WO2006006583A1 - ＨＮＦ４αアイソフォーム検出による癌等の診断及び原発巣の特定 - Google Patents

ＨＮＦ４αアイソフォーム検出による癌等の診断及び原発巣の特定 Download PDF

Info

Publication number
WO2006006583A1
WO2006006583A1 PCT/JP2005/012811 JP2005012811W WO2006006583A1 WO 2006006583 A1 WO2006006583 A1 WO 2006006583A1 JP 2005012811 W JP2005012811 W JP 2005012811W WO 2006006583 A1 WO2006006583 A1 WO 2006006583A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
amino acid
cancer
acid sequence
protein
seq
Prior art date
Application number
PCT/JP2005/012811
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Makoto Naito
Toshiya Tanaka
Tatsuhiko Kodama
Takao Hamakubo
Toshiro Sakai
Hiroko Iwanari
Yasutomo Uchiyama
Original Assignee
Perseus Proteomics Inc.
The University Of Tokyo
Niigata University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Perseus Proteomics Inc., The University Of Tokyo, Niigata University filed Critical Perseus Proteomics Inc.
Priority to JP2006529051A priority Critical patent/JPWO2006006583A1/ja
Publication of WO2006006583A1 publication Critical patent/WO2006006583A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4703—Regulators; Modulating activity

Definitions

  • the present invention relates to a marker HNF4a specific for cancer (stomach cancer, liver cancer, spleen cancer, colon cancer, renal cancer, bile duct cancer, gallbladder cancer), pseudobile duct, and intestinal epithelial pseudonym.
  • the present inventors have conducted gene expression analysis using DNA chips in normal tissues, cancer cell lines, and various cancer tissues in order to identify targets for diagnosis and treatment of diseases including cancer. As a result, we succeeded in extracting genes with enhanced expression in various cancers. Among them, it was confirmed that the expression of HNF4a mRNA was increased in many cancer yarns and tissues.
  • HNF4 is an abbreviation for Hepatocyte nuclear factor, and HNF4 ⁇ and HNF4 j8 force S exist.
  • Rat HNF4 gene sequence in a in 1991 (Patent Document 1), with respect to human HNF 4 alpha is Kuroyungu cDNA is 1994 (Non-Patent Document 1), nuclear receptors involved in the development of metabolic regulation and endodermal It is one of the superfamily (Non-patent Documents 2 and 3), and it has been revealed that it is the causative gene of MODY1 (maturity—onset diabetes of the young type 1). It was not.
  • HNF4 ⁇ Human HNF4 ⁇ is responsive to alternative splicing, and there are numerous isoforms due to alternative promoter usage (PI and P2 promoters), suggesting that isoforms with different functions are expressed in different tissues.
  • PI and P2 promoters alternative promoter usage
  • HNF4a derived from the P1 promoter has been reported to have 1-6, and for those gene sequences, HNF4a1-3 are not registered for the registered force HNF4 ⁇ 4-6.
  • the gene sequence and tissue distribution of human HNF4a derived from the ⁇ 2 promoter and its function are unknown.
  • Patent Document 5 Non-Patent Document 5
  • Non-Patent Document l Gene, 1994, Sep. 30; 147 (2): 269-72
  • Non-Patent Document 2 Mol. Endcrinol., 2001, 27: 11-29
  • Non-Patent Document 3 Endcr. Rev., 1999, 20: 689-725
  • Non-Patent Document 4 Mech. Dev., 2001, 109: 183-193
  • Non-Patent Document 5 de Almeida PC, Pestana CB: AMB Rev Assoc Med Bras. 1989; 35 (3): 84-7.
  • an object of the present invention is to provide a simple and accurate method for determining the primary lesion of a cancer of unknown primary.
  • HNF4a derived from the P1 promoter, which was also known in the past, was known. It came to discover HNF4a7, HNF4a8 and HNF4a9 derived from P2 promoter different from 1-6. Furthermore, the ability to specifically recognize HNF4 ⁇ derived from the P1 promoter ⁇ An antibody that does not recognize HNF4a derived from the 2 promoter, the ability to specifically recognize HNF4a derived from the P2 promoterAn antibody that does not recognize the HNF4 a derived from the P1 promoter, and An antibody that recognizes both was successfully produced.
  • the present invention also includes a protein having an amino acid sequence ability described in SEQ ID NO: 14, or an amino acid sequence ability in which one or several amino acids are deleted, substituted, or appended in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 14,
  • the present invention also provides a protein having the amino acid sequence ability described in SEQ ID NO: 16, or one or several amino acids deleted, substituted or added in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 16.
  • the present invention provides a protein comprising an amino acid sequence and having the function of HNF4a.
  • the present invention also includes a protein having an amino acid sequence ability described in SEQ ID NO: 18, or an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 18, and the function of HNF4a
  • the protein which has this is provided.
  • the present invention also provides genes encoding the above three proteins.
  • the present invention includes a protein comprising the amino acid sequence described in IJ Nos. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, and 18 !, SEQ ID Nos.
  • the present invention provides an antibody against a peptide having 10 to consecutive LOO amino acid powers among the amino acid sequences constituting these proteins.
  • the present invention also relates to a protein comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, and 18 in a biological sample, or SEQ ID NOs: 2, 4, 6 , 8, 10, 12, 14, 16 and 18, in which one or several amino acids are deleted, substituted or added, and the amino acid sequence is also immunized to immunize a protein having the function of HNF4 ⁇ . It is intended to provide a method for judging cancer, pseudobile duct and intestinal epithelial pseudomorphism, which are characterized by detection by a pharmacological method.
  • the present invention provides a protein comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, and 18 in a biological sample, or SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, An amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence described in any one of 12, 14, 16 and 18, and the protein having the function of HNF4 ⁇ is detected by an immunological technique. Therefore, the present invention provides a method for specifying a primary tumor focus.
  • immunological techniques using antibodies that specifically recognize PNF and ⁇ 2 promoter-derived HNF4a, or both can easily diagnose and diagnose primary tumors in metastatic cancers. It is possible to identify well, and to provide technology that can meet the needs in the medical field.
  • FIG. 1 shows the reactivity of P1 antibody K9218, 182 antibody ⁇ 6939, and C-terminal antibody H1415 with HNF4 a-isoforms 1-9.
  • FIG. 2 shows an image of tissue immunostaining with antibodies from normal colon.
  • FIG. 3 shows a tissue immunostaining image of normal spleen antibody.
  • FIG. 4 shows an image of tissue immunostaining with antibodies from normal kidney.
  • FIG. 5 shows tissue immunostaining images with normal lung antibodies.
  • FIG. 6 shows tissue immunostaining images with gastric cancer antibodies.
  • FIG. 7 shows tissue immunostaining images of colon cancer and thyroid cancer antibodies.
  • FIG. 8 shows tissue immunostaining images of spleen cancer and liver cancer antibodies.
  • FIG. 9 shows images of tissue immunostaining with antibodies of renal cell carcinoma and lung adenocarcinoma.
  • the present invention provides a method for diagnosing various cancers and identifying a primary lesion of a cancer of unknown primary by detecting HNF4a isoform in a biological sample.
  • the HNF4a isoform to be detected in the present invention is a protein having an amino acid sequence ability described in SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 and 18, or SEQ ID NO: 2. 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, and 18, in which one or several amino acids are deleted, substituted, or added, and the protein has HNF4 ⁇ function. Quality.
  • the proteins of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10 and 12 correspond to HNF4a 1 to 6 derived from the P1 promoter, which are known HNF4a isoforms, respectively.
  • the proteins of SEQ ID NOs: 14, 16 and 18 are HNF4 a isoforms derived from the P2 promoter newly found by the present inventors. These are referred to as HNF4a7-9, respectively.
  • Cloning of HNF4a7, HNF4a8, and HNF4a9 is based on the base sequence of HNF4a 1-6 gene, for example, cDNA library obtained from human cancer cells. Cloning can be performed by PCR reaction using the designed primers. Examples of cancer cells to be used include Caco-2 and Kato ⁇ .
  • As the primer it is preferable to use the primer of SEQ ID NO: 19 as a forward primer and the primer of SEQ ID NO: 20 or 21 as a reverse primer.
  • the PCR is preferably RT-PCR.
  • the PCR product can be made into a recombinant vector by subcloning into a sputum vector, fragmenting the cDNA, and inserting it into a known plasmid. HNF4a7, HNF4a8, and HNF4a9 genes can be cloned by analyzing the gene of the recombinant vector.
  • HNF4a7, HNF4a8 or HNF4a9 gene an expression system using a known expression virus, expression plasmid or the like is used.
  • a known expression virus for example, baculovirus, phage, plasmid or the like is used as an expression vector.
  • host cells insect cells, yeasts, mammalian cells, E. coli, and the like are used.
  • HNF4a1 ⁇ HNF4a9 to ⁇ , ⁇ ⁇ ⁇ IJ numbers 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, and 18 amino acid sequences Amino acid sequence power in which one or several amino acid sequences are deleted, substituted or added in the amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, and 18
  • proteins having the function of HNF4 ⁇ are also included.
  • HNF4 1-9 also includes post-translationally modified proteins. There are one or more positions and types that are modified after translation. Examples of post-translational modifications include phosphorylation, saccharification, acetylation, myristoylation, and the like.
  • the HNF4 a 1 to 9 also includes pharmaceutically acceptable salts.
  • the one or several amino acid sequences are deleted, substituted or amino acid IJ is an amino acid described in IJ No. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 or 18. Same as IJ Those having a property of 80% or more, more preferably 90% or more are included.
  • the gene encoding HNF4a7, HNF4a8 or HNF4a9 includes a gene having a nucleotide sequence ability described in SEQ ID NO: 13, 15 or 17, or a gene described in SEQ ID NO: 13, 15 or 17.
  • Examples include DNA that is hybridized under stringent conditions with a base sequence complementary to DNA that also has base sequence power and that encodes a protein having the function of HNF4a.
  • stringent conditions include conditions of 50 ° C. in 0.2 X SSC containing 0.1% SDS and 60 ° C. in 1 X SSC containing 0.1% SDS.
  • Such a DNA that can be hybridized under stringent conditions includes a DNA having a similarity of 80% or more, more preferably 90% or more, with the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 13, 15, or 17.
  • the determination method of the present invention determines whether or not the patient is afflicted with a disease associated with increased expression of any of HNF4a1 to 9 in a clinical sample.
  • the disease include cancer (stomach cancer, liver cancer, spleen cancer, colon cancer, renal cancer, bile duct cancer / gallbladder cancer), pseudobile duct, and intestinal epithelial pseudonym.
  • the present invention is not limited to the case where determination is made only by detecting the protein of the HNF4a isoform, and includes cases where it is used in combination with other diagnostic methods.
  • the biological samples used in the method for determining cancer and the method for identifying the primary tumor of the present invention include (a) a tissue, (b) a culture of the collected tissue, (c) a tissue extract, d) sputum of cancer patients, (e) urine, or (f) blood. It is desirable to use (a) to (d) when judging by immunohistochemistry.
  • the tissue can be collected by biopsy. The collected tissue can be used by embedding in paraffin or frozen when immunohistological staining is performed.
  • the method for determining cancer and the method for specifying the primary tumor focus of the present invention are based on an immunological method using an antibody. Immunological techniques are accomplished by a number of means known to those skilled in the art, including immunohistochemistry, Western blotting, enzyme immunoassay (EIA, ELISA), radioimmunoassay (RIA), chemiluminescence immunization Includes assay (CLIA) and fluorescence immunoassay (FIA).
  • anti-HNF4 a-isoform antibody is detected in a tissue excised by biopsy or surgery, and the HNF4 a-isoform in the tissue is detected.
  • HE hematoxylin eosin
  • the protein obtained from the clinical specimen is separated by polyacrylamide electrophoresis with different molecular weights, and transferred to a polypyridene difluoride (PVDF) membrane or a trocellulose membrane.
  • PVDF polypyridene difluoride
  • HNF4 a isoform antibodies subsequently, Western Wa rust pel O Kishida over peptidase, alkaline phosphatase fluorescent dye, an antibody that recognizes the anti HNF4 a isoform antibodies labeled with like Piochin, the Sunawa Chi secondary antibody Detection is performed by acting. Detection may be performed by directly labeling the anti-HNF4 a-isoform antibody.
  • Detection may be performed by directly labeling the anti-HNF4 a-isoform antibody.
  • the protein size is HNF4 a isoform. This size can be the full length protein of the HNF4 a isoform, or it can be a shift of a post-translationally modified HNF4 a isoform or a fragment of the degraded HNF4 a isoform.
  • any of HNF4a 1 to 9 in a sample is captured using a solid phase (eg, immunoplate, latex particle, etc.) to which an antibody is bound by physical adsorption or chemical binding, and then captured.
  • a solid phase eg, immunoplate, latex particle, etc.
  • Any one of HNF4a 1 to 9 can be detected and quantified using a labeled antibody having an antigen recognition site different from the antibody immobilized on the solid support. It is also possible to detect and quantify a sample by immobilizing a sample on a solid phase carrier and using a labeled antibody.
  • Antibodies are roughly classified into polyclonal antibodies and monoclonal antibodies.
  • Monoclonal monoclonal antibodies are known to have high specificity by recognizing a single antigenic site.
  • the immunological technique according to the present invention preferably uses a monoclonal antibody. That is, the present invention includes the case where HNF4a1-9 is detected by a monoclonal antibody alone, a plurality of monoclonal antibodies, or a combination of a monoclonal antibody and a polyclonal antibody.
  • the antibody used in the present invention may be any of an endogenous protein or a recombinant protein that has been obtained with vitality and is an immunogen.
  • a force that is an immunogen in producing an antibody One or more full lengths of one or more of the isoforms of the HNF4a protein or a fragment thereof may be offset.
  • a synthetic peptide may be used as an immunogen, but its length is not less than 10 consecutive amino acids of the amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, and 18, 10 ⁇ : LOO amino acids, especially 10-80 amino acids are desirable.
  • N-terminal side 10- LOO amino acid peptide of HNF4 a 2 (for example, the 3rd to 49th positions described later) Peptide of 10 to 100 amino acids on the C-terminal side of HNF4 a 8 (for example, a peptide of amino acids 380 to 449 below), peptide of 10 to 100 amino acids on the N-terminal side of HNF4 a 8 (for example, 1 below) ⁇ 16th amino acid peptide).
  • the host that produces the recombinant protein is not limited. Examples include viruses, enterococci, yeast, insect cells, mammalian cells, and the like, including the production of proteins by a cell-free synthesis system. Recombinant proteins also include fusion proteins.
  • the fusion protein is a fusion protein with glutathione S-transferase (GST), maltose fusion protein (MBP), thioredoxin, polyhistidine, FLAG sequence, Xpress sequence and the like.
  • Animals producing antibodies include mammals such as mice, rabbits, goats, hidges, chickens, guinea pigs, and camels, but there are no restrictions on animal species as long as they specifically recognize HNF4a.
  • HNF4a 1 to 9 Cancer, pseudobile duct and intestinal epithelial pseudonym can be determined from the detection results of HNF4a 1 to 9 according to the present invention.
  • P1 antibody was positive in almost all cases of liver cancer and gastric cancer
  • P2 antibody was positive in 100% of gastric cancer and colon cancer.
  • the P1 antibody was positive for almost half of gastric cancer and colon cancer, and positive for biliary tract cancer and gallbladder cancer.
  • P2 antibody was positive in spleen cancer.
  • lung cancer, uterine cancer, thyroid cancer, and ovarian cancer were negative for both P1 antibody and P2 antibody.
  • HNF4a7 and 8 were cloned from Caco-2 cells, and HNF4a9 was cloned by RT-PCR using the Expand High Fidelity PCR System from Kato Kasumi Cell Force.
  • the primer used was SEQ ID NO: 19 as the forward primer.
  • SEQ ID NO: 20 was used as the reverse primer for HNF4 a 7 and 8, and SEQ ID NO: 21 was used as the reverse primer for HNF4 a 9.
  • the PCR product was subcloned into a T vector (Promega), and the cDNA was restricted to the restriction enzyme Not I.
  • the fragment cleaved in step 1 was inserted into pcDNA3 (Invitrogen)
  • the gene sequence of the prepared recombinant was confirmed by the dye terminator method (ABI).
  • the peptide of interest was prepared by recombinant g ⁇ 64 fusion protein of Autographa calif ornica nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV). With respect to the amino acid sequences 3 to 4 of HNF4a2, SEQ ID NO: 22 was used as a forward primer, and U # 23 was used as a reverse primer! The amino acids of HNF4a8 were Ij380th to 448th, and the sequence number 24 was used as a forward primer and sequence number 25 was used as a reverse primer.
  • Recombinant genes were prepared so that the cDNA corresponding to each peptide was amplified by PCR using the cDNA of human HNF4a8 in a cocoon-like form, and a fusion protein of the gp64 gene was obtained.
  • the recombinant gene was expressed by inserting the prepared recombinant gene into baculovirus DNA. That is, a recombinant virus was prepared by inserting a transfer vector and baculovirus DNA (Bac-N-Blue DNA) (Invitrogen) into Sf9 cells.
  • fetal bovine serum FBS
  • the Braquatssay method was implemented as follows. After culturing 5 x 10 6 cells in a 10 mm FBS medium in a 100 mm dish and making a 10-fold diluted virus solution series, one hour later Then, the medium was removed and agar-containing medium was placed.
  • plaques were taken with a Pasteur pipette, stirred in lmL medium, and the virus was eluted.
  • the virus was purified by performing this operation twice.
  • the purified virus was infected with 2 ⁇ 10 6 Sf9 cells and cultured at 27 ° C. for 10 days.
  • 5 mL of the virus solution was suspended in 500 mL of 2 ⁇ 10 6 Sf9 cells / mL suspension culture. After culturing for 10 days, centrifugation was performed at 1000 ⁇ g for 20 minutes to obtain a supernatant virus solution.
  • the titer was measured by the above plaque assay method, and the virus solution was infected with 500 mL of 2 ⁇ 10 6 Sf9 cell ZmL suspension culture so that the MOI was 5. Subsequently, in order to express it as a gp64 fusion protein, after 3 days of culture, centrifuge at 45000 Xg for 30 minutes to obtain the virus in the precipitated fraction, and then suspend in PBS to express purified baculovirus. I got a thing.
  • the peptides 1 to 16 of the amino acid sequence of HNF4a7 were obtained by consigning synthesis to Peptide Research Institute.
  • Purified baculovirus expression (gp64-fu sion-expressing virus particle) incorporating the amino acid sequence 3 to 49 of human HNF4 a 2 and the amino acid sequence 380 to 448 of HNF4 a 8 was used as an immunogen.
  • mice (BALBZc female 6 weeks old) were immunized three times with 100 gZ mice, and spleen cells were collected 72 hours later, and myeloma cells (P3ZNSI-1 Ag4-1) and cell fusion (Kohler G, Milst ein C) : Nature 256, 495 (1975)). Hypridoma was obtained by culturing in HAT selective medium.
  • immune antigen gp64-expressing virus particle
  • solid phase ELI SA and wild type virus particle solid phase ELIS A line, and those that react only with immune antigen were primarily selected.
  • the outline of the ELISA method is that HRP labeled anti-mouse is prepared by reacting the culture supernatant of Hyperidoma to an ELISA plate on which 0.5 ⁇ g Zwell of immunogen and wild-type virus particles are immobilized. A method of measuring the absorbance at 450 nm (immunoantigen solid-phase ELISA method) for the color development obtained after addition of the substrate through antibody reaction was used.
  • a strain that was secondarily selected as a strain that reacts only with a band specific to the HNF4a expression product of the immunizing antigen was cloned by limiting dilution to establish a monoclonal antibody-producing strain.
  • Mouse ascites was obtained by inoculating the antibody-producing antibody, ibridoma, into BALBZc mice. The ascites thus obtained was purified by ammonium sulfate salting out to obtain a monoclonal purified antibody.
  • An immunogen was prepared by conjugating peptides 1 to 16 of the amino acid sequence of HNF4a8 to keyhole limpet hemocyanin (hereinafter KLH; manufactured by Calbiochem).
  • mice (BALBZc female 6 weeks old) were immunized three times with 100 gZ mice, and spleen cells were collected 72 hours later, and myeloma cells (P3ZNSI-1 Ag4-1) and cell fusion (Kohler G, Milst ein C) : Nature 256, 495 (1975)).
  • Hypridoma was obtained by culturing in HAT selective medium.
  • immune antigen peptide solid-phase ELISA was performed to select primary ones that react with the immune antigen peptide.
  • the outline of the ELISA method is as follows: HNF4a8 amino acid sequence 1st to 16th peptide 0.5 ⁇ g Zwell is immobilized on an ELISA plate, and the culture supernatant of hyperidoma is reacted with an HRP label. The color development obtained after the addition of the substrate through the reaction of the anti-mouse antibody was 450 ⁇ The method for measuring the absorbance of m (immunoantigen solid phase ELISA) was used.
  • a large number of antibodies can be recognized by Western plotting using lysates of cells in which the full-length proteins of each isoform of HNF4 a 1 to 9 are forcibly expressed in the CHO expression system, And the isoform specificity was confirmed.
  • the outline of the Western blot is as follows: CHO cells forcibly expressing the full-length expression of HNF4a8 and lysate of host CHO cells as a negative control were applied to 6 gZlene. Acrylamide gel electrophoresis was performed. Next, the gel was transferred to a Hybond E CL membrane (manufactured by Amersham Biosciences), and after blocking the transfer membrane, the culture supernatant of Hypridoma was reacted. Next, the chemiluminescence obtained after the reaction with an HRP-labeled anti-mouse antibody and the addition of an ECL detection reagent (Amersham Bioscience) was detected by exposing the X-ray film.
  • CHO cells were cultured in 6 x 10 5 in 100 mm dishes, and 18 hours later, transformed with Tran sIT LT-1 transfection reagent (Mirus) and 8; zg pcDNA3—HNF4 a 1-9 expression vector Converted.
  • the transformed HNF4 ⁇ -expressing cultured cells were cultured for 48 hours, washed twice with ice-cold PBS, and the cells were recovered by scrubbing. The cells were centrifuged at 2000 ⁇ g for 5 minutes, and the resulting cells were suspended in ice-cold lysis buffer.
  • Buffer composition is 20mm Hepes (pH 7.9), 20% (vZv) Glyce mouth Ichinole, 400mm Kcl, 0.5mm EDTA, lmm DTT, 2 ⁇ gZ mL aprotinin, pe pstatin A, leupeptin, 0.5mm PMSF was used.
  • Cells were treated with liquid nitrogen and a 37 ° C freeze saw. This operation was dissolved by repeating 3 minutes 3 times. Dissolution Thereafter, centrifugation was performed at 20,000 X g for 10 minutes, and the protein concentration of the supernatant after centrifugation was measured by the Bradford method (Biorad) to prepare HNF4a 1-9 standards.
  • K9218 and HNF4a8 amino acid sequence 380-44 antibodies against the 8th peptide as antibodies (P1 antibodies) against the 3rd to 49th amino acid sequences of HNF4a2 H6939 was selected as the antibody (P2 antibody) against the peptides 1 to 16 of the amino acid sequence of H1415 and HNF4a8 (C-terminal antibody). That is, P1 antibody K9218 has ⁇ 1, 2, 3, 4, 5, 6 and C-terminal antibody H1415 has ⁇ 1, 2, 4, 5, 7, 8, and 3 ⁇ 423 ⁇ 4 #: ⁇ 6939 « ⁇ 7, 8, 9 It was confirmed that each reacts specifically 3 ⁇ 4
  • Hybridomas producing K9218 (FERM ⁇ -10363), hybridomas producing H14 15 (FERM ⁇ -10361) and hybridomas producing ⁇ 6939 (FERM ⁇ -10362) Deposited at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Depositary Center (Tsukuba Rokuto 1-1-5 Chuo No. 305-8566, Ibaraki Prefecture).
  • the tissue was adjusted to an appropriate size, fixed with formalin, and embedded in paraffin by a method well known to those skilled in the art.
  • HNF4a was added with 1% BSAZPBS at a final concentration of 10 / z gZmL for 2 hours at 25 ° C or 4 ° C. It was a reaction.
  • the endogenous peroxidase reaction was blocked with methanol containing 0.3% hydrogen peroxide for 30 minutes, and the secondary antibody (MultiPOX, -Chilei, Tokyo) was reacted at room temperature for 1 hour.
  • 0. lmgZmL of 3,3'-diaminobenzidine (DAB) tetrahydride chloride was reacted for 5 minutes, and nuclear staining was performed with hematoxylene.
  • DAB 3,3'-diaminobenzidine
  • tissues that are negative for Pl, P2 and C-terminal antibodies include tongue, salivary gland, esophagus, bladder, testis, prostate, ovary, uterus, mammary gland, placenta, trachea, bronchi, lung, Myocardium, skeletal and smooth muscle, liver (sinus capillary wall cells, Kupffer cells) and kidneys (endothelial cells, podocytes, mesangial cells, paraglomerular cells, distal tubules, collecting ducts, Henry) It was a hoof repertoire.
  • the tissues in which all antibodies were strongly positive were the duodenum (goblet cells, surface absorption cells,) jejunum and ileum (goblet cells, surface absorption cells, APUD cells) large intestine, and only the C-terminal antibody was negative. Liver (liver cell) and kidney (proximal tubule), and only P1 antibody was negative as spleen. In ontogeny, it was expressed in yolk sac endoderm cells.
  • colon tissue was used, as for P2 and C-terminal antibody positive examples, as for knees, as for P1 and P2 positive examples as kidneys; Examples of sex are shown in Figs.
  • Endometrial cancer (6 cases): 0 antibody positive 0 cases, 2 antibody positive 0 cases, C-terminal antibody positive 0 cases Ovarian cancer (9 cases): P1 antibody positive 0 cases, 2 antibody positive 0 cases, C-terminal antibody positive 0 cases
  • P1 antibody was positive in almost all cases of liver cancer and renal cancer, and ⁇ 2 antibody was 100% positive in gastric cancer and colon cancer.
  • the P1 antibody showed positive findings in almost half of gastric and colon cancers.
  • the rate of spleen cancer was lower than expected, ⁇ 2 antibody-positive findings were obtained, and it was confirmed that there were cases of P1 antibody-positive in biliary tract cancer and gallbladder cancer. Lung cancer, uterine cancer, thyroid cancer, and ovarian cancer were all negative.
  • Example 7 From the results of Example 7, it can be estimated with high probability that the following cancer is the primary lesion.
  • Figure shows typical immunostaining results with P1, P2 and C-terminal antibodies in the above table.
  • Kidney cancer Gastric cancer (stomach type) Gastric cancer (intestinal type)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

　癌の判定法及び癌原発巣の特定化法を提供する。 　生体試料中の、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６及び１８のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６及び１８のいずれかに記載のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列からなり、ＨＮＦ４αの機能を有するタンパク質を免疫学的手法により検出することを特徴とする癌原発巣の特定化方法。

Description

明 細 書
HNF4 aァイソフォーム検出による癌等の診断及び原発巣の特定 技術分野
[0001] 本発明は、癌（胃癌、肝癌、脾臓癌、大腸癌、腎癌、胆管癌，胆嚢癌)および偽胆管 、腸上皮仮性に特異的なマーカー HNF4 aに関する。
背景技術
[0002] 本発明者らは、癌をはじめとする疾患の診断及び治療の標的を同定するために、 正常組織、癌細胞株及び各種癌組織における DNAチップによる遺伝子の発現解析 を行ってきた。その結果、各種癌で発現が亢進している遺伝子群を抽出することに成 功した。その中でも、 HNF4 aの mRNAが多くの癌糸且織で発現が亢進していること が確認された。
[0003] HNF4とは Hepatocyte nuclear factorの略称であり、 HNF4 αと HNF4 j8力 S 存在する。ラット HNF4 aにおける遺伝子配列は 1991年に（特許文献 1)、ヒト HNF 4 αに関しては 1994年に cDNAがクローユングされ (非特許文献 1)、代謝調節や内 胚葉の発生に関与する核内受容体スーパーファミリーの一つであり（非特許文献 2、 3)、 MODY1 (maturity— onset diabetes of the young type 1)の原因遺 伝子であることが明らかにされた力 腫瘍マーカーとしての知見は知られていなかつ た。ヒト HNF4 αは alternative splicingにカロえ、 alternative promoter usage ( PIおよび P2プロモーター）により多数のァイソフォームが存在し、組織毎に異なる機 能を有するァイソフォームが発現していることが示唆されている（非特許文献 4)。 P1 プロモーター由来の HNF4 aには 1〜6が存在することが報告され、それらの遺伝子 配列については HNF4 a 1から 3は登録されている力 HNF4 α 4〜6については未 登録である。一方、 Ρ2プロモーター由来のヒト HNF4 aの遺伝子配列および組織に おける分布ならびにその機能については不明である。
[0004] 癌は世界的に増加傾向にあり、日本における死亡率第 1位の疾患である。また癌の 内でも、胃癌、肝癌、脾臓癌、大腸癌、腎癌、胆管癌，胆嚢癌の占める割合は極めて 高い。さらに、それらの癌による転移は頻繁に見られ、原発癌を特定することは治療 方針を立てる上で重要な因子となっている。また、原発不明の転移性癌の 60%は腺 癌であり、原発巣として肺癌と脾臓癌が最も多ぐ一般に予後不良であるにも関わら ず、決して稀ではないことから臨床的に大きな問題となっている (非特許文献 5)。 特許文献 1:W09211365
非特許文献 l:Gene, 1994, Sep. 30;147(2) :269-72
非特許文献 2: Mol. Endcrinol. , 2001, 27:11-29
非特許文献 3:Endcr. Rev. , 1999, 20:689-725
非特許文献 4:Mech. Dev. , 2001, 109:183-193
非特許文献 5: de Almeida PC, Pestana CB:AMB Rev Assoc Med Bras . 1989;35(3) :84-7.
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 原発不明癌の原発巣特定には病理学的、放射線学的検索が行われ、正確な診断 にたどり着くこともあるが、多くの場合、原発巣は不明のままで、病理解剖でようやく明 らカ〖こなる。この場合、臓器別に鑑別する方法であり、特定の腫瘍のマーカーを用い た検討は多くの時間を費やすば力りでなぐ十分な情報を提供できないことから、新 たな方法の医療現場への導入が望まれている。そのような背景から、マイクロアレイ 解析による癌種別の発現プロフィール解析も試みられつつあるが、その実用化の見 通しはたっていない。従って、本発明は原発不明癌の原発巣を、簡便で精度良く判 定する方法を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0006] HNF4aには相同性の高い 1から 6のァイソフォームが存在することが知られてい たが、本発明者が類似遺伝子を探索したところ、従来力も知られた P1プロモーター 由来の HNF4 a 1〜6とは異なる P2プロモーター由来 HNF4 a 7、 HNF4 a 8およ び HNF4a9を発見するに至った。さらに、 P1プロモーター由来の HNF4 αを特異 的に認識する力 Ρ2プロモーター由来 HNF4aを認識しない抗体、 P2プロモータ 一由来の HNF4 aを特異的に認識する力 P1プロモーター由来 HNF4 aを認識し な 、抗体および両者を認識する抗体の作製に成功した。それら抗体による免疫学的 手法によって、それらァイソフォームの発現が糸且織により異なることを発見した。この 結果をもとに、癌および偽胆管、腸上皮仮性の判定および原発不明癌の原発巣の 特定化に成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、配列番号 14記載のアミノ酸配列力もなるタンパク質、又は配 列番号 14記載のアミノ酸配列において 1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付カロ したアミノ酸配列力もなり、 HNF4 aの機能を有するタンパク質を提供するものである また、本発明は、配列番号 16記載のアミノ酸配列力もなるタンパク質、又は配列番 号 16記載のアミノ酸配列において 1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加した アミノ酸配列からなり、 HNF4 aの機能を有するタンパク質を提供するものである。 また、本発明は、配列番号 18記載のアミノ酸配列力もなるタンパク質、又は配列番 号 18記載のアミノ酸配列において 1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加した アミノ酸配列からなり、 HNF4 aの機能を有するタンパク質を提供するものである。 また、本発明は、上記 3種のタンパク質をコードする遺伝子を提供するものである。 また、本発明 ίま、酉己歹 IJ番号 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16及び 18の!ヽずれ力に記載 のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16及び 18の いずれかに記載のアミノ酸配列において 1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付 加したアミノ酸配列力 なり、 HNF4 αの機能を有するタンパク質、又はこれらのタン パク質を構成するアミノ酸配列のうちの連続した 10〜： LOOアミノ酸力もなるペプチドに 対する抗体を提供するものである。
また、本発明は、生体試料中の、配列番号 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16及び 18の いずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16及び 18のいずれかに記載のアミノ酸配列において 1又は数個のアミノ酸 が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列力もなり、 HNF4 αの機能を有するタンパク 質を免疫学的手法により検出することを特徴とする癌、偽胆管及び腸上皮仮性の判 定方法を提供するものである。
さらに本発明は、生体試料中の、配列番号 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16及び 18の いずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16及び 18のいずれかに記載のアミノ酸配列において 1又は数個のアミノ酸 が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列力もなり、 HNF4 αの機能を有するタンパク 質を免疫学的手法により検出することを特徴とする癌原発巣の特定化方法を提供す るものである。
発明の効果
[0008] 本発明によれば、 P1および Ρ2プロモーター由来 HNF4 aをそれぞれあるいは両 者を特異的に認識する抗体による免疫学的手法により、多くの癌の診断および転移 癌における原発巣を簡便に精度よく特定することを可能とし、医療現場でのニーズに 答えることのできる技術を提供可能とした。
図面の簡単な説明
[0009] [図 1]P1抗体 K9218、 Ρ2抗体 Η6939及び C端抗体 H1415と HNF4 aァイソフォー ム 1〜9との反応性を示す図である。
[図 2]正常大腸の抗体による組織免疫染色像を示す。
[図 3]正常脾臓の抗体による組織免疫染色像を示す。
[図 4]正常腎臓の抗体による組織免疫染色像を示す。
[図 5]正常肺の抗体による組織免疫染色像を示す。
[図 6]胃癌の抗体による組織免疫染色像を示す。
[図 7]大腸癌及び甲状腺癌の抗体による組織免疫染色像を示す。
[図 8]脾癌及び肝癌の抗体による組織免疫染色像を示す。
[図 9]腎細胞癌及び肺腺癌の抗体による組織免疫染色像を示す。
発明を実施するための最良の形態
[0010] 以下、本発明について詳細に説明する。
本発明は、生体試料中の HNF4 aアイソフォームを検出することで、各種癌の診断 および原発不明癌の原発巣を特定する方法を提供するものである。
[0011] 本発明の検出対象である HNF4 aのァイソフォームは、配列番号 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16及び 18に記載のアミノ酸配列力もなるタンパク質、又は配列番号 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16及び 18に記載のアミノ酸配列において 1又は数個のアミノ酸 が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列力もなり、 HNF4 αの機能を有するタンパク 質である。このうち、配列番号 2、 4、 6、 8、 10及び 12のタンパク質は、既知の HNF4 aのァイソフォームである、 P1プロモーター由来の HNF4 a 1〜6にそれぞれ対応す る。一方、配列番号 14、 16及び 18のタンパク質は、本発明者らが新たに見出した P 2プロモーター由来の HNF4 aァイソフォームである。これらをそれぞれ HNF4 a 7 〜9と称する。
[0012] HNF4 a 7、 HNF4 a 8及び HNF4 a 9のクロー-ングは、例えばヒト由来の癌細 胞カゝら得られた cDNAライブラリ一力ゝら HNF4 a 1〜6遺伝子の塩基配列を基にして 設計したプライマーを用いた PCR反応によりクローユングすることができる。用いる癌 細胞としては、 Caco— 2、 Kato ΙΠ等が挙げられる。プライマーとしては、フォワード プライマーとして配列番号 19のプライマーを、リバースプライマーとして配列番号 20 又は 21のプライマーを用いるのが好ましい。 PCRは、 RT— PCRが好ましい。さらに PCR産物は、 Τベクターにサブクローユングし、 cDNAを断片化し、公知のプラスミド に挿入することにより、組換えベクターとすることができる。組換えベクターの遺伝子 を解析することにより、 HNF4 a 7、 HNF4 a 8、 HNF4 a 9遺伝子がクローユングで きる。
[0013] 得られた HNF4 a 7、 HNF4 a 8又は HNF4 a 9遺伝子の発現には、公知の発現 用ウィルス、発現用プラスミド等を用いた発現系が用いられる。例えば、発現ベクター としてバキュロウィルス、ファージ、プラスミド等が用いられる。また宿主細胞としては、 昆虫細胞、酵母、哺乳動物細胞、大腸菌等が用いられる。
[0014] 本発明で用! /、る HNF4 a 1〜： HNF4 a 9に ίま、酉己歹 IJ番号 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14 、 16及び 18に記載のアミノ酸配列力もなるタンパク質だけでなぐ配列番号 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16及び 18に記載のアミノ酸配列において 1又は数個のアミノ酸配 列が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列力 なり、 HNF4 αの機能を有するタンパ ク質も含まれる。また、 HNF4ひ 1〜9には翻訳後修飾されたタンパク質も含まれる。 翻訳後修飾される位置、種類は 1又は複数個である。翻訳後修飾としては、リン酸ィ匕 、糖化、ァセチル化、ミリストイルイ匕等が挙げられる。 HNF4 a 1〜9には、医薬的に 許容される塩も含まれる。前記 1又は数個のアミノ酸配列が欠失、置換又はアミノ酸 酉己歹 IJは、酉己歹 IJ番号 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16又は 18に記載のアミノ酸酉己歹 IJとネ目同 性が 80%以上、より好ましくは 90%以上のものが含まれる。
[0015] また HNF4 a 7、 HNF4 a 8又は HNF4 a 9をコードする遺伝子には、配列番号 13 、 15又は 17に記載の塩基配列力もなる遺伝子、又は配列番号 13、 15又は 17に記 載の塩基配列力もなる DNAと相補的な塩基配列とストリンジヱントな条件でハイプリ ダイズし、かつ HNF4 aの機能を有するタンパク質をコードする DNAが挙げられる。 ここでストリンジェントな条件としては、 0. 1%SDSを含む 0. 2 X SSC中 50°C、 0. 1 %SDSを含む 1 X SSC中 60°Cの条件が挙げられる。このようなストリンジェントな条 件でノ、イブリダィズする DNAには、配列番号 13、 15又は 17に記載の塩基配列と相 同性が 80%以上、より好ましくは 90%以上のものが含まれる。
[0016] 本発明の判定方法は、臨床検体における HNF4 a 1〜9のいずれかの発現亢進が 関与する疾患に罹患している力否かを判定する。疾患としては、例えば、癌（胃癌、 肝癌、脾臓癌、大腸癌、腎癌、胆管癌 ·胆嚢癌)および偽胆管、腸上皮仮性が挙げら れる。本発明は、 HNF4 aアイソフオームのタンパク質の検出のみで判定する場合に 限定されず、他の診断方法と併せて使用される場合も含まれる。
[0017] 本発明の癌の判定方法及び癌原発巣の特定ィヒ方法に用いられる生体試料として は、（a)組織、（b)採取した組織の培養物、（c)組織抽出物、（d)癌患者の喀痰、（e) 尿、又は (f)血液等が挙げられる。免疫組織ィ匕学による判断では (a)〜（d)を用いる のが望ましい。当該組織は、バイオプシーにより採取できる。採取した組織は、免疫 組織染色する場合にはパラフィン包埋又は凍結して用いることもできる。
[0018] 本発明の癌の判定方法及び癌原発巣の特定化方法は、抗体を用いた免疫学的手 法に基づく。免疫学的手法は当業者に公知の数多くの手段によって達成され、免疫 組織化学法、ウェスタン 'ブロッテイング法、酵素免疫測定法 (EIA、 ELISA)、放射 能免疫測定法 (RIA)、化学発光免疫測定法 (CLIA)、蛍光免疫測定法 (FIA)が含 まれる。
[0019] 具体的には、免疫組織化学であれば、バイオプシー又は手術により切除された組 織などに抗 HNF4 aァイソフォーム抗体を用いて組織中の HNF4 aァイソフォーム を検出する。同時に、へマトキシリンェォジン (HE)染色を行うことで、組織型と HNF 4 aァイソフォームの発現量の関係を知ることができる。 ウェスタン 'ブロッテイングであれば、当該臨床検体から得られたタンパク質をポリア クリルアミド電気泳動で分子量の違 ヽで分離し、ポリピリ-デンジフルオライド (PVDF )膜又は-トロセルロース膜に転写を行う。その後、抗 HNF4 aアイソフォーム抗体を 作用させ、引き続き、西洋ヮサビペルォキシダーゼ、アルカリホスファターゼ蛍光色素 、ピオチンなどで標識された抗 HNF4 aアイソフォーム抗体を認識する抗体、すなわ ち二次抗体を作用させることで検出を行う。検出は抗 HNF4 aァイソフォーム抗体を 直接標識して行っても良い。タンパク質のサイズで HNF4 aァイソフォームであること を確認する。このサイズは HNF4 aァイソフォームの全長のタンパク質であってもよい し、翻訳後修飾された HNF4 aァイソフォーム、又は分解された HNF4 aアイソフォ ームの断片の 、ずれでもよ 、。
免疫測定法では、物理吸着や化学結合により抗体を結合させた固相単体 (例えば 、ィムノプレート、ラテックス粒子等）を用いて、検体中の HNF4 a 1〜9のいずれかを 捕捉した後、捕捉された HNF4 a 1〜9のいずれかを、固相担体に固定化された抗 体とは別の抗原認識部位をもつ標識ィ匕抗体を用いて検出、定量ができる。また、固 相担体に検体を固相し、標識化抗体を用いて検出、定量することも可能である。
[0020] 抗体は大別してポリクローナル抗体とモノクローナル抗体に分けられる。モノクロ一 ナル抗体は、単一の抗原部位を認識することより、特異性が高いことが知られている 。本発明による免疫学的手法は、モノクローナル抗体を用いることが望ましい。すな わち、本発明には、モノクローナル抗体単独、複数のモノクローナル抗体、又はモノ クローナル抗体とポリクローナル抗体の組み合わせにより HNF4 a 1〜9を検出する 場合が含まれる。
[0021] 本発明に用いる抗体は、生体力も得られた内在性タンパク質又は組換えタンパク 質のいずれを免疫原としたものでもよい。抗体を作製する際の免疫原である力 HN F4 aタンパク質のァイソフォームの一種類以上の全長又はその断片の 、ずれでもよ い。また、合成ペプチドを免疫原としてもよいが、その長さは配列番号 2、 4、 6、 8、 10 、 12、 14、 16及び 18記載のアミノ酸配列のうちの連続した 10アミノ酸以上、さらの 1 0〜： LOOアミノ酸、特に 10〜80アミノ酸が望ましい。このような合成ペプチドの例とし ては、 HNF4 a 2の N末端側 10〜： LOOアミノ酸のペプチド（例えば後記 3〜49番目 のアミノ酸のペプチド）、 HNF4 a 8の C末端側 10〜 100アミノ酸のペプチド（例えば 後記 380〜449番目のアミノ酸のペプチド）、 HNF4 a 8の N末端側 10〜100ァミノ 酸のペプチド（例えば後記 1〜16番目のアミノ酸のペプチド）が挙げられる。
[0022] 組換えタンパク質を産生する宿主は限定されるものではなぐ例えば、ウィルス、大 腸菌、酵母、昆虫細胞、哺乳類細胞などであり、無細胞合成系によるタンパク質の産 生も含む。組換えタンパク質には、融合タンパク質も含まれる。融合タンパク質とは、 グルタチオン S—トランスフェラーゼ（GST)、マルトース融合タンパク質（MBP)、 チォレドキシン、ポリヒスチジン、 FLAG配列、 Xpress配列等との融合タンパク質であ る。抗体を産生する動物は、マウス、ゥサギ、ャギ、ヒッジ、 -ヮトリ、モルモット、ラクダ などの哺乳動物があるが、 HNF4 aを特異的に認識する抗体であれば動物種は限 定しない。
[0023] 本発明による HNF4 a 1〜9の検出結果により、癌、偽胆管及び腸上皮仮性が判 定できる。これには、例えば、 P1プロモーター由来の HNF4 aアイソフォーム、すな わち HNF4 a 1〜6と反応する抗体（P1抗体）と、 P2プロモーター由来の HNF4 αァ イソフォーム、すなわち HNF4 a 7〜9と反応する抗体 (P2抗体）とを組み合せて検 出するのが好ましい。さらに必要に応じて HNF4 a 1〜6の一部及び HNF4 a 7〜9 の一部の両方に反応する抗体 (C端抗体)を組み合せて検出するのが好ま 、。判 定の例としては、 P1抗体は肝癌、胃癌のほとんど全例が陽性であり、 P2抗体は胃癌 、大腸癌の 100%が陽性であった。また、 P1抗体は胃癌、大腸癌のほぼ半数が陽性 であり、胆道癌、胆嚢癌でも陽性例があった。さらに P2抗体は脾臓癌でも陽性例が あった。一方、肺癌、子宮癌、甲状腺癌、卵巣癌は P1抗体、 P2抗体ともに陰性であ つた o
[0024] また、本発明による HNF4 a 1〜9の検出結果により、癌原発巣が後記表 3のように 特定化できる。
実施例
[0025] 次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定される ものではない。
[0026] [実施例 1]HNF4 a 7、 HNF4 a 8および HNF4 a 9のクロー-ング 全 RNAはいくつかの細胞種から ISOGEN (Wakoケミカル）を用いて抽出した。す なわち、 HNF4 a 7および 8は Caco— 2細胞から、 HNF4 a 9は Kato ΙΠ細胞力ら E xpand High Fidelity PCR Systemを用いて RT—PCRを行い、クロー-ング した。 cDNAを合成するためには、 RNAをランダムへキサマーによりアニーリングし、 superscript II reverse transcriptase (Invitrogenノ 用 ヽて f申長反 J心を? Tつ た。用いたプライマーはフォワードプライマーに配列番号 19と HNF4 a 7および 8のリ バースプライマーに配列番号 20、 HNF4 a 9のリバースプライマーに配列番号 21を 用いた。 PCR産物は Tベクター（プロメガ）にサブクローユングして、 cDNAを制限酵 素 Not Iで切断した断片を pcDNA3 (インビトロジェン）に挿入した。作製した組換え 体の遺伝子はダイターミネータ一法 (ABI)により遺伝子の配列を確認した。
[実施例 2]HNF4 a 2のアミノ酸配列 3番目〜49番目までのペプチドおよび HNF4 a 8のアミノ酸配列 380〜448番目までのペプチド発現ウィルスの調製と培養
(精製ウィルス発現物の取得）
目的のペプチドは Autographa calif ornicaの核多角体ウィルス (AcMNPV)の g ρ64融合タンパク質の組換え体により作製した。 HNF4 a 2のアミノ酸配列 3番目〜4 9番目について、フォワードプライマーとして、配列番号 22、リバースプライマーとして 酉己歹 U番号 23を用!ヽた。 HNF4 a 8のアミノ酸酉己歹 Ij380番目〜448番目【こつ!/ヽて、フ ォワードプライマーとして、配列番号 24、リバースプライマーとして配列番号 25を用い た。ヒト HNF4 a 8の cDN Aを铸型にそれぞれのペプチドに対応する部位を PCR法 により増幅させ、 gp64遺伝子の融合タンパク質となるように組換え体遺伝子の作成を 行った。作製した組換え体遺伝子をバキュロウィルスの DNAに挿入することで、組換 え体遺伝子の発現を行った。すなわち、トランスファーベクターとバキュロウィルス DN A (Bac— N— Blue DNA) (インビトロジェン）を Sf 9細胞に挿入することにより組換 体ウィルスを作製した。次いで、 Sf 9細胞の培養には Grace' s Insect Media, 10 %牛胎児血清 (FBS)を用い、組換え後 72から 120時間 27°Cで培養し、培養上清中 に組換えウィルスを産生し、プラークアツセィ法によりウィルスの精製を行った。ブラー クアツセィ法は次のように実施した。 10%FBSの培地に 100mmディッシュに 5 X 106 の細胞を培養し、 10倍希釈のウィルス液系列を作製したものを、感染させ、一時間後 に、培地を取り除き、寒天入り培地をのせた。 27°Cで 6日間培養し、ニュートラルレツ ドで染色を 3時間行った後、パスツールピペットでプラークを採り、 lmLの培地に入れ て攪拌しウィルスを溶出した。この操作を 2度行うことにより、ウィルスの精製をおこな つた。精製ウィルスを 2 X 106個の Sf9細胞に感染させ、 10日間 27°Cで培養を行った 。さらに、 500mLの 2 X 106Sf9細胞/ mLサスペンジョンカルチャーに、ウィルス液 の上記 5mLを懸濁した。 10日間培養後、遠心操作 1000 X g、 20分を行い、上清の ウィルス液を得た。タイターは上記プラークアツセィ法で測定し、 MOIを 5になるように 、ウィルス液を、 500mLの 2 X 106Sf9細胞 ZmLサスペンジョンカルチャーに感染さ せた。続いて、 gp64融合タンパク質として発現させるために、培養 3日後に、 45000 X gで 30分の遠心操作を行い、沈澱画分にあるウィルスを得た後、 PBSで懸濁し、精 製バキュロウィルス発現物を得た。
[0028] [実施例 3]HNF4 a 8のアミノ酸配列 1番目〜16番目までのペプチドの入手
HNF4 a 7のアミノ酸配列 1番目〜 16番目までのペプチドは株式会社ペプチド研 究所に合成を委託し、入手した。
[0029] [実施例 4]HNF4 a 2のアミノ酸配列 3番目〜49番目までのペプチド、および、 HN F4 a 8のアミノ酸配列 380〜448番目までのペプチドに対する抗体の作製
ヒト HNF4 a 2のアミノ酸配列 3番目〜49番目の配列、及び HNF4 a 8のアミノ酸配 列 380〜448番目までの配列を^ &み込んだ精製バキュロウィルス発現物（gp64—fu sion発現ウィルス粒子）を免疫原とした。
マウス (BALBZc雌 6週齢）に 100 gZ匹で 3回免疫した後、 72時間後に脾臓細 胞を採取し、骨髄腫細胞（P3ZNSI— 1 Ag4— 1)と細胞融合 (Kohler G, Milst ein C : Nature 256, 495 (1975) )を行った。 HAT選択培地で培養を行うことに より、ハイプリドーマを得た。
ノ、イブリドーマの培養上清について、免疫抗原 (gp64発現ウィルス粒子）固相 ELI S Aと野生型ウィルス粒子固相 ELIS A行 、、免疫抗原に対してのみ反応するものを 一次選択した。
[0030] ELISA法の概略は、免疫原および野生型のウィルス粒子 0. 5 μ gZwellを固相化 した ELISA用プレートに、ハイプリドーマの培養上清を反応させ、 HRP標識抗マウス 抗体の反応を経て、基質添加後に得られた発色について 450nmの吸光度を測定す る方法 (免疫抗原固相 ELISA法)を使用した。
[0031] 一次選択されたパイブリドーマについて、免疫抗原と野生型の各ウィルス粒子を用 いたウェスタンブロットを行い二次選択した。ウェスタンブロットの概略は、免疫原およ び野生型のウィルス粒子を 0. 6 /z gZlaneとなるようにアプライして、 SDS ポリアタリ ルアミドゲル電気泳動を行った。次に、 Hybond ECL膜（アマシャムバイオサイェン ス社製）に転写し、転写膜をブロッキング後、ハイプリドーマの培養上清を反応させた 。次に HRP標識抗マウス抗体を反応させ、 ECL検出試薬 (アマシャムバイオサイェン ス社)を添加後に得られた化学発光について、 X線フィルムを感光させて検出した。
[0032] 免疫抗原の HNF4 a発現物に特異的なバンドのみと反応する株として二次選択さ れたものについて限界希釈法にてクローユングを行い、モノクローナル抗体産生株を 榭立した。
[0033] 抗体産生ノ、イブリドーマを BALBZcマウスに接種することによってマウス腹水を得 た。そのようにして得た腹水から硫安塩析法で精製し、モノクローナル精製抗体を得 た。
[0034] [実施例 5]HNF4 a 8のアミノ酸配列 1番〜 16番目までのペプチドに対する抗体の 作製
HNF4 a 8のアミノ酸配列 1番目〜16番目までのペプチドをキーホールリンペット へモシァニン（以下 KLH；カルビオケム社製）にコンジュゲートさせたものを免疫原と した。
マウス (BALBZc雌 6週齢）に 100 gZ匹で 3回免疫した後、 72時間後に脾臓細 胞を採取し、骨髄腫細胞（P3ZNSI— 1 Ag4— 1)と細胞融合 (Kohler G, Milst ein C : Nature 256, 495 (1975) )を行った。 HAT選択培地で培養を行うことに より、ハイプリドーマを得た。ノ、イブリドーマの培養上清について、免疫抗原ペプチド 固相 ELISAを行 、、免疫抗原ペプチドに対して反応するものを一次選択した。
[0035] ELISA法の概略は、 HNF4 a 8のアミノ酸配列 1番目〜16番目のペプチドを 0. 5 μ gZwellを固相化した ELISA用プレートに、ハイプリドーマの培養上清を反応させ 、 HRP標識抗マウス抗体の反応を経て、基質添加後に得られた発色について 450η mの吸光度を測定する方法 (免疫抗原固相 ELISA法)を使用した。
[0036] 一次選択されたパイブリドーマにっ 、ては、 CHO発現系にて HNF4 a 8完全長発 現物を強制発現させた細胞のライセートを用いてウェスタンプロットを行い、完全長 H NF4 a 8と反応する株を二次選択した。二次選択陽性のものについて限界希釈法に てクロー-ングを行い、モノクローナル抗体産生株を榭立した。抗体産生ハイブリドー マを BALBZcマウスに接種することによってマウス腹水を得た。次いで、硫安塩析 法で精製し、精製モノクローナル抗体を得た。
[0037] [実施例 6]ウェスタンプロティングによるモノクローナル抗体の特性
多数得られた抗体について、 CHO発現系にて HNF4 a 1から 9の各ァイソフォーム の完全長蛋白質を強制発現させた細胞のライゼートを用いたウェスタンプロットを行 つて、完全長蛋白質を認識できること、およびァイソフォーム特異性を確認した。
[0038] ウェスタンブロットの概略は、 HNF4 a 8完全長発現物を強制発現させた CHO細 胞と、陰性コントロールとしての宿主 CHO細胞のライセートを、 6 gZleneとなるよう にアプライして、 SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。次に、 Hybond E CL膜 (アマシャムバイオサイエンス社製）にゲルを転写し、転写膜をブロッキング後、 ハイプリドーマの培養上清を反応させた。次に HRP標識抗マウス抗体を反応させ、 E CL検出試薬 (アマシャムバイオサイエンス社)を添加後に得られた化学発光につい て、 X線フィルムを感光させて検出した。
[0039] 細胞ライセート調製は以下の手順に従った。
CHO細胞は 100mmのディッシュに 6 X 105で培養を開始して、 18時間後に Tran sIT LT— 1トランスフエクシヨン試薬（Mirus)と 8 ;z gの pcDNA3— HNF4 a 1〜9 の発現ベクターを形質転換した。形質転換した HNF4 α発現の培養細胞を 48時間 培養した後、氷冷した PBSで二度洗浄し、細胞をスクレイビングによって回収した。細 胞は 2000 X gで 5分間遠心操作を行い、沈澱として得た細胞を、氷冷した溶解用緩 衝液で懸濁した。緩衝液の組成は 20mm Hepes (pH7. 9)、 20% (vZv)グリセ口 一ノレ、 400mm Kcl, 0. 5mm EDTA, lmm DTT, 2 μ gZ mL aprotinin, pe pstatin A, leupeptin, 0. 5mm PMSFを用いた。細胞は液体窒素と 37°Cのフリ ーズソ一の操作を行った。この操作は 3分間を 3回繰り返すことで溶解させた。溶解 後、 20, 000 X gで 10分間遠心操作を行い、遠心後の上清をブラッドフォード法 (バ ィォラッド）によりタンパク質の濃度を測定し、 HNF4 a 1〜9の標品とした。
[0040] 多数得られた抗体の中でも特に、 HNF4 a 2のアミノ酸配列 3番目〜49番目までの ペプチドに対する抗体（P1抗体）として K9218、 HNF4 a 8のアミノ酸配列 380〜44 8番目までペプチドに対する抗体 (C端抗体）として H1415および HNF4 a 8のァミノ 酸配列 1番〜 16番目までのペプチドに対する抗体（P2抗体）として H6939が選択さ れた。すなわち、 P1抗体 K9218は α 1、 2、 3、 4、 5、 6と、 C端抗体 H1415は α 1、 2 、 4、 5、 7、 8と、 Ρ2¾#:Ρί6939« α 7、 8、 9と、それぞれ特異的に反応すること力 ¾| 認された（図 1)。 K9218を産生するハイブリドーマ（FERM ΑΒΡ— 10363)、 H14 15を産生するハイブリドーマ（FERM ΑΒΡ— 10361)及び Η6939を産生するハイ ブリドーマ（FERM ΑΒΡ- 10362)を、 2004年 9月 1日にそれぞれ独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒 305— 8566 茨城県つくば巿東 1 - 1 - 1 中央第 6)に寄託した。
[0041] [実施例 7]癌の判定
(1)免疫染色
組織を適当な大きさに整えてカゝらホルマリン固定を行い、当業者に良く知られた方 法にてパラフィンに包埋した。 4 mに細切した標本をオートクレープ処理し、非特異 的反応を抑制するため、馬血清処理後、 HNF4 aを 1%BSAZPBSで最終濃度 10 /z gZmLで 2時間 25°Cまたは 4°Cでー晚反応した。 PBSで洗浄後、 0. 3%過酸ィ匕 水素含有メタノールで 30分内因性ペルォキシダーゼ反応の阻止を行 ヽ、 2次抗体（ MultiPOX, -チレイ、東京）は室温で 1時間反応させた。最後に 0. lmgZmLの 3 , 3' —ジァミノべンジディン (DAB)テトラハイド口クロライドに 5分反応させ、核の染 色はへマトキシレンで行った。
[0042] (2)各種癌組織
新潟大学医学部病理学教室および新潟大学医歯学総合病院病理部の手術例、 生検例、を用いた。胃癌 14例、大腸癌 18例、脾癌 3例、子宮内膜癌 6例、卵巣癌 9 例、肺癌 21例、甲状腺癌 10例、肝癌 2例、腎癌 25例である。
[0043] (3)各種正常組織における免疫染色 正常組織における各種 HNF4 aァイソフォームの発現を検討した。
その結果、 HNF4 aァイソフォーム全体として腎臓の近位地尿細管を例外として内 胚葉組織に発現した。表 1に示すように、 Pl、 P2および C端抗体のいずれも陰性の 組織としては、舌、唾液腺、食道、膀胱、精巣、前立腺、卵巣、子宮、乳腺、胎盤、気 管，気管支、肺、心筋、骨格筋および平滑筋、さらに、肝臓 (洞様毛細血管壁細胞、 クッパー細胞)および腎臓（内皮細胞、有足突起細胞、メサンギゥム細胞、傍糸球体 細胞、遠位尿細管、集合管、ヘンレ係蹄太上行脚)であった。一方、全ての抗体で強 陽性所見が認められた組織として、十二指腸 (杯細胞、表層吸収細胞、）空腸 ·回腸( 杯細胞、表層吸収細胞、 APUD細胞）大腸であり、 C端抗体のみ陰性は肝臓 (肝細 胞)および腎臓 (近位尿細管)であり、 P1抗体のみ陰性としては脾臓であった。なお、 個体発生では卵黄嚢内胚葉細胞に発現した。
[表 1]
Figure imgf000016_0001
Figure imgf000016_0002
[0045] 全ての抗体で強陽性を示した組織免疫染色例として大腸組織を、 P2と C端抗体陽 性例として膝臓を、 1部位のみ P1および P2陽性例として腎臓、いずれの抗体でも陰 性例として図 2〜5に示した。
[0046] (4)各種腫瘍における免疫染色
腫瘍における HNF4 aのァイソフォームの発現を検討した結果は下記の通りである
[0047] [表 2] 胃癌 （1 4例） ： Π抗体陽性 8例、 P2抗体陽性 1 4例、 C端抗体陽性 1 4例 大腸癌 （1 8例中） ： P 1抗体陽性 5例、 P2抗体陽性 1 8例、 C端抗体陽性 1 8例 塍癌 （3例） ： P 1抗体陽性 0例、 P2抗体陽性 1例、 C端抗体陽性 1例
子宮内膜癌 （6例） ：Π抗体陽性 0例、 Ρ2抗体陽性 0例、 C端抗体陽性 0例 卵巣癌 （9例） ： P1抗体陽性 0例， Ρ2抗体陽性 0例、 C端抗体陽性 0例
肝癌 （2例） ： P1抗体陽性 2例、 Ρ2抗体陽性 1例、 C端抗体陽性 2例
肺瘙 （2 1例）
腺癌 （1 1例） ： P1抗体陽性 0例、 Ρ2抗体陽性 0例、 C端抗体陽性 0例
扁平上皮癌 （7例） ： P1抗体陽性 0例、 Ρ2抗体陽性 0例、 C端抗体陽性 0例
小細胞癌 （3例） ：1>1折体陽性0例、 Ρ2抗体陽性 0例、 C端抗体陽性 0例 甲状腺癌 （1 0例） ： Ρ1抗体陽性 0例， Ρ2抗体陽性 0例、 C端抗体陽性 0例 腎癌 （2 5例） ： 1>1抗体陽性2 4例、 Ρ2抗体陽性 0例、 C端抗体陽性 2 4例
[0048] 上記結果を要約すると、 P1抗体は肝癌、腎癌のほとんど全例が陽性で、 Ρ2抗体は 胃癌、大腸癌で 100%陽性であった。また、 P1抗体は胃癌、大腸癌のほぼ半数に陽 性所見を呈した。脾臓癌は予想より率は低力 たが Ρ2抗体陽性所見が得られ、胆道 癌や胆嚢癌でも P1抗体陽性症例があることを確認している。肺癌、子宮癌、甲状腺 癌、卵巣癌はすべて陰性であった。
[0049] [実施例 8]原発不明癌の原発巣の特定ィ匕
実施例 7の結果から下記の癌が原発巣であることが高い確率で推定できる。
[0050] [表 3]
Figure imgf000017_0001
[0051] 上記表における P1抗体、 P2抗体および C端抗体による代表的免疫染色結果を図
6から 9に示す。そのうち腫瘍につ!、て染色像を以下に示す。
[0052] [表 4] P1-P2-(C-) P1+P2-(C+) P1-P2KC+) PHP2HC+)
肺癌 腎癌 胃癌 （胃型） 胃癌 （腸型）
甲状腺癌 mm 大腸癌
肝癌
[0053] プラインドをかけて行った転移癌の推 結果が剖検によって正解であった例を以下 に示す。
[0054] [表 5]
Figure imgf000018_0001

Claims

請求の範囲
[1] 配列番号 14記載のアミノ酸配列力もなるタンパク質、又は配列番号 14記載のァミノ 酸配列にぉ 、て 1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列力 な り、 HNF4 aの機能を有するタンパク質。
[2] 配列番号 16記載のアミノ酸配列力もなるタンパク質、又は配列番号 16記載のァミノ 酸配列にぉ 、て 1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列力 な り、 HNF4 aの機能を有するタンパク質。
[3] 配列番号 18記載のアミノ酸配列力もなるタンパク質、又は配列番号 18記載のァミノ 酸配列にぉ 、て 1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列力 な り、 HNF4 aの機能を有するタンパク質。
[4] 請求項 1〜3のいずれか 1項記載のタンパク質をコードする遺伝子。
[5] 配列番号 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16及び 18のいずれかに記載のアミノ酸配列か らなるタンノ ク質、酉己歹 IJ番号 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16及び 18の!ヽずれ力に記載 のアミノ酸配列において 1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配 列からなり、 HNF4 aの機能を有するタンパク質、又はこれらのタンパク質を構成す るアミノ酸配列のうちの連続した 10〜： LOOアミノ酸力もなるペプチドに対する抗体。
[6] 請求項 1〜3のいずれか 1項記載のタンパク質、又はそれらのタンパク質を構成する アミノ酸配列のうちの連続した 10〜： LOOアミノ酸力もなるペプチドに対する抗体。
[7] 生体試料中の、配列番号 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16及び 18のいずれかに記載 のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16及び 18のいずれかに記載のアミノ酸配列において 1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又 は付加したアミノ酸配列力もなり、 HNF4 aの機能を有するタンパク質を免疫学的手 法により検出することを特徴とする癌、偽胆管及び腸上皮仮性の判定方法。
[8] 生体試料中の、配列番号 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16及び 18のいずれかに記載 のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16及び 18のいずれかに記載のアミノ酸配列において 1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又 は付加したアミノ酸配列力もなり、 HNF4 aの機能を有するタンパク質を免疫学的手 法により検出することを特徴とする癌原発巣の特定化方法。
[9] 生体試料が、生体組織である請求項 7又は 8記載の方法。
[10] 生体組織が癌あるいはその他疾患組織である請求項 7又は 8記載の方法。
[11] 判定または特定化の対象が、胃癌、肝癌、脾臓癌、大腸癌、腎癌及び胆管癌 '胆 嚢癌カも選ばれる癌、偽胆管及び腸上皮仮性である請求項 7〜10のいずれか 1項 記載の方法。
PCT/JP2005/012811 2004-07-12 2005-07-12 ＨＮＦ４αアイソフォーム検出による癌等の診断及び原発巣の特定 WO2006006583A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2006529051A JPWO2006006583A1 (ja) 2004-07-12 2005-07-12 ＨＮＦ４αアイソフォーム検出による癌等の診断及び原発巣の特定

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2004-205224 2004-07-12
JP2004205224 2004-07-12
JP2004260588 2004-09-08
JP2004-260588 2004-09-08

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2006006583A1 true WO2006006583A1 (ja) 2006-01-19

Family

ID=35783924

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2005/012811 WO2006006583A1 (ja) 2004-07-12 2005-07-12 ＨＮＦ４αアイソフォーム検出による癌等の診断及び原発巣の特定

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JPWO2006006583A1 (ja)
WO (1) WO2006006583A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023214405A1 (en) * 2022-05-01 2023-11-09 Yeda Research And Development Co. Ltd. Reexpression of hnf4a to alleviate cancer-associated cachexia

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004019983A1 (ja) * 2002-08-30 2004-03-11 Daiichi Pharmaceutical Co.,Ltd. 糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解方法、分解阻害方法および分解阻害剤
WO2004058052A2 (en) * 2002-12-20 2004-07-15 Applera Corporation Genetic polymorphisms associated with myocardial infarction, methods of detection and uses thereof

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2002024227A1 (ja) * 2000-09-20 2004-01-29 協和醗酵工業株式会社 腫瘍細胞増殖抑制剤

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004019983A1 (ja) * 2002-08-30 2004-03-11 Daiichi Pharmaceutical Co.,Ltd. 糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解方法、分解阻害方法および分解阻害剤
WO2004058052A2 (en) * 2002-12-20 2004-07-15 Applera Corporation Genetic polymorphisms associated with myocardial infarction, methods of detection and uses thereof

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EECKHOUTE J. ET AL: "Hepatocyte nuclear 4 alpha isoforms originated from the P1 promoter are expressed in human pancreatic beta-cells and exhibit stronger transcriptional potentials than P2 promoter-driven isoforms", ENDOCRINOLOGY, vol. 144, no. 5, 2003, pages 1686 - 1694, XP002991100 *
HANSEN S.K. ET AL: "Genetic evidence that HNF-lalpha-dependent transcriptional control of HNF-4alpha is essential for human pancreatic beta cell function", J CLIN INVEST, vol. 110, no. 6, September 2002 (2002-09-01), pages 827 - 833, XP002991099 *
TORRES-PADILLA M.E. ET AL: "Expression of HNFalpha isoforms in mouse liver development is regulated by sequential promoter usage and constitutive 3' end splicing", MECHANISMS OD DEVELOPMENT, vol. 109, no. 2, 2001, pages 183 - 193, XP002991501 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023214405A1 (en) * 2022-05-01 2023-11-09 Yeda Research And Development Co. Ltd. Reexpression of hnf4a to alleviate cancer-associated cachexia

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2006006583A1 (ja) 2008-04-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2741641C (en) Antibody specific for a mammaglobin polypeptide
US7812145B2 (en) Short isoform of annexin A10 at chromosome 4q, termed annexin 10s (ANXA 10s) and methods of use
CN106086177B (zh) 癌的检测方法
US8426140B2 (en) Method of assessing colorectal cancer status in an individual
MX2011001445A (es) Metodo para detectar cancer.
WO2007026896A1 (ja) 腎ガン診断、腎ガン患者予後予測のための組成物および方法
WO2009142257A1 (ja) 食道ガン判定用組成物及び方法
JP2010528261A (ja) 前立腺癌および肺癌の診断および治療方法
JP2005525103A (ja) 結腸癌および結腸癌の肝臓転移に関わる核マトリックスタンパク質の変化とその使用
WO2006006583A1 (ja) ＨＮＦ４αアイソフォーム検出による癌等の診断及び原発巣の特定
WO2005093063A1 (ja) 固形癌診断キット及び固形癌治療用医薬
JP2009168669A (ja) 胃癌の診断又は検出のための組成物及び方法
JP2009168686A (ja) 大腸癌の診断又は検出のための組成物及び方法
CN101762708A (zh) 用于诊断非小细胞肺癌的血清标志物
WO2006013474A2 (en) Ppgalnac-t6 mrna or peptide as a new marker for detection cancer cells
WO2010117010A1 (ja) 腫瘍マーカーおよびその利用
CN110865184B (zh) Srsp蛋白和srsp抗原表位肽的应用及诊断和治疗肿瘤的产品
JP4923252B2 (ja) 癌の判定方法および癌診断キット
EP1313875A2 (en) Method of diagnosing, monitoring, staging, imaging and treating colon cancer
EP3436830B1 (en) Thsd7a as a novel target for cancer therapy and diagnosis
JP2004159600A (ja) 癌の診断方法及び癌の診断用キット
JP2008263840A (ja) 胃ガンの診断又は検出のための組成物及び方法
JP2007139656A (ja) 食道癌診断キット
WO2023217886A1 (en) Use of bmmf1 rep protein as diagnostic marker for pancreatic cancer and diabetes mellitus type 2
US9200262B2 (en) Method for the diagnosis of the presence of an ovarian cancer

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KM KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NG NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SM SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LT LU LV MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006529051

Country of ref document: JP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Country of ref document: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase