PT1140071E - Utilização de antagonista do receptor at-1 ou modulador do receptor at-2 para o tratamento de doenças associadas com um aumento de receptores at-1 ou at-2 - Google Patents

Description

ΡΕ1140071 1 DESCRIÇÃO "UTILIZAÇÃO DE ANTAGONISTA DO RECEPTOR AT-1 OU MODULADOR DO RECEPTOR AT-2 PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS ASSOCIADAS COM UM AUMENTO DE RECEPTORES AT-1 OU AT-2" O angiotensinogénio, uma a2-macroglicoproteína, é clivado pelo enzima renina dando origem à decapeptídeo angiotensina 1, a qual é ela própria muito ligeiramente biologicamente activa. No passo que se segue da cascata, dois outros amino ácidos são separados por clivagem pela acção do enzima de conversão do enzima angiotensina (ACE), o qual é principalmente ligado (fixado) no endotélio, com a formação de angiotensina II. Esta última é encarada como sendo um dos mais potentes vasoconstritores naturais. A angiotensina II interactua com receptores específicos sobre a superfície da célula alvo. Tem sido actualmente conseguido sucesso na identificação de subtipos de receptores os quais são por exemplo, designados receptores ΑΤχ e receptores AT2. Estudos feitos sobre o sistema renina-angiotensina, particularmente em relação com a hipertensão, aumentaram quase exponencialmente na última década. Como resultado, o número de receptores para Angiotensina li foram actualmente identificados e alguns deles foram clonados e analisados. Recentemente, foram feitos esforços consideráveis para identificar as 2 ΡΕ1140071 substâncias que se ligam ao receptor ΑΤχ, sendo os compostos activos desta natureza frequentemente denominados antagonistas da angiotensina II. Como consequência da inibição do receptor ΑΤχ, estes antagonistas podem, por exemplo, ser utilizados com agentes antihipertensores ou para o tratamento da insuficiência cardiaca congestiva.

Os receptores ΑΤχ e AT2 também foram estudados quanto à sua distribuição e propriedades biológicas e revelaram que, apesar de uma homologia de 30%, apresentavam uma distribuição e actividade muito diferentes. O receptor de ΑΤχ, que desempenha uma parte major na regulação da pressão sanguínea, foi encontrado no córtex adrenal, rim, útero, etc. A um nivel celular foi encontrado em fibroblastos, macrófagos e células musculares lisas (SMC) .

Em contraste, o receptor AT2 tem sido encontrado principalmente em tecidos fetais mas também no adulto especialmente em tecido patológico tal como doença isqué-mica do miocárdio. Aqui tem sido localizado em fibroblastos e células endoteliais. A finalidade dos estudos aqui a seguir descritos consiste em avaliar a distribuição dos receptores ΑΤχ e AT2 no pulmão humano usando essencialmente as metodologias imunocitoquimicas e de hibridização in situ. 3 ΡΕ1140071

Previamente, foram feitos anticorpos específicos contra epítopos do receptor ATi mas não existiam tais instrumentos (ferramentas) específicos em relação ao receptor AT2. Estudos histológicos dependem assim de antagonistas do receptor marcados com rádio juntamente com autoradiografia a qual apenas proporciona uma localização de tecido relativamente imperfeita. Nos últimos dois anos, contudo, anticorpos bem caracterizados específicos em relação ao receptor humano tornaram-se disponíveis e têm sido assim sido usados nos estudos confiados (realizados) aqui a seguir. Métodos e Materiais 1. Anticorpos e hibridização in situ (SH) exploram especificidade e titulação

Afim de confirmar a especificidade da imunocito-química (ICC) e dos estudos ISH, blocos embebidos em parafina de (córtex e medula) da supra-renal humana normal são obtidos a partir dos aequivos de Pathology Dept. University Hospital, Ghent, Belgium, e são usados como material de teste. Os receptores ATi são conhecidos como estando predominantemente localizados no córtex da supra-renal e AT2 na medula.

Para os estudos do pulmão humano, material de controlo é obtido a partir de autópsias em que os pacientes tenham morrido por causas não relacionadas com a 4 ΡΕ1140071 doença pulmonar mas sim ,por exemplo, por acidentes fatais. Algum deste material provém de Ghent como acima, algum provém a partir dos arquivos do Pathology Dept. of The Pennsylvania Hospital, Philadelphia, USA. Tecido contendo vias respiratórias pequenas é seleccionado visto parecerem ser mais sensíveis a lesões.

Todas as amostras foram fixadas em formalina tamponada a 10% tão rapidamente quanto possível pós-mortem, sendo desidratadas e embebidas em cera de parafina. Cortes de 3,4 pm são cortados e montados em lâminas de vidro revestidas com silano.

Para minimizar quaisquer variações no processamento, pares de cortes sequenciais são montados em cada lâmina, para exposição a anticorpos um para ATi e o outro para AT2. Até 20 lâminas são tratadas ao mesmo tempo e assim, com a excepção do anticorpo primário, todos os reagentes incluindo o cromogénio são idênticos. A espessura do corte constitui a única variável que não pode ser totalmente controlada. 2. Anticorpos

Dois anticorpos do receptor ATX, de Santa Cruz Inc., San Diego, CA, USA, (Clones N 10 e 306) são testados e verificou-se que apresentam uma idêntica distribuição do receptor do córtex da supra-renal. 5 ΡΕ1140071 A maior parte do estudo é realizado com um anticorpo do receptor at2 de Santa Cruz (clone 18) o qual é testado verificando-se que ele proporciona o padrão de coloração idêntico ao primeiro na medula supra-renal e pulmão.

Todos os anticorpos foram testados rigorosamente pelos fornecedores comerciais e individuais quanto a especificidade e reactividade cruzada.

3. Sondas ISH

Produtos PCR (Polymerase Chain Reaction) foram preparados e usados como se segue:

Oligonucleótidos específicos para o receptor humano da angiotensina II do tipo I (número de acesso GenBank número M93394) receptor da angiotensina II do tipo II (número de acesso GenBank U15592) foram designados usando o programa de software Oligo 5,0 para regiões homólogas de ambas as sequências (Quadro 1). cDNA do tecido ósseo humano preparado seguindo métodos padrão (Sambrook J. Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) . Para PCR foram usados pares primeros de nucleótido: receptor de angiotensina li do tipo 1, 5'- CTggCTgACTTATgCTTTTTACTgACT-3' e 5'-gATgCAggTgACTTTggCTACA-3'; (produto PCR pares de base tamanho 236) e para 6 ΡΕ1140071 angiotensina II do tipo II, 5'-ATTTACTCCTTTTggCTACTCTTCCTC-3';e 5'-ggTCACgggTTATCCTgTTCTTC-3'(produto PCR pares de base tamanho 489) . Amplificações de PCR foram realizadas com 10 ng de cDNA template usando uma máquina MJ Research PCR Cycle e os seguintes ciclos PCR: 1) 94 0 C/2 min, 2) 94° C/10 seg, 60° C/30 seg, 12° C/15 seg durante 35 ciclos, usando polimerase High Fidelity Taq (Boehringer Mannheim) com componentes proporcionados no estojo do fabricante. Produtos das amplificações PCR foram idênticos por electroforese através de uma agarose a 0,8%/gel TBE (Sambrook, J. Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Sring Harbor, NY, 1989) . Para confirmar a identidade dos produtos de amplificação PCR, o DNA foi submetido a eluição a partir do gel e clonado para o vector de clonagem A/T pMOSBlue (Amersham). Colónias contendo implante de DNA do tamanho correcto (Quadro 1) foram sequenciadas completamente em ambos os cordões para confirmar a sua identidade.

Cada sonda, ambas senso e anti-senso para ATi e anti-senso apenas como foi acima descrito, são marcadas com fluorescin (FITC) e a presença de mRNA nas células detectado a seguir a hibridização com a sonda e utilização de uma sonda anti-FITC de ratinho mais o sistema de detecção de fosfatase anti-alcalina fosfatase alcalina (APAAP). Esta técnica de marcação melhorou a detecção de números de cópia muito baixos. 7 ΡΕ1140071 4. Imunocitoquímica

Para todos os anticorpos o processo é como se segue: Cortes de 5 pm são primeiro tratados por meio de técnicas de recuperação de antigénio, juntamente com utilização de microondas, em tampão citrato (pH 6,0). A exposição é de 20 minutos e as lâminas são deixadas arrefecer no tampão. Quando os anticorpos são policlonais de cabra, é utilizado o método de peroxidase anti-peroxidase (PAP) com diaminobenzidina (DAB) como cromogénio, por outro lado para policlonais de coelho é usado o sistema APAAP com nova Fuchsin. Os cortes são primeiro bloqueados com albumina do soro bovino (BSA) a 1% durante 30 minutos para bloquear receptores não específicos, seguindo-se incubação com o anticorpo primário durante 30 minutos à temperatura ambiente. Cada anticorpo é titulado e as diluições óptimas são como se segue:

Anticorpos Usados: Tecido Pulmonar Supra-renal ATi Clone N 10 1:200 1:500 Clone N 306 1:200 1:500 AT2 Clone C 18 1:150 1:500

Como um controlo negativo, para o policlonal de coelho é usado um soro negativo de Dako (Prosan, Ghent, Belgium). Para o policlonal de cabra o anticorpo primário é omitido. ΡΕ1140071

ISH

Cortes de 5 μιη são desparafinizados sendo então expostos "in situ" a hibridização seguindo técnicas bem estabelecidas. Os cortes são primeiro tratados com solução de pré-hibridização durante 20 minutos a 55° C. São então lavados antes da exposição às sondas durante a noite a 55° C. Após outra lavagem, são tratados com um anticorpo anti-FITC de ratinho e o sistema de detecção APAAP para localização da mensagem especifica. Para o receptor ATi, a sonda senso é o controlo negativo, para o receptor AT2, a sonda é omitida.

Análise de imagem

Para medir a intensidade de coloração de um modo quantitativo, as lâminas são visionadas na Leica MR500 e a quantidade de corante por unidade de área de tecido é registada em "pixels" seguindo as instruções de Leica. Isto é realizado para estabelecer os racios entre os receptores ATi e AT2 em diferentes regiões. Estas são a) epitélio das vias respiratórias, b) o interstício sub-epitelial, c) SMC em volta dos vasos sanguíneos e d) glandulas da mucosa.

RESULTADOS

Estudos de distribuição da supra-renal

Distribuição de ΑΤχ: Os dois anticorpos dão 9 ΡΕ1140071 origem ao padrão de distribuição que se segue no córtex da supra-renal, que consiste em coloração distintivas em redor das células musculares lisas que circundam os vasos sanguíneos e também na rede intersticial em e em redor dos fibroblastos tal como predito. Não há coloração de células endoteliais.

Distribuição de AT2: O anticorpo é testado contra medula da supra-renal onde se observa forte coloração das células de feocromocitoma da supra-renal. ISH: Ambas as sondas antisenso dão origem a um quadro semelhante.

Pulmão de Controlo

Distribuição de Ali: Observa-se coloração muito clara das células intersticiais subjacentes ao epitélio das vias respiratórias (sub-epiteliais) e também das margens da célula muscular lisa (SMC) rodeando os vasos sanguíneos. Além disso os macrófagos são também positivos.

Distribuição de AT2: Este receptor parece estar fortemente associado às células epiteliais das vias respiratórias, com coloração densa da margem em escova. Células positivas são também observadas nalgumas das glandulas mucosas, em algumas células endoteliais e em fibroblastos, condrocitos e macrófagos. Não existe coloração de SMC. 10 ΡΕ1140071 ISH: De novo as sondas dão origem a um quadro semelhante. Em particular a sonda de AT2 origina um sinal forte nas células endoteliais e apenas nalgumas glandulas mucosas.

Análise da imagem A distribuição da proteina e assim o receptor tal como é representada pela intensidade da coloração isto é pixels por pm2 de tecido é apresentada no quadro que se segue.

Anticorpo Epitélio Vias Sub-Epiteliais Glândulas SMC Respiratórias ATi 0,00 8 0,00 10 at2 5 0-1 5 O o o A presença de receptores de Angiotensina II no córtex e medula da supra-renal foi previamente demonstrada por meios tanto bioquímicos como biológicos. Os dados são obtidos com anticorpos comercialmente disponíveis e fornecidos privadamente ambos confirmando estes achados mas também estabelecendo a fiabilidade da presente metodologia imunocitoquímica e ISH.

Tendo em vista os resultados destes estudos, a distribuição dos receptores ATi e AT2 em tecidos pulmonares normais e patológicos tem que ser comparada, para 11 ΡΕ1140071 determinar as distribuições e racios específicos de ATi e de AT2. A presença de receptores Ali no pulmão foi previamente demonstrada bioquimicamente e actualmente foi demonstrada a sua exacta localização celular. Esta informação é vital para o estabelecimento das proporções dos receptores Ali e at2 em diferentes regiões do pulmão em condições normais e patológicas.

Os dados sobre a distribuição especialmente do receptor AT2 é totalmente nova visto não existirem dados anteriores quanto à sua presença ou distribuição. Derivam deste estudo vários pontos importantes.

Em primeiro lugar a presença do receptor AT2 nas células epiteliais dos brônquios das vias respiratórias pequenas. Como é já sabido este receptor é considerado como sendo anti-fibrótico, anti-proliferativo e pro-apoptotico. Assim uma regulação para cima ou para baixo das células epiteliais tem profundos efeitos sobre a substituição, desenvolvimento de hiperpalsia das células epiteliais e tem mesmo um papel no desenvolvimento do cancro do pulmão.

Em segundo lugar, a presença de quantidades consideráveis da proteína na margem ciliada das células epiteliais pode estar associada à quantidade da secreção mucosa visto que algumas das células epiteliais das glândulas mucosas também revelaram possuir o receptor. A 12 ΡΕ1140071 partir dos dados ISH, algumas glândulas contêm um elevado nível de mRNA.

Finalmente, a presença do receptor AT2 nas células endoteliais vasculares foi actualmente confirmada tanto por imunocitoquímica como por hibridização. Verificou-se que a sua distribuição era não frequente e não em todas as células de um vaso em particular.

Estes estudos confirmam e alargam os dados existentes sobre a presença e distribuição de Angiotensina II do tipo ATi e AT2 no pulmão humano. A presença de receptor AT2 nas células epiteliais das vias respiratórias pequenas tem consequências consideráveis para a compreensão de doenças que derivam da alteração na função destas células.

Pouco se sabe sobre a localização dos receptores AT no pulmão humano e sobre a sua distribuição, regulação para cima ou para baixo e proporção em tecido pulmonar normal e patológico. Para este estudo, são recolhidas amostras a partir do pulmão normal, e a partir de pacientes com doença pulmonar obstrutiva crónica (COPD) ± hipertensão.

Amostras de pulmão

Estas foram obtidas a partir dos grupos de pacientes que se seguem todos eles definidos clinicamente. PE1140071 - 13 - NN (n=3)- não fumadores, tecido normal C (n=5)- fumadores mas contudo normais COPD (n=8)- COPD positivos, BP (PA) normal COPD/H (n=3)- COPD mais hipsrtensão H (n=4)- fumadores com BP (PA) aumentada

As vias respiratórias são cuidadosamente dissecadas fora dos pulmões imediatamente após remoção do pulmão a partir do paciente por ressecção do tumor ou por outras razões. A região é cuidadosamente seleccionada para ficar livre de qualquer tecido canceroso. Os blocos pequenos são então fixados em 4% de paraformaldeido durante 2 horas à temperatura ambiente antes de serem embebidos em cera de parafina. Isto é para assegurar uma integridade estrutural óptima e retenção de actividade antigénica. Métodos para o estabelecimento da localização do recptor a) imunocitoquimica (ICC). 2 x anticorpos ATi são testados, Santa Cruz (clones N-10 e 306). Foi também testado um anticorpo AT2, Santa Cruz (clone C 18) .

Imagens digitais revelam:

Distribuição do receptor AT2 em células epite-liais bronquiolares incluindo a margem ciliada e nas células glandulares mucosas. 14 ΡΕ1140071

Corte adjacente corado para receptor ATX ilustrando a muito diferente distribuição nas células musculares lisas, fibroblastos/estroma e macrófagos.

Análise de pulmão humano a partir de pacientes

Todo o material obtido até à data foi seccionado e corado por ICC para localização do receptor ATi e at2 com controlos negativos apropriados. A análise da imagem foi iniciada com leituras a partir de um corte por paciente até à data (é este um processo lento visto que as linhas de base têm que lhe aderir rigidamente). Foram feitas medições do epitélio v subepitélio e dos vasos sanguíneos. Esta análise está a ser feita de um modo "cego" de modo a que não se possa fazer qualquer comentário exceptuando o facto de alguns "pacientes" terem claramente níveis muito afastados da média. Discrepâncias devidas a espessuras e colorações variáveis dos cortes foram minimizadas ao efectuar o ICC ATi e AT2 simultâneamente com cortes sequênciais. Assim o mesmo lote de cromogénio poderá também ser usado.

Os achados de uma localização epitelial do pulmão para o receptor AT2 apresenta um certo número de consequências . Como se verificou que este receptor era anti-proliferativo, anti-fibrótico e pro-apoptico antecipa-se que a sua regulação para cima tenha consequências para um certo número de doenças pulmonares; por exemplo que o fumo isoladamente não tem qualquer influência. Tem um papel em 15 ΡΕ1140071 condições fibróticas tais como síndrome de dificuldade respiratória no adulto (ARDS), ou mesmo na redução da capacidade proliferativa do epitélio no cancro do pulmão.

Resultados

Localização do receptor

Todos os anticorpos e ribo-sondas são testados em córtex e medula de supra-renal normal onde é sabido que ambos os tipos de receptores estão presentes com uma relativa abundância. O processo é repetido no tecido pulmonar normal onde somos capazes de detectar os receptores tanto ATi como AT2 e o seu mRNA. A localização é como se segue: ATi - em células musculares lisas, fibroblastos/es-troma, macrófagos. Isto é razoávelmente predizivel excep-tuando o facto da intensidade e número de receptores no pulmão normal serem bastante elevados. AT2 - em células epiteliais dos bronquios (especialmente na margem ciliada), em glândulas mucosas (algumas). Além disso, em células endoteliais vasculares, fibroblas-tos, macrófagos e células de cartilagens.

Trata-se de um achado totalmente inesperado e novo que necessita de posterior investigação. A localização na célula epitelial e na glândula mucosa é confirmada pelo 16 ΡΕ1140071 conteúdo tanto de proteína como de mRNA, relacionando-se a localização na margem ciliada com a secreção mucosa.

DISTRIBUIÇÃO DE ANGIOTENSIMA ΑΤχ E AT2 NOS PULMÕES DE PACIENTES COM BRONQUITE CRÓNICA EM COMPARAÇÃO COM CONTROLOS

Grupo Epitelial Sub-epitelial Proporção AT! at2 AT! at2 ATi (Epitelial/ AT2 (Sub-epitelial) Controlo (1) Fumadores - N=4 0,02 7,15 4,07 0,01 0,56 Controlo (2) Não-Fumadores N=5 0,02 9,49 6,45 1,3 0.67 Controlo (3) Fumadores Hipertensão 0,1 7,97 11,02 0,04 1,38 COPD Fumadores Sem hipertensão N=7 0,10 6,84 19,64 0,11 2,87 COPD Fumadores Hipertensão N=3 0,30 6,01 6,12 0,05 1,01 O equipamento Leica (analisador de imagem MR 500) traduz a intensidade da mancha para uma escala cinzenta (0-250), sendo cada unidade um pixel. Isto permite quantificar os dados de um modo rigoroso).

Estes dados estão baseados em análise de imagem do paciente. Os dados são expressos com pixels por unidade de área de tecido corado positivamente e a média de cinco campos por lâmina.

Como se pode concluir a partir destes resultados, 17 ΡΕ1140071 a proporção de distribuição de Ali no sub-epitélio e de AT2 no epitélio em tecido pulmonar normal situa-se significativamente abaixo de 1, enquanto que esta proporção está próxima de ou acima de 1 em tecidos pulmonares patológicos. O epitélio forma o revestimento interior da traqueia e dos brônquios principais. O aumento na proporção do receptor ATχ/AT2 na região sub-epitelial dos brônquios do pulmão a partir de pacientes com bronquite crónica em comparação com um controlo é devido principalmente a níveis aumentados do receptor ATX encontrados nos fibroblastos e macrófagos que rodeiam o epitélio das vias respiratórias e reflecte os níveis aumentados de inflamação e fibrose observados em COPD.

Os resultados acima referidos demonstram que receptores ATX que modulam a angiotensina II se encontram localizados no tecido pulmonar sub-epitelial e especialmente a distribuição no tecido pulmonar correspondente está aumentada. Consequentemente, a inibição de angiotensina II por meio de antagonistas do receptor ATX leva a uma diminuição da obstrução nas vias respiratórias.

Além disso, as experimentações revelam que a distribuição de AT2 no tecido pulmonar epitelial, especialmente em tecido patológico correspondente, por exemplo principalmente em células epiteliais dos brônquios e também em células estruturais dos alvéolos, por exemplo em glândulas mucosas dos alvéolos, está aumentada. Como os receptores AT2 são anti-proliferativos, anti-fibróticos e 18 ΡΕ1140071 pro-apoptoticos, a sua modulação é útil para o tratamento de formas específicas de condições e doenças pulmonares, especialmente para o tratamento do síndrome de dificuldade respiratória no adulto (ARDS) e para a redução da capacidade proliferativa do epitélio no cancro do pulmão e da mama, e ainda, para o tratamento do síndrome de sépsis, formas de lesão do pulmão, tais como pneumonia, aspiração de conteúdo gástrico, traumatismo do tórax, queimaduras, embolia gorda, bypass cardiopulmonar, toxicidade por 02, pancreatite hemorrágica, inflamação intersticial e broncoalveolar, proliferação de células epiteliais e intersticiais, acumulação de colagénio, fibrose.

Distribuição do receptor em tecido mamário normal e em pacientes com cancro da mama

Os espécimes de mama incluídos neste estudo são recrutados de um modo aleatório a partir dos arquivos do Pathology Dept, University Hospital, Ghent. Todos tinham sido fixados em formalina, processados em cera de parafina e um diagnóstico da sua patologia fora feito pela departamento de análise patológica. Foram incluídos dezasseis casos: 14 carcinomas invasivos do canal, um carcinoma coloide invasivo e um carcinoma lobular invasivo.

Imunocitoquímica é realizada em cortes de tecido embebido em cera de parafina usando os anticorpos policlonais para ATi e AT2 usados no estudo do pulmão juntamente com o método complexo de streptavidin-biotin-peroxidase como anteriormente. Para proporcionar um 19 ΡΕ1140071 possível modelo para testar antagonistas do receptor, linhagens celulares provenientes de tecidos da mama humana são também estudados quanto ao seu conteúdo de receptor. Isto pode proporcionar um modelo de trabalho in vitro para posteriores estudos bioquímicos e citológicos.

Resultados

Os dados obtidos demonstram claramente a presença de receptores tipo 1 e 2 da angiotensina II em tecido da mama humana normal sendo AT2 encontrado no epitélio cuboidal que reveste os canais e ΑΤχ predominantemente presente nas células mioepiteliais do canal. Toda a coloração foi abolida ao omitir o anticorpo primário da incubação.

Em todos os casos o tecido conjuntivo foi positivo para o receptor ATi juntamente com coloração nula (11/16) a fraca (5/16) das células cancerosas. Para o receptor AT2, foi observado o oposto sendo todos os carcinomas positivos quase sem reactividade do estroma (1/16) .

Os resultados a partir das linhagens celulares testadas foram muito interessantes com um padrão diferente de coloração sendo observado em cada uma. As culturas a curto prazo de células epiteliais mamárias normais foram fortemente positivas para o receptor ATI mas coraram apenas fracamente para o receptor AT2. 20 ΡΕ1140071

Carcinomas da mama

Paci ente ATi AT 2 Carcinoma da Mama Carci noma Es- troma Carci noma Es-tr oma 1 Carcinoma de canal diferenciado in-term., invasivo - classificação Bloom-Richardson grau 2 + + + + 2 Adenocarcinoma de canal diferenciado interm., invasivo - + + + + + focal - 3 Carcinoma de canal fracamente diferenciado, invasivo - carcinoma de canal in situ + + + 4 Carcinoma de canal diferenciado interm. Invasivo - carcinoma de canal extensivo in situ + + + 5 Carcinoma coloide invasivo - + + + + - 6 Carcinoma de canal diferenciado interm., invasivo - carcinoma de canal in situ + + + + + 7 Carcinoma de canal bem diferenciado, invasivo - carcinoma de canal in situ - + + + + - 8 Carcinoma de canal fracamente diferenciado - carcinoma de canal in situ + + + + + + - 9 Carcinoma de canal ben diferenciado, invasivo - + ++foca 1 - 10 Carcinoma de canal fracamente diferenciado, invasivo - carcinoma de canal in situ + + 11 Carcinoma de canal fracamente diferenciado, invasivo - carcinoma multifocal in situ + + + + 12 Carcinoma de canal fracamente diferenciado, invasivo - + + + + + + 21 ΡΕ1140071 (continuação)

Paci ente AT, at2 Carcinoma da Mama Carci noma Es troma Carci noma Es troma 13 Carcinoma invasivo fracamente diferenciado, invasivo + + + + + - 14 Carcinoma de canal fracamente diferenciado, invasivo - vários carcinoma de canal grave in situ + + focal + + 15 Carcinoma de canal fracamente diferenciado, invasivo - vários carcinomas de canal in situ + +++ + 16 Carcinoma lobular, invasivo - carcinoma no interior do canal cribriforme + + + -

Conclusões

Como se pode observar a partir destes resultados, a presença de receptor ATI em células epiteliais normais parece ser muito diferente para o pulmão. Contudo, o tipo celular epitelial é mioepitelial enquanto que o receptor AT2 em ambos os tecidos é encontrado em células epiteliais cuboidais. Ao mesmo tempo, a coloração positiva do estroma para o receptor ATI é igual para ambos os tecidos. A última está claramente ligada à presença de fibroblastos na matriz extracelular. A presença do receptor AT2 nas células de carcinoma e de um modo tão espalhado e reprodutível é surpreendente. Os tipos de células aqui descritos contendo os receptores específicos proporcionam um modelo in vítro ideal para esses estudos. 22 ΡΕ1140071

Estas experimentações demonstram claramente o efeito surpreendente que no presente modelo usando células de carcinoma da mama, os receptores Ali estão principalmente distribuídos no estroma enquanto que os receptores AT2 podem principalmente ser verificados nas células de carcinoma.

Todos estes resultados surpreendentes demonstram claramente que qualquer antagonista do receptor ATX ou modulador do receptor AT2 pode ser usado para o tratamento de condições ou doenças associadas com o aumento de receptores ATi na área sub-epitelial ou com o aumento de receptores AT2 nos epitélios, especialmente para o tratamento de doenças obstrutivas das vias respiratórias. Doenças obstrutivas das vias respiratórias uma classificação das doenças respiratórias que são caracterizadas por diminuição do tamanho das vias respiratórias e por secreção aumentada das vias respiratórias, resultando em ventilação alveolar reduzida. Doenças obstrutivas das vias respiratórias compreendem condições reversíveis e irreversíveis e são seleccionadas, por exemplo, de entre doença pulmonar obstrutiva crónica, tal como bronquite, por exemplo bronquite crónica e enfisema, igualmente de entre asma, fibrose quistica, doença pulmonar intersticial, cancro invasivo do pulmão, doença vascular pulmonar, e resistência aumentada ao fluxo do ar durante a expiração forçada. Qualquer um desses tratamentos pode também, mas não necessariamente, estar associado com o tratamento da hipertensão tanto de não fumadores como de fumadores. 23 ΡΕ1140071

Estes resultados surpreendentes demonstram claramente que qualquer modulador do receptor AT2 pode ser usado para o tratamento de condições ou doenças associadas a um aumento de receptores AT2 em tecido epitelial pulmonar, especialmente para o tratamento de formas especificas de condições e doenças do pulmão, especialmente para o tratamento do sindrome de dificuldade respiratória em adultos (ARDS) e para a redução da capacidade proliferativa do epitélio no cancro invasivo do pulmão, e além disso, para o tratamento do sindrome de sépsis, formas de lesão pulmonar, tais como pneumonia, aspiração de conteúdo gástrico, traumatismo do tórax, choque, queimaduras, embolia gorda, bypass cardiopulmonar, toxicidade por 02, pancreatite hemorrágica, inflamação intersticial e bronco-alveolar, proliferação de células epiteliais e intersticiais, acumulação de colagénio, fibrose.

Antagonistas do receptor ATi ou modulador do receptor AT2 são agentes que modificam a resposta biológica do hospedeiro a células tumorais com resultante beneficio terapêutico. A expressão aumentada do receptor Ali em mioepitélio de canal mamário e do receptor AT2 em epitélio cuboidal mamário demonstra que qualquer antagonista do receptor ATi ou modulador do receptor AT2 pode ser usado para o tratamento do carcinoma invasivo da mama. Estes incluem cancros de mama cirrosos, infiltrativos, papilares, do canal, medulares e lobulares assim como metástases nos pulmões, pleura, esqueleto e fígado. 0 tratamento deverá ser considerado como terapêutica adjuvante em combinação 24 ΡΕ1140071 com cirurgia, radioterapia ou como terapêutica paliativa com terapêutica hormonal ou outros modificadores da resposta biológica tais como interferons, interleuquinas, factores de necrose tumoral, anticorpos monoclonais, etc.

Embora o exame clinico e a mamografia sugiram cancro da mama, só o exame do tecido da biópsia permite fazer o diagnóstico, O padrão de distribuição de receptores ATi e AT2 pode ser usado como marcador para hiperplasia (localização de receptores ATi) e para cancro invasivo (localização de receptores AT2) e assim para o diagnóstico da malignidade do tumor. 0 presente invento é dirigido à utilização de Valsartan ou de um seu sal farmaceuticamente aceitável, para a produção de uma preparação farmacêutica para o tratamento do cancro invasivo do pulmão ou do cancro invasivo da mama. (S)-N-(l-carboxi-2-metilprop-l-il)-N-pentanoil-N-[2'(lH-tetrazol-5-il)bifenil-4-ilmetil]amina [Valsartan] tem a fórmula

25 ΡΕ1140071 e pode apresentar-se sob a forma dos seus sais farmaceuticamente utilizáveis.

Exemplos de sais apropriados de Valsartan com bases são sais de metal, tais como sais de metal alcalino ou metal alcalino terroso, por exemplo sais de sódio, potássio ou magnésio, ou sais com amónia ou uma amina orgânica, tal como morfolina, tiomorfolina, piperidina, pirrolidina, uma amina mono-, di- ou tri-alquilo inferior, por exemplo etil-, tert-butil-, dietil-, diidopropil-, trietil-, tributil- ou dimetilpropil-aminas, ou uma mono-, di- ou tri-hidroxialquil amina inferior, por exemplo mono-, di- ou tri-etanolamina. Além disso, podem ser formados sais internos correspondentes. 0 invento utiliza preparações farmacêuticas, que compreendem Valsartan ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, para o tratamento de condições ou doenças associadas com o aumento de receptores ATI na área sub-epitelial ou aumento de receptores AT2 nos epitélios, nomeadamente cancro invasivo do pulmão ou cancro invasivo da mama.

Estas preparações farmacêuticas têm como finalidade a administração oral, e também rectal ou parentérica, administração a animais de sangue quente, compreendendo as preparações o composto farmacológico activo quer isoladamente quer em conjunto com substâncias 26 ΡΕ1140071 farmacêuticas auxiliares habituais. Por exemplo, as preparações farmacêuticas consistem em de 0,1% a 100%, de preferência de 1% a 80%, do composto activo. Preparações farmacêuticas para administração entérica ou parentérica e também ocular são, por exemplo, em formas de unidade de dosagem, tais como comprimidos revestidos, comprimidos, cápsulas ou supositórios e também ampolas. Estes são preparados de um modo que é conhecido per se, por exemplo usando processos convencionais de mistura, granulação, revestimento, solubilização ou liofilização. Assim, preparações farmacêuticas para utilização por via oral podem ser obtidas combinando o composto activo com excipientes sólidos, se desejado granulando uma mistura que tenha sido obtida, e, se requerido ou necessário, processando a mistura ou granulado em núcleos de comprimidos ou de comprimidos revestidos após adição de substâncias auxiliares apropriadas. A dosagem do composto activo pode depender de uma série de factores, tais como o modo de administração, espécies de animais de sangue quente, idade e/ou condição individual. Normalmente, no caso da administração por via oral, uma dose diária de aproximadamente 10 mg a 360 mg, por exemplo no caso de Valsartan por exemplo de 40 mg, 80 mg, 160 mg ou 320 mg, é considerada para um paciente com um peso de aproximadamente 75 kg.

Um outro aspecto consiste em formas de dosagem oral sólida de valsartan que podem ser usadas para o 27 ΡΕ1140071 tratamento de doenças e condições, por exemplo tal como foi indicado aqui anteriormente. É feita referência a WO 97/49394 que apresenta formas de dosagem oral sólida, por exemplo por compactação, de valsartan (facultativamente sob a forma de sal) facultativamente combinado com hidroclorotiazida (HCTZ). Em wo 97/49394 a gama preferida de celulose é indicada como sendo de 10 a 30%, por exemplo, 21%, para composições de valsartan/HCTZ e 5% de Valsartan isoladamente. A gama preferida de polivinilpirolidona com ligação cruzada (Crospovidona) é indicada como sendo de 10 a 20%, por exemplo 13%.

Após testes exaustivos verificou-se de um modo surpreendente que é possível melhorar as características de biodisponibilidade de formulações sólidas conhecidas de valsartan ao aumentar a proporção de celulose micro-cristalina. Verificou-se também, de um modo surpreendente, que é possível melhorar a qualidade, por exemplo, melhor uniformidade de peso e melhor compressão para os comprimidos, das referidas formulações sólidas conhecidas de Valsartan ao diminuir a proporção de crospovidona PVP com ligação cruzada.

Assim, num outro aspecto, o presente invento utiliza uma forma de dosagem oral sólida compreendendo valsartan como o agente activo e mais de 30% de celulose microcristalina em peso tendo como base o peso total dos 28 ΡΕ1140071 componentes do núcleo da referida forma de dosagem oral sólida, por exemplo, 31 a 65%, por exemplo 50%.

Num outro aspecto, o presente invento utiliza uma forma de dosagem oral sólida compreendendo valsartan como o agente activo e celulose microcristalina em que a proporção em peso entre valsartan e celulose microcristalina é de 2,5:1 a 0,3:1, por exemplo, 2:1 a 1:1, por exemplo, 14:1.

Numa outra apresentação a forma de dosagem oral sólida do invento compreende menos de 13% de crospovidona, por exemplo, 2 a 10%, em peso tendo como base o peso total dos componentes do núcleo da forma de dosagem oral sólida.

De preferência, a proporção em peso entre valsartan e Crosppovidone é de 7:1 a 3:1, por exemplo, 6:1 a 4:1, por exemplo 5,3:1.

De preferência, a proporção em peso entre celulose microcristalina e crospovidona é de 7:1 a 1:1, por exemplo, 4:1 a 2:1, por exemplo, 3,6:1. A forma de dosagem oral sólida usada no invento pode compreender de 20 a 360 mg de valsartan, por exemplo, 40, 80, 160, 320 mg. Com esta gama de dosagens a flexibilidade e eficácia, por exemplo na redução da pressão sanguínea, pode ser aumentada. 29 ΡΕ1140071

Num outro aspecto, o invento utiliza uma forma de dosagem oral sólida compreendendo 20 a 65% de valsartan 31 a 65% de celulose microcristalina 2 a 13% de crospovidona.

Uma composição típica pode compreender: 20 a 65% de valsartan 31 a 50% e celulose microcristalina 2 a 10% de crospovidona 1 a 10% de estearato de magnésio 0,5 a 5% de sílica anidra coloidal.

Se desejado pode-se adicionar 1 a 10% em peso da composoição do núcleo, por exemplo 5 a 10% de Cutina, ou 1 a 10% em peso da composição do núcleo, por exemplo, 5 a 10% de ácido esteárico.

De preferência formas de dosagem oral sólida do invento apresentam-se sob a forma de um comprimido prensado.

Num outro aspecto o invento utiliza uma forma de dosagem oral sólida, por exemplo, um comprimido prensado, compreendendo mais de 250 mg e até 360 mg, por exemplo 320 mg de Valsartan como um agente activo.

Podem ser usados outros excipientes como 30 ΡΕ1140071 lubrificantes tais como agentes de deslizamento habitualmente usados em formulações orais sólidas sendo feita referência a uma extensa bibliografia sobre substâncias apropriadas, ver em particular Fiedler's "Lexicon der Hiifstoffe", 4th Edition, ECV Aulendorf 1996 e "Handbook of Pharmaceutical Excipients" Wade and Weller Ed. (1994) .

As formas de dosagem oral sólida de acordo com o presente invento podem apresentar-se sob a forma de drageias caso esse em que a forma de dosagem oral sólida é proporcionada com um revestimento tipicamente um açúcar, goma-laca ou outra película de revestimento inteiramente convencional neste campo da técnica. É prestada atenção aos numerosos métodos conhecidos de revestimento utilizados na técnica, por exemplo revestimento por pulverização numa camada fluidizada, por exemplo, pelos métodos conhecidos usando um aparelho disponível a partir de Aeromatic, Glatt, Wurster or Huttlin, numa panela perfurada pelo método Accela Cota, ou pelo método de revestimento de espada submersa. Os aditivos habitualmente usados em pastelaria são utilizados nesses métodos. Por exemplo, revestimentos que podem ser usados são os apresentados em WO 97/49394, Opadry.

As composições farmacêuticas usadas no presente invento são úteis nas indicações conhecidas do agente particular aqui incorporado. 31 ΡΕ1140071 A dose exacta de agente activo e a formulação particular a ser administrada dependem de um certo número de factores, por exemplo, a condição a ser tratada, a duração desejada do tratamento e a taxa de libertação do agente activo. Por exemplo, a quantidade do agente activo requerido e a sua taxa de libertação podem ser determinadas tendo como base técnicas conhecidas in vitro ou in vivo, determinando quanto tempo a concentração de um agente activo particular no plasma sanguíneo permanece num nível aceitável para um efeito terapêutico.

Por exemplo, a composição do invento em ensaios clínicos apresenta uma biodisponibilidade comparável à da forma comercial de Diovan®.

De preferência a taxa de dissolução da forma sólida de acordo com o presente invento é superior a 90% durante 30 minutos.

Por exemplo podem ser usadas dosagens variando entre 10 mg e 360 mg de valsartan por dia para um mamífero com 755 quilogramas, por exemplo um ser humano, e em modelos animais padronizados. Uma excelente capacidade de tolerância de valsartan proporcionada pelas composições pode ser observada em testes e ensaios clínicos animais padronizados. 32 ΡΕ1140071 O invento proporciona num de outros seus aspectos um processo para produzir uma forma de dosagem oral sólida tal como foi aqui anteriormente descrito. Essa forma de dosagem oral sólida pode ser produzida processando componentes tal como em WO 97/49394, por exemplo tal como foi aqui anteriormente definido, em quantidades apropriadas, para formar formas de unidades de dosagem.

Por exemplo é proporcionado um processo para produzir formas de dosagem oral sólida tal como foi aqui anteriormente descrito compreendendo os passos de i) Trituração (moagem) do agente activo e de aditivos farmaceuticamente aceitáveis, ii) Submeter uma mistura do agente activo e aditivos triturados a compressão para formar um "coprimato" (a massa compactada) iii) Conversão do "coprimato" para formar um granulado e iv) Compressão do granulado para formar uma forma de dosagem oral sólida. O processo é realizado na ausência de água, isto é um método de compressão seca. O processo pode ser realizado em condições ambiente de temperatura e humidade; não é necessário assegurar que o processo seja realizado numa atmosfera seca. 33 ΡΕ1140071 O passo inicial i) de trituração pode ser realizado de acordo com métodos de trituração convencionais ou por métodos de micronização. O agente activo e os aditivos podem ser moidos quer individualmente quer em conjunto para se obter tamanhos de partículas variando entre 0,1 micrómetros (pm) e 1.500 pm por exemplo, 1,0 pm e 900 pm, por exemplo, 60 pm a 600 pm. Pelo menos 90% dos cristais de ambos o agente activo e os aditivos encontram-se presentes nestas gamas. Partículas deste tamanho são obtidas por métodos de fragmentação (pulverização) convencionais, por exemplo trituração num moinho de jacto de ar, martelo, moinho de crivo, moinho de impacto fino, moinho de bola ou moinho com vibrador. A micronização é de preferência efectuada por métodos conhecidos usando um desintegrador ultrasónico, por exemplo do tipo BRANSON Sonifier, ou agitando uma suspensão com um agitador mecânico de alta velocidade, por exemplo com um agitador mecânico do tipo HOMOREX.

As partículas moídas podem facultativamente neste estádio ser feitas passar por crivo e misturadas de acordo com métodos conhecidos. A compressão para formar um "coprimato" requere a 34 ΡΕ1140071 compactação dos componentes moídos secos. A compactação pode ser realizada usando uma técnica de granulação ou de preferência, compactação com cilindro. O aparelho de compactação com cilindro é convencional e utiliza essencialmente dois cilindros que rolam ao encontro um do outro. Um êmbolo hidráulico força um dos cilindros contra o outro para exercer uma força de compactação contra as partículas moídas fornecidas ao aparelho para compactar de cilindro por meio de um sistema de gancho de parafuso.

Pode ser usada uma força de compactação variando entre 25 e 65 kN, por exemplo entre 25 e 45 kN. Nesta gama de forças de compactação verificou-se de um modo surpreendente que para cada formulação particular deverá ser usada uma força de compactação mínima para que se obtenha uma forma de dosagem oral sólida em que o granulado se desintegra em partículas primárias descontínuas numa taxa desejável, por exemplo a desintegração ocorre aproximadamente seis vezes mais depressa para uma forma de dosagem oral sólida prensada acima de uma força de compactação mínima. Uma tal taxa de desintegração rápida não é usual para comprimidos e é semelhante à taxa de desintegração de uma formulação sob a forma de cápsula. Uma força de compactação mínima particular depende do conteúdo de agente activo em qualquer determinada formulação e assim também depende da quantidade e da natureza dos aditivos presentes. 35 ΡΕ1140071

Dada esta informação, os especialistas nesta técnica serão claramente capazes de determinar a força de compactação minima para outras formulações usando experimentação de rotina e sem dificuldade indevida. A velocidade do cilindro pode ser fixada entre 1 e 20 rpm e de preferência entre 9 e 15 rpm. Após passagem através dos cilindros a massa compactada (o "coprimato") assemelha-se a uma fita delgada em segmentos. 0 "coprimato" pode ser feito passar por um crivo e ou moido para produzir grânulos. A passagem por crivo na sua forma mais simples envolve a passagem do "coprimato" que emerge dos cilindros através de um crivo sob pressão mecânica. Com maior preferência, o "coprimato" é feito passar por crivo usando um moinho de oscilação, por exemplo um MGI 624 Frewitt (Key International Inc.). A compressão dos granulados para formar núcleos de comprimidos pode ser realizada numa máquina para fazer comprimidos convencional, por exemplo numa máquina para fazer comprimidos excêntrica EK-0 Korsch ou numa máquina de compressão rotativa, por exemplo com uma compressão superior a 2 kN. Os núcleos dos comprimidos podem variar quanto à sua forma e ser, por exemplo, redondos, ovais, oblongos, cilíndricos ou podem ter qualquer outra forma apropriada, e o seu tamanho pode também variar dependendo da concentração dos agentes terapêuticos. Uma caracte-rística dos comprimidos de acordo com o invento é o seu 36 ΡΕ1140071 tamanho pequeno tomando em consideração a quantidade de agente activo neles contida.

Numa apresentação preferida do invento comprimidos obtidos pelo método de compressão acima descrito são ligeiramente ovais. As bordas dos comprimidos podem ser em bisel ou arredondadas.

Numa apresentação particularmente preferida do invento uma forma de dosagem oral sólida é comprimida sob a forma de um comprimido tendo um formato oblongo no qual a proporção de dimensões comprimento:largura:altura é, por exemplo, de 2,5-5,0: 0,9-2,0: 1,0, e de preferência em que a face da base e do topo independentemente uma da outra são planares ou convexamente curvadas ao longo do eixo longitudinal: as faces laterais são planares, as faces terminais podem ter qualquer formato e as bordas são facultativamente em bisel ou arredondadas.

Numa apresentação particularmente preferida do invento uma forma de dosagem oral sólida é comprimida, a partir do granulado, sob a forma de um comprimido com formato oblongo em que o comprimento é de aproximadamente 10,0 a 15,0 mm, a largura de aproximadamente 5,0 a 6,0 mm e a altura de aproximadamente 3,0 a 4,0 mm.

Numa outra apresentação particularmente preferida do invento uma forma de dosagem oral sólida é comprimida a partir dos granulados sob a forma de um comprimido com 37 ΡΕ1140071 formato oblongo em que o comprimento é de aproximadamente 15,0 a 18,0 mm, a largura é de aproximadamente 6,0 a 9,0 mm e a altura é de aproximadamente 3,5 a 5,0 mm.

Ainda numa apresentação preferida do invento é proporcionado um comprimido que tem essencialmente um formato de disco com as faces superior e inferior tendo uma superfície ligeiramente convexa. De preferência o comprimido tem um diâmetro de cerca de 8 a 8,5 mm e uma profundidade de cerca de 3 a 3,5 mm, ou um diâmetro de cerca de 16 mm e uma profundidade de cerca de 6 mm. Os comprimidos podem ocupar um volume de cerca de 0,1 cm3 a cerca de 1 cm3, por exemplo 0,1 cm3 a cerca de 0,45 cm3, por exemplo 0,2 a 0,3 cm3, por exemplo cerca de 0,125 cm3 ou 0,25 cm3.

Podem ainda ser transparentes, incolores ou corados e também marcados de modo a transmitir a este produto um aspecto individual e torná-los instantâneamente reconhecíveis. A utilização de corantes pode servir para melhorar o aspecto assim como para identificar as composições. Corantes apropriados para utilização em farmácia incluem tipicamente carotinoides, óxidos de ferro ou clorofil.

Os exemplos que se seguem ilustram o invento acima descrito; contudo, não se pretende de qualquer modo restringir o âmbito deste invento. 38 ΡΕ1140071

Exemplo Formulação 1:

Comprimidos Revestidos com Película:

Componentes Composição Por Unidade (mg) Valsartan (=ingrediente activo) 80, 00 Celulose microcristalina/ 54, 00 NF, Ph, Eur Avicel PH 102 Crospovidona 20, 00 NF, Ph, Eur Sílica anidra coloidal/ dióxido de 0, 75 Ph, Eur/ silício coloidal / Aerosil 200 NF Estearato de magnésio 2,5 NF, Ph, Eur ϊίίίίίίίίίίίίίίίϊίϊΐ 111111111111111111111111111111111111111111111111 Sílica anidra coloidal/ dióxido de 0, 75 Ph. Eur/ silício coloidal/ Aerosil 200 NF Estearato de magnésio 2, 00 NF, PH, Eur ísssíííííííííííííííííííííííííís^ mmiimmvmmmmmm Água purificada *) _ DIOLACK pale red OOF34899 7, 00 Massa total do comprimido 167,00 *) Removida durante o processamento. 0 comprimido revestido com película é fabricado por exemplo como se segue:

Uma mistura de valsartan, celulose microcrista-lina, crospovidona, parte da sílica anidra coloidal/dióxido de silício coloidal/aerosile 200, dióxido de silício e estearato de magnésio é previamente misturada num misturador de difusão sendo em seguida feita passar através de moinho com crivo. A mistura resultante é de novo 39 ΡΕ1140071 previamente misturada num misturador de difusão, compactada num aparelho para compactar de cilindro sendo em seguida feita passar por um crivo através de um moinho com crivo. À mistura resultante, é adicionado o resto da silica anidra coloidal/dióxido de silício coloidal/aerosile 200 e a mistura final é feita num misturador de difusão. A totalidade da mistura é prensada numa máquina para fazer comprimidos rotativa e os comprimidos são revestidos com uma película usando Diolack pale red numa panela perfurada.

Exemplo Formulação 2:

Comprimidos revestidos com película:

Componentes Compcs: '2.o Por...... Padrões........................... Unicode (mg)............. SsSsSsssSsíSsSsS Valsartan [= ingrediente activo] 160,00 Celulose microcristalina/ 108,00 NF, Ph, Eur Avicel PH 102 Crospovidona 40,00 NF, Ph, Eur Silica anidra coloidal/Dióxido de silício coloidal/ Aerosil 200 1, 50 Ph, Eur/ NF Estearato de magnésio 5, 00 NF, Ph, Eur Sílica anidra coloidal/Dióxido de silício coloidal/ Aerosil 200 1, 50 Ph, Eur/ NF Estearato de magnésio 4,00 NF, Ph, Eur ............................................................... imanto.................................. Opadry Light Brown OOF33172 10,00 ................................................................... 40 ΡΕ1140071 O comprimido revestido com película é fabricado por exemplo tal como é descrito no Exemplo da Formulação 1.

Exemplo Formulação 3:

Comprimidos Revestidos com Película .......................................Composição Por Unidade (mg) ....................................................Núcleo:.......Fase.......Interna Valsartan [0 ingrediente activo] 40, 00 Sílica, coloidal anidra (Dióxido de silício coloidal) (= Agente de deslizamento] 1,00 Ph, Eur, USP/NF Estearato de magnésio [=Lubrificante] 2,00 USP/NF Crospovidona [Agente de desintegração] 20, 00 Ph, Eur Celulose microcristalina [=Agente de ligação] 124,00 USP/NF 1____ 1- Sílica, coloidal anidra, (Dióxido de silício coloidal) [= Agente de deslizamento] 1,00 Ph, Eur, USP/NF Estearato de magnésio [Lubrificante] 2,00 USP/NF F.e" ·. 1 - ?” p-. Opadry® brown OOF 16711 1) 9, 40 Água purificada 2) Massa total do comprimi clóiiiiiiiiiiiiii líílííííííííílilií/ÉÉiíí ííííííííííííííííííííí5;íííííííí^ 1 A composição do agente de coloração Opadry® brown OOF16711 encontra-se no quadro mais abaixo. 2

Removida durante o processamento ΡΕ1140071 41

Composição de Opadry®:

Ingrediente Composição % Aproximada Óxido de ferro, preto (C.I. No. 77499, E 172) 0,50 Óxido de ferro, castanho (C.I.No. 77499, E 172) 0,50 Óxido de ferro, vermelho (C.I. No. 77491, E 172) 0,50 Óxido de ferro, amarelo (C.I. No. 77492, E 172) 0,50 Macrogolum (Ph, Eur) 4,00 Dióxido de titânio (C.I. No. 77891, E 171) 14,00 Hypromellose (Ph, Eur) 80,00 O comprimido revestido com pelicula é fabricado por exemplo tal como é descrito no Exemplo da Formulação 1.

Exemplo da Formulação 4: Cápsulas: !!!:!: Valsartan [= ingrediente activo] 80,00 Celulose microcristalina 25,10 Crospovidona 13,00 Povidone 12,50 Estearato de magnésio 1,30 Sulfato laurilo de sódio 0,60 Óxido de ferro, vermelho (C.I. No. 77491, EC No. E 172) 0,123 Óxido de ferro, amarelo (C.I. No. 77492, EC No. E 172) 0, 123 Óxido de ferro, preto (C.I. No. 77499, EC No. E 172) 0, 245 Dióxido de titânio 1, 540 Gelatina 74,969 :i" -imprimid: is;!!! !ll!l!!!!!!!ll!l!il!!iiil!ll!lllllillll:l: 42 ΡΕ1140071 O comprimido é fabricado por exemplo como se segue:

Granulação/Secagem

Valsartan e a celulose microcristalina são granulados por pulverização num granulador de camada fluidizada com uma solução de granulação consistindo em povidone e sulfato laurilo de sódio dissolvido em água purificada. 0 granulado obtido é seco num secador de camada fluidizada.

Moagem/Mistura 0 granulado seco é moído juntamente com crospovidona e estearato de magnésio. A massa é então misturada num misturador do tipo parafuso cónico durante aproximadamente 10 minutos.

Encapsulação

As cápsulas de gelatina vazias são cheias com os grânulos da massa misturada sob temperatura e condições de humidade controladas. As cápsulas cheias são limpas de pó, inspeccionadas visualmente, pesadas e caucionadas pelo departamento de avalição de qualidade. 43 ΡΕ1140071

Exemplo da Formulação 5: Cápsulas: ÍSÍÍSÍÍÍSÍÍÍíSÍíSÍíÍÍSÍÍSÍÍSÍÍSÍÍÍÍ íPÓÍi^ÓSlÓãÓisBÓfíS Valsartan [ =ingrediente activo] 160,00 Celulose microcristalina 50,20 Crospovidona 26, 00 Povidone 25, 00 Estearato de magnésio 2, 60 Sulfato laurilo de sódio 1,20 Oxido de ferro, vermelho 0,123 (C.I. No. 77491, EC No. E 172) Oxido de ferro, amarelo 0,123 (C.I. No. 77492, EC No. E 172 Óxido de ferro, preto 0,245 (C.I. No. 77499, EC No. E 172) Dióxido de titânio 1,540 Gelatina 74,969 A formulação é fabricada por exemplo tal como é descrito no Exemplo da Formulação 4 • Exemplo da Formulação 6: Cápsula de Gelatina Dura: iiiiiiiiiiiiiiiíSÍÍSÍSÍSÍSiS Composição Por Unidade (mg) Valsartan [= ingrediente activo] 80,00 Sulfato laurilo de sódio 0, 60 Estearato de magnésio 1, 30 Povidone 12, 50 Crospovidona 13, 00 Celulose microcristalina 21,10 44 ΡΕ1140071

Exemplos 7 a 11:

Exemplo 7 8 9 10 11 Componentes COMPOSIÇÃO POR UNIDADE (mg) COMPOSIÇÃO POR UNIDADE (mg) COMPOSIÇÃO POR UNIDADE (mg) COMPOSIÇÃO POR UNIDADE (mg) COMPOSIÇÃO POR UNIDADE (mg) Granulação Substância Fármaco Valsartan 80,000 160,000 40,000 320,000 320,000 Celulose Micro-cristalina (NF, Ph, Eur.)/ Avicel PH 102 54,000 108,000 27,000 216,000 216,000 Crospovidona (NF, Ph, Eur.) 15,000 30,000 7,500 80,000 60,000 Sílica Anidra Coloidal (Ph, Eur.)/Dióxido de Silício Coloidal (NF)/Aerosil 200 1,500 3,000 0,750 3,000 6,000 Estearato de Magnésio (NF, Ph, Eur.) 3,000 6,000 1,500 10,000 12,000 Mistura Sílica Anidra Coloidal (Ph, Eur.)/Dióxido de Silício Coloidal (NF)/Aerosil 200 3,000 Estearato de Magnésio, NF, Ph, Eur. 1,500 3,000 0,750 8,000 6,000 Peso do Núcleo 155,000 310,000 77,500 640,000 620,000 Revestimento - - 3,800 15,000 16,000 45 ΡΕ1140071

Exemplo 12: Dissolução de comprimidos revestidos com película (FCT)

Os critérios de aceitação da dissolução são Q = 75% em 30 minutos (Paddle 50 rpm, tampão fosfato pH 6,8) 40 mg Potência 320 mg Potência Dissolução FCT - nível + nível - nível + nível Média (%) 98 97 93 89 Rei. std [%] 1, 06 2,48 2, 12 2,34 Min. [%] 96 94 90 86 Max. [%] 99 99 95 92

Lisboa, 15 de Maio de 2007

Claims (1)

1. ΡΕ1140071 1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de valsartan da fórmula C«, CH; / "K / OH* CH, O11 c CH^ OH» < / S CH I ^ ' COOH

   ou de um seu sal farmaceuticamente aceitável, para a produção de uma preparação farmacêutica para o tratamento do cancro invasivo do pulmão e invasivo da mama. Lisboa, 15 de Maio de 2007