JPWO2002024227A1 - 腫瘍細胞増殖抑制剤 - Google Patents

Abstract

本発明は、核内受容体ＨＮＦ４αタンパク質の過剰産生により増殖する腫瘍細胞の増殖を抑制する物質、該物質を有効成分として含有する腫瘍細胞増殖抑制剤、および該腫瘍細胞増殖抑制剤を用いる腫瘍細胞増殖抑制方法に関する。

Description

技術分野
本発明は、核内受容体ＨＮＦ４αタンパク質の過剰産生により増殖する腫瘍細胞の増殖を抑制する活性を有効成分として含有する腫瘍細胞増殖抑制剤に関する。
背景技術
脂溶性ホルモンや活性型ビタミンＤ、レチノイン酸などの生体内で生物活性を持つ低分子の多くは細胞内に存在する核内受容体と称するタンパク質を通して機能を発揮している。これらの核内受容体タンパク質の多くは、ステロイドやビタミンといったリガンドと複合体を形成することにより、リガンド特異的な標的遺伝子の転写を調節する転写因子として機能する〔Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｇｙ．，１０，１４８９（１９９６）〕。構造の類似性から核内受容体であると予想される数多くのタンパク質をコードする遺伝子が発見され報告されているが、その中には、生体内リガンドが不明なオーファン受容体が数多く含まれている。
その一部には、細胞内に過剰発現するだけで機能を発揮し、構成的に転写活性を有するものが存在する。構成的転写活性化活性を示す核内受容体の一つであるＨＮＦ４αタンパク質は、成人の肝、腎、小腸、および膵臓で発現している。マウスでのＨＮＦ４αタンパク質のホモ欠失体は胎生致死であり、さらに脂質代謝、糖代謝およびアミノ酸代謝に関与する遺伝子群の発現を調節することが知られている〔Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１３，１７０８（１９９２）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，１６８３１（１９９３）〕。
一方、ＨＮＦ４αタンパク質と大腸癌の発症および増殖との関連性は示唆されている（ＷＯ９９／００１１６）が、ＨＮＦ４αタンパク質の癌細胞増殖への作用を直接示す報告はなく、特に大腸癌組織でのＨＮＦ４αタンパク質の高産生および大腸癌細胞でのＨＮＦ４αタンパク質の産生量の変化に伴う細胞増殖能の変化については報告されていない。またＨＮＦ４αタンパク質に作用するリガンドとして長鎖脂肪酸アシルＣｏＡ（パルミトイル−ＣｏＡ、ミリストイル−ＣｏＡ、ドデカノイル−ＣｏＡ、ステアロイル−ＣｏＡ、オレオイル−ＣｏＡ、リノレオイル−ＣｏＡ、リオレノイル−ＣｏＡ、エイコサペンタエノイル−ＣｏＡ、ドコサヘキサエノイル−ＣｏＡ）が報告されているが〔Ｎａｔｕｒｅ，３９２，５１２（１９９８）〕、これらリガンドによる癌細胞の増殖への作用については解析が行われていない。
発明の開示
本発明者らは、正常組識では産生していないＨＮＦ４αタンパク質の産生量が大腸癌由来の細胞株および大腸癌組識で上昇しており、該タンパク質の産生レベルを抑制することにより腫瘍細胞の増殖を抑制できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の（１）〜（２０）に関する。
（１）　ＨＮＦ４αタンパク質の過剰産生により増殖する腫瘍細胞の増殖を抑制する活性を有する物質を有効成分として含有する腫瘍細胞増殖抑制剤。
（２）　ＨＮＦ４αタンパク質の過剰産生により増殖する腫瘍細胞の増殖を抑制する活性を有する物質が、ＨＮＦ４αタンパク質の発現を阻害する物質である、上記（１）の腫瘍細胞増殖抑制剤。
（３）　ＨＮＦ４αタンパク質の発現を阻害する物質が、ＨＮＦ４αタンパク質の発現を阻害するヌクレオチドである、上記（２）の腫瘍細胞増殖抑制剤。
（４）　ＨＮＦ４αタンパク質の発現を阻害するヌクレオチドが、ＨＮＦ４αタンパク質をコードするＤＮＡ（以下、ＨＮＦ４αＤＮＡと略す）のアンチセンスヌクレオチドである、上記（３）の腫瘍細胞増殖抑制剤。
（５）　アンチセンスヌクレオチドが、５〜６０塩基のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドである、上記（４）の腫瘍細胞増殖抑制剤。
（６）　アンチセンスヌクレオチドが、配列番号７で表される塩基配列を有するＤＮＡである、上記（４）の腫瘍細胞増殖抑制剤。
（７）　アンチセンスヌクレオチドが、配列番号７で表される塩基配列の相補配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＮＦ４αタンパク質の発現を阻害するヌクレオチドである、上記（４）の腫瘍細胞増殖抑制剤。
（８）　配列番号７で表される塩基配列を有するＤＮＡ。
（９）　配列番号７で表される塩基配列の相補配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＮＦ４αタンパク質の発現を阻害するＤＮＡ。
（１０）　上記（８）または（９）のＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ。
（１１）　上記（１０）の組換え体ＤＮＡを有効成分として含有する、上記（１）の腫瘍細胞増殖抑制剤。
（１２）　ＨＮＦ４αタンパク質の過剰産生により増殖する腫瘍細胞の増殖を抑制する活性を有する物質が、ＨＮＦ４αタンパク質による転写の活性化を阻害する物質である、上記（１）の腫瘍細胞増殖抑制剤。
（１３）　ＨＮＦ４αタンパク質による転写の活性化を阻害する物質が、転写を活性化する機能が欠損したＨＮＦ４αタンパク質である、上記（１２）の腫瘍細胞増殖抑制剤。
（１４）　転写を活性化する機能が欠損したＨＮＦ４αタンパク質が、ＨＮＦ４αタンパク質のリガンド結合部位の一部またはすべてを欠失したＨＮＦ４αタンパク質である、上記（１３）の腫瘍細胞増殖抑制剤。
（１５）　転写を活性化する機能が欠損したＨＮＦ４αタンパク質が、ＨＮＦ４αタンパク質の転写促進部位またはＤＮＡ結合部位のみを有するＨＮＦ４αタンパク質である、上記（１３）の腫瘍細胞増殖抑制剤。
（１６）　転写を活性化する機能が欠損したＨＮＦ４αをコードするＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを有効成分として含有する、上記（１）の腫瘍細胞増殖抑制剤。
（１７）　組換え体ＤＮＡに用いられるベクターがウイルスベクターである、上記（１１）または（１６）の腫瘍細胞増殖抑制剤。
（１８）　ＨＮＦ４αタンパク質による転写の活性化を阻害する物質が、ＨＮＦ４α受容体のアンタゴニストである、上記（１２）の腫瘍細胞増殖抑制剤。
（１９）　腫瘍細胞増殖抑制剤が、大腸癌細胞の増殖抑制剤である、上記（１）〜（７）、（１１）〜（１８）いずれか１つの腫瘍細胞増殖抑制剤。
（２０）　上記（１）〜（７）、（１１）〜（１９）いずれか１つの腫瘍細胞増殖抑制剤を腫瘍細胞に作用させることを特徴とする腫瘍細胞増殖抑制方法。
本発明の腫瘍細胞増殖抑制剤は、ＨＮＦ４αタンパク質の過剰産生により増殖する腫瘍細胞の増殖を抑制する活性を有する物質を有効成分として含有する。
本発明において、ＨＮＦ４αタンパク質とは、ＨＮＦ４α受容体を構成するタンパク質、該タンパク質のアイソフォームおよび該タンパク質の相同タンパク質をいう。
ＨＮＦ４αタンパク質の過剰産生により増殖する腫瘍細胞としては、ＨＮＦ４αタンパク質の過剰産生により増殖する腫瘍細胞であれば、いずれの腫瘍細胞でもよい。該腫瘍細胞の例としては、例えば、大腸癌細胞があげられる。
該腫瘍細胞の増殖を抑制する活性を有する物質としては、例えば（１）ＨＮＦ４αタンパク質の発現を阻害する物質、（２）ＨＮＦ４αタンパク質による転写の活性化を阻害する物質があげられる。
ＨＮＦ４αタンパク質による転写の活性化を阻害する物質としては、例えば（ａ）転写を活性化する機能が欠損したＨＮＦ４αタンパク質、（ｂ）ＨＮＦ４αタンパク質のアンタゴニストがあげられる。
以下に、これらの物質について説明する。
（１）ＨＮＦ４αタンパク質の発現を阻害する物質
ＨＮＦ４αＤＮＡとしては、例えば、ヒトＨＮＦ４α１、ヒトＨＮＦ４α２、ヒトＨＮＦ４α４、およびラット、マウス、アフリカツメガエル由来のＨＮＦ４αがあげられる。好ましくはＨＮＦ４α２〔Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１６，９２５（１９９６）、Ｇｅｎｅ，１４７，２６９（１９９４）〕があげられる。
ＨＮＦ４αＤＮＡは、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１６，９２５（１９９６）、Ｇｅｎｅ，１４７，２６９（１９９４）等において開示された塩基配列よりＨＮＦ４αＤＮＡに特異的なプライマーまたはプローブを作製し、該プライマーあるいはプローブを用いてヒトの肝臓、腎臓、膵臓あるいは小腸由来のｃＤＮＡライブラリー等をスクリーニングすることにより、容易にクローニングすることができる。
ｃＤＮＡライブラリー作製法としては、〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）（以下、モレキュラー・クローニング　第２版と略す）〕、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｃｙ　＆　Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）、ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　１：Ｃｏｒｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等に記載された方法、あるいは市販のキット、例えばスーパースクリプト・プラスミド・システム・フォー・ｃＤＮＡ・シンセシス・アンド・プラスミド・クローニング〔ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ社製〕やＺＡＰ−ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ〔Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製〕を用いる方法などがあげられる。更に、市販のｃＤＮＡライブラリー、例えばＬｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のヒト白血球ｃＤＮＡライブラリー等を利用することもできる。
ｃＤＮＡライブラリーを作成するためのクローニングベクターとしては、大腸菌Ｋ１２株中で自立複製できるものであれば、ファージベクター、プラスミドベクター等いずれでも使用できる。具体的には、ＺＡＰ　Ｅｘｐｒｅｓｓ〔Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，５８（１９９２）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（＋）〔Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｃｓｅａｒｃｈ，１７，９４９４（１９８９）〕、λｚａｐ　ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１〔ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，１，４９（１９８５）〕、λＴｒｉｐｌＥｘ（クロンテック社製）、λＢｌｕｅＭｉｄ（クロンテック社製）、λＥｘＣｅｌｌ（ファルマシア社製）、ｐＴ７Ｔ３１８Ｕ（ファルマシア社製）、ｐｃＤ２〔Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３，２８０（１９８３）〕、ｐＵＣ１８〔Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）〕等をあげることができる。
ｃＤＮＡを組み込んだベクターを導入する大腸菌としては、大腸菌に属する微生物であればいずれも用いることができる。具体的には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ１−Ｂｌｕｅ　ＭＲＦ〔Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，８１（１９９２）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｃ６００〔Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９，４４０（１９５４）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉ ｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｙ１０８８〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８（１９８３）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｙ１０９０〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８（１９８３）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＭ５２２〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６，１（１９８３）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ８０２〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６，１１８（１９６６）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０５〔Ｇｅｎｅ，３８，２７５（１９８５）〕等を用いることができる。
クローニングの方法は、例えば、モレキュラー・クローニング　第２版等に詳細に記載されている。具体的には、ハイブリダイゼーションを用いる方法、あるいはＰＣＲを用いる方法等があげられる。
クローニングされたＨＮＦ４αＤＮＡの塩基配列は、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）〕あるいは３７３Ａ・ＤＮＡシークエンサー〔ＰＥＲＫＩＮ　ＥＬＭＥＲ社製〕等の塩基配列分析装置を用いて決定することができる。
該ＤＮＡ断片、または全長ｃＤＮＡを、発現ベクター、遺伝子導入ベクター等のベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクター、遺伝子導入ベクター等の組換え体ＤＮＡを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入する。宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞および植物細胞等を用いることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等をあげることができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｃａｎｄｉｄａ属等に属する微生物、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ　ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ　ａｌｌｕｖｉｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）〕、スフェロプラスト法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）〕、酢酸リチウム法〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１５３，１６３（１９８３）〕、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）記載の方法等をあげることができる。
動物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社製）、ｐＡＧＥ１０７〔特開平３−２２９７９、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５）、ｐＣＤＭ８〔Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０（１９８７）〕、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｃｎ社製）、ｐＡＧＥ１０３〔Ｊ．Ｂｉｏｃｈｃｍ．，１０１，１３０７（１９８７）〕、ｐＡＧＥ２１０等をあげることができる。
プロモーターとしては、動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルスに（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ　ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）等をあげることができる。
動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）等をあげることができる。
昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合には、例えばＣｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９９２）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、ＨＮＦ４αタンパク質を産生することができる。
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させることにより、昆虫細胞にＨＮＦ４αタンパク質を産生させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（ともにＩｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）等をあげることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ　ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９９２）〕、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉの卵巣細胞であるＨｉｇｈ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遣伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕等をあげることができる。
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第２６０６８５６、特許第２５１７８１３）等をあげることができる。
ＨＮＦ４αタンパク質の発現方法は、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング　第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質産生等を行うことができる。
上記方法により得られる形質転換細胞は、ＨＮＦ４αタンパク質を発現するので、本発明に用いられるＨＮＦ４αタンパク質の発現を阻害する物質のスクリーニングに用いることができる。
具体的には、被検物質を形質転換体に接触させ、ＨＮＦ４αＤＮＡの転写活性、ＨＮＦ４αタンパク質の発現量を測定するなどして、ＨＮＦ４αＤＮＡの転写またはＨＮＦ４αタンパク質への翻訳を抑制する活性を有する被検物質を、ＨＮＦ４αタンパク質の発現を阻害する物質として選択することができる。
被験物質としては、合成化合物、天然に存在する蛋白質、人工的に合成された蛋白質、ペプチド、糖質、脂質、これらの修飾体、誘導体を、また哺乳動物（例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、サル、ヒト等）の尿、体液、組織抽出物、細胞培養上清、細胞抽出物を、更に、微生物の発酵生産物、植物その他の生物の抽出物等をあげられる。
上記ＨＮＦ４α発現阻害物質を形質転換体に接触させる方法としては、該形質転換体を培養液に添加する方法があげられる。
該形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
該形質転換体を培養する培地として、該形質転換体が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該形質転換体が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中のｐＨは３．０〜９．０に保持することが好ましい。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターを導入した形質転換体を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地〔Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）〕、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）〕、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）〕、１９９培地〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ_２存在下等の条件下で１〜７日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）、Ｓｆ−９００　ＩＩ　ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５（いずれもＪＲＨ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、Ｇｒａｃｅ’ｓ　Ｉｎｓｅｃｔ　Ｍｅｄｉｕｍ〔Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２）〕等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜７、２５〜３０℃等の条件下で、１〜５日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
植物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ５〜９、２０〜４０℃の条件下で３〜６０日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
このようにして培養された形質転換体中でのＨＮＦ４αタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現量は、例えば、ＨＮＦ４αＤＮＡまたは該ＤＮＡより得られるオリゴヌクレオチドを用い、ノーザンハイブリダイゼーション法（モレキュラー・クローニング　第２版）またはＰＣＲ法〔ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（１９９０）〕、Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ法〔Ｊｕｎｋｏ　Ｓｔｅｖｅｎｓ，実験医学（増刊），１５，４６−５１（１９９７）〕により、測定することができる。また、ＨＮＦ４αタンパク質の発現量は、例えば、ＨＮＦ４αタンパク質と特異的に結合する抗体を用い、ウエスタンブロッティング法（モレキュラー・クローニング　第２版）により、測定することができる。
上記スクリーニングで得られるＨＮＦ４αタンパク質の発現を阻害する物質としては、例えば、ＨＮＦ４αＤＮＡのアンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ等のアンチセンスヌクレオチドがあげられる。
本発明のアンチセンスヌクレオチドとしては、ＨＮＦ４αＤＮＡの有する塩基配列（センス配列）に相補する塩基配列を有し、かつセンス配列の転写・翻訳を阻害するヌクレオチドであればいずれでもよい。
本発明のアンチセンスヌクレオチドは、ＨＮＦ４αＤＮＡの塩基配列に基づいて、アンチセンスプライマーを作製し、ＨＮＦ４αＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行うことによって得ることができる。また、化学合成によっても調製することができる。化学合成は、チオホスファイト法を利用した島津製作所社製のＤＮＡ合成機、フォスフォアミダイト法を利用したＰＥＲＫＩＮ　ＥＬＭＥＲ社製のＤＮＡ合成機ｍｏｄｅｌ３９２等を用いて行うことができる。本発明のアンチセンスヌクレオチドの例としては、例えば、配列番号７で表される塩基配列を有するＤＮＡがあげられる。
また、配列番号７で表される塩基配列の相補配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＮＦ４αタンパク質の発現を阻害するヌクレオチドも本発明のアンチセンスヌクレオチドに含まれる。
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチドは、配列番号７で表される塩基配列の相補配列を有するＤＮＡをプローブとして、例えばコロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、ストリンジェントな条件下で、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いて、ハイブリダイゼーションを行うことにより得られる。
ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング第２版、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）、ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　１：Ｃｏｒｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
ストリンジェントな条件とは、０．７〜１．０ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄する条件があげられる。
ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして、例えばＢＬＡＳＴ〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）〕やＦＡＳＴＡ〔Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８３，６３−９８（１９９０）〕等を用いて計算したときに、配列番号７で表される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
本発明のアンチセンスヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドであってもよい。アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、ＨＮＦ４αＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を用いて、モレキュラー・クローニング　第２版等に記載の方法により、あるいは該ＤＮＡの塩基配列情報よりＤＮＡ合成機により、ＨＮＦ４αＤＮＡの部分配列を有するアンチセンス・オリゴヌクレオチドとして、調製することができる。
該オリゴヌクレオチドとしては、例えばＨＮＦ４αＤＮＡの有する塩基配列中の連続した５〜６０塩基と同じ配列を有するＤＮＡ、該ＤＮＡと相補する塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。
更に、これらオリゴヌクレオチドの誘導体（以下、オリゴヌクレオチド誘導体という）も本発明のオリゴヌクレオチドとして利用することができる。
該オリゴヌクレオチド誘導体としては、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスフォロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスフォアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、あるいはオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体等をあげることができる〔Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，２７，１７８８（１９９９）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９６，１００１０−１００１５（１９９９）〕。
該アンチセンスヌクレオチドを適当な発現ベクターのプロモーター下流に挿入した組換え体ベクターを造成し、後述する方法により、該組換え体ベクターを腫瘍細胞に導入することにより、該腫瘍細胞の増殖を抑制することができる。発現ベクターとしては例えば、ｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）等の発現ベクターがあげられる。該発現ベクターは、ウイルスベクターであってもよい。（２）ＨＮＦ４αタンパク質による転写の活性化を阻害する物質
ＨＮＦ４αタンパク質による転写の活性化を阻害する物質の選択方法としては、被験物質を上記のＨＮＦ４αタンパク質を発現する形質転換体と接触させ、ＨＮＦ４αタンパク質の転写活性化活性を以下に示す方法で測定することにより、ＨＮＦ４αタンパク質による転写の活性化を阻害する物質を選択する方法があげられる。
ＨＮＦ４αタンパク質の転写活性化活性は以下の方法により測定できる。
ヒト子宮頚癌由来のＨｅＬａ細胞をデキストランをコートしたチャコール処理済み５％牛胎児血清（ＪＲＨバイオサイエンス社製）を含むフェノールレッド不含の最少必須培地（日本水産社製）で培養し、１０ｃｍペトリディッシュで５０％コンフルエントになった時点で、０．５μｇの上記で作成したＨＮＦ４αＤＮＡ発現ベクター、１μｇのＨＮＦ４α応答配列−ルシフェラーゼレポータープラスミド、３μｇのβ−ガラクトシダーゼ発現ベクターにＤＮＡ量が２０μｇになるようにｐＢｌｕｓｃｒｉｂｅ＋プラスミド（ストラタジーン社製）を混合したＤＮＡ混合物をリン酸カルシウム法にて導入する。また、コントロールとして、ＨＮＦ４αＤＮＡ発現ベクターを含まないＤＮＡ混合物を導入する。
遺伝子導入後２４時間培養し、培地交換を行ってさらに２４時間培養した後、細胞をかきとり、常法によりβ−ガラクトシダーゼ活性を測定してＤＮＡの細胞導入効率を確認する。導入効率を揃えるために細胞抽出液１０単位を用いて、ルシフェリンおよびＡＴＰを反応させ、Ｍｉｃｒｏ　Ｌｕｍａｔ　ＬＢ９６Ｐ（ＥＧ＆ＧＢＥＲＴＨＯＬＤ社製）にてルシフェラーゼ酵素活性測定することにより、ＨＮＦ４αタンパク質の転写活性化活性を測定することができる。
ＨＮＦ４αタンパク貿による転写の活性化を阻害する物質としては、例えば転写を活性化する機能が欠損したＨＮＦ４αタンパク質、ＨＮＦ４α受容体のアンタゴニストがあげられる。
（ａ）転写を活性化する機能が欠損したＨＮＦ４αタンパク質
転写を活性化する機能が欠損したＨＮＦ４αタンパク質としては、例えばリガンド結合部位の一部またはすべてを欠失したＨＮＦ４αタンパク質、転写促進部位またはＤＮＡ結合部位のみを有するＨＮＦ４αタンパク質等、人為的に作製したＨＮＦ４αタンパク質の改変タンパク質、あるいは生体内に存在するＨＮＦ４αタンパク質が有する転写を活性化する機能が欠損したＨＮＦ４αタンパク質のアイソフォーム等があげられる。
転写を活性化する機能が欠損したＨＮＦ４αタンパク質の具体例としては、例えばラットＨＮＦ４αタンパク質が有するアミノ酸配列のうち、第３５５位以降が欠失したラットＨＮＦ４欠失変異タンパク質があげられる〔Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１５，２１３５（１９９５）〕。
核内受容体は、その構造上の特徴から、Ａ領域〜Ｆ領域より構成されており、そのうちＡ／Ｂ領域は転写促進に、Ｃ領域はＤＮＡ結合に、そしてＥ領域はリガンドとの結合に関与することが判明している〔Ｃｅｌｌ．，８３，８４１（１９９５）〕。上記ラットＨＮＦ４欠失変異タンパク質は、Ｅ／Ｆ領域の一部のアミノ酸が欠失したものである。
したがって、転写を活性化する機能が欠損したＨＮＦ４αタンパク質としては、上記以外にも、Ｃ領域のみを保持するＨＮＦ４αタンパク質の欠失変異体、あるいはＡ／Ｂ領域のみを保持するＨＮＦ４αタンパク貿の欠失変異体も含まれる。
転写を活性化する機能が欠損したＨＮＦ４αタンパク質は、ＨＮＦ４αタンパク質による転写の活性化を阻害するため、ＨＮＦ４αタンパク質の過剰産生により増殖する腫瘍細胞の増殖を抑制する活性を有する。
該タンパク質は、ＨＮＦ４αＤＮＡの構造遺伝子部位に、例えば部位特異的突然変異誘発〔Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１００，４４８（１９８３）〕やＰＣＲ法〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ　Ｅｄｔ．，１５章，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、ＰＣＲ　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　２００−２１０（１９９１）〕等の手法により変異を導入することにより、作製することができる。また、生体内に存在するアイソフォームの場合は、上記の如くＨＮＦ４αＤＮＡ特異的なプライマーあるいはプローブを用い、ヒトの肝臓、あるいは腎臓等のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、クローニングすることができる。
該タンパク質をコードするＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーター下流に挿入した組換え体ベクターを造成し、後述する方法により、該組換え体ベクターを腫瘍細胞に導入することにより、該腫瘍細胞の増殖を抑制することができる。発現ベクターとしては例えば、ｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）等の発現ベクターがあげられる。該発現ベクターとしては、ウイルスベクターを用いてもよい。
（ｂ）ＨＮＦ４α受容体のアンタゴニスト
ＨＮＦ４α受容体のアンタゴニストを腫瘍細胞に作用させることによって、ＨＮＦ４αタンパク質の過剰産生している腫瘍細胞の増殖を抑制することができる。該アンタゴニストは、大腸癌由来の細胞であるＨＣＴ１１６（ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−２４７）およびＳＷ４８０（ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−２２８）に被験物質を接触させ、該大腸癌細胞のＨＮＦ４αＤＮＡの転写の活性化を阻害する物質をスクリーニングすることにより得ることができる。
被験試料としては、合成化合物、天然に存在する蛋白質、人工的に合成された蛋白質、ペプチド、糖質、脂質、これらの修飾体、誘導体を、また哺乳動物（例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、サル、ヒト等）の尿、体液、組織抽出物、細胞培養上清、細胞抽出物を、更に、微生物の発酵生産物、植物その他の生物の抽出物等をあげることができる。
該転写活性化活性の測定は、上記（ａ）に記載の方法に従って行うことができる。
上記の方法により取得される、ＨＮＦ４α受容体のアンタゴニストは、治療薬として単独で用いることが可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として用いることが望ましい。
該治療薬の投与方法としては、治療に際して最も効果的な方法を使用することが望ましく、経口投与または、口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与による方法を用いることができる。
該治療薬の剤形としては、軟膏剤、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、テープ剤等をあげることができる。
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等をあげることができる。
乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造することができる。
カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用い製造することができる。
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。
注射剤は、例えば、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製することができる。
座剤は、例えば、カカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製することができる。
噴霧剤は、上記で取得されたアンタゴニストをそのまま噴霧剤として用いることが可能であるが、受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該化合物を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製した噴霧剤が好ましい。
担体として、具体的には乳糖、グリセリン等を例示することができる。
上記で取得されたアンタゴニスト、および担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤を調製することが可能である。
これらの非経口剤においても、経口剤で添加剤として例示した成分を添加することができる。
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ〜８ｍｇ／ｋｇである。
（３）ヌクレオチド以外のＨＮＦ４αタンパク質の転写活性化活性を阻害する物質を有効成分として含有する腫瘍細胞増殖抑制剤
上記（１）のスクリーニングで得られるＨＮＦ４αタンパク質の発現を阻害する物質がヌクレオチド以外の物質である場合には、該阻害物質を有効成分として含有する腫瘍細胞増殖抑制剤は、上記（２）（ｂ）で得られるＨＮＦ４α受容体のアンタゴニストを有効成分として含有する腫瘍細胞増殖抑制剤と同様な方法で得ることができる。
（４）ＨＮＦ４αＤＮＡのアンチセンスヌクレオチドまたは転写を活性化する機能を欠損したＨＮＦ４αタンパク質をコードするＤＮＡを有効成分として含有する腫瘍細胞増殖抑制剤
上記（１）で得られるアンチセンスヌクレオチドまたは上記（２）（ａ）で得られる転写を活性化する機能が欠損したＨＮＦ４αタンパク質をコードするＤＮＡは、腫瘍細胞増殖抑制剤の有効成分として使用することができる。
本発明のアンチセンスヌクレオチドまたは転写を活性化する機能が欠損したＨＮＦ４αタンパク質をコードするＤＮＡを有効成分として含有する腫瘍細胞増殖抑制剤（以下、本発明の遺伝子治療剤と略す）は、該ＤＮＡを上記（１）に示した発現ベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡおよび遺伝子治療剤に用いる基剤を調合することにより製造することができる〔Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔ．，８，４２（１９９４）〕。
本発明の遺伝子治療剤に用いる基剤としては、通常注射剤に用いる基剤であればどのようなものでもよく、蒸留水、塩化ナトリウム又は塩化ナトリウムと無機塩との混合物等の塩溶液、マンニトール、ラクトース、デキストラン、グルコース等の糖溶液、グリシン、アルギニン等のアミノ酸溶液、有機酸溶液又は塩溶液とグルコース溶液との混合溶液等があげられる。また常法に従い、これらの基剤に浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、ゴマ油、ダイズ油等の植物油またはレシチンもしくは非イオン界面活性剤等の界面活性剤等の助剤を用いて、溶液、懸濁液、分散液として注射剤を調製してもよい。これらの注射剤を、粉末化、凍結乾燥等の操作により、用時溶解用製剤として調製することもできる。本発明の遺伝子治療剤は、液体の場合はそのままで、個体の場合は必要により滅菌処理をした上記の基剤に遺伝子治療の直前に溶解して治療に使用することができる。
本発明の遺伝子治療剤を細胞内に導入する方法としては、ウイルスベクターを利用した遺伝子導入方法、あるいは非ウイルス性の遺伝子導入方法〔Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．，１０，８２６（２０００）、Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．，１０，８４４（２０００）〕等、いずれの方法も適用することができる。
ウイルスベクターによる遺伝子導入方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス等のＤＮＡウイルス、またはＲＮＡウイルスに、ＨＮＦ４αＤＮＡのアンチセンス鎖またはＨＮＦ４α変異タンパク質をコードするＤＮＡ等の本発明に用いられるＤＮＡを組み込んで導入する方法があげられる。このうち、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルスを用いた方法が、特に好ましい。
非ウイルス性の遺伝子導入方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等があげられ、特にＤＮＡワクチン法、リポソーム法が好ましい。
本発明の遺伝子治療剤を実際に医薬として作用させるには、ＤＮＡを直接体内に導入するｉｎ　ｖｉｖｏ法、およびヒトからある種の細胞を取り出し体外でＤＮＡを該細胞に導入し、その細胞を体内に戻すｅｘ　ｖｉｖｏ法がある〔Ｓｅｍｉｎ　Ｏｎｃｏｌ．，２５，６６１（１９９８）、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，７１，２０３（２０００）〕が、ｉｎ　ｖｉｖｏ法が好ましく用いられる。
本発明の遺伝子治療剤をｉｎ　ｖｉｖｏ法により投与する場合は、疾患、症状等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内等に投与することができる。ｉｎ　ｖｉｖｏ法により投与する場合は、一般的には注射剤等とされ、必要に応じて慣用の担体を加えてもよい。また、リポソームまたは膜融合リポソーム（センダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソーム等）の形態にした場合は、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤とすることができる。
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ〜８ｍｇ／ｋｇである。
（５）腫瘍細胞増殖抑制活性の測定方法
本発明の腫瘍細胞増殖抑制剤について、腫瘍細胞増殖抑制活性の測定は、以下の方法で行う。
まず、本発明の腫瘍細胞増殖抑制剤を、上記（１）で得られるＨＮＦ４αタンパク質を産生している細胞または既存のＨＮＦ４αタンパク質を産生している細胞に作用させる。
本発明の腫瘍細胞増殖抑制剤を該細胞に作用させる方法としては、該腫瘍細胞増殖抑制剤が遺伝子治療剤である場合は該遺伝子治療剤を該細胞に導入する方法を、該腫瘍細胞増殖抑制剤が遺伝子治療剤以外である場合は、該腫瘍細胞増殖抑制剤を細胞に接触させる方法を、それぞれ用いることができる。
次に、該細胞を培地で培養し、生細胞数を測定する。生細胞数はミトコンドリア内に存在する脱水素酵素活性を指標にする。該脱水素酵素活性は、テトラゾリウム塩であるＸＴＴ（Ｓｏｄｉｕｍ３’−［１−（ｐｈｅｎｙｌａｍｉｎｏｃａｒｂｏｎｙｌ）−３，４−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ］−ｂｉｓ−（４−ｍｅｔｈｏｘｙ−６−ｎｉｔｒｏ）ｂｅｎｚｅｎｅ　ｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｈｙｄｒａｔｅ）を代謝して水溶性のフォルマザン色素を形成する。この酵素反応は生細胞においてのみ行われることから、色素の吸光度を測定することで生細胞の定量を行うことができる。
作用させる細胞としては、例えば大腸癌由来の細胞であるＨＣＴ１１６（ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−２４７）およびＳＷ４８０（ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−２２８）があげられる。細胞へのＤＮＡの導入法としては、例えばリポフェクション法〔Ｓｃｉｅｎｃｅ．，２６０，１５１０（１９９３）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，１８１６２（１９９１）〕があげられる。
以上の測定方法により、作製した腫瘍細胞増殖抑制剤の中から、腫瘍細胞の細胞株に対してすぐれた増殖抑制作用を示すものを容易に選択することができる。
（６）　本発明の腫瘍細胞増殖抑制剤を用いた腫瘍細胞増殖抑制方法
本発明の腫瘍細胞増殖抑制剤は、上記（２）または（４）に示す投与量および投与方法により投与することで、腫瘍細胞の増殖を抑制することができる。
発明を実施するための最良の形態
以下の参考例および実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１　種々の癌由来の培養細胞株でのＨＮＦ４αＤＮＡの発現
（１）種々の癌由来の培養細胞株の培養とｍＲＮＡおよび単鎖ＤＮＡの調製
ヒト大腸癌由来のＬＳ１８０細胞株、ＷｉＤｒ細胞株、ＳＷ４８０細胞株、ヒト肝癌由来のＨｅｐＧ２細胞株、ヒト腎癌由来のＡＣＨＮ細胞株、ヒト乳癌由来のＴ４７Ｄ細胞株、ヒト胃癌由来のＡＺ５２１細胞株、ＭＫＮ７４細胞株、ヒト膵臓癌由来のＢＸＰＣ−３細胞株、ＰＡＮＣ−１細胞株、ヒト皮膚癌由来のＳＫＭＥＬ−２６細胞株、ヒト前立腺癌由来のＤＵ１４５細胞株、ＬＮＣａＰ細胞株およびヒト子宮頚癌由来のＨｅＬａＳ３細胞株を１０％牛胎児血清（ＪＲＨバイオサイエンス社製）を含む最少必須培地（日本水産社製）中で、直径１００ｍｍの培養皿にコンフルエントの状態近くになるまで培養した。同様に、ヒト大腸癌由来のＨＣＴ１１６細胞株は１０％牛胎児血清（ＪＲＨバイオサイエンス社製）を含むマッコイ改変培地（ギブコ社製）中で培養した。
培養後、培地を除去し、リン酸緩衝液生理食塩水（以下ＰＢＳと略称する）で洗浄した。得られた細胞から、市販のＲＮイージープラントミニキット（キアゲン社製）を用いて全ＲＮＡを回収し、それぞれ約１００μｇの全ＲＮＡを得た。　市販の単鎖ＤＮＡ合成キット（ギブコ社製）を用いて、以下の方法により、全ＲＮＡから単鎖ＤＮＡを取得した。まず、上記で得られた全ＲＮＡを５μｇ含む滅菌水１１μｌにオリゴｄＴプライマー１μｌを加えて混合した後、７０℃にて１０分間加熱した。該混合液に該キットに添付の反応緩衝液を最終反応量２０μｌとなるように添加した。さらに逆転写酵素を加え、４２℃にて１時間加温してｍＲＮＡのみ逆転写反応を行い、単鎖ＤＮＡを取得した。
（２）ＰＣＲ法による発現の検出（第１図）
得られた単鎖ＤＮＡを鋳型に、ＰＣＲ法によりＨＮＦ４αＤＮＡの増幅を行った。なお、内部標準としてアクチン遺伝子を用い、該遺伝子の増幅も同時に行った。該ＰＣＲにおいて、ＨＮＦ４αＤＮＡのみを増幅することのできるオリゴヌクレオチドＤＮＡ（配列番号１および２）、およびアクチン遺伝子のみを増幅することのできるオリゴヌクレオチドＤＮＡ（配列番号３および４）を市販のＤＮＡ合成機（パーセプティブバイオシステム社製）により合成した。これらのオリゴヌクレオチドＤＮＡをプライマーとして、ＨＮＦ４αＤＮＡおよびアクチン遺伝子断片の増幅を以下の方法で行った。
上記で得られた単鎖ＤＮＡ溶液を５０倍に希釈したもの２μｌにプライマーを各４ｐｍｏｌ加えて混合した。該混合液に最終反応量が２０μｌになるように、ＥｘＴａｑキット（宝酒造）に添付の１０×ＰＣＲ反応緩衝液およびｄＮＴＰ溶液を適量加え、９４℃で５分間静置した。静置後、０．１μｌのポリメラーゼを加え、９４℃−１分間、５２℃−１分間、７２℃−１分３０秒間を１サイクルとして、ＨＮＦ４αＤＮＡの増幅には２８サイクル、アクチン遺伝子の増幅には１８サイクル行った。
ＰＣＲ反応産物を２％アガロースゲルにて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色を行った。ＵＶランプ下で確認したところ、ヒト大腸癌由来のＬＳ１８０細胞株、ＷｉＤｒ細胞株、ＳＷ４８０細胞株、ＨＣＴ１１６細胞株において、ＨＮＦ４αＤＮＡの増幅ＤＮＡ断片が確認された。該遺伝子の発現量は、既に発現が報告されているヒト肝癌由来のＨｅｐＧ２細胞株と同程度であった。その他の癌細胞株では該遺伝子の発現が検出されないことから、ＨＮＦ４αタンパク質をコードするＲＮＡの発現は大腸由来の癌細胞に特異的であることが明らかとなった。
実施例２　ＨＮＦ４αＤＮＡのアンチセンス鎖の発現による大腸癌細胞株の増殖抑制
（１）ＨＮＦ４αＤＮＡのアンチセンス鎖発現ベクターの造成（第２図）
上記実施例１（２）の操作でＨＣＴ１１６細胞株より得られた単鎖ＤＮＡを鋳型として以下の方法で、ＨＮＦ４αＤＮＡの翻訳可能領域部をＰＣＲ法にて増幅して、クローニングを行った。
配列番号５および６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドＤＮＡをＤＮＡ合成機（パーセプティブバイオシステム社製）により合成した。これらのオリゴヌクレオチドＤＮＡ各１０ｐｍｏｌをＨＣＴ１１６細胞株より得られた単鎖ＤＮＡ５μｌに加えて混合した。得られた混合液に、最終反応量５０μｌになるようにＬＡ−ＰＣＲキット（宝酒造社製）添付の１０×ＰＣＲ反応緩衝液およびｄＮＴＰ溶液を添加し、９４℃で５分間静置した。さらにポリメラーゼを加え、９４℃−１分間、５０℃−１分間、７２℃−３分間を１サイクルとして、２５サイクル繰り返した。
該反応により増幅したＨＮＦ４αＤＮＡ断片を、アガロース電気泳動法により分離し、精製した。得られたＨＮＦ４αＤＮＡ断片はプライマー末端に制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩ（宝酒造）切断部位を有している。該ＤＮＡ断片をこれらの制限酵素で処理し粘着末端とした。一方、市販の培養細胞発現用プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）（インビトロジェン社製）をＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩで切断した。該切断プラスミド断片と該ＤＮＡ断片とを市販のライゲーションキット（宝酒造）を用いて連結し、ＨＮＦ４αＤＮＡのアンチセンス鎖（配列番号７）を発現可能なプラスミドを作成した。
（２）大腸癌細胞株の増殖抑制活性の検出（第３図）
上記で作成したプラスミドを大腸癌由来の細胞株ＨＣＴ１１６およびＳＷ４８０に導入した。得られた細胞を、上記実施例１（１）で示した培地で、６穴プレート（住友ベークライト）にて培養した。１穴あたり５×１０^４個の細胞になる様に播種し、一晩培養した。上記（１）で作成したアンチセンス鎖発現プラスミドおよびｐｃＤＮＡ３．１プラスミドの混合比率を、それぞれ５：０、４：１、３：２、２：３、１：４、０：５となるように混合した後、リポフェクション法により該ＤＮＡ混合物を３μｇずつ培養細胞に導入した。該ＤＮＡ混合物を導入した細胞を３日間培養した後、以下の方法で生細胞数を測定した。
細胞増殖測定キット（ＸＴＴ）添付のＸＴＴ標識試薬と電子カップリング試薬を５０：１の比率で混合した後、該混合液を培地の半分量、培養皿に添加し適当な３時間培養した。呈色した培養液の吸光度を４８０ｎｍの波長にて測定した。その結果、アンチセンス鎖発現プラスミド量に比例して細胞増殖が抑制されていることを確認した（第３図Ａ）。また、アンチセンス鎖の発現が、各細胞株でのＨＮＦ４αタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現に及ぼす影響を調べた。
ｐｃＤＮＡ３．１プラスミドもしくはアンチセンス鎖発現プラスミド３μｇをＨＣＴ１１６およびＳＷ４８０細胞に導入し、２４時間後細胞よりＲＮＡを回収し上記で示したＰＣＲ法により検出したところ、ＨＮＦ４αタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現量はアンチセンス鎖を発現した細胞で低下していることを確認した（第３図Ｂ）。
産業上の利用可能性
本発明により、核内受容体ＨＮＦ４αタンパク質またはその変異体をコードするＤＮＡを有効成分として含有する新規な抗腫瘍遺伝子治療剤が提供される。また、ＨＮＦ４αＤＮＡの発現抑制剤もしくはＨＮＦ４αタンパク質機能阻害剤を有効成分とする抗腫瘍剤が提供される。とりわけ本発明の抗腫瘍遺伝子治療剤および抗腫瘍剤は大腸癌由来の細胞において効果を発揮するものであるため、ＨＮＦ４αタンパク質を過剰産生した大腸癌に対する治療剤として有用である。
配列表フリーテキスト
配列番号１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【配列表】

【図面の簡単な説明】
第１図　１図は、各種ヒト癌細胞株でのＨＮＦ４αタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現パターンを示す図である。大腸癌細胞株４種（ＬＳ１８０、ＷｉＤｒ、ＳＷ４８０、ＨＣＴ１１６）および肝癌細胞株ＨｅｐＧ２において、ＨＮＦ４αタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現することが示されている。
第２図　２図は、ＨＮＦ４αＤＮＡのアンチセンスＲＮＡを発現させるためのプラスミド構築を示す図である。ベクターは、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）を用いた。
第３図　３図Ａは、ＨＮＦ４αＤＮＡのアンチセンス鎖の発現による大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６およびＳＷ４８０の増殖抑制を示す図である。該アンチセンス鎖の発現量に依存して細胞増殖が抑制されることが示されている。第３図Ｂは、ＨＮＦ４αタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現量が該アンチセンスＲＮＡの発現によって減少することを示す図である。

Claims (20)

1. ＨＮＦ４αタンパク質の過剰産生により増殖する腫瘍細胞の増殖を抑制する活性を有する物質を有効成分として含有する腫瘍細胞増殖抑制剤。
2. ＨＮＦ４αタンパク質の過剰産生により増殖する腫瘍細胞の増殖を抑制する活性を有する物質が、ＨＮＦ４αタンパク質の発現を阻害する物質である、請求項１記載の腫瘍細胞増殖抑制剤。
3. ＨＮＦ４αタンパク質の発現を阻害する物質が、ＨＮＦ４αタンパク質の発現を阻害するヌクレオチドである、請求項２記載の腫瘍細胞増殖抑制剤。
4. ＨＮＦ４αタンパク質をコードするＤＮＡの発現を阻害するヌクレオチドが、ＨＮＦ４αタンパク質をコードするＤＮＡのアンチセンスヌクレオチドである、請求項３記載の腫瘍細胞増殖抑制剤。
5. アンチセンスヌクレオチドが、５〜６０塩基のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドである、請求項４記載の腫瘍細胞増殖抑制剤。
6. アンチセンスヌクレオチドが、配列番号７で表される塩基配列を有するＤＮＡである、請求項４記載の腫瘍細胞増殖抑制剤。
7. アンチセンスヌクレオチドが、配列番号７で表される塩基配列の相補配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＮＦ４αタンパク質の発現を阻害するヌクレオチドである、請求項４記載の腫瘍細胞増殖抑制剤。
8. 配列番号７で表される塩基配列を有するＤＮＡ。
9. 配列番号７で表される塩基配列の相補配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＮＦ４αタンパク賀の発現を阻害するＤＮＡ。
10. 請求項８または９記載のＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ。
11. 請求項１０記載の組換え体ＤＮＡを有効成分として含有する、請求項１記載の腫瘍細胞増殖抑制剤。
12. ＨＮＦ４αタンパク質の過剰産生により増殖する腫瘍細胞の増殖を抑制する活性を有する物質が、ＨＮＦ４αタンパク質による転写の活性化を阻害する物質である、請求項１記載の腫瘍細胞増殖抑制剤。
13. ＨＮＦ４αタンパク質による転写の活性化を阻害する物質が、転写を活性化する機能が欠損したＨＮＦ４αタンパク質である、請求項１２記載の腫瘍細胞増殖抑制剤。
14. 転写を活性化する機能が欠損したＨＮＦ４αタンパク質が、ＨＮＦ４αタンパク質のリガンド結合部位が一部またはすべてを欠失したＨＮＦ４αタンパク質である、請求項１３記載の腫瘍細胞増殖抑制剤。
15. 転写を活性化する機能が欠損したＨＮＦ４αタンパク質が、ＨＮＦ４αタンパク質の転写促進部位またはＤＮＡ結合部位のみを有するＨＮＦ４αタンパク質である、請求項１３記載の腫瘍細胞増殖抑制剤。
16. 転写を活性化する機能が欠損したＨＮＦ４αタンパク質をコードするＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを有効成分として含有する、請求項１記載の腫瘍細胞増殖抑制剤。
17. 組換え体ＤＮＡに用いられるベクターがウイルスベクターである、請求項１１または１６記載の腫瘍細胞増殖抑制剤。
18. ＨＮＦ４αタンパク質による転写の活性化を阻害する物質が、ＨＮＦ４α受容体のアンタゴニストである、請求項１２記載の腫瘍細胞増殖抑制剤。
19. 腫瘍細胞増殖抑制剤が、大腸癌細胞の増殖抑制剤である、請求項１〜７、１１〜１８いずれか１項に記載の腫瘍細胞増殖抑制剤。
20. 請求項１〜７、１１〜１９いずれか１項に記載の腫瘍細胞増殖抑制剤を腫瘍細胞に作用させることを特徴とする腫瘍細胞増殖抑制方法。

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