias para mostrar um efeitoterapêutico em pacientes com CF. Isto é superado com formulações de Ii-possoma de amicacina. Assim, o nível terapêutico de fármaco é mantido porum longo período de tempo nas formulações lipossômicas de amicacinacomparado com a tobramicina livre. Esta facilitação de ligação e penetraçãopode ser também um meio pelas quais as formulações de Iipossoma de ami-cacina podem significativamente reduzir a resistência bacteriana comumentevista desenvolver quando as antibactérias estão presentes in vivo em níveisabaixo da concentração inibitória mínima.

8.2. Farmacocinéticos

Os farmacocinéticos de amicacina foram determinados em ratosapós a administração intratraqueal (IT) de tobramicina livre ou formulaçõeslipossômica de amicacina. Estes dados foram comparados com a distribui-ção obtida nos pulmões seguinte a uma injeção na veia da cauda de tobra-micina livre. Em todos os casos uma dose de 4 mg/rato foi administrada.Como pode ser visto na figura 2, uma deposição muito maior de aminoglico-sídeo pode ser liberada por IT, em comparação com a injeção. O efeito dedepósito da tecnologia de antiinfectivo lipossômico também é demonstradoem que, em comparação com tobramicina administrada quer por IT quer porIV, um aumento maior do que uma centena de vezes no fármaco para formu-lações lipossômicas de amicacina ainda permanece nos pulmões vinte equatro horas após a administração. Assim, o nível terapêutico de fármaco émantido por um longo período de tempo nas formulações lipossômicas deamicacina comparado com a tobramicina livre.

A ligação de aminoglicosídeos à saliva de pacientes CF é umapreocupação, particularmente se esta ligação reduz a bioatividade do antiin-fectivo (Hunt et al., 1995). Para determinar se as formulações lipossômicasde amicacina podem reter a atividade biológica durante um período de tem-po prolongado, ratos normais foram administrados com formulações lipos-sômicas de amicacina por instilação intratraqueal. Isto foi seguido por suaremoção em 2 ou 24 horas através de uma lavagem brônquica alveolar(BAL) para determinar a atividade biológica. As amostras foram concentra-das por ultrafiltração seguido de filtração (0,2 mícrons) para remover os mi-cróbios pulmonares contaminantes. A concentração de amicacina foi deter-minada empregando um instrumento TDX e a atividade biológica determina-da usando um ensaio de diluição de caldo Mueller Hinton (Pseudomonasaeruginosa). Os resultados são apresentados na Tabela 7.

Tabela 7. Resultados mostrando que as formulações lipossômica de amica-cina retêm a atividade biológica duran te um período de tempo prolongado.

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Como demonstrado pela tabela acima, a formulação lipossômicafiltrada recuperada de amicacina foi capaz de matar a P. aeruginosa em umensaio de caldo Mueller Hinton mesmo após 24 horas com uma MIC de 4.Em 2 horas uma MIC de 2 foi obtida, que é similar àquela obtida para o es-toque de amicacina lipossômica/complexa filtrado. Assim, a formulação Ii-possômica de amicacina foi ainda ativa 24 horas seguintes no pulmão. Em24 horas a tobramicina livre na mesma dose foi indetectável em uma BAL.Isto indica que não apenas a formulação antiinfectiva lipossômica é retida nopulmão, mas também é livremente disponível para penetrar em uma sali-va/biopelícula durante um tempo. Estes dados combinados com os fatos tãoevidentes na Figura 2 e Tabela 9 (abaixo), em que as formulações lipossô-micas de amicacina liberam o antiinfectivo livre durante um tempo, enquantomantém altos níveis do antiinfectivo nos pulmões, sustentam a análise racio-nal de que este sistema pode produzir um efeito antiinfectivo controlado du-rante um tempo. Este efeito deve provar significativo na redução tanto dabio-carga da Pseudomonas e o desenvolvimento de resistência devido aosníveis mínimos de antiinfectivo.

Como uma demonstração in vitro de liberação lenta de formula-ção lipossômica de amicacina e seu efeito antiinfectivo controlado, a formu-lação foi incubada na saliva de pacientes com doença pulmonar obstrutivacrônica (DPOC) contendo PAOI Pseudomonas mucóides. A formulação li-possômica de amicacina também foi incubada em alginato contendo PAOIPseudomonas mucóides. Em ambos os casos a matança controlada e refor-çada das Pseudomonas foi observada durante um tempo, como mostrado naTabela 8.

Tabela 8. Matança in vitro de Pseudomonas durante um tempo.

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As curvas de morte clássicas não são aplicáveis para a tecnolo-gia de formulação antiinfectiva lipossômica porque as formulações lipossô-micas apresentam uma liberação lenta de antiinfectivo com um efeito antiin-fectivo reforçado. A formulação lipossômica protege a amicacina da salivae/ou alginato até a sua liberação. Em tempo, a matança completa é obser-vada, em consonância com o modelo de efeito antiinfectivo controlado deliberação lenta liberação sem interferência ou inativação do antiinfectivo.

A eficácia das formulações de amicacina lipossômicas foi estu-dada usando um modelo de infecção pulmonar crônica (Cash et al., 1979),em que a P. aeruginosa, embutida em uma matriz globular de agarose, foiinstilada na traquéia dos ratos. Este modelo animal de Pseudomonas mucói-des foi desenvolvido para se parecer com as infecções de Pseudomonasobservadas em pacientes CF. Algumas dos correlatos clínicos à CF incluem:uma similar patologia pulmonar; o desenvolvimento de distúrbios complexosimunes; e uma conversão ao fenótipo mucóide por cepas de P. aeruginosa(Cantin and Woods, 1999). Os pulmões de ratos foram infectados com maisde 107 CFUs de um Pseudomonas mucóide (cepa PAOI) tomado de um iso-lado de paciente CF e, subseqüentemente tratados com (a) aminoglicosí-deos livres, (b) o veículo lipídico isoladamente como controle não fármacoso,e (c) Formulação de amicacina lipossômica. Além disso, as formulações fo-ram primeiro submetidos a triagem sobre a capacidade de matar P. aerugi-nosa in vitro em placas Kirby-Bauer modificadas.

Várias formulações de amicacina lipossômicas foram testadascom base em diferentes composições lipídicas ou fabricação de parâmetrosresultando em diferentes zonas de matança em experiências in vitro. Estaexperiência foi concebida para determinar o aumento na eficácia obtida comformulações de aminoglicosídeo lipossômicas sobre o aminoglicosídeo livre.Composições lipídicas de controle em branco, duas diferentes formulaçõesde amicacina lipossômicas e amicacina livre e Tobramicina livre nas mes-mas concentrações de aminoglicosídeo como as formulações antiinfectivaslipossômicas foram comparadas. Além disso, uma dose 10 vezes maior daamicacina livre e uma dose 10 vezes maior da tobramicina livre também fo-ram dadas. A dosagem foi IT diariamente durante sete dias. Os resultados(Figura 3) indicam que a amicacina lipossômica nas duas formulações (dife-rindo na composição lipídica) revelaram uma redução significativa nos níveisde CFU e foram melhores na redução de CFUs do que a amicacina livre outobramicina livre em dosagens 10 vezes mais elevadas. Na Figura 3, Lip-An-14 é DPPC/Chol/DOPG/DOPG (42:45:4:9) e 10 mg/ml de amicacina, Lip-An-15 é DDPC/Chol (1:1) também em 10 mg/ml. Todas as relações de lipídio-lipídio e lipídio-fármaco aqui são peso de peso.

A próxima experiência (Figura 4) foi designada para demonstrara liberação lenta e controlada das capacidades de antiinfectivos de formula-ções de amicacina lipossômicas. A dosagem foi dia sim, dia não durante 14dias, em oposição a todos os dias durante sete dias como nas experiênciasanteriores. Os resultados indicam que a amicacina lipossômica nas duasformulações (diferindo na composição de lipídio) tinha uma potência de 10 a100 vezes (maior capacidade de reduzir os níveis de CFU) do que a amica-cina livre ou tobramicina livre. A dose humana diária de 600 mg de TOBI®(uma solução de inalação de tobramicina produzida pela Chiron Corporation,Ameryville1 CA), ou cerca de 375 mg/m2, corresponde a uma dose de ratodiária de 9,4 mg. Assim, os dados podem ser diretamente correlacionados auma melhora de 10 para 100 vezes na eficácia em seres humanos. Deve serobservado que uma redução de dois Iog é a melhor que pode ser observadaneste modelo. Uma redução de 100 vezes em P. aeruginosa nos ensaios desaliva foi correlacionada com a função pulmonar melhorada (Ramsey et al.,1993). A liberação controlada das formulações de amicacina lipossômicasindicam que uma dose mais baixa e/ou menos freqüentes de dosagem podeser utilizada para obter uma maior redução no crescimento bacteriano doque pode ser obtida com aminoglicosídeo livre.

A eficácia da formulação amicacina lipossômica foi estudada emum modelo de infecção pulmonar crônica em que P. aeruginosa foi incorpo-rada em uma matriz.glóbular de agarose que foi instilada através da traquéiade ratos Sprague/Dawley. Três dias mais tarde a amicacina livre ou a amica-cina lipossômica foi dosada todos os dias (Figura 3), ou dia sim, dia não (Fi-gura 4) em 1 mg/rato ou 10 mg/rato do aminoglicosídeo administrado ou 1mg/rato de amicacina lipossômica, assim como com Iipossomas em branco(veículo lipídico) como o controle, com cinco ratos por grupo.

Os pulmões de rato homogeneizados (congelados) seguinte aexperiência de 14 dias foram analisados com relação ao teor e a atividadede aminoglicosídeo. A análise química clínica foi realizada utilizando um ins-trumento TDX enquanto o bioensaio foi realizado pela medição das zonas deinibição em placas de ágar embutidas com Bacillus subtilis. Os resultadossão apresentados na Tabela 9:

Tabela 9: Resultados dos pulmões de rato tratados com a formulação deamicacina lipossômica infectados com P. aeruginosa.

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Os pesos de fármaco são para o fármaco normalizado na au-sência de qualquer forma de sal.

Os resultados da Tabela 10 indicam que o aminoglicosídeo estápresente e ativo para ambas as formulações antiinfectivas lipossômicas, en-quanto pouco pode ser detectado para o aminoglicosídeo livre mesmo nadose 10 vezes mais elevada. Estes outros resultados estabelecem as carac-terísticas de liberação controlada de formulações antiinfectivas lipossômicas,e também confirmam que o antiinfectivo que permanece ainda está ativo.Das formulações acima apenas a tobramicina livre (0,1 micrograma/ml) a -presentou qualquer nível detectável de aminoglicosídeo nos rins.

O efeito de liberação e depósito controlado da formulação deamicacina lipossômica é ainda demonstrado na Figura 5. Os ratos foramprovidos com uma infecção pulmonar crônica em que P. aeruginosa foi in-corporada em uma matriz globular de agarose que foi instilad.a através datraquéia, usando os mesmos glóbulos empregados nos estudos de eficácia.Os ratos foram depois providos com tobramicina livre ou amicacina lipossô-mica (formulação Lip-An-14), através da administração intratraqueal namesma dose (2 mg/rato). Os dados, medidos em micrograma de antiinfectivopor grama de tecido pulmonar durante um tempo, mostram que o antiinfecti-vo lipossômico apresenta um efeito de liberação e depósito controlado en-quanto a tobramicina livre revelou níveis insignificantes nos pulmões em 24horas, acredita-se principalmente devido à rápida absorção sistêmica. Esteaumento maior do que uma centena de vezes de antiinfectivo no pulmãocom relação às formulações de amicacina lipossômica em um rato infectadosustenta a idéia de um antiinfectivo lipossômico de liberação controlada quepode ser tomado significativamente menos vezes do que a formulação deTOBI® correntemente aprovada (uma solução de inalação de tobramicinaproduzida pela Chiron Corporation, Ameryville, CA).

Os farmacocinéticos de amicacina foram determinados em ratosseguinte à administração intratraqueal (IT) de tobramicina livre ou amicacinalipossômica. Uma dose de 2 mg/rato foi administrada. O efeito de depósitode tecnologia antiinfectiva lipossômica é demonstrado em que em compara-ção com a tobramicina livre fornecida IT1 um aumento maior do que umacentena de vezes no fármaco com relação a amicacina lipossômica aindapermanece nos pulmões infectados vinte e quatro horas após a administra-ção. Assim, o nível terapêutico de fármaco é mantido por um período detempo mais longo nas formulações lipossômicas em comparação com a to-bramicina livre.

A Figura 7 mostra o tempo de permanência extraordinário e a-cúmulo de quantidades efetivas de antiinfectivo nos pulmões, um resultadoque estabelece que dosagens relativamente freqüentes podem ser usadas.Cada dose é de 4 h. por inalação (em ratos, 3 ratos por grupo, como acima),de formulações de amicacina lipossômica nebulizadas (DPPC/Chol., 1:1) em15 mg/ml de amicacina. A dosagem foi no dia um; no dia um, três e cinco, oudia um, dois, três, quatro e cinco. Os ratos fornecendo uma dada barra dedados foram sacrificados após a,respectiva dosagem da barra de dados. Aformulação é feita como no Exemplo.

Os antiinfectivos similares podem ser utilizados para o tratamen-to de infecções intracelulares como o antraz e tularemia pulmonares. No an-traz pulmonar os esporos de antraz atingem os alvéolos em um aerossol. Osesporos de inalação são ingeridos por macrófagos pulmonares nos alvéolose transportados para os nódulos da Iinfa traqueobrônquica regionais ou nó-dulos da Iinfa mediastínica através dos linfáticos (Pile et al., 1998; Gleiser etal., 1968). O macrófago é central tanto na via infectiva quanto no contribuidorprincipal de auto-destruição do hospedeiro no antraz sistêmico (inalação).Além de seus atributos de liberação controlada e direcionamento, a tecnolo-gia de formulação antiinfectiva lipossômica pode intensificar a absorção celu-lar e pode usar macrófagos alveolares e células epiteliais pulmonares nodirecionamento e liberação de fármaco. A posse destas características ésuposta de facilitar o tratamento destas infecções intracelulares, cujas infec-ções ocorrem nos pulmões e são transportadas por macrófagos. Mais impor-tante ainda, estas características devem tornar o antiinfectivo mais eficaz emque o antiinfectivo lipossômico deve ser consumido por fagocitose pelas mui-tas células contendo a doença. O antiinfectivo seria liberado intracelularmen-te em uma maneira direcionada, desse modo atacando a infecção antes queseja disseminado. O fármaco encapsulado pode ser um produto farmacêuti-co anteriormente aprovado como ciprofloxacina, tetraciclina, ertiromicina ouamicacina. As formulações de ciprofloxacina lipossômicas foram desenvolvidas.

Em um estudo, este composto foi administrado em camundon-gos e comparados tanto com a ciprofloxacina livre administrada intratraque-almente quanto com a ciprofloxacina livre administrada por via oral, com to-dos os três compostos administrados na mesma dose (Figura 6). A dose pa-ra cada camundongo foi de 15 mg/kg, com três camundongos por grupo. Aciprofloxacina lipossômica foi em DPPC/Colesterol (9:1), em 3 mg/ml de ci-profloxacina, com a formulação produzida como no Exemplo. A relação delipídio para fármaco foi de 12,5:1 em peso. Em comparação com a ciproflo-xacina oralmenje administrada, a ciprofloxacina lipossômica estava presentenos pulmões dos camundongos em quantidades de mais de duas ordens degrandeza superiores do que a ciprofloxacina livre. Além disso, apenas a ci-profloxacina lipossômica mostraou níveis de fármaco no pulmão após 24horas, enquanto o fármaco oralmente administrado erá não detectável emmenos de duas horas. Estes dados sustentam o uso de formulações de ci-profloxacina lipossômicas e outros antiinfectivos como aminoglicosídeos,tetraciclinas e macrólidos para o tratamento e para a prevenção de profiláticade doenças intracelulares usadas por bioterroristas.

8.3. Parâmetros de Lipossoma

Os lipídios a serem empregados são dissolvidos em etanol paraformar uma solução de lipídio-etanol. A solução de lipídio-etanol é infundidaem uma solução aquosa ou etanólica contendo a molécula do agente bioati-vo a ser capturado. Os lipídios espontaneamente formam vesículas.

A Tabela 10 descreve os parâmetros de formulação antiinfectivolipossômica em que os lipídeos são DPPC e colesterol.

Tabela 10. Parâmetros de formulação antiinfectiva lipossômica.

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* Lipossomas DPPC/Colesterol em que a relação de DPPC/Col é de aproxi-madamente 1:1.

** Apenas a quantidade capturada de amicacina foi considerado no cálculoL/D.

Outra informação sobre a formação de formulações antiinfecti-vas lipossômicas pode ser encontrada em PCT/US03/06847, depositado emde março de 2003, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade.

O volume capturado é uma característica fundamental de umaformulação lipossômica e é determinado como o volume de fase aquosa in-tralipossomal por unidade de lipídio. É geralmente expresso em unidades daplitros/Mmol. Freqüentemente se assume que quando os lipossomas sãoformados a concentração dos Iipossomas dentro do soluto é igual àquelafora da solução de volume. Um volume capturado mais elevado então levariaà relação de fármaco/lipídio mais elevada, ou seja, uma concentração defármaco total superior para a formulação final.

Na formulação de amicacina lipossômica, no entanto, verificou-se que a verdadeira relação de fármaco/lipídio que pode ser produzida foimais do que 3 vezes mais elevada que seria de esperar com base no volu-me capturado. A Tabela 11 mostra os resultados para 4 preparações de a-mostra diferentes de formulações antiinfectivas de lipídio (ver Exemplo 2 naseção de exemplificação).

Tabela 11. Carga de amicacina em lipossomas preparados por diferentesmétodos.

<formula>formula see original document page 48</formula>

As amostras 1 e 2 foram produzidas pelo procedimento de infu-são de etanol aqui descrito, e as amostras 3 e 4 foram produzidas pelas téc-nicas de formação de Iipossoma conhecidas no técnica.

As concentrações de amicacina foram medidas por ensaio deimuno-fluorescência utilizando reagente INNOFLUO Seradyn fixado no ana-lisador TDx. Os lipídeos foram medidos por HPLC de fase reversa utilizandocoluna C-8 e detector de dispersão luminosa.

O volume lipossômico (volume ocupado por Iipossomas por uni-dade de volume total) nas amostras # 1 a 3 foi determinado pela medição daconcentração da sonda fluorescente (Sulforrodamina 101 ou Carboxifluores-ceína) no volume total e no volume de filtrado da formulação obtida por cen-trifugação no dispositivo de filtração CentriSart. A concentração de sonda nofiltrado é mais elevada que a média devido à exclusão da sonda a partir dovolume ocupado por lipossomas.Na amostra # 4, o volume de Iipossoma foi determinado pelamedição da concentração de íon de potássio em uma amostra depois deadicionar a quantidade fixa de 250 ul de KCI (VacJd) em 10 ml de suspensãode Iipossoma (V0). As amostras foram depois centrifugadas 30 min a 4000rpm e um sobrenadante foi tomada para medir o íon potássio (K) por eletro-do sensível a potássio Cole-Parmer. A concentração de potássio medida foisempre mais elevada do que o esperado devido à exclusão dos íons potás-sio do volume ocupado por lipossomas. No controle, uma quantidade igualde KCI foi adicionada em 10 ml de solução salina. A concentração de potás-sio no controle Kc foi medida. Os volumes aquosos e lipossômicos foramestimados como:

<formula>formula see original document page 49</formula>

Conhecendo o volume de Iipossoma e a concentração de lipídiopode-se determinar o volume capturado:

<formula>formula see original document page 49</formula>

em que Lw e Lm são o peso e as concentrações de lipídio molares, respecti-vamente. A densidade de lipídio é assumida de ser próxima a 1 mg/ml.

Conseqüentemente, pode-se estimar a relação de lipí-dio/fármaco esperada em que a amostra deveria ter se o fármaco fosse dis-tribuído de forma ideal nos espaços aquosos dentro e fora dos lipossomas:

<formula>formula see original document page 49</formula>

em que D0 é a concentração de massa do fármaco durante a formação dolipossoma, Ml é o peso molecular médio dos lipídios.

Como se pode ver, as relações UD verdadeiras para as amos-tras #1 e #2 (1,8 e 1,9) são consistentemente mais baixas do que se espera-ria de uma mesma distribuição de amicacina (5,6 e 6,0), enquanto as L/D'spara as amostras #3 e #4 são mais próxima dos valores teóricos.

Uma comparação similar foi feita entre 2 preparações de amos-tra de uma formulação antiinfectiva de lipídio em que sulfato de gentamicinaera o antiinfectivo (ver Exemplo 3 na seção de exemplificação). Os dados naTabela 12 indicam que o método aqui revelado fornece captura inesperada-mente elevada de gentamicina. Em ambas as amostras #5 e #6, as relaçõesde lipídio/fármaco verdadeiras eram quase o dobro do valor teoricamenteesperado.

Tabela 12. Carga de gentamicina nos Iipossomas preparados por diferentesmétodos.

<table>table see original document page 50</column></row><table>

8.4. Liberação de fármaco mediada pela infeccão de P. aeruainosa

A liberação de fármaco em uma forma ativa nas proximidadesdas infecções é um aspecto importante da ação da formulação fármacosa delipossoma da presente invenção. O potencial para tal liberação direcionadafoi testado mediante o monitoramento da liberação do fármaco após a incu-bação com saliva de um paciente com CF, liberação nos pulmões de ratospré-inoculados com P. aeruginosa, assim como a atividade contra culturasde P. aeruginosa.

A liberação de amicacina pela incubação direta de uma culturade P. aeruginosa com uma formulação de amicacina lipossômica da presen-te invenção foi anteriormente debatidá. Para investigar mais este fenômeno,uma formulação de amicacina lipossômica foi incubada com uma preparaçãode saliva de um paciente com fibrose cística com infecção de P. aeruginosa.A saliva expectorada foi liqüefeita com DNase I bovino e alginato Iiase por 2h. em 37 ° C. A formulação de amicacina lipossômica ou amicacina solúvel(1 mg/ml de amicacina) foi misturado 1:1: com saliva liqüefeita ou controle eincubada a 37°C com agitação suave. As alíquotas foram analisadas comrelação a concentração de amicacina por Abbott TDx Analyzer. Os Iiposso-mas intactos foram submetidos a Iise em uma alíquota separada de cadaamostra utilizando um detergente, 1% Triton X-100. Os sobrenadantes decada amostra foram utilizados para análise. Durante o período de 48 horas,(80 - 90%) da amicacina foi liberada, em uma forma dependente do tempoda composição lipídica sob estas condições, indicando que a liberação defármaco pode ocorrer nos sítios de infecção no pulmão CF.

A liberação do fármaco a partir de Iipossomas in vivo foi compa-rada aos ratos que tinham sido instilados com glóbulos de agar contendo P.aeruginosa (3,5 χ "IO4 UFC/rato) versus aqueles que não tinham. Três diasapós a instilação com glóbulo, os ratos foram deixados inalar formulações deamicacina lipossômica da presente invenção (aproximadamente 6 mg/kg dedose diária) todos os dias (sem grupo de bactérias) ou dia sim, dia não du-rante 14 dias (grupo instilado com glóbulos). 24 horas após o último trata-mento, a amicacina total e amicacina livre foram medidas como descrito a-cima. Em ratos que tinham recebido bactérias, uma média de aproximada-mente 50 a 70% da amicacina detectada estava na forma livre, ou seja, libe-rada dos lipossomas. Nos ratos que não tinham recebido bactérias aproxi-madamente 20 a 25% do fármaco estava na forma livre. Estes dados suge-rem fortemente que a liberação de amicacina livre a partir dos lipossomaspode ser mediada pela presença de P. aeruginosa in vivo.

Um teste in vitro de liberação e atividade foi realizado em condi-ções similares aos farmacocinéticos no pulmão, em que foi anteriormentedemonstrado que o antibiótico livre é purificado na escala de tempo de al-gumas horas. A amicacina livre ou uma formulação de amicacina lipossômi-ca foi incubado com P. aeruginosa PAOI. (~108/ml) em 0,5 ml de cartuchosSlide-A-Lyzer em concentrações de fármaco variáveis. O fármaco livre diali-sa fora dos cartuchos na escala temporal de horas nestas condições. Após24 h, as amostras foram retiradas dos cartuchos e plaqueados para medir aCFU. Nas experiências preliminares a amicacina livre apenas ligeiramentereduziu a CFU destas amostras, ao passo que uma redução de dois IogCFUs foi observada com relação a amicacina compreendendo composiçõesde Iiptdio na mesma concentração de amicacina (50 Mg/ml). Estes dadossugerem que a amicacina é de fato liberada em uma forma ativa na presen-ça de bactérias e que a liberação lenta proporcionada pela formulação deixaa utilização mais eficaz do fármaco.

A interação das formulações de amicacina lipossômicas da pre-sente invenção com P. aeruginosa ou seus fatores de virulência leva à libe-ração de amicacina possivelmente direcionando a liberação ao sítio da in-fecção. Quando a amicacina for liberada ela é ativa contra P. aeruginosa, e aliberação lenta nas imediações das bactérias pode ter uma vantagem sobrea distribuição não específica e liberação rápida do fármaco livre inalado.

8.5. Efeito das Formulações de Fármaco Lipossomal Inalado sobre a funçãode macrófagos alveolares

As formulações de amicacina lipossômicas da presente invençãoestão em uma modalidade em uma forma encapsulada de Iipossoma emnanoescala (200-300 nm) de amicacina que é formulada para tratar infec-ções crônicas de P. aeruginosa em pacientes com fibrose cística. Ela é de-signada para inalação com liberação controlada de amicacina no pulmão.Pela razão dos macrófagos alveolares serem conhecidos por avidamenteabsorver as partículas nesta faixa tamanho, o efeito das formulações lipos-sômicas sobre estas células é de interesse particular. As funções basais eestimuladas de macrófagos alveolares de rato obtidas pela lavagem internaforam estudadas com e sem a administração de formulações de amicacinalipossômicas e comparadas com vários controles.

Os aerossóis das formulações de amicacina lipossômicas, ami-cacina, Iipossomas placebos e salina foram gerados com um nebulizadorPARI LC Star e inalados pelos ratos fêmeas CD®IGS em uma câmara deinalação apenas pelo focinho. A terapia de inalação foi conduzida durante 4h por 14 dias consecutivos, tal que a dose pulmonar diária estimada de lipí-dio total foi de aproximadamente 12 mg/kg para o grupo de amicacina Iipos-sômica e 11 mg/kg para o grupo de Iipossoma placebo. Metade dos ratosforam sacrificados no dia 15. Os ratos remanescentes foram sacrificados nodia 43. O fluido de lavagem interna alveolar brônquico (BALF) foi coletado decada rato e armazenado a -80°C para posterior análise de óxido nítrico (co-mo representado pelos nitratos totais), e fator da necrose tumoral alfa (TNF-a). As células do BALF foram coletadas por centrifugação, contadas e culti-vadas em meio com e sem lipopolissacarídeo (LPS) durante 24 h. Os sobre-nadantes destas culturas foram coletados por centrifugação e analisadoscom relação ao oxido nítrico e TNF-α. A função fagocítica dos macrófagosBAL ((106)/ml) foi testada por medir a absorção durante a noite de microesfe-ras fluorescentes opsonizadas (0,2 pm, 2 (109)/ml).

Inalação da formulação de amicacina lipossômica, Iipossomasvazio, amicacina solúvel ou solução salina durante 14 dias consecutivos, nãoproduziram uma resposta inflamatória aguda ou atrasada significativa nospulmões de ratos como evidente pelos níveis de óxido nítrico (nitratos) eTNF-ci no BALF que insignificantemente diferentes dos controles, emborahouvesse uma tendência precoce em direção aos níveis de NO mais eleva-dos em todos os grupos que receberam inalantes, incluindo os controles. Arecuperação total das células foi insignificantemente diferente em todos osgrupos com uma tendência precoce em direção aos leucócitos mais polimor-fonucleares em todos os grupos que receberam inalantes. Os macrófagosalveolares de rato tinham funções normais após exposição aos aerossóisdos artigos de teste acima apesar do fato de que eles pareceram ampliadosno dia 15 nos grupos de inalação dos lipossomas. As concentrações de ni-tratos e TNF-α detectadas após o cultivo de macrófagos alveolares no meiono dia 15 ou 43 do estudo foram insignificantemente diferentes dos contro-les. Os macrófagos reagiram normalmente quando estimulados por LPS,produzindo concentrações substanciais de óxido nítrico (20 a 40 nmol/106células) e TNF-α (5 a 20 ng/106 células). Estes macrófagos também tinhamfunções fagocíticas normais, como mostrado pela absorção idêntica dos gló-bulos fluorescentes em comparação com os controles não tratados.

A inalação das formulações de amicacina lipossômicas durante14 dias consecutivos não afeta substancialmente a função dos macrófagosalveolares em termos de fagocitose dos glóbulos opsonizados, produção demediadores inflamatórios TNF e NO.

9. DosaqensA dosagem de quaisquer composições da presente invençãovariará dependendo dos sintomas, idade e peso corporal do paciente, a na-tureza e a gravidade do distúrbio a ser tratado ou evitado, a via de adminis-tração, e a forma da composição objeto. Qualquer uma das formulações ob-jetos pode ser administrada em dose única ou em doses divididas. As dosa-gens para as composições do presente invenção podem ser facilmente de-terminadas por técnicas conhecidas por aqueles versados na técnica ou co-mo aqui ensinado.

Em certas modalidades, a dosagem dos compostos objetos es-tará na faixa de cerca de 0,01 ng a cerca de 10 g per kg de peso corporal,especificamente na faixa de cerca de 1 ng de cerca de 0,1 g per kg, e maisespecificamente na faixa de cerca de 100 ng de cerca de 50 mg per kg.

Uma dose eficaz ou quantidade, e quaisquer efeitos possíveissobre o tempo de administração da formulação, podem necessitar de seremidentificados por qualquer composição particular da presente invenção. Istopode ser executado por experiência rotineira como aqui descrita, usando umou mais grupos de animais (preferivelmente pelo menos 5 animais por gru-po), ou em ensaios humanos se apropriado. A eficácia de qualquer composi-ção objeto e o método de tratamento ou prevenção podem ser avaliados pe-la administração da composição e avaliação do efeito da administração me-diante a medição de um ou mais índices aplicáveis, e comparando os valo-res de pós-tratamento destes índices com os valores dos mesmos índicesantes do tratamento.

O tempo exato de administração e quantidade de qualquer com-posição objeto particular que produzirá o tratamento mais eficaz em um dadopaciente dependerá da atividade, farmacocinética e biodisponibilidade deuma composição objeto, da condição fisiológica do paciente (incluindo idade,sexo, tipo e estágio da doença, condição física geral, resposta a uma dadadosagem e tipo de medicação), via de administração, e similares. As orien-tações aqui apresentadas podem ser usadas para otimizar o tratamento, porexemplo, determinar o melhor tempo e/ou quantidade de administração, queexigirá não mais do que a experimentação rotineira consistindo em acompa-nhamento do indivíduo e ajuste da dose e/ou tempo.

Embora o indivíduo esteja sendo tratado, a saúde do pacientepode ser monitorizada pela medição de um ou mais dos índices relevantesem horários predeterminados durante o período de tratamento. O tratamen-to, incluindo a composição, quantidades, tempos de administração e formu-lação, pode ser otimizado de acordo com os resultados de tal monitoramen-to. O paciente pode ser reavaliado periodicamente para determinar o grau demelhora pela medição dos mesmos parâmetros. Os ajustes da(s) quantida-de(s) da composição objeto administrada e possivelmente do tempo de ad-ministração podem ser feitos com base nestas reavaliações.

O tratamento pode ser iniciado com doses menores que sãomenos do que a dose ideal do composto. Posteriormente, a dose pode seraumentada em pequenos incrementos até que o efeito terapêutico ideal sejaalcançado.

A utilização das composições objetos pode reduzir a dose reque-rida para qualquer agente individual contido nas composições (por exemplo,o antiinfectivo) porque o início e a duração do efeito dos diferentes agentespodem ser complementares.

A toxicidade e eficácia terapêutica das composições objetos po-dem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padrão nas culturasde células ou animais experimentais, por exemplo, para determinar a LD50 ea ED50.

Os dados obtidos a partir dos ensaios da cultura celular e estu-dos em animais podem ser utilizados na formulação de uma faixa de dosa-gem para uso em §eres humanos. A dosagem de qualquer composição obje-to reside preferivelmente dentro de uma faixa de concentrações circulantesque incluem a ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem podevariar dentro desta faixa dependendo da forma de dosagem empregada e avia de administração utilizada. Para composições da presente invenção, adose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente a partir dosensaios de cultura celular.10. Formulação

As formulações antiinfectivas de lipídio da presente invençãopodem compreender uma dispersão aquosa de lipossomas. A formulaçãopode conter excipientes de lipídio para formar os lipossomas, esais/tamponantes para fornecer a osmolaridade e pH apropriados. A formu-lação pode compreender um excipiente farmacêutico. O excipiente farma-cêutico pode ser um líquido, diluente, solvente ou material de encapsula-mento, envolvido no carregamento ou transporte de qualquer composiçãoobjeto ou seu componente de um órgão, ou parte do corpo, para um outroórgão, ou parte do corpo. Cada excipiente deve ser "aceitável" no sentido deser compatível com a composição objeto e seus componentes e não prejudi-cial para o paciente: Os excipientes adequados incluem trealose, rafinose,manitol, sacarose, leucina, trileucina e cloreto de cálcio. Exemplos de outrosexcipientes adequados incluem (1) açúcares, como lactose e glicose; (2)amidos, como o amido de milho e amido de batata; (3)celulose, e seus derivados, tais como a carboximetil celulose de sódio, etilcelulose e acetato de celulose; (4) tragacanto em pó; (5) malte; (6) gelatina;(7) talco; (8) excipientes, tais como manteiga de cacau e ceras de supositó-rio; (9) óleos, tais como óleo amendoim, óleo de algodão, óleo de açafroa,óleo de gergelim, óleo de oliva, óleo de milho e óleo de soja; (10) glicóis, taiscomo propileno glicol; (11) polióis, tais como a glicerina, sorbitol e polietilenoglicol; (12) ésteres, tais como oleato etílico e Iaurato etílico; (13) ágar; (14)agentes tamponantes, tais como hidróxido de magnésio e hidróxido de alu-mínio; (15) ácido algínico; (16) águal livre de pirogênio; (17) salina isotónica;(,18) solução de Ringer; (19) álcool etílico; (20) soluções tamponantes defosfato; e (21) outras substâncias compatíveis não tóxicas empregadas nasformulações farmacêuticas.

Exemplificação

Exemplo 1

O que segue é uma descrição detalhada da fabricação de 150ml de Lipossoma/amicacina complexa.Volume Inicial Total = 1,5 L

Teor de Etanol = 23,5% (v/v)

Composição de Lipídio: DPPC/Col (1:1 relação molar)

Inicial [Lipídio] = 7,6 mg/ml

Inicial [sulfato de amicacina] = 57,3 mg/ml

Volume do Produto Final = 150 ml

I) Composição e Infusão:

7,47 g dé DPPC e 3,93 g de Colesterol foram dissolvidos diretamente em352,5 ml de etanol em um banho de água a 50 0C. 85,95 g de sulfato de a-micacina foram dissolvidos diretamente em 1147,5 ml de tampão PBS. Asolução é então titulada com ION NaOH ou KOH para levar o pH para apro-ximadamente 6,8.

352,5 ml de etanol/lipídio foram adicionados ou infundidos comos 1147,5 ml de amicacina/tampão para dar um volume inicial total de 1,5 L.

O etanol/lipídio foi bombeado @ -30 mUmin (também chamada de taxa deinfusão) com uma bomba peristáltica na solução de amicacina/tampão queestava sendo rapidamente agitada a 150 RPM em uma recipiente de reaçãoem uma placa agitada na temperatura ambiente.

O produto foi agitado na temperatura ambiente durante 20 a 30minutos.

II) Diafiltration ou Etapa de "Lavagem":

O recipiente de mistura foi conectado a uma bomba peristáltica ecartucho de diafiltração. O cartucho de diafiltração é uma fibra de membranaoca com um peso molecular de corte de 500 kilodáltons. O produto foi bom-beado a partir do recipiente de reação através do cartucho de diafiltração edepois volta dentro do recipiente de mistura na temperatura ambiente. Umacontra-pressão de aproximadamente 48,3 kpa (7 psi) é criada em todo o car-tucho. A amicacina livre e etanol foram forçados através da membrana defibra oca pela contra-pressão deixando a amicacina lipossômica (produto)para trás. O produto foi lavado 8 vezes na temperatura ambiente. TampãoPBS novo foi adicionado (por meio de uma outra bomba peristáltica) ao reci-piente de reação para compensar a remoção de permeação e para manterum volume de produto constante. O produto foi concentrado.

Exemplo 2

Caputra lipossômica elevada de amicacina. Quatro amostras deformulações antiinfectivas de lipídio foram preparadas em várias concentra-ções de lipídio e antiinfectivo de acordo com os seguintes procedimentos.

Amostra #1. Sulfato de amicacina 1,72 kg foi dissolvido em 23litros de solução de salina (0,9% NaCI) e o pH foi ajustado para 6,5 mediantea adição da quantidade necessária de NaOH. Lipídeos - 98,2 g de DPPC e51,8 g de Colesterol foram dissolvidos em 7 litros de etanol. Os Iipossomasforam formadas pela infusão da solução de lipídio em solução de amicacinaem uma taxa de -600 ml/min e sob constante agitação. A suspensão resul-tante foi depois lavada para remover etanol e amicacina não capturada pordiafiltração usando um cartucho Amersham Hollow Fiber 500 kD de tamanhode poro. A suspensão fòi concentrada em um volume final de -3,5 L.

Amostra #2. O procedimento foi similar a aquele para a amostra#1, com todas as quantidades de material reduzidas 100 vezes. Sulfato deamicacina 17,2 g foi dissolvido em 230 ml de solução de salina (0,9% NaCI)e o pH foi ajustado para 6,6 mediante a adição da quantidade necessária deNaOH. Lipídeos - 0,982 g de DPPC e 0,518 g de Colesterol foram dissolvi-dos em 70 ml de etanol. Os Iipossomas foram formados por infusão da solu-ção lipídica na solução de amicacina em uma taxa de -300 ml/min e sobconstante agitação. A suspensão resultante foi então lavada para removeretanol e amicacina não capturada por diafiltração usando um cartucho A-mersham Hollow Fiber. A suspensão foi concentrada em um volume final de-35 ml.

Amostra #3. Os Iipossomas foram produzidos" por um processoconhecido como SPLV. Sulfato de amicacina 1,4 g foi dissolvido em 20 ml desolução de salina (0,9% NaCI) tornando o pH 3,3. Lipídeos, 0,666 g deDPPC e 0,333 g de Colesterol foram dissolvidos em 40 ml de diclorometano.As soluções de amicacina e lipídio foram misturadas entre si em um frascoredondo de 500 ml e brevemente submetidas a sonicação para formar umaemulsão. O frasco foi depois conectado a um sistema BUCHI Rotavapor pa-ra remover diclorometano em vácuo baixo -127 mm (-5 polegadas Hg) etemperatura de 50 0C e rotação constante até que a mistura de amicacina-lipidio formasse um gel. Quando o gel eventualmente entrou em colapso,vácuo foi progressivamente aumentado para -508 mm (-20 polegadas) Hg ea secagem continuou durante mais de 30 minutos. O volume final de sus-pensão lipossômica formada era de 22 ml.

Amostra #4. O procedimento foi semelhante a aquele para aamostra #3. Sulfato de amicacina 1,3 g foi dissolvido em 20 ml de solução desalina, e o pH foi ajustado em 6,5 mediante a adição de NaOH. Lipídeos,0,583 g de DPPC e 0,291 g de Colesterol foram dissolvidos em 35 ml de di-clorometano. A etapa de sonicação foi ignorada. A etapa de remoção de sol-vente no sistema Rotavapor foi realizada em 40 0C durante 2 h. Volume finalfoi de 20 ml.

Exemplo 3

Captura de Iipossoma elevada de gentamicina.

Amostra #5. Sulfato de gentamicina 20,0 g foi dissolvido em 230ml de solução de salina (0,9% de NaCI) e o pH foi ajustado para 6,5 median-te a adição da quantidade necessária de ácido sulfúrico. Lipídeos - 0,982 gde DPPC e 0,518 g de Colesterol foram dissolvidos em 70 ml de etanol. Oslipossomas foram formados mediante a infusão da solução de lipídio em so-lução de gentamicina em uma taxa de -500 ml/min e sob constante agita-ção. A gentamicina não capturada e etanol foram removidos por diafiltraçãousando um cartucho Amersham Hollow Fiber. A suspensão foi concentradapara um volume final de -35 ml.

Amostra #6. O procedimento foi similar ao da amostra #5, comexceção: Sulfato de gentamicina 17,0 g foi dissolvido em 230 ml de soluçãode Na2SO4 a 100 mM e o pH foi ajustado para 6,5 mediante a adição daquantidade necessária de H2SO4. Lipídeos - 0,982 g de DPPC e 0,518 g deColesterol foram dissolvidos em 75 ml de etanol.

Exemplo 4

Captura de outras formas de sal de amicacina.Amostra #7. O procedimento foi similar a aquele da amostra #2 sob o Exem-pio 2. Base de amicacina 0,7 g e ácido cítrico 4,2 g foram dissolvidos em 230ml de solução de salina (0,9% NaCI). O pH resultante da solução de amica-cina-citrato foi de 6,2. Lipídeos - 0,982 g de DPPC e 0,518 g de Colesterolforam dissolvidos em 70 ml de etanol. Os lipossomas foram formados pelainfusão da solução de lipídio em solução de amicacina, a uma taxa de -500ml/min e sob constante agitação. A amicacina não capturada e etanol foramremovidos por diafiltração usando um cartucho Amersham Hollow Fiber. Asuspensão foi concentrada em um volume final de -35 ml.

A relação de Lipídio/Fármaco real era semelhante àquela daamostra #2 e novamente mais baixa do que o esperado (Captura de fármacomais elevada do que o esperado). Considerando o fato de que o volume decaptura na amostra #7 foi apenas de 1,5 (comparado a 2,5 para a amostra#2), a relação de L/D esperada/real foi tão elevada quanto 5,2. Assim, o ci-trato de amicacina lipossômico, como sulfato de amicacina, pode tambémser formulado com alta captura.

Tabela 13. Sumário dos parâmetros das amostras de 5 a 7.

<table>table see original document page 60</column></row><table>

Exemplo 5

Biodisponibilidade da amicacina das formulações de amicacina lipossômicasinaladas no rato.

A taxa de liberação de amicacina dos lipossomas foi medida a-pós inalação por ratos e comparada com a amicacina solúvel inalada.

Os itens de teste foram submetidos a aerossol através de umnebulizador Pari LC Star anexado a uma câmara de inalação somente denariz. Os ratos CD®IGS receberam uma dose depositada no pulmão esti-mada de 6 mg/kg de amicacina na forma de uma formulação lipossômica ou5 mg/kg de amicacina solúvel como uma dose única ou dosada diariamentedurante 14 dias consecutivos. O pulmão ou outro tecido foi homogeneizadocom um aparelho Polytron. Os cinéticos de liberação de amicacina do pul-mão foram examinados pela análise dos homogeneizados do pulmão empontos de tempo variáveis após o tratamento com dose única ou 1 dia e 28dias após a administração de múltiplas doses. Os níveis de amicacina forammedidos pela polarização de imunofluorescência em um analisador AbbottTDx® na ausência ou presença de 1% Triton X-100, que libera amicacinados lipossomas. Todas as amostras de pulmão foram perfuradas com lipos-somas antes da homogeneização para testar a liberação de amicacina sobestas condições. A amicacina livre e total foi medida com e sem 1% Triton X-100 para avaliar a fuga de fármaco.

A amicacina lipossômica, perfurada em todas as amostras depulmão, não apresentou nenhuma liberação significativa de amicacina comoum resultado da homogeneização de tecido com o homogenizador Polytronna ausência deste detergente. No entanto, a adição de l% Triton X-100 levouà recuperação de todo o fármaco esperado. Portanto uma comparação dire-ta pode ser feita do nível total de amicacina (com detergente) versus os ní-veis livremente disponíveis no tecido pulmonar.

Uma alta concentração total de amicacina (aprox. 500 a 600pg/g de tecido pulmonar) foi observada imediatamente após a dose única de6 mg/kg da amicacina lipossômica, que lentamente diminuiu em cerca de50% ao longo do período de 7 dias. O perfil temporal para a liberação deamicacina livre destes lipossomas mostrou uma alta concentração inicial defármaco livre, provavelmente resultante da amicacina liberada como resulta-do dá nebulização. Esta fase foi seguida por um nadir de cerca de 24 horase um subseqüente aumento, atingindo um máximo de 279 pg/g em 96 horasapós a administração. Pelo final dos 7 dias de experiência, uma parte subs-tancial do fármaco remanescentes no pulmão estava na forma livre (aproxi-madamente 50 a 70%). Constatou-se que uma pequena porção do fármacosolúvel administrado por inalação também permaneceu por um longo perío-do de tempo no pulmão. Entretanto, a maioria da amicacina administrada naforma solúvel foi liberada dentro de algumas horas, e a amicacina livre apa-rente AUC durante 7 dias foi pelo menos 2x mais elevada para os animaiscom amicacina Iipossomal do que para aqueles que receberam amicacinasolúvel. Alguns aspectos deste comportamento pode ser qualitativamentemodelado com constantes taxas apropriadas para a liberação e liberaçãolenta do fármaco a partir de lipossomas.

Após 14 dias consecutivos de administração (24 horas após aúltima dose), mais do que 20% da amicacina total nos pulmões dos ratosque receberam amicacina lipossômica estavam presentes como fármacolivre (cerca de 650 pg/g). O nível de fármaco livre total foi ainda maior doque a quantidade em ratos que inalaram amicacina solúvel (aprox. 500M9/g).

A amicacina livre é liberado lentamente a partir de lipossomasdas formulações de amicacina lipossômicas nos pulmões de animais saudá-veis em uma escala temporal de dias. O fármaco livre que é liberados temum tempo de permanência relativamente longo no pulmão como visto porum depósito substancial de fármaco livre nos pulmões.

Exemplo 6

Processo de Infusão em Linha

A essência do processo de infusão em linha é que uma correntede solução de lipídio é misturada com uma corrente de solução de antiinfec-tivo "em linha" através de, por exemplo, um conector Y que se conecta a umcomprimento de tubulação, denominado um tubo de mistura, em que outramistura pode ocorrer. Neste sentido, este novo processo difere do processode infusão de etanol 'convencional', em que a solução de- lipídio é infundidacomo uma corrente em um volume de solução de amicacina.

Preparação de soluções de amicacina e lipídio.

Sulfato de amicacina 12,0 g foi dissolvido em 200 ml de água e opH foi ajustado para 6,5 mediante a adição de quantidades necessárias desolução de NaOH a 25%. Lipídeos, 1,480 g de DPPC e 0,520 g de coleste-rol, foram dissolvidos em uma mistura de 60 ml de etanol e 10 ml de água.Estas quantidades resultam em uma batelada de 300 ml após infusão emuma taxa de fluxo de lipídio/amicacina de 300/500 ml/min, respectivamente.Os volumes podem ser proporcionalmente ajustados para a maior escala ouse taxas de fluxo diferentes forem desejadas.

A solução de amicacina preparada de acordo com os resultadosacima em aproximadamente 40 mg/ml de solução de amicacina (por base).A solução de lipídio como apresentada era DPPC/Col (relação molar de60/40) com um lipídio total de aproximadamente 20 mg/ml de solução (90%etanol). Os lipídeos foram aquecidos para ~40°C durante a dissolução maisrápida.

As quantidades exatas necessárias para uma batelada de 300ml são: amicacina 150 ml, lipídio 90 ml, e 60 ml de salina adicional (ou á-gua), que é adicionada após ou durante a infusão para ajustar a concentra-ção de etanol final.

Processo de fabricação.

Uma modalidade do sistema de infusão é mostrada na figura 8.

Soluções de lipídio e amicacina são misturadas em linha utili-zando um conector Y (ID 3,2 mm, OD 6,4 mm) em taxas de fluxo de ~300/500 ml/min (isto é, relação de volume de -1/1,67 em lugar de -1/3,35 noprocesso convencional). Um tubo MasterFIex L/S 25 (ID 4,8 mm) foi utilizadopara liberar a solução de lipídio e um tubo LVS 17 (ID 6,4 mm) foi utilizadopara liberar a solução de amicacina. Para obter taxas de fluxo sincrônicas,dois cabeçotes de bomba com uma tração MasterFIex foram utilizados.

De acordo com as áreas em corte transversal do tubo, a relaçãode taxa de fluxo teórica deverá ser 4,82/6,42 = 0,562 = 1/1,78. Quando a tra-ção da bomba foi fixada em 500 ml/min,para o tubo de Amicacina US 17, ástaxas de fluxo medidas foram -300/500 = 1/1,67.

Visto que a solução de lipídio contém 90% de etanol, a misturaem linha tinha -34% de etanol. Para impedir a precipitação de amicacina, asolução de NaCI pode ser adicionada após ou durante a infusão em umataxa de fluxo de 100 a 200 ml/min (assume-se que os Iipossomas já estãoformados neste ponto). Assim, a mistura final teria -27% de etanol, da qualtoda a amicacina livre é esperada ser solúvel.A taxa de fluxo de infusão líquida total, 800 a 1000 ml/min, écomparável à taxa de fluxo permeada quando se usa dois grandes cartuchosde diafiltração. Isto torna possível fazer a infusão e concentração simultâneapor diafiltração.

A suspensão de Iipossoma resultante foi lavada para remover aamicacina livre por diafiltração usando um cartucho de fibra oca AmershamUFP-500-C-3MA (área de membrana 140 cm2, fibra ID 0,5 mm). Na primeiraetapa, a suspensão foi concentrada em quase metade do volume original(150 ml). Então, durante a diafiltração para lavagem, a suspensão foi recircu-Iada e solução de salina nova foi alimentada na mistura em uma taxa de ~6ml/min de modo a coincidir com a taxa de permeação e assim manter umvolume constante. A diafiltração continuou até que 4 vezes o volume de sus-pensão da alimentação de solução de salina foi dispensada (isto é, 4*150 ml= 600 ml). Este procedimento de diafiltração/lavagem será referido como 4"lavagens". Finalmente, a suspensão foi concentrada (diafiltração sem en-trada de salina) para obter o produto final em uma concentração de amicaci-na e lipídio desejada. A taxa de fluxo de recirculação durante a etapa de dia-filtração foi -350 ml/min, e durante a etapa de concentração final foi pro-gressivamente reduzida para -150 ml/min de modo a manter a pressão deentrada abaixo de 69 kpa (10 PSI).

Referências

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As publicações e referências, incluindo, mas não limitados àspatentes e pedidos de patente, citadas neste relatório descritivo são aquiincorporadas por referência em sua totalidade na parte inteira citada comose cada publicação ou referência individual fosse específica e individualmen-te indicada a ser aqui incorporada por referência como sendo completamen-te apresentada. Qualquer pedido de patente em que este pedido reivindicaprioridade é também aqui incorporado por referência da maneira descritaacima para as publicações e referências.

Equivalentes

Embora esta invenção tenha sido descrita com uma ênfase so-bre as modalidades preferidas, ficará óbvio para aqueles versados na técni-ca que variações nos dispositivos e métodos preferidos podem ser usadas eque é planejado que a invenção possa ser praticada de outra maneira doque como aqui especificamente descrita. Conseqüentemente, esta invençãoinclui todas as modificações incluídas dentro do espírito e escopo da inven-ção como definidos pelas reivindicações que seguem.

Claims

1. Formulação antiinfectiva de lipídeo compreendendo umaformulação de lipídeo e um antiinfectivo, em que a formulação de lipídeo ésubstancialmente livre de lipídeos aniônicos e em que a razão em peso delipídeo para antiinfectivo é 4:1 a 1:1, 3:1 a 1:1, 2:1 a 1:1 ou 1:1.

2. Formulação antiinfectiva de lipídeo de acordo com a reivindi-cação 1, em que a formulação de lipídeo é um lipossoma.

3. Formulação antiinfectiva de lipídeo de acordo com a reivindi-cação 2, em que o lipossoma tem um diâmetro médio de 0,1 pm a 1,0 μιτι, 0,2 ym a 0,5 pm, 0,2 pm a 0,4 pm ou 0,2 pm a 0,3 pm.

4. Formulação antiinfectiva de lipídeo de acordo com a reivindi-cação 1, em que o antiinfectivo é selecionado do que segue: um aminoglico-sídeo, uma tetraciclina, uma sulfonamida, ácido p-aminobenzóico, uma dia-minopiridina, uma quinolona, uma β-lactama, um inibidor de β-lactama e umde β-lactamase, clorafenicol, um macrólido, penicilinas, cefálosporinas, corti-costeróide, prostaglandina, linomicina, clindamicina, espectinomicina, polimi-xina B, colistina, vancomicina, bacitracina, isoniazida, rifampina, etambutol,etionamida, ácido aminossalicílico, cicloserina, capreomicina, uma sulfona,clofazimina, talidomida, um antifúngico polieno, flucitosina, imidazol, triazol,griseofulvina, terconazol, butoconazol ciclopirax, ciclopirox olamina, halopro-gina, tolnaftato, naftifina, terbinafina ou suas combinações.

5. Formulação antiinfectiva de lipídeo de acordo com a reivindi-cação 1, em que o antiinfectivo é um aminoglicosídeo.

6. Formulação antiinfectiva de lipídeo de acordo com a reivindi-cação 1, em que o antiinfectivo é amicacina.

7. Formulação antiinfectiva de lipídeo de acordo com a reivindi-cação 1, em que o antiinfectivo é tobramicina.

8. Formulação antiinfectiva de lipídeo de acordo com a reivindi-cação 1, o antiinfectivo é gentamicina.

9. Formulação antiinfectiva de lipídeo de acordo com a reivindi-cação 1, em que formulação de lipídeo compreende lipídeos neutros.

10. Formulação antiinfectiva de lipídeo de acordo com a reivin-dicação 1, em que os lipídeos que formam a formulação de lipídeo são todoslipídeos neutros.

11. Formulação antiinfectiva de lipídeo de acordo com a reivin-dicação 1, livre de lipídeos aniônicos.

12. Formulação antiinfectiva de lipídeo de acordo com a reivin-dicação 1, em que a formulação de lipídeo compreende um fosfolipídeo.

13. Formulação antiinfectiva de lipídeo de acordo com a reivin-dicação 1, em que a formulação de lipídeo compreende um esteróide.

14. Formulação antiinfectiva de lipídeo de acordo com a reivin-dicação 1, a formulação de lipídeo compreende um esterol.

15. Formulação antiinfectiva de lipídeo de acordo com a reivin-dicação 1, em que a formulação de lipídeo compreende um fosfolipídeo e umesteróide.

16. Formulação antiinfectiva de lipídeo de acordo com a reivin-dicação 1, em que a formulação de lipídeo compreende um fosfolipídeo e umesterol.

17. Formulação antiinfectiva de lipídeo de acordo com a reivin-dicação 1, em que a formulação de lipídeo compreende uma dipalmitoilfosfa-tidilcolina (DPPC) e colesterol.

18. Formulação antiinfectiva de lipídeo de acordo com a reivin-dicação 1, em que a formulação de lipídeo é um Iipossoma com um diâmetromédio de 0,1 pm a 1,0 pm, 0,2 pm a 0,5 pm, 0,2 pm a 0,4 pm ou 0,2 pm a-0,3 pm; o antiinfectivo é amicacina; e a formulação de lipídeo compreendeum fosfolipídeo e um esteróide.

19. Formulação antiinfectiva de lipídeo de acordo com a reivin-dicação 1, em que a formulação de lipídeo é um Iipossoma com um diâmetromédio de 0,1 pm a 1,0 pm, 0,2 pm a 0,5 pm, 0,2 pm a 0,4 pm ou 0,2 pm a-0,3 pm; o antiinfectivo é amicacina; e a formulação de lipídeo compreendeum fosfolipídeo e um esterol.

20. Formulação antiinfectiva de lipídeo de acordo com a reivin-dicação 1, em que a formulação de lipídeo é um Iipossoma com um diâmetromédio de 0,1 pm a 1,0 pm, 0,2 pm a 0,5 pm, 0,2 pm a 0,4 pm ou 0,2 pm a- 0,3 pm; ο antiinfectivo é amicacina; e a formulação de lipídeo compreendeDPPC e colesterol.

21. Método de preparação de uma formulação antiinfectiva delipídeo como definida na reivindicação 1, compreendendo infusão de umasolução ou mistura aquosa ou alcoólica do antiinfectivo com uma solução oumistura de lipídeo-álcool em uma temperatura abaixo da transição de fasede pelo menos um dos lipídeos, em que infusão da solução ou mistura a-quosa ou alcoólica do antiinfectivo é feita a partir do acima.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, em que a solu-ção ou mistura de lipídeo-álcool tem uma concentração de 10 a 30 mg/mL.

23. Método de acordo com a reivindicação 21, em que a solu-ção ou mistura aquosa ou alcoólica do antiinfectivo tem uma concentraçãode 20 a 70 mg/mL.

24. Método de acordo com a reivindicação 21, em que a solu-ção ou mistura de lipídeo-álcool tem uma concentração de 10 a 30 mg/mL ea solução ou mistura aquosa ou alcoólica do antiinfectivo tem uma concen-tração de 20 a 70 mg/mL.

25. Método de acordo com a reivindicação 21, em que o antiin-fectivo é selecionado do que segue: um aminoglicosídeo, uma tetraciclina,uma sulfonamida, ácido p-aminobenzóico, uma diaminopiridina, uma quino-lona, uma β-lactama, um inibidor de β-lactama e um de β-lactamase, clora-fenicol, um macrólido, penicilinas, cefalosporinas, corticosteróide, prosta-glandina, linomicina, clindamicina, espectinomicina, polimixina B, colistina,vancomicina, bacitracina, isoniazida, rifampina, etambutol, etionamida, ácidoaminossalicílico, ciclóserina, capreomicina, uma sülfona, clofazimina, talido-mida, um antifúngico polieho, flucitosina, imidazol, triazol, griseofulvina, ter-conazol, butoconazol ciclopirax, ciclopirox olamina, haloprogina, tolnaftato,naftifina, terbinafina ou suas combinações.

26. Método de acordo com a reivindicação 21, em que o antiin-fectivo é um aminoglicosídeo.

27. Método de acordo com a reivindicação 21, em que o antiin-fectivo é amicacina.

28. Método de acordo com a reivindicação 21, em que o antiin-fectivo é tobramicina.

29. Método de acordo com a reivindicação 21, em que o antiin-fectivo é gentamicina.

30. Método de acordo com a reivindicação 21, em que a solu-ção ou mistura de lipídeo-álcool compreende um fosfolipídeo.

31. Método de acordo com a reivindicação 21, em que a solu-ção ou mistura de lipídeo-álcool compreende um esterol.

32. Método de acordo com a reivindicação 21, em que a solu-ção ou mistura de lipídeo-álcool compreende DPPC e colesterol.

33. Formulação antiinfectiva de lipídeo compreendendo umaformulação de lipídeo e um antiinfectivo, em que a razão de lipídeo para anti-infectivo é 1:1 ou menos.

34. Formulação antiinfectiva de lipídeo de acordo com a reivin-dicação 33, em que a razão de lipídeo para antiinfectivo é menos do que-0,75:1.

35. Formulação antiinfectiva de lipídeo de acordo com a reivin-dicação 33, em que a razão de lipídeo para antiinfectivo é menos do que-0,5:1.

36. Formulação antiinfectiva de lipídeo acordo com a reivindica-ção 33, em que o antiinfectivo é um aminoglicosídeo.

37. Formulação antiinfectiva de lipídeo de acordo com a reivin-dicação 33, em que o antiinfectivo é um aminoglicosídeo selecionado do quesegue: amicacina, gentamicina ou tobramicina.

38. Formulação antiinfectiva de lipídeo acordo com a reivindica-ção 33, ém que o antiinfectivo é amicacina.

39. Formulação antiinfectiva de lipídeo acordo com a reivindica-ção 33, em que o antiinfectivo é gentamicina.

40. Formulação antiinfectiva de lipídeo acordo com a reivindica-ção 33, em que o antiinfectivo é tobramicina.

41. Formulação antiinfectiva de lipídeo acordo com a reivindica-ção 33, em que a formulação de lipídeo é um lipossoma.

42. Formulação antiinfectiva de lipídeo acordo com a reivindica-ção 33, em que a formulação de lipídeo compreende um fosfolipídeo.

43. Formulação antiinfectiva de lipídeo acordo com a reivindica-ção 33, em que a formulação de lipídeo compreende um esteróide.

44. Formulação antiinfectiva de lipídeo acordo com a reivindica-ção 33, em que a formulação de lipídeo compreende um esterol.

45. Formulação antiinfectiva de lipídeo acordo com a reivindica-ção 33, em que a formulação de lipídeo compreende dipalmitoilfosfatidilcoli-na(DPPC).

46. Formulação antiinfectiva de lipídeo acordo com a reivindica-ção 33, em que a formulação de lipídeo compreende colesterol.

47. Formulação antiinfectiva de lipídeo acordo com a reivindica-ção 33, em que a formulação de lipídeo compreende um fosfolipídeo e umesteróide.

48. Formulação antiinfectiva de lipídeo acordo com a reivindica-ção 33, em que a formulação de lipídeo compreende um fosfolipídeo e umesterol.

49. Formulação antiinfectiva de lipídeo acordo com a reivindica-ção 33, em que a formulação de lipídeo compreende DPPC e colesterol.

50. Formulação antiinfectiva de lipídeo acordo com a reivindica-ção 33, em que a formulação de lipídeo é um Iipossoma e o antiinfectivo éamicacina.

51. Formulação antiinfectiva de lipídeo acordo com a reivindica-ção 33, em que a formulação de lipídeo é um lipossoma, o antiinfectivo éamicacina e a formulação de lipídeo compreende um fosfolipídeo e um este-rol. #

52. Formulação antiinfectiva de lipídeo acordo com a reivindica-ção 33, em que a formulação de lipídeo é um lipossoma, o antiinfectivo éamicacina e a formulação de lipídeo compreende um DPPC e um colesterol.

53. Método de preparação de uma formulação antiinfectiva delipídeo compreendendo uma formulação de lipídeo a um antiinfectivo com-preendendo: mistura de uma corrente de uma solução ou mistura de lipídeocom uma corrente de uma solução ou mistura antiinfectiva, em que as duascorrentes são misturadas em linha.

54. Método de acordo com a reivindicação 53, em que as duascorrentes entram em um conector Y antes da mistura em linha.

55. Método de acordo com a reivindicação 53, em que as solu-ções ou misturas são aquosas ou alcoólicas.

56. Método de acordo com a reivindicação 53, em que a formu-lação de lipídeo é um lipossoma.

57. Método de acordo com a reivindicação 53, em que o antiin-fectivo é um aminoglicosídeo.

58. Método de acordo com a reivindicação 53, em que o antiin-fectivo é um aminoglicosídeo selecionado do que segue: amicacina, genta-micina ou tobramicina.

59. Método de acordo com a reivindicação 53, em que o antiin-fectivo é amicacina.

60. Método de acordo com a reivindicação 53, em que o antiin-fectivo é gentamicina.

61. Método de acordo com a reivindicação 53, em que o antiin-fectivo é tobramicina.

62. Método de acordo com a reivindicação 53, em que a corren-te de uma solução ou mistura de lipídeo e a corrente de uma solução ou mis-tura antiinfectiva são misturadas em uma taxa de fluxo total de 700 a 900mLVmin.

63. Método de acordo com a reivindicação 53, em que a corren-te de uma solução ou mistura de lipídeo e a. corrente de uma solução ou mis-tura antiinfectiva são misturadas em uma taxa de fluxo total de 800 mL/min.

64. Método de acordo com a reivindicação 53, em que a corren-te de uma solução ou mistura de lipídeo é adicionada em uma taxa de fluxode 200 a 400 mLVmin.

65. Método de acordo com a reivindicação 53, em que a corren-te de uma solução ou mistura de lipídeo é adicionada em um taxa de fluxode 300 mL/min.

66. Método de acordo com a reivindicação 53, em que a corren-te de uma solução ou mistura antiinfectiva é adicionada em uma taxa de flu-xo de 400 a 600 mL/min.

67. Método de acordo com a reivindicação 53, em que a corren-te de uma solução ou mistura antiinfectiva é adicionada em uma taxa de flu-xo de 500 mL/min.

68. Método de acordo com a reivindicação 53, em que a corren-te de uma solução ou mistura de lipídeo é adicionada em uma taxa de fluxode 300 mL/min e a corrente de uma solução ou mistura antiinfectiva é adi-cionada em uma taxa de fluxo de 500 mL/min.

69. Método de acordo com a reivindicação 53, em que a tempe-ratura das correntes combinadas é 30-40-C.

70. Método de acordo com a reivindicação 53, em que a tempe-ratura da solução ou mistura de lipídeo é 30-C e a temperatura da soluçãoou mistura antiinfectiva é 30-C.

71. Método de acordo com a reivindicação 53, em que a tempe-ratura da solução ou mistura de lipídeo é 50e C e a temperatura da soluçãoou mistura antiinfectiva é temperatura ambiente.

72. Método de acordo com a reivindicação 53, compreendendoainda a etapa de diluição das correntes combinadas com água pelo menos 20 segundos após mistura.

73. Método de acordo com a reivindicação 53, em que a con-centração da solução ou mistura antiinfectiva é 30 a 50 mg/mL.

74. Método de acordo com a reivindicação 53, em que a con-centração da solução ou çnistura antiinfectiva é 40 a 50 mg/mL.

75. Método de acordo com a reivindicação 53, em que a corren-te de uma solução ou mistura de lipídeo é adicionada em uma taxa de fluxode 300 mL/min e a corrente da solução ou mistura antiinfectiva é adicionadaem uma taxa de fluxo de 500 mL/min; a temperatura das correntes combina-das é 30-40-C; as correntes combinadas são diluídas com água pelo menossegundos após mistura; e a concentração da solução ou mistura antiin-fectiva é 40 a 50 mg/mL.

76. Método de acordo com a reivindicação 53, em que o lipídeocompreende um fosfolipídeo.

77. Método de acordo com a reivindicação 53, em que o lipídeocompreende um esteróide.

78. Método de acordo com a reivindicação 53, em que o lipídeocompreende um esterol.

79. Método de acordo com a reivindicação 53, em que o lipídeocompreende DPPC.

80. Método de acordo com a reivindicação 53, em que o lipídeocompreende colesterol.

81. Método de acordo com a reivindicação 53, em que o lipídeocompreende um fosfolipídeo e um esterol.

82. Método de acordo com a reivindicação 53, em que o lipídeocompreende DPPC e colesterol.

83. Método de acordo com a reivindicação 53, em que a formu-lação de lipídeo é um Iipossoma e o antiinfectivo é amicacina.

84. Método de acordo com a reivindicação 53, em que a formu-lação de lipídeo é um lipossoma, o antiinfectivo é amicacina e o lipídeo com-preende um fosfolipídeo e um esterol.

85. Método de acordo com a reivindicação 53, em que a formu-lação de lipídeo é um lipossoma, o antiinfectivo é amicacina e o lipídeo com-preende DPPC e colesterol.

86. Método de acordo com a reivindicação 53, em que a razãode lipídeo para antiinfectivo é 1:1 ou menos.

87. Método de acordo com, a reivindicação 53, em que a razãode lipídeo para antiinfectivo é 0,75:1 ou menos.

88. Método de acordo com a reivindicação 53, em que a razãode lipídeo para antiinfectivo é 0,5:1 ou menos.

89. Método de acordo com a reivindicação 53, em que a formu-lação de lipídeo é um lipossoma, o antiinfectivo é amicacina, o lipídeo com-preende DPPC e colesterol e a razão de lipídeo para antiinfectivo é 1:1 oumenos.

90. Método de tratamento de um paciente para infecção pulmo-nar compreendendo administrar ao paciente uma quantidade terapeutica-mente eficaz da formulação antiinfectiva de lipídeo de acordo com a reivindi-cação 1 ou 33.

91. Método de acordo com a reivindicação 90, em que a infec-ção pulmonar é uma infecção por pseudomonas, P. aeruginosa, P. paucimo-bilis, P. putida, P. fluorescens e P. acidovorans, staphyIococcal, Staphylo-coccus aureus resistente à Meticilina (MRSA), streptococcal, Streptococcuspneumoniae, Escherichia coli, Klebsiellal Enterobacter, Serratia, Haemophi-lus, Yersinia pesos, Burkholderia pseudomallei, B. cepacia, B. gladioli, B.multivorans, B. vietnamiensis, Mycobacterium tuberculosis, complexo de M.avium (MAC), M. avium, M. intracellulare, M. kansasii, M. xenopi, M. mari-num, M. ulcerans, complexo de M. fortuitum, M. fortuitum ou M. chelonei.

92. Método de tratamento de um paciente para uma infecçãopulmonar causada por fibrose cística compreendendo administrar ao pacien-te uma quantidade terapeuticamente eficaz da formulação antiinfectiva delipídeo de acordo com a reivindicação 1 ou 33.