JP4972847B2 - コラーゲン蓄積抑制剤 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、コラーゲン蓄積抑制剤等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
肝硬変、間質性肺疾患、慢性腎不全（又は慢性腎不全に陥る疾患）、炎症後の過形成痕跡、術後の瘢痕や熱傷性瘢痕、或いは強皮症、動脈硬化、高血圧、関節リウマチなどの疾患や異状においては、コラーゲン等の細胞外マトリックスの過度の集積により組織が線維化して硬化し、その結果、臓器・組織の機能低下や瘢痕形成等に至る。このような細胞外マトリックスの過度の集積は、コラーゲン等の生合成と分解のバランスが破綻し産生が亢進することにより導かれる。実際、線維化した組織においては、コラーゲン遺伝子、特にＩ型コラーゲン遺伝子の発現量が上昇していることが観察されている［Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，９４，３６５，（１９９０）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，６６４２，（１９９１）］。そして、種々の動物線維症モデルにおいて、インターフェロンγの投与により、組織におけるＩ型コラーゲン遺伝子の発現量が低下し、コラーゲン量が低下して組織の線維化が改善されることが報告されている［Ｅｘｐ．Ｌｕｎｇ Ｒｅｓ．，２１，７９１−８０８，（１９９５），Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．，４７，６２−６９，（１９９５），Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．，２８，４７１−４７９，（１９９８），Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．，２６，８９４−９０３，（１９９７）］。また、線維化した組織においては、サイトカインの１種であるＴＧＦβの量が上昇していることも観察されている［Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，９４，３６５，（１９９０）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，６６４２，（１９９１）］。ＴＧＦβは、Ｉ型コラーゲン遺伝子の発現量を増加させ、コラーゲンの産生亢進、ひいては、組織の線維化に関与していることが示されている［Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，６３，１７１，（１９９０）、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，９４，３６５，（１９９０）］。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、組織におけるＩ型コラーゲン遺伝子の過剰発現を抑制し、よってコラーゲンの産生亢進を抑え、細胞外マトリックスの過度の集積に伴う種々の疾患や異状の予防、治療に有用な方法や薬剤の開発が切望されている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らはかかる状況の下、鋭意検討した結果、特定のアミノ酸配列を有するＤＮＡ結合蛋白質が、Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制し、その結果としてコラーゲンの蓄積を抑制することを見出した。当該知見を基づき、コラーゲン過剰蓄積疾患（例えば線維症）等の予防又は治療のための医療分野において有用となる、コラーゲン蓄積抑制剤、コラーゲン蓄積抑制方法、Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を有する物質の探索方法等を見出し、本発明に至った。
即ち、本発明は、
１．下記のいずれかのアミノ酸配列を有するＤＮＡ結合蛋白質を有効成分として含み、該有効成分が薬学的に許容される担体中に製剤化されてなることを特徴とするコラーゲン蓄積抑制剤（以下、本発明蓄積抑制剤（I）と記すこともある。）
＜アミノ酸配列（以下、当該アミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列をアミノ酸配列（I）と記すこともある。）＞
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列；
２．アミノ酸配列（I）を有するＤＮＡ結合蛋白質をコードする核酸を有効成分として含み、該有効成分が薬学的に許容される担体中に製剤化されてなることを特徴とするコラーゲン蓄積抑制剤（以下、本発明蓄積抑制剤（II）と記すこともある。）；
３．コラーゲン蓄積抑制のための、アミノ酸配列（I）を有するＤＮＡ結合蛋白質の使用；
４．コラーゲン蓄積抑制のための、アミノ酸配列（I）を有するＤＮＡ結合蛋白質をコードする核酸の使用；
５．Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写抑制のための、アミノ酸配列（I）を有するＤＮＡ結合蛋白質の使用；
６．Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写抑制のための、アミノ酸配列（I）を有するＤＮＡ結合蛋白質をコードする核酸の使用；
７．哺乳動物細胞に、アミノ酸配列（I）を有するＤＮＡ結合蛋白質をコードする外来遺伝子を、当該外来遺伝子が前記細胞で発現する位置に置かれるように提供する工程を有することを特徴とする哺乳動物におけるコラーゲン蓄積抑制方法（以下、本発明蓄積抑制方法（I）と記すこともある。）；
８．哺乳動物細胞に、コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子が前記細胞外に存在する条件下において、前記外来遺伝子を提供することを特徴とする前項７記載のコラーゲン蓄積抑制方法；
９．コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子が、ＤＮＡ結合蛋白質依存的コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子であることを特徴とする前項８記載のコラーゲン蓄積抑制方法；
１０．ＤＮＡ結合蛋白質がＡＰ−１又はＳｍａｄであることを特徴とする前項９記載のコラーゲン蓄積抑制方法；
１１．コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子がＴＧＦ−βであることを特徴とする前項８記載のコラーゲン蓄積抑制方法；
１２．コラーゲン過剰蓄積に起因する疾患と診断されうる哺乳動物の体内にある細胞に、アミノ酸配列（I）を有するＤＮＡ結合蛋白質を投与する工程を有することを特徴とするコラーゲン蓄積抑制方法；
１３．線維症に羅患していると診断されうる哺乳動物の体内にある細胞に、アミノ酸配列（I）を有するＤＮＡ結合蛋白質を投与する工程を有することを特徴とするコラーゲン蓄積抑制方法；
１４．哺乳動物細胞に、コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子が前記細胞外に存在する条件下において、アミノ酸配列（I）を有するＤＮＡ結合蛋白質を投与する工程を有することを特徴とするコラーゲン蓄積抑制方法（以下、本発明蓄積抑制方法（II）と記すこともある。）；
１５．コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子が、ＤＮＡ結合蛋白質依存的コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子であることを特徴とする前項１４記載のコラーゲン蓄積抑制方法；
１６．Ｉ型コラーゲン遺伝子を有する細胞に、アミノ酸配列（I）を有するＤＮＡ結合蛋白質を投与する工程を有することを特徴とするコラーゲン蓄積抑制方法（以下、本発明蓄積抑制方法（III）と記すこともある。）；
１７．Ｉ型コラーゲン遺伝子を有する細胞に、コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子が前記細胞外に存在する条件下において、アミノ酸配列（I）を有するＤＮＡ結合蛋白質を投与する工程を有することを特徴とするコラーゲン蓄積抑制方法；
１８．コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子が、ＤＮＡ結合蛋白質依存的コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子であることを特徴とする前項１７記載のコラーゲン蓄積抑制方法；
１９．Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を有する物質の探索方法であって、
（１）アミノ酸配列（I）を有するＤＮＡ結合蛋白質を発現する細胞に、被験物質を接触させる第一工程、
（２）前記第一工程後に、上記のＤＮＡ結合蛋白質の細胞核内への移行量又はその量と相関関係を有する指標値を測定する第二工程、
（３）第二工程により測定された移行量又はその量と相関関係を有する指標値に基づき前記物質のＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を評価する第三工程、及び
（４）前記第三工程で評価されたＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能に基づきＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を有する物質を選抜する第四工程
を有することを特徴とする探索方法（以下、本発明探索方法（I）と記すこともある。）；
２０．前記細胞が、前記ＤＮＡ結合蛋白質の細胞核内への移行量と相関関係を有する指標値を提供可能とする外来性マーカー蛋白質を発現する細胞であることを特徴とする前項１９記載の探索方法；
２１．Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を有する物質の探索方法であって、
（１）Ｉ型コラーゲン遺伝子を有し、かつ、アミノ酸配列（I）を有するＤＮＡ結合蛋白質をコードする外来遺伝子を当該外来遺伝子が細胞で発現する位置に置かれるように提供されてなる細胞に、異なる２種以上の被験物質を独立して接触させる第一工程
（２）前記第一工程後に、コラーゲン蓄積量を独立してモニターする第二工程、
（３）第二工程により独立してモニターされたコラーゲン蓄積量を互いに比較することにより得られる差異に基づき前記物質のＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を評価する第三工程、
（４）前記第三工程で評価されたＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能に基づきＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を有する物質を選抜する第四工程、
を有することを特徴とする探索方法（以下、本発明探索方法（II）と記すこともある。）；
２２．第一工程が、コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子が前記細胞外に存在する条件下でなされることを特徴とする前項２１記載の探索方法；
２３．コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子が、ＤＮＡ結合蛋白質依存的コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子であることを特徴とする前項２２記載の探索方法；
２４．Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を有する物質の探索方法であって、
（１）（ａ）転写開始に必要な塩基配列を含む、Ｉ型コラーゲン遺伝子の発現調節領域を機能可能な形で連結されてなるレポーター遺伝子と、アミノ酸配列（I）を有するＤＮＡ結合蛋白質とを含有する細胞と、（ｂ）転写開始に必要な塩基配列を含み、かつアミノ酸配列（I）を有するＤＮＡ結合蛋白質との結合能力を有さない塩基配列を機能可能な形で連結されてなるレポーター遺伝子と、アミノ酸配列（I）を有するＤＮＡ結合蛋白質とを含有する細胞とにそれぞれ、被験物質を独立して接触させる第一工程、
（２）前記第一工程後に、レポーター遺伝子の発現量を独立してモニターする第二工程、及び
（３）第二工程により独立してモニターされた発現量を互いに比較することにより得られる差異に基づき前記物質のＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を評価する第三工程、及び
（４）前記第三工程で評価されたＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能に基づきＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を有する物質を選抜する第四工程
を有することを特徴とする探索方法（以下、本発明探索方法（III）と記すこともある。）；
２５．第一工程が、コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子が前記細胞外に存在する条件下においてなされることを特徴とする前項２４記載の探索方法；
２６．コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子がＤＮＡ結合蛋白質依存的コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子であることを特徴とする前項２５記載の探索方法；
２７．請求項１９〜２６記載の探索方法により選抜された物質またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含み、該有効成分が薬学的に許容される担体中に製剤化されてなることを特徴とするコラーゲン蓄積抑制剤（以下、本発明蓄積抑制剤（III）と記すこともある。）
２８．一般式（Ｉ）で示される化合物またはその薬学的に許容される塩。
（式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、同一または相異なり、水素原子、アルキル基またはアシル基を表す。）;
２９．一般式（Ｉ）で示される化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含み、該有効成分が薬学的に許容される担体中に製剤化されてなることを特徴とするコラーゲン蓄積抑制剤；
（式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、同一または相異なり、水素原子、アルキル基またはアシル基を表す。）；
３０．サンショウ（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ ｐｉｐｅｒｉｔｕｍ Ｄｅ Ｃａｎｄｏｌｌｅ）およびその同属植物、ならびにボダイジュ（Ｔｉｌｉａ ｃｏｒｄａｔａ Ｍｉｌｌ）およびその同属植物からなる群から選択される植物の少なくとも１つの部位またはその処理物を有効成分として含み、該有効成分が薬学的に許容される担体中に製剤化されてなることを特徴とするコラーゲン蓄積抑制剤；
３１．Ｉ型コラーゲン遺伝子を有する細胞に、コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子が前記細胞外に存在する条件下において、アミノ酸配列（I）を有するＤＮＡ結合蛋白質依存的コラーゲン蓄積抑制経路の正の調節因子を投与する工程を有することを特徴とするコラーゲン蓄積抑制方法（以下、本発明蓄積抑制方法（IV）と記すこともある。）；
３２．コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子がＤＮＡ結合蛋白質依存的コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子であることを特徴とする前項３１記載のコラーゲン蓄積抑制方法；
等を提供するものである。
【０００５】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明蓄積抑制剤（I）は、コラーゲン蓄積抑制（特にＩ型コラーゲン遺伝子の転写抑制）のために使用される。
本発明蓄積抑制剤（I）において用いられるＤＮＡ結合蛋白質とは、下記のいずれかのアミノ酸配列を有する蛋白質である（以下、本蛋白質と記すこともある。）。
＜アミノ酸配列＞
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列
【０００６】
ここで、前記（ｂ）〜（ｅ）のアミノ酸配列と、配列番号１で示されるアミノ酸配列との相違は、一部のアミノ酸の欠失、置換、修飾、付加等である。これらは、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質が細胞内で受けるプロセシング、該蛋白質が由来する生物の種差、個体差、器官、組織間の差異等により天然に生じる変異や、部位特異的変異導入法や突然変異処理等によって遺伝子に人為的に導入される変異等により生じ得る。
かかるアミノ酸の欠失、付加もしくは置換（以下、総じてアミノ酸の改変と記すこともある。）を人為的に行う手法としては、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードするDNAに対して部位特異的変異導入を施し、その後このDNAを常法により発現させる手法が挙げられる。ここで部位特異的変異導入法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法（ギャップド・デュプレックス法、Nucleic Acids Res.,12,9441-9456(1984)）、変異導入用プライマーを用いたPCRによる方法等が挙げられる。
前記で改変されるアミノ酸の数については、少なくとも１個、具体的には1若しくは数個（ここで「数個」とは、２〜約１０個程度である。）、又はそれ以上である。かかる改変を受けるアミノ酸の数は、本蛋白質にＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を見出すことのできる範囲であれば良い。
また、アミノ酸の置換としては、例えば、疎水性、電荷、ｐＫ、立体構造上における特徴等の類似したアミノ酸への置換をあげることができる。このような置換としては、具体的には例えば、▲１▼グリシン、アラニン；▲２▼バリン、イソロイシン、ロイシン；▲３▼アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、▲４▼セリン、スレオニン；▲５▼リジン、アルギニン；▲６▼フェニルアラニン、チロシン等のグループ内での置換が挙げられる。
【０００７】
本発明において「配列同一性」とは、２つの塩基配列または２つのアミノ酸配列間の同一性及び相同性をいう。前記「配列同一性」は、比較対象の配列の全領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象の塩基配列またはアミノ酸配列の最適なアラインメントにおいては、付加又は欠失（例えばギャップ等）を許容してもよい。このような配列同一性は、例えば、Vector NTIを用いて、ClustalWアルゴリズム[Nucleic Acid Res.,22(22):4673-4680(1994)]を利用してアラインメントを作成することにより算出することができる。尚、配列同一性は、例えば、市販の配列解析ソフトウェア、具体的にはVector NTI、GENETYX-MACや、公共のデータベースで提供される解析ツールを用いて測定することができる。前記公共データベースは、例えば、ホームページアドレスhttp://www.ddbj.nig.ac.jpにおいて、一般的に利用可能である。
本発明における配列同一性は、例えば、アミノ酸配列基準の場合には８０％以上であることが好ましく、また塩基配列基準の場合には９０％以上であることが好ましい。上記条件を満たす限りにおいて、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号第５２番から第１３０番までのアミノ酸配列における配列同一性が実質的にほぼ１００％であり、第１番から第５１番までのアミノ配列における配列同一性が５０％以上であるような配列同一性であってもよい。
【０００８】
前記（ｅ）にある「ストリンジェントな条件」としては、Sambrook J., Frisch E. F., Maniatis T.著、モレキュラークローニング第2版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー発行（Cold Spring Harbor Laboratory press）等に記載される通常の方法に準じて行われるハイブリダイゼーションにおいて、例えば、６×SSC（１．５M NaCl、０．１５Mクエン酸三ナトリウムを含む溶液を１０×SSCとする）を含む溶液中で４５℃にてハイブリッドを形成させた後、2×SSCで５０℃にて洗浄するような条件（Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6）等を挙げることができる。洗浄ステップにおける塩濃度は、例えば、２×SSC（低ストリンジェンシーな条件）から０．２×SSC（高ストリンジェンシーな条件）までの条件から選択することができる。洗浄ステップにおける温度は、例えば、室温（低ストリンジェンシーな条件）から６５℃（高ストリンジェンシーな条件）までの条件から選択することができる。また、塩濃度と温度の両方を変えることもできる。
尚、本蛋白質のうち、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するＤＮＡ結合蛋白質は、ヒト由来のＹＢ−１（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｍ２４０７０）として知られている。
【０００９】
このような蛋白質は、以下のように探索すればよい。
例えば、まず（１）Ｉ型コラーゲン遺伝子を有する細胞に、被験蛋白質を接触させる第一工程、及び（２）前記第一工程後に、コラーゲン蓄積量を測定する第二工程を有する方法によりコラーゲン蓄積量を分析する。この際に、被験蛋白質として異なる２種以上の蛋白質を各々独立して用いた区におけるコラーゲン蓄積量を比較しその差異を調べる。その結果、得られる差異に基づき前記被験蛋白質のＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能力を評価する。このようにして評価されたＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力に基づき被験蛋白質を選抜することにより、Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質を探索することができる。上記第二工程におけるコラーゲン蓄積量を分析する代わりに、後述の本発明物質探索方法(III)のように、コラーゲン蓄積量の指標となるレポーター遺伝子の発現量をモニターすることで、被験蛋白質のＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能力を評価することにより、Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質を探索してもよい。
上記の方法において、前記異なる２種以上の被験蛋白質のうち少なくとも一つの蛋白質を、Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有さない蛋白質とすることで、他の被験蛋白質が有するＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を評価してもよい。また、前記異なる２種以上の蛋白質のうち少なくとも一つの蛋白質が有するＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を基準として、他の被験蛋白質が有するＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を評価してもよい。
【００１０】
本蛋白質は、SDS-PAGEでの分子量として約４万以上約６万以下の分子量であることが好ましく、特に約５万程度の分子量（例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質と同等）が適している。ただし、例えば配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち連続する約５０アミノ酸以上からなるアミノ酸配列が欠失したアミノ酸配列を有する蛋白質である場合には、SDS-PAGEでの分子量として約１万以上約４万以下の分子量であることが好ましく、特に約２万程度の分子量（例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号第１番から第１２９番までのアミノ酸配列からなる蛋白質に相当）が適している。
【００１１】
本蛋白質の調製方法（本蛋白質をコードする核酸の調製方法を含む）について以下に説明する。
まず、本蛋白質をコードする核酸（以下、本遺伝子と記すこともある。）、例えば、（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ；
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡであり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ；
（ｄ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡであり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ；
（ｅ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
等を、通常の遺伝子工学的方法（例えば、Sambrook J., Frisch E. F., Maniatis T.著、モレキュラークローニング第2版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー発行（Cold Spring Harbor Laboratory press）等に記載されている方法）に準じて取得する。次いで、得られた本遺伝子を用いることにより、通常の遺伝子工学的方法に準じて本蛋白質を製造・取得する。このようにして本蛋白質を調製することができる。
【００１２】
具体的には、まず、ヒト等の組織、細胞やこれらに由来する培養細胞などからＲＮＡを調製する。例えば、正常ヒト胎児皮膚繊維芽細胞等を塩酸グアニジンやグアニジンチオシアネート等の強力な蛋白質変性剤を含む溶液中で粉砕し、さらに該粉砕物にフェノール、クロロホルム等を加えることにより蛋白質を変性させる。変性蛋白質を遠心分離等により除去した後、回収された上清画分から塩酸グアニジン／フェノール法、ＳＤＳ−フェノール法、グアニジンチオシアネート／ＣｓＣｌ法等の方法により全ＲＮＡを抽出する。なお、これらの方法に基づいた市販の試薬としては、例えばISOGEN（ニッポンジーン製）、トリゾル試薬（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）等がある。
得られた全ＲＮＡを鋳型としてオリゴｄＴプライマーをＲＮＡのポリＡ配列にアニールさせ、逆転写酵素を作用させることにより一本鎖ｃＤＮＡを合成する。次いで、該一本鎖ｃＤＮＡを鋳型とし、本蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列（例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列又は配列番号２６で示される塩基配列）に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼチェイン反応（以下、ＰＣＲと記す。）を行うことにより、本遺伝子を増幅し、取得することができる。
また、上記の一本鎖ｃＤＮＡを鋳型としてＤＮＡポリメラーゼを作用させることにより二本鎖のｃＤＮＡを合成する。得られた二本鎖ｃＤＮＡを、例えばプラスミドpUC118やファージλgt10などのベクターに挿入することによりｃＤＮＡライブラリーを作製する。このようにして得られるｃＤＮＡライブラリーや市販のｃＤＮＡライブラリーから、例えば、本蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列（例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列又は配列番号２６で示される塩基配列）の部分塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして用いるハイブリダイゼーション法や、本蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列（例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列又は配列番号２６で示される塩基配列）に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるＰＣＲにより、本遺伝子を取得することもできる。
ＰＣＲに用いるプライマーとしては、例えば、約20bpから約50bp程度の長さでかつGまたはC塩基の割合が約40%から約60%程度の塩基配列を、上記のような本蛋白質をコードする塩基配列から選択し、該塩基配列に基いてオリゴヌクレオチドを設計し、合成するとよい。具体的には、例えば、ヒト由来の本遺伝子を取得するには、フォワードプライマーとして配列番号５で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いることができ、リバースプライマーとして配列番号６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いることができる。
得られた本遺伝子の塩基配列は、Maxam Gilbert法 (例えば、Maxam,A.M & W.Gilbert, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 74, 560, 1977 等に記載される)やSanger法（例えばSanger,F. & A.R.Coulson, J.Mol.Biol., 94, 441, 1975、Sanger,F, & Nicklen and A.R.Coulson., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 74, 5463, 1977等に記載される）により確認することができる。
このようにして、コラーゲン蓄積抑制（特にＩ型コラーゲン遺伝子の転写抑制）のために使用される本発明蓄積抑制剤（II）の有効成分となる本蛋白質をコードする核酸を調製することができる。
【００１３】
本遺伝子は、例えば、J.Sambrook,E.F.Frisch,T.Maniatis著；モレキュラー クローニング第２版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールドスプリング ハーバー ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）発行、１９８９年等記載の遺伝子工学的方法に準じてベクターにクローニングすることができる。
ベクターとしては、具体的には、大腸菌を宿主細胞とする場合には、例えばプラスミドpUC119(宝酒造（株）製)や、ファージミドpBluescriptII(ストラタジーン社製)等をあげることができる。出芽酵母を宿主細胞とする場合には、プラスミドpACT2(Clontech社製)などをあげることができる。また、哺乳類動物細胞を宿主細胞とする場合には、pRC/RSV、pRC/CMV(Invitrogen社製)等のプラスミド、ウシパピローマウイルスプラスミドpBPV(アマシャムファルマシア社製)、EBウイルスプラスミドpCEP4(Invitrogen社製)等のウイルス由来の自律複製起点を含むベクター、ワクシニアウイルス等のウイルスなどをあげることができる。昆虫類動物細胞（以下、昆虫細胞と記す。）を宿主細胞とする場合には、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスをあげることができる。
【００１４】
本遺伝子の上流に、宿主細胞で機能可能なプロモーターを機能可能な形で結合させ、これを上述のようなベクターに組み込むことにより、本遺伝子を宿主細胞で発現させることの可能な発現ベクターを構築することができる。ここで、「機能可能な形で結合させる」とは、本遺伝子が宿主細胞に導入された際に、宿主細胞においてプロモーターの制御下に発現されるように、当該プロモーターと本遺伝子とを結合させることを意味する。宿主細胞で機能可能なプロモーターとしては、例えば、宿主細胞が大腸菌である場合には、大腸菌のラクトースオペロンのプロモーター（lacP）、トリプトファンオペロンのプロモーター(trpP)、アルギニンオペロンのプロモーター(argP)、ガラクトースオペロンのプロモーター(galP)、tacプロモーターもしくはtrcプロモーター等の大腸菌内で機能可能な合成プロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、λファージのプロモーター(λ-pL、λ-pR)等をあげることができる。また、宿主細胞が動物細胞や分裂酵母である場合には、例えば、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、シミアンウイルス(SV40)の初期もしくは後期プロモーター、マウス乳頭腫ウイルス(MMTV)プロモーター等をあげることができる。宿主細胞が出芽酵母である場合には、ADH1プロモーターなどをあげることができる。
一般的には、宿主細胞で機能可能なプロモーターと本遺伝子とが機能可能な形で接続されてなるＤＮＡを、宿主細胞で利用可能なベクターに組込んで、これを宿主細胞に導入する。宿主細胞において機能可能なプロモーターをあらかじめ保有するベクターを使用する場合には、ベクター保有のプロモーターと本遺伝子とが機能可能な形で結合するように、該プロモーターの下流に本遺伝子を挿入すればよい。例えば、前述のプラスミドpRC/RSV,pRC/CMV等は、動物細胞で機能可能なプロモーターの下流にクローニング部位が設けられており、該クローニング部位に本遺伝子を挿入し動物細胞へ導入することにより、本遺伝子を発現させることができる。また、前述の酵母用プラスミドpACT2はADH1プロモーターを有しており、該プラスミドまたはその誘導体のADH1プロモーターの下流に本遺伝子を挿入すれば、本遺伝子を例えばCG1945(Clontech社製)等の出芽酵母内で発現させることが可能な発現ベクターが構築できる。マーカー遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等の抗生物質耐性付与遺伝子など）を含むベクターを用いると、本遺伝子が導入された形質転換体を当該マーカー遺伝子の表現型等を指標にして選択する際に便利である。
【００１５】
本遺伝子が組み込まれたベクター（以下、本ベクターと記すこともある。）を宿主細胞へ導入する方法としては、宿主細胞に応じた通常の導入方法を適用することができる。例えば、大腸菌を宿主細胞とする場合には、「モレキュラー・クローニング」（J.Sambrookら、コールド・スプリング・ハーバー、１９８９年）等に記載される塩化カルシウム法やエレクトロポレーション法等の通常の方法を用いることにより本ベクターを宿主細胞へ導入することができる。また、哺乳類動物細胞または昆虫細胞を宿主細胞とする場合には、例えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、エレクトロポレーション法またはリポフェクション法等の一般的な遺伝子導入法により前記細胞に本ベクターを導入することができる。酵母菌を宿主細胞とする場合には、例えば、リチウム法を基にしたYeast transformation kit(Clontech社製)などを用いて導入することができる。本ベクターが導入された形質転換体を選抜するには、例えば、本ベクターと同時に下記のようなマーカー遺伝子を宿主細胞に導入し、導入されたマーカー遺伝子の性質に応じた方法で本ベクターが導入された宿主細胞を培養すればよい。例えば、当該マーカー遺伝子が、宿主細胞に致死活性を示す選抜薬剤に対する薬剤耐性を付与する遺伝子（薬剤耐性付与遺伝子）である場合には、該薬剤を添加した培地を用いて、本ベクターが導入された宿主細胞を培養すれば良い。薬剤耐性付与遺伝子と選抜薬剤との組み合わせとしては、例えば、ネオマイシン耐性付与遺伝子とネオマイシンとの組み合わせ、ハイグロマイシン耐性付与遺伝子とハイグロマイシンとの組み合わせ、ブラストサイジンＳ耐性付与遺伝子とブラストサイジンＳとの組み合わせ等をあげることができる。また、当該マーカー遺伝子が宿主細胞の栄養要求性を相補する遺伝子である場合には、該栄養素を含まない最少培地を用いて、本ベクターが導入された細胞を培養すればよい。
【００１６】
上述のようにして得られた本ベクターが導入された形質転換体（以下、本形質転換体と記すこともある。）を培養することにより本遺伝子にコードされる本蛋白質を産生させることができる。
例えば、本形質転換体が微生物である場合には、形質転換体は、通常、一般微生物における培養に使用される炭素源や窒素源、有機ないし無機塩等を適宜含む各種の培地を用いて培養される。培地のｐＨは約６〜約８程度が一般的である。培養は、一般微生物における通常の方法に準じて行い、固体培養、液体培養（試験管振とう式培養、往復式振とう培養、ジャーファーメンター（Jar Fermenter）培養、タンク培養等）などが可能である。培養温度は、微生物が生育する範囲で適宜変更できるが、例えば、約１５℃〜約４０℃の培養温度で培養するのが一般的である。培養時間は、種々の培養条件によって異なるが、通常約１〜約５日間である。温度シフト型やIPTG誘導型等の誘導型の発現ベクターを用いた場合には誘導時間は１日以内が望ましく、通常数時間程度である。
また、本形質転換体が哺乳類や昆虫類等の動物細胞である場合には、形質転換体は、通常、一般の培養細胞における培養に使用される培地を用いて培養することができる。本形質転換体の選択に選抜薬剤を用いた場合には、当該選抜薬剤の存在下に培養するのが望ましい。哺乳類動物細胞の場合には、例えば、終濃度が10%となるようFBSが添加されたＤ−ＭＥＭ培地（ニッスイ社製等）を用い、３７℃、５％CO2存在下等の条件下で数日毎に新しい培養液に交換しながら培養すればよい。細胞がコンフルエントになるまで増殖したら、例えば０．２５(w/v)％程度のトリプシンPBS溶液を加えて個々の細胞に分散させ、得られた細胞の懸濁液を数倍に希釈して新しいぺトリディッシュに播種し継代を続ける。昆虫類動物細胞の場合も同様に、例えば10(v/v)%FBSおよび2(w/v)%Yeastlateを含むGrace's medium等の昆虫細胞用培地を用いて約２５℃〜約３５℃の培養温度で培養すればよい。
本形質転換体を培養することにより産生された本蛋白質は、蛋白質の通常の単離、精製の方法を適宜組み合わせて回収することができる。例えば、培養終了後、本形質転換体の細胞を遠心分離等で集め、必要に応じて、集められた該細胞を適宜バッファーに懸濁した後、ポリトロン、超音波処理、ダウンスホモジナイザー等で破砕する。得られた破砕液から、遠心分離、メンブレンフィルターろ過等により不溶物を除去して無細胞抽出液を調製し、これをイオン交換，疎水，ゲルろ過、アフィニティ等の各種クロマトグラフィーに供することにより、本蛋白質を精製することができる。この際、本蛋白質が結合するＤＮＡが有する塩基配列（例えば、後述の実施例に記載されるようなＹＢ−１結合配列）を含む約２０塩基から約２００塩基程度の長さのオリゴヌクレオチドをプローブとしたDNA結合アッセイなどにより、本蛋白質を含む画分を見分けることもできる。また、本蛋白質を、そのＮ末端側やＣ末端側に、例えば６〜１０個のヒスチジンが並んだアミノ酸配列が融合された形で発現させると、金属キレート樹脂を用いたキレートクロマトグラフィーによって１段階で精製が可能となる。
このようにして、本発明蓄積抑制剤（I）の有効成分となる本蛋白質を調製することができる。
【００１７】
本発明蓄積抑制剤（I）は、その有効量を経口的又は非経口的にヒト等の哺乳動物に対し投与することができる。例えば、経口的に投与する場合には、本発明蓄積抑制剤（I）は錠剤、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の通常の形態で使用することができる。前記形態の本発明蓄積抑制剤(I)を非経口的に投与する方法としては、例えば、注射（皮下、静脈内等）、経皮投与、直腸投与等を挙げることができる。前記の適当な投与剤型は薬学的に許容される、例えば、賦型剤、結合剤、安定剤、希釈剤等の通常の担体に本蛋白質を配合することにより製造することができる。必要に応じて、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、保存剤、着色剤、香料、保湿剤、防腐剤、酸化防止剤等の補助剤を添加してもよい。また注射剤型で用いる場合には、薬学的に許容される、例えば、水溶性溶剤、非水溶性溶剤、緩衝剤、溶解補助剤、等張剤、安定剤等の担体に本蛋白質を配合することにより製造することができる。必要に応じて、防腐剤、懸濁化剤、乳化剤等の補助剤を添加してもよい。また、非経口的に投与する場合には、本発明蓄積抑制剤（I）を溶液、乳剤、懸濁液等の通常の液剤・ローション剤の形態や軟膏剤、ゲル状経皮吸収剤等の通常の半固体剤の形態で使用することができる。さらに担体として徐放性ポリマー等を用いた徐放性製剤（例えば、本発明蓄積抑制剤（I）をエチレンビニル酢酸ポリマーのペレットに取り込ませた製剤。当該ペレットを治療すべき組織中に外科的に移植するような形態で使用される。）の形態で使用してもよい。
投与量は、投与される哺乳動物の年令、性別、体重、疾患の程度、本発明蓄積抑制剤の種類、投与形態等によって異なるが、通常は経口の場合には成人で１日あたり有効成分量として約１ｍｇ〜約２ｇ、好ましくは有効成分量として約５ｍｇ〜約１ｇを投与すればよく、注射の場合には成人で有効成分量として約０．１ｍｇ〜約５００ｍｇを投与すればよい。また、前記の１日の投与量を１回または数回に分けて投与することができる。
本発明蓄積抑制剤（I）の適用可能な疾患としては、例えば、肝硬変、間質性肺疾患、慢性腎不全（又は慢性腎不全に陥る疾患）、炎症後の過形成痕跡、術後の瘢痕や熱傷性瘢痕、或いは強皮症、動脈硬化、高血圧、関節リウマチ等のコラーゲン過剰蓄積疾患（例えば線維症）等をあげることができる。
【００１８】
本発明蓄積抑制剤（II）の有効成分となる、本蛋白質をコードする核酸（即ち、本遺伝子）は、前述の如く調製すればよい。また、例えば、当該核酸を含有する組換えベクターの形態で使用されることもある。ベクターとしては、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連性ベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、ＳＶ４０ベクター、ポリオーマウイルスベクター、乳頭腫ウイルスベクター、ピコルナウイルスベクター及びワクシニアウイルスベクター等のウイルスベクターをあげることができる。アデノウイルスベクターを使用する場合には、例えばＱＵＡＮＴＵＭ社製のＡｄＥａｓｙ Ｋｉｔを用い、本遺伝子をＴｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒのマルチクローニングサイトに組み込み、得られた組換えベクターを直線化した後に、ｐＡｄＥａｓｙ ｖｅｃｔｏｒと共に大腸菌にトランスフォームし、相同組換え体ＤＮＡをヒト２９３Ａ細胞に組み込むことにより、本遺伝子を含有する組換えウイルスを産生させ、これを回収し、使用することもできる。
また、ヒトサイトメガウイルスのプロモーター／エンハンサー領域を有するプラスミドＤＮＡ等のような非ウイルス系のベクターを用いることもできる。本遺伝子を線維化組織部位に直接注入する場合のように、非ウイルスベクターを用いて本遺伝子を局所的に送達するシステムにおいては、プラスミドＤＮＡの使用は有益である。体外に取り出された細胞に発現ベクターを導入して体内に戻す方法、すなわち、ｅｘ ｖｉｖｏ法を使えば、あらゆる既知の導入方法が利用可能である。例えば、ａ）直接注入、ｂ）リポソームを介する形質導入、ｃ）リン酸カルシウム法・エレクトロポレーション法・ＤＥＡＥ−デキストラン法による細胞トランスフェクション、ｄ）ポリブレンを介した送達、ｅ）プロトプラスト融合、ｆ）マイクロインジェクション、ｇ）ポリリシンを使った形質導入などによって、非ウイルスベクターを導入することができる。
【００１９】
本発明蓄積抑制剤（II）は、その有効量を非経口的にヒト等の哺乳動物に対し投与することができる。例えば、非経口的に投与する方法としては、例えば、上述のような注射（皮下、静脈内等）等を挙げることができる。前記の適当な投与剤型は薬学的に許容される、例えば、水溶性溶剤、非水溶性溶剤、緩衝剤、溶解補助剤、等張剤、安定剤等の担体に本遺伝子（ベクター型もしくはウィルス型、又はプラスミド型の本遺伝子の形態を含む）を配合することにより製造することができる。必要に応じて、防腐剤、懸濁化剤、乳化剤等の補助剤を添加してもよい。また、非経口的に投与する場合には、本発明蓄積抑制剤（II）を溶液等の通常の液剤の形態で使用することができる。
投与量は、投与される哺乳動物の年令、性別、体重、疾患の程度、本発明蓄積抑制剤の種類、投与形態等によって異なるが、通常は、患者細胞において前述の本発明蓄積抑制剤（I）を投与した場合における本蛋白質の細胞内レベルと等しい、本蛋白質の細胞内レベルをもたらす有効成分量を投与すればよい。また、前記の１日の投与量を１回または数回に分けて投与することができる。
本発明蓄積抑制剤（II）の適用可能な疾患としては、例えば、肝硬変、間質性肺疾患、慢性腎不全（又は慢性腎不全に陥る疾患）、炎症後の過形成痕跡、術後の瘢痕や熱傷性瘢痕、或いは強皮症、動脈硬化、高血圧、関節リウマチ等のコラーゲン過剰蓄積疾患（例えば線維症）等をあげることができる。
【００２０】
本発明は、哺乳動物細胞に、本蛋白質をコードする外来遺伝子を、当該外来遺伝子が前記細胞で発現する位置に置かれるように提供する工程を有することを特徴とする哺乳動物におけるコラーゲン蓄積抑制方法［本発明蓄積抑制方法（I）］も提供している。
哺乳動物細胞としては、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター等の哺乳動物由来の細胞を挙げることができる。当該細胞は、組織から分離された細胞や、同一の機能・形態を持つ集団を形成している細胞や、前記哺乳動物の体内にある細胞であってもよい。
従って、哺乳動物がヒトである場合には、一般にいう遺伝子治療が施されたヒトの細胞から各種実験に使用されるような株化細胞までを意味し、また哺乳動物が非ヒト動物である場合には、一般にいう遺伝子治療が施された非ヒト動物の細胞から各種実験に使用されるようなモデル動物の細胞や株化細胞までを意味する。後者の場合には、ラット、マウス等を好ましい動物種として挙げることができる。
本蛋白質をコードする外来遺伝子の調製方法は、前述の「本蛋白質の調製方法（本蛋白質をコードする遺伝子の調製方法を含む）」において説明されたものと同等な方法に準じて調製すればよい。
このように調製された外来遺伝子を用いて後述のように形質転換細胞を調製することにより、当該外来遺伝子が哺乳動物細胞で発現する位置に置かれるように提供された形質転換細胞を得ることができる。
本発明蓄積抑制方法（I）において「発現する位置に置かれた」とは、ＤＮＡ分子が、その塩基配列からの転写及び翻訳を指向する（即ち、例えば、本蛋白質をコードするＲＮＡおよび本蛋白質の産生を促進するような）塩基配列と隣接した位置に置かれていることを意味する。
本蛋白質の遺伝子の発現レベルは、本蛋白質の遺伝子が導入されていない細胞と比較してコラーゲン蓄積を抑制するために十分である量であればよい。この場合、本蛋白質をコードする外来遺伝子は、本蛋白質の全体又は一部をコードする外来遺伝子であってもよい。
上記のコラーゲン蓄積抑制方法において、本蛋白質をコードする外来遺伝子がゲノムに組み込まれた形質転換細胞を作製することによりコラーゲン蓄積を抑制してもよい。
【００２１】
上記のコラーゲン蓄積抑制方法において、本蛋白質をコードする外来遺伝子を哺乳動物細胞に導入するために用いられる遺伝子構築物（以下、本遺伝子構築物と記載することもある。）及び遺伝子移入到達手段には、当該外来遺伝子が導入される哺乳動物細胞に対して親和性を有する、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター又はその他のウイルスベクターを用いることができる。具体的には例えば、ミラー(Miller)，Human Gene Therapy 15〜14，1990;フリードマン(Friedman)，Science 244:1275〜1281，1989;エグリティス(Eglitis)およびアンダーソン(Anderson)，BioTechniques 6:608〜614，1988;トルストシェフ(Tolstoshev)およびアンダーソン(Anderson)，current opinion in Biotechnology 1;55〜61，1990;シャープ(Sharp)，The Lancet 337:1277〜1278，1991;コルネッタ(Cornetta)ら、Nucleic Acid Research and Molecular Biology 36:311〜322，1987;アンダーソン(Anderson)，Science 22-:401〜409，1984;モーン(Moen)，Blood Cells 17:407〜416，1991;ミラー(Miller)ら、Biotechniques 7:980〜990，1989;Le Gai La Salleら、Science 259:988〜990，1993;およびジョンソン(Johnson)，Chest 107:77S〜83S，1995等に記載される公知のベクターをあげることができる。ローゼンバーグ(Rosenberg)ら、N．Engl．J．Med 323:370，1990;アンダーソン(Anderson)ら、米国特許第5,399,346号等に記載されるレトロウイルスベクターは特に開発が進んでおり、臨床の場でもすでに使用されている。
また、そのままではコラーゲン過剰蓄積が起こると予想される細胞内に本蛋白質をコードする外来遺伝子（DNA）を導入するためには、非ウイルス的手法も用いることができる。例えば、フェルグナー(Felgner)ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:7413，1987;オノ(Ono)ら、Neurosci．Lett．117:259，1990;ブライアム(Brigham)ら、Am．J．Med．Sci．298:278，1989;シュタウビンガー(Staubinger)ら、Meth．Enz．101:512，1983）、アシアロソヌコイド・ポリリジン抱合（ウー(Wu)ら、J．Biol．Chem．263:14621，1988;ウー(Wu)ら、J．Biol．Chem．264:16985，1989等に記載されるリポフェクション、ウォルフ(Wolff)ら、Science 247:1465，1990等に記載されるマイクロインジェクション、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、エレクトロポレーション法及びプロトプラスト融合法、リポソーム法等があげられる。
本遺伝子構築物において、当該外来遺伝子は、本蛋白質の遺伝子を構成的に発現させるようなプロモーターの制御下に置かれていてもよい。例えば、ＳＶ４０ウイルスプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶプロモーター）、Raus Sarcoma Virusプロモーター（ＲＳＶプロモーター）、βアクチン遺伝子プロモーター等が挙げられる。また、当該外来遺伝子は、本蛋白質の遺伝子の発現を環境刺激により調節するようなプロモーターの制御下に置かれていてもよい。例えば、外来遺伝子は、組織特異的もしくは細胞型特異的なプロモーター、又は化学的信号もしくは薬物等の外来性の信号もしくは薬物の導入により活性化されるプロモーターを用いて発現させてもよい。尚、このようなプロモーターをマルチクローニング部位の上流に含む市販のベクターを利用することもできる。
【００２２】
上記のコラーゲン蓄積抑制方法を遺伝子治療の手段として応用する場合には、上記の適用手段のいずれについても、本遺伝子構築物は、コラーゲン過剰蓄積が予想される部位に対して適用される（例えば、注入によって）ことがよい。また、コラーゲン過剰蓄積等の現象が予想される部位の近傍の組織又はコラーゲン過剰蓄積が起こると予想される細胞に供給される血管に対してそれを適用してもよい。また、本蛋白質をコードする遺伝子を導入しようとする動物にとって外因性又は内因性の培養可能な細胞に、本蛋白質の遺伝子をトランスフェクションし、次いで、トランスフェクションされた細胞を血清学的に標的組織に対して注入することもできる。
理想的には、かかる遺伝子治療の手法により、少なくとも正常細胞における本蛋白質の細胞内レベルと同等の、本蛋白質の細胞内レベルがもたらされるとよい。
【００２３】
以下に、一例として、哺乳動物が形質転換非ヒト動物である場合の本発明蓄積抑制方法（I）についてより詳細に説明する。
形質転換非ヒト動物の作製における本遺伝子の導入法としては、例えば、マイクロインジェクション法、レトロウイルスを用いる方法、胚性未分化細胞（ＥＳ細胞）を用いる方法等を挙げることができる。このうち、マイクロインジェクション法が最も汎用されている。マイクロインジェクション法とは、マイクロマニピュレーターを用いて、顕微鏡下で受精卵の前核内部に外来遺伝子を含んだ溶液を注入する方法である。
まず、本遺伝子を受精卵に注入する。その際、遺伝子を高い確率で染色体へ組込むためには、本遺伝子の単離に用いたベクター領域を可能な限り除去すること、ｍＲＮＡの不安定化に寄与するＡＵに富む領域を除くこと、直鎖状にすることが好ましい。また、本遺伝子に対してイントロンを予め挿入しておくことが好ましく、当該イントロンとしては、例えば、β−グロビンイントロン等を挙げることができる。
受精卵は、目的に応じた系統の非ヒト動物から採取する。例えば、マウスの場合には、近交系のＣ５７ＢＬ／６マウスやＣ３Ｈマウス、あるいはＣ５７ＢＬ／６マウスと他系統のマウスとの交雑系（例えば、（Ｃ５７ＢＬ／６ｘＤＢＡ／２）Ｆ1等）、非近交系のＩＣＲマウスを用いることができる。受精卵は、通常、妊馬血清ゴナドトロピンとヒト絨毛性ゴナドトロピンとの両者の腹腔内投与により過剰排卵を誘発させた雌マウスと雄マウスとを交尾させた後、前記雌マウスから採取する。尚、採取した受精卵は培養用ドロップに入れ、ＣＯ2ガスインキュベーターで培養・維持することにより、本遺伝子の注入操作まで保管することができる。
本遺伝子の注入はマイクロマニピュレーターをセットした倒立顕微鏡下で行なう。用いられる受精卵としては、雄性前核が雌性前核より大きくなる頃から両前核が融合するまでの発達段階にあるものを用いるとよい。まず受精卵を固定し、当該受精卵の雄性前核内に本遺伝子を含有するＤＮＡ溶液を注入する。当該ＤＮＡ溶液は必要に応じて複合体として調製する。複合体形成に用いられる物質としては、リポソーム、リン酸カルシウム、レトロウイルス等を挙げることができる。ＤＮＡ溶液の注入は雄性前核が膨らむことにより確認できる。ＤＮＡ注入量としては、例えば、約２００〜約３，０００コピーの本遺伝子を含む量を挙げることができる。
【００２４】
このようにして、本遺伝子が注入された受精卵は胚盤胞になるまで前記と同様にして培養した後、仮親の子宮に移植する。好ましくは本遺伝子の注入操作後ただちに仮親の卵管に移植するとよい。仮親としては、マウスの場合には、精管切断手術を施した雄マウスと交尾させて偽妊娠状態にしたＩＣＲ雌マウスを用いるとよい。具体的には、まず当該ＩＣＲ雌マウス背側の腎臓付近の皮膚と筋層を切開して卵巣・卵管・子宮を引き出し、卵巣膜を破いて卵管口を探し出す。次いで本遺伝子の注入操作後に生き残った受精卵を該卵管口から移入し、卵巣・卵管・子宮を腹腔内に戻した後、筋層を縫合し、皮膚をクリップでとめる。約２０日後に仔が生まれる。
得られた仔の体組織の一部、例えば尾の一部、を切り取り、当該部位から抽出されたＤＮＡのサザンブロッティング等により本遺伝子の存在有無を確認する。このようにして、本遺伝子が非ヒト動物に導入されたことを確認できる。あるいは他の方法、例えばＰＣＲなどの確認方法を利用してもよい。
【００２５】
このようにして構築された形質転換非ヒト動物を、本蛋白質を発現する細胞として後述のような本発明探索方法に利用する場合において、当該形質転換非ヒト動物への被験物質の投与は、通常の方法を用いればよい。例えば、被験物質を飼料や飲水に混合する方法や、直接投与する方法（例えば静脈内投与や、筋肉内、皮内、皮下もしくは腹腔内投与）が挙げられる。また、必要に応じて、被験物質を投与する前に予備飼育を行ってもよい。投与量および投与期間は、動物の種類、週齢、採用される投与方法等により適宜選択することができるが、例えば、げっし類動物等の非ヒト動物に対する腹腔内投与の場合には、約０．１ｍｇ／ｋｇ−体重／日〜約１０ｍｇ／ｋｇ−体重／日、げっし類動物等の非ヒト動物に対する経口投与の場合には、約１ｍｇ／ｋｇ−体重／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ−体重／日の被験物質を２〜４週間程度投与すればよい。
【００２６】
上記方法のうち、コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子が細胞の外に存在する条件下において、当該細胞に前記外来遺伝子を提供することもできる。このような条件としては、例えば、コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子が細胞外に、下記のようなコラーゲン過剰蓄積に起因する疾患と診断されうる哺乳動物の体内、例えば、線維症に羅患していると診断されうる哺乳動物の体内、における当該因子の存在量と同等な量存在するような条件をあげることができる。
ここで、「コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子」とは、細胞が有するコラーゲン合成機構において、コラーゲン遺伝子の転写を活性化させるように作用する物質を意味し、例えば、ＤＮＡ結合蛋白質依存的コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子を挙げることができる。
上記のＤＮＡ結合蛋白質としては、例えば、ＡＰ−１、Ｓｍａｄ等を挙げることができる。このような蛋白質は、通常、細胞内に存在しており、細胞外からの刺激等が引き金になって活性型（リン酸化状態）に変化することでコラーゲン遺伝子の上流領域に存在する発現調節領域に結合する。この結合によりコラーゲン遺伝子の転写が活性化される。
具体的には、コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子としてＴＧＦ−βを挙げることができる。
【００２７】
本発明は、コラーゲン過剰蓄積に起因する疾患と診断されうる哺乳動物の体内にある細胞、例えば、線維症に羅患していると診断されうる哺乳動物の体内にある細胞に、本蛋白質を投与する工程を有することを特徴とするコラーゲン蓄積抑制方法も提供する。
コラーゲン過剰蓄積に起因する疾患としては、例えば、肝硬変、間質性肺疾患、慢性腎不全（又は慢性腎不全に陥る疾患）、炎症後の過形成痕跡、術後の瘢痕や熱傷性瘢痕、或いは強皮症、動脈硬化、高血圧、関節リウマチ等のコラーゲン過剰蓄積疾患（例えば線維症）等をあげることができる。
ここで「本蛋白質を投与する」には、本蛋白質を前述のような本発明蓄積抑制剤（I）の形態にして直接的に投与してもよいし、また前述のような本発明蓄積抑制方法（I）の形態にて、目的とする細胞に本遺伝子を導入して発現させ本蛋白質を産生させることにより投与してもよい。尚、後者の場合には、本蛋白質の細胞内レベルが、例えば、前者の場合における本蛋白質の細胞内レベルと同等となるように投与すればよい。
【００２８】
本発明は、哺乳動物細胞に、コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子が前記細胞外に存在する条件下において、本蛋白質を投与する工程を有することを特徴とするコラーゲン蓄積抑制方法［本発明蓄積抑制方法（II）］も提供している。
ここで、「哺乳動物細胞」や「コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子が前記細胞外に存在する条件」とは、前述の本発明蓄積抑制方法（I）において説明されたものと同様である。
本発明は、Ｉ型コラーゲン遺伝子を有する細胞に、本蛋白質を投与する工程を有することを特徴とするコラーゲン蓄積抑制方法［本発明蓄積抑制方法（III）］も提供している。
ここで、Ｉ型コラーゲン遺伝子を有する細胞とは、I型コラーゲン遺伝子を有し、コラーゲン遺伝子の転写、当該転写によって生じるｍＲＮＡの翻訳、当該翻訳によって生じるコラーゲン蛋白質の複合体形成、当該複合体形成によって生じる成熟型コラーゲンの分泌等の一連のコラーゲン合成機構が機能する細胞である。
当該細胞に本蛋白質を投与するには、本蛋白質を前述のような本発明蓄積抑制剤（I）の形態にして直接的に投与してもよいし、また前述のような本発明蓄積抑制方法（I）の形態にて、目的とする細胞に本遺伝子を導入して発現させ本蛋白質を産生させることにより投与してもよい。尚、後者の場合には、本蛋白質の細胞内レベルが、例えば、前者の場合における本蛋白質の細胞内レベルと同等となるように投与すればよい。。
上記方法において、コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子が前記細胞外に存在する条件下に、本蛋白質を投与することもできる。尚、「コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子が前記細胞外に存在する条件」とは、前述の本発明蓄積抑制方法（I）において説明された条件と同様である。
【００２９】
本発明は、Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を調節する物質の探索方法であって、
（１）本蛋白質を発現する細胞に、被験物質を接触させる第一工程、
（２）前記第一工程後に、本蛋白質の細胞核内への移行量又はその量と相関関係を有する指標値を測定する第二工程、
（３）第二工程により測定された移行量又はその量と相関関係を有する指標値に基づき前記物質のＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を評価する第三工程、及び
（４）前記第三工程で評価されたＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能に基づきＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を有する物質を選抜する第四工程
を有することを特徴とする探索方法［本発明探索方法（I）］も提供している。
本蛋白質の細胞核内への移行量又はその量と相関関係を有する指標値を測定するには、例えば、被験物質と接触した後の細胞から、通常の方法に準じて細胞核画分を分離し、分離された細胞核画分内に存在する本蛋白質の量又はその量と相関関係を有する指標値を測定すればよい。また、例えば、被験物質と接触した後の細胞を蛍光顕微鏡等にて観察することにより、細胞核内に存在する（蛍光標識された）本蛋白質の量又は本蛋白質の量と相関関係を有する（蛍光）指標値を測定してもよい。
【００３０】
本蛋白質の細胞核内への移行量を測定する場合において用いられる細胞としては、例えば、ヒト由来の本蛋白質を発現する細胞を好ましいものとして挙げることができる。また本蛋白質の細胞核内への移行量と相関関係を有する指標値を測定する場合において用いられる細胞としては、本蛋白質の細胞核内への移行量と相関関係を有する指標値を提供可能とする外来性マーカー蛋白質を発現する細胞を挙げることができる。使用可能な外来性マーカー蛋白質としては、具体的には、本蛋白質とGreen Fluorescent Protein（以下、ＧＦＰと記す。）との融合蛋白質等が挙げられる。
例えば、本蛋白質のアミノ酸配列とＧＦＰのアミノ酸配列とを有する蛋白質を発現する細胞を調製する。まず、本蛋白質のアミノ酸配列をコードしかつ終止コドンを含まないＤＮＡ、及び、開始コドンを除くＧＦＰのアミノ酸配列を有するＤＮＡを、それぞれの塩基配列に基づいて作製されたオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行うこと等により調製する。調製されたＤＮＡを、本蛋白質のアミノ酸配列の下流にＧＦＰのアミノ酸配列が読み枠が連続する形でコードされ、かつラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）プロモーター、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーター等のプロモーターと発現可能な形で接続されるように、ベクターに挿入する。例えば、前記プロモーターを有しかつその下流に遺伝子挿入部位とＧＦＰのアミノ酸配列をコードする塩基配列とを有する市販のベクターを利用してもよい。このようにして得られる本蛋白質のアミノ酸配列とＧＦＰのアミノ酸配列とを有する蛋白質を発現させるためのベクターを、繊維芽細胞等の細胞に導入することにより、当該蛋白質を発現する細胞を取得する。
得られた細胞を培養して、これに被験物質を接触させた後、蛍光顕微鏡でＦＩＴＣフィルターを用いて観察することにより、核内の蛍光の有無を検出する。被験物質と接触させた細胞における核内の蛍光量が、溶媒のみと接触させた細胞（対照区）の核内の蛍光量よりも多い場合には、当該被験物質が、Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写調節能（この場合には、転写抑制能である。）を有すると評価することができる。
【００３１】
本発明は、Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を調節する物質の探索方法であって、
（１）Ｉ型コラーゲン遺伝子を有し、かつ、本蛋白質をコードする外来遺伝子を当該外来遺伝子が細胞で発現する位置に置かれるように提供されてなる細胞に、異なる２種以上の被験物質を独立して接触させる第一工程
（２）前記第一工程後に、コラーゲン蓄積量を独立してモニターする第二工程、
（３）第二工程により独立してモニターされたコラーゲン蓄積量を互いに比較することにより得られる差異に基づき前記物質のＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を評価する第三工程、
（４）前記第三工程で評価されたＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能に基づきＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を有する物質を選抜する第四工程、
を有することを特徴とする探索方法［本発明探索方法（II）］も提供している。
「Ｉ型コラーゲン遺伝子を有し、かつ、本蛋白質をコードする外来遺伝子を当該外来遺伝子が細胞で発現する位置に置かれるように提供されてなる細胞」とは、、I型コラーゲン遺伝子を有し、コラーゲン遺伝子の転写、当該転写によって生じるｍＲＮＡの翻訳、当該翻訳によって生じるコラーゲン蛋白質の複合体形成、当該複合体形成によって生じる成熟型コラーゲンの分泌等の一連のコラーゲン合成機構が機能する細胞に、前述の本発明蓄積抑制方法（I）で用いられる形質転換細胞のように、本蛋白質をコードする外来遺伝子が発現されるような形質転換を施すことによって得られる細胞である。当該細胞では、細胞内で発現された本蛋白質によりコラーゲン遺伝子の転写が抑制されるために、上記のような一連のコラーゲン合成機構が正常に機能しない。そこで、被験物質の作用によって当該細胞が有する一連のコラーゲン合成機構が正常に機能するように回復する変化を、コラーゲン蓄積量をモニターすることによって調べれば、Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を有する物質の探索に利用できる。
上記方法のうち、第一工程が、コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子が前記細胞外に存在する条件下でなされてもよい。尚、「コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子が前記細胞外に存在する条件」とは、前述の本発明蓄積抑制方法（I）において説明された条件と同様である。
【００３２】
本発明は、Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を調節する物質の探索方法であって、
（１）（ａ）転写開始に必要な塩基配列を含む、Ｉ型コラーゲン遺伝子の発現調節領域を機能可能な形で連結されてなるレポーター遺伝子を含有する細胞と、（ｂ）転写開始に必要な塩基配列を含み、かつ本蛋白質との結合能力を有さない塩基配列を機能可能な形で連結されてなるレポーター遺伝子を含有する細胞との両細胞に、被験物質を独立して接触させる第一工程、
（２）前記第一工程後に、レポーター遺伝子の発現量を独立してモニターする第二工程、及び
（３）第二工程により独立してモニターされた発現量を互いに比較することにより得られる差異に基づき前記物質のＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を評価する第三工程、及び
（４）前記第三工程で評価されたＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能に基づきＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を有する物質を選抜する第四工程
を有することを特徴とする探索方法［本発明探索方法（III）］も提供している。
【００３３】
「（a）転写開始に必要な塩基配列を含み、Ｉ型コラーゲン遺伝子の発現調節領域を機能可能な形で連結されてなるレポーター遺伝子」は、例えば、上流から順に、Ｉ型コラーゲン遺伝子の発現調節領域（即ち、本蛋白質との結合能を有する塩基配列）、転写開始に必要な塩基配列及びレポーター蛋白質をコードする塩基配列が位置するように、これらの塩基配列を有するＤＮＡを機能可能な形で連結することにより調製することができる。
当該レポーター遺伝子に用いられる「Ｉ型コラーゲン遺伝子の発現調節領域の塩基配列」としては、例えば、配列番号２で示される塩基配列、ヒトコラーゲンα２（Ｉ）鎖遺伝子（ＣＯＬ１Ａ２）のプロモーター領域の−１６１から−１２５まで（転写開始点を＋１とする。）の塩基配列（配列番号３で示される塩基配列）等をあげることができる。かかる塩基配列と本蛋白質とが結合すると、該塩基配列を有する上記レポーター遺伝子の転写が抑制される。
そして、「Ｉ型コラーゲン遺伝子の発現調節領域」の下流に「転写開始に必要な塩基配列」が位置する塩基配列として、例えば、ヒトコラーゲンα２（Ｉ）鎖遺伝子（ＣＯＬ１Ａ２）の５’上流領域（例えば、転写開始点を１として、−１６１番目の塩基〜＋５７番目の塩基を含む領域（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮｏＪ０３４６４、Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌ．，１６：４４７，１９９８）の塩基配列を挙げることができる。当該塩基配列を有するＤＮＡと、レポーター蛋白質をコードする塩基配列を有するＤＮＡとを連結することによりＩ型コラーゲン遺伝子の発現調節領域、転写開始に必要な塩基配列及びレポーター蛋白質をコードする塩基配列を含むレポーター遺伝子（以下、本蛋白質による転写調節を受けるレポーター遺伝子と記すこともある。）のＤＮＡを調製することができる。
【００３４】
「（ｂ）転写開始に必要な塩基配列を含み、かつ本蛋白質との結合能力を有さない塩基配列を機能可能な形で連結されてなるレポーター遺伝子」は、例えば、上流から順に、本蛋白質との結合能を示さない塩基配列、転写開始に必要な塩基配列及びレポーター蛋白質をコードする塩基配列が位置するように、これらの塩基配列を有するＤＮＡを機能可能な形で連結することにより調製することができる。
当該レポーター遺伝子に用いられる「本蛋白質との結合能を示さない塩基配列」としては、例えば、前記の「Ｉ型コラーゲン遺伝子の発現調節領域の塩基配列が有する本蛋白質との結合能が消失するように、当該塩基配列の一部が置換されるか又は欠失した塩基配列等を挙げることができる。具体的には、例えば、配列番号２５で示される塩基配列、配列番号４で示される塩基配列等をあげることができる。尚、所定の塩基配列を有するＤＮＡと本蛋白質との結合能は、前記配列を有する標識されたＤＮＡと本蛋白質との複合体の形成の有無を検出するゲルシフトアッセイ等の通常の方法により調べることができる。「転写開始に必要な塩基配列」としては、例えば、ＴＡＴＡボックスをあげることができる。具体的には、チミジンキナーゼ遺伝子（ｔｋ）の５’上流領域の塩基配列等があげられる。かかる塩基配列を有するＤＮＡは、化学合成するか、ＰＣＲにより増幅しクローニングすること等により調製することができる。
そして前述と同様の方法により、本蛋白質との結合能を示さない塩基配列、転写開始に必要な塩基配列及びレポーター蛋白質をコードする塩基配列を含むレポーター遺伝子（以下、本蛋白質による転写調節を受けないレポーター遺伝子と記すこともある。）のＤＮＡを調製することができる。
【００３５】
「レポーター遺伝子」にコードされるレポーター蛋白質としては、当該蛋白質が有する酵素活性等に基づき当該蛋白質又はレポーター遺伝子の発現量の測定が可能となるような蛋白質が好ましい。例えば、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ等をあげることができる。このようなレポーター蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、これらのＤＮＡを含む市販のプラスミドのＤＮＡを制限酵素消化して目的とするＤＮＡを単離すること等により得ることができる。
【００３６】
次に、上記のようにして得られる「本蛋白質による転写調節を受けないレポーター遺伝子」を含むＤＮＡ及び「本蛋白質による転写調節を受けるレポーター遺伝子」を含むＤＮＡを、それぞれプラスミド等のベクターに組込んで、これをリポフェクション法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等の通常の方法によって細胞に導入し、これらのレポーター遺伝子がそれぞれ導入されてなる細胞を選抜する。ベクターとしては、大腸菌等の遺伝子工学的技術に適した微生物内で機能可能な複製起点及び薬剤耐性遺伝子を有するプラスミド等があげられる。このとき、これらのレポーター遺伝子が導入された細胞の選抜を容易にするために、薬剤耐性遺伝子等の選抜マーカー遺伝子を同時に導入してもよい。使用可能な薬剤耐性遺伝子としては、例えば、ネオマイシン耐性（アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ）遺伝子、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子等があげられる。
本発明探索方法（III）に使用可能な細胞としては、例えば、本蛋白質を含有する哺乳動物由来の細胞をあげることができ、好ましくは、ヒト組織由来の細胞をあげることができる。より具体的には、ヒト皮膚由来の繊維芽細胞等のＹＢ−１遺伝子内在性細胞があげられる。また、ヒトｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ細胞等の本蛋白質遺伝子非内在性細胞は、該細胞に、例えば本蛋白質をコードするＤＮＡを導入し発現させて使用すればよい。尚、本蛋白質をコードするＤＮＡは、上述のレポーター遺伝子を含むＤＮＡと同時に細胞へ導入されてもよいし、別々に導入されてもよい。例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する本蛋白質をコードするＤＮＡは、該ＤＮＡを増幅するためのオリゴヌクレオチドを、例えば配列番号２６で示される塩基配列に基づいて設計して作製し、作製されたオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行うことなどにより調製することができる。かかるＰＣＲにおいて鋳型としては、例えば、市販のヒト由来ｃＤＮＡを使用することができる。得られた本蛋白質をコードするＤＮＡを、例えば、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）プロモーター、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーター、シミアンウィルス（ＳＶ４０）の初期もしくは後期プロモーター等のプロモーターと発現可能な形で接続されるようにベクターに挿入して細胞に導入し、本蛋白質を発現する細胞を取得する。ベクターとしては、例えば、上記のようなプロモーターを有しその下流に遺伝子挿入部位を有する市販の発現用ベクター等を使用することができる。
【００３７】
次に、このようにして得られた細胞（両細胞）に、被験物質を（独立して）接触させる。当該工程において、当該細胞と接触させる被験物質の濃度は、例えば、約０．１μＭ〜約１００μＭであればよく、１μＭ〜５０μＭが好ましい。当該細胞と被験物質とを接触させる時間は、例えば、１時間以上５日間程度であり、好ましくは数時間から４日間程度が挙げられる。
この工程後に、レポーター遺伝子の発現量を（独立して）モニターする。レポーター遺伝子の発現量のをモニターする方法は、使用されるレポーター遺伝子にコードされるレポーター蛋白質の種類にもよるが、一般的には、測定対象の細胞に細胞溶解剤を添加することにより調製された細胞抽出液に含まれるレポーター蛋白質の量を測定すればよい。例えば、使用されたレポーター蛋白質が酵素活性を有する場合には、当該酵素に特異的な基質と当該酵素を含む細胞抽出液とを反応させた後、残存する基質の量又は反応産物の量を、その発光量、蛍光吸光度、吸光度等を指標にしてレポーター蛋白質の量を測定する。具体的には、例えば、レポーター蛋白質としてルシフェラーゼを用いた場合には、ルシフェラーゼの基質であるルシフェリンと細胞抽出液とを反応させると、細胞抽出液中のルシフェラーゼ量に比例した強度で発光する。従って、この発光強度をルミノメーター等の測定装置で測定することにより、細胞抽出液中のルシフェラーゼ量、又は、ルシフェラーゼ遺伝子の発現量を知ることができる。
次に、上記のようにしてモニターされた
（ｉ）被験物質と本蛋白質の転写調節を受けるレポーター遺伝子を有する細胞とを接触させてなるレポーター遺伝子の発現量、と
（ii）被験物質と本蛋白質の転写調節を受けないレポーター遺伝子を有する細胞とを接触させてなるレポーター遺伝子の発現量
との両者を互いに比較することにより得られる差異に基づき被験物質のＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を評価する。前者発現量が後者発現量よりも低い場合または高い場合には、当該被験物質はＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能に基づきＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能（低い場合には、本蛋白質依存的コラーゲン蓄積抑制経路の正の調節因子、高い場合には、本蛋白質依存的コラーゲン蓄積抑制経路の負の調節因子）を有する物質であると評価すればよい。
このように評価されたＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能に基づきＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を有する物質を選抜すればよい。
【００３８】
また、より精密な探索方法が要求される場合には、例えば、下記のような方法が適している。まず本蛋白質の転写調節を受けないレポーター遺伝子を有する細胞について、被験物質と接触させた場合における当該レポーター遺伝子の発現量の測定値と、溶媒のみと接触させた場合（対照区）における当該レポーター遺伝子の発現量の測定値とを比較する。両者の値が実質的に同等、具体的には例えば両者の比が約０．９〜約１．１程度の範囲内であれば、当該被験物質をＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を検定するために仮選択する。当該比が、例えば約０．９未満となる場合には、被験物質が細胞毒性を有する可能性等が考えられ、一方、例えば約１．１を超えるような場合には、被験物質が遺伝子の転写調節系に対して本蛋白質を介さずに作用している可能性等が考えられる。但し、被験物質を選択するために適した当該比の範囲は、検定に使用される細胞の性質や測定の条件によって異なり、前述の例示数値に限定されるものではない。
次いで、本蛋白質の転写調節を受けるレポーター遺伝子を有する細胞について、上記のようにして仮選択された被験物質と接触させた場合における当該レポーター遺伝子の発現量の測定値と、溶媒のみと接触させた場合（対照区）における当該レポーター遺伝子の発現量の測定値とを比較する。被験物質と接触させた細胞におけるレポーター遺伝子の発現量の測定値が、溶媒のみと接触させた細胞（対照区）の測定値よりも低い場合には、当該被験物質が本蛋白質依存的コラーゲン蓄積抑制経路の正の調節因子であると評価することができる。一方、被験物質と接触させた細胞におけるレポーター遺伝子の発現量の測定値が、溶媒のみと接触させた細胞（対照区）の測定値よりも高い場合には、当該被験物質が本蛋白質依存的コラーゲン蓄積抑制経路の負の調節因子であると評価することができる。
上記方法のうち、第一工程が、コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子が前記細胞外に存在する条件下においてなされてもよい。尚、「コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子が前記細胞外に存在する条件」とは、前述の本発明蓄積抑制方法（I）において説明された条件と同様である。
【００３９】
また上記方法のうち、第一工程が、本蛋白質依存的コラーゲン蓄積抑制経路の正の調節因子が前記細胞内に存在する条件下においてなされる方法であってもよい。ここで本蛋白質依存的コラーゲン蓄積抑制経路の正の調節因子とは、細胞が有するコラーゲン合成機構において、コラーゲン遺伝子の転写を抑制させるように作用する物質を意味し、例えば、本蛋白質自身を挙げることができる。
【００４０】
このような前記の探索方法により選抜された物質またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含み、該有効成分が薬学的に許容される担体中に製剤化されてなることを特徴とするコラーゲン蓄積抑制剤［本発明蓄積抑制剤（III）］を提供可能とした。
本発明蓄積抑制剤（III）では、有効成分として、一般式（Ｉ）で示される化合物またはその薬学的に許容される塩を用いることができる。
（式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、同一または相異なり、水素原子、アルキル基またはアシル基を表す。）
上記一般式（Ｉ）において、
Ｒ1、Ｒ2またはＲ3で示されるアルキル基としては、例えば、炭素数１から６のアルキル基等があげられる。具体的には、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、１，１−ジメチルプロピル基、１−エチルプロピル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基、２−エチルブチル基、１−メチルペンチル基、１−エチルブチル基、３−メチルペンチル基、１，３−ジメチルブチル基等があげられる。
Ｒ1、Ｒ2またはＲ3で示されるアシル基としては、例えば、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、バレリル基、イソバレリル基、ピバロイル基等があげられる。
上記一般式（Ｉ）で示される化合物は、例えば、サンショウの果皮のエタノール抽出物を、シリカゲルを用いた薄層クロマトグラフィー、逆相カラムを用いたカラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等に供して分画するか、又は、かかる天然物から精製された化合物から通常の化学合成方法に準じて導くことにより、得ることができる。得られる化合物は、マスペクトル又はＮＭＲスペクトル等を測定することにより、その化学構造を確認することができる。
上記の本発明蓄積抑制剤（III）では、一般式（Ｉ）で示される化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含み、該有効成分が薬学的に許容される担体中に製剤化されている。
【００４１】
また本発明蓄積抑制剤（III）では、有効成分として、サンショウ（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ ｐｉｐｅｒｉｔｕｍ Ｄｅ Ｃａｎｄｏｌｌｅ）およびその同属植物、ならびにボダイジュ（Ｔｉｌｉａ ｃｏｒｄａｔａ Ｍｉｌｌ）およびその同属植物からなる群から選択される植物の少なくとも１つの部位またはその処理物を用いることもできる。
植物の部位としては、例えば、地上部、地下部、葉、樹皮、木部、根、花部、果実、果皮、種子等をあげることができる。具体的には、サンショウの果皮、ボダイジュの花部等をあげることができる。
上記の植物部位の処理物としては、例えば、乾燥物、抽出物、水蒸気蒸留物、圧搾物、破砕物、磨砕物、部分精製物、精製物等をあげることができる。これらは、植物から、例えば、生薬調製等に用いられる通常の方法に準じて得ることができる。具体的には、サンショウの果皮を、常温又は加温下に、水、エーテル、酢酸エチル、アセトニトリル、アセトン、メタノール、エタノール、ジクロロメタン、クロロホルム、トルエン、ベンゼン、ヘキサン、ヘプタン、１，３−ブチレングリコール等の溶媒又はこれらの混合溶媒で抽出する。また、ボダイジュの花部を水、エーテル、酢酸エチル、アセトニトリル、アセトン、メタノール、エタノール、ジクロロメタン、クロロホルム、トルエン、ベンゼン、ヘキサン、ヘプタン、１，３−ブチレングリコール等の溶媒又はこれらの混合溶媒で抽出する。このようにして得られる抽出物自身を有効成分として用いることもできる。さらに、当該抽出物を、例えば、シリカゲル、アルミナ、セルロースパウダー等を用いたカラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー等に供して分画するか、又はこれらの方法を組み合わせて分画することにより得られる部分精製物または精製物を有効成分として用いることもできる。
上記の本発明蓄積抑制剤（III）では、上記の有効成分が薬学的に許容される担体中に製剤化されている。
【００４２】
本発明は、Ｉ型コラーゲン遺伝子を有する細胞に、コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子が前記細胞外に存在する条件下において、本蛋白質依存的コラーゲン蓄積抑制経路の正の調節因子を投与する工程を有することを特徴とするコラーゲン蓄積抑制方法［本発明蓄積抑制方法（IV）］も提供している。
ここで、「Ｉ型コラーゲン遺伝子を有する細胞」とは、前述の本発明蓄積抑制方法（III）において説明された細胞と同様であり、また「コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子が前記細胞外に存在する条件」とは、前述の本発明蓄積抑制方法（I）において説明された条件と同様である。
【００４３】
【実施例】
以下に、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４４】
実施例１ （本発明コラーゲン蓄積抑制剤の有効成分である本蛋白質の調製例）（１）本蛋白質をコードする外来遺伝子を発現するベクターの調製
ヒト胎児皮膚線維芽細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号ＣＣ−２５０９）１ｘ１０7細胞を３７℃、５％ ＣＯ2雰囲気下で一晩培養した。培養された細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、トリゾル試薬（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、カタログ番号１５５９６−０１８）１ｍｌを添加して当該細胞を懸濁させた。得られた細胞懸濁液を室温にて５分間静置した後、当該細胞懸濁液にクロロホルム ０．２ｍｌを添加して１５秒間攪拌し、４℃で１５，０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離した。水層を回収した後、これにイソプロパノール ０．５ｍｌを加えて室温で５分間静置し、４℃で１５，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離した。回収された沈殿物に７０％ エタノール １ｍｌを加えて攪拌した後、４℃で１２，０００ｒｐｍ、５分間遠心分離した。回収された沈殿物を風乾した後、これをＴＥ溶液［組成：１０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭ エチレンジアミン四酢酸ナトリウム（以下、ＥＤＴＡと記す。）（ｐＨ８．０）］２０μｌに溶解した（得られた溶解液を、以下、全ＲＮＡ溶液と記す。）。次に、ＴＨＥＲＭＯＳＣＲＩＰＴＲＴ−ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、カタログ番号１１１４６−０２４）を用いて以下のように逆転写反応を行った。まず全ＲＮＡ溶液 ２μｌ、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）20 １μｌ及びＤＥＰＣ−Ｔｒｅａｔｅｄ Ｗａｔｅｒ ７μｌを混合し、この混合液を６５℃、５分間保温した後、直ちに氷冷した。次に当該混合液に、５ｘｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ ４μｌ、ＲＮａｓｅＯＵＴ １μｌ、ＤＴＴ １μｌ、ＤＥＰＣ−Ｔｒｅａｔｅｄ Ｗａｔｅｒ １μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ ２μｌ及びＴＨＥＲＭＯＳＣＲＩＰＴ ＲＴ１μｌを添加して５５℃、１時間保温し、続いて８５℃、５分間保温した。さらに、当該混合液にＲＮａｓｅ Ｈ １μｌを加えて３７℃、２０分間保温した。得られた混合液１μｌ、配列番号５で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（１０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、配列番号６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（１０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、蒸留水２９μｌ、ＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ（宝酒造、カタログ番号ＲＲ００２Ａ）に含まれるｂｕｆｆｅｒ５μｌ、Ｍｇ2+溶液 ５μｌ、ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ ５μｌ、及びＬＡ Ｔａｑ ０．５μｌを混合した後、得られた混合液を９４℃、５分間保温した。続いて９４℃、１分間、次いで６０℃、１分間、さらに７２℃、２分間の保温を１サイクルとしてこれを３５サイクル行い、さらに７２℃、７分間保温した。保温後の混合液を１％Ａｇａｒｏｓｅ Ｌ（ニッポンジーン、カタログ番号３１７−０１１８２）ゲルを用いた電気泳動に供した。約１ｋｂのＤＮＡを含むゲル部分を切り出した後、これを６５℃、５分間保温した。得られたゲル溶解液に等容量のフェノールを添加して混合した後、１５，０００ｒｐｍ、３分間遠心分離した。回収された上清に等容量のクロロホルムを添加して混合した後、１５，０００ｒｐｍ、３分間遠心分離し、再び上清を回収した（以下、該操作をフェノール・クロロホルム処理と記す。）。回収された上清にその１／９容量の３Ｍ 酢酸ナトリウム、２倍容量のエタノールを加えて−８０℃、３０分間放置した後、１５，０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離し、沈澱を回収した。回収された沈殿に冷８０％エタノール１ｍｌを加えた後、１５，０００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、再び沈澱を回収した。回収された沈澱に蒸留水４０μｌ、１０ｘＨ Ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造）５μｌ、ＢａｍＨＩ（１５Ｕ／μｌ、宝酒造、カタログ番号１０６０Ａ）２．５μｌ、ＸｈｏＩ（１５Ｕ／μｌ、宝酒造、カタログ番号１０９３Ａ）２．５μｌを添加し、この混合液を３７℃、３時間保温した。そして当該混合液を１％アガロースゲル電気泳動に供した。約１ｋｂのＤＮＡ含むゲル部分を切り出した後、これを前記と同様にしてフェノール・クロロホルム処理した後、エタノール沈殿することによりＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡをＴＥ溶液２０μｌに溶解して目的とするＤＮＡ（本蛋白質をコードする外来遺伝子：以下、本ＤＮＡと記すこともある。）溶液を得た。
【００４５】
ベクターＤＮＡは以下のように調製された。ベクターｐＥＴ−２８ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ、カタログ番号６９８６４−３）５μｇ、１０ｘＫ Ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造）５μｌ、ＢａｍＨＩ ２．５μｌ及びＸｈｏＩ ２．５μｌを混合し、さらに全容量が５０μｌになるように蒸留水を添加した。得られた混合液を３７℃、３時間保温した後、当該混合液を１％アガロースゲル電気泳動に供した。ベクターＤＮＡを含むゲル部分を切り出した後、これを前記と同様にしてフェノール・クロロホルム処理した後、エタノール沈殿することによりベクターＤＮＡを回収した。回収された沈澱に、蒸留水４４μｌ、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｂｕｆｆｅｒ５μｌ及びＡｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造、カタログ番号２１２０Ａ）１μｌを加えて６５℃、３０分間保温した後、この混合液に１％ドデシル硫酸ナトリウム１μｌ、０．２Ｍ ＥＤＴＡ ２．５μｌ及び１％プロテイナーゼＫ（和光純薬、カタログ番号）１μｌを加えて５５℃、３０分間保温した（以下、該操作をＢＡＰ処理と記す。）。さらに当該混合液に蒸留水を４５０μｌ添加し、これをフェノール・クロロホルム処理した後、エタノール沈殿することによりＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡをＴＥ溶液２０μｌに溶解してベクターＤＮＡ（以下、本ベクターＤＮＡと記すこともある。）を得た。
【００４６】
次に、得られた本ＤＮＡ溶液５μｌ、得られた本ベクターＤＮＡ溶液１μｌ、及びＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｖｅｒ２（宝酒造、カタログ番号６０２２）の酵素溶液６μｌを混合した後、得られた混合液を１６℃、一昼夜保温した。当該混合液に大腸菌ＢＬ２１−ＧＯＬＤ（ＤＥ３）（ＴＯＹＯＢＯ、カタログ番号ＳＣ２３０１３２）１００μｌを加えて氷中に３０分間放置し、次いで４２℃、４５秒間保温した後、得られた大腸菌を３０μｇ／ｍｌ硫酸カナマイシン（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１５１６０−０５４）を含むＬＢプレート（１％トリプトン、０．５％イーストエキストラクト、１％ 塩化ナトリウム、１．５％バクトアガー）に播種し、３７℃、一昼夜放置した。出現したシングルコロニーを単離することにより後述で用いられる、本蛋白質をコードする外来遺伝子を発現するベクターを含有する大腸菌（以下、本蛋白質発現ベクター含有大腸菌と記すこともある。）を得た。一方、当該シングルコロニーを３０μｇ／ｍｌ 硫酸カナマイシンを含むＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％イーストエキストラクト、１％塩化ナトリウム）２ｍｌで３７℃、１２時間培養した。得られた培養液から、ＡＵＴＯＭＡＴＩＣ ＤＮＡ ＩＳＯＬＡＴＩＯＮ ＳＹＳＴＥＭ ＰＩ−５０（ＫＵＲＡＢＯ）を用いて、プラスミドＤＮＡを調製した。このようにして、本蛋白質をコードする外来遺伝子を発現するベクターを得た。
【００４７】
（２）本蛋白質の調製
実施例１（１）で得られた本蛋白質発現ベクター含有大腸菌を、３０μｇ／ｍｌ 硫酸カナマイシンを含むＬＢ培地２００ｍｌに接種し、ＯＤ600値が０．４〜０．６になるまで、３７℃で振とう培養した。得られた培養液に、終濃度が０．５ｍＭとなるようイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（以下、ＩＰＴＧと記す。）を加えて、さらに３時間、３７℃で振とう培養を続けた。得られた培養液を遠心分離（５，０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）することにより回収された沈澱（菌）に、氷冷した１０ｍｌ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ［５ｍＭ イミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０％ グリセロール、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）］を加えて懸濁させた後、この菌懸濁液の粘性がなくなるまで超音波処理を行った。そして超音波処理された菌懸濁液を遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、３０分間、４℃）し、上清を回収した。次に、回収された上清をニッケル−ＮＴＡ−アガロースカラム（ＱＩＡＧＥＮ）に供した。次に、当該カラムには、カラム体積の２倍量のＢｉｎｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒを通流し、続いて５倍量のＷａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ［２０ｍＭ イミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０％ グリセロール、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．５）］を通流した後、Ｅｌｕｔｅ ｂｕｆｆｅｒ［２００ｍＭ イミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０％ グリセロール、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）］を通流することにより、目的とする蛋白質をカラムから溶出させ、その溶出液を回収した。尚、回収された溶出液の一部をドデシル硫酸ナトリウム（以下、ＳＤＳと記す。）−１３％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。電気泳動後のゲルを銀染色した結果、本蛋白質に相当する電気泳動位置に単一バンドが確認された。
回収された溶出液の大部分を、４℃で透析［透析液：１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）、４０ｍＭ ＫＣｌ、０．４ｍＭ ＥＤＴＡ、４％ グリセロール、０．５ｍＭ ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、０．５ｍＭ フェニルメチルスルフォニルフロリド（ＰＭＳＦ）、２μｇ／ｍｌ ロイペプチン、２μｇ／ｍｌ ペプスタチン Ａ］した後、セントリコン３０（Ａｍｉｃｏｎ）で濃縮することにより本蛋白質を得た。
【００４８】
実施例２ （本蛋白質が有する、Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力）（１）（ａ）Ｉ型コラーゲン遺伝子の発現調節領域を有するＤＮＡ（結合型プローブ）及び（ｂ）本蛋白質との結合能力を有さない塩基配列を有するＤＮＡ（非結合型プローブ）の調製
配列番号３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、該塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとを混合し、このオリゴヌクレオチド混合物を５分間煮沸した後そのまま室温に放置した。次いで、前記オリゴヌクレオチド混合物の１０ｐｍｏｌ ＤＮＡ相当量、Ｔ４キナーゼバッファー ２μｌ 、Ｔ４ キナーゼ １μｌ、及びγ−32Ｐ−ＡＴＰ（＞３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、第一化学薬品、カタログ番号ＮＥＧ−５０２Ａ）６μｌに蒸留水を加えて全量を２０μｌとした後、これを３７℃、１時間保温した。当該混合液をクイックスピンカラムＧ−２５（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、カタログ番号１２７３９４９）に供した。当該カラムを遠心分離（２，５００ｒｐｍ、５分間）した後、溶出液を回収した。回収された溶出液を１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供することにより32Ｐ標識された２本鎖ＤＮＡを含むゲル部分を回収した。回収されたゲル部分に蒸留水を加えて３７℃、一昼夜放置した後、32Ｐ標識されたＤＮＡ（以下、該ＤＮＡを結合型プローブと記す。）を抽出した。このようにして結合型プローブを調製した。
一方、配列番号３で示される塩基配列の塩基番号５で示される塩基及び塩基番号６で示される塩基が置換された塩基配列（配列番号７で示す。）からなるオリゴヌクレオチドと、該塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとを混合し、以後、前記結合型プローブの調製と同様な操作を行い、32Ｐ標識されたＤＮＡ（以下、非結合型プローブと記す。）を抽出した。このようにして非結合型プローブを調製した。
【００４９】
（２）ゲルシフトアッセイ
実施例１（２）で調製された本蛋白質 ２００ｎｇ及びＰｏｌｙ ｄＩ−ｄＣ１μｇに、上記（１）で調製された２種のプローブのいずれか一方（各５０，０００ｃｐｍ）をそれぞれ添加し、この混合物を氷中で３０分間放置した。次に、それぞれの混合液の全量を６％ ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１５０Ｖ、４℃、１５０分間）に供した。電気泳動終了後、ゲルをメタノールと酢酸と水の３：１：６（ｖ／ｖ／ｖ）混合液に浸して固定した。固定されたゲルをゲルドライヤーで乾燥した後、Ｘ線フィルムに露光した。結合型プローブ添加試験区では、本蛋白質の電気泳動位置に放射活性のシグナルが検出された。一方、非結合型プローブ添加試験区では、本蛋白質の電気泳動位置には放射活性のシグナルは検出されなかった。
以上の確認結果に基づき、後述のプライマー設計を行った。すなわち、後述の結合型レポーターベクター作成には、配列番号１０で示されるオリゴヌクレオチド及び配列番号１１で示されるオリゴヌクレオチドを利用し、一方、後述の非結合型レポーターベクター作成には、配列番号１２で示されるオリゴヌクレオチド及び配列番号１１で示されるオリゴヌクレオチドを利用した。
【００５０】
（３）レポーター遺伝子を有するベクターの調製
正常ヒト胎児皮膚線維芽細胞をＰＢＳで洗浄した後、トリゾル試薬１ｍｌを添加して当該細胞を懸濁させる。得られる細胞懸濁液を室温で５分間放置した後、当該細胞懸濁液にクロロホルム０．２ｍｌを添加し１５秒間振とう混合する。室温でさらに３分間放置した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分間）する。中間層及び有機層を回収した後、これにエタノール０．３ｍｌを加えて混合し、この混合物を室温で３分間放置した後、遠心分離（３，０００ｒｐｍ、４℃、５分間）する。回収される沈殿物に０．１Ｍ クエン酸ナトリウム１ｍｌを加えて室温で３０分間放置した後、これを遠心分離（３，０００ｒｐｍ、４℃、５分間）して沈澱物を回収する。この操作をもう１度繰り返す。得られる沈殿物に７５％エタノール２ｍｌを加えて室温で２０分間放置した後、この混合物を遠心分離（３，０００ｒｐｍ、４℃、５分間）する。沈殿物を５分間真空乾燥した後、超純水に溶解する。
得られる溶解液と、配列番号８で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号９で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとを用いてＰＣＲを行う。ＰＣＲ反応溶液を９４℃、５分間保温した後、９４℃、１分間次いで５５℃、２分間さらに７２℃、３分間の保温を１サイクルとしてこれを３０サイクル行う。ＰＣＲ反応終了後、ＰＣＲ反応溶液を１％アガロースゲル電気泳動に供することにより、約２．５ｋｂのＤＮＡを回収した。回収されるＤＮＡをフェノール・クロロホルム処理した後、エタノール沈殿してＤＮＡを回収する。回収されるＤＮＡを超純水に再び溶解し、ＢａｍＨＩ２．５μｌ及びＨｉｎｄＩＩＩ（ニッポンジーン、カタログ番号３１１−０１１６３）２．５μｌを加え、３７℃、３時間保温した後、この混合液を１％アガロースゲル電気泳動に供することにより、約２．５ｋｂのＤＮＡを回収する。回収されたＤＮＡをエタノール沈殿することにより目的とするＤＮＡを得た（以下、プロモーターＤＮＡと記す。）。
一方、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（以下、ＣＡＴと記す。）をコードする塩基配列を有するベクターｐ８−ＣＡＴ［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，１３３５１−１３３５６（１９９０）］をＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、上記と同様にアガロースゲル電気泳動に供することにより、約５ｋｂのＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡをエタノール沈殿することによりＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡをＢＡＰ処理し、次いでフェノール・クロロホルム処理した後、エタノール沈殿することによりＤＮＡを回収した（以下、ＣＡＴベクターＤＮＡと記す。）。
【００５１】
次いで、前記プロモーターＤＮＡと、ＣＡＴベクターＤＮＡとを混合し、この混合物にＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｖｅｒ２酵素溶液を添加して１６℃で一昼夜保温する。当該混合物に大腸菌５Ｈｄα（ＴＯＹＯＢＯ、カタログ番号ＤＮＡ−９０３）を加えて氷中に３０分間放置し、次いで４２℃、４５秒間保温した後、得られた大腸菌を５０μｇ／ｍｌ アンピシリンナトリウム（ナカライ、カタログ番号０２７−３９）を含むＬＢプレートに播種し、３７℃、一昼夜放置する。出現したシングルコロニーを５０μｇ／ｍｌ アンピシリンナトリウムを含むＬＢ培地２ｍｌに接種して３７℃、１２時間培養した後、得られた培養液からＡＵＴＯＭＡＴＩＣ ＤＮＡ ＩＳＯＬＡＴＩＯＮ ＳＹＳＴＥＭ ＰＩ−５０（ＫＵＲＡＢＯ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製する。得られたプラスミドＤＮＡの塩基配列をＤＮＡシークエンサーで分析し、目的とする塩基配列を保有していることを確認する。当該プラスミドＤＮＡ１００ｎｇを鋳型とし、配列番号１０で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号１１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとを各々１０ｐｍｏｌ添加して、ＰＣＲを行う。ＰＣＲ反応溶液を、９４℃、５分間保温した後、９４℃、１分間次いで５５℃、１分間さらに７２℃、１分間の保温を１サイクルとしてこれを３０サイクル行う。ＰＣＲ反応終了後、ＰＣＲ反応溶液を１％アガロースゲル電気泳動に供することにより、約０．２２ｋｂのＤＮＡを回収する。回収されるＤＮＡをＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、１％アガロースゲル電気泳動に供することにより、約０．２２ｋｂのＤＮＡを回収する。回収されるＤＮＡを、ＣＡＴベクターＤＮＡとライゲーションした後、ライゲーション化ＤＮＡを大腸菌５Ｈｄαに導入する。得られる形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製することにより、ヒトＩ型コラーゲンα２鎖遺伝子のプロモーター領域の−１６１〜＋５７（転写開始点を＋１とする。）の塩基配列の下流に、ＣＡＴをコードする塩基配列が接続されてなるプラスミド（以下、結合型レポーターベクターと記す。）を得る。当該プラスミドの塩基配列を自動ＤＮＡシークエンサーにより分析し確認する。
【００５２】
次に、結合型レポーターベクターをＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIIIで消化した後、この消化物を３％アガロースゲル電気泳動に供することにより、ＣＡＴをコードする塩基配列を有するＤＮＡを回収した。
一方、配列番号１２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号１１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとを各々１０ｐｍｏｌ添加し、結合型レポーターベクター１００ｎｇを鋳型としてＰＣＲを行なった。ＰＣＲ反応溶液を、９４℃、５分間保温した後、９４℃、１分間次いで５５℃、１分間さらに７２℃、１分間の保温を１サイクルとしてこれを３０サイクル行った。ＰＣＲ反応終了後、ＰＣＲ反応溶液を１％アガロースゲル電気泳動に供することにより、約０．２２ｋｂのＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡをＢａｍＨＩ２．５μｌ及びＨｉｎｄＩＩＩ２．５μｌで消化した後、この消化物を３％アガロースゲル電気泳動に供することにより、約０．２２ｋｂのＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡとＣＡＴベクターＤＮＡとをライゲーションした後、ライゲーション化ＤＮＡを大腸菌５Ｈｄαに導入した。得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製することにより、結合型レポーターベクターに含まれるヒトＩ型コラーゲンα２鎖遺伝子（ＣＯＬ１Ａ２）の発現調節領域の−１６０と−１５９との位置（転写開始点を＋１とする。）のシトシンが、グアニンに置換されてなるプラスミド（以下、該プラスミドを非結合型レポーターベクターと記す。）を得た。当該プラスミドの塩基配列を、自動ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ、３７７ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）により確認した。
【００５３】
（４）レポーター遺伝子の発現量測定
実施例１（１）と同様にして、本蛋白質をコードするＤＮＡを、発現ベクターｐＲｃ／ＲＳＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号２８−００５１）のＨｉｎｄＩＩＩ切断部位とＸｂａＩ切断部位との間にクローニングし、得られたベクターをＹＢ−１／ＲＳＶ（本蛋白質発現ベクター）と名付けた。
ヒトｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ細胞 ＡＧ−３７３［Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、カタログ番号ＨＴＢ−１７］１ｘ１０6細胞を６０ｍｍディッシュ（ＢＥＣＴＯＮ ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ、カタログ番号３００２）に播種し、１０％非働化牛胎児血清（以下、ＦＢＳと記す。Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２１１４０−０７９）、８．９ｍｇ／ｌＬ−アラニン、１５ｍｇ／ｌ Ｌ−アスパラギン・Ｈ2Ｏ、１３．３ｍｇ／ｌＬ−アスパラギン酸、１４．７ｍｇ／ｌ Ｌ−グルタミン酸、７．５ｍｇ／ｌグリシン、１１．５ｍｇ／ｌ Ｌ−プロリン及び１０．５ｍｇ／ｌ Ｌ−セリンが添加されたＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ、カタログ番号１１０９５−０７２）（以下、該培地をＭＥＭ（＋）と記す。）にて３７℃、５％ＣＯ2存在下で一晩培養した後、培地をＦＢＳを含まないＭＥＭ培地（以下、該培地をＭＥＭ（−）と記す。）に置換した。
ＭＥＭ（−）１００μｌに、結合型レポーターベクター２μｇ又は非結合型レポーターベクター ２μｇのいずれかと、ＹＢ−１／ＲＳＶ ４μｇ又はｐＲｃ／ＲＳＶ ４μｇのいずれかとを加え、この混合液を室温で４０分間放置した（溶液１）。また、ＭＥＭ（−）１００μｌにＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１８２９２−０１１）２０μｌを加え、この混合液を室温で４０分間放置した（溶液２）。次に、溶液１と溶液２とを混合し、室温で１０分間放置した後に、ＭＥＭ（−） ２ｍｌを加え、よく混合した。当該混合液を前記ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ細胞に添加した後、当該細胞を３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下で６時間培養した。その後、ディッシュから培養上清を除いて細胞をＭＥＭ（−）で２回洗浄し、ＭＥＭ（＋）４ｍｌを添加し、３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下でさらに４０時間培養した。
【００５４】
培養された細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、細胞溶解剤（東洋インキ、カタログ番号ＰＤ１０）２００μｌを加え、セルスクレイパー（Ｎａｌｇｅｎ、カタログ番号１７９６９３）を用いて細胞を器壁から剥がした。剥がされた細胞を細胞溶解剤に懸濁した後、この細胞懸濁液を遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、５分間）し、上清を回収した。回収された上清（蛋白質量に換算して２０μｇ）に、１０ｍＭ アセチル−ＣｏＡ（シグマ、カタログ番号Ａ２０５６）１０μｌ及びＤ−ｔｈｒｅｏ−［ｄｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｙｌ−１−14Ｃ］ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ（アマシャム、カタログ番号ＣＦＡ７５４）２μｌを添加し、この混合液を３７℃で５時間保温した。次いで、この混合液に酢酸エチル１００μｌを加えて混合した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、５分間）し、上層を回収した。回収された上層を窒素気流下に蒸発乾固させた後、残渣を酢酸エチル３０μｌに溶解した。この溶解液の全量をシリカゲル薄層クロマトグラフィーにて展開した（薄層プレート：Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ＴＬＣ ｐｌａｔｅ ２０ｘ２０ｃｍ、ＭＥＲＣＫ、カタログ番号１．０５７１５、展開溶媒：クロロホルムとメタノールの９５：５（ｖ／ｖ）混合液）。薄層プレート上の放射活性を、バイオ・イメージングアナライザーＢＡＳｔａｔｉｏｎ（富士フィルム）を用いて定量した。次式に従って、ＣＡＴ活性を算出した。
ＣＡＴ活性（％）＝アセチルクロラムフェニコールの放射活性／全放射活性
結果を表１に示す。本蛋白質発現ベクターであるＹＢ−１／ＲＳＶと結合型レポーターベクターとが導入された細胞では、発現ベクター（本蛋白質非発現ベクター）であるｐＲｃ／ＲＳＶと結合型レポーターベクターとが導入された細胞に比し、ＣＡＴ活性が低下していた。一方、本蛋白質発現ベクターと非結合型レポーターベクターとが導入された細胞及び発現ベクター（本蛋白質非発現ベクター）と非結合型レポーターベクターとが導入された細胞の両者では、かかる活性低下は認められなかった。
【００５５】
【表１】
＊ＣＡＴ相対活性は、発現ベクターｐＲｃ／ＲＳＶと結合型レポーターベクターとが導入された細胞のＣＡＴ活性を１．０とした、各区のＣＡＴ活性を示す。
【００５６】
実施例３ （本蛋白質をコードする外来遺伝子導入によるコラーゲン蓄積抑制方法）
（１）プローブ作製
正常ヒト胎児皮膚線維芽細胞の全ＲＮＡ １μｇとＯｌｉｇｏ（ｄＴ）20とを用いて、実施例１（１）と同様に逆転写反応を行なった。得られたｃＤＮＡ溶液１μｌと、配列番号１３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（１０ｐｍｏｌ／μｌ）と配列番号１４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（１０ｐｍｏｌ／μｌ）各々１μｌを用いて、実施例１（１）と同様にＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動に供することにより約２ｋｂのＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡをＴＥ溶液１０μｌに溶解して目的とするＤＮＡ溶液を得た。得られたＤＮＡ溶液９μｌ、ｐＧＥＭ Ｔ−ｅａｓｙベクター溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ａ１３６０）１μｌ、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｖｅｒ２の酵素溶液 １０μｌを混合してライゲーションした。このライゲーション化ＤＮＡを大腸菌５Ｈｄαに導入した。得られた形質転換体を、アンピシリンナトリウムを含むＬＢプレートに播種してコロニーを形成するまで培養した。出現したシングルコロニーを回収し、再び培養した後、当該形質転換体から、ヒトＩ型コラーゲンα２鎖のコーディング領域の２０２１番目の塩基から４０５１番目の塩基までの塩基配列を含むプラスミドを単離した。また、上記２種のオリゴヌクレオチドに代えて配列番号２１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（１０ｐｍｏｌ／μｌ）と配列番号２２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（１０ｐｍｏｌ／μｌ）各々１μｌを用いて、上記と同様な操作を行い、ヒトＩ型コラーゲンα１鎖のコーディング領域の２３４２番目の塩基から３７３５番目の塩基までの塩基配列を含むプラスミドを単離した。
単離された各プラスミドをＸｈｏＩ及びＳａｃＩで消化した後、アガロースゲル電気泳動に供することによりそれぞれ約１．０ｋｂ、約１．３ｋｂのＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡをそれぞれ約１０ｎｇ／μｌとなるようＴＥ溶液に溶解して目的とするＤＮＡ溶液を得た。得られたＤＮＡ溶液１μｌにＴＥ溶液 ４４μｌを加えて混合し、この混合物を９５℃、５分間保温した後、氷中に置いた。次いで当該混合物を、ランダムプライムラベリングシステム（Ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ ＩＩ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、カタログ番号ＲＰＮ１６３３）１チューブに加え、さらに［α−32Ｐ］ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、カタログ番号ＲＰＮＡＡ０００５）５μｌを添加して混合した。この混合物を３７℃にて１時間保温した後、当該混合物をＧ−５０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、カタログ番号２７−５３３５−０１）に供した。当該カラムを２０００ｇ、２分間遠心分離した後、溶出液を回収した。回収された溶出液を９５℃、５分間保温した後、氷中に置いた。このようにして調製されたＤＮＡをノザンブロット解析用プローブとして用いた。
【００５７】
（２）Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）測定
正常ヒト胎児皮膚線維芽細胞 ５ｘ１０7細胞を１００ｍｍディッシュ（ＢＥＣＴＯＮ ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ、カタログ番号３００３）に播種し、Ｄ−ＭＥＭ（＋）で３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下において一晩培養した。翌日、培地をＤ−ＭＥＭ（−）に置換した。
Ｄ−ＭＥＭ（−） ３００μｌにＹＢ−１／ＲＳＶ又はｐＲｃ／ＲＳＶのいずれか１５０ｎｇを加え、この混合液を室温で４５分間放置した（溶液１）。また、Ｄ−ＭＥＭ（−） ３００μｌにＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎｅ ２０μｌを加え、この混合液を室温で４０分間放置した（溶液２）。次に、溶液１と溶液２とを混合して得られた混合液を室温で１０分間放置した後、この混合液にＤ−ＭＥＭ（−）５．４ｍｌを加えた。得られた混合液に、前記ヒト胎児皮膚線維芽細胞を添加した。当該混合液（細胞を含む）を３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下で６時間培養した後、ディッシュから上清を除いてＤ−ＭＥＭ（−）で２回洗浄した。次いで、ディッシュにＤ−ＭＥＭ（０．１％）１０ｍｌを添加して３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下で１時間培養した後、当該細胞に、コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子であるＴＧＦβ ５μｇ／ｍｌ水溶液を１０μｌ添加（培地中のＴＧＦβ濃度：５ｎｇ／ｍｌ）し、３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下でさらに４０時間培養した。尚、ＴＧＦβ無添加試験区では、ＴＧＦβに代えて蒸留水１０μｌを用いた。培養された細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、当該細胞から実施例１（１）と同様に全ＲＮＡを調製した。
【００５８】
全ＲＮＡ１０μｇ、ホルムアミド（ナカライテスク、カタログ番号１６３−４５）１０μｌ、ホルマリン（和光、カタログ番号０６４−００４０６）４μｌ、１０ｘ ＭＯＰＳ［３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ナカライテスク、カタログ番号２３４−３８）４１．８５４ｇ、酢酸ナトリウム ６．８０４ｇ、ＥＤＴＡ ３．７２２ｇを蒸留水に溶解し、ｐＨ７．０に調整して全量を１Ｌとした。］３μｌを混合し、この混合液を６５℃、１０分間保温した後、直ぐに氷中に置いた。得られた混合液を１００Ｖにて６０分間電気泳動した（ゲル：アガロース １．５ｇ、１０ｘＭＯＰＳ １５ｍｌ、蒸留水 １１０ｍｌを加温してアガロースを溶解し、ホルマリン ２５ｍｌを加えて作製した。電気泳動バッファー：１ｘ ＭＯＰＳ）。電気泳動後のゲルにＨｙｂｏｎｄ−Ｎフィルター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、カタログ番号ＲＰＮ３０３Ｎ）を密着させ、加圧しながら、これを２０ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム １７５．３２ｇ、クエン酸ナトリウム ８８．２２ｇを蒸留水に溶解して１Ｌとした。）中で一晩放置することによりＲＮＡをフィルターに転写した。ＲＮＡが転写されたフィルターを８０℃、２時間保温した後、このフィルターを、ハイブリダイゼーションバッファー（ホルムアミド ２５ｍｌ、２０ｘ ＳＳＣ １２．５ｍｌ、０．５Ｍ リン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）５ｍｌ、サケ精子ＤＮＡ溶液（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、カタログ番号１５６３２−０１１）０．２ｍｌ、５ｘ デンハルト溶液（和光、カタログ番号０４３−２１８７１）４ｍｌ、蒸留水 ３．３ｍｌ）４０ｍｌ中で４２℃、５時間保温した。次に、ハイブリダイゼーションバッファーを除去した後、このフィルターに新しいハイブリダイゼーションバッファー １０ｍｌを加え、さらに１０6ｃｐｍ／ｍｌとなるように、上記（１）で調製されたノザンブロット解析用プローブ（ヒトＩ型コラーゲンα２鎖のコーディング領域の２６３１番目の塩基から３６５４番目の塩基までの塩基配列を有する。）を添加し、４２℃、一晩保温した。次いで、プローブ溶液を除去した後、このフィルターに０．１％ ＳＤＳが添加された２ｘＳＳＣ １００ｍｌを加え、室温で１０分間保温した。さらにこの操作を２回繰り返した。得られたフィルターに、０．１％ ＳＤＳが添加された０．１ｘＳＳＣ １００ｍｌを加え、５０℃、２０分間の保温を３回繰り返した後、当該フィルターを風乾した。風乾されたフィルター上の放射活性をＢＡＳｔａｔｉｏｎを用いて定量した。上記のハイブリダイゼーションが行われたフィルターを、次いで、沸騰した０．１ｘＳＳＣ中で１０分間保温した後、さらに、ハイブリダイゼーションバッファー中で４２℃、５時間保温した。このフィルターに、ノザンブロット解析用プローブ（ヒトＩ型コラーゲンα１鎖のコーディング領域の２３８１番目の塩基から３６８５番目の塩基までの塩基配列を有する。）を添加し、上記と同様なハイブリダイゼーションを行なった。
一方、全ＲＮＡ １０μｇを、０．５μｇ／ｍｌ エチジウムブロマイド（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、カタログ番号１５５８２−０１８）を含む前記のゲルを用いて電気泳動した後、２８Ｓ リボゾームＲＮＡの蛍光強度をＬＵＭＩＮＥＳＣＥＮＴ ＩＭＡＧＥ ＡＮＡＬＹＺＥＲ ＬＡＳ−１０００ ｐｌｕｓ（富士フィルム）及びＩｍａｇｅ Ｇａｕｇｅ ｖｅｒ ３．１２（富士フィルム）を用いて定量した。次式に従い、２８Ｓ リボゾームＲＮＡ量に対する各遺伝子のｍＲＮＡの量を算出した。
ｍＲＮＡ量＝約５ｋｂに相当する電気泳動位置の放射活性／２８Ｓ リボゾームＲＮＡの蛍光強度
結果を表２に示す。本蛋白質をコードする外来遺伝子導入によるコラーゲン蓄積抑制がｍＲＮＡレベルにおいて確認できた。さらに、コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子が細胞外に存在する条件下でも上記効果は十分に確認できるものであることが判った。
【００５９】
【表２】
＊Ｉ型コラーゲン（α１鎖又はα２鎖）遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）相対値は、ｐＲｃ／ＲＳＶが導入された細胞にＴＧＦβ無添加試験区のＩ型コラーゲン遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）をそれぞれ１．０とした、各区のＩ型コラーゲン遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）を表す。
【００６０】
実施例４ （本蛋白質投与によるコラーゲン蓄積抑制方法）
（１）細胞抽出物の調製
実施例３（２）と同様にして、正常ヒト胎児皮膚線維芽細胞に、本蛋白質発現ベクターであるＹＢ−１／ＲＳＶ又は本蛋白質非発現ベクターｐＲｃ／ＲＳＶを導入した後、この形質転換体にコラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子であるＴＧＦβを添加し、３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下で４０時間培養した。尚、ＴＧＦβ無添加試験区では、ＴＧＦβに代えて同量の蒸留水を用いた。培養された細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、培養された細胞が存在するディッシュにＲＩＰＡバッファー（５０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１％ ＮＰ−４０、０．５％ デオキシコール酸、０．１％ ＳＤＳ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、２，５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ Ｎａ3ＶＯ4、２０μｇ／ｍｌ アプロチニン、１０μｇ／ｍｌ ロイペプチン、５０ｍＭ フッ化ナトリウム）０．５ｍｌを加えた後、細胞をディッシュから剥がした。このようにして細胞懸濁液を得て、これを２２Ｇ注射針に通した後、氷中で１時間静置した。そして当該細胞懸濁液を４℃で１５，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、上清を回収した（以下、該上清を細胞抽出物と記す。）。細胞抽出物の蛋白質濃度は、ＤＣプロテインアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カタログ番号５００-０１１３）を用いて定量した。すなわち、９６穴プレートに、細胞抽出物５μｌ、ｒｅａｇｅｎｔＡ ２５μｌ及びｒｅａｇｅｎｔＢ ２００μｌ加えて振とう混合し、この混合液を室温で１５分間静置した後、当該混合液の６５５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００６１】
（２）Ｉ型コラーゲン蛋白質量の測定
細胞抽出物２５μｇに同容量のＳＤＳサンプルバッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０％グリセロール、４％ＳＤＳ、２％メルカプトエタノール、０．０１％ブロモフェノールブルー）を加え、この混合物を９５℃、５分間保温した。当該混合物の全量をＳＤＳ−１３％ポリアクリルアミド電気泳動（４０ｍＡ定電流、電気泳動バッファー：０．２５Ｍトリス、１．９２Ｍグリシン、１％ＳＤＳ）に供した。電気泳動終了後、ゲルにニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ、カタログ番号ＲＰＮ３０３Ｅ）を密着させて転写（２５０ｍＡ定電流、転写バッファー：２０％メタノール、０．２５Ｍトリス、１．９２Ｍグリシン、１％ＳＤＳ）を行なった。転写後の膜を５％スキムミルク（和光、カタログ番号）に浸し、４℃で終夜振とうした。次に、当該膜を０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ（以下、該溶液をＰＢＳ−Ｔと記す。）に浸して室温で１０分間振とうする操作を２回行なった後、ウサギ抗ヒトＩ型コラーゲン抗体（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カタログ番号２３７０６）の１０００倍希釈液（ＰＢＳ−Ｔで希釈）に当該膜を浸し、室温で１時間振とうした。次いで当該膜を、ＰＢＳ−Ｔに浸して室温で１５分間振とうする操作を３回行った後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体の５０００倍希釈液（ＰＢＳ−Ｔで希釈）に当該膜を浸し、室温で１時間振とうした。さらに当該膜をＰＢＳ−Ｔに浸して室温で１５分間振とうする操作を３回行った後、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、カタログ番号ＲＰＮ２１０６）を用いて発色させ、この発色をＢＩＯＭＡＸ ＭＲフィルム（ｋｏｄａｋ、カタログ番号８９１２５６０）に感光させた。感光したフィルムを現像した後、このフィルムをＬＵＭＩＮＥＳＣＥＮＴ ＩＭＡＧＥ ＡＮＡＬＹＺＥＲ ＬＡＳ−１０００ ｐｌｕｓ（富士フィルム）を用いて白色光によるデジタイズ（透過）でデジタル画像化した後、Ｉｍａｇｅ Ｇａｕｇｅ ｖｅｒ ３．１２（富士フィルム）を用いて黒化度を定量した。得られた値から、Ｉ型コラーゲン蛋白質量の相対値を算出した。
結果を表３に示す。本蛋白質をコードする外来遺伝子導入によるコラーゲン蓄積抑制が蛋白質レベルにおいて確認できた。さらに、コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子が細胞外に存在する条件下でも上記効果は十分に確認できるものであることが判った。
【００６２】
【表３】
＊Ｉ型コラーゲン蛋白質量相対値は、ｐＲｃ／ＲＳＶが導入された細胞にＴＧＦβ無添加試験区のＩ型コラーゲン蛋白質量を１．０とした、各区のＩ型コラーゲン蛋白質量を表す。
【００６３】
実施例５ （Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を調節する物質の探索方法：本蛋白質の細胞核内への移行量又はその量と相関関係を有する指標値の測定によるＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能の評価）
（１）本蛋白質のアミノ酸配列と外来性マーカー蛋白質（ＧＦＰ）のアミノ酸配列とを有する蛋白質の発現ベクター作製
ＹＢ−１／ＲＳＶ １００ｎｇ、配列番号１５で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド１０ｐｍｏｌ、配列番号１６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド１０ｐｍｏｌ、ＫＯＤ−Ｄａｓｈ（ＴＯＹＯＢＯ、カタログ番号ＲＲ００２Ａ）に含まれるｂｕｆｆｅｒ ５μｌ、Ｍｇ2+溶液 ５μｌ、ｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ ５μｌ、ＫＯＤ−Ｄａｓｈ １μｌ及び蒸留水を混合して全量５０μｌのＰＣＲ反応液を調製し、このＰＣＲ反応液を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、９４℃で２分間保温した後、９４℃、１５秒間、次いで６０℃、３０秒間、さらに６８℃、１分間の保温を１サイクルとしてこれを３５サイクル行うというものであった。ＰＣＲ後、ＰＣＲ反応液をＨｉｎｄＩＩＩ及びＰｍｌＩで消化した後、エタノール沈殿することによりＤＮＡを回収した（沈澱として得られたＤＮＡを、以下、ＹＢ−１ＤＮＡと記す。）。一方、ｐＣＭＸ−ｈＧＲ−ＧＦＰ（Ｏｇａｗａ，Ｕｍｅｚｏｎｏ，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．１９９９、３１巻、３０３−３０８頁）をＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｍｌＩで消化した後、この消化物をアガロースゲル電気泳動することによりｈＧＲを含まない約５ｋｂのＤＮＡを分離し、これを回収した。回収されたＤＮＡをＢＡＰ処理した後、エタノール沈殿することによりＤＮＡを回収した（沈澱として得られたＤＮＡを、以下、ＧＦＰベクターＤＮＡと記す。）。ＹＢ−１ＤＮＡとＧＦＰベクターＤＮＡとをライゲーションした後、このライゲーション化ＤＮＡを大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体を、アンピシリンを含むＬＢプレートに播種してコロニーを形成するまで培養することにより大腸菌クローンを得た。そして、当該大腸菌クローンを再び培養し、培養された大腸菌から通常の方法によりプラスミドＤＮＡを調製した。得られたプラスミドＤＮＡの塩基配列を分析し、本蛋白質のアミノ酸配の下流にＧＦＰのアミノ酸配列が読み枠が連続する形でコードされた塩基配列を有するプラスミドを選択した。選択されたプラスミドをｐＣＭＸ−ＹＢ−１−ＧＦＰと名付けた。
【００６４】
（２）発現ベクターの導入及び蛍光顕微鏡観察
ヒト線維芽細胞 ５ｘ１０6細胞を６ウエルプレート（ＢＥＣＴＯＮ ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ、カタログ番号３０４６）に播種し、Ｄ−ＭＥＭ（＋）で３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下において一晩培養した。
Ｄ−ＭＥＭ（−）１００μｌにｐＣＭＸ−ＹＢ−１−ＧＦＰ １μｇとＰｌｕｓ ｒｅａｇｅｎｔ １０μｌ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、カタログ番号１１５１４−０１５）を加え、これを室温に１５分間放置した（溶液１）。また、Ｄ−ＭＥＭ（−） １００μｌにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ６μｌ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、カタログ番号１８３２４−０１２）を加え、これを室温に１５分間放置した（溶液２）。
次に、溶液１と溶液２とを混合し、この混合液をさらに室温で１５分間放置した後、当該混合液にＤ−ＭＥＭ（−）１ｍｌを加え、さらに上記のように培養された細胞を添加した。当該混合液（細胞を含む）を３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下で６時間培養した後、プレートから上清を除いてＤ−ＭＥＭ（−）で２回洗浄した。次いでプレートにＤ−ＭＥＭ（＋）２ｍｌを添加して３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下で３６時間培養した後、当該細胞に、５０μｇ凍結乾燥物／ｍｌ培地となるように実施例９記載のボダイジュエキス試料又はサンショウエキス試料を接触させ、さらに３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下で４時間培養した。培養後、プレートをＰＢＳで洗浄し、蛍光顕微鏡（ＮＩＫＯＮ、ＤＩＡＰＨＯＴ−ＴＭＤ）でＦＩＴＣフィルター下に倍率１００倍にて観察した。尚、陰性対照区では、上記試料に代えてＤＭＳＯ（終濃度０．１％）を用い、また、陽性対照区では、上記試料に買えてＩＦＮ−γ（終濃度１００Ｕ／ｍｌ）を用いた。ボダイジュエキス試料又はサンショウエキス試料が接触された細胞では、陽性対照区における細胞と同様に、蛍光は細胞質内では検出されなかったが、しかし核内では検出された。陰性対照区における細胞では、蛍光は細胞質内では検出されたが、しかし核内では検出されなかった。
その結果、本蛋白質の細胞核内への移行量又はその量と相関関係を有する指標値の測定によるＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能の評価することにＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を調節する物質（ボダイジュエキス試料又はサンショウエキス試料を選抜可能であることが確認できた。
【００６５】
実施例６ （本蛋白質をコードする外来遺伝子利用によるＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を調節する物質の探索方法）
（１）プローブ作製
正常ヒト胎児皮膚線維芽細胞の全ＲＮＡ１μｇと配列番号１３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド１０ｐｍｏｌとを用いて、実施例１（１）と同様に逆転写反応を行なった。得られたｃＤＮＡ溶液１μｌと、配列番号１３で示されるオリゴヌクレオチド及び配列番号１４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド各々１０ｐｍｏｌとを用いて、実施例１（１）と同様にＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液を９４℃にて５分間保温した後、９４℃にて１分間次いで５５℃にて１分間さらに７２℃にて２．５分間の保温を１サイクルとしてこれを３５サイクル行った。ＰＣＲ反応液終了後、ＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動に供することにより約２ｋｂのＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡをＴＥ溶液（１０μｌ）に溶解して目的とするＤＮＡ溶液を得た。得られたＤＮＡ溶液９μｌ、ｐＧＥＭ Ｔ−ｅａｓｙベクター溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ａ１３６０）１μｌ、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｖｅｒ２の酵素溶液１０μｌを混合してライゲーションした後、このライゲーション化ＤＮＡを大腸菌５Ｈｄαに導入した。得られた形質転換体をアンピシリンナトリウムを含むＬＢプレートに播種してコロニーを形成するまで培養した。出現したシングルコロニーを回収し、再び培養した後、当該形質転換体から、ヒトＩ型コラーゲンα２鎖のコーディング領域の２０２１番目の塩基から４０５１番目の塩基までの塩基配列を含むプラスミドを単離した。単離されたプラスミドをＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで消化した後、アガロースゲル電気泳動に供することにより約１．４ｋｂのＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡを約１０ｎｇ／μｌとなるようＴＥ溶液に溶解して目的とするＤＮＡ溶液を得た。得られたＤＮＡ溶液１μｌにＴＥ溶液４４μｌを加えて混合し、この混合物を９５℃、５分間保温した後、氷中に置いた。次いで、当該混合物をランダムプライムラベリングシステム（ＲｅｄｉｐｒｉｍｅＩＩ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、カタログ番号ＲＰＮ１６３３）１チューブに加え、さらに［α−32Ｐ］ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、カタログ番号ＲＰＮＡＡ０００５）５μｌを添加して混合した。この混合物を３７℃で１時間保温した後、当該混合物をＧ−５０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、カタログ番号２７−５３３５−０１）に供した。当該カラムを２０００ｇ、２分間遠心分離した後、溶出液を回収した。回収された溶出液を９５℃、５分間保温した後、氷中に置いた。このようにして調製されたＤＮＡをノザンブロット解析用プローブとして用いた。
【００６６】
（２）コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子（ＴＧＦβ）非存在下でのＩ型コラーゲン遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）測定
正常ヒト胎児皮膚線維芽細胞 ５ｘ１０7細胞を１００ｍｍディッシュに播種し、Ｄ−ＭＥＭ（＋）で３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下において一晩培養した。該細胞に、実施例７（２）で調製されたサンショウエキス試料を、５０μｇ凍結乾燥物／ｍｌ培地となるように添加し、さらに２４時間培養した。尚、陰性対照区では、サンショウエキス試料に代えてＤＭＳＯ（培地中の濃度が０．１％となるよう添加）を用いた。陽性対照区では、サンショウエキス試料に代えてＩＦＮ−γ（培地中の濃度が１００Ｕ／ｍｌとなるように添加）を用いた。培養された細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、当該細胞から実施例１（１）と同様に全ＲＮＡを調製した。
【００６７】
全ＲＮＡ１０μｇ、ホルムアミド（ナカライテスク、カタログ番号１６３−４５）１０μｌ、ホルマリン（和光、カタログ番号０６４−００４０６）４μｌ、１０ｘＭＯＰＳ［３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ナカライテスク、カタログ番号２３４−３８）４１．８５４ｇ、酢酸ナトリウム６．８０４ｇ、ＥＤＴＡ３．７２２ｇを蒸留水に溶解し、ｐＨ７．０に調整して全量を１Ｌとした。］３μｌを混合し、この混合液を６５℃、１０分間保温した後、直ぐに氷中に置いた。得られた混合液を１００Ｖにて６０分間電気泳動した（ゲル：アガロース１．５ｇ、１０ｘＭＯＰＳ １５ｍｌ、蒸留水１１０ｍｌを加温してアガロースを溶解し、ホルマリン ２５ｍｌを加えて作製した。電気泳動バッファー：１ｘ ＭＯＰＳ）。電気泳動後のゲルにＨｙｂｏｎｄ−Ｎフィルター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、カタログ番号ＲＰＮ３０３Ｎ）を密着させ、加圧しながら、これを２０ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム１７５．３２ｇ、クエン酸ナトリウム８８．２２ｇを蒸留水に溶解して１Ｌとした。）中で一晩放置することにより、ＲＮＡをフィルターに転写した。ＲＮＡが転写されたフィルターを８０℃、２時間保温した後、このフィルターをハイブリダイゼーションバッファー（ホルムアミド２５ｍｌ、２０ｘＳＳＣ １２．５ｍｌ、０．５Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）５ｍｌ、サケ精子ＤＮＡ溶液（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、カタログ番号１５６３２−０１１）０．２ｍｌ、５ｘデンハルト溶液（和光、カタログ番号０４３−２１８７１）４ｍｌ、蒸留水３．３ｍｌ）４０ｍｌ中で４２℃、５時間保温した。次に、ハイブリダイゼーションバッファーを除去した後、このフィルターに新しいハイブリダイゼーションバッファー１０ｍｌを加え、さらに１０6ｃｐｍ／ｍｌとなるように、上記（１）で調製されたノザンブロット解析用プローブを添加し、４２℃、一晩保温した。次いで、プローブ溶液を除去した後、このフィルターに０．１％ ＳＤＳが添加された２ｘＳＳＣ １００ｍｌを加え、室温で１０分間保温した。さらにこの操作を２回繰り返した。得られたフィルターに、０．１％ＳＤＳが添加された０．１ｘＳＳＣ １００ｍｌを加え、５０℃、２０分間の保温を３回繰り返した後、当該フィルターを風乾した。風乾されたフィルター上の放射活性をＢＡＳｔａｔｉｏｎを用いて定量した。
一方、全ＲＮＡ１０μｇを、０．５μｇ／ｍｌ エチジウムブロマイド（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、カタログ番号１５５８２−０１８）を含む前記ゲルを用いて電気泳動した後、２８Ｓ リボゾームＲＮＡの蛍光強度をＬＵＭＩＮＥＳＣＥＮＴ ＩＭＡＧＥ ＡＮＡＬＹＺＥＲ ＬＡＳ−１０００ ｐｌｕｓ（富士フィルム）及びＩｍａｇｅ Ｇａｕｇｅ ｖｅｒ ３．１２（富士フィルム）を用いて定量した。次式に従い、２８Ｓ リボゾームＲＮＡ量に対するＩ型コラーゲンα２鎖ｍＲＮＡの量を算出した。
Ｉ型コラーゲンα２鎖ｍＲＮＡ量＝５．８ｋｂに相当する電気泳動位置の放射活性／２８Ｓ リボゾームＲＮＡの蛍光強度
結果を表４に示す。サンショウエキス試料には、Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写調節能が存在していることが判明した。このように、当該方法によりＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を有する物質を選抜できることが確認できた。
【００６８】
【表４】
＊Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写量（α２鎖ｍＲＮＡ量）相対値は、陰性対照添加試験区におけるＩ型コラーゲン遺伝子の転写量（α２鎖ｍＲＮＡ量）を１．０とした、各区におけるＩ型コラーゲン遺伝子の転写量（α２鎖ｍＲＮＡ量）を表す。
【００６９】
（３）コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子（ＴＧＦβ）存在下でのＩ型コラーゲン遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）測定
正常ヒト胎児皮膚線維芽細胞 ５ｘ１０7を１００ｍｍディッシュに播種し、Ｄ−ＭＥＭ（＋）で３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下において一晩培養した。該細胞の培養液を１％ ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭ培地に交換して１時間培養した後、実施例７（２）で調製されたサンショウエキス試料を、５０μｇ凍結乾燥物／ｍｌ培地となるように添加し、さらに１時間培養した。その後、当該細胞の培養液に、コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子であるヒトＴＧＦβ（ＰＥＰＲＯ ＴＥＣＨ、カタログ番号Ｅ２７９）を培地中の濃度が１０ｎｇ／ｍｌとなるように添加し、さらに２３時間培養した。尚、陰性対照区では、サンショウエキス試料に代えてＤＭＳＯ（培地中の濃度が０．１％となるよう添加）を用いた。陽性対照区では、サンショウエキス試料に代えてＩＦＮ−γ（培地中の濃度が１００Ｕ／ｍｌとなるように添加）を用いた。培養された細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、当該細胞から実施例１（１）と同様に全ＲＮＡを調製した。得られた全ＲＮＡ１０μｇを上記（２）と同様にノザンブロット解析に供し、２８Ｓ リボゾームＲＮＡ量に対するヒトＩ型コラーゲンα２鎖ｍＲＮＡ量を求めた。
結果を表５に示す。その結果、サンショウエキス試料には、コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子が細胞外に存在する条件下でも、Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を充分に確認できることが判明した。このように、当該方法によりＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を有する物質を選抜できることが確認できた。
【００７０】
【表５】
Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写量（α２鎖ｍＲＮＡ量）相対値は、陰性対照添加であって、かつ、コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子（ＴＧＦβ）存在試験区におけるＩ型コラーゲン遺伝子の転写量（α２鎖ｍＲＮＡ量）を１．０とした、各区におけるＩ型コラーゲン遺伝子の転写量（α２鎖ｍＲＮＡ量）を表す。
【００７１】
実施例７ （Ｉ型コラーゲン遺伝子の発現調節領域結合レポーター遺伝子利用によるＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を調節する物質の探索方法）
（１）転写開始に必要な塩基配列を含む、Ｉ型コラーゲン遺伝子の発現調節領域を機能可能な形で連結されてなるレポーター遺伝子の調製
正常ヒト胎児皮膚線維芽細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号ＣＣ−２５０９）１ｘ１０8細胞を３７℃、５％ ＣＯ2雰囲気下で一晩培養した。培養された細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、ＰＢＳ３ｍｌを加えセルスクレイパー（Ｎａｌｇｅｎ、カタログ番号１７９６９３）を用いて細胞を器壁から剥がした。剥がした細胞を遠心分離（１，５００ｒｐｍ、４℃、１５分間）により集め、これをＰＢＳ ２０ｍｌに懸濁して再度遠心分離した。得られた沈殿に、ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ番号２００６００）のＳｏｌｕｔｉｏｎ２を１１ｍｌ、ｐｒｏｎａｓｅを４．８μｌそれぞれ加えて６０℃にて１時間振とうした後、この混合液を氷中に１０分間放置した。次に、当該混合液に上記キットのＳｏｌｕｔｉｏｎ３を４ｍｌ加えて混合した後、これを氷中に５分間放置した。遠心分離（３，０００ｒｐｍ、４℃、１５分間）し、上清を回収した。回収された上清に、当該上清１ｍｌ当たりＲＮａｓｅを２μｌ加え、３７℃で１５分間放置した。この混合液に、２倍容量のエタノールを加えて混合することにより、出現した白い糸状の物質（ゲノムＤＮＡ）を回収した。回収されたゲノムＤＮＡを７０％エタノールで洗浄した後、風乾した。風乾されたゲノムＤＮＡを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ ８．０）（以下、ＴＥと記す。）５００μｌに溶解した。
溶解されたゲノムＤＮＡ １μｇと、配列番号１６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号１７で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（１０ｐｍｏｌ／μｌ）各１μｌ、蒸留水 ２９μｌ、ＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ（宝酒造、カタログ番号ＲＲ００２Ａ）に添付されたｂｕｆｆｅｒ ５μｌ、Ｍｇ2+溶液 ５μｌ、ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ ５μｌ及びＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ（宝酒造、カタログ番号ＲＲ００２Ａ）０．５μｌを混合した。得られた反応溶液を９４℃、５分間保温した後、９４℃、１分間次いで６０℃、１分間さらに７２℃、１分間の保温を１サイクルとしてこれを３０サイクル行った。当該反応溶液を２％アガロースゲル電気泳動に供することにより、約０．５ｋｂのＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡをフェノール・クロロホルム処理した後、エタノール沈殿することによりＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡを超純水に溶解し、この溶解液にＮｈｅＩ ２．５μｌ及びＨｉｎｄIII ２．５μｌを加え、３７℃で３時間保温した後、当該溶解液を２％アガロースゲル電気泳動に供することにより、約０．５ｋｂのＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡをエタノール沈殿することにより再びＤＮＡを回収した（以下、コラーゲンプロモーターＤＮＡと記す。）。
【００７２】
一方、ホタルルシフェラーゼをコードする塩基配列を有するベクターｐＧＬ３（プロメガ、カタログ番号Ｅ１７５１）をＮｈｅＩ及びＨｉｎｄIIIで消化した後、上記と同様にアガロースゲル電気泳動に供することにより、約５ｋｂのＤＮＡ（以下、ＬｕｃベクターＤＮＡと記す。）を回収した。回収されたＤＮＡをエタノール沈殿することにより再びＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡに蒸留水４４μｌ、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造、カタログ番号２１２０Ａ）に添付されたＢｕｆｆｅｒ５μｌ及びＡｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造、カタログ番号２１２０Ａ）１μｌを加えて、この混合液を６５℃で３０分間保温した。次に、当該混合液を２回フェノール・クロロホルム処理した（以下、該操作をＢＡＰ処理２と記す。）。
次いで、前記コラーゲンプロモーターＤＮＡ 約２０ｎｇ及びＬｕｃベクターＤＮＡ 約２０ｎｇを混合した後、この混合液にＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｖｅｒ２酵素溶液を同量添加して１６℃で一昼夜保温した。当該混合液に大腸菌５Ｈｄα（ＴＯＹＯＢＯ、カタログ番号ＤＮＡ−９０３）を加えて氷中に３０分間放置し、次いで４２℃、４５秒間保温した後、得られた大腸菌を５０μｇ／ｍｌ アンピシリンナトリウム（ナカライ、カタログ番号０２７−３９）を含むＬＢプレートに播種し、３７℃、一昼夜放置した。出現したシングルコロニーを５０μｇ／ｍｌ アンピシリンを含むＬＢ培地２ｍｌで３７℃、１２時間培養した。得られた培養液からＡＵＴＯＭＡＴＩＣ ＤＮＡ ＩＳＯＬＡＴＩＯＮ ＳＹＳＴＥＭ ＰＩ−５０（ＫＵＲＡＢＯ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。調製されたプラスミドＤＮＡの塩基配列をＤＮＡシークエンサーで分析した結果、ヒトＩ型コラーゲンα２鎖遺伝子のプロモーター領域の−３４２〜＋５７（転写開始点を＋１とする。）の塩基配列の下流に、ホタルルシフェラーゼをコードする塩基配列が接続されてなる塩基配列を保有していることが確認された（以下、ＣＯＬ−Ｌｕｃと記す。）。
【００７３】
（２）本蛋白質発現ベクターの調製
実施例１（１）で調製された全ＲＮＡ溶液とＴＨＥＲＭＯＳＣＲＩＰＴ ＲＴ−ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、カタログ番号１１１４６−０２４）とを用いて逆転写反応を行なった。即ち、まず全ＲＮＡ溶液 １μｇ、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）20 １μｌ及びＤＥＰＣ−Ｔｒｅａｔｅｄ Ｗａｔｅｒを計１０μｌになるように加えて混合し、この混合液を６５℃、５分間保温した後、直ちに氷冷した。次に当該混合液に、５ｘｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ ４μｌ、ＲＮａｓｅＯＵＴ １μｌ、ＤＴＴ １μｌ、ＤＥＰＣ−ＴｒｅａｔｅｄＷａｔｅｒ １μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ ２μｌ及びＴＨＥＲＭＯＳＣＲＩＰＴ ＲＴ １μｌを添加して５５℃、１時間保温し、続いて、８５℃、５分間保温した。さらに当該混合液にＲＮａｓｅ Ｈ １μｌを加えて３７℃、２０分間保温した。得られた溶液 １μｌ、配列番号１９で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（１０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、配列番号２０で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（１０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、蒸留水２９μｌ、ＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ（宝酒造、カタログ番号ＲＲ００２Ａ）に含まれるｂｕｆｆｅｒ ５μｌ、Ｍｇ2+溶液５μｌ、ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ ５μｌ及びＬＡ Ｔａｑ ０．５μｌを混合した後、得られた混合液を９４℃、５分間保温した。続いて、９４℃、１分間次いで６０℃、１分間さらに７２℃、２分間の保温を１サイクルとしてこれを３５サイクル行い、さらに７２℃、７分間保温した。保温後の混合液を４℃に保存した。保存された混合液を１％ＡｇａｒｏｓｅＬゲルを用いた電気泳動に供した。約１ｋｂのＤＮＡを含むゲル部分を切り出した後、これを６５℃、５分間保温した。得られたゲル溶解液をエタノール沈殿することによりＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡに蒸留水 ４０μｌ、１０ｘＨ Ｂｕｆｆｅｒ ５μｌ、ＨｉｎｄIII（宝酒造、カタログ番号１０６０Ａ）２．５μｌ 、ＸｂａＩ（宝酒造、カタログ番号１０９３Ａ）２．５μｌを添加して３７℃、３時間保温した。この混合液を１％アガロースゲル電気泳動に供することにより、約１ｋｂのＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡをエタノール沈殿し、得られた沈殿（ＤＮＡ）をＴＥ溶液２０μｌに溶解した。
一方、ｐＲｃ／ＲＳＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号２８−００５１）をＨｉｎｄIII及びＸｂａＩで消化した後、この消化物にＢＡＰ処理し、さらにエタノール沈殿した。得られた沈殿（ＤＮＡ）と、上記で得られた約１ｋｂのＤＮＡとをライゲーションした。このようにしてＹＢ−１／ＲＳＶを構築した。
【００７４】
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列の部分アミノ酸配列からなる本蛋白質の発現ベクターの調製
ＹＢ−１／ＲＳＶを鋳型として、配列番号２３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号２４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて上記（２）と同様にＰＣＲを行なうことにより、ヒトＹＢ−１のＮ末端から１番目のアミノ酸から１２９番目のアミノ酸までのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ（以下、ＹＢｄｅｌ ＤＮＡと記す。）を調製した。ＹＢｄｅｌ ＤＮＡをＨｉｎｄIII及びＸｂａＩで消化した後、上記（２）と同様にして、ＨｉｎｄIII及びＸｂａＩで消化したｐＲｃ／ＲＳＶのＤＮＡとライゲートした。得られたプラスミドをＹＢｄｅｌ／ＲＳＶと名付けた。
【００７５】
（４）レポーター遺伝子の発現量測定
正常ヒト胎児皮膚線維芽細胞 １ｘ１０6細胞を６０ｍｍディッシュに播種し、１０％ＦＢＳを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ−ＭＥＭ（日水製薬、カタログ番号０５９１９）培地（以下、該培地をＤ−ＭＥＭ（＋）と記す。）中で３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下において一晩培養した。次いで培地を、ＦＢＳを含まないＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ−ＭＥＭ培地（以下、該培地をＤ−ＭＥＭ（−）と記す。）に置換した。
Ｄ−ＭＥＭ（−） １００μｌに、ＹＢ−１／ＲＳＶまたはｐＲｃ／ＲＳＶのいずれか５０ｎｇと、ＣＯＬ−Ｌｕｃ ４μｇとを加え、この混合液を室温で４５分間放置した（溶液１）。また、Ｄ−ＭＥＭ（−） １００μｌにＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１８２９２−０１１）６μｌを加え、この混合液を室温で４０分間放置した（溶液２）。次に、溶液１と溶液２とを混合し、室温で１０分間放置した後、この混合液にＤ−ＭＥＭ（−）１．８ｍｌを加え、混合した。当該混合液を前記正常ヒト胎児皮膚線維芽細胞に添加した後、当該細胞を３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下で６時間培養した。その後、ディッシュから培養上清を除いて細胞をＤ−ＭＥＭ（−）で２回洗浄し、０．１％ＦＢＳを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ−ＭＥＭ培地［以下、Ｄ−ＭＥＭ（０．１％）と記す。］４ｍｌを添加し３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下で１時間培養した。当該細胞に、コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子であるＴＧＦβ（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ、カタログ番号）５μｇ／ｍｌ水溶液を４μｌ添加（培地中のＴＧＦβ濃度：５ｎｇ／ｍｌ）し、３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下でさらに４０時間培養した。尚、ＴＧＦβ無添加試験区では、ＴＧＦβに代えて蒸留水４μｌを用いた。培養された細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、細胞溶解剤（東洋インキ、カタログ番号ＰＤ１０）１５０μｌを加えセルスクレイパー（Ｎａｌｇｅｎ、カタログ番号１７９６９３）を用いて細胞を器壁から剥がした。得られた細胞懸濁液を回収した後、この細胞懸濁液を遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、５分間）し、上清を回収した。回収された上清各１５μｌを９６ウエルプレートに移した後、ＭＩＣＲＯＬＵＭＡＴ ＬＢ９６Ｐ（ＥＧ＆Ｇ ＢＥＲＴＨＯＬＤ社製）を用いて、Ｌｕｃアッセイ溶液（２０ｍＭ Ｔｒｉｃｉｎｅ（ｐＨ７．８）、２．６７ｍＭ ＭｇＳＯ4、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、３３．３ｍＭ ＤＴＴ、２７０μＭ Ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ａ、５３０μＭＡＴＰ、４７０μＭ Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ）５０μｌを当該プレートに自動分注した後、各ウェル内の発光量を測定した（Ｄｅｌａｙ：１．６秒、Ｍｅａｓ．Ｉｎｔｅｒｖａｌ：５秒）。
一方、回収された上清５μｌを、予め９６ウエルプレートに分注された５倍希釈Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ溶液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カタログ番号５００−０００６）２００μｌに加えて振とう混合した後、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ）を用いて各ウェル内の５９５ｎｍの吸光度を測定した。陰性対照区では、該上清に代えて細胞溶解剤５μｌを用いた。上記の測定で得られた値を基にし、次式に従ってプロモーター活性を算出した。
プロモーター活性＝［Ｌｕｃ活性（上清添加試験区）−Ｌｕｃ活性（細胞溶解剤添加試験区）］／［５９５ｎｍ吸光度（上清添加試験区）−５９５ｎｍ吸光度（細胞溶解剤添加試験区）］
結果を表６に示す。
【００７６】
【表６】
プロモーター相対活性は、ｐＲｃ／ＲＳＶが導入された細胞にコラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子（ＴＧＦβ）無添加試験区におけるプロモーター活性を１．０とした、各区におけるプロモーター活性を示す。
【００７７】
（５）レポーター遺伝子の発現量を指標とした被験物質のＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能
被験物質としてサンショウエキス及びボダイジュエキスを使用した。
サンショウエキス［一丸ファルコス製、ファルコレックス（一丸ファルコス登録商標）サンショウ］２ｍｌ及びシナノキエキス［一丸ファルコス製、ファルコレックス（一丸ファルコス登録商標）ボダイジュ］２ｍｌをそれぞれ凍結乾燥した後、得られた凍結乾燥物５０ｍｇ当り１ｍｌのジメチルスルフォキサイド（以下、ＤＭＳＯと記す。）を加えて混合することにより、サンショウエキス試料及びボダイジュエキス試料を得た。
正常ヒト胎児皮膚線維芽細胞 １ｘ１０6を６０ｍｍディッシュに播種し、Ｄ−ＭＥＭ（＋）培地中で３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下において一晩培養した後、培地をＤ−ＭＥＭ（−）培地に置換した。一方、Ｄ−ＭＥＭ（−） １００μｌに、実施例２（３）で調製された結合型レポーターベクターのＤＮＡ ２μｇ又は非結合型レポーターベクターのＤＮＡ ２μｇのいずれかを加え、この混合液を室温で４０分間放置した（溶液１）。また、Ｄ−ＭＥＭ（−） １００μｌにＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１８２９２−０１１）４．５μｌを加え、この混合液を室温で４０分間放置した（溶液２）。次に、溶液１と溶液２とを混合し、室温で１０分間放置した後、この混合液にＤ−ＭＥＭ（−）２ｍｌを加え、混合した。当該混合液を前記正常ヒト胎児皮膚線維芽細胞に添加した後、当該細胞を３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下で６時間培養した。その後、ディッシュから培養上清を除いて細胞をＤ−ＭＥＭ（−）で２回洗浄し、Ｄ−ＭＥＭ（＋）４ｍｌを添加し３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下で１時間培養した。
上記のサンショウエキス試料又はボダイジュエキス試料をそれぞれ１ｍｇ凍結乾燥物／ｍｌ ＤＭＳＯとなるよう希釈した。得られた希釈液４μｌをそれぞれ、レポーターベクターが導入された上記の正常ヒト胎児皮膚線維芽細胞に添加し（培地中の試料濃度：１μｇ凍結乾燥物／ｍｌ、培地中のＤＭＳＯ濃度：０．１％）、３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下でさらに４０時間培養した。陰性対照区では、試料に代えてＤＭＳＯ４μｌ（培地中のＤＭＳＯ濃度が０．１％となるように添加）を用いた。陽性対照区では、試料に代えてインターフェロン−γ（以下、ＩＦＮ−γと記す。Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１０４０５９６）を培地中のＩＦＮ−γ濃度が１００Ｕ／ｍｌとなるように添加）を用いた。
培養された細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、実施例２（４）と同様にＣＡＴ活性を測定した。
結果を表７に示す。いずれの試料もレポーター遺伝子の発現量を低下させることが判明した。即ち、ボダイジュエキス及びサンショウエキスは、Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を充分に有することが確認できた。このようにＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を有する物質を選抜できることが確認できた。
【００７８】
【表７】
＊ＣＡＴ相対活性は、結合型レポーターベクターが導入された細胞に陰性対照添加試験区におけるＣＡＴ活性を１．０とした、各区のにおけるＣＡＴ活性を示す。
【００７９】
実施例８ （コラーゲン蓄積抑制剤：I型コラーゲン遺伝子の転写調節能を有する物質）
（１）サンショウから抽出精製された化合物
（１−１）サンショウからの化合物の抽出精製
サンショウ果皮３ｋｇに１００％エタノール２５ｋｇを加えて１０日間浸漬した後、濾紙でろ過し、濾液を回収した。回収された濾液を減圧濃縮した後、この濃縮液から上清を分取し、そのうち２ｇをエタノールと水の１：１（ｖ／ｖ）混合液３ｍｌと混合した。この混合液をシリカゲルＴＬＣプレート（メルク社製、Ａｒｔ．５７４４，２０ｘ２０ｃｍ，０．５ｍｍ厚）（２０枚）に塗布し、クロロホルムとメタノールの混合液８：１（ｖ／ｖ）で展開した。Ｒｆ値０〜０．０５の画分をかき取り、メタノールと水の９：１（ｖ／ｖ）混合液５０ｍｌで溶出した。溶出液を窒素気流下に蒸発乾固した後、残渣をメタノールと水の１：１（ｖ／ｖ）混合液１ｍｌに溶解した。この溶解液をシリカゲルＴＬＣプレート（１０枚）に塗布し、クロロホルムとメタノールと水の３０：１０：１（ｖ／ｖ／ｖ）混合液で展開した。Ｒｆ値０．７の画分をかき取り、メタノール３０ｍｌで溶出した。溶出液から溶媒を減圧下に蒸発させた後、残渣をメタノール１ｍｌに溶解した。この溶解液をＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ ＡＭカラム（ＹＭＣ社製、１０ｍｍＩ．Ｄ．ｘ２５ｃｍ）を用いた高速液体クロマトグラフィー（溶出液：メタノールと水の１：１（ｖ／ｖ）混合液）に供した。保持時間２９分の画分を分取し、分取された溶出液から溶媒を窒素気流下に留去させることにより化合物Ａ（０．５ｍｇ）を得た。
【００８０】
（１−２）抽出精製された化合物の物性分析
化合物Ａの物性を分析した。
【００８１】
1Ｈ−ＮＭＲスペクトル
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）δ：１．１４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），１．１７（６Ｈ，ｓ），２．２９−２．４０（４Ｈ，ｍ），３．２５（２Ｈ，ｓ），３．６５−３．６８（１Ｈ，ｍ），３．９５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，６．２Ｈｚ），５．４４（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１０．４Ｈｚ），５．７６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１５．３Ｈｚ），６．００−６．０７（２Ｈ，ｍ），６．５８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．９Ｈｚ，１５．７Ｈｚ），６．７９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．１Ｈｚ）
【００８２】
質量分析スペクトル
ＦＡＢ−ＭＳ：２９８［Ｍ＋Ｈ］+，ＨＲＭＳ：２９８．２０１９［Ｍ＋Ｈ］+
分子式；Ｃ16Ｈ28ＮＯ4
【００８３】
構造式
【００８４】
（１−３）化合物Ａが有するI型コラーゲン遺伝子の転写調節能
実施例７（５）と同様にして、結合型レポーターベクターが導入された正常ヒト胎児皮膚線維芽細胞を用いて、化合物Ａが有するI型コラーゲン遺伝子の転写調節能を検定した。当該細胞に、培地中の化合物Ａの最終濃度が８μＭとなるように調製された化合物Ａのメタノール溶液（被験物質）を接触させた。尚、陰性対照区では、化合物Ａのメタノール溶液に代えて該溶液と同量のメタノールを用いた。その結果、化合物Ａを接触させた区におけるＣＡＴ相対活性（陰性対照区のＣＡＴ活性を１．０としたときの試験区のＣＡＴ活性）は０．７であり、化合物ＡがI型コラーゲン遺伝子の転写調節能を有することが確認できた。つまり、化合物Ａはコラーゲン蓄積抑制剤の有効成分となりえることが判明した。
【００８５】
実施例９ （本蛋白質依存的コラーゲン抑制経路の正因子投与によるコラーゲン蓄積抑制方法：肝線維症モデルマウスを用いた被験物質のコラーゲン蓄積抑制能検定）
（１）試料調製
サンショウエキス［一丸ファルコス製、ファルコレックス（一丸ファルコス登録商標） サンショウ］の凍結乾燥物及びシナノキエキス［一丸ファルコス製、ファルコレックス（一丸ファルコス登録商標）ボダイジュ］の凍結乾燥物それぞれに、生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム水溶液）を１５０ｍｇ凍結乾燥物／ｍｌとなるように加えて混合することにより、それぞれサンショウエキス試料、ボダイジュエキス試料を調製とした。またコラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子として、四塩化炭素（和光、カタログ番号０３０−１５７３１）に等量のコーンオイル（ナカライテスク、カタログ番号２５６−０６）を加えて均一になるまで混合した、四塩化炭素溶液を用いた。
【００８６】
（２）試料投与
７週齢雄Ｂａｌｂ／ｃマウス（日本チャールズリバー、体重２５〜３０ｇ）に、上記（１）により調製されたサンショウエキス試料又はボダイジュエキス試料を０．５ｇ凍結乾燥物／ｋｇ体重（１００μｌ／３０ｇ体重）となるように経口ゾンデ（フチガミ器械、カタログ番号６２０２）を用いて毎日１回、４週間連続して経口投与した。サンショウエキス試料又はボダイジュエキス試料の投与開始１週間後から開始して１週間毎に４回、四塩化炭素溶液を３．５ｍｌ／ｋｇ体重となるように経口投与した（以下、該投与群を各々サンショウ群、ボダイジュ群と記す。）。また、これらエキス試料に代えて生理食塩水を１００μｌ／３０ｇ体重となるよう、毎日１回、４週間連続経口投与し、かつ、四塩化炭素溶液の代えてコーンオイルのみを３．５ｍｌ／ｋｇ体重となるように経口投与した群（以下、該投与群を未処理群と記す。）と、エキス試料に代えて生理食塩水を１００μｌ／３０ｇ体重となるよう、毎日１回、４週間連続経口投与し、かつ、四塩化炭素溶液を１週間ごとに計４回経口投与した群（以下、該投与群をコントロール群と記す。）とを設けた。尚、各群マウス２匹を用いた。サンショウエキス試料又はボダイジュエキス試料の最終投与から１週間後、マウスをエーテル麻酔した後に肝臓中葉を摘出した。摘出された肝臓中葉は直ちに液体窒素に浸せきされた。
【００８７】
（３）コラーゲン蓄積抑制能検定
ホウ酸バッファーは、６．１８ｇのホウ酸と２２．５ｇのＫＣｌを蒸留水に溶かし、水酸化カリウムでｐＨ８．７に調整した後に全量を１００ｍｌにすることにより調製された。クロラミンＴ溶液は、クロラミンＴ（ナカライテスク、カタログ番号０８０−０５）１．４１ｇを２−メトキシエタノール（ナカライテスク、カタログ番号１５３−１０）２５ｍｌに溶解することにより調製された。ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド溶液は、ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド（ナカライテスク、カタログ番号１２８−１６）１２ｇをエタノール２０ｍｌに溶かし、この溶液に氷冷しながら濃硫酸２．７４ｍｌ−エタノール２０ｍｌ混合液をゆっくり加えて混合にすることにより調製された。ヒドロキシプロリン標準液は、ヒドロキシ−Ｌ−プロリン（ナカライテスク、カタログ番号１８８−１７）３ｍｇを蒸留水１ｍｌに溶解（３ｍｇ／ｍｌ）にすることにより調製された。
上記（２）により得られた肝臓中葉約５０ｍｇをネジ付きガラス製試験管１３ｘ１００ｍｍ（ＩＷＡＫＩ、カタログ番号ＴＳＴ−ＳＣＲ１３−１００）に取り、６Ｎ ＨＣＬ １ｍｌを加えて１１０℃にて２０時間加水分解した。得られた加水分解液に５Ｍ水酸化カリウム １ｍｌを加えた後、この溶液をフィルター（０．２２μｍ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、カタログ番号ＳＬＧＰ Ｒ２５ＬＳ）でろ過し、ろ液を回収した。回収されたろ液１ｍｌに蒸留水１ｍｌを加えて、以下の試料溶液とした。またヒドロキシプロリン標準液０、１、２又は４μｌ（それぞれヒドロキシプロリン０、３、６又は１２μｇに相当する。）を蒸留水２ｍｌに加え、これを標準溶液とした。試料溶液及び標準溶液それぞれに、ＫＣＬ １．５ｇ、１０％アラニン水溶液（ｐＨ ８．７）０．２５ｍｌ及びホウ酸バッファー０．５ｍｌを加えて混合し、この混合液を室温で３０分間放置した。混合液にクロラミンＴ溶液０．５ｍｌを加えて、さらに２５分間放置した。当該混合液に３．６Ｍチオ硫酸ナトリウム（ナカライテスク、カタログ番号３２０−０６）１．５ｍｌ及びトルエン２．５ｍｌを加えた後、キャップをして５分間撹拌した。混合液を１５００ｒｐｍ、５分間遠心分離した後、上層のトルエンを吸引除去した後、残りの下層を回収した。回収された溶液を１００℃、３０分間保温した。当該溶液を流水で冷却した後、再びトルエン２．５ｍｌを加えて５分間撹拌した。混合液を１５００ｒｐｍ、５分間遠心分離した後、トルエン層を回収した。回収されたトルエン層１．２５ｍｌにｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド溶液 ０．５ｍｌを加えて室温で３０分間放置した後、この混合液について５６０ｎｍの吸光度を測定した。ヒドロキシプロリン標準液の値（ヒドロキシプロリン０μｇをブランクとする。）から検量線を作成することにより次式を得た。
ヒドロキシプロリン量（μｇ）＝１７．４１６ｘ［（試料の吸光度）−（ブランクの吸光度）］−０．１６１９ Ｒ2＝０．９９５４
この式を用いて各試料溶液中のヒドロキシプロリン量を求めることにより肝臓中１ｇ当たりに存在するヒドロキシプロリン量を算出した。結果を表８に示す。
その結果、サンショウエキス試料投与群及びボダイジュエキス試料投与群ではコラーゲン蓄積抑制効果が確認できた。つまり、サンショウエキス及びボダイジュエキスはコラーゲン蓄積抑制剤の有効成分となりえることが判明した。
【００８８】
【表８】
＊ヒドロキシプロリン相対量は、未処理群のヒドロキシプロリン量を１．０として、各群のヒドロキシプロリン量を示す。
【００８９】
【発明の効果】
本発明により、組織におけるＩ型コラーゲン遺伝子の過剰発現を抑制し、よってコラーゲンの産生亢進を抑え、細胞外マトリックスの過度の集積に伴う種々の疾患や異状の予防、治療に有用な方法や薬剤の開発が可能となる。
【００９０】
［配列表フリーテキスト］
配列番号２
結合性配列を作製するために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号３
結合性配列を作製するために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号４
非結合性配列を作製するために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号７
非結合性配列を作製するために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１７
コラーゲンプロモーターＤＮＡを増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１８
コラーゲンプロモーターＤＮＡを増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１９
発現ベクターを作製するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２０
発現ベクターを作製するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２１
コラーゲンα１プローブを作製するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２２
コラーゲンα１プローブを作製するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２５
非結合性配列を作製するために設計されたオリゴヌクレオチド
【００９１】
【配列表】
【発明の属する技術分野】
本発明は、コラーゲン蓄積抑制剤等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
肝硬変、間質性肺疾患、慢性腎不全（又は慢性腎不全に陥る疾患）、炎症後の過形成痕跡、術後の瘢痕や熱傷性瘢痕、或いは強皮症、動脈硬化、高血圧、関節リウマチなどの疾患や異状においては、コラーゲン等の細胞外マトリックスの過度の集積により組織が線維化して硬化し、その結果、臓器・組織の機能低下や瘢痕形成等に至る。このような細胞外マトリックスの過度の集積は、コラーゲン等の生合成と分解のバランスが破綻し産生が亢進することにより導かれる。実際、線維化した組織においては、コラーゲン遺伝子、特にＩ型コラーゲン遺伝子の発現量が上昇していることが観察されている［Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，９４，３６５，（１９９０）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，６６４２，（１９９１）］。そして、種々の動物線維症モデルにおいて、インターフェロンγの投与により、組織におけるＩ型コラーゲン遺伝子の発現量が低下し、コラーゲン量が低下して組織の線維化が改善されることが報告されている［Ｅｘｐ．Ｌｕｎｇ Ｒｅｓ．，２１，７９１−８０８，（１９９５），Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．，４７，６２−６９，（１９９５），Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．，２８，４７１−４７９，（１９９８），Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．，２６，８９４−９０３，（１９９７）］。また、線維化した組織においては、サイトカインの１種であるＴＧＦβの量が上昇していることも観察されている［Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，９４，３６５，（１９９０）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，６６４２，（１９９１）］。ＴＧＦβは、Ｉ型コラーゲン遺伝子の発現量を増加させ、コラーゲンの産生亢進、ひいては、組織の線維化に関与していることが示されている［Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，６３，１７１，（１９９０）、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，９４，３６５，（１９９０）］。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、組織におけるＩ型コラーゲン遺伝子の過剰発現を抑制し、よってコラーゲンの産生亢進を抑え、細胞外マトリックスの過度の集積に伴う種々の疾患や異状の予防、治療に有用な方法や薬剤の開発が切望されている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らはかかる状況の下、鋭意検討した結果、特定のアミノ酸配列を有するＤＮＡ結合蛋白質が、Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制し、その結果としてコラーゲンの蓄積を抑制することを見出した。当該知見を基づき、コラーゲン過剰蓄積疾患（例えば線維症）等の予防又は治療のための医療分野において有用となる、コラーゲン蓄積抑制剤、コラーゲン蓄積抑制方法、Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を有する物質の探索方法等を見出し、本発明に至った。
即ち、本発明は、
１．下記のいずれかのアミノ酸配列を有するＤＮＡ結合蛋白質を有効成分として含み、該有効成分が薬学的に許容される担体中に製剤化されてなることを特徴とするコラーゲン蓄積抑制剤（以下、本発明蓄積抑制剤（I）と記すこともある。）
＜アミノ酸配列（以下、当該アミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列をアミノ酸配列（I）と記すこともある。）＞
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列；
２．アミノ酸配列（I）を有するＤＮＡ結合蛋白質をコードする核酸を有効成分として含み、該有効成分が薬学的に許容される担体中に製剤化されてなることを特徴とするコラーゲン蓄積抑制剤（以下、本発明蓄積抑制剤（II）と記すこともある。）；
３．コラーゲン蓄積抑制のための、アミノ酸配列（I）を有するＤＮＡ結合蛋白質の使用；
４．コラーゲン蓄積抑制のための、アミノ酸配列（I）を有するＤＮＡ結合蛋白質をコードする核酸の使用；
５．Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写抑制のための、アミノ酸配列（I）を有するＤＮＡ結合蛋白質の使用；
６．Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写抑制のための、アミノ酸配列（I）を有するＤＮＡ結合蛋白質をコードする核酸の使用；
７．哺乳動物細胞に、アミノ酸配列（I）を有するＤＮＡ結合蛋白質をコードする外来遺伝子を、当該外来遺伝子が前記細胞で発現する位置に置かれるように提供する工程を有することを特徴とする哺乳動物におけるコラーゲン蓄積抑制方法（以下、本発明蓄積抑制方法（I）と記すこともある。）；
８．哺乳動物細胞に、コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子が前記細胞外に存在する条件下において、前記外来遺伝子を提供することを特徴とする前項７記載のコラーゲン蓄積抑制方法；
９．コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子が、ＤＮＡ結合蛋白質依存的コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子であることを特徴とする前項８記載のコラーゲン蓄積抑制方法；
１０．ＤＮＡ結合蛋白質がＡＰ−１又はＳｍａｄであることを特徴とする前項９記載のコラーゲン蓄積抑制方法；
１１．コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子がＴＧＦ−βであることを特徴とする前項８記載のコラーゲン蓄積抑制方法；
１２．コラーゲン過剰蓄積に起因する疾患と診断されうる哺乳動物の体内にある細胞に、アミノ酸配列（I）を有するＤＮＡ結合蛋白質を投与する工程を有することを特徴とするコラーゲン蓄積抑制方法；
１３．線維症に羅患していると診断されうる哺乳動物の体内にある細胞に、アミノ酸配列（I）を有するＤＮＡ結合蛋白質を投与する工程を有することを特徴とするコラーゲン蓄積抑制方法；
１４．哺乳動物細胞に、コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子が前記細胞外に存在する条件下において、アミノ酸配列（I）を有するＤＮＡ結合蛋白質を投与する工程を有することを特徴とするコラーゲン蓄積抑制方法（以下、本発明蓄積抑制方法（II）と記すこともある。）；
１５．コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子が、ＤＮＡ結合蛋白質依存的コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子であることを特徴とする前項１４記載のコラーゲン蓄積抑制方法；
１６．Ｉ型コラーゲン遺伝子を有する細胞に、アミノ酸配列（I）を有するＤＮＡ結合蛋白質を投与する工程を有することを特徴とするコラーゲン蓄積抑制方法（以下、本発明蓄積抑制方法（III）と記すこともある。）；
１７．Ｉ型コラーゲン遺伝子を有する細胞に、コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子が前記細胞外に存在する条件下において、アミノ酸配列（I）を有するＤＮＡ結合蛋白質を投与する工程を有することを特徴とするコラーゲン蓄積抑制方法；
１８．コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子が、ＤＮＡ結合蛋白質依存的コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子であることを特徴とする前項１７記載のコラーゲン蓄積抑制方法；
１９．Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を有する物質の探索方法であって、
（１）アミノ酸配列（I）を有するＤＮＡ結合蛋白質を発現する細胞に、被験物質を接触させる第一工程、
（２）前記第一工程後に、上記のＤＮＡ結合蛋白質の細胞核内への移行量又はその量と相関関係を有する指標値を測定する第二工程、
（３）第二工程により測定された移行量又はその量と相関関係を有する指標値に基づき前記物質のＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を評価する第三工程、及び
（４）前記第三工程で評価されたＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能に基づきＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を有する物質を選抜する第四工程
を有することを特徴とする探索方法（以下、本発明探索方法（I）と記すこともある。）；
２０．前記細胞が、前記ＤＮＡ結合蛋白質の細胞核内への移行量と相関関係を有する指標値を提供可能とする外来性マーカー蛋白質を発現する細胞であることを特徴とする前項１９記載の探索方法；
２１．Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を有する物質の探索方法であって、
（１）Ｉ型コラーゲン遺伝子を有し、かつ、アミノ酸配列（I）を有するＤＮＡ結合蛋白質をコードする外来遺伝子を当該外来遺伝子が細胞で発現する位置に置かれるように提供されてなる細胞に、異なる２種以上の被験物質を独立して接触させる第一工程
（２）前記第一工程後に、コラーゲン蓄積量を独立してモニターする第二工程、
（３）第二工程により独立してモニターされたコラーゲン蓄積量を互いに比較することにより得られる差異に基づき前記物質のＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を評価する第三工程、
（４）前記第三工程で評価されたＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能に基づきＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を有する物質を選抜する第四工程、
を有することを特徴とする探索方法（以下、本発明探索方法（II）と記すこともある。）；
２２．第一工程が、コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子が前記細胞外に存在する条件下でなされることを特徴とする前項２１記載の探索方法；
２３．コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子が、ＤＮＡ結合蛋白質依存的コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子であることを特徴とする前項２２記載の探索方法；
２４．Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を有する物質の探索方法であって、
（１）（ａ）転写開始に必要な塩基配列を含む、Ｉ型コラーゲン遺伝子の発現調節領域を機能可能な形で連結されてなるレポーター遺伝子と、アミノ酸配列（I）を有するＤＮＡ結合蛋白質とを含有する細胞と、（ｂ）転写開始に必要な塩基配列を含み、かつアミノ酸配列（I）を有するＤＮＡ結合蛋白質との結合能力を有さない塩基配列を機能可能な形で連結されてなるレポーター遺伝子と、アミノ酸配列（I）を有するＤＮＡ結合蛋白質とを含有する細胞とにそれぞれ、被験物質を独立して接触させる第一工程、
（２）前記第一工程後に、レポーター遺伝子の発現量を独立してモニターする第二工程、及び
（３）第二工程により独立してモニターされた発現量を互いに比較することにより得られる差異に基づき前記物質のＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を評価する第三工程、及び
（４）前記第三工程で評価されたＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能に基づきＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を有する物質を選抜する第四工程
を有することを特徴とする探索方法（以下、本発明探索方法（III）と記すこともある。）；
２５．第一工程が、コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子が前記細胞外に存在する条件下においてなされることを特徴とする前項２４記載の探索方法；
２６．コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子がＤＮＡ結合蛋白質依存的コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子であることを特徴とする前項２５記載の探索方法；
２７．請求項１９〜２６記載の探索方法により選抜された物質またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含み、該有効成分が薬学的に許容される担体中に製剤化されてなることを特徴とするコラーゲン蓄積抑制剤（以下、本発明蓄積抑制剤（III）と記すこともある。）
２８．一般式（Ｉ）で示される化合物またはその薬学的に許容される塩。
２９．一般式（Ｉ）で示される化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含み、該有効成分が薬学的に許容される担体中に製剤化されてなることを特徴とするコラーゲン蓄積抑制剤；
３０．サンショウ（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ ｐｉｐｅｒｉｔｕｍ Ｄｅ Ｃａｎｄｏｌｌｅ）およびその同属植物、ならびにボダイジュ（Ｔｉｌｉａ ｃｏｒｄａｔａ Ｍｉｌｌ）およびその同属植物からなる群から選択される植物の少なくとも１つの部位またはその処理物を有効成分として含み、該有効成分が薬学的に許容される担体中に製剤化されてなることを特徴とするコラーゲン蓄積抑制剤；
３１．Ｉ型コラーゲン遺伝子を有する細胞に、コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子が前記細胞外に存在する条件下において、アミノ酸配列（I）を有するＤＮＡ結合蛋白質依存的コラーゲン蓄積抑制経路の正の調節因子を投与する工程を有することを特徴とするコラーゲン蓄積抑制方法（以下、本発明蓄積抑制方法（IV）と記すこともある。）；
３２．コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子がＤＮＡ結合蛋白質依存的コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子であることを特徴とする前項３１記載のコラーゲン蓄積抑制方法；
等を提供するものである。
【０００５】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明蓄積抑制剤（I）は、コラーゲン蓄積抑制（特にＩ型コラーゲン遺伝子の転写抑制）のために使用される。
本発明蓄積抑制剤（I）において用いられるＤＮＡ結合蛋白質とは、下記のいずれかのアミノ酸配列を有する蛋白質である（以下、本蛋白質と記すこともある。）。
＜アミノ酸配列＞
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列
【０００６】
ここで、前記（ｂ）〜（ｅ）のアミノ酸配列と、配列番号１で示されるアミノ酸配列との相違は、一部のアミノ酸の欠失、置換、修飾、付加等である。これらは、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質が細胞内で受けるプロセシング、該蛋白質が由来する生物の種差、個体差、器官、組織間の差異等により天然に生じる変異や、部位特異的変異導入法や突然変異処理等によって遺伝子に人為的に導入される変異等により生じ得る。
かかるアミノ酸の欠失、付加もしくは置換（以下、総じてアミノ酸の改変と記すこともある。）を人為的に行う手法としては、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードするDNAに対して部位特異的変異導入を施し、その後このDNAを常法により発現させる手法が挙げられる。ここで部位特異的変異導入法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法（ギャップド・デュプレックス法、Nucleic Acids Res.,12,9441-9456(1984)）、変異導入用プライマーを用いたPCRによる方法等が挙げられる。
前記で改変されるアミノ酸の数については、少なくとも１個、具体的には1若しくは数個（ここで「数個」とは、２〜約１０個程度である。）、又はそれ以上である。かかる改変を受けるアミノ酸の数は、本蛋白質にＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を見出すことのできる範囲であれば良い。
また、アミノ酸の置換としては、例えば、疎水性、電荷、ｐＫ、立体構造上における特徴等の類似したアミノ酸への置換をあげることができる。このような置換としては、具体的には例えば、▲１▼グリシン、アラニン；▲２▼バリン、イソロイシン、ロイシン；▲３▼アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、▲４▼セリン、スレオニン；▲５▼リジン、アルギニン；▲６▼フェニルアラニン、チロシン等のグループ内での置換が挙げられる。
【０００７】
本発明において「配列同一性」とは、２つの塩基配列または２つのアミノ酸配列間の同一性及び相同性をいう。前記「配列同一性」は、比較対象の配列の全領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象の塩基配列またはアミノ酸配列の最適なアラインメントにおいては、付加又は欠失（例えばギャップ等）を許容してもよい。このような配列同一性は、例えば、Vector NTIを用いて、ClustalWアルゴリズム[Nucleic Acid Res.,22(22):4673-4680(1994)]を利用してアラインメントを作成することにより算出することができる。尚、配列同一性は、例えば、市販の配列解析ソフトウェア、具体的にはVector NTI、GENETYX-MACや、公共のデータベースで提供される解析ツールを用いて測定することができる。前記公共データベースは、例えば、ホームページアドレスhttp://www.ddbj.nig.ac.jpにおいて、一般的に利用可能である。
本発明における配列同一性は、例えば、アミノ酸配列基準の場合には８０％以上であることが好ましく、また塩基配列基準の場合には９０％以上であることが好ましい。上記条件を満たす限りにおいて、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号第５２番から第１３０番までのアミノ酸配列における配列同一性が実質的にほぼ１００％であり、第１番から第５１番までのアミノ配列における配列同一性が５０％以上であるような配列同一性であってもよい。
【０００８】
前記（ｅ）にある「ストリンジェントな条件」としては、Sambrook J., Frisch E. F., Maniatis T.著、モレキュラークローニング第2版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー発行（Cold Spring Harbor Laboratory press）等に記載される通常の方法に準じて行われるハイブリダイゼーションにおいて、例えば、６×SSC（１．５M NaCl、０．１５Mクエン酸三ナトリウムを含む溶液を１０×SSCとする）を含む溶液中で４５℃にてハイブリッドを形成させた後、2×SSCで５０℃にて洗浄するような条件（Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6）等を挙げることができる。洗浄ステップにおける塩濃度は、例えば、２×SSC（低ストリンジェンシーな条件）から０．２×SSC（高ストリンジェンシーな条件）までの条件から選択することができる。洗浄ステップにおける温度は、例えば、室温（低ストリンジェンシーな条件）から６５℃（高ストリンジェンシーな条件）までの条件から選択することができる。また、塩濃度と温度の両方を変えることもできる。
尚、本蛋白質のうち、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するＤＮＡ結合蛋白質は、ヒト由来のＹＢ−１（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｍ２４０７０）として知られている。
【０００９】
このような蛋白質は、以下のように探索すればよい。
例えば、まず（１）Ｉ型コラーゲン遺伝子を有する細胞に、被験蛋白質を接触させる第一工程、及び（２）前記第一工程後に、コラーゲン蓄積量を測定する第二工程を有する方法によりコラーゲン蓄積量を分析する。この際に、被験蛋白質として異なる２種以上の蛋白質を各々独立して用いた区におけるコラーゲン蓄積量を比較しその差異を調べる。その結果、得られる差異に基づき前記被験蛋白質のＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能力を評価する。このようにして評価されたＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力に基づき被験蛋白質を選抜することにより、Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質を探索することができる。上記第二工程におけるコラーゲン蓄積量を分析する代わりに、後述の本発明物質探索方法(III)のように、コラーゲン蓄積量の指標となるレポーター遺伝子の発現量をモニターすることで、被験蛋白質のＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能力を評価することにより、Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質を探索してもよい。
上記の方法において、前記異なる２種以上の被験蛋白質のうち少なくとも一つの蛋白質を、Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有さない蛋白質とすることで、他の被験蛋白質が有するＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を評価してもよい。また、前記異なる２種以上の蛋白質のうち少なくとも一つの蛋白質が有するＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を基準として、他の被験蛋白質が有するＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を評価してもよい。
【００１０】
本蛋白質は、SDS-PAGEでの分子量として約４万以上約６万以下の分子量であることが好ましく、特に約５万程度の分子量（例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質と同等）が適している。ただし、例えば配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち連続する約５０アミノ酸以上からなるアミノ酸配列が欠失したアミノ酸配列を有する蛋白質である場合には、SDS-PAGEでの分子量として約１万以上約４万以下の分子量であることが好ましく、特に約２万程度の分子量（例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号第１番から第１２９番までのアミノ酸配列からなる蛋白質に相当）が適している。
【００１１】
本蛋白質の調製方法（本蛋白質をコードする核酸の調製方法を含む）について以下に説明する。
まず、本蛋白質をコードする核酸（以下、本遺伝子と記すこともある。）、例えば、（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ；
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡであり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ；
（ｄ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡであり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ；
（ｅ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
等を、通常の遺伝子工学的方法（例えば、Sambrook J., Frisch E. F., Maniatis T.著、モレキュラークローニング第2版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー発行（Cold Spring Harbor Laboratory press）等に記載されている方法）に準じて取得する。次いで、得られた本遺伝子を用いることにより、通常の遺伝子工学的方法に準じて本蛋白質を製造・取得する。このようにして本蛋白質を調製することができる。
【００１２】
具体的には、まず、ヒト等の組織、細胞やこれらに由来する培養細胞などからＲＮＡを調製する。例えば、正常ヒト胎児皮膚繊維芽細胞等を塩酸グアニジンやグアニジンチオシアネート等の強力な蛋白質変性剤を含む溶液中で粉砕し、さらに該粉砕物にフェノール、クロロホルム等を加えることにより蛋白質を変性させる。変性蛋白質を遠心分離等により除去した後、回収された上清画分から塩酸グアニジン／フェノール法、ＳＤＳ−フェノール法、グアニジンチオシアネート／ＣｓＣｌ法等の方法により全ＲＮＡを抽出する。なお、これらの方法に基づいた市販の試薬としては、例えばISOGEN（ニッポンジーン製）、トリゾル試薬（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）等がある。
得られた全ＲＮＡを鋳型としてオリゴｄＴプライマーをＲＮＡのポリＡ配列にアニールさせ、逆転写酵素を作用させることにより一本鎖ｃＤＮＡを合成する。次いで、該一本鎖ｃＤＮＡを鋳型とし、本蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列（例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列又は配列番号２６で示される塩基配列）に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼチェイン反応（以下、ＰＣＲと記す。）を行うことにより、本遺伝子を増幅し、取得することができる。
また、上記の一本鎖ｃＤＮＡを鋳型としてＤＮＡポリメラーゼを作用させることにより二本鎖のｃＤＮＡを合成する。得られた二本鎖ｃＤＮＡを、例えばプラスミドpUC118やファージλgt10などのベクターに挿入することによりｃＤＮＡライブラリーを作製する。このようにして得られるｃＤＮＡライブラリーや市販のｃＤＮＡライブラリーから、例えば、本蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列（例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列又は配列番号２６で示される塩基配列）の部分塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして用いるハイブリダイゼーション法や、本蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列（例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列又は配列番号２６で示される塩基配列）に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるＰＣＲにより、本遺伝子を取得することもできる。
ＰＣＲに用いるプライマーとしては、例えば、約20bpから約50bp程度の長さでかつGまたはC塩基の割合が約40%から約60%程度の塩基配列を、上記のような本蛋白質をコードする塩基配列から選択し、該塩基配列に基いてオリゴヌクレオチドを設計し、合成するとよい。具体的には、例えば、ヒト由来の本遺伝子を取得するには、フォワードプライマーとして配列番号５で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いることができ、リバースプライマーとして配列番号６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いることができる。
得られた本遺伝子の塩基配列は、Maxam Gilbert法 (例えば、Maxam,A.M & W.Gilbert, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 74, 560, 1977 等に記載される)やSanger法（例えばSanger,F. & A.R.Coulson, J.Mol.Biol., 94, 441, 1975、Sanger,F, & Nicklen and A.R.Coulson., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 74, 5463, 1977等に記載される）により確認することができる。
このようにして、コラーゲン蓄積抑制（特にＩ型コラーゲン遺伝子の転写抑制）のために使用される本発明蓄積抑制剤（II）の有効成分となる本蛋白質をコードする核酸を調製することができる。
【００１３】
本遺伝子は、例えば、J.Sambrook,E.F.Frisch,T.Maniatis著；モレキュラー クローニング第２版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールドスプリング ハーバー ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）発行、１９８９年等記載の遺伝子工学的方法に準じてベクターにクローニングすることができる。
ベクターとしては、具体的には、大腸菌を宿主細胞とする場合には、例えばプラスミドpUC119(宝酒造（株）製)や、ファージミドpBluescriptII(ストラタジーン社製)等をあげることができる。出芽酵母を宿主細胞とする場合には、プラスミドpACT2(Clontech社製)などをあげることができる。また、哺乳類動物細胞を宿主細胞とする場合には、pRC/RSV、pRC/CMV(Invitrogen社製)等のプラスミド、ウシパピローマウイルスプラスミドpBPV(アマシャムファルマシア社製)、EBウイルスプラスミドpCEP4(Invitrogen社製)等のウイルス由来の自律複製起点を含むベクター、ワクシニアウイルス等のウイルスなどをあげることができる。昆虫類動物細胞（以下、昆虫細胞と記す。）を宿主細胞とする場合には、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスをあげることができる。
【００１４】
本遺伝子の上流に、宿主細胞で機能可能なプロモーターを機能可能な形で結合させ、これを上述のようなベクターに組み込むことにより、本遺伝子を宿主細胞で発現させることの可能な発現ベクターを構築することができる。ここで、「機能可能な形で結合させる」とは、本遺伝子が宿主細胞に導入された際に、宿主細胞においてプロモーターの制御下に発現されるように、当該プロモーターと本遺伝子とを結合させることを意味する。宿主細胞で機能可能なプロモーターとしては、例えば、宿主細胞が大腸菌である場合には、大腸菌のラクトースオペロンのプロモーター（lacP）、トリプトファンオペロンのプロモーター(trpP)、アルギニンオペロンのプロモーター(argP)、ガラクトースオペロンのプロモーター(galP)、tacプロモーターもしくはtrcプロモーター等の大腸菌内で機能可能な合成プロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、λファージのプロモーター(λ-pL、λ-pR)等をあげることができる。また、宿主細胞が動物細胞や分裂酵母である場合には、例えば、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、シミアンウイルス(SV40)の初期もしくは後期プロモーター、マウス乳頭腫ウイルス(MMTV)プロモーター等をあげることができる。宿主細胞が出芽酵母である場合には、ADH1プロモーターなどをあげることができる。
一般的には、宿主細胞で機能可能なプロモーターと本遺伝子とが機能可能な形で接続されてなるＤＮＡを、宿主細胞で利用可能なベクターに組込んで、これを宿主細胞に導入する。宿主細胞において機能可能なプロモーターをあらかじめ保有するベクターを使用する場合には、ベクター保有のプロモーターと本遺伝子とが機能可能な形で結合するように、該プロモーターの下流に本遺伝子を挿入すればよい。例えば、前述のプラスミドpRC/RSV,pRC/CMV等は、動物細胞で機能可能なプロモーターの下流にクローニング部位が設けられており、該クローニング部位に本遺伝子を挿入し動物細胞へ導入することにより、本遺伝子を発現させることができる。また、前述の酵母用プラスミドpACT2はADH1プロモーターを有しており、該プラスミドまたはその誘導体のADH1プロモーターの下流に本遺伝子を挿入すれば、本遺伝子を例えばCG1945(Clontech社製)等の出芽酵母内で発現させることが可能な発現ベクターが構築できる。マーカー遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等の抗生物質耐性付与遺伝子など）を含むベクターを用いると、本遺伝子が導入された形質転換体を当該マーカー遺伝子の表現型等を指標にして選択する際に便利である。
【００１５】
本遺伝子が組み込まれたベクター（以下、本ベクターと記すこともある。）を宿主細胞へ導入する方法としては、宿主細胞に応じた通常の導入方法を適用することができる。例えば、大腸菌を宿主細胞とする場合には、「モレキュラー・クローニング」（J.Sambrookら、コールド・スプリング・ハーバー、１９８９年）等に記載される塩化カルシウム法やエレクトロポレーション法等の通常の方法を用いることにより本ベクターを宿主細胞へ導入することができる。また、哺乳類動物細胞または昆虫細胞を宿主細胞とする場合には、例えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、エレクトロポレーション法またはリポフェクション法等の一般的な遺伝子導入法により前記細胞に本ベクターを導入することができる。酵母菌を宿主細胞とする場合には、例えば、リチウム法を基にしたYeast transformation kit(Clontech社製)などを用いて導入することができる。本ベクターが導入された形質転換体を選抜するには、例えば、本ベクターと同時に下記のようなマーカー遺伝子を宿主細胞に導入し、導入されたマーカー遺伝子の性質に応じた方法で本ベクターが導入された宿主細胞を培養すればよい。例えば、当該マーカー遺伝子が、宿主細胞に致死活性を示す選抜薬剤に対する薬剤耐性を付与する遺伝子（薬剤耐性付与遺伝子）である場合には、該薬剤を添加した培地を用いて、本ベクターが導入された宿主細胞を培養すれば良い。薬剤耐性付与遺伝子と選抜薬剤との組み合わせとしては、例えば、ネオマイシン耐性付与遺伝子とネオマイシンとの組み合わせ、ハイグロマイシン耐性付与遺伝子とハイグロマイシンとの組み合わせ、ブラストサイジンＳ耐性付与遺伝子とブラストサイジンＳとの組み合わせ等をあげることができる。また、当該マーカー遺伝子が宿主細胞の栄養要求性を相補する遺伝子である場合には、該栄養素を含まない最少培地を用いて、本ベクターが導入された細胞を培養すればよい。
【００１６】
上述のようにして得られた本ベクターが導入された形質転換体（以下、本形質転換体と記すこともある。）を培養することにより本遺伝子にコードされる本蛋白質を産生させることができる。
例えば、本形質転換体が微生物である場合には、形質転換体は、通常、一般微生物における培養に使用される炭素源や窒素源、有機ないし無機塩等を適宜含む各種の培地を用いて培養される。培地のｐＨは約６〜約８程度が一般的である。培養は、一般微生物における通常の方法に準じて行い、固体培養、液体培養（試験管振とう式培養、往復式振とう培養、ジャーファーメンター（Jar Fermenter）培養、タンク培養等）などが可能である。培養温度は、微生物が生育する範囲で適宜変更できるが、例えば、約１５℃〜約４０℃の培養温度で培養するのが一般的である。培養時間は、種々の培養条件によって異なるが、通常約１〜約５日間である。温度シフト型やIPTG誘導型等の誘導型の発現ベクターを用いた場合には誘導時間は１日以内が望ましく、通常数時間程度である。
また、本形質転換体が哺乳類や昆虫類等の動物細胞である場合には、形質転換体は、通常、一般の培養細胞における培養に使用される培地を用いて培養することができる。本形質転換体の選択に選抜薬剤を用いた場合には、当該選抜薬剤の存在下に培養するのが望ましい。哺乳類動物細胞の場合には、例えば、終濃度が10%となるようFBSが添加されたＤ−ＭＥＭ培地（ニッスイ社製等）を用い、３７℃、５％CO2存在下等の条件下で数日毎に新しい培養液に交換しながら培養すればよい。細胞がコンフルエントになるまで増殖したら、例えば０．２５(w/v)％程度のトリプシンPBS溶液を加えて個々の細胞に分散させ、得られた細胞の懸濁液を数倍に希釈して新しいぺトリディッシュに播種し継代を続ける。昆虫類動物細胞の場合も同様に、例えば10(v/v)%FBSおよび2(w/v)%Yeastlateを含むGrace's medium等の昆虫細胞用培地を用いて約２５℃〜約３５℃の培養温度で培養すればよい。
本形質転換体を培養することにより産生された本蛋白質は、蛋白質の通常の単離、精製の方法を適宜組み合わせて回収することができる。例えば、培養終了後、本形質転換体の細胞を遠心分離等で集め、必要に応じて、集められた該細胞を適宜バッファーに懸濁した後、ポリトロン、超音波処理、ダウンスホモジナイザー等で破砕する。得られた破砕液から、遠心分離、メンブレンフィルターろ過等により不溶物を除去して無細胞抽出液を調製し、これをイオン交換，疎水，ゲルろ過、アフィニティ等の各種クロマトグラフィーに供することにより、本蛋白質を精製することができる。この際、本蛋白質が結合するＤＮＡが有する塩基配列（例えば、後述の実施例に記載されるようなＹＢ−１結合配列）を含む約２０塩基から約２００塩基程度の長さのオリゴヌクレオチドをプローブとしたDNA結合アッセイなどにより、本蛋白質を含む画分を見分けることもできる。また、本蛋白質を、そのＮ末端側やＣ末端側に、例えば６〜１０個のヒスチジンが並んだアミノ酸配列が融合された形で発現させると、金属キレート樹脂を用いたキレートクロマトグラフィーによって１段階で精製が可能となる。
このようにして、本発明蓄積抑制剤（I）の有効成分となる本蛋白質を調製することができる。
【００１７】
本発明蓄積抑制剤（I）は、その有効量を経口的又は非経口的にヒト等の哺乳動物に対し投与することができる。例えば、経口的に投与する場合には、本発明蓄積抑制剤（I）は錠剤、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の通常の形態で使用することができる。前記形態の本発明蓄積抑制剤(I)を非経口的に投与する方法としては、例えば、注射（皮下、静脈内等）、経皮投与、直腸投与等を挙げることができる。前記の適当な投与剤型は薬学的に許容される、例えば、賦型剤、結合剤、安定剤、希釈剤等の通常の担体に本蛋白質を配合することにより製造することができる。必要に応じて、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、保存剤、着色剤、香料、保湿剤、防腐剤、酸化防止剤等の補助剤を添加してもよい。また注射剤型で用いる場合には、薬学的に許容される、例えば、水溶性溶剤、非水溶性溶剤、緩衝剤、溶解補助剤、等張剤、安定剤等の担体に本蛋白質を配合することにより製造することができる。必要に応じて、防腐剤、懸濁化剤、乳化剤等の補助剤を添加してもよい。また、非経口的に投与する場合には、本発明蓄積抑制剤（I）を溶液、乳剤、懸濁液等の通常の液剤・ローション剤の形態や軟膏剤、ゲル状経皮吸収剤等の通常の半固体剤の形態で使用することができる。さらに担体として徐放性ポリマー等を用いた徐放性製剤（例えば、本発明蓄積抑制剤（I）をエチレンビニル酢酸ポリマーのペレットに取り込ませた製剤。当該ペレットを治療すべき組織中に外科的に移植するような形態で使用される。）の形態で使用してもよい。
投与量は、投与される哺乳動物の年令、性別、体重、疾患の程度、本発明蓄積抑制剤の種類、投与形態等によって異なるが、通常は経口の場合には成人で１日あたり有効成分量として約１ｍｇ〜約２ｇ、好ましくは有効成分量として約５ｍｇ〜約１ｇを投与すればよく、注射の場合には成人で有効成分量として約０．１ｍｇ〜約５００ｍｇを投与すればよい。また、前記の１日の投与量を１回または数回に分けて投与することができる。
本発明蓄積抑制剤（I）の適用可能な疾患としては、例えば、肝硬変、間質性肺疾患、慢性腎不全（又は慢性腎不全に陥る疾患）、炎症後の過形成痕跡、術後の瘢痕や熱傷性瘢痕、或いは強皮症、動脈硬化、高血圧、関節リウマチ等のコラーゲン過剰蓄積疾患（例えば線維症）等をあげることができる。
【００１８】
本発明蓄積抑制剤（II）の有効成分となる、本蛋白質をコードする核酸（即ち、本遺伝子）は、前述の如く調製すればよい。また、例えば、当該核酸を含有する組換えベクターの形態で使用されることもある。ベクターとしては、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連性ベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、ＳＶ４０ベクター、ポリオーマウイルスベクター、乳頭腫ウイルスベクター、ピコルナウイルスベクター及びワクシニアウイルスベクター等のウイルスベクターをあげることができる。アデノウイルスベクターを使用する場合には、例えばＱＵＡＮＴＵＭ社製のＡｄＥａｓｙ Ｋｉｔを用い、本遺伝子をＴｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒのマルチクローニングサイトに組み込み、得られた組換えベクターを直線化した後に、ｐＡｄＥａｓｙ ｖｅｃｔｏｒと共に大腸菌にトランスフォームし、相同組換え体ＤＮＡをヒト２９３Ａ細胞に組み込むことにより、本遺伝子を含有する組換えウイルスを産生させ、これを回収し、使用することもできる。
また、ヒトサイトメガウイルスのプロモーター／エンハンサー領域を有するプラスミドＤＮＡ等のような非ウイルス系のベクターを用いることもできる。本遺伝子を線維化組織部位に直接注入する場合のように、非ウイルスベクターを用いて本遺伝子を局所的に送達するシステムにおいては、プラスミドＤＮＡの使用は有益である。体外に取り出された細胞に発現ベクターを導入して体内に戻す方法、すなわち、ｅｘ ｖｉｖｏ法を使えば、あらゆる既知の導入方法が利用可能である。例えば、ａ）直接注入、ｂ）リポソームを介する形質導入、ｃ）リン酸カルシウム法・エレクトロポレーション法・ＤＥＡＥ−デキストラン法による細胞トランスフェクション、ｄ）ポリブレンを介した送達、ｅ）プロトプラスト融合、ｆ）マイクロインジェクション、ｇ）ポリリシンを使った形質導入などによって、非ウイルスベクターを導入することができる。
【００１９】
本発明蓄積抑制剤（II）は、その有効量を非経口的にヒト等の哺乳動物に対し投与することができる。例えば、非経口的に投与する方法としては、例えば、上述のような注射（皮下、静脈内等）等を挙げることができる。前記の適当な投与剤型は薬学的に許容される、例えば、水溶性溶剤、非水溶性溶剤、緩衝剤、溶解補助剤、等張剤、安定剤等の担体に本遺伝子（ベクター型もしくはウィルス型、又はプラスミド型の本遺伝子の形態を含む）を配合することにより製造することができる。必要に応じて、防腐剤、懸濁化剤、乳化剤等の補助剤を添加してもよい。また、非経口的に投与する場合には、本発明蓄積抑制剤（II）を溶液等の通常の液剤の形態で使用することができる。
投与量は、投与される哺乳動物の年令、性別、体重、疾患の程度、本発明蓄積抑制剤の種類、投与形態等によって異なるが、通常は、患者細胞において前述の本発明蓄積抑制剤（I）を投与した場合における本蛋白質の細胞内レベルと等しい、本蛋白質の細胞内レベルをもたらす有効成分量を投与すればよい。また、前記の１日の投与量を１回または数回に分けて投与することができる。
本発明蓄積抑制剤（II）の適用可能な疾患としては、例えば、肝硬変、間質性肺疾患、慢性腎不全（又は慢性腎不全に陥る疾患）、炎症後の過形成痕跡、術後の瘢痕や熱傷性瘢痕、或いは強皮症、動脈硬化、高血圧、関節リウマチ等のコラーゲン過剰蓄積疾患（例えば線維症）等をあげることができる。
【００２０】
本発明は、哺乳動物細胞に、本蛋白質をコードする外来遺伝子を、当該外来遺伝子が前記細胞で発現する位置に置かれるように提供する工程を有することを特徴とする哺乳動物におけるコラーゲン蓄積抑制方法［本発明蓄積抑制方法（I）］も提供している。
哺乳動物細胞としては、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター等の哺乳動物由来の細胞を挙げることができる。当該細胞は、組織から分離された細胞や、同一の機能・形態を持つ集団を形成している細胞や、前記哺乳動物の体内にある細胞であってもよい。
従って、哺乳動物がヒトである場合には、一般にいう遺伝子治療が施されたヒトの細胞から各種実験に使用されるような株化細胞までを意味し、また哺乳動物が非ヒト動物である場合には、一般にいう遺伝子治療が施された非ヒト動物の細胞から各種実験に使用されるようなモデル動物の細胞や株化細胞までを意味する。後者の場合には、ラット、マウス等を好ましい動物種として挙げることができる。
本蛋白質をコードする外来遺伝子の調製方法は、前述の「本蛋白質の調製方法（本蛋白質をコードする遺伝子の調製方法を含む）」において説明されたものと同等な方法に準じて調製すればよい。
このように調製された外来遺伝子を用いて後述のように形質転換細胞を調製することにより、当該外来遺伝子が哺乳動物細胞で発現する位置に置かれるように提供された形質転換細胞を得ることができる。
本発明蓄積抑制方法（I）において「発現する位置に置かれた」とは、ＤＮＡ分子が、その塩基配列からの転写及び翻訳を指向する（即ち、例えば、本蛋白質をコードするＲＮＡおよび本蛋白質の産生を促進するような）塩基配列と隣接した位置に置かれていることを意味する。
本蛋白質の遺伝子の発現レベルは、本蛋白質の遺伝子が導入されていない細胞と比較してコラーゲン蓄積を抑制するために十分である量であればよい。この場合、本蛋白質をコードする外来遺伝子は、本蛋白質の全体又は一部をコードする外来遺伝子であってもよい。
上記のコラーゲン蓄積抑制方法において、本蛋白質をコードする外来遺伝子がゲノムに組み込まれた形質転換細胞を作製することによりコラーゲン蓄積を抑制してもよい。
【００２１】
上記のコラーゲン蓄積抑制方法において、本蛋白質をコードする外来遺伝子を哺乳動物細胞に導入するために用いられる遺伝子構築物（以下、本遺伝子構築物と記載することもある。）及び遺伝子移入到達手段には、当該外来遺伝子が導入される哺乳動物細胞に対して親和性を有する、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター又はその他のウイルスベクターを用いることができる。具体的には例えば、ミラー(Miller)，Human Gene Therapy 15〜14，1990;フリードマン(Friedman)，Science 244:1275〜1281，1989;エグリティス(Eglitis)およびアンダーソン(Anderson)，BioTechniques 6:608〜614，1988;トルストシェフ(Tolstoshev)およびアンダーソン(Anderson)，current opinion in Biotechnology 1;55〜61，1990;シャープ(Sharp)，The Lancet 337:1277〜1278，1991;コルネッタ(Cornetta)ら、Nucleic Acid Research and Molecular Biology 36:311〜322，1987;アンダーソン(Anderson)，Science 22-:401〜409，1984;モーン(Moen)，Blood Cells 17:407〜416，1991;ミラー(Miller)ら、Biotechniques 7:980〜990，1989;Le Gai La Salleら、Science 259:988〜990，1993;およびジョンソン(Johnson)，Chest 107:77S〜83S，1995等に記載される公知のベクターをあげることができる。ローゼンバーグ(Rosenberg)ら、N．Engl．J．Med 323:370，1990;アンダーソン(Anderson)ら、米国特許第5,399,346号等に記載されるレトロウイルスベクターは特に開発が進んでおり、臨床の場でもすでに使用されている。
また、そのままではコラーゲン過剰蓄積が起こると予想される細胞内に本蛋白質をコードする外来遺伝子（DNA）を導入するためには、非ウイルス的手法も用いることができる。例えば、フェルグナー(Felgner)ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:7413，1987;オノ(Ono)ら、Neurosci．Lett．117:259，1990;ブライアム(Brigham)ら、Am．J．Med．Sci．298:278，1989;シュタウビンガー(Staubinger)ら、Meth．Enz．101:512，1983）、アシアロソヌコイド・ポリリジン抱合（ウー(Wu)ら、J．Biol．Chem．263:14621，1988;ウー(Wu)ら、J．Biol．Chem．264:16985，1989等に記載されるリポフェクション、ウォルフ(Wolff)ら、Science 247:1465，1990等に記載されるマイクロインジェクション、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、エレクトロポレーション法及びプロトプラスト融合法、リポソーム法等があげられる。
本遺伝子構築物において、当該外来遺伝子は、本蛋白質の遺伝子を構成的に発現させるようなプロモーターの制御下に置かれていてもよい。例えば、ＳＶ４０ウイルスプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶプロモーター）、Raus Sarcoma Virusプロモーター（ＲＳＶプロモーター）、βアクチン遺伝子プロモーター等が挙げられる。また、当該外来遺伝子は、本蛋白質の遺伝子の発現を環境刺激により調節するようなプロモーターの制御下に置かれていてもよい。例えば、外来遺伝子は、組織特異的もしくは細胞型特異的なプロモーター、又は化学的信号もしくは薬物等の外来性の信号もしくは薬物の導入により活性化されるプロモーターを用いて発現させてもよい。尚、このようなプロモーターをマルチクローニング部位の上流に含む市販のベクターを利用することもできる。
【００２２】
上記のコラーゲン蓄積抑制方法を遺伝子治療の手段として応用する場合には、上記の適用手段のいずれについても、本遺伝子構築物は、コラーゲン過剰蓄積が予想される部位に対して適用される（例えば、注入によって）ことがよい。また、コラーゲン過剰蓄積等の現象が予想される部位の近傍の組織又はコラーゲン過剰蓄積が起こると予想される細胞に供給される血管に対してそれを適用してもよい。また、本蛋白質をコードする遺伝子を導入しようとする動物にとって外因性又は内因性の培養可能な細胞に、本蛋白質の遺伝子をトランスフェクションし、次いで、トランスフェクションされた細胞を血清学的に標的組織に対して注入することもできる。
理想的には、かかる遺伝子治療の手法により、少なくとも正常細胞における本蛋白質の細胞内レベルと同等の、本蛋白質の細胞内レベルがもたらされるとよい。
【００２３】
以下に、一例として、哺乳動物が形質転換非ヒト動物である場合の本発明蓄積抑制方法（I）についてより詳細に説明する。
形質転換非ヒト動物の作製における本遺伝子の導入法としては、例えば、マイクロインジェクション法、レトロウイルスを用いる方法、胚性未分化細胞（ＥＳ細胞）を用いる方法等を挙げることができる。このうち、マイクロインジェクション法が最も汎用されている。マイクロインジェクション法とは、マイクロマニピュレーターを用いて、顕微鏡下で受精卵の前核内部に外来遺伝子を含んだ溶液を注入する方法である。
まず、本遺伝子を受精卵に注入する。その際、遺伝子を高い確率で染色体へ組込むためには、本遺伝子の単離に用いたベクター領域を可能な限り除去すること、ｍＲＮＡの不安定化に寄与するＡＵに富む領域を除くこと、直鎖状にすることが好ましい。また、本遺伝子に対してイントロンを予め挿入しておくことが好ましく、当該イントロンとしては、例えば、β−グロビンイントロン等を挙げることができる。
受精卵は、目的に応じた系統の非ヒト動物から採取する。例えば、マウスの場合には、近交系のＣ５７ＢＬ／６マウスやＣ３Ｈマウス、あるいはＣ５７ＢＬ／６マウスと他系統のマウスとの交雑系（例えば、（Ｃ５７ＢＬ／６ｘＤＢＡ／２）Ｆ1等）、非近交系のＩＣＲマウスを用いることができる。受精卵は、通常、妊馬血清ゴナドトロピンとヒト絨毛性ゴナドトロピンとの両者の腹腔内投与により過剰排卵を誘発させた雌マウスと雄マウスとを交尾させた後、前記雌マウスから採取する。尚、採取した受精卵は培養用ドロップに入れ、ＣＯ2ガスインキュベーターで培養・維持することにより、本遺伝子の注入操作まで保管することができる。
本遺伝子の注入はマイクロマニピュレーターをセットした倒立顕微鏡下で行なう。用いられる受精卵としては、雄性前核が雌性前核より大きくなる頃から両前核が融合するまでの発達段階にあるものを用いるとよい。まず受精卵を固定し、当該受精卵の雄性前核内に本遺伝子を含有するＤＮＡ溶液を注入する。当該ＤＮＡ溶液は必要に応じて複合体として調製する。複合体形成に用いられる物質としては、リポソーム、リン酸カルシウム、レトロウイルス等を挙げることができる。ＤＮＡ溶液の注入は雄性前核が膨らむことにより確認できる。ＤＮＡ注入量としては、例えば、約２００〜約３，０００コピーの本遺伝子を含む量を挙げることができる。
【００２４】
このようにして、本遺伝子が注入された受精卵は胚盤胞になるまで前記と同様にして培養した後、仮親の子宮に移植する。好ましくは本遺伝子の注入操作後ただちに仮親の卵管に移植するとよい。仮親としては、マウスの場合には、精管切断手術を施した雄マウスと交尾させて偽妊娠状態にしたＩＣＲ雌マウスを用いるとよい。具体的には、まず当該ＩＣＲ雌マウス背側の腎臓付近の皮膚と筋層を切開して卵巣・卵管・子宮を引き出し、卵巣膜を破いて卵管口を探し出す。次いで本遺伝子の注入操作後に生き残った受精卵を該卵管口から移入し、卵巣・卵管・子宮を腹腔内に戻した後、筋層を縫合し、皮膚をクリップでとめる。約２０日後に仔が生まれる。
得られた仔の体組織の一部、例えば尾の一部、を切り取り、当該部位から抽出されたＤＮＡのサザンブロッティング等により本遺伝子の存在有無を確認する。このようにして、本遺伝子が非ヒト動物に導入されたことを確認できる。あるいは他の方法、例えばＰＣＲなどの確認方法を利用してもよい。
【００２５】
このようにして構築された形質転換非ヒト動物を、本蛋白質を発現する細胞として後述のような本発明探索方法に利用する場合において、当該形質転換非ヒト動物への被験物質の投与は、通常の方法を用いればよい。例えば、被験物質を飼料や飲水に混合する方法や、直接投与する方法（例えば静脈内投与や、筋肉内、皮内、皮下もしくは腹腔内投与）が挙げられる。また、必要に応じて、被験物質を投与する前に予備飼育を行ってもよい。投与量および投与期間は、動物の種類、週齢、採用される投与方法等により適宜選択することができるが、例えば、げっし類動物等の非ヒト動物に対する腹腔内投与の場合には、約０．１ｍｇ／ｋｇ−体重／日〜約１０ｍｇ／ｋｇ−体重／日、げっし類動物等の非ヒト動物に対する経口投与の場合には、約１ｍｇ／ｋｇ−体重／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ−体重／日の被験物質を２〜４週間程度投与すればよい。
【００２６】
上記方法のうち、コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子が細胞の外に存在する条件下において、当該細胞に前記外来遺伝子を提供することもできる。このような条件としては、例えば、コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子が細胞外に、下記のようなコラーゲン過剰蓄積に起因する疾患と診断されうる哺乳動物の体内、例えば、線維症に羅患していると診断されうる哺乳動物の体内、における当該因子の存在量と同等な量存在するような条件をあげることができる。
ここで、「コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子」とは、細胞が有するコラーゲン合成機構において、コラーゲン遺伝子の転写を活性化させるように作用する物質を意味し、例えば、ＤＮＡ結合蛋白質依存的コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子を挙げることができる。
上記のＤＮＡ結合蛋白質としては、例えば、ＡＰ−１、Ｓｍａｄ等を挙げることができる。このような蛋白質は、通常、細胞内に存在しており、細胞外からの刺激等が引き金になって活性型（リン酸化状態）に変化することでコラーゲン遺伝子の上流領域に存在する発現調節領域に結合する。この結合によりコラーゲン遺伝子の転写が活性化される。
具体的には、コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子としてＴＧＦ−βを挙げることができる。
【００２７】
本発明は、コラーゲン過剰蓄積に起因する疾患と診断されうる哺乳動物の体内にある細胞、例えば、線維症に羅患していると診断されうる哺乳動物の体内にある細胞に、本蛋白質を投与する工程を有することを特徴とするコラーゲン蓄積抑制方法も提供する。
コラーゲン過剰蓄積に起因する疾患としては、例えば、肝硬変、間質性肺疾患、慢性腎不全（又は慢性腎不全に陥る疾患）、炎症後の過形成痕跡、術後の瘢痕や熱傷性瘢痕、或いは強皮症、動脈硬化、高血圧、関節リウマチ等のコラーゲン過剰蓄積疾患（例えば線維症）等をあげることができる。
ここで「本蛋白質を投与する」には、本蛋白質を前述のような本発明蓄積抑制剤（I）の形態にして直接的に投与してもよいし、また前述のような本発明蓄積抑制方法（I）の形態にて、目的とする細胞に本遺伝子を導入して発現させ本蛋白質を産生させることにより投与してもよい。尚、後者の場合には、本蛋白質の細胞内レベルが、例えば、前者の場合における本蛋白質の細胞内レベルと同等となるように投与すればよい。
【００２８】
本発明は、哺乳動物細胞に、コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子が前記細胞外に存在する条件下において、本蛋白質を投与する工程を有することを特徴とするコラーゲン蓄積抑制方法［本発明蓄積抑制方法（II）］も提供している。
ここで、「哺乳動物細胞」や「コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子が前記細胞外に存在する条件」とは、前述の本発明蓄積抑制方法（I）において説明されたものと同様である。
本発明は、Ｉ型コラーゲン遺伝子を有する細胞に、本蛋白質を投与する工程を有することを特徴とするコラーゲン蓄積抑制方法［本発明蓄積抑制方法（III）］も提供している。
ここで、Ｉ型コラーゲン遺伝子を有する細胞とは、I型コラーゲン遺伝子を有し、コラーゲン遺伝子の転写、当該転写によって生じるｍＲＮＡの翻訳、当該翻訳によって生じるコラーゲン蛋白質の複合体形成、当該複合体形成によって生じる成熟型コラーゲンの分泌等の一連のコラーゲン合成機構が機能する細胞である。
当該細胞に本蛋白質を投与するには、本蛋白質を前述のような本発明蓄積抑制剤（I）の形態にして直接的に投与してもよいし、また前述のような本発明蓄積抑制方法（I）の形態にて、目的とする細胞に本遺伝子を導入して発現させ本蛋白質を産生させることにより投与してもよい。尚、後者の場合には、本蛋白質の細胞内レベルが、例えば、前者の場合における本蛋白質の細胞内レベルと同等となるように投与すればよい。。
上記方法において、コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子が前記細胞外に存在する条件下に、本蛋白質を投与することもできる。尚、「コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子が前記細胞外に存在する条件」とは、前述の本発明蓄積抑制方法（I）において説明された条件と同様である。
【００２９】
本発明は、Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を調節する物質の探索方法であって、
（１）本蛋白質を発現する細胞に、被験物質を接触させる第一工程、
（２）前記第一工程後に、本蛋白質の細胞核内への移行量又はその量と相関関係を有する指標値を測定する第二工程、
（３）第二工程により測定された移行量又はその量と相関関係を有する指標値に基づき前記物質のＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を評価する第三工程、及び
（４）前記第三工程で評価されたＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能に基づきＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を有する物質を選抜する第四工程
を有することを特徴とする探索方法［本発明探索方法（I）］も提供している。
本蛋白質の細胞核内への移行量又はその量と相関関係を有する指標値を測定するには、例えば、被験物質と接触した後の細胞から、通常の方法に準じて細胞核画分を分離し、分離された細胞核画分内に存在する本蛋白質の量又はその量と相関関係を有する指標値を測定すればよい。また、例えば、被験物質と接触した後の細胞を蛍光顕微鏡等にて観察することにより、細胞核内に存在する（蛍光標識された）本蛋白質の量又は本蛋白質の量と相関関係を有する（蛍光）指標値を測定してもよい。
【００３０】
本蛋白質の細胞核内への移行量を測定する場合において用いられる細胞としては、例えば、ヒト由来の本蛋白質を発現する細胞を好ましいものとして挙げることができる。また本蛋白質の細胞核内への移行量と相関関係を有する指標値を測定する場合において用いられる細胞としては、本蛋白質の細胞核内への移行量と相関関係を有する指標値を提供可能とする外来性マーカー蛋白質を発現する細胞を挙げることができる。使用可能な外来性マーカー蛋白質としては、具体的には、本蛋白質とGreen Fluorescent Protein（以下、ＧＦＰと記す。）との融合蛋白質等が挙げられる。
例えば、本蛋白質のアミノ酸配列とＧＦＰのアミノ酸配列とを有する蛋白質を発現する細胞を調製する。まず、本蛋白質のアミノ酸配列をコードしかつ終止コドンを含まないＤＮＡ、及び、開始コドンを除くＧＦＰのアミノ酸配列を有するＤＮＡを、それぞれの塩基配列に基づいて作製されたオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行うこと等により調製する。調製されたＤＮＡを、本蛋白質のアミノ酸配列の下流にＧＦＰのアミノ酸配列が読み枠が連続する形でコードされ、かつラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）プロモーター、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーター等のプロモーターと発現可能な形で接続されるように、ベクターに挿入する。例えば、前記プロモーターを有しかつその下流に遺伝子挿入部位とＧＦＰのアミノ酸配列をコードする塩基配列とを有する市販のベクターを利用してもよい。このようにして得られる本蛋白質のアミノ酸配列とＧＦＰのアミノ酸配列とを有する蛋白質を発現させるためのベクターを、繊維芽細胞等の細胞に導入することにより、当該蛋白質を発現する細胞を取得する。
得られた細胞を培養して、これに被験物質を接触させた後、蛍光顕微鏡でＦＩＴＣフィルターを用いて観察することにより、核内の蛍光の有無を検出する。被験物質と接触させた細胞における核内の蛍光量が、溶媒のみと接触させた細胞（対照区）の核内の蛍光量よりも多い場合には、当該被験物質が、Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写調節能（この場合には、転写抑制能である。）を有すると評価することができる。
【００３１】
本発明は、Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を調節する物質の探索方法であって、
（１）Ｉ型コラーゲン遺伝子を有し、かつ、本蛋白質をコードする外来遺伝子を当該外来遺伝子が細胞で発現する位置に置かれるように提供されてなる細胞に、異なる２種以上の被験物質を独立して接触させる第一工程
（２）前記第一工程後に、コラーゲン蓄積量を独立してモニターする第二工程、
（３）第二工程により独立してモニターされたコラーゲン蓄積量を互いに比較することにより得られる差異に基づき前記物質のＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を評価する第三工程、
（４）前記第三工程で評価されたＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能に基づきＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を有する物質を選抜する第四工程、
を有することを特徴とする探索方法［本発明探索方法（II）］も提供している。
「Ｉ型コラーゲン遺伝子を有し、かつ、本蛋白質をコードする外来遺伝子を当該外来遺伝子が細胞で発現する位置に置かれるように提供されてなる細胞」とは、、I型コラーゲン遺伝子を有し、コラーゲン遺伝子の転写、当該転写によって生じるｍＲＮＡの翻訳、当該翻訳によって生じるコラーゲン蛋白質の複合体形成、当該複合体形成によって生じる成熟型コラーゲンの分泌等の一連のコラーゲン合成機構が機能する細胞に、前述の本発明蓄積抑制方法（I）で用いられる形質転換細胞のように、本蛋白質をコードする外来遺伝子が発現されるような形質転換を施すことによって得られる細胞である。当該細胞では、細胞内で発現された本蛋白質によりコラーゲン遺伝子の転写が抑制されるために、上記のような一連のコラーゲン合成機構が正常に機能しない。そこで、被験物質の作用によって当該細胞が有する一連のコラーゲン合成機構が正常に機能するように回復する変化を、コラーゲン蓄積量をモニターすることによって調べれば、Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を有する物質の探索に利用できる。
上記方法のうち、第一工程が、コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子が前記細胞外に存在する条件下でなされてもよい。尚、「コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子が前記細胞外に存在する条件」とは、前述の本発明蓄積抑制方法（I）において説明された条件と同様である。
【００３２】
本発明は、Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を調節する物質の探索方法であって、
（１）（ａ）転写開始に必要な塩基配列を含む、Ｉ型コラーゲン遺伝子の発現調節領域を機能可能な形で連結されてなるレポーター遺伝子を含有する細胞と、（ｂ）転写開始に必要な塩基配列を含み、かつ本蛋白質との結合能力を有さない塩基配列を機能可能な形で連結されてなるレポーター遺伝子を含有する細胞との両細胞に、被験物質を独立して接触させる第一工程、
（２）前記第一工程後に、レポーター遺伝子の発現量を独立してモニターする第二工程、及び
（３）第二工程により独立してモニターされた発現量を互いに比較することにより得られる差異に基づき前記物質のＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を評価する第三工程、及び
（４）前記第三工程で評価されたＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能に基づきＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を有する物質を選抜する第四工程
を有することを特徴とする探索方法［本発明探索方法（III）］も提供している。
【００３３】
「（a）転写開始に必要な塩基配列を含み、Ｉ型コラーゲン遺伝子の発現調節領域を機能可能な形で連結されてなるレポーター遺伝子」は、例えば、上流から順に、Ｉ型コラーゲン遺伝子の発現調節領域（即ち、本蛋白質との結合能を有する塩基配列）、転写開始に必要な塩基配列及びレポーター蛋白質をコードする塩基配列が位置するように、これらの塩基配列を有するＤＮＡを機能可能な形で連結することにより調製することができる。
当該レポーター遺伝子に用いられる「Ｉ型コラーゲン遺伝子の発現調節領域の塩基配列」としては、例えば、配列番号２で示される塩基配列、ヒトコラーゲンα２（Ｉ）鎖遺伝子（ＣＯＬ１Ａ２）のプロモーター領域の−１６１から−１２５まで（転写開始点を＋１とする。）の塩基配列（配列番号３で示される塩基配列）等をあげることができる。かかる塩基配列と本蛋白質とが結合すると、該塩基配列を有する上記レポーター遺伝子の転写が抑制される。
そして、「Ｉ型コラーゲン遺伝子の発現調節領域」の下流に「転写開始に必要な塩基配列」が位置する塩基配列として、例えば、ヒトコラーゲンα２（Ｉ）鎖遺伝子（ＣＯＬ１Ａ２）の５’上流領域（例えば、転写開始点を１として、−１６１番目の塩基〜＋５７番目の塩基を含む領域（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮｏＪ０３４６４、Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌ．，１６：４４７，１９９８）の塩基配列を挙げることができる。当該塩基配列を有するＤＮＡと、レポーター蛋白質をコードする塩基配列を有するＤＮＡとを連結することによりＩ型コラーゲン遺伝子の発現調節領域、転写開始に必要な塩基配列及びレポーター蛋白質をコードする塩基配列を含むレポーター遺伝子（以下、本蛋白質による転写調節を受けるレポーター遺伝子と記すこともある。）のＤＮＡを調製することができる。
【００３４】
「（ｂ）転写開始に必要な塩基配列を含み、かつ本蛋白質との結合能力を有さない塩基配列を機能可能な形で連結されてなるレポーター遺伝子」は、例えば、上流から順に、本蛋白質との結合能を示さない塩基配列、転写開始に必要な塩基配列及びレポーター蛋白質をコードする塩基配列が位置するように、これらの塩基配列を有するＤＮＡを機能可能な形で連結することにより調製することができる。
当該レポーター遺伝子に用いられる「本蛋白質との結合能を示さない塩基配列」としては、例えば、前記の「Ｉ型コラーゲン遺伝子の発現調節領域の塩基配列が有する本蛋白質との結合能が消失するように、当該塩基配列の一部が置換されるか又は欠失した塩基配列等を挙げることができる。具体的には、例えば、配列番号２５で示される塩基配列、配列番号４で示される塩基配列等をあげることができる。尚、所定の塩基配列を有するＤＮＡと本蛋白質との結合能は、前記配列を有する標識されたＤＮＡと本蛋白質との複合体の形成の有無を検出するゲルシフトアッセイ等の通常の方法により調べることができる。「転写開始に必要な塩基配列」としては、例えば、ＴＡＴＡボックスをあげることができる。具体的には、チミジンキナーゼ遺伝子（ｔｋ）の５’上流領域の塩基配列等があげられる。かかる塩基配列を有するＤＮＡは、化学合成するか、ＰＣＲにより増幅しクローニングすること等により調製することができる。
そして前述と同様の方法により、本蛋白質との結合能を示さない塩基配列、転写開始に必要な塩基配列及びレポーター蛋白質をコードする塩基配列を含むレポーター遺伝子（以下、本蛋白質による転写調節を受けないレポーター遺伝子と記すこともある。）のＤＮＡを調製することができる。
【００３５】
「レポーター遺伝子」にコードされるレポーター蛋白質としては、当該蛋白質が有する酵素活性等に基づき当該蛋白質又はレポーター遺伝子の発現量の測定が可能となるような蛋白質が好ましい。例えば、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ等をあげることができる。このようなレポーター蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、これらのＤＮＡを含む市販のプラスミドのＤＮＡを制限酵素消化して目的とするＤＮＡを単離すること等により得ることができる。
【００３６】
次に、上記のようにして得られる「本蛋白質による転写調節を受けないレポーター遺伝子」を含むＤＮＡ及び「本蛋白質による転写調節を受けるレポーター遺伝子」を含むＤＮＡを、それぞれプラスミド等のベクターに組込んで、これをリポフェクション法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等の通常の方法によって細胞に導入し、これらのレポーター遺伝子がそれぞれ導入されてなる細胞を選抜する。ベクターとしては、大腸菌等の遺伝子工学的技術に適した微生物内で機能可能な複製起点及び薬剤耐性遺伝子を有するプラスミド等があげられる。このとき、これらのレポーター遺伝子が導入された細胞の選抜を容易にするために、薬剤耐性遺伝子等の選抜マーカー遺伝子を同時に導入してもよい。使用可能な薬剤耐性遺伝子としては、例えば、ネオマイシン耐性（アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ）遺伝子、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子等があげられる。
本発明探索方法（III）に使用可能な細胞としては、例えば、本蛋白質を含有する哺乳動物由来の細胞をあげることができ、好ましくは、ヒト組織由来の細胞をあげることができる。より具体的には、ヒト皮膚由来の繊維芽細胞等のＹＢ−１遺伝子内在性細胞があげられる。また、ヒトｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ細胞等の本蛋白質遺伝子非内在性細胞は、該細胞に、例えば本蛋白質をコードするＤＮＡを導入し発現させて使用すればよい。尚、本蛋白質をコードするＤＮＡは、上述のレポーター遺伝子を含むＤＮＡと同時に細胞へ導入されてもよいし、別々に導入されてもよい。例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する本蛋白質をコードするＤＮＡは、該ＤＮＡを増幅するためのオリゴヌクレオチドを、例えば配列番号２６で示される塩基配列に基づいて設計して作製し、作製されたオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行うことなどにより調製することができる。かかるＰＣＲにおいて鋳型としては、例えば、市販のヒト由来ｃＤＮＡを使用することができる。得られた本蛋白質をコードするＤＮＡを、例えば、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）プロモーター、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーター、シミアンウィルス（ＳＶ４０）の初期もしくは後期プロモーター等のプロモーターと発現可能な形で接続されるようにベクターに挿入して細胞に導入し、本蛋白質を発現する細胞を取得する。ベクターとしては、例えば、上記のようなプロモーターを有しその下流に遺伝子挿入部位を有する市販の発現用ベクター等を使用することができる。
【００３７】
次に、このようにして得られた細胞（両細胞）に、被験物質を（独立して）接触させる。当該工程において、当該細胞と接触させる被験物質の濃度は、例えば、約０．１μＭ〜約１００μＭであればよく、１μＭ〜５０μＭが好ましい。当該細胞と被験物質とを接触させる時間は、例えば、１時間以上５日間程度であり、好ましくは数時間から４日間程度が挙げられる。
この工程後に、レポーター遺伝子の発現量を（独立して）モニターする。レポーター遺伝子の発現量のをモニターする方法は、使用されるレポーター遺伝子にコードされるレポーター蛋白質の種類にもよるが、一般的には、測定対象の細胞に細胞溶解剤を添加することにより調製された細胞抽出液に含まれるレポーター蛋白質の量を測定すればよい。例えば、使用されたレポーター蛋白質が酵素活性を有する場合には、当該酵素に特異的な基質と当該酵素を含む細胞抽出液とを反応させた後、残存する基質の量又は反応産物の量を、その発光量、蛍光吸光度、吸光度等を指標にしてレポーター蛋白質の量を測定する。具体的には、例えば、レポーター蛋白質としてルシフェラーゼを用いた場合には、ルシフェラーゼの基質であるルシフェリンと細胞抽出液とを反応させると、細胞抽出液中のルシフェラーゼ量に比例した強度で発光する。従って、この発光強度をルミノメーター等の測定装置で測定することにより、細胞抽出液中のルシフェラーゼ量、又は、ルシフェラーゼ遺伝子の発現量を知ることができる。
次に、上記のようにしてモニターされた
（ｉ）被験物質と本蛋白質の転写調節を受けるレポーター遺伝子を有する細胞とを接触させてなるレポーター遺伝子の発現量、と
（ii）被験物質と本蛋白質の転写調節を受けないレポーター遺伝子を有する細胞とを接触させてなるレポーター遺伝子の発現量
との両者を互いに比較することにより得られる差異に基づき被験物質のＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を評価する。前者発現量が後者発現量よりも低い場合または高い場合には、当該被験物質はＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能に基づきＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能（低い場合には、本蛋白質依存的コラーゲン蓄積抑制経路の正の調節因子、高い場合には、本蛋白質依存的コラーゲン蓄積抑制経路の負の調節因子）を有する物質であると評価すればよい。
このように評価されたＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能に基づきＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を有する物質を選抜すればよい。
【００３８】
また、より精密な探索方法が要求される場合には、例えば、下記のような方法が適している。まず本蛋白質の転写調節を受けないレポーター遺伝子を有する細胞について、被験物質と接触させた場合における当該レポーター遺伝子の発現量の測定値と、溶媒のみと接触させた場合（対照区）における当該レポーター遺伝子の発現量の測定値とを比較する。両者の値が実質的に同等、具体的には例えば両者の比が約０．９〜約１．１程度の範囲内であれば、当該被験物質をＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を検定するために仮選択する。当該比が、例えば約０．９未満となる場合には、被験物質が細胞毒性を有する可能性等が考えられ、一方、例えば約１．１を超えるような場合には、被験物質が遺伝子の転写調節系に対して本蛋白質を介さずに作用している可能性等が考えられる。但し、被験物質を選択するために適した当該比の範囲は、検定に使用される細胞の性質や測定の条件によって異なり、前述の例示数値に限定されるものではない。
次いで、本蛋白質の転写調節を受けるレポーター遺伝子を有する細胞について、上記のようにして仮選択された被験物質と接触させた場合における当該レポーター遺伝子の発現量の測定値と、溶媒のみと接触させた場合（対照区）における当該レポーター遺伝子の発現量の測定値とを比較する。被験物質と接触させた細胞におけるレポーター遺伝子の発現量の測定値が、溶媒のみと接触させた細胞（対照区）の測定値よりも低い場合には、当該被験物質が本蛋白質依存的コラーゲン蓄積抑制経路の正の調節因子であると評価することができる。一方、被験物質と接触させた細胞におけるレポーター遺伝子の発現量の測定値が、溶媒のみと接触させた細胞（対照区）の測定値よりも高い場合には、当該被験物質が本蛋白質依存的コラーゲン蓄積抑制経路の負の調節因子であると評価することができる。
上記方法のうち、第一工程が、コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子が前記細胞外に存在する条件下においてなされてもよい。尚、「コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子が前記細胞外に存在する条件」とは、前述の本発明蓄積抑制方法（I）において説明された条件と同様である。
【００３９】
また上記方法のうち、第一工程が、本蛋白質依存的コラーゲン蓄積抑制経路の正の調節因子が前記細胞内に存在する条件下においてなされる方法であってもよい。ここで本蛋白質依存的コラーゲン蓄積抑制経路の正の調節因子とは、細胞が有するコラーゲン合成機構において、コラーゲン遺伝子の転写を抑制させるように作用する物質を意味し、例えば、本蛋白質自身を挙げることができる。
【００４０】
このような前記の探索方法により選抜された物質またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含み、該有効成分が薬学的に許容される担体中に製剤化されてなることを特徴とするコラーゲン蓄積抑制剤［本発明蓄積抑制剤（III）］を提供可能とした。
本発明蓄積抑制剤（III）では、有効成分として、一般式（Ｉ）で示される化合物またはその薬学的に許容される塩を用いることができる。
上記一般式（Ｉ）において、
Ｒ1、Ｒ2またはＲ3で示されるアルキル基としては、例えば、炭素数１から６のアルキル基等があげられる。具体的には、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、１，１−ジメチルプロピル基、１−エチルプロピル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基、２−エチルブチル基、１−メチルペンチル基、１−エチルブチル基、３−メチルペンチル基、１，３−ジメチルブチル基等があげられる。
Ｒ1、Ｒ2またはＲ3で示されるアシル基としては、例えば、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、バレリル基、イソバレリル基、ピバロイル基等があげられる。
上記一般式（Ｉ）で示される化合物は、例えば、サンショウの果皮のエタノール抽出物を、シリカゲルを用いた薄層クロマトグラフィー、逆相カラムを用いたカラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等に供して分画するか、又は、かかる天然物から精製された化合物から通常の化学合成方法に準じて導くことにより、得ることができる。得られる化合物は、マスペクトル又はＮＭＲスペクトル等を測定することにより、その化学構造を確認することができる。
上記の本発明蓄積抑制剤（III）では、一般式（Ｉ）で示される化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含み、該有効成分が薬学的に許容される担体中に製剤化されている。
【００４１】
また本発明蓄積抑制剤（III）では、有効成分として、サンショウ（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ ｐｉｐｅｒｉｔｕｍ Ｄｅ Ｃａｎｄｏｌｌｅ）およびその同属植物、ならびにボダイジュ（Ｔｉｌｉａ ｃｏｒｄａｔａ Ｍｉｌｌ）およびその同属植物からなる群から選択される植物の少なくとも１つの部位またはその処理物を用いることもできる。
植物の部位としては、例えば、地上部、地下部、葉、樹皮、木部、根、花部、果実、果皮、種子等をあげることができる。具体的には、サンショウの果皮、ボダイジュの花部等をあげることができる。
上記の植物部位の処理物としては、例えば、乾燥物、抽出物、水蒸気蒸留物、圧搾物、破砕物、磨砕物、部分精製物、精製物等をあげることができる。これらは、植物から、例えば、生薬調製等に用いられる通常の方法に準じて得ることができる。具体的には、サンショウの果皮を、常温又は加温下に、水、エーテル、酢酸エチル、アセトニトリル、アセトン、メタノール、エタノール、ジクロロメタン、クロロホルム、トルエン、ベンゼン、ヘキサン、ヘプタン、１，３−ブチレングリコール等の溶媒又はこれらの混合溶媒で抽出する。また、ボダイジュの花部を水、エーテル、酢酸エチル、アセトニトリル、アセトン、メタノール、エタノール、ジクロロメタン、クロロホルム、トルエン、ベンゼン、ヘキサン、ヘプタン、１，３−ブチレングリコール等の溶媒又はこれらの混合溶媒で抽出する。このようにして得られる抽出物自身を有効成分として用いることもできる。さらに、当該抽出物を、例えば、シリカゲル、アルミナ、セルロースパウダー等を用いたカラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー等に供して分画するか、又はこれらの方法を組み合わせて分画することにより得られる部分精製物または精製物を有効成分として用いることもできる。
上記の本発明蓄積抑制剤（III）では、上記の有効成分が薬学的に許容される担体中に製剤化されている。
【００４２】
本発明は、Ｉ型コラーゲン遺伝子を有する細胞に、コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子が前記細胞外に存在する条件下において、本蛋白質依存的コラーゲン蓄積抑制経路の正の調節因子を投与する工程を有することを特徴とするコラーゲン蓄積抑制方法［本発明蓄積抑制方法（IV）］も提供している。
ここで、「Ｉ型コラーゲン遺伝子を有する細胞」とは、前述の本発明蓄積抑制方法（III）において説明された細胞と同様であり、また「コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子が前記細胞外に存在する条件」とは、前述の本発明蓄積抑制方法（I）において説明された条件と同様である。
【００４３】
【実施例】
以下に、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４４】
実施例１ （本発明コラーゲン蓄積抑制剤の有効成分である本蛋白質の調製例）（１）本蛋白質をコードする外来遺伝子を発現するベクターの調製
ヒト胎児皮膚線維芽細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号ＣＣ−２５０９）１ｘ１０7細胞を３７℃、５％ ＣＯ2雰囲気下で一晩培養した。培養された細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、トリゾル試薬（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、カタログ番号１５５９６−０１８）１ｍｌを添加して当該細胞を懸濁させた。得られた細胞懸濁液を室温にて５分間静置した後、当該細胞懸濁液にクロロホルム ０．２ｍｌを添加して１５秒間攪拌し、４℃で１５，０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離した。水層を回収した後、これにイソプロパノール ０．５ｍｌを加えて室温で５分間静置し、４℃で１５，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離した。回収された沈殿物に７０％ エタノール １ｍｌを加えて攪拌した後、４℃で１２，０００ｒｐｍ、５分間遠心分離した。回収された沈殿物を風乾した後、これをＴＥ溶液［組成：１０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭ エチレンジアミン四酢酸ナトリウム（以下、ＥＤＴＡと記す。）（ｐＨ８．０）］２０μｌに溶解した（得られた溶解液を、以下、全ＲＮＡ溶液と記す。）。次に、ＴＨＥＲＭＯＳＣＲＩＰＴＲＴ−ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、カタログ番号１１１４６−０２４）を用いて以下のように逆転写反応を行った。まず全ＲＮＡ溶液 ２μｌ、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）20 １μｌ及びＤＥＰＣ−Ｔｒｅａｔｅｄ Ｗａｔｅｒ ７μｌを混合し、この混合液を６５℃、５分間保温した後、直ちに氷冷した。次に当該混合液に、５ｘｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ ４μｌ、ＲＮａｓｅＯＵＴ １μｌ、ＤＴＴ １μｌ、ＤＥＰＣ−Ｔｒｅａｔｅｄ Ｗａｔｅｒ １μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ ２μｌ及びＴＨＥＲＭＯＳＣＲＩＰＴ ＲＴ１μｌを添加して５５℃、１時間保温し、続いて８５℃、５分間保温した。さらに、当該混合液にＲＮａｓｅ Ｈ １μｌを加えて３７℃、２０分間保温した。得られた混合液１μｌ、配列番号５で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（１０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、配列番号６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（１０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、蒸留水２９μｌ、ＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ（宝酒造、カタログ番号ＲＲ００２Ａ）に含まれるｂｕｆｆｅｒ５μｌ、Ｍｇ2+溶液 ５μｌ、ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ ５μｌ、及びＬＡ Ｔａｑ ０．５μｌを混合した後、得られた混合液を９４℃、５分間保温した。続いて９４℃、１分間、次いで６０℃、１分間、さらに７２℃、２分間の保温を１サイクルとしてこれを３５サイクル行い、さらに７２℃、７分間保温した。保温後の混合液を１％Ａｇａｒｏｓｅ Ｌ（ニッポンジーン、カタログ番号３１７−０１１８２）ゲルを用いた電気泳動に供した。約１ｋｂのＤＮＡを含むゲル部分を切り出した後、これを６５℃、５分間保温した。得られたゲル溶解液に等容量のフェノールを添加して混合した後、１５，０００ｒｐｍ、３分間遠心分離した。回収された上清に等容量のクロロホルムを添加して混合した後、１５，０００ｒｐｍ、３分間遠心分離し、再び上清を回収した（以下、該操作をフェノール・クロロホルム処理と記す。）。回収された上清にその１／９容量の３Ｍ 酢酸ナトリウム、２倍容量のエタノールを加えて−８０℃、３０分間放置した後、１５，０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離し、沈澱を回収した。回収された沈殿に冷８０％エタノール１ｍｌを加えた後、１５，０００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、再び沈澱を回収した。回収された沈澱に蒸留水４０μｌ、１０ｘＨ Ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造）５μｌ、ＢａｍＨＩ（１５Ｕ／μｌ、宝酒造、カタログ番号１０６０Ａ）２．５μｌ、ＸｈｏＩ（１５Ｕ／μｌ、宝酒造、カタログ番号１０９３Ａ）２．５μｌを添加し、この混合液を３７℃、３時間保温した。そして当該混合液を１％アガロースゲル電気泳動に供した。約１ｋｂのＤＮＡ含むゲル部分を切り出した後、これを前記と同様にしてフェノール・クロロホルム処理した後、エタノール沈殿することによりＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡをＴＥ溶液２０μｌに溶解して目的とするＤＮＡ（本蛋白質をコードする外来遺伝子：以下、本ＤＮＡと記すこともある。）溶液を得た。
【００４５】
ベクターＤＮＡは以下のように調製された。ベクターｐＥＴ−２８ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ、カタログ番号６９８６４−３）５μｇ、１０ｘＫ Ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造）５μｌ、ＢａｍＨＩ ２．５μｌ及びＸｈｏＩ ２．５μｌを混合し、さらに全容量が５０μｌになるように蒸留水を添加した。得られた混合液を３７℃、３時間保温した後、当該混合液を１％アガロースゲル電気泳動に供した。ベクターＤＮＡを含むゲル部分を切り出した後、これを前記と同様にしてフェノール・クロロホルム処理した後、エタノール沈殿することによりベクターＤＮＡを回収した。回収された沈澱に、蒸留水４４μｌ、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｂｕｆｆｅｒ５μｌ及びＡｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造、カタログ番号２１２０Ａ）１μｌを加えて６５℃、３０分間保温した後、この混合液に１％ドデシル硫酸ナトリウム１μｌ、０．２Ｍ ＥＤＴＡ ２．５μｌ及び１％プロテイナーゼＫ（和光純薬、カタログ番号）１μｌを加えて５５℃、３０分間保温した（以下、該操作をＢＡＰ処理と記す。）。さらに当該混合液に蒸留水を４５０μｌ添加し、これをフェノール・クロロホルム処理した後、エタノール沈殿することによりＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡをＴＥ溶液２０μｌに溶解してベクターＤＮＡ（以下、本ベクターＤＮＡと記すこともある。）を得た。
【００４６】
次に、得られた本ＤＮＡ溶液５μｌ、得られた本ベクターＤＮＡ溶液１μｌ、及びＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｖｅｒ２（宝酒造、カタログ番号６０２２）の酵素溶液６μｌを混合した後、得られた混合液を１６℃、一昼夜保温した。当該混合液に大腸菌ＢＬ２１−ＧＯＬＤ（ＤＥ３）（ＴＯＹＯＢＯ、カタログ番号ＳＣ２３０１３２）１００μｌを加えて氷中に３０分間放置し、次いで４２℃、４５秒間保温した後、得られた大腸菌を３０μｇ／ｍｌ硫酸カナマイシン（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１５１６０−０５４）を含むＬＢプレート（１％トリプトン、０．５％イーストエキストラクト、１％ 塩化ナトリウム、１．５％バクトアガー）に播種し、３７℃、一昼夜放置した。出現したシングルコロニーを単離することにより後述で用いられる、本蛋白質をコードする外来遺伝子を発現するベクターを含有する大腸菌（以下、本蛋白質発現ベクター含有大腸菌と記すこともある。）を得た。一方、当該シングルコロニーを３０μｇ／ｍｌ 硫酸カナマイシンを含むＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％イーストエキストラクト、１％塩化ナトリウム）２ｍｌで３７℃、１２時間培養した。得られた培養液から、ＡＵＴＯＭＡＴＩＣ ＤＮＡ ＩＳＯＬＡＴＩＯＮ ＳＹＳＴＥＭ ＰＩ−５０（ＫＵＲＡＢＯ）を用いて、プラスミドＤＮＡを調製した。このようにして、本蛋白質をコードする外来遺伝子を発現するベクターを得た。
【００４７】
（２）本蛋白質の調製
実施例１（１）で得られた本蛋白質発現ベクター含有大腸菌を、３０μｇ／ｍｌ 硫酸カナマイシンを含むＬＢ培地２００ｍｌに接種し、ＯＤ600値が０．４〜０．６になるまで、３７℃で振とう培養した。得られた培養液に、終濃度が０．５ｍＭとなるようイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（以下、ＩＰＴＧと記す。）を加えて、さらに３時間、３７℃で振とう培養を続けた。得られた培養液を遠心分離（５，０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）することにより回収された沈澱（菌）に、氷冷した１０ｍｌ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ［５ｍＭ イミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０％ グリセロール、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）］を加えて懸濁させた後、この菌懸濁液の粘性がなくなるまで超音波処理を行った。そして超音波処理された菌懸濁液を遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、３０分間、４℃）し、上清を回収した。次に、回収された上清をニッケル−ＮＴＡ−アガロースカラム（ＱＩＡＧＥＮ）に供した。次に、当該カラムには、カラム体積の２倍量のＢｉｎｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒを通流し、続いて５倍量のＷａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ［２０ｍＭ イミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０％ グリセロール、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．５）］を通流した後、Ｅｌｕｔｅ ｂｕｆｆｅｒ［２００ｍＭ イミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０％ グリセロール、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）］を通流することにより、目的とする蛋白質をカラムから溶出させ、その溶出液を回収した。尚、回収された溶出液の一部をドデシル硫酸ナトリウム（以下、ＳＤＳと記す。）−１３％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。電気泳動後のゲルを銀染色した結果、本蛋白質に相当する電気泳動位置に単一バンドが確認された。
回収された溶出液の大部分を、４℃で透析［透析液：１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）、４０ｍＭ ＫＣｌ、０．４ｍＭ ＥＤＴＡ、４％ グリセロール、０．５ｍＭ ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、０．５ｍＭ フェニルメチルスルフォニルフロリド（ＰＭＳＦ）、２μｇ／ｍｌ ロイペプチン、２μｇ／ｍｌ ペプスタチン Ａ］した後、セントリコン３０（Ａｍｉｃｏｎ）で濃縮することにより本蛋白質を得た。
【００４８】
実施例２ （本蛋白質が有する、Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力）（１）（ａ）Ｉ型コラーゲン遺伝子の発現調節領域を有するＤＮＡ（結合型プローブ）及び（ｂ）本蛋白質との結合能力を有さない塩基配列を有するＤＮＡ（非結合型プローブ）の調製
配列番号３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、該塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとを混合し、このオリゴヌクレオチド混合物を５分間煮沸した後そのまま室温に放置した。次いで、前記オリゴヌクレオチド混合物の１０ｐｍｏｌ ＤＮＡ相当量、Ｔ４キナーゼバッファー ２μｌ 、Ｔ４ キナーゼ １μｌ、及びγ−32Ｐ−ＡＴＰ（＞３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、第一化学薬品、カタログ番号ＮＥＧ−５０２Ａ）６μｌに蒸留水を加えて全量を２０μｌとした後、これを３７℃、１時間保温した。当該混合液をクイックスピンカラムＧ−２５（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、カタログ番号１２７３９４９）に供した。当該カラムを遠心分離（２，５００ｒｐｍ、５分間）した後、溶出液を回収した。回収された溶出液を１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供することにより32Ｐ標識された２本鎖ＤＮＡを含むゲル部分を回収した。回収されたゲル部分に蒸留水を加えて３７℃、一昼夜放置した後、32Ｐ標識されたＤＮＡ（以下、該ＤＮＡを結合型プローブと記す。）を抽出した。このようにして結合型プローブを調製した。
一方、配列番号３で示される塩基配列の塩基番号５で示される塩基及び塩基番号６で示される塩基が置換された塩基配列（配列番号７で示す。）からなるオリゴヌクレオチドと、該塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとを混合し、以後、前記結合型プローブの調製と同様な操作を行い、32Ｐ標識されたＤＮＡ（以下、非結合型プローブと記す。）を抽出した。このようにして非結合型プローブを調製した。
【００４９】
（２）ゲルシフトアッセイ
実施例１（２）で調製された本蛋白質 ２００ｎｇ及びＰｏｌｙ ｄＩ−ｄＣ１μｇに、上記（１）で調製された２種のプローブのいずれか一方（各５０，０００ｃｐｍ）をそれぞれ添加し、この混合物を氷中で３０分間放置した。次に、それぞれの混合液の全量を６％ ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１５０Ｖ、４℃、１５０分間）に供した。電気泳動終了後、ゲルをメタノールと酢酸と水の３：１：６（ｖ／ｖ／ｖ）混合液に浸して固定した。固定されたゲルをゲルドライヤーで乾燥した後、Ｘ線フィルムに露光した。結合型プローブ添加試験区では、本蛋白質の電気泳動位置に放射活性のシグナルが検出された。一方、非結合型プローブ添加試験区では、本蛋白質の電気泳動位置には放射活性のシグナルは検出されなかった。
以上の確認結果に基づき、後述のプライマー設計を行った。すなわち、後述の結合型レポーターベクター作成には、配列番号１０で示されるオリゴヌクレオチド及び配列番号１１で示されるオリゴヌクレオチドを利用し、一方、後述の非結合型レポーターベクター作成には、配列番号１２で示されるオリゴヌクレオチド及び配列番号１１で示されるオリゴヌクレオチドを利用した。
【００５０】
（３）レポーター遺伝子を有するベクターの調製
正常ヒト胎児皮膚線維芽細胞をＰＢＳで洗浄した後、トリゾル試薬１ｍｌを添加して当該細胞を懸濁させる。得られる細胞懸濁液を室温で５分間放置した後、当該細胞懸濁液にクロロホルム０．２ｍｌを添加し１５秒間振とう混合する。室温でさらに３分間放置した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分間）する。中間層及び有機層を回収した後、これにエタノール０．３ｍｌを加えて混合し、この混合物を室温で３分間放置した後、遠心分離（３，０００ｒｐｍ、４℃、５分間）する。回収される沈殿物に０．１Ｍ クエン酸ナトリウム１ｍｌを加えて室温で３０分間放置した後、これを遠心分離（３，０００ｒｐｍ、４℃、５分間）して沈澱物を回収する。この操作をもう１度繰り返す。得られる沈殿物に７５％エタノール２ｍｌを加えて室温で２０分間放置した後、この混合物を遠心分離（３，０００ｒｐｍ、４℃、５分間）する。沈殿物を５分間真空乾燥した後、超純水に溶解する。
得られる溶解液と、配列番号８で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号９で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとを用いてＰＣＲを行う。ＰＣＲ反応溶液を９４℃、５分間保温した後、９４℃、１分間次いで５５℃、２分間さらに７２℃、３分間の保温を１サイクルとしてこれを３０サイクル行う。ＰＣＲ反応終了後、ＰＣＲ反応溶液を１％アガロースゲル電気泳動に供することにより、約２．５ｋｂのＤＮＡを回収した。回収されるＤＮＡをフェノール・クロロホルム処理した後、エタノール沈殿してＤＮＡを回収する。回収されるＤＮＡを超純水に再び溶解し、ＢａｍＨＩ２．５μｌ及びＨｉｎｄＩＩＩ（ニッポンジーン、カタログ番号３１１−０１１６３）２．５μｌを加え、３７℃、３時間保温した後、この混合液を１％アガロースゲル電気泳動に供することにより、約２．５ｋｂのＤＮＡを回収する。回収されたＤＮＡをエタノール沈殿することにより目的とするＤＮＡを得た（以下、プロモーターＤＮＡと記す。）。
一方、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（以下、ＣＡＴと記す。）をコードする塩基配列を有するベクターｐ８−ＣＡＴ［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，１３３５１−１３３５６（１９９０）］をＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、上記と同様にアガロースゲル電気泳動に供することにより、約５ｋｂのＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡをエタノール沈殿することによりＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡをＢＡＰ処理し、次いでフェノール・クロロホルム処理した後、エタノール沈殿することによりＤＮＡを回収した（以下、ＣＡＴベクターＤＮＡと記す。）。
【００５１】
次いで、前記プロモーターＤＮＡと、ＣＡＴベクターＤＮＡとを混合し、この混合物にＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｖｅｒ２酵素溶液を添加して１６℃で一昼夜保温する。当該混合物に大腸菌５Ｈｄα（ＴＯＹＯＢＯ、カタログ番号ＤＮＡ−９０３）を加えて氷中に３０分間放置し、次いで４２℃、４５秒間保温した後、得られた大腸菌を５０μｇ／ｍｌ アンピシリンナトリウム（ナカライ、カタログ番号０２７−３９）を含むＬＢプレートに播種し、３７℃、一昼夜放置する。出現したシングルコロニーを５０μｇ／ｍｌ アンピシリンナトリウムを含むＬＢ培地２ｍｌに接種して３７℃、１２時間培養した後、得られた培養液からＡＵＴＯＭＡＴＩＣ ＤＮＡ ＩＳＯＬＡＴＩＯＮ ＳＹＳＴＥＭ ＰＩ−５０（ＫＵＲＡＢＯ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製する。得られたプラスミドＤＮＡの塩基配列をＤＮＡシークエンサーで分析し、目的とする塩基配列を保有していることを確認する。当該プラスミドＤＮＡ１００ｎｇを鋳型とし、配列番号１０で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号１１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとを各々１０ｐｍｏｌ添加して、ＰＣＲを行う。ＰＣＲ反応溶液を、９４℃、５分間保温した後、９４℃、１分間次いで５５℃、１分間さらに７２℃、１分間の保温を１サイクルとしてこれを３０サイクル行う。ＰＣＲ反応終了後、ＰＣＲ反応溶液を１％アガロースゲル電気泳動に供することにより、約０．２２ｋｂのＤＮＡを回収する。回収されるＤＮＡをＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、１％アガロースゲル電気泳動に供することにより、約０．２２ｋｂのＤＮＡを回収する。回収されるＤＮＡを、ＣＡＴベクターＤＮＡとライゲーションした後、ライゲーション化ＤＮＡを大腸菌５Ｈｄαに導入する。得られる形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製することにより、ヒトＩ型コラーゲンα２鎖遺伝子のプロモーター領域の−１６１〜＋５７（転写開始点を＋１とする。）の塩基配列の下流に、ＣＡＴをコードする塩基配列が接続されてなるプラスミド（以下、結合型レポーターベクターと記す。）を得る。当該プラスミドの塩基配列を自動ＤＮＡシークエンサーにより分析し確認する。
【００５２】
次に、結合型レポーターベクターをＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIIIで消化した後、この消化物を３％アガロースゲル電気泳動に供することにより、ＣＡＴをコードする塩基配列を有するＤＮＡを回収した。
一方、配列番号１２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号１１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとを各々１０ｐｍｏｌ添加し、結合型レポーターベクター１００ｎｇを鋳型としてＰＣＲを行なった。ＰＣＲ反応溶液を、９４℃、５分間保温した後、９４℃、１分間次いで５５℃、１分間さらに７２℃、１分間の保温を１サイクルとしてこれを３０サイクル行った。ＰＣＲ反応終了後、ＰＣＲ反応溶液を１％アガロースゲル電気泳動に供することにより、約０．２２ｋｂのＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡをＢａｍＨＩ２．５μｌ及びＨｉｎｄＩＩＩ２．５μｌで消化した後、この消化物を３％アガロースゲル電気泳動に供することにより、約０．２２ｋｂのＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡとＣＡＴベクターＤＮＡとをライゲーションした後、ライゲーション化ＤＮＡを大腸菌５Ｈｄαに導入した。得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製することにより、結合型レポーターベクターに含まれるヒトＩ型コラーゲンα２鎖遺伝子（ＣＯＬ１Ａ２）の発現調節領域の−１６０と−１５９との位置（転写開始点を＋１とする。）のシトシンが、グアニンに置換されてなるプラスミド（以下、該プラスミドを非結合型レポーターベクターと記す。）を得た。当該プラスミドの塩基配列を、自動ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ、３７７ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）により確認した。
【００５３】
（４）レポーター遺伝子の発現量測定
実施例１（１）と同様にして、本蛋白質をコードするＤＮＡを、発現ベクターｐＲｃ／ＲＳＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号２８−００５１）のＨｉｎｄＩＩＩ切断部位とＸｂａＩ切断部位との間にクローニングし、得られたベクターをＹＢ−１／ＲＳＶ（本蛋白質発現ベクター）と名付けた。
ヒトｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ細胞 ＡＧ−３７３［Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、カタログ番号ＨＴＢ−１７］１ｘ１０6細胞を６０ｍｍディッシュ（ＢＥＣＴＯＮ ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ、カタログ番号３００２）に播種し、１０％非働化牛胎児血清（以下、ＦＢＳと記す。Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２１１４０−０７９）、８．９ｍｇ／ｌＬ−アラニン、１５ｍｇ／ｌ Ｌ−アスパラギン・Ｈ2Ｏ、１３．３ｍｇ／ｌＬ−アスパラギン酸、１４．７ｍｇ／ｌ Ｌ−グルタミン酸、７．５ｍｇ／ｌグリシン、１１．５ｍｇ／ｌ Ｌ−プロリン及び１０．５ｍｇ／ｌ Ｌ−セリンが添加されたＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ、カタログ番号１１０９５−０７２）（以下、該培地をＭＥＭ（＋）と記す。）にて３７℃、５％ＣＯ2存在下で一晩培養した後、培地をＦＢＳを含まないＭＥＭ培地（以下、該培地をＭＥＭ（−）と記す。）に置換した。
ＭＥＭ（−）１００μｌに、結合型レポーターベクター２μｇ又は非結合型レポーターベクター ２μｇのいずれかと、ＹＢ−１／ＲＳＶ ４μｇ又はｐＲｃ／ＲＳＶ ４μｇのいずれかとを加え、この混合液を室温で４０分間放置した（溶液１）。また、ＭＥＭ（−）１００μｌにＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１８２９２−０１１）２０μｌを加え、この混合液を室温で４０分間放置した（溶液２）。次に、溶液１と溶液２とを混合し、室温で１０分間放置した後に、ＭＥＭ（−） ２ｍｌを加え、よく混合した。当該混合液を前記ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ細胞に添加した後、当該細胞を３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下で６時間培養した。その後、ディッシュから培養上清を除いて細胞をＭＥＭ（−）で２回洗浄し、ＭＥＭ（＋）４ｍｌを添加し、３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下でさらに４０時間培養した。
【００５４】
培養された細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、細胞溶解剤（東洋インキ、カタログ番号ＰＤ１０）２００μｌを加え、セルスクレイパー（Ｎａｌｇｅｎ、カタログ番号１７９６９３）を用いて細胞を器壁から剥がした。剥がされた細胞を細胞溶解剤に懸濁した後、この細胞懸濁液を遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、５分間）し、上清を回収した。回収された上清（蛋白質量に換算して２０μｇ）に、１０ｍＭ アセチル−ＣｏＡ（シグマ、カタログ番号Ａ２０５６）１０μｌ及びＤ−ｔｈｒｅｏ−［ｄｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｙｌ−１−14Ｃ］ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ（アマシャム、カタログ番号ＣＦＡ７５４）２μｌを添加し、この混合液を３７℃で５時間保温した。次いで、この混合液に酢酸エチル１００μｌを加えて混合した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、５分間）し、上層を回収した。回収された上層を窒素気流下に蒸発乾固させた後、残渣を酢酸エチル３０μｌに溶解した。この溶解液の全量をシリカゲル薄層クロマトグラフィーにて展開した（薄層プレート：Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ＴＬＣ ｐｌａｔｅ ２０ｘ２０ｃｍ、ＭＥＲＣＫ、カタログ番号１．０５７１５、展開溶媒：クロロホルムとメタノールの９５：５（ｖ／ｖ）混合液）。薄層プレート上の放射活性を、バイオ・イメージングアナライザーＢＡＳｔａｔｉｏｎ（富士フィルム）を用いて定量した。次式に従って、ＣＡＴ活性を算出した。
ＣＡＴ活性（％）＝アセチルクロラムフェニコールの放射活性／全放射活性
結果を表１に示す。本蛋白質発現ベクターであるＹＢ−１／ＲＳＶと結合型レポーターベクターとが導入された細胞では、発現ベクター（本蛋白質非発現ベクター）であるｐＲｃ／ＲＳＶと結合型レポーターベクターとが導入された細胞に比し、ＣＡＴ活性が低下していた。一方、本蛋白質発現ベクターと非結合型レポーターベクターとが導入された細胞及び発現ベクター（本蛋白質非発現ベクター）と非結合型レポーターベクターとが導入された細胞の両者では、かかる活性低下は認められなかった。
【００５５】
【表１】
【００５６】
実施例３ （本蛋白質をコードする外来遺伝子導入によるコラーゲン蓄積抑制方法）
（１）プローブ作製
正常ヒト胎児皮膚線維芽細胞の全ＲＮＡ １μｇとＯｌｉｇｏ（ｄＴ）20とを用いて、実施例１（１）と同様に逆転写反応を行なった。得られたｃＤＮＡ溶液１μｌと、配列番号１３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（１０ｐｍｏｌ／μｌ）と配列番号１４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（１０ｐｍｏｌ／μｌ）各々１μｌを用いて、実施例１（１）と同様にＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動に供することにより約２ｋｂのＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡをＴＥ溶液１０μｌに溶解して目的とするＤＮＡ溶液を得た。得られたＤＮＡ溶液９μｌ、ｐＧＥＭ Ｔ−ｅａｓｙベクター溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ａ１３６０）１μｌ、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｖｅｒ２の酵素溶液 １０μｌを混合してライゲーションした。このライゲーション化ＤＮＡを大腸菌５Ｈｄαに導入した。得られた形質転換体を、アンピシリンナトリウムを含むＬＢプレートに播種してコロニーを形成するまで培養した。出現したシングルコロニーを回収し、再び培養した後、当該形質転換体から、ヒトＩ型コラーゲンα２鎖のコーディング領域の２０２１番目の塩基から４０５１番目の塩基までの塩基配列を含むプラスミドを単離した。また、上記２種のオリゴヌクレオチドに代えて配列番号２１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（１０ｐｍｏｌ／μｌ）と配列番号２２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（１０ｐｍｏｌ／μｌ）各々１μｌを用いて、上記と同様な操作を行い、ヒトＩ型コラーゲンα１鎖のコーディング領域の２３４２番目の塩基から３７３５番目の塩基までの塩基配列を含むプラスミドを単離した。
単離された各プラスミドをＸｈｏＩ及びＳａｃＩで消化した後、アガロースゲル電気泳動に供することによりそれぞれ約１．０ｋｂ、約１．３ｋｂのＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡをそれぞれ約１０ｎｇ／μｌとなるようＴＥ溶液に溶解して目的とするＤＮＡ溶液を得た。得られたＤＮＡ溶液１μｌにＴＥ溶液 ４４μｌを加えて混合し、この混合物を９５℃、５分間保温した後、氷中に置いた。次いで当該混合物を、ランダムプライムラベリングシステム（Ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ ＩＩ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、カタログ番号ＲＰＮ１６３３）１チューブに加え、さらに［α−32Ｐ］ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、カタログ番号ＲＰＮＡＡ０００５）５μｌを添加して混合した。この混合物を３７℃にて１時間保温した後、当該混合物をＧ−５０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、カタログ番号２７−５３３５−０１）に供した。当該カラムを２０００ｇ、２分間遠心分離した後、溶出液を回収した。回収された溶出液を９５℃、５分間保温した後、氷中に置いた。このようにして調製されたＤＮＡをノザンブロット解析用プローブとして用いた。
【００５７】
（２）Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）測定
正常ヒト胎児皮膚線維芽細胞 ５ｘ１０7細胞を１００ｍｍディッシュ（ＢＥＣＴＯＮ ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ、カタログ番号３００３）に播種し、Ｄ−ＭＥＭ（＋）で３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下において一晩培養した。翌日、培地をＤ−ＭＥＭ（−）に置換した。
Ｄ−ＭＥＭ（−） ３００μｌにＹＢ−１／ＲＳＶ又はｐＲｃ／ＲＳＶのいずれか１５０ｎｇを加え、この混合液を室温で４５分間放置した（溶液１）。また、Ｄ−ＭＥＭ（−） ３００μｌにＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎｅ ２０μｌを加え、この混合液を室温で４０分間放置した（溶液２）。次に、溶液１と溶液２とを混合して得られた混合液を室温で１０分間放置した後、この混合液にＤ−ＭＥＭ（−）５．４ｍｌを加えた。得られた混合液に、前記ヒト胎児皮膚線維芽細胞を添加した。当該混合液（細胞を含む）を３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下で６時間培養した後、ディッシュから上清を除いてＤ−ＭＥＭ（−）で２回洗浄した。次いで、ディッシュにＤ−ＭＥＭ（０．１％）１０ｍｌを添加して３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下で１時間培養した後、当該細胞に、コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子であるＴＧＦβ ５μｇ／ｍｌ水溶液を１０μｌ添加（培地中のＴＧＦβ濃度：５ｎｇ／ｍｌ）し、３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下でさらに４０時間培養した。尚、ＴＧＦβ無添加試験区では、ＴＧＦβに代えて蒸留水１０μｌを用いた。培養された細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、当該細胞から実施例１（１）と同様に全ＲＮＡを調製した。
【００５８】
全ＲＮＡ１０μｇ、ホルムアミド（ナカライテスク、カタログ番号１６３−４５）１０μｌ、ホルマリン（和光、カタログ番号０６４−００４０６）４μｌ、１０ｘ ＭＯＰＳ［３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ナカライテスク、カタログ番号２３４−３８）４１．８５４ｇ、酢酸ナトリウム ６．８０４ｇ、ＥＤＴＡ ３．７２２ｇを蒸留水に溶解し、ｐＨ７．０に調整して全量を１Ｌとした。］３μｌを混合し、この混合液を６５℃、１０分間保温した後、直ぐに氷中に置いた。得られた混合液を１００Ｖにて６０分間電気泳動した（ゲル：アガロース １．５ｇ、１０ｘＭＯＰＳ １５ｍｌ、蒸留水 １１０ｍｌを加温してアガロースを溶解し、ホルマリン ２５ｍｌを加えて作製した。電気泳動バッファー：１ｘ ＭＯＰＳ）。電気泳動後のゲルにＨｙｂｏｎｄ−Ｎフィルター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、カタログ番号ＲＰＮ３０３Ｎ）を密着させ、加圧しながら、これを２０ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム １７５．３２ｇ、クエン酸ナトリウム ８８．２２ｇを蒸留水に溶解して１Ｌとした。）中で一晩放置することによりＲＮＡをフィルターに転写した。ＲＮＡが転写されたフィルターを８０℃、２時間保温した後、このフィルターを、ハイブリダイゼーションバッファー（ホルムアミド ２５ｍｌ、２０ｘ ＳＳＣ １２．５ｍｌ、０．５Ｍ リン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）５ｍｌ、サケ精子ＤＮＡ溶液（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、カタログ番号１５６３２−０１１）０．２ｍｌ、５ｘ デンハルト溶液（和光、カタログ番号０４３−２１８７１）４ｍｌ、蒸留水 ３．３ｍｌ）４０ｍｌ中で４２℃、５時間保温した。次に、ハイブリダイゼーションバッファーを除去した後、このフィルターに新しいハイブリダイゼーションバッファー １０ｍｌを加え、さらに１０6ｃｐｍ／ｍｌとなるように、上記（１）で調製されたノザンブロット解析用プローブ（ヒトＩ型コラーゲンα２鎖のコーディング領域の２６３１番目の塩基から３６５４番目の塩基までの塩基配列を有する。）を添加し、４２℃、一晩保温した。次いで、プローブ溶液を除去した後、このフィルターに０．１％ ＳＤＳが添加された２ｘＳＳＣ １００ｍｌを加え、室温で１０分間保温した。さらにこの操作を２回繰り返した。得られたフィルターに、０．１％ ＳＤＳが添加された０．１ｘＳＳＣ １００ｍｌを加え、５０℃、２０分間の保温を３回繰り返した後、当該フィルターを風乾した。風乾されたフィルター上の放射活性をＢＡＳｔａｔｉｏｎを用いて定量した。上記のハイブリダイゼーションが行われたフィルターを、次いで、沸騰した０．１ｘＳＳＣ中で１０分間保温した後、さらに、ハイブリダイゼーションバッファー中で４２℃、５時間保温した。このフィルターに、ノザンブロット解析用プローブ（ヒトＩ型コラーゲンα１鎖のコーディング領域の２３８１番目の塩基から３６８５番目の塩基までの塩基配列を有する。）を添加し、上記と同様なハイブリダイゼーションを行なった。
一方、全ＲＮＡ １０μｇを、０．５μｇ／ｍｌ エチジウムブロマイド（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、カタログ番号１５５８２−０１８）を含む前記のゲルを用いて電気泳動した後、２８Ｓ リボゾームＲＮＡの蛍光強度をＬＵＭＩＮＥＳＣＥＮＴ ＩＭＡＧＥ ＡＮＡＬＹＺＥＲ ＬＡＳ−１０００ ｐｌｕｓ（富士フィルム）及びＩｍａｇｅ Ｇａｕｇｅ ｖｅｒ ３．１２（富士フィルム）を用いて定量した。次式に従い、２８Ｓ リボゾームＲＮＡ量に対する各遺伝子のｍＲＮＡの量を算出した。
ｍＲＮＡ量＝約５ｋｂに相当する電気泳動位置の放射活性／２８Ｓ リボゾームＲＮＡの蛍光強度
結果を表２に示す。本蛋白質をコードする外来遺伝子導入によるコラーゲン蓄積抑制がｍＲＮＡレベルにおいて確認できた。さらに、コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子が細胞外に存在する条件下でも上記効果は十分に確認できるものであることが判った。
【００５９】
【表２】
【００６０】
実施例４ （本蛋白質投与によるコラーゲン蓄積抑制方法）
（１）細胞抽出物の調製
実施例３（２）と同様にして、正常ヒト胎児皮膚線維芽細胞に、本蛋白質発現ベクターであるＹＢ−１／ＲＳＶ又は本蛋白質非発現ベクターｐＲｃ／ＲＳＶを導入した後、この形質転換体にコラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子であるＴＧＦβを添加し、３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下で４０時間培養した。尚、ＴＧＦβ無添加試験区では、ＴＧＦβに代えて同量の蒸留水を用いた。培養された細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、培養された細胞が存在するディッシュにＲＩＰＡバッファー（５０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１％ ＮＰ−４０、０．５％ デオキシコール酸、０．１％ ＳＤＳ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、２，５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ Ｎａ3ＶＯ4、２０μｇ／ｍｌ アプロチニン、１０μｇ／ｍｌ ロイペプチン、５０ｍＭ フッ化ナトリウム）０．５ｍｌを加えた後、細胞をディッシュから剥がした。このようにして細胞懸濁液を得て、これを２２Ｇ注射針に通した後、氷中で１時間静置した。そして当該細胞懸濁液を４℃で１５，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、上清を回収した（以下、該上清を細胞抽出物と記す。）。細胞抽出物の蛋白質濃度は、ＤＣプロテインアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カタログ番号５００-０１１３）を用いて定量した。すなわち、９６穴プレートに、細胞抽出物５μｌ、ｒｅａｇｅｎｔＡ ２５μｌ及びｒｅａｇｅｎｔＢ ２００μｌ加えて振とう混合し、この混合液を室温で１５分間静置した後、当該混合液の６５５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００６１】
（２）Ｉ型コラーゲン蛋白質量の測定
細胞抽出物２５μｇに同容量のＳＤＳサンプルバッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０％グリセロール、４％ＳＤＳ、２％メルカプトエタノール、０．０１％ブロモフェノールブルー）を加え、この混合物を９５℃、５分間保温した。当該混合物の全量をＳＤＳ−１３％ポリアクリルアミド電気泳動（４０ｍＡ定電流、電気泳動バッファー：０．２５Ｍトリス、１．９２Ｍグリシン、１％ＳＤＳ）に供した。電気泳動終了後、ゲルにニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ、カタログ番号ＲＰＮ３０３Ｅ）を密着させて転写（２５０ｍＡ定電流、転写バッファー：２０％メタノール、０．２５Ｍトリス、１．９２Ｍグリシン、１％ＳＤＳ）を行なった。転写後の膜を５％スキムミルク（和光、カタログ番号）に浸し、４℃で終夜振とうした。次に、当該膜を０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ（以下、該溶液をＰＢＳ−Ｔと記す。）に浸して室温で１０分間振とうする操作を２回行なった後、ウサギ抗ヒトＩ型コラーゲン抗体（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カタログ番号２３７０６）の１０００倍希釈液（ＰＢＳ−Ｔで希釈）に当該膜を浸し、室温で１時間振とうした。次いで当該膜を、ＰＢＳ−Ｔに浸して室温で１５分間振とうする操作を３回行った後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体の５０００倍希釈液（ＰＢＳ−Ｔで希釈）に当該膜を浸し、室温で１時間振とうした。さらに当該膜をＰＢＳ−Ｔに浸して室温で１５分間振とうする操作を３回行った後、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、カタログ番号ＲＰＮ２１０６）を用いて発色させ、この発色をＢＩＯＭＡＸ ＭＲフィルム（ｋｏｄａｋ、カタログ番号８９１２５６０）に感光させた。感光したフィルムを現像した後、このフィルムをＬＵＭＩＮＥＳＣＥＮＴ ＩＭＡＧＥ ＡＮＡＬＹＺＥＲ ＬＡＳ−１０００ ｐｌｕｓ（富士フィルム）を用いて白色光によるデジタイズ（透過）でデジタル画像化した後、Ｉｍａｇｅ Ｇａｕｇｅ ｖｅｒ ３．１２（富士フィルム）を用いて黒化度を定量した。得られた値から、Ｉ型コラーゲン蛋白質量の相対値を算出した。
結果を表３に示す。本蛋白質をコードする外来遺伝子導入によるコラーゲン蓄積抑制が蛋白質レベルにおいて確認できた。さらに、コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子が細胞外に存在する条件下でも上記効果は十分に確認できるものであることが判った。
【００６２】
【表３】
【００６３】
実施例５ （Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を調節する物質の探索方法：本蛋白質の細胞核内への移行量又はその量と相関関係を有する指標値の測定によるＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能の評価）
（１）本蛋白質のアミノ酸配列と外来性マーカー蛋白質（ＧＦＰ）のアミノ酸配列とを有する蛋白質の発現ベクター作製
ＹＢ−１／ＲＳＶ １００ｎｇ、配列番号１５で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド１０ｐｍｏｌ、配列番号１６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド１０ｐｍｏｌ、ＫＯＤ−Ｄａｓｈ（ＴＯＹＯＢＯ、カタログ番号ＲＲ００２Ａ）に含まれるｂｕｆｆｅｒ ５μｌ、Ｍｇ2+溶液 ５μｌ、ｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ ５μｌ、ＫＯＤ−Ｄａｓｈ １μｌ及び蒸留水を混合して全量５０μｌのＰＣＲ反応液を調製し、このＰＣＲ反応液を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、９４℃で２分間保温した後、９４℃、１５秒間、次いで６０℃、３０秒間、さらに６８℃、１分間の保温を１サイクルとしてこれを３５サイクル行うというものであった。ＰＣＲ後、ＰＣＲ反応液をＨｉｎｄＩＩＩ及びＰｍｌＩで消化した後、エタノール沈殿することによりＤＮＡを回収した（沈澱として得られたＤＮＡを、以下、ＹＢ−１ＤＮＡと記す。）。一方、ｐＣＭＸ−ｈＧＲ−ＧＦＰ（Ｏｇａｗａ，Ｕｍｅｚｏｎｏ，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．１９９９、３１巻、３０３−３０８頁）をＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｍｌＩで消化した後、この消化物をアガロースゲル電気泳動することによりｈＧＲを含まない約５ｋｂのＤＮＡを分離し、これを回収した。回収されたＤＮＡをＢＡＰ処理した後、エタノール沈殿することによりＤＮＡを回収した（沈澱として得られたＤＮＡを、以下、ＧＦＰベクターＤＮＡと記す。）。ＹＢ−１ＤＮＡとＧＦＰベクターＤＮＡとをライゲーションした後、このライゲーション化ＤＮＡを大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体を、アンピシリンを含むＬＢプレートに播種してコロニーを形成するまで培養することにより大腸菌クローンを得た。そして、当該大腸菌クローンを再び培養し、培養された大腸菌から通常の方法によりプラスミドＤＮＡを調製した。得られたプラスミドＤＮＡの塩基配列を分析し、本蛋白質のアミノ酸配の下流にＧＦＰのアミノ酸配列が読み枠が連続する形でコードされた塩基配列を有するプラスミドを選択した。選択されたプラスミドをｐＣＭＸ−ＹＢ−１−ＧＦＰと名付けた。
【００６４】
（２）発現ベクターの導入及び蛍光顕微鏡観察
ヒト線維芽細胞 ５ｘ１０6細胞を６ウエルプレート（ＢＥＣＴＯＮ ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ、カタログ番号３０４６）に播種し、Ｄ−ＭＥＭ（＋）で３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下において一晩培養した。
Ｄ−ＭＥＭ（−）１００μｌにｐＣＭＸ−ＹＢ−１−ＧＦＰ １μｇとＰｌｕｓ ｒｅａｇｅｎｔ １０μｌ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、カタログ番号１１５１４−０１５）を加え、これを室温に１５分間放置した（溶液１）。また、Ｄ−ＭＥＭ（−） １００μｌにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ６μｌ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、カタログ番号１８３２４−０１２）を加え、これを室温に１５分間放置した（溶液２）。
次に、溶液１と溶液２とを混合し、この混合液をさらに室温で１５分間放置した後、当該混合液にＤ−ＭＥＭ（−）１ｍｌを加え、さらに上記のように培養された細胞を添加した。当該混合液（細胞を含む）を３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下で６時間培養した後、プレートから上清を除いてＤ−ＭＥＭ（−）で２回洗浄した。次いでプレートにＤ−ＭＥＭ（＋）２ｍｌを添加して３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下で３６時間培養した後、当該細胞に、５０μｇ凍結乾燥物／ｍｌ培地となるように実施例９記載のボダイジュエキス試料又はサンショウエキス試料を接触させ、さらに３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下で４時間培養した。培養後、プレートをＰＢＳで洗浄し、蛍光顕微鏡（ＮＩＫＯＮ、ＤＩＡＰＨＯＴ−ＴＭＤ）でＦＩＴＣフィルター下に倍率１００倍にて観察した。尚、陰性対照区では、上記試料に代えてＤＭＳＯ（終濃度０．１％）を用い、また、陽性対照区では、上記試料に買えてＩＦＮ−γ（終濃度１００Ｕ／ｍｌ）を用いた。ボダイジュエキス試料又はサンショウエキス試料が接触された細胞では、陽性対照区における細胞と同様に、蛍光は細胞質内では検出されなかったが、しかし核内では検出された。陰性対照区における細胞では、蛍光は細胞質内では検出されたが、しかし核内では検出されなかった。
その結果、本蛋白質の細胞核内への移行量又はその量と相関関係を有する指標値の測定によるＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能の評価することにＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を調節する物質（ボダイジュエキス試料又はサンショウエキス試料を選抜可能であることが確認できた。
【００６５】
実施例６ （本蛋白質をコードする外来遺伝子利用によるＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を調節する物質の探索方法）
（１）プローブ作製
正常ヒト胎児皮膚線維芽細胞の全ＲＮＡ１μｇと配列番号１３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド１０ｐｍｏｌとを用いて、実施例１（１）と同様に逆転写反応を行なった。得られたｃＤＮＡ溶液１μｌと、配列番号１３で示されるオリゴヌクレオチド及び配列番号１４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド各々１０ｐｍｏｌとを用いて、実施例１（１）と同様にＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液を９４℃にて５分間保温した後、９４℃にて１分間次いで５５℃にて１分間さらに７２℃にて２．５分間の保温を１サイクルとしてこれを３５サイクル行った。ＰＣＲ反応液終了後、ＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動に供することにより約２ｋｂのＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡをＴＥ溶液（１０μｌ）に溶解して目的とするＤＮＡ溶液を得た。得られたＤＮＡ溶液９μｌ、ｐＧＥＭ Ｔ−ｅａｓｙベクター溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ａ１３６０）１μｌ、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｖｅｒ２の酵素溶液１０μｌを混合してライゲーションした後、このライゲーション化ＤＮＡを大腸菌５Ｈｄαに導入した。得られた形質転換体をアンピシリンナトリウムを含むＬＢプレートに播種してコロニーを形成するまで培養した。出現したシングルコロニーを回収し、再び培養した後、当該形質転換体から、ヒトＩ型コラーゲンα２鎖のコーディング領域の２０２１番目の塩基から４０５１番目の塩基までの塩基配列を含むプラスミドを単離した。単離されたプラスミドをＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで消化した後、アガロースゲル電気泳動に供することにより約１．４ｋｂのＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡを約１０ｎｇ／μｌとなるようＴＥ溶液に溶解して目的とするＤＮＡ溶液を得た。得られたＤＮＡ溶液１μｌにＴＥ溶液４４μｌを加えて混合し、この混合物を９５℃、５分間保温した後、氷中に置いた。次いで、当該混合物をランダムプライムラベリングシステム（ＲｅｄｉｐｒｉｍｅＩＩ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、カタログ番号ＲＰＮ１６３３）１チューブに加え、さらに［α−32Ｐ］ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、カタログ番号ＲＰＮＡＡ０００５）５μｌを添加して混合した。この混合物を３７℃で１時間保温した後、当該混合物をＧ−５０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、カタログ番号２７−５３３５−０１）に供した。当該カラムを２０００ｇ、２分間遠心分離した後、溶出液を回収した。回収された溶出液を９５℃、５分間保温した後、氷中に置いた。このようにして調製されたＤＮＡをノザンブロット解析用プローブとして用いた。
【００６６】
（２）コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子（ＴＧＦβ）非存在下でのＩ型コラーゲン遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）測定
正常ヒト胎児皮膚線維芽細胞 ５ｘ１０7細胞を１００ｍｍディッシュに播種し、Ｄ−ＭＥＭ（＋）で３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下において一晩培養した。該細胞に、実施例７（２）で調製されたサンショウエキス試料を、５０μｇ凍結乾燥物／ｍｌ培地となるように添加し、さらに２４時間培養した。尚、陰性対照区では、サンショウエキス試料に代えてＤＭＳＯ（培地中の濃度が０．１％となるよう添加）を用いた。陽性対照区では、サンショウエキス試料に代えてＩＦＮ−γ（培地中の濃度が１００Ｕ／ｍｌとなるように添加）を用いた。培養された細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、当該細胞から実施例１（１）と同様に全ＲＮＡを調製した。
【００６７】
全ＲＮＡ１０μｇ、ホルムアミド（ナカライテスク、カタログ番号１６３−４５）１０μｌ、ホルマリン（和光、カタログ番号０６４−００４０６）４μｌ、１０ｘＭＯＰＳ［３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ナカライテスク、カタログ番号２３４−３８）４１．８５４ｇ、酢酸ナトリウム６．８０４ｇ、ＥＤＴＡ３．７２２ｇを蒸留水に溶解し、ｐＨ７．０に調整して全量を１Ｌとした。］３μｌを混合し、この混合液を６５℃、１０分間保温した後、直ぐに氷中に置いた。得られた混合液を１００Ｖにて６０分間電気泳動した（ゲル：アガロース１．５ｇ、１０ｘＭＯＰＳ １５ｍｌ、蒸留水１１０ｍｌを加温してアガロースを溶解し、ホルマリン ２５ｍｌを加えて作製した。電気泳動バッファー：１ｘ ＭＯＰＳ）。電気泳動後のゲルにＨｙｂｏｎｄ−Ｎフィルター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、カタログ番号ＲＰＮ３０３Ｎ）を密着させ、加圧しながら、これを２０ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム１７５．３２ｇ、クエン酸ナトリウム８８．２２ｇを蒸留水に溶解して１Ｌとした。）中で一晩放置することにより、ＲＮＡをフィルターに転写した。ＲＮＡが転写されたフィルターを８０℃、２時間保温した後、このフィルターをハイブリダイゼーションバッファー（ホルムアミド２５ｍｌ、２０ｘＳＳＣ １２．５ｍｌ、０．５Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）５ｍｌ、サケ精子ＤＮＡ溶液（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、カタログ番号１５６３２−０１１）０．２ｍｌ、５ｘデンハルト溶液（和光、カタログ番号０４３−２１８７１）４ｍｌ、蒸留水３．３ｍｌ）４０ｍｌ中で４２℃、５時間保温した。次に、ハイブリダイゼーションバッファーを除去した後、このフィルターに新しいハイブリダイゼーションバッファー１０ｍｌを加え、さらに１０6ｃｐｍ／ｍｌとなるように、上記（１）で調製されたノザンブロット解析用プローブを添加し、４２℃、一晩保温した。次いで、プローブ溶液を除去した後、このフィルターに０．１％ ＳＤＳが添加された２ｘＳＳＣ １００ｍｌを加え、室温で１０分間保温した。さらにこの操作を２回繰り返した。得られたフィルターに、０．１％ＳＤＳが添加された０．１ｘＳＳＣ １００ｍｌを加え、５０℃、２０分間の保温を３回繰り返した後、当該フィルターを風乾した。風乾されたフィルター上の放射活性をＢＡＳｔａｔｉｏｎを用いて定量した。
一方、全ＲＮＡ１０μｇを、０．５μｇ／ｍｌ エチジウムブロマイド（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、カタログ番号１５５８２−０１８）を含む前記ゲルを用いて電気泳動した後、２８Ｓ リボゾームＲＮＡの蛍光強度をＬＵＭＩＮＥＳＣＥＮＴ ＩＭＡＧＥ ＡＮＡＬＹＺＥＲ ＬＡＳ−１０００ ｐｌｕｓ（富士フィルム）及びＩｍａｇｅ Ｇａｕｇｅ ｖｅｒ ３．１２（富士フィルム）を用いて定量した。次式に従い、２８Ｓ リボゾームＲＮＡ量に対するＩ型コラーゲンα２鎖ｍＲＮＡの量を算出した。
Ｉ型コラーゲンα２鎖ｍＲＮＡ量＝５．８ｋｂに相当する電気泳動位置の放射活性／２８Ｓ リボゾームＲＮＡの蛍光強度
結果を表４に示す。サンショウエキス試料には、Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写調節能が存在していることが判明した。このように、当該方法によりＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を有する物質を選抜できることが確認できた。
【００６８】
【表４】
【００６９】
（３）コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子（ＴＧＦβ）存在下でのＩ型コラーゲン遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）測定
正常ヒト胎児皮膚線維芽細胞 ５ｘ１０7を１００ｍｍディッシュに播種し、Ｄ−ＭＥＭ（＋）で３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下において一晩培養した。該細胞の培養液を１％ ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭ培地に交換して１時間培養した後、実施例７（２）で調製されたサンショウエキス試料を、５０μｇ凍結乾燥物／ｍｌ培地となるように添加し、さらに１時間培養した。その後、当該細胞の培養液に、コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子であるヒトＴＧＦβ（ＰＥＰＲＯ ＴＥＣＨ、カタログ番号Ｅ２７９）を培地中の濃度が１０ｎｇ／ｍｌとなるように添加し、さらに２３時間培養した。尚、陰性対照区では、サンショウエキス試料に代えてＤＭＳＯ（培地中の濃度が０．１％となるよう添加）を用いた。陽性対照区では、サンショウエキス試料に代えてＩＦＮ−γ（培地中の濃度が１００Ｕ／ｍｌとなるように添加）を用いた。培養された細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、当該細胞から実施例１（１）と同様に全ＲＮＡを調製した。得られた全ＲＮＡ１０μｇを上記（２）と同様にノザンブロット解析に供し、２８Ｓ リボゾームＲＮＡ量に対するヒトＩ型コラーゲンα２鎖ｍＲＮＡ量を求めた。
結果を表５に示す。その結果、サンショウエキス試料には、コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子が細胞外に存在する条件下でも、Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を充分に確認できることが判明した。このように、当該方法によりＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を有する物質を選抜できることが確認できた。
【００７０】
【表５】
【００７１】
実施例７ （Ｉ型コラーゲン遺伝子の発現調節領域結合レポーター遺伝子利用によるＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を調節する物質の探索方法）
（１）転写開始に必要な塩基配列を含む、Ｉ型コラーゲン遺伝子の発現調節領域を機能可能な形で連結されてなるレポーター遺伝子の調製
正常ヒト胎児皮膚線維芽細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号ＣＣ−２５０９）１ｘ１０8細胞を３７℃、５％ ＣＯ2雰囲気下で一晩培養した。培養された細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、ＰＢＳ３ｍｌを加えセルスクレイパー（Ｎａｌｇｅｎ、カタログ番号１７９６９３）を用いて細胞を器壁から剥がした。剥がした細胞を遠心分離（１，５００ｒｐｍ、４℃、１５分間）により集め、これをＰＢＳ ２０ｍｌに懸濁して再度遠心分離した。得られた沈殿に、ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ番号２００６００）のＳｏｌｕｔｉｏｎ２を１１ｍｌ、ｐｒｏｎａｓｅを４．８μｌそれぞれ加えて６０℃にて１時間振とうした後、この混合液を氷中に１０分間放置した。次に、当該混合液に上記キットのＳｏｌｕｔｉｏｎ３を４ｍｌ加えて混合した後、これを氷中に５分間放置した。遠心分離（３，０００ｒｐｍ、４℃、１５分間）し、上清を回収した。回収された上清に、当該上清１ｍｌ当たりＲＮａｓｅを２μｌ加え、３７℃で１５分間放置した。この混合液に、２倍容量のエタノールを加えて混合することにより、出現した白い糸状の物質（ゲノムＤＮＡ）を回収した。回収されたゲノムＤＮＡを７０％エタノールで洗浄した後、風乾した。風乾されたゲノムＤＮＡを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ ８．０）（以下、ＴＥと記す。）５００μｌに溶解した。
溶解されたゲノムＤＮＡ １μｇと、配列番号１６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号１７で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（１０ｐｍｏｌ／μｌ）各１μｌ、蒸留水 ２９μｌ、ＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ（宝酒造、カタログ番号ＲＲ００２Ａ）に添付されたｂｕｆｆｅｒ ５μｌ、Ｍｇ2+溶液 ５μｌ、ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ ５μｌ及びＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ（宝酒造、カタログ番号ＲＲ００２Ａ）０．５μｌを混合した。得られた反応溶液を９４℃、５分間保温した後、９４℃、１分間次いで６０℃、１分間さらに７２℃、１分間の保温を１サイクルとしてこれを３０サイクル行った。当該反応溶液を２％アガロースゲル電気泳動に供することにより、約０．５ｋｂのＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡをフェノール・クロロホルム処理した後、エタノール沈殿することによりＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡを超純水に溶解し、この溶解液にＮｈｅＩ ２．５μｌ及びＨｉｎｄIII ２．５μｌを加え、３７℃で３時間保温した後、当該溶解液を２％アガロースゲル電気泳動に供することにより、約０．５ｋｂのＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡをエタノール沈殿することにより再びＤＮＡを回収した（以下、コラーゲンプロモーターＤＮＡと記す。）。
【００７２】
一方、ホタルルシフェラーゼをコードする塩基配列を有するベクターｐＧＬ３（プロメガ、カタログ番号Ｅ１７５１）をＮｈｅＩ及びＨｉｎｄIIIで消化した後、上記と同様にアガロースゲル電気泳動に供することにより、約５ｋｂのＤＮＡ（以下、ＬｕｃベクターＤＮＡと記す。）を回収した。回収されたＤＮＡをエタノール沈殿することにより再びＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡに蒸留水４４μｌ、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造、カタログ番号２１２０Ａ）に添付されたＢｕｆｆｅｒ５μｌ及びＡｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造、カタログ番号２１２０Ａ）１μｌを加えて、この混合液を６５℃で３０分間保温した。次に、当該混合液を２回フェノール・クロロホルム処理した（以下、該操作をＢＡＰ処理２と記す。）。
次いで、前記コラーゲンプロモーターＤＮＡ 約２０ｎｇ及びＬｕｃベクターＤＮＡ 約２０ｎｇを混合した後、この混合液にＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｖｅｒ２酵素溶液を同量添加して１６℃で一昼夜保温した。当該混合液に大腸菌５Ｈｄα（ＴＯＹＯＢＯ、カタログ番号ＤＮＡ−９０３）を加えて氷中に３０分間放置し、次いで４２℃、４５秒間保温した後、得られた大腸菌を５０μｇ／ｍｌ アンピシリンナトリウム（ナカライ、カタログ番号０２７−３９）を含むＬＢプレートに播種し、３７℃、一昼夜放置した。出現したシングルコロニーを５０μｇ／ｍｌ アンピシリンを含むＬＢ培地２ｍｌで３７℃、１２時間培養した。得られた培養液からＡＵＴＯＭＡＴＩＣ ＤＮＡ ＩＳＯＬＡＴＩＯＮ ＳＹＳＴＥＭ ＰＩ−５０（ＫＵＲＡＢＯ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。調製されたプラスミドＤＮＡの塩基配列をＤＮＡシークエンサーで分析した結果、ヒトＩ型コラーゲンα２鎖遺伝子のプロモーター領域の−３４２〜＋５７（転写開始点を＋１とする。）の塩基配列の下流に、ホタルルシフェラーゼをコードする塩基配列が接続されてなる塩基配列を保有していることが確認された（以下、ＣＯＬ−Ｌｕｃと記す。）。
【００７３】
（２）本蛋白質発現ベクターの調製
実施例１（１）で調製された全ＲＮＡ溶液とＴＨＥＲＭＯＳＣＲＩＰＴ ＲＴ−ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、カタログ番号１１１４６−０２４）とを用いて逆転写反応を行なった。即ち、まず全ＲＮＡ溶液 １μｇ、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）20 １μｌ及びＤＥＰＣ−Ｔｒｅａｔｅｄ Ｗａｔｅｒを計１０μｌになるように加えて混合し、この混合液を６５℃、５分間保温した後、直ちに氷冷した。次に当該混合液に、５ｘｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ ４μｌ、ＲＮａｓｅＯＵＴ １μｌ、ＤＴＴ １μｌ、ＤＥＰＣ−ＴｒｅａｔｅｄＷａｔｅｒ １μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ ２μｌ及びＴＨＥＲＭＯＳＣＲＩＰＴ ＲＴ １μｌを添加して５５℃、１時間保温し、続いて、８５℃、５分間保温した。さらに当該混合液にＲＮａｓｅ Ｈ １μｌを加えて３７℃、２０分間保温した。得られた溶液 １μｌ、配列番号１９で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（１０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、配列番号２０で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（１０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、蒸留水２９μｌ、ＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ（宝酒造、カタログ番号ＲＲ００２Ａ）に含まれるｂｕｆｆｅｒ ５μｌ、Ｍｇ2+溶液５μｌ、ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ ５μｌ及びＬＡ Ｔａｑ ０．５μｌを混合した後、得られた混合液を９４℃、５分間保温した。続いて、９４℃、１分間次いで６０℃、１分間さらに７２℃、２分間の保温を１サイクルとしてこれを３５サイクル行い、さらに７２℃、７分間保温した。保温後の混合液を４℃に保存した。保存された混合液を１％ＡｇａｒｏｓｅＬゲルを用いた電気泳動に供した。約１ｋｂのＤＮＡを含むゲル部分を切り出した後、これを６５℃、５分間保温した。得られたゲル溶解液をエタノール沈殿することによりＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡに蒸留水 ４０μｌ、１０ｘＨ Ｂｕｆｆｅｒ ５μｌ、ＨｉｎｄIII（宝酒造、カタログ番号１０６０Ａ）２．５μｌ 、ＸｂａＩ（宝酒造、カタログ番号１０９３Ａ）２．５μｌを添加して３７℃、３時間保温した。この混合液を１％アガロースゲル電気泳動に供することにより、約１ｋｂのＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡをエタノール沈殿し、得られた沈殿（ＤＮＡ）をＴＥ溶液２０μｌに溶解した。
一方、ｐＲｃ／ＲＳＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号２８−００５１）をＨｉｎｄIII及びＸｂａＩで消化した後、この消化物にＢＡＰ処理し、さらにエタノール沈殿した。得られた沈殿（ＤＮＡ）と、上記で得られた約１ｋｂのＤＮＡとをライゲーションした。このようにしてＹＢ−１／ＲＳＶを構築した。
【００７４】
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列の部分アミノ酸配列からなる本蛋白質の発現ベクターの調製
ＹＢ−１／ＲＳＶを鋳型として、配列番号２３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号２４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて上記（２）と同様にＰＣＲを行なうことにより、ヒトＹＢ−１のＮ末端から１番目のアミノ酸から１２９番目のアミノ酸までのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ（以下、ＹＢｄｅｌ ＤＮＡと記す。）を調製した。ＹＢｄｅｌ ＤＮＡをＨｉｎｄIII及びＸｂａＩで消化した後、上記（２）と同様にして、ＨｉｎｄIII及びＸｂａＩで消化したｐＲｃ／ＲＳＶのＤＮＡとライゲートした。得られたプラスミドをＹＢｄｅｌ／ＲＳＶと名付けた。
【００７５】
（４）レポーター遺伝子の発現量測定
正常ヒト胎児皮膚線維芽細胞 １ｘ１０6細胞を６０ｍｍディッシュに播種し、１０％ＦＢＳを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ−ＭＥＭ（日水製薬、カタログ番号０５９１９）培地（以下、該培地をＤ−ＭＥＭ（＋）と記す。）中で３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下において一晩培養した。次いで培地を、ＦＢＳを含まないＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ−ＭＥＭ培地（以下、該培地をＤ−ＭＥＭ（−）と記す。）に置換した。
Ｄ−ＭＥＭ（−） １００μｌに、ＹＢ−１／ＲＳＶまたはｐＲｃ／ＲＳＶのいずれか５０ｎｇと、ＣＯＬ−Ｌｕｃ ４μｇとを加え、この混合液を室温で４５分間放置した（溶液１）。また、Ｄ−ＭＥＭ（−） １００μｌにＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１８２９２−０１１）６μｌを加え、この混合液を室温で４０分間放置した（溶液２）。次に、溶液１と溶液２とを混合し、室温で１０分間放置した後、この混合液にＤ−ＭＥＭ（−）１．８ｍｌを加え、混合した。当該混合液を前記正常ヒト胎児皮膚線維芽細胞に添加した後、当該細胞を３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下で６時間培養した。その後、ディッシュから培養上清を除いて細胞をＤ−ＭＥＭ（−）で２回洗浄し、０．１％ＦＢＳを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ−ＭＥＭ培地［以下、Ｄ−ＭＥＭ（０．１％）と記す。］４ｍｌを添加し３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下で１時間培養した。当該細胞に、コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子であるＴＧＦβ（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ、カタログ番号）５μｇ／ｍｌ水溶液を４μｌ添加（培地中のＴＧＦβ濃度：５ｎｇ／ｍｌ）し、３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下でさらに４０時間培養した。尚、ＴＧＦβ無添加試験区では、ＴＧＦβに代えて蒸留水４μｌを用いた。培養された細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、細胞溶解剤（東洋インキ、カタログ番号ＰＤ１０）１５０μｌを加えセルスクレイパー（Ｎａｌｇｅｎ、カタログ番号１７９６９３）を用いて細胞を器壁から剥がした。得られた細胞懸濁液を回収した後、この細胞懸濁液を遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、５分間）し、上清を回収した。回収された上清各１５μｌを９６ウエルプレートに移した後、ＭＩＣＲＯＬＵＭＡＴ ＬＢ９６Ｐ（ＥＧ＆Ｇ ＢＥＲＴＨＯＬＤ社製）を用いて、Ｌｕｃアッセイ溶液（２０ｍＭ Ｔｒｉｃｉｎｅ（ｐＨ７．８）、２．６７ｍＭ ＭｇＳＯ4、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、３３．３ｍＭ ＤＴＴ、２７０μＭ Ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ａ、５３０μＭＡＴＰ、４７０μＭ Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ）５０μｌを当該プレートに自動分注した後、各ウェル内の発光量を測定した（Ｄｅｌａｙ：１．６秒、Ｍｅａｓ．Ｉｎｔｅｒｖａｌ：５秒）。
一方、回収された上清５μｌを、予め９６ウエルプレートに分注された５倍希釈Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ溶液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カタログ番号５００−０００６）２００μｌに加えて振とう混合した後、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ）を用いて各ウェル内の５９５ｎｍの吸光度を測定した。陰性対照区では、該上清に代えて細胞溶解剤５μｌを用いた。上記の測定で得られた値を基にし、次式に従ってプロモーター活性を算出した。
プロモーター活性＝［Ｌｕｃ活性（上清添加試験区）−Ｌｕｃ活性（細胞溶解剤添加試験区）］／［５９５ｎｍ吸光度（上清添加試験区）−５９５ｎｍ吸光度（細胞溶解剤添加試験区）］
結果を表６に示す。
【００７６】
【表６】
【００７７】
（５）レポーター遺伝子の発現量を指標とした被験物質のＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能
被験物質としてサンショウエキス及びボダイジュエキスを使用した。
サンショウエキス［一丸ファルコス製、ファルコレックス（一丸ファルコス登録商標）サンショウ］２ｍｌ及びシナノキエキス［一丸ファルコス製、ファルコレックス（一丸ファルコス登録商標）ボダイジュ］２ｍｌをそれぞれ凍結乾燥した後、得られた凍結乾燥物５０ｍｇ当り１ｍｌのジメチルスルフォキサイド（以下、ＤＭＳＯと記す。）を加えて混合することにより、サンショウエキス試料及びボダイジュエキス試料を得た。
正常ヒト胎児皮膚線維芽細胞 １ｘ１０6を６０ｍｍディッシュに播種し、Ｄ−ＭＥＭ（＋）培地中で３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下において一晩培養した後、培地をＤ−ＭＥＭ（−）培地に置換した。一方、Ｄ−ＭＥＭ（−） １００μｌに、実施例２（３）で調製された結合型レポーターベクターのＤＮＡ ２μｇ又は非結合型レポーターベクターのＤＮＡ ２μｇのいずれかを加え、この混合液を室温で４０分間放置した（溶液１）。また、Ｄ−ＭＥＭ（−） １００μｌにＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１８２９２−０１１）４．５μｌを加え、この混合液を室温で４０分間放置した（溶液２）。次に、溶液１と溶液２とを混合し、室温で１０分間放置した後、この混合液にＤ−ＭＥＭ（−）２ｍｌを加え、混合した。当該混合液を前記正常ヒト胎児皮膚線維芽細胞に添加した後、当該細胞を３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下で６時間培養した。その後、ディッシュから培養上清を除いて細胞をＤ−ＭＥＭ（−）で２回洗浄し、Ｄ−ＭＥＭ（＋）４ｍｌを添加し３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下で１時間培養した。
上記のサンショウエキス試料又はボダイジュエキス試料をそれぞれ１ｍｇ凍結乾燥物／ｍｌ ＤＭＳＯとなるよう希釈した。得られた希釈液４μｌをそれぞれ、レポーターベクターが導入された上記の正常ヒト胎児皮膚線維芽細胞に添加し（培地中の試料濃度：１μｇ凍結乾燥物／ｍｌ、培地中のＤＭＳＯ濃度：０．１％）、３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下でさらに４０時間培養した。陰性対照区では、試料に代えてＤＭＳＯ４μｌ（培地中のＤＭＳＯ濃度が０．１％となるように添加）を用いた。陽性対照区では、試料に代えてインターフェロン−γ（以下、ＩＦＮ−γと記す。Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１０４０５９６）を培地中のＩＦＮ−γ濃度が１００Ｕ／ｍｌとなるように添加）を用いた。
培養された細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、実施例２（４）と同様にＣＡＴ活性を測定した。
結果を表７に示す。いずれの試料もレポーター遺伝子の発現量を低下させることが判明した。即ち、ボダイジュエキス及びサンショウエキスは、Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を充分に有することが確認できた。このようにＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を有する物質を選抜できることが確認できた。
【００７８】
【表７】
【００７９】
実施例８ （コラーゲン蓄積抑制剤：I型コラーゲン遺伝子の転写調節能を有する物質）
（１）サンショウから抽出精製された化合物
（１−１）サンショウからの化合物の抽出精製
サンショウ果皮３ｋｇに１００％エタノール２５ｋｇを加えて１０日間浸漬した後、濾紙でろ過し、濾液を回収した。回収された濾液を減圧濃縮した後、この濃縮液から上清を分取し、そのうち２ｇをエタノールと水の１：１（ｖ／ｖ）混合液３ｍｌと混合した。この混合液をシリカゲルＴＬＣプレート（メルク社製、Ａｒｔ．５７４４，２０ｘ２０ｃｍ，０．５ｍｍ厚）（２０枚）に塗布し、クロロホルムとメタノールの混合液８：１（ｖ／ｖ）で展開した。Ｒｆ値０〜０．０５の画分をかき取り、メタノールと水の９：１（ｖ／ｖ）混合液５０ｍｌで溶出した。溶出液を窒素気流下に蒸発乾固した後、残渣をメタノールと水の１：１（ｖ／ｖ）混合液１ｍｌに溶解した。この溶解液をシリカゲルＴＬＣプレート（１０枚）に塗布し、クロロホルムとメタノールと水の３０：１０：１（ｖ／ｖ／ｖ）混合液で展開した。Ｒｆ値０．７の画分をかき取り、メタノール３０ｍｌで溶出した。溶出液から溶媒を減圧下に蒸発させた後、残渣をメタノール１ｍｌに溶解した。この溶解液をＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ ＡＭカラム（ＹＭＣ社製、１０ｍｍＩ．Ｄ．ｘ２５ｃｍ）を用いた高速液体クロマトグラフィー（溶出液：メタノールと水の１：１（ｖ／ｖ）混合液）に供した。保持時間２９分の画分を分取し、分取された溶出液から溶媒を窒素気流下に留去させることにより化合物Ａ（０．５ｍｇ）を得た。
【００８０】
（１−２）抽出精製された化合物の物性分析
化合物Ａの物性を分析した。
【００８１】
1Ｈ−ＮＭＲスペクトル
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）δ：１．１４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），１．１７（６Ｈ，ｓ），２．２９−２．４０（４Ｈ，ｍ），３．２５（２Ｈ，ｓ），３．６５−３．６８（１Ｈ，ｍ），３．９５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，６．２Ｈｚ），５．４４（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１０．４Ｈｚ），５．７６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１５．３Ｈｚ），６．００−６．０７（２Ｈ，ｍ），６．５８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．９Ｈｚ，１５．７Ｈｚ），６．７９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．１Ｈｚ）
【００８２】
質量分析スペクトル
ＦＡＢ−ＭＳ：２９８［Ｍ＋Ｈ］+，ＨＲＭＳ：２９８．２０１９［Ｍ＋Ｈ］+
分子式；Ｃ16Ｈ28ＮＯ4
【００８３】
構造式
（１−３）化合物Ａが有するI型コラーゲン遺伝子の転写調節能
実施例７（５）と同様にして、結合型レポーターベクターが導入された正常ヒト胎児皮膚線維芽細胞を用いて、化合物Ａが有するI型コラーゲン遺伝子の転写調節能を検定した。当該細胞に、培地中の化合物Ａの最終濃度が８μＭとなるように調製された化合物Ａのメタノール溶液（被験物質）を接触させた。尚、陰性対照区では、化合物Ａのメタノール溶液に代えて該溶液と同量のメタノールを用いた。その結果、化合物Ａを接触させた区におけるＣＡＴ相対活性（陰性対照区のＣＡＴ活性を１．０としたときの試験区のＣＡＴ活性）は０．７であり、化合物ＡがI型コラーゲン遺伝子の転写調節能を有することが確認できた。つまり、化合物Ａはコラーゲン蓄積抑制剤の有効成分となりえることが判明した。
【００８５】
実施例９ （本蛋白質依存的コラーゲン抑制経路の正因子投与によるコラーゲン蓄積抑制方法：肝線維症モデルマウスを用いた被験物質のコラーゲン蓄積抑制能検定）
（１）試料調製
サンショウエキス［一丸ファルコス製、ファルコレックス（一丸ファルコス登録商標） サンショウ］の凍結乾燥物及びシナノキエキス［一丸ファルコス製、ファルコレックス（一丸ファルコス登録商標）ボダイジュ］の凍結乾燥物それぞれに、生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム水溶液）を１５０ｍｇ凍結乾燥物／ｍｌとなるように加えて混合することにより、それぞれサンショウエキス試料、ボダイジュエキス試料を調製とした。またコラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子として、四塩化炭素（和光、カタログ番号０３０−１５７３１）に等量のコーンオイル（ナカライテスク、カタログ番号２５６−０６）を加えて均一になるまで混合した、四塩化炭素溶液を用いた。
【００８６】
（２）試料投与
７週齢雄Ｂａｌｂ／ｃマウス（日本チャールズリバー、体重２５〜３０ｇ）に、上記（１）により調製されたサンショウエキス試料又はボダイジュエキス試料を０．５ｇ凍結乾燥物／ｋｇ体重（１００μｌ／３０ｇ体重）となるように経口ゾンデ（フチガミ器械、カタログ番号６２０２）を用いて毎日１回、４週間連続して経口投与した。サンショウエキス試料又はボダイジュエキス試料の投与開始１週間後から開始して１週間毎に４回、四塩化炭素溶液を３．５ｍｌ／ｋｇ体重となるように経口投与した（以下、該投与群を各々サンショウ群、ボダイジュ群と記す。）。また、これらエキス試料に代えて生理食塩水を１００μｌ／３０ｇ体重となるよう、毎日１回、４週間連続経口投与し、かつ、四塩化炭素溶液の代えてコーンオイルのみを３．５ｍｌ／ｋｇ体重となるように経口投与した群（以下、該投与群を未処理群と記す。）と、エキス試料に代えて生理食塩水を１００μｌ／３０ｇ体重となるよう、毎日１回、４週間連続経口投与し、かつ、四塩化炭素溶液を１週間ごとに計４回経口投与した群（以下、該投与群をコントロール群と記す。）とを設けた。尚、各群マウス２匹を用いた。サンショウエキス試料又はボダイジュエキス試料の最終投与から１週間後、マウスをエーテル麻酔した後に肝臓中葉を摘出した。摘出された肝臓中葉は直ちに液体窒素に浸せきされた。
【００８７】
（３）コラーゲン蓄積抑制能検定
ホウ酸バッファーは、６．１８ｇのホウ酸と２２．５ｇのＫＣｌを蒸留水に溶かし、水酸化カリウムでｐＨ８．７に調整した後に全量を１００ｍｌにすることにより調製された。クロラミンＴ溶液は、クロラミンＴ（ナカライテスク、カタログ番号０８０−０５）１．４１ｇを２−メトキシエタノール（ナカライテスク、カタログ番号１５３−１０）２５ｍｌに溶解することにより調製された。ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド溶液は、ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド（ナカライテスク、カタログ番号１２８−１６）１２ｇをエタノール２０ｍｌに溶かし、この溶液に氷冷しながら濃硫酸２．７４ｍｌ−エタノール２０ｍｌ混合液をゆっくり加えて混合にすることにより調製された。ヒドロキシプロリン標準液は、ヒドロキシ−Ｌ−プロリン（ナカライテスク、カタログ番号１８８−１７）３ｍｇを蒸留水１ｍｌに溶解（３ｍｇ／ｍｌ）にすることにより調製された。
上記（２）により得られた肝臓中葉約５０ｍｇをネジ付きガラス製試験管１３ｘ１００ｍｍ（ＩＷＡＫＩ、カタログ番号ＴＳＴ−ＳＣＲ１３−１００）に取り、６Ｎ ＨＣＬ １ｍｌを加えて１１０℃にて２０時間加水分解した。得られた加水分解液に５Ｍ水酸化カリウム １ｍｌを加えた後、この溶液をフィルター（０．２２μｍ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、カタログ番号ＳＬＧＰ Ｒ２５ＬＳ）でろ過し、ろ液を回収した。回収されたろ液１ｍｌに蒸留水１ｍｌを加えて、以下の試料溶液とした。またヒドロキシプロリン標準液０、１、２又は４μｌ（それぞれヒドロキシプロリン０、３、６又は１２μｇに相当する。）を蒸留水２ｍｌに加え、これを標準溶液とした。試料溶液及び標準溶液それぞれに、ＫＣＬ １．５ｇ、１０％アラニン水溶液（ｐＨ ８．７）０．２５ｍｌ及びホウ酸バッファー０．５ｍｌを加えて混合し、この混合液を室温で３０分間放置した。混合液にクロラミンＴ溶液０．５ｍｌを加えて、さらに２５分間放置した。当該混合液に３．６Ｍチオ硫酸ナトリウム（ナカライテスク、カタログ番号３２０−０６）１．５ｍｌ及びトルエン２．５ｍｌを加えた後、キャップをして５分間撹拌した。混合液を１５００ｒｐｍ、５分間遠心分離した後、上層のトルエンを吸引除去した後、残りの下層を回収した。回収された溶液を１００℃、３０分間保温した。当該溶液を流水で冷却した後、再びトルエン２．５ｍｌを加えて５分間撹拌した。混合液を１５００ｒｐｍ、５分間遠心分離した後、トルエン層を回収した。回収されたトルエン層１．２５ｍｌにｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド溶液 ０．５ｍｌを加えて室温で３０分間放置した後、この混合液について５６０ｎｍの吸光度を測定した。ヒドロキシプロリン標準液の値（ヒドロキシプロリン０μｇをブランクとする。）から検量線を作成することにより次式を得た。
ヒドロキシプロリン量（μｇ）＝１７．４１６ｘ［（試料の吸光度）−（ブランクの吸光度）］−０．１６１９ Ｒ2＝０．９９５４
この式を用いて各試料溶液中のヒドロキシプロリン量を求めることにより肝臓中１ｇ当たりに存在するヒドロキシプロリン量を算出した。結果を表８に示す。
その結果、サンショウエキス試料投与群及びボダイジュエキス試料投与群ではコラーゲン蓄積抑制効果が確認できた。つまり、サンショウエキス及びボダイジュエキスはコラーゲン蓄積抑制剤の有効成分となりえることが判明した。
【００８８】
【表８】
【００８９】
【発明の効果】
本発明により、組織におけるＩ型コラーゲン遺伝子の過剰発現を抑制し、よってコラーゲンの産生亢進を抑え、細胞外マトリックスの過度の集積に伴う種々の疾患や異状の予防、治療に有用な方法や薬剤の開発が可能となる。
【００９０】
［配列表フリーテキスト］
配列番号２
結合性配列を作製するために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号３
結合性配列を作製するために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号４
非結合性配列を作製するために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号７
非結合性配列を作製するために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１７
コラーゲンプロモーターＤＮＡを増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１８
コラーゲンプロモーターＤＮＡを増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１９
発現ベクターを作製するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２０
発現ベクターを作製するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２１
コラーゲンα１プローブを作製するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２２
コラーゲンα１プローブを作製するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２５
非結合性配列を作製するために設計されたオリゴヌクレオチド
【００９１】
【配列表】
Claims (20)
- 下記のいずれかのアミノ酸配列を有するＤＮＡ結合蛋白質を有効成分として含み、該有効成分が薬学的に許容される担体中に製剤化されてなることを特徴とするコラーゲン蓄積抑制剤。
＜アミノ酸配列＞
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列、 - 下記のいずれかのアミノ酸配列を有するＤＮＡ結合蛋白質をコードする核酸を有効成分として含み、該有効成分が薬学的に許容される担体中に製剤化されてなることを特徴とするコラーゲン蓄積抑制剤。
＜アミノ酸配列＞
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列、 - コラーゲン蓄積抑制のための、下記のいずれかのアミノ酸配列を有するＤＮＡ結合蛋白質の使用（但し、ヒトに対する使用を除く）。
＜アミノ酸配列＞
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列、 - コラーゲン蓄積抑制のための、下記のいずれかのアミノ酸配列を有するＤＮＡ結合蛋白質をコードする核酸の使用（但し、ヒトに対する使用を除く）。
＜アミノ酸配列＞
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋
白質のアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列、 - Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写抑制のための、下記のいずれかのアミノ酸配列を有するＤＮＡ結合蛋白質の使用（但し、ヒトに対する使用を除く）。
＜アミノ酸配列＞
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋
白質のアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列、 - Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写抑制のための、下記のいずれかのアミノ酸配列を有するＤＮＡ結合蛋白質をコードする核酸の使用（但し、ヒトに対する使用を除く）。
＜アミノ酸配列＞
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列、 - 非ヒト哺乳動物細胞に、下記のいずれかのアミノ酸配列を有するＤＮＡ結合蛋白質をコードする外来遺伝子を、当該外来遺伝子が前記細胞で発現する位置に置かれるように提供する工程を有することを特徴とする非ヒト哺乳動物におけるコラーゲン蓄積抑制方法。
＜アミノ酸配列＞
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列、 - 非ヒト哺乳動物細胞に、ＴＧＦ−βが前記細胞外に存在する条件下において、前記外来遺伝子を提供することを特徴とする請求項７記載のコラーゲン蓄積抑制方法。
- コラーゲン過剰蓄積に起因する疾患と診断されうる非ヒト哺乳動物の体内にある細胞に、下記のいずれかのアミノ酸配列を有するＤＮＡ結合蛋白質を投与する工程を有することを特徴とする非ヒト哺乳動物に対するコラーゲン蓄積抑制方法。
＜アミノ酸配列＞
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列、 - 線維症に羅患していると診断されうる非ヒト哺乳動物の体内にある細胞に、下記のいずれかのアミノ酸配列を有するＤＮＡ結合蛋白質を投与する工程を有することを特徴とする非ヒト哺乳動物に対するコラーゲン蓄積抑制方法。
＜アミノ酸配列＞
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列、 - 非ヒト哺乳動物細胞に、ＴＧＦ−βが前記細胞外に存在する条件下において、下記のいずれかのアミノ酸配列を有するＤＮＡ結合蛋白質を投与する工程を有することを特徴とするコラーゲン蓄積抑制方法。
＜アミノ酸配列＞
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列、 - Ｉ型コラーゲン遺伝子を有する非ヒト細胞に、下記のいずれかのアミノ酸配列を有するＤＮＡ結合蛋白質を投与する工程を有することを特徴とするコラーゲン蓄積抑制方法。
＜アミノ酸配列＞
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列、 - Ｉ型コラーゲン遺伝子を有する非ヒト細胞に、ＴＧＦ−βが前記細胞外に存在する条件下において、下記のいずれかのアミノ酸配列を有するＤＮＡ結合蛋白質を投与する工程を有することを特徴とするコラーゲン蓄積抑制方法。
＜アミノ酸配列＞
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列、 - Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を有する物質の探索方法であって、
（１）下記のいずれかのアミノ酸配列を有するＤＮＡ結合蛋白質を発現する細胞に、被験物質を接触させる第一工程、
（２）前記第一工程後に、上記のＤＮＡ結合蛋白質の細胞核内への移行量又はその量と相関関係を有する指標値を測定する第二工程、
（３）第二工程により測定された移行量又はその量と相関関係を有する指標値を、溶媒対照と比較して、前記物質が有するＤＮＡ結合蛋白質の細胞核内への移行量又はその量と相関関係を有する指標値が、溶媒対照が有するＤＮＡ結合蛋白質の細胞核内への移行量又はその量と相関関係を有する指標値よりも大きければ、前記物質がＩ型コラーゲン遺伝子の転写抑制能を有すると評価し、小さければ、前記物質がＩ型コラーゲン遺伝子の転写抑制能を有さない評価する第三工程、及び
（４）前記第三工程で評価されたＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能に基づきＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を有する物質を選抜する第四工程
を有することを特徴とする探索方法。
＜アミノ酸配列＞
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列、 - 前記細胞が、前記ＤＮＡ結合蛋白質の細胞核内への移行量と相関関係を有する指標値を提供可能とする外来性マーカー蛋白質を発現する細胞であることを特徴とする請求項１４記載の探索方法。
- Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を有する物質の探索方法であって、
（１）Ｉ型コラーゲン遺伝子を有し、かつ、下記のいずれかのアミノ酸配列を有するＤＮＡ結合蛋白質をコードする外来遺伝子を当該外来遺伝子が細胞で発現する位置に置かれるように提供されてなる細胞に、被験物質と陰性対照とを独立して接触させる第一工程
（２）前記第一工程後に、コラーゲン蓄積量を独立してモニターする第二工程、
（３）第二工程により独立してモニターされたコラーゲン蓄積量を陰性対照と比較して、前記物質を接触させてモニターされたコラーゲン蓄積量が、陰性対照を接触させてモニターされたコラーゲン蓄積量より大きければ、前記物質がＩ型コラーゲン遺伝子の転写抑制能を有さないと評価し、小さければ、前記物質がＩ型コラーゲン遺伝子の転写抑制能を有すると評価する第三工程
（４）前記第三工程で評価されたＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能に基づきＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を有する物質を選抜する第四工程、
を有することを特徴とする探索方法。
＜アミノ酸配列＞
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列、 - 第一工程が、ＴＧＦ−βが前記細胞外に存在する条件下でなされることを特徴とする請求項１６記載の探索方法。
- Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を有する物質の探索方法であって、
（１）（ａ）転写開始に必要な塩基配列を含む、Ｉ型コラーゲン遺伝子の発現調節領域を機能可能な形で連結されてなるレポーター遺伝子と、下記のいずれかのアミノ酸配列を有するＤＮＡ結合蛋白質とを含有する細胞と、（ｂ）転写開始に必要な塩基配列を含み、かつ下記のいずれかのアミノ酸配列を有するＤＮＡ結合蛋白質との結合能力を有さない塩基配列を機能可能な形で連結されてなるレポーター遺伝子と、下記のいずれかのアミノ酸配列を有するＤＮＡ結合蛋白質とを含有する細胞とにそれぞれ、被験物質を独立して接触させる第一工程、
（２）前記第一工程後に、レポーター遺伝子の発現量を独立してモニターする第二工程、
（３）第二工程により独立してモニターされた発現量を比較して、上記（ａ）のレポーター遺伝子の発現量が、上記（ｂ）のレポーター遺伝子の発現量より大きければ、前記物質がＩ型コラーゲン蓄積抑制経路の負の調節因子と評価し、小さければ、前記物質がＩ型コラーゲン蓄積抑制経路の正の調節因子と評価する第三工程、及び
（４）前記第三工程で評価されたＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能に基づきＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能を有する物質を選抜する第四工程
を有することを特徴とする探索方法。
＜アミノ酸配列＞
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列、 - 第一工程が、ＴＧＦ−βが前記細胞外に存在する条件下においてなされることを特徴とする請求項１８記載の探索方法。
- Ｉ型コラーゲン遺伝子を有する細胞に、コラーゲン蓄積促進経路の正の調節因子が前記細胞外に存在する条件下において、下記のいずれかのアミノ酸配列を有するＤＮＡ結合蛋白質依存的コラーゲン蓄積抑制経路の正の調節因子を投与する工程を有することを特徴とする非ヒト哺乳動物に対するコラーゲン蓄積抑制方法。
＜アミノ酸配列＞
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋
白質のアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であり、かつＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列
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2001
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