PT1025077E - Novas ariloxi-alquil-dialquilaminas - Google Patents

Description

ΡΕ1025077 1 DESCRIÇÃO "NOVAS ARILOXI-ALQUIL-DIALQUILAMINAS" A presente invenção refere-se a novos compostos úteis na produção de compostos biologicamente activos, assim como a processos para a sua produção. Mais particularmente, a presente invenção fornece novas ariloxi-alquil-dialquilaminas que podem ser utilizadas na produção de produtos farmacêuticos.

Antecedentes da Invenção

As metaloproteinases de matriz (MMPs) são um grupo de enzimas que foram implicadas na destruição patológica do tecido conjuntivo e das membranas basais [Woessner, J. F., Jr. FASEB J. 1991, 5, 2145; Birkedal-

Hansen, H.; Moore, W. G. I.; Bodden, Μ. K.; Windsor, L. J.;

Birkedal-Hansen, B.; DeCarlo, A.; Engler, J.A. Crlt. Rev. Oral Biol. Med. 1993, 4, 197 ; Cawston, T. E. , Pharmacol. Ther. 1996, 70, 163; Powell, W.C.; Matrisian , L.M. Cur. Top. Microbiol. and Immunol. 1996, 213, 1] . Estas endo- peptidases que contêm zinco consistem em vários subconjuntos de enzimas, incluindo colagenases, estromelisinas e gelatinases. Destas classes, demonstrou-se que as gelatinases são as MMPs mais intimamente envolvidas no crescimento e proliferação de tumores, enquanto que as 2 ΡΕ1025077 colagenases foram associadas à patogénese da osteoartrite [Howell, D. S.; Pelletier, J.-P. In Arthritis and Allied Conditions; McCarthy, D. J.; Koopman, W. J., Eds.; Lea and Febiger: Philadelphia, 1993; 12th Edition Vol. 2, pp. 1723; Dean, D. D. Sem. Arthritis Rheum. 1991, 20, 2; Crawford, H. C; Matrisian, L. M. Invasion Metast. 1994-95, 14, 234; Ray, J. M.; Stetler-Stevenson, W.G. Exp. Op in. Invest. Drugs, 1996, 5, 323]. A utilização da terapêutica hormonal de substituição para a prevenção da perda óssea em mulheres pós-menopáusicas está bem justificada por precedentes. O protocolo normal exige a suplementação de estrogénios utilizando formulações tais como as que contêm estrona, estriol, etinilestradiol ou estrogénios conjugados isolados de fontes naturais (i. e., Premarin® estrogénios conjugados da Wyeth-Ayerst). Em alguns doentes, a terapêutica pode estar contra-indicada devido aos efeitos proliferativos que os estrogénios sem oposição (estrogénios não administrados em combinação com progestinas) têm sobre o tecido uterino. Esta proliferação está associada ao aumento do risco de endometriose e/ou de cancro endometrial. Os efeitos dos estrogénios sem oposição no tecido mamário são menos claros, mas constituem alguma preocupação. A necessidade de estrogénios que possam manter o efeito de preservação do osso enquanto minimizam os efeitos proliferativos no útero e na mama é evidente. Demonstrou-se que determinados antiestrogénios não esteróides mantêm a massa óssea no modelo rato ovarectomizado, assim como em ensaios clínicos humanos. O tamoxifeno (comercializado na forma de citrato 3 ΡΕ1025077 de tamoxifeno com a marca Novadex® pela Zeneca Pharma-ceuticals, Wilmington, Delaware), por exemplo, é um paliativo útil no tratamento do cancro da mama e tem-se demonstrado como exercendo um efeito do tipo agonista do estrogénio no osso, no ser humano. Contudo, também é um agonista parcial no útero e esta é causa de alguma preocupação. Demonstrou-se que o raloxifeno, um anti-estrogénio benzotiofénico, estimula o crescimento uterino no rato ovarectomizado em menor escala que o tamoxifeno, enquanto que mantém a capacidade de preservação do osso. Uma revisão adequada dos estrogénios selectivos do tecido pode ser vista no artigo "Tissue-Selective Actions Of Estrogen Analogs", Bone Vol. 17, N.° 4, Outubro 1995, 181S-190S. A presente invenção fornece novos intermediários que podem ser utilizados na produção de compostos farmacêuticos para utilidades anti-estrogénicas e de inibição da MMP. A utilização dos compostos de cloreto de 4-carbamoilmetoxi-metoxi-benzilo das estruturas:

é ensinada nos documentos NL 6402393; 1964; e Chem. Abstr. 1965, 62, 7698. A utilização dos compostos cloreto de 4—(2 — dialquilamino-etoxi)benzoílo 4 ΡΕ1025077

é revelada em Sharpe, C. J. et. al. J. Med. Chem. 1972, 15, 523 e Jones, C. D. et. al. J. Med. Chem. 1984, 27, 1057. De modo semelhante, a utilização de cloreto de 4-(2-quino-linilmetoxi)benzilo

I é revelada por Huang, F-C. et. al. J. Med. Chem. 1990, 33, 1194.

Determinados derivados halogeneto de alcoxiben-zilo são conhecidos de Collect. Czech. Chem. Commun., 55, 1602-1612 (1990); J. Chem. Soc. 1965, 954-973; Arzneim. Forsch., 29, 591-4 (1979); Chem. Abst. 54, 648d e 568h e documento patente EP 00428312.

Sumário da Invenção A presente invenção refere-se a novos compostos, assim como a métodos para a sua produção, que podem ser utilizados na produção de compostos farmaceuticamente activos. Os compostos desta invenção podem ser utilizados 5 ΡΕ1025077 particularmente como intermediários na produção de compostos farmacêuticos, tais como inibidores não péptidos de baixo peso molecular das metaloproteinases de matriz (e.g., gelatinases, estromelisinas e colagenases) e da enzima de conversão de TNF (TACE, enzima de conversão do factor da necrose tumoral) que são úteis no tratamento de doenças nas quais estas enzimas estão implicadas, tais como a artrite, as metástases tumorais, a ulceração tecidular, a cicatrização anormal, a doença periodontal, a doença óssea, a proteinúria, a doença aórtica aneurismática, a perda degenerativa da cartilagem a seguir a uma lesão articular traumática, as doenças desmineralizantes do sistema nervoso e a infecção por VIH. Para além disso, os compostos desta invenção podem ser utilizados para produzir compostos que se comportam como agonistas do estrogénio diminuindo o colesterol e evitando a perda óssea. Assim, estes compostos são úteis para o tratamento de muitas doenças, incluindo osteoporose, hipertrofia prostática, infertilidade, cancro da mama, hiperplasia e cancro endometrial, doença cardiovascular, contracepção, doença de Alzheimer e melanoma. A presente invenção inclui novos sais farmaceuti-camente aceitáveis dos compostos da fórmula (I):

em que: 6 ΡΕ1025077 R1 e R2 são, independentemente, seleccionados entre H; C1-C12 alquilo, de modo preferido C1-C6 alquilo; ou C1-C6 alquilo perfluorado, de modo preferido -CF3; X é um grupo de saída, seleccionado entre halogénio, -O-SO2-CH3, -0-S02-CF3 ou uma fracção da estrutura:

Z é seleccionado entre -NO2, halogénio,-CH3 ou -CF3; A é seleccionado entre -O- ou -S-, -SO- ou -SO2-; m é um número inteiro de 0 a 3, de modo preferido 1; R3, R4, R5 e R6 são, independentemente, seleccionados entre H, halogénio, -NO2, alquilo (de modo preferido C1-C12 alquilo, de modo mais preferido Ci-C6 alquilo), alcoxi (de modo preferido C1-C12 alcoxi, de modo mais preferido Ci-C6 alcoxi), Ci-Cê alquilo perfluorado (de modo preferido -CF3), OH ou os ésteres C1-C4 ou os seus éteres de alquilo, -CN, -0-R4,-0-Ar, -S-R1, -S-Ar, SO-R1, -SO-Ar, - SO2-R1, -S02-Ar, -CO-R1, -C0-Ar,-C02-R1 ou -C02-Ar; Y é seleccionado entre: a) a fracção: 7 ΡΕ1025077 em que R7 e R8 são combinados por -(CH2)P- em que p é 6 de modo a formar um anel, sendo o anel assim formado opcionalmente substituído por um a três substituintes seleccionados entre o grupo de Ci-C3 alquilo, trifluoro-metilo, halogénio, hidrogénio, fenilo, N02 e CN, ou b) um heterociclo saturado, insaturado ou parcialmente saturado com sete membros contendo até dois hete-roátomos seleccionados entre o grupo que consiste em -O-, -NH-, -N(Ci-C4 alquilo)-, -N=, e -S(0)n-, em que n é um número inteiro de 0 a 2, opcionalmente substituído por 1-3 substituintes independentemente seleccionados entre o grupo que consiste em hidrogénio, hidroxi, halo, C1-C4 alquilo, tri-halometilo, C1-C4 alcoxi, tri-halometoxi, C1-C4 aciloxi, C1-C4 alquiltio, C1-C4 alquilsulfinilo, C1-C4 alquil-sulfonilo, hidroxi (C1-C4) alquilo, fenilo opcionalmente substituído por 1-3 (C1-C4) alquilo, -C02H, -CN, -CONHR1, -NH2, C1-C4 alquilamino, C1-C4 dialquilamino, NHSO2R1, -NHCOR1, -NO2.

Na descrição genérica e nos outros grupos aqui mencionados entende-se que, em cada exemplo em que possam aparecer, R1 e R2 são seleccionados, independentemente, entre o grupo de substituintes listados. Qualquer R1 listado em qualquer estrutura aqui mencionada não representa necessariamente o mesmo substituinte que outro R1, nem qualquer R2 tem necessariamente de ser o mesmo substituinte que outro qualquer R2, mesmo que se encontrem mais de um R1 ou R2 na mesma estrutura. 8 ΡΕ1025077

Na descrição anteriormente referida, o símbolo "Ar" indica um arilo monocíclico ou policíclico ou grupos heteroarilo que podem, opcionalmente, serem substituídos por um ou mais substituintes seleccionados entre halogénio, Ci-Cê alquilo ou -CF3. Exemplos de grupos arilo preferidos incluem o antracenilo e grupos fenantrenilo, assim como os mais preferidos grupos fenilo, cumenilo, mesitilo, tolilo, xililo e naftalenilo. Exemplos de grupos heteroarilo preferidos incluem o indole izinilo, o indazolilo, o inda-zolilo, o purinilo, o quinozinilo, o isoquinolinilo, o quinolinilo, o ftalozinilo, o naftiridinilo, o quinoxali-nilo, o quinazolinilo, o cinolinilo e grupos pteridinilo e similares, assim como os grupos mais preferidos piridilo, pirazinilo, pirimidinilo, piridizinilo e indole ilo. A invenção inclui formas de sais aceitáveis formados a partir da reacção de adição com ácidos inorgânicos ou orgânicos. Os ácidos inorgânicos tais como o ácido clorídrico, o ácido bromídrico, o ácido iodidrico, o ácido sulfúrico, o ácido fosfórico, o ácido nítrico são úteis, assim como são úteis os ácidos orgânicos tais como o ácido acético, o ácido propiónico, o ácido cítrico, o ácido maleico, o ácido málico, o ácido tartárico, o ácido itálico, o ácido succínico, o ácido metano-sulfónico, o ácido tolueno-sulfónico, o ácido naftaleno-sulfónico, o ácido canforossulfónico e o ácido benzeno-sulfónico. Sabe-se que os compostos que possuem um azoto básico podem ser tornados complexos com muitos ácidos diferentes (tanto próticos como 9 ΡΕ1025077 não próticos) e geralmente é preferido administrar um composto desta invenção na forma de um sal de adição ao ácido. Adicionalmente, esta invenção inclui sais de amónio quaternários dos compostos aqui descritos, que podem ser preparados através da reacção das aminas nucleofilicas da cadeia lateral com um agente alquilante reactivo adequado, tal como um halogeneto de alquilo ou um halogeneto de benzilo.

Entre os compostos preferidos desta invenção estão os da fórmula (I):

em que R1 e R2 são, independentemente, seleccionados de H; C1-C12 alquilo, de modo preferido C1-C6 alquilo; ou C1-C6 alquilo perfluorado, de modo preferido -CF3; X é halogénio, -0-S02-CH3, -0-S02-CF3 ou uma fracção da estrutura:

Z é seleccionado entre -N02, halogénio,-CH3 ou r -cf3 A é seleccionado entre -O- ou -S-, -SO- ou -S02-; ΡΕ1025077 10 m é um número inteiro de 0 a 3, de modo preferido 1; Y é seleccionado entre: um grupo seleccionado entre azepina, diazepina, oxazepina, tiezepina, oxapina e tiepina, sendo o grupo opcionalmente substituído por 1-3 substituintes independentemente seleccionados do grupo que consiste em hidrogénio, hidroxi, halo, C1-C4 alquilo, tri-halometilo, C1-C4 alcoxi, tri-halometoxi, C1-C4 aciloxi, C1-C4 alquiltio, C1-C4 alquilsulfinilo, C1-C4 alquilsulfonilo, hidroxi (Ci— C4)alquilo, fenilo opcionalmente substituídos por 1-3 (Ci— C4) alquilo, -C02H, -CN, -CONHR1, -NH2, C1-C4 alquilamino, Ci-C4 dialquilamino, -NHSO2R1, -NHCOR1, -N02.

Outros compostos preferidos desta invenção estão os da fórmula (I):

Entre os compostos mais preferidos da presente invenção encontram-se aqueles com a fórmula geral

em que: R1 e R2 são, independentemente, seleccionados entre H, Ci-C6 alquilo ou C1-C6 alquilo perfluorado, de modo preferido, entre os grupos alquilo perfluorados, -CF3; 11 ΡΕ1025077 R3, R4, R5 e R6 são, independentemente, seleccio-nados entre H, OH ou os ésteres C1-C4 ou os seus éteres de alquilo, halogénio, -CN, C1-C6 alquilo ou trifluorometilo, m é um número inteiro de 0 a 3, de modo preferido 1; R7 e R8 são combinados por -(CH2)p-, em que p é 6, de modo a formar um anel, sendo o anel opcionalmente substituído por até três substituintes seleccionados entre o grupo de hidrogénio, hidroxi, halo, C1-C3 alquilo, tri-halometilo, alquiltio, C1-C4 alquilsulfinilo, C1-C4 alquil-sulfonilo, hidroxi (C1-C4) alquilo, -C02H, -CN e N02, e X é conforme definido anteriormente; invenção geral

Entre os compostos mais preferidos da presente encontram-se igualmente aqueles com a fórmula

em que: R1 e R2 são, independentemente, seleccionados entre H, Ci-C6 alquilo ou Ci-C6 alquilo perfluorado, de modo preferido, entre os grupos alquilo perfluorados, -CF3; R3, R4, R5 e R6 são, independentemente, seleccionados entre H, OH ou os ésteres C1-C4 ou os seus éteres de alquilo, halogénio, -CN, Ci-Cê alquilo ou trifluorometilo, m é um número inteiro de 0 a 3, de modo preferido 1; 12 ΡΕ1025077 A é seleccionado entre -S-, -SO- ou -S02-; R7 e R8 são combinados por -(CH2)p-, em que p é 6, de modo a formar um anel, sendo o anel opcionalmente substituído por até três substituintes seleccionados entre o grupo de hidrogénio, halo, Ci-C3 alquilo, trifluoro-metilo, alquiltio, C1-C4 alquilsulfinilo, C1-C4 alquilsul-fonilo, hidroxi (C1-C4) alquilo, -C02H, -CN e N02, e X é conforme definido anteriormente.

Esta invenção inclui também um processo para a produção dos compostos anteriormente referidos.

Os sais farmaceuticamente aceitáveis da invenção podem ser preparados por um processo que compreende um dos seguintes: a) a conversão de um álcool da fórmula

num composto correspondente da fórmula I em que X é um grupo de saída por meios apropriados; e.q., utilizando um agente halogenante, sulfonilante ou acilante que contém o grupo de saída X; caso necessário, convertendo o composto da fórmula (I) formado num seu sal farmaceuticamente aceitável; ou 13 ΡΕ1025077 b) a oxidação de um composto da fórmula I em que A é S para dar origem a um composto correspondente da fórmula I em que A é SO ou -S02-, caso necessário convertendo o composto da fórmula (I) formado num seu sal farmaceuticamente aceitável; ou c) a conversão de um composto da fórmula (I) num seu sal farmaceuticamente aceitável.

Os compostos da fórmula A podem ser preparados mediante a reacção de um fenol da fórmula

em que P é um grupo protector de hidroxi e A e R1-6 são conforme anteriormente definidos (e.g., R1 e R2 são cada um H ou C1-C12 alquilo) com um composto da fórmula

ir "Mo em que Y, R1, R2 e m são conforme anteriormente descritos e halo é F, Cl, Br ou I, seguida pela remoção do grupo protector. 14 ΡΕ1025077

Os compostos desta invenção em que "A" é oxigénio podem ser sintetizados pelos passos do processo de a) alquilação de um hidroxibenzaldeído relevante da fórmula:

em que R3-R6 são conforme anteriormente descritos, com um halogeneto de alquilo relevante da fórmula: R1 R1 ϊ f

< Ç \n~“ Μβ S, L E.“ Rr em que Y, R1, R2 e m são conforme definidos nos grupos genéricos e subgenéricos anteriormente mencionados e halo pode ser Cl, F, Br ou I, para produzir um aldeído da fórmula:

b) redução do produto aldeído do passo a) para dar origem ao álcool relevante com a fórmula: 15 ΡΕ1025077

CHaQH c) conversão do álcool do passo b) no seu sal cloridrato, tal como com HC1/THF; e d) a conversão do álcool num grupo de saída preferido, tal como através do tratamento com cloreto de metano-sulfonilo, cloreto de tolueno-sulfonilo ou anidrido trifluoroacético na presença de uma base como a piridina ou a trietilamina.

De modo similar, a presente invenção fornece um processo para a produção dos compostos desta invenção em que "A" é enxofre através dos passos de: a) alquilação de um composto da fórmula m

com um agente alquilante da fórmula:

c j. k2 em que Y e m são conforme anteriormente definidos e halo é 16 ΡΕ1025077 seleccionado entre Cl, F, Br ou I, para produzir um aldeído da fórmula:

b) redução do produto aldeído do passo a), tal como com boro-hidreto de sódio para um álcool da fórmula;

c) tratamento do álcool do passo b) com HC1 gasoso para gerar o seu cloridrato; e d) conversão do produto cloridrato de álcool do passo c) num grupo de saída preferido, tal como através do tratamento com cloreto de metano-sulfonilo, cloreto de tolueno-sulfonilo ou anidrido trifluoroacético na presença de uma base como a piridina ou a trietilamina ou o tratamento continuado com HC1 para formar o cloreto de benzilo correspondente; e e) opcionalmente, terminar a oxidação controlada do enxofre até sulfóxido ou até sulfona, tal como com ácido m-cloroperbenzóico. O material inicial de aldeído e tiofenóxido do passo a), anteriormente descrito, pode ser criado a partir do seu aldeído tiofenol correspondente, tal como com 17 ΡΕ1025077 hidreto de sódio, que pode ou não ser considerado um passo do processo anteriormente descrito.

Descrição detalhada da invenção

Os seguintes esquemas das reacções I a V demons tram a síntese dos compostos da presente invenção ou dos seus análogos, utilizando diferentes variáveis para "Y". Os reagentes e solventes para os passos individuais são fornecidos apenas para fins ilustrativos e podem ser substituídos por outros reagentes e solventes conhecidos pelos técnicos.

Esquema I

,CHO

Cl 1 *, R7R8 *{CHZtf ; b, R7RS *íCH2'*6;c. R 7“ R8 ® CH3 e R3 “H.

CH20H ΡΕ1025077 18

Esquema II

HCI

Passo í KfcCOsyOMFm%

y ou

socigmfF

Passo 2

Passo 3 HÇyitaO

Esquema lia

0 esquema lia oferece uma síntese alternativa dos álcoois benzílicos desta invenção, exemplificando a síntese do álcool 4-(2-piperidiniletoxi)benzílico. Nesta síntese o álcool 4-hidroxibenzílico é tratado com um cloreto de aril-amino-alquilo desejado para dar origem ao álcool alcoxi- 19 ΡΕ1025077 benzílico correspondente. No exemplo específico do esquema lia, o álcool 4-hidroxibenzílico pode ser tratado com o cloridrato de 1-(2-cloroetilo)-piperidina na presença de K2C03/Me2C0 para dar origem ao álcool 4-(2-piperidiniletoxi)benzílico. O esquema lia também ilustra mais especificamente outro modo de realização preferido da presente invenção. Esta invenção também inclui um processo para a produção de compostos de álcool úteis da fórmula:

em que X representa um anel heterocíclico com cinco, seis ou sete membros, não saturado ou parcialmente saturado que contém um ou dois átomos de azoto, estando o anel heterocíclico ligado à ponte de etoxi num átomo de azoto no anel e sendo, opcionalmente, substituído por 1 a 3 grupos seleccionados entre halogénio, C1-C6 alquilo, Ci-Ce alcoxi,Ci-C6 tioalquilo, -CF3 ou -N02.

Entre os grupos Y preferidos deste processo encontram-se a azepina ou a hexametilenoimina. 20 ΡΕ1025077 O processo que compreende a reacção, num meio alcalino, de álcool 4-hidroxibenzilico com um sal, tal como um sal de acetato, cloridrato, bromidrato ou iodidrato, de um composto da fórmula:

c* em que Y é conforme definido anteriormente.

Esta reacção é efectuada num solvente orgânico ou num sistema solvente, tal como em acetona, dimetilformamida ou tetra-hidrofurano. De modo preferido, o pH do meio é mantido acima de um pH de 8, de modo mais preferido acima de um pH de 9.

Esquema III

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Esquema IV

Utilizando passos similares, os compostos desta invenção, em que "A" é enxofre, podem ser produzidos conforme demonstrado no esquema V, abaixo. Num primeiro passo, pode produzir-se tiofenóxido com hidreto de sódio, sequido pela alquilação e redução para o aldeído relevante, tal como com boro-hidreto de sódio ou cataliticamente com hidrogénio e catalisadores níquel de Raney, platina ou paládio sobre carbono. O álcool resultante pode ser tratado com HC1 gasoso para dar origem ao seu cloridrato, com tratamento HC1 continuado para formar um cloreto de benzilo. O produto final pode ser, então, formado pela oxidação controlada do enxofre até sulfóxido e, de seguida, até sulfona, tal como com ácido m-cloroperbenzóico. ΡΕ1025077 22

Esquema V I HCÍ

Os seguintes exemplos são apresentados para ilustrar e não para limitar o âmbito da invenção.

Nos procedimentos anteriores, os compostos da fórmula (I) em que R1 e R2 adjacentes à fracção X são preparados a partir de álcoois primários (e.g., esquema I, compostos 3a-c) que são eles próprios preparados mediante a redução de percursores de aldeído (e.g., esquema I, compostos 2a-c).

Os compostos análogos da fórmula (I), em que um de R e R adjacentes à fracção X é alquilo ou perfluo-roalquilo e o outro é hidrogénio, podem ser preparados a partir de álcoois secundários apropriados que, por sua vez, 23 ΡΕ1025077 podem ser preparados a partir das cetonas correspondentes, e.g., compostos com uma fracção COR1 em que R1 é alquilo ou perfluoroalquilo.

Os compostos análogos da fórmula (I) em que ambos R1 e R2 adjacentes à fracção X são, cada um, seleccionados entre alquilo e perfluoroalquilo, podem ser preparados a partir de álcoois terciários apropriados.

Os seguintes exemplos e esquemas ilustram a preparação e a utilização dos compostos da fórmula I. O exemplos 1, 3-5, 7, 8, 10, 11, 13, 15, 18-20 e 24-26 são comparativos. EXEMPLO 1 4-(2-piperidin-l-il-etoxi)-benzil-aldeído (2a) A uma suspensão bem agitada de p-hidroxibenzal-deído (83,5 g; 0,68 mol; 1,05 eq.) e K2C03 (224 g; 1,6 mol; 2,5 eq.) em DMF (1 1) é adicionado cloridrato de l-(2-cloroetil) piperidina (120 g; 0,65 mol, 1,0 eq.). A mistura da reacção é sujeita a refluxo durante 2 h com agitação mecânica vigorosa. A TLC neste ponto não demonstra material inicial, sobretudo produto (EtOAc/hexano 1:1). A mistura da reacção é filtrada através de Celite, diluida com EtOAc (2 1) e lavada com água (3 x 500 ml) . A camada orgânica é concentrada num evaporador rotativo para dar origem a 147 g (97%) de aldeído (2a) na forma de um óleo amarelo. 24 ΡΕ1025077 ΧΗ RMN (CDCI3/TMS) : 9,87 (s, 1H) ; 7,81 (d, 2H, J = 8,7 Hz); 7,01 (d, 2H, J = 8,7 Hz); 4,18 (t, 2H, J = 6,03 Hz); 2,79 (t, 2H, J = 6,03 Hz); 2,51 (m, 4H); 1,6-1,4 (m, 6H) EXEMPLO 2 4-(2-hexametilenoimin-l-il-etoxi)-benzil-aldeído (2b) A uma suspensão bem agitada de NaH (65 g, 60 % de dispersão do óleo; 1,6 mol; 2,2 eq.) em DMF (500 ml) é adicionada uma solução de cloridrato de p-hidroxiben-zaldeido (90 g; 0,74 mol; 1,0 eq.) gota-a-gota a 0°C. A mistura da reacção é agitada durante 30 min, adicionando-se, de seguida, em porções cloreto de 4-[2-(hexametileno-imino)]etilo (153 g; 0,77 mol; 1,0 eq.). A mistura da reacção é agitada durante 1 h. A TLC neste ponto demonstra pouco material inicial, sobretudo produto (EtOAc/hexano 1:1). A mistura da reacção é diluida com água (1 1) e extraída com éter (5 1) . A camada orgânica é seca sobre MgSCu e concentrada num evaporador rotativo para dar origem a 176,8 g (97%) de aldeído (2b) na forma de um óleo amarelo. ΧΗ RMN(CDC13/TMS) : 9,87 (s, 1H); 7,81 (d, 2H, J = 8,7 Hz); 7,02 (d, 2H, J = 8,7 Hz); 4,14 (t, 2H, J = 6,09 Hz); 2,98 (t, 2H, J = 6,14 Hz); 2,78 (m, 4H); 1,66-1,61 (m, 8H) 25 ΡΕ1025077 EXEMPLO 3 4-(2-dimetilamino-etoxi)-benzil-aldeído (2c) A uma suspensão bem agitada de p-hidroxiben-zaldeído (9,54 g; 0,078 mol; 1,00 eq.) e K2CO3 (27 g; 0,195 mol; 2,5 eq.) em DMF (100 ml) é adicionado cloridrato de 1-(2-cloroetil)dimetilamina (11,26 g; 0,078 mol, 1,0 eq.). A mistura da reacção é agitada durante 2 h a 60 - 70°C. A TLC neste ponto não demonstra material inicial, sobretudo produto (EtOAc/hexano/Et3N 3:7:1). A mistura da reacção é vertida numa mistura de água/gelo (200 ml) e extraída com Et2<3 (3 x 200 ml) . A camada orgânica é seca sobre MgSCU e concentrada num evaporador rotativo para dar origem a 5,9 g (39 %) de aldeído (2c) na forma de um líquido cor-de-rosa. XH RMN (CDCI3/TMS) : 9,88 (s, 1H) ; 7,8 (d, 2H, J = 8,7 Hz); 7,02 (d, 2H, J = 8,7 Hz); 4,15 (t, 2H, J = 5,64 Hz); 2,77 (t, 2H, J = 5,64 Hz); 2,35 (S, 6H) EXEMPLO 4 4-(2-piperidin-l-il-etoxi)-álcool benzílico (3a) A uma solução agitada do aldeído 2a (115 g; 0,494 mol; 1,0 eq.) em metanol (360 ml) a 0/5°C é adicionado em porções boro-hidreto de sódio (9,44 g; 0,249 mol; 0,5 eq.). A reacção é agitada durante 30 min. A TLC neste ponto não demonstra material inicial, sobretudo produto (EtOAc/hexano/trietilamina 3:7:1). A mistura da reacção é vertida sobre água (1,1 1), extraída com cloreto de 26 ΡΕ1025077 metileno (3 x 550 ml) e seca sobre MgS04. A solução é concentrada num evaporador rotativo para dar origem a 91,6 g (80%) do álcool 3a na forma de um óleo espesso que cristalizou instantaneamente ao ser semeado. ^NMR (CDCI3/TMS) : 7,23 (d, 2H, J = 8,5 Hz); 6,80 (d, 2H, J = 8,5 Hz); 4,56 (s, 2H) ; 3,99 (t, 2H, J = 6,12 Hz); 2,69 (t, 2H, J = 6,14 Hz); 2,47 (m, 4H); 1,6-1,25 (m, 6H) 13C RMN (DMSO-de) : 158,23; 135,34; 128, 70; 114,84; 66,42; 63,44; 58,27; 55,29; 26,45; 24,80 EXEMPLO 5 álcool 4-(2-piperidin-l-il-etoxi)-benzílico (3a)

Dissolveu-se álcool 4-hidroxibenzilico (6,2 g; 0,05 mol) em hidróxido de sódio aquoso (5N, 30 ml). Adicionou-se tolueno (30 ml) seguido por cloridrato de 1 — (2 — cloroetil)piperidina (9,29 g; 0,05 mol) e brometo de benziltrietilamónio (0,3 g ). A mistura da reacção foi aquecida sob agitação vigorosa durante 1,5 h. As camadas foram separadas, a camada aquosa foi extraída com tolueno (2 x 15 ml) . Os extractos orgânicos combinados e a camada orgânica foram lavados com água (50 ml), salmoura (50 ml), secos sobre sulfato de sódio e concentrados num evaporador rotativo para dar origem a 8,725 g (75%) de álcool (3a) na forma de um óleo amarelo acastanhado. 27 ΡΕ1025077 EXEMPLO 6 álcool 4-(2-hexametilenoimin-l-il-etoxi)-benzílico (3b) A uma solução agitada do aldeído 2b (200 g; 0,72 mol; 1,0 eq.) em metanol (400 ml) a 0/5°C é adicionado em porções boro-hidreto de sódio (15,6 g; 0,41 mol; 0,57 eq.). A reacção é agitada durante 30 min. A TLC neste ponto não demonstra material inicial, sobretudo produto (EtOAc/hexano/trietilamina 3:7:1). A mistura da reacção é diluída com água (400 ml), extraída com cloreto de metileno (3 x 400 ml) e seca sobre MgSCg. A solução é concentrada num evaporador rotativo para dar origem a 201 g (100%) do álcool 3b na forma de um óleo espesso. ^NMR (CDCI3/TMS) : 7,27 (d, 2H, J = 8,5 Hz); 6,87 (d, 2H, J = 8,5 Hz); 4,60 (s, 2H); 4,05 (t, 2H, J = 6,21 Hz); 2,93 (t, 2H, J = 6,15 Hz); 2,77 (m, 4H); 1,7-1,5 (m, 8H) EXEMPLO 7 4-(2-dimetilamino-etoxi)-álcool benzílico (3c) A uma solução agitada do aldeído 2c (5,9 g; 0,031 mol; 1,0 eq.) em metanol (20 ml) a 22°C é adicionado em porções boro-hidreto de sódio (0,58 g; 0,015 mol; 0,5 eq.). A reacção é agitada durante 30 min. A TLC neste ponto não demonstra material inicial, sobretudo produto (EtOAc/hexano/trietilamina 5:5:1). A mistura da reacção é diluída com água (50 ml), extraída com cloreto de metileno (3 x 40 ml) e seca sobre MgS04. A solução é concentrada num evaporador 28 ΡΕ1025077 rotativo para dar origem a 5,25 g (88 %) do álcool 3c na forma de um óleo espesso. :Η RMN (CDCI3/TMS) : 7,25 (d, 2H, J = 8,64 Hz); 6,85 (d, 2H, J = 8,64 Hz); 4,52 (s, 2H); 3,99 (t, 2H, J = 5,88 Hz); 2,67 (t, 2H, J = 5,79 Hz); 2,29 (s, 6H) EXEMPLO 8

Cloridrato de (4-clorometil-fenoxi)-etil-piperidin-l-ilo (la)

Uma solução do álcool 3a (61,3 g; 0,26 mol; 1 eq.) em THF (500 ml) é arrefecida a 0/-5°C (banho de água gelada) e borbulhada com HC1 gasoso. A borbulhação é continuada até não ocorrer mais espessamento da mistura da reacção. O banho de arrefecimento é removido. Adiciona-se cloreto de tionilo (29 ml; 0,39 mol; 1,5 eq.) à suspensão espessa do cloridrato 4a e aquece-se a mistura a 50°C até ficar limpida. A mistura da reacção é arrefecida a -3°C e agitada durante 30 min. O sólido branco obtido é filtrado e seco para dar origem a 72 g (96 %) do cloreto la. 4a: XH RMN (DMSO-d6) : 10,9 (s, HC1); 7,25 (d, 2H, J = 8,5

Hz); 6,94 (d, 2H, J = 8,5 Hz); 4,42 (m, 4H); 3,41 (m, 4H) la: XH RMN (DMSO-d6) : 11 (br s, HC1) ; 7,39 (d, 2H, J = 8,5

Hz); 6,99 (d, 2H, J = 8,5 Hz); 4,74 (s, 2H); 4,46 (m, 2H); 3,45 (m, 4H); 2,69 (m, 2H) e 1,9-1,2 (m, 6H) 29 ΡΕ1025077 EXEMPLO 9

Cloridrato de (4-clorometil-fenoxi)-etil-hexametilenoimin- 1-ilo (lb) A uma solução do álcool 3b (179 g; 0,72 mol; 1 eq.) em THF (300 ml) adiciona-se uma solução de HC1 (26,3 g de HC1 em 263 ml de THF, 0,72 mol, 1,0 eq.) gota-a-gota a 0/ + 10°C. Forma-se um precipitado branco. Adiciona-se cloreto de tionilo (80 ml; 1,1 mol; 1,5 eq.) à suspensão espessa do cloridrato 4b e aquece-se a mistura a 50°C até ficar límpida. A mistura da reacção é concentrada até 350 ml e mantida no frigorífico durante a noite. O sólido branco obtido é filtrado, lavado com THF frio (100 ml) e seco para dar origem a 147 g (67 %) do cloreto lb. XH RMN (DMSO-d6) : 11 (br s, HC1); 7,40 (d, 2H, J = 8,6 Hz); 7,00 (d, 2H, J = 8,6 Hz); 4,74 (s, 2H) ; 4,44 (t, 2H, J = 5,25); 3,64 - 3,39 (m, 4H); 3,25 - 3,17 (m, 2H); 1,84-1,54 (m, 8H) EXEMPLO 10

Cloridrato de (4-clorometil-fenoxi)-etil-dimetilamino (lc)

Uma solução do álcool 3c (5,25 g; 0, 027 mol; 1 eq.) em THF (100 ml) foi borbulhado com HC1 gasoso a 0/+ 25°C durante 15 min. Forma-se um precipitado branco. Adiciona-se cloreto de tionilo (6 ml; 9,6 g; 0,081 mol; 3,0 30 ΡΕ1025077 eq.) à suspensão espessa do cloridrato 4c e aquece-se a mistura a 30°C até ficar límpida. A mistura da reacção é concentrada até 350 ml e mantida no frigorífico durante a noite. O sólido branco obtido é filtrado, lavado com THF frio (100 ml) e seco para dar origem a 4,57 g (68 %) do cloreto lc.

Entre os compostos farmaceuticamente activos que podem ser produzidos utilizando os compostos da presente invenção encontram-se compostos 2-fenil-l-[4-(2-aminoeto-xi)-benzil]-índole e que são úteis como agentes estrogénicos. Estes compostos incluem os das fórmulas IV e V, de seguida apresentados:

em que: R11 é seleccionado entre H, OH ou os ésteres Ci-C12 (cadeia linear ou ramificada) ou os seus éteres de alquilo C1-C12 (de cadeia linear, ramificada ou cíclica), ou 31 ΡΕ1025077 halogéneos; ou éteres halogenados, incluindo o éter trifluorometilo e o éter triclorometilo. R12, R9 e R10 são, independentemente, seleccio-nados entre H, OH ou os ésteres C1-C12 (de cadeia linear ou ramificada) ou os seus éteres de alquilo C1-C12 (de cadeia linear, ramificada ou cíclica), halogéneos ou éteres halogenados, incluindo o éter trifluorometílico e o éter triclorometílico, ciano, Ci-C6 alquilo (de cadeia linear ou ramificada) ou trifluorometilo, com a condição de que, quando R1 é H, R2 não é OH. R13 é seleccionado entre H, Ci-C6 alquilo, ciano, nitro, trifluorometilo, halogénio; e Y, A, m, R3 e R4 são conforme aqui definidos.

Os compostos 2-fenil-l-[4-(2-aminoetoxi)-benzil]-índole deste tipo são agonistas parciais do estrogénio e exibem uma elevada afinidade com o receptor do estrogénio. No entanto, ao contrário de muitos estrogénios, estes compostos não causam aumentos no peso uterino molhado. Estes compostos são anti-estrogénicos no útero e podem antagonizar completamente os efeitos tróficos dos agonistas do estrogénio no tecido uterino. Estes compostos são úteis no tratamento ou na prevenção de estados ou sintomas de uma doença dos mamíferos que são causados ou associados à deficiência estrogénica.

Estes compostos têm a capacidade de se compor- 32 ΡΕ1025077 tarem como agonistas do estrogénio diminuindo o colesterol e evitando a perda óssea. Assim, estes compostos são úteis para o tratamento de muitas doenças, incluindo osteoporose, hipertrofia prostática, infertilidade, cancro da mama, cancro endometrial, doença cardiovascular, contracepção, doença de Alzheimer e melanoma. Adicionalmente, estes compostos podem ser utilizados na terapêutica hormonal de substituição em mulheres pós-menopáusicas ou noutros estados de deficiência estrogénica em que a suplementação de estrogénios seria benéfica.

Os compostos de 2-fenil-1-[4-(2-aminoetoxi)-benzil]-índole produzidos com os compostos desta invenção também podem ser utilizados em métodos de tratamento da perda óssea, que pode resultar de um desequilíbrio na formação de novos tecidos ósseos de um indivíduo e a reabsorção de tecidos antigos, provocando uma perda óssea líquida. Uma tal depleção óssea resulta numa variedade de indivíduos, particularmente em mulheres pós-menopáusicas, mulheres que tenham sido submetidas a uma histerectomia, mulheres a receberem ou que tenham recebido terapêuticas prolongadas com corticóides, mulheres com disgenesia gonadal e mulheres com síndroma de Cushing. As necessidades especiais para a substituição óssea também podem ser tratadas utilizando estes compostos em indivíduos com fracturas ósseas, estruturas ósseas defeituosas e indivíduos a serem submetidos a cirurgias relacionadas com 33 ΡΕ1025077 os ossos e/ou o implante de prótese. Além desses problemas anteriormente descritos, estes compostos podem ser utilizados em tratamentos para a osteoartrite, doença de Paget, osteomalacia, osteo-halisterese, cancro endometrial, mieloma múltiplo e outras formas de cancro com efeitos perniciosos nos tecidos ósseos. Os métodos de tratamento das doenças aqui apresentadas são entendidos como compreendendo a administração de uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um ou mais dos compostos desta invenção ou de um seu sal farmaceuticamente aceitável a um indivíduo com necessidade desse tratamento. Esta invenção também inclui composições farmacêuticas utilizando um ou mais dos presentes compostos, e/ou os seus sais farmaceuticamente aceitáveis, juntamente com um ou mais veículos, excipi-entes, etc., farmaceuticamente aceitáveis.

Entende-se que a posologia, o regime e o modo de administração destes compostos de 2-fenil-l-[4-(2-amino-etoxi)-benzil]-indole variam de acordo com a doença e o indivíduo em tratamento e ficam ao critério do profissional médico envolvido. É preferido que a administração de um ou mais dos compostos aqui descritos comece com uma dose baixa e que seja aumentada até serem alcançados os efeitos desejados . A administração eficaz destes compostos pode dar-se com uma dose de cerca de 0,1 mg/dia a cerca de 1,000 34 ΡΕ1025077 mg/dia. De modo preferido, a administração será de cerca de 50 mg/dia a cerca de 600 mg/dia numa dose única ou em duas ou mais doses divididas.

Tais doses podem ser administradas em um qualquer modo útil na direcção dos compostos activos aqui descritos para o fluxo sanguíneo do receptor, incluindo oralmente, parentericamente (incluindo injecções intravenosas, intra-peritoneais e subcutâneas) e transdermicamente. Para os efeitos desta revelação, as administrações transdérmicas são entendidas como incluindo todas as administrações ao longo da superfície corporal e dos revestimentos interiores dos canais corporais, incluindo tecidos epiteliais e mucosas. Essas administrações podem ser efectuadas utilizando os presentes compostos, ou os seus sais farmaceu-ticamente aceitáveis, em loções, cremes, espumas, adesivos, suspensões, soluções e supositórios (rectais e vaginais) .

As formulações orais contendo os compostos activos desta invenção podem compreender quaisquer formas orais convencionalmente utilizadas, incluindo comprimidos, cápsulas, formas bucais, trociscos, patilhas e líquidos, suspensões ou soluções orais. As cápsulas podem conter misturas do(s) composto(s) activo(s) com agentes de enchimento inertes e/ou diluentes tais como os amidos farmaceuti-camente aceitáveis (e.g., amido de milho, batata ou tapioca), açúcares, agentes adoçantes artificiais, celuloses em pó, tais como celuloses cristalinas e microcristalinas, 35 ΡΕ1025077 farinhas, gelatinas, gomas, etc. Podem ser feitas formulações úteis de comprimidos através da compressão convencional, métodos de granulação a húmido ou de granulação a seco e utilizando diluentes, agentes de ligação, lubrificantes, desintegrantes, agentes de suspensão ou de estabilização farmaceuticamente aceitáveis, incluindo mas não estando limitado a estearato de magnésio, ácido esteárico, talco, laurilsulfato de sódio, celulose microcristalina, carboximetilcelulose cálcica, polivinilpirrolidona, gelatina, ácido alginico, goma acácia, goma de xantano, citrato de sódio, silicatos complexos, carbonato de sódio, glicina, dextrina, sacarose, sorbitol, fosfato bicálcico, sulfato de cálcio, lactose, caulino, manitol, cloreto de sódio, talco, amidos secos e açúcar em pó. As formulações orais aqui mencionadas podem utilizar formulações de atraso padrão ou de libertação durante um período de tempo para alterar a absorção do(s) composto(s) activo(s). As formulações em supositórios podem ser feitas a partir de materiais tradicionais, incluindo manteiga de cacau, com ou sem a adição de ceras para alterar o ponto de fusão do supositório, e glicerina. Também podem ser utilizadas bases de supositórios hidrossolúveis, tais como polietilenoglicóis de vários pesos moleculares.

Conforme demonstrado no esquema VI, os compostos deste grupo podem ser sintetizados mediante a alquilação do azoto do indole com compostos da presente invenção, conforme ilustrado nos exemplos 11 a 13, a seguir, utilizando o 36 ΡΕ1025077 cloridrato de (4-clorometil-fenoxi)-etil-piperidin-l-ilo do Exemplo 8, o cloridrato de (4-clorometil-fenoxi)-etil-hexametilenoimin-l-ilo do Exemplo 9 e o cloridrato (4-clorometil-fenoxi)-etil-dimetilamino do Exemplo 10, respec-tivamente. Para além de NaH, podem ser utilizadas outras bases, incluindo t-butóxido de potássio ou t-butóxido de sódio.

Esquema VI

Os esquemas VII e VIII exemplificam a sintese do cloridrato de 1-[4-(2-azepan-l-il-etoxi)-benzil]2-(4-hidro-xi-fenil)-3-metil-lH-indole -5-ol utilizando intermediários da presente invenção. ΡΕ1025077 37

Esquema VII

SB

SMS

O esquema VII ilustra a alquilação do 4-hidro-xibenzaldeído com cloridrato de cloreto de 2-(hexametil-amino)etilo, que pode ser realizado na presença de carbonato de potássio para dar origem ao correspondente aldeído I (passo 1). Quando a reacção estiver terminada, a mistura pode ser clarificada, misturada com tolueno e lavada com água. A solução de tolueno pode então ser concentrada e o resíduo resultante tratado com isopropanol para dar origem à solução do aldeído I. A solução de isopropanol de I pode ser tratada por redução catalítica, tal como com níquel de Raney, para dar origem ao álcool II (passo 2). A seguir à redução, a mistura da reacção pode ser clarificada e concentrada, com o resíduo resultante a ser dissolvido em dicloridrato de etileno para dar origem a uma solução contendo o álcool II. Esta solução pode ser tratada com 38 ΡΕ1025077 cloreto de tionilo, seguida pela concentração. O resíduo resultante pode ser então tratado com 1,2 dimetoxietano para dar origem ao cristalino III (passo 3).

Esquema viu

No esquema VIII, passo 4,4-benziloxipropiofenona é bromada em ácido acético com bromo. Quando a reacção estiver terminada, a mistura pode ser arrefecida com água e o precipitado resultante é lavado com ácido acético diluído, água e heptano. O sólido resultante é seco para dar origem a IV, cloridrato de 4-benziloxianilina. No passo 5, a mistura de IV, N,N-diisopropiletilamina e tolueno é aquecida sob refluxo com remoção da água. Quando a reacção estiver terminada, a mistura pode ser arrefecida e diluída com metanol. Os sólidos produzidos podem ser colhidos, lavados com metanol e secos para dar origem ao composto 39 ΡΕ1025077 índole V. Uma mistura dos compostos V e III pode ser misturada no passo 6 com terc-butóxido de sódio em N,N-dimetilformamida e agitada até a reacção estar terminada. De seguida, a mistura pode ser arrefecida com salmoura e extraída com tolueno. Os extractos são concentrados e o resíduo diluído com metanol. Os sólidos resultantes podem ser colhidos, dissolvidos em acetato de etilo, clarificados e diluídos com metanol. Os sólidos podem ser colhidos desta diluição e secos para dar origem do composto VI.

Num passo 7 (não apresentado), o composto VI numa solução de etanol pode ser hidrogenado com um catalisador Pd-carvão. A seguir à clarificação, o material hidrogenado pode ser misturado com uma pequena quantidade de ácido ascórbico e tratado com ácido acético. O precipitado cristalino resultante pode, então, ser colhido, lavado com etanol e seco para dar origem ao produto final, cloridrato de 1-[4-(2-azepan-l-il-etoxi)-benzil]2-(4-hidroxi-fenil)-3-metil-lH-indol-5-ol. O produto pode, então, se recristalizado a partir de etanol, opcionalmente contendo uma pequena quantidade de ácido ascórbico, de modo preferido tal como de cerca de 0,5% por peso a cerca de 3,0% por peso.

Nas descrições anteriores, os intermediários III a VI podem ser prontamente isolados como sólidos. Todos os outros intermediários podem ser, de modo mais preferido, utilizados como soluções em solventes orgânicos. 40 ΡΕ1025077

Os esquemas IX a XII exemplificam a síntese de 2-(4-hidroxi-fenil)-metil-1-[4-(2-piperidin-l-il-etoxi)-ben-zil]-lH-indol-5-ol utilizando intermediários da presente invenção. O esquema lia, anteriormente descritos, podem ser considerados o primeiro passo do esquema IX ou um passo anterior a este. Neste passo, o álcool 4-hidroxibenzílico é tratado com um cloreto de arilo amino alquilo desejado para dar origem ao álcool benzílico alcoxi correspondente. No exemplo específico do esquema lia, o álcool 4-hidroxibenzílico é tratado com cloridrato de 1-(2-cloroetil)-piperidina na presença de K2C03/Me2C0 para dar origem ao álcool 4-(2-piperidiniletoxi)benzílico. Pode adicionar-se tolueno e salmoura à mistura de álcool resultante para separar as suas fases. A fase de tolueno pode, então, ser lavada sucessivamente com alcali aquosa e salmoura. 0 lote resultante pode, então, ser concentrado e adicionar-se dicloridrato de etileno para formar uma solução do intermediário, álcool 4-(2-piperidiniletoxi)benzílico. A solução de álcool 4-(2-piperidiniletoxi)benzílico em dicloridrato de etileno pode se combinada com cloreto de tionilo e aquecida até a reacção estar terminada. Ao arrefecer, a mistura pode ser concentrada, seguida pela adição de 1,2-dimetoxietano e a concentração adicional. O precipitado pode ser colhido e seco para dar origem ao intermediário cloridrato de cloreto de 4-(2-piperi-diniletoxi)benzilo, conforme demonstrado no esquema IX. ΡΕ1025077 41

Esquema IX

Conforme demonstrado no esquema IX, uma solução de álcool 4-(2-piperidiniletoxi)benzílico pode ser combinada com cloreto de etileno e cloreto de tionilo e aquecida para criar uma mistura de reacção. Ao arrefecer, a mistura da reacção pode ser tratada com 1,2 dimetoxietano e, novamente, concentrada. 0 precipitado resultante, cloridrato de cloreto de 4-(2-piperidiniletoxi)benzilo, pode, então, ser colhido e seco.

Esquema X

O esquema X representa a bromação de 4-benziloxi-propiofenona em ácido acético com bromo para dar origem a 4'-(benziloxi)-2-bromopropiofenona. Quando esta reacção estiver terminada, a mistura pode ser arrefecida com água. 42 ΡΕ1025077 O precipitado resultante pode ser colhido, lavado com ácido acético diluido, água e heptano e seco.

Esquema XI

0 produto de 4'-(benziloxi)-2-bromopropiofenona do esquema x pode ser aquecido com cloridrato de 4-benziloxianilina na presença de N,N-di-isopropiletilamina e tolueno sob refluxo com a remoção azeotrópica da água, conforme demonstrado no esquema XI. Quando a reacção estiver terminada, a mistura pode ser arrefecida e diluida com metanol. Os sólidos resultantes de 3-metil-2-(4-ben-ziloxi)fenil-5-benziloxiindole podem ser colhidos, lavados com metanol e secos. ΡΕ1025077 43

Esquema XII

O produto de 3-metil-2-(4-benziloxi)fenil-5-ben-ziloxiindole do esquema XI pode então ser reagido com cloridrato de cloreto de 4-(2-piperidiniletoxi)benzilo na presença de terc-butóxido de sódio em N,N-dimetilformamida. A mistura resultante pode ser arrefecida com salmoura e 44 ΡΕ1025077 extraída com tolueno. A seguir à clarificação, os extractos podem ser concentrados e diluídos com metanol. Os sólidos resultantes do 5-benziloxi-2-(4-benziloxifenil)-1-[4-(2-piperidin-l-il-etoxi)benzil]-lH-indole podem ser colhidos, dissolvidos em acetato de etilo, diluídos com metanol e secos. Estes sólidos podem ser dissolvidos em etanol-tetra-hidrofurano e hidrogenados utilizando o catalisador Pd-carvão. A solução pode, então, ser clarificada, opcionalmente misturada com uma pequena quantidade de ácido ascór-bico e depois tratada com HC1 aquoso. O precipitado pode então ser colhido, lavado com etanol-tetra-hidrofurano e água e seco para obter o produto final de 2-(4-hidroxi-fenil)-3-metil-l-[4-(2-piperidin-l-il-etoxi)-benzil]-1H-indol-5-ol. EXEMPLO 11 5-benziloxi-2-(4-benziloxi-fenil)-3-1-[4-(2-piperidin-l-il- etoxi) -benzil] -lH-indole A uma solução de 5-benziloxi-2-(4-benziloxifenil) -3-metil-lH-indole (117,5 g; 0,28 mol; 1,0 eq.) em DMF (1,3 1) adicionou-se NaH (28,0 g; 60 % de dispersão do óleo; 0,7 mol; 2,5 eq.) em porções a -5/-8°C ao longo de 1 h. A mistura da reacção foi agitada durante 2 h. Adicionou-se uma solução do cloreto do exemplo 8 em THF (1,0 1) gota-a-gota a -10/0°C ao longo de 2 h. A mistura da reacção foi agitada a 25°C durante a noite. A TLC neste ponto não demonstrou material inicial, sobretudo produto (EtOAc/hexa-no 1:5) . A mistura da reacção foi diluída com água (6 1), extraída com EtOAc (2x31) e seca sobre Na2S04. A solução 45 ΡΕ1025077 foi concentrada até 1 1, vertida sobre MeOH (2,5 1) e agitada durante 1 h. 0 precipitado foi filtrado e seco para dar origem ao composto do titulo (129 g; 73 %) . '"H RMN (CDCI3/TMS) : 7, 64 - 6,63 (m, 21H) ; 5,12 (s, 2H) ; 5,09 (s, 2H); 5,07 (s, 2H); 4,07 (t, 2H, J = 6,06 Hz); 2,72 (t, 2H, J = 6,06 Hz); 2,48 (m, 4H) ; 2,24 (s, 3H) ; 1,62 -1,24 (m, 6H). EXEMPLO 12 5-benziloxi-2-(4-benziloxi-fenil)-3-1-[4-(2-hexametilenoimin-l-il-etoxi)-benzil]-lH-indole A uma suspensão de NaH (20,0 g; 60% de dispersão do óleo; 0,5 mol; 2,5 eq.) adicionou-se solução de 5-benziloxi-2-(4-benziloxi-fenil)-3-metil-lH-indole (84 g; 0,2 mol; 1,0 eq.) em DMF (100 ml) a 0/10°C ao longo de 1 h. A mistura da reacção foi agitada durante 30 min. Adicionou-se uma solução do cloreto do exemplo 9 (67 g; 0,22 mol; 1,1 eq.) em DMF (200 ml) gota-a-gota a 0/+10°C ao longo de 2 h. A mistura da reacção foi agitada a 25°C durante 2 h. A TLC neste ponto não demonstrou material inicial, sobretudo produto (EtOAc/hexano 1:5). A mistura da reacção foi diluída com água (1 1), extraída com EtOAc (3x11) e seca sobre MgSCu. A solução foi concentrada até 150 ml, vertida sobre MeOH (750 ml) e agitada durante a noite. O precipitado foi filtrado e seco para dar origem ao composto do título (99g; 76 %). 46 ΡΕ1025077 ΧΗ RMN (CDCI3/TMS) : 7, 48 - 6,74 (m, 21H) ; 5,13 (s, 2H) ; 5,11 (S, 2H); 5,09 (s, 2H); 4,00 (t, 2H, J = 6,24 Hz); 2,91 (t, 2H, J = 6,27 Hz); 2,75 (m, 4H) ; 2,24 (s, 3H) ; 1,71 - 1,52 (m, 8H). EXEMPLO 13 5-benziloxi-2-(4-benziloxi-fenil)-3-1-[4-(2-dimetilaminoetoxi)-benzil]1-1H indole A uma suspensão de NaH (1,1 g; 60% de dispersão do óleo; 0,05 mol; 2,5 eq.) adicionou-se solução de 5-benziloxi-2-(4-benziloxi-fenil)-3-metil-lH-indole (6,97 g; 0,017 mol; 1,0 eq.) em DMF (100 ml) a 0/10°C ao longo de 0,5 h. A mistura da reacção foi agitada durante 30 min. Adicionou-se uma solução do cloreto do exemplo 10 (4,57 g; 0,018 mol; 1,1 eq.) na forma de porção a 0/ + 10°C ao longo de 2 h. A mistura da reacção foi agitada a 25°C durante 0.5 h. A TLC neste ponto não demonstrou material inicial, sobretudo produto (EtOAc/hexano 1:5). A mistura da reacção foi diluída com água (200 ml), extraída com EtOAc (3 x 200 ml) e seca sobre MgSC>4. A solução foi concentrada até 150 ml, vertida sobre MeOH (300 ml) e agitada durante a noite. O precipitado foi filtrado e seco para dar origem ao composto do título 5,6 g (53%). 1H RMN(CDCI3/TMS) : 7, 50-6, 66(m, 21H); 5,13 (s, 2H) ; 5,11 (S, 2H); 5,09 (S, 2H); 3,99 (t, 2H, J = 5,76 Hz); 2,69 (t, 2H, J = 5,73 Hz); 2,31 (s, 6H); 2,42 (s, 3H) 47 ΡΕ1025077 EXEMPLO 14 5-benziloxi-2-(4-benziloxi-fenil)-3-metil-lH-indole

Um balão foi enchido com 4-benziloxianilina (45 g; 0,23 mol), 4'-benziloxi-2-bromofenilpropiofenona (66414— 19-5) (21 g; 0, 066 mol) e 50 ml de DMF. A reacção foi aquecida até ao refluxo durante 30 minutos, de seguida arrefecida até à temperatura ambiente e depois dividida entre 250 ml de EtOAc e 100 ml de IN HC1 (aq). O EtOAc foi lavado com NaHC03 (aq) e salmoura e seco sobre MgS04. A solução foi concentrada, o resíduo foi absorvido em CH2C12 e adicionaram-se hexanos para precipitar 25 g de um sólido bruto. O sólido foi dissolvido em CH2C12, evaporado sobre silica gel e cromatografado utilizando CH2Cl2/hexano (1:5) para obter 9,2 g de um sólido castanho-claro (33%): P.f. =150-152°C; XH RMN (DMSO) 10,88 (S, 1 H) ; 7,56 (d, 2 H, J = 8,8 Hz); 7,48 (d, 4H, J = 7,9 Hz); 7, 42-7, 29 (m, 6 H); 7,21 (d, 1 H, J = 7,0 Hz); 7,13 (d, 2 H, J = 8,8Hz); 7,08 (d, 1 H, J = 2,2 Hz); 6,94 (dd, 1 H,J = 8,8; 2,4 Hz); 5,16 (s, 2 H); 5,11 (s, 2 H); 2,33 (s, 3 Η); IV (KBr) 3470, 2880, 2820, 1620cm_1; MS ei m/z 419. 48 ΡΕ1025077 EXEMPLO 15 2-(4-hidroxi-fenil)-3-metil-l-[4-(2-piperidin-l-il-etoxi)- benzil]-lH-indole -5-ol

Tratou-se uma suspensão de Pd a 10%/C (1,1 g) em EtOH com uma solução do composto do título do exemplo 11 (2.2 g; 3,4 mmol) em THF/EtOH. Adicionou-se ciclo-hexadieno (6,0 ml; 63 mmol) e agitou-se a reacção durante 48 horas. O catalisador foi filtrado através de Celite e a mistura da reacção foi concentrada e cromatografada sobre sílica gel utilizando uma eluição por gradiente de MeOH/CH2Cl2 (1:19 a 1:10) para obter 0,8 g do produto na forma de um sólido branco. P.f .=109-113°C; CHN calcul. para C29H32N203 + 0,5 H20; 2H RMN 9,64 (s, 1 H) ; 8,67 (s, 1 H) ; 7,14 (d, 2 H, J = 8,6 Hz); 7,05 (d, 1 H, J = 8,6 Hz); 6,84 (d, 2 H, J = 8,8

Hz); 6,79 (d, 1 H, J = 2,2 Hz); 6,74 (s, 4 H); 6,56 (dd, 1 H, J = 8,8; 2,4 Hz); 5,09 (s, 2 H) ; 3,95-3, 93 (m, 2 H) ; 2,60-2,51 (m, 2 H); 2,39-2,38 (m, 4 H); 2,09 (s, 3 H); I, 46-1,45 (m, 4 H); 1,35-1,34 (m, 2 Η); IV (KBr) 3350 (br), 2920, 1620, 1510 cm-1; EM (IE) m/z 456.

Ensaio in vitro de ligação ao receptor do estro- génio

Preparação do receptor

As células de CHO que sobreexpressam o receptor do estrogénio foram cultivadas em placas de 150 mm2 em DMEM + soro bovino fetal extraído com carvão revestido com 49 ΡΕ1025077 dextrano a 10%. As placas foram lavadas duas vezes com PBS e uma vez com 10 mM Tris-HCl, pH 7,4; 1 mM EDTA. As células foram colhidas raspando a superfície e, de seguida, a suspensão celular foi colocada sobre gelo. As células foram quebradas com um triturador de tecido motorizado portátil utilizando dois impulsos de 10 segundos. A preparação bruta foi centrifugada a 12.000 g durante 20 minutos seguida por uma centrifugação de 60 minutos a 100.000 g para produzir um citosol livre de ribosomas. O citosol foi então congelado e conservado a -80°C. A concentração proteica do citosol foi calculada utilizando o ensaio BCA com uma proteína de referência padrão.

Condições do ensaio de ligação 0 ensaio concorrente foi efectuado numa placa de 96 poços (poliestireno*) que liga < 2,0% da entrada total de [3 H]-17_-estradiol e cada ponto de informação foi reunido em triplicado. 100 ug/100 ul da preparação do receptor foi dividida em aliquotas por poço. Adicionou-se uma dose de saturação de 2,5 nM [3H]17_-estradiol + concorrente (ou tampão) num volume de 50 ul na competição preliminar quando foram avaliados os concorrentes lOOx e 500x, foi utilizado apenas 0,8 nM de [3H]17_-estradiol. A placa foi incubada à temperatura ambiente durante 2,5 h. No final deste período de incubação, adicionou-se 150 ul de carvão revestido a dextrano gelado (5% de carvão activado revestido com 0,05% de dextrano 69K) a cada poço e a placa foi imediatamente centrifugada a 99 g durante 5 minutos a 50 ΡΕ1025077 4°C. 200 ul da solução sobrenadante foram então removidos para a contagem de cintilação. As amostras foram contadas a 2% ou 10 minutos, o que ocorreu primeiro. Como o poliestireno absorve uma pequena quantidade de [3H] 17_-estra-diol, foram incluídos poços que continham radioactividade e citosol mas que não foram processados com carvão para quantificar as quantidades de isótopos disponíveis. Igualmente, poços que continham radioactividade mas nenhum citosol foram processados com carvão para calcular o DPM não removível de [3H]17_-estradiol., Foram utilizadas placas de 96 poços Corning #25880-96, por revelarem ligar-se a menor quantidade de estradiol.

Análise dos resultados

As contagens por minuto (CPM) da radioactividade foram automaticamente convertidas para desintegrações por minuto (DPM) pelo contador de cintilações LS 7500 da Beckman utilizando um conjunto de padrões amortecidos para criar um H# para cada amostra. Para calcular a % da ligação de estradiol na presença de 100 vezes ou 500 vezes o concorrente, aplicou-se a seguinte fórmula: ((DPM da amostra - DPM não removido por carvão /(DPM de estradiol - DPM não removido por carvão)) x 100% = % da ligação de estradiol

Para a criação das curvas IC50, a % da ligação é calculada vs. o composto. As IC50 são criadas para os 51 ΡΕ1025077 compostos que apresentam > 30% de concorrência a 500x a concentração concorrente. Para uma descrição destes métodos, ver Hulme, E. C., ed. 1992. Receptor-Ligand Inter-actions: A Practical Approach. IRL Press, New York (consultar especialmente o capitulo 8). Nas tabelas seguintes, a referência ao composto do exemplo 1 refere-se ao produto final, 2-(4-hidroxi-fenil)-3-metil-l-[4-(2-piperi-din-l-il-etoxi)-benzil]-lH-indole -5-ol.

Afinidade para receptor de estrogénio (descrita como RBA: 17_-estradiol=100)

Composto RBA Raloxifeno 200 Tamoxifeno 1,8 Equilino 5,3 Exemplo 15 400

Ensaio de fosfatase alcalina das células de

Ishikawa

Manutenção e tratamento celular:

As células de Ishikawa foram mantidas em DMEM/F12 (50%:50%) contendo vermelho de fenol + 10% de soro bovino fetal e o meio foi suplementado com 2 mM Glutamax, 1% de Pen/Strap e piruvato de sódio 1 mM . Cinco dias antes do inicio de cada experiência (tratamento das células), o meio foi alterado para DMEM/F12 isento de vermelho de fenol + 10% de soro separado de carvão revestido com dextrano. No 52 ΡΕ1025077

dia anterior ao tratamento, as células foram colhidas utilizando 0,5% de tripsina/EDTA e plaqueadas numa densidade de 5 x 104 células/poço em placas de cultura de tecidos de 96 poços. Os compostos do teste foram doseados a 10”6, 10~7 e 10~8M para além de 10~6M (composto) +10“9 M 17 - estradiol para avaliar a capacidade dos compostos de funcionarem como anti-estrogénios. As células foram tratadas durante 48 h antes do ensaio. Cada placa de 96 poços continha um controlo de 17 estradiol. A população de amostras para cada dose foi de n=8.

Ensaio da fosfatase alcalina:

No final das 48h, o meio é aspirado e as células são lavadas três vezes com solução salina com tampão fosfato (PBS). Adiciona-se 50 1 de tampão de lise (Tris-HCl 0,1 M; pH 9,8; 0,2% Triton x-100) a cada poço. As placas são colocadas a -80°C durante pelo menos 15 minutos. As placas são submetidas a descongelação a 37°C seguida pela adição de 150 1 de Tris-HCl 0,1 M, pH 9,8, contendo paranitrofenilfosfato (pNPP) 4 mM, a cada poço (concentração final, pNPP 3 mM) . Os cálculos da absorvância e do declive foram efectuados utilizando o programa KineticCalc Application (Bio-Tek Instruments, Inc., Winooski, VT) . Os resultados são expressos como a média +/- D.P. da taxa da reacção enzimática (declive) perfazendo a média através da porção linear da curva da reacção cinética (leituras de densidade óptica a cada 5 minutos durante 30 minutos de leitura da absorvância). Os resultados dos compostos são resumidos como percentagem da resposta relacionada com 1 nM 53 ΡΕ1025077 17_-estradiol. Os vários compostos foram ensaiados quanto a actividade estrogénica mediante o método de fosfatase alcalina e foram calculados os valores correspondentes de ED50 (95% C.I.). Os quatro listados de seguida foram utilizados como padrões de referência:

17_-estradiol 0,03 nM 17-estradiol 1,42 nM estriol 0,13 nM estrona 0,36 nM

Uma descrição destes métodos é feita por Holinka, C. F., Hata, H., Kuramoto, H. e Gurpide, E. (1986) Effects of steroid hormones and antisteroids on alkaline phos- phatase activity in human endometrial câncer cells (Ishikawa Line) . Câncer Research, 46:2771 -2774 , e por Littlefield, B.A., Gurpide, E. , Markiewicz, L., McKinley, B. e Hochberg, R.B. (1990) A simple and sensitive microtiter plate estrogen bioassay based on stimulation alkaline phosphatase in Ishikawa cells; Estrogen action of D5 adrenal steroids. Endocrinology, 6:2757-2762.

Ensaio da fosfatase alcalina de Ishikawa

Composto 17_-estradiol tamoxifeno raloxifeno

Exemplo 15 % Activagão 100% de actividade 0% de actividade (45% com 1 nM 17_-estradiol) 5% de actividade (5% com 1 nM 17_-estradiol) 1% de actividade (1% com 1 nM 17_-estradiol) ΡΕ1025077 54

Ensaio de transfecção 2X VIT ERE

Manutenção e tratamento celular Células de ovário de hamster chinês (CHO) que foram estavelmente transfectadas com o receptor do estrogénio humano foram mantidas em DMEM + 10% de soro bovino fetal (FBS) . 48 h antes do tratamento, o meio de cultura foi substituído por DMEM isento de vermelho de fenol + 10% FBS separado de carvão revestido de dextrano (meio de tratamento). As células foram plaqueadas com uma densidade de 5000 células/poço em placas de 96 poços contendo 200 1 de meio/poço.

Transfecção de fosfato de cálcio ADN repórter (plasmídio Promega pGL2 contendo duas cópias em série da vitelogenina ERE em frente ao promotor da cinase da timidina que conduz o gene da luciferase) foi combinado com o plasmídio pCH 110 (Pharmacia) de expressão da b-galactosidase e ADN portador (pTZl8U) na seguinte razão:

10 uG de ADN repórter 5 uG de pCHUODNA 5 uG de pTZl8U 20 uG de ADN/1 ml de solução de transfecção 55 ΡΕ1025077 O ADN (20 ug) foi dissolvido em 500 ul de 250 mM CaCÍ2 estéril e adicionado gota-a-gota a 500 ul de 2 x HeBS (0,28 M NaClm, 50 mM HEPES, 1,5 mM Na2HP04, pH 7,05) e incubado à temperatura ambiente durante 20 minutos. 20 ul desta mistura foram adicionados a cada poço de células e permaneceram nas células durante 16 h. No final desta incubação, o precipitado foi removido, as células foram lavadas com o meio, foi substituído meio de tratamento novo e as células foram tratadas com veículo, 1 nM 17_-estradiol, 1 nM de composto ou 1 nM de composto + 1 nM de 17_-estradiol (testes relativos a antagonismo do estrogénio). Cada condição de tratamento foi efectuada em 8 poços (n=8) que foram incubados durante 24 h antes do ensaio com luciferase.

Ensaio com luciferase

Após 24 h de exposição aos compostos, o meio foi removido e cada poço lavado com 2 x 125 ul de PBS sem Mg++ e Ca++. Após a remoção do PBS, adicionou-se 25 ul de tampão de lise Promega a cada poço e deixou-se repousar à temperatura ambiente durante 15 minutos, seguidos por 15 min a -80°C e 15 min a 37°C. Transferiu-se 20 ul de lisado para uma placa de 96 poços opaca para a avaliação da actividade da luciferase e utilizou-se o restante lisado (5 ul) para a avaliação da actividade da B-galactosidase (normalizar a transfecção). Adicionou-se o substrato luciferina (Promega) em 100 ul de aliquotas a cada poço automaticamente mediante o luminómetro e a luz produzida 56 ΡΕ1025077 (unidades relativas de luz) foi lida 10 segundos após a adição.

Ensaio de infecção de luciferase

Composto 17_-estradiol estriol tamoxifeno raloxifeno Exemplo 15 % Activação 100% de actividade 38% de actividade 0% de actividade (10% com 1 nM 17_-estradiol) 0% de actividade (0% com 1 nM 17_-estradiol) 0% de actividade (0% com 1 nM 17_-estradiol)

Ensaio de B-galactosidade

Aos restantes 5 ul do lisado adicionou-se 45 ul de PBS. De seguida, adicionou-se 50 ul de tampão do ensaio Promega B-galactosidade 2X, misturou-se bem e incubou-se a 37°C durante 1 hora. Preparou-se uma placa contendo uma curva padrão (0,1 a 1,5 miliunidades em triplicado) para cada corrida experimental. As placas foram analisadas num leitor espectrofotométrico de placas da Molecular Devices a 410 nm. As densidades ópticas do desconhecido foram convertidas para miliunidades de actividade mediante uma extrapolação matemática da curva padrão.

Análise dos resultados

Os dados da luciferase foram criados na forma de unidades de luz relativas (RLU) acumuladas durante uma 57 ΡΕ1025077 medição de 10 segundos e automaticamente transferidos para um ficheiro JMP (SAS Inc) onde foram subtraídas as RLUs de base. Os valores da B-galactosidade foram importados automaticamente para o ficheiro e estes valores foram divididos em RLUs para normalizar os dados. Os desvios médios e padrão foram determinados a partir de um n=8 de cada tratamento. A actividade dos compostos foi comparada ao 17-estradiol para cada placa. A percentagem da actividade conforme comparada com o 17_-estradiol foi calculada mediante a fórmula %=((controlo de estradiol)/(valor do composto)) x 100. Estas técnicas são descritas por Tzukerman, M.T., Esty, A., Santiso-Mere, D., Danielian, P., Parker, M.G., Stein, R.B., Pike, J.W. e McDonnel, D.P. (1994). A capacidade de transactivação do receptor do estrogénio humano foi determinada tanto pelo contexto celular como pelo contexto do promotor e mediada por duas regiões intramoleculares funcionalmente distintas (ver Molecular Endocrinology, 8:21-30).

Bioensaio uterotrófico/anti-uterotrófico no rato

As propriedades estrogénicas e anti-estrogénicas dos compostos foram determinadas num ensaio uterotrófico de rato imaturo (4 dias) que (conforme descrito anteriormente por L. J. Black e R. L. Goode, Life Sciences, 26, 1453 (1980)). Ratos Sprague-Dawley imaturos (fêmeas, 18 dias de idade) foram testados em grupos de seis. Os animais foram tratados mediante a injecção i.p. diária com 10 ug do composto, 100 ug do composto, (100 ug de composto + 1 ug de 58 ΡΕ1025077 17_-estradiol) para verificar a antiestrogenicidade e 1 ug de 17_-estradiol com 50% de DMSO/50% solução salina como veiculo da injecção. No dia 4 , os animais foram sacrificados por asfixia com C02 e os seus úteros foram removidos e separados dos lipidos em excesso, todo o fluído foi removido e o peso molhado foi determinado. Uma pequena secção de uma trompa foi submetida a histologia e o restante foi utilizado para isolar o arn total a fim de avaliar a expressão génica do componente complemento 3.

Modelo de rato ovarectomlzado de 3 dias

Composto Tamoxifeno Raloxifeno controlo = 42,7 mg 69,6 mg 47.5 43.2 1 ug 17_-estradiol = 98,2

Composto 10 ug Exemplo 15 39,9 mg controlo = 30,7 mg 100 ug 100 ug+1 ug 17_-estradiol 2 7,4 mg 2 4,3 mg 1 ug 17_-estradiol = 63,2 O composto raloxifeno [cloridrato de 2-(4-hidro-xifenil)-6-hidroxibenzo[b]tien-3-il][4-(1-piperidinileto-xi]fenil-metanona é representativo de uma classe de compostos conhecidos como sendo moduladores selectivos do receptor do estrogénio, possuindo actividades semelhantes aos agonistas do estrogénio sobre os tecidos ósseos e os lipidos séricos enquanto exibe um antagonismo ao estrogénio nos tecidos uterinos e da mama. Palkowitz et al. sugere em 59 ΡΕ1025077 J. Med. Chem 1997, 40, 1407 análogos activos de Raloxifeno que também podem ser produzidos utilizando os compostos desta invenção. Por exemplo, o seu composto 4a revelado, cloridrato de [2-(4-hidroxifenil)-6-hidroxibenzo[b]tien-3-il] [4-(1-piperidinil)etoxi]fenilmetano pode ser produzido pelo esquema geral da reacção abaixo descrito.

EXEMPLO 16 Éster de metilo do ácido 2-(4-metoxi-benzeno-sulfonilamino)benzóico

A uma solução de 2,00 g (0,013 mol) de antra-nilato de metilo dissolvido em 20 ml de clorofórmio adicionou-se 3,2 ml (0,039 mol) de piridina seguida por 2,733 g (0,013 mol) de cloreto de p-metoxibenzeno-sul-fonilo. A mistura da reacção foi agitada à temperatura ambiente durante 5 h e, de seguida, lavada com HC1 3 N e 60 ΡΕ1025077 água. Os orgânicos foram então secos sobre Na2S04, filtrados e concentrados em vácuo. 0 sólido branco resultante foi lavado com éter e seco em vácuo para dar origem a 3,7 g (87%) da sulfonamida desejada. Cl Espec. de massa: 322 (M+H). EXEMPLO 17 Éster de metilo do ácido 2-(4-methoxi-benzeno-sulfonilamino)-3-metil-benzóico

Do mesmo modo descrito no exemplo 16, 6,24 g (0,038 mol) de 3-metil-antranilato de metilo deu origem a 6,21 g (48%) da sulfonamida desejada na forma de um sólido branco. Espectr. de massa de electropulverização 336,2 (M+H). EXEMPLO 18

Cloreto de 4-(2-piperidin-l-il-etoxi)benzilo

A uma solução agitada de 4-hidroxi-benzaldeído 61 ΡΕ1025077 (12,2 gm; 0,1 mol) e K2CO3 (25 gm, excesso) em N,N-dimetil-formamida (250 ml) adicionou-se monocloridrato de l-(2-cloroetil)piperidina (20,0 gm; 1,08 mol). A mistura da reacção foi aquecida a 80°C durante 24 h e arrefecida à temperatura ambiente. A mistura da reacção foi arrefecida com água gelada e extraída com clorofórmio. Os orgânicos foram lavados com água, secos sobre MgS04 anidro, filtrados e concentrados em vácuo. O resíduo foi dissolvido em metanol e adicionou-se boro-hidreto de sódio (10 gms, excesso) lentamente a 0°C. A mistura da reacção foi agitada à temperatura ambiente durante 2 h e, de seguida, arrefecida com água. O álcool foi extraído com clorofórmio, os orgânicos foram bem lavados com água, secos sobre Na2SC>4, filtrados e concentrados em vácuo. O álcool bruto assim obtido foi dissolvido em THF (200 ml) e passou-se gás de HC1 através deste durante 30 minutos a 0°C. À suspensão de cloridrato assim obtido, adicionou-se lentamente cloreto de tionilo (30 ml, excesso) . A mistura da reacção foi submetida a refluxo durante trinta minutos e arrefecida à temperatura ambiente. A mistura da reacção foi então concentrada até à secura e triturada com éter anidro. O precipitado sólido foi filtrado e seco sob vácuo à temperatura ambiente para dar origem a 25 g (86%) do produto na forma de um sólido branco, p.f. 145 - 148°C. Espectr. de massa de electro-pulverização; 256 (M+H). ΡΕ1025077 62 EXEMPLO 19

Cloreto de 4-(2-N,N-dietil-etoxi)benzilo CICHg

OCH2C%H Γ

A uma solução agitada de 4-hidroxi-benzaldeído (12,2 gm; 0,1 mol) e K2C03 (25 gm, excesso) em N, N-dimetilformamida (250 ml) adicionou-se monocloridrato de 2-dietil-cloreto de aminoetilo (20,0 gm; 1,2 mol). A mistura da reacção foi aquecida a 80°C durante 24 h e arrefecida à temperatura ambiente. A mistura da reacção foi arrefecida com água gelada e extraída com clorofórmio. Os orgânicos foram lavados com água, secos sobre MgS04 anidro, filtrados e concentrados em vácuo. O residuo foi dissolvido em metanol e adicionou-se boro-hidreto de sódio (10 gms, excesso) lentamente a 0°C. A mistura da reacção foi agitada à temperatura ambiente durante 2 h e, de seguida, arrefecida com água. O álcool foi extraído com clorofórmio, bem lavado com água, seco, filtrado e concentrado em vácuo.

O álcool bruto assim obtido foi dissolvido em THF (200 ml) e passou-se gás de HC1 através deste durante 30 minutos a 0°C. À suspensão de cloridrato assim obtido adicionou-se lentamente cloreto de tionilo (30 ml, excesso). A mistura da reacção foi submetida a refluxo durante trinta minutos e arrefecida à temperatura ambiente. A mistura da reacção foi então concentrada até à secura e 63 ΡΕ1025077 triturada com éter anidro. O precipitado sólido foi filtrado e seco sob vácuo à temperatura ambiente para dar origem a 18g (65%) do produto na forma de um sólido branco, p.f. 76 -79°C. Espectr. de massa de electropulverização; 244 (M+H). EXEMPLO 20 N-hidroxi-2-[[(4-metoxifenil)sulfonil][[4- [2—(1— piperidinil)etoxi]fenil]metil]amino]-3-metilbenzamida A uma solução de 1,00 g (2,985 mmol) de éster de metilo do ácido 2-(4-metoxi-benzeno-sulfonilamino)-3-metil-benzóico em 5 ml de DMF adicionou-se 0,952 g (3,284 mmol) de cloreto de 4-(2-piperidin-l-il-etoxi)benzilo e 1,65 g (11,9 mmol) de carbonato de potássio. A mistura da reacção foi então agitada à temperatura ambiente durante 18 h, diluída com água e extraída com éter. Os orgânicos foram então extraídos com solução de HC1 6 N e a camada ácida aquosa foi então alcalinizada com solução de NaOH 6 N e depois extraída com éter. A camada de éter resultante foi seca sobre sulfato de sódio, filtrada e concentrada in vacuo para dar origem a 0, 965 g do éster de piperidina na forma de um óleo incolor. Espectr. de massa de electropulverização; 553,5 (M+H)+. A uma solução de 0,889 g (1,611 mmol) de éster de piperidina em 7 ml de THF adicionou-se 0,203 g de hidróxido de lítio mono-hidratado. A mistura resultante foi aquecida até ao refluxo durante 15 h e, de seguida, concentrada in vacuo para dar origem a um resíduo. O resíduo foi diluído 64 ΡΕ1025077 com água, neutralizado com solução HC1 a 5% e extraído com diclorometano. A camada orgânica foi seca sobre Na2SC>4, filtrada e concentrada in vacuo para dar origem a 0,872 g do ácido carboxílico na forma de uma espuma branca. Espectr. de massa de electropulverização; 539,2 (M+H) + . A uma solução de 0,814 g (1,513 mmol) do ácido carboxílico em 10 ml de DMF adicionou-se 0,245 g (1,82 mmol) de HOBT e 0,386 g (2,01 mmol) de EDC. A reacção foi então agitada durante 1 h à temperatura ambiente e adicionou-se 0,46 ml (7,57 mmol) de uma solução de hidroxilamina a 50% em água. A reacção foi agitada durante a noite e, de seguida, concentrada in vacuo até dar origem a um residuo. O residuo foi diluído com EtOAc, lavado com água e solução de bicarbonato de sódio, seco sobre Na2SC>4, filtrado e concentrado in vacuo para dar origem a um resíduo. O resíduo foi dissolvido em 5 ml de diclorometano e adicionou-se 0,69 ml de uma solução de HC1 1 N em éter. Após 1 h, a reacção foi diluída com éter e o sólido resultante foi filtrado e seco in vacuo para dar origem a 0,179 g do sal de hidroxamato-amina na forma de um sólido branco. Espectr. de massa de electropulverização; 554,5 (M+H) +. EXEMPLO 21 2-[[4-(2-dietilamino-etoxi)-benzil]-(4-metoxi-benzeno-sulfonil)-amino]-N-hidroxi-3-metil-benzamida metilo A uma solução de 1,0 g (2, 653 mmol) de éster de do ácido 2-(4-metoxibenzeno-sulfonilamino)-3- 65 ΡΕ1025077 metilbenzóico em 10 ml de DMF adicionou-se 0,811 g (2,918 mmol) de cloreto de 4-(2-N,N-dietil-etoxi)-benzilo e 1,5 g (10,9 mmol) de carbonato de potássio. A mistura da reacção foi então agitada à temperatura ambiente durante 18 h, diluída com água e extraída com éter. Os orgânicos foram então extraídos com solução de HC1 6 N e a camada ácida aquosa foi então alcalinizada com solução de NaOH 6 N e depois extraída com éter. A camada de éter resultante foi seca sobre sulfato de sódio, filtrada e concentrada in vacuo para dar origem a 0,575 g (37%) do éster de N,N-dietilamino na forma de uma espuma castanho claro. Espectr. de massa de electropulverização; 583,1 (M+H)+. A uma solução de 0,539 g (0,926 mmol) do éster de N,N-dietilamino em diclorometano adicionou-se 2 ml de ácido trifluoroacético. A reacção foi agitada à temperatura ambiente durante 2 h e, de seguida, concentrada in vacuo para dar origem a um residuo. O residuo foi triturado com éter e o sólido resultante foi colhido mediante a filtração e seco in vacuo para dar origem a 0,369 g do ácido carboxílico na forma de um sólido branco. Espectr. de massa de electropulverização: 525,2 (M-H)“. A uma solução de 0, 328 g (0,513 mmol) do ácido carboxílico em 6,5 ml de diclorometano adicionou-se 0,12 ml de DMF seguido por 0,77 ml de 2.0 M cloreto do oxalilo em CH2CI2 e agitou-se a mistura da reacção à temperatura ambiente durante 1 h. 66 ΡΕ1025077

Num balão separado, adicionou-se 8 ml de THF e 1,7 ml de água a 0°C a uma mistura de 0,47 ml (7,7 mmol) de uma solução de hidroxilamina a 50% em água. Após esta mistura ter sido agitada durante 15 minutos a 0°C, adicionou-se a solução de ácido clorídrico numa porção e deixou-se a solução resultante aquecer à temperatura ambiente com agitação durante a noite. A mistura da reacção foi, então, acidificada para o pH 3 com 10% de HC1 e extraída com EtOAc. As camadas orgânicas combinadas foram então secas sobre Na2S04, filtradas e concentradas in vacuo para dar origem a um sólido. O resíduo foi triturado com éter para dar origem a 0,194 g do sal hidroximato-amina na forma de um sólido branco. Espectr. de massa de electropulverização; 542,3 (M+H)+. EXEMPLO 22 Éster de etilo do ácido 2-(4-metoxi-fenilsulfanil)propiónico

A uma solução agitada de 4-metoxibenzenotiol (2,5 gm; 14 mmol) e K2C03 anidro (4,0 gm, excesso) em acetona seca (100 ml) adicionou-se 2-bromo-propionato de etilo (3,0 gm, 16 mmol) num balão com fundo redondo e aqueceu-se a mistura da reacção até ao refluxo durante 8 horas com uma 67 ΡΕ1025077 boa agitação. No final, deixou-se a reacção arrefecer, filtrou-se e a mistura da reacção foi concentrada até dar origem a um resíduo. O resíduo foi extraído com clorofórmio e lavado com H20 e a camada orgânica foi seca sobre MgS04, filtrada e concentrada até dar origem ao éster de etilo do ácido 2-(4-metoxi-fenulsulfanil)propiónico na forma de um óleo amarelo claro. Rendimento 3,6 gms (94%). EXEMPLO 23 Éster de etilo do ácido 2-(4-metoxi-benzeno-sulfonil)propiónico

A uma solução agitada de 12,0 gm (50 mmol) de éster de etilo do ácido 2-(4-metoxi-fenilsulfanil)-propiónico em 300 ml de cloreto de metileno a 0°C adicionou-se lentamente a uma taxa para controlar a exotermia. A mistura da reacção foi agitada à temperatura ambiente durante 2 horas e diluída com 600 ml de hexanos. A mistura da reacção foi filtrada e o filtrado foi agitado com 500 ml de uma solução saturada de Na2SC>3 durante 3 horas. A camada orgânica foi separada, bem lavada com água, seca e evaporada in vacuo para dar origem a 12 gm de um semi-sólido. 68 ΡΕ1025077 EXEMPLO 24 Éster de metilo do ácido 2-(4-metoxi-benzeno-sulfonil)-2-metil-3-[4-(2-piperidin-l-il-etoxi)-fenil]propiónico

A uma mistura agitada de 2,7 g (10 mmol) de éster de etilo do ácido 2-(4-metoxi-benzeno-sulfonil)-propiónico, 3,03 gm (10 mmol) de cloreto de 4-(2-piperidin-l-il-etoxi)-benzilo, 10 gm de K2C03 e 500 mg de 18-coroa-6 em 250 ml de acetona foi sujeita ao refluxo durante 16 horas. No final, a mistura da reacção foi filtrada e a camada de acetona foi concentrada até dar origem a um resíduo. O álcool foi extraído com clorofórmio, bem lavado com água, seco sobre MgS04 anidro, filtrado e concentrado para dar origem a um resíduo. O resíduo obtido foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel mediante a eluição com 50% de acetato de etilo-hexanos para dar origem a 4,8 gm (92%) do produto desejado na forma de um óleo. MS: 490(M+H)+. EXEMPLO 25 Ácido 2-(4-metoxibenzeno-sulfonil)-2-metil-3-[-4-(2-piperidinil-l-il-etoxi)-fenil]propiónico

69 ΡΕ1025077 A uma solução agitada de éster de etilo do ácido 2-(4-metoxibenzeno-sulfonil)-2-metil-3-[4-(2-piperidin-l-il-etoxi)fenil]propiónico (4,9 gm; 10 mmol) em álcool metálico adicionou-se NaOH 10 N (20 ml, excesso) . A mistura da reacção foi agitada à temperatura ambiente durante 48 horas. No final, a mistura da reacção foi concentrada e cuidadosamente neutralizada com HC1 diluído. O resíduo obtido foi extraído com clorofórmio, bem lavado com água, seco e concentrado. O produto obtido foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel mediante a eluição com acetato de etilo:metanol (95:5) para dar origem ao produto do exemplo na forma de cristais incolores, p. f. 106°C; MS: 462,5 (M+H)+. Rendimento 4,1 gm, 88-1. EXEMPLO 26 2-(4-metoxibenzeno-sulfonil)-2-metil-3-[4-(2-piperidin-l- il-etoxi)-fenil]-propionamida

íl „0 Q

A uma solução agitada de ácido 2-(4-metoxi-fenilsulfonil)-2-metil-3-fenil-[4(2-piperidin-l-il-etoxi)]- 70 ΡΕ1025077 propiónico (2,3 g, 5 mmol) de DMF (2 gotas) em CH2CI2 (lOOml) a 0°C adicionou-se cloreto de oxalilo (1,2 gm, 10 mmol) gota-a-gota. Após esta adição, a mistura da reacção foi agitada à temperatura ambiente durante 1 hora. Simultaneamente, num balão separado, agitou-se uma mistura de cloridrato de hidroxilamina (3,4 gm; 50 mmol) de trietilamina (10,1 gm, 100 mmol) em THFrágua (5:1; 50 ml) a 0°C durante 1 hora. Ao fim de 1 hora, a mistura da reacção do cloreto de oxalilo foi concentrada e o resíduo amarelo pálido foi dissolvido em 10 ml de CH2C12 e adicionado lentamente à hidroxilamina a 0°C. A mistura da reacção foi agitada à temperatura ambiente durante 24 horas e concentrada. O resíduo obtido foi extraído com clorofórmio e bem lavado com água. O produto obtido foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel e eluído com acetato de etilo. O produto do exemplo foi isolado na forma de um sólido incolor, . P. f. 98°C; rendimento, 48%; MS: 477 (M+ Η)+; 1H RMN (300 MHz, CDCI3) : 1,2 (s,3H) ; 3,5-1,5 (m, 16H); 3,9 (s, 3H) ; 4,4 (m, 1H); 6,5-7,8 (m, 8H) ; 10,8 (bs,1H) .

Os compostos objectos da presente invenção foram testados quanto a actividade biológica de acordo com os seguintes procedimentos.

Ensaio in vitro da gelatinase 0 ensaio está baseado na clivagem do substrato tiopéptido ((Ac-Pro-Leu-Gly(2 mercapto-4 metil-pentanoil)- 71 ΡΕ1025077

Leu-Gly-OEt), Bachem Bioscience) pela enzima, gelatinase, libertando o produto do substrato que reage colorime-tricamente com DTNB ((5,5'-ditio-bis(ácido 2-nitro-benzói-co) ) . A actividade da enzima é medida mediante a taxa do aumento da cor. O substrato tiopeptideo é preparado de fresco na forma de um estoque 20 mM em 100% de DMSO e o DTNB é dissolvido em 100% de DMSO na forma de um estoque 110 mM e conservado no escuro à temperatura ambiente. Tanto o substrato como o DTNB são diluídos em conjunto até 1 mM com o tampão de substrato (50 mM HEPES pH 7,5; 5 mM CaCl2) antes de serem utilizados. O estoque de gelatinase B neu-trofílica humana é diluído com tampão do ensaio (HEPES pH 7, 5 50 mM; CaCl2 5 mM; 0,02% Brij) para resultar numa concentração final 0,15 nM. O tampão do ensaio, a enzima, o DTNB/ substrato (500 μΜ de concentração final) e o veículo ou inibidor são adicionados a uma placa de 96 poços (volume total da reacção de 200 μΐ) e o aumento na cor é monitorizado espectrofotometricamente durante 5 minutos a 405 nm num leitor de placas. O aumento do OD405 é calculado e o declive da linha é calculado, o qual representa a taxa da reacção. A linearidade da taxa da reacção é confirmada (r2 > 0,85). A média (x ± dmp) da taxa de controlo é calculada e comparada quanto a importância estatística (p < 0,05) com ratos tratados com fármacos utilizando o teste de comparações múltiplas de Dunnett. As relações dose-resposta podem ser criadas mediante a utilização de doses múltiplas e os valores de IC50 com 95% Cl são calculados utilizando a regressão linear (IPRED, HTB). 72 ΡΕ1025077

Referências: Weingarten, H and Feder, J.,

Spectrophotometric assay for vertebrate collagenase, Anal. Biochem. 147, 437-440 (1985).

Ensaio in vitro da colagenase

Este ensaio tem como base a clivagem do substrato do peptideo ((Dnp-Pro-Cha-GICys(Me)-His-Ala-Lys(NMa)-nh2) , Peptide International, Inc.) mediante a colagenase que liberta o grupo NMa fluorescente, que é quantificada no fluorómetro. Dnp tempera a fluorescência de NMa no substrato intacto. O ensaio é corrido em tampão do ensaio HCBC (HEPES 50 mM, pH 7,0; Ca+2 5 mM; 0,02% de Brij; 0,5% de cisteína), com colagenase fibroblástica recombinante humana (truncada, pm=18 828; WAR, Radnor). O substrato é dissolvido em metanol e conservado congelado em aliquotas de 1 mM. A colagenase é conservada congelada em tampão em aliquotas de 25 μΜ. Para o ensaio, o substrato é dissolvido em tampão de HCBC para uma concentração final 10 μΜ e colagenase para uma concentração final 5 nM. Os compostos são dissolvidos em metanol, DMSO ou HCBC. O metanol e o DMSO são diluídos em HCBC até < 1,0%. Os compostos são adicionados a uma placa de 96 poços contendo a enzima e a reacção é iniciada pela adição do substrato. A reacção é lida (excitação 340 nm, emissão 444 nm) durante 10 min e o aumento na fluorescência ao longo do tempo é calculado como uma linha linear. O declive da linha é calculado e representa a taxa da reacção. A linearidade da taxa da reacção é confirmada (r2 > 0,85). A média (x ± dmp) da taxa de 73 ΡΕ1025077 controlo é calculada e comparada quanto a importância estatística (p < 0,05) com ratos tratados com fármacos utilizando o teste de comparações múltiplas de Dunnett. As relações dose-resposta podem ser criadas mediante a utilização de doses múltiplas do fármaco e os valores de IC50 com 95% Cl são calculados utilizando a regressão linear (IPRED, HTB).

Referências: Bickett, D. M. et al., A high throu-ghput fluorogenic substrate for interstitial collage-nase(MMP-l) and gelatinase (MMP-9), Anal. Biochem. 212, 58-64 (1993).

Procedimento para a medição da inibição da TACE

Utilizando placas de microtitulação negras de 96 poços, cada poço recebe uma solução composta por 10 μΐ de TACE (Immunex, concentração final 1 pg/ml), 70 μΐ de tampão Tris, pH 7,4 contendo 10% de glicerol (concentração final lOmM) e 10 μΐ da solução do composto do teste em DMSO (concentração final 1 μΜ, concentração do DMSO < 1%) e incubada durante 10 minutos à temperatura ambiente. A reacção é iniciada mediante a adição de um substrato do peptídeo fluorescente (concentração final 100 μΜ) a cada poço, procedendo-se, de seguida, à agitação num agitador durante 5 seg. A reacção é lida (excitação 340 nm, emissão 420 nm) durante 10 min e o aumento na fluorescência ao longo do tempo é calculado como uma linha linear. O declive da linha é calculado e representa a taxa da reacção. A 74 ΡΕ1025077 linearidade da taxa da reacção é confirmada (r2 > 0,85). A média (x ± dmp) da taxa de controlo é calculada e comparada quanto a importância estatística (p < 0,05) com ratos tratados com fármacos utilizando o teste de comparações múltiplas de Dunnett. As relações dose-resposta podem ser criadas mediante a utilização de doses múltiplas do fármaco e os valores de IC50 com 95% Cl são calculados utilizando a regressão linear.

Os resultados obtidos seguindo estes procedimentos de teste experimental padrão são apresentados na tabela seguinte.

IC 50 (nM ou % da inibição a 1 micromolar) Exemplo_MMP 1_MMP 9_MMP 13_TACE 26 238,6 8,9 1,4 41,00%

Procedimentos para a medição da inibição de MMP-1, MMP-9, e MMP-13

Estes ensaios baseiam-se na clivagem de substratos tiopeptídeos tais como APro-Leu-Gly(2-mercapto-4-metil-pentanoil)-Leu-Gly-OEt pelas metaloproteinases de matriz MMP- 1, MMP-13 (colagenases) ou MMP-9 (gelatinase), que resulta na libertação de um produto do substrato que reage colorimetricamente com DTNB (5,5'-ditiobis(ácido 2-nitro-benzóico)) . A actividade da enzima é medida mediante a taxa do aumento da cor. O substrato tiopeptídeo é preparado de fresco na forma de um estoque 20 mM em 100% de 75 ΡΕ1025077 DMSO e o DTNB é dissolvido em 100% de DMSO na forma de um estoque 110 mM e conservado no escuro à temperatura ambiente. Tanto o substrato como o DTNB são diluídos em conjunto até 1 mM com o tampão de substrato (HEPES 50 mM pH 7,5; CaCl2 5 mM) antes de serem utilizados. O estoque de enzima é diluido com tampão do ensaio (HEPES 50 mM pH 7,5; CaCl2 5 mM; 0,02% de Brij) para resultar na concentração final desejada. O tampão do ensaio, a enzima, o veiculo ou inibidor e o DTNB/substrato são adicionados por esta ordem a uma placa de 96 poços (volume total da reacção de 200 μΐ) e o aumento na cor é monitorizado espectrofotometricamente durante 5 minutos a 405 nm num leitor de placas e o aumento na cor durante o tempo é calculado como uma linha linear.

Alternativamente, é utilizado um substrato do peptideo fluorescente. Neste ensaio, o substrato de peptí-deo contém um grupo fluorescente e um grupo de têmpera. Após a clivagem do substrato por uma MMP, a fluorescência que é gerada é quantificada no leitor de placas de fluorescência. O ensaio é corrido em tampão do ensaio HCBC (HEPES 50 mM, pH 7,0; Ca+2 5 mM; 0,02% de Brij; 0,5% de cisteina), com colagenase fibroblástica recombinante humana (truncada, pm=18 828; WAR, Radnor). O substrato é dissolvido em metanol e conservado congelado em aliquotas de 1 mM. Para o ensaio, o substrato e as enzimas são diluídas em tampão de HCBC para as concentrações desejadas. Os compostos são adicionados a uma placa de 96 poços contendo a enzima e a reacção é iniciada pela adição do substrato. A reacção é lida (excitação 340 nm, emissão 444 76 ΡΕ1025077 nm) durante 10 min e o aumento na fluorescência ao longo do tempo é calculado como uma linha linear.

Tanto para os ensaios do tiopeptídeo ou do peptí-deo fluorescente, o declive da linha é calculado e representa a taxa da reacção. A linearidade da taxa da reacção é confirmada (r2 > 0,85). A média (x ± sem) da taxa de controlo é calculada e comparada quanto a importância estatística (p < 0,05) com ratos tratados com fármacos utilizando o teste de comparações múltiplas de Dunnett. As relações dose-resposta podem ser criadas mediante a utilização de doses múltiplas do fármaco e os valores de IC50 com 95% Cl são calculados utilizando a regressão linear.

Inibição da MMP in vivo

Um bocado de um tubo de diálise com 2 cm (selectividade de pesos moleculares 12-14 000; 10 mm de largura plana) contendo a enzima metaloproteinase de matriz (estromelisina, colagenase ou gelatinase em 0,5 ml de tampão) é implantado tanto ip. como sc. (nas costas) de um rato (Sprague-Dawley, 150-200 g) ou ratinho (CD-I, 25-50 g) com anestesia. Os fármacos são administrados po, ip, sc ou iv através de uma cânula na veia jugular. Os fármacos são administrados num volume posológico de 0,1 a 0,25 ml/animal. O conteúdo do tubo de diálise é colhido e a actividade da enzima é ensaiada. 77 ΡΕ1025077 São calculadas as taxas da reacção enzimática de cada tubo de diálise. Os tubos de pelo menos 3 animais diferentes são utilizados para calcular a média ± sem. A importância estatística (p < 0,05) dos animais tratados com veiculo versus animais tratados com fármaco é determinada mediante a análise da variação. (Agents and Actions 21: 331, 1987) .

Procedimento para a medição da inibição da TACE

Utilizando placas de microtitulação negras de 96 poços, cada poço recebe uma solução composta por 10 μΐ de TACE (Immunex, concentração final 1 pg/ml), 70 μΐ de tampão Tris, pH 7,4 contendo 10% de glicerol (concentração final 10 mM) e 10 μΐ da solução do composto do teste em DMSO (concentração final 1 μΜ, concentração do DMSO < 1%) e incubada durante 10 minutos à temperatura ambiente. A reacção é iniciada mediante a adição de um substrato de peptidilo fluorescente (concentração final 100 μΜ) a cada poço, procedendo-se, de seguida, à agitação num agitador durante 5 seg. A reacção é lida (excitação 340 nm, emissão 420 nm) durante 10 min e o aumento na fluorescência ao longo do tempo é calculado como uma linha linear. O declive da linha é calculado e representa a taxa da reacção. A linearidade da taxa da reacção é confirmada (r2 > 0,85). A média (x ± dmp) da taxa de controlo é calculada 78 ΡΕ1025077 e comparada quanto a importância estatística (p < 0,05) com ratos tratados com fármacos utilizando o teste de comparações múltiplas de Dunnett. As relações dose-resposta podem ser criadas mediante a utilização de doses múltiplas do fármaco e os valores de IC50 com 95% Cl são calculados utilizando a regressão linear.

Os resultados dos ensaios farmacológicos da inibição anterior in-vitro e in-vivo da metaloproteinase de matriz e a inibição da TACE são fornecidos na Tabela 1 em baixo.

Tabela I. Inibição da MMP e da TACE

Exemplo MMP-11 MMP-91 m-vivo MMP-131 MMP2 TACE1 20 176 6,9 56 277 21 96 2.3 co 00 215 1. IC50 nM ou % de inibição numa concentração ΙμΜ 2. % de inibição vs. MMP-9 (dose, mg/kg), ip = intraperi toneal, po = oral

Lisboa, 19 de Abril de 2007

Claims (14)

1. ΡΕ1025077 1 REIVINDICAÇÕES 1. Um sal f armaceuticamente aceitável de um composto da fórmula:

   em que: R1 e R2 são, independentemente, seleccionados entre H; C1-C12 alquilo ou Ci-C6 alquilo perfluorado; X é seleccionado entre halogénio, -O-SO2-CH3, -0-SO2-CF3 ou uma fracção da estrutura:

   Z é -NO2, halogénio,-CH3 ou -CF3; A é seleccionado entre -O- ou -S-, -S0- ou -SO2-; m é um número inteiro de 0 a 3; R3, R4, R5, and R6 são, independentemente, seleccionados entre H, halogénio, -NO2, alquilo, alcoxi, C1-C6 alquilo perfluorado, OH ou os ésteres C1-C4 ou os seus éteres de alquilo, -ΟΝ,-Ο-R1, -O-Ar, -S-R1, -S-Ar, -SO-R1, -SO-Ar, -SO2-R1, -S02-Ar, -CO-R1, -CO-Ar,-CO2-R1, OU -C02-Ar; ΡΕ1025077 2 e Y é seleccionado entre: a) a fracção:

   R7 em que R7 e R8 são combinados por -(CH2)P- em que p é 6 de modo a formar um anel, sendo o anel formado de modo a ser opcionalmente substituído por um dos três substituintes seleccionados entre o grupo de Ci-C3 alquilo, trifluorometilo, halogénio, hidrogénio, fenilo, N02 e CN; ou b) um heterociclo saturado, insaturado ou parcialmente saturado de sete membros contendo até dois heteroátomos seleccionados entre o grupo que consiste em -0-, -NH-, -N(Ci-C4 alquilo)-, -N= e —S (0) n—, em que n é um número inteiro de 0 a 2, opcionalmente substituído por 1-3 substituintes independentemente seleccionados entre o grupo que consiste em hidrogénio, hidroxi, halo, C1-C4 alquilo, tri-halometilo, C1-C4 alcoxi, tri-halometoxi, C1-C4 aciloxi, C1-C4 alquiltio, C1-C4 alquilsulfinilo, C1-C4 alquil- sulfonilo, hidroxi(C1-C4)alquilo, fenilo opcionalmente substituído por 1-3 (C1-C4) alquilo, -C02H, -CN, -C0NHR1, -NH2, C1-C4 alquilamino, C1-C4 dialquilamino, NHSO2R1, -NHC0R1, -N02;
2. 2. Um composto da reivindicação 1 em que: ΡΕ1025077 3

   0) em que: R1 e R2 são, independentemente, seleccionados entre H; C1-C12 alquilo ou Ci-Cê alquilo perfluorado; X é halogénio, -0-S02-CH3, -0-S02-CF3 ou uma fracção da estrutura: i'»>i i i i

   Z é -NO2, halogénio,-CH3 ou -CF3; A é seleccionado entre -O- ou -S-, -S0- ou -S02-; m é um número inteiro de 0 a 3; e Y é seleccionado entre: um grupo seleccionado entre azepina, diazepina, oxazepina, tiazepina, oxapina e tiepina, sendo o grupo opcionalmente substituído por 1-3 substituintes independentemente seleccionados entre o grupo que consiste em hidrogénio, hidroxi, halo, C1-C4 alquilo, tri-halometilo, C1-C4 alcoxi, tri-halometoxi, C1-C4 aciloxi, C1-C4 alquiltio, C1-C4 alquil-sulfinilo, C1-C4 alquilsulfonilo, hidroxi(C1-C4)alquilo, fenil opcionalmente substituído por 1-3 (C1-C4) alquilo, 4 ΡΕ1025077 -C02H, -CN, -CONHR1, -NH2, C1-C4 alquilamino, C1-C4 dialquil-amino, -NHSO2R1, -NHCOR1, -N02.
3. 3. Um composto da reivindicação I da fórmula:

   em que: R1 e R2 são, independentemente, seleccionados entre H; Ci-C6 alquilo ou Ci-C6 alquilo perfluorado; R3, R4, R5 e R6 são, independentemente, seleccionados entre H, OH ou os ésteres C1-C4 ou os seus éteres de alquilo, halogénio, -CN, Ci-C6 alquilo ou trifluoro-metilo, m é um número inteiro de 0 a 3; R7 e R8 são combinados por -(CH2)P-, em que p é 6 de modo a formar um anel, sendo o anel formado de modo a ser opcionalmente substituído por até três substituintes seleccionados entre o grupo de hidrogénio, hidroxi, halogénio, C1-C3 alquilo, trifluorometilo, CN e N02; e X é halogénio, -0-S02-CH3, -0-S02-CF3 ou uma fracção da estrutura:

   ΡΕ1025077 5 Z é seleccionado entre -N02, halogénio,-CH3 ou -CF3.
4. 4. Um composto da reivindicação I da fórmula: em que:

   A é seleccionado entre -S-, -S0- ou -S02-; R1 e R2 são, independentemente, seleccionados entre H, C1-C6 alquilo ou Ci-C6 alquilo perfluorado; R3, R4, R5 e R6 são, independentemente, seleccionados entre H, OH ou os ésteres C1-C4 ou os seus éteres de alquilo, halogénio, -CN, Ci-C6 alquilo ou trifluoro-metilo, m é um número inteiro de 0 a 3; Y é -NR7R8 em que R7 e R8 são combinados por (CH2)p-, em que p é 6 de modo a formar um anel, sendo o anel formado de modo a ser opcionalmente substituído por até três substituintes seleccionados entre o grupo de hidrogénio, halogénio, C1-C3 alquilo, trifluorometilo, CN e N02; X é halogénio, -0-S02-CH3, -0-S02-CF3 ou uma fracção da estrutura:

   O ΡΕ1025077 6 Z é seleccionado entre -NO2, halogénio,-CH3 ou -cf3
5. 5. Um composto da reivindicação 1 que é clori-drato de (4-clorometil-fenoxi)-etil-hexametilenoimin-l-ilo.
6. 6. Um processo para a preparação de um sal farmaceuticamente aceitável de um composto da fórmula (I) conforme reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, que compreende um dos seguintes: a) a conversão de um álcool da fórmula

   em que m, A, Y e R1-6 são conforme definidos na reivindicação 1 para dar origem a um composto correspondente da fórmula (I) em que X é um grupo de saida por meios apropriados; e.g., utilizando um agente halogenante, sulfonilante ou acilante contendo o grupo de saída X; caso necessário, convertendo 0 composto da fórmula (I) formado num seu sal farmaceuticamente aceitável; ou b) a oxidação de um composto da fórmula (I) em que A é S para dar origem a um composto correspondente da 7 ΡΕ1025077 fórmula (I) em que A é SO ou -SO2-, caso necessário convertendo o composto da fórmula (I) formado num seu sal farma-ceuticamente aceitável ou c) a conversão de um composto da fórmula (I) num seu sal farmaceuticamente aceitável.
7. 7. Um processo para a preparação de um composto da reivindicação 1 em que A é O compreendendo os passos de: a) alquilação de um hidroxibenzaldeido da fórmula :

   em que R3-R6 são conforme definidos na reivindicação 1, com um haleto de alquilo da fórmula: R* R' ! 1 bato Y— <ÇX»—Ç“ tf k2 em que Y, R1 e R2 são conforme definidos na reivindicação 1, m é um número inteiro de 0 a 3 e halo é seleccionado entre Cl, F, Br ou I, para produzir um aldeído da fórmula:

   ΡΕ1025077 b) redução do produto aldeído do passo a) para dar origem a um álcool da fórmula:

   c) conversão do álcool do passo b) no seu sal de cloridrato; e d) conversão do álcool no composto do passo c) num grupo de saída.
8. 8. Um processo para a produção de compostos da reivindicação 1 em que A é S, compreendendo o processo os passos de: a) alquilação de um composto da seguinte fórmula: l3

   em que R3 6 são conforme definidos na reivindicação 1 com um agente alquilante da fórmula: ΡΕ1025077 9 Y"' R' i R2 em que Y, R1, R2 e m ; reivindicação 1, halo pode produzir um aldeído da fórmula R* R* Y- “ίοχ,τ —è—: ií R* I halo C I, R2

   cm b) redução do aldeído, tal como com boro-hidreto de sódio para um álcool da fórmula;

   c) tratamento do álcool do passo b) com HC1 gasoso para gerar o seu cloridrato; e
9. 9. O processo da reivindicação 8 compreende ainda o passo da oxidação controlada do enxofre no álcool de cloridrato do passo d) em sulfóxido ou em sulfona.
10. 10. Um processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9 em que o álcool é convertido num grupo de saída através do tratamento com cloreto de metano-sulfonilo, cloreto de tolueno-sulfonilo ou anidrido tri-fluoroacético na presença de uma base como a piridina ou trietilamina.

    10 ΡΕ1025077 d) conversão do produto do álcool de cloridrato do passo c) num grupo de saída.
11. 11. Um processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 10 em que halo é Cl, m é 1.
12. 12. Um processo para a produção dos compostos da fórmula:

    em que Y representa um anel heterocíclico com sete membros não saturado ou parcialmente saturado contendo um ou dois átomos de azoto, estando o anel heterocíclico ligado à 11 ΡΕ1025077 ponte de etoxi num átomo de azoto no anel e sendo, opcionalmente, substituído por 1 a 3 grupos seleccionados entre Ci-C6 alquilo, Ci-C6 alcoxi, Ci-C6 tioalquilo, -CF3 ou -N02; cuju processo compreende a reacção, num meio alcalino, do álcool 4-hidroxibenzílico com um sal de um composto da fórmula:

    em que Y é conforme definido anteriormente.
13. 13. 0 processo da reivindicação 12, em que o meio alcalino é mantido no pH 9 ou superior.
14. 14. Utilização de um composto conforme reivin dicado na reivindicação 5 num processo para a preparação de 1-[4-(2-azepan-l-il-etoxi)-benzil]-2-(4-hidroxi-fenil)-3-metil-lH-indol-5-ol, cloridrato que compreende a reacção de um composto conforme reivindicado na reivindicação 5 com 3-metil-2-(4-benziloxi)fenil-5-benziloxiindole na presença de uma base seguida pela desprotecção para dar origem ao produto desejado. Lisboa, 19 de Abril de 2007