JP2014237729A - 徐放性抗感染剤 - Google Patents

Abstract

【課題】徐放性抗感染剤の提供。【課題を解決するための手段】陰イオン脂質を実質的に含まず、かつ脂質と抗感染薬との比率は、約１：１から約４：１であり、平均直径が約１μｍ未満である抗感染脂質製剤が提供される。さらに、注入プロセスを含む、抗感染脂質製剤を調製する方法が提供される。さらに、薬物に対する脂質の比率が約１：１以下、約０．７５：１以下、または約０．５０：１以下である、インライン注入プロセスによって調製される、抗感染脂質製剤が提供される。本発明はさらに、肺感染症に罹患した患者を治療する方法であって、該患者に治療的有効量の本発明の抗感染脂質製剤を投与することを含む方法に関する。本発明はさらに、嚢胞性線維症に罹患した患者を治療する方法であって、該患者に治療的有効量の本発明の抗感染脂質製剤を投与することを含む方法に関する。【選択図】なし

Description

関連出願
本出願は、２００２年１０月２９日に出願された米国特許出願第６０／４２１，９２３
号の利益の権利を主張している、２００３年１０月２９日に出願された米国特許出願第１
０／６９６，３８９号の部分継続出願である、２００４年１２月２８日に出願された米国
特許出願第１１／０２３，９７１号の部分継続出願である。

序論
吸入法による投与に適した、ある徐放性のテクノロジーは、そして肺において、全身的
に徐放性及び目的とする部位に向けそして病巣への薬の取り込みを促進する能力により、
薬の持続性のある治療効果を提供する、リポソーム及び脂質複合体を採用している。本発
明は、リポソーム化された抗感染薬、及びリポソーム化された抗感染薬、又は脂質と複合
体化された抗感染薬を使用する、肺感染症の治療方法を包含する。

グッドマン及びギルマン共著（Goodman andGilman's）「The Pharmaceutical Basis of Therapeutics,EighthEdition」において報告されているように、「腎毒性及び聴器毒性の発生は、アミノ配糖体類が蓄積する濃度と関連しているので、腎機能が損なわれている患者におけるこれらの薬の維持投与量を減らすことが欠く事ができない。」アミノ配糖体類は、患者の欠陥に関係なく耳の前庭又は聴覚の機能不全を引き起こすので、一般的に維持投薬量を減らすことが重要である。本発明は、劇的に毒性を減らすことができるので、通常の投与量よりも高い投与量が可能になる。

嚢胞性線維症（ＣＦ）患者は、肺において濃い粘液及び／又は痰を分泌し、頻繁に重篤な
感染症に罹り、そして細菌のコロニーから生じたバイオフィルムを保有する。全てのこれ
らの流体及び成分は、抗感染薬による効果的に感染症を狙い打つことに対して障壁を作り
出す。本発明は、これらの障壁を乗り越え、そして削減された投与量（投与量又は投与頻
度において）さえ可能にするので、患者への前記の薬の投与量を減らす。一般的に肺感染
症に対する、本発明により提供される投薬計画は、投薬量を減らす手段を提供する。

リポソーム・ドラッグ・デリバリーシステムのためには、生体内における飽和効果を避
けるために前記の脂質負荷を最小限にするために、出来る限り薬に対する脂質の比（Ｌ／
Ｄ）を下げることがしばしば望ましい。吸入法による肺での薬の放出のためには、長期に
亘る使用のためには、リポソームの投与量は、クリアランス量を超えうるので前記の薬の
投与及び薬の有効性を制限することから、このことはとりわけ事実に合致しているかもし
れない。より低いＬ／Ｄ比は、前記の投与量／クリアランス閾値が出現する前により多く
の薬を投与することを可能にする。

発明の概略
ここで開示された注入法によって、典型的には脂質／抗感染薬の重量比が約４：１から
約５：１で抗感染薬を封入する適度の大きさ（＜１μｍ）の陰イオン脂質を実質的に含ま
ないリポソームが創製された。リポソームの捕捉された量は定量されており、これらの数
値に基づいて、その理論封入量が前記の抗感染薬が理想的な溶質として振舞う（すなわち
、リポソーム膜と相互作用することなく、水と共に理想的に封入される）かどうかをを算
出することができる。この比較によれば、予測より３〜５倍高い封入数が観察される。こ
れは、特殊な相互作用が起こり、予測した封入より大きな封入と、低い脂質／抗感染薬比
が可能になることを示すものである。リポソームが形成する溶液は、ある濃度の抗感染薬
を含有している。このリポソーム中の抗感染薬の濃度は、溶液中の抗感染薬の濃度とほぼ
同じであるはずである。しかしながら、内部の抗感染薬の濃度は、少なくとも３倍高いこ
とが計算されている。

部分的には、本発明は、脂質製剤および抗感染薬を含むリポソーム抗感染製剤を特徴とす
る。該脂質製剤は、陰イオン脂質を実質的に含まず、かつ抗感染薬に対する脂質の重量比
は、約４：１から約１：１である。いくつかの態様において、抗感染薬に対する脂質の重
量比は、約３：１〜約１：１、２：１〜約１：１、または約１：１である。

別の実施態様において、本発明は、抗感染薬に対する脂質の重量比が約１：１以下、約
０．７５：１以下、または約０．５：１以下である、抗感染薬を含む脂質製剤に関する。

いくつかの態様において、抗感染脂質製剤は、平均直径が約０．２μｍ乃至１．０μｍ
であるリポソームを含む。別のいくつかの実施態様において、該平均直径は、０．２μｍ
乃至約０．５μｍである。別のいくつかの実施態様において、該平均直径は、０．２μｍ
乃至約０．３μｍである。

いくつかの実施態様において、該抗感染薬は、当業で公知の抗感染薬のいずれかである
ことができる。いくつかの実施態様において、該抗感染薬は、限定されないが、アミカシ
ン、トブラマイシン、またはゲンタマイシン、または薬学的に許容可能なそれらの塩を含
むアミノ配糖体であることができる。

いくつかの実施態様において、脂質製剤は、中性脂質を含む。いくつかの実施態様にお
いて、脂質製剤は、陰イオン脂質を含まない。別のいくつかの実施態様において、該脂質
は、限定されないが、ジパルミトイルホスファチジルコリンもしくはジオレイルホスファ
チジルコリンといったホスファチジルコリンを含むリン脂質である。または、該脂質は、
限定されないが、コレステロールをはじめとしたステロールなどのステロイドであること
ができる。または、該脂質は、それらの組み合わせであることができる。

部分的に、本発明は、水性またはアルコール性溶液、もしくは脂質−アルコールの溶液
と抗感染薬との混合物、または中性脂質の脂質成分の少なくとも１つの相転移の温度未満
での混合物を注入するステップを含む、上記抗感染脂質製剤を調製する方法を特徴とする
。ここで、注入は、上記のように行われる。いくつかの実施態様において、アルコールは
エタノールである。

いくつかの実施態様において、脂質−アルコールの溶液またはその混合物の濃度は、約
１０乃至約３０ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施態様において、抗感染薬の水性もしく
はアルコール性溶液または混合物の濃度は、約２０乃至約７０ｍｇ／ｍＬである。いくつ
かの実施態様において、中性脂質−アルコールの溶液または混合物の濃度は、約１０乃至
約３０ｍｇ／ｍＬであり、その抗感染薬の水性もしくはアルコール性溶液または混合物の
濃度は、約２０乃至約７０ｍｇ／ｍＬである。しかしながら、当業者であれば、濃度は、
含まれる脂質および／または抗感染薬によって変えてもよいこと、あるいは、最適化して
もよいことを理解するであろう。

いくつかの実施態様において、本発明は、抗感染薬が下記から選択される上記脂質製剤
に関する。アミノ配糖体、テトラサイクリン、スルホンアミド、ｐ−アミノ安息香酸、ジ
アミノピリミジン、キノロン、β−ラクタム、β−ラクタムおよびβ−ラクタマーゼ阻害
剤、クロラムフェニコール、マクロライド、リノマイシン（原語：ｌｉｎｏｍｙｃｉｎ）
、クリンダマイシン、スペクチノノマイシン、ポリミキシンＢ、コリスチン、バンコマイ
シン、バシトラシン、イソニアジド、リファンピン、エタンブトール、エチオナミド、ア
ミノサリチル酸、サイクロセリン、カプレオマイシン、スルホン（原語：sulfone）、ク
ロファジミン、サリドマイド、ポリエン抗真菌剤、フルシトシン、イミダゾール、トリア
ゾール、グリセオフルビン、テルコナゾール、ブトコナゾールシクロピラックス（原語：
butoconazoleciclopirax）、シクロピロクスオラミン、ハロプロジン、トルナフタート、ナフティフィン（naftifine）、テルビナフィン、またはそれらの組合せ。いくつかの実施態様において、本発明は、抗感染薬がアミノ配糖体である、上記脂質製剤に関する。更なる実施態様において、該抗感染薬は、アミカシン、ゲンタマイシン、またはトブラマイシンから選択されるアミノ配糖体である。更なる実施態様において、該抗感染薬はアミカシンである。更なる実施態様において、該抗感染薬はゲンタマイシンである。更なる実施態様において、該抗感染薬はトブラマイシンである。

いくつかの実施態様において、本発明は、脂質製剤がリポソームである、上記脂質製剤
に関する。

いくつかの実施態様において、脂質製剤がリン脂質を含む、上記脂質製剤に関する。い
くつかの実施態様において、該脂質製剤は、ステロイドを含む。いくつかの実施態様にお
いて、該脂質製剤は、ステロールを含む。いくつかの実施態様において、該脂質製剤は、
ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）を含む。いくつかの実施態様において
、該脂質製剤は、コレステロールを含む。いくつかの実施態様において、該脂質製剤は、
リン脂質およびステロイドを含む。いくつかの実施態様において、該脂質製剤は、リン脂
質およびステロールを含む。いくつかの実施態様において、該脂質製剤は、ＤＰＰＣおよ
びコレステロールを含む。いくつかの実施態様において、本発明は、脂質製剤がＤＰＰＣ
、ジオレイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、およびコレステロールを含む、上記製
剤に関する。

いくつかの実施態様において、脂質製剤が、ＤＰＰＣおよびコレステロールを約２０：
１、１０：１、５：１、２：１、または１：１のモル比で含む、上記製剤に関する。

いくつかの実施態様において、本発明は、脂質製剤は、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＣ、およびコ
レステロールを約５〜２０：１〜２０：０．５〜１のモル比で含む、上記製剤に関する。
.

いくつかの実施態様において、本発明は、脂質製剤がリポソームであり、抗感染薬がア
ミカシンである、上記脂質製剤に関する。

いくつかの実施態様において、本発明は、脂質製剤がリポソームであり、抗感染薬がア
ミカシンであり、脂質製剤が、リン脂質およびステロールを含む、上記脂質製剤に関する
。

いくつかの実施態様において、本発明は、脂質製剤がリポソームであり、抗感染薬がア
ミカシンであり、脂質製剤がＤＰＰＣおよびコレステロールを含む、上記脂質製剤に関す
る。

別の実施態様において、本発明は、抗感染薬を含む脂質製剤を調製する方法に関し、該
方法は、脂質の溶液または混合物の液流と、抗感染薬の溶液または混合物の液流とを混合
させるステップを含む。そこでは、２つの液流が１つのラインに混合される。いくつかの
実施態様において、この２つの液流を１つのラインに混合する前にＹ字コネクターに入れ
る。

いくつかの実施態様において、本発明は、脂質の溶液または混合物の液流、および抗感
染薬の溶液または混合物の液流を、合計流速約７００乃至約９００ｍＬ／分で混合する、
上記脂質製剤に関する。いくつかの実施態様において、脂質の溶液または混合物の液流お
よび抗感染薬の溶液または混合物の液流を、合計流速約８００ｍＬ／分で混合する。いく
つかの実施態様において、脂質の溶液または混合物の液流を、合計流速約２００乃至約４
００ｍＬ／分で添加する。いくつかの実施態様において、脂質の溶液または混合物の液流
を、流速約３００ｍＬ／分で添加する。いくつかの実施態様において、抗感染薬の溶液ま
たは混合物の液流を、流速約４００乃至６００ｍＬ／分で添加する。いくつかの実施態様
において、抗感染薬の溶液または混合物の液流を、流速約５００ｍＬ／分で添加する。い
くつかの実施態様において、脂質の溶液または混合物の液流を、流速約３００ｍＬ／分で
添加し、抗感染薬の溶液または混合物を流速約５００ｍＬ／分で添加する。

いくつかの実施態様において、本発明は、液流の組み合わせの温度が約３０〜４０℃で
ある、上記方法に関する。いくつかの実施態様において、脂質の溶液または混合物の温度
が約３０℃であり、抗感染薬の溶液のまたは混合物の温度が約３０℃である。いくつかの
実施態様において、脂質の溶液または混合物の温度が約５０℃であり、抗感染薬の溶液ま
たは混合物の温度が室温である。

いくつかの実施態様において、本発明は、抗感染薬を含む脂質製剤を調製する方法が、
混合後、組み合わせの液流を水で少なくとも約２０秒間希釈するステップを更に含む、上
記方法に関する。

いくつかの実施態様において、本発明は、抗感染薬の溶液または混合物の濃度が約３０
乃至約５０ｍｇ／ｍＬである、上記方法に関する。いくつかの実施態様において、該抗感
染薬の溶液または混合物の濃度は、約４０乃至約５０ｍｇ／ｍＬである。

いくつかの実施態様において、本発明は、脂質の溶液または混合物の液流を流速約３０
０ｍＬ／分で添加し、抗感染薬の溶液または混合物の液流を流速約５００ｍＬ／分で添加
し；液流の組み合わせの温度が約３０〜４０℃であり；組み合わせの液流を、混合を行っ
た少なくとも約２０後に水で希釈し；そして、抗感染薬の溶液または混合物の濃度を約４
０乃至約５０ｍｇ／ｍＬとした、上記方法に関する。．

いくつかの実施態様において、本発明は、溶液または混合物が水性もしくはアルコール
性である、上記方法に関する。いくつかの実施態様において、本発明は、脂質製剤がリポ
ソームである、上記方法に関する。

いくつかの実施態様において、本発明は、抗感染薬が下記から選択される、上記方法に
関する。アミノ配糖体、テトラサイクリン、スルホンアミド、ｐ−アミノ安息香酸、ジア
ミノピリミジン、キノロン、β−ラクタム、β−ラクタムおよびβ−ラクタマーゼ阻害剤
、クロラムフェニコール、マクロライド、リノマイシン（原語：ｌｉｎｏｍｙｃｉｎ）、
クリンダマイシン、スペクチノノマイシン、ポリミキシンＢ、コリスチン、バンコマイシ
ン、バシトラシン、イソニアジド、リファンピン、エタンブトール、エチオナミド、アミ
ノサリチル酸、サイクロセリン、カプレオマイシン、スルホン（原語：sulfone）、クロ
ファジミン、サリドマイド、ポリエン抗真菌剤、フルシトシン、イミダゾール、トリアゾ
ール、グリセオフルビン、テルコナゾール、ブトコナゾールシクロピラックス（原語：bu
toconazoleciclopirax）、シクロピロクスオラミン、ハロプロジン、トルナフタート、ナフティフィン（naftifine）、テルビナフィン、またはそれらの組合せ。いくつかの実施態様において、抗感染薬は、アミノ配糖体である。いくつかの実施態様において、該抗感染薬は、アミカシン、ゲンタマイシン、またはトブラマイシンから選択されるアミノ配糖体である。
いくつかの実施態様において、該抗感染薬は、アミカシンである。いくつかの実施態様に
おいて、該抗感染薬は、ゲンタマイシンである。いくつかの実施態様において、該抗感染
薬は、トブラマイシンである。

いくつかの実施態様において、本発明は、脂質がリン脂質である、上記方法に関する。
いくつかの実施態様において、該脂質は、ステロイドを含む。いくつかの実施態様におい
て、該脂質は、ステロールを含む。いくつかの実施態様において、該脂質は、ＤＰＰＣを
含む。いくつかの実施態様において、該脂質は、コレステロールを含む。いくつかの実施
態様において、該脂質は、リン脂質およびステロールを含む。いくつかの実施態様におい
て、該脂質は、ＤＰＰＣおよびコレステロールを含む。

いくつかの実施態様において、本発明は、脂質製剤がリポソームであり、抗感染薬がア
ミカシンである、上記方法に関する。

いくつかの実施態様において、本発明は、脂質製剤がリポソームであり、抗感染薬がア
ミカシンであり、該脂質がリン脂質およびステロールを含む、上記方法に関する。

いくつかの実施態様において、本発明は、脂質製剤がリポソームであり、抗感染薬がア
ミカシンであり、該脂質がＤＰＰＣおよびコレステロールを含む、上記方法に関する。

いくつかの実施態様において、本発明は、該脂質製剤における、脂質対抗感染薬の比率
が約１：１以下である、上記方法に関する。

いくつかの実施態様において、本発明は、該脂質製剤における、脂質対抗感染薬の比率
が約０．７５：１以下である、上記方法に関する。

いくつかの実施態様において、本発明は、該脂質製剤における、脂質対抗感染薬の比率
が約０．５：１以下である、上記方法に関する。

いくつかの実施態様において、本発明は、脂質製剤がリポソームであり、抗感染薬がア
ミカシンであり、脂質がＤＰＰＣおよびコレステロールを含み、脂質対抗感染薬の比率が
約１：１以下である、上記方法に関する。

別の実施態様において、本発明は、それを必要とする患者における肺感染症を治療する
方法に関する。該方法は、該患者に対し、脂質製剤と抗感染とを含むリポゾーム抗感染製
剤の治療学的に有効な量を投与するステップを包含する。ここでは、抗感染薬の投与量は
、約１００ｍｇ／日以下である。さらなる実施態様において、抗感染薬の投与量は、１日
おきに約３０ｍｇ以下乃至約５０ｍｇである。ささらなる実施態様において、抗感染薬の
投与量は、３日おきに約３０ｍｇ以下乃至約５０ｍｇである。

別の実施態様において、本発明は、上記治療方法に関する。該リポソームは、平均直径
が約０．２μｍ乃至約１．０μｍである。さらなる実施態様において、該リポソームは、
平均直径が約０．２μｍ乃至約０．５μｍであり、または約０．２μｍ乃至約０．３μｍ
である。

別の実施態様において、本発明は、肺感染症が嚢胞性線維症の結果起こるものである、
上記方法に関する。

別の実施態様において、本発明は、脂質対抗感染薬の重量比が、約４：１乃至約０．５
：１、約３：１乃至約０．５：１、約２：１乃至約０．５：１、または約１：１乃至約０．５：１である、上記治療方法に関する。

別の実施態様において、本発明は、抗感染薬が下記から選択される、上記治療方法に関
する。アミノ配糖体、テトラサイクリン、スルホンアミド、ｐ−アミノ安息香酸、ジアミ
ノピリミジン、キノロン、β−ラクタム、β−ラクタムおよびβ−ラクタマーゼ阻害剤、
クロラムフェニコール、ペニシリン類、セファロスポリン類、マクロライド、リノマイシ
ン（原語：linomycin）、クリンダマイシン、コルチコステロイド（原語：coricosteroid
s）、プロスタグランジン、スペクチノノマイシン、ポリミキシン Ｂ、コリスチン、バ
ンコマイシン、バシトラシン、イソニアジド、リファンピン、エタンブトール、エチオナ
ミド、アミノサリチル酸、サイクロセリン、カプレオマイシン、スルホン（原語：sulfon
e）、クロファジミン、サリドマイド、ポリエン抗真菌剤、フルシトシン、イミダゾール
、トリアゾール、グリセオフルビン、テルコナゾール、ブトコナゾールシクロピラックス
（原語：butoconazoleciclopirax）、シクロピロクスオラミン、ハロプロジン、トルナフタート、ナフティフィン（原語：naftifine）、テルビナフィン、またはその組み合わせ。別の実施態様において、該抗感染薬は、アミノ配糖体である。別の実施態様において、抗感染薬はアミカシンである。

別の実施態様において、本発明は、脂質製剤が中性脂質を含む、上記治療方法に関する
。別の実施態様において、脂質製剤を構成する脂質は、全て中性脂質である。別の実施態
様において、リポソームは、陰イオン脂質を含まない。別の実施態様において、脂質製剤
は、リン脂質を含む。別の実施態様において、脂質製剤はステロールを含む。別の実施態
様において、脂質製剤は、ＤＰＰＣおよびコレステロールを含む。

別の実施態様において、本発明は、抗感染薬がアミカシンであり、脂質製剤がＤＰＰＣ
およびコレステロールを含む、上記治療方法に関する。

別の実施態様において、本発明は、抗感染薬がアミカシンであり、脂質対抗感染薬の重
量比が約４：１乃至約１：１であり、そして脂質製剤がＤＰＰＣおよびコレステロールを
含む、上記治療方法に関する。更なる実施態様において、該重量比は、約３：１乃至約１
：１、２：１乃至約１：１、または約１：１である。

別の実施態様において、本発明は、抗感染薬がアミカシンであり、脂質対抗感染薬の重
量比が約４：１乃至約１：１であり、脂質製剤がＤＰＰＣおよびコレステロールを含み、
そして肺感染症が嚢胞性線維症を原因とするものである、上記治療方法に関する。さらな
る実施態様において、該重量比は、約３：１乃至約１：１、２：１乃至約１：１、または
約１：１である。

別の実施態様において、本発明は、抗感染薬がアミカシンであり、脂質対抗感染薬の重
量比が約４：１乃至約０．５：１であり、脂質製剤がＤＰＰＣおよびコレステロールを含
み、そして、リポソームの平均直径が約０．１μｍ乃至約０．５μｍである、上記治療方
法に関する。さらなる実施態様において、該平均直径は０．２μｍ乃至約０．４μｍであ
り、または約０．２μｍ乃至約０．３μｍである。

別の実施態様において、本発明は、抗感染薬がアミカシンであり、脂質対抗感染薬の重
量比が約４：１乃至約０．５：１であり、脂質製剤がＤＰＰＣおよびコレステロールを含
み、肺感染症が嚢胞性線維症を原因とするものであり、リポソームの平均直径が約０．１
μｍ乃至約１．０μｍである、上記治療方法に関する。さらなる実施態様において、該平
均直径は０．２μｍ乃至約０．５μｍであり、または約０．２μｍ乃至約０．３μｍであ
る。

本発明のこれらの実施態様、他の実施態様、ならびにそれらの特徴および特性を、以下
の明細書、図面、および請求項により明らかにする。

図１は、嚢胞性線維症患者において見られる喀痰／バイオフィルムの断面図である。 図２は、本発明の薬物の標的およびデポー効果を表すグラフである。 図３は、種々の形態のアミカシンの細菌学的性質を示すグラフである。 図４は、種々の形態のアミカシンの細菌学的性質を示すグラフである。 図５は、リポソーム性／複合体化アミカシンおよびトブラマイシンの徐放を示すグラフである。 図６は、遊離の、または複合体化された、シプロフロキサシンについてのデータを示す図である。 図７は、種々の投与計画が施された肺での、薬物残留を示すグラフである。 図８は、リポソーム性抗感染薬製剤を調製するための２つの流れによるインライン注入プロセスをグラフィカルに示した図である。 図９は、アミカシンスルフェートとエタノール／水との混和性を示す図である。直線は、室温（ＲＴ）および４０℃でエタノールと混和する、最大アミカシン濃度（ベース）をそれぞれ示している。より高濃度で、アミカシンは、後に結晶として析出する分離した液相（コアセルベート）を形成する。水平方向の線は、脂質／アミカシン注入混合物（３００／５００部）および水２００部を添加後ののエタノール濃度を示している。

発明の詳細な説明
本発明は、その大きさおよび脂質対薬物の比率が、これまでに知られているものより小
さい、抗感染薬を含む脂質製剤を開示している。さらに本発明は、これらの脂質製剤を調
製する方法を開示している。

１.定義
本発明をさらに説明する前に、便宜上、本明細書、実施例および添付の請求の範囲にお
いて用いられるいくつかの用語をここに集めている。これらの定義を、当業者は本開示の
他の部分に照らして読み取り、理解するであろう。他に特に規定しない限り、ここで用い
られる全ての技術および科学用語は、当業者が通常理解するものと同じ意味を有する。

冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書においては、該冠詞の文法上の目的語が１また
は１より多い（すなわち、少なくとも１である）ことをを意味する。例えば、「an eleme
nt」は、１つのエレメントまたは１より多くのエレメントを意味する。

「バイオアベイラブル」は技術的に認識されており、それが投与された患者または被験
者が、投与された量、またはその一部を吸収し、組み込み、そうでなければ、生理学的に
利用することができる、本発明の形態を表す。

用語「comprise（含む）」および「comprising（含んでいる）」は、包括的な、オープ
ンな意味で用いられ、さらに追加的なエレメントを含んでもよいことを意味する。

用語「閉じ込められた」および「閉じ込められている」は、脂質ベースの製剤の表面へ
の抗感染薬の吸着、二重層もしくは２つの単層間の内部領域への抗感染薬の結合、２つの
二重層間の空間での抗感染薬の捕捉、または最内層の二重層もしくは炭層によって囲まれ
た空間内での抗感染薬の捕捉を意味する。

本明細書において用いられている用語「including（含んでいる）」は、「including
but not limitedto（限定されないが、〜を含んでいる）」の意味で用いられている。「
including（含んでいる）」は、「including
but not limitedto（限定されないが、〜を含んでいる）」は、交換可能に用いられる。

本明細書において説明している、用語「脂質抗感染薬製剤」または「Ｌｉｐ抗感染薬」
または「Ｌｉｐ−Ａｐ」は、脂質との複合体の一部として、あるいは、抗生物質が水性相
もしくは疎水性二重層の相もしくはリポソーム二重層の界面頭部基の領域でとなりうるリ
ポソームとして存在する、少なくとも約１重量％の抗感染薬が脂質に結合している、もし
くはあらゆる形態の抗感染薬組成物を意味する。好ましくは、少なくとも約５％、または
少なくとも約１０％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約２５％を結合させ
ることができる。結合は、脂質と脂質結合抗感染薬が保持され、フリーの抗感染薬が濾過
物中に存在する場合、フィルターを介して分離することによって測定することができる。
「リポソーム抗感染薬製剤」は、脂質製剤がリポソームの形態の抗感染脂質製剤である。

用語「哺乳動物」は、当業で公知である。哺乳動物の例としては、ヒト、霊長類、ウシ
、ブタ、イヌ、ネコ、および齧歯類（例えば、マウスおよびラット）があげられる。

当該方法によって治療される「患者」、「被験者」、または「ホスト」は、ヒトあるい
は非ヒト動物であってよい。

用語「薬学的に許容可能な塩」は、当業で認識されており、例えば、本発明の組成物に
含有される形態のものを含めた、比較的非毒性の、無機および有機の酸添加塩の化合物を
意味する。

用語「溶媒注入」は、１以上の脂質を少量、好ましくは微量のプロセス適合性溶媒に溶
解して、脂質懸濁液もしくは溶液（好ましくは、溶液）を作製し、その後該溶液を、生物
活性物質を含有する水性媒体に添加することを含むプロセスである。典型的には、プロセ
ス適合性溶媒は、水性プロセス、例えば、透析法によって洗い流すことができるものであ
る。冷却／加温のサイクルをを繰り返す組成物は、溶媒注入によって作製されることが好
ましく、エタノール注入が好ましい。溶媒として、アルコールが好ましい。「エタノール
注入」は、溶媒注入の１つのタイプであり、１以上の脂質を少量、好ましくは微量のエタ
ノールに溶解して、脂質溶液を作製し、その後該溶液を、生物活性物質を含有する水性媒
体に添加することを含むプロセスである。溶媒の「小」量とは、注入プロセスにおけるリ
ポソームまたは脂質複合体の作製に適合する量である。さらに、用語「溶媒注入」は、製
剤成分の２つの流れを最初に１つのラインに混合しておく、インライン注入プロセスを含
む。

用語「実質的に含まない」は、当業で認識されており、些細な量以下を意味する。

用語「治療薬」は、当業で認識されており、被験者において局所的もしくは全身的に作
用を及ぼす、生物学的、生理学的、または薬理学的活性物質である、任意の化学的部分を
意味する。「薬物」と称されることもある治療薬の例としては、Merck Index, the Physi
cians DeskReference, and The Pharmacological
Basis ofTherapeuticsなどの公知の参考文献に記載があり、限定されないが、医薬品；
ビタミン類；ミネラルサプリメント類；疾患もしくは疾病の治療、予防、診断、治癒もし
くは軽減のために用いられる物質；または生物学的に活性のある、もしくはそれらが生理
学的環境におかれたときにより活性的になるプロドラッグがあげられる。

本明細書において用いられているフレーズ「治療的有効量」は、肺感染症を阻害するこ
とによって望ましい治療効果をもたらすのに有効な、本発明の抗感染脂質製剤を含む、化
合物、物質、または組成物の量を意味する。

用語「治療」は、当業で認識されており、あらゆる状態および疾患の少なくとも１つの
症状を治癒ならびに軽減させることを言う。用語「治療する」は、状態または疾患から防
御または予防の機能を果たす予防的治療をも意味する。

２．抗感染薬
抗感染薬は、細菌性、ミコバクテリア性、真菌性、ウイルス性、または原生動物性感染
などの感染に対して作用する作用物質である。本発明で論じる抗感染薬としては、限定さ
れないが、アミノ配糖体類（例えば、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、トブラマイ
シン、アミカシン、ネチルマイシン、カナマイシン、など）、テトラサイクリン類（例え
ば、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、メタサイクリン、ドキシサイク
リン、ミノサイクリン、など）、スルホンアミド類（例えば、スルファニルアミド、スル
ファジアジン、スルファメタジン、スルフイソキサゾール、スルファセタミド、など）、
パラアミノ安息香酸、ジアミノピリミジン（例えば、トリメトプリム、スルファメトキサ
ゾール、ピラジンアミド、などと組み合わせて使用されることが多い）、キノロン類（例
えば、ナリジキシ酸、シノキサシン、シプロフロキサシン、およびノルフロキサシン、な
ど）、ペニシリン類（例えば、ペニシリンＧ、ペニシリンクロルＶ、アンピシリン、アモ
キシシリン、バカンピシリン、カルベニシリン、カルベニシリンインダニル、チカルシリ
ン、アズロシリン、メズロシリン、ピペラシリン、など）、ペニシリナーゼ耐性ペニシリ
ン（例えば、メチシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、ナフシリ
ン、など）、第１世代セファロスポリン系物質（例えば、セファドロキシル、セファレキ
シン、セフラジン、セファロチン、セファピリン、セファゾリン、など）、第２世代セフ
ァロスポリン系物質（例えば、セファクロール、セファマンドール、セフォニシド、セフ
ォキシチン、セフォテタン、セフロキシム、セフロキシムアクセチル；セフメタゾール、
セフプロジル（原語：cefprozil）、ロラカルベフ（原語：loracarbef）、セホラニド、
など）、第三世代セファロスポリン系物質（例えば、セフェプリム（原語：cefepime）、
セホペラゾン、セフォタキシム、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフタジジム、セ
フィキシム、セフポドキシム、セフチゾキシム、など）、他のベータ−ラクタム系物質（
例えば、イミペネム、メロペネム（原語：meropenem）、アズトレオナム、クラブラン酸
、スルバクタム、タロバクタム（原語：tazobactam）、など）、ベータ−ラクタマーゼ阻
害剤（例えば、クラブラニン酸）、クロラムフェニコール、マクロライド類（例えば、エ
リスロマイシン、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、など）、リンコマイシン、ク
リンダマイシン、スペクチノマイシン、ポリミキシンＢ、ポリミキシン類（例えば、ポリ
ミキシンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅｌ（コリスチンＡ）、もしくはＥ２、コリスチンＢもしくは
Ｃ、など）、コリスチン、バンコマイシン、バシトラシン、イソニアジド、リファンピン、エタンブトール、エチオナミド、アミノサリチル酸、サイクロセリン、カプレオマイシン、スルホン類（例えば、ダプソン、スルホキソンナトリウム、など）、クロファジミン、サリドマイド、または他の脂質カプセル化が可能な抗細菌剤が含まれる。抗感染薬は、抗真菌性物質を含むことができ、それは、ポリエン抗真菌性物質（例えば、アンホテリシンＢ、ナイスタチン、ナタマイシン、など）、フルシトシン、イミダゾール類（例えば、ｎ−チコナゾール（原語：ticonazole）、クロトリマゾール、エコナゾール、ケトコナゾール、など）、トリアゾール類（例えば、イトラコナゾール、フルコナゾール、など）、グリセオフルビン、テルコナゾール、ブトコナゾール（原語：butoconazole）、シクロピロックス、シクロピロクスオラミン、ハロプロジン、トルナフテート、ナフチフィン、テルビナフィン、または他の脂質カプセル化もしくは複合体化することが可能な抗真菌性の物質が含まれる。説明と例は、主にアミカシンについて行うが、適用範囲はこの抗感染薬に限定されることを意図するものではない。薬物の併用も可能である。

特に好ましい抗感染薬は、アミノ配糖体類、キノロン類、ポリエン抗真菌性物質および
ポリミキシン類を含む。

本発明の抗感染脂質製剤に用いられる好適な抗感染薬には、薬学的に許容される添加塩
および抗感染薬の複合体も含まれる。化合物が１以上のキラル中心を持つ場合、特に明記
しない限り、本発明は、それぞれの独自のラセミ化合物、ならびに独自の非ラセミ化合物
を含む。

抗感染薬が不飽和の炭素−炭素二重結合を有する場合、ｃｉｓ（Ｚ）およびｔｒａｎｓ
（Ｅ）双方のアイソマーが本発明の範囲に含まれる。抗感染薬が、例えば、下記式（化１
）で表されるような、ケト−エノール互変異性体などの互変異性型で存在する場合、各互
変異性型について、それが均衡を保って存在するか、１つの型にロックされているかを、
Ｒ’で適切な置換を行って本発明に記載のように検討される。いずれか１つに対する置換
基の意味は、その意味において、または他の置換基の意味において、それぞれ独立してい
る。

本発明の抗感染脂質製剤に用いられる好適な抗感染薬には、白金化合物のプロドラッグ
も含まれる。プロドラッグは、活性親化合物をin vivoで放出する、共有結合したあらゆ
る担体であると考えられている。

３．肺感染症
本発明の方法を用いて治療することができる肺感染症（例えば、嚢胞性線維症患者）に
は、シュードモナス（例えば、シュードモナス・アエルギノーザ（P. aeruginosa）、シ
ュードモナス・パウシモビリス（Ｐ. Paucimobilis）、シュードモナス・プチダ（P.
putida）、シュードモナス-フルオレッセンス（P.fluorescens）、およびシュードモナ
ス・アシドボランス（P. acidovorans）、ブドウ球菌（staphylococcal）、耐性黄色ブド
ウ球菌（MethicillinresistantStaphylococcusaureus （ＭＲＳＡ））、連鎖球菌（streptococcal）（連鎖球菌性肺炎（Streptococcuspneumoniae）によるものを含む）、大腸菌（Escherichiacoli）、クレブシエラ（Klebsiella）、エンテロバクター（Enterobacter）、セラチア属（Serratia）、ヘモフィルス属（Haemophilus）、エルシニア属ペソス（Yersiniapesos）、ブルクホルデリア・プセウドマレイ（Burkholderiapseudomallei）、ブルクホルデリア・セパシア（B.cepacia）、ブルクホルデリア・グラディオリ（B. gladioli）、ブルクホルデリア・マルチボランス（B. multivorans）、ブルクホルデリア・ベトナミエンシス（B.vietnamiensis）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacteriumtuberculosis）、マイコバクテリウムアビウム複合体（M.avium（ＭＡＣ）（マイコバクテリウム・アビウム（M avium）およびマイコバクテリウム・イントラセルラーレ（M.intracellular））、マイコバクテリウム・カンサシイ（M.kansasii）、マイコバクテリウム-キセノピー（M. xenopi）、マイコバクテリウム・マリナム（M.marinum）、マイコバクテリウム-ウルセランス（M.ulcerans）、またはマイコバクテリウム・フォルツイタム複合体（M. fortuitum complex）（マイコバクテリウム・フォルツイタム（M.fortuitum）およびマイコバクテリウム・ケロネイ（M.chelonei））感染がある。

４．治療方法
ある実施態様において、本発明は、抗感染脂質製剤の治療的有効量を投与することを含
む治療方法を含む。

以下に特別の投与量を規定しない限り、１４日間の治療クールでの用量による肺おける
ＣＦＵ数を減らすために、ネブライザーで肺に送達する場合、本発明の好ましい用量は、
最小量のフリーの薬物（もちろん、塩であってもよい）の有効量の５０％以下、３５％以
下、２０％以下、または１０％以下である。比較のフリー薬物の量は、本発明の薬物治療
を適用する投与期間に使用されることになる累積量である。このパラグラフに定義するフ
リー薬物の比較の最小量は、「比較のフリー薬物量」である。

本発明の非ＣＦ治療態様の使用は、好ましくはヒトであるが、あらゆる動物を用いて行
うことができる。所与の動物における相対量は、その動物について測定される。

投与計画は、好ましくは１日１回以下である。好ましい実施態様において、投与計画は
、１日おき、３日おき、毎週、以下であり、例えば、投与計画は、１日おき以下で、比較
フリー薬物量の５０％以下を用いて行うことができる。あるいは、例えば、投与は、比較
フリー薬物量の３５％以下を用いて行うことができる。図３および４の動物データを参照
されたい。それは、本発明の抗感染脂質製剤がフリーの薬物より有効であることを示して
いる。

感染症を治療するための抗感染薬の有効量を臨床医師は認識しているであろうが、その
有効量とは、治療することが求められている疾患、または避けること、もしくは治療する
ことが求められている状態の１以上の徴候を治療、減少、寛解、除去もしくは予防するた
めの有効量、またはそうでなければ疾患もしくは状態の病理学的状態に臨床的に認識可能
な変化をもたらすための有効量である。寛解は、予防的に治療される動物において感染症
の発生もしくは重篤度を減らすことが含まれる。いくつかの実施態様において、該有効量
は、肺感染症の徴候が現れてから後に治療もしくは寛解するために有効な量である。別の
いくつかの実施態様において、該有効量は、予防的に治療される動物における感染症の平
均的な発生率もしくは重篤度を治療または寛解するために有効な量である（統計学的研究
に基づいて測定される）。

リポソームまたは他の脂質の送達システムは、ネブライザースプレー、パウダー、もし
くはエアゾールのいずれかを用いた吸引によって、または、くも膜下腔内投与によって、
投与することができる。吸引投与が好ましい。全体的な結果は、フリー薬物もしくは非経
口形態の薬物と比較して、少ない投与頻度で治療指数を高められる。リポソームまたは他
の脂質製剤は、肺の裏打ちまたは肺の界面活性物質と適合可能でありながら、薬物を保護
する能力をもつことから、特に有利である。

本発明は、肺のグラム陰性菌感染を治療するための方法を含む。通常治療される感染の
一例として、ＣＦ患者における慢性シュードモナス感染がある。アミノ配糖体を用いた肺
の感染症（例えば、ＣＦ患者におけるもの）の公知の治療は、通常、約２００〜６００ｍ
ｇ／日のアミカシンまたはトブラマイシンを吸引によって投与することを含む。本発明は
、好ましい実施態様において、１００ｍｇ／日以下のアミカシン（または、投与頻度が少
ない場合、１００ｍｇ／日以下に正規化）を投与することによって治療することができる
。さらに別の実施態様においては、６０ｍｇ／日以下のアミカシンを毎日投与する。さら
に別の実施態様においては、約３０乃至５０ｍｇを２日おき以下で投与する。最も好まし
い実施態様は、１日おき、または３日に１回、約３０乃至５０ｍｇを投与する。

５．脂質およびリポソーム
本発明の組成物に用いられる資質は、合成脂質、半合成脂質、または天然に存在する脂
質であることができ、リン脂質類、トコフェロール類、ステロイド類、脂肪酸類、アルブ
ミンなどのグリコプロテイン類、陰イオン脂質および陽イオン性脂質があげられる。該脂
質は、陰イオン性でも、陽イオン性でも、中性でもよい。ある実施態様において、当該脂
質製剤は、実質的に陰イオン脂質を含まない。ある実施態様において、当該脂質製剤は、
中性脂質のみを含む。別の実施態様において、当該脂質製剤は、陰イオン脂質を含まない
。別の実施態様において、当該脂質は、リン脂質である。リン脂質は、卵ホスファチジル
コリン（ＥＰＣ）、卵ホスファチジルグリセロール（ＥＰＧ）、卵ホスファチジルイノシ
トール（ＥＰＩ）、卵ホスファチジルセリン（ＥＰＳ）、ホスファチジルエタノールアミ
ン（ＥＰＥ）、および卵ホスファチド酸（ＥＰＡ）；その大豆の対応物、大豆ホスファチ
ジルコリン（ＳＰＣ）；ＳＰＧ，ＳＰＳ、ＳＰＩ、ＳＰＥ、およびＳＰＡ；その硬化卵お
よび大豆対応物（例えば、ＨＥＰＣ、ＨＳＰＣ）、炭素数１２〜２６の鎖を含有する２お
よび３のグリセロール位置における脂肪酸のエステル結合、およびコリン、グリセロール
、イノシトール、セリン、エタノールアミンを含むグリセロールの１位置における異なる
頭基（headgroup）から構成された他のリン脂質、ならびに対応するホスファチジン酸が
あげられる。これらの脂肪酸の鎖は、飽和であっても不飽和であってもよく、そのリン脂
質は、異なる鎖長および異なる不飽和度の脂肪酸で構成してもよい。特に、製剤の組成物
は、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、天然に存在する肺表面活性剤の
主要な構成要素、ならびにジオレイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）を含むことがで
きる。他の例としては、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）およびジミリ
ストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルコリ
ン（ＤＰＰＣ）およびジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジステ
アロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）およびジステアロイルホスファチジルグリセ
ロール（ＤＳＰＧ）、ジオレイルホスファチジル−エタノールアミン（ＤＯＰＥ）および
パルミトイルステアロイルホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）やパルミトイルステアロイ
ルホスファチジルグリセロール（ＰＳＰＧ）のような混合リン脂質、トリアシルグリセロ
ール（原語：driacylglycerol）、ジアシルグリセロール、セラニド（原語：seranide）
、スフィンゴシン、スフィンゴミエリンおよびモノオレイル−ホスファチジルエタノール
アミン（ＭＯＰＥ）のような単一アシル化リン脂質を含むことができる。

用いられる脂質は、脂肪酸のアンモニウム塩、リン脂質およびグリセリド類、ステロイ
ド類、ホスファチジルグリセロール類（ＰＧ）、ホスファチジン酸類（ＰＡ）、ホスファ
チジルコリン類（ＰＣ）、ホスファチジルイノシトール類（ＰＩ）、ホスファチジルセリ
ン類（ＰＳ）を含むことができる。脂肪酸は、炭素数１２〜２６の鎖長の飽和もしくは不
飽和脂肪酸を含む。いくつかの具体例としては、ミリスチルアミン、パルミトイルアミン
、ラウリルアミン、およびステアリルアミン、ジラウロイルエチルホスホロチオエート（
ＤＬＥＰ）、ジミリストイルエチルホスホコリン（ＤＭＥＰ）、ジパルミトイルエチルホ
スホコリン（ＤＰＥＰ）およびジステアロイルエチルホスホコリン（ＤＳＥＰ）、Ｎ−（
２，３−ジ−（９（Ｚ）−オクタデセニルオキシ）−プロ−ｌ−ピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリ
メチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）および１，２−ビス（オレオイルオキシ）−
３−（トリメチルアンモニウム）プロパン（ＤＯＴＡＰ）が含まれる。ステロイドの例と
しては、コレステロールおよびエルゴステロールが含まれる。ＰＧ、ＰＡ、ＰＩ、ＰＣお
よびＰＳの例としては、ＤＭＰＧ、ＤＰＰＧ、ＤＳＰＧ、ＤＭＰＡ、ＤＰＰＡ、ＤＳＰＡ
、ＤＭＰＩ、ＤＰＰＩ、ＤＳＰＩ、ＤＭＰＳ、ＤＰＰＳ、およびＤＳＰＳ、ＤＳＰＣ、Ｄ
ＰＰＧ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、卵ＰＣがある。

リポソームまたはＤＰＰＣなどのホスファチジルコリンの抗感染脂質製剤化合物は、肺
、肺胞マクロファージなどにおける細胞の摂取を助け、抗感染薬物質の肺での放出を助け
る（Gonzales-Rothiet al. （1991））。負に帯電したＰＧ、Ｐａ、ＰＳ、およびＰＩな
どの脂質は、粒状凝集物を減少させることに加えて、吸引用製剤の徐放の特徴ならびに肺
への製剤の輸送において役割を果たす（全身における取り込みのためのトランスサイトー
シス）。該ステロール化合物は、製剤の放出および漏洩の特徴に影響を及ぼすと考えられ
ている。

リポソームは、水性容積を閉じ込めた完全に閉じた脂質二重層である。リポソームは、
ユニラメラ小胞（単一の膜二重層を保有する）、または多層ラメラ小胞（多数の膜二重層
をもち、そのそれぞれが隣の水性層と分離したタマネギ状構造を特徴とする）であること
ができる。当該二重層は、疎水性の「尾部」領域、と親水性の「頭部」領域を持つ２つの
脂質単層膜からなる。当該膜二重層の構造は、脂質単層の疎水性（非極性）の「尾部」が
二重層の中心に向かい、親水性の「頭部」が水相に向かうような構造になっている。抗感
染脂質製剤は、脂質と抗感染薬剤の結合である。この結合は、共有結合、イオン結合、静
電結合、または立体結合である。これらの複合体は、さらなる水溶性の溶質を閉じ込める
ことができない。そのような複合物の例としては、アンフォトテンシン（原語：amphoten
cin）の脂質複合体（Janoffet al., Proc. Nat Acad. ScL, 85:6122 6126,
1988）、およびカルジオリピンのドキソルビシンとの複合体がある。

脂質クラスレートは、１以上の脂質を有する３次元のケージ状構造で、該構造は、生物
活性物質を閉じ込めている。こうしたクラスレートは本発明に包含される。

プロリポソームは、水性液と接触するとリポソームまたは脂質複合物となり得る製剤で
ある。攪拌またはその他の混合を行う必要がある。そのようなプロリポソームは本発明の
範囲に含まれる。

リポソームは、種々の方法で作製することができる（例えば、Bally, Cullis et al, B
iotechnol Adv.5（1）: 194, 1987を参照されたい）。Bangham's処置（J.MoI. Biol., J MoI Biol. 13（l）:238-52, 1965）は、通常のマルチラメラ小胞（ＭＬＶ）を作製する。Lenket al. （米国特許第４，５２２，８０３号、第５，０３０，４５３号および第５，１６９，６３７号）、Fountainet al.（米国特許第４，５８８，５７８号）ならびにCulliset al.（米国特許第４，９７５，２８２号）は、各水性コンパートメント内の溶質の分散がラメラ間で実質的に等しいマルチラメラリポソームを形成する方法を開示している。Paphadjopouloset al.（米国特許第４，２３５，８７１号）は、逆相エバポレーションによってオリゴラメラを調製することを開示している。

ユニラメラ小胞は、いくつかの技術、例えば、Culliset al.（米国特許第５，００８，０５０号）やLoughrey et al.（米国特許第 ５，０５９，４２１号）の押出法によってＭＬＶから作製することができる。超音波処理および超音波処理を用いて、大きなユニラメラリポソームから小さなユニラメラリポソームを形成することもできる（例えば、Paphadjopoulosetal.、Biochim. Biophys. Acta., 135:624-638, 1967; Deamer, 米国特許第４，５１５，７３６号；およびChapmanetal., Liposome technol.、1984, pp. 1-18）。

Banghamet al（J. MoI.Biol., 1965,13:238- 252）のオリジナルのリポソーム調製は、リン脂質を有機溶媒に懸濁化し、次いで、それを蒸発させ、乾燥させてリン脂質膜を反応容器上に取り出すことができる。次に、適量の水性相を添加し、該混合物を「膨張」させ、残りのマルチラメラ小胞（ＭＬＶ）からなるリポソームを、機械的手段によって分散させる。この調製は、Papahadjopouloset al. （Biochim.Biophys, Acta., 1967, 135:624- 638）に記載の、超音波処理した小さなユニラメラ小胞および大きなユニラメラ小胞の開発に基づいている。

大きなユニラメラ小胞（ＬＵＶ）を作製する技法、例えば、逆相エバポレーション、注
入処理、および界面活性剤希釈などを用いて、リポソームを使用することができる。リポ
ソームを形成するためのこれらおよび他の方法は、テキスト、Lipoxomes, Marc Ostro, e
d., MarcelDekker, Inc., New York, 1983,Chapter 1に記載がある。その関連部分を本明細書に引用を以って援用する。さらに、Szoka,Jr. et al.（1980, Ann. Rev.Biophys. Bioeng.、9:467）を参照されたい。その関連部分を本明細書に引用を以って援用する。

小胞を調製するための他の方法としては、逆相エバポレーション小胞（ＲＥＶ）からの
ものが挙げられる。Papahadjopoulosらの米国特許第４，２３５，８７１号を参照された
い。使用可能な別のクラスのリポソームは、ラメラ溶質分散とほぼ等しい特徴を持つ。こ
のリポソームは、米国特許第４，５２２，８０３号（Lenk,et al.）に記載されているように、安定な複室小胞（ＳＰＬＶ）、米国特許第４，５８８，５７８号（Fountain,et al.）に記載されているように１相性小胞、そして、上記のように凍結および解凍マルチラメラ小胞（ＦＡＴＭＬＶ）とそれぞれ命名されている。

種々のステロールおよびそれらの水溶性誘導体、例えば、コレステロールヘミスクシナ
ートを用いてリポソームが作製されてきた；具体的には、Janoffらの米国特許第４，７２
１，６１２号（１９９８年１月２６日発行、発明の名称：「ステロイド性リポソーム」）
を参照されたい。Mayhewらは、アルファトコフェロールおよびその誘導体を含むリポソー
ムをカプセル化することによって抗細菌剤および抗ウイルス性物質の毒性を減少させる方
法について述べている。さらに、種々のトコフェロールおよびそれらの水溶性誘導体を用
いてリポソームが形成されている。例えば、Janoffらの米国特許第５，０４１，２７８号を参照されたい。

６．調製方法
リポソームまたは抗感染脂質製剤を作製するプロセスには、「溶媒注入」プロセスが含
まれる。これは、１以上の脂質を少量、好ましくは微量のプロセス適合性溶媒に溶解して
、脂質懸濁液もしくは溶液（好ましくは、溶液）を作製し、その後該溶液を、抗感染薬を
含有する水性媒体に注入することを含むプロセスである。典型的には、プロセス適合性溶
媒は、水性プロセス、例えば、透析法によって洗い流すことができるものである。「エタ
ノール注入」は、溶媒注入の１つのタイプであり、１以上の脂質を少量、好ましくは微量
のエタノールに溶解して、脂質溶液を作製し、その後該溶液を、抗感染薬を含有する水性
媒体に添加することを含むプロセスである。溶媒の「少」量とは、注入プロセスにおける
リポソームまたは脂質複合体の作製に適合する量である。こうしたプロセスについては、
２００３年８月４日に出願されたLee らの米国特許第１０／６３４，１４４号、２００３
年３月５日に出願されたPilkiewicz らの米国特許第１０／３８３，１７３号、および２
００３年３月５日に出願されたBoniらの米国特許第１０／３８３，００４号に記載がある
。その全てを、引用を以って本明細書に引用する。

脂質−アルコールの溶液を、抗感染薬を含有する水性またはアルコール性溶液または混
合物に注入するステップは、抗感染薬を含有する水性またはアルコール性溶液または混合
物の表面の上または下で行うことができる。好ましくは、このステップは、溶液または混
合物の表面の上または下で行われる。

リポソームはまた、２００３年３月５日に出願された米国特許第１０／３８３，００４号
、２００３年８月４日に出願された米国特許第１０／６３４，１４４号、２００２年８月
２０日に出願された米国特許第１０／２２４，２９３号、および２００３年１０月２９日
に出願された米国特許第１０／６９６，３８９号に記載の方法によって調製することがで
きる。これらの特許明細書の全てを、引用を以って本明細書に援用する。

リポソームまたは脂質製剤のサイジングは、例えば、押し出し法、超音波処理、および
超音波処理技法など、当業者に公知であり、容易に行うことができるいくつかの方法によ
って行うことができる。押し出し法は、加圧しながらリポソームを１回以上、規定された
孔サイズのフィルターに通すことを含む。フィルターは通常ポリカーボネート製であるが
、該フィルターは、リポソームと相互作用しない、圧力がかかった状態での押し出し法に
耐える十分な強度を持つ、あらゆる耐性材料で作製することができる。好ましいフィルタ
ーは、「直接通す」フィルターである。なぜなら、それらは、通常、本発明の好ましい押
し出し法の高圧に対して耐性があるからである。「蛇行経路」フィルターを使ってもよい
。さらに押し出し法は、例えば、リポソームを枝分かれした孔タイプの酸化アルミニウム
孔フィルターを通して押し出す、Anopore（登録商標）フィルターなどの非対称フィルタ
ーを用いることもできる。

リポソームまたは脂質製剤は、超音波処理によってサイズを小さくすることもできる。
これは、超音波エネルギーを用いて、リポソームを分裂またはせん断するものであり、同
時により小さなリポソームに作製しなおすものである。超音波処理は、リポソーム懸濁液
を含有するガラスを、浴タイプの超音波処理器内にできた超音波の震央に浸漬することに
よって行われる。別法として、リポソーム懸濁液に接触させたチタンプローブの振動によ
って超音波エネルギーを発生させるプローブタイプの超音波処理器を用いてもよい。Giff
ord Wood ホモジナイザーなどの、超音波処理装置や製粉処理機を用いて、より大きなリ
ポソームもしくは脂質製剤をより小さなリポソームもしくは脂質製剤にすることができる
。

得られたリポソーム製剤は、接線方向に流す濾過などの、当業で公知の方法を用いて均
質の集団に分離することができる。この処置においては、大きさの不均一なリポソームま
たは脂質製剤の集団を接線方向に流してフィルターを通過させ、大きさの上限および／ま
たは下限をもつリポソーム集団とする。サイズの異なる、すなわち、ポアサイズの異なる
、２つのフィルターを用いた場合、最初のポア径より小さなリポソームは、該フィルター
を通過する。次いで、この濾過物に接線方向の濾過処理を施し、第１のポアサイズより小
さいポアサイズをもつ第２のフィルターに通す。このフィルターの濃縮水は、それぞれ第
１および第２のフィルターのポアサイズの大きさによって定義された上限と下限をそれぞ
れ有するリポソーム／複合体集団である。

Mayer らは、抗癌剤、アントラサイクリン、またはビンカアルカロイドなどの親油性イ
オン性生物活性物質を効率的に閉じ込めることに関する諸問題が、膜貫通イオン勾配によ
って軽減されることを見出した。摂取を大きくすることとは別に、そのような膜貫通勾配
はまた、リポソーム製剤中での抗感染薬の保留を増加させる。

抗感染脂質製剤は、持続的な抗感染効果および低い毒性を有し、投与回数を減らしなが
ら、治療指数を高めることができる。前臨床動物実験、および等しい用量レベルで吸入さ
れたトブラマイシン（非リポソームまたは脂質ベース）との比較試験においては、リポソ
ーム性アミカシンは、投与直後から２４時間後までの間に、肺における薬物濃度が、トブ
ラマイシンのそれの２倍乃至数百倍になることがわかっている。追加的に、リポソーム性
アミカシンは、これらのレベルを２４時間良好に保つ。ＣＦ患者のシュードモナス感染を
模倣して設計した動物モデルにおいては、リポソーム性アミカシンが、フリーのアミノ配
糖体と比較して、有意に動物肺における感染を減らすことがわかっている。

肺の界面活性物質は、呼吸中の肺の拡張および収縮を可能にする。これは、肺を脂質と
タンパク質の組み合わせを用いて被覆することに伴って起こるものである。該脂質は、外
側へ向いた疎水性鎖をもつ単層として存在する。該脂質は、肺の界面活性物質の８０％を
占める。脂質の大半は、ホスファチジルコリンであり、その５０％は、ジパルミトイルホ
スファチジルコリン（ＤＰＰＣ）（Veldhuizen et al, 1998）である。当該界面活性物質
たんぱく質（ＳＰ）は、構造を維持するための機能を示し、呼吸中におこる肺の界面活性
物質の拡張および収縮を容易にする。もちろん、ＳＰ−ＢおよびＳＰ−Ｃは、特にリポソ
ームを分解する（Hagwood et al., 1998;Johansson, 1998）。この分解の振る舞いは、リポソームを徐々に分解することを容易にするであろう。さらにリポソームはまた、ファゴサイトーシスを介してマクロファージによって直接的に消化されることもある（Couveuret al., 1991; Gonzales-Roth et al., 1991; Swenson et al, 1991）。肺胞マクロファージによるリポソームの取り込みは、薬物が疾患部位に送達される別の手段である。

吸引用のリポソーム製剤もしくは脂質製剤に用いられる該脂質は、好ましくは、肺の界
面活性物質に見出される内因性脂質に共通している。リポソームは、所望の薬剤を閉じ込
める二重層からなる。これらは、異なる層のいずれかの脂質、または層間の水性空間に薬
剤を閉じ込めた、同心の二重層としてのマルチラメラ小胞によって構成することができる
。本発明は、独自のリポソーム性または抗感染脂質製剤を創製する独自の方法を用いる。
プロセスおよびこれらのプロセスによって得られる生成物のどちらも本発明に包含される
。

６．１ インライン注入法
ある特に好ましい実施態様において、本発明のリポソーム性抗感染薬製剤は、インライ
ン注入法によって作製される。そこでは、脂質溶液の流れと抗感染薬溶液の流れとを１つ
の流れに混合する。例えば、２つの溶液を、図８に示すように、先の方がＹ字コネクター
になった混合チューブ内のインラインに混合するとよい。このようにインライン注入法は
、上記注入法とは異なり、そこでは、脂質溶液は、大量の抗感染薬用液の流れの中に注入
される。驚くべきことに、この注入法の結果、脂質対薬物の比率を低くし、閉じ込め効果
を高めることができる。該プロセスは、流速、温度、抗感染薬濃度、注入ステップ後の塩
添加といったパラメーターを最適化することによって、さらに改良することができる。

６．１ａ 流速の効果
流速の合計を８００ｍＬ／分に保ちながら、個別の流速を変化させた。そうするために
、ポンピングスピードの異なる２つの別々のポンプを用いた。ＮａＣｌの最終濃度が１．
５％、エタノールの最終濃度が３０％を超えないようにしながら、ＮａＣｌ溶液の入った
ビーカーに、混合溶液を１０秒間注入した。混合後、１ｍＬのアリコートをセファデック
ス（Sephadex）Ｇ−７５ゲル濾過カラムに通して、閉じ込められたものから遊離アミカシ
ンを分離させた。（視覚混濁度による測定によって）密度の最も高い１ｍＬの画分を回収
し、さらに分析した。得られた結果を表１に示す。脂質/アミカシン流速比率が増加した
結果、３００／５００ｍＬ／分までほぼＬ/Ｄは一定であった。さらに脂質率を増やした
ところ、Ｌ／Ｄは、上昇し、粒径は大きくなり始めた。同時に脂質の流速が大きくなり、
脂質の質量を大きくするにつれて、アミカシン回収率（カプセル化効率）が上昇した。

表１：流速がアミカシンのカプセル化に及ぼす影響*

*：脂質およびアミカシン溶液は４０℃に維持した。アミカシン保存溶液は５０ｍｇ／
ｍＬとした。注入前にＮａＣｌの１０％溶液を添加し、最終的に１．５％とした。注入時
間は、１０秒に設定した。混合チューブを１０ｃｍ、６−エレメントインラインミキサー
を０ｃｍのところに位置づけた。

脂質/アミカシン流速が３００／５００ｍＬ／分のバッチ３は、合理的に高度なアミカ
シン回収率と合わせて、Ｌ／Ｄおよび粒径が最もよかった。したがって、今後の実験では
すべて、これらの流速を用いることとした。

選択された条件で、結果を再現するために、よく洗浄したバッチ（バッチ６）を表２に
示すように、ダイアフィルトレーションを用いて準備した。１０％ＮａＣｌ溶液を、注入
前にビーカーに添加し、（表１のバッチの１．５％と比較して）最終濃度を２％とした。
得られたＬ／Ｄ（１．７１）は、表１のバッチ３ほどよくなかったが、粒径は高かった。
これは、リポソーム作製の早期にリポソームと接触するＮａＣｌが高いことによる悪影響
かもしれない。ゲル濾過カラムを用いて分離した（洗浄した）サンプルは、ダイアフィル
トレーションによって洗浄したものに比べて、より良好なＬ／Ｄを持つ傾向にあった。こ
れは、異なる程度の応力でリポソーム、または単に、集団全体ではない良好なＬ／Ｄをも
つリポソームの画分を含有するゲル濾過カラム上に分離したサンプルを、処理しなければ
ならないかもしれない。

表２：よく洗浄したバッチのまとめ。プロセスパラメーターである、温度、アミカシン
保存濃度、その他（下の表３を参照されたい）を変化させた。すべてのバッチを、ほぼ最
大限に濃縮し、内圧を１０ＰＳＩとした。

３番目のカラムは、注入直前の脂質およびアミカシンの温度、および洗浄（ダイアフィ
ルトレーション）中の温度を表す。ＲＴ＝室温。「ＶＯＬサイズ」は、体積加重粒径であ
る。

表３：バッチ１〜１８のプロセス条件

＊脂質およびアミカシン溶液を、３００/５００ｍＬ／分の速度で３０秒間注入した（
実施例６乃至１０）、または３０秒間注入した（実施例１１乃至１８）。追加の水性液（
ＮａＣｌまたは水）を添加した（５００部のアミカシン体積に対する部）。

６．１．ｂ プロセス温度の影響
各種設定は、添加するＮａＣｌ溶液の量を少なくし、最終濃度を１．０％とした以外は
、バッチ３と同じとした。注入開始前に溶液を再び添加した。注入時間が短いと、注入中
に添加することが難しいからである。さらに、注入中に、インラインミキサーを流れの圧
力の下で混合チューブの端に移動させた。ミキサーの位置は、バッチ３では０ｃｍとして
いたが、ここではチューブの前端から５ｃｍのところとした。バッチ２０において同じ温
度条件（４０／４０℃）で得られたＬ／Ｄ比率が０．５５、すなわち、バッチ３のほぼ半
分であったことから、このことは重要かもしれない。異なる注入温度で、アミカシンカプ
セル化の比較を行ったところ、驚くべきことに、温度が低いほど、Ｌ／Ｄが良好であった
。試験した温度のうち、脂質／アミカシン温度３０／３０℃および５０／ＲＴのとき、類
似のＬ／Ｄ比率０．３２および０．３７が得られた。また、バッチ１〜５に見られるよう
に、より低いゲル濾過で洗浄したものは、おそらくバッチをダイアフィルトレーションで
洗浄した場合よりも低いであろう。

表４：アミカシンカプセル化に及ぼす温度の影響*

*：脂質およびアミカシン溶液は、３００／５００ｍＬ／分で１０秒間注入した。アミ
カシン保存溶液は５０ｍｇ／ｍＬとした。注入する前にＮａＣｌの１０％溶液を添加し、
最終濃度を１．０％とした。混合チューブ１０ｃｍ；６−エレメントインラインミキサー
を５ｃｍのところに位置づけた。

別個の実験において、それぞれ３０℃および３０℃または５０℃および２２℃いずれか
の９０％エタノールおよび水を混合したところ、類似の最終温度、約３６℃が得られた。
このことは、別個の成分よりむしろ最終的な混合物の温度がアミカシンのカプセル化にと
って重要であることを示唆するものである。実施例６〜１５においては、温度を５０℃/
ＲＴとした。２つの流れについて温度を３０℃/３０℃とした実施例１６〜１８において
は、、アミカシンカプセル化がやや低かったものの、同等の結果が得られた。

６．１．ｃ 注入後の水性体積の追加の影響
次にＮａＣｌ溶液添加および洗浄プロセスのステップに注目した。プロセスパラメータ
ーは、種々の方向において変化させた。流速３００／５００で注入ステップを行った直後
、混合物中のエタノール濃度は、３４％に達する。この濃度においては、アミカシンの安
定性は限定されていた（図９参照）。

５０ｍｇ／ｍＬのアミカシン保存溶液を用いて開始した場合、脂質溶液と混合後、アミ
カシン合計は、３０ｍｇ／ｍＬを超えるであろう。その場合、少なくとも半分（１５ｍｇ
／ｍＬ）は、遊離アミカシンであり、カプセル化効率は５０％であると推測される。これ
は、３４％エタノールの溶解性より高い。この問題に対する１つの可能な解決策は、脂質
／アミカシン混合物の入った容器により多くの水を添加し、エタノールおよびアミカシン
双方の濃度を下げることである。例えば、２００部の水（またはＮａＣｌ溶液）を、８０
０部の脂質／アミカシンに添加すると、エタノールは２７％まで減少するであろう（図９
）。これは、温度次第で、アミカシンを１５ｍｇ／ｍＬさらには、それ以上で溶解させる
ものである。

さらに、ＮａＣｌを添加させることによって、浸透圧条件を最適化してもよい。リポソ
ームを形成し、アミカシンを内部濃度２００〜３００ｍｇ／ｍＬでカプセル化した場合、
カプセル化されなかったのは、わずか〜１５ｍｇ／ｍＬほどのアミカシンだけである。食
塩の不存在下では、これは、浸透性の不均衡をもたらし、ひいては、アミカシンの漏れを
ひきおこすかもしれない。１５０部の１０％ＮａＣｌ乃至８００部の脂質／アミカシンを
添加した場合、最終濃度は、約１．５％ＮａＣｌとなるであろう（外部のリポソーム）。

ＮａＣｌ溶液（またはいくつかのバッチ中の水）を、注入ごとに異なる濃度で添加した
（表２および３から編集した表５を参照されたい）。いくつかのバッチを作製した。これ
らの表から、一般的な傾向が見て取れる。そこから以下のように結論付けた。

- Ｌ／Ｄを低くするには（短い混合チューブが必要である場合）、水性ボリュームの
注入と添加の間に、ある時間間隔が必要である。バッチ６〜１５では、２０秒以上の間隔
があれば、Ｌ/Ｄが低下した。１つの可能な説明は、流れの混合直後には、リポソームは
完全には作製されないということである。より長い混合時間を可能にする、長い混合チュ
ーブを用いた場合（バッチ１６〜１８）、時間間隔は必要でない。

- 高濃度のＮａＣｌ溶液を添加して、浸透圧を均衡化させることは、実際、アミカシ
ンを保留する助けとはならない。実際、純水を、適切な時間間隔で添加したところ、Ｌ/
Ｄとアミカシン濃度の合計は低かった。

- 注入後、１００部の１０％ＮａＣｌ（バッチ９）を５分間添加したところ、競合的
なＬ／Ｄ比率が得られたが、合計のアミカシン濃度は良好ではなかった。比較的エタノー
ル濃度が高い早期に存在するＮａＣｌは、凝集と粘性を増加させるかもしれない。

表５：エタノール濃度を調整するために脂質／アミカシン混合物に添加された水性体積
とＮａＣｌ濃度の役割。すべての変数を示しているわけではない。図２および３を参照さ
れたい。

６．１．ｄ 抗感染薬保存溶液の影響
これまで、５０ｍｇ／ｍＬのアミカシンの保存溶液を用いることで、最もよく閉じ込め
を行うことがわかっている。アミカシン保存濃度を４０ｍｇ／ｍＬまで下げると、従来の
プロセスにおいて用いられた場合、Ｌ／Ｄが上昇する。２つの流れのインライン注入プロ
セスによって、エタノール濃度が高いレベルに達することから、現在の５０ｍｇ／ｍＬア
ミカシンは、最適濃度ではないかもしれない。

表６は、種々のアミカシン保存濃度を用いることの影響をまとめたものである。４０ｍ
ｇ／ｍＬは、比較的に、または良好なＬ／Ｄ値を示し、さらにアミカシン回収率を向上さ
せた。一定量の脂質に対してアミカシンを少なくし、類似のＬ／Ｄがもたらされ、その結
果、カプセル化のパーセンテージがより高くなる（バッチ１２）。さらにアミカシン保存
濃度を３０ｍｇ／ｍＬまで下げたところ、回収率は依然著明であったが、Ｌ／Ｄはわずか
に上昇しただけであった（バッチ１３）。

表６：効率を高めながら、アミカシン保存濃度を減少させることができる。アミカシン
回収率は、得られたＬ／Ｄに基づいて計算される。脂質の回収率を１００％とする。

アミカシン保存濃度を減少させることには、別の意味がある。それは、注入後脂質／ア
ミカシン混合物における遊離アミカシン濃度を減少させ、より高いエタノール濃度で可溶
化することができる。脂質およびアミカシンを３００／５００比率で混合すると、アミカ
シン保存は、５０ｍｇ／ｍＬであり、カプセル化効率は３７％である。その後当初の遊離
アミカシンは、２０ｍｇ／ｍＬまでとなる。同様にカプセル化が５２％の４０ｍｇ／ｍＬ
アミカシン保存液では、遊離アミカシンは、１２ｍｇ／ｍＬまでとなる。カプセル化率が
４６％の３０ｍｇ／ｍＬアミカシン保存では、遊離アミカシンは、１０ｍｇ／ｍＬまでと
なる。

７．脂質対薬物の比率
抗感染薬（例えば、アミカシン、トブラマイシン、ゲンタマイシンなどのアミノ配糖体
）のリポソームへの閉じ込めを増加させるための方法がいくつかある。１つの方法は、脂
質の量あたりの閉じ込めの体積が大きい場合、より大きなリポソーム（＞１μｍ）とする
ことである。より小さなＬ／Ｄ比率を達成するためのこのアプローチは、リポソームの吸
引（噴霧）には適用できない。なぜなら、１）より大きなリポソーム（＞０．５μｍ）が
大きな放出をしようとした場合、噴霧中の剪断応力がリポソームをサイズ依存的に破裂さ
せる可能性があるからである。２）肺での良好な蓄積のために必要なより小さな液滴のサ
イズは、約３μｍまでである。だから、吸引の場合、放出しすぎることを避けるために、
リポソームサイズをできるだけ小さくすることが望ましい。現在、ここに開示しているリ
ポソームの平均粒径は、約０．４μｍ未満である（表４を参照されたい）。

Ｌ／Ｄ比率を小さくするための別のアプローチは、負に帯電した脂質を用いることであ
る。上に挙げたアミノ配糖体は、高度に正に帯電しており、化合物ごとに４〜５のアミン
を持つ。通常、これらのアミノ配糖体の表面の塩が治療薬に用いられる。多価陽イオン性
の特徴が、負に帯電したリポソームとの強い結合となる。この結果、リポソーム作製中の
閉じ込めが大きくなる。抗感染薬製剤の目的は、肺環境での持続的な放出である。リポソ
ームのマクロファージ取り込みによる急速なクリアランスは、これとは相容れない。負に
帯電したリポソームが、中性のリポソームよりマクロファージによる取り込みの程度が高
いことはこのことをよく説明するものである。いたがって、中性のリポソームを用いるこ
とが望ましい。

小さなリポソームへの薬物閉じ込めを高めることを可能とする１群の技術は、ｐＨ勾配
、硫酸アンモニウム勾配、または硫酸マグネシウム勾配を用いてアミン系薬物をリポソー
ムに装填するの勾配装填に基づく。米国特許第５，５７８，３２０号、第５，７３６，１
５５号、第５，８３７，２７９号、第５，９２２，３５０号（ｐＨ勾配）；第５，８３７
，２８２号、第５，７８５，９８７号（硫酸マグネシウム勾配）；および第５，３１６，
７７１号（硫酸アンモニウム勾配）を参照されたい。これらの技術は、膜貫通アミンにつ
いてのみ機能する（ドキソルビシンのように中立の形状が透過性である場合はモノアミン
）。勾配装填アミノ配糖体のような特定の抗感染薬では、それらが（大きすぎたり、負荷
が高すぎたりのため）不透過性であるため、機能しないであろう。

ここに記載の全てのプロセスは、大規模かつ無菌の製造に容易に適用することができる
。最終的なリポソームサイズは、脂質組成物、濃度、付加剤、およびプロセスパラメータ
ーを改善することによって調整することができる。

本発明のプロセスを用いる脂質対薬物の比率は、約４：１乃至約１：１である。別の実
施態様において脂質対薬物の比率は、約３：１乃至約１：１、約２：１乃至約１：１、約
１：１未満、約０．７５：１未満、または約０．５：１未満である。さらに、生成物を特
定期間、透析した後のフリーの抗感染薬のパーセンテージは減少している。

８．結果
８．１ 肺感染のバイオフィルム障壁
シュードモナス-アエルギノーザなどの感染の疾患の治療にとっての障害である、嚢胞
性線維症患者における慢性疾患の主な原因は、上皮細胞上の喀痰／バイオフィルム関門内
の薬物調製である（図１）。図１において、ドーナツ形は、リポソーム性抗感染薬製剤を
表している。「+」印は、遊離状態の抗感染薬を表し、「−」印は、ムチン、アルギン酸
塩およびＤＮＡを表し、太線は、シュードモナス・アエルギノーザを表している。この関
門は、アルギン酸塩に埋設した、コロニー化した、またはプランクトン様のシュードモナ
ス・アエルギノーザ、または、細菌からのエキソポリサッカライド、ならびに損傷した白
血球からのＤＮＡ、および肺上皮細胞からのムチンからなり、これらは全て正味で負に帯
電している（Costerton,
et al., 1999）。この負の電荷は、正に帯電した薬物、例えば、アミノ配糖体に結合し、
その通過を阻止し、それらが生物学的に影響力を持たないようにしている（Mendelman
et al., 1985）。抗感染薬をリポソーム性製剤または脂質製剤に閉じ込めることによって
、抗感染薬が、喀痰／バイオフィルムに非特異的な結合をするのを遮断したり、または部
分的に遮断したりすることができ、リポソーム性製剤または脂質製剤を（閉じ込めたアミ
ノ配糖体とともに）貫通するようにしている（図１）。

アミカシンは、細菌性酵素に対して高い耐性を示し、それによって、トブラマイシンやゲ
ンタマイシンを含むアミノ配糖体に認められるものより高いパーセンテージの感受性のあ
る臨床的分離菌を提供する（Price et al., 1976）。特に、Ｐ．アエルギノーザ分離菌は
、他のアミノ配糖体よりアミカシンに対してはるかに高い感受性を示しつつ、クロス耐性
を示さない（Damaso
et al., 1976）。

リポソーム性のアミカシン製剤の徐放およびデポー効果は、図２より明らかである。こ
の研究では、ラットにトブラマイシンを、気管内投与および静脈内投与によって投与した
。該ラットに、同じ用量（ラット１匹あたり４ｍｇ）のリポソーム性のアミカシン製剤を
、気管内投与した。データは、リポソーム性のアミカシン製剤を用いた場合のみ、徐放性
とデポー効果を達成することを示している。実際、投与の２４時間後、リポソーム性のア
ミカシン製剤のみ動物の肺において有意な濃度を示していた。一方、トブラマイシン製剤
は、無視しうるほどのレベルであり、主に、急速な合成吸収によるものと思われる。リポ
ソーム性抗感染薬製剤による、この１００倍を超えるアミノ配糖体の肺での増加は、現在
認可されているＴＯＢＩ（登録商標）製剤（トブラマイシン吸引溶液、Chiron Corporati
on製、Ameryville,CA）より有意に用いられることが少ない、抗感染薬の徐放性リポソー
ム製剤の考え方を支持するものである。

さらに、喀痰／バイオフィルムの存在によって、遊離状態のアミノ配糖体は、抗感染薬
がその表面と結合することにより、その貫通が阻害される（図１）。したがって、ＣＦ患
者において治療効果を発揮するようにするためには、肺組織のトブラマイシン／グラムを
１，０００ｇｍと、過剰に投与する必要がなる。リポソーム性のアミカシン製剤によって
克服される。したがって、リポソーム性のアミカシン製剤においては、遊離のトブラマイ
シンと比較して、より長い時間薬物の治療レベルが維持される。この結合と貫通の促進は
、さらにリポソーム性のアミカシン製剤が、通常in vivoで抗菌薬が最低阻害剤濃度以下
で存在する場合に発生することがわかっている細菌耐性を有意に減らす手段でもありうる
。

８．２ 薬物動態
遊離のトブラマイシンまたはリポソーム性のアミカシン製剤のいずれかを気管内（ＩＴ
）投与した後のラットにおいて、アミカシンの薬物動態を測定した。これらのデータを、
トブラマイシンを尾の静脈注射した後の肺で得られた分散と比較した。全てのケースにお
いて、ラット１匹あたり４ｍｇを投与した。図２から、注射と比較して、ＩＴによるとア
ミノ配糖体をはるかに多く送達可能であることがわかる。リポソーム性抗感染薬技術のデ
ポー効果はさらに、ＩＴもしくはＩＶで投与されたトブラマイシンと比較した場合、投与
の２４時間後に肺に残留するリポソーム性のアミカシン製剤は１００倍であることを示す
。したがって、薬物の肺での治療効果は、遊離のトブラマイシンと比較した場合、リポソ
ーム性のアミカシン製剤では長時間持続する。

ＣＦ患者におけるアミノ配糖体と喀痰との結合が問題である。特に、この結合が抗感染
薬の生物活性を減少させる場合に問題である（Hunt et al., 1995）。リポソーム性のア
ミカシン製剤が長時間生物活性を持続することができるかどうかを測定するために、正常
ラットに気管内吸引によってリポソーム性のアミカシン製剤を投与した。これは、気管支
肺胞洗浄法（ＢＡＬ）によって２または２４時間後に除去した後に引き続いて行い、生物
学的活性を測定した。サンプルを濾過（０．２ミクロン）により濃縮して、混在する肺の
微生物を除去した。アミカシン濃度を測定し、Mueller
Hintonブロス希釈アッセイ（シュードモナス・アエルギノーザ）を用いて、生物活性を測
定した。この結果を表７に示す。

表７：リポソーム性のアミカシン製剤が生物活性を長時間維持することを示す結果

上の表からわかるように、回収した濾過したリポソーム性のアミカシン製剤は、２４時
間後でさえ、ＭＩＣ４で、Mueller Hintonブロスアッセイにおいて、Ｐ．アエルギノーザ
を殺傷可能であった。２時間後、ＭＩＣ＝２が得られた。それは、濾過したリポソーム性
／複合体アミカシン保存のために取得したものと類似している。肺において、２４時間後
もリポソーム性のアミカシン製剤は依然として活性であった。２４時間後、同じ用量の遊
離のトブラマイシンは、ＢＡＬにおいて発見できなかった。このことは、肺においてリポ
ソーム性抗感染薬製剤が維持されているということを示すのみならず、時間をかけて喀痰
／バイオフィルムを自由に通過するということも示すものである。これらのデータと、図
２および表９（下に示す）に示された事実とを組み合わせて、肺において、抗感染薬の高
いレベルを維持しながら、リポソーム性のアミカシン製剤が時間をかけて遊離の抗感染薬
を放出することを示している。これは、この系が抗感染薬の持続性効果を長時間発揮する
という理論を裏付けるものである。この効果は、シュードモナス属の生物負荷および抗感
染薬のレベルを通して耐性を発達させることを減少させる上で重要である。

リポソーム性アミカシン製剤の放出を遅らせること、およびその抗感染薬の徐放効果が
in vitroで証明されているように、該製剤をＰＡＯＩムコイドシュードモナスを含有する
慢性の閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の患者からの喀痰中でインキュベートした。該リポソー
ム性のアミカシン製剤をさらに、ＰＡＯｌムコイドシュードモナス属を含有するアルギン
酸塩中でインキュベートした。両方のケースにおいて、表８に示すように、シュードモナ
ス属に対する時間をかけた、持続的かつ増強された殺傷が認められた。

表８：Invitroでのシュードモナス属の経時的殺傷

古典的な殺傷曲線は、リポソーム性抗感染薬製剤の技術には適用することができない。
なぜなら、リポソーム製剤は、抗感染薬効果を高めながら、抗感染薬の遅放を示すからで
ある。該リポソーム製剤は、喀痰および／またはアルギン酸塩からアミカシンを、それが
放出を行うまで保護する。時間内に、完全な殺傷が観察される。それは、抗感染薬の阻害
または不活性化をおこさない抗感染薬の徐放性効果モデルと一致する。

慢性肺感染症のモデルを用いて、リポソーム性アミカシン製剤の有効性を検討した（Ca
sh et al., 1979）。そこでは、アガロースビーズマトリックスに包埋したＰ．アエルギ
ノーザをラットの気管支に点滴注入した。ＣＦ患者におけるシュードモナス感染に類似し
た、ムコイドシュードモナス属の動物モデルを開発した。ＣＦと臨床的に相関を成すもの
としては、肺の病理学的状態の類似；免疫複合体障害；およびＰ．アエルギノーザ株によ
るムコイド表現型への変換（CantinとWoods、1999）がある。ラット肺を、ＣＦ患者分離
菌から採取した１０^７ＣＦＵのムコイドシュードモナス属（株ＰＡＯｌ）で感染させ、次
いで、（ａ）フリーのアミノ配糖体、（ｂ）非毒性対照としての脂質賦形剤のみ、および
（ｃ）リポソーム性アミカシン製剤を用いて試験した。さらに、まず製剤を、改良したKi
rby-Bauerプレート上でin vitroでＰ．アエルギノーザを殺傷する能力に基づいてスクリーニングした。

種々のリポソーム性アミカシン製剤を、異なる脂質組成物または製造パラメーターに基
づいて試験した。その結果、in vitro実験において異なる殺傷ゾーンが得られた。この実
験は、リポソーム性アミノ配糖体製剤によって得られた有効性が遊離のアミノ配糖体と比
較して上昇することを測定するようにデザインされている。ブランク対照脂質組成物、２
つの異なるリポソーム性アミカシン製剤、ならびに遊離アミカシンおよび遊離トブラマイ
シンを、同じアミノ配糖体濃度、リポソーム性抗感染薬製剤として、測定した。さらに、
１０倍高い投与量の遊離アミカシンおよび１０倍高い投与量の遊離トブラマイシンも投与
した。投与は、ＩＴで７日間毎日行った。結果（図３）は、２つの製剤（脂質組成物にお
いて異なる）中のリポソーム性アミカシンは、１０倍高い投与量での遊離アミカシンまた
は遊離トブラマイシンよりＣＦＵ濃度を有意に減少させた。図３において、Ｌｉｐ−Ａｎ
−１４は、ＤＰＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＣ／ＤＯＰＧ（４２：４５：４：９）および１０
ｍｇ／ｍＬアミカシンであり、Ｌｉｐ−Ａｎ−１５は、ＤＤＰＣ／Ｃｈｏｌ（１：１）（
同じく１０ｍｇ／ｍＬ）である。ＡＵ脂質−脂質および脂質−薬物比率は、ここでは重量
−重量で示している。

次の実験（図４）は、リポソーム性アミカシン製剤が、抗感染薬製剤を遅く、持続的に
放出することができることを証明するためにデザインされたものである。前述の実験では
、７日間毎日投与を行ったのに対して、本実験では１４日間毎日投与を行った。結果は、
２つの製剤（脂質組成物が異なる）中のリポソーム性アミカシンは、遊離アミカシンまた
は遊離トブラマイシンと比較して１０〜１００倍力価が高かった（より高いレベルでＣＦ
Ｕレベルを減少させた）。毎日のヒト用量は、６００ｍｇのＴＯＢＩ（登録商標）製剤（
トブラマイシン吸引溶液、Chiron Corporation製、Ameryville, CA）、または約３７５ｍ
ｇ／ｍ^２である。これは、ラット用量の９．４ｍｇに相当する。したがって、該データは
、１０〜１００倍増強させたヒトでの有効性に直接的に相関させることができる。２ログ
減少がこのモデルにおいて観察され得る最も良好なものであることに留意すべきである。
喀痰アッセイにおけるＰ．アエルギノーザにおいて１００倍減少が、改良された肺機能に
相当する（Ramseyet al., 1993）。リポソーム性アミカシン製剤のこの徐放によって、フリーのアミノ配糖体を用いた場合に比べて、低い用量および／または低い頻度の投与回数で、細菌の成長をよりよく抑えることができる。

慢性肺感染症のモデルを用いて、リポソーム性アミカシン製剤の有効性を研究した。そ
こでは、Ｐ．アエルギノーザを、Sprague/Dawleyラットの気管支に点滴注入したアガロー
スビーズマトリックスに包埋した。ラットを５匹ずつにグループ分けして、３日後、アミ
カシンまたはリポソーム性アミカシンを毎日（図３）または１日おき（図４）、１ｍｇ／
匹もしくは１０ｍｇ／匹の所与のアミノ配糖体または１ｍｇ／匹のリポソーム性アミカシ
ンを投与した。ならびに、対照としてブランクリポソーム（脂質賦形剤）を投与した。

実験開始１４日後から、均質化したラット肺（凍結）を分析して、アミノ配糖体含有率
および活性を調べた。ＴＤＸ機器を用いて臨床化学アッセイを行い、一方、バシラス・サ
チリスを包埋した寒天プレート上で阻害ゾーンを測定することによって、バイオアッセイ
を行った。その結果を表９に示す。

表９：Ｐ．アエルギノーザ感染ラット肺をリポソーム性アミカシン製剤で治療した結果

薬物の重量は、あらゆる塩形態が存在しない場合に正規化された薬物のものである。

表１０の結果は、アミノ配糖体が存在し、リポソーム性抗感染薬製剤に活性を持つが、
一方、フリーのアミノ配糖体では、たとえ用量が１０倍であっても、あまり検出できない
ことを示す。これらのさらなる結果は、リポソーム性抗感染薬製剤の標準的な放出特性を
示し、また残留する抗感染薬が未だに活性を有していることを示している。上記製剤の中
で、遊離トブラマイシン（０．１マイクログラム／ｍＬ）のみが、腎臓での検出可能なア
ミノ配糖体を示していた。

リポソーム性アミカシン製剤の徐放およびデポー効果を図５においてさらに証明する。
ラットを慢性肺感染症にする。そこでは、有効性の研究において用いられたものと同じビ
ーズを用いて、気管支に浸透させたＰ．アエルギノーザをアガロースビーズマトリックス
に包埋した。次いでそのラットに遊離トブラマイシンまたはリポソーム性アミカシン（製
剤Ｌｉｐ−Ａｎ−１４）を気管内投与によって、同じ投与量（ラットあたり２ｍｇ）投与
した。抗生物質（マイクログラム）／肺組織（グラム）を経時的に測定した該データから
、リポソーム性抗感染薬は徐放およびデポー効果を発揮するが、一方遊離トブラマイシン
では、２４時間後の肺においては無視しうるほどのレベルしかないことがわかる。これは
主に急速な系吸収によるものであると思われる。リポソーム性アミカシン製剤の、感染ラ
ット肺における抗感染薬のこの１００倍を超えるアミノ配糖体の肺での増加は、現在認可
されているＴＯＢＩ（登録商標）製剤（トブラマイシン吸引溶液、Chiron Corporation製
、Ameryville,CA）より有意に用いられることが少ない、抗感染薬の徐放性リポソーム製
剤の考え方を支持するものである。

遊離トブラマイシンまたはリポソーム性のアミカシン製剤のいずれかを気管内（ＩＴ）
投与した後のラットにおいてアミカシンの薬物動態を測定した。ラットあたり２ｍｇの用
量を投与した。リポソーム性抗感染薬技術のデポー効果は、遊離トブラマイシンをＩＴ投
与した場合に比べて、リポソーム性アミカシンの１００倍を超える薬物の増加が、投与の
２４時間後も依然として感染肺に残留していた。したがって、リポソーム製剤での薬物の
治療レベルは、遊離トブラマイシンと比べて、維持されていた。

図７は、著明な残留時間、および有効量の抗感染薬の肺での蓄積の結果を示すものであ
る。比較的頻度の少ない用量を確立する結果を用いることができる。各投与は、４時間、
１５ｍｇ／ｍＬアミカシンでリポソーム性アミカシン製剤噴霧剤（ＤＰＰＣ／Ｃｈｏｌ．
、１：１）の吸引（ラットを上記のように３匹ずつのグループに分けた）で行った。投与
は、１日目；１，３および５日目；または１、２、３、４、５日目に行った。データバー
のそれぞれの投与後、所与のデータバーを示したラットを屠殺した。実施例に示したよう
に製剤を行った。

類似の抗感染薬を用いることができる。肺の炭疽病や野兎病のような細胞内感染の治療に
用いることができる。肺の炭疽病において、該炭疽病の胞子は、エーロゾル剤の気胞に達
する。吸入された胞子は、気胞中の肺のマクロファージによって注入され、気管支の気管
領域のリンパ節または縦隔のリンパ節に、リンパ管を介して運ばれる（Pile et al., 199
8; Gleiser etal., 1968）。該マクロファージは、感染経路の中心に存在し、全身性の
（吸引）炭疽病におけるホストの自己破壊の主な原因となっている。徐放および標的化と
いうそれがもつ属性に加えて、リポソーム性抗感染薬製剤技術は、薬物標的化と送達にお
いて細胞の取り込みを高め、肺胞マクロファージと肺上皮細胞を用いることができる。こ
れらの特徴を持つことは、これらの、肺でおこり、マクロファージによって輸送される細
胞内感染を促進する。より重要なことは、これらの特徴は、抗感染薬をより有効なものと
するはずであるということである。リポソーム性抗感染薬が、疾患を含有するまさにその
細胞によって食作用を受けるはずである。該抗感染薬は、標的化されて細胞内に放出され
、それによって、散剤する前に感染を攻撃することができるであろう。カプセル化された
薬物は、既に認可されている製剤シプロフロキサシン、テトラサイクリン、エリスロマイ
シン（原語：erthyromycin）またはアミカシンであってよい。リポソーム性シプロフロキ
サシン製剤が開発された。

この研究においては、この化合物をマウスに投与し、遊離のシプロフロキサシンを気管
内投与したものと、遊離のシプロフロキサシンを経口投与したものを比較した。３つの場
合すべてで、同じ用量を投与した（図６）。マウスを３群に分け、各マウスの用量を１５
ｍｇ／ｋｇとした。リポソーム性シプロフロキサシンは、ＤＰＰＣ／コレステロール（９
：１）、３ｍｇ／ｍＬのシプロフロキサシンで、実施例に示したようにして作製された製
剤として存在している。脂質対薬物の比率は、重量比で１２．５：１とした。経口投与の
シプロフロキサシンと比較した場合、リポソーム性シプロフロキサシンは、遊離のシプロ
フロキサシンより２オーダーの大きさ以上の量で肺に存在していた。さらに、リポソーム
性シプロフロキサシンのみが、２４時間後の肺において濃度を示した。一方、経口投与薬
物は、２時間未満で検出できなくなった。このデータは、リポソーム性シプロフロキサシ
ン製剤や、アミノ配糖体、テトラサイクリンおよびマクロライドなどの他の抗感染薬を、
バイオテロリストによる細胞内疾患の治療および予防的阻止での使用を支持するものであ
る。

８．３ リポソームパラメーター
適用する脂質をエタノールに溶解し、脂質−エタノール溶液を作製する。該脂質−エタ
ノール溶液を、閉じ込められた生物活性物質の分子を含有する水溶性またはエタノール性
溶液中に注入する。該脂質は、自発的に小胞を形成する。

表１０は、リポソーム性抗感染薬製剤パラメーターを開示している。

表１０：追加的リポソーム性抗感染薬製剤のパラメーター

＊：ＤＰＰＣ／コレステロールのモル比率が約１：１である、ＤＰＰＣ／コレステロー
ルリポソーム
＊＊：Ｌ/Ｄの計算においては、閉じ込められたアミカシンの量のみを考慮した。

リポソーム性抗感染薬製剤の作製に関するさらなる情報については、ＰＣＴ国際公開公
報第ＰＣＴ／ＵＳ０３／０６８４７号（２００３年３月５日出願）を参照されたい。その
全てを引用によって明細書中に援用する。

閉じ込め量は、リポソーム製剤の基本的な特徴であり、脂質の単位あたりのリポソーム
内水性相として測定される。それは通常、μリットル／μモルの単位で表される。リポソ
ームが形成されるとき、リポソーム内の溶質の濃度は、大量の溶液の外部と等しい。閉じ
込められた体積が大きいと、薬物／脂質比率、すなわち、最終的な製剤における全体の薬
物濃度が高くなる。

しかしながら、リポソーム性アミカシンの製剤においては、製剤することができる実際
の薬物/脂質比率は、閉じ込められた体積に基づいて予測したものより３倍以上高い。表
１１は、抗感染脂質製剤の４つの異なるサンプル製剤の結果を示している（例えば、実施
例のセクションの実施例２）。

表１１：異なる方法で調製されたリポソームへのアミカシンの装填

サンプル１および２は、本明細書に記載のエタノール注入によって作製した。サンプル
３および４は、当業で公知のリポソーム製剤技術によって作製した。

ＴＤｘアナライザー上に設定されたINNOFLUO
Seradyn 試薬を用いた免疫蛍光アッセイによって、アミカシンの濃度を測定した。Ｃ−８
カラムと光散乱デテクターを用いた逆相ＨＰＬＣによって脂質を測定した。

サンプル＃１〜３におけるリポソームの体積（合計体積の単位あたりのリポソームが占
める体積の割合）を、合計体積中、およびCentriSart濾過装置で遠心分離して得た濾過物
の体積中の、蛍光プローブ（スルホロダミン１０１またはカルボキシフルオレセイン）の
濃度を測定することによって測定した。濾過物中のプローブ濃度は、リポソームが占める
体積からのプローブの押し出しにより、平均より高かった。

サンプル＃４においては、リポソームの体積は、固定量を添加した後にサンプル中のカリ
ウムイオンを測定することによって測定した。１０ｍＬリポソーム懸濁液（Ｖ_０）中に２
５０μｌのＫＣｌ（Ｖ_ａｄｄ）を入れる。その後、サンプルを４０００ｒｐｍで３０分遠
心分離し、上清を取り出し、カリウムイオン（Ｋ）をCole-Parmer カリウム感受性電極に
よって測定した。測定したカリウム濃度は、リポソームが占める体積からのプローブの押
し出しにより、予想していたよりも通常高かった。対照においては、等しい用量のＫＣｌ
を、１０ｍＬの食塩水に添加した。対照におけるカリウム濃度Ｋｃを測定した。水溶性体
積およびリポソーム性体積は、以下の式により推定される。

リポソームの体積と脂質の濃度を知ることによって、下記数式２で表される、閉じ込め
られた体積を測定することができる。

但し、式中、Ｌ_ｗおよびＬ_ｍは、重量および脂質のモル濃度をそれぞれ表す。脂質密度
は、１ｍｇ/ｍＬに近似していると仮定される。

その結果、サンプルが持つであろう予測される脂質/薬物比率は、薬物がリポソーム内
部および外部の水性のスペース理想的に分散されているとすれば、下記数式３によって推
定することができる。

但し、式中、Ｄ_ｏは、リポソーム作製中の製薬物のバルク濃度を表し、Ｍ_Ｌは、脂質の
平均のモル重量を表す。

サンプル＃１および＃２（１．８および１．９）の実際のＬ/Ｄは、アミカシン（５．
６および６．０）がさらに分散している場合から予測されるものよりかなり低い。一方、
例えば、サンプル＃３および＃４のＬ/Ｄは、理論値に近い。

ゲンタマイシンサルフェートが抗感染薬である抗感染脂質製剤の２つのサンプル製剤で
同様の比較を行った（実施例のセクションの実施例３を参照）。表１２のデータは、本明
細書に示されたデータによれば、当該方法がゲンタマイシンの予期せぬ高い閉じ込めを提
供することを示している。サンプル＃５および＃６において、実際の脂質／薬物比率は、
予測される理論値のほぼ２倍である。

表１２：異なる方法で調製されたリポソームへのゲンタマイシンの装填

８．４ Ｐ．アエルギノーザ感染により媒介される薬物放出
感染の近隣での活性形態の薬物の放出は、本発明のリポソーム性の薬物の活性の局面に
おいて重要である。そのような標的化された放出の可能性は、ＣＦ患者からの喀痰ととも
にインキュベートしたときの薬物の放出、Ｐ．アエルギノーザとともにプレインキュベー
トしたときのラット肺での薬物の放出、ならびにＰ．アエルギノーザの培養に対する活性
をモニターすることによって、試験した。

Ｐ．アエルギノーザの培養物を本発明のリポソーム性アミカシン製剤とともに直接的に
インキュベートすることによるアミカシンの放出は、先に述べた。この現象をさらに調べ
るために、リポソーム性アミカシン製剤を、Ｐ．アエルギノーザ感染した嚢胞性線維症患
者からの喀痰試料とともにインキュベートした。吐き出された痰をウシDNase Iおよびア
ルギン酸塩リアーゼを用いて、３７℃で２時間液状化した。リポソーム性アミカシン製剤
または可溶性アミカシン（１ｍｇ／ｍＬのアミカシン）を、液状化した痰または対照と、
１：１で混合し、穏やかに振りながら、３７℃でインキュベートした。アリコートを分析
して、AbbottTDx Analyzerを用いてアミカシン濃度を調べた。インタクトのリポソームを、界面活性剤である１％TritonX-IOOを用いて、サンプルごとの分離したアリコート中で溶解させた。各サンプルからの上清を用いて分析した。こうした条件のもとでは、４８時間かけて（８０〜９０％の）アミカシンが脂質組成物から時間依存的に放出された。このことは、薬物放出が、ＣＦ肺の感染部位において起こることかもしれないことを示すものである。

リポソームからの遊離の薬物のin vivoでの放出を、Ｐ．アエルギノーザ（ラット１匹
あたり３．５×１０^４ＣＦＵ）を含有する寒天ビーズを用いて浸透させたラットのものと
、そうでないものとで比較した。ビーズ浸透の３日後、ラットに本発明のリポソーム性ア
ミカシン製剤（１日用量、約６ｍｇ／ｋｇ）を毎日吸引させた（非細菌群）。または１４
日間、１日おきに吸引させた（ビーズ浸透群）。最終治療の２４時間後、合計アミカシン
および遊離アミカシンを上記のようにして測定した。細菌を投与されたラットにおいては
、検出されたアミカシンの平均約５０〜７０％は、フリーの形態であった。すなわち、リ
ポソームから放出されていた。細菌を投与されていないラットにおいては、検出された薬
物の２０〜２５％が遊離形態であった。これらのデータは、リポソームからの遊離アミカ
シンの放出がinvivoでのＰ．アエルギノーザの存在によって媒介されるかもしれないことを強く示唆するものである。

遊離形態の構成物質が数時間のタイムスケールで取り除かれることが既に証明されてい
る、肺での薬物動態に類似した条件下で、放出および活性のin vitroでの試験を行った。
遊離アミカシンまたはリポソーム性アミカシン製剤を、０．５ｍＬの無菌Slide-A-Lyzer
カートリッジ中Ｐ．アエルギノーザＰＡ０１（〜１０^８／ｍＬ）を用いて、薬物の濃度を
変化させながら、インキュベートした。フリーの薬物は、こうした条件下で数時間のタイ
ムスケールでカートリッジを透析する。２４時間後、該サンプルをカートリッジから取り
除き、播種し、ＣＦＵを測定した。予備実験においては、遊離アミカシンのみが、これら
のサンプルのＣＦＵをわずかに減少させた。一方、同じアミカシン濃度（５０μｇ／ｍＬ
）で脂質組成物を含むアミカシンでは、ＣＦＵの２対数減少が観察された。これらのデー
タから、アミカシンは実際には、細菌の存在下で放出されること、そして、その徐放によ
って薬物をより効果的に使用することができることを示唆している。

本発明のリポソーム性アミカシン製剤とＰ．アエルギノーザまたはその毒性ファクター
との相互作用によって、感染部位に向かって放出することが可能なアミカシンが放出され
る。アミカシンが放出されるとき、それはＰ．アエルギノーザに対して活性を示し、細菌
の近くでの徐放は、非特異的な分散および急速なクリアランスに対して利点を持つかもし
れない。

８．５． 吸入されたリポソーム性薬物製剤が肺胞マクロファージの機能に及ぼす影響
ある実施態様においては、本発明のリポソーム性アミカシン製剤は、嚢胞性線維症患者
の慢性Ｐ．アエルギノーザ感染を治療するために製剤されたナノスケール（２００〜３０
０ｎｍ）のリポソームカプセル化形態のアミカシンである。吸引に際しては、肺でアミカ
シンが持続的に放出されることが好ましい。なぜなら、肺胞マクロファージは、このサイ
ズ範囲で積極的に粒子を取り込むことが知られており、リポソーム製剤がこれらの細胞に
及ぼす影響は、特に興味深い。洗浄法によって取得したラット肺胞マクロファージの基本
的かつ刺激的な機能を、リポソーム性アミカシン製剤を投与して、および投与せずに研究
し、種々の対照と比較した。

リポソーム性アミカシン製剤、アミカシン、プラセボリポソームおよび食塩水のエアロ
ゾールを、PARILC Star 噴霧器を用いて生成し、ＣＤ（登録商標）ＩＧＳ雌ラットに鼻
のみの吸引チャンバーで吸引させた。吸引治療を４時間ずつ１４日間連続して行った結果
、合計脂質の１日の肺の投与量は、リポソーム性アミカシン群で約１２ｍｇ／ｋｇ、プラ
セボリポソーム群で１１ｍｇ／ｋｇであった。１５日目に半数のラットを安楽死させた。
残りのラットは、４３日目に安楽死させた。各ラットから気管支の肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ
）を回収し、続く窒素酸化物（硝酸塩の合計によって表す）および腫瘍壊死因子アルファ
（ＴＮＦ−α）のアッセイを行うために−８０℃で保存した。ＢＡＬＦからの細胞を遠心
分離によって回収し、計測し、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）を用いて、または用いて
ないで２４時間培養した。これらの培養物からの上清を遠心分離によって回収し、窒素酸
化物およびＴＮＦ−αがあるかどうか調べた。オプソニン化した蛍光ミクロスフェａ（０
．２μｍ、２（１０^９）／ｍＬ）の一晩の取り込みを測定することによって、ＢＡＬマク
ロファージ（（１０^６）／ｍＬ）の食細胞を調べた。

リポソーム性アミカシン製剤、空のリポソーム、可溶性アミカシン、または食塩水の１
４日間連続の吸引では、対照とは有意に異なる、ＢＡＬＦ中の窒素酸化物（硝酸塩）およ
びＴＮＦ−αの濃度によって示されているように、ラット肺において有意な急性もしくは
遅延性炎症反応は起こらなかったが、吸入剤を投与された全ての群において早期に高いＮ
Ｏレベルに向かう傾向があった。細胞の合計回収率は、吸入剤を投与された全ての群のよ
り多くの多形核白血球へ向かう早期の傾向を持つ全ての群で有意差が認められた。ラット
肺胞マクロファージは、上記試験粒子のエアロゾールに曝露後、リポソームを吸引した群
では、１５日目に拡大したように見えたことにもかかわらず、正常の機能を果たした。研
究の１５日目もしくは４３日目に培地で肺胞マクロファージ培養して、検出された硝酸塩
およびＴＮＦ−αの濃度は、対照とは有意に異なっていた。ＬＰＳで刺激したとき、マク
ロファージは正常に反応し、窒素酸化物（２０−４０ｎｍｏｌ／１０^６細胞）およびＴＮ
Ｆ−α（５−２０ｎｇ／１０^６細胞）の実質的な濃度を生じさせた。未処置の対照と比較
して傾向ビーズの同一の取り込みからわかるように、これらのマクロファージはさらに、
正常の食細胞機能を果たした。

リポソーム性アミカシン製剤の１４日間連続の吸引では、オプソニン化されたビーズの
食作用に関しては、肺胞マクロファージの機能、炎症性媒介物質であるＴＮＦおよびＮＯ
に実質的な影響を及ぼさなかった。

９．投与量
本発明の組成物の投与量は、患者の徴候、年齢および体重、治療もしくは予防すべき障
害の性質および重篤度、投与経路、ならびに対象組成物の形態によって変わる。対象とな
る製剤は全て、単回投与でもよいし、分けて投与してもよい。本発明の組成物の投与は、
当業で公知の技術または本明細書において教示している技術によって容易に決定すればよ
い。

いくつかの実施態様において、対象となる化合物の投与量は、一般的に、体重１ｋｇあ
たり約０．０１ｎｇ乃至約１０ｇの範囲、特に、体重１ｋｇあたり約１ｎｇ乃至約０．１
ｇの範囲、さらに特に、体重１ｋｇあたり約１００ｎｇ乃至約５０ｍｇの範囲である。

有効な投与量または量、および製剤の投与のタイミングにおよぼす可能なあらゆる影響
を、本発明の特定の組成物について確認しておく必要がある。これは本明細書に記載の、
１群以上の動物（好ましくは、各群少なくとも５例）を用いたルーチンの実験、または適
切であればヒトの治験によって成されうる。対象となる全ての組成物および治療もしくは
予防方法の有効性は、組成物を投与し、１以上の適用可能なインデックスを測定し、これ
らのインデックスの治療後の値と治療前の同じインデックスを比較することによって、投
与の効果を評価すればよい。

所与の患者における最も効果的な治療をもたらす特定の組成物の正確な投与時間および
量は、対象となる組成物の活性、薬物動態およびバイオアベイラビリティー、患者の生理
的状態（年齢、性別、疾患の種類および病期、一般的な身体状態、所与の投与に対する応
答性、治療の種類を含む）、投与経路などに依存するであろう。本明細書に提示したガイ
ドラインを用いて治療を最適化すればよい。例えば、最適投与時間および／または投与量
の決定をすればよい。それに必要なことは、被験者をモニターし、投与量および／または
タイミングを調整するだけのルーチンの実験に過ぎない。

被験者を治療しながら、治療期間の特定の時間に１以上の関連するインデックスを測定
することによって、該患者の健康状態をモニターすることができる。組成物、量、投与時
間および製剤を含めた治療は、そのようなモニターによって最適化することができる。該
患者を、周期的に再検査し、同じパラメーターを測定することによって改善の程度を決定
してもよい。対象となる組成物の量、そしておそらく投与時間の調整は、これらの再検査
に基づいて行えばよい。

治療は、該化合物の最適投与量未満の少量の投与量から始めるとよい。その後、最適な
治療効果が得られるまで、少しずつ投与量を増やすとよい。

異なる作用物質の効果の開始および持続性が補い合う（原語：complimentary）ため、
対象組成物を使用することによって、組成物（例えば、抗感染薬）中に含有される個別の
作用物質はいずれも、その必要投与量を減少させることができる。

対象組成物の毒性および有効性は、細胞培養もしくは実験動物において、標準的な薬学
的処置によって決定すればよい（例えば、ＬＤ５０およびＥＤ５０の測定）。

細胞培養アッセイおよび動物実験から得たデータを用いて、ヒトでの使用に関する投与
範囲を公式化できる。対象組成物の全ては、毒性が殆どないＥＤ５０をもつ循環濃度内に
あることが好ましい。該投与量は、採用される投与形態および用いられる投与経路に基づ
いて、この範囲内で変わるであろう。本発明の組成物にとっての治療的有効投与量は、細
胞培養アッセイにおいてまず推定すればよい。

１０．製剤
本発明の抗感染脂質製剤は、リポソームの水性分散液を含んでもよい。該製剤は、脂質
添加剤を含有し、リポソームおよび塩／緩衝剤を形成して、適切な浸透圧およびｐＨを提
供することもできる。該製剤は、薬学的添加剤を含んでもよい。薬学的添加剤は、いずれ
かの対象の組成物またはその成分の、ある器官または身体部分から別の器官または身体部
分への運搬または輸送に関与する、流体、希釈液、溶媒、またはカプセル化剤であること
ができる。各添加剤は、対象組成物およびその成分と相溶性があるという意味において、
「許容可能」でなければならず、患者にとって有害であってはならない。好適な添加剤と
しては、トレハロース、ラフィノース、マンニトール、スクロース、ロイシン、トリロイ
シン、および塩化カルシウムがある。他の好適な添加剤の例には：（１）乳糖、ブドウ糖
およびショ糖などの糖類；（２）コーンスターチおよびいもでんぷんなどのでんぷん；（
３）セルロースおよび、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロー
スおよび酢酸セルロースなどのその誘導体；（４）粉末トラガカント；（５）麦芽；（６
）ゼラチン；（７）タルク；（８）ココアバターおよび座薬用ろうなどの添加物；（９）
ピーナッツ油、綿実油、紅花油、ごま油、オリーブ油、コーン油および大豆油などの油類
；（１０）プロピレングリコールなどのグリコール；（１１）グリセリン、ソルビトール
、マンニトールおよびポリエチレングリコールなどのポリオール；（１２）オレイン酸エ
チルおよびラウリル酸エチルなどのエステル；（１３）寒天；（１４）水酸化マグネシウ
ムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；（１５）アルギン酸；（１６）無発熱源水；
（１７）等張生理食塩水；（１８）リンガー液；（１９）エチルアルコール；（２０）リ
ン酸緩衝液；および（２１）薬剤処方に用いられる他の無毒性の適合性物質、がある。

以下は、１５０ｍＬのリポソーム製／複合アミカシンの製造についての詳細な説明で
ある。
当初の合計体積＝１．５Ｌ
エタノール成分＝２３．５％（ｖ／ｖ）
脂質組成物：ＤＰＰＣ／Ｃｈｏｌ（１：１モル比）
当初［脂質］＝７．６ｍｇ／ｍＬ
当初［アミカシンスルフェート］＝５７．３ｍｇ／ｍＬ
最終生成物体積＝１５０ｍＬ

Ｉ）化合および注入
７．４７ｇのＤＰＰＣおよび３．９３ｇのコレステロールを、５０Ｃ水浴中３５２．５
ｍＬのエタノールに直接溶解した。８５．９５ｇのアミカシンスルフェートを１１４７．
５ｍＬのＰＢＳ緩衝剤中に直接溶解した。次いで該溶液を、ＩＯＮ
ＮａＯＨまたはＫＯＨを用いて滴定し、ｐＨを約６．８とした。

３５２．５ｍＬのエタノール／脂質を、１１４７．５ｍＬのアミカシン／緩衝剤に添加
または注入し、当初体積の合計を１．５Ｌとした。該エタノール／脂質を＠−３０ｍＵｍ
ｉｎ（注入率ともいう）でアミカシン／緩衝剤中に、ぜん動ポンプを用いてポンピングし
、それを攪拌プレート上の反応容器中で１５０ＲＰＭで、室温で高速撹拌した。

生成物を室温で２０〜３０分間撹拌した。

ＩＩ）ダイアフィルトレーションまたは「洗浄」ステップ
混合容器をぜん動ポンプおよびダイアフィルトレーションカートリッジに引っ掛けた。
該ダイアフィルトレーションカートリッジは、分子量の遮断が５００キロダルトンの中空
膜ファイバーである。該生成物を反応容器からダイアフィルトレーションカートリッジを
介してポンピングし、室温で混合容器に戻した。カートリッジを介して約７ｐｓｉの逆圧
が生じる。リポソーム性のアミカシン（生成物）を残しながら、遊離アミカシンおよびエ
タノールを、逆圧によって中空ファイバー膜に通した。該生成物を室温で８回洗浄した。
浸透除去を補填し、一定の生成物の体積を維持するために、新鮮なＰＢＳ緩衝剤を（別の
ぜん動ポンプを介して）反応容器に添加した。該生成物を濃縮した。

リポソーム性のアミカシンの高い捕捉。以下の手順に従って、脂質と抗感染薬の濃度を
様々に変えて、抗感染脂質製剤の４つのサンプルを準備した。

サンプル＃１。アミカシンスルフェート１．７２ｋｇを２３リットルの食塩水溶液に溶
解し（０．９％ＮａＣｌ）、必要量のＮａＯＨを加えてｐＨを６．５に調整した。脂質−
９８．２ｇのＤＰＰＣおよび５１．８ｇのコレステロールを７リットルのエタノールに溶
解した。脂質溶液をアミカシン溶液に注入し（〜６００ｍＬ／分）、一定に撹拌しながら
リポソームを形成した。次いで得られた懸濁液を洗浄して、エタノールおよび捕捉されて
いないアミカシンを、Amersham Hollow Fiber カートリッジ（ポアサイズ＝５００ｋＤ）
を用いたダイアフィルトレーションによって除去した。該懸濁液を最終体積が〜３．５Ｌ
となるように濃縮した。

サンプル＃２。全ての物質の量を１００分の１として、サンプル１と同様の処置を行っ
た。アミカシンスルフェート１７．２ｇを２３０ミリリットルの食塩水溶液に溶解し（０
．９％ＮａＣｌ）、必要量のＮａＯＨを加えてｐＨを６．６に調整した。脂質−０．９８
２ｇのＤＰＰＣおよび０．５１８ｇのコレステロールを７０ミリリットルのエタノールに
溶解した。脂質溶液を〜３００ｍＬ／分の速度でアミカシン溶液に注入し、一定に撹拌し
ながらリポソームを形成した。次いで得られた懸濁液を洗浄して、エタノールおよび捕捉
されていないアミカシンを、Amersham Hollow Fiber カートリッジを用いたダイアフィル
トレーションによって除去した。該懸濁液を最終体積が〜３５ｍＬとなるように濃縮した
。

サンプル＃３。ＳＰＬＶとして知られている処置によってリポソームを形成した。アミ
カシンスルフェート１．４ｇを２０ｍＬの食塩水溶液に溶解し（０．９％ＮａＣｌ）、ｐ
Ｈを３．３とした。脂質−０．６６６ｇのＤＰＰＣおよび０．３３３ｇのコレステロール
を４０ｍＬのジクロロメタンに溶解した。アミカシンおよび脂質の溶液を５００ｍＬの丸
底フラスコ内で混合し、手短に超音波処理し、エマルションを形成した。次いで、フラス
コをBUCHIRotavaporシステムに結合し、低真空下（−５インチＨｇ）で、５０℃でジク
ロロメタンを除去し、アミカシン−脂質混合物がゲル状になるまで一定に回転させた。該
ゲルが徐々に崩壊すると、真空度が−２０インチＨｇまで徐々に上昇した。３０分より長
い間乾燥を続けた。得られたリポソーム性の懸濁液の最終体積は２２ｍＬとなった。

サンプル＃４。サンプル＃３と同様の処置を行った。アミカシンスルフェート１．３ｇ
を２０ミリリットルの食塩水溶液に溶解し、ＮａＯＨを加えてｐＨを６．５に調整した。
脂質、０．５８３ｇのＤＰＰＣおよび０．２９１ｇのコレステロールを３５ミリリットル
のジクロロメタンに溶解した。超音波処理は行わなかった。Rotavaporシステム上での除
去ステップは、４０℃で２時間行った。最終体積は２０ｍＬであった。

リポソーム性のゲンタマイシンの高捕捉率
サンプル＃５。ゲンタマイシンスルフェート２０．０ｇを２３０ｍＬの食塩水溶液に溶
解し（０．９％ＮａＣｌ）、必要量の硫酸を加えてｐＨを６．５に調整した。脂質−０．
９８２ｇのＤＰＰＣおよび０．５１８ｇのコレステロールを７０ｍＬのエタノールに溶解
した。脂質溶液をゲンタマイシン溶液に注入し（〜５００ｍＬ／分）、一定に撹拌しなが
らリポソームを形成した。捕捉されていないアミカシンおよびエタノールを、Amersham H
ollow Fiber カートリッジを用いたダイアフィルトレーションによって除去した。該懸濁
液を最終体積が〜３５ｍＬとなるように濃縮した。

サンプル＃６。ゲンタマイシンスルフェート１７．０ｇを、２３０ｍＬのＮａ_２ＳＯ_４
の１００ｍＭ溶液中に溶解し、必要量のＨ_２ＳＯ_４を加えてｐＨを６．５に調整したこと
、ならびに脂質−０．９８２ｇのＤＰＰＣおよび０．５１８ｇのコレステロールを７５ｍ
Ｌのエタノールに溶解したこと以外はサンプル＃５の処置と同様の処置を行った。

他の塩形態のアミカシンの捕捉
サンプル＃７。実施例２のサンプル＃２と同様の処置を行った。アミカシン塩基１０．
７ｇおよびクエン酸４．２ｇを２３０ｍＬの食塩水溶液に溶解し（０．９％ＮａＣｌ）、
得られたアミカシン−クエン酸塩溶液のｐＨを６．２に調整した。脂質−０．９８２ｇの
ＤＰＰＣおよび０．５１８ｇのコレステロールを７０ミリリットルのエタノールに溶解し
た。脂質溶液を〜５００ｍｌ／分の速度でアミカシン溶液に注入し、一定に撹拌しながら
リポソームを形成した。捕捉されていないアミカシンおよびエタノールをAmersham Hollo
w Fiber カートリッジを用いたダイアフィルトレーションによって除去した。該懸濁液を
最終体積が〜３５ｍＬとなるように濃縮した。

実際の脂質／薬物比率は、サンプル＃２と同様にしたところ、ここでも予測より低かっ
た（薬物捕捉が予測より高かった）。サンプル＃７の捕捉された体積がわずか１．５であ
ったこと（尚、サンプル＃２は２．５であった）を考慮すると、予測された／実際のＬ／
Ｄ比率は、５．２と高かった。したがって、アミカシンスルフェートのようなリポソーム
性のアミカシンクエン酸塩も高い捕捉率で製剤することができる。

表１３：サンプル５〜７のパラメーターのまとめ

ラットにおける、吸入されたリポソーム性アミカシン製剤のアミカシンのバイオアベ
イラビリティー ラットで吸引後のリポソームからのアミカシンの放出速度を測定し、吸入された可溶性アミカシンと比較した。

試験品を鼻専用吸引チャンバーに取り付けられたPari LC Star噴霧器を介して噴霧状に
した。ＣＤ（登録商標）ＩＧＳラットに、肺に蓄積されると推定される用量の、６ｍｇ／
ｋｇのリポソーム製剤の形態のアミカシン、または５ｍｇ／ｋｇの可溶性アミカシンを単
回投与または１４日間連続投与で投与した。肺または他の組織を、ポリトロン装置を用い
てホモジナイズした。単回投与治療後、複数回投与の１日目および２８日目の、異なる時
点で肺ホモジネートを分析することによって、肺からのアミカシンのクリアランスのカイ
ネティクスを調べた。リポソームからアミカシンを放出する１％Triton
X-IOOの存在下または不存在下で、アミカシンレベルをAbbottTDx（登録商標）アナライ
ザー上で蛍光抗体法の偏光によって測定した。超音波処理を行う前に全肺サンプルをリポ
ソームでスパイクし、これらの条件下でのアミカシンの放出を調べた。遊離アミカシンお
よび合計アミカシンを１％TritonX-IOOを用いて、および用いずに測定し、薬物の漏出を調べた。

全肺サンプルにスパイクしたリポソーム性のアミカシンは、界面活性剤の不存在下では
Polytronホモジナイザーを用いた組織超音波処理の結果としての有意なアミカシンの放出
を示さなかった。 しかしながら、ｌ％のTriton
X-100を添加することで、全ての期待された薬物が回収された。したがって、アミカシン
（および界面活性剤）の合計レベルと、肺組織において自由に入手可能なレベルとを直接
的に比較することができるであろう。

６ｍｇ／ｋｇのリポソーム性アミカシンの単回投与直後に、高い合計濃度のアミカシン
（肺組織の約５００〜６００μｇ／ｇ）が認められた。それは、７日以上かけてゆっくり
と約５０％低下した。これらのリポソームからの遊離アミカシンの放出の時間的プロファ
イルは、おそらく噴霧化の結果遊離したアミカシンからの遊離薬物の高い当初濃度を示し
た。この段階の後、約２４時間で最下点を示し、その後上昇し、投与後９６時間で２７９
μｇ／ｇの最高点に達した。７日間の実験が終わるまでに、肺に残留する薬物の実質的な
部分が遊離形態となった（約５０〜７０％）。吸引によって投与された可溶性薬物の少量
部分も肺に長く残留するようであった。しかしながら、可溶性形態で投与されたアミカシ
ンの大半は、数時間でなくなり、７日後の見かけ上の遊離アミカシンＡＵＣは、投与され
た可溶性アミカシンを処理したものより、動物のリポソーム性アミカシンの方が、少なく
とも２倍以上高かった。この振る舞いのいくつかの局面は、クリアランスとリポソームか
らの徐放について、適切な速度定数を用いて、定性的にモデル化することができる。

連続１４日間の投与後（最終投与の２４時間後）、リポソーム性アミカシンを投与され
たラット肺における合計アミカシンの２０％より多くが、遊離の薬物として存在していた
（約６５０μｇ／ｇ）。合計の遊離の薬物のレベルは、可溶性アミカシンを吸引によって
投与されたラットにおける量と同じぐらい高かった（約５００μｇ／ｇ）。

遊離のアミカシンは、健康な動物の肺で、リポソーム性アミカシン製剤のリポソームか
ら数日のタイムスケールでゆっくりと放出される。放出される遊離の薬物は、肺での遊離
の薬物の標準的なデポーからわかるように、肺での残留時間が比較的長かった。

インライン注入プロセス
インライン注入プロセスの本質は、脂質溶液の流れと、抗感染薬溶液の流れとが、例え
ば、そこでさらなる混合を行うことができる混合チューブと呼ばれるチュービングの長手
方向に結合するＹ字コネクターによって「インライン」に混合することである。この意味
で、この新たなプロセスは、大量のアミカシン溶液の流れとして脂質溶液を注入する「従
来の」エタノール注入プロセスとは異なる。

アミカシンおよび脂質溶液の調製
アミカシンスルフェート１２．０ｇを２００ｍＬの水に溶解し、必要量の２５％のＮａ
ＯＨ溶液を加えてｐＨを６．５に調整した。脂質、１．４８０ｇのＤＰＰＣおよび０．５
２０ｇのコレステロールを６０ｍＬのエタノールと１０ｍＬの水の混合物中に溶解した。
これらの量は、脂質／アミカシンの流速をそれぞれ３００／５００ｍＬ／分で注入した後
、３００ｍＬのバッチとする。より大きなスケールまたは異なる流速が望ましければ、そ
れにあわせて体積を調整することができる。

上記のようにして調製したアミカシン溶液は、約４０ｍｇ／ｍＬのアミカシン（塩基に
対して）溶液となる。提示されているように、脂質溶液は、脂質合計が約２０ｍｇ／ｍＬ
の溶液（９０％エタノール）であるＤＰＰＣ／Ｃｈｏｌ（モル比６０／４０）であった。
溶解を速くするため脂質を〜４０℃まで加熱した。

３００ｍＬのバッチに必要とされる正確な量は、アミカシン１５０ｍＬ、脂質９０ｍＬ
そして、最終エタノール濃度を調整するために注入後もしくは注入中に添加するの追加食
塩水（もしくは水）６０ｍＬである。

製造手順
注入システムの一実施態様を図８に示す。

脂質溶液およびアミカシン溶液を、Ｙ字コネクター（ＩＤ３．２ｍｍ、ＯＤ６．４ｍｍ
）を用いたインラインに、流速〜３００／５００ｍＬ／分（すなわち、従来のプロセスの
〜１／３．３５ではなく、〜１／１．６７体積比）で混合した。脂質溶液の送達にはMast
erFlexチューブＬ／Ｓ２５（ＩＤ４．８ｍｍ）を用い、アミカシン溶液の送達にはＬ／Ｓ
１７チューブ（ＩＤ６．４ｍｍ）を用いた。流速を同期させるために、１つのMasterFlex
ドライブを備えた２つのポンプヘッドを用いた。チューブの断面積に基づけば、流速比の
理論値は、４．８^２／６．４^２＝０．５６２＝１／１．７８となるはずである。アミカシ
ンチューブＬ／Ｓ１７については、ポンプドライブを５００ｍＬ／ｍｉｎに設定した場合
、流速の測定値は、〜３００／５００＝１／１．６７となった。

脂質溶液は、９０％のエタノールを含有するので、インライン混合物のエタノールは〜
３４％であった。アミカシンの蓄積を防ぐために、流速１００〜２００ｍＬ／分で注入後
および注入中、ＮａＣｌ溶液を添加することができる（この点で、リポソームが既に形成
されていると想定される）。したがって、最終的な混合物は〜２７％のエタノールを有す
ることになり、その全てにおいて遊離のアミカシンが可溶性であることが予測される。

注入の流速の合計、８００〜１０００ｍＬ／ｍｉｎは、２つの大きなダイアフィルトレ
ーションカートリッジを用いて透過流速と比較可能である。これによって、ダイアフィル
トレーションによる注入と濃縮を同時に行うことが可能になる。

得られたリポソーム懸濁液を洗浄して、Ａｍｅｒｓｈａｍ製の中空ファイバーカートリ
ッジＵＦＰ−５００−Ｃ−３ＭＡ（膜面積：１４０ｃｍ^２、ファイバーＩＤ：０．５ｍｍ
）を用いたダイアフィルトレーションによって遊離アミカシンを除去した。第１のステッ
プにおいて、該懸濁液を当初の体積の半分（１５０ｍＬ）に濃縮した。その後、ダイアフ
ィルトレーションで洗浄中、懸濁液を再度循環し、浸透率に合致させ、一定体積を維持す
るために、新鮮な食塩水溶液を混合物中に〜６ｍＬ／分の速度で供給した。ダイアフィル
トレーションは、懸濁液の体積が、供給する食塩水溶液の懸濁液体積の４倍に分散される
まで続けた（すなわち、４＊１５０ｍＬ＝６００ｍＬ）。このダイアフィルトレーション
／洗浄の手順を４「洗浄」と呼ぶことにする。最終的に、該懸濁液を濃縮し（食塩水を入
れないダイアフィルトレーション）、所望のアミカシンおよび脂質の濃度で最終的な生成
物を得た。ダイアフィルトレーションステップ中のこの再循環の流速は〜３５０ｍＬ／分
であった。１０ＰＳＩ以下の入口圧力を維持するために、最終濃縮ステップ中、徐々に減
少させ、〜１５０ｍＬ／分まで減少させた。

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引用による援用
限定されないが特許および特許出願を含む、本明細書に引用されている文献および引例
を、個々の出願または引例が特別に、かつ個別に引用によって本明細書に援用されるのと
同程度に、その全体、その部分全体を引用によってここに援用する。この出願が優先権を
主張する特許出願もまた、出願および引例について上記したように、ここに引用を以って
援用する。

均等物
好ましい実施態様を強調して本発明を説明してきたが、好ましいデバイスおよび方法に
おける変形を用いてもよいこと、ならびに本発明は本明細書に特に記載したもの以外の方
法で行ってもよいことが意図されていることが当業者には明らかであろう。したがって、
本発明は、以下に示す請求項によって定義されている本発明の精神および範囲に包含され
るすべての変形を含む。

Claims (1)

1. 明細書に記載された発明。

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