PT1853310E - Formulação de anticorpo anti-a beta - Google Patents

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Donna Luisi
Angela Kantor
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Wyeth Llc
Janssen Alzheimer Immunotherap
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Description

1
DESCRIÇÃO "FORMULAÇÃO DE ANTICORPO ΑΝΤΙ-A BETA"
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A doença de Alzheimer ("AD") é um distúrbio neurodegenerativo caracterizado pela ocorrência de placas amilóides, emaranhados neurofibrilares e perda neuronal significativa. Implicou-se a proteína β- Amilóide (também referida como o péptido Αβ), o componente principal de placas senis, na patogénese da doença de Alzheimer (Selkoe (1989) Cell 58: 611-612; Hardy (1997) Trends Neurosci. 20: 154-159). β-Amilóide mostrou-se ser tanto directamente tóxico aos neurónios cultivados (Lorenzo e Yankner (1996) Ann. NY Acad. Sei. 777: 89-95) quanto indirectamente tóxico através de vários mediadores (Koh et al. (1990) Brain
Research 533: 315-320; Mattson et al. (1992) J.
Neurosciences 12: 376- 389). Adicionalmente, modelos in vivo, incluindo o ratinho PDAPP e um modelo de rato têm β-amilóide ligado para déficits de aprendizado, função cognitiva alterada e inibição da potenciação hipocámpica de longa duração (Chen et al. (2000) Nature 408: 975-985;
Walsh et al. (2002) Nature 416: 535-539). Portanto, existe um interesse considerável focalizado em terapias que alteram os níveis de β-amilóide para reduzir potencialmente a gravidade ou mesmo abolir a própria doença.
Uma estratégia de tratamento da AD que surgiu recentemente em resposta aos estudos bem-sucedidos em ratinhos PDAPP e modelos experimentais em rato, é aquela da imunização de indivíduos para proporcionar imunoglobulinas tais como anticorpos (como no caso de imunização passiva, em que as imunoglobulinas terapêuticas são administradas a um paciente) ou para gerar imunoglobulinas (imunização activa, em que o sistema imune de um paciente é activado para produzir imunoglobulinas para um antígeno 2 administrado) especificas para β-amilóide. Estes anticorpos por sua vez ajudariam a reduzir a carga de placa pela prevenção da agregação de β- amilóide (Solomon et al. (1997) Neurobiology 94: 4109-4112) ou estimulação de células microgliais para a fagocitose e remoção das placas (Bard et al. (2000) Nature Medicine 6: 916-919). Ainda por via de exemplo, um anticorpo monoclonal IgGl péptido anti Αβ humanizado (um anticorpo 3D6 humanizado) pode eficazmente tratar a AD pela ligação selectiva de péptido Αβ humano.
Para uma proteína e em particular, um anticorpo, permanecer biologicamente activo, uma formulação deve preservar intacta a integridade conformacional de pelo menos uma sequência de núcleo dos aminoácidos da proteína enquanto ao mesmo tempo protege os grupos funcionais múltiplos da proteína da degradação. As vias da degradação para as proteínas podem envolver instabilidade química (isto é, qualquer processo que envolve a modificação da proteína pela formação de ligação ou clivagem que resulta numa nova entidade química) ou instabilidade física (isto é, mudanças na estrutura de ordem superior da proteína). A instabilidade química pode resultar da desamidação, racemização, hidrólise, oxidação, eliminação beta ou troca de dissulfureto. A instabilidade física pode resultar da desnaturação, agregação, precipitação ou adsorção, por exemplo. Para uma revisão geral da estabilidade de produtos farmacêuticos de proteína, veja-se, por exemplo, Manning, et al. (1989) Pharmaceutical Research 6: 903-918. Além disso, é desejável manter a estabilidade quando polipéptidos transportadores não são incluídos na formulação.
Embora a ocorrência possível de instabilidades de proteína seja amplamente avaliada, é impossível prognosticar problemas de instabilidade particulares para uma proteína particular. Qualquer uma destas instabilidades 3 pode potencialmente resultar na formação de um subproduto de polipéptido ou derivado tendo actividade diminuída, toxicidade aumentada, e/ou imunogenicidade aumentada. Na verdade, a precipitação de polipéptido pode levar à trombose, não homogeneidade da forma farmacêutica e reacções imunes. Assim, a segurança e eficácia de qualquer formulação farmacêutica de um polipéptido está directamente relacionada com a sua estabilidade.
Consequentemente, continua a existir uma necessidade quanto a formulações que não apenas mantenham a estabilidade e actividade biológica de polipéptidos biológicos, por exemplo, polipéptidos de ligação Αβ, no armazenamento e libertação, mas que sejam também adequadas para várias vias de administração terapêutica. 0 âmbito da presente invenção é definido pelas reivindicações e qualquer informação que não esteja incluída nas reivindicações é fornecida apenas para informação.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona formulações projectadas para proporcionar estabilidade e manter a actividade biológica de uma proteína activa biologicamente incorporada, em particular proteínas ou polipéptidos de ligação Αβ, tais como, por exemplo, anticorpos Αβ ou fragmentos ou porções dos mesmos. A invenção proporciona ainda formulações de polipéptido, tais como, por exemplo, formulações de polipéptido líquidas estabilizadas que são resistentes à formação de subprodutos de polipéptido indesejados. A integridade de antigénio-polipéptidos de ligação para utilização terapêutica é especialmente importante porque se o polipéptido forma subprodutos, por exemplo, agregados ou fragmentos de degradação durante o armazenamento, a bioactividade pode ser perdida, comprometendo deste modo a actividade terapêutica da 4 molécula por dose unitária. Além disso, existe um desejo intenso para estabilizar polipéptidos terapêuticos destinados para funções especializadas, para a libertação e utilização em certas indicações biológicas, por exemplo, tratamento de condições neurodegenerativas, onde um polipéptido deve passar através da barreira hematoencefálica (BBB) e ligar um antigénio alvo.
Num aspecto, a presente invenção proporciona uma formulação estabilizada que inclui pelo menos um polipéptido de ligação de Αβ, pelo menos um agente de tonicidade, em que o agente de tonicidade está presente numa quantidade suficiente para tornar a formulação adequada para a administração e pelo menos um agente de tamponamento numa quantidade suficiente para manter um pH fisiologicamente adequado. A formulação pode ser uma formulação liofilizada ou uma liquida. Algumas formulações incluem pelo menos um antioxidante, tal como, por exemplo, um aminoácido antioxidante, tal como, por exemplo, metionina. Em algumas formulações, o agente de tonicidade é manitol ou NaCl. Em algumas formulações, pelo menos um agente de tamponamento é succinato, fosfato de sódio ou um aminoácido tal como histidina. As formulações preferidas também incluem pelo menos um estabilizante tal como, por exemplo, polissorbato 80. Em algumas formulações, o estabilizante é polissorbato 80, o antioxidante é metionina, o agente de tonicidade é manitol, sorbitol ou NaCl e o agente de tamponamento é histidina. Em algumas formulações, pelo menos um polipéptido de ligação de Αβ é seleccionado a partir do grupo que consiste num anticorpo anti-Αβ, um fragmento Fv de anticorpo anti-Αβ, um fragmento Fab de anticorpo anti-Αβ, um fragmento Fab'(2) de anticorpo anti-Αβ, um fragmento Fd de anticorpo anti-Αβ, um anticorpo anti-Αβ de cadeia única(scFv), um fragmento de anticorpo anti-Αβ de domínio único (Dab), um polipéptido de folha beta pregueada incluindo pelo menos uma região de 5 determinação de complementaridade (CDR) de anticorpo de um anticorpo anti-Αβ e um polipéptido não globular incluindo pelo menos um CDR de anticorpo de um anticorpo anti-Αβ. Em algumas formulações, pelo menos um polipéptido de ligação Αβ é um anticorpo anti-Αβ, por exemplo, que se liga especificamente ao epítopo dentro dos resíduos de 1-7, 1-5, 3-7, 3-6, 13-28, 15 a 24, 16-24, 16-21, 19-22, 33-40, 33-42 de Αβ ou Fab, Fab'(2) ou fragmento Fv do mesmo. Os anticorpos anti-Αβ exemplares especificamente se ligam a um epítopo dentro dos resíduos de 1 a 10 de Αβ, tal como, por exemplo, dentro dos resíduos de 1-7, 1-5, 3-7 ou 3-6 de Αβ. Outros anticorpos anti-Αβ exemplares especificamente se ligam a um epítopo dentro dos resíduos de 13-28 de Αβ, tal como, por exemplo, dentro dos resíduos de 16-21 ou 19-22 de Αβ. Já outros anticorpos anti-Αβ exemplares especificamente se ligam a um epítopo de terminal C de Αβ tal como, por exemplo, de 33-40 ou de 33-42 de Αβ. Os anticorpos anti-Αβ preferidos incluem um anticorpo anti-Αβ humanizado, por exemplo, um anticorpo 3D6 humanizado, um anticorpo 10D5 humanizado, um anticorpo 12B4 humanizado, um anticorpo 266 humanizado, um anticorpo 12A11 humanizado ou um anticorpo 15C11 humanizado.
Em algumas formulações, o anticorpo anti-Αβ liga-se a um epítopo descontínuo que inclui os resíduos dentro de 1-7 e dentro de 13-28 de Αβ. Em algumas de tais formulações, o anticorpo é anticorpo biespecífico ou um anticorpo fabricado pelo processo descrito na Publicação de Patente Internacional N° W003/070760. Em algumas tais formulações, 0 epítopo é um epítopo descontínuo. Em formulações preferidas, o anticorpo anti-Αβ é um anticorpo 3D6 humanizado, um anticorpo 10D5 humanizado, um anticorpo 12B4 humanizado, um anticorpo 266 humanizado, um anticorpo 12A1 1 humanizado ou um anticorpo 15C11 humanizado. O isotipo do anticorpo pode ser IgM, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 ou qualquer outro isotipo farmaceuticamente aceitável. 6
Em formulações preferidas, o isotipo é IgGl humano ou IgG4 humano. Em algumas formulações líquidas, a concentração do anticorpo anti-Αβ é de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 60 mg/ml, de cerca de 40 mg/ml a cerca de 60 mg/ml, de cerca de 50 mg/ml, de cerca de 30 mg/ml, de cerca de 17 mg/ml a cerca de 23 mg/ml, de cerca de 20 mg/ml, de cerca de 17 mg/ml, de cerca de 10 mg/ml, de cerca de 5 mg/ml, de cerca de 2 mg/ml ou cerca de 1 mg/ml, preferivelmente de cerca de 17 mg/ml a cerca de 23 mg/ml.
Em algumas formulações, pelo menos um agente de tonicidade é D-manitol e está presente numa concentração de cerca de 1% p/v a cerca de 10% p/v, de cerca de 2% p/v a cerca de 6% p/v ou preferivelmente de cerca de 4% p/v. Em algumas formulações, pelo menos um agente de tamponamento é histidina e está presente numa concentração de cerca de 0,1 mM a cerca de 25 mM, de cerca de 5 mM a cerca de 15 mM, preferivelmente de cerca de 5 mM ou cerca de 10 mM. Em outras formulações, pelo menos um agente de tamponamento é succinato e está presente numa concentração de cerca de 0,1 mM a cerca de 25 mM, tal como, por exemplo, a cerca de 10 mM. Em algumas formulações, o antioxidante é metionina e está presente numa concentração de cerca de 0,1 mM a cerca de 2 5 mM, de cerca de 5 mM a cerca de 15 mM ou preferivelmente de cerca de 10 mM. Em formulações preferidas, o estabilizante é polissorbato 80 e está presente numa concentração de cerca de 0,001% p/v a cerca de 0,01% p/v, de cerca de 0,005% p/v a cerca de 0,01% p/v ou cerca de 0,005% p/v. A formulação pode ter um pH de cerca de 5 a 7, de cerca de 5,5 a cerca de 6,5, de cerca de 6,0 a cerca de 6,5, de cerca de 6,2, de cerca de 6,0 ou de cerca de 5,5, preferivelmente de cerca de 6,0.
Uma formulação preferida tem um pH de cerca de 6,0 a cerca de 6,5 e inclui um anticorpo anti-Αβ que se liga especificamente a um epítopo dentro de resíduos seleccionados a partir do grupo que consiste em 1-7, 1-5, 7 3-7, 3-6, 13-28, 15 a 24, 16-24, 16-21, 19-22, 33-40 e 33-42 de Αβ, por exemplo, D- manitol numa concentração de cerca de 2% p/v a cerca de 6%, por exemplo, histidina numa concentração de cerca de 0,1 mM a cerca de 25 mM, metionina numa concentração de cerca de 0,1 mM a cerca de 25 mM e um estabilizante. Preferivelmente, o estabilizante é polissorbato 80 numa concentração de cerca de 0,001% a cerca de 0,01% p/v. A formulação pode ser uma formulação de polipéptido líquida estabilizada projectada para proporcionar estabilidade e para manter a actividade biológica do polipéptido incorporado. A formulação inclui um polipéptido de ligação Αβ terapeuticamente activo e um antioxidante numa quantidade suficiente para reduzir a formação de subproduto do polipéptido durante o armazenamento da formulação.
Um pouco das formulações de polipéptido líquidas são estabilizadas contra a formação de subprodutos indesejados tais como agregados de polipéptido de peso molecular alto, produtos de degradação de agregados de polipéptido de peso molecular baixo ou misturas dos mesmos.
Em formulações em que o polipéptido de ligação a antigénio terapêutico é um anticorpo, os agregados de peso molecular alto típicos a serem minimizados são, por exemplo, complexos de anticorpo:anticorpo, complexos de anticorpo:fragmento de anticorpo, complexos de fragmento de anticorpo:fragmento de anticorpo ou misturas dos mesmos. No geral, os complexos ou subprodutos de peso molecular alto têm um peso molecular maior do que um monómero do polipéptido de ligação a antigénio, por exemplo, no caso de um anticorpo IgG, maior do que cerca de 150 kD. Em tais formulações de anticorpo, os produtos de degradação de agregados de polipéptido de peso molecular baixo típicos a serem minimizados são, por exemplo, complexos que consistem numa cadeia leve de anticorpo, uma cadeia pesada de anticorpo, um complexo de cadeia leve e cadeia pesada de anticorpo ou misturas dos mesmos. No geral, os complexos ou subprodutos de peso molecular baixo têm um peso molecular menor do que aquele de um monómero do polipéptido de ligação a antigénio, por exemplo, no caso de um anticorpo IgG, menor do que cerca de 150 kD.
Uma formulação estabilizada preferida de um anticorpo anti- Αβ inclui metionina como um antioxidante numa quantidade suficiente para inibir a formação de subprodutos indesejados, um agente de tonicidade por exemplo, numa quantidade suficiente para tornar a formulação adequada para a administração e um aminoácido por exemplo, ou derivado do mesmo numa quantidade suficiente para manter um pH fisiologicamente adequado.
Algumas formulações são estáveis quando congeladas. A formulação pode ser adequada para a administração parentérica, intravenosa, intramuscular, subcutânea, intracraniana ou epidural, preferivelmente intravenosa ou subcutânea. Algumas formulações podem ser adequadas para a libertação alvejada ao cérebro ou ao fluido espinal de um paciente. A formulação pode ser substancialmente livre de conservantes. Algumas formulações são estáveis durante pelo menos cerca de 12 meses, pelo menos cerca de 18 meses, pelo menos cerca de 24 meses ou pelo menos cerca de 30 meses. Algumas formulações são estáveis a cerca de -80 °C a cerca de 40 °C, de cerca de 0 °C a cerca de 25 °C, de cerca de 0 °C a cerca de 10 °C, preferivelmente de cerca de -80 °C a cerca de -50 °C ou de cerca de 2 °C a cerca de 8 °C.
Algumas formulações são estáveis durante pelo menos cerca de 12 meses a uma temperatura acima da de congelamento a cerca de 10 °C e têm um pH de cerca de 5,5 a cerca de 6,5. Tal formulação inclui pelo menos um anticorpo Αβ numa concentração de cerca de 1 mg/ml a cerca de 30 mg/ml, manitol numa concentração de cerca de 4% p/v ou NaCl numa concentração de cerca de 150 mM, histidina ou 9 succinato numa concentração de cerca de 5 mM a cerca de 10 mM e 10 mM de metionina. Uma tal formulação tem um pH de cerca de 6,0, cerca de 1 mg/ml de anticorpo Αβ, cerca de 10 mM de histidina e cerca de 4% p/v de manitol. Outras formulações são estáveis durante pelo menos cerca de 24 meses a uma temperatura de cerca de 2 °C a 8 °C e incluem polissorbato 80 numa concentração de cerca de 0,001% p/v a cerca de 0,01% p/v. Algumas de tais formulações têm um pH de cerca de 6,0 a cerca de 6,5 e incluem cerca de 10 mM de histidina, cerca de 4% p/v de manitol e cerca de 1 mg/ml, cerca de 2 mg/ml ou cerca de 5 mg/ml de anticorpo Αβ. Outras tais formulações incluem cerca de 10 mM de histidina, cerca de 4% p/v de manitol, cerca de 0,005% p/v de polissorbato 80 e cerca de 10 mg/ml, cerca de 20 mg/ml ou 3 0 mg/ml de anticorpo Αβ, preferivelmente num pH de cerca de 6,0 a cerca de 6,2. 0 anticorpo anti-Αβ em tais formulações é preferivelmente um anticorpo 3D6 humanizado, um anticorpo 10D5 humanizado, um anticorpo 12B4 humanizado, um anticorpo 266 humanizado, um anticorpo 12A11 humanizado ou um anticorpo 15C11 humanizado. Uma tal formulação tem um pH de cerca de 6,0 a 6,5 e inclui cerca de 10 mM de histidina, cerca de 4% p/v de manitol e de cerca de 2 mg/ml a cerca de 20 mg/ml de um anticorpo Αβ seleccionado a partir do grupo que consiste num anticorpo 3D6 humanizado, um anticorpo 10D5 humanizado, um anticorpo 12B4 humanizado e um anticorpo 12A11 humanizado. Uma outra tal formulação tem um pH de cerca de 6,0 a 6,5 e inclui cerca de 10 mM de histidina, cerca de 150 mM de NaCl e cerca de 2 mg/ml a cerca de 20 mg/ml de um anticorpo Αβ seleccionado a partir do grupo que consiste num anticorpo 12B4 humanizado e um anticorpo 12Ali humanizado. Ainda uma outra tal formulação tem um pH de cerca de 6,0 a 6,5 e inclui cerca de 10 mM de histidina, cerca de 4% p/v de manitol e cerca de 2 mg/ml a cerca de 20 mg/ml de um anticorpo Αβ seleccionado a partir 10 do grupo que consiste num anticorpo 266 humanizado e um anticorpo 15C11 humanizado.
Uma formulação preferida é estável durante pelo menos cerca de 24 meses a uma temperatura de cerca de 2 °C a cerca de 8 °C, tem um pH de cerca de 5,5 a cerca de 6,5 e inclui cerca de 2 mg/ml a cerca de 23 mg/ml, preferivelmente de cerca de 17 mg/ml a cerca de 23 mg/ml, de um anticorpo 3D6 humanizado, cerca de 10 mM de histidina e cerca de 10 mM de metionina. Preferivelmente, a formulação inclui ainda cerca de 4% p/v de manitol. A formulação preferivelmente inclui polissorbato 80 numa concentração de cerca de 0,001% p/v a cerca de 0,01% p/v, mais preferivelmente de cerca de 0,005% p/v de polissorbato 80. Em tais formulações, o anticorpo 3D6 humanizado pode estar presente numa concentração de cerca de 20 mg/ml a cerca de 23 mg/ml.
Uma outra formulação é estável durante pelo menos cerca de 24 meses a uma temperatura de cerca de 2 °C a cerca de 8 °C, tem um pH de cerca de 5,5 a cerca de 6,5 e inclui cerca de 2 mg/ml a cerca de 23 mg/ml de um anticorpo 3D6 humanizado, cerca de 10 mM de succinato, cerca de 10 mM de metionina, cerca de 4% p/v de manitol e cerca de 0,005% p/v de polissorbato 80. Em algumas de tais formulações, a concentração de anticorpo 3D6 humanizado está presente numa concentração de cerca de 17 mg/ml a cerca de 23 mg/ml.
Uma outra formulação preferida é estável durante pelo menos cerca de 24 meses a uma temperatura de cerca de 2 °C a cerca de 8 °C, tem um pH de cerca de 6,0 a cerca de 6,5 e inclui cerca de 2 mg/ml a cerca de 30 mg/ml de um anticorpo 266 humanizado, cerca de 10 mM histidina e cerca de 10 mM de metionina. Algumas de tais formulações incluem ainda cerca de 4% p/v de manitol. Algumas de tais formulações incluem polissorbato 80 numa concentração de cerca de 0,001% p/v a cerca de 0,01% p/v, por exemplo, cerca de 0, 005% p/v de polissorbato 80. Em algumas de tais 11 formulações, o anticorpo 266 humanizado está presente numa concentração de cerca de 17 mg/ml a cerca de 23 mg/ml ou de cerca de 20 mg/ml a cerca de 23 mg/ml.
Ainda outra formulação é estável durante pelo menos cerca de 24 meses a uma temperatura de cerca de 2 °C a cerca de 8 °C, tem um pH de cerca de 6,0 a cerca de 6,5 e inclui de cerca de 2 mg/ml a cerca de 20 mg/ml de um anticorpo 266 humanizado, cerca de 10 mM de succinato, cerca de 10 mM de metionina, cerca de 4% p/v de manitol e cerca de 0,005% p/v de polissorbato.
Uma outra formulação preferida é estável durante pelo menos cerca de 24 meses a uma temperatura de cerca de 2 °C a cerca de 8 °C, tem um pH de cerca de 6,0 a cerca de 6,5, e inclui cerca de 2 mg/ml a cerca de 30 mg/ml de um anticorpo 12A11 humanizado, cerca de 10 mM de histidina e cerca de 10 mM de metionina. Algumas de tais formulações incluem cerca de 150 mM de NaCl. Tais formulações podem incluir polissorbato 80 numa concentração de cerca de 0,001% p/v a cerca de 0,01% p/v, tal como, por exemplo, cerca de 0,005% p/v de polissorbato 80. Em algumas das formulações, o anticorpo 12A11 humanizado está presente numa concentração de cerca de 17 mg/ml a cerca de 23 mg/ml ou de cerca de 20 mg/ml a cerca de 23 mg/ml.
Ainda outra formulação é estável durante pelo menos cerca de 24 meses a uma temperatura de cerca de 2 °C a cerca de 8 °C, tem um pH de cerca de 6,0 a cerca de 6,5 e inclui cerca de 2 mg/ml a cerca de 20 mg/ml de um anticorpo 12A11 humanizado, cerca de 5 mM de histidina, cerca de 10 mM de metionina, cerca de 4% p/v de manitol e cerca de 0,005% p/v de polissorbato 80. A invenção também proporciona uma formulação que é estável quando descongelada de cerca de -50 °C a cerca de -80 °C, tem um pH de cerca de 6,0 e inclui de cerca de 40 a cerca de 60 mg/ml de um anticorpo anti-Αβ, de cerca de 1,0 mg/ml a cerca de 2,0 mg/ml de histidina, de cerca de 1,0 12 mg/ml a 2,0 mg/ml de metionina e cerca de 0,05 mg/ml de polissorbato 80. Preferivelmente, manitol é excluído. Preferivelmente, o anticorpo Αβ é um anticorpo 3D6 humanizado ou um anticorpo 266 humanizado. A presente invenção também proporciona uma formulação líquida que inclui um anticorpo anti-Αβ, manitol e histidina. Em algumas de tais formulações, o anticorpo Αβ está presente de cerca de 1 mg/ml a cerca de 30 mg/ml. Preferivelmente, o manitol está presente numa quantidade suficiente para manter a isotonicidade da formulação. Preferivelmente, a histidina está presente numa quantidade suficiente para manter um pH fisiologicamente adequado. Uma tal formulação inclui cerca de 20 mg/ml de anticorpo anti-Αβ, cerca de 10 mM de L-histidina, cerca de 10 mM de metionina, cerca de 4% de manitol e tem um pH de cerca de 6. Uma outra tal formulação inclui cerca de 30 mg/ml de anticorpo anti-Αβ, cerca de 10 mM de succinato, cerca de 10 mM de metionina, cerca de 6% de manitol e tem um pH de cerca de 6,2. Ainda uma outra tal formulação inclui cerca de 20 mg/ml de anticorpo anti-Αβ, cerca de 10 mM de L-histidina, cerca de 10 mM de metionina, cerca de 4% manitol, cerca de 0,005% de polissorbato 80 e tem um pH de cerca de 6. Uma outra tal formulação inclui cerca de 10 mg/ml de anticorpo anti-Αβ, cerca de 10 mM de succinato, cerca de 10 mM de metionina, cerca de 10% de manitol, cerca de 0,005% de polissorbato 80 e tem um pH de cerca de 6,5.
Ainda uma outra tal formulação inclui cerca de 5 mg/ml a cerca de 20 mg/ml de anticorpo anti-Αβ, de cerca de 5 mM a cerca de 10 mM de L-histidina, cerca de 10 mM de metionina, cerca de 4% de manitol, cerca de 0,005% de polissorbato 80 e tem um pH de cerca de 6,0 a cerca de 6,5. Ainda uma outra tal formulação inclui de cerca de 5 mg/ml a cerca de 20 mg/ml de anticorpo anti-Αβ, de cerca de 5 mM a cerca de 10 mM de L-histidina, cerca de 10 mM de metionina, cerca de 150 mM de NaCl, cerca de 0,005% de polissorbato 80 13 e tem um pH de cerca de 6,0 a cerca de 6,5. A presente invenção também proporciona uma formulação adequada para a administração intravenosa que inclui cerca de 20 mg/ml de um anticorpo anti-Αβ, cerca de 10 mM de L-histidina, cerca de 10 mM de metionina, cerca de 4% de manitol e tem um pH de cerca de 6. Preferivelmente, tal formulação inclui cerca de 0,005% de polissorbato 80. A invenção proporciona um método para aumentar a estabilidade de um polipéptido de ligação a antigénio, por exemplo, um anticorpo, numa formulação farmacêutica liquida, onde o polipéptido de outro modo exibiria a formação de subproduto durante o armazenamento numa formulação liquida. Consequentemente, o método compreende incorporar na formulação um antioxidante, por exemplo, metionina ou um análogo da mesma, numa quantidade suficiente para reduzir a quantidade de formação de subproduto. A presente invenção também proporciona um método para manter a estabilidade de uma formulação de anticorpo anti-Αβ humanizado para ser armazenada a uma temperatura de cerca de -50 °C a cerca de -80 °C seguida pelo armazenamento a uma temperatura de cerca de 2 °C a cerca de 8 °C, que compreende (i) combinar de cerca de 40 mg/ml a cerca de 60 mg/ml de anticorpo anti-Αβ humanizado, de cerca de 1 mg/ml a cerca de 2 mg/ml de L- histidina, de cerca de 1 mg/ml a cerca de 2 mg/ml de metionina e cerca de 0,05 mg/ml de polissorbato 80; (ii) ajustar o pH a cerca de 6,0; (iii) filtrar num criorrecipiente e congelar; (iv) descongelar; (v) adicionar manitol ou NaCl e diluente in quantidades suficientes para resultar numa concentração final de cerca de 4% de manitol ou de cerca de 150 mM de NaCl, de cerca de 2 mg/ml a cerca de 20 mg/ml de anticorpo anti-Αβ humanizado; de cerca de 5 mM a cerca de 10 mM de histidina; cerca de 10 mM de metionina e cerca de 0,005% de polissorbato 80; (vi) filtrar; (vii) transferir para um 14 frasco de vidro e selar; e (viii) armazenar a uma temperatura de cerca de 2 °C a cerca de 8 °C. A presente invenção também proporciona um kit que inclui um recipiente com uma formulação descrita no presente documento e instruções para utilização. A presente invenção também proporciona uma forma farmacêutica unitária, que inclui uma formulação de cerca de 10 mg a cerca de 250 mg de um anticorpo anti-Αβ, cerca de 4% de manitol ou cerca de 150 mM de NaCl, de cerca de 5 mM a cerca de 10 mM de histidina ou succinato e cerca de 10 mM de metionina. Algumas de tais formas de dosagem unitárias farmacêuticas incluem de cerca de 0,001% a cerca de 0,1% de polissorbato 80. Algumas de tais formas de dosagem unitárias farmacêuticas incluem de cerca de 40 mg a cerca de 60 mg, de cerca de 60 mg a cerca de 80 mg, de cerca de 80 mg a cerca de 120 mg, de cerca de 120 mg a cerca de 160 mg ou de cerca de 160 mg a cerca de 240 mg do anticorpo anti-Αβ. Algumas de tais formulações podem ser mantidas num frasco de vidro a uma temperatura de cerca de 2 °C a cerca de 8 °C antes da administração a um paciente.
Além disso, a presente invenção proporciona um produto terapêutico que inclui um frasco de vidro com uma formulação que inclui cerca de 10 mg a cerca de 250 mg de um anticorpo anti-Αβ humanizado, cerca de 4% de manitol ou cerca de 150 mM de NaCl, de cerca de 5 mM a cerca de 10 mM de histidina e cerca de 10 mM de metionina. Alguns de tais produtos terapêuticos incluem ainda um rótulo para utilização que inclui instruções para utilização do volume apropriado necessário para se obter uma dose de cerca de 0,15 mg/kg a cerca de 5 mg/kg num paciente. Tipicamente, o frasco é um frasco de 1 ml, um de 2 ml, um de 5 ml, um de 10 ml, um de 25 ml ou um de 50 ml. A dose de alguns de tais produtos terapêuticos é de cerca de 0,5 mg/kg a cerca de 3 mg/kg, preferivelmente de cerca de 1 mg/kg a cerca de 2 mg/kg. Em alguns de tais produtos terapêuticos, a 15 concentração de anticorpo anti-Αβ é de cerca de 10 mg/ml a cerca de 60 mg/ml, preferivelmente de cerca de 20 mg/ml. O produto terapêutico preferivelmente inclui cerca de 0,005% de polissorbato 80. A formulação de alguns de tais produtos terapêuticos é para a administração subcutânea ou administração intravenosa. A presente invenção também proporciona um método para tratar profiláctica ou terapeuticamente uma doença caracterizada por depósitos de Αβ que inclui administrar intravenosa ou subcutaneamente uma dosagem unitária farmacêutica como é descrita no presente documento.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 descreve uma representação esquemática da estrutura prognosticada de um anticorpo IgG e posições aproximadas de ligações de dissulfureto intra- e inter-cadeia, locais de glicosilação (símbolo hexagonal), regiões de determinação de complementaridade (CDRs), regiões de matriz (sombreado) e regiões constantes. A Figura 2 mostra as sequências de aminoácido completas das cadeias pesada e leve de anticorpo anti-Αβ 3D6 humanizado versão 2 (hu3D6.v2), SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, respectivamente. Regiões de determinação de complementaridade da cadeia leve (CDR) , isto é, CDR1, CDR2 e CDR3 estão, respectivamente, nas posições de resíduo 24 a 39, 55 a 61 e 94 a 102 (painel superior) . As regiões de determinação de complementaridade (CDR) da cadeia pesada, isto é, CDR1, CDR2 e CDR3 estão, respectivamente, nas posições de resíduo 40 a 44, 50 a 65 e 99 a 108 (painel inferior) . Ligações de dissulfureto intramoleculares prognosticadas são ilustradas pelas conexões dos resíduos de cisteína envolvidos. As cisteínas esperadas formar ligações de dissulfureto intermoleculares são sublinhadas e a conectividade indicada. O local de consenso de glicosilação ligado em N da cadeia pesada de anticorpo está indicado em itálicos nas posições de resíduo 299 a 301 16 (painel inferior). A lisina de terminal C da cadeia pesada prognosticada é mostrada em parênteses. A Figura 3 descreve graficamente os prognósticos de vida de prateleira para as formulações de anticorpo (com e sem polissorbato 80 (PS80)) fabricadas de acordo com a presente invenção e armazenada a 5 °C. A Figura 4 descreve graficamente os prognósticos de vida de prateleira para as formulações de anticorpo (com e sem PS80) fabricados de acordo com a presente invenção e armazenados a 25 °C. A Figura 5 descreve graficamente os prognósticos de vida de prateleira para as formulações de anticorpo (com e sem PS80) fabricadas de acordo com a presente invenção e armazenadas a 40 °C. A Figura 6 descreve graficamente os prognósticos de degradação de formulações com PS80 fabricados de acordo com a presente invenção e armazenados a 5 °C. A Figura 7 descreve graficamente a análise de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) de formulações com PS80 fabricadas de acordo com a presente invenção, armazenadas a 5 °C e reprocessadas para minimizar a variabilidade do ensaio. A Figura 8 descreve graficamente os prognósticos de degradação de formulações sem PS 80 fabricadas de acordo com a presente invenção e armazenadas a 5 °C. A Figura 9 descreve um cromatograma que indica que a presença de PS80 muda os subprodutos encontrados dentro da formulação de polipéptido estabilizado de uma espécie de peso molecular alto para uma espécie de peso molecular baixo sem mudar o perfil de anticorpo monomérico. A Figura 10 descreve graficamente a inibição da formação de subprodutos indesejados numa formulação de polipéptido que compreende IgG4, em particular, agregados de polipéptido de peso molecular alto, na adição de um antioxidante tal como metionina livre. 17 A Figura 11 descreve graficamente a inibição da formação de subprodutos indesejados numa formulação de polipéptido que compreende IgG2, em particular, agregados de polipéptido de peso molecular alto, na adição de um antioxidante tal como metionina livre.
DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO
De modo a proporcionar um entendimento claro da memória descritiva e reivindicações, as seguintes definições são proporcionadas convenientemente a seguir.
Como é usado no presente documento, o termo "doença amiloidogénica" inclui qualquer doença associada à (ou causada por) formação ou deposição de fibrilas de amilóide insolúveis. As doenças amiloidogénicas exemplares incluem, mas não são limitadas à amiloidose sistémica, doença de Alzheimer, diabetes de início maduro, doença de Parkinson, doença de Huntington, demência fronto-temporal e as encefalopatias espongiformes transmissíveis relacionadas com prião (kuru e doença de Creutzfeldt-Jacob em seres humanos e scrapie (paraplexia enzoótica) e BSE em ovelhas e gado, respectivamente). Doenças amiloidogénicas diferentes são definidas ou caracterizadas pela natureza do componente de polipéptido das fibrilas depositadas. Por exemplo, em indivíduos ou pacientes tendo a doença de Alzheimer, a proteína β-amilóide (por exemplo, a proteína β-amilóide do tipo selvagem, variante ou truncada) é o componente de polipéptido caracterizante do depósito amilóide. Consequentemente, a doença de Alzheimer é um exemplo de uma "doença caracterizada pelos depósitos de Αβ" ou uma "doença associada a depósitos de Αβ", por exemplo, no cérebro de um indivíduo ou paciente.
Os termos "proteína β-amilóide", "péptido β-amilóide", "β-amilóide", "Αβ" e "péptido Αβ" são usados no presente documento intercambiavelmente. 0 termo "polipéptido de ligação de Αβ" inclui polipéptidos capazes de ligar-se especificamente ao(s) 18 péptido(s) Αβ ou ao(s) epítopo(s) dentro dos ditos péptidos Αβ. Tipicamente, polipéptidos de ligação de Αβ compreendem pelo menos uma porção funcional de uma imunoglobulina ou domínio equivalente à imunoglobulina, por exemplo, um receptor que compreende uma ou mais regiões variáveis ou regiões de determinação de complementaridade (CDRs) que comunicam uma característica de ligação específica ao polipéptido. Os polipéptidos de ligação a antigénio preferidos incluem anticorpos, por exemplo, IgM, IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4. 0 termo "anticorpo" refere-se às moléculas de imunoglobulina e porções imunologicamente activas de moléculas de imunoglobulina (moléculas que contêm um local de ligação a antigénio que se liga especif icamente a um antigénio), que inclui anticorpos monoclonais (que inclui anticorpos monoclonais de tamanho natural), anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) , anticorpos quiméricos, anticorpos enxertados com CDR, anticorpos humanizados, anticorpos humanos e anticorpos de cadeia única (scFvs). 0 termo "anticorpo monoclonal" ou "composição de anticorpo monoclonal", como é usado no presente documento, refere-se a uma população de moléculas de anticorpo que contém apenas uma espécie de um local de ligação a antigénio capaz de reconhecer e ligar-se a um epítopo particular de um antigénio alvo, por exemplo, um epítopo(s) de Αβ. Uma composição de anticorpo monoclonal assim tipicamente demonstra uma especificidade de ligação única e afinidade quanto a um antigénio alvo particular com o qual a mesma imunorreage. 0 termo "anticorpo de cadeia única" refere-se a uma proteína que tem uma estrutura de cadeia de polipéptido dupla que consiste numa cadeia pesada e uma leve, as ditas cadeias sendo estabilizadas, por exemplo, pelos ligadores peptídicos intercadeia, que tem a capacidade para ligar especificamente antigénio. As 19 técnicas para produzir anticorpos de cadeia única específicos ao antigénio alvo são descritas, por exemplo, na Patente US 4.946.778. 0 termo "fragmento de anticorpo" inclui fragmentos F(ab')2, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos Fd, fragmentos Fv e fragmentos de anticorpo de domínio único (DAbs). Porções imunologicamente activas de imunoglobulinas incluem, por exemplo, fragmentos F(ab) e F(ab')2. Os métodos para a construção de fragmentos Fab são descritos, por exemplo, em Huse, et al. (1989) Science 246: 1275 1281). Outros fragmentos de anticorpo podem ser produzidos pelas técnicas conhecidas no ramo que incluem, mas não são limitadas a: (i) um fragmento F(ab')2 produzido pela digestão de pepsina de uma molécula de anticorpo; (ii) um fragmento Fab gerado pela redução das pontes de dissulfureto de um fragmento F(ab')2; (iii) um fragmento Fab' gerado pelo tratamento da molécula de anticorpo com papaína e um agente redutor e (iv) fragmentos Fv. Vários fragmentos também podem ser produzidos pelas técnicas de engenharia recombinante reconhecidas na especialidade. Os anticorpos não humanos podem ser "humanizados" pelas técnicas descritas, por exemplo, na Patente US 5.225.539. Num método, as CDRs não humanas são inseridas numa sequência matriz de anticorpo humano ou anticorpo de consenso. Outras mudanças podem ser depois introduzidas na matriz de anticorpo para modular a afinidade ou imunogenicidade. 0 termo "domínio" refere-se a uma região globular de um polipéptido de cadeia pesada ou leve que compreende uma dobra de imunoglobulina. A dobra de imunoglobulina é compreendida de estrutura secundária de folha sanfonada (3 e inclui uma ligação de dissulfureto única. Os domínios são ainda referidos aqui como "constante" ou "variável", com base na falta relativa de variação de sequência dentro dos domínios de vários membros da classe no caso de um domínio "constante" ou a variação significativa dentro dos domínios 20 de vários membros da classe no caso de um domínio variável. Os "domínios" de anticorpo ou polipéptido são frequentemente referidos intercambiavelmente na técnica como "regiões" de anticorpo ou polipéptido. Os domínios "constantes" de uma cadeia leve de anticorpo são referidos intercambiavelmente como "regiões constantes de cadeia leve", "domínios constantes de cadeia leve", regiões "CL" ou domínios "CL". Os domínios "constantes" de uma cadeia pesada de anticorpo são referidos intercambiavelmente como "regiões constantes de cadeia pesada", "domínios constantes de cadeia pesada", regiões "CH" ou domínios "CH"). Os domínios "variáveis" de uma cadeia leve de anticorpo são referidos intercambiavelmente como "regiões de cadeia leve", "domínios variáveis de cadeia leve", regiões "VL" ou domínios "VL"). Os domínios "variáveis" de uma cadeia pesada de anticorpo são referidos intercambiavelmente como "regiões constantes de cadeia pesada", "domínios constantes de cadeia pesada", regiões "VH" ou domínios "VH"). O termo "região" também pode se referir a uma parte ou porção de uma cadeia de anticorpo ou domínio de cadeia de anticorpo (por exemplo, uma parte ou porção de uma cadeia pesada ou leve ou uma parte ou porção de um domínio constante ou variável, como é definido no presente documento), assim como partes ou porções mais distintas das ditas cadeias ou domínios. Por exemplo, os domínios variáveis de cadeia leve e pesada ou cadeia leve e pesada incluem "regiões de determinação de complementaridade" ou "CDRs" intercaladas entre as "regiões de matriz" ou "FRs", como é definido no presente documento. O termo "anticorpo anti-Αβ" inclui anticorpos (e fragmentos dos mesmos) que são capazes de ligar epítopos(s) do péptido Αβ. Anticorpos anti-Αβ incluem, por exemplo, aqueles anticorpos descritos na Publicação de Patente US 20030165496A1, Publicação de Patente US 20040087777A1, Publicação de Patente Internacional N° WO02/46237A3 e 21
Publicação de Patente Internacional N° W004/080419A2. Outros anticorpos anti-Αβ são descritos, por exemplo, nas Publicações de Patente Internacional N° WO03/07785 8A2 e WO04/108895A2, ambas intituladas "Humanized Antibodies that Recognize Beta Amyloid Peptide", Publicação de Patente Internacional N° WO03/016466A2, intitulada "Anti-Αβ Antibodies", Publicação de Patente Internacional N° W00162801A2, intitulada "Humanized Antibodies that Sequester Beta Amyloid Peptide" e Publicação de Patente Internacional N° W002/088306A2, intitulada "Humanized Antibodies" e Publicação de Patente Internacional N° W003/070760A2, intitulada "Anti-Αβ Antibodies and Their Use." 0 termo "fragmento" refere-se a uma parte ou porção de um anticorpo ou cadeia de anticorpo que compreende menos resíduos de aminoácido do que um anticorpo ou cadeia de anticorpo intactos ou completos. Fragmentos podem ser obtidos por intermédio de tratamento químico ou enzimático de um anticorpo ou cadeia de anticorpo intactos ou completos. Fragmentos também podem ser obtidos por meios recombinantes. Os fragmentos exemplares incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2f Fabc e/ou Fv. 0 termo "fragmento de ligação a antigénio" refere-se a um fragmento de polipéptido de uma imunoglobulina ou anticorpo que se liga a antigénio ou compete com o anticorpo intacto a partir do qual eles foram derivados para ligação a antigénio específica. 0 termo "conformação" refere-se à estrutura terciária de uma proteína ou polipéptido, tal como, por exemplo, um anticorpo, cadeia de anticorpo, domínio ou região dos mesmos. Por exemplo, a frase "conformação de cadeia leve (ou pesada)" refere-se à estrutura terciária de uma região variável de cadeia leve (ou pesada) e as frases "conformação de anticorpo" ou "conformação de fragmento de anticorpo" referem-se á estrutura terciária de um anticorpo 22 ou fragmento deste. 0 termo "ligação específica" de um anticorpo significa que o anticorpo exibe afinidade apreciável quanto a um antigénio ou epítopo particulares e, no geral, não exibe reactividade cruzada significativa. Em formas de realização exemplares, o anticorpo não exibe nenhuma reactividade cruzada (por exemplo, não reage cruzado com péptidos não Αβ ou com epitopos remotos ou distantes em Αβ). A ligação "apreciável" ou preferida inclui ligação com uma afinidade de pelo menos 10”6, 10”7, 10”8, 10”9 M ou 1CT10 M. As afinidades maiores do que 10”7 M, preferivelmente maiores do que 1CT8 M são mais preferidas. Os valores intermediários daqueles apresentados no presente documento também são intencionados a estar dentro do âmbito da presente invenção e uma afinidade de ligação preferida pode ser indicada como um intervalo de afinidades, por exemplo, de 1CT6 a IO-10 M, preferivelmente de IO”7 a 1CT10 M, mais preferivelmente de 10”8 a IO”10 M. Um anticorpo que "não exibe reactividade cruzada significativa" é um que não ligará apreciavelmente a uma entidade indesejável (por exemplo, uma proteína, polipéptido ou péptido indesejável). Por exemplo, um anticorpo que se liga especificamente a Αβ apreciavelmente ligará Αβ, mas não reagirá significantemente com proteínas ou péptidos não Αβ (por exemplo, proteínas ou péptidos não Αβ incluídos nas placas). Um anticorpo específico para um epítopo particular, por exemplo, não reagirá cruzado significantemente com epitopos remotos ou diferentes na mesma proteína ou péptido. A ligação específica pode ser determinada de acordo com quaisquer meios reconhecidos na técnica para a determinação de tal ligação. Preferivelmente, a ligação específica é determinada de acordo com a análise de Scatchard e/ou ensaios de ligação competitivos.
Os fragmentos de ligação são produzidos pelas técnicas 23 de ADN recombinantes ou pela clivagem enzimática ou química de imunoglobulinas intactas. Os fragmentos de ligação incluem Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, Fv, cadeias únicas e anticorpos de cadeia única. Além de imunoglobulinas ou anticorpos "biespecíficos" ou "bifuncionais", uma imunoglobulina ou anticorpo são entendidos ter cada um de seus locais de ligação idênticos. Um anticorpo "biespecífico" ou "bifuncional" é um anticorpo híbrido artificial tendo dois pares de cadeia pesada/leve diferentes e dois locais de ligação diferentes. Os anticorpos biespecíficos podem ser produzidos por uma variedade de métodos que incluem a fusão de hibridomas ou a ligação de fragmentos Fab'. Veja-se, por exemplo, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992).
Um "antigénio" é uma molécula (por exemplo, uma proteína, polipéptido, péptido, carboidrato ou molécula pequena) contendo um determinante antigénico ao qual um anticorpo se liga especificamente. 0 termo "epítopo" ou "determinante antigénico" refere-se a um local num antigénio ao qual uma imunoglobulina ou anticorpo (ou fragmento de ligação a antigénio deste) especificamente se liga. Epítopos podem ser formados tanto a partir de aminoácidos contíguos ou aminoácidos não contíguos justapostos pela dobra terciária de uma proteína. Os epítopos formados a partir de aminoácidos contíguos são tipicamente retidos na exposição aos solventes desnaturantes, ao passo que os epítopos formados pelas dobras terciárias são tipicamente perdidos no tratamento com solventes desnaturantes. Um epítopo tipicamente inclui pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 aminoácidos numa única conformação espacial. Os métodos de determinar a conformação espacial de epítopos incluem, por exemplo, a cristalografia de raio X e ressonância magnética nuclear bidimensional. Veja-se, por exemplo, Epitope
Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996). 0 termo "formulação estabilizada" ou "formulação de polipéptido liquida estabilizada" inclui formulações em que o polipéptido nesta essencialmente retém a sua identidade fisica e química e a integridade no armazenamento. Várias técnicas analíticas para medir a estabilidade da proteína são disponíveis na técnica e são descritas no presente documento (revisadas em, Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, N.Y., Pubs. (1991) e Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29- 90 (1993)). A estabilidade pode ser medida numa temperatura seleccionada durante um período de tempo seleccionado. Para o teste rápido, a formulação pode ser mantida numa temperatura mais alta ou "acelerada", por exemplo, 40 °C por 2 semanas a 1 mês ou mais tempo no qual a estabilidade é medida. Em formas de realização exemplares, a formulação é refractária à formação de subprodutos do polipéptido componente, por exemplo, produtos de agregação de peso molecular alto, produtos de degradação ou fragmentação de peso molecular baixo ou misturas dos mesmos. O termo "estabilidade" refere-se ao comprimento de tempo em que uma espécie molecular tal como um anticorpo retém a sua identidade química original, por exemplo, estrutura primária, secundária, e/ou terciária. O termo "subproduto" inclui produtos indesejados, que reduz ou diminui a proporção de polipéptido terapêutico numa dada formulação. Os subprodutos típicos incluem agregados do polipéptido terapêutico, fragmentos do polipéptido terapêutico (por exemplo, produzido pela degradação do polipéptido pela desamidação ou hidrólise) ou misturas dos mesmos. O termo "agregados de polipéptido de peso molecular alto" inclui agregados do polipéptido terapêutico, fragmentos do polipéptido terapêutica (por exemplo, 25 produzidos pela degradação do polipéptido, por exemplo, pela hidrólise) ou misturas dos mesmos, que depois se agregam. Tipicamente, os agregados de peso molecular alto são complexos que têm um peso molecular que é maior do que o polipéptido monomérico terapêutico. No caso de um anticorpo, por exemplo, um anticorpo IgG, tais agregados são maiores do que cerca de 150 kD. Entretanto, no caso de outros polipéptidos terapêuticos, por exemplo, anticorpos de cadeia única, que tipicamente têm um peso molecular de 25 kD, tais agregados teriam um peso molecular maior do que cerca de 25 kD. O termo "agregados de produto de degradação de polipéptido de peso molecular baixo" inclui, por exemplo, fragmentos do polipéptido terapêutico, por exemplo, realizados pela desamidação ou hidrólise. Tipicamente, os produtos de degradação de peso molecular baixo são complexos que têm um peso molecular que é menor do que o polipéptido monomérico terapêutico. No caso de um anticorpo, por exemplo, um anticorpo IgG, tais produtos de degradação são menores do que cerca de 150 kD. Entretanto, no caso de outros polipéptidos terapêuticos, por exemplo, anticorpos de cadeia única, que tipicamente têm um peso molecular de 25 kD, tais agregados teriam um peso molecular menor do que cerca de 25 kD. O termo "via de administração" inclui as vias de administração reconhecidas na técnica para a libertação de um polipéptido terapêutico tal como, por exemplo, parentérica, intravenosa, intramuscular, subcutânea, intracraniana ou epiduralmente. Para a administração de um polipéptido terapêutico para o tratamento de uma doença neurodegenerativa, as vias intravenosa, epidural ou intracraniana, podem ser desejadas. O termo "tratamento" como é usado no presente documento, é definido como a aplicação ou administração de um agente terapêutico a um paciente ou a aplicação ou 26 administração de um agente terapêutico a um tecido ou linhagem de célula isolados de um paciente, que tem uma doença, um sintoma de doença ou uma predisposição para uma doença, com o propósito de curar, sarar, aliviar, retardar, mitigar, alterar, remediar, melhorar, restabelecer ou afectar a doença, o sintoma da doença ou a predisposição para a doença.
Os termos "dose eficaz" ou "dosagem eficaz" são definidos como uma quantidade suficiente para se obter ou pelo menos parcialmente obter o efeito desejado. 0 termo "dose terapeuticamente eficaz" é definido como uma quantidade suficiente para curar ou pelo menos parcialmente deter a doença e suas complicações num paciente que já sofre da doença. As quantidades eficazes para esta utilização dependerão da gravidade da infecção e do estado geral do sistema imune do próprio paciente. 0 termo "paciente" inclui o ser humano e outros indivíduos mamíferos que recebem tratamento profiláctico ou terapêutico. 0 termo "forma farmacêutica unitária" (ou "forma unitária farmacêutica") como é usado no presente documento refere-se a uma unidade fisicamente separada adequada como dosagens unitárias para o paciente a ser tratado, cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de composto activo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o transportador, diluente ou excipiente farmacêuticos requeridos. A especificação para as formas de dosagem unitárias da invenção são ditadas pelas e directamente dependentes das características únicas do composto activo e o efeito terapêutico particular a ser obtido e as limitações inerentes na técnica de combinar um tal composto activo para o tratamento de pacientes.
Os níveis de dosagem reais do ingrediente activo (por exemplo, polipéptidos Αβ) nas formulações da presente invenção podem ser variados de modo a ser obtida uma 27 quantidade do ingrediente activo que seja eficaz para ser obtida a resposta terapêutica desejada para um paciente particular, composição e modo de administração, sem ser tóxica para o paciente. 0 nível de dosagem seleccionado dependerá de uma variedade de factores farmacocinéticos que inclui a actividade das composições particulares da presente invenção utilizada, da via de administração, do tempo de administração, da taxa de excreção do composto particular que é utilizado, da duração do tratamento, outros medicamentos, compostos e/ou materiais usados em combinação com as composições particulares utilizadas, a idade, sexo, peso, condição, saúde geral e história médica anterior do paciente que é tratado e factores semelhantes bem conhecidos nas especialidades médicas. 0 termo "diluente" como é usado no presente documento refere-se a uma solução adequada para alterar ou obter uma concentração ou concentrações exemplares ou apropriadas como é descrito no presente documento.
VISÃO GERAL A presente invenção proporciona formulações para polipéptidos de ligação Αβ, em particular, anticorpos anti-Αβ, assim como porções e/ou fragmentos dos mesmos. Em certos aspectos, a invenção proporciona formulações de polipéptido líquidas estabilizadas para utilização terapêutica. Em particular, a invenção proporciona a estabilização de polipéptidos de ligação Αβ, por exemplo, anticorpos e fragmentos de ligação a antigénio dos mesmos, par o utilização no tratamento de doenças e/ou distúrbios amiloidogénicos. Em particular, a invenção proporciona formulações que são estabilizadas tal que o polipéptido terapêutico activo seja estável num período prolongado de tempo e pode ser administrado através de uma variedade de vias de administração. Isto é especialmente crítico para aqueles polipéptidos de ligação de Αβ (por exemplo, anticorpos) destinados para utilização no tratamento de 28 doenças e/ou distúrbios amiloidogénicos. Em outros aspectos, a invenção proporciona uma formulação de anticorpo unicamente estável que, por exemplo, é estável a vários stresses tais como congelamento, liofilização, calor e/ou reconstituição. Além disso, as formulações exemplares da presente invenção são capazes de manter a estabilidade, actividade biológica, pureza e qualidade do anticorpo num período prolongado de tempo (por exemplo, um ano ou mais tempo durante o qual a formulação é armazenada) e ainda em temperaturas desfavoráveis. Além disso, as formulações exemplares da presente invenção são adequadas para a administração a um indivíduo ou paciente (por exemplo, administração intravenosa a um indivíduo ou paciente), por exemplo, um ser humano tendo ou prognosticado ter uma doença ou distúrbio amiloidogénicos.
FORMULAÇÕES
Num aspecto, a presente invenção proporciona uma formulação estabilizada que inclui um polipéptido de ligação de Αβ, um agente de tonicidade, onde o agente de tonicidade está presente numa quantidade suficiente para tornar a formulação estabilizada adequada para a infusão intravenosa e um aminoácido ou derivado do mesmo, onde o aminoácido ou derivado do mesmo está presente numa quantidade suficiente para manter um pH fisiologicamente adequado. A presente invenção proporciona uma formulação estabilizada que inclui um anticorpo anti-Αβ, manitol e histidina. A presente invenção proporciona uma formulação estabilizada que inclui um polipéptido de ligação de Αβ, um agente de tonicidade, em que o agente de tonicidade está presente numa quantidade suficiente para tornar a formulação adequada para a infusão intravenosa e um aminoácido ou derivado do mesmo, onde o aminoácido ou derivado do mesmo está presente numa quantidade suficiente para manter um pH fisiologicamente adequado. 0 agente de 29 tonicidade é manitol. 0 aminoácido é histidina.
Num outro aspecto, a presente invenção proporciona uma formulação estabilizada que inclui um polipéptido de ligação de Αβ. Os polipéptidos de ligação de Αβ adequados para a estabilização numa formulação da invenção incluem anticorpos e fragmentos dos mesmos e em particular, anticorpos capazes de ligação a um alvo terapêutico envolvido na doença ou distúrbio amiloidogénicos. Consequentemente, os polipéptidos terapêuticos são estabilizados para evitar a formação de subprodutos, tipicamente agregados de peso molecular alto, fragmentos de degradação de peso molecular baixo ou uma mistura dos mesmos, pela adição de um antioxidante numa quantidade suficiente de modo a inibir a formação de tais subprodutos. Os agentes antioxidantes incluem metionina e análogos desta, em concentrações suficientes para se obter a inibição desejada de subprodutos indesejados como debatido a seguir. Opcionalmente, as formulações de polipéptido estabilizadas compreendem ainda um agente de tonicidade, onde o agente de tonicidade está presente numa quantidade suficiente para tornar a formulação estabilizada adequada para diversas vias diferentes de administração, por exemplo, infusão intravenosa e um aminoácido ou derivado do mesmo, onde o aminoácido ou derivado do mesmo está presente numa quantidade suficiente para manter um pH fisiologicamente adequado. A presente invenção proporciona uma formulação estabilizada que inclui um anticorpo anti-Αβ, metionina, manitol e histidina. A presente invenção proporciona uma formulação liquida estabilizada que inclui um polipéptido de ligação de Αβ terapeuticamente activo, em que o polipéptido é capaz de formação de subproduto durante o armazenamento e um antioxidante, onde o antioxidante está presente numa quantidade suficiente para reduzir a formação de subproduto durante o armazenamento da formulação. 0 antioxidante é 30 metionina ou um análogo da mesma. O polipéptido de ligação de Αβ é seleccionado a partir do grupo que consiste num anticorpo, um fragmento de anticorpo Fv, um fragmento de anticorpo Fab, um fragmento de anticorpo Fab' (2), um fragmento de anticorpo Fd, um anticorpo de cadeia única (scFv), um fragmento de anticorpo de domínio único (Dab), um polipéptido de folha sanfonada beta que inclui pelo menos uma região de determinação de complementaridade (CDR) de anticorpo e um polipéptido não globular que inclui pelo menos uma região de determinação de complementaridade de anticorpo. O polipéptido de ligação de Αβ pode estar presente desde cerca de 0,1 mg/ml até cerca de 60 mg/ml. As formulações da presente invenção incluem polipéptido de ligação de Αβ a cerca de 30 mg/ml. Além disso, as formulações da presente invenção incluem polipéptido de ligação de Αβ a cerca de 20 mg/ml. As formulações da invenção podem incluir polipéptido de ligação de Αβ a cerca de 17 mg/ml. O polipéptido de ligação de Αβ é um anticorpo anti-Αβ. 0 anticorpo anti-Αβ pode ser seleccionado a partir do grupo que consiste num anticorpo 3D6 humanizado, um anticorpo 10D5 humanizado, um anticorpo 12B4 humanizado, um anticorpo 266 humanizado, um anticorpo 12A11 humanizado e um anticorpo 15C11 humanizado. O anticorpo anti-Αβ liga-se a um epítopo que inclui resíduos de aminoácido Αβ seleccionados a partir do grupo que consiste em 1-7, 1-5, 3-7, 3-6, 13-28, 16-21, 19-22, 33-40, e 33-42. 0 anticorpo anti-Αβ é de um subtipo seleccionado a partir do grupo que consiste em IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4 humanos. O anticorpo anti-Αβ é de um subtipo IgGl humano. 0 polipéptido Αβ pode ser capaz de formar um subproduto seleccionado a partir do grupo que consiste num agregado de polipéptido de peso molecular alto, um produto de degradação de agregado de polipéptido de peso molecular baixo e combinações dos mesmos. Os agregados de peso 31 molecular alto podem incluir complexos de anticorpo:anticorpo, complexos de anticorpo: fragmento de anticorpo, complexos de fragmento de anticorpo:fragmento de anticorpo e combinações dos mesmos. Os produtos de degradação de agregados de polipéptido de peso molecular baixo podem incluir uma cadeia leve de anticorpo, uma cadeia pesada de anticorpo, um complexo de cadeia leve e cadeia pesada de anticorpo, um fragmento de anticorpo e combinações dos mesmos.
Uma formulação liquida de acordo com a presente invenção inclui um anticorpo anti-Αβ, manitol e histidina. 0 anticorpo anti-Αβ é um anticorpo 3D6. 0 anticorpo anti-Αβ liga-se a um epítopo que inclui resíduos de aminoácido Αβ seleccionados a partir do grupo que consiste em 1-7, 1-5, 3-7, 3-6, 13-28, 16-21, 19-22, 33-40 e 33-42. O anticorpo é de um subtipo IgGl. O anticorpo anti-Αβ pode estar presente desde cerca de 0,1 mg/ml até cerca de 200 mg/ml. O anticorpo anti-Αβ está presente em cerca de 20 mg/ml.
As formulações da presente invenção incluem manitol numa quantidade suficiente para manter a isotonicidade da formulação. O manitol pode estar presente desde cerca de 2% p/v até cerca de 10% p/v, por exemplo, em cerca de 4% p/v, ou em cerca de 6% p/v, ou em cerca de 10% p/v.
As formulações da presente invenção incluem histidina numa quantidade suficiente para manter um pH fisiologicamente adequado. A histidina pode estar presente desde cerca de 0,1 mM até cerca de 25 mM, por exemplo, em cerca de 10 mM.
As formulações da presente invenção incluem succinato desde cerca de 0,1 mM até cerca de 25 mM, por exemplo, em cerca de 10 mM.
As formulações da presente invenção incluem ainda um antioxidante. O antioxidante é metionina ou um análogo da mesma. A metionina ou análogo está presente em cerca de 0,1 32 mM a cerca de 25 mM, por exemplo, em cerca de 10 mM. A formulação inclui ainda um estabilizante. O dito estabilizante é polissorbato 80. O polissorbato 80 pode estar presente desde cerca de 0,001% p/v até cerca de 0,01% p/v. Em outras formas de realização, o polissorbato 80 está presente em cerca de 0,005% p/v. Ainda em outras formas de realização da presente invenção, o polissorbato 80 está presente em cerca de 0,01% p/v. A formulação tem um pH de cerca de 5 a cerca de 7, por exemplo, de cerca de 5,5, de cerca de 6,0, de cerca de 6,2, ou de cerca de 6,5. A formulação pode ser estável ao congelamento. A formulação pode ser adequada para a administração intravenosa. A formulação pode ser adequada para a administração intramuscular ou subcutânea. A formulação pode ser adequada para a libertação ao cérebro de um indivíduo. A formulação pode ser adequada para a libertação ao fluido espinal de um indivíduo. A formulação pode ser substancialmente isenta de conservantes. A formulação é estável durante pelo menos cerca de 12 meses. A formulação é estável durante pelo menos cerca de 18 meses. A formulação é estável durante pelo menos cerca de 24 meses. A formulação é estável durante pelo menos cerca de 30 meses. A formulação é estável desde cerca de -80 °C até cerca de 40 °C. A formulação é estável desde cerca de 0 °C até cerca de 25 °C. Preferivelmente, a formulação é estável desde cerca de 2 °C até cerca de 8 °C. A formulação adequada para a administração intravenosa inclui cerca de 20 mg/ml de anticorpo anti-Αβ, cerca de 10 mM de L-histidina, cerca de 10 mM de metionina, cerca de 4% de manitol e tem um pH de cerca de 6. Uma formulação adequada para a administração intravenosa inclui cerca de 30 mg/ml de anticorpo anti-Αβ, cerca de 10 mM de L- 33 histidina, cerca de 10 mM de metionina, cerca de 6% de manitol e tem um pH de cerca de 6,2. Uma formulação preferida adequada para a administração intravenosa inclui cerca de 20 mg/ml de anticorpo anti-Αβ, cerca de 10 mM de L-histidina, cerca de 10 mM de metionina, cerca de 4% de manitol, cerca de 0,005% de polissorbato 80 e tem um pH de cerca de 6. Uma formulação adequada para a administração intravenosa inclui cerca de 10 mg/ml de anticorpo anti-Αβ, cerca de 10 mM de L-histidina, cerca de 10 mM de metionina, cerca de 10% de manitol, cerca de 0,005% de polissorbato 80 e tem um pH de cerca de 6,5.
Em algumas formas de realização das formulações precedentes de acordo com a presente invenção, o anticorpo anti-Αβ é seleccionado a partir do grupo que consiste num anticorpo 3D6 humanizado, um anticorpo 10D5 humanizado, um anticorpo 12B4 humanizado, um anticorpo 266 humanizado, um anticorpo 12A11 humanizado e um anticorpo 15C11 humanizado. 0 anticorpo anti-Αβ liga-se a um epitopo dentro dos residuos de aminoácido seleccionados a partir do grupo que consiste em 1 -7, 1-5, 3-7, 3-6, 13-28, 16-21, 19-22, 33-40 e 33-42 de Αβ. Em algumas formulações, o anticorpo anti-Αβ liga-se a um epitopo descontinuo que inclui residuos dentro de 1-7 dentro de 13-28 de Αβ. Em algumas tais formulações, o anticorpo é um anticorpo biespecífico ou um anticorpo fabricado pelo processo descrito na Publicação de Patente Internacional N° WO 03/070760. Em algumas tais formulações, o epitopo é um epitopo descontinuo.
Num outro aspecto da presente invenção, uma forma farmacêutica unitária inclui uma quantidade eficaz da formulação de qualquer uma das formas de realização precedentes para tratar doença num paciente por intermédio da administração da forma de dosagem ao paciente. Numa forma de realização exemplar, a forma farmacêutica unitária é um recipiente contendo uma formulação de acordo com a presente invenção. O recipiente pode ser um frasco que 34 contém de cerca de 1 mg a cerca de 2000 mg do polipéptido de ligação de Αβ. O frasco pode conter de cerca de 50 mg a cerca de 1500 mg do polipéptido de ligação de Αβ. O frasco pode conter de cerca de 5 mg a cerca de 50 mg do polipéptido de ligação de Αβ. O frasco pode ter um volume de cerca de 2 a cerca de 100 ml. O frasco pode ter um volume de cerca de 2 a cerca de 10 ml.
Em algumas formas de realização, uma forma farmacêutica unitária de acordo com a presente invenção é adequada para a infusão intravenosa a um paciente.
Também são descritos no presente documento kits que incluem uma forma farmacêutica unitária, como é descrita no presente documento e instruções para utilização. Numa forma de realização da presente invenção, um recipiente que inclui a forma farmacêutica unitária é um recipiente rotulado para utilização. O recipiente pode ser rotulado para utilização profiláctica. O recipiente pode ser rotulado para utilização terapêutica. A presente invenção proporciona um método para aumentar a estabilidade de um polipéptido de ligação de Αβ numa formulação farmacêutica líquida, onde o polipéptido exibe a formação de subproduto durante o armazenamento numa formulação líquida, cujo método inclui incorporar na formulação um antioxidante numa quantidade suficiente para reduzir a quantidade de formação de subproduto do polipéptido. O componente de polipéptido de ligação de Αβ é seleccionado a partir do grupo que consiste num anticorpo, um fragmento de anticorpo Fv, um fragmento de anticorpo Fab, um fragmento de anticorpo Fab'(2), um fragmento de anticorpo Fd, um anticorpo de cadeia única (scFv), um fragmento de anticorpo de domínio único (Dab), um polipéptido de folha sanfonada beta que inclui pelo menos uma região de determinação de complementaridade (CDR) de anticorpo e um polipéptido não globular que inclui pelo 35 menos uma região de determinação de complementaridade de anticorpo. 0 subproduto é seleccionado a partir do grupo que consiste num agregado de polipéptido de peso molecular alto, um produto de degradação de agregados de polipéptido de peso molecular baixo e combinações dos mesmos. 0 antioxidante é seleccionado a partir do grupo que consiste em metionina e um análogo da mesma.
Um método para preparar uma formulação de acordo com qualquer uma das formas de realização precedentes da presente invenção inclui combinar os excipientes da formulação. Um método para preparar a formulação de acordo com qualquer uma das formas de realização precedentes inclui combinar o polipéptido de ligação de Αβ com um ou mais diluentes, onde o um ou mais diluentes incluem os excipientes da formulação.
Um método para preparar uma forma farmacêutica unitária inclui combinar a formulação de qualquer uma das formas de realização precedentes num recipiente adequado. Um método para preparar a formulação de qualquer uma das formas de realização precedentes inclui combinar uma solução que inclui o polipéptido de ligação de Αβ e pelo menos uma porção dos excipientes da formulação com um diluente que inclui o resto dos excipientes.
Polipéptidos para utilização nas Formulações Estabilizadas da Invenção 0 polipéptido a ser formulado de acordo com a invenção como é descrita no presente documento é preparado usando técnicas que são bem estabelecidas no ramo e incluem, por exemplo, técnicas sintéticas (tais como técnicas recombinantes e síntese de péptido ou uma combinação destas técnicas) ou pode ser isolado de uma fonte endógena do polipéptido. As técnicas para a produção de anticorpos, são descritas a seguir.
Anticorpos Policlonais
Os anticorpos policlonais podem ser preparados pela 36 imunização de um paciente adequado com um imunógeno. A titulação de anticorpo no paciente imunizado pode ser monitorizada ao longo do tempo pelas técnicas padrão, tal como com um ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA) usando o antigénio alvo imobilizado. Se for desejado, as moléculas de anticorpo direcionadas contra o antigénio alvo podem ser isoladas dos mamíferos (por exemplo, do sangue) e ainda purificadas por meio de técnicas bem conhecidas, tais como a cromatografia em proteína A Sepharose para se obter o anticorpo, por exemplo, IgG, fracção. Num tempo apropriado depois da imunização, por exemplo, quando as titulações de anticorpo anti-antigénio são mais altas, as células que produzem o anticorpo podem ser obtidas do paciente e usadas para preparar anticorpos monoclonais pelas técnicas padrão, tal como a técnica de hibridoma descrita originalmente por Kohler e Milstein (1975) Nature 256: 495-497) (veja-se também, Brown et al (1981) J. Immunol. 127: 539-46; Brown et al (1980) J. Biol. Chem 255: 4980-83; Yeh et al (1976) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76: 2927-31; e Yeh et al (1982) Int. J. Câncer 29: 269-75). Para a preparação de anticorpos policlonais quiméricos, veja-se Buechler et al. Patente US 6.420.113.
Anticorpos monoclonais
Qualquer um dos muitos protocolos bem conhecidos usados para fundir linfócitos e linhas de células imortalizadas podem ser aplicados com o propósito de gerar um anticorpo monoclonal (veja-se, por exemplo, G. Galfre et al. (1977) Nature 266: 55052; Gefter et al. Somatic Cell Genet., citado acima; Lerner, Yale J. Biol. Med., citado acima; Kenneth, Monoclonais Antibody, citado acima). Além disso, o perito ordinariamente habilitado avaliará que existem muitas variações de tais métodos que também seriam úteis. Tipicamente, a linha de células imortalizadas (por exemplo, uma linha de células de mieloma) é derivada da mesma espécie de mamífero como os linfócitos. Por exemplo, 37 hibridomas de murino podem ser fabricados pela fusão de linfócitos de um ratinho imunizado com uma preparação imunogénica da presente invenção com uma linha de células de ratinho imortalizadas. As linhas de células imortalizadas preferidas são as linhas de células de mieloma de ratinho que sejam sensíveis ao meio de cultura contendo hipoxantina, aminopterina e timidina ("meio HAT"). Qualquer uma de várias linhas de células de mieloma pode ser usada como um parceiro de fusão de acordo com técnicas padrão, por exemplo, as linhas de mieloma P3-NSl/l-Ag4-l, P3-x63-Ag8.653 ou Sp2/0-Agl4. Estas linhas de mieloma são disponíveis da ATCC. Tipicamente, as células de mieloma de ratinho sensíveis a HAT são fundidas aos esplenócitos de ratinho usando polietileno glicol ("PEG"). As células de hibridoma que resultam da fusão são depois seleccionadas usando meio HAT, que mata células de mieloma não fundidas e não produtivamente fundidas (os esplenócitos não fundidos morrem depois de vários dias porque eles não são transformados). As células de hibridoma que produzem um anticorpo monoclonal da invenção são detectadas pelo rastreio dos sobrenadantes da cultura de hibridoma quanto aos anticorpos que se ligam a um antigénio alvo, por exemplo, Αβ, usando um ensaio de ELISA padrão.
Anticorpos Recombinantes A alternativa para preparar hibridomas que segregam anticorpo monoclonal, um anticorpo monoclonal pode ser identificado e isolado pelo rastreio de uma biblioteca de imunoglobulina combinatória recombinante (por exemplo, uma biblioteca de apresentação de fago de anticorpo) com um antigénio alvo para isolar deste modo os membros da biblioteca de imunoglobulina que se ligam ao antigénio alvo. Os kits para gerar e triar bibliotecas de demonstração de fago são comercialmente disponíveis (por exemplo, o Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, N° de Catálogo 27-9400-01; e o Stratagene SurfZAP® Phage 38
Display Kit, N° de Catálogo 240612). Adicionalmente, exemplos de métodos e reagentes particularmente acessíveis para utilização na geração e triagem de biblioteca de demonstração de anticorpo podem ser encontrados, por exemplo, em Ladner et al Patente US 5.223.409; Kang et al. Publicação Internacional PCT N° WO 92/18619; Dower et al. Publicação Internacional PCT N° WO 91/17271; Winter et al. Publicação Internacional PCT WO 92/20791; Markland et al. Publicação Internacional PCT N° WO 92/15679; Breitling et al Publicação Internacional PCT WO 93/01288; McCafferty et al. Publicação Internacional PCT N° WO 92/01047; Garrard et al Publicação Internacional PCT N° WO 92/09690; Ladner et al Publicação Internacional PCT N° WO 90/02809; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9: 1370-1372; Hay et al (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3: 81-85; Huse et al (1989) Science 246: 1275-1281; Griffiths et al (1993) EMBO J 12: 725-734; Hawkins et al (1992) J. Mol. Biol. 226: 889-896; Clarkson et al (1991) Nature 352: 624-628; Gram et al (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 3576-3580; Garrad et al (1991) Bio/Technology 9: 1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc. Acid Res. 19: 4133-4137; Barbas et al (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 7978-7982; e McCafferty et al Nature (1990) 348: 552-554.
Anticorpos Quiméricos e Humanizados
Adicionalmente, anticorpos recombinantes, tais como anticorpos monoclonais quiméricos e humanizados, que compreendem porções tanto humanas quanto não humanas, que podem ser fabricadas usando técnicas de ADN recombinantes padrão, são descritos. O termo "imunoglobulina humanizada" ou "anticorpo humanizado" refere-se a uma imunoglobulina ou anticorpo que inclui pelo menos uma cadeia de imunoglobulina ou anticorpo humanizada (isto é, pelo menos uma cadeia leve ou pesada humanizada). O termo "cadeia de imunoglobulina humanizada" ou "cadeia de anticorpo humanizada" (isto é, uma "cadeia 39 leve de imunoglobulina humanizada" ou "cadeia pesada de imunoglobulina humanizada") refere-se a uma cadeia de imunoglobulina ou anticorpo (isto é, uma cadeia leve ou pesada, respectivamente) que tem uma região variável que inclui uma região de matriz variável substancialmente de uma imunoglobulina ou anticorpo humanos e regiões de determinação de complementaridade (CDRs) (por exemplo, pelo menos uma CDR, preferivelmente duas CDRs, mais preferivelmente três CDRs) substancialmente de uma imunoglobulina ou anticorpo não humanos e inclui ainda regiões constantes (por exemplo, pelo menos uma região constante ou porção da mesma, no caso de uma cadeia leve e três regiões constantes no caso de uma cadeia pesada). 0 termo "região variável humanizada" (por exemplo, "regiões variáveis de cadeia leve humanizadas" ou "regiões variáveis de cadeia pesada humanizadas") refere-se a uma região variável que inclui uma região de matriz variável substancialmente de uma imunoglobulina ou anticorpo humanos e regiões de determinação de complementaridade (CDRs) substancialmente de uma imunoglobulina ou anticorpo não humanos. A frase "substancialmente de uma imunoglobulina ou anticorpo humanos" ou "substancialmente humano" significa que, quando alinhados a uma imunoglobulina ou sequência de amino de anticorpo humanas com propósitos de comparação, a região compartilha pelo menos 80-90%, 90-95% ou 95-99% de identidade (isto é, identidade de sequência local) com a matriz humana ou sequência de região constante, possibilitando, por exemplo, substituições conservativas, substituições de sequência de consenso, substituições da linha germinativa, retromutações e semelhantes. A introdução de substituições conservativas, substituições de sequência de consenso, substituições da linha germinativa, retromutações e semelhantes, é frequentemente referida como "otimização" de um anticorpo ou cadeia humanizados. A frase 40 "substancialmente de uma imunoglobulina ou anticorpo não humanos" ou "substancialmente não humano" significa que tem uma sequência de imunoglobulina ou anticorpo pelo menos 80-95%, preferivelmente pelo menos 90-95%, mais preferivelmente, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica àquela de um organismo não humano, por exemplo, um mamífero não humano.
Consequentemente, todas as regiões ou resíduos de uma imunoglobulina ou anticorpo humanizados ou de uma cadeia de imunoglobulina ou anticorpo humanizados, exceto as CDRs, são substancialmente idênticas às regiões ou resíduos correspondentes de uma ou mais sequências de imunoglobulina humanas nativas. Os termos "região correspondente" ou "resíduo correspondente" referem-se a uma região ou resíduo numa segunda sequência de aminoácido ou nucleótido que ocupam a mesma posição (isto é, equivalente) como uma região ou resíduo numa primeira sequência de aminoácido ou nucleótido, quando as sequências primeira e segunda são otimamente alinhadas com propósitos de comparação. O termo "identidade significativa" significa que duas sequências de polipéptido, quando otimamente alinhadas, tal como pelos programas GAP ou BESTFIT usando pesos de intervalo padrão, compartilham pelo menos 50-60% de identidade de sequência, preferivelmente pelo menos 60-70% de identidade de sequência, mais preferivelmente pelo menos 70-80% de identidade de sequência, mais preferivelmente pelo menos 80-90% de identidade de sequência, ainda mais preferivelmente pelo menos 90-95% de identidade de sequência e ainda mais preferivelmente pelo menos 95% de identidade de sequência ou mais (por exemplo, 99% de identidade de sequência ou mais). O termo "identidade substancial" significa que duas sequências de polipéptido, quando são otimamente alinhadas, tal como pelos programas GAP ou BESTFIT usando pesos de intervalo padrão, compartilham pelo menos 80-90% de identidade de sequência, preferivelmente pelo menos 90-95% de identidade de 41 sequência e mais preferivelmente pelo menos 95% de identidade de sequência ou mais (por exemplo, 99% de identidade de sequência ou mais). Para a comparação de sequência, tipicamente uma sequência atua como uma sequência de referência, à qual as sequências de teste são comparadas. Quando da utilização de um algoritmo de comparação de sequência, as sequências de teste e referência são introduzidas num computador, as coordenadas de subsequência são designadas, se necessário e os parâmetros de programa de algoritmo de sequência são designados. 0 algoritmo de comparação de sequência então calcula a identidade de sequência percentual para a(s) sequência(s) de teste em relação à sequência de referência, com base nos parâmetros de programa designados. 0 alinhamento ótimo de sequências para comparação pode ser conduzido, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento por homologia de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), pelo método de procura quanto a similaridade de Pearson & Lipman, Proc. Nat'1. Acad. Sei. USA 85: 2444 (1988), pelas implementações computadorizadas dos mesmos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) ou pela inspeção visual (veja-se no geral Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology). Um exemplo de algoritmo que é adequado para a determinação da identidade de sequência e da similaridade de sequência percentuais é o algoritmo BLAST, que é descrito em Altschul et ai., J. Mol. Biol. 215: 403 (1990) . O software para realizar as análises de BLAST é publicamente disponível através da National Center for Biotechnology Information (publicamente acessível através do servidor da internet National Institutes of Health NCBI). Tipicamente, os parâmetros de programa padrão podem ser usados para realizar a comparação 42 de sequência, embora parâmetros feitos de encomenda também possam ser usados. Para as sequências de aminoácido, o programa BLASTP usa como padrão um comprimento de palavra (W) de 3, uma expectativa (E) de 10 e a matriz de pontuação BLOSUM62 (veja-se Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 10915 (1989)).
Preferivelmente, as posições de resíduo que não são idênticas diferem pelas substituições de aminoácido conservativas. Com o propósito de classificar as substituições de aminoácidos como conservativas ou não conservativas, os aminoácidos são agrupados como segue: Grupo I (cadeias laterais hidrofóbicas) : leu, met, ala, vai, leu, ile; Grupo II (cadeias laterais hidrofílicas neutras): cys, ser, thr; Grupo III (cadeias laterais ácidas): asp, glu; Grupo IV (cadeias laterais básicas): asn, gin, his, lys, arg; Grupo V (resíduos que influenciam a orientação da cadeia): gly, pro; e Grupo VI (cadeias laterais aromáticas): trp, tyr, phe. As substituições conservativas envolvem substituições entre aminoácidos na mesma classe. As substituições não conservativas constituem trocar um membro de uma destas classes por um membro de uma outra.
Preferivelmente, as imunoglobulinas ou anticorpos humanizados ligam antigénio com uma afinidade que está dentro de um factor de três, quatro ou cinco daquele do anticorpo não humanizado correspondente. Por exemplo, se o anticorpo não humanizado tem uma afinidade de ligação de 1CT9 M, os anticorpos humanizados terão uma afinidade de ligação de pelo menos 3 x IO”8 M, 4 x 10”8 M, 5 x 10”8 M ou 10”9 M. Quando da descrição das propriedades de ligação de uma cadeia de imunoglobulina ou anticorpo, a cadeia pode ser descrita com base na sua capacidade para a "ligação a antigénio directa (por exemplo, Αβ)". Uma cadeia é dita "ligar antigénio directamente" quando a mesma confere numa imunoglobulina ou anticorpo intactos (ou fragmento de 43 ligação a antigénio dos mesmos) uma propriedade de ligação especifica ou afinidade de ligação. Uma mutação (por exemplo, uma retromutação) é dita afectar substancialmente a capacidade de uma cadeia pesada ou leve para ligação a antigénio directa se a mesma afecta (por exemplo, diminui) a afinidade de ligação de uma imunoglobulina ou anticorpo intactos (ou fragmento de ligação a antigénio dos mesmos) gue compreendem a dita cadeia em pelo menos uma ordem de magnitude comparada com aquela do anticorpo (ou fragmento de ligação a antigénio deste) que compreende uma cadeia equivalente que não possui dita mutação. Uma mutação "não afecta substancialmente (por exemplo, diminui) a capacidade de uma cadeia para direcionar a ligação a antigénio" se a mesma afecta (por exemplo, diminui) a afinidade de ligação de uma imunoglobulina ou anticorpo intactos (ou fragmento de ligação a antigénio dos mesmos) que compreende a dita cadeia em apenas um factor de dois, três ou quatro daquela do anticorpo (ou fragmento de ligação a antigénio deste) que compreende uma cadeia equivalente que não possui dita mutação. 0 termo "imunoglobulina quimérica" ou anticorpo referem- se a uma imunoglobulina ou anticorpo cujas regiões variáveis derivam de uma primeira espécie e cujas regiões constantes derivam de uma segunda espécie. As imunoglobulinas ou anticorpos quiméricos podem ser construídos, por exemplo, por meio de engenharia genética, a partir de segmentos do gene da imunoglobulina pertencentes a espécies diferentes. Os termos "imunoglobulina humanizada" ou "anticorpo humanizado" não têm a intenção de abranger imunoglobulinas ou anticorpos quiméricos, como são definidos a seguir. Embora imunoglobulinas ou anticorpos humanizados sejam quiméricos em sua construção (isto é, compreende regiões de mais do que uma espécie de proteína), elas incluem características adicionais (isto é, regiões variáveis que compreendem 44 resíduos de CDR dadores e resíduos de matriz aceitadores) não encontrados em imunoglobulinas ou anticorpos quiméricos, como é definido no presente documento.
Tais anticorpos monoclonais quiméricos e humanizados podem ser produzidos pelas técnicas de ADN recombinantes conhecidas na especialidade, por exemplo, usando métodos descritos em Robinson et al. Pedido Internacional N° PCT/US86/02269; Akira, et al. Pedido de Patente Europeia 184.187; Taniguchi, M., Pedido de Patente Europeia 171.496; Morrison et al. Pedido de Patente Europeia 173.494; Neuberger et al. Publicação Internacional PCT N2 WO 86/01533; Cabilly et al. Patente US 4.816.567; Cabilly et al. Pedido de Patente Europeia 125.023; Better et al. (1988) Science 240: 1041-1043; Liu et al. (1987) Proc. Nat 1. Acad. Sei. USA 84: 3439.3443; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139: 3521-3526; Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84: 214218; Nishimura et al. (1987) Canc. Res. 47: 999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314: 446-449; e Shaw et al. (1988) J. Natl. Câncer Inst. 80: 1553-1559); Morrison, S. L. (1985) Science 229: 1202-1207; Oi et al. (1986) BioTechniques 4: 214; Winter Patente US 5.225.539; Jones et al. (1986) Nature 321: 552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239: 1534; e Beidler et al (1988) J. Immunol. 141: 4053-4060.
Anticorpos Humanos de Animais Transgénicos e Apresentação em Fago
Alternativamente, é agora possível produzir animais transgénicos (por exemplo, ratinhos) que são capazes, na imunização, de produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena. Por exemplo, foi descrito que a deleção homozigótica do gene da região de junção da cadeia pesada de anticorpo (JH) em ratinhos quiméricos e mutantes na linha germinativa resulta na inibição completa da produção de anticorpo endógeno. A transferência da série do 45 gene da imunoglobulina da linha germinativa humana em tais ratinhos mutantes na linha germinativa resulta na produção de anticorpos humanos na inoculação de antigénio. Veja-se, por exemplo, as Patentes US N° 6.150.584; 6.114.598; e 5.770.429 .
Os anticorpos totalmente humanos também podem ser derivados de bibliotecas de demonstração de fago (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al, J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)). Os anticorpos policlonais quiméricos também podem ser obtidos a partir de bibliotecas de demonstração de fago (Buechler et al. Patente US 6.420.113) .
Anticorpos Blespecíficos. Polipéptidos de Fusão de Anticorpo, e Anticorpos de Cadeia Única
Os anticorpos biespecificos (BsAbs) são anticorpos que têm especificidades de ligação a pelo menos dois epítopos diferentes. Tais anticorpos podem ser derivados de anticorpos de tamanho natural ou fragmentos de anticorpo (por exemplo, anticorpos biespecificos F(ab)'2). Os métodos para preparar anticorpos biespecificos são conhecidos na técnica. A produção tradicional de anticorpos biespecificos de tamanho natural está fundamentada na coexpressão de dois pares de cadeia pesada-leve de imunoglobulina, onde as duas cadeias têm especificidades diferentes (Millstein et al., Nature, 305: 537-539 (1983)). Por causa da selecção aleatória de cadeias pesadas e leves de imunoglobulina, estes hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de moléculas de anticorpo diferentes (veja-se, a WO 93/08829 e em Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991)) .
Os anticorpos biespecificos também incluem anticorpos reticulados ou "heteroconjugados". Por exemplo, um dos anticorpos no heteroconjugado pode ser ligado à avidina, o outro à biotina ou outra carga útil. Os anticorpos heteroconjugados podem ser fabricados usando quaisquer 46 métodos de reticulação convenientes. Os agentes de reticulação adequados são bem conhecidos na técnica e são divulgados na Pat. US N° 4.676.980, junto com várias técnicas de reticulação. O anticorpo pode ser fundido, quimicamente ou geneticamente, a uma carga útil tal como uma fracção reactiva, detectável ou funcional, por exemplo, uma imunotoxina para produzir um polipéptido de fusão de anticorpo. Tais cargas úteis incluem, por exemplo, imunotoxinas, produtos imunoterapêuticos e radioisótopos, todos os quais são bem conhecidos na técnica.
Os anticorpos de cadeia única também são adequados para a estabilização de acordo com a invenção. Os fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VL) com um ligante, que possibilite que cada região variável forme interface com uma outra e recrie a bolsa de ligação a antigénio do anticorpo precursor a partir da qual as regiões VL e VH são derivadas. Veja-se Gruber et al., J. Immunol., 152: 5368 (1994). É entendido que qualquer uma das moléculas de polipéptido precedentes, em separado ou em combinação, são adequadas para a preparação como formulações estabilizadas de acordo com a invenção.
Anticorpos An ti Αβ
No geral, as formulações da presente invenção incluem uma variedade de anticorpos para tratar doenças amiloidogénicas, em particular, a Doença de Alzheimer, pelo direccionamento do péptido Αβ.
Os termos "anticorpo Αβ", "anticorpo anti-Αβ" e "anti-Αβ" são usados no presente documento intercambiavelmente para se referir a um anticorpo que se liga a um ou mais epítopos ou determinantes antigénicos da proteína precursor de amilóide humana (APP), proteína Αβ ou ambas. Os epítopos ou determinantes antigénicos exemplares podem ser 47 encontrados dentro da APP, mas são preferivelmente encontrados dentro do péptido Αβ de APP. As isoformas múltiplas de APP existem, por exemplo, APP695, APP751 e APP770. Aos aminoácidos dentro de APP são designados números de acordo com a sequência da isoforma APP770 (veja-se por exemplo, Acesso no GenBank N2 P05067). Os exemplos de isotipos específicos de APP que são correntemente conhecidos existir em seres humanos são o polipéptido de 695 aminoácidos descrito por Kang et al. (1987) Nature 325: 733-736 que é designado como o APP "normal"; o polipéptido de 751 aminoácidos descrito por Ponte et al. (1988) Nature 331: 525-527 (1988) e Tanzi et al. (1988) Nature 331: 528- 530; e o polipéptido de 770 aminoácidos descrito por Kitaguchi et al. (1988) Nature 331: 530-532. Como um resultado do processamento proteolitico de APP pelas enzimas de secretase diferentes in vivo ou in situ, Αβ é encontrado tanto numa "forma curta", 40 aminoácidos no comprimento quanto uma "forma longa", variando de 42 a 43 aminoácidos no comprimento. A forma curta, Αβ40, consiste em resíduos 672-711 de APP. A forma longa, por exemplo, Αβ42 ou Αβ43, consiste em resíduos 672-713 ou 672-714, respectivamente. Parte do domínio hidrofóbico de APP é encontrada na extremidade carboxi de Αβ e pode ser responsável pela capacidade de Αβ para agregar, particularmente no caso da forma longa. O péptido Αβ pode ser encontrado nos corpos fluidos ou purificados a partir dos mesmos de seres humanos e outros mamíferos, por exemplo, fluido cerebrospinal, que inclui tanto indivíduos normais quanto indivíduos que sofrem de distúrbios amiloidogénicos.
Os termos "proteína amilóide β", "péptido amilóide β", "amilóide β", "Αβ" e "péptido Αβ" são usados no presente documento intercambiavelmente. O péptido Αβ (por exemplo, Αβ39, Αβ40, Αβ41, Αβ42 e Αβ43) é um fragmento interno de ~4 kDa de 39 a 43 aminoácidos de APP. Αβ40, por exemplo, 48 consiste nos resíduos 672-711 de APP e Αβ42 consiste nos resíduos 672-713 de APP. Os péptidos Αβ incluem péptidos que resultam da clivagem por secretase de APP e péptidos sintético tendo a mesma ou essencialmente a mesma sequência como os produtos de clivagem. Os péptidos Αβ podem ser derivados de uma variedade de fontes, por exemplo, tecidos, linhas de célula ou fluidos corporais (por exemplo, soros ou fluido cerebrospinal) . Por exemplo, um Αβ pode ser derivado de células que expressam APP tais como células do ovário de hamster chinês (CHO) estavelmente transfectadas com APP717V^F, como descrito, por exemplo, em Walsh et al., (2002), Nature, 416, pp 535-539. Uma preparação de Αβ pode ser derivada de fontes de tecido usando métodos previamente descritos (veja-se, por exemplo, Johnson-Wood et al., (1997), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94: 1550).
Alternativamente, os péptidos Αβ podem ser sintetizados usando métodos que são bem conhecidos por aqueles na técnica. Veja-se, por exemplo, Fields et al., Synthetic Peptides: A User's Guide, ed. Grant, W. H. Freeman & Co., Nova Iorque, NY, 1992, p 77). Consequentemente, os péptidos podem ser sintetizados usando as técnicas de Merrifield automatizadas de síntese de fase sólida com o grupo cx-amino protegido pela química de t-Boc ou F-moc usando aminoácidos protegidos na cadeia lateral, por exemplo, num Sintetizador de Péptido da Applied Biosystems Modelo 430A ou 431. Antigénios de péptido mais longos podem ser sintetizados usando técnicas de ADN recombinantes bem conhecidas. Por exemplo, um polinucleótido que codifica o péptido ou péptido de fusão pode ser sintetizado ou molecularmente clonado e inserido num vector de expressão adequado para a transfecção e expressão heteróloga por uma célula hospedeira adequada. O péptido Αβ também se refere a sequências de Αβ relacionadas que resulta das mutações na região de Αβ do gene normal.
Os epítopos ou determinantes antigénicos exemplares 49 aos quais um anticorpo Αβ se liga podem ser encontrados dentro da proteína precursora de amilóide humana (APP), mas são preferivelmente encontrados dentro do péptido Αβ de APP. Os epítopos ou determinantes antigénicos exemplares dentro de Αβ estão localizados dentro do terminal N, região central ou terminal C de Αβ. Um "epítopo de terminal N", é um epítopo ou determinante antigénico localizado dentro ou incluindo o terminal N do péptido Αβ. Os epítopos de terminal N exemplares incluem resíduos dentro dos aminoácidos 1-10 ou 1-12 de Αβ, preferivelmente dos resíduos 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 2-6, 2-7, 3-6 ou 3-7 de Αβ42. Outros epítopos de terminal N exemplares começam nos resíduos 1-3 e terminal nos resíduos 7-11 de Αβ. Os epítopos de terminal N exemplares adicionais incluem os resíduos 2-4, 5, 6, 7 ou 8 de Αβ, resíduos 3-5, 6, 7, 8 ou 9 de Αβ ou resíduos 4-7, 8, 9 ou 10 de Αβ42. "Epítopos centrais" são epítopos ou determinantes antigénicos que compreendem resíduos localizados dentro da porção central ou intermediária do péptido Αβ. Os epítopos centrais exemplares incluem resíduos dentro dos aminoácidos 13-28 de Αβ, preferivelmente dos resíduos 14-27, 15-26, 16-25, 17- 24, 18-23 ou 19-22 de Αβ. Outros epítopos centrais exemplares incluem resíduos dentro dos aminoácidos 16-24, 16-23, 16-22, 16-21, 18-21, 19-21, 19-22, 19-23 ou 19-24 de Αβ. Os epítopos ou determinantes antigénicos de "terminal C" estão localizados dentro ou incluindo o terminal C do péptido Αβ e incluem resíduos dentro dos aminoácidos 33-40, 33-41 ou 33-42 de Αβ. Os "epítopos de terminal C" são epítopos ou determinantes antigénicos que compreendem resíduos localizados dentro do terminal C do péptido Αβ (por exemplo, dentro de cerca dos aminoácidos 30-40 ou 30-42 de Αβ. Os epítopos ou determinantes antigénicos de terminal C exemplares adicionais incluem resíduos 33-40 ou 33-42 de Αβ.
Quando um anticorpo é dito ligar a um epítopo dentro 50 de resíduos especificados, tais como Αβ 3-7, o que é intencionado é que o anticorpo especificamente se ligue a um polipéptido contendo os resíduos especificados (isto é, Αβ 3-7 neste exemplo). Um tal anticorpo não contacta necessariamente cada resíduo dentro de Αβ 3-7. Nem cada substituição ou deleção de aminoácido único dentro de Αβ 3-7 de modo necessariamente significativa afecta a afinidade de ligação. Em várias formas de realização, um anticorpo Αβ é específico de extremidade. Como é usado no presente documento, o termo "específico de extremidade" refere-se a um anticorpo que se liga especificamente aos resíduos de terminal N ou de terminal C de um péptido Αβ mas que não reconhece os mesmos resíduos quando presentes numa espécie de Αβ mais longa que compreende os resíduos ou em APP. Em várias formas de realização, um anticorpo Αβ é "específico de terminal C." Como é usado no presente documento, o termo "específico de terminal C" significa que o anticorpo especificamente reconhece um terminal C livre de um péptido Αβ. Os exemplos de anticorpos Αβ específicos de terminal C incluem aqueles que reconhecem um péptido Αβ terminando no resíduo 40 mas não reconhece um péptido Αβ terminando nos resíduos 41, 42 e/ou 43; reconhecem um péptido Αβ terminando no resíduo 42 mas não reconhecem um péptido Αβ terminando nos resíduos 40, 41 e/ou 43; etc.
Numa forma de realização, o anticorpo Αβ pode ser um anticorpo 3D6 ou variante do mesmo ou um anticorpo 10D5 ou variante do mesmo, ambos os quais são descritos na Publicação de Patente US 20030165496A1, Publicação de Patente US 20040087777A1, Publicação de Patente Internacional N° WO 02/46237A3 e Publicação de Patente Internacional N° WO 04/080419A2. A descrição de anticorpos 3D6 e 10D5 também pode ser encontrada, por exemplo, na Publicação de Patente Internacional N° WO 02/088306A2 e Publicação de Patente Internacional N° WO 02/088307A2. Os anticorpos 3D6 adicionais são descritos no Pedido de 51
Patente US 11/303.478 e Pedido Internacional N° PCT/US05/45614. 3D6 é um anticorpo monoclonal (mAb) que se liga especificamente a um epitopo de terminal N localizado no péptido amilóide β humano, especificamente, residuos 1-5. Por comparação, 10D5 é um mAb que se liga especificamente a um epitopo de terminal N localizado no péptido amilóide β humano, especificamente, residuos 3-6. Uma linha de célula que produz o anticorpo monoclonal 3D6 (RB96 3D6.32.2.4) foi depositada com a American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA 20108, USA em 8 de abril de 2003 sob os termos do Tratado de Budapest e tem o número de depósito PTA-5130. Uma linha de célula que produz o anticorpo monoclonal 10D5 (RB44 10D5.19.21) foi depositado com a ATCC em 8 de abril de 2003 sob os termos do Tratado de Budapest e tem o número de depósito PTA-5129.
Os anticorpos 3D6 variantes exemplares são aqueles tendo, por exemplo, uma cadeia leve humanizada que compreende as sequências de aminoácido da região variável apresentadas como a SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5 e uma cadeia pesada humanizada que compreende as sequências de aminoácido da região variável apresentadas como SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 6. Outros anticorpos 3D6 variantes exemplares são aqueles tendo, por exemplo, uma sequência de aminoácido de cadeia leve humanizada apresentada como a SEQ ID NO: 7 e uma sequência de aminoácido de cadeia pesada humanizada apresentada como SEQ ID NO: 8.
Os anticorpos 10D5 variantes exemplares são aqueles tendo, por exemplo, uma cadeia leve humanizada que compreende sequências de aminoácido da região variável apresentadas como SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 11 e uma cadeia pesada humanizada que compreende as sequências de aminoácido da região variável apresentadas como SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 12. Outros anticorpos 10D5 variantes exemplares são aqueles tendo, por exemplo, uma sequência de aminoácido de cadeia leve humanizada apresentada como SEQ 52 ID NO: 13 e uma sequência de aminoácido de cadeia pesada humanizada apresentada como SEQ ID NO: 14. Tais anticorpos variantes são ainda descritos na WO 02/088306A2. 0 anticorpo pode ser um anticorpo 12B4 ou variante do mesmo, como é descrito na Publicação de Patente U.S. 20040082762A1 e Publicação de Patente Internacional N° WO 03/077858A2. 12B4 é um mAb que se liga especificamente a um epitopo de terminal N localizado no péptido amilóide |3 humano, especificamente, os resíduos 3-7.
Os anticorpos 12B4 variantes exemplares são aqueles tendo, por exemplo, uma cadeia leve humanizada (ou cadeia leve) que compreende sequências de aminoácido da região variável apresentadas como SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 17 e uma cadeia pesada humanizada que compreende as sequências de aminoácido da região variável apresentadas como SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 19. 0 anticorpo pode ser um anticorpo 12A11 ou uma variante do mesmo, como descrito na Publicação de Patente US 20050118651A1, Pedido de Patente US Serial N2 11/303.478, Publicação de Patente Internacional N° WO 04/108895A2 e Pedido de Patente Internacional Serial N2 PCT/US05/45614. 12A11 é um mAb que se liga especificamente a um epitopo de terminal N localizado no péptido amilóide β humano, especificamente, resíduos 3-7. Uma linha de célula que produz o anticorpo monoclonal 12A11 foi depositada com a ATCC em 12 de Dezembro de 2005 sob os termos do Tratado de Budapest e tem número de depósito
Os anticorpos 12A11 variantes exemplares são aqueles tendo, por exemplo, uma cadeia leve humanizada que compreende a sequência de aminoácido da região variável apresentada como SEQ ID NO: 20 e uma cadeia pesada humanizada que compreende as sequências de aminoácido da região variável apresentada como SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 53 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40 ou SEQ ID NO: 41 0 anticorpo pode ser um anticorpo 6C6 ou uma variante do mesmo, como descrito num Pedido de Patente US 11/304.986 e Pedido de Patente Internacional N° PCT/US05/45515 intitulado "Humanized Antibodies that Recognize Beta Amyloid Peptide." 6C6 é um mAb que se liga especificamente a um epitopo de terminal N localizado no péptido amilóide β humano, especificamente, resíduos 3-7. Uma linha de célula que produz o anticorpo 6C6 foi depositada em 1 de Novembro de 2005, com a ATCC sob os termos do Tratado de Budapest e designado o número de acesso PTA-7200. O anticorpo pode ser um anticorpo 2H3 como descrito no Pedido de Patente US 11/304.986 e Pedido de Patente Internacional N° PCT/US05/45515 intitulado "Humanized Antibodies that Recognize Beta Amyloid Peptide.". 2H3 é um mAb que se liga especificamente a um epitopo de terminal N localizado no péptido amilóide β humano, especificamente, resíduos 2-7. Já numa outra forma de realização, o anticorpo pode ser um anticorpo 3A3, 3A3 é um mAb que se liga especificamente a um epitopo de terminal N localizado no péptido amilóide β humano, especificamente, resíduos 3-7. O anticorpo pode ser um anticorpo 15C11 ou variante do mesmo, como descrito num Pedido de Patente US 11/304.986 e Publicação de Patente Internacional N° WO 2006/066049 intitulado "Humanized Antibodies that Recognize Beta Amyloid Peptide." 15C11 é um mAb que se liga especificamente a um epitopo central localizado no péptido de amilóide β humano, especificamente, resíduos 19-22. O anticorpo pode ser um anticorpo 266 como descrito na Publicação de Patente US 20050249725A1 e Publicação de Patente Internacional N° WO 01/62801A2. 266 é um mAb que se liga especificamente a um epitopo central localizado no 54 péptido amilóide β humano, especificamente, resíduos 16-24. Uma linha de célula que produz o anticorpo monoclonal 266 foi depositada com a ATCC em 20 de julho de 2004 sob os termos do Tratado de Budapest e tem número de depósito PTA-6123 .
Os anticorpos 266 variantes exemplares são aqueles tendo, por exemplo, uma cadeia leve humanizada que compreende sequências de aminoácido da região variável apresentadas como SEQ ID NO: 42 ou SEQ ID NO: 44 e uma cadeia pesada humanizada que compreende sequências de aminoácido da região variável apresentadas como SEQ ID NO: 43 ou SEQ ID NO: 45. Outros anticorpos 266 variantes exemplares são aqueles tendo, por exemplo, uma sequência de aminoácido da cadeia leve humanizada apresentada como SEQ ID NO: 46 e uma sequência de aminoácido da cadeia pesada humanizada apresentada como SEQ ID NO: 47. Tais anticorpos variantes são ainda descritos na Publicação de Patente US 20050249725A1 e Publicação de Patente Internacional N° WO 01/62801A2. O anticorpo pode ser um anticorpo 2B1 ou uma variante do mesmo, como descrito num Pedido de Patente US 11/304.986 e Publicação de Patente Internacional WO 2006/066049 intitulado "Humanized Antibodies that Recognize Beta Amyloid Peptide." 2B1 é um mAb que se liga especificamente a um epítopo central localizado no péptido amilóide β humano, especificamente, resíduos 19-23. O anticorpo pode ser um anticorpo 1C2 ou uma variante do mesmo, como descrito num Pedido de Patente US 11/304.986 e Publicação de Patente Internacional N° W02006/066049 intitulado "Humanized Antibodies that Recognize Beta Amyloid Peptide." 1C2 é um mAb que se liga especificamente a um epítopo central localizado no péptido amilóide β humano, especificamente, resíduos 16-23. O anticorpo pode ser um anticorpo 9G8 ou uma variante do mesmo, como descrito num Pedido de Patente US 11/304.986 55 e Publicação de Patente Internacional N° W02006/066049 intitulado "Humanized Antibodies that Recognize Beta Amyloid Peptide". 9G8 é um mAb que se liga especificamente a um epitopo central localizado no péptido amilóide β humano, especificamente, resíduos 16-21.
As linhas de célula que produzem os anticorpos 2B1, 1C2 e 9G8 foram depositadas em 1 de Novembro de 2005, com a ATCC sob os termos do Tratado de Budapest e foram designados números de acesso PTA- 7202, PTA-7199 e PTA-7201, respectivamente.
Os anticorpos que se ligam especificamente aos epítopos de terminal C localizados no péptido amilóide β humano, para utilização na presente invenção incluem, mas não são limitados a, 369.2B, como descrito na Patente US 5.786.180, intitulada "Monoclonal antibody 369.2B specific for β A4 peptide." Descrição adicional de anticorpos para utilização na presente invenção pode ser encontrada, por exemplo, em Bussiere et al., (Am. J. Pathol. 165(3): 987-95 (2004)) Bard et al. (PNAS 100(4): 2023-8 (2003)), Kajkowski et al. (J. Biol. Chem. 276(22): 18748-56 (2001)), Games etal. (Ann. NY Acad. Sei. 920: 274-84 (2000)), Bard et al. (Nat. Med. 6 (8): 916-9 (2000)) e no Pedido de Patente Internacional N° WO 03015691A2 intitulada "Effecting rapid improvement of cognition in a subject having Alzheimer's disease, Down's syndrome, cerebral amyloid angiopathy ou mild cognitive impairment, comprises administering anti-A beta antibody". Descrição adicional de fragmentos de anticorpo para utilização na presente invenção pode ser encontrada, por exemplo, em Bales et al. (Resumo P4-396, página 5587, apresentada em Póster Session P4: Therapeutics and Therapeutic Strategies-Therapeutic Strategies, Amyloid-Based) e Zameer et al. (Resumo P4-420, página 5593, apresentada em Póster Session P4: Therapeutics and Therapeutic Strategies- Therapeutic Strategies, Amiloid-Based). 56
Os anticorpos para utilização na presente invenção podem ser recombinante ou sinteticamente produzidos. Por exemplo, o anticorpo pode ser produzido por um processo de cultura de célula recombinante, usando, por exemplo, células CHO, células NIH 3T3, células PER.C6®, células NSO, células VERO, fibroblastos de embrião de pintinho ou células BHK. Além disso, anticorpos com modificações menores que retenham a propriedade funcional primária de ligação de péptido Αβ são considerados pela presente invenção. Numa forma de realização particular, o anticorpo é um anticorpo de péptido 3D6 anti-Αβ humanizado que selectivamente liga péptido Αβ. Mais especificamente, o anticorpo de péptido 3D6 anti-Αβ humanizado é projectado para ligar especificamente a um epitopo de terminal NH2, por exemplo, os resíduos de aminoácido 1-5, localizados nos péptidos 1-40 ou 1- 42 de amilóide β humano encontrados nos depósitos de placa no cérebro (por exemplo, em pacientes que sofrem da doença de Alzheimer). A Figura 1 proporciona uma representação esquemática da estrutura prognosticada de um anticorpo de péptido anti-Αβ humanizado exemplar. As sequências de aminoácido completas das cadeias leve e pesada de h3D6v2 prognosticadas a partir das sequências de ADN dos vectores de expressão correspondentes são mostradas na Figura 2 (onde os resíduos são numerados partindo com o terminal NH2 de cadeia leve e pesada como número de resíduo 1) e na SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, respectivamente. O último resíduo de aminoácido codificado pela sequência de ADN de cadeia leve, Lys449 , não foi observado na forma madura, segregada a partir do h3D6v2 e, sem desejar estar ligado por qualquer teoria particular, é removido presumivelmente durante o processamento intracelular pelas proteases celulares de CHO. Portanto, o término COOH da cadeia leve h3D6v2 é opcionalmente Gly448. O processamento de lisina de terminal COOH foi observado em anticorpos recombinantes e derivados 57 de plasma e não parecem impactar a sua função (Harris (1995) J. Chromatogr. A. 705: 129-134). O h3D6v2 purificado é pós-translacionalmente modificado pela adição de glicanos ligados em N em relação à porção Fc da cadeia leve, que é conhecido conter um local de consenso de glicosilação em N único. O local de glicosilação em N demonstra três estruturas de oligossacárido neutras biantenárias complexas principais habitualmente observadas no local de glicosilação em N análogo de proteínas IgG de mamífero.
Um outro anticorpo de péptido anti-Αβ humanizado exemplar é 3D6 humanizado versão 1 (hu3D6vl) que tem a sequência apresentada na Figura 2, mas para uma
, , _ ni- Y substituição de ··' 1 na posição 1 da cadeia leve. O anticorpo anti-Αβ (por exemplo, um anticorpo de péptido 3D6 anti-Αβ humanizado) está presente de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 100 mg/ml, de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 75 mg/ml, de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 50 mg/ml, de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 40 mg/ml, de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 3 0 mg/ml, de cerca de 10 mg/ml a cerca de 20 mg/ml, de cerca de 20 mg/ml a 30 mg/ml ou mais alto, por exemplo, até cerca de 100 mg/ml, cerca de 200 mg/ml, cerca de 500 mg/ml de cerca de 1000 mg/ml ou mais. Preferivelmente o anticorpo anti-Αβ está presente numa concentração de cerca de 17 mg/ml a cerca de 23 mg/ml. O anticorpo anti-Αβ está presente em cerca de 1, 2, 5, 10,
15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou 30 mg/ml. O anticorpo (por exemplo, um anticorpo de péptido 3D6 anti-Αβ humanizado) está presente em cerca de 17 mg/ml. O anticorpo (por exemplo, um anticorpo de péptido 3D6 anti-Αβ humanizado) está presente em cerca de 20 mg/ml. Numa outra forma de realização particular, o anticorpo (por exemplo, um anticorpo de péptido 3D6 anti-Αβ humanizado) em cerca de 30 mg/ml.
Excipientes A presente invenção proporciona uma formulação que 58 pode incluir vários excipientes, que incluem, mas não limitados a, tampão, antioxidante, um agente de tonicidade e um estabilizante. Além disso, as formulações podem conter um agente adicional para o ajuste de pH (por exemplo, HC1) e um diluente (por exemplo, água). Formas diferentes de histidina podem ser usadas para o ajuste de pH. Em parte, os excipientes servem para manter a estabilidade e a actividade biológica do anticorpo (por exemplo, pela manutenção da conformação apropriada da proteína), e/ou para manter o pH.
Agente de tamponamento A formulação inclui um agente de tamponamento (tampão). 0 tampão serve para manter um pH fisiologicamente adequado. Além disso, o tampão pode servir para realçar a isotonicidade e a estabilidade química da formulação. No geral, a formulação deve ter um pH fisiologicamente adequado. A formulação tem um pH de cerca de 5 a cerca de 7, de cerca de 5,5 a cerca de 6,5, preferivelmente de cerca de 6,0 a cerca de 6,5. Numa forma de realização particular, a formulação tem um pH de cerca de 6. Os intervalos intermediários para os níveis de pH relatados acima, por exemplo, de cerca de pH 5,2 a cerca de pH 6,3, preferivelmente 6,0 ou pH 6,2), são também descritos. Por exemplo, intervalos de valores usando uma combinação de qualquer um dos valores relatados acima como limites superiores e/ou inferiores são descritos. O pH pode ser ajustado como necessário pelas técnicas conhecidas no ramo. Por exemplo, HC1 pode ser adicionado como necessário para ajustar o pH aos níveis desejados ou formas diferentes de histidina podem ser usadas para ajustar o pH aos níveis desejados.
O tampão pode incluir, mas não é limitado a, succinato (sódio ou fosfato), histidina, fosfato (sódio ou potássio), Tris (tris (hidroximetil) aminometano), dietanolamina, citrato, outros ácidos orgânicos e misturas dos mesmos. O 59 tampão é histidina (por exemplo, L-histidina). 0 tampão é succinato. A formulação inclui um aminoácido tal como histidina que está presente numa quantidade suficiente para manter a formulação num pH fisioloqicamente adequado. A histidina é um aminoácido exemplar tendo capacidades de tamponização no intervalo do pH fisiológico. A histidina deriva as suas capacidades de tamponamento do seu grupo imidazol. Numa forma de realização exemplar, o tampão é L-histidina (base) (por exemplo, C6H9N3O2, PF: 155,15). Numa outra forma de realização, o tampão é monocloreto de L-histidina monoidratado (por exemplo, C5H9N3O2.HCl.H2O, PF: 209,63). O tampão é uma mistura de L-histidina (base) e monocloreto de L- histidina monoidratado. A concentração do tampão (por exemplo, L-histidina ou succinato) está presente de cerca de 0,1 mM a cerca de 50 mM, de cerca de 0,1 mM a cerca de 40 mM, de cerca de 0,1 mM a cerca de 30 mM, de cerca de 0,1 mM a cerca de 25 mM, de cerca de 0,1 mM a cerca de 20 mM ou de cerca de 5 mM a cerca de 15 mM, preferivelmente de 5 mM ou 10 mM. Em várias formas de realização, o tampão pode estar presente em cerca de 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM ou 15 mM. Numa forma de realização particular, o tampão está presente em cerca de 10 mM. Os intervalos intermediários para as concentrações relatadas acima, por exemplo, de cerca de 12 mM a cerca de 17 mM, também são descritos. Por exemplo, os intervalos de valores usando uma combinação de qualquer um dos valores acima relatados como limites superior e/ou inferior são descritos. Em certas formas de realização, o tampão está presente numa quantidade suficiente para manter um pH fisiologicamente adequado. Agente de tonicidade A formulação inclui um agente de tonicidade. Em parte, o agente de tonicidade contribui para manter a isotonicidade da formulação e para manter os níveis de proteína. Em parte, o agente de tonicidade contribui para 60 preservar o nível, razão ou proporção do polipéptido terapeuticamente activo presente na formulação. Como é usado no presente documento, o termo "tonicidade" refere-se ao comportamento de componentes biológicos num ambiente fluídico ou solução. As soluções isotónicas possuem a mesma pressão osmótica como o plasma sanguíneo e assim podem ser intravenosamente infundidas num paciente sem mudar a pressão osmótica do plasma sanguíneo do sangue do paciente. De facto, o agente de tonicidade está presente numa quantidade suficiente para tornar a formulação adequada para a infusão intravenosa. Frequentemente, o agente de tonicidade serve também como um agente de volume. Como tal, o agente pode possibilitar que a proteína supere vários stresses tais como congelamento e cisalhamento. O agente de tonicidade pode incluir, mas não é limitado a, CaCl2, NaCl, MgCl2, lactose, sorbitol, sacarose, manitol, trealose, rafinose, polietileno glicol, amido hidroxietílico, glicina e misturas dos mesmos. Numa forma de realização preferida, o agente de tonicidade é manitol (por exemplo, D-manitol, por exemplo, C6H14O6, PF: 182,17). O agente de tonicidade está presente em cerca de 2% a cerca de 6% p/v ou de cerca de 3% a cerca de 5% p/v. O agente de tonicidade está presente em cerca de 3,5% a cerca de 4,5% p/v. O agente de tonicidade está presente em cerca de 20 mg/ml a cerca de 60 mg/ml, em cerca de 30 mg/ml a cerca de 50 mg/ml ou em cerca de 35 mg/ml a cerca de 45 mg/ml. Preferivelmente, o agente de tonicidade está presente em cerca de 4% p/v ou em cerca de 40 mg/ml. O agente de tonicidade está presente em cerca de 6% p/v ou em cerca de 10% p/v.
Os intervalos intermediários para as concentrações relatadas acima, por exemplo, de cerca de 3,2% a cerca de 4,3% p/v ou de cerca de 32 a cerca de 43 mg/ml, também são descritos. Por exemplo, os intervalos de valores usando uma 61 combinação de qualquer um dos valores acima relatados como limites superior e/ou inferior são descritos. 0 agente de tonicidade deve estar presente numa quantidade suficiente de modo a manter a tonicidade da formulação.
Antioxidante A formulação inclui um antioxidante de modo a preservar, em parte, a formulação (por exemplo, pela prevenção da oxidação). 0 antioxidante pode incluir, mas não é limitado a, GLA (ácido gama-linolénico)-ácido lipóico, DHA (ácido docosaexaenóico)-ácido lipóico, GLA-tocoferol, di-GLA-ácido 3,3'-tiodipropiónico e no geral qualquer um de, por exemplo, GLA, DGLA (ácido di-homo-gama-linolénico), AA (ácido araquidónico), SA (ácido salicilico) , EPA (ácido eicosapentaenóico) ou DHA (ácido docosaexaenóico) com qualquer antioxidante natural ou sintético com que estes possam ser quimicamente ligados. Estes incluem antioxidantes fenólicos (por exemplo, eugenol, ácido carnósico, ácido caféico, BHT (hidroxianisol butilado), ácido gálico, tocoferóis, tocotrienóis e antioxidantes flavonóides (tais como miricetin e fisetin)), polienos (por exemplo, ácido retinóico), esteróis insaturados (por exemplo, A5-avenosterol), compostos de organoenxofre (por exemplo, alicina), terpenos (por exemplo, geraniol, ácido abiético) e antioxidantes de aminoácido (por exemplo, metionina, cisteina, carnosina). 0 antioxidante é o ácido ascórbico. Preferivelmente, o antioxidante é metionina ou um análogo da mesma, por exemplo, selenometionina, ácido hidróxi metil butanóico, etionina ou trifluorometionina. 0 antioxidante (por exemplo, uma metionina tal como L-metionina, por exemplo, CH3SCH2CH2CH (NH2) CO2H, PF = 149,21) está presente desde cerca de 0,1 mM até cerca de 50 mM, desde cerca de 0,1 mM até cerca de 40 mM, desde cerca de 0,1 mM até cerca de 30 mM, desde cerca de 0,1 mM até cerca de 20 mM ou desde cerca de 5 mM até cerca de 15 mM. Em 62 várias formas de realização, o antioxidante pode estar presente em cerca de 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM ou 15 mM. Preferivelmente, o antioxidante está presente em cerca de 10 mM. Numa outra forma de realização particular, o antioxidante está presente em cerca de 15 mM. Intervalos intermediários para as concentrações relatadas acima, por exemplo, de cerca de 12 mM a cerca de 17 mM, também são descritos. Por exemplo, os intervalos de valores usando uma combinação de qualquer um dos valores relatados acima como limites superior e/ou inferior são descritos. Em certas formas de realização, o antioxidante deve estar presente numa quantidade suficiente de modo a preservar a formulação, em parte, pela prevenção da oxidação.
Estabilizante
Além disso, a formulação inclui um estabilizante, também conhecido como um tensoactivo. Os estabilizantes são compostos químicos específicos que interagem e estabilizam as moléculas biológicas e/ou excipientes farmacêuticos gerais numa formulação. Os ditos estabilizantes podem ser usados em conjunto com armazenagem em temperatura mais baixa. Os estabilizantes no geral protegem a proteína dos stresses induzidos pela interface ar/solução e stresses induzidos pela solução/superfície, que podem de outro modo resultar na agregação da proteína. O estabilizante pode incluir, mas não é limitado a, glicerina, polissorbatos tais como polissorbato 80, ácidos dicarboxílicos, ácido oxálico, ácido succínico, ácido adípico, ácido fumárico, ácidos ftálicos e combinações dos mesmos. O estabilizante é polissorbato 80.
Numa forma de realização, a concentração do estabilizante (por exemplo, polissorbato 80) é de cerca de 0,001% p/v a cerca de 0,01% p/v, de cerca de 0,001% p/v a cerca de 0, 009% p/v ou de cerca de 0,003% p/v a cerca de 0,007% p/v. Preferivelmente, a concentração de 63 estabilizante é de cerca de 0,005% p/v. Numa outra forma de realização particular, o estabilizante está presente em cerca de 0,01% p/v. Os intervalos intermediários para as concentrações acima relatadas, por exemplo, de cerca de 0,002% p/v a cerca de 0,006% p/v, também são descritos. Por exemplo, os intervalos de valores usando uma combinação de qualquer um dos valores relatados acima como limites superior e/ou inferior são descritos. O estabilizante deve estar presente numa quantidade suficiente de modo a estabilizar o polipéptido de ligação de Αβ (por exemplo, anticorpo anti-Αβ).
Outros transportadores, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis tais como aqueles descritos em Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed. (1980) podem ser incluídos na formulação contanto que não afectem adversamente as características desejadas da formulação. A formulação é substancialmente isenta de conservantes, embora, em formas de realização alternativas, os conservantes possam ser adicionados como necessário. Por exemplo, crioprotectores ou lioprotectores podem ser incluídos, por exemplo, caso a formulação deva ser liofilizada.
Num aspecto, as formulações da presente invenção incluem polipéptido de ligação de Αβ (por exemplo, anticorpo anti-Αβ), manitol e histidina. As formulações podem incluir um antioxidante tal como metionina, e/ou um estabilizante tal como polissorbato 80. As formulações têm um pH de cerca de 6. Num outro aspecto, a formulação inclui um polipéptido de ligação de Αβ (por exemplo, um anticorpo anti-Αβ), manitol, histidina e metionina. Ainda num outro aspecto, a formulação inclui um polipéptido de ligação de Αβ (por exemplo, um anticorpo anti-Αβ), manitol, histidina, metionina e polissorbato 80. Num aspecto particular da invenção, a formulação inclui cerca de 20 mg/ml de um polipéptido de ligação de Αβ (por exemplo, um anticorpo 6 4 anti-Αβ), de cerca de 10 mM de histidina, cerca de 10 mM de metionina, cerca de 4% de manitol e tem um pH de cerca de 6. Num outro aspecto da invenção, a formulação inclui cerca de 20 mg/ml de polipéptido de ligação de Αβ (por exemplo, anticorpo anti-Αβ), 10 mM de histidina, 10 mM de metionina, 4% p/v de manitol, 0,005% p/v de polissorbato 80 e tem um pH de cerca de 6. Uma formulação preferida inclui cerca de 17 mg/ml a cerca de 23 mg/ml de um anticorpo 3D6 humanizado, cerca de 10 mM de histidina, cerca de 10 mM de metionina, cerca de 4% p/v de manitol, cerca de 0, 005% de polissorbato 80 e tem um pH de cerca de 5,5 a cerca de 6,5. Uma outra formulação preferida inclui cerca de 10 mg/ml a cerca de 30 mg/ml de um anticorpo 266 humanizado, cerca de 10 mM de histidina ou succinato, cerca de 10 mM de metionina, cerca de 4% p/v de manitol ou sorbitol e tem um pH de cerca de 5,5 a cerca de 6,5. Ainda uma outra formulação preferida inclui cerca de 10 mg/ml a cerca de 30 mg/ml de um anticorpo 12A11 humanizado, cerca de 5 mM de histidina, cerca de 10 mM de metionina, cerca de 4% de manitol ou 150 mM de NaCl e tem um pH de cerca de 5,5 a cerca de 6,5. Uma outra formulação é estável durante pelo menos cerca de 12 meses a uma temperatura acima da de congelamento a cerca de 10 °C, tem um pH de cerca de 5,5 a cerca de 6,5 e inclui pelo menos um anticorpo anti-Αβ numa concentração de cerca de 1 mg/ml a cerca de 30 mg/ml, manitol numa concentração de cerca de 4% p/v ou NaCl numa concentração de cerca de 150 mM, de cerca de 5 mM a cerca de 10 mM de histidina ou succinato e 10 mM de metionina. Preferivelmente, a formulação também inclui polissorbato numa concentração de cerca de 0,001% p/v a cerca de 0,01% p/v.
Proporciona-se preparações concentradas de polipéptido de ligação de Αβ (por exemplo, anticorpo anti-Αβ), frequentemente úteis como produto medicamentoso de volume. Além disso, as formas de realização exemplares da presente 65 invenção são estáveis ao congelamento, liofilização e/ou reconstituição. Além disso, as formas de realização exemplares da presente invenção são estáveis em períodos prolongados de tempo. Por exemplo, as formulações da presente invenção são estáveis durante pelo menos cerca de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 meses. Em formas de realização particulares, as formulações da presente invenção são estáveis durante pelo menos cerca de 12 meses, durante pelo menos cerca de 18 meses, durante pelo menos cerca de 24 meses ou durante pelo menos cerca de 30 meses.
De acordo com a invenção, a formulação pode ser armazenada em temperaturas de cerca de -80 °C a cerca de 40 °C, de cerca de 0 °C a cerca de 25 °C, de cerca de 0 °C a cerca de 15 °C ou de cerca de 0 °C a cerca de 10 °C, preferivelmente de cerca de 2 °C a cerca de 8 °C. Em várias formas de realização, a formulação pode ser armazenada em cerca de 0 °C, 1 °C, 2 °C, 3 °C, 4 °C, 5 °C, 6 °C, 7 °C, 8 °C, 9 °C ou 10 °C. Numa forma de realização particular, a formulação é armazenada em cerca de 5 °C. No geral, a formulação é estável e retém a actividade biológica destes intervalos. Os intervalos intermediários para as temperaturas acima relatadas, por exemplo, de cerca de 2 °C a cerca de 17 °C, também são descritos. Por exemplo, os intervalos de valores usando uma combinação de qualquer um dos valores relatados acima como limites superior e/ou inferior são intencionadas a serem incluídas.
As formulações da presente invenção são adequadas para a libertação por uma variedade de técnicas. Em certas formas de realização, a formulação é administrada parentericamente, tal como intravenosa ou intramuscularmente. Adicionalmente, pode-se alvejar a libertação da formulação para o cérebro (por exemplo, de modo que o anticorpo possa cruzar a barreira hematoencefálica) ou o fluido espinal. Numa forma de 66 realização particular, a formulação é administrada intravenosamente.
As doses eficazes das formulações da presente invenção variam dependendo de muitos factores diferentes, que incluem meios de administração, local alvo, estado fisiológico do paciente, se o paciente é humano ou um animal, outras medicações administradas e se o tratamento for profiláctico ou terapêutico. Usualmente, o paciente é um ser humano, mas mamíferos não humanos que incluem mamíferos transgénicos também podem ser tratados. As dosagens de tratamento precisam ser tituladas para optimizar segurança e eficácia.
Para a imunização passiva com um anticorpo, as dosagens exemplares são de cerca de 0,0001 mg/kg a cerca de 100 mg/kg, de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 5 mg/kg, de cerca de 0,15 mg/kg a cerca de 3 mg/kg, de 0,5 mg/kg a cerca de 2 mg/kg, preferivelmente de cerca de 1 mg/kg a cerca de 2 mg/kg do peso corporal do hospedeiro. Em algumas formas de realização exemplares, as dosagens podem ser cerca de 0,5, 0,6, 0, 7, 0, 75, 0, 8, 0, 9, 1, 0, 1,2, 1,25, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,75, 1,8, 1,9 ou 2,0 mg/kg. Outras dosagens exemplares para a imunização passiva são de cerca de 1 mg/kg a cerca de 20 mg/kg. Em algumas formas de realização exemplares, as dosagens podem ser cerca de 5, 10, 15 ou 20 mg/kg. Os indivíduos podem ser administrados com tais doses diariamente, em dias alternados, semanalmente ou de acordo com qualquer outro programa determinado pela análise empírica. Um tratamento exemplar acarreta necessariamente a administração em dosagens múltiplas num período prolongado, por exemplo, de pelo menos seis meses. Os regimes de tratamento exemplares adicionais acarretam necessariamente a administração uma vez a cada duas semanas ou uma vez ao mês ou uma vez a cada 3-6 meses. Os programas de dosagem exemplares incluem 1 a 10 mg/kg ou 15 mg/kg em dias consecutivos, 30 mg/kg em dias 67 alternados ou 60 mg/kg semanalmente. Em alguns métodos, dois ou mais anticorpos monoclonais com especificidades de ligação diferentes são simultaneamente administrados, caso em gue a dosagem de cada anticorpo administrado está dentro dos intervalos indicados. 0 anticorpo é usualmente administrado em ocasiões múltiplas. Intervalos entre dosagens únicas podem ser semanal, mensal ou anualmente. Os intervalos também podem ser irregulares como indicado pela medição dos níveis sanguíneos de anticorpo para Αβ no paciente. Em alguns métodos, a dosagem é ajustada para ser obtida uma concentração plasmática de anticorpo de 1 a 1000 pg/ml e em alguns métodos de 25 a 300 pg/ml. Alternativamente, o anticorpo pode ser administrado como uma formulação de libertação prolongada, caso este em gue a administração menos frequente é requerida. A dosagem e frequência variam dependendo da semivida do anticorpo no paciente. No geral, os anticorpos humanos mostram a semivida mais longa, seguidos pelos anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos e anticorpos não humanos. A dosagem e frequência de administração podem variar dependendo se o tratamento é profiláctico ou terapêutico. Em aplicações profilácticas, as formulações que contêm os presentes anticorpos ou um coquetel dos mesmos são administradas a um paciente ainda não no estado de doença para realçar a resistência do paciente. Uma tal quantidade é definida ser uma "dose profilacticamente eficaz". Nesta utilização, as quantidades exactas mais uma vez dependem do estado de saúde do paciente e da imunidade geral, mas no geral variam de 0,1 a 25 mg por dose, especialmente de 0,5 a 2,5 mg por dose. Uma dosagem relativamente baixa é administrada em intervalos relativamente não frequentes num período longo de tempo. Alguns pacientes continuam a receber tratamento pelo resto de suas vidas. uma dosagem
Em algumas aplicações terapêuticas, 68 relativamente alta (por exemplo, de cerca de 0,5 ou 1 a cerca de 200 mg/kg de anticorpo por dose (por exemplo, 0,5, 1, 1,5, 2, 5, 10, 20, 25, 50 ou 100 mg/kg), com dosagens de 5 a 25 mg/kg sendo mais habitualmente usadas) em intervalos relativamente curtos são algumas vezes requeridas até que a progressão da doença seja reduzida ou terminada e preferivelmente até que o paciente mostre melhora parcial ou completa de sintomas de doença. Depois disso, ao paciente pode ser administrado um regime profiláctico. É especialmente vantajoso proporcionar as formulações da invenção em forma farmacêutica unitária para a facilidade de administração e uniformidade de dosagem. As formulações da invenção podem ser apresentadas em cápsulas, ampolas, forma liofilizada ou em recipientes de dose múltipla. O termo "recipiente" refere-se a alguma coisa, por exemplo, um vasilhame, receptáculo ou vaso, em que um objecto ou liquido possam ser colocados ou contidos, por exemplo, para armazenamento. A forma farmacêutica unitária pode compreender qualquer formulação descrita no presente documento que inclui suspensões, soluções ou emulsões do ingrediente activo juntas com agentes de formulação tais como agentes de suspensão, estabilização e/ou dispersão. Numa forma de realização exemplar, a forma farmacêutica unitária pode ser adicionada a uma bolsa de gotejamento intravenoso (por exemplo, uma bolsa de gotejamento de 50 ml, 100 ml ou 250 ml ou 500 ml) com um diluente adequado, por exemplo, solução aquosa ou salina isenta de pirogénio estéril, antes da administração ao paciente, por exemplo, pela infusão intravenosa. Algumas formas de dosagem unitárias farmacêuticas podem requerer reconstituição com um diluente adequado antes da adição a uma bolsa de gotejamento intravenoso, particularmente formas liofilizadas. Em formas de realização exemplares, a forma farmacêutica unitária é um recipiente contendo uma formulação descrita no presente documento. Por exemplo, o 69 recipiente pode ser um frasco de tubo de vidro de 10 ml, tipo I. No geral, o recipiente deve manter a esterilidade e estabilidade da formulação. Por exemplo, o frasco pode ser fechado com um tampão de soro. Além disso, em várias formas de realização, o recipiente deve ser projectado de modo a possibilitar a retirada de cerca de 100 mg de formulação ou ingrediente activo (por exemplo, para utilização único). Alternativamente, o recipiente pode ser adequado para quantidades maiores de formulação ou ingrediente activo, por exemplo, desde cerca de 10 mg até cerca de 5000 mg, desde cerca de 100 mg até cerca de 1000 mg e desde cerca de 100 mg até cerca de 500 mg, de cerca de 40 mg a cerca de 250 mg, de cerca de 60 mg a cerca de 80 mg, de cerca de 80 mg a cerca de 120 mg, de cerca de 120 mg a cerca de 160 mg ou intervalos ou intervalos das mesmas, por exemplo, de cerca de 100 mg a cerca de 200 mg. Os intervalos intermediários para as quantidades acima relatadas, por exemplo, de cerca de 25 mg a cerca de 195 mg, também são descritos. Por exemplo, os intervalos de valores usando uma combinação de qualquer um dos valores relatados acima como limites superior e/ou inferior são descritos. A formulação frequentemente é proporcionada como um liquido na forma farmacêutica unitária.
Num outro aspecto, proporciona-se um kit que inclui uma forma farmacêutica unitária (por exemplo, um recipiente com uma formulação divulgada no presente documento) e instruções para utilização. Consequentemente, o recipiente e o kit podem ser projectados para proporcionar formulação suficiente para utilizações múltiplas. O dito kit pode incluir ainda diluente. O diluente pode incluir excipientes, separados ou combinados. Por exemplo, o diluente pode incluir um modificador de tonicidade tal como manitol, um agente de tamponamento tal como histidina, um estabilizante tal como polissorbato 80, um antioxidante tal como metionina e/ou combinações dos mesmos. O diluente pode 70 conter outros excipientes, por exemplo, lioprotectores, como julgado necessário por um perito na especialidade.
As formas de realização úteis adicionais da invenção são apresentadas na secção deste pedido intitulada "Sumário da Invenção".
Esta invenção é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos que não devem ser interpretados como limitativos. EXEMPLOS
No geral, a prática da presente invenção utiliza, a menos que de outro modo indicado, técnicas convencionais da química, biologia molecular, tecnologia de ADN recombinante, imunologia (especialmente, por exemplo, tecnologia de anticorpo) e técnicas padrão de preparação de polipéptido. Veja-se, por exemplo, Sambrook, Fritsch e Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996);
Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., C.S.H.L. Press, Pub. (1999); e Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992). Exemplo I. Clonagem e Expressão de Anticorpo Anti A beta Humanizado
Um anticorpo exemplar para a formulação de acordo com os métodos da presente invenção é 3D6. O mAb 3D6 é específico para o terminal N de Αβ e foi mostrado mediar a fagocitose (por exemplo, induzir a fagocitose) de placa amilóide. 3D6 não reconhece APP segregado ou APP de tamanho natural, mas detecta apenas a espécie Αβ com um ácido aspártico de terminal amino. Portanto, 3D6 é um anticorpo específico de extremidade. A linha de célula designada RB96 3D6.32.2.4 que produz o anticorpo 3D6 tem o número de acesso ATCC PTA-5130, foi depositado em 8 de Abril de 2003. A clonagem, caracterização e humanização de anticorpo 3D6 é 71 descrito na Publicação do Pedido de Patente US 20030165496 AI. Em resumo, a humanizaçao do anticorpo monoclonal de murino de péptido anti-Αβ (designado como m3D6) foi realizada pela isolaçao das sequências de ADN para as regiões variáveis de cadeia leve e cadeia pesada de m3D6 (VL e VH) pela transcrição reversa - reacção da cadeia da polimerase (RT-PCR) . Com base nas sequências de VL e VH de m3D6 determinadas, regiões de matriz humanas homólogas foram identificadas. Para garantir que o anticorpo humanizado reteve a capacidade de interagir com o antigénio de péptido Αβ, os resíduos de matriz vL e vH de murino críticos foram retidos na sequência 3D6 humanizada para preservar a estrutura global das regiões de domínio constante (CDRs) no contexto das sequências de cadeia leve capa humana e sequências de cadeia pesada IgGl. As sequências de ADN que codificam as sequências VL e VH 3D6 humanizadas identificadas por este processo (que inclui a sequência de péptido de sinal 5' e sequência doadora de junção de intrão 3') foram gerados pelo recozimento de oligonucleótidos de ADN de sobreposição sintetizados seguidos pelas reacções de preenchimento de ADN polimerase. A integridade de cada uma das sequências da região variável humanizada foi verificada pelo sequenciamento de ADN. A Figura 1 descreve uma representação esquemática da estrutura prognosticada de um anticorpo 3D6 de péptido anti-Αβ humanizado exemplar denominado h3D6v2. A Figura 2 identifica as sequências de aminoácido completas das cadeias leve e pesada de h3D6v2. O anticorpo 3D6 humanizado foi expressado pela transfecção de uma linha de célula hospedeira do Ovário do Hamster Chinês (CHO) com plasmideos de expressão que codificam genes de cadeia leve e cadeia pesada de anticorpo anti-Αβ. As células CHO que expressam o anticorpo foram isoladas usando procedimentos de selecção de medicamento/amplificação de gene com base em metotrexato 72 padrão. Uma linha de célula CHO clonal que exibe os fenótipos de produtividade e crescimento desejados foi seleccionada e usada para estabelecer uma linha de célula que expressa o anticorpo usando meio quimicamente definido isento de componentes derivados de animal ou ser humano. Exemplo II. Fabrico de Substância Medicamentosa de
Anticorpo An ti Αβ Humanizado 0 processo de fabrico de polipéptido começou com o descongelamento de uma cultura iniciadora de células clonais que expressam estavelmente o anticorpo anti-Αβ. As células foram cultivadas usando um meio quimicamente definido que não contivesse nenhuma proteína derivada de animal ou ser humano. As culturas foram depois expandidas e usadas para inocular um biorreator de semente, que por sua vez foi usado para inocular ciclos de biorreator de produção múltipla. 0 biorreator de produção foi operado no modo de lote alimentado. No final do ciclo de produção, o meio condicionado colhido foi clarificado pela microfiltração na preparação para processamento a jusante adicional.
Os processos de purificação consistiram em etapas cromatográficas padrão seguidas pela filtração. 0 anticorpo purificado foi concentrado pela ultrafiltração e diafiltrado em polissorbato-80 ausente de tampão de formulação. Opcionalmente, polissorbato 80 (derivado de vegetal) é adicionado à reunião de retido de ultrafiltração/ diafiltração, seguido pela filtração de retenção bacteriana. A substância medicamentosa foi armazenada congelada a -80 °C e mantida para o fabrico adicional em produto medicamentoso, que inclui as formulações líquidas estabilizadas descritas no presente documento.
Exemplo III. Preparação de Formulação de Anticorpo e
Placebo
Dois lotes de produto medicamentoso de anticorpo foram 73 fabricados. Um lote inicial foi fabricado pela combinação de substância medicamentosa numa formulação isenta de proteína animal e humana contendo 20 mg de substância activa de anticorpo anti-Αβ por ml, 10 mM de histidina, 10 mM de metionina, 4% de manitol, 0,005% de polissorbato-80, pH 6,0. O produto medicamentoso foi assepticamente enchida em frascos, a 100 mg de substância activa de anticorpo anti-Αβ/ίrasco. O frasco de produto medicamentoso acabado não conteve nenhum conservante e foi intencionado apenas para utilização única.
Um segundo lote de produto medicamentoso foi fabricado por um método similar usando uma formulação tampão sem polissorbato-80.
Exemplo IV. Análise da Estabilidade de Formulações com e sem Polissorbato-80 A estabilidade e, em particular, a integridade físico-química (tal como agregação, desamidação, hidrólise, e/ou rearranjo da ligação de dissulfureto) da formulação foram avaliadas pelos seguintes métodos bem conhecidos na técnica: aspecto; pH; concentração de proteína (A280); ELISA, em parte, como um teste de bioactividade; dodecil sulfato de sódio-electroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), em parte como um teste de agregação; cromatografia líquida de alto desempenho por exclusão de tamanho (SEC-HPLC), em parte, como um teste de agregação e estabilidade no geral; cromatografia líquida de alto desempenho de troca catiónica (CEX- HPLC), em parte, como um teste de desamidação e estabilidade no geral; e mapeamento de péptido. Estes métodos avaliaram a recuperação e integridade da proteína sob as condições de teste em várias temperaturas. A análise de aspecto das formulações foi conduzida de modo a determinar a qualidade das formulações em vários pontos de tempo. A análise foi conduzida com base na inspecção visual quanto à clareza, cor e a presença de 74 particulados. Por exemplo, o grau de opalescência foi analisado em termos de suspensões de referência. A análise de aparência das formulações fabricadas com e sem polissorbato 80 de acordo com a presente invenção demonstrou que ambas as formulações foram aceitáveis quando armazenadas em cada uma de -80 °C, 5 °C, 25 °C e 40 °C em cada um dos seguintes pontos no tempo: inicial, 1 mês, 2 meses, 3 meses, 6 meses, 9 meses e 12 meses.
Uma análise de pH foi realizada para determinar a manutenção do pH da formulação dentro de um intervalo aceitável de cerca de 5,5 a cerca de 6,5. A análise de pH de formulações fabricadas com e sem polissorbato 80 de acordo com a presente invenção demonstrou que ambas as formulações foram aceitáveis quando armazenadas em cada uma de -80 °C, 5 °C, 25 °C e 40 °C em cada um dos seguintes pontos no tempo: inicial, 1 mês, 2 meses, 3 meses, 6 meses, 9 meses e 12 meses. No geral, o pH nunca variou a seguir de 5,8 ou acima de 6,2. A análise da concentração de proteína pelos ensaios de A280 foi realizada para determinar a manutenção da concentração de proteína da formulação dentro de um intervalo aceitável de cerca de 17 mg/ml a cerca de 23 mg/ml. A análise da concentração de proteína de formulações fabricadas com e sem polissorbato 80 de acordo com a presente invenção demonstrou que ambas as formulações foram no geral aceitáveis quando armazenadas em cada uma de -80 °C, 5 °C, 25 °C e 40 °C em cada um dos seguintes pontos de tempo: inicial, 1 mês, 2 meses, 3 meses, 6 meses, 9 meses e 12 meses. Com a excepção das concentrações de proteína que variam levemente acima de 23 mg/ml para a formulação sem polissorbato 80 quando armazenada a 5 °C, 25 °C e 40 °C nos pontos de tempo de 3 mês, a concentração de proteína de outro modo permaneceu dentro dos intervalos aceitáveis. Consequentemente, a análise da concentração de proteína não demonstrou nenhuma perda detectável de proteína ocorrendo, 75 mesmo em condições aceleradas, particularmente para as formulações com polissorbato 80. Além disso, a concentração de proteina no geral falhou em demonstrar uma mudança dependente do tempo ou temperatura significativa subsequente ao ponto de tempo inicial. A manutenção da actividade biológica foi ensaiada, em parte, pelas técnicas de ELISA. A actividade biológica foi analisada como unidades de ligação (BU)/mg com a actividade aceitável sendo > 2500 BU/mg ou 50% (isto é, 5000 BU/mg é igual a 100%). A análise de ELISA de formulações fabricadas com e sem polissorbato 80 de acordo com a presente invenção demonstrou que ambas as formulações foram no geral aceitáveis quando armazenadas em cada uma de -80 °C, 5 °C, 25 °C e 40 °C em cada um dos seguintes pontos de tempo: inicial, 1 mês, 2 meses, 3 meses, 6 meses, 9 meses e 12 meses. Com a excepção da actividade biológica que varia levemente a seguir de 50% no ponto de tempo de 12 mês para ambas as formulações quando armazenadas a 40 °C, a actividade biológica de outro modo permaneceu dentro dos intervalos aceitáveis. A análise de SEC-HPLC foi conduzida como um teste de agregação, pureza e estabilidade no geral. As rodadas de SEC-HPLC sob condições usando cromatografia de fase móvel com um tampão dibásico de fosfato de sódio indicaram que a formulação foi aceitável se a análise de SEC-HPLC identificou > 90% de monómero de IgG, comparados com a percentagem de produto de peso molecular alto e produto de peso molecular baixo. A análise de SEC-HPLC das formulações fabricadas com e sem polissorbato 80 de acordo com a presente invenção demonstrou que ambas as formulações foram no geral aceitáveis quando armazenadas em cada uma de - 80 °C, 5 °C, 25 °C e 40 °C em cada um dos seguintes pontos de tempo: inicial, 1 mês, 2 meses, 3 meses, 6 meses, 9 meses e 12 meses. Com a excepção do monómero percentual que varia a seguir de 90% para ambas as formulações quando armazenadas 76 a 40 °C em cada ponto de tempo em e depois de 6 meses (onde a análise identificou mais do que pelo menos 10% de produto de peso molecular baixo para ambas as formulações em cada ponto de tempo), o monómero percentual foi de outro modo dentro do intervalo aceitável. A análise de SEC-HPLC no geral demonstrou que embora os perfis de peso molecular alto e peso molecular baixo foram diferentes com o tempo em amostras com e sem polissorbato, a forma monomérica do anticorpo no geral permaneceu constante, por exemplo, no ponto de tempo de 12 meses, quando a formulação foi armazenada a 5 °C. A análise de CEX-HPLC foi conduzida como um teste de aminação e estabilidade no geral. As rodadas de CEX-HPLC sob condições usando a cromatografia de fase móvel com um tampão de NaCl produziu perfil de eluição e tempos de retenção de picos predominantes que foram analisados como sendo comparável ou não comparável com os perfis de padrão de referência. A análise de CEX-HPLC de formulações fabricadas com e sem polissorbato 80 de acordo com a presente invenção demonstrou que ambas as formulações foram no geral aceitáveis quando armazenadas em cada uma de -80 °C, 5 °C, 25 °C e 40 °C em cada um dos seguintes pontos de tempo: inicial, 1 mês, 2 meses, 3 meses, 6 meses, 9 meses e 12 meses. Com a excepção do perfil de eluição e tempo de retenção dos picos predominantes não sendo comparável para ambas as formulações quando armazenadas a 40 °C em cada ponto de tempo em e depois de 3 meses, os picos predominantes foram de outro modo comparáveis aos picos de referência.
No geral, a análise das formulações com polissorbato 80 armazenadas a 5 °C possibilitaram as seguintes conclusões particularmente importantes: 1) as análises de opalescência, pH, ELISA, CEX-HPLC, SEC- HPLC e SDS PAGE todas mostraram mudanças mínimas na formulação em 9 meses; 2) as formulações armazenadas a 5 °C pareceram mais como as 77 amostras de referência em 9 meses do que as amostras aceleradas; 3) o mapeamento de péptido mostrou mudanças a 5 °C; e 4) os dados de tendência de SEC-HPLC a 5 °C prognosticou pelo menos 17,2 meses de estabilidade (veja-se a Figura 6), entretanto, na remoção da coluna, a variabilidade de instrumento e tampão, os dados possibilitaram um prognóstico de mais do que 30 meses de estabilidade (veja-se a Figura 7). Adicionalmente, as amostras aceleradas com polissorbato 80 armazenadas a 25 °C passaram em todas as especificações em 9 meses (Figura 4).
Além disso, a análise das formulações sem polissorbato 80 armazenadas a 5 °C possibilitaram as seguintes conclusões particularmente importantes: 1) análise de opalescência, pH e ELISA todas mostraram mudanças minimas na formulação em 9 meses; 2) resultados da CEX-HPLC e SDS PAGE mostraram descobertas comparáveis para amostras de referência ou o controlo a -80 °C em 9 meses; 3) a análise de SEC-HPLC mostrou mudanças menores em 9 meses embora as mudanças fossem mais pronunciadas em temperaturas aceleradas; e 4) os dados de tendência de SEC- HPLC prognosticaram pelo menos 18 meses de estabilidade, mesmo com os problemas de variabilidade do ensaio (veja-se a Figura 8).
As Figuras 3 a 5 são representações gráficas dos prognósticos de vida de prateleira para as formulações (com e sem PS80) fabricados de acordo com a presente invenção e armazenadas a 5 °C, 25 °C e 40 °C, respectivamente. No geral, as Figuras 3 a 5 indicam que o armazenamento das formulações da presente invenção em temperaturas mais altas reduz a vida de prateleira esperada. A Figura 3, em particular, indica que a formulação tem uma vida de prateleira esperada de pelo menos 18 meses quando a formulação é armazenada a 5 °C. A Figura 4 indica que o armazenamento da formulação na temperatura ambiente (25 °C) pode servir para reduzir a vida de prateleira esperada a 78 cerca de 12 meses. A Figura 5 demonstra ainda que o armazenamento da formulação a 40 °C pode servir para reduzir a vida de prateleira esperada em cerca de 4 meses. Exemplo de Referência V. Estudos de Estabilidade na Utilização de Metionina como um Antioxidante
Os estudos foram conduzidos para determinar o efeito da metionina na manutenção da estabilidade do anticorpo em formulações de anticorpo. A análise de SEC-HPLC foi conduzida em 6 meses em várias temperaturas em quatro amostras de anticorpo (usando um anticorpo IgG4 anti-CD22): uma formulação de anticorpo com 20 mM de succinato num pH de 6,0; uma formulação de anticorpo com 20 mM de succinato e 10 mM de metionina; uma formulação de anticorpo com 20 mM de succinato e 0,01% de PS80; e uma formulação de anticorpo com 20 mM de succinato, 10 mM de metionina e 0,01% de PS80. No geral, os resultados indicaram que a metionina desejavelmente diminui a formação de peso molecular alto (HMW). Além disso, a metionina diminui o aumento dependente da temperatura na percentagem de HMW (Veja-se a Figura 10).
Além disso, um estudo de estabilidade de pH (no pH 5,8, 6,0 e 6,2) foi conduzido em 6 semanas em várias temperaturas (5 °C e 40 °C) nas seguintes quatro amostras de anticorpo (um anticorpo IgG2 anti-B7.2): (1) uma amostra que inclui anticorpo, 10 mM de histidina e 150 mM de NaCl; (2) uma amostra que inclui anticorpo, 10 mM de histidina, 150 mM NaCl e 0,01% de PS80; (3) uma amostra que inclui anticorpo, 10 mM de histidina, 150 mM de NaCl e 10 mM de metionina; e (4) uma amostra que inclui anticorpo, 10 mM de histidina, 150 mM de NaCl, 10 mM de metionina e 0,01% de PS80. A análise de SEC-HPLC foi conduzida. Os resultados demonstraram que a metionina diminui o aumento dependente da temperatura na percentagem de formação de subproduto (por exemplo, subprodutos HMW) em relação ao intervalo de pH indicada, por exemplo, de cerca de pH 5,8 a cerca de pH 6,2 (veja-se a Figura 11). Como mostrado na Figura 11, as 79 amostras contendo metionina demonstraram uma quantidade baixa de agregação quando mantidas a 40 °C por seis semanas, que foi similar àquela para as amostras mantidas a 5 °C por seis semanas.
Exemplo VI. Análise de Excipiente de um Anticorpo IcfGl por meio da Calorimetria Diferencial de Varrimento
Uma meta primária de formulação medicamentosa de proteína é estabilizar uma proteína na sua forma nativa, biologicamente activa. Isto pode ser feito tipicamente pelo rastreio de vários excipientes numa formulação base e monitorando seu efeito no peso molecular e actividade da molécula. Estes parâmetros são indicativos de estabilidade. Uma outra medida de estabilidade é a desnaturação térmica que pode ser monitorizada usando uma variedade de técnicas biofísicas. No geral, níveis aumentados de estabilidade da proteína foram atribuídos às temperaturas de fusão, desnaturação ou decomposição altas. Consequentemente, as propriedades térmicas de um anticorpo monoclonal IgGl representativo foram monitorizadas na presença de vários excipientes usando um Calorímetro Diferencial de Varrimento Capilar VP. Especificamente, as Tms aparentes foram determinadas para as formulações que contêm 10 mM de histidina (pH 6,0) com vários excipientes. Diversos excipientes foram mostrados proporcionar estabilidade térmica aumentada ou diminuída. Porque níveis aumentados de estabilidade da proteína foram atribuídos a uma temperatura de fusão alta, excipientes em amostras que comunicam uma Tm2 ou Tm3 aumentadas, quando comparados ao valores de Tm2 / Tm3 de controlo (respectivamente, 74,9 °C e 83,4 °C), foram julgados ser excipientes especialmente desejáveis (veja-se o Quadro 1 a seguir).
Consequentemente, foi concluído que os excipientes tais como glicose (formulada numa concentração de 4% e 10%) , sacarose (formulada numa concentração de 4% e 10%) , sorbitol (formulada numa concentração de 4% e 10%) e 80 manitol (formulada numa concentração de 4% e 10%), realizou especialmente bem na estabilização de uma formulação de polipéptido liquida, em particular, uma formulação de IgG de anticorpo.
Quadro 1 Resultados de Análise de Excipiente
Excipiente Concentração T 1* T 2* ΑιηΛ T 3* Histidina (Controlo) 10 mM - 74, 9 83,4 NaCl 10 mM 69,3 74, 8 82,9 10 0 mM 67, 9 74, 4 82,4 50 0 mM 66,5 74,5 81,9 1 M 65, 4 74, 9 82,3 CaCl2 10 mM 68, 7 74,6 82, 7 10 0 mM 68,5 74,5 82,4 Metionina 30 mM - 74,5 83, 7 Vitamina C ~3 0 mM 52,2 68, 7 - Polissorbato 20 0,005% - 74,5 83, 7 0, 01% - 74,5 83,8 0, 1% - 74, 4 83, 7 Polissorbato 80 0,005% - 74,6 83,8 0, 01% - 74,5 83, 7 0, 1% - 74,5 83, 7 Glicose 0,5% - 74, 7 83,8 2% - 74, 9 83,9 4% - 75, 0 84,3 10% - 75, 8 84, 9 Sacarose 0,5% - 74,6 83,6 2% - 74, 8 83,8 4% - 75, 0 83,9 10% - 75,5 84, 4 Sorbitol 0,5% - 74, 8 83,6 2% - 75, 0 83,8 4% - 75,2 84, 1 10% - 75, 9 84, 8 81
Excipiente Concentração T 1* T 2* T 3* Manitol 0,5% - 74, 8 83,6 2% - 74, 9 83,8 4% - 75,2 84, 1 10% - 75, 9 84, 8 *No controlo (10 mM de histidina, pH 6,0) duas transições foram observadas, Tm2 e Tm3. Uma transição inicial (Tml) foi observada na presença de alguns excipientes.
LISTA DE SEQUÊNCIAS
<110> NEURALAB LIMITED WYETH
<120> FORMULAÇÃO DE ANTICORPO ΑΝΤΙ A BETA
<130> P047546EP <140> EP 06719621.2 <141> 27-01-2006 <150> US 60/648.631 <151> 28-01-2005 <160> 47 <170> Patentln versão 3.3
<210> 1 <211> 219 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> 82 <223> Construção sintética <400> 1 83
Asp Vai Vai Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45 Pro Gin Arg Leu Ile Tyr Leu Vai Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gin Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Vai Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 2 84
<211> 449 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Construção sintética <400> 2
Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45 Ala Ser Ile Arg Ser Gly Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Vai 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95 Vai Arg Tyr Asp His Tyr Ser Gly Ser Ser Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110 Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 85
Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai Ser Trp 145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Vai His Thr Phe Pro Ala Vai Leu 165 170 175
Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai vai Thr Vai Pro Ser 180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Vai Asn His Lys Pro 195 200 205
Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Lys Vai Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240
Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255
Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp 260 265 270
Pro Glu Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn 275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Vai 290 295 300
Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr 340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr 355 360 365
Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu 370 375 380
Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu 385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys 86 405 410 415 Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445
Lys <210> 3 <211> 113 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Anticorpo humanizado <220> <221> VARIANTE <222> 1 <223> Xaa = Asp ou Tyr <220> <221> VARIANTE <222> 7 <223> Xaa = Ser ou Thr <220> <221> VARIANTE <222> 10 <223> Xaa = Ser ou Thr <220> <221> VARIANTE <222> 15 87 <223> Xaa = Leu, Ile ou <220> <221> VARIANTE <222> 50 <223> Xaa = Arg ou Lys <220> <221> VARIANTE <222> 88 <223> Xaa = Vai ou Leu <220> <221> VARIANTE <222> 109 <223> Xaa = Vai ou Leu <400> 3
Xaa Vai vai Met Thr Gin Xaa Pro Leu Xaa Leu Pro Vai Thr Xaa Gly 15 10 15
Gin Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gin Gin Arg Pro Gly Gin Ser 35 40 45
Pro Xaa Arg Leu Ile Tyr Leu Vai Ser Lys Leu Asp Ser Gly Vai Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80
Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Xaa Gly Vai Tyr Tyr Cys Trp Gin Gly 85 90 95
Thr His Phe pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Xaa Glu Ile Lys 100 105 110
Arg
<210> 4 <211> 119 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Anticorpo humanizado sintético <220> <221> VARIANTE <222> 3 <223> Xaa = Gin, Lys ou Arg <220> <221> VARIANTE <222> 78 <223> Xaa = Ser ou Thr 89 <220> <221> VARIANTE <222> 87 <223> Xaa = Arg ou Lys <220> <221> VARIANTE <222> 88 <223> Xaa = Ala, Ser ou Thr <220> <221> VARIANTE <222> 114 <223> Xaa = Leu, Thr, Ile ou <400> 4
Glu Vai Xaa Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45 Ala Ser Ile Arg Ser Gly Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Vai 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Xaa Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Met Asn Ser Leu Xaa Xaa Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95 Vai Arg Tyr Asp HÍS Tyr Ser Gly Ser Ser Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Xaa Vai Thr Vai Ser Ser 115 90
<210> 5 <211> 113 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Anticorpo humanizado sintético <400> 5
Asp Vai Vai Met Thr Gin Ser 1 5
Pro Leu Ser Leu Pro Vai Thr 10
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys 20
Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn 35
Trp Leu Gin Gin Arg Pro Gly 40 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu 50 55
Vai Ser Lys Leu Asp Ser Gly 60
Leu Gly 15 Asp Ser Gin Ser Val Pro
Lys Ile 80
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly 65 70
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 75
Gin Gly 95
Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp 85
Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys Trp 90
Ile Lys
Thr His Phe Pro Arg Thr Phe 100
Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu 105 110
Arg
<210> 6 <211> 119 <212> PRT <213> Sequência artificial 91 <220> <223> Anticorpo humanizado sintético <400> 6
Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 -ao 45 Ala Ser Ile Arg Ser Gly Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Vai 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95 Vai Arg Tyr Asp His Tyr Ser Gly Sex Ser Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110 Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 <210> 7 <211> 219 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Anticorpo humanizado <400> 7 92
Asp Vai Vai Met Thr Gin Ser Pro 1 5
Gin Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys 20
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp 35 40
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Vai 50 55
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 65 70
Ser Arg Vai Gin Ala Glu Asp Vai 85
Thr His Phe Pro Arg Thr Phe Gly 100
Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai 115 120
Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser 130 135
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Vai Gin 145 150
Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Vai 165
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu 180
Lys His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu 195 200
Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg 210 215 <210> 8 <211> 449
Leu Ser Leu Pro Vai Thr Leu >1 10 15 Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asp Ser 25 30 Leu Gin Gin Arg Pro Gly Gin Ser 45 Ser Lys Leu Asp Ser Gly Vai Pro 60 Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 75 80 Gly Vai Tyr Tyr Cys Trp Gin Gly 90 95 Gly Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys 105 110 Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 125 Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe 140 Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gin 155 160 Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 170 175 Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 185 190 Vai Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 205
Gly Glu Cys 93
<212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Anticorpo humanizado sintético <400> 8
Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45 Ala Ser Ile Arg Ser Gly Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Val 50 55 60 94 94 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 65 70 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala 85 Vai Arg Tyr Asp His Tyr Ser Gly 100 Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser Ala 115 120 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser 130 135 Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe 145 150 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 165 Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 180 Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr 195 200 Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Lys 210 215 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 225 230 Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys 245 Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai 260 Pro Glu Vai Lys Phe Asn Trp Tyr 275 280 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 290 295 Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu His 305 310
Glu Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 75 80
Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 90 95
Ser Ser Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 105 110
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe 125
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 140
Pro Glu Pro Vai Thr Vai Ser Trp 155 160
Vai His Thr Phe Pro Ala Vai Leu 170 175
Ser Ser Vai Vai Thr Vai Pro Ser 185 190
Ile Cys Asn Vai Asn His Lys Pro 205
Vai Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 220
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 235 240
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 250 255
Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp 265 270
Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn 285
Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Vai 300
Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 315 320 95
Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 The Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445
Lys <210> 9 <211> 113 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Anticorpo humanizado <220> <221> VARIANTE <222> 3 <223> Xaa = Vai ou Leu sintético <220> 96 <221> VARIANTE <222> 7 <223> Xaa = Ser ou Thr <220> <221> VARIANTE <222> 14 <223> Xaa = Thr ou Ser <220> <221> VARIANTE <222> 17 <223> Xaa = Gin, Asp ou <220> <221> VARIANTE <222> 30 <223> Xaa = Ile ou Vai <220> <221> VARIANTE <222> 50 <223> Xaa = Arg ou Lys <220> <221> VARIANTE <222> 88 <223> Xaa = Vai ou Leu <220> <221> VARIANTE <222> 105 <223> Xaa = Gly ou Ala <220> 97 <221> VARIANTE <222> 109 <223> Xaa = Vai ou Leu <400> 9
Asp Vai Xaa Met Thr Gin Xaa Pro Leu Ser Leu Pro Vai Xaa Leu Gly 15 10 15
Xaa Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Asn Ile Xaa His Ser 20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45
Pro Xaa Leu Leu Ile Tyr Lys Vai Ser Asn Arg Phe Ser Gly Vai Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80
Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Xaa Gly Vai Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly 85 90 95
Ser His Vai Pro Leu Thr Phe Gly Xaa Gly Thr Lys Xaa Glu Ile Lys 100 105 110
Arg
<210> 10 <211> 123 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Anticorpo humanizado sintético <220> <221> VARIANTE <222> 1 98 <223> Xaa = Gin ou Glu <220> <221> VARIANTE <222> 2 <223> Xaa = Vai ou Ala <220> <221> VARIANTE <222> 64 <223> Xaa = Ser ou Thr <220> <221> VARIANTE <2 2 2> 77 <223> Xaa = Lys ou Arg <220> <221> VARIANTE <222> 78 <223> Xaa = Ser ou Thr <220> <221> VARIANTE <222> 83 <223> Xaa = Thr ou Ser <220> <221> VARIANTE <222> 84 <223> Xaa = Met, Ile ou <220> <221> VARIANTE <222> 86 99 99 <223> Xaa = Asn, Ser ou Thr <220> <221> VARIANTE <222> 87 <223> Xaa = Met, Vai ou Leu <220> <221> VARIANTE <222> 118 <223> Xaa = Leu ou Ser <400> 10
Xaa Xaa Thr Leu Lys Glu Ser Gly 1 5
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe 20
Gly Met Gly Vai Ser Trp Ile Arg 35 40
Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp 50 55
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser 65 70
Vai Leu Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Asp 85
Cys Vai Arg Arg Pro Ile Thr Pro 100
Trp Gly Gin Gly Thr Xaa Vai Thr 115 120 <210> 11 <211> 113
Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu 10 15 Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 25 30 Gin Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 45 Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Xaa 60 Lys Asp Thr Ser Xaa Xaa Gin Val 75 80 Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 90 95 Vai Leu Val Asp Ala Met Asp Tyr 105 110 Vai Ser Ser 100
<212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Anticorpo humanizado sintético <400> 11
Asp Vai Vai Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Vai Thr Leu Gly 15 io 15
Gin Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Asn Ile Ile His Ser 20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Vai Ser Asn Arg Phe Ser Gly Vai Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80
Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly 85 90 95
Ser His Vai Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys 100 105 HO
Arg
<210> 12 <211> 123 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Anticorpo humanizado sintético 101 <400> 12 101 Gin Vai Tbt Leu Lys Glu Ser Gly 1 5
Pro Vai Leu Vai Lys Pro Thr Glu 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe 20
Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 25 30
Gly Met Gly Vai Ser Trp Ile Arg 35 40
Gin Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 45-
Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp 50 55
Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser 65 70
Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gin Vai 75 80
Vai Leu Thr Met Thr Asn Met Asp 85
Pro Vai Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 90 95
Cys Vai Arg Arg Pro Ile Thr Pro 100
Vai Leu Vai Asp Ala Met Asp Tyr 105 110
Vai Ser Ser
Trp Gin Gin Gly Thr Leu Vai Thr 115 120 <210> 13 <211> 219 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Anticorpo humanizado <400> 13 102
Asp Vai Vai Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Vai Thr Leu Gly 15 10 15
Gin Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Asn Ile Ile His Ser 20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Vai Ser Asn Arg Phe Ser Gly Vai Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80
Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly 85 90 95
Ser His Vai Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys 100 105 110
Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125
Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140
Tyr Pro Arg Gly Ala Lys Vai Gin Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gin 145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175
Tyr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190
Lys His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 195 200 205
Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 14 <211> 453 103
<212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Anticorpo humanizado sintético <400> 14
Glu Vai Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Vai Leu Vai Lys Pro Thr Glu 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Gly Vai Ser Trp Ile Arg Gin Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Axg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gin Vai 65 70 75 80 Vai Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Vai Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 104
Cys Vai Arg Arg Pro Ile Thr Pro Vai Leu vai Asp Ala Met Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai 115 Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 120 125 Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala 130 135 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 140 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 145 150 Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vai 155 160
Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Vai His Thr Phe 165 170 175 Pro Ala Vai Leu Gin Ser Ser 180 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Vai 185 190 Thr Vai Pro Ser Ser Ser Leu 195 Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Vai 200 205 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 210 215 Lys Vai Asp Lys Lys Vai Glu Pro Lys 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp Vai 260 265 270 Ser His Glu Asp Pro Glu Vai 275 Lys Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai 280 285 Glu Vai His Asn Ala Lys Thr 290 295 Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser 300
Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu His Gin Asp Trp Leu 305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro 340 345 350
Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin 105 355 360 365
Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 370 375 380
Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Gin Asn Asn Tyr Lys Thr Tyr 385 390 395 400
Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 405 410 415
Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser 420 425 430
Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser 435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys 450
<210> 15 <211> 132 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Anticorpo humanizado sintético <220> <221> SINAL <222> 1-20 <223> <220> <221> CADEIA <222> 21 - 132 <223> <400> 15 106
Met Arg Leu Pro Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Vai Ser -20 -15 -10 -5
Gly Ser Ser Gly Asp Vai Vai Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro -11 5 10
Vai Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Asn 15 20 25
Ile Vai His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Lys 30 35 40
Pro Gly Gin Ser Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Lys Vai Ser Asn Arg Phe 45 50 55 60
Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 65 70 75
Thr Leu Lys Ile Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr 80 85 90
Cys Phe Gin Gly Ser His Vai Pro Leu Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys 95 100 105
Leu Glu Ile Lys 110
<210> 16 <211> 142 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Anticorpo humanizado sintético <220> <221> SINAL <222> 1-19 <223> 107 <220> <221> CADEIA <222> 20-1 <223> <400> 16
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Vai Ala Ala Pro Arg Trp -15 -10 -5
Vai Leu Ser Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Vai Lys -11 5 10
Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu 15 20 25
Ser Thr Asn Gly Met Gly Vai Ser Trp Ile Arg Gin Pro Pro Gly Lys 30 35 40 45
Gly Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Glu Asp Lys Arg Tyr 50 55 60
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys 65 70 75
Asn Gin Vai Ser Leu Lys Leu Ser Ser Vai Thr Ala Ala Asp Thr Ala 80 85 90
Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Arg Ile Ile Tyr Asp Vai Glu Asp Tyr 95 100 105
Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 110 115 120
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<221> SINAL 108 <222> 1-19 <223> <220> <221> CADEIA <222> 20 - 131 <223> <400> 17
Met Lys Leu Pro Vai Arg Leu Leu Vai Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala -15 -10 -5
Ser Ser Ser Asp Vai Leu Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Vai -11 5 10
Ser Leu Gly Asp Gin Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Asn Ile 15 20 25
Vai His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro 30 35 40 45
Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Vai Ser Asn Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Vai Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 65 70 75
Leu Lys Ile Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Leu Gly Vai Tyr Tyr Cys 80 85 90
Phe Gin Gly Ser His Vai Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu 95 100 105
Glu Leu Lys 110
<210> 18 <211> 142 <212> PRT 109 <213> Sequência artificial <220> <223> Anticorpo humanizado sintético <220> <221> SINAL <222> 1-19 <223> <220> <221> CADEIA <222> 20 - 142 <223> <400> 18 110
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu -15
Leu Leu Vai Ala Ala Pro Arg Trp -10 -5
Vai Leu Ser Gin Leu Gin Leu Gin -11 5
Glu Ser Gly Pro Gly Leu Vai Lys 10
Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr 15 20
Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu 25
Ser Thr Asn Gly Met Gly Vai Ser 30 35
Trp Ile Arg Gin Pro Pro Gly Lys 40 45
Gly Leu Glu Trp Ile Gly His Ile 50
Tyr Trp Asp Glu Asp Lys Arg Tyr 55 60
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Vai 65
Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys 70 75
Asn Gin Phe Ser Leu Lys Leu Ser 80 85
Ser Vai Thr Ala Ala Asp Thr Ala 90
Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Arg 95 100
Ile Ile Tyr Asp Vai Glu Asp Tyr 105
Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 <210> 19 <211> 142 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Anticorpo humanizado sintético <220> <221> SINAL <222> 1-19 <223> <220> 111 <221> CADEIA <222> 20 - 142 <223> <400> 19
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Vai Ala Ala Pro Arg Trp -15 -10 -5
Vai Leu Ser Gin Leu Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Vai Lys -11 5 10
Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu 15 20 25
Ser Thr Asn Gly Met Gly Vai Ser Trp Ile Arg Gin Pro Pro Gly Lys 30 35 40 45
Gly Leu Glu Trp Leu Gly His Ile Tyr Trp Asp Glu Asp Lys Arg Tyr 50 55 60
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Vai Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys 65 70 75
Asn Gin Vai Ser Leu Lys Leu Ser Ser Vai Thr Ala Ala Asp Thr Ala 80 85 90
Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Arg Ile Ile Tyr Asp Vai Glu Asp Tyr 95 100 105
Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 110 115 120
<210> 20 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Anticorpo humanizado sintético 112 <400> 20
Asp Vai Vai Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Vai Thr Pro Gly 15 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Ile Vai His Ser 20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45
Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Lys Vai Ser Asn Arg Phe Ser Gly Vai Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80
Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys Phe Gin Ser 85 90 95
Ser His Vai Pro Leu Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 21 <211> 120 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Anticorpo humanizado <400> 21 113
Gin Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Vai Vai Gin Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Ser Vai Gly Trp Ile Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Vai 65 70 75 80 Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gin 100 105 110 Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 120
<210> 22 <211> 120 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Anticorpo humanizado sintético <400> 22 114
Gin Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Vai Vai Gin Pro Gly Arg 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Ser 20 25 30
Gly Met Ser Vai Gly Trp Ile Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45
Trp Vai Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60
Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu 65 70 75 80
Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 <210> 23 <211> 120 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Anticorpo humanizado <400> 23 115
Gin Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Vai Vai Gin Pro Gly Arg 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Ser 20 25 30
Gly Met Ser Vai Gly Trp Ile Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45
Trp Vai Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60
Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu 65 70 75 80
Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 <210> 24 <211> 120 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Anticorpo humanizado <400> 24 116
Gin Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly 1 5
Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe 20
Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Ser 25 30
Gly Met Ser Vai Gly Trp Ile Arg 35 40
Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 45
Trp Val Ala His Ile Trp Trp Asp 50 55
Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 60
Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser 65 70
Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu 75 80
Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg 85
Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 90 95
Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala 100
Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gin 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 25 <211> 120 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Anticorpo humanizado sintético <400> 25 117 Gin Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly 1 5
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe 20
Gly Met Ser Vai Gly Trp Ile Arg 35 40
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp 50 55
Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser 65 70
Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg 85
Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala 100
Gly Vai Vai Gin Pro Gly Arg 10 15 Gly Phe Thr Leu Ser Thr Ser 30 Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 45 Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 60 Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu 75 80 Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr 90 95 Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gin 110
Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 <210> 26 <211> 120 <212> PRT <213> Sequência artific <220> <223> Anticorpo humaniz sintético <400> 26 118
Gin Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Vai Vai Gin Pro Gly Arg 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Ser 20 25 30
Gly Met Ser Vai Gly Trp Ile Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Vai 65 70 75 80
Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 <210> 27 <211> 120 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Anticorpo humanizado <400> 27 119
Gin Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Vai Vai Gin Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Ser Vai Gly Trp Ile Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Vai Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Vai 65 70 75 80 Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gin 100 105 110 Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 120
<210> 28 <211> 120 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Anticorpo humanizado sintético <400> 28 120
Gin Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Vai Vai Gin Pro Gly Arg 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30
Gly Met Ser Vai Gly Trp Ile Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60
Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Vai 65 70 75 80
Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gin
100 105 HO
Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 120
<210> 29 <211> 120 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Anticorpo humanizado sintético <400> 29 121
Gin Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Vai Vai Gin Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Ser VaL Gly Trp Ile Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu 65 70 75 80 Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gin 100 105 110 Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 <210> 30 <211> 120 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Anticorpo humanizado <400> 30
Gin Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Vai Vai Gin Pro Gly Arg 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Ser 20 25 30 122
Gly Met Ser Vai Gly Trp Ile Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45
Trp Vai 50 Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp 55 Lys Tyr 60 Tyr Asn Pro Ser Leu 65 Lys Ser Arg Leu Thr 70 Ile Ser Lys Asp Thr 75 Ser Lys Asn Thr Vai 80 Tyr Leu Gin Met Asn 85 Ser Leu Arg Ala Glu Asp 90 Thr Ala Vai Tyr 95 Tyr Cys Ala Arg Arg 100 Thr Thr Thr Ala Asp 105 Tyr Phe Ala Tyr Trp 110 Gly Gin Gly Thr Thr 115 Vai Thr Vai Ser Ser 120 <210> 31 <211> 120 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Anticorpo humanizado <400> 31 123
Gin Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Vai Vai Gin Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Ser Vai Gly Trp Ile Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Vai 65 70 75 80 Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gin 100 105 110 Gly Thr Thr vai Thr Vai Ser Ser 115 120 <210> 32 <211> 121 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Anticorpo humanizado <400> 32 124
Gin Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly 1 5
Gly Gly Vai Vai Gin Pro Gly Arg 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe 20
Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Ser 25 30
Gly Met Ser Vai Gly Trp Ile Arg 35 40
Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp 50 55
Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser 65 70
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Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg 85
Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr 90 95
Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala 100
Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gin 105 110
Vai
Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 <210> 33 <211> 121 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Anticorpo humanizado <400> 33 125
Gin Val Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Vai Vai Gin Pro Gly Arg 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30
Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45
Trp Val Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60
Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val 65 70 75 80
Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Val 115 120 <210> 34 <211> 120 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Anticorpo humanizado sintético <400> 34 126 126 Gin Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly 1 5 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe 20 Gly Met Ser Vai Gly Trp Ile Arg 35 40 Trp Vai Ala His lie Trp Trp Asp 50 55 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser 65 70 Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg 85 Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala 100 Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser
Gly Gly Vai Vai Gin Pro Gly Arg 10 15
Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 25 , 30
Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 45
Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 60
Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu 75 80
Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr 90 95
Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gin 105 110 115 120 <210> 35 <211> 120 <212> PRT <213> Sequência art if <220> <223> Anticorpo human icial izado sintético <400> 35 127 Gin Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Vai Vai Gin Pro 15 10
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser 20 25 30
Gly Met Ser Vai Gly Trp Ile Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly 35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn 50 55 60
Gly Arg 15 Thr Ser Leu Glu Pro Ser
Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75
Thr Leu 80
Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai 85 90
Tyr Tyr 95
Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp 100 105 110
Gly Gin
Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 <210> 36 <211> 120 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Anticorpo humanizado <400> 36 128
Gin Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Vai Vai Gin Pro Gly Arg 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Ser 20 25 30
Gly Met Ser Vai Gly Trp Ile Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45
Trp Vai Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60
Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Vai 65 70 75 80
Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 120
<210> 37 <211> 120 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Anticorpo humanizado sintético <400> 37 129
Gin Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Vai Vai Gin Pro Gly Arg 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Ser 20 25 30
Gly Met Ser Vai Gly Trp Ile Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45
Trp Vai Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu 65 70 75 80
Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 120
<210> 38 <211> 120 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Anticorpo humanizado sintético <400> 38
Gin 1 Vai Gin Leu Vai 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Vai Vai Gin Pro Gly 15 Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Ser 20 25 30
Gly Met Ser Vai Gly Trp Ile Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 130 35 40 45 Trp Leu 50 Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp 55 Lys Tyr 60 Tyr Asn Pro Ser Leu 65 Lys Ser Arg Phe Thr 70 Ile Ser Lys Asp Thr 75 Ser Lys Asn Thr Leu 80 Tyr Leu Gin Met Asn 85 Ser Leu Arg Ala Glu Asp 90 Thr Ala Vai Tyr 95 Tyr Cys Ala Arg Arg 100 Thr Thr Thr Ala Asp 105 Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly 110 Gin Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 <210> 39 <211> 120 <212> PRT Λ PO \—1 CM V Sequência artificial <220> <223> Anticorpo humanizado <400> 39 131
Gin Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Vai Vai Gin Pro Gly Arg 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30
Gly Met Ser Vai Gly Trp Ile Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45
Trp Vai Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60
Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu 65 70 75 80
Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 <210> 40 <211> 120 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Anticorpo humanizado <400> 40 132
Gin Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Vai Vai Gin Pro Gly Arg 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Ser 20 25 30
Gly Met Ser Vai Gly Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Vai 65 70 75 80
Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 <210> 41 <211> 120 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Anticorpo humanizado <400> 41 133 65 Vai Gin Leu Vai Glu 5 Ser Gly Gly Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser 20 25 Met Ser Vai Gly Trp Ile Arg Gin 35 40 Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp 50 55 Lys Ser Arg Leu Thr 70 Ile Ser Lys Leu Gin Met Asn Ser 85 Leu Arg Ala Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp 100 105 Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 <210> 42 <211> 113 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Anticorpo humanizado <220> <221> VARIANTE <222> 2 <223> Xaa = Vai ou Ile <220> <221> VARIANTE <222> 7 10 90 30 75 60 45 110
Gly Arg 15 Thr Ser Leu Glu Pro Ser
Thr Vai 80
Tyr Tyr 95
Gly Gin 134 <223> Xaa = Ser ou Thr <220> <221> VARIANTE <222> 14 <223> Xaa = Thr ou Ser <220> <221> VARIANTE <222> 15 <223> Xaa = Leu ou Pro <220> <221> VARIANTE <222> 30 <223> Xaa = Ile ou Vai <220> <221> VARIANTE <222> 50 <223> Xaa = Arg, Gin, ou <220> <221> VARIANTE <222> 88 <223> Xaa = Vai ou Leu <220> <221> VARIANTE <222> 105 <223> Xaa = Gin ou Gly <220> <221> VARIANTE <222> 108 135 <223> Xaa = Lys ou Arg <220> <221> VARIANTE <222> 109 <223> Xaa = Vai ou Leu <400> 42
Asp Xaa Vai Met Thr Gin Xaa Pro Leu Ser Leu Pro Vai Xaa Xaa Gly 1 5 10 15 Gin Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Xaa Tyr Ser 20 25 30 Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His Trp Phe Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45 Pro Xaa Leu Leu Ile Tyr Lys Vai Ser Asn Arg Phe Ser Gly Vai Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Xaa Gly Vai Tyr Tyr Cys Ser Gin Ser 85 90 95 Thr His Vai Pro Trp Thr Phe Gly Xaa Gly Thr Xaa Xaa Glu Ile Lys 100 105 110
Arg
<210> 43 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Anticorpo humanizado sintético 136 <220> <221> VARIANTE <222> 1 <223> Xaa = Glu ou Gin <220> <221> VARIANTE <222> 7 <223> Xaa = Ser ou Leu <220> <221> VARIANTE <222> 46 <223> Xaa = Glu, Vai, Asp ou Ser <220> <221> VARIANTE <222> 63 <223> Xaa = Thr ou Ser <220> <221> VARIANTE <222> 75 <223> Xaa = Ala, Ser, Vai ou Thr <220> <221> VARIANTE <222> 76 <223> Xaa = Lys ou Arg <220>
Glu ou Asp <221> VARIANTE <222> 89 <223> Xaa = 137 <220> <221> VARIANTE <222> 107 <223> Xaa = Leu <400> 43
Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gin 100 <210> 44 <211> 113 <212> PRT <213> Sequência artifi <220> <223> Anticorpo humani ial ado sintético
Gly Thr Xaa Vai Thr Vai Ser Ser 105 110 <400> 44
Xaa Vai Gin Leu Vai Glu Xaa Gly 1 5
Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 20
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 25 30
Ser Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala 35 40
Pro Gly Lys Gly Leu Xaa Leu Vai 45
Ala Gin Ile Asn Ser Vai Gly Asn 50 55
Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Xaa Vai 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 65 70
Asp Asn Xaa Xaa Asn Thr Leu Tyr 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala 85
Xaa Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 90 95 138
Asp Vai Vai Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Vai Thr Leu Gly 15 10 15
Gin Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Ile Tyr Ser 20 25 30
Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His Trp Phe Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Vai Ser Asn Arg Phe Ser Gly Vai Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80
Ser Arg vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai Thr Tyr Cys Ser Gin Ser 85 90 95
Thr His Vai Pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys 100 105 110
Arg
<210> 45 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Anticorpo humanizado sintético <400> 45 139
Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Ser Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val 35 40 45 Ala Gin Ile Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110
<210> 46 <211> 219 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Anticorpo humanizado sintético <400> 46 140
Asp Vai Vai Met Thr Gin Ser Pro 1 S
Gin Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg 20
Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His Trp 35 40
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Vai 50 55
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 65 70
Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai 85
Thr His Vai Pro Trp Thr Phe Gly 100
Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai 115 120
Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser 130 135
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Vai Gin 145 150
Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Vai 165
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu 180
Lys His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu 195 200
Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg 210 215 <210> 47 <211> 442
Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 10 15 Ser Ser Gin Ser Leu Ile Tyr Ser 25 30 Phe Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 45 Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 60 Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 75 80 Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gin Ser 90 95 Gin Gly Thr Lys val Glu Ile Lys 105 110 Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 125 Vai Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 140 Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin 155 160 Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 170 175 Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 185 190 val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser
Gly Glu Cys 205 141
<212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Anticorpo humanizado sintético <400> 47 142
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Ser Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val 35 40 45 Ala Gin Ile Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 115 120 125 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 130 135 140 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 145 150 155 160 Gly Val His Thr Phe Pro Ala val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 165 170 175 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 180 185 190 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 195 200 205 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 210 215 220
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro 143 225 230 235 240
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu 260 Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His 275 280 Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr 340 Leu Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu 355 360 Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu Trp 370 375 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai 385 390 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp 405 Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His 420 Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 Gly Lys
Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys 250 255
Asp Pro Glu Vai Lys Phe Asn Trp 265 270
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 285
Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu 300
Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn 315 320
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 330 335
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 345 350
Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr 365
Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 380
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 395 400
Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn 410 415
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 425 430 144
DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO
Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.
Documentos de patente referidos na descrição wo 03070760 A [0010] [0084] us 4946778 A [0042] us 5225539 A [0042] [0105] us 20030165496 AI [0045] [0118] [0169] us 20040087777 AI [0045] [0118] wo 0246237 A3 [0045] [0118] wo 04080419 A2 [0045] [0118] wo 03077858 A2 [0045] [0121] wo 04108895 A2 [0045] [0123] wo 03016466 A2 [0045] wo 0162801 A2 [0045] [0129] [0130] wo 02088306 A2 [0045] [0118] [0120] wo 03070760 A2 [0045] us 6420113 B, Buechler [0093] [0107] us 5223409 A, Ladner [0095] wo 9218619 A, Kang [0095] wo 9117271 A, Dower [0095] wo 9220791 A, Winter [0095] wo 9215679 A, Markland [0095] wo 9301288 A, Breitling [0095] wo 9201047 A, McCafferty [0095] wo 9209690 A, Garrard [0095] wo 9002809 A, Ladner [0095] us 8602269 W [0105] EP 184187 A . [0105] EP 171496 A . [0105] 145 • ΕΡ 173494 A [0105] • WO 8601533 A, Neuberger [0105] • US 4816567 A, Cabilly [0105] • EP 125023 A [0105] • US 6150584 A [0106] • US 6114598 A [0106] • US 5770429 A [0106] • WO 9308829 A [0108] • US 4676980 A [0109] • WO 02088307 A2 [0118] • US 303478 A [0118] [0123] • US 0545614 W [0118] [0123] • US 20040082762 AI [0121] • US 20050118651 AI [0123] • US 304986 A [0125] [0126] [0128] [0131] [0133] • US 0545515 W [0125] [0126] • WO 2006066049 A [0128] [0131] [0132] [0133] • US 20050249725 AI [0129] [0130] • US 111304986 A [0132] • US 5786180 A [0135] • WO 03015691 A2 [0135] • EP 06719621 A [0189] • US 60648631 B [0189]
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Claims (21)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Uma formulação estável, que compreende: (a) um anticorpo monoclonal anti-Αβ humanizado numa concentração de desde 17 mg/ml até 23 mg/ml, em que o anticorpo humanizado compreende uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 e uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de resíduos 1-448 de SEQ ID NO: 2; (b) histidina numa concentração de desde 5 mM até 15 mM; (c) manitol numa quantidade de desde 2% p/v até 6% p/v; (d) metionina numa concentração de desde 5 mM até 15 mM, e (e) polisorbato numa quantidade de desde 0,001% p/v até 0,01% p/v, em que a formulação tem um pH de desde 5,5 a 6,5.
2. A formulação de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo está presente numa concentração de 20 mg/ml.
3. A formulação de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que a histidina está presente numa concentração de 10 mM.
4. A formulação de qualquer reivindicação anterior, em que o manitol está presente numa quantidade de 4% p/v.
5. A formulação de qualquer reivindicação anterior, em que a metionina está presente numa concentração de 10 mM.
6. A formulação de qualquer reivindicação anterior, em que o polisorbato está presente numa quantidade de 0,005% p/v.
7. A formulação de qualquer reivindicação anterior, em que o pH é 6,0. 2
8. A formulação de qualquer reivindicação anterior, em que a histidina é L-histidina, o manitol é D-manitol, a metionina é L-metionina, e o polisorbato é polisorbato-80.
9. Uma forma farmacêutica de dosagem unitária que compreende uma formulação de acordo com qualquer reivindicação anterior, que compreende desde 10 mg até 250 mg do anticorpo monoclonal anti-Αβ humanizado.
10. A forma farmacêutica de dosagem unitária de acordo com a reivindicação 9, que compreende desde 40 mg até 200 mg do anticorpo monoclonal anti-Αβ humanizado.
11. A forma farmacêutica de dosagem unitária de acordo com a reivindicação 10, que compreende desde 60 mg até 160 mg do anticorpo monoclonal anti-Αβ humanizado.
12. A forma farmacêutica de dosagem unitária de acordo com a reivindicação 11, que compreende desde 80 mg até 120 mg do anticorpo monoclonal anti-Αβ humanizado.
13. A forma farmacêutica de dosagem unitária de acordo com a reivindicação 12, que compreende 100 mg do anticorpo monoclonal anti-Αβ humanizado.
14. Um produto terapêutico, que compreende: (i) um frasco de vidro que contém uma formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, que compreende desde 10 mg até 250 mg do anticorpo monoclonal anti-Αβ humanizado; e (ii) rótulo para utilização que compreende instruções para utilizar o volume apropriado da formulação para alcançar uma dose de desde 0, 0001 mg/kg até 100 mg/kg num paciente. 3 15. 0 produto terapêutico de acordo com a reivindicação 14, que compreende desde 40 mg até 200 mg do anticorpo monoclonal anti-Αβ humanizado.
16. O produto terapêutico de acordo com a reivindicação 15, que compreende desde 60 mg até 160 mg do anticorpo monoclonal anti-Αβ humanizado. 17. 0 produto terapêutico de acordo com a reivindicação 16, que compreende desde 80 mg até 120 mg do anticorpo monoclonal anti-Αβ humanizado.
18. O produto terapêutico de acordo com a reivindicação 17, que compreende 100 mg do anticorpo monoclonal anti-Αβ humanizado. 19. 0 produto terapêutico de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 18, em que a dose é desde 0,01 mg/kg até 5 mg/kg. 20 . 0 produto terapêutico de acordo com a reivindicação 19, em que a dose é desde 1 mg/kg até 2 mg/kg. 21. 0 produto terapêutico de acordo com a reivindicação 14, em que a dose é 5 mg/kg • 22 . 0 produto terapêutico de acordo com a reivindicação 14, em que a dose é 10 mg/kg. 23. 0 produto terapêutico de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 22, em que a utilização é uma administração subcutânea.
24. O produto terapêutico de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 22, em que a utilização é uma 4 administraçao intravenosa.
25. A formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, a forma farmacêutica de dosagem unitária de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 13, ou o produto terapêutico de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 24, para utilização no tratamento ou profilaxia de uma doença caracterizada por depósitos de Αβ.
26. A formulação, forma farmacêutica de dosagem unitária, ou produto terapêutico de acordo com a reivindicação 25, em que a doença é a doença de Alzheimer.
27. Utilização de uma formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, no fabrico de um medicamento para utilização no tratamento ou profilaxia de uma doença caracterizada por depósitos de Αβ.
28. A utilização de acordo com a reivindicação 27, em que a doença é a doença de Alzheimer.
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