PL224701B1 - Środki specyficznie wiążące ludzką angiopoetynę-2 - Google Patents

Środki specyficznie wiążące ludzką angiopoetynę-2

Info

Publication number
PL224701B1
PL224701B1 PL372671A PL37267102A PL224701B1 PL 224701 B1 PL224701 B1 PL 224701B1 PL 372671 A PL372671 A PL 372671A PL 37267102 A PL37267102 A PL 37267102A PL 224701 B1 PL224701 B1 PL 224701B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
polypeptide
seq
peptide
amino acid
ang
Prior art date
Application number
PL372671A
Other languages
English (en)
Other versions
PL372671A1 (pl
Inventor
Jonathan Daniel Oliner
Hosung Min
Original Assignee
Amgen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Amgen Inc filed Critical Amgen Inc
Publication of PL372671A1 publication Critical patent/PL372671A1/pl
Publication of PL224701B1 publication Critical patent/PL224701B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)

Description

Opis wynalazku
Dziedzina techniki
Obecny wynalazek dotyczy środków specyficznie wiążących, które rozpoznają oraz wiążą się z angiopoetyną-2 (Ang-2). W szczególności wynalazek dotyczy wytwarzania, zastosowania diagnostycznego i terapeutycznego środków specyficznie wiążących Ang-2 oraz ich fragmentów, które specyficznie wiążą Ang-2.
Tło wynalazku
Angiogeneza, tworzenie nowych naczyń krwionośnych z już istniejących, ma zasadnicze zn aczenie dla wielu procesów fizjologicznych oraz patologicznych. Normalnie, angiogeneza jest ściśle regulowana przez pro- oraz anty-angiogeniczne czynniki, lecz w przypadku chorób takich jak rak, choroby neo-unaczynienia gałki ocznej, zapalenia stawów oraz łuszczyca, proces ten może zachodzić opacznie. Folkman, J., Nat. Med., 1:27-31 (1995).
Istnieje szereg chorób, o których wiadomo, że są związane z rozregulowaną lub niepożądaną angiogenezą. Takie choroby obejmują - lecz nie wyłącznie: neo-unaczynianie gałki ocznej, takie jak retinopatie (w tym retinopatię cukrzycową), związaną z wiekiem degenerację plamki, łuszczycę, naczyniaka zarodowego, naczyniaka jamistego, stwardnienie tętnic, zapalenia, takie jak zapalenia reumatoidalne lub reumatyczne, w szczególności zapalenie stawów (w tym reumatoidalne zapalenie st awów) lub inne chroniczne stany zapalne, takie jak chroniczna astma, tętnicowa lub posttransplantacyjna miażdżyca naczyń, gruczolistość oraz choroby nowotworowe, przykładowo tak zwane lite guzy oraz ciekłe (lub hematopoetyczne) nowotwory (takie jak białaczki oraz chłoniaki). Inne choroby związane z niepożądaną angiogenezą będą oczywiste dla biegłych w sztuce.
Jakkolwiek wiele układów transdukcji sygnałów bierze udział w regulowaniu angiogenezy, jeden z najlepiej zbadanych systemów i najbardziej selektywnych względem komórek błony wewnętrznej naczyń angażuje receptor-Tie-2 kinazy tyrozynowej (określany jako „Tie-2” lub „Tie-2R” (określany także jako „ORK”); mysi Tie-2 znany jest również jako „tek”) oraz jego ligandy - angiopoetyny (Gale, N. W. i Yancopoulos, G. D., Genes Dev. 13:1055-1066 [1999]). Znane są 4 angiopoetyny; od angiopoetyny-1 („Ang-1”) do angiopoetyny-4 („Ang-4”). Angiopoetyny te określane są również jako „ligandy Tie-2”. (Davis, S., i wsp., Cell, 87:1161-1169 [1996]; Grosios, K., i wsp., Cytogenet Cell Genet, 84:118-120 [1999]; Holash, J., i wsp., /nvestigative Ophthalmology & Visual Science, 42:1617-1625 [1999]; Koblizek, T. I., i wsp., Current Biology, 8:529-532 [1998]; Lin, P., i wsp., Proc Natl Acad Sci USA, 95:8829-8834 [1998]; Maisonpierre, P. C., i wsp., Science, 277:55-60 [1997]; Papapetropoulos, A., i wsp., Lab Invest, 79:213-223 [1999]; Sato, T. N., i wsp., Nature, 375:70-74 [1998]; Shyu, K. G., i wsp., Circulation, 98:2081-2087 [1998]; Suri, C., i wsp., Cell, 87:1171-1180 [1996]; Suri, C., i wsp., Science, 282:468-471 [1998]; Valenzuela, D. M., i wsp., Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 96:1904-1909 [1999]; Witzenbichler, B., i wsp., J Biol Chem, 273:18514-18521 [1998]). Podczas gdy Ang-1 wiążąc się z Tie-2 stymuluje fosforylację receptora w hodowli komórek błony wewnętrznej naczyń, to zaobserwowano, że Ang-2 zarówno agonizuje, jak i antagonizuje fosforylację receptora Tie-2 (Davis, S., i wsp., [1996], jak wyżej; Maisonpierre, P.C., i wsp., [1997], jak wyżej; Kim, I., J.H. Kim, i wsp., Oncogene 19(39): 4549-4552 (2000); Teichert-Kuliszewska, K., P.C. Maisonpierre, i wsp., Cardiovascular Research 49(3): 659-70 (2001)).
Fenotypy nokautu mysiego Tie-2 oraz Ang-1 są podobne, co sugeruje, że stymulowana przez Ang-1 fosforylacja Tie-2 mediuje remodelowanie oraz stabilizację powstających naczyń in utero poprzez utrzymywanie adhezji komórek wewnętrznej błony naczyń i komórek podtrzymujących (Dumont,
D. J., i wsp., Genes & Development, 8:1897-1909 [1994]; Sato, T. N., i wsp., Nature, 376:70-74 [1995]; Suri, C., i wsp., [1996], jak wyżej). Uważa się, że rola Ang-1 w stabilizowaniu naczyń jest zachowana u dorosłych, gdzie szeroko i konstytutywnie podlega ona ekspresji (Hanahan, D., Science, 277:48-50 [1997]; Zagzag, D., i wsp., Experimental Neurology, 159:391-400 [1999]). W przeciwieństwie do tego, ekspresja Ang-2 jest przede wszystkim ograniczona do miejsc re-modelowania naczyń, gdzie - jak się uważa, blokuje funkcję Ang-1, a tym samym indukuje stan naczyniowej plastyczności prowadzącej do angiogenezy (Hanahan, D., [1997], jak wyżej; Holash, J., i wsp., Science, 284:19941998 [1999]; Maisonpierre, P. C., i wsp., [1997], jak wyżej).
Wiele opublikowanych badań wykazało rzekomo naczyniowo-selektywną ekspresję Ang-2 w stanach chorobowych związanych z angiogenezą. Te patologiczne stany obejmują, przykładowo, łuszczycę, degenerację plamki oraz raka (Bunone, G., i wsp., American Journal of Pathology, 155:1967-1976 [1999]; Etoh, T., i wsp., Cancer Research, 61:2145-2153 [2001]; Hangai, M., i wsp.,
PL 224 701 B1 \nvestigative Ophthalmology & Visual Science, 42:1617-1625 [2001]; Holash, J., i wsp., [1999] jak wyżej; Kuroda, K., i wsp., Journal of Investigative Dermatology, 116:713-720 [2001]; Otani, A., i wsp., Investigative Ophthalmology & Visual Science, 40:1912-1920 [1999]; Stratmann, A., i wsp., American Journal of Pathology, 153:1459-1466 [1998]; Tanaka, S., i wsp., J Clin Invest, 103:34-345 [1999]; Yoshida, Y., i wsp., International Journal of Oncology, 15:1221-1225 [1999]; Yuan, K., i wsp., Journal of Periodontal Research, 35/165-171 [2000]; Zagzag, D., i wsp., [1999] jak wyżej). Większość tych badań ogniskowało się na raku wykazując, że wiele rodzajów nowotworów zdaje się pobudzać naczyniową ekspresję Ang-2. W przeciwieństwie do tej ekspresji w patologicznej angiogenezie, ekspresja Ang-2 w normalnych zdrowych tkankach jest niezwykle ograniczona (Maisonpierre, P. C., i wsp., [1997], jak wyżej; Mezquita, J., i wsp., Biochemical oraz Biophysical Research Communications, 260:492-498 [1999]). U zdrowego dorosłego, trzema głównymi miejscami angiogenezy są: jajnik, łożysko oraz macica; są to główne tkanki wśród zdrowych (to znaczy, nie-zrakowaciałych) tkanek, w których wykryto Ang-2 mRNA.
Pewne badania funkcyjne sugerują, że Ang-2 może być zaangażowana w nowotworową angiogenezę. Ahmad i wsp., (Cancer Res., 61:1255-1259 [2001]) opisują nad-ekspresję Ang-2 i wykazują, że jest ona rzekomo związana ze zwiększeniem wzrostu nowotworu w mysim modelu ksenograftowym. Patrz również Etoh i wsp., jak wyżej, oraz Tanaka i wsp., jak wyżej, gdzie zaprezentowano dane ściśle wiążące nad-ekspresję Ang-2 z nowotworowym hiperunaczynieniem. Jednakże, w przeciwieństwie do tego, Yu i wsp., (Am. J. Path., 158:563-570 [2001]) przedstawiają dane pokazujące, że nadekspresja Ang-2 w komórkach raka płuc Lewis'a oraz w komórkach raka piersi TA3 rzekomo wydłużyła czas życia myszy, którym podano w iniekcji odpowiednie transfektanty.
W ostatnich kilku latach, różne publikacje sugerowały, że Ang-1, Ang-2 i/lub Tie-2 stanowią możliwy cel terapii antyrakowej. Przykładowo, każdy z patentów nr US 6,166,185; US 5,650,490 oraz US 5,814,464 ujawnia koncepcję przeciwciał przeciw-ligandom Tie-2 oraz ciał receptorowych. Lin i wsp., (Proc. Natl. Acad. Sci USA, 95:8829-8834 [1998]) wstrzykiwali myszom adenowirus ekspresjonujący rozpuszczalny Tie-2; rozpuszczalny Tie-2 rzekomo zmniejszył ilość i rozmiar nowotworów rozwijających się u tych myszy. W związanym z tym badaniu, Lin i wsp., (J. Clin. Invest., 100:2072-2078 [1997]) wstrzykiwali szczurom rozpuszczalną postać Tie-2; związek ten rzekomo redukował rozmiary nowotworów u szczurów. Siemeister i wsp., (Cancer Res., 59:3185-3189 [1999]) wygenerowali ludzkie linie komórkowe czerniaka, ekspresjonujące zewnątrzkomórkową domenę Tie-2, wstrzykiwali te linie komórkowe bezwłosym myszom i stwierdzili, że rozpuszczalny Tie-2 rzekomo spowodował „znaczące inhibitowanie” wzrostu nowotworu oraz nowotworowej angiogenezy. W świetle tej informacji, zakładając, że zarówno Ang-1, jak i Ang-2 wiążą się z Tie-2, nie jest jasne na podstawie tych badań, czy Ang-1, Ang-2 lub Tie-2 mogłyby być atrakcyjnym celem terapii antyrakowej.
Fuzję pewnych peptydów ze stałą proteiną osocza, taką jak stały obszar Ig, polepszającą czas pół-trwania tych cząsteczek opisano, przykładowo w: publikacji PCT WO 00/24782, opublikowanej 4.05.2000 r.
Fuzję proteiny lub jej fragmentu ze stałą proteiną osocza, taką jak stały obszar Ig, w celu pole pszenia okresu pół-trwania tych cząsteczek różnie opisywano (patrz, przykładowo, patent nr US 5,480,981; Zheng i wsp., J. Immunol., 154:5590-5600, (1995); Fisher i wsp., N. Engl. J. Med., 334:1697-1702, (1996); Van Zee, K. i wsp., J. Immunol., 156:2221-2230, (1996); patent nr US 5,808,029, wydany 15.09.1998 r.; Capon i wsp., Nature, 337:525-531, (1989); Harvill i wsp., Immunotech., 1:95-105, (1995); broszura WO 97/23614, opublikowana 3.07.1997 r.; zgłoszenie PCT/US 97/23183 z dnia 11.12.1997 r.; Linsley, J. Exp. Med., 174:561-569, (1991); broszura WO 95/21258 opublikowana 10.08.1995 r.).
Skuteczna terapia anty-Ang-2 mogłaby przynieść korzyść olbrzymiej populacji pacjentów chorych na raka, ponieważ większość litych (stałych) nowotworów wymaga neo-unaczynienia, aby mogły rozrosnąć się do wymiarów przekraczających 1 do 2 milimetrów średnicy. Taka terapia mogłaby ró wnież mieć szersze zastosowanie w innych chorobach związanych z angiogenezą, takich jak retinopatia, zapalenie stawów oraz łuszczyca.
Istnieje niezaspokojone zapotrzebowanie na zidentyfikowanie nowych środków, które specyficznie rozpoznają i wiążą Ang-2. Takie środki powinny być użyteczne w diagnostycznym skriningu oraz w interwencji terapeutycznej w stanach chorobowych, związanych z aktywnością Ang-2.
Jest zatem celem obecnego wynalazku zapewnienie środków specyficznie wiążących Ang-2, które modulują aktywność Ang-2. Takie środki według obecnego wynalazku przyjmują postać ciał
PL 224 701 B1 peptydowych, to znaczy peptydów połączonych fuzyjnie z innymi cząsteczkami takimi jak domena Fc przeciwciała, gdzie reszta peptydowa wiąże się specyficznie z Ang-2.
Istota wynalazku
Obecny wynalazek obejmuje polipeptyd, który zawiera sekwencję aminokwasową wybraną z grupy, którą stanowią sekwencje SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oraz SEQ ID NO: 76 do SEQ ID NO: 118 włącznie, który to polipeptyd jest zdolny do wiązania z Ang-2, oraz jego fizjologicznie akceptowalne sole.
Polipeptyd fuzyjny według wynalazku zawiera powyższy polipeptyd oraz podłoże. Ten polipe ptyd fuzyjny oraz jego fizjologicznie akceptowalne sole są zdolne do wiązania z Ang-2. Korzystnie, wskazane podłoże jest wybrane z grupy, którą tworzą: domena Fc, glikol polietylenowy, lipid, grupa cholesterolowa, węglowodan oraz oligosacharyd.
Polipeptyd według według wynalazku może być polipeptydem cyklicznym.
Polipeptyd według wynalazku może być także dimerem lub multimerem tego polipeptydu.
Obecny wynalazek obejmuje także związek o wzorze:
(X1)a-F1-(X2)b oraz jego multimery, gdzie:
F1 oznacza podłoże, które to podłoże jest domeną Fc, glikolem polietylenowym, lipidem, grupą cholesterolową, węglowodanem lub oligosacharydem;
2
X oraz X - każdy niezależnie, jest wybrany z grupy obejmującej
-L1)c-P1;
-(L1)c-P1-(L2)d-P2;
-(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3; oraz
-(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)fP4;
gdzie jeden lub więcej niż jeden spośród P1, P2, P3 oraz P4 - każdy niezależnie, zawiera polipeptyd wybrany z grupy obejmującej sekwencje SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oraz SEQ ID NO: 76 do SEQ ID NO: 118 włącznie,
L1, L2, L3 oraz L4 - każdy niezależnie, jest linkerem; oraz a, b, c, d, e oraz f - każdy niezależnie, oznacza 0 lub 1, z takim zastrzeżeniem, że co najmniej jeden spośród a oraz b oznacza 1;
oraz jego fizjologicznie akceptowalne sole.
Korzystnym związkiem o wyżej określonej budowie jest związek o wzorze:
X1-F1 lub F1-X2 oraz jego fizjologicznie dopuszczalne sole.
Innym korzystnym związkiem o wyżej określonej budowie jest związek o wzorze:
F1-(L1)C-P1 oraz jego fizjologicznie akceptowalne sole.
Korzystnym związkiem o wyżej określonej budowie jest także związek o wzorze:
F1-(L1)c-P1-(L2)d-P2 oraz jego fizjologicznie akceptowalne sole.
Kolejnym korzystnym związkiem o wyżej określonej budowie jest związek o wzorze:
P1-(L1)c-F1-(L2)d-P2 oraz jej fizjologicznie akceptowalne sole.
1
Korzystnie, w związku o wyżej określonej budowie F1 oznacza domenę Fc lub jej fragment.
1
Korzystnie, w związku o wyżej określonej budowie F1 zawiera sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 60.
Wynalazek obejmuje także polinukleotyd, który koduje polipeptyd według wynalazku, a także wektor ekspresji zawierający ten polinukleotyd, jak również komórkę gospodarza, która zawiera wskazany wektor ekspresji.
Zgodnie z wynalazkiem komórka gospodarza jest komórką prokariotyczną lub komórką eukariotyczną.
PL 224 701 B1
Korzystnie, komórką gospodarza według wynalazku jest komórka prokariotyczna, korzystnie komórka E. coli.
Polipeptyd według wynalazku jest korzystnie wybrany z grupy, którą tworzą sekwencje: SEQ ID NO: 2 oraz SEQ ID NO: 4.
Obecny wynalazek odnosi się także do kompozycji farmaceutycznej, która zawiera skuteczną ilość polipeptydu według wynalazku w mieszaninie z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.
Powyższy polipeptyd fuzyjny albo związek według wynalazku może być stosowany w sposobie leczenia angiogenezy u pacjenta, korzystnie jest stosowany w sposobie inhibitowania niepożądanej angiogenezy albo w sposobie modulowania angiogenezy u ssaka.
Powyższy polipeptyd fuzyjny albo związek według wynalazku może być stosowany także w sposobie inhibitowania wzrostu guza nowotworowego, przejawiającego niepożądaną angiogenezę, u ssaka.
Wynalazek dotyczy również kompozycji, która zawiera powyższy polipeptyd fuzyjny albo związek według wynalazku oraz środek chemoterapeutyczny, do stosowania w sposobie leczenia raka u ssaka. Korzystnie, wskazany środek chemoterapeutyczny jest wybrany z grupy, którą tworzą: fluorouracyl, kamptotecyna oraz docetaksel w postaci trójwodzianu.
Powyższy polipeptyd fuzyjny albo związek według wynalazku może być stosowany także w sposobie modulowania co najmniej jednego spośród następujących stanów: nieszczelności naczyniowej lub wycieku osocza, u ssaka.
Powyższy polipeptyd fuzyjny albo związek według wynalazku może być stosowany również w sposobie leczenia co najmniej jednego spośród następujących stanów: choroby neo-unaczynienia gałki ocznej, otyłości, naczyniaka niedojrzałego, naczyniaka jamistego, stwardnienia tętnic, zapalenia, stanów zapalnych, miażdżycy naczyń, endometriozy (gruczolistości), choroby nowotworowej, chorób kości lub łuszczycy, u ssaka.
Zgodnie z wynalazkiem korzystny jest polipeptyd zdolny do wiązania z Ang-2, który zawiera sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO: 25), oraz jego fizjologicznie akceptowalne sole. Korzystnie, sekwencja aminokwasowa domeny Fc w sekwencji SEQ ID NO: 25 jest sekwencją SEQ ID NO: 60.
Wynalazek obejmuje także polinukleotyd, który koduje polipeptyd według wynalazku, zawierający sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO: 25), w której korzystnie sekwencja aminokwasowa dom eny Fc w sekwencji SEQ ID NO: 25 jest sekwencją SEQ ID NO: 60. Korzystnie, polinukleotyd ten zawiera sekwencję SEQ ID NO: 46. Zgodnie z wynalazkiem, wektor ekspresji zawiera taki polinukleotyd. Korzystnie, także komórka gospodarza według wynalazku zawiera ten wektor ekspresji. Korzystną komórką gospodarza jest przy tym komórka E. coli.
Korzystną kompozycją farmaceutyczną jest kompozycja, która zawiera polipeptyd według wynalazku zawierający sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO: 25), w której korzystnie sekwencja aminokwasowa domeny Fc w sekwencji SEQ ID NO: 25 jest sekwencją SEQ ID NO: 60, w mieszaninie z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.
Powyższy polipeptyd według wynalazku, zawierający sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO: 25), w której korzystnie sekwencja aminokwasowa domeny Fc w sekwencji SEQ ID NO: 25 jest sekwencją SEQ ID NO: 60, może być stosowany w sposobie inhibitowania angiogenezy, u ssaka.
Powyższy polipeptyd według wynalazku, zawierający sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO: 25), w której korzystnie sekwencja aminokwasowa domeny Fc w sekwencji SEQ ID NO: 25 jest sekwencją SEQ ID NO: 60, może być stosowany w sposobie leczenia angiogenezy, u pacjenta albo w sposobie modulowania angiogenezy, u ssaka.
Powyższy polipeptyd według wynalazku, zawierający sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO: 25), w której korzystnie sekwencja aminokwasowa domeny Fc w sekwencji SEQ ID NO: 25 jest sekwencją SEQ ID NO: 60, może być stosowany także w sposobie inhibitowania wzrostu guza nowotworowego, przejawiającego niepożądaną angiogenezę, u ssaka.
Wynalazek dotyczy również kompozycji, która zawiera polipeptyd według wynalazku, zawierający sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO: 25), w której korzystnie sekwencja aminokwasowa dom eny Fc w sekwencji SEQ ID NO: 25 jest sekwencją SEQ ID NO: 60 oraz środek chemoterapeutyczny, do stosowania w sposobie leczenia raka u ssaka. Korzystnie, wskazany środek chemoterapeutyczny jest wybrany z grupy, którą tworzą: fluorouracyl oraz docetaksel w postaci trójwodzianu.
Powyższy polipeptyd według wynalazku, zawierający sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO: 25), w której korzystnie sekwencja aminokwasowa domeny Fc w sekwencji SEQ ID NO: 25 jest sekwencją
PL 224 701 B1
SEQ ID NO: 60, może być również stosowany w sposobie modulowania co najmniej jednego spośród następujących stanów: nieszczelności naczyniowej lub wycieku osocza, u ssaka.
Powyższy polipeptyd według wynalazku, zawierający sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO: 25), w której korzystnie sekwencja aminokwasowa domeny Fc w sekwencji SEQ ID NO: 25 jest sekwencją SEQ ID NO: 60, może być także stosowany w sposobie leczenia co najmniej jednego spośród następujących stanów: choroby neo-unaczynienia gałki ocznej, otyłości, naczyniaka niedojrzałego, naczyniaka jamistego, stwardnienia tętnic, zapalenia, stanów zapalnych, miażdżycy naczyń, endometriozy (gruczolistości), choroby nowotworowej, chorób kości lub łuszczycy, u ssaka.
Jak wskazano, obecny wynalazek, w jednym z przykładów realizacji odnosi się do peptydów (określanych również tutaj jako polipeptydy), które wiążą się z Ang-2. Wynalazkiem objęte są również odmiany i pochodne takich peptydów.
Zgodnie z wynalazkiem te peptydy oraz ich odmiany i pochodne są połączone z podłożami.
W innym wykonaniu, peptydy te mogą być przyłączone do domen Fc, tworząc tym samym ciała peptydowe. Ciała peptydowe obejmują co najmniej jeden peptyd według wynalazku, jak również ich odmiany i pochodne. Ujawniono także szereg analogicznych ciał peptydowych nieobjętych obecnym wynalazkiem, które obejmują co najmniej jeden peptyd, przykładowo, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 lub SEQ ID NO: 119 - SEQ ID NO: 157, jak również ich odmiany i pochodne, a także peptydy według wzorów podanych dla SEQ ID NO: 65 - SEQ ID NO: 75 oraz SEQ ID NO: 158.
W jeszcze innym wykonaniu, wynalazek zapewnia cząsteczki kwasu nukleinowego kodującego specyficzne środki wiążące oraz ich odmiany i pochodne.
W innym wykonaniu, wynalazek zapewnia cząsteczki kwasu nukleinowego kodującego ciała peptydowe, jak również ich odmiany i pochodne. Jak wspomniano, cząsteczki kwasu nukleinowego obejmują SEQ ID NO: 46. Ujawniono także inne cząsteczki kwasu nukleinowego, które obejmują SEQ ID NO: 33 - SEQ ID NO: 45 oraz SEQ ID NO: 47 do SEQ ID NO: 53.
W kolejnym innym wykonaniu, wynalazek zapewnia zastosowanie peptydów i ciał peptydowych według wynalazku jako środków terapeutycznie czynnych, do stosowania w sposobie zmniejszania nowotworu przez podawanie pacjentom potrzebującym skutecznej ilości środków specyficznie wiążących Ang-2 według obecnego wynalazku. Wynalazek zapewnia również zastosowanie środków terapeutycznie czynnych według wynalazku do wytwarzania środków leczniczych do inhibitowania angiogenezy u pacjenta, umożliwiających podawanie pacjentowi potrzebującemu tego, skutecznej ilości środków specyficznie wiążących Ang-2 według obecnego wynalazku, a także środków leczniczych do leczenia nowotworu u pacjenta, opartego na podawaniu pacjentowi potrzebującemu tego skutecznej ilości środków specyficznie wiążących Ang-2 według obecnego wynalazku.
Ujawniono także polipeptyd zdolny do wiązania Ang-2, który obejmuje sekwencję aminokwasową WDPWT (SEQ ID NO: 65), i który liczy od 5 do 50 aminokwasów długości, jak również jego fizjologicznie dopuszczalne sole. Polipeptyd może również obejmować sekwencję aminokwasową:
WDPWTC (SEQ ID NO: 66) oraz jej fizjologicznie dopuszczalne sole. Ponadto, polipeptyd może obejmować sekwencję aminokwasową:
Cz2WDPWT (SEQ ID NO: 67) gdzie z2 oznacza kwasową lub obojętną polarną resztę aminokwasową oraz jej fizjologicznie dopuszczalne sole. Polipeptyd może dalej obejmować sekwencję aminokwasową:
Cz2WDPWTC (SEQ ID NO: 68) 2 gdzie z2 oznacza kwasową lub obojętną, polarną resztę aminokwasową oraz jej fizjologicznie dopuszczalne sole.
Ujawniono także polipeptyd zdolny do wiązania Ang-2, zawierający sekwencję aminokwasową o wzorze:
a1a2a3Ca5WDPWTCa12a13a14 (SEQ ID NO: 69)
PL 224 701 B1 gdzie:
3
- każdy sposrod a , a , oraz a oznacza niezależnie reszty aminokwasowe;
- a oznacza resztę aminokwasową;
- a nie występuje lub oznacza resztę aminokwasową;
- a nie występuje lub oznacza obojętną (resztę) hydrofobową, obojętną polarną lub zasadową resztę aminokwasową;
- a oznacza obojętną (resztę) hydrofobową lub obojętną polarną resztę aminokwasową; oraz jego fizjologicznie dopuszczalne sole, przy czym korzystnie:
- a1 oznacza V, I, P, W, G, S, Q, N, E, K, R lub H;
- a2 oznacza V, P, M, G, S, Q, D, E, K, R lub H;
- a3 oznacza A, V, P, M, F, T, G, D, E, K lub H;
- a8 oznacza A, V, G, Q, N, D lub E;
- a12 oznacza S, Q, N, D, E, K lub R;
- a oznacza L, T lub H; a
- a14 oznacza V, L, I, W lub M.
Bardziej korzystnie a1 oznacza Q; a2 oznacza E; a3 oznacza E; a5 oznacza D lub E; a12 oznacza D
14 lub E; a oznacza H; zaś a oznacza M.
Małe litery z numerem u góry (jak a oraz b) służą identyfikowaniu pozycji aminokwasowych, a nie oznaczają jednoliterowych skrótów nazwy danego aminokwasu. W niniejszej dokumentacji jednoliterowe skróty nazw aminokwasów oznaczane są wyłącznie wielkimi literami.
Ujawniono także polipeptyd zdolny do wiązania Ang-2, obejmujący sekwencję aminokwasową o wzorze:
b1b2b3b4b5b6Cb8WDPWTCb15b16b17b18b19b20 (SEQ ID NO: 70) gdzie:
1
- b nie występuje lub oznacza resztę aminokwasową;
2
- b nie występuje lub oznacza obojętną (resztę) hydrofobową, obojętną polarną lub zasadową resztę aminokwasową;
- b3, b4, b5, oraz b6 każdy niezależnie nie występuje lub oznacza resztę aminokwasową;
- b8 oznacza resztę aminokwasową;
- b nie występuje lub oznacza resztę aminokwasową;
- b16 nie występuje lub oznacza obojętną (resztę) hydrofobową, obojętną polarną lub zasadową resztę aminokwasową;
- b nie występuje lub oznacza obojętną hydrofobową, bądź obojętną polarną resztę aminokwasową;
1Q 2D
- każdy z b , b , oraz b niezależnie nie występuje lub oznacza resztę aminokwasową; oraz do jego fizjologicznie dopuszczalne sole, przy czym korzystnie:
- b1 nie występuje lub oznacza A, V, L, P, W, F, T, G, S, Q, N, K, R lub H;
- b2 nie występuje lub oznacza A, V, L, I, P, W, M, T, G, S, Y, N, K, R lub H;
- b3 nie występuje lub oznacza A, L, I, P, W, M, T, G, S, Q, N, E, R lub H;
- b4 oznacza V, I, P, W, G, S, Q, N, E, K, R lub H;
- b5 oznacza V, P, M, G, S, Q, D, E, K, R lub H;
- b6 oznacza A, V, P, M, F, T, G, D, E, K lub H;
- b8 oznacza A, V, G, Q, N, D lub E;
- b15 oznacza S, Q, N, D, E, K lub R;
- b16 oznacza L, T lub H;
- b17 oznacza V, L, I, W lub M;
- b18 nie występuje lub oznacza A, V, L, P, W, F, T, G, Y, Q, D, E lub R;
- b19 nie występuje lub oznacza V, L, I, P, T, G, S, Y, Q, N, D, E lub R; zaś
- b20 nie występuje lub oznacza V, L, P, W, M, T, G, S, Y, Q, N, D, K lub R.
Bardziej korzystnie b1 nie występuje lub oznacza P lub T; b2 nie występuje lub oznacza I lub N; b3 nie występuje lub oznacza R lub I; b4 oznacza Q; b5 oznacza E; b6 oznacza E; b8 oznacza D lub E;
16 17 18 19 b oznacza D lub E; b oznacza H; b oznacza M; b nie występuje lub oznacza W lub P; b nie występuje lub oznacza G lub E; oraz b nie występuje lub oznacza V lub K.
PL 224 701 B1
Jak wspomniano, wynalazek dotyczy polipeptydu obejmującego co najmniej jedną sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej SEQ ID NO: 4 oraz od SEQ ID NO: 76 do SEQ ID NO: 118 włącznie, gdzie polipeptyd jest zdolny do wiązania z Ang-2, jak również jego fizjologicznie dopuszczalnych soli. Sekwencje peptydowe są podane poniżej:
T a b l i c a 1
Peptyd SEQ ID NO. Sekwencja peptydowa
Con4-44 76 PIRQEECDWDPWTCEHMWEV
Con4-40 77 TNIQEECEWDPWTCDHMPGK
Con4-4 78 WYEQD ACEWDPWTCEHMAEV
Con4-31 79 NRLQEVCEWDPWTCEHMENV
Con4-C5 80 AATQEECEWDPWTCEHMPRS
Con4-42 81 LRHQEGCEWDPWTCEHMFDW
Con4-35 82 VPRQKDCEWDPWTCEHMYVG
Con4-43 83 SISHEECEWDPWTCEHMQVG
Con4-49 84 WAAQEECEWDPWTCEHMGRM
Con4-27 85 TWPQDKCEWDPWTCEHMGST
Con4-48 86 GHSQEECGWDPWTCEHMGTS
Con4-46 87 QHWQEECEWDPWTCDHMPSK
Con4-41 88 NVRQEKCEWDPWTCEHMPVR
Con4-36 89 KSGQVECNWDPWTCEHMPRN
Con4-34 90 VKTQEHCDWDPWTCEHMREW
Con4-28 91 AWGQEGCDWDPWTCEHMLPM
Con4-39 92 PVNQEDCEWDPWTCEHMPPM
Con4-25 93 RAPQEDCEWDPWTCAHMDIK
Con4-50 94 HGQNMECEWDPWTCEHMFRY
Con4-38 95 PRLQEECVWDPWTCEHMPLR
Con4-29 96 RTTQEKCEWDPWTCEHMESQ
Con4-47 97 QTSQEDCVWDPWTCDHMVSS
Con4-20 98 QVIGRPCEWDPWTCEHLEGL
Con4-45 99 WAQQEECAWDPWTCDHMVGL
Con4-37 100 LPGQEDCEWDPWTCEHMVRS
Con4-33 101 PMNQVECDWDPWTCEHMPRS
AC2-Con4 102 FGWSHGCEWDPWTCEHMGST
Con4-32 103 KSTQDDCDWDPWTCEHMVGP
Con4-17 104 GPRISTCQWDPWTCEHMDQL
Con4-8 105 STIGDMCEWDPWTCAHMQVD
AC4-Con4 106 VLGGQGCEWDPWTCRLLQGW
Con4-1 107 VLGGQGCQWDPWTCSHLEDG
Con4-C1 108 TTIGSMCEWDPWTCAHMQGG
PL 224 701 B1
Con4-21 109 TKGKSVCQWDPWTCSHMQSG
Con4-C2 110 TTIGSMCQWDPWTCAHMQGG
Con4-18 111 WVNEVVCEWDPWTCNHWDTP
Con4-19 112 VVQVGMCQWDPWTCKHMRLQ
Con4-16 113 AVGSQTCEWDPWTCAHLVEV
Con4-11 114 QGMKMFCEWDPWTCAHIVYR
Con4-C4 115 TTIGSMCQWDPWTCEHMQGG
Con4-23 116 TSQRVGCEWDPWTCQHLTYT
Con4-15 117 QWSWPPCEWDPWTCQTVWPS
Con4-9 118 GTSPSFCQWDPWTCSHMVQG
TN8-Con4* 4 QEECEWDPWTCEHM
*) Wiadomo, że pewne peptydy i/lub ciała peptydowe mogą zawierać prefix „TN”, „TN8” lub „TN12” oraz to, że prefix ten może ewentualnie występować w przypadku danego ciała peptydowego. A więc, przykładowo, określenia „TN8-Con4” oraz „Con4” są tutaj stosowane wymiennie.
W innym wykonaniu, wynalazek odnosi się do związku o wzorze:
(X1)a-F1-(X2)b oraz jego multimerów, gdzie:
1
F1 oznacza podłoże, które to podłoże jest domeną Fc, glikolem polietylenowym, lipidem, grupą cholesterolową, węglowodanem lub oligosacharydem;
każdy spośród X oraz X jest niezależnie wybrany z grupy obejmującej
- (L1)c-P1;
- (L1)c-P1-(L2)d-P2;
- (L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3; oraz
- (L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)fP4;
gdzie jeden lub więcej niż jeden spośród P1, P2, P3 oraz P4 każdy niezależnie zawiera polipeptyd tu opisany. Przykładowo, w korzystnym wykonaniu, każdy spośród P1, P2, P3 oraz P4 może niezależnie zawierać polipeptyd o sekwencjach od SEQ ID NO: 76 do SEQ ID NO: 118. Ujawnione tu ró wnież kombinacje peptydów SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 do SEQ ID NO: 6 oraz SEQ ID NO: 119 do SEQ ID NO: 157 nie są objęte obecnym wynalazkiem.
W innym wykonaniu, wynalazek obejmuje związek, który ma wzór:
X1-F1 lub F1-X2
1 2 oraz jego fizjologicznie dopuszczalne sole, gdzie X , F , oraz X są takie jak tutaj zdefiniowano. W innym wykonaniu, związek ma wzór:
F1-(L1)c-P1
1 1 oraz jego fizjologicznie dopuszczalne sole, gdzie L , F , oraz P są takie jak tutaj zdefiniowano. W jeszcze innym wykonaniu, związek ma wzór:
F1-(L1)c-P1-(L2)d-P2
1 12 oraz jego fizjologicznie dopuszczalne sole, gdzie L , F , P ,P oraz c oraz d są takie jak tutaj zdefiniowano. W kolejnym innym wykonaniu związek ma wzór:
P1-(L1)c-F1-(L2)d-P2 1 oraz jego fizjologicznie dopuszczalne sole. W korzystnym wykonaniu, F oznacza domenę Fc lub jej fragment.
Ujawniono także nieobjęty wynalazkiem polipeptyd zdolny do wiązania Ang-2, zawierający sekwencję aminokwasową o wzorze:
PL 224 701 B1
Pc2Dc4Lc6c7C8LY (SEQ ID NO: 71) gdzie:
c2 oznacza obojętną hydrofobową resztę aminokwasową c4 oznacza A, D lub E c6 oznacza kwasową resztę aminokwasową c7 oznacza resztę aminokwasową; oraz c8 oznacza obojętną hydrofobową, obojętną polarną lub zasadową resztę aminokwasową; oraz jego fizjologicznie dopuszczalne sole, przy czym korzystnie c oznacza L lub M, a w innym korzystnym wykonaniu, c6 oznacza D lub E.
Ujawniono także nieobjęty wynalazkiem polipeptyd zdolny do wiązania Ang-2, obejmujący sekwencję aminokwasową o wzorze:
d1d2d3d4Pd6Dd8Ld10d11d12LYd15d16d17d18d19d20d21d22 (SEQ ID NO: 72), gdzie:
1 d1 nie występuje lub oznacza resztę aminokwasową;
2 d2 nie występuje lub oznacza obojętną polarną, kwasową lub zasadową resztę aminokwasową;
3 d3 nie występuje lub oznacza obojętną hydrofobową lub obojętną polarną resztę aminokwasową; d4 nie występuje lub oznacza resztę aminokwasową; d6 oznacza obojętną hydrofobową resztę aminokwasową; d8 oznacza A, D lub E;
d oznacza kwasową resztę aminokwasową;
d11 oznacza resztę aminokwasową;
d oznacza obojętną hydrofobową, obojętną polarną lub zasadową resztę aminokwasową;
d nie występuje lub oznacza obojętną polarną, kwasową lub zasadową resztę aminokwasową; d16 nie występuje lub oznacza obojętną polarną, kwasową lub zasadową resztę aminokwasową;
d nie występuje lub oznacza obojętną hydrofobową lub obojętną polarną resztę aminokwasową; d18 nie występuje lub oznacza obojętną hydrofobową lub obojętną polarną resztę aminokwasową;
d nie występuje lub oznacza obojętną hydrofobową, obojętną polarną lub zasadową resztę aminokwasową;
d nie występuje lub oznacza resztę aminokwasową;
d nie występuje lub oznacza obojętną polarną, kwasową lub zasadową resztę aminokwasową;
d nie występuje lub oznacza obojętną hydrofobową, obojętną polarną lub zasadową resztę aminokwasową;
oraz jego fizjologicznie dopuszczalne sole, przy czym korzystnie:
d1 oznacza T, S, Q, R lub H;
2 d2 oznacza T, Q, N lub K;
3 d oznacza F; d4 oznacza M, Q, E lub K; d6 oznacza L lub M;
d8 oznacza D lub E;
d oznacza E;
d11 oznacza Q lub E;
d oznacza T lub R; d15 oznacza Y, D, E lub K; d16 oznacza Q; d17 oznacza W lub F; d18 oznacza L, I, M lub T; d19 oznacza L, F lub Y;
d20 oznacza Q, D lub E;
d nie występuje lub oznacza Q lub H;
d nie występuje lub oznacza A, L, G, S lub R.
W korzystnym wykonaniu, ten polipeptyd nieobjęty obecnym wynalazkiem obejmuje co najmniej jedną sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej SEQ ID NO: 6 oraz od SEQ ID NO:
PL 224 701 B1
119 do SEQ ID NO: 142 włącznie, gdzie polipeptyd jest zdolny do wiązania z Ang-2. SEQ ID NO: 6 oraz SEQ ID NO: 119-142 podano poniżej:
Peptyd SEQ ID NO. Sekwencja peptydowa
L1 6 KFNPLDELEETLYEQFTFQQ
L1-1 119 QNYKPLDELDATLYEHFIFHYT
L1-2 120 LNFTPLDELEQTLYEQWTLQQS
L1-3 121 TKFNPLDELEQTLYEQWTLQHQ
L1-4 122 VKFKPLDALEQTLYEHWMFQQA
L1-5 123 VKYKPLDELDEILYEQQTFQER
L1-7 124 TNFMPMDDLEQRLYEQFILQQG
L1-9 125 SKFKPLDELEQTLYEQWTLQHA
L1-10 126 QKFQPLDELEQTLYEQFMLQQA
L1-11 127 QNFKPMDELEDTLYKQFLFQHS
L1-12 128 YKFTPLDDLEQTLYEQWTLQHV
L1-13 129 QEYEPLDELDETLYNQWMFHQR
L1-14 130 SNFMPLDELEQTLYEQFMLQHQ
L1-15 131 QKYQPLDELDKTL YDQFMLQQG
L1-16 132 QKFQPLDELEETLYKQWTLQQR
L1-17 133 VKYKPLDELDEWLYHQFTLHHQ
L1-18 134 QKFMPLDELDEILYEQFMFQQS
L1-19 135 QTFQPLDDLEEYLYEQWIRRYH
L1-20 136 EDYMPLDALDAQLYEQFILLHG
L1-21 137 HTFQPLDELEETLYYQWLYDQL
L1-22 138 YKFNPMDELEQTLYEEFLFQHA
AC6-L1 139 TNYKPLDELDATLYEHWILQHS
L1-C1 140 QKFKPLDELEQTLYEQWTLQQR
L1-C2 141 TKFQPLDELDQTLYEQWTLQQR
L1-C3 142 TNFQPLDELDQTLYEQWTLQQR
Ujawniono także nieobjęty wynalazkiem polipeptyd zdolny do wiązania Ang-2, obejmujący sekwencję aminokwasową o wzorze:
RPe3e4e5e6e7G (SEQ ID NO: 73) gdzie:
3 e3 oznacza obojętną polarną resztę aminokwasową; e4 oznacza kwasową resztę aminokwasową; e5 oznacza obojętną polarną lub kwasową resztę aminokwasową; e6 oznacza obojętną hydrofobową resztę aminokwasową; e7 oznacza obojętną hydrofobową resztę aminokwasową;
3 oraz jego fizjologicznie dopuszczalne sole, przy czym korzystnie e oznacza Y lub C, a w innym korzystnym wykonaniu, e4 oznacza D lub E, zaś w jeszcze innym korzystnym wykonaniu, e6 oznacza I lub M.
Ujawniono także nieobjęty wynalazkiem polipeptyd zdolny do wiązania Ang-2, obejmujący sekwencję aminokwasową o wzorze:
PL 224 701 B1 f1 f2f3f4ppf7f8f9f10f11 Gf13f14f15f16f17f18f19f20 (SEQ ID NO: 74) gdzie:
1 f oznacza obojętną hydrofobową lub obojętną polarną resztę aminokwasową;
2 f oznacza obojętną hydrofobową lub obojętną polarną resztę aminokwasową; f oznacza obojętną polarną lub kwasową resztę aminokwasową; f4 oznacza obojętną hydrofobową lub obojętną polarną resztę aminokwasową; f7 oznacza obojętną polarną resztę aminokwasową; f8 oznacza kwasową resztę aminokwasową;
f9 oznacza obojętną polarną lub kwasową resztę aminokwasową; f oznacza obojętną hydrofobową resztę aminokwasową; f11 oznacza obojętną hydrofobową resztę aminokwasową;
f oznacza obojętną hydrofobową lub obojętną polarną resztę aminokwasową;
f oznacza obojętną hydrofobową lub obojętną polarną resztę aminokwasową; f oznacza obojętną polarną resztę aminokwasową; f16 oznacza obojętną polarną resztę aminokwasową;
f oznacza obojętną polarną lub kwasową resztę aminokwasową; f18 oznacza obojętną hydrofobową lub zasadową resztę aminokwasową;
f oznacza obojętną hydrofobową lub obojętną polarną resztę aminokwasową; oraz f oznacza obojętną hydrofobową lub obojętną polarną resztę aminokwasową;
oraz do jego fizjologicznie dopuszczalne sole, przy czym korzystnie:
f1 oznacza S, A lub G; f2 oznacza G, Q lub P; f3 oznacza Q, G lub D; f4 oznacza L, M lub Q; f7 oznacza C lub Y; f8 oznacza E lub D; f9 oznacza E, G lub D; f10 oznacza I lub M; f11 oznacza F lub L; f13 oznacza C lub W; f14 oznacza G lub P; f15 oznacza T lub N; f16 oznacza Q, Y lub K; f17 oznacza N, D lub Q; f18 oznacza L, V, W lub R; f19 oznacza A, Q, Y lub I; zaś f20 oznacza L, A, G lub V.
Bardziej korzystnie, polipeptyd ten obejmuje co najmniej jedną sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej SEQ ID NO: 3 oraz od SEQ ID NO: 143 do SEQ ID NO: 148, włącznie, gdzie polipeptyd jest zdolny do wiązania z Ang-2 oraz do jego fizjologicznie dopuszczalne sole. SEQ ID NO: 3 oraz od SEQ ID NO: 143 do SEQ ID NO: 148 są następujące:
Peptyd SEQ ID NO. Sekwencja
Con1 3 KRPCEEIFGGCTYQ
Con1-1 143 AGGMRPYDGMLGWPNYDVQA
Con1-2 144 QTWDDPCMHILGPVTWRRCI
Con1-3 145 APGQRPYDGMLGWPTYQRIV
Con1-4 146 SGQLRPCEEIFGCGTQNLAL
Con1-5 147 FGDKRPLECMFGGPIQLCPR
Con1-6 148 GQDLRPCEDMFGCGTKDWYG
PL 224 701 B1
Ujawniono także nieobjęty wynalazkiem polipeptyd zdolny do wiązania Ang-2, obejmujący sekwencję aminokwasową o wzorze:
Cg2Gg4g5DPFTg10GCg13 (SEQ ID NO: 75) gdzie:
g2 oznacza kwasową resztę aminokwasową; g4 oznacza obojętną hydrofobową resztę aminokwasową;
g5 oznacza E, D lub Q;
g oznacza obojętną hydrofobową lub obojętną polarną resztę aminokwasową;
g oznacza resztę kwasową;
2 oraz do jego fizjologicznie dopuszczalne sole, przy czym korzystnie g oznacza E lub D, a w innym korzystnym wykonaniu, g4 oznacza V lub M, zaś w jeszcze innym wykonaniu, g10 oznacza F lub Q, nato13 miast w kolejnym innym wykonaniu, g oznacza D lub E.
Nie jest objęty wynalazkiem także inny ujawniony obecnie polipeptyd zdolny do wiązania Ang-2, obejmujący sekwencję aminokwasową o wzorze:
h1h2h3h4Ch6Gh8h9DPFTh14GCh17h18h19h20 (SEQ ID NO: 158) gdzie:
1 h1 nie występuje lub oznacza obojętną hydrofobową, obojętną polarną, lub zasadową resztę aminokwasową;
2 h2 oznacza obojętną hydrofobową lub obojętną polarną resztę aminokwasową;
3 h3 oznacza kwasową resztę aminokwasową;
h4 oznacza obojętną hydrofobową lub obojętną polarną resztę aminokwasową; h6 oznacza kwasową resztę aminokwasową; h8 oznacza obojętną hydrofobową resztę aminokwasową; h9 oznacza E, D lub Q;
h14 oznacza obojętną hydrofobową lub obojętną polarną resztę aminokwasową; h oznacza kwasową resztę aminokwasową;
h18 oznacza obojętną hydrofobową, obojętną polarną lub zasadową resztę aminokwasową;
h oznacza obojętną hydrofobową lub obojętną polarną resztę aminokwasową; oraz h nie występuje lub oznacza resztę aminokwasową;
oraz do jego fizjologicznie dopuszczalne sole, przy czym korzystnie:
1 h nie występuje lub oznacza A, L, M, G, K lub H;
2 h2 oznacza L, F lub Q;
3 h3 oznacza D lub E; h4 oznacza W lub Y; h6 oznacza D lub E; h8 oznacza V lub M;
h oznacza F lub Q;
h oznacza D lub E; h18 oznacza M, Y, N lub K;
h oznacza L lub Q; oraz h20 nie występuje lub oznacza M, T, G, S, D, K lub R.
Wynalazek nie odnosi się również do polipeptydu obejmującego co najmniej jedną sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej SEQ ID NO: 5 lub od SEQ ID NO: 149 do SEQ ID NO: 157 włącznie, gdzie wspomniany polipeptyd jest zdolny do wiązania z Ang-2 oraz do jego fizjologicznie dopuszczalnych soli. SEQ ID NO: 5 oraz od SEQ ID NO: 149 do SEQ ID NO: 157 podano poniżej:
PL 224 701 B1
Peptyd SEQ ID NO: Sekwencja
12-9 5 FDYCEGVEDPFTFGCDNH
12-9-1 149 GFEYCDGMEDPFTFGCDKQT
12-9-2 150 KLEYCDGMEDPFTQGCDNQS
12-9-3 151 LQEWCEGVEDPFTFGCEKQR
12-9-4 152 AQDYCEGMEDPFTFGCEMQK
12-9-5 153 LLDYCEGVQDPFTFGCENLD
12-9-6 154 HQEYCEGMEDPFTFGCEYQG
12-9-7 155 MLDYCEGMDDPFTFGCDKQM
12-9-C2 156 LQDYCEGVEDPFTFGCENQR
12-9-C1 157 LQDYCEGVEDPFTFGCEKQR
W wysoce korzystnym wykonaniu, wynalazek odnosi się do związku o wzorze:
(X1)q-F1-(X2)r oraz jego multimerów, gdzie:
1
- F1 oznacza podłoże
- X1 oraz X2 jest niezależnie wybrany z grupy obejmującej - (L1)s-P1;
- (L1)s-P1-(L2)t-P2;
- (L1)s-P1-(L2)t-P2-(L5)u-P3; oraz
- (L1)s-P1-(L2)t-P2-(L3)u-P3-(L4)v-P4;
P3 oraz P4 każdy niezależnie zawiera polipepgdzie jeden lub więcej niż jeden spośród P1, P2 tyd wybrany z grupy obejmującej:
(a) polipeptyd o SEQ ID NO: 2;
gdzie L1, L2 niezależnie - oznaczają 0 lub 1, z zastrzeżeniem, że co najmniej jeden spośród q oraz r oznacza 1; oraz do jego fizjologicznie dopuszczalnych soli;
nie są natomiast objęte wynalazkiem te spośród związków objętych powyższym wzorem ogólL3 oraz L4, każdy niezależnie, oznaczają linkery; oraz q, r, s, t, u oraz v - każdy P 2
P3 oraz P4 każdy niezależnie zawiera polipeptyd (c) (d) nym, gdzie jeden lub więcej niż jeden spośród P wybrany z grupy obejmującej:
(b) sekwencję aminokwasową WDPWT (SEQ ID NO: 65), gdzie wspomniany polipeptyd liczy od 5 do 50 aminokwasów długości;
sekwencję aminokwasową WDPWTC (SEQ ID NO: 66);
wencję aminokwasową Cz WDPWT (SEQ ID NO: 67), gdzie z oznacza kwasową lub obojętną polarną resztę aminokwasową;
(e) sekwencję aminokwasową Cz WDPWTC (SEQ ID NO: 68), gdzie z oznacza kwasową lub obojętną polarną resztę aminokwasową;
(f) sekwencję aminokwasową Pc Dc Lc c c LY (SEQ ID NO: 71) gdzie c oznacza obojętną hydrofobową resztę aminokwasową; c4 oznacza A, D lub E; c6 oznacza kwasową resztę aminokwasową; c7 oznacza resztę aminokwasową, a c8 oznacza obojętną hydrofobową, obojętną polarną lub zasadową resztę aminokwasową;
(g) sekwencję aminokwasową RPe3e4e5e6e7G (SEQ ID NO: 73) gdzie e3 oznacza obojętną polarną resztę aminokwasową; e4 oznacza kwasową resztę aminokwasową;
6 e oznacza obojętną polarną lub kwasową resztę aminokwasową; e - oznacza obojętną hydrofobową resztę aminokwasową, a e tę aminokwasową;
oznacza obojętną hydrofobową res z(h) sekwencję aminokwasową Cg2Gg4g5DPFTg10GCg13 (SEQ ID NO: 75) gdzie: g2 oznacza kwasową resztę aminokwasową; g4 oznacza obojętną hydrofobową resztę
10 aminokwasową; g oznacza obojętną polarną lub kwasową resztę aminokwasową; g oznacza obo13 jętną hydrofobową lub obojętną polarną resztę aminokwasową, a g oznacza resztę kwasową;
PL 224 701 B1 (i) polipeptyd o SEQ ID NO: 1; oraz (j) polipeptyd o SEQ ID NO: 7;
gdzie L1, L2, L3 oraz L4, każdy niezależnie, oznaczają linkery; oraz q, r, s, t, u oraz v - każdy niezależnie - oznaczają 0 lub 1, z zastrzeżeniem, że co najmniej jeden spośród q oraz r oznacza 1;
oraz ich fizjologicznie dopuszczalne sole.
Należy zauważyć, że wynalazek dotyczy dalej polipeptydu fuzyjnego, obejmującego co najmniej jeden opisany peptyd według wynalazku oraz podłoże, gdzie polipeptyd fuzyjny jest zdolny do wiąz ania z Ang-2 oraz jego fizjologicznie dopuszczalnych soli. Inne ujawnione tu polipeptydy wiążące Ang-2 także tworzą polipeptydy fuzyjne z podłożem. W polipeptydzie fuzyjnym, podłoże oznacza korzystnie co najmniej jedną domenę Fc, glikol polietylenowy, lipid, grupę cholesterolową, węglowodan, oraz oligosacharyd. Inne odpowiednie podłoża, takie jak albumina oraz podobne, będą dobrane przez biegłych w sztuce i są włączone w zakres obecnego wynalazku.
Biegły w sztuce rozpozna, że różne cząsteczki mogą być wstawione w strukturę środka spec yficznie wiążącego Ang-2. Tak więc dana cząsteczka może być wstawiona, przykładowo, między części stanowiące peptyd oraz podłoże w środkach specyficznie wiążących Ang-2, lub wstawiona w obrębie ich części peptydowych, zachowując jednocześnie pożądaną aktywność środka specyficznie wiążącego. W pewnym przypadku, można łatwo wstawić, przykładowo, cząsteczkę taką jak domena Fc lub jej fragment, glikol polietylenowy lub inne pokrewne cząsteczki takie jak dekstran, kwas tłus zczowy, lipid, grupę cholesterolową, mały węglowodan, peptyd, środek cytotoksyczny, środek chemioterapeutyczny, wykrywalne ugrupowanie jak to tutaj opisano (włączając środki fluorescencyjne, radioznakowane takie jak radioizotopy), oligosacharyd, oligonukleotyd, polinukleotyd, interferencyjny (lub inny) RNA, enzymy, hormony, lub podobne. Inne cząsteczki odpowiednie do wstawienia w ten sposób będą dobrane przez biegłych w sztuce i są objęte zakresem obecnego wynalazku. Obejmuje to wstawienie, przykładowo, pożądanej cząsteczki między dwa kolejne aminokwasy, ewentualnie połączone przez odpowiedni linker. Dla przykładu, do sekwencji ciała peptydowego Con4(C):
M-Fc-GGGGGAQQEECEWDPWTCEHMLE (SEQ ID NO:23) każdy biegły w sztuce mógłby łatwo wstawić pożądaną cząsteczkę między, przykładowo, dwie sąsiednie reszty glutaminowe („QQ”) uzyskując pożądaną strukturę i/lub funkcję, zachowującą jednocześnie zdolność peptydu do wiązania Ang-2. A więc, sekwencja mogłaby być zmodyfikowana jak następuje:
M-Fc-GGGGGAQ-[cząsteczka]-QEECEWDPWTCEHMLE
Odpowiednie cząsteczki linkera mogą być dodane, jeśli jest to pożądane. Dalej należy zauważyć, że dodatkowa cząsteczka może być wstawiona w wielu miejscach w cząsteczce, włączając odpowiednie zewnętrzne łańcuchy, między podłożem oraz sekwencją peptydową, jak następuje:
M-Fc-[cząsteczka]-GGGGGAQQEECEWDPWTCEHMLE lub w dowolne inne miejsce pożądane przez biegłego w sztuce. Inne odpowiednie wykonania będą oczywiste dla biegłych w sztuce.
W kolejnym innym wykonaniu, wynalazek dotyczy polinukleotydu kodującego środki specyficznie wiążące Ang-2 (włączając, bez ograniczeń, peptydy i/lub ciała peptydowe) według wynalazku, oraz inne środki wiążące, jakie tutaj opisano. Biegły w sztuce doceni, że jeżeli sekwencja aminokwasowa jest znana, odpowiednia sekwencja(e) nukleotydowa(e) może(gą) być łatwo określona znanymi tec hnikami. Patrz, przykładowo, Suzuki, D., An Introduction to Genetic Analysis, W.H. Freeman Pub. Co. (1986). Przykładowe sekwencje nukleotydowe kodujące peptydy według wynalazku podano poniżej. Biegły w sztuce rozpozna, że więcej niż jeden kodon może kodować dany aminokwas i dlatego wynalazek odnosi się do dowolnej sekwencji nukleotydowej, która koduje peptydy i/lub ciała peptydowe według wynalazku.
PL 224 701 B1
Peptyd Seq. Id No. Sekwencja peptydowa Przykładowa sekwencja DNA
Con4-44 76 PIRQEECDWDPWTCEHMWEV ccgatccgtcaggaagaatgcga ctgggacccgtggacctgcgaac acatgtgggaagtt (SEQ ID NO; 159)
Con4-40 77 TNIQEECEWDPWTCDHMPGK accaacatccaggaagaatgcga atgggacccgtggacctgcgacc acatgccgggtaaa (SEQ ID NO: 160)
Con4-4 78 WYEQDACEWDPWTCEHMAEV tggtacgaacaggacgcttgcga atgggacccgtggacctgcgaac acatggctgaagtt (SEQ ID NO: 161)
Con4-31 79 NRLQEVCEWDPWTCEHMENV aaccgtctgcaggaagtttgcga atgggacccgtggacctgcgaac acatggaaaacgtt (SEQ ID NO: 162)
Con4-C5 80 AATQEECEWDPWTCEHMPRS gctgctacccaggaagaatgcga atgggacccgtggacctgcgaac acatgccgcgttcc (SEQ ID NO: 163)
Con4-42 81 LRHQEGCEWDPWTCEHMFDW ctgcgtcaccaggaaggttgcga atgggacccgtggacctgcgaac acatgttcgactgg (SEQ ID NO: 164)
Con4-35 82 VPRQKDCEWDPWTCEHMYVG gttccgcgtcagaaagactgcga atgggacccgtggacctgcgaac acatgtacgttggt (SEQ ID NO: 165)
PL 224 701 B1
Con4-43 83 SISHEECEWDPWTCEHMQVG tccatctcccacgaagaatgcga atgggacccgtggacctgcgaac acatgcaggttggt {SEQ ID NO: 360)
Con4-49 84 WAĄQEECEWDPWTCEHMGRM tgggctgctcaggaagaatgcga atgggatccgtggacttgcgaac acatgggtcgtatg (SEQ ID NO: 166)
Con4-27 85 TWPQDKCEWDPWTCEHMGST acttggccgcaggacaaatgcga atgggatccgtggacttgcgaac acatgggttctact (SEQ ID NO: 167)
Con4-48 86 GHSQEECGWDPWTCEHMGTS ggtcactcccaggaagaatgcgg ttgggacccgtggacctgcgaac acatgggtacgtcc (SEQ ID NO: 168)
Con4-46 87 QHWQEECEWDPWTCDHMPSK cagcactggcaggaagaatgcga atgggacccgtggacctgcgacc acatgccgtccaaa (SEQ ID NO: 169)
Con4-41 88 NVRQEKCEWDPWTCEHMPVR aacgttcgtcaggaaaaatgcga atgggacccgtggacctgcgaac acatgccggttcgt {SEQ ID NO: 170)
Con4-36 89 KSGQVECNWDPWTCEHMPRN aaatccggtcaggttgaatgcaa ctgggacccgtggacctgcgaac acatgccgcgtaac (SEQ ID NO: 171)
Con4-34 90 VKTQEHCDWDPWTCEHMREW gttaaaacccaggaacactgcga ctgggacccgtggacctgcgaac acatgcgtgaatgg (SEQ ID NO: 172)
Con4-28 91 AWGQEGCDWDPWTCEHMLPM gcttggggtcaggaaggttgcga ctgggacccgtggacctgcgaac acatgctgccgatg {SEQ ID NO: 173)
Con4-39 92 PVNQEDCEWDPWTCEHMPPM ccggttaaccaggaagactgcga atgggacccgtggacctgcgaac acatgccgccgatg (SEQ ID NO: 174)
Con4-25 93 RAPQEDCEWDPWTCAHMDIK cgtgctccgcaggaagactgcga atgggacccgtggacctgcgctc acatggacatcaaa (SEQ ID NO: 175)
PL 224 701 B1
Con4-50 94 HGQNMECEWDPWTCEHMFRY cacggtcagaacatggaatgcga atgggacccgtggacctgcgaac acatgttccgttac (SEQ ID NO: 176)
Con4-38 95 PRLQEECVWDPWTCEHMPLR ccgcgtctgcaggaagaatgcgt ttgggacccgtggacctgcgaac acatgccgctgcgt (SEQ ID NO: 177)
Con4-29 96 RTTQEKCEWDPWTCEHMESQ cgtaccacccaggaaaaatgcga atgggacccgtggacctgcgaac acatggaatcccag (SEQ ID NO: 178)
Con4-47 97 QTSQEDCVWDPWTCDHMVSS cagacctcccaggaagactgcgt ttgggacccgtggacctgcgacc acatggtttcctcc {SEQ ID NO: 179)
Con4-20 98 QVIGRPCEWDPWTCEHLEGL caggttatcggtcgtccgtgcga atgggacccgtggacctgcgaac acctggaaggtctg (SEQ ID NO: 180)
Con4-45 99 WAQQEECAWDPWTCDHMVGL tgggctcagcaggaagaatgcgc ttgggacccgtggacctgcgacc acatggttggtctg (SEQ ID NO: 181)
Con4-37 100 LPGQEDCEWDPWTCEHMVRS ctgccgggtcaggaagactgcga atgggacccgtggacctgcgaac acatggttcgttcc (SEQ ID NO: 182)
Con4-33 101 PMNQVECDWDPWTCEHMPRS ccgatgaaccaggttgaatgcga ctgggacccgtggacctgcgaac acatgccgcgttcc (SEQ ID NO: 183)
AC2- Con4 102 FGWSHGCEWDPWTCEHMGST ttcggttggtctcacggttgcga atgggatccgtggacttgcgaac acatgggttctacc (SEQ ID NO: 184)
Con4-32 103 KSTQDDCDWDPWTCEHMVGP aaatccacccaggacgactgcga ctgggacccgtggacctgcgaac acatggttggtccg (SEQ ID NO: 185)
Con4-17 104 GPRISTCQWDPWTCEHMDQL ggtccgcgtatctccacctgcca gtgggacccgtggacctgcgaac acatggaccagctg (SEQ ID NO: 186)
PL 224 701 B1
Con4-8 105 STIGDMCEWDPWTCAHMQVD tccaccatcggtgacatgtgcga atgggacccgtggacctgcgcfcc acatgcaggttgac (SEQ ID NO: 187)
AC4- Con4 106 VLGGQGCEWDPWTCRLLQGW gttctgggtggtcagggttgcga atgggacccgtggacctgccgtc tgctgcagggttgg (SEQ ID NO: 188)
Con4-1 107 VLGGQGCQWDPWTCSHLEDG gttctgggtggtcagggttgcca gtgggacccgtggacctgctccc acctggaagacggt (SEQ ID NO: 189)
Con4-Cl 108 TTIGSMCEWDPWTCAHMQGG accaccatcggttccatgtgcga atgggacccgtggacctgcgctc acatgcagggtggt (SEQ ID NO: 190'
Con4-21 109 TKGKSVCQWDPWTCSHMQSG accaaaggtaaatccgtttgcca gtgggacccgtggacctgctccc acatgcagtccggt (SEQ ID NO: 191)
Con4-C2 110 TTIGSMCQWDPWTCAHMQGG accaccatcggttccatgtgcca gtgggacccgtggacctgcgctc acatgcagggtggt (SEQ ID NO: 192)
Con4-18 111 WVNEWCEWDPWTCNHWDTP tgggttaacgaagttgtttgcga atgggacccgtggacctgcaacc actgggacaccccg (SEQ ID ! NO: 193)
Con4-19 112 WQVGMCQWDPWTCKHMRLQ gttgttcaggttggtatgtgcca gtgggacccgtggacctgcaaac acatgcgtctgcag (SEQ ID NO: 194)
Con4-16 113 AVGSQTCEWDPWTCAHLVEV gctgttggttcccagacctgcga atgggacccgtggacctgcgctc acctggttgaagtt {SEQ ID NO: 195)
Con4-ll 114 QGMKMFCEWDPWTCAHIVYR cagggtatgaaaatgttctgcga atgggacccgtggacctgcgctc acatcgtttaccgt (SEQ ID NO: 196)
Con4-C4 115 TTIGSMCQWDPWTCEHMQGG accaccatcggttccatgtgcca gtgggacccgtggacctgcgaac acatgcagggtggt (SEQ ID NO: 197)
PL 224 701 B1
Con4-23 116 TSQRVGCEWDPWTCQHLTYT acctcccagcgtgttggttgcga atgggacccgtggacctgccagc acctgacctacacc (SEQ ID NO: 198)
Con4-15 117 QWSWPPCEWDPWTCQTVWPS cagtggtcctggccgccgtgcga atgggacccgtggacctgccaga ccgtttggccgtcc (SEQ ID NO: 199)
Con4-9 118 GTSPSFCQWDPWTCSHMVQG ggtacctccccgtccttctgcca gtgggacccgtggacctgctccc acatggttcagggt (SEQ ID NO: 200)
TN8- Con4 4 QEECEWDPWTCEHM caggaagaatgcgaatgggaccc atggacttgcgaacacatg (SEQ ID NO: 201)
Ll-1 119 QNYKPLDELDATLYEHFIFHYT cagaactacaaaccgctggacga actggacgctaccctgtacgaac acttcatcttccactacacc (SEQ ID NO: 202}
LI-2 120 LNFTPLDELEQTLYEQWTLQQS ctgaacttcaccccgctggacga actggaacagaccctgtacgaac agtggaccctgcagcagtcc (SEQ ID NO: 203}
Ll-3 121 TKFNPLDELEQTLYEQWTLQHQ accaaattcaacccgctggacga actggaacagaccctgtacgaac agtggaccctgcagcaccag (SEQ ID NO: 204)
Ll-4 122 VKFKPLDALEQTLYEHWMFQQA gttaaattcaaaccgctggacgc tctggaacagaccctgtacgaac actggatgttccagcaggct (SEQ ID NO: 205)
Ll-5 123 VKYKPLDELDEILYEQQTFQER gttaaatacaaaccgctggacga actggacgaaatcctgtacgaac agc agac c 11 c c aggaacg t (SEQ ID NO: 206)
LI-7 124 TNFMPMDDLEQRLYEQFILQQG accaacttcatgccgatggacga cctggaacagcgtctgtacgaac agttcatcctgcagcagggt (SEQ ID NO: 207)
Ll-9 125 SKFKPLDELEQTLYEQWTLQHA tccaaattcaaaccgctggacga actggaacagaccctgtacgaac agtggaccctgcagcacgct (SEQ ID NO: 208)
PL 224 701 B1
Ll-10 126 QKFQPLDELEQTLYEQFMLQQA cagaaattccagccgctggacga actggaacagaccctgtacgaac agttcatgctgcagcaggct (SEQ ID NO: 209)
Ll-11 127 QNFKPMDELEDTLYKQFLFQHS cagaacttcaaaccgatggacga attggaagacaccctgtacaaac agttcctgttccagcactcc (SEQ ID NO: 210)
Ll-12 128 YKFTPLDDLEQTLYEQWTLQHV tacaaattcaccccgctggacga cctggaacagaccctgtacgaac agtggaccctgcagcacgtt (SEQ ID NO: 211)
Ll-13 129 QEYEPLDELDETLYNQWMFHQR caggaatacgaaccgctggacga actggacgaaaccctgtacaacc agtggatgttccaccagcgt (SEQ ID NO: 212)
Ll-14 130 SNFMPLDELEQTLYEQFMLQHQ tccaacttcatgccgctggacga actggaacagaccctgtacgaac agttcatgctgcagcaccag (SEQ ID NO: 213)
Ll-15 131 QKYQPLDELDKTLYDQFMLQQG cagaaataccagccgctggacga actggacaaaaccctgtacgatc agttcatgctgcagcagggt (SEQ ID NO: 214)
Ll-16 132 QKFQPLDELEETLYKQWTLQQR cagaaattccagccgctggacga actggaagaaaccctgtacaaac agtggaccętgcagcagcgt (SEQ ID NO: 215)
Ll-17 133 VKYKPLDELDEWLYHQFTLHHQ gttaaatacaaaccgctggacga actggacgaatggctgtaccacc agttcaccctgcaccaccag (SEQ ID NO: 216)
Ll-18 134 QKFMPLDELDEILYEQFMFQQS cagaaattcatgccgctggacga actggacgaaatcctgtacgaac agttcatgttccagcagtccc (SEQ ID NO: 217)
Ll-19 135 QTFQPLDDLEEYLYEQWIRRYH cagaccttccagccgctggacga cctggaagaatacttgtacgaac agtggatccgtcgttaccac (SEQ ID NO: 218)
Ll-20 136 EDYMPLDALDAQLYEQFILLHG gaagactacatgccgctggacgc tctggacgctcagctgtacgaac agttcatcctgctgcacggt {SEQ ID NO: 219)
PL 224 701 B1
Ll-21 137 HTFQPLDELEETLYYQWLYDQL cacaccttccagccgctggacga actggaagaaaccctgtactacc agtggctgtacgaccagctg (SEQ ID NO: 220)
Ll-22 138 YKFNPMDELEQTLYEEFLFQHA tacaaattcaacccgatggacga actggaacagaccctgtacgaag aattcctgttccagcacgct (SEQ ID NO: 221)
AC6-L1 139 TNYKPLDELDATLYEHWILQHS accaactacaaaccgctggacga actggacgctaccetgtacgaac actggatcctgcagcactcc (SEQ ID NO: 222)
Ll-Cl 140 QKFKPLDELEQTLYEQWTLQQR cagaaattcaaaccgctggacga actggaacagaccctgtacgaac agtggaccctgcagcagcgt (SEQ ID NO: 223)
L1-C2 141 TKFQPLDELDQTLYEQWTLQQR accaaattccagccgctggacga actggaccagaccctgtacgaac agtggaccctgcagcagcgt (SEQ ID NO: 224)
L1-C3 142 TNFQPLDELDQTLYEQWTLQQR accaacttccagccgctggacga actggaccagaccctgtacgaac agtggaccctgcagcagcgt (SEQ ID NO: 225)
LI 6 KFNPLDELEETLYEQFTFQQ aaattcaacccgctggacgagct ggaagagactctgtacgaacagt ttacttttcaacag (SEQ ID NO: 226)
Conl-1 143 AGGMRPYDGMLGWPNYDVQA gctggtggtatgcgtccgtacga cggtatgctgggttggccgaact acgacgttcaggct (SEQ ID NO: 227)
Conl -2 144 QTWDDPCMHILGPVTWRRCI cagacttgggacgatccgtgcat gcacattctgggtccggttactt ggcgtcgttgcatc (SEQ ID NO: 228)
Conl-3 145 APGQRPYDGMLGWPTYQRIV gctccgggtcagcgtccgtacga cggtatgctgggttggccgacct accagcgtatcgtt (SEQ ID NO: 229)
Conl-4 146 SGQLRPCEEIFGCGTQNLAL tccggtcagctgcgtccgtgcga agaaatcttcggttgcggtaccc agaacctggctctg (SEQ ID NO: 230)
PL 224 701 B1
Conl-5 147 FGDKRPLECMFGGP1QLCPR ttcggtgacaaacgtccgctgga atgcatgttcggtggtccgatcc agctgtgcccgcgt (SEQ ID NO: 231)
Conl-6 148 GQDLRPCEDMFGCGTKDWYG ggtcaggacctgcgtccgtgcga agacatgttcggttgcggtacca aagactggtacggt (SEQ ID NO: 232)
12-9-1 149 GFEYCDGMEDPFTFGCDKQT ggtttcgaatactgcgacggtat ggaagacccgttcaccttcggtt gcgacaaacagacc (SEQ ID NO: 233)
12-9-2 150 KLEYCDGMEDPFTQGCDNQS aaactggaatactgcgacggtat ggaagacccgttcacccagggtt gcgacaaccagtcc (SEQ ID NO: 234)
12-9-3 151 LQEWCEGVEDPFTFGCEKQR ctgcaggaatggtgcgaaggtgt tgaagacccgttcaccttcggtt gcgaaaaacagcgt (SEQ ID NO: 235)
12-9-4 152 AQDYCEGMEDPFTFGCEMQK gctcaggactactgcgaaggtat ggaagacccgttcaccttcggtt gcgaaatgcagaaa (SEQ ID NO: 236)
12-9-5 153 LLDYCEGVQDPFTFGCENLD ctgctggactactgcgaaggtgt tcaggacccgttcaccttcggtt gcgaaaacctggac (SEQ ID NO: 237)
12-9-6 154 HQEYCEGMEDPFTFGCEYQG caccaggaatactgcgaaggtat ggaagacccgttcaccttcggtt gcgaataccagggt (SEQ ID NO: 238)
12-9-7 155 MLDYCEGMDDPFTFGCDKQM atgctggactactgcgaaggtat ggacgacccgttcaccttcggtt gcgacaaacagatg (SEQ ID NO: 239)
12-9-C2 156 LQDYCEGVEDPFTFGCENQR ctgcaggactactgcgaaggtgt tgaagacccgttcaccttcggtt gcgaaaaccagcgt (SEQ ID NO: 240)
12-9-C1 157 LQDYCEGVEDPFTFGCEKQR ctgcaggactactgcgaaggtgt tgaagacccgttcaccttcggtt gcgaaaaacagcgt (SEQ ID NO: 241)
12-9 5 FDYCEGYEDPFTFGCDNH ttcgactactgcgaaggtgttga agacccgttcactttcggctgtg ataaccac (SEQ ID NO: 242)
PL 224 701 B1
W kolejnym innym aspekcie, wynalazek oraz zawarte tu pełne ujawnienie odnosi się do wektorów ekspresji obejmujących co najmniej jeden polinukleotyd według wynalazku. W innym aspekcie, wynalazek oraz pełne zawarte tu ujawnienie odnosi się do komórek gospodarza zawierających ten wektor ekspresji. Należy zaznaczyć, że komórki gospodarza są korzystnie prokariotycznymi komórkami (takimi jak komórki E. coli) lub komórkami eukariotycznymi.
Wynalazek odnosi się również do kompozycji farmaceutycznej obejmującej skuteczną ilość op isanej tu substancji czynnej, w mieszaninie z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.
Substancje czynne tu ujawnione, w tym substancje według wynalazku są stosowane w sposobie inhibitowania niepożądanej angiogenezy u ssaków, obejmującym podawanie terapeutycznie sk utecznej ilości polipeptydu lub kompozycji, jak tutaj opisano. Wynalazek odnosi się również do ich stosowania w sposobie modulowania angiogenezy u ssaków. Wynalazek dotyczy dalej zastosowania w sposobie inhibitowania wzrostu nowotworu charakteryzującego się niepożądaną angiogenezą u ssaków. Ponadto, wynalazek odnosi się do zastosowania substancji terapeutycznie czynnych według wynalazku oraz innych tu ujawnionych w leczeniu raka u ssaków, obejmującym podawanie polipeptydu lub kompozycji, jak tutaj opisano oraz ewentualnie środka chemioterapeutycznego. W korzystnym wykonaniu, chemioterapeutyczny środek jest co najmniej jednym spośród: fluorouracyl - 5-FU, kamptotecyna - CPT-11 oraz docetaksel w postaci trójwodzianu preparat Taxotere. Należy zaznaczyć, jednakże, że inne odpowiednie środki chemioterapeutyczne oraz inne terapie rakowe m ogą być stosowane.
Wynalazek odnosi się również do zastosowania substancji czynnej do modulowania co najmniej jednego spośród: przepuszczalności naczyń lub wycieku osocza u ssaków. Wynalazek odnosi się dalej do zastosowania substancji aktywnej według wynalazku do leczenia co najmniej jednego spośród choroby neo-unaczynienia gałki ocznej, otyłości, naczyniaka zarodowego, naczyniaka jamistego, stwardnienia tętnic, zapalenia, stanu zapalnego, miażdżycy naczyń, gruczolistości, choroby nowotworowej, choroby związanej z kośćmi lub łuszczycy u ssaków.
Należy zaznaczyć, że środki specyficznie wiążące Ang-2 według wynalazku mogą być stosowane w leczeniu wielu chorób związanych z rozregulowaną lub niepożądaną angiogenezą. Takie choroby obejmują, lecz nie wyłącznie: neo-unaczynienie gałki ocznej, takie jak retinopatie (włączają retinopatię cukrzycową, oraz zależną od wieku degenerację plamkową) łuszczycę, naczyniaka zarodowego, naczyniaka jamistego, stwardnienia tętnic, zapalenia, takie jak zapalenie reumatoidalne lub reumatyczne, w szczególności zapalenie stawów (włączając reumatoidalne zapalenie stawów) lub inne chroniczne zaburzenia stanu zapalnego, takie jak chroniczna astma, naczyniowa lub posttransplantacyjna miażdżyca naczyń, endometrioza, oraz choroby nowotworowe, przykładowo tak zwane stałe nowotwory oraz ciekłe nowotwory (takie jak białaczki). Dodatkowe choroby, które mogą być leczone przez podawanie środków specyficznie wiążących Ang-2 będą oczywiste dla biegłych w sztuce. Takie dodatkowe choroby obejmują, bez ograniczeń, otyłość, przepuszczalność naczyń lub wyciek plazmy oraz zaburzenia związane z kośćmi, włącznie z osteoporozą. A więc, wynalazek obejmuje dalej zastosowania odnoszące się do leczenia tych chorób związanych z rozregulowaną lub niepożądaną angiogenezą.
Inne wykonania według obecnego wynalazku staną się bardziej oczywiste na podstawie poniższego ujawnienia.
Krótki opis rysunków
Fig. 1 przedstawia graficznie objętość nowotworu (oś y) względem czasu (oś x) u myszy dotkniętej nowotworem A-431, leczonej ciałem peptydowym TN8- Con4-C według obecnego wynalazku, lub solanką buforowaną fosforanem (PBS). Szczegóły opisano w przykładach.
Fig. 2 przedstawia graficznie stężenie ciała peptydowego (oś y) względem czasu po podaniu dawki (oś x) u myszy dzikiego typu leczonej 50 μg dawką 2xCon4-C, L1-7-N, lub L1-21-N ciała peptydowego. Szczegóły opisano w przykładach.
Fig. 3 przedstawia graficznie objętość nowotworu (oś y) względem czasu (oś x), występującego u myszy dotkniętej nowotworem A431 leczonej ciałem peptydowym 2xCon4-C według obecnego wynalazku, lub solanką buforowaną fosforanem (PBS) lub kontrolnym ciałem peptydowym. Szczegóły opisano w przykładach.
Fig. 4 przedstawia graficznie wzrost in vitro hodowanych komórek A431 zadanych ciałem peptydowym Con4-C według obecnego wynalazku, kontrolnym ciałem peptydowym lub niczym nie traktowanych. Szczegóły opisano w przykładach.
PL 224 701 B1
Fig. 5 przedstawia graficznie objętość nowotworu (oś y) względem czasu (oś x) w komórkach nowotworowych Colo205 zadanych ciałem peptydowym Con4-C, ciałem peptydowym L1 -7-N, ciałem peptydowym L1-21-N lub ciałem peptydowym 2xCon4-C według obecnego wynalazku, bądź solanką buforowaną fosforanem (PBS), przeciwciałem anty-Ang-2 (Ab536) lub Fc. Szczegóły opisano w przykładach.
Fig. 6 przedstawia graficznie objętość nowotworu (oś y) względem czasu (oś x) u myszy dotkniętej ksenograftowym (wszczepionym) nowotworem Colo205, której podawano różne dawki ciała peptydowego 2xCon4-C według obecnego wynalazku lub solanki buforowanej fosforanem (PBS) lub Fc. Szczegóły opisano w przykładach.
Fig. 7 przedstawia graficznie objętość nowotworu (oś y) względem czasu (oś x) u myszy dotkniętej ksenograftowym (wszczepionym) nowotworem Colo205, której podawano różne dawki ciała peptydowego 2xCon4-C według obecnego wynalazku lub kontrolne ciało peptydowe. Fig. 7 przedstawia również graficznie wybarwiony obszar CD31/ogólną powierzchnię guza dla tych ciał peptydowych. Szczegóły opisano w przykładach.
Fig. 8 przedstawia graficznie objętość nowotworu (oś y) względem czasu (oś x) u myszy dotkniętej ksenograftowym (wszczepionym) nowotworem Colo205, której podawano różne dawki ciała peptydowego 2xCon4-C według obecnego wynalazku lub solankę buforowaną fosforanem (PBS) lub kontrolne ciało peptydowe. Szczegóły opisano w przykładach. Wykres ten wykazuje, że ciała peptydowe anty-Ang-2 są zdolne do inhibitowania wzrostu nowotworu Colo205 niezależnie od tego, kiedy następuje początek podawania.
Fig. 9 przedstawia sumarycznie całkowitą odpowiedź (CR) uzyskanych u myszy bezwłosych płci żeńskiej przy użyciu przeciwciała Ab536 lub ciała peptydowego 2xCon4-C, w obu modelach A431 oraz ksenograftów Colo-205. Szczegóły opisano w przykładach.
Fig. 10A przedstawia graficznie objętość nowotworu (oś y) względem czasu (oś x) u myszy d otkniętej ksenograftowym (wszczepionym) nowotworem Colo205, której podawano różne dawki ciała peptydowego 2xCon4-C według obecnego wynalazku lub kombinację 2xCon4-C i preparat Taxotere, lub solankę buforowaną fosforanem (PBS), lub też PBS plus preparat Taxotere. Szczegóły opisano w przykładach.
Fig. 10B przedstawia graficznie objętość nowotworu (oś y) względem czasu (oś x) u myszy d otkniętej ksenograftowym (wszczepionym) nowotworem Colo205, której podawano różne dawki ciała peptydowego 2xCon4-C według obecnego wynalazku, lub kombinację 2xCon4-C oraz 5-FU, lub solankę buforowaną fosforanem (PBS), lub też PBS plus 5-FU. Szczegóły opisano w przykładach.
Fig. 11A przedstawia graficznie poziomy opuchnięcia łapy (AUC±SE) w modelu zapalenia stawów indukowanego adiuwantem (farmaceutyczną substancją pomocniczą) u szczurów, którym podawano ciało peptydowe 2xCon4-C według obecnego wynalazku lub buforowaną fosforanem solankę (PBS), lub kontrolne ciało peptydowe, oraz u zdrowych lub chorych na zapalenie stawów zwierząt kontrolnych. Szczegóły opisano w przykładach.
Fig. 11 B przedstawia graficznie mineralną gęstość kości (BMD) w modelu zapalenia stawów indukowanego farmaceutyczną substancją pomocniczą u szczurów, którym podawano ciało peptydowe 2xCon4-C według obecnego wynalazku lub buforowaną fosforanem solankę (PBS), lub kontrolne ciało peptydowe, oraz u zdrowych lub chorych na zapalenie stawów zwierząt kontrolnych. Szczegóły opisano w przykładach.
Fig. 11C przedstawia graficznie zmianę ciężaru ciała w modelu zapalenia stawów indukowanego farmaceutyczną substancją pomocniczą u szczurów, którym podawano ciało peptydowe 2xCon4-C według obecnego wynalazku lub buforowaną fosforanem solankę (PBS), lub kontrolne ciało peptydowe, oraz u zdrowych lub chorych na zapalenie stawów zwierząt kontrolnych. Szczegóły opisano w przykładach.
Fig. 12 przedstawia dwa wykresy obrazujące hamowanie w rogówce angiogenezy indukowanej przez VEGF u szczurów. Pierwszy wykres przedstawia ilość naczyń krwionośnych u szczurów, którym podawano albuminę z surowicy bydlęcej (BSA), VEGF plus buforowaną fosforanami solankę (PBS), lub VEGF plus ciało peptydowe Con4-C według wynalazku. Drugi wykres przedstawia powierzchnię naczyń krwionośnych (mm ) u szczurów, którym podawano albuminę z surowicy bydlęcej (BSA), VEGF plus buforowaną fosforanami solankę (PBS), lub VEGF plus ciało peptydowe Con4-C według wynalazku. Szczegóły opisano w przykładach.
Fig. 13A, 13B oraz 13C przedstawiają dane dotyczące mapowania epitopów (O.D. 370) odp owiednio, dla ludzkiej Ang-2 (hAng-2) pełnej długości, dla N-końca hAng-2 oraz dla C-końca hAng-2,
PL 224 701 B1 dla ciała peptydowego TN8-Con4-C, L1-7-N oraz 12-9-3-C według wynalazku, jak również dla kontrolnego ciała peptydowego Tie2-Fc, C2B8, lub 5B12. Szczegóły opisano w przykładach.
Fig. 14 przedstawia powinowactwo wiążące (KD) 2xCon-4-C względem ciała peptydowego według wynalazku oznaczone w próbie Sapidyne KinExA. Szczegóły opisano w przykładach.
Szczegółowy opis wynalazku
Tytuły podrozdziałów wprowadzono wyłącznie ze względu na organizację tekstu i nie mogą być one interpretowane jako ograniczające w jakimkolwiek stopniu zakres opisanych zagadnień
Standardowe techniki mogą być zastosowane do wytwarzania rekombinacyjnej cząsteczki, proteiny oraz przeciwciała, jak również do hodowli tkankowej oraz transformacji komórkowej. Reakcje enzymatyczne oraz techniki oczyszczania prowadzi się typowo według zaleceń producenta lub w zwykły znany sposób, przy zastosowaniu konwencjonalnych procedur, takich jak podane w: Sambrook i wsp. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY [1989]), lub jak tutaj opisano. Jeśli nie wprowadzono konkretnych odmiennych definicji, zastosowano tu powszechnie przyjętą i znaną terminologię oraz procedury laboratoryjne i techniki chemii analitycznej, syntezy chemii organicznej, a także chemii medycznej i farmaceutycznej. Mogą być stosowane standardowe techniki w przypadku chemicznych syntez, analiz chemicznych, preparatyki farmaceutycznej, formulacji oraz podawania, jak również leczenia pacjentów.
Definicje
W znaczeniu tu używanym, następujące terminy - jeśli nie zaznaczono inaczej - będą miały następujące znaczenie:
Określenie „Ang-2” odnosi się do polipeptydu podanego na Fig. 6 w patencie nr US 6,166,185 („Tie-2 ligand-2”) lub jego fragmentów, jak również do pokrewnych polipeptydów, które obejmują odmiany allelowe, odmiany splicingowe, pochodne, odmiany wynikające z substytucji, delecji i/lub wst awienia, peptydy fuzyjne oraz polipeptydy, jak również międzygatunkowe homologi. Polipeptyd Ang-2 może - lecz nie musi - obejmować dodatkowe końcowe reszty, przykładowo, sekwencje lidera, sekwencje nakierowujące, amino-końcową metioninę, amino-końcowe reszty metioninową oraz lizynową i/lub sekwencję tag bądź sekwencje protein fuzyjnych, w zależności od sposobu jego wytwarzania.
Określenie „biologicznie aktywny” kiedy jest stosowane w przypadku Ang-2 lub środka specyficznie wiążącego Ang-2, odnosi się do peptydu lub polipeptydu posiadającego co najmniej jedną aktywność charakterystyczną dla Ang-2 lub dla środka specyficznie wiążącego Ang-2. Środek specyficznie wiążący Ang-2 może posiadać aktywność agonisty, antagonisty, albo aktywność neutralizującą lub blokującą, w odniesieniu do co najmniej jednej biologicznej aktywności Ang-2.
Określenie „środek specyficznie wiążący” odnosi się do cząsteczki, korzystnie do cząsteczki białkowej, która wiąże Ang-2 oraz do jej odmian i pochodnych, jak tu zdefiniowano, ze zwiększonym powinowactwem w porównaniu z innymi angiopoetynami. Środkiem specyficznie wiążącym może być proteina, peptyd, kwas nukleinowy, węglowodan, lipid lub związek o małym ciężarze cząsteczkowym, który wiąże się korzystnie z Ang-2. W korzystnym wykonaniu, środkiem specyficznie wiążącym według obecnego wynalazku jest peptyd lub ciało peptydowe, jak również ich fragmenty, odmiany lub pochodne, zarówno samodzielnie, jak i w kombinacji z innymi sekwencjami aminokwasowymi, wytworzone przy użyciu znanych technik. Techniki takie obejmują - lecz nie wyłącznie: enzymatyczne rozszczepienie, chemiczne rozszczepienie, syntezy peptydowe lub techniki rekombinacyjne. Środki specyficznie wiążące anty-Ang-2 według obecnego wynalazku są zdolne do wiązania części Ang-2, które modulują, przykładowo inhibitują lub promują, biologiczną aktywność Ang-2 i/lub innych aktywności związanych z Ang-2.
Określenie „odmiany” (warianty) w znaczeniu tutaj użytym, obejmują te z polipeptydów, w których reszty aminokwasowe są wstawione do, usunięte z- i/lub podstawione do występującej w naturze (lub co najmniej znanej) sekwencji aminokwasowej środka wiążącego. Odmiany według wynalazku obejmują proteiny fuzyjne, jak opisano poniżej.
Określenia „pochodne” obejmują te spośród środków wiążących, które zostały chemicznie zm odyfikowane w sposób inny niż odmiany ze wstawieniem, delecją lub substytucją.
Określenie „specyficznie wiąże Ang-2” odnosi się do zdolności środka specyficznie wiążącego (takiego jak ciało peptydowe lub jego część peptydowa) według obecnego wynalazku do rozpoznania oraz związania dojrzałego, o pełnej długości lub o częściowej długości, ludzkiego polipeptydu Ang-2 lub jego ortologa tak, że jego powinowactwo (jak to określono przez przykładowo, próby na powinowactwo ELISA lub próby BIAcore, tutaj opisane) lub jego zdolność do neutralizacji (jak to określono
PL 224 701 B1 przez, przykładowo, próby neutralizacji ELISA tutaj opisane, lub przy użyciu podobnych prób) jest co najmniej 10 razy większa, lecz ewentualnie 50 razy większa, 100, 250 lub 500 razy większa, a nawet co najmniej 1000 razy większa w porównaniu z powinowactwem lub zdolnością do neutralizacji tego środka względem dowolnej innej angiopoetyny lub innego peptydu lub polipeptydu, gdzie część peptydową ciała peptydowego najpierw przyłącza się do ludzkiego ugrupowania Fc celem przeprowadzenia oceny w takiej próbie.
Określenie „epitop” odnosi się do tej części dowolnej cząsteczki, która jest zdolna do rozpoznawania przez oraz zdolna do wiązania ze środkiem specyficznie wiążącym, przykładowo, ciałem pept ydowym, w jednym lub więcej niż jednym obszarze środka wiążącego, wiążącym antygen. Epitopy zwykłe składają się z chemicznie aktywnych powierzchniowych ugrupowań występujących w cząsteczkach, takich jak, przykładowo, aminokwasowe lub węglowodanowe boczne łańcuchy i posiadają specyficzne, trójwymiarowe właściwości strukturalne, jak również specyficzną charakterystykę ładunku. Epitopy w znaczeniu tutaj użytym mogą być przyległe wzajemnie do siebie lub nieprzyległe.
Określenie „inhibitujący i/lub neutralizujący epitop” oznacza epitop, który kiedy jest związany ze specyficznym środkiem wiążącym takim jak ciało peptydowe, powoduje utratę (lub co najmniej obniżenie) aktywności biologicznej cząsteczki, komórki lub organizmu zawierającego taki epitop, in vivo, in vitro, lub in situ. W kontekście według obecnego wynalazku, zobojętniający epitop jest umiejscowiony w, lub związany z biologicznie aktywnym obszarem Ang-2. Alternatywnie, określenie „aktywujący epitop” jest epitopem, który - kiedy jest związany ze środkiem specyficznie wiążącym według wynalazku, takim jak przeciwciało - powoduje aktywację lub co najmniej zachowanie (utrzymanie) aktywnej biologicznej konformacji Ang-2.
Określenie „fragment ciała peptydowego” odnosi się do peptydu lub polipeptydu, który zawiera mniej niż kompletne, nienaruszone ciało peptydowe.
Określenie „występujący w naturze”, odnośnie materiałów biologicznych, takich jak cząsteczki kwasu nukleinowego, polipeptydy, komórki gospodarza oraz tym podobne, dotyczy postaci występujących w naturze i które nie zostały zmodyfikowane przez człowieka.
Określenie „wyizolowany”, w odniesieniu do Ang-2 lub do środka specyficznie wiążącego Ang-2, oznacza związek wolny od co najmniej jednego zanieczyszczającego polipeptydu lub związku, który występuje w swoim naturalnym środowisku, a korzystnie jest zasadniczo wolny od innych zanieczyszczających ssaczych polipeptydów, które mogłyby zakłócać jego terapeutyczne lub diagnostyczne zastosowanie.
Określenie „dojrzały”, w odniesieniu do ciała peptydowego Ang-2 lub jego fragmentu, lub do dowolnego innego proteinowego środka specyficznie wiążącego Ang-2, dotyczy peptydu lub polipeptydu bez sekwencji liderowej lub sygnałowej. Gdy ekspresjonuje się środek wiążący według wynala zku, przykładowo w prokariotycznej komórce gospodarza, „dojrzały” peptyd lub polipeptyd może także zawierać dodatkowe reszty aminokwasowe (lecz nadal nie będzie zawierać sekwencji liderowej), takie jak amino-końcowa metionina lub jedna, bądź więcej niż jedna reszta metioninowa oraz lizynowa. Wytwarzany w ten sposób peptyd lub polipeptyd może być wykorzystywany łącznie z tymi dodatkowymi resztami aminokwasowymi lub bez tych usuniętych reszt.
Określenia „skuteczna ilość” oraz „terapeutycznie skuteczna ilość”, w odniesieniu do środka specyficznie wiążącego Ang-2, oznacza ilość środka specyficznie wiążącego, która jest przydatna lub konieczna do spowodowania obserwowalnej zmiany poziomu jednej lub więcej niż jednej biologicznej aktywności Ang-2. Zmiana może oznaczać zwiększenie lub obniżenie poziomu aktywności Ang-2. Korzystnie, zmiana oznacza obniżenie aktywności Ang-2.
Określenie „ciało peptydowe” odnosi się do cząsteczki obejmującej domenę przeciwciała Fc połączonej z co najmniej jednym peptydem. Wytwarzanie ciał peptydowych opisano generalnie w publikacji PCT WO 00/24782, wydanej 4 maja 2000 roku.
Określenie „odmiany”, w znaczeniu tutaj użytym, obejmuje cząsteczki takie jak peptydy lub kombinacje peptyd-podłoże, takie jak ciała peptydowe według obecnego wynalazku, w których reszty aminokwasowe wstawiono do, usunięto z - i/lub podstawiono w sekwencji aminokwasowej tych cząsteczek. Odmiany posiadające jeden lub więcej niż jeden wstawiony aminokwas obejmują proteiny fuzyjne, jak opisano poniżej.
Określenie „fragment” odnosi się do peptydu lub kombinacji peptyd-podłoże, który obejmuje mniej niż sekwencję aminokwasową o pełnej długości takich peptydów i/lub kombinacji peptydpodłoże. Taki fragment może powstać, przykładowo, w wyniku obcięcia przy końcu aminowym, obcięcia przy końcu karboksy i/lub w wyniku wewnętrznego usunięcia reszty (reszt) z sekwencji aminokwa28
PL 224 701 B1 sowej peptydu lub kombinacji peptyd-podłoże. Fragmenty mogą być wynikiem splicingu alternatywnego RNA lub działania proteazy in vivo lub in vitro. Fragmenty takie można także konstruować chemicznymi metodami peptydowej syntezy lub przez modyfikowanie polinukleotydu kodującego peptyd, kombinację peptyd-podłoże lub część Fc i/lub część peptydu ciała peptydowego.
Określenie „Fc” odnosi się do jednego rodzaju podłoża według obecnego wynalazku i obejmuje sekwencję fragmentu niewiążącego antygenu otrzymanego w wyniku trawienia całego przeciwci ała, niezależnie czy w formie monomerycznej czy też multimerycznej. Źródłem Fc w obecnym w ynalazku jest korzystnie w pełni ludzka domena Fc i może nią być domena dowolnej immunoglob uliny, aczkolwiek IgG1 oraz IgG2 są korzystne. Jednakże, cząsteczki F c, które są częściowo lud zkie lub otrzymane z nie-ludzkich gatunków, także są tutaj włączone. Cząsteczki Fc zbudowane są z monomerycznych polipeptydów, które mogą być połączone w formy dimeryczne lub multim eryczne przez połączenia kowalencyjne (to znaczy, przez wiązania dwusiarczkowe) oraz nie kowalencyjne. Ilość wewnątrzcząsteczkowych wiązań dwusiarczkowych między monomerycznymi podjednostkami natywnych cząsteczek Fc zawiera się w przedziale od 1 do 4, w zależności od klasy (przykładowo, IgG, IgA, IgE) lub podklasy (przykładowo, IgG 1, IgG2, IgG3, IgA1, IgGA2). Jednym z przykładów natywnej Fc jest połączony wiązaniem dwusiarczkowym dimer, otrzymywany w wyniku trawienia IgG papainą [patrz Ellison i wsp., (1982), Nucl. Acids. Res. 10: 4071-9], Określenie „natywna domena Fc” w znaczeniu tutaj używanym jest określeniem rodzajowym dla postaci monomerycznej, dimerycznej oraz multimerycznej.
Określenie „domena Fc” obejmuje cząsteczki oraz sekwencje natywnej domeny Fc i odmiany Fc, zdefiniowane powyżej. Podobnie jak w przypadku odmian Fc oraz natywnych domen Fc, określenie „domena Fc” obejmuje cząsteczki w postaci monomerycznej lub multimerycznej, zarówno wytrawione z całego przeciwciała, jak i wytworzone w inny sposób.
Określenie „multimer” stosowane w stosunku do domen Fc lub cząsteczek zawierających domeny Fc, odnosi się do cząsteczek zawierających dwa lub więcej niż dwa łańcuchy polipeptydowe, połączone przez oddziaływania kowalencyjne, niekonwalencyjne lub zarówno kowalencyjnie oraz niekowalencyjnie. Cząsteczki IgG typowo tworzą dimery; IgM, pentamery; IgD, dimery; zaś IgA, m onomery, dimery, trimery lub tetramery. Multimery mogą powstawać w wyniku wykorzystania sekwencji oraz wynikającej z nich aktywności natywnego Ig źródła domeny Fc lub w wyniku derywatyzacji (zgodnie z podaną tu definicją) takiej natywnej domeny Fc.
Określenie „dimer” stosowane w odniesieniu do domen Fc lub cząsteczek zawierających domeny Fc odnosi się do cząsteczek posiadających dwa łańcuchy polipeptydowe połączone kowalencyjnie lub niekowalencyjnie.
Określenie „podłoże” odnosi się do cząsteczki, która zapobiega degradacji i/lub zwiększa okres pół-trwania, redukuje toksyczność, redukuje immunogeniczność lub zwiększa biologiczną aktywność proteiny terapeutycznej. Przykładowe podłoża obejmują domenę Fc, jak również liniowy polimer (przykładowo, glikol polietylenowy (PEG), polilizynę, dekstran, itd.); polimer o rozgałęzionym łańcuch u (patrz, przykładowo, patent nr US 4,289,872 na rzecz Denkenwalter'a i wsp., wydany 15 września 1981 roku; patent nr US 5,229,490 na rzecz Tam, wydany 20 lipca 1993 roku; broszura WO 93/21259 autorstwa Frechet i wsp., opublikowana 28 października 1993 roku); lipid; grupę cholesterolową (taką jak steroid); węglowodan lub oligosacharyd; lub dowolną naturalną lub syntetyczną proteinę, polipeptyd lub peptyd, który wiąże się z receptorem ratunkowym. Podłoża opisano dalej poniżej.
Określenia „derywatyzowanie” oraz „pochodna” lub „zderywatyzowany” wiążą się z procesami oraz z uzyskiwanymi w wyniku tych procesów związkami, w których, odpowiednio, (1) związek posiada część cykliczną; przykładowo, w wyniku sieciowania między resztami cysteinylowymi w obrębie danego związku; (2) związek jest usieciowany lub ma miejsce sieciowania; przykładowo, związek ma resztę cysteinylową, a tym samym tworzy usieciowane dimery w hodowli lub in vivo; (3) jedno lub więcej niż jedno wiązanie peptydylowe jest zastąpione wiązaniem niepeptydylowym; (4) N-koniec jest zastąpiony przez -NRR1, NRC(O)R1, -NRC(O)OR1, -NRS(O)2R1, -NHC(O)NHR, grupę sukcynimidową, bądź podstawioną lub niepodstawioną grupę benzyloksykarbonylo-NH-, gdzie R oraz R1 oraz podstawniki przy pierścieniach mają znaczenie podane niżej; (5) C-koniec jest zastąpiony przez -C(O)R2 lub -NR3R4, gdzie R2, R3 oraz R4 mają znaczenie podane niżej; a także (6) związki, w których indywidualne ugrupowania aminokwasowe zmodyfikowano przez obróbkę przy użyciu środków zdolnych do reakcji z wybranymi łańcuchami bocznymi lub z resztami końcowymi. Pochodne opisano dalej poniżej.
PL 224 701 B1
Określenie „peptyd” odnosi się do cząsteczek liczących około 3 do około 75 aminokwasów, korzystnie do cząsteczek od około 5 do 50 aminokwasów, korzystniej 8 do 40, a najkorzystniej do cząsteczek od około 10 do 25 aminokwasów. Peptydy mogą być sekwencjami aminokwasowymi pochodzenia naturalnego lub sztucznymi (to znaczy, nie mającymi pochodzenia naturalnego). Przykładowe peptydy mogą być generowane dowolnymi sposobami podanymi tutaj, takimi jak realizowane z użyciem biblioteki peptydowej (przykładowo, biblioteka prezentacji fagowej), generowane na drodze chemicznych syntez lub mogą pochodzić z wytrawiania protein, lub być generowane przy użyciu technik rekombinacyjnego DNA.
Określenie „farmakologicznie aktywna” oznacza, że ustalono, iż substancja tak określona posiada aktywność, która wpływa na parametr medyczny (przykładowo, ciśnienie krwi, ilość k omórek krwi, poziom cholesterolu) lub stan chorobowy (przykładowo, rak, zaburzenia autoimmun ologiczne, etc.).
Określenia „peptyd antagonista” lub „peptyd inhibitorowy” odnoszą się do peptydu, który blokuje lub w pewien sposób wpływa na aktywność biologiczną pokrewnej badanej proteiny lub posiada biologiczną aktywność porównywalną z aktywnością znanego antagonisty lub inhibitora pokrewnej badanej proteiny. A więc, określenie „peptyd antagonista-Ang-2” obejmuje peptydy, które mogą być identyfikowane jako posiadające właściwości antagonistyczne względem Ang-2 lub można im takie własności przypisać.
Ponadto, fizjologiczne dopuszczalne sole związków według obecnego wynalazku są także objęte tym wynalazkiem. Przez określenie „fizjologiczne dopuszczalne sole” należy rozumieć dowolne sole, które są znane lub które zostaną później odkryte, jako będące solami farmaceutycznie dopus zczalnymi. Kilka specyficznych przykładów to: octan; trifluorooctan; chlorowcowodory, takie jak chlorowodorek oraz bromowodorek; siarczan; cytrynian; winian; glikolan; a także szczawian, mesylan oraz fosforan.
Ciała peptydowe
W pewnym aspekcie obecny wynalazek odnosi się do uzyskiwania ciał peptydowych Ang-2. Oddziaływanie ligandu proteinowego z jego receptorem często ma miejsce na względnie dużej powierzchni styku. Jednakże, jak to zaprezentowano w przypadku ludzkiego hormonu wzrostu oraz jego receptora, tylko kilka kluczowych reszt na powierzchni styku ma największy wkład w energię wiązania. Clackson i wsp., Science 267: 383-6 (1995). Cała struktura objętościowa ligandu proteinowego jedynie prezentuje epitopy wiążące w prawidłowej topologii lub służy funkcjom niezwiązanych z wiązaniem. Zatem, cząsteczki jedynie o „peptydowej” długości (generalnie 2 do 40 aminokwasów) mogą wiązać się z proteiną receptorową danego dużego ligandu proteinowego. Takie peptydy mogą naśladować bioaktywność dużego ligandu proteinowego („agoniści peptydowi”) lub przez wiązanie konkurujące - inhibitować bioaktywność dużego ligandu proteinowego („antagoniści peptydowi”).
Technologia prezentacji fagowej pojawiła się jako mający duże znaczenie sposób identyfikowania takich agonistów oraz antagonistów peptydowych. Patrz, przykładowo, Scott i wsp., Science 249: 386 (1990); Devlin i wsp., Science 249: 404 (1990); patent nr US 5,223,409, wydany 29 czerwca 1993 r.; patent nr US 5,733,731, wydany 31 marca 1998 r.; patent nr US 5,498,530, wydany 12 marca 1996 r.; patent nr US 5,432,018, wydany I lipca 1995 r.; patent nr US 5,338,665, wydany 16 sierpnia 1994 r.; patent nr US 5,922,545, wydany 13 lipca 1999 r.; broszura WO 96/40987, opublikowana 19 grudnia 1996 r.; oraz broszura WO 98/15833, opublikowana 16 kwietnia 1998 r. (każda z tych pozycji jest tutaj włączona jako odnośnik literaturowy). W peptydowych bibliotekach prezentacji fagowej, losowe sekwencje peptydowe można prezentować dzięki fuzji z proteinami pokrywającymi włóknisty fag. Prezentowane peptydy mogą być eluowane na zasadzie powinowactwa, jeśli zachodzi potrzeba wobec immobilizowanej za pomocą przeciwciała zewnątrzkomórkowej domeny receptora. Zatrzymany fag może być wzbogacony w wyniku przeprowadzenia kolejnych rund oczyszczania z powinowactwem oraz repropagacji. Najlepiej wiążące peptydy mogą być sekwencjonowane w celu identyfikacji kluczowych reszt w obrębie jednej lub więcej niż jednej strukturalnie pokrewnych rodzin peptydów. Patrz, przykładowo, Cwirla i wsp., Science 276: 1696-9 (1997), gdzie zidentyfikowano dwie różne rodziny. Sekwencje peptydowe mogą również sugerować, które reszty mogą być bezpiecznie zamienione przez skaning alaninowy lub w wyniku mutagenezy na poziomie DNA. Biblioteki mutagenezy mogą być kreowane oraz skrinowane do dalszej optymalizacji sekwencji najlepszych środków wiążących. Lowman, Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26: 401-24 (1997).
Analiza strukturalna oddziaływania proteina-proteina również może być wykorzystana do sugerowania peptydów udających aktywność wiążącą dużych ligandów proteinowych. W takich analizach, struktura
PL 224 701 B1 krystaliczna może sugerować identyczność oraz względną orientację krytycznych reszt dużego ligandu proteinowego, a na tej podstawie można zaprojektować peptyd. Patrz, przykładowo, Takasaki i wsp., Naturę Biotech 15: 1266-70 (1997). Te metody analityczne również mogą być wykorzystane do badania oddziaływania między proteiną receptorową a peptydami wybranymi przez prezentację fagową, co może sugerować dalszą modyfikację peptydów pod kątem zwiększenia powinowactwa do wiązania.
Inne metody konkurują z metodą prezentacji fagowej w badaniach nad peptydami. Biblioteka peptydowa może być połączona fuzyjnie z końcem karboksylowym represora Iac oraz ekspresjonowana w E. coli. Inna metoda oparta na wykorzystaniu E. coli umożliwia prezentację na zewnętrznej powierzchni błony komórkowej dzięki fuzji ze związaną z peptydoglikanem lipoproteiną (PAL). W obecnej dokumentacji, te oraz pokrewne im sposoby wspólnie określono jako „prezentację na
E. coli”. W innej metodzie, translacja losowego RNA jest zatrzymana przed wydzieleniem rybosomu, co daje bibliotekę polipeptydów z przyłączonymi do nich ich odpowiednimi kwasami RN A. W niniejszej dokumentacji, ta oraz pokrewne jej metody są określone wspólnie jako „prezentacja rybosomowa.” Inne metody wykorzystują chemiczne połączenie peptydów z RNA. Patrz, przykładowo, Roberts i Szostak, Proc Natl Acad Sci USA, 94: 12297-303 (1997). W niniejszej dokumentacji, tę oraz pokrewne metody wspólnie określono mianem „skrining układu RNA-peptyd”. Opracowano także biblioteki peptydów wyprowadzone chemicznie, w których peptydy są unieruchamiane na stabilnych, niebiologicznych materiałach, takich jak pręty polietylenowe lub żywice przepuszczające rozpuszczalnik. Inna biblioteka peptydów wyprowadzona chemicznie wykorzystuje fotolitografię w celu skanowania peptydów unieruchomionych na szklanych płytkach. W niniejszej dokumentacji te oraz pokrewne metody są wspólnie określone jako „chemiczny skrining peptydów”. Chemiczny skrining peptydów może być korzystny z tego względu, że pozwala wykorzystywać D-aminokwasy oraz inne nie występujące w naturze analogi, jak również elementy nie-peptydowe. Zarówno biologiczne, jak i chemiczne metody są omówione w przeglądzie Wells'a & Lowman'a (1992), Curr. Opin. Biotechnol, 3: 355-62.
Konceptualnie, można odkryć mimetyki peptydowe dowolnego białka stosując metodę prezentacji fagowej oraz inne metody wyżej wymienione. Metody te stosowano do mapowania epit opów, w celu identyfikacji krytycznych aminokwasów w oddziaływaniach proteina-proteina oraz jako prowadzące do odkrywania nowych środków terapeutycznych. Patrz, przykładowo, Cortese i wsp., Curr. Opin. Biotech. 7: 616-21 (1996). Biblioteki peptydowe są obecnie najczęściej stosowane w badaniach immunologicznych, takich jak mapowanie epitopów. Patrz Kreeger, The Scientist 10(13): 19-20 (1996).
Peptydy zidentyfikowane metodą skriningu prezentacji fagowej uważano jako „prowadzące” do opracowania środków terapeutycznych raczej niż jako środki terapeutyczne same w sobie. Podobnie jak inne proteiny oraz peptydy, najprawdopodobniej powinny być szybko usuwane in vivo poprzez filtrację nerkową, mechanizmy komórkowego oczyszczania w systemie siateczki śródbłonkowej lub przez proteolityczną degradację [Francis, (jak wyżej)]. W wyniku tego, w stanie techniki obecnie stos uje się peptydy w celu potwierdzania celów leków lub jako rusztowanie dla projektowania związków organicznych, które nie mogłyby być tak łatwo lub tak szybko zidentyfikowane przez skrining bibliotek chemicznych [Lowman, (jak wyżej); Kay i wsp., (jak wyżej)]. W tej dziedzinie techniki powinny wystąpić korzyści z procesu, w wyniku którego takie peptydy mogłyby łatwo prowadzić do środków terapeutycznych przeciwko angiogenezie.
Struktura ciał peptydowych
W substancjach wytworzonych zgodnie z obecnym wynalazkiem peptyd może być połączony z podłożem poprzez N-koniec lub C-koniec peptydu . Zatem cząsteczce podłoże-peptyd według obecnego wynalazku można przypisać pięć następujących wzorów oraz następujące ich multimery:
(X1)a-F1-(X2)b (Wzór I)
X1-F1 (Wzór II)
F1-X2 (Wzór III)
F1-(L1)c-P1 (Wzór IV)
F1-(L1)c-P1-(L2)d-P2 (Wzór V)
gdzie:
- F1 oznacza podłoże (korzystnie domenę Fc);
PL 224 701 B1
- X1 oraz X2 jest niezależnie wybrany z grupy obejmującej -(L1)c-P1], -(L1)c-P1(L2)d-P2, -(L1)cP1-(L2)d-P2-(Ls)e-P3, oraz -(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)f-P4;;
- P1, P2, P3 oraz P4 - każdy niezależnie, oznacza sekwencje farmakologicznie aktywnych peptydów, tu opisanych;
- L1, L2, L3 oraz L4 - każdy niezależnie, jest linkerem; zaś
- „a”, „b”, „c”, „d”, „e” oraz „f” - każdy niezależnie, oznacza 0 lub 1, z tym zastrzeżeniem, że co najmniej jeden spośród „a” oraz „b” oznacza 1.
Peptydy
Obecny wynalazek uwzględnia peptydy, które selektywnie lub specyficznie wiążą się z Ang-2. Dowolna ilość takich peptydów może być stosowana w związku z obecnym wynalazkiem. Prezentacja fagowa w szczególności, jest przydatna w generowaniu peptydów do stosowania według obecnego wynalazku, ponieważ wykazano, że selekcja z powinowactwem z bibliotek losowych peptydów może być stosowana do identyfikowania ligandów peptydowych dla dowolnego miejsca dowolnego produktu genowego. Dedman i wsp., J. Biol. Chem. 268: 23025-30 (1993).
Peptydy według obecnego wynalazku mogą być wytwarzane dowolną metodą ujawnioną w stanie techniki. W dokumentacji stosowane są jednoliterowe skróty nazw aminokwasów. Oznaczenie „X” w dowolnej sekwencji (i w całym obecnym opisie wynalazku, jeżeli nie zaznaczono inaczej w szczególnym przypadku) oznacza, że może w danej pozycji występować dowolna z 20 występujących w naturze reszt aminokwasowych lub dowolny z niewystępujących w naturze aminokwasów (opisanych poniżej w rozdziale „Odmiany”). Dowolny z tych peptydów może być połączony w tandem (to znaczy, kolejno), z linkerami lub bez linkerów, a przykłady peptydów połączonych w tandem zebrano w tablicy. Linkery reprezentuje symbol „L” i mogą to być dowolne spośród linkerów tutaj opisanych. Powtórzenia tandemowe oraz linkery wyodrębniono we wzorach myślnikami, dla jasności. Dowolny z peptydów zawierających resztę cysteinylową może być usieciowany (połączony) z innym peptydem zawierającym Cys, z których każdy lub oba mogą być połączone z podłożem. Dowolny z peptydów posiadających więcej niż jedną resztę Cys może również tworzyć wewnątrzcząsteczkowe dwusiarc zkowe wiązanie. Dowolny z tych peptydów może być zderywatyzowany, tak jak tutaj opisano. W przypadku pochodnych, w których koniec karboksylowy może być zabezpieczony grupą aminową, zabezpieczającą grupą aminową stanowiącą „kapturek” jest grupa -NH2. W przypadku pochodnych, w których reszty aminokwasowe są podstawione innymi ugrupowaniami niż reszty aminokwasowe, substytucje oznaczono jako „S”, które to określenie oznacza dowolne z ugrupowań opisanych w: Bhatnagar i wsp., J. Med. Chem. 39: 3814-9 (1996), oraz Cuthbertson i wsp., J. Med. Chem. 40: 2876-82 (1997), które to pozycje włączono tu jako odnośniki literaturowe. Wszystkie peptydy są połączone przez wiązanie peptydowe, jeżeli nie zaznaczono inaczej.
Podłoża
W jednym z wykonań, obecny wynalazek zapewnia co najmniej jeden peptyd, który jest połączony z co najmniej jednym podłożem (F1, F2) przez N-koniec, C-koniec lub łańcuch boczny jednej z reszt aminokwasowych peptydu(ów). Można także stosować wielość podłoży; przykładowo Fc na każdym końcu lub Fc na jednym końcu oraz grupę PEG na drugim końcu lub przy łańcuchu bocznym.
Domena Fc jest jednym z korzystnych podłoży. Domena Fc może być przyłączona do końców N lub C peptydów, bądź do obu końców N i C.
Jak wyżej zauważono, odmiany domen Fc są korzystnymi podłożami w świetle obecnego wyn alazku. Natywna Fc może być ekstensywnie modyfikowana tworząc odmianę Fc zgodnie z obecnym wynalazkiem, pod warunkiem utrzymania wiązania z receptorem ratunkowym. Patrz, przykładowo WO 97/34631 oraz WO 96/32478. W takich odmianach Fc, można usunąć jedno lub więcej niż jedno z miejsc natywnej Fc, które zapewnia strukturalne własności lub aktywność funkcyjną niewymagane dla cząsteczek fuzyjnych według obecnego wynalazku. Można usunąć te miejsca przez, przykładowo podstawienie lub usunięcie reszt, wstawienie reszt do miejsca lub przez obcięcie części zawierającej dane miejsce. Wstawionymi lub podstawionymi resztami mogą być także zamienione aminokwasy, takie jak peptydomimetyki lub D-aminokwasy. Odmiany Fc mogą być pożądane z wielu powodów, z których kilka opisano poniżej. Przykładowe odmiany Fc obejmują cząsteczki i sekwencje w których:
1. Usunięto miejsca obejmujące zaangażowane w tworzenie wiązania dwusiarczkowego. T akie usunięcie pozwala uniknąć reakcji z innymi proteinami zawierającymi cysteinę, obecn ymi w komórce gospodarza stosowanej do wytwarzania cząsteczek związków według wynalazku. W tym celu, segment zawierający cysteinę w N-końcu, może być obcięty lub reszty
PL 224 701 B1 cysteinowe mogą być usunięte lub podstawione innymi aminokwasami (przykładowo resztą alanylową, serylową). Nawet jeśli usunie się reszty cysteinowe, jednołańcuchowe domeny Fc ciągle mogą tworzyć dimeryczną domenę Fc, która jest spajana niekowalencyjnie.
2. Natywna Fc jest zmodyfikowana w ten sposób, że jest bardziej kompatybilna z wybraną komórką gospodarza. Przykładowo, można usunąć sekwencję PA blisko N-końca typowej natywnej Fc, która może być rozpoznawana przez trawiący enzym w E. coli, taki jak iminopeptydaza prolinowa. Można również dodać N-końcową resztę metionylową, w szczególności kiedy cząsteczka jest ekspresjonowana rekombinacyjnie w komórce bakteryjnej, takiej jak E. coli.
3. Usunięto część N-końcową natywnej Fc w celu zapobieżenia N-końcowej heterogeniczności podczas ekspresjonowania w wybranej komórce gospodarza. W tym celu, można usunąć dowolną z pierwszych 20 reszt aminokwasowych na N-końcu, w szczególności te w pozycjach 1, 2, 3, 4 oraz 5.
4. Usunięto jedno lub więcej niż jedno miejsce glikozylacji. Reszty, które są typowo glikozylowane (przykładowo, asparagina) mogą nadawać zdolność odpowiedzi cytolitycznej. Takie reszty mogą być usunięte lub podstawione nieglikozylowanymi resztami (przykładowo, alaniną).
5. Usunięto miejsca zaangażowane w oddziaływanie z komplementem, takie jak miejsce wiążące C1q. Przykładowo, można usunąć lub podstawić sekwencję EKK ludzkiej IgG 1. Wybór (rekrutacja) i wiązanie komplementu może nie być korzystne dla cząsteczek według obecnego wynalazku, czego można uniknąć stosując taką odmianę Fc.
6. Usunięto miejsca, które wpływają na wiązanie z innymi receptorami Fc niż receptor ratunkowy. Natywna Fc może posiadać miejsca oddziaływania z pewnymi białymi ciałkami krwi, które nie są wymagane w przypadku cząsteczek fuzyjnych według obecnego wynalazku, a zatem miejsca te mogą być usunięte.
7. Usunięto miejsce ADCC. Miejsca ADCC znane są w stanie techniki. Patrz, przykładowo, Molec. Immunol. 29 (5):633-9 (1992) w odniesieniu do miejsc ADCC w IgG1. Miejsca te, również, nie są wymagane dla cząsteczek fuzyjnych według obecnego wynalazku, a zatem także mogą być usunięte.
8. Jeżeli natywna Fc pochodzi z nie-ludzkiego przeciwciała, natywna Fc może być humanizowana. Typowo, by humanizować natywną Fc, można podstawić wybrane reszty w nieludzkiej natywnej Fc resztami, które normalnie występują w ludzkiej natywnej F c. Techniki humanizowania przeciwciała są dobrze znane w sztuce.
Alternatywnym podłożem powinna być proteina, polipeptyd, peptyd, przeciwciało, fragment przeciwciała lub mała cząsteczka (przykładowo, związek peptydomimetyczny), zdolne do wiązania z receptorem ratunkowym. Przykładowo, jako podłoże można by stosować polipeptyd opisany w patencie nr US 5,739,277, wydanym 14 kwietnia 1998 r. na rzecz Presta i wsp. Peptydy mogłyby być także wybrane metodą prezentacji fagowej pod kątem wiązania z receptorem ratunkowym FcRn. T akie związki wiążące receptor ratunkowy są także objęte określeniem „podłoże” i są włączone w zakres obecnego ujawnienia. Takie podłoża powinny być wybrane w celu zwiększenia czasu pół-trwan ia (przykładowo, przez unikanie sekwencji rozpoznawanych przez proteazy) oraz obniżenia immunogeniczności (przykładowo, przez dawanie pierwszeństwa sekwencjom nie-immunogenicznym, jak to odkryto w przypadku humanizowania przeciwciał).
Jak powyżej zauważono, podłoża polimerowe można także przyłączyć do F1 oraz F2. Różne sposoby przyłączania ugrupowań chemicznych przydatnych jako podłoża są obecnie dostępne, patrz przykładowo zgłoszenie patentowe PCT, międzynarodowa publikacja nr WO 96/11953, zatytułowana „Chemicznie modyfikowane N-końcowe kompozycje proteinowe oraz sposoby” („N-Terminally Chemically Modified Protein Compositions and Methods”), włączona tutaj w całości jako odnośnik literaturowy. Ta publikacja PCT ujawnia, pośród innych zagadnień, selektywne przyłączanie rozpuszczalnych w wodzie polimerów do N-końców protein.
Korzystnym podłożem polimerycznym jest glikol polietylenowy (PEG). Grupa PEG może mieć dogodną masę cząsteczkową i może być liniowa lub rozgałęziona. Zakres masy cząsteczkowej PEG będzie korzystnie zawierał się w przedziale od około 2 kiloDaltonów („kDa”) do około 100 kDa, korzystniej od około 5 kDa do około 50 kDa, najkorzystniej od około 5 kDa do około 10 kDa. Grupy PEG będą, generalnie, przyłączone do związków według wynalazku w wyniku acylowania lub redukcyjnego alkilowania przez reaktywną grupę w ugrupowaniu PEG (przykładowo, przez grupę aldehydową, amiPL 224 701 B1 nową, tiolową, estrową) z reaktywną grupą badanego związku (przykładowo, grupą aldehydową, am inową, lub estrową).
Przydatna strategia PEGylowania syntetycznego peptydu polega na połączeniu przez utworzenie w roztworze wiązania sprzęgającego peptyd i resztę PEG, gdzie któryś z elementów ma specjalną grupę funkcyjną reaktywną względem grupy funkcyjnej drugiego członu. Peptydy można łatwo wytwarzać stosując konwencjonalne syntezy w fazie stałej, co jest znane w stanie techniki. Peptydy są „wstępnie aktywowane” w obrębie odpowiedniej grupy funkcyjnej w specyficznym miejscu. Prekursory oczyszcza się i całkowicie charakteryzuje przed reakcją z ugrupowaniem PEG. Ligowanie peptydu z PEG zwykle ma miejsce w fazie wodnej i może być łatwo monitorowane metodą analitycznej HPLC z odwróconymi fazami. PEGylowane peptydy można łatwo oczyszczać metodą preparatywnej HPLC i charakteryzować metodą analitycznej HPLC, analizą aminokwasową oraz metodą laserowej desorpcyjnej spektrometrii masowej.
Polimery polisacharydowe są innym rodzajem rozpuszczalnego w wodzie polimeru, który może być stosowany do modyfikacji proteiny. Dekstrany są polisacharydowymi polimerami zawierającymi poszczególne podjednostki glukozy, przeważnie połączone wiązaniami a1-6. Dekstran dostępny jest w szerokim zakresie mas cząsteczkowych i jest łatwo dostępny w postaci o masie cząsteczkowej od około 1 kDa do około 70 kDa. Dekstran jest polimerem rozpuszczalnym w wodzie, odpowiednim do stosowania zgodnie z obecnym wynalazkiem jako podłoże w zarówno samodzielnie, jak i w połączeniu z innym podłożem (przykładowo, Fc). Patrz, przykładowo, WO 96/11953 oraz WO 96/05309. O stosowaniu dekstranu sprzężonego z terapeutycznymi lub diagnostycznymi immunoglobulinami doniesiono wcześniej, patrz przykładowo w europejskiej publikacji patentowej nr EP 0 315 456, która jest włączona tutaj jako odnośnik literaturowy. Dekstran od około 1 kDa do około 20 kDa jest korzystny, jeżeli dekstran jest stosowany jako podłoże zgodnie z obecnym wynalazkiem.
Linkery „Linker” jest grupą ewentualną. Jeżeli występuje, jego chemiczna struktura nie ma decydującego znaczenia, ponieważ służy przede wszystkim do przestrzennego rozsunięcia innych członów. Linker korzystnie zbudowany jest z aminokwasów połączonych wiązaniami peptydowymi. A zatem, w korzystnych wykonaniach, linker zbudowany jest z od 1 do 20 aminokwasów połączonych wiązaniami peptydowymi, gdzie aminokwasy wybrano spośród 20 występujących w naturze aminokwasów. Jeden lub więcej niż jeden z tych aminokwasów może być glikozylowany, co jest dobrze zrozumiałe dla biegłego w sztuce. W bardziej korzystnym wykonaniu, od 1 do 20 aminokwasów wybrano spośród glicyny, alaniny, proliny, asparaginy, glutaminy oraz lizyny. W jeszcze bardziej korzystnym wykonaniu, linker zbudowany jest w większości z aminokwasów, które nie stanowią zawady przestrzennej, takich jak glicyna oraz alanina. Zatem, korzystnymi linkerami są poliglicyny (w szczególności (Gly) 5, (Gly)8), poli(Gly-Ala) oraz polialaniny. Korzystne są także kombinacje Gly oraz Ala, takie jak linker oznaczony tu symbolem K1 oraz posiadające sekwencje aminokwasowe podane tu w przykładach.
Nie-peptydowe linkery są również możliwe. Przykładowo, mogą być stosowane linkery alkilowe takie jak -NH-(CH2)s-C(O)-, gdzie s = 2-20. Powyższe linkery alkilowe można dalej podstawiać dowolną grupą nie stanowiącą zawady przestrzennej, taką jak niższy alkil (przykładowo, C1-C6) niższy acyl, chlorowiec (przykładowo, Cl, Br), CN, NH2, fenyl, etc. Przykładowym nie-peptydowym linkerem jest linker PEG, mający masę cząsteczkową od 100 do 5000 kDa, korzystnie od 100 do 500 kDa. Linkery peptydowe można modyfikować tworząc pochodne w taki sam sposób jak wyżej opisano.
Odmiany i pochodne
Odmiany i pochodne środków specyficznie wiążących objęte są zakresem obecnego ujawnienia. Odmiany obejmują formy insercyjne, delecyjne i/lub substytucyjne. Jest zrozumiałe, że szczególny środek specyficznie wiążący według obecnego ujawnienia może obejmować jeden, dwa lub wszystkie trzy rodzaje odmian. Odmiany insercyjne oraz substytucyjne mogą zawierać naturalne aminokwasy, niekonwencjonalne aminokwasy (jak podano poniżej) lub oba ich rodzaje.
W pewnym wykonaniu, zapewnione są odmiany insercyjne, gdzie jedna lub więcej niż jedna z reszt aminokwasowych, zarówno występujących w naturze lub niekonwencjonalnych aminokwasów, uzupełnia sekwencję aminokwasową peptydu lub ciała peptydowego. Insercje mogą być umiejscowi one na dowolnym lub obu końcach proteiny, bądź mogą być umiejscowione w obrębie wewnętrznych obszarów sekwencji aminokwasowej ciała peptydowego. Odmiany insercyjne z dodatkowymi resztami na jednym lub obu końcach mogą, przykładowo, obejmować proteiny fuzyjne oraz proteiny zawierające aminokwasowe tagi lub znaczniki. Odmiany insercyjne obejmują peptydy oraz ciała peptydowe,
PL 224 701 B1 gdzie jedna lub więcej niż jedna z reszt aminokwasowych jest dodana do sekwencji aminokwasowej peptydu lub ciała peptydowego, lub ich fragmentów.
Wariantowe produkty według obecnego ujawnienia obejmują także dojrzałe peptydy oraz ciała peptydowe, w których usunięto sekwencje: liderową oraz sygnałową, a otrzymane proteiny posiadają dodatkowe reszty amino-końcowe, w których występujące aminokwasy mogą być naturalne lub nienaturalne. Uwzględniono środki specyficznie wiążące (takie jak ciała peptydowe) z dodatkową resztą metionylową w pozycji aminokwasowej -1 (Met- -ciało peptydowe), jak również środki specyficznie wiążące z dodatkowymi resztami metioninową oraz lizynową w pozycjach -2 oraz -1 (Met- -Lys- -). Odmiany posiadające dodatkowe reszty Met, Met-Lys, Lys (lub generalnie jedną lub więcej niż jedną resztę zasadową) są użyteczne zwłaszcza w celu wzmożenia wytwarzania proteiny rekombinacyjnej w bakteryjnych komórkach gospodarza.
Obecne ujawnienie obejmuje również odmiany środka specyficznie wiążącego posiadające dodatkowe reszty aminokwasowe, które wynikają ze stosowania specyficznych systemów ekspresji. Przykładowo, stosowanie dostępnych w handlu wektorów, które ekspresjonują pożądany polipeptyd jako część produktu fuzyjnego transferazy-S-glutationowej (GST) zapewnia pożądany polipeptyd posiadający dodatkową resztę glicynową w pozycji aminokwasowej -1, po odczepieniu komponentu GST od pożądanego polipeptydu. Odmiany, które są wynikiem ekspresji w innych systemach wektorowych również uwzględniono, włączając te, w których polihistydynowe tagi wstawiono do sekwencji aminokwasowej, generalnie na karboksy- i/lub amino-końcu sekwencji.
Odmiany z insercją obejmują również opisane powyżej proteiny fuzyjne, w których koniec aminowy i/lub koniec karboksylowy polipeptydu lub ciała peptydowego jest przyłączony do drugiego pol ipeptydu, jego fragmentu, lub sekwencji aminokwasowych, które zasadniczo nie są rozpoznawane jako będące częścią dowolnej specyficznej sekwencji proteinowej. Przykładami takich protein fuzyjnych są immunologiczne polipeptydy, proteiny o długim czasie cyrkulacyjnego półtrwania, takie jak stałe obszary immunoglobuliny, proteiny markera, proteiny lub polipeptydy, które ułatwiają oczyszczanie pożądanego peptydu lub ciała peptydowego oraz sekwencje polipeptydowe, które promują formowanie multimerycznych protein (takie jak motywy suwaka leucynowego, które są przydatne w stabilizowaniu utworzonego dimeru).
Ten rodzaj odmiany z insercją generalnie zawiera całą lub zasadniczą część natywnej cząsteczki, połączonej z N- lub C-końcem, całego lub części drugiego polipeptydu. Przykładowo, proteiny fuzyjne typowo obejmują sekwencje liderowe z innych gatunków, co pozwala na rekombinacyjną ek spresję proteiny w heterologicznym gospodarzu. Inna przydatna proteina fuzyjna obejmuje dodatkową immunologicznie aktywną domenę, taką jak epitop przeciwciała, by ułatwiać oczyszczanie proteiny fuzyjnej. Inkluzja rozszczepionego miejsca w - lub blisko fuzyjnego połączenia ułatwi usunięcie zewnętrznego polipeptydu po oczyszczaniu. Inne przydatne fuzje obejmują wiązanie funkcyjnych domen, takich jak aktywne miejsca enzymów, domen glikozylacji, docelowych sygnałów komórkowych lub obszarów transmembranowych.
Są różne dostępne w handlu systemy ekspresji proteiny fuzyjnej, które mogą być stosowane zgodnie z obecnym ujawnieniem. Szczególnie przydatne są systemy obejmujące - lecz nie wyłącznie, system transferazy-S-glutationowej (GST) (Pharmacia), system proteiny wiążącej maltozę (NEB, Beverley, MA), system FLAG (IBI, New Haven, CT) oraz system 6xHis (Qiagen, Chatsworth, CA). Systemy te są zdolne do wytwarzania rekombinacyjnych peptydów i/lub ciał peptydowych, zawierających jedynie niewielką ilość dodatkowych aminokwasów, które nie mają znaczącego wpływu na aktywność peptydu lub ciała peptydowego. Przykładowo, oba systemy: FLAG oraz 6xHis - dodają tylko krótkie sekwencje, z których obie są znane jako będące słabo antygenicznymi oraz które nie wpływają niekorzystnie na fałdowanie polipeptydu z jego natywną konformacją. Inna N-końcowa fuzja, którą uważa się za przydatną, jest fuzją dipeptydu Met-Lys do N-końcowego obszaru proteiny lub peptydów. Taka fuzja może wytwarzać korzystne zwiększenie ekspresji proteiny lub aktywności.
Inne systemy fuzyjne wytwarzają hybrydy polipeptydowe, gdzie jest pożądane wycięcie partn era fuzyjnego z pożądanego peptydu lub ciała peptydowego. W pewnym wykonaniu, partner fuzyjny jest połączony z rekombinacyjnym ciałem peptydowym przez sekwencję peptydową obejmującą specyficzną sekwencję rozpoznającą proteazę. Przykładami odpowiednich sekwencji są takie, które rozpoznają proteazę Tobacco Etch Virus (Life Technologies, Gaithersburg, MD) lub Czynnik Xa (New England Biolabs, Beverley, MA).
Wynalazek zapewnia również polipeptydy fuzyjne zawierające całą lub część ciała peptydowego lub peptydu według obecnego wynalazku, w kombinacji z obciętym czynnikiem tkankowym (tTF).
PL 224 701 B1
Obcięty czynnik tkankowy (tTF) jest docelowym środkiem naczyniowym obejmującym obciętą formę ludzkiej proteiny indukującej koagulację, która oddziałuje jako środek ścinający naczynia krwionośne nowotworu, jak to opisano w patentach US o numerach 5,877,289; 6,004,555; 6,132,729; 6,132,730; 6,156,321; oraz w patencie Europejskim nr EP 0988056. Fuzja tTF z ciałem peptydowym anty-Ang-2 lub z peptydem, lub z jego fragmentami ułatwia dostarczanie anty-Ang-2 do docelowych komórek.
W innym aspekcie, zapewniono odmiany z delecją, w których usunięto jedną lub więcej niż je dną z reszt aminokwasowych w peptydzie lub w ciele peptydowym. Delecje mogą być wykonane w jednym lub obu końcach ciała peptydowego, lub wynikać z usunięcia jednej lub więcej niż jednej z reszt w obrębie sekwencji aminokwasowej ciała peptydowego. Odmiany z delecją obejmują k oniecznie wszystkie fragmenty peptydu lub ciała peptydowego.
W jeszcze innym aspekcie, zapewniono odmiany peptydów oraz ciał peptydowych według w ynalazku z substytucją. Odmiany z substytucją obejmują te z peptydów oraz ciał peptydowych, w których usunięto jedną lub więcej niż jedną z reszt aminokwasowych i zamieniono jednym lub więcej niż jednym z alternatywnych aminokwasów, które to aminokwasy mogą występować w naturze, lub nie występują w naturze. Odmiany z substytucjami generują peptydy lub ciała peptydowe, które są „podobne” do oryginalnego peptydu lub ciała peptydowego, które to dwie cząsteczki posiadają w pewnym stopniu, w procentach, identyczne aminokwasy. Odmiany z substytucją obejmują substytucje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30 aminokwasów w obrębie peptydu lub ciała peptydowego, gdzie ilość substytucji może dochodzić do 10% - lub więcej, aminokwasów w peptydzie lub ciele peptydowym. W pewnym aspekcie, substytucje są w swej naturze konserwatywne, jednakże ujawnienie obejmuje także substytucje, które są niekonserwatywne oraz obejmuje również niekonwencjonalne aminokwasy.
Identyczność oraz podobieństwo pokrewnych peptydów oraz ciał peptydowych mogą być łatwo obliczone znanymi metodami. Metody takie obejmują - lecz nie wyłącznie, metody opisane w: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., wyd., Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., wyd., Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Część 1, Griffin, A.M., oraz Griffin, H.G., wyd., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. oraz Devereux, J., wyd., M. Stockton Press, New York (1991); oraz Carillo i wsp., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988).
Korzystne metody oznaczania pokrewieństwa lub wyrażenia w procentach identyczności dwóch peptydów lub polipeptydów, lub polipeptydu oraz peptydu, pozwalają na znalezienie największego dopasowania badanych sekwencji. Metody oznaczania identyczności opisano w publicznie udostępnionych programach komputerowych. Korzystne metody wykorzystujące programy komputerowe do oznaczania identyczności pomiędzy dwiema sekwencjami obejmują - lecz nie wyłącznie: pakiet programów GCG, obejmujący GAP (Devereux i wsp., Nucl. Acid. Res., 12:387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI, BLASTP, BLASTN oraz FASTA (Altschul i wsp., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990)). Program BLASTX jest publicznie udostępniany w National Center for Biotechnology Information (NCBI) oraz w innych źródłach (BLAST Manual, Altschul i wsp., NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894; Altschul i wsp., jak wyżej (1990)). Dobrze znany algorytm Sm ith'a Waterman'a może być także stosowany do oznaczenia identyczności.
Pewne schematy ustawiania obok siebie dwóch sekwencji aminokwasowych mogą prowadzić do dopasowania jedynie krótkiego obszaru dwóch sekwencji, a ten niewielki dopasowany obszar m oże posiadać bardzo duży stopień identyczności sekwencji, nawet jeśli nie występuje znaczące pokrewieństwo między obu sekwencjami o pełnej długości. W związku z tym, w pewnych wykonaniach, wybrany sposób ustawiania obok siebie (program GAP) będzie dawał w rezultacie ustawienie obok siebie, które pokrywa co najmniej 10% docelowego porównywanego polipeptydu o pełnej długości, to znaczy, co najmniej 40 sąsiadujących ze sobą aminokwasów, jeżeli porównuje się sekwencje o co najmniej 400 aminokwasach, 30 sąsiadujących ze sobą aminokwasów, jeżeli porównuje się sekwencje liczące co najmniej 300 do około 400 aminokwasów, co najmniej 20 sąsiadujących ze sobą aminokwasów, jeżeli porównuje się sekwencje liczące 200 do około 300 aminokwasów oraz co najmniej 10 sąsiadujących ze sobą aminokwasów, jeżeli porównuje się sekwencje liczące od około 100 do 200 aminokwasów.
Przykładowo, stosując komputerowy algorytm GAP (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI), dwa polipeptydy, dla których ma być oznaczony procent identyczności sekwencji, ustawiane są obok siebie w sposób zapewniający optymalne dopasowanie ich odpowiednich aminokwasów („dopasowany zakres”, ustalany za pomocą tego algorytmu). W związku z tym
PL 224 701 B1 algorytmem, w pewnych wykonaniach, wykorzystuje się karę za wielkość przerwy (obliczaną typowo jako 3X średnia przekątna; gdzie „średnia przekątna” oznacza średnią przekątną stosowanej matrycy porównawczej; „przekątna” oznacza współczynnik lub liczbę przypisaną do każdego doskonałego dopasowania aminokwasu przez określoną matrycę porównawczą) oraz karę za rozciągnięcie przerwy (stanowiącą zwykle 1/10 x kara za wielkość otwartej przerwy), jak również matrycę porównawczą, taką jak PAM 250 lub BLOSUM 62. W pewnych wykonaniach, algorytm ten wykorzystuje standardową matrycę porównawczą (patrz Dayhoff i wsp., Atlas of Protein Sequence and Structure, 5(3)(1978) w przypadku matrycy porównawczej PAM250; Henikoff i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci USA 89:1091510919 (1992) w przypadku matrycy porównawczej BLOSUM 62).
W pewnych wykonaniach, parametry dla porównania sekwencji polipeptydów obejmują:
Algorytm: Needleman i wsp., J. Mol. Biol 48:443-53 (1970);
Matryca porównawcza: BLOSUM 62 według: Henikoff i wsp., jak wyżej (1992);
Kara za przerwę: 12
Kara za długość przerwy: 4
Podobieństwo progowe: 0
Program GAP może być przydatny przy powyższych parametrach. W pewnych wykonaniach, podane wyżej parametry są parametrami domyślnymi w przypadku porównywania polipeptydów (wraz z brakiem kary za końcowe przerwy) przy użyciu algorytmu GAP.
W pewnych wykonaniach, parametry dla porównywania sekwencji cząsteczek polinukleotydowych obejmują (w przeciwieństwie do sekwencji aminokwasowej):
Algorytm: Needleman i wsp., jak wyżej (1970);
Matryca porównawcza: dopasowania = +10, złe dopasowania = 0
Kara za przerwę: 50
Kara za długość przerwy: 3
Program GAP może być także użyteczny przy powyższych parametrach. Powyższe parametry są parametrami domyślnymi w przypadku porównywania cząsteczek polinukleotydowych.
Można stosować inne przykładowe algorytmy, kary za wielkość przerwy, kary za rozciągnięcie przerwy, matryce porównawcze oraz podobieństwo progowe, etc., łącznie z opisanymi w przewodniku Program Manual, Wisconsin Package, Version 9, wrzesień 1997. Szczegółowe wybory, jakich trzeba dokonać, będą zrozumiałe dla biegłych w sztuce i będą uzależnione od konkretnego porównania, jakiego należy dokonać: takiego jak DNA z DNA, proteina z proteiną, proteina z DNA; a ponadto, od tego, czy porównania dokonuje się pomiędzy danymi parami sekwencji (w którym to przypadku, gen eralnie korzystny jest program GAP lub BestFit), czy pomiędzy daną sekwencją a dużą bazą danych sekwencji (w którym to przypadku korzystny jest program FASTA lub BLASTA).
W znaczeniu tutaj użytym, dwadzieścia konwencjonalnych aminokwasów oraz formy skrócone ich oznaczeń są zgodne z powszechnym użyciem. Patrz: Immunology-A Synthesis (2-gie wydanie, E. S. Golub oraz D. R. Gren, wyd. Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)), która to pozycja jest włączona tutaj jako odnośnik literaturowy dla wszelakich potrzeb.
Aminokwasy mogą posiadać stereochemię zarówno L lub D (za wyjątkiem Gly, która nie jest ani L ani D), a polipeptydy oraz kompozycje według obecnego wynalazku mogą zawierać kombinację obu stereochemii. Jednakże, stereochemia L jest korzystna. Wynalazek zapewnia również odwrócone cząsteczki, w których to sekwencjach aminokwasowych odwrócono koniec aminowy względem końca karboksy. Przykładowo, odwrócenie cząsteczki posiadającej normalną sekwencję X1-X2-X3 powinno wyglądać tak: X3-X2-X1. Wynalazek zapewnia również retro- odwrócone cząsteczki, w których - jak wyżej, koniec amino względem końca karboksy w sekwencji aminokwasów jest odwrócony, a reszty, które normalnie są enancjomerami „L”, zmieniają się w stereoizomeryczne formy „D”.
Stereoizomery (przykładowo, D-aminokwasy) dwudziestu konwencjonalnych aminokwasów, nienaturalnych aminokwasów takich jak α-,α-dwupodstawione aminokwasy, N-alkilo-aminokwasy, kwas mlekowy oraz inne niekonwencjonalne aminokwasy mogą być także odpowiednimi komponentami polipeptydów według obecnego ujawnienia. Przykłady niekonwencjonalnych aminokwasów obejmują, bez ograniczania: kwas aminoadypinowy, β-alaninę, kwas β-aminopropionowy, kwas aminomasłowy, kwas piperydynowy, kwas aminokapronowy, kwas aminoheptanowy, kwas aminoizom asłowy, kwas aminopimelinowy, kwas diaminomasłowy, desmozynę, kwas diaminopimelinowy, kwas diaminopropionowy, N-etyloglicynę, N-etyloasparaginę, hyroksylizynę, allo-hydroksylizynę, hydroksyprolinę, izodesmozynę, allo-izoleucynę, N-metyloglicynę, sarkozynę, N-metyloizoleucynę, N-metylowalinę, norwalinę, norleucynę, oritynę, 4-hydroksyprolinę, γ-karboksyglutaminian, e-N,N,N-trimetylolizynę, ε-NPL 224 701 B1
-acetylolizynę, O-fosfoserynę, N-acetyloserynę, N-formylometioninę, 3-metylohistydynę, 5-hydroksylizynę, σ-N-metyloargininę oraz inne podobne aminokwasy oraz aminokwasy (przykładowo, 4-hydroksyprolinę).
Podobnie, o ile nie zaznaczono inaczej, koniec z lewej strony jednoniciowych sekwencji polinukleotydowych jest końcem 5'; kierunek z lewej strony dwuniciowych sekwencji polinukleotydowych jest oznaczony jako kierunek 5'. Kierunek dodawania 5' do 3' powstających transkryptów RNA określa się jako kierunek transkrypcji; obszary sekwencji nici DNA posiadające taką samą sekwencję jak RNA i które mają kierunek 5' do końca 5' traskryptu RNA są określone jako „sekwencje w górę”; obszary sekwencji nici DNA posiadające taką samą sekwencję jak RNA i które mają kierunek 3' do końca 3' transkryptu RNA są określone jako „sekwencje w dół”.
Należy zauważyć, że reszty aminokwasowe można podzielić na klasy w oparciu o ich zwykłe właściwości zewnętrznego łańcucha:
1. obojętne hydrofobowe: alanina (Ala; A), walina (Val; V), leucyna (Leu; L), izoleucyna (Ile; I), prolina (Pro; P), tryptofan (Trp; W), fenyloalanina (Phe; F), oraz metionina (Met, M).
2. obojętne polarne: glicyna (Gly; G); seryna (Ser; S), treonina (Thr; T), tyrozyna (Tyr; Y), cysteina (Cys; C), glutamina (Glu; Q), asparagina (Asn; N), oraz norleucyna.
3. kwasowe: kwas asparaginowy (Asp; D), kwas glutaminowy (Glu; E);
4. zasadowe: lizyna (Lys; K), arginina (Arg; R), histydyna (His; H),
Patrz Lewin, B., Genes V, Oxford University Press (1994), str. 11.
Konserwatywne substytucje aminokwasowe mogą obejmować niekonwencjonalne reszty am inokwasowe, które typowo wprowadzono raczej metodami chemicznej syntezy peptydowej, niż na drodze syntezy w systemach biologicznych. Obejmują one - lecz nie wyłącznie, peptydomimetyki oraz inne odwrócone lub inwertowane formy ugrupowań aminokwasowych. Przykładowo, n iekonserwatywne substytucje mogą obejmować wymianę członu jednej z tych klas na człon z innej k lasy.
Przy wprowadzaniu takich zmian, w przypadku pewnych wykonań, można brać pod uwagę h ydropatyczny współczynnik aminokwasów. Każdemu aminokwasowi przypisano współczynnik hydropatyczny na podstawie właściwej mu charakterystyki hydrofobowości i ładunku. Wynoszą one: izoleucyna (+4,5), walina (+4,2), leucyna (+3,8), fenyloalanina (+2,8), cysteina/cystyna (+2,5), metionina (+1,9), alanina (+1,8), glicyna (-0,4), treonina (-0,7), seryna (-0,8), tryptofan (-0,9), tyrozyna (-1,3), prolina (-1,6), histydyna (-3,2), kwas glutaminowy (-3,5), glutamina (-3,5), kwas asparaginowy (-3,5), asparagina (-3,5), lizyna (-3,9) oraz arginina (-4,5).
W tej dziedzinie docenia się wagę współczynnika (indeksu) hydropatycznego aminokwasów przy potwierdzaniu interaktywnego biologicznego działania proteiny. Kyte i wsp., J. Mol. Biol., 157: 105-131 (1982). Wiadomo, że pewne aminokwasy mogą być podstawione za inne aminokwasy posiadające podobny współczynnik (indeks) hydropatyczny lub wynik, a mimo to zachowana jest podo bna aktywność biologiczna. Przy dokonywaniu zmian w oparciu o indeks hydropatyczny, w pewnych wykonaniach, obejmują one podstawienia aminokwasów, dla których współczynniki hydropatyczne zawierają się w przedziale ±2. W pewnych wykonaniach współczynniki te zawierają się w przedziale ±1, a w pewnych wykonaniach zawierają się w przedziale ±0,5.
W dziedzinie tej wiadomo również, że podstawienie podobnych aminokwasów może być wyk onane skutecznie w oparciu o hydrofilowość, w szczególności jeżeli biologicznie funkcyjne ciało pept ydowe lub peptyd tutaj wytworzony ma być stosowany w realizacjach immunologicznych, jak w obe cnym przypadku. W pewnych wykonaniach, największa lokalna przeciętna hydrofilowość proteiny, na którą wpływa hydrofilowość sąsiednich aminokwasów, koreluje z jej immunogenicznością i antygenicznością, to znaczy, z biologicznymi własnościami proteiny.
Poniższym resztom aminokwasowym przypisano następujące wartości hydrofilowości: arginina (+3,0), lizyna (+3,0), kwas asparaginowy (+3,0 ± 1), kwas glutaminowy (+3,0 ± 1), seryna (+0,3), asparagina (+0,2), glutamina (+0,2), glicyna (0), treonina (-0,4), prolina (-0,5 ± 1), alanina (-0,5), histydyna (-0,5), cysteina (-1,0), metionina (-1,3), walina (-1,5), leucyna (-1,8), izoleucyna (-1,8), tyrozyna (-2,3), fenyloalanina (-2,5) oraz tryptofan (-3,4). Przy dokonywaniu zmian w oparciu o podobne wartości hydrofilowości, w pewnych wykonaniach objęte są podstawienia aminokwasów, dla których współczynniki hydrofilowości zawierają się w przedziale ±2, w pewnych wykonaniach współczynniki te zawierają się w przedziale ±1, a w pewnych wykonaniach zawierają się w przedziale ±0,5. Można również zide ntyfikować epitopy z pierwszorzędowych sekwencji aminokwasowych na podstawie hydrofilowości. Obszary te określane są również terminem „epitopowe regiony rdzeniowe”. Przykładowe substytucje aminokwasowe podano poniżej w Tablicy 2.
PL 224 701 B1
T a b l i c a 2 Substytucje aminokwasowe
Oryginalne reszty Przykładowe substytucje Korzystne substytucje
Ala Val, Leu, Ile Val
Arg Lys, Gln, Asn Lys
Asn Gln, Glu, Asp Gln
Asp Glu, Gln, Asn Glu
Cys Ser, Ala Ser
Gln Asn, Glu, Asp Asn
Glu Asp, Asn, Gln Asp
Gly Pro, Ala Ala
His Asn, Gln, Lys, Arg Arg
Ile Leu, Val, Met, Ala, Phe, norleucyna Leu
Leu norleucyna, Ile, Val, Met, Ala, Phe Ile
Lys Arg, kwas 1,4-diaminomasłowy, Gln, Asn Arg
Met Leu, Phe, Ile Leu
Phe Leu, Val, Ile, Ala, Tyr Leu
Pro Ala Gly
Ser Thr, Ala, Cys Thr
Thr Ser Ser
Trp Tyr, Phe Tyr
Tyr Trp, Phe, Thr, Ser Phe
Val Ile, Met, Leu, Phe, Ala, norleucyna Leu
Biegły w sztuce będzie mógł określić odpowiednie odmiany podanego tutaj polipeptydu stosując dobrze znane techniki. W pewnych wykonaniach, biegły w sztuce może zidentyfikować odpowiednie obszary cząsteczki, które mogą być zmienione bez zniszczenia aktywności poprzez skupienie się na obszarach uważanych za nieistotne z punktu widzenia aktywności. W pewnych wykonaniach, można zidentyfikować reszty i części cząsteczek, które są konserwatywne wśród podobnych peptydów lub polipeptydów. W pewnych wykonaniach, nawet obszary, które mogą być ważne dla aktywności biologicznej lub struktury, mogą podlegać konserwatywnym aminokwasowym podstawieniom bez zniszczenia aktywności biologicznej lub bez niekorzystnego wpływu na strukturę peptydu.
Ponadto, biegły w sztuce może dokonać przeglądu badań nad zależnościami funkcji i struktury, identyfikując w podobnych polipeptydach reszty ważne dla aktywności biologicznej lub dla struktury. W świetle takiego porównania, można przewidzieć wagę reszt aminokwasowych w proteinie, odpowiadających resztom aminokwasowym ważnym z punktu widzenia aktywności lub budowy podobnych protein. Biegły w sztuce może wskazać chemicznie podobne podstawienia aminokwasowe dla takich dających się wytypować, ważnych reszt aminokwasowych.
Biegły w sztuce może również przeprowadzić analizę trójwymiarowej struktury oraz sekwencji aminokwasowej w porównaniu z trójwymiarową strukturą podobnych polipeptydów. W świetle uzyskanych informacji biegły w sztuce może przewidzieć ustawienie reszt aminokwasowych przeciwciała względem jego trójwymiarowej struktury. W pewnych wykonaniach, biegły w sztuce może dokonać wyboru niedokonywania radykalnych zmian w odniesieniu do reszt aminokwasowych, co do których można przewidywać, że występują na powierzchni proteiny, ponieważ takie reszty mogą być zaangażowane w ważne oddziaływania z innymi cząsteczkami. Ponadto, biegły w sztuce może generować testowe odmiany zawierające pojedyncze podstawienie aminokwasowe w każdej pożądanej reszcie aminokwasowej. Odmiany mogą być następnie poddane skriningowi przy użyciu prób na aktywność, znanych biegłym w sztuce. Takie odmiany mogłyby być użyte do gromadzenia informacji o odpowie dPL 224 701 B1 nich odmianach. Przykładowo, gdyby się okazało, że zmiana przy określonej reszcie aminokwasowej powoduje zniszczenie, niepożądane obniżenie lub nieodpowiednią aktywność, odmian z taką zmianą należałoby unikać. Innymi słowy, w oparciu o informacje zebrane na podstawie takich rutynowych eksperymentów, biegły w sztuce może z łatwością ustalić aminokwasy, przy których należy unikać dalszych podstawień zarówno występujących samodzielnie, jak i w kombinacji z innymi mutacjami.
Wiele naukowych publikacji poświęcono przewidywaniu drugorzędowej struktury. Patrz: Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7(4): 422-427 (1996), Chou i wsp., Biochemistry, 13(2): 222-245 (1974); Chou i wsp., Biochemistry, 113(2): 211-222 (1974); Chou i wsp., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47: 45-148 (1978); Chou i wsp., Ann. Rev. Biochem., 47: 251 -276 oraz Chou i wsp., Biophys. J., 26: 367-384 (1979). Ponadto, dostępne są obecnie programy komputerowe, które wspomagają przewidywanie drugorzędowej struktury. Jedna z metod przewidywania drugorzędowej struktury oparta jest na modelowaniu homologii. Przykładowo, dwa polipeptydy lub białka, które w stopniu większym niż 30% wykazują identyczność sekwencji, albo podobieństwo w stopniu większym niż w 40%, często mają podobne topologie strukturalne. Obserwowany ostatnio rozwój baz danych dotyczących struktury białek (PDB) zapewnia zwiększoną przewidywalność drugorzędowej struktury, łącznie z ilością potencjalnych fałdowań w obrębie struktury polipeptydu lub proteiny. Patrz Holm i wsp., Nucl. Acid. Res., 27(1): 244-247 (1999). Zasugerowano (Brenner i wsp., Curr. Op. Struct. Biol., 7(3): 369-376 (1997)), że w strukturze występuje ograniczona ilość fałd w danym polipeptydzie lub białku oraz że - jeśli krytyczna ilość struktur zostanie rozwiązana, przewidywania struktury zyskają dramatycznie na d okładności.
Dodatkowe metody przewidywania drugorzędowej struktury obejmują „snucie (threading)” (Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3): 377-87 (1997); Sippl i wsp., Structure, 4(1): 15-9 (1996)), „analizę profilową (profile analysis)” (Bowie i wsp., Science, 253: 164-170 (1991); Gribskov i wsp., Meth. Enzym., 183: 146-159 (1990); Gribskov i wsp., Proc. Nat. Acad. Sci., 84(13): 4355-4358 (1987)) oraz „ewolucyjne łączenie (evolutionary linkage)” (patrz Holm, jak wyżej (1999) oraz Brenner, jak wyżej (1997)).
W pewnych wykonaniach, odmiany ciała peptydowego obejmują odmiany glikozylacyjne, gdzie jedno lub więcej niż jedno miejsce glikozylacji, takie jak miejsce glikozylacji połączone z N, dodano do ciała peptydowego. N-połączone miejsce glikozylacji charakteryzuje się sekwencją: Asn-X-Ser lub Asn-X-Thr, gdzie reszta aminokwasowa oznaczona jako „X” może być dowolną resztą aminokwasową, z wyjątkiem proliny. Substytucja lub addycja reszt aminokwasowych powodująca powstanie takiej sekwencji zapewnia potencjalne nowe miejsce dla addycji N-połączonego łańcucha węglowodanowego. Alternatywnie, substytucje, które eliminują tę sekwencję spowodują usunięcie N-połączonego łańcucha węglowodanowego. Zapewniono także przemieszczenie N-połączonych łańcuchów węglowodanowych, gdzie wyeliminowano jedno lub więcej niż jedno z N-połączonych miejsc glikozylacji (typowo takich, które występują w naturze) oraz utworzono jedno lub więcej niż jedno nowe połączone z N miejsce glokozylacji.
Obecne ujawnienie zapewnia również „pochodne”, które obejmują ciała peptydowe zawierające modyfikacje dodatkowe lub inne niż modyfikacje polegające na insercji, delecji lub substytucji reszt aminokwasowych. Korzystnie, modyfikacje są kowalencyjne w swej naturze oraz obejmują, przykładowo chemiczne wiązanie z polimerami, lipidami, innymi organicznymi oraz nieorganicznymi ugrupowaniami. Pochodne według obecnego ujawnienia mogą być wytwarzane w celu zwiększenia okresu półtrwania cyrkulacji ciała peptydowego, lub mogą być zaprojektowane pod kątem poprawy zdolności nakierowania ciała peptydowego na pożądane komórki, tkanki lub organy.
Przykładowe pochodne obejmują ugrupowania, w których wykonano jedną lub więcej niż jedną z następujących modyfikacji:
• Jedno lub więcej niż jedno z peptydylowych [-C(O)NR-] połączeń (wiązań) zamieniono na nie-peptydylowe połączenie, takie jak: połączenie -CH2-karbaminianowe [-CH2OC(O)NR-]; połączenie fosfonianowe; połączenie -CH2-sulfonamidowe [-CH2-S(O)2NR-]; połączenie mocznikowe [-NHC(O)NH-]; połączenie -CH2-drugorzędowe aminowe; lub na alkilowane połączenie peptydylowe [-C(O)NR6 - gdzie R6 oznacza niższy alkil];
1 • Peptydy, w których N-koniec jest zderywatyzowany do grupy -NRR ; do grupy
-NRC(O)R; do grupy -NRC(O)OR; do grupy -NRS(O)2R; do grupy -NHC(O)NHR, gdzie 1
R oraz R1 oznaczają wodór lub niższy alkil, z tym zastrzeżeniem, że oba podstawniki R 1 oraz R nie oznaczają jednocześnie wodoru; do grupy bursztynowej; do grupy benzyloksykarbonylo-NH-(CBZ-NH-); lub do grupy benzyloksykarbonyIo-NH- zawierającej od
PL 224 701 B1 do 3 podstawników w pierścieniu fenylowym, wybranych z grupy obejmującej niższy alkil, niższy alkoksyl, chlor i brom; oraz 2 • Peptydy, w których wolny C-koniec jest zderywatyzowany do ugrupowania -C(O)R , gdzie R jest wybrany z grupy obejmującej niższy alkoksyl oraz -NR R , gdzie R oraz R4 są niezależnie wybrane z grupy obejmującej atom wodoru oraz niższy alkil. Przez określenie „niższy” należy rozumieć grupę posiadającą od 1 do 6 atomów węgla.
Dodatkowo, modyfikacje indywidualnych aminokwasów mogą być wprowadzone do polipeptydów lub kompozycji według wynalazku w wyniku reakcji wybranych reszt aminokwasowych peptydu z organicznym środkiem derywatyzującym, który jest zdolny do reakcji z wybranymi łańcuchami boc znymi lub z resztami końcowymi. Następujące reszty stnowią reszty przykładowe:
Reszty lizynylowe oraz końcowe reszty aminowe mogą reagować z bezwodnikiem kwasu bursztynowego lub z innymi bezwodnikami kwasów karboksylowych. Derywatyzacja przy użyciu tych środków powoduje odwrócenie ładunku reszt lizynylowych. Inne odpowiednie reagenty dla derywatyzowania reszt α-aminowych obejmują imidoestry takie, jak: pikolinimidonian metylu; fosforan pirydoksalu; pirydoksal; chloroborowodorek; kwas trinitrobenzenosulfonowy; O-metyloizomocznik; 2,4-pentanodion; oraz katalizowana transaminazą reakcja z glioksylanem.
Reszty arginylowe mogą być modyfikowane w wyniku reakcji z jednym lub z k ilkoma konwencjonalnymi reagentami, wśród których są: fenyloglioksal, 2,3-butanodion, 1,2-cykloheksanodion oraz ninhydryna. Derywatyzacja reszt argininowych wymaga tego, by reakcja była prowadzona w alkalicznym środowisku, z uwagi na wysoką wartość pKa funkcyjnej grupy guanidyny. Ponadto, reagenty te mogą reagować z grupami lizynowymi, jak również z grupą argininowo-guanidynową.
Specyficzna modyfikacja reszt tyrozylowych - jako takich, była przedmiotem szerokich badań, ze szczególną uwagą poświęconą wprowadzeniu znaczników spektralnych do reszt tyrozynowych w wyniku reakcji z aromatycznymi związkami dwuazoniowymi lub tetranitrometanem. Najpowszechniej, N-acetyloimidizol oraz tetranitrometan mogą być stosowane celem wytworzenia - odpowiednio, układów O-acetylo-tyrozylowych oraz 3-nitro-pochodnych.
Boczne grupy karboksylowe (aspartylowa lub glutamylowa) mogą być selektywnie modyfikowa1 ne w wyniku reakcji z karbodiimidami (R1-N=C=N-R'), takimi jak 1-cykloheksylo-3-(2-morfolinylo-(4-etylo)-karbodiimid lub 1-etylo-3-(4-azonia-4,4-dimetylopentylo)-karbodiimid. Ponadto, reszty aspartylowa oraz glutamylowa mogą być przekształcone w reszty asparaginylową oraz glutaminylową w w yniku reakcji z jonami amonowymi.
Reszty glutaminylowa oraz asparaginylowa często są poddawane deamidowaniu do odpowiednich reszt glutamylowej oraz aspartylowej. Alternatywnie, reszty te mogą być deamidowane w umiarkowanie kwaśnych warunkach. Obie formy tych reszt wchodzą w zakres obecnego ujawnienia.
Derywatyzacja przy użyciu środków dwufunkcyjnych jest przydatna dla tworzenia połączeń sieciujących peptydów lub ich funkcjonalnych pochodnych z nierozpuszczalną w wodzie matrycą nośn ikową lub z innymi nośnikami makrocząsteczkowymi. Powszechnie stosowane środki sieciujące obejmują przykładowo, 1,1-bis(diazoacetylo)-2-fenyloetan, aldehyd glutarowy, estry N-hydroksysukcynimidowe, przykładowo, estry z kwasem 4-azydosalicylowym, imidoestry homobifunkcyjne, obejmujące estry disukcynimidylowe takie jak 3,3'-ditiobis-(sukcynimidylopropionian) oraz bifunkcyjne maleimidy, takie jak bis-N-maleimido-1,8-oktan. Użycie środków derywatyzujących takich jak metylo-3-[(p-azydofenylo)ditio]propionimidan prowadzi do otrzymania fotoaktywnych związków pośrednich, które są zdolne do tworzenia wiązań sieciujących pod wpływem światła. Alternatywnie, reaktywne, nierozpuszczalne w wodzie matryce, przykładowo, aktywowane bromkiem dwucyjanu węglow odany oraz reaktywne substraty opisane w patentach o numerach: US 3,969,287; US 3,691,016; US 4,195,128; US 4,247,642; US 4,229,537 oraz US 4,330,440, mogą być zastosowane w celu immobilizacji proteiny.
Inne możliwe modyfikacje obejmują hydroksylację proliny oraz lizyny, fosforylację grup h ydroksylowych reszt serylowej lub treonylowej, utlenienie atomu siarki w Cys, metylowanie grup alfa-aminowych bocznych łańcuchów lizyny, argininy oraz histydyny (Creighton, T.E., Proteins: Structure and Molecule Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, str. 79 -86 (1983)), acetylowanie N-końcowej aminy oraz - w niektórych przypadkach - amidowanie C-końcowych grup karboksylowych.
Określenia „derywatyzowanie” oraz „pochodna” lub „zderywatyzowany” wiążą się z procesami oraz z uzyskiwanymi w wyniku tych procesów związkami, gdzie (1) związki mają część cykliczną; przykładowo, w wyniku sieciowania między resztami cysteinylowymi w obrębie danego związku; (2)
PL 224 701 B1 związek jest usieciowany lub ma miejsce sieciowania; przykładowo, związek ma resztę cysteinylową, a tym samym tworzy usieciowane dimery w hodowli lub in vivo; (3) jedno lub więcej niż jedno wiązanie 1 peptydylowe jest zastąpione wiązaniem niepeptydylowym; (4) N-koniec jest zastąpiony przez -NRR ,
-NRC(O)R1, -NRC(O)OR1, -NRS(O)2R1, -NHC(O)NHR, grupę sukcynimidową lub podstawioną lub 1 niepodstawioną grupę benzyloksykarbonyIo-NH-, gdzie R i R1 oraz podstawniki przy pierścieniach
4 2 3 mają niżej podane znaczenie; (5) C-koniec jest zastąpiony przez -C(O)R2 lub -NR3R4, gdzie R2, R3 oraz R4 mają znaczenie podane niżej; a także (6) związki, w których indywidualne reszty aminokwasowe zostały zmodyfikowane poprzez obróbkę przy użyciu środków zdolnych do reakcji z wybranymi łańcuchami bocznymi lub z resztami końcowymi. Pochodne są dokładniej opisane poniżej.
Tak zderywatyzowane ugrupowania korzystnie poprawiają jedną lub więcej niż jedną z charakterystyk obejmujących aktywność anty-angiogeniczną, rozpuszczalność, absorpcję, biologiczny czas pół-trwania oraz tym podobne cechy związków według wynalazku. Alternatywnie, derywatyzacja okr eślonych ugrupowań może prowadzić do wytworzenia związków posiadających takie sam e lub zasadniczo takie same, charakterystyki i/lub właściwości jak związek, który nie jest zderywatyzowany. Ugr upowania takie mogą alternatywnie eliminować lub osłabiać dowolny niepożądany efekt uboczny danych związków oraz wywoływać podobne skutki.
Związki według obecnego wynalazku mogą również być zmienione na poziomie DNA. Sekwencja DNA dla dowolnej części związku może być zmieniona na kodony bardziej kompatybilne z wybr aną komórką gospodarza. W przypadku E. coli, której komórki są korzystnymi komórkami gospodarza, w stanie techniki znane są zoptymalizowane kodony. Kodony mogą być podstawione w celu wyelim inowania miejsc restrykcyjnych lub w celu wprowadzenia uśpionych (wyciszonych) miejsc restrykcyjnych, które mogą ułatwiać przetwarzanie DNA w wybranej komórce gospodarza. Podłoże, linker oraz sekwencje DNA peptydu mogą być modyfikowane w celu uwzględnienia dowolnej z wyżej omówionych zmian sekwencji. A więc, wszystkie modyfikacje, substytucje, derywatyzacje itp. tu omówione odnoszą się w równym stopniu do wszystkich aspektów obecnego wynalazku, obejmujących - lecz nie wyłącznie: peptydy, ich dimery oraz multimery, linkery oraz podłoża.
Dodatkowo, biegły w sztuce może dokonać przeglądu doniesień z badań strukturalnofunkcyjnych identyfikujących w podobnych peptydach reszty ważne ze względu na aktywność lub strukturę. Na podstawie takiego porównania, można przewidywać znaczenie tych reszt aminokwasowych w dowolnym peptydzie, które odpowiadają resztom aminokwasowym ważnym ze względu na aktywność lub strukturę w podobnych peptydach. Biegły w sztuce może wybrać chemicznie podobne substytucje aminokwasowe dla takich przewidywanych ważnych reszt aminokwasowych w peptydach.
Biegły w sztuce może również przeprowadzić analizę trójwymiarowej struktury i sekwencji aminokwasowej w relacji do takiej struktury w podobnych polipeptydach. Uwzględniając taką informację, biegły w sztuce może przewidzieć ustawienie reszt aminokwasowych peptydu z odniesieniem do jego trójwymiarowej struktury. Biegły w sztuce może zdecydować się na niewprowadzanie radykalnych zmian w odniesieniu do reszt aminokwasowych, co do których można przewidywać, że znajdą się na powierzchni proteiny, ponieważ takie reszty mogą brać udział w ważnych oddziaływaniach z innymi cząsteczkami. Ponadto, biegły w sztuce może wygenerować odmiany cząsteczek przeznaczone do testów obejmujące pojedynczą aminokwasową substytucję w odniesieniu do każdej pożądanej reszty aminokwasowej. Takie odmiany mogą być dalej poddawane skriningowi z zastosowaniem prób na aktywność znanych biegłym w sztuce. Tak uzyskane dane mogłyby dostarczać informacji o odpowiednich odmianach. Przykładowo, jeśli odkryto by, że zmiana na określoną resztę aminokwasową powoduje zniszczenie, niepożądane obniżenie lub nadanie niepożądanej aktywności należałoby unikać wariantów z taką zmianą. Innymi słowy, opierając się na informacjach wynikających z takich rutynowych eksperymentów, biegły w sztuce może z łatwością ustalić te aminokwasy, w odniesieniu do których należałoby unikać dalszych substytucji zarówno wprowadzanych pojedynczo lub w połączeniu z innymi mutacjami.
Wiele naukowych publikacji poświęcono przewidywaniom struktury drugorzędowej. Patrz: Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7(4): 422-427 (1996), Chou i wsp., Biochemistry, 13(2): 222-245 (1974); Chou i wsp., Biochemistry, 113(2): 211-222 (1974); Chou i wsp., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47: 45-148 (1978); Chou i wsp., Ann. Rev. Biochem., 47: 251 -276 oraz Chou i wsp., Biophys. J., 26: 367-384 (1979). Ponadto, obecnie dostępne są programy komputerowe wspomagające przewidywanie struktury drugorzędowej. Jedna z metod przewidywania struktury drugorzędowej oparta jest o modelowanie homologiczne. Przykładowo, dwa polipeptydy lub dwie proteiny, które posiadają sekwencje identyczne w stopniu większym niż 30% lub są podobne w stopniu większym niż
PL 224 701 B1
40%, często posiadają podobne topologie struktur. Ostatni wzrost bazy danych o strukturach białek (PDB) zapewnia zwiększoną przewidywalność struktury drugorzędowej, obejmującą potencjalną ilość fałd w obrębie struktury polipeptydu lub proteiny. Patrz: Holm i wsp., Nucl. Acid. Res., 27(1): 244-247 (1999). Zasugerowano (Brenner i wsp., Curr. Op. Struct. Biol., 7(3): 369-376 (1997)), że występuje ograniczona ilość fałd w danym polipeptydzie lub proteinie, oraz że jeśli rozwiąże się krytyczną ilość struktur, przewidywania odnoszące się do struktury dramatycznie zyskają na dokładności.
Dodatkowe sposoby przewidywania struktury drugorzędowej obejmują „snucie” (Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3): 377-87 (1997); Sippl i wsp., Structure, 4(1): 15-9 (1996)), „analizę profilową” (Bowie i wsp., Science, 253: 164-170 (1991); Gribskov i wsp., Met. Enzym., 183: 146-159 (1990); Gribskov i wsp., Proc. Nat. Acad. Sci., 84(13): 4355-8 (1987)) oraz „wiązania ewolucyjne” (patrz Home, jak wyżej oraz Brenner, jak wyżej).
Wynalazek obejmuje dalej pochodne środków specyficznie wiążących, przykładowo, ciała peptydowe, modyfikowane kowalencyjnie w celu wprowadzenia jednego lub więcej niż jednego rozpus zczalnego w wodzie przyłączenia, takiego jak glikol polietylenowy, glikol polioksyetylenowy lub glikol polipropylenowy, zgodnie z opisem zawartym w patentach o numerach US 4,640,835; US 4,496,689; US 4,301,144; US 4,670,417; US 4,791,192 oraz US 4,179,337. Jeszcze inne przydatne polimery znane w stanie techniki obejmują glikol monometoksypoli-etylenowy, dekstran, celulozę lub inne polimery oparte na węglowodanach, glikol poli-(N-winylopirolidono)-polietylenowy, homopolimery glikolu propylenowego, kopolimer tlenku polipropylenu i tlenku etylenu, polioksyetylowane poliole (przykład owo, glicerol) oraz alkohol poliwinylowy, jak również mieszaniny tych polimerów. Szczególnie korzystne są ciała peptydowe modyfikowane kowalencyjnie z podjednostkami glikolu polietylenowego (PEG). Rozpuszczalne w wodzie polimery mogą być przyłączone w specyficznych pozycjach, przykładowo przy końcu aminowym ciał peptydowych lub losowo przyłączone do jednego lub więcej niż jednego z zewnętrznych łańcuchów polipeptydu. Stosowanie PEG w celu polepszenia terapeutycznej zdolności środków specyficznie wiążących, przykładowo, ciał peptydowych, a w szczególności humanizowanych przeciwciał, opisano w patencie nr US 6,133,426, wydanym na rzecz Gonzales'a i wsp. Dnia 17 października 2000 r.
Obecne ujawnienie uwzględnia także derywatyzowanie peptydu i/lub części podłoża związków. Takie pochodne mogą polepszać rozpuszczalność, absorpcję, biologiczny czas pół-trwania oraz tym podobne cechy związków. Ugrupowania takie mogą alternatywnie eliminować lub osłabiać dowolny niepożądany efekt uboczny danych związków oraz wywoływać podobne skutki. Przykładowe pochodne obejmują związki, w których:
1. Związek lub pewna jego część, jest cykliczny. Przykładowo, część peptydu może być modyfikowana na zawartość dwóch lub więcej niż dwóch reszt Cys (przykładowo, w linkerze), które mogłyby cyklizować poprzez tworzenie wiązania dwusiarczkowego.
2. Związek jest usieciowany lub jest zdolny do tworzenia usieciowania między cząsteczkami. Przykładowo, część peptydu może być modyfikowana na zawartość jednej reszty Cys i w związku z tym może tworzyć wewnątrzcząsteczkowe wiązanie dwusiarczkowe z podobną cząsteczką. Związek może być także usieciowany przez jego C-koniec.
3. Jedno lub więcej niż jedno wiązanie peptydylowe [-C(O)NR-] jest zastąpione wiązaniem niepeptydylowym. Przykładowymi połączeniami niepeptydylowymi są -CH2-karbaminian [-CH2-OC(O)NR-], fosfonian, -CH2-sulfonamid [-CH2-S(O)2NR-], mocznik [-NHC(O)NH-], -CH2-drugorzędowa amina oraz alkilowany peptyd [-C(O)NR6 - gdzie R6 oznacza niższy alkil].
4. N-koniec jest zderywatyzowany. Typowo, N-koniec może być acylowany lub zmodyfikowany do otrzymania podstawionej aminy. Przykładowe N- końcowe grupy derywatyzujące obejmują -NRR1 (inne niż -NH2), -NRC(O)R1 -NRC(O)OR1, -NRS(O)2R1, -NHC(O)NHR1, sukcynimid, lub benzyloksy-karbonylo-NH-(CBZ-NH-), gdzie R oraz R1 oznaczają, każdy niezależnie, wodór lub niższy alkil, oraz gdzie pierścień fenylowy może być podstawiony od 1 do 3 podstawnikami wybranymi z grupy obejmującej C1-C4 alkil, C1-C4 alkoksyl, chlor oraz brom.
5. Wolny C-koniec jest zderywatyzowany. Typowo, C-koniec jest estryfikowany lub amidowany. Przykładowo, można stosować sposoby opisane w stanie techniki by dodać (NH-CH2CH2-NH2)2 do związków według obecnego wynalazku przy C-końcu. Podobnie, można stosować sposoby opisane w stanie techniki by dodać -NH2 do związków według obecnego wynalazku przy C-końcu. Przykładowe grupy derywatyzujące C-koniec obejmują, przykłaPL 224 701 B1 dowo, -C(O)R2, gdzie R2 oznacza niższy alkoksyl lub -NR3R4 gdzie R3 oraz R4 oznaczają niezależnie wodór lub C1-C8 alkil (korzystnie C1-C4 alkil).
6. Wiązanie dwusiarczkowe zamieniono innym, korzystnie bardziej stabilnym, ugrupowaniem sieciującym (przykładowo, alkilenem). Patrz, przykładowo, Bhatnagar (jak wyżej); Alberts i wsp., Thirteenth Am. Pep. Symp., 357-9 (1993).
7. Modyfikowano jedną lub więcej niż jedną indywidualną resztę aminokwasową. Znane środki derywatyzujące reagują specyficznie z wybranymi bocznymi łańcuchami lub z resztami końcowymi, jak opisano szczegółowo poniżej.
Reszty lizynylowe oraz końcowe reszty aminowe mogą reagować z bezwodnikiem kwasu bursztynowch. Do innych odpowiednich reagentów do derywatyzacji reszt zawierających grupy alfaaminowe zalicza się imidoestry, takie jak pikolinimidynian metylu; fosforan pirydoksalu; pirydoksal; chloroborowodorek; kwas trinitrobenzenosulfonowy; O-metyloizomocznik; 2,4-pentanodion; oraz katalizowaną transaminazą reakcję z glioksylanem.
Reszty arginylowe mogą być modyfikowane w wyniku reakcji z dowolnym reagentem lub kombinacją kilku konwencjonalnych reagentów, do których zalicza się fenyloglioksal, 2,3-butanodion, 1,2-cykloheksanodion oraz ninhydrynę. Derywatyzacja reszt argininowych wymaga by reakcja była prowadzona w warunkach alkalicznych, z uwagi na wysoką wartość pKa funkcyjnej grupy guanidynowej. Ponadto, reagenty te mogą reagować z grupami lizyny, jak również z grupą epsilon-argininowoaminową.
Specyficzna modyfikacja reszt tyrozylowych - jako takich, była przedmiotem szerokich badań, ze szczególną uwagą poświęconą wprowadzeniu znaczników spektralnych do reszt tyrozylowych, w wyniku reakcji z aromatycznymi związkami dwuazoniowymi lub tetranitrometanem. Najpowszechniej, mogą być stosowane N-acetyloimidizol oraz tetranitrometan, celem wytworzenia - odpowiednio, układów O-acetylotyrozylowych oraz 3-nitropochodnych.
Grupy karboksylowe w łańcuchu bocznym (w aspartylu lub w glutamylu) mogą być selektywnie modyfikowane w wyniku reakcji z karbodiimidami (R'-N=C=N-R'), przykładowo z 1-cykloheksylo-3-(2-morfolinylo-(4-etylo)-karbodiimidem lub 1-etylo-3-(4-azonia-4,4-dimetylopentylo)-karbodiimidem. Ponadto, reszty aspartylowa oraz glutamylowa mogą być przekształcone w reszty asparaginylową oraz glutaminylową w wyniku reakcji z jonami amonowymi.
Reszty glutaminylowa oraz asparaginylowa mogą być poddane deamidowaniu do odpowiednich reszt glutamylowej oraz aspartylowej. Alternatywnie, reszty te mogą być deamidowane w umiarkowanie kwaśnych warunkach. Obie formy tych reszt wchodzą w zakres obecnego ujawnienia.
Reszty cysteinylowe mogą być zamienione przez reszty aminokwasowe lub inne ugrupowania w celu wyeliminowania połączenia dwusiarczkowego lub - odwrotnie, w celu stabilizowania usieciowania. Patrz, przykładowo, Bhatnagar, (jak wyżej).
Derywatyzacja przy użyciu środków dwufunkcyjnych jest przydatna dla tworzenia połączeń sieciujących peptydów lub ich funkcjonalnych pochodnych z nierozpuszczalną w wodzie matrycą nośn ikową lub z innymi nośnikami makrocząsteczkowymi. Powszechnie stosowane środki sieciujące obejmują przykładowo, 1,1-bis(diazoacetylo)-2-fenyloetan, aldehyd glutarowy, estry N-hydroksy-sukcynimidowe, przykładowo estry z kwasem 4-azydosalicylowym, imidoestry homobifunkcyjne, obejmujące estry disukcynimidylowe takie jak 3,3'-ditiobis-(sukcynimidylopropionian) oraz bifunkcyjne maleimidy takie jak bis-N-maleimido-1,8-oktan. Użycie środków derywatyzujących takich jak metylo-3-[(p-azydofenylo)ditio]propionimidan prowadzi do otrzymania fotoaktywnych związków pośrednich, które są zdolne do tworzenia wiązań sieciujących pod wpływem światła. Alternatywnie, reaktywne, nierozpuszczalne w wodzie matryce takie jak węglowodany aktywowane bromkiem dwucyjanu oraz reaktywne substraty opisane w patentach o numerach: US 3,969,287; US 3,691,016; US 4,195,128; US 4,247,642; US 4,229,537 oraz US 4,330,440, mogą być zastosowane w celu immobilizacji proteiny.
Grupy węglowodanowe (oligosacharydy) można dogodnie przyłączać do miejsc znanych jako miejsca glikozylacji w proteinach. Ogólnie, połączenia oligosacharydów przez atom tlenu występują w przypadku reszt serynowych (Ser) lub treoninowych (Thr), podczas gdy połączenia oligosacharydów przez atom azotu występują w przypadku reszt asparaginowych (Asn), gdy są one częścią sekwencji Asn-X-Ser/Thr, gdzie X może być dowolnym aminokwasem z wyjątkiem proliny. Jednym z rodzajów cukru spotykanym powszechnie w obu typach jest kwas N-acetyloneuraminowy (określany jako kwas sialowy). Kwas sialowy jest zwykle końcową resztą w oligosacharydach połączonych przez atom azotu oraz połączonych przez atom tlenu i dzięki swemu negatywnemu ładunkowi, może nadawać właściwości kwasowe związkowi zglikozylowanemu. Takie miejsce(a) można włączyć do linkera związków
PL 224 701 B1 według obecnego wynalazku i korzystnie ich glikozylacja następuje w komórkach podczas rekombin acyjnego wytwarzania związków polipeptydowych (przykładowo w komórkach ssaków takich, jak CHO, BHK, COS). Jednakże, takie miejsca można dodatkowo glikozylować znanymi w sztuce metodami syntetycznymi lub semi-syntetycznymi.
Inne możliwe modyfikacje obejmują hydroksylację proliny oraz lizyny, fosforylację grup hydroksylowych reszt serylowej lub treonylowej, utlenienie atomu siarki w Cys, metylowanie grup alfaaminowych bocznych łańcuchów lizyny, argininy oraz histydyny [Creighton, Proteins: Structure and Molecule Properties, (W. H. Freeman & Co., San Francisco, str. 79-86 (1983)].
Związki według obecnego wynalazku mogą również być zmienione na poziomie DNA. Sekwencja DNA dla dowolnej części związku może być zmieniona na kodony bardziej kompatybilne z wybr aną komórką gospodarza. W przypadku E. coli, której komórki są korzystnymi komórkami gospodarza, w stanie techniki znane są zoptymalizowane kodony. Kodony mogą być podstawione w celu wyelim inowania miejsc restrykcyjnych lub w celu wprowadzenia uśpionych (wyciszonych) miejsc restrykcyjnych, które mogą ułatwiać przetwarzanie DNA w wybranej komórce gospodarza. Podłoże, linker oraz sekwencje DNA peptydu mogą być modyfikowane w celu uwzględnienia dowolnej z wyżej omówionych zmian sekwencji.
Dojrzewanie z powinowactwem
W pewnym wykonaniu obecny wynalazek obejmuje „dojrzałe z powinowactwem” peptydy oraz ciała peptydowe. Procedura „dojrzewania z powinowactwem” uwzględnia zwiększenie powinowactwa lub bioaktywności peptydów oraz ciał peptydowych według obecnego wynalazku, z wykorzystaniem prezentacji fagowej lub innych technologii selekcji. W oparciu o sekwencję zgodną (która jest generowana w celu zebrania pokrewnych peptydów), można wygenerować ukierunkowane wtórne biblioteki prezentacji fagowej, w których „rdzeniowe” aminokwasy (ustalone dzięki sekwencji zgodnej) utrzymywane są na stałym poziomie lub pojawiają się zgodnie z ustaloną częstotliwością występowania. A lternatywnie, indywidualną sekwencję peptydową można zastosować do wygenerowania korzystnie ukierunkowanej biblioteki prezentacji fagowej. Selekcjonowanie za pomocą takich bibliotek może prowadzić do otrzymania peptydów (które mogą być przekształcone w ciała peptydowe) ze zwiększoną zdolnością wiązania z Ang-2 lub ze zwiększoną bioaktywnością.
Nie-peptydowe analogi/mimetyki protein
Ponadto, uwzględniono także nie-peptydowe analogi peptydów, które zapewniają stabilizację struktury lub zmniejszoną biodegradowalność. Analogi peptydowych mimetyków można wytwarzać w oparciu o wybrany peptyd inhibitorowy przez zamianę jednej lub więcej niż jednej reszty przez ugrupowania nie-peptydowe. Korzystnie, nie-peptydowe ugrupowania pozwalają zachować peptydowi jego naturalną konformację lub stabilizują korzystną, przykładowo bioaktywną, konformację, która zachowuje zdolność do rozpoznawania i wiązania Ang-2. W pewnym aspekcie, otrzymane analogi/mimetyki wykazują zwiększone powinowactwo wiążące Ang-2. Jeden z przykładowych sposobów wytwarzania niepeptydowych analogów mimetycznych z peptydów opisano w: Nachman i wsp., Regul. Pept. 57:359-370 (1995). Jeżeli jest to pożądane, peptydy według wynalazku mogą być modyfikowane, przykładowo w wyniku glikozylacji, amidowania, karboksyIacji, lub fosforylacji, lub w wyniku tworzenia kwasowych soli addycyjnych, amidów, estrów, w szczególności C-końcowych estrów oraz N-acylowych pochodnych peptydów według wynalazku. Ciała peptydowe mogą być także modyfikowane dając pochodne peptydów w wyniku tworzenia kowalencyjnych lub niekowalencyjnych kompleksów z innymi ugrupowaniami. Kowalencyjnie połączone kompleksy można wytwarzać w wyniku łączenia chemicznych ugrupowań z grupami funkcyjnymi w łańcuchach bocznych aminokwasów zawierających ciała peptydowe albo przy N- lub C-końcach.
W szczególności, przewiduje się, że peptydy mogą być sprzężone z grupą reportera, włączając - lecz nie wyłącznie: radioznakowanie, znakowanie fluorescencyjne, enzym (przykładowo, który katalizuje reakcję kolorymetryczną lub fluorometryczną), substrat, stałą matrycę lub nośnik (przykładowo, biotyna lub awidyna). W związku z tym, obecne ujawnienie zapewnia cząsteczkę zawierającą cząsteczkę ciała peptydowego, gdzie cząsteczka ta korzystnie zawiera dalej grupę reportera wybraną z grupy obejmującej radioznakowanie, znakowanie fluorescencyjne, enzym, substrat, stałą matrycę oraz nośnik. Takie znakowania są dobrze znane biegłym w sztuce, przykładowo w szczególności uwzględniono znakowania biotyną. Stosowanie takich znakowań jest dobrze znane biegłym w sztuce i jest opisane przykładowo w patentach nr US 3,817,837; US 3,850,752; US 3,996,345 oraz US 4,277,437. Inne znakowania, które będą przydatne, obejmują, lecz nie wyłącznie: radioaktywne znakowania, znakowania fluorescencyjne oraz znakowania chemiluminescencyjne. Patenty udzielone
PL 224 701 B1 w Stanach Zjednoczonych Am. dotyczące stosowania takich znakowań obejmują, przykładowo, patenty nr US 3,817,837; US 3,850,752; US 3,939,350 oraz US 3,996,345. Dowolne z ciał peptydowych według obecnego wynalazku mogą zawierać jedno, dwa lub więcej jakichkolwiek z tych znakowań.
Sposoby wytwarzania peptydów
Peptydy według obecnego wynalazku można generować stosując szeroki zakres technik znanych w stanie techniki. Przykładowo, takie peptydy można syntezować w roztworze lub na stałym podłożu według konwencjonalnych technik. Dostępne są różne automatyczne syntetyzery i mogą być stosowane według znanych protokołów. Patrz, przykładowo, Stewart i Young (jak wyżej); Tam i wsp., J. Am. Chem. Soc., 105:6442, (1983); Merrifield, Science 232:341-347 (1986); Barany i Merrifield, The Peptydes, Gross & Meienhofer, wyd. Academic Press, New York, 1 -284; Barany i wsp., Int. J. Pep. Protein Res., 30:705-739 (1987); oraz patent nr US 5,424,398, z których to pozycji wszystkie są włączone tutaj jako odnośniki literaturowe.
W sposobach syntez peptydów w fazie stałej stosuje się kopoli(styren-diwinylobenzen) zawierający 0,1-1,0 mM aminy/gram polimeru. W tych sposobach syntezy peptydu stosuje się zabezpieczenie grup α-aminowych butyloksy-karbonylem (t-BOC) lub 9-fluorenylometyloksy-karbonylem (FMOC). Oba sposoby obejmują etapowe syntezy, w których pojedynczy aminokwas dodaje się w każdym etapie, wychodząc od C-końca peptydu (Patrz, Coligan i wsp., Curr. Prot. Immunol., Wiley Interscience, 1991, część 9). Na zakończenie chemicznych syntez, syntetyczny peptyd można odbezpieczyć usuwając grupy blokujące aminokwas: t-BOC lub FMOC, poprzez odszczepienie od polimeru przez potraktowanie kwasem w obniżonej temperaturze (przykładowo, ciekły HF-10% anizol przez około 0,25 do około 1 godziny w temperaturze 0°C). Po odparowaniu reagentów, peptydy ekstrahuje się z polimeru przy użyciu 1% kwasu octowego, który następnie liofilizuje się otrzymując surowy materiał. Może być on normalnie oczyszczany takimi technikami jak filtracja żelowa na Sephadex G-15 przy użyciu 5% kwasu octowego jako rozpuszczalnika. Liofilizacja odpowiednich frakcji z kolumny prowadzi do otrzymania homogenicznych peptydów lub pochodnych peptydów, które następnie można badać takimi standardowymi technikami jak analizy aminokwasów, metoda chromatografii cienkowarstwowej, metoda HPLC - wysoko wydajnej chromatografii cieczowej, spektroskopia absorpcyjna w nadfiolecie, molarna rotacja, rozpuszczalność oraz ilościowa degradacja Edmana w fazie stałej.
Inne sposoby, takie jak selekcja peptydów z biblioteki prezentacji fagowej, są także dostępne. Biblioteki można wytwarzać z zestawów aminokwasów, jak tutaj opisano. Prezentacja fagowa może być szczególnie skuteczna w identyfikacji przydatnych peptydów według wynalazku. Krótko mówiąc, można wytwarzać bibliotekę fagową (stosują, przykładowo, ml 13, fd, lub fag lambda), prezentujących inserty od około 4 do około 80 reszt aminokwasowych. Inserty mogą reprezentować, przykładowo całkowicie rozłożony lub korzystnie uszeregowany układ. Następnie można wyselekcjonować fagi z dołączonymi insertami, które wiążą się z pożądanym antygenem. Proces ten może być powtórzony w kilku cyklach reselekcji fagu, który wiąże się z pożądanym antygenem. Powtórzone rundy prowadzą do wzbogacenia fagu z dołączonymi szczególnymi sekwencjami. Analizy sekwencji DNA mogą być prowadzone w celu identyfikacji sekwencji ekspresjonowanych peptydów. Można oznaczyć najmniejszą liniową część sekwencji, która wiąże się z pożądanym antygenem. Można powtórzyć procedurę stosując korzystną bibliotekę zawierającą inserty zawierające część lub całą najmniejszą liniową część plus jedną lub więcej niż jedną dodatkową zdegenerowaną resztę „w górę” lub „w dół” względem niej. Technikami tymi można identyfikować peptydy według wynalazku z jeszcze większym powinowactwem wiązania z Ang-2 w porównaniu ze środkami już tutaj zidentyfikowanymi.
Bez względu na sposób w jaki wytwarza się peptydy, cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca każdy taki peptyd oraz ciało peptydowe może być generowane przy użyciu standardowych procedur rekombinacyjnego DNA. Sekwencja nukleotydowa takich cząsteczek DNA może być odpowiednio manipulowana bez zmiany sekwencji aminokwasowej, jaką dany kwas koduje ze skutkiem w postaci degeneracji kodu kwasu nukleinowego oraz preferencyjnych kodonów dla określonych komórek gospodarza.
Techniki rekombinacyjnego DNA są dogodną metodą wytwarzania ciał peptydowych o pełnej długości oraz innych dużych proteinowych środków specyficznie wiążących według obecnego wynalazku lub ich fragmentów. Cząsteczka cDNA kodująca przeciwciało lub fragment może być wstawiona do wektora ekspresji, który z kolei może być wprowadzony do komórki gospodarza w celu wytworzenia przeciwciała lub fragmentu.
Generalnie, cząsteczkę DNA kodującą peptyd lub ciało peptydowe można otrzymać przy użyciu procedur tu opisanych w sekcji z przykładami. Sondy oraz typowe warunki hybrydyzacji są takie jak
PL 224 701 B1 opisano w: Ausubel i wsp., (Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols Press [1994]). Po hybrydyzacji, zbiór wybrany przez sondy można przemyć zachowując odpowiednią surowość warunków, w zależności od takich czynników, jak: wielkość sondy, spodziewana homologia sondy względem klonu, rodzaj biblioteki poddanej skriningowi oraz od liczby klonów poddanych skriningowi. Przykładem skriningu w warunkach wysokiej surowości są 0,1 X SSC oraz 0,1% SDS w temperaturze w przedziale 50-65°C.
Metody dwu-hybrydowego skriningu przy użyciu drożdży także mogą być stosowane do ident yfikacji peptydów według wynalazku, które wiążą się z Ang-2. Zatem, antygen lub jego fragment, można stosować do skriningu bibliotek peptydowych, włącznie z bibliotekami prezentacji fagowej, w celu identyfikacji oraz selekcji środków wiążących Ang-2, przykładowo, ciał peptydowych, według obecnego wynalazku.
Alternatywnie, rozmaite systemy ekspresji wektor/gospodarz mogą być wykorzystywane do wprowadzenia oraz ekspresji peptydów według wynalazku. Systemy te obejmują, lecz nie wyłącznie: mikroorganizmy takie jak bakterie transformowane wektorami ekspresji rekombinacyjnego DNA bakteriofagowego plazmidowego lub kosmidowego; drożdże transformowane drożdżowymi wektorami ekspresji; systemy komórkowe owadów infekowane wirusowymi wektorami ekspresji (przykładowo, wirusem baculovirus); systemy komórkowe roślin transfekowane wirusowymi wektorami ekspresji (przykładowo, wirusem mozaiki kalafiorowej, CaMV; wirus mozaiki tytoniowej, TMV) lub transformowane bakteryjnymi wektorami ekspresji (przykładowo, Ti lub plazmidem pBR322); albo zwierzęce systemy komórkowe. Ssacze komórki, które są przydatne w wytwarzaniu rekombinacyjnej proteiny obejmują, lecz nie wyłącznie: komórki VERO, komórki HeLa, linie komórkowe jajnika chińskiego chomika (CHO), komórki COS (takie jak COS-7), W138, BHK, HepG2, 3T3, RIN, MDCK, A549, PC12, K562 oraz komórki 293. Przykładowe protokoły rekombinacyjnej ekspresji peptydów opisano te poniżej.
Określenie „wektor ekspresji” odnosi się do plazmidu, faga, wirusa lub wektora, do ekspresjonowania polipeptydu na podstawie sekwencji DNA (RNA). Wektor ekspresji może zawierać transkrypcyjną jednostkę zawierającą zespół, w którego skład wchodzą (1) genetyczny element lub elementy posiadające regulatorową rolę w ekspresji genu, przykładowo, promotory lub wzmacniacze, (2) struktura lub sekwencja kodująca środek wiążący, która jest transkrybowana w mRNA i translowana w proteinę oraz (3) właściwe sekwencje inicjacji i zakończenia transkrypcji. Jednostki strukturalne przeznaczone do stosowania w drożdżach lub w eukariotycznych systemach ekspresji, korzystnie obejmują sekwencję lidera umożliwiającą zewnątrzkomórkowe wydzielanie translowanej proteiny przez komórkę gospodarza. Alternatywnie, jeżeli rekombinacyjna proteina jest ekspresjonowana bez sekwencji lidera lub sekwencji transportowej, może ona obejmować aminokońcową resztę metioninową. Reszta ta może - lecz nie musi - być następnie odszczepiona od ekspresjonowanej rekombinacyjnej proteiny, zapewniając końcowy produkt peptydowy.
Przykładowo, peptydy mogą być rekombinacyjnie ekspresjonowane w drożdżach przy użyciu dostępnego w handlu systemu ekspresji, przykładowo Pichia Expression System (Invitrogen, San Diego, CA), według instrukcji producenta. Ten system także opiera się na sekwencji pre-pro-alfa kierującej wydzielaniem, lecz transkrypcja wstawki jest powodowana przez promotor oksydazy alkoholowej (AOX1) po indukcji metanolem.
Wydzielony peptyd oczyszcza się z pożywki wzrostu drożdży metodami, przykładowo stosowanymi do oczyszczania peptydu z bakteryjnych i ssaczych supernatantów komórkowych.
Alternatywnie, cDNA kodujący peptyd można sklonować do baculowirusowego wektora ekspresji pVL1393 (PharMingen, San Diego, CA). Wektor ten może być stosowany według instrukcji producenta (PharMingen) do zainfekowania komórek Spodoptera frugiperda w pożywce sF9 wolnej od protein, oraz do wytwarzania rekombinacyjnej proteiny. Rekombinacyjną proteinę można oczyszczać oraz zatężać z pożywki stosując kolumny typu heparyna-sefaroza (Pharmacia).
Alternatywnie, można prowadzić ekspresję peptydu w systemie owadzim. Systemy owadzie do ekspresji protein są dobrze znane biegłym w sztuce. W jednym takim systemie, może być wykorzystany wirus Autographa californica nuclear polyhedrosis (AcNPV) jako wektor do ekspresji obcych genów w komórkach Spodoptera frugiperda lub w larwach Trichoplusia. Sekwencję kodującą peptyd można wklonować do nieistotnego obszaru wirusa, takiego jak gen polihedryny i umieścić pod kontrolą promotora polihedryny. Zakończone powodzeniem wstawienie peptydu spowoduje inaktywację genu polihedryny oraz wytworzenie rekombinacyjnego wirusa pozbawionego otoczki z białka otoczkowego. Rekombinacyjne wirusy mogą być stosowane do zainfekowania komórek S. frugiperda lub larw
PL 224 701 B1
Trichoplusia, w których następuje ekspresja peptydu [Smith i wsp., J Virol 46: 584 (1983); Engelhard i wsp., Proc Nat Acad Sci (USA) 91: 3224-7 (1994)].
W innym przykładzie, sekwencję DNA kodującą peptyd można zamplifikować metodą PCR oraz wklonować do odpowiedniego wektora, przykładowo pGEX-3X (Pharmacia). Wektor pGEX jest zaprojektowany do wytwarzania proteiny fuzyjnej zawierającej glutation-S-transferazę (GST), kodowanej przez ten wektor oraz proteiny kodowanej przez fragment DNA wstawiony do miejsca klonowania w wektorze. Primery dla reakcji PCR można wygenerować by zawierały, przykładowo odpowiednie miejsce odszczepienia. Jeżeli ugrupowanie fuzyjne jest stosowane wyłącznie w celu ułatwienia ekspresji lub gdy z innych względów jest ona niepożądana jako dodatek do przedmiotowego interesującego peptydu, rekombinacyjną fuzyjną proteinę można następnie odszczepić od części GST tej prot einy fuzyjnej. Konstrukt pGEX-3X/peptydowy środek specyficznie wiążący transformuje się do komórek E. coli XL-1 Blue (Stratagene, La Jolla CA), a indywidualne transformanty wyizolowuje się i poddaje wzrostowi. Plazmidowy DNA z poszczególnych transformantów można oczyścić i jego część poddać sekwencjonowaniu przy użyciu automatycznego sekwencera, aby potwierdzić obecność wstawionego kwasu nukleinowego kodującego pożądany środek specyficznie wiążący, o właściwej orientacji.
Pewnymi kompozycjami peptydowymi według obecnego wynalazku są takie, w których ciało peptydowe jest sprzężone z dowolnym anty-nowotworowym peptydem, takim jak czynnik nekrozy nowotworu (TNF). W szczególnie korzystnym sposobie, chimeryczne peptydy środka wiążącego specyficznie-TNF generuje się jako rekombinacyjne fuzje z sekwencjami kodującymi peptyd przyłączon ymi w ramce do sekwencji kodujących TNF (Novagen, Madison, WI). cDNA peptyd-TNF może być klonowany do wektora pET-11b (Novagen), a ekspresja TNF-peptyd w BL21 E. coli może być indukowana według instrukcji producenta pET11b. Rozpuszczalny TNF-peptyd może być oczyszczany z bakteryjnych lizatów na drodze preparatyki z siarczanem amonowym, metodą chromatograficzną z oddziaływaniem hydrofobowym w układzie Fenyl-Sepharose 6 z szybkim przepływem, jonowymienną metodą chromatograficzną na DEAE- Sepharose Fast Flow oraz metodą chromatograficzną z filtracją żelową na Sephacryl-S-300 HR.
Proteinę fuzyjną, która może być wytwarzana jako nierozpuszczalne ciało inkluzyjne w bakterii, oczyszcza się jak następuje. Komórki gospodarza niszczy się przez odwirowanie; przemywa się w 0,15 M NaCl, 10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA i zadaje się 0,1 mg/ml lizozymu (Sigma, St. Louis, MO) przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Lizat można sklarować przez sonikację, a szczątki komórek przeprowadza się w zbite grudki przez odwirowanie przez 10 minut przy 12,000 x g. Zbite grudki zawierające proteinę fuzyjną ponownie przeprowadza się w stan zawiesiny w 50 mM Tris, pH 8 oraz 10 mM EDTA, wylewa się na 50% glicerynę i odwirowuje przez 30 minut przy 6000 x g. Zbite grudki można ponownie przeprowadzić w stan zawiesiny w standardowym roztworze solanki buforowanej fosforanami (PBS) wolnym od Mg++ oraz Ca++. Proteinę fuzyjną można dalej oczyszczać przez rozfrakcjonowanie przeprowadzonych w stan zawiesiny grudek metodą SDS-PAGE w warunkach denaturujących (Sambrook i wsp., jak wyżej). Żel można namoczyć w 0,4 M KCl w celu wizualizacji proteiny, którą można wyciąć i elektroeluować metodą SDS na żelu bez buforu. Jeżeli proteina fuzyjna GST jest wytwarzana w bakterii, jako proteina rozpuszczalna, to można ją oczyszczać przy użyciu modułu GST Purification Module (Pharmacia).
Proteina fuzyjna może być poddana wytrawianiu w celu wycięcia GST z peptydu według wynalazku. Reakcję wytrawiania (20-40 mg proteiny fuzyjnej, 20-30 jednostek ludzkiej trombiny (4000 jednostek/mg, Sigma) w 0,5 ml PBS można inkubować przez 16-48 godzin w temperaturze pokojowej i załadować na denaturujący SDS-PAGE żel w celu frakcjonowania produktów reakcji. Żel można namoczyć w 0,4 M KCl w celu wizualizacji wiązań proteinowych. Identyczność wiązania proteinowego odpowiadającego spodziewanej masie cząsteczkowej peptydu może być potwierdzona metodą analizy sekwencji aminokwasowej przy użyciu automatycznego sekwencera (Applied Biosystems Model 473A, Foster City, CA). Alternatywnie, identyczność można potwierdzić przeprowadzając analizę HPLC i/lub spektrometrią masową peptydów.
Alternatywnie, sekwencja DNA kodująca peptyd może być klonowana do plazmidu zawierającego pożądany promotor oraz - ewentualnie, sekwencję liderową [Better i wsp., Science 240:1041-43 (1988)]. Sekwencję tego konstruktu można potwierdzić przez automatyczne sekwencjonowanie. Plazmid może być następnie transformowany do E. coli szczepu MC1061 przy zastosowaniu standardowych procedur z wykorzystaniem inkubowania CaCl2 oraz obróbki bakterii metodą szoku termicznego (Sambrook i wsp., jak wyżej). Transformowaną bakterię można poddać wzrostowi w pożywce LB wzbogaconej carbenicyliną, a wytwarzanie ekspresjonowanej proteiny może być indukowane wzro48
PL 224 701 B1 stem w odpowiedniej pożywce. Jeżeli jest obecna, sekwencja liderowa może mieć wpływ na wydzielanie peptydu i może być wycięta podczas wydzielania.
Wydzieloną rekombinacyjną proteinę można oczyszczać z pożywki hodowli bakteryjnej stosując metody opisane tutaj poniżej.
Ssacze systemy gospodarza do ekspresji proteiny rekombinacyjnej są dobrze znane biegłym w sztuce. Szczepy komórek gospodarza mogą być wybrane ze względu na szczególną zdolność do przetwarzania proteiny otrzymanej w wyniku ekspresji lub wytwarzania pewnych post-translacyjnych modyfikacji, które będą przydatne w nadaniu proteinie aktywności. Takie modyfikacje proteiny obejmują, lecz nie wyłącznie: acetylowanie, karboksylację, glikozylację, fosforylację, lipidowanie oraz acylowanie. Różne komórki gospodarzy, takie jak CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38 oraz podobne, posiadają specyficzną maszynerię komórkową, oraz charakterystyczne mechanizmy dla takich posttranslacyjnych aktywności i mogą być dobierane pod kątem zapewnienia prawidłowej modyfikacji oraz przetwarzania wprowadzonej, obcej proteiny.
Jest korzystne, żeby transformowane komórki stosowane były do długoterminowej, wysoko wydajnej produkcji protein, a zatem pożądana jest stabilna ekspresja. Gdy tylko takie komórki transfo rmuje się wektorami posiadającymi wybieralne markery jednocześnie z pożądaną kasetą ekspresji, komórki można poddać wzrostowi przez 1-2 dni we wzbogaconej pożywce przed jej przestawieniem na selektywne media. Wybieralny marker jest zaprojektowany do nadania odporności w celu selekcji i jego obecność prowadzi do wzrostu i wyodrębnienia komórek, które z powodzeniem ekspresjonują wstawione sekwencje. Odporne grudki stabilnie transformowanych komórek można proliferować stosując techniki hodowli tkankowych odpowiednie dla komórki.
Wiele systemów selekcji można stosować w celu wyodrębniania komórek, które transformowano w celu wytwarzania rekombinacyjnej proteiny. Takie systemy selekcji obejmują, lecz nie wyłącznie: geny kinazy tymidynowej HSV, geny fosforybozylotransferazy hypoksantyno-guaninowej oraz geny fosforybozylo-transferazy adeninowej, odpowiednio w komórkach tk-, hgprt- lub aprt-. Również, odporność anty-metabolitowa może być wykorzystana jako podstawa do selekcji ze względu na DHFR, który nadaje odporność na metotreksanian; gpt, który nadaje odporność na kwas mykofenolowy; neo, który nadaje odporność na aminoglikozyd G418 oraz nadaje odporność na chlorsulfuron; oraz hygro, który nadaje odporność na higromycynę. Dodatkowe wybieralne geny, które mogą być przydatne, obejmują trpB, który pozwala komórkom na wykorzystanie indolu w miejsce tryptofanu lub hisD, który pozwala komórkom na wykorzystanie histynolu w miejsce histydyny. Markery, które zapewniają wskaźnik wizualny do identyfikacji transformantów obejmują antocyjaniny, β-glukuronidazę oraz jej substrat, GUS oraz lucyferazę i substrat - lucyferynę.
Oczyszczanie i ponowne fałdowanie środków specyficznie wiążących
W niektórych przypadkach, środki specyficznie wiążące takie jak peptydy i/lub ciała peptydowe według obecnego wynalazku mogą wymagać „ponownego fałdowania” oraz utlenienia do właściwej, trzeciorzędowej struktury oraz wygenerowania mostków di-siarczkowych, by zyskać biologiczną aktywność. Ponowne fałdowanie może być przeprowadzone przy użyciu wielu procedur dobrze znanych w stanie techniki. Takie metody obejmują, przykładowo wystawienie zsolubilizowanego środka polipeptydowego na działanie pH zwykle powyżej 7, w obecności środka chaotropowego. Selekcja chaotropu jest podobna do wyborów stosowanych w przypadku solubilizacji ciała inkluzyjnego, jednakże chaotrop jest typowo stosowany w niższym stężeniu. Przykładowym środkiem chaotropowym jest guanidyna. W większości przypadków, roztwór do ponownego fałdowania/utleniania będzie również zawierał środek redukujący oraz jego utlenioną postać, w dokładnej proporcji, w celu wygenerowania szczególnego potencjału redox, niezbędnego do przetasowania di-siarczków przy formowaniu mostków cysteinowych. Do kilku zwykle stosowanych par redox zalicza się układy cysteina/cystamina, glutation/ditiobisGSH, chlorek miedzi, ditiotreitol DTT/ditian DTT oraz 2-merkaptoetanol (bME)/ditiobME. W wielu przypadkach, można stosować ko-rozpuszczalnik do zwiększenia skuteczności ponownego fałdowania. Powszechnie stosowane ko-ropuszczalniki obejmują glicerynę, glikol polietylenowy o różnych masach cząsteczkowych oraz argininę.
Będzie pożądane oczyszczenie peptydów oraz ciał peptydowych według obecnego wynalazku. Techniki oczyszczania protein są dobrze znane biegłym w sztuce. Techniki te obejmują, na jednym poziomie, rozfrakcjonowanie surowych frakcji proteinowych i nieproteinowych. Po oddzieleniu peptydu i/lub ciała peptydowego od innych protein, będący przedmiotem zainteresowania peptyd lub polipeptyd może być dalej oczyszczany przy użyciu technik chromatograficznych oraz elektroforetycznych, w celu częściowego lub całkowitego oczyszczenia (lub oczyszczenia do homogeniczności). Metodami
PL 224 701 B1 analitycznymi szczególnie odpowiednimi do otrzymywania ciał peptydowych oraz peptydów według obecnego wynalazku są: chromatografia jonowymienna, chromatografia ekskluzyjna; elektroforeza na żelu poliakryloamidowym; ogniskowanie izoelektryczne. Szczególnie skuteczną metodą oczyszczania peptydów jest szybka proteinowa chromatografia cieczowa lub nawet HPLC.
Pewne aspekty obecnego wynalazku dotyczą oczyszczania, a w szczególnych przykładach realizacji, zasadniczego oczyszczania, ciała peptydowego lub peptydu według obecnego wynalazku. Przez określenie „oczyszczone ciało peptydowe lub peptyd” w znaczeniu tutaj użytym, należy rozumieć kompozycję, możliwą do oddzielenia od innych składników, gdzie ciało peptydowe lub peptyd jest oczyszczony w stopniu odpowiadającym czystości w jakiej jest on otrzymywalny w naturze. Oczyszczony peptyd lub ciało peptydowe zatem również odnosi się do ciała peptydowego lub peptydu, który jest wolny od środowiska, w którym występuje w stanie naturalnym.
Generalnie, określenie „oczyszczony” będzie dotyczyło kompozycji peptydu lub ciała peptydowego, którą poddano rozfrakcjonowaniu by usunąć różne inne komponenty oraz która to kompozycja zasadniczo zachowuje swoją ekspresjonowaną aktywność biologiczną. Kiedy używa się określenia „zasadnicze oczyszczenie”, to odnosi się ono do kompozycji peptydu lub ciała peptydowego, w której ciało peptydowe lub peptyd jest głównym składnikiem kompozycji, stanowiącym około 50%, około 60%, około 70%, około 80%, około 90%, około 95% lub więcej, protein wchodzących w skład tej kompozycji.
W świetle obecnego ujawnienia biegłym w sztuce będą znane różne sposoby ilościowego określenia stopnia oczyszczenia peptydu lub ciała peptydowego. Zalicza się do nich, przykładowo, oznaczenie specyficznej aktywności wiążącej frakcji aktywnej lub oszacowanie ilości peptydu lub ciała pe ptydowego w obrębie frakcji, metodą analizy SDS/PAGE. Korzystnym sposobem oszacowania czystości frakcji peptydu lub ciała peptydowego jest obliczenie aktywności wiążącej tej frakcji, porównanie jej z aktywnością wiążącą wyjściowego ekstraktu, i tym samym obliczenie stopnia oczyszczenia, tu wyrażanego przez „-krotność oczyszczenia”. Jednostki stosowane by wyrazić faktyczną ilość aktywności wiążącej będą, oczywiście, uzależnione od określonej techniki badania wybranej do przeprowadzenia po oczyszczaniu oraz od tego, czy ciało peptydowe lub peptyd wykazuje wykrywalną aktywność wiązania czy też jej nie wykazuje.
Różnorodne techniki odpowiednie do wykorzystania przy określonej metodzie oczyszczania są dobrze znane biegłym w sztuce. Obejmują one, przykładowo, wytrącanie siarczanem amonu, PEG, przeciwciałami (immunowytrącanie) oraz tym podobnymi środkami lub przez denaturację termiczną, a następnie odwirowanie; obróbkę chromatograficzną, taką jak chromatografia oparta na powinowactwie (przykładowo Proteina-A-Sepharose), chromatografia jonowymienna, z filtracją na żelu, z odwróconymi fazami, chromatografia hydroksylo-apatytowa i oparta na powinowactwie; ogniskowanie izoelektryczne; elektroforezę na żelu oraz użycie kombinacji tych i innych technik. Jak to ogólnie wiadomo ze stanu techniki, uważa się, że kolejność przeprowadzenia różnych etapów oczyszczania można zmienić oraz że pewne etapy można pominąć, a mimo to uzyskać w efekcie odpowiednią metodę do wytworzenia zasadniczo oczyszczonego środka specyficznie wiążącego.
Nie ma generalnego wymogu, aby peptyd lub ciało peptydowe według obecnego wynalazku był zawsze dostarczony w swojej najczystszej postaci. Faktycznie, uważa się że zasadniczo mniej oczyszczone produkty zawierające środek specyficznie wiążący będą przydatne w pewnych przykładach wykonania. Częściowe oczyszczanie można osiągnąć przeprowadzając mniej etapów oczyszczania w kombinacji z lub wykorzystując różne formy tego samego ogólnego schematu oczyszczania. Przykładowo, wiadomo, że metoda kationo-wymiennej chromatografii kolumnowej przeprowadzona z wykorzystaniem techniki HPLC będzie generalnie dawać wyższą „-krotność” oczyszczenia, w porównaniu z taką samą techniką zrealizowaną przy użyciu systemu chromatografii niskociśnieniowej. Sposoby wykazujące niższy stopień względnego oczyszczenia mogą okazać się korzystne z punktu widzenia całkowitości wyodrębnienia peptydu lub ciała peptydowego, lub utrzymania aktywności wiążącej peptydu lub ciała peptydowego.
Wiadomo, że migracja peptydu lub polipeptydu może zmieniać się, czasami znacząco, przy różnych warunkach SDS/PAGE [Capaldi i wsp., Biochem. Biophys. Res. Comm., 76: 425 (1977)]. Należy zatem rozumieć, że w różnych warunkach elektroforezy, pozorna masa cząsteczkowa oczyszczonych lub częściowo oczyszczonych produktów środka specyficznie wiążącego uzyskanego w w yniku ekspresji może mieć różną wartość.
PL 224 701 B1
Próby na wiązanie
Immunologiczne próby na wiązanie typowo wykorzystują środek wychwytujący, który wiąże specyficznie, a często unieruchamia analitowy docelowy antygen. Środek wychwytujący jest ugrup owaniem, które specyficznie wiąże się z analitem. W pewnym wykonaniu według obecnego wynalazku, środek wychwytujący jest przeciwciałem lub jego fragmentem, który specyficznie wiąże Ang-2. Te immunologiczne próby na wiązanie są dobrze znane w stanie techniki [patrz, Asai, wyd. Methods in Cell Biology, Tom 37, Antibodies in Cell Biology, Academic Press, Inc., New York (1993)].
Immunologiczne próby na wiązanie wykorzystują często środek znakowany, który będzie s ygnalizował występowanie związanego kompleksu wytworzonego przez środek wychwytujący oraz antygen. Znakowany środek może być jedną z cząsteczek obejmujących związany kompleks; to zn aczy, może być znakowanym środkiem specyficznie wiążącym lub znakowanym anty-środkiem specyficznie wiążącym przeciwciało. Alternatywnie, znakowany środek może być trzecią cząsteczką, zwykle innym przeciwciałem, które wiąże się ze związanym kompleksem. Znakowany środek może być, prz ykładowo, anty-środkiem specyficznie wiążącym przeciwciało, zawierającym znacznik. Drugie przeciwciało, specyficzne względem związanego kompleksu, może nie mieć etykiety, lecz może być związane przez czwartą cząsteczkę specyficzną na gatunki przeciwciał, do gatunku których należy drugie przeciwciało. Przykładowo, drugie przeciwciało może być modyfikowane wykrywalnym ugrupowaniem, takim jak biotyna, która może następnie być związana przez czwartą cząsteczkę, taką jak streptawidyna znakowana enzymem. Inne proteiny, takie jak proteina A lub proteina G, mogą również być st osowane jako środek znakujący. Te proteiny wiążące są normalnymi składnikami ścian komórkowych streptococcal bacteria oraz wykazują silną nieimmunogeniczną reaktywność ze stałym obszarem immunoglobulin pochodzących od różnych gatunków [patrz, ogólnie Akerstrom, J Immunol, 135:25892542 (1985); oraz Chaubert, Mod Pathol, 10:585-591 (1997)].
Przez cały okres trwania tych prób, etapy inkubowania i/lub przemywania mogą być wymagane po każdej kombinacji reagentów. Etapy inkubowania mogą zmieniać się od około 5 sekund do kilku godzin, korzystnie od około 5 minut do około 24 godzin. Jednakże, czas inkubowania będzie zależał od formatu próby, analitu, objętości roztworu, stężeń oraz tym podobnych czynników. Zwykle, próby będą przebiegały w temperaturze otoczenia, chociaż mogą być prowadzone w szerszym przedziale temperatur.
A. Próby na wiązanie niekonkurujące:
Immunologiczne próby na wiązanie mogą być próbami typu nie-konkurującego. W próbach tych mamy do czynienia z pewną ilością wychwyconego analitu, która jest mierzona bezpośrednio. Przykładowo, w pewnej korzystnej próbie „sandwiczowej”, środek wychwytujący (przeciwciało) może być związany bezpośrednio ze stałym substratem, gdzie jest immobilizowany. Te immobilizowane przeciwciała następnie wychwytują antygen obecny w testowanej próbce. Tak immobilizowana proteina wiąże się następnie ze znakowanym środkiem, takim jak drugie przeciwciało posiadające znacznik. W innej korzystnej „sandwiczowej” próbie, drugie przeciwciało nie ma znacznika, lecz może być związane przez znakowane przeciwciało specyficzne na przeciwciała z gatunków, z których pochodzi drugie przeciwciało. Drugie przeciwciało również może być zmodyfikowane wykrywalnym ugrupowaniem, takim jak biotyna, z którą może wiązać się specyficznie trzecia znakowana cząsteczka, taka jak streptawidyna. [Patrz, Harlow i Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Rozdział 14, Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1988), publikacja włączona tu jako odnośnik literaturowy].
B. Próby na wiązanie konkurujące:
Immunologiczne próby na wiązanie mogą być rodzajem prób konkurujących. Ilość analitu obecnego w próbce jest mierzona pośrednio przez zmierzenie ilości dodanego analitu, który zastępuje lub inaczej konkuruje ze środkiem wychwytującym. W pewnej korzystnej próbie na wiązania konkurujące, znana ilość analitu, zwykle znakowanego, jest dodawana do próbki, a próbkę następnie kontaktuje się z przeciwciałem (środek wychwytujący). Ilość znakowanego analitu związanego z przeciwciałem jest odwrotnie proporcjonalna do stężenia analitu obecnego w próbce. (Patrz, Harlow i Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, rozdział 14, str. 579-583, jak wyżej).
W innej korzystnej próbie na wiązanie konkurujące, przeciwciało jest immobilizowane na stałym substracie. Ilość proteiny związanej z przeciwciałem może być określona zarówno przez zmierzenie ilości proteiny obecnej w kompleksie proteina/przeciwciało lub alternatywnie, przez zmierzenie ilości pozostałej, nieskompleksowanej proteiny. Ilość proteiny może być wykryta przez wprowadzenie zn akowanej proteiny. Patrz, Harlow i Lane, jak wyżej.
PL 224 701 B1
Jeszcze inna korzystna próba na wiązanie konkurujące oparta jest na wykorzystaniu inhibitowania n-haptenu. W próbie tej analit podlega immobilizacji na stałym podłożu. Do próbki dodaje się znaną ilość przeciwciała i kontaktuje się próbkę z unieruchomionym analitem. Ilość przeciwciała związanego przez zimmobilizowany analit jest odwrotnie proporcjonalna do ilości analitu obecnego w próbce. Ilość unieruchomionego przeciwciała można wykryć na drodze oznaczenia albo unieruchomionej części przeciwciała lub tej części, która pozostaje w roztworze. Wykrywanie może być bezpośrednie i wówczas przeciwciało jest znakowane - lub pośrednie, wymagające dodania znakowanej reszty, wiążącej się specyficznie z przeciwciałem zgodnie z powyższym opisem.
C. Wykorzystanie prób na wiązanie konkurujące:
Próby na wiązanie konkurujące mogą być stosowane do oznaczania reaktywności sieciującej, aby pozwolić biegłym w sztuce określić, czy proteina lub kompleks enzymu, który jest rozpoznawany przez środek specyficznie wiążący według wynalazku, jest pożądaną proteiną, a nie zaś cząsteczką sieciującą lub w celu określenia, czy przeciwciało to jest specyficzne na antygen i nie wiąże niepokrewnych antygenów. W próbach tego rodzaju, antygen należy unieruchomić na stałym podłożu, a do próby dodaje się mieszaninę nieznanych protein, które będą konkurować we wiązaniu środków specyficznie wiążących z unieruchomioną proteiną. Konkurująca cząsteczka wiąże również jeden lub więcej niż jeden z antygenów postronnych względem antygenu. Zdolność protein do konkurowania w wiązaniu środków specyficznie wiążących przeciwciała z unieruchomionym antygenem jest porównywana z wiązaniem przez tę samą proteinę, która została unieruchomiona na stałym podłożu, aby ustalić reaktywność sieciującą mieszaniny protein.
D. Inne próby na wiązanie:
Obecny wynalazek zapewnia również sposoby Western blot do detekcji lub zliczania obecności Ang-2 w próbce. Technika ogólnie obejmuje rozdział próbek proteinowych metodą elektroforezy na żelu ze względu na ciężar cząsteczkowy oraz przeniesienie protein na odpowiednie stałe podłoże, takie jak filtr nitrocelulozowy, filtr nylonowy lub zderywatyzowany filtr nylonowy. Próbkę inkubuje się z przeciwciałem lub jego fragmentami, które specyficznie wiążą Ang-2, a następnie wykrywa się kompleks powstający w wyniku wiązania. Przeciwciała te mogą być bezpośrednio znakowane lub - alternatywnie, mogą być następnie wykrywane przy użyciu znakowanych przeciwciał, które specyficznie wiążą się z tym przeciwciałem.
Próby diagnostyczne
Przeciwciała lub ich fragmenty tu ujawnione są użyteczne w diagnozowaniu stanów lub chorób charakteryzujących się ekspresją Ang-2 lub jej podjednostek, bądź w próbach monitorowania pacjentów podczas ich leczenia inducerami Ang-2, jego fragmentami, agonistami lub inhibitorami aktywności Ang-2. Próby diagnostyczne dla Ang-2 obejmują sposoby wykorzystywania środka specyficznie wiążącego i znakowanego dla detekcji Ang-2 w ludzkich płynach ustrojowych lub w ekstraktach komórkowych, bądź tkankowych. Środki specyficznie wiążące według obecnego wynalazku mogą być stosowane w postaci zmodyfikowanej lub bez modyfikacji. W korzystnej próbie diagnostycznej, środki specyficznie wiążące będą znakowane przez przyłączenie, przykładowo, etykiety lub cząsteczki reportera. Znany jest szeroki wachlarz etykiet lub cząsteczek reportera, z których niektóre już tutaj opisano. W szczególności, obecny wynalazek jest stosowany w celach diagnostyki chorób u ludzi.
W stanie techniki znane są różne protokoły pomiarów protein Ang-2 przy użyciu ciał peptydowych specyficznych względem odpowiedniej proteiny. Przykłady obejmują próbę z immunosorbentem przyłączonym do enzymu (ELISA), próbę radioimmunologiczną (RIA) oraz sortowanie komórek aktywowanych fluorescencyjnie (FACS). Korzystna jest immunopróba dwumiejscowa, oparta na użyciu przeciwciał monoklonalnych reaktywnych względem dwóch, niekolidujących epitopów Ang-2, lecz można zastosować również próbę na wiązanie konkurujące. Próby te opisano, przykładowo, w: Ma ddox i wsp., J Exp Med, 158:1211 [1983].
W celu zapewnienia podstaw dla diagnozy, ustala się zazwyczaj normalne lub standardowe wartości dla ekspresji ludzkiej Ang-2. Oznaczenie to może być przeprowadzone w wyniku kombinacji płynów ustrojowych lub ekstraktów komórkowych pochodzących od normalnych osobników, korzystnie ludzi, z ciałem peptydowym dla Ang-2, w warunkach odpowiednich do tworzenia kompleksu, które są dobrze znane w sztuce. Ilościowo tworzenie standardowego kompleksu można oznaczyć przez porównanie wiązania ciał peptydowych ze znanymi ilościami proteiny Ang-2, zarówno z próbkami kontrolnymi, jak i z próbkami od chorych. Zatem, standardowe wielkości uzyskane z normalnych próbek można porównać z wartościami otrzymanymi z próbek pochodzących od osobników potencjalnie do52
PL 224 701 B1 tkniętych chorobą. Rozbieżność między wartością standardową a wartościami w próbkach uzyskanych od osobnika wskazuje na rolę Ang-2 w danym stanie chorobowym.
W przypadku zastosowań diagnostycznych, w pewnych wykonaniach, środki specyficznie wiążące typowo będą znakowane wykrywalnym ugrupowaniem. Wykrywalne ugrupowanie może być dowolnym ugrupowaniem, które jest zdolne do wytwarzania, zarówno bezpośrednio, jak i pośrednio, 3 wykrywalnego sygnału. Przykładowo, wykrywalne ugrupowanie może być radioizotopem, takim jak 3H,
Ί A go gc Ί OR
C, P, S, lub I, związkiem fluorescencyjnym lub chemiluminescencyjnym, takim jak fluorescencyjny izotiocyjanian, rodamina lub lucyferyna; bądź enzym, taki jak alkaliczna fosfataza, β-galaktozydaza lub peroksydaza z chrzanu [Bayer i wsp ., Meth Enz, 184: 138-163, (1990)].
Choroby
Obecny wynalazek zapewnia środek specyficznie wiążący, który wiąże się z Ang-2, użyteczny w leczeniu ludzkich chorób oraz stanów patologicznych. Środki, które modulują aktywność wiążącą Ang-2 lub inną aktywność komórkową, mogą być stosowane w połączeniu z innymi środkami terapeutycznymi by zwiększyć ich terapeutyczne wpływy lub zmniejszyć potencjalne niepożądane skutki uboczne.
W innym aspekcie, obecny wynalazek zapewnia reagenty i sposoby użyteczne w leczeniu chorób i stanów charakteryzujących się niepożądanymi lub zniekształconymi poziomami aktywności Ang-2 w komórce. Choroby te obejmują raki oraz inne stany hyperproliferacyjne, takie jak hyperplasia, łuszczyca, zaburzenia immunologiczne oraz bezpłodność.
Obecnie ujawniono także zastosowania medyczne związków według wynalazku do leczenia raka u zwierząt oraz u ludzi, obejmujące podawanie leczonemu skutecznej ilości środka specyficznie wiążącego, który inhibituje lub obniża aktywność Ang-2. Wynalazek obejmuje zastosowania związane ze sposobem inhibitowania wzrostu komórek rakowych, uwzględniając procesy proliferacji komórkowej, inwazyjność oraz fazy przerzutów w układach biologicznych. Zastosowania te obejmują zastos owanie związku według wynalazku jako inhibitora wzrostu komórek rakowych. Korzystnie, sposoby te stosuje się w celu inhibitowania lub redukowania wzrostu komórek rakowych u żywych zwierząt, takich jak ssaki. Zastosowania według wynalazku są również łatwo adaptowalne do stosowania w systemach prób, przykładowo, w próbach na wzrost komórek rakowych oraz na oznaczenie ich właściwości, jak również w próbach na identyfikację związków, które mają wpływ na wzrost komórek rakowych.
Raki nadające się leczenia za pomocą środków leczniczych opartych na związkach według obecnego wynalazku i innych tu ujawnionych, korzystnie występują u ssaków. Ssaki obejmują, przykładowo ludzi oraz inne naczelne, jak również zwierzęta-ulubieńców lub towarzyszy, jak psy czy koty, zwierzęta laboratoryjne takie jak szczury, myszy oraz króliki, a także zwierzęta hodowlane, takie jak konie, świnie, owce oraz bydło.
Nowotwory lub neoplazmy cechuje wzrost komórek tkankowych, gdzie multiplikacja komórek jest niekontrolowana i progresywna. Niektóre z takich „wzrostów” są łagodne, lecz inne są określone jako złośliwe i mogą prowadzić do śmierci organizmu. Złośliwe nowotwory lub raki różnią się od łagodnych tym, że poza przejawianiem agresywnej proliferacji mogą dokonywać inwazji otaczających tkanek. Ponadto, złośliwe nowotwory charakteryzują się tym, że wykazują wyższy zanik różnicowania (większe deróżnicowanie). Tę właściwość określa się również terminem „anaplazja”.
Nowotwory nadające się do leczenia z zastosowaniem związków objętych obecnym wynala zkiem obejmują również stałe guzy, to znaczy raki oraz mięsaki. Do raków zalicza się te złośliwe nowotwory wywodzące się z komórek nabłonkowych, które infiltrują (dokonują inwazji) otaczające tkanki i wchodzą w fazę przerzutów. Gruczolakoraki są rakami pochodzącymi z tkanki gruczołów lub które tworzą rozpoznawalne struktury gruczołowe. Inna szeroka kategoria raków obejmuje mięsaki, które są nowotworami, których komórki są zagnieżdżone we włóknistej lub homogenicznej substancji takiej jak embrionalna tkanka łączna. Wynalazek zapewnia także środki do leczenia raków układów szpikowego lub limfatycznego, w tym białaczek, chłoniaków oraz innych raków, które typowo nie występują w postaci litego guza, lecz rozprzestrzeniają się w układzie naczyń lub siateczki naczyń limfatycznych.
Do rodzajów komórek rakowych lub nowotworowych podatnych na leczenie z zastoso waniem środków objętych wynalazkiem należą, przykładowo guz produkujący ACTH, ostra białaczka limfocytowa, ostra białaczka nie-limfocytowa, rak kory nadnerczy, rak pęcherza moczowego, rak mózgu, rak piersi, rak szyjki macicy, chroniczna białaczka limfocytowa, chroniczna białaczka szpikowa, rak okrężnicy i odbytnicy, chłoniak skórnych komórek T, rak błony śluzowej macicy, rak przełyku, mięsak Ewing'a, rak woreczka żółciowego, białaczka włochatokomórkowa, chroniczna białaczka, rak głowy i karku, chłoniak Hodgkina, mięsak Kaposi'ego, rak nerek, rak wątroby, rak płuc (małokomórkowy oraz
PL 224 701 B1 niemałokomórkowy), złośliwy wysięk otrzewnowy, złośliwy wysięk opłucnej, czerniak, śródbłoniak, szpiczak mnogi, nerwiak niedojrzały, glejak, chłoniak nie-Hodgkin'a, mięsak kostny (osteosarkoma), rak jajnika, rak (komórek płciowych) jajnika, rak trzustki, rak penisa, rak prostaty, siatkówczak, rak skóry, mięsak tkanek miękkich, rak komórek łuskowatych, rak żołądka, rak jąder, rak tarczycy, nowotwory trofoblastów, rak macicy, rak pochwy, rak warg sromowych oraz guz Wilmsa.
Przydatność wynalazku w szczególności jest tu zilustrowana w odniesieniu do leczenia pewnych rodzajów eksperymentalnie zdefiniowanych raków. W tych ilustracyjnych procesach, stosowano modele in vitro oraz in vivo, standardowo wykorzystywane w stanie techniki. Metody te mogą być stosowane do identyfikacji środków, co do których można oczekiwać, że okażą się skuteczne w systemach leczenia in vivo. Jednakże będzie zrozumiałe, że leczenie z wykorzystaniem związków według wynalazku nie jest ograniczone do leczenia tego rodzaju nowotworów, lecz rozciąga się na dowolny stały nowotwór wywodzący się z układu dowolnego organu. Raki, których inwazyjność lub zdolność do przerzutów związane są z ekspresją lub aktywnością Ang-2, są w szczególności podatne na inhibitowanie sposobami opartymi na zastosowaniu związków według wynalazku, a nawet mogą pod ich wpływem cofnąć się.
Terapia ta może być także stosowana w praktyce w taki sposób, że związek według wynalazku, taki jak ciało peptydowe, może być stosowany w kombinacji innym antyrakowym środkiem chemoterapeutycznym, takim jak dowolny konwencjonalny środek chemoterapeutyczny. Kombinacja obecnego środka specyficznie wiążącego z takimi innymi środkami może wzmocnić oddziaływanie chemoterapeutyczne. Biegli w sztuce znajdą liczne protokoły stosowania środków chemoterapeutycznych, odpowiednie do włączenia do leczenia w oparciu o środki według wynalazku. Można stosować dowolny środek chemoterapeutyczny, w tym: środki alkilujące, antymetabolity, hormony oraz antagonisty, radioizotopy, jak również naturalne produkty. Przykładowo, związek według wynalazku może być podawany łącznie z antybiotykami, takimi jak doksorubicyna oraz inne analogi antracykliny, chlorometyny, takie jak cyklofosfamid, analogi pirymidyny, takie jak 5-fluorouracyl, cisplatyna, hydroksymocznik, taksol oraz jego naturalne lub syntetyczne pochodne oraz tym podobne. Innym przykładem, w przypadku mieszanych nowotworów, takich jak gruczolakorak piersi, gdzie nowotwory zawierają komórki zależne od gonadotropiny oraz gonadotropino-niezależne, związek może być podawany łącznie z leuprolidem lub gosereliną (syntetycznymi peptydowymi analogami LH-RH). Inne anty-nowotworowe protokoły obejmują stosowanie związku tetracyklinowego z innym trybem leczenia, przykładowo, z operacją chirurgiczną, z naświetlaniem, itp., określanych tu również jako „stowarzyszone lecznicze zabiegi przeciwnowotworowe”. A więc, środek według wynalazku może być stosowany łącznie z takimi konwencjonalnymi reżimami o takim dobroczynnym skutku, jak redukcja niepożądanych skutków ubocznych oraz zwiększenie skuteczności.
Obecny wynalazek zapewnia zatem kompozycje i środki przydatne w leczeniu szerokiej palety raków, włącznie ze stałymi guzami i białaczkami. Do rodzajów raka, które mogą być tak leczone należą - lecz nie wyłącznie: gruczolakorak piersi, prostaty oraz okrężnicy; wszystkie postacie odoskrzelowego raka płuc; szpiczak; czerniak; wątrobiak; nerwiak niedojrzały; brodawczak; apudoma; choristoma; guz skrzelopochodny; syndrom rakowiaka złośliwego; rakowiakowa choroba serca; rak (przykładowo, Walkera, podstawnokomórkowy, zasadochłonny kolczystokomórkowy, Browna-Pearcea, przewodowy, nowotwór Ehrlicha, Krebsa 2, komórek merkelowych, śluzowaty, nie-małokomórkowy rak płuc, owsianokomórkowy, brodawczakowaty, rak włóknisty, oskrzelkowy, odoskrzelowy, kolczystokomórkowy oraz komórek przejściowych); zaburzenia histiocytowe; białaczka; histiocytoza złośliwa; choroba Hodgkina; immunoproliferacyjny małokomórkowy rak płuc; chłoniak nie-Hodgkina; szpiczak mnogi (plazmocytoma); siatkowicośródbłonkowica białaczkowa; czerniak; rak komórek chrząstkotwórczych (chrzęstniak niedojrzały); chrzęstniak; chrzęstniakomięsak; włókniak; włókniakomięsak; nowotwory komórek olbrzymich; włókniak komórkowy (histiocytoma); tłuszczak; tłuszczako-mięsak; śródbłoniak (mezotelioma); śluzak; śluzakomięsak; kostniak; kostniakomięsak; struniak; przewodziak czaszkowogardłowy; dysgerminoma; hamartoma; mezenchymiak; śródnerczak; mięśniako-mięsak; szkliwiak niedojrzały; szkliwiak (cementoma); zębiak; potwomiak; grasiczak; guz tofoblastowy. Ponadto, do raków, które także mogą być leczone należą: gruczolak; gruczolak z przewodów żółciowych; perlak (cholesteatoma); cyklindroma; gruczakolakotorbielakorak; gruczakolako-torbielak; guz komórek granulozowych; gynandroblastoma; wątrobiak; gruczakolak z gruczołów potowych; guz komórek wysepk owych; guz komórek Leydiga; brodawczak; guz komórek Sertoliego; otoczkowiak; mięśniak gładkokomórkowy; mięśniak gładkokomórkowy mięsakowy; mięśniak niedojrzały (mioblastoma); mięśniak; mięśniako-mięsak; mięśniak prążkowanokomórkowy; mięśniak prążkowanokomórkowy mięsakowy;
PL 224 701 B1 mięśniak z wyściółki (ependymoma); zwojakonerwiak; glejak; rdzeniak niedojrzały; oponiak; osłoniak nerwowy; nerwiak niedojrzały; nabłoniak nerwowy; włókniak nerwowy; nerwiak; nerwiak przyzwojowy; nerwiak przyzwojowy niechromochłonny; rogowiec krwawy (angiokeratoma); rozrost naczyń chłonnych z eozinofilią (kwasochłonnością); naczyniak twardniejący; naczyniakowatość; kłębczak; śródbłoniak krwionośny; naczyniak krwionośny; pericytoma krwionośna; naczyniak krwionośny mięsakowy; naczyniak limfatyczny; mięśniak naczyń chłonnych; mięsak naczyń chłonnych; gruczolak szyszynki (pinealoma); rakomięsak; chrzęstniakomięsak; torbielakomięsak liściasty; włókniakomięsak; hemangiomięsak; leiomyomięsak; leukomięsak; tłuszczakomięsak; mięsak naczyń krwionośnych; mięśniakomięsak; śluzakomięsak; rak jajnika; mięśniak prążkowanokomórkowy mięsakowy; mięsak; nowotwory; nerwiakowatość (neurofibromatoza) oraz dysplazja szyjki.
Innym aspektem obecnego wynalazku jest zastosowanie materiałów oraz środków według obecnego wynalazku w celu zapobiegania i/lub leczenia dowolnych stanów hiperproliferacyjnych skóry, w tym łuszczycy oraz stykowego zapalenia skóry lub innych hiperproliferacyjnych chorób. Wykazano, że pacjenci dotknięci łuszczycą oraz stykowym zapaleniem skóry posiadają zwiększoną aktywność Ang-2 w obrębie miejsc dotkniętych chorobą [Ogoshi i wsp., J. Inv. Dermatol., 110:818-23 (1998)]. Korzystnie, środek specyficznie wiążący Ang-2 będzie stosowany w kombinacji z innymi środkami farmaceutycznymi w celu leczenia ludzi, u których rozwijają się te objawy kliniczne. Środek sp ecyficznie wiążący może być dostarczony przy użyciu dowolnego spośród różnego rodzaju nośników, wykorzystując opisane tu drogi podawania oraz inne, które są dobrze znane biegłym w sztuce.
Inne aspekty obecnego wynalazku obejmują środki do leczenia różnych retinopatii (włączając retinopitię cukrzycową oraz związaną z wiekiem degenerację plamki), przy których zachodzi angiogeneza, jak również zaburzeń/chorób żeńskiego układu rozrodczego, takich jak gruczolistość, mięśniaki macicy, a także innych takich stanów związanych z dysfunkcyjną proliferacją naczyń (w tym wzrost mikronaczyń w błonie śluzowej macicy) podczas żeńskiego cyklu reprodukcyjnego.
W jeszcze innym aspekcie obecny wynalazek odnosi się do medycznych zastosowań do leczenia odbiegającego od normy wzrostu naczyń, w tym mózgowych zniekształceń tętniczo-żylnych (AVMs), uszkodzeń i regeneracji błony śluzowej przewodu pokarmowego (żołądkowo-jelitowego), owrzodzeń dwunastnicy u pacjentów po chorobie wrzodowej układu trawiennego, łącznie z miejscowym niedokrwieniem wynikającym z udaru, szerokim wachlarzem naczyniowych zaburzeń w płucach przy chorobie wątroby oraz nadciśnienia wrotnego u pacjentów z niewątrobowym nadciśnieniem wrotnym.
Innym aspektem obecnego ujawnienia jest wykorzystanie środków według wynalazku w profilaktyce przeciwrakowej, oparte na wykorzystaniu kompozycji i sposobów tu ujawnionych. Reagenty takie będą obejmować środki specyficznie wiążące, takie jak ciała peptydowe przeciw Ang-2.
Kompozycje farmaceutyczne
Kompozycje farmaceutyczne środków specyficznie wiążących Ang-2 są objęte zakresem obecnego wynalazku. Kompozycje farmaceutyczne mogą obejmować przeciwciała opisane szczegółowo, przykładowo w patencie nr US 6,171,586, dla Lam i wsp., wydanym 9 stycznia 2001 roku. Takie kompozycje obejmują terapeutycznie lub profilaktycznie skuteczną ilość środka specyficznie wiążącego, takiego jak przeciwciało, jego fragment, odmiana, pochodna lub fuzja, jak tutaj opisano, w mieszaninie z farmaceutycznie dopuszczalnym środkiem. W korzystnym wykonaniu, kompozycje farmaceutyczne obejmują środki specyficznie wiążące antagonistę, które modulują częściowo lub całkowicie co najmniej jedną biologiczną aktywność Ang-2, w mieszaninie z farmaceutycznie dopuszczalnym środkiem. Typowo, środki specyficznie wiążące będą wystarczająco oczyszczone dla podawania zwierzętom.
Kompozycja farmaceutyczna może zawierać materiały do formulacji dla modyfikowania, utrzymywania lub zabezpieczania, przykładowo, pH, osmolarności, lepkości, klarowności, barwy, izotoniczności, zapachu, sterylności, stabilności, szybkości rozpuszczania lub uwalniania, adsorpcji lu b penetracji kompozycji. Odpowiednie materiały do formulacji obejmują, lecz nie wyłącznie: aminokwasy (takie jak glicyna, glutamina, asparagina, arginina lub lizyna); środki przeciwmikroorganizmowe; ant yutleniacze (takie jak kwas askorbinowy, siarczyn sodu lub kwaśny siarczyn sodu); bufory (takie jak boranowy, kwaśny węglan, Tris- HCl, cytrynianowe, fosforanowe, innych kwasów organicznych); substancje masotwórcze (takie jak mannitol lub glicyna), środki chelatujące, takie jak kwas etylenodiaminoczterooctowy (EDTA); środki kompleksujące (takie jak kofeina, poliwinylopirolidon, β-cyklodekstryna lub hydroksypropylo-beta-cyklodekstryna); wypełniacze; monosacharydy; disacharydy oraz inne węglowodany (takie jak glukoza, mannoza, lub dekstryny); proteiny (takie jak albumina surowicy, żelatyna lub immunoglobuliny); środki barwiące; środki zapachowe oraz rozcieńczające; środki emulgujące;
PL 224 701 B1 polimery hydrofilowe (takie jak poliwinylopirolidon); polipeptydy o niskiej masie cząsteczkowej; podwójne jony tworzące sól (takie jak sód); środki zabezpieczające (takie jak chlorek benzalkoniowy, kwas benzoesowy, kwas salicylowy, timerosal, alkohol fenetylowy, metyloparaben, propyloparaben, chloroheksydyna, kwas sorbowy lub nadtlenek wodoru); rozpuszczalniki (takie jak gliceryna, glikol propylenowy lub glikol polietylenowy); alkohole cukrowe (takie jak mannitol lub sorbitol); środki tworzące zawiesinę; środki powierzchniowo czynne lub środki zwilżające (takie jak pluroniki, PEG, estry sorbitanowe, polisorbaty, takie jak polisorbat 20, polisorbat 80, triton, trometamina, lecytyna, cholesterol, tyloksapal); środki zwiększające stabilność (cukier trzcinowy lub sorbitol); środki zwiększające toniczność (takie jak chlorowcopochodne metali alkalicznych (korzystnie chlorek sodu lub potasu, mannitol sorbitol); podłoża dostarczające; rozcieńczalniki; zaróbki i/lub farmaceutyczne adiuwanty (pomocnicze środki obojętne). (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18-te wydanie, A.R. Gennaro, wyd., Mack Publishing Company, 1990).
Optymalne kompozycje farmaceutyczne będą określone przez biegłego w sztuce w zależności od, przykładowo zamierzonej drogi podawania, formy dostarczania oraz pożądanej dawki. Patrz, przykładowo, Remington's Pharmaceutical Sciences, jak wyżej. Takie kompozycje mogą wpływać na stan fizyczny, stabilność, szybkość uwalniania in vivo oraz szybkość usuwania in vivo środka specyficznie wiążącego.
Pierwszorzędowe podłoże lub nośnik w kompozycji farmaceutycznej mogą być w swojej naturze wodne lub nie-wodne. Przykładowo, odpowiednim podłożem lub nośnikiem może być woda do iniekcji, fizjologiczny roztwór solanki lub sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy, ewentualnie uzupełnione innymi materiałami zwykle występującymi w kompozycjach dla podawania pozajelitowego. Solanka buforowana w środowisku obojętnym lub solanka zmieszana z albuminą surowicy są dalszymi przykładowymi podłożami. Inne przykładowe kompozycje farmaceutyczne obejmują bufor Tris o pH około 7,0-8,5 lub bufor octanowy o pH około 4,0-5,5, które mogą dalej zawierać sorbitol lub odpowiedni jego substytut. W pewnym wykonaniu według obecnego wynalazku, kompozycje środka wiążącego mogą być wytwarzane w celu przechowywania przez zmieszanie wybranych kompozycji zawierających pożądany stopień czystości ze środkami o optymalnej formulacji (Remington's Pharmaceutical Sciences, jak wyżej) w postaci liofilizowanego „ciastka” lub wodnego roztworu. Dalej, produkt środka wiążącego może być formułowany w postaci liofilizatu przy użyciu odpowiednich zaróbek, takich jak sacharoza.
Kompozycje farmaceutyczne mogą być wyselekcjonowane do podawania pozajelitowego. Alternatywnie, kompozycje mogą być wybrane do podawania na drodze inhalacji lub dojelitowo, takiego jak podawanie doustne, douszne, oftalmiczne (dooczne), doodbytnicze lub dopochwowe. Wytwarzanie takich farmaceutycznie dopuszczalnych kompozycji jest znane biegłym w sztuce.
Komponenty do formulacji występują w stężeniach, które są dopuszczalne ze względu na drogę podawania. Przykładowo, bufory są stosowane do utrzymania fizjologicznego pH kompozycji lub odrobinę niższego pH, typowo w obszarze pH od około 5 do około 8.
Jeżeli uwzględnia się podawanie pozajelitowe, kompozycje terapeutyczne do stosowania według obecnego ujawnienia mogą występować w postaci wolnej od pyrogenów, pozajelitowo dopus zczalnego wodnego roztworu obejmującego pożądany środek specyficznie wiążący w farmaceutycznie dopuszczalnym podłożu. Szczególnie odpowiednim podłożem dla pozajelitowej iniekcji jest sterylna, destylowana woda, w której środek wiążący jest formułowany w postaci sterylnego, izotonicznego roztworu, właściwie konserwowanego. Jeszcze inny preparat może obejmować formulację pożądanej cząsteczki ze środkiem, takim jak nadające się do wstrzykiwania mikrosfery, bio-erodowalne cząstki, związki polimerowe (kwas polimlekowy, kwas poliglikolowy), perełki lub lipozomy, które zapewniają kontrolowane lub ciągłe uwalnianie produktu, który w przypadku takich postaci może być podawany w zastrzykach depozytowych. Kwas hialuronowy również może być stosowany oraz może mieć wpływ na promowanie przedłużonej obecności w krwioobiegu. Inne odpowiednie środki do wprowadzenia pożądanych związków obejmują implantowalne urządzenia do podawania leków.
W innym aspekcie, formulacje farmaceutyczne odpowiednie dla pozajelitowego podawania mogą być formułowane w wodnych roztworach, korzystnie w fizjologicznie kompatybilnych buforach, takich jak roztwór Hanks'a, roztwór Ringer'a lub fizjologicznie buforowana solanka. Wodne zawiesiny do iniekcji mogą zawierać substancje, które zwiększają lepkość zawiesiny, takie jak karboksymetyloceluloza sodu, sorbitol lub dekstran. Ponadto, zawiesiny aktywnych związków mogą być wytwarzane w postaci odpowiednich olejowych zawiesin do iniekcji. Odpowiednie lipofilowe rozpuszczalniki lub podłoża obejmują oleje tłuszczowe, takie jak olej sezamowy lub syntetyczne estry kwasów tłuszczowych, takie jak oleinian etylu, triglicerydy lub lipozomy. Nie-Iipidowe polikationowe amino-polimery
PL 224 701 B1 mogą być również wykorzystywane przy podawaniu obecnych środków. Zawiesina może również ewentualnie zawierać odpowiednie stabilizatory lub środki w celu zwiększenia rozpuszczalności związków, co pozwala na przygotowywanie roztworów w dużych stężeniach.
W innym wykonaniu, kompozycja farmaceutyczna może być formułowana do inhalacji. Przykładowo, środek wiążący może być formułowany w postaci suchego pudru do inhalacji. Roztwory do inhalacji polipeptydu lub cząsteczki kwasu nukleinowego mogą również być formułowane z dodatkiem propelantu do podawania w postaci aerozolu. W jeszcze innym wykonaniu, roztwory mogą być nebulizowane. Podawanie dopłucne opisano szerzej w zgłoszeniu nr PCT/US94/001875, w którym opisano dostarczanie dopłucne chemicznie modyfikowanych protein.
Brano również pod uwagę, że pewne formulacje mogą być podawane doustnie. W pewnym wykonaniu zgodnie z obecnym ujawnieniem, cząsteczki środka wiążącego, które są podawane tą drogą mogą być formułowane z nośnikami zwyczajowo stosowanymi w komponowaniu stałych postaci dawek, takich jak tabletki i kapsułki lub bez tych nośników. Przykładowo, kapsułka może być przeznaczona do uwalniania aktywnej części formulacji w takim miejscu układu pokarmowo-jelitowego, gdzie biodostępność jest maksymalna, a pre-systemowa degradacja jest zminimalizowana. Można włączyć dodatkowe środki w celu ułatwienia absorpcji cząsteczki środka wiążącego. Mogą być także stosowane rozcieńczalniki, substancje zapachowe, woski o niskiej temperaturze topnienia, oleje roślinne, środki smarujące, środki rozpraszające, środki dezintegrujące tabletkę oraz substancje wiążące.
Kompozycje farmaceutyczne do podawania doustnego można także formułować stosując farmaceutycznie dopuszczalne nośniki, dobrze znane w stanie techniki, w dawkach odpowiednich dla podawania doustnego. Nośniki takie umożliwiają wytwarzanie kompozycji farmaceutycznych w postaci tabletek, pigułek, drażetek, kapsułek, płynów, żeli, syropów, papek, zawiesin i tym podobnych, do przyjmowania leku przez pacjenta.
Preparaty farmaceutyczne do podawania doustnego można otrzymać w wyniku połączenia aktywnych związków ze stałym obojętnym dodatkiem i poddanie otrzymanej mieszaniny granulek (ewentualnie po zmieleniu) dalszemu przerobowi w celu otrzymania tabletek lub rdzeni drażetek. Można dodać substancje pomocnicze, jeżeli jest to pożądane. Odpowiednie obojętne dodatki obejmują w ypełnienia węglowodanowe lub proteinowe, takie jak cukry, włącznie z laktozą, cukrem trzcinowym, mannitolem oraz sorbitolem; skrobię z kukurydzy, pszenicy, ryżu, ziemniaków lub z innych roślin; celulozę, przykładowo metylocelulozę, hydroksypropylometylocelulozę lub karboksymetylocelulozę sodu; gumy, włączając gumę arabską oraz tragakantową; jak i proteiny, takie jak żelatyna i kolagen. Jeżeli jest to pożądane, można dodać środki dezintegrujące lub solubilizujące, takie jak usieciowany poliwinylopirolidon, agar oraz kwas alginowy lub jego sól, przykładowo alginian sodu.
Rdzenie drażetek mogą być stosowane w połączeniu z odpowiednimi powleczeniami, takimi jak stężone roztwory cukru, które mogą zawierać również gumę arabską, talk, poliwinylopirolidon, żel karbopolowy, glikol polietylenowy, i/lub dwutlenek tytanu, roztwory lakierów oraz odpowiednie organiczne rozpuszczalniki lub mieszaniny rozpuszczalników. Do powleczeń tabletek lub drażetek można dodać środki barwiące lub pigmenty w celu identyfikacji produktu, lub w celu oznaczenia ilości aktywnego środka, to znaczy dawki.
Preparaty farmaceutyczne, które mogą być stosowane doustnie obejmują również kapsułki spasowane przylgowo wykonane z żelatyny, jak również miękkie, zamknięte kapsułki wykonane z żelatyny i powleczone, przykładowo, gliceryną lub sorbitolem. Kapsułki spasowane przylgowo mogą zawierać aktywne składniki zmieszane z wypełniaczami lub substancjami wiążącymi, takimi jak laktoza lub skrobie, środki poślizgowe, takie jak talk lub stearynian magnezu, oraz ewentualnie stabilizatory. W miękkich kapsułkach, aktywne związki mogą być rozpuszczone lub zawieszone w odpowiednich cieczach, takich jak tłuste oleje, ciecz, lub ciekły glikol polietylenowy, z dodatkiem stabilizatorów lub bez stabilizatorów.
Inne kompozycje farmaceutyczne mogą obejmować skuteczną ilość środka wiążącego w mieszaninie z nietoksycznymi substancjami obojętnymi, które są odpowiednie do wytwarzania tabletek. Przez rozpuszczenie tabletek w sterylnej wodzie lub w innym odpowiednim podłożu, można otrzymać roztwory w postaci dawek jednostkowych. Odpowiednie obojętne substancje obejmują, lecz nie w yłącznie: inertne rozcieńczalniki, takie jak węglan wapnia, węglan sodu lub kwaśny węglan sodu, laktozę, lub fosforan wapnia; lub środki wiążące, takie jak skrobia, żelatyna lub guma akacjowa; albo środki poślizgowe takie jak stearynian magnezu, kwas stearynowy lub talk.
Dalsze kompozycje farmaceutyczne będące oczywistymi dla biegłych w sztuce, obejmują formulacje zawierające cząsteczki środka wiążącego w formulacjach z powolnym lub kontrolowanym
PL 224 701 B1 dostarczaniem. Techniki formulacji różnorodnych innych środków z powolnym lub kontrolowanym uwalnianiem, takich jak nośniki lipozomowe, bio-degradowalne mikrocząstki lub porowate perełki oraz iniekcje depozytowe, są również znane biegłym w sztuce. Patrz, przykładowo, międzynarodowe zgłoszenie patentowe PCT/US93/00829, w którym opisano porowate polimerowe mikrocząstki z kontrolowanym uwalnianiem do dostarczania kompozycji farmaceutycznych. Dodatkowe przykłady preparatów z powolnym uwalnianiem obejmują półprzepuszczalne matryce polimerowe w postaci ukształtowanych wyrobów, przykładowo folii lub mikrokapsułek. Matryce do przedłużonego uwalniania mogą obejmować poliestry, hydrożele, polilaktydy (patenty nr US 3,773,919, oraz EP 58 481), kopolimery kwasu L-glutaminowego oraz gamma etylo-L-glutaminianu [Sidman i wsp., Biopolymers, 22:547-556 (1983)], poli-(2-hydroksyetylo-metakrylan) [Langer i wsp., J Biomed Mater Res, 15:167-277, (1981)] oraz [Langer i wsp., Chem Tech, 12:98-105(1982)], octan etylenowinylu (Langer i wsp., jak wyżej) lub kwas poli-D(-)-3-hydroksymasłowy (EP 133.988). Kompozycje do przedłużonego uwalniania obejmują również lipozomy, które można wytwarzać dowolną z wielu znanych w stanie techniki. Patrz, przykładowo, Eppstein i wsp., Proc Natl Acad Sci (USA), 82:3688-3692 (1985); EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949.
Kompozycja farmaceutyczna, która ma być stosowana w podawaniu in vivo typowo musi być sterylna. Można to osiągnąć przez filtrację przez sterylne membrany do filtracji. Jeżeli kompozycja jest liofilizowana, sterylizację przy użyciu tej metody można przeprowadzić zarówno przed jak i po liofilizacji i rekonstytucji. Kompozycja do podawania pozajelitowego może być przechowywana w postaci liofilizowanej lub w roztworze. Ponadto, kompozycje do podawania pozajelitowego generalnie umieszcza się w pojemniku posiadającym port do sterylnego dostępu, przykładowo, worek z roztworem dożylnym lub fiolka z korkiem możliwym do przekłucia igłą do iniekcji podskórnej.
Po sporządzeniu kompozycji farmaceutycznej, może być ona przechowywana w sterylnych fio lkach w postaci roztworu, zawiesiny, żelu, emulsji, w postaci stałej, lub w postaci odwodnionego lub liofilizowanego proszku. Takie formulacje można przechowywać zarówno w postaci gotowej do użycia lub w postaci (przykładowo, liofilizowanej) wymagającej rekonstytucji przed podaniem.
W specyficznym wykonaniu, obecny wynalazek jest nakierowany na zestawy do wytwarzania pojedynczej dawki jednostkowej do bezpośredniego podania. Każdy zestaw może obejmować zarówno pierwszy pojemnik zawierający suchą proteinę, jak i drugi zbiornik zawierający wodną formulację. Objęte obecnym ujawnieniem są zestawy obejmujące jedno- lub wielokomorowe, wstępnie napełnione strzykawki (przykładowo, strzykawki z roztworami oraz strzykawki z preparatem zliofilizowanym).
Skuteczna ilość kompozycji farmaceutycznej do terapeutycznego zastosowania będzie zależała, przykładowo, od terapeutycznego kontekstu oraz czynników obiektywnych. Biegły w sztuce rozumie, że odpowiednie poziomy leczenia będą więc bardzo różne w zależności, po części, od podaw ania cząsteczki, wskazania, w związku z którym cząsteczka środka wiążącego jest stosowana, drogi podawania oraz cech fizycznych (masa ciała, powierzchnia ciała lub rozmiar organu) oraz stanu (wiek, oraz ogólny stan zdrowia) pacjenta. Na podstawie tych danych lekarz prowadzący może ustalić dawkę i modyfikować sposób podawania by uzyskać optymalny skutek terapeutyczny. Typowo, dawka może zawierać się w przedziale od około 0,1 mg/kg do najwyżej około 100 mg/kg lub więcej, w zależności od czynników wyżej wymienionych. W innych wykonaniach, dawka może zawierać się od 0,1 mg/kg do około 100 mg/kg; lub 1 mg/kg do około 100 mg/kg; lub 5 mg/kg do około 100 mg/kg.
W przypadku dowolnego związku, skuteczna terapeutycznie dawka może być wstępnie oszacowana w próbach hodowli komórkowej lub w modelach zwierzęcych takich jak myszy, szczury, króliki, psy, świnie lub małpy. Model zwierzęcy może być również przyjęty do określenia odpowiedniego zakresu stężenia oraz drogi podawania. Informacje takie mogą być wykorzystane do określenia przydatnych dawek oraz dróg podawania w przypadku ludzi.
Dokładna dawka będzie określona w świetle czynników związanych z osobnikiem wymagającym leczenia. Dawkowanie oraz podawanie będą dostosowane do zapewnienia wystarczających poziomów aktywnego związku lub do utrzymania pożądanego skutku. Czynniki, które mogą być wzięte pod uwagę obejmują nasilenie stanu chorobowego, ogólny stan zdrowia osobnika, wiek, wagę, oraz płeć osobnika, czas oraz częstotliwość podawania, łączenie leków, czułość reakcji oraz odpowiedź na terapię. Kompozycje farmaceutyczne o długim czasie działania mogą być podawane każdorazowo przez 3 do 4 dni, co tydzień, lub co dwa tygodnie, w zależności od okresu półtrwania i szybkości us uwania z organizmu danej formulacji.
Częstotliwość dawkowania będzie zależała od farmakokinetycznych parametrów cząsteczki środka wiążącego w stosowanej formulacji. Typowo, kompozycja jest podawana aż osiągnie się daw58
PL 224 701 B1 kę, przy której uzyskuje się pożądany skutek. Kompozycja może zatem być podawana w postaci pojedynczej dawki, lub w postaci dawek wielokrotnych (w takich samych lub różnych stężeniach/dawkach) w określonym czasie lub w postaci ciągłej infuzji. Dalsze uściślenie właściwej dawki dokonywane jest rutynowo. Właściwe i odpowiednie dawkowanie można ustalić wykorzystując dane o zależności odpowiedzi od dawki.
Droga podawania kompozycji farmaceutycznej związana jest ze znan ymi sposobami podawania, przykładowo: doustnie, na drodze iniekcji: dożylnie, dootrzewnowo, domózgowo (domiąższowo), mózgowo-dokomorowo, domięśniowo, dogałkowo, dotętniczo, do żyły wrotnej, do miejsca dotkniętego chorobą, doszpikowo, iniekcji doosłonkowej, dokomorowej, skrośskórnej, podskórnej, dootrzewnowo, donosowo, dojelitowo, zewnętrznie, podjęzykowo, do cewki moczowej, dopochwowo lub doodbytniczo, przy zastosowaniu systemów do powolnego uwalniania lub urządzeń przystosowanych do zaimplantowania. Jeżeli jest to pożądane, kompozycje mogą być podawane przez wstrzyknięcie jednorazowej dawki uderzeniowej lub w sposób ciągły na drodze infuzji lub przez zaimplantowane urządzenie.
Alternatywnie lub dodatkowo, kompozycja może być podawana miejscowo przez implantację membrany, gąbki, lub innego odpowiedniego materiału, w którym pożądana cząsteczka była zaabsorbowana lub zamknięta. Jeżeli stosuje się urządzenia zaimplantowane, urządzenie można zaimplantować do dowolnej odpowiedniej tkanki lub organu, a dostarczanie pożądanej cząsteczki może odbywać się przez dyfuzję, uwalnianie w czasie dawki uderzeniowej lub przez ciągłe podawanie.
W pewnych przypadkach, pożądane może być stosowanie kompozycji farmaceutycznych w sposób ex vivo. W takich przypadkach komórki, tkanki, lub organy, które pobrano od pacjenta, wystawia się na działanie kompozycji farmaceutycznych, po czym komórki, tkanki i/lub organy są n astępnie ponownie implantowane pacjentowi.
W innych przypadkach, środek wiążący według obecnego wynalazku taki jak ciało peptydowe, może być dostarczony przez zaimplantowanie pewnych komórek, które uprzednio zmodyfikowano genetycznie, przy zastosowaniu metod, takich jak opisane tutaj, w celu ekspresjonowania i wydzielenia polipeptydu. Komórki takie mogą być pochodzenia zwierzęcego lub ludzkiego, i mogą być autologiczne, heterologiczne, lub ksenogeniczne. Ewentualnie, komórki mogą być unieśmiertelnione. W celu zwiększenia szansy immunologicznej odpowiedzi, komórki mogą być zakapsułkowane by uniknąć infiltracji otaczających tkanek. Materiałami do kapsułkowania są typowo biokompatybilne, półprzepuszczalne polimerowe otoczki lub membrany, które pozwalają uwolnić produkt(ty) proteinowe, lecz zapobiegają zniszczeniu komórek przez system odpornościowy pacjenta, lub przez inne szkodliwe czynniki z otaczających tkanek.
Terapia łączona
Specyficzne środki wiążące według wynalazku takie jak ciała peptydowe można wykorzystywać w kombinacji z innymi środkami terapeutycznymi w leczeniu chorób związanych z ekspresją Ang-2. Te inne środki terapeutyczne obejmują, przykładowo leczenie naświetlaniami, chemioterapię, oraz docelowe terapie takie jak Herceptin™, Rituxan™, Gleevec™, oraz podobne. Dodatkowe terapie łączone nie wyszczególnione tutaj, są także objęte obszarem według obecnego wynalazku.
Leczenie chemioterapeutyczne może wykorzystywać środki anty-nowotworowe obejmujące, przykładowo, środki alkilujące do których należą chlorometyny, przykładowo mechloroetamina, cykl ofosfamid, ifosfamid, melfalan oraz chlorambucyl; nitrozomoczniki, takie jak karmustyna (BCNU), lomustyna (CCNU), oraz semustyna (metylo-CCNU); etylenoiminy/metylomelaminy takie jak trietylenomelamina (TEM), trietylen, tiofosforamid (tiotepa), heksametylomelamina (HMM, altretamina); alkilosulfony takie jak busulfan; triazyny takie jak dakarbazyna (DTIC); antymetabolity włącznie z analogami kwasu foliowego takie jak metotreksan oraz trimetreksan, analogi pirymidyny takie jak 5-fluorouracyl, fluorodeoksyurydyna, gemcitabina, arabinozydowa cytozyna (AraC, cytarabina), 5-azacytydyna, 2,2'-difluorodeoksycytydyna, analogi puryny takie jak 6-merkaptopuryna, 6-tioguanina, azatiopryna, 2'-deoksykoformycyna (pentostatyna), erytrohydroksynonyloadenina (EHNA), fosforan fludarabiny, oraz 2-chlorodeoksyadenozyna (cladribine, 2-CdA); produkty naturalne włączając leki antymitotyczne takie jak paclitaxel, alkaloidy vinca w tym winblastyna (VLB), winkrystyna, oraz winorelbina, preparat Taxotere, estramustyna, oraz fosforan estramustyny; pipodofylotoksyny takie jak etopozyd oraz tenipozyd; antybiotyki takie jak aktymomycyna D, daunorubicyna (rubidomycyna), doksorubicyna, mitoksantron, idarubicyna, bleomycyny, plikamycyna (mitramycyna), mitomycynaC, oraz aktynomycyna; enzymy takie jak L-asparaginaza; modyfikatory odpowiedzi biologicznej takie jak interferon-alfa, IL-2, G-CSF oraz GM-CSF; różnorodne inne środki, w tym skoordynowane kompleksy platyny takie jak
PL 224 701 B1 cysplatyna oraz karboplatyna, antracenodiony takie jak mitoksantron, podstawiony mocznik przykładowo hydroksymocznik, pochodne metylohydrazyny włączając N-metylohydrazynę (MIH) oraz prokarbazynę, supresory kory nadnerczy takie jak mitotan (o,p'-DDD) oraz aminoglutetimid; hormony oraz antagoniści w tym antagoniści adrenokortykosteroidów takie jak prednizon oraz równoważniki oraz równoważniki, deksametazon oraz aminoglutetimid; progestynę taką jak kapronian hydroksyprogesteronu, octan medroksyprogesteronu oraz octan megestrolu; estrogen taki jak dietylstylbestrol oraz ró wnoważniki etynylo-estradiolowe; antyestrogen taki jak tamoksyfen; androgeny włączając propionian testosteronu oraz fluoksymesteron/równoważniki; antyandrogeny takie jak flutamid, analogi hormonalne uwalniające gonadotropinę oraz leuprolid; oraz nie-sterydowe antyandrogeny takie jak flutamid.
Terapia łączona z czynnikami wzrostu może obejmować cytokiny, limfokiny, czynniki wzrostu, lub inne hematopoetyczne czynniki, takie jak M-CSF, GM-CSF, TNF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IFN, TNF0, TNF1, TNF2, G-CSF, Meg-CSF, GM-CSF, trombopoetynę, czynnik komórki macierzystej, oraz erytropoetynę. Inne kompozycje mogą obejmować znane angiopoetyny, przykładowo Ang-1, -2, -4, -Y, i/lub ludzki polipeptyd podobny do Ang, i/lub naczyniowy śródbłonkowy czynnik wzrostu (VEGF). Czynniki wzrostu obejmują angiogeninę, morfogeniczną proteinę-1 kości, morfogeniczną proteinę-2 kości, morfogeniczną proteinę-3 kości, morfogeniczną proteinę-4 kości, morfogeniczną proteinę-5 kości, morfogeniczną proteinę-6 kości, morfogeniczną proteinę-7 kości, morfogeniczną proteinę-8 kości, morfogeniczną proteinę-9 kości, morfogeniczną proteinę-10 kości, morfogeniczną proteinę-11 kości, morfogeniczną proteinę-12 kości, morfogeniczną proteinę-13 kości, morfogeniczną proteinę-14 kości, morfogeniczną proteinę-15 kości, receptor-IA morfogenicznej proteiny kości, receptor-IB morfogenicznej proteiny kości, czynnik neutrotrofowy pochodzący z mózgu, rzęskowy czynnik neutrofowy, receptor rzęskowego czynnika neutrofowego, indukowany cytokiną czynnik-1 chematotaktyczny neutrofilu, indukowany cytokiną neutrofil, czynnik-2 chemotaktyczny, indukowany cytokiną czynnik-2 chematotaktyczny neutrofilu, czynnik wzrostu komórki śródbłonkowej, endotelina-1, czynnik wzrostu epidermalny, atraktant neutrofili pochodzący ze śródbłonka, czynnik-4 wzrostu fibroblastu, czynnik-5 wzrostu fibroblastu, czynnik-6 wzrostu fibroblastu, czynnik-7 wzrostu fibroblastu, czynnik-8 wzrostu fibroblastu, czynnik-8b wzrostu fibroblastu, czynnik-8c wzrostu fibroblastu, czynnik-9 wzrostu fibroblastu, czynnik-10 wzrostu fibroblastu, kwasowy czynnik wzrostu fibroblastu, zasadowy czynnik wzrostu fibroblastu, receptor-1 czynnika neutrofowego pochodzącego z linii komórkowej gleja, receptor-2 czynnika neutrofowego pochodzącego z linii komórkowej gleja, proteina związana ze wzrostem, proteina-2 związana ze wzrostem, proteina-2 związana ze wzrostem, proteina-3 związana ze wzrostem, epidermalny czynnik wzrostu wiążący heparynę, czynnik wzrostu hepatocytu, receptor czynnika wzrostu hepatocytu, czynnik-1 wzrostu podobny do insuliny, receptor czynnika wzrostu podobnego do insuliny, czynnik-II wzrostu podobny do insuliny, proteina wiążąca czynnik wzrostu podobny do insuliny, czynnik wzrostu keratynocytu, czynnik inhibitorowy leukemii, receptor-1 czynnika inhibitorowego leukemii, czynnik wzrostu nerwu, receptor czynnika wzrostu nerwu, neurotrofina-3, neurotrofina-4, czynnik wzrostu łożyska, czynnik-2 wzrostu łożyska, śródbłonkowy czynnik wzrostu pochodzący od płytek, czynnik wzrostu pochodzący od płytek, łańcuch czynnika wzrostu A pochodzącego od płytek, czynnik wzrostu AA pochodzący od płytki, czynnik wzrostu AB pochodzący od płytek, łańcuch czynnika wzrostu B pochodzący od płytek, czynnik wzrostu BB pochodzący od płytek, receptor-1 czynnika wzrostu pochodzącego od płytek, receptor-2 czynnika wzrostu pochodzącego od płytek, czynnik stymulujący wzrost komórki pre-B, czynnik wzrostu komórki macierzystej, receptor czynnika wzrostu komórki macierzystej, transformujący czynnik wzrostu-1, transformujący czynnik wzrostu-2, transformujący czynnik wzrostu-1, transformujący czynnik wzrostu-1.2, transformujący czynnik wzrostu-2, transformujący czynnik wzrostu-3, transformujący czynnik wzrostu-5, uśpiony transformujący czynnik wzrostu-1, transformujący czynnik wzrostu wiążący proteinę I, transformujący czynnik wzrostu wiążący proteinę II, transformujący czynnik wzrostu wiążący proteinę III, receptor typu I czynnika nekrozy nowotworów, receptor typu II czynnika nekrozy nowotworów, receptor aktywatora plazminogenu typu urokinazy, czynnik wzrostu naczyniowego śródbłonka, oraz proteiny chimeryczne i ich biologicznie lub immunologicznie aktywne fragmenty.
Środki immunoterapeutyczne
Środki immunoterapeutyczne generalnie opierają się na stosowaniu immunicznych komórek efektorowych oraz cząsteczek zdolnych do namierzenia oraz zniszczenia komórek rakowych. Efektorami immunicznymi mogą być, przykładowo, ciało peptydowe według obecnego wynalazku, które rozpoznaje pewien marker na powierzchni docelowej komórki. Ciało peptydowe samodzielnie może słu60
PL 224 701 B1 żyć jako efektor terapii, lub może rekrutować inne komórki do spowodowania faktycznego zabicia komórki. Ciało peptydowe może być również połączone z lekiem lub toksyną (chemioterapeutyk, radionuklid, łańcuch rycyny A, toksyna cholery, toksyna krztuśca, etc.) a więc może jedynie służyć jako środek nakierowujący.
Według obecnego wynalazku, zmutowane formy Ang-2 mogą być namierzone metodą immunoterapii przy użyciu ciał peptydowych lub skoniugowanych ciał peptydowych według wynalazku. W szczególności uwzględnia się stosowanie kompozycji zawierających ciało peptydowe według wyn alazku stosując podejście właściwe dla terapii łączonej, wraz z terapią nakierowaną na Ang-2.
Udowodniono, że bierna immunoterapia jest szczególnie skuteczna względem wielu rodzajów raków. Patrz, przykładowo, broszura WO 98/39027.
Poniższe przykłady mają stanowić ilustrację wynalazku i powinny być interpretowane w sposób nie ograniczający zakresu wynalazku w jakikolwiek w sposób.
P r z y k ł a d 1. Ekspresja Ang-2 w patologicznej i zdrowej tkance
Ekspresję Ang-2 przebadano w zdrowej i patologicznej tkance stosując hybrydyzację in situ. Fragmenty ludzkich (Genbank numer dostępu: AF004327, nukleotydy 1274-1726) oraz mysich (Genbank numer dostępu: AF004326, nukleotydy 1135-1588) sekwencji Ang-2 amplifikowano z cDNA z płuc ludzkiego lub mysiego płodu metodą PCR z odwrotną transkryptazą, klonowano do plazmidu pGEM-T oraz weryfikowano przez sekwencjonowanie. Znakowane 33P sondy antysensownego RNA transkrybowano ze zlinearyzowanych wzorców plazmidu stosując 33P-UTP oraz polimerazę RNA. Bloki tkanek utrwalonych formaldehydem i zalanych parafiną pocięto na 5 μm wycinki i zebrano na naładowanych szkiełkach. Przed hybrydyzacją in situ, przez tkanki przepuszczono 0,2M HCl, a następnie trawiono je proteinazą K oraz acetylowano trietanoloaminą i bezwodnikiem octowym. Wycinki poddano hybrydyzacji z radio-znakowaną sondą przez noc w temperaturze 55°C, po czym trawiono RNazą i przemyto w surowych warunkach w około 0,1 X SSC w temperaturze 55°C. Slajdy zanurzono w emulsji Kodak NTB2, eksponowano w temperaturze 4°C przez 2-3 tygodnie, wywołano i wybarwiono. Wycinki badano w ciemnym polu i przy standardowym oświetleniu aby umożliwić jednoczesną ocenę morfologii próbki oraz sygnału hybrydyzacji.
Wyniki wskazały, że w przypadku zdrowych ludzi, po urodzeniu ekspresja Ang-2 jest ograniczona do kilku tkanek obejmujących angiogeniczne unaczynienie, takich jak jajnik, łożysko oraz macica. Nie wykryto ekspresji Ang-2 w zdrowym ludzkim sercu, mózgu, nerkach, wątrobie, płucach, trzustce, śledzionie, mięśniach, migdałkach, grasicy, wyrostku robaczkowym, węzłach chłonnych, pęcherzyku żółciowym, prostacie oraz w jądrach osób dorosłych. W przypadku myszy w wieku pięciu tygodni (lecz nie u dorosłych małp ani u dorosłych ludzi), nerki wykazywały wyraźną ekspresję Ang-2 w naczyńkach vasa recta. Aby określić czy ekspresja ta była pozostałością rozwoju embrionalnego, eksperyment ten powtórzono w nerkach pochodzących od myszy w przedziale wieku do jednego roku, przy użyciu m ysiej sondy Ang-2 oraz warunków wyżej opisanych. Zaobserwowano spadek ekspresji Ang-2 w toku rozwoju post-natalnego, lecz była ona nadal ewidentna w nerkach myszy jednorocznych.
Ekspresję Ang-2 również wykryto w praktycznie wszystkich badanych rodzajach nowotworów, w tym w głównych ludzkich nowotworach takich jak rak jelita grubego (5 przypadków), rak piersi (10 przypadków), rak płuc (8 przypadków), glejak niedojrzały (1 przypadek), ludzkie nowotwory w fazie przerzutów takie jak rak piersi (2 przypadki), rak płuc (2 przypadki) oraz rak jajnika (2 przypadki), z przerzutami do mózgu oraz w szczurzych modelach nowotworów takich jak C6 (glejak szczurzy), HT29 (ludzki rak jelita grubego), Colo-205 (ludzki rak jelita grubego), HCT1 16 (ludzki rak jelita grubego), A431 (ludzki rak naskórka), A673 (ludzki mięśniak prążkowanokomórkowy mięsakowy), HT1080 (ludzki włókniakomięsak), PC-3 (ludzki rak prostaty), B16F10 (czerniak mysi), MethA (mięsak mysi) oraz Lewis'a rak płuc w fazie przerzutów. Ponadto, ekspresję Ang-2 wykryto w neonaczyniach wrastających w płytkę żelu Matrigel w odpowiedzi na VEGF oraz w mysim hipoksjalnym modelu retinopatii wcześniaków.
P r z y k ł a d 2. Próby molekularne na zliczanie ciał peptydowych Ang-2
Opracowano próby molekularne (powinowactwa ELISA, neutralizacji ELISA oraz BIAcore) aby oszacować bezpośrednie wiązanie ciała peptydowego z Ang-2 oraz z pokrewnymi członami jej rodziny, a także wpływ ciał peptydowych na oddziaływanie Ang-2:Tie2. Te próby in vitro opisano jak następuje.
PL 224 701 B1
Próba powinowactwa ELISA
Dla przeprowadzenia początkowego skriningu kandydackich ciał peptydowych anty-Ang-2, użyto oczyszczony ludzki polipeptyd Ang-2 (R & D Systems, Inc; numer katalogowy 623-AN; Ang-2 jest dostarczana w postaci mieszaniny 2 obciętych wersji) lub mysi polipeptyd Ang-2 (wytworzony jak opisano powyżej). Do potwierdzających prób na wiązania, ludzką Ang-2 otrzymano w kondycjonowanej pożywce ludzkich komórek 293T transfekowanych DNA ludzkiej Ang-2 o pełnej długości, hodowanych w DMEM - zmodyfikowanej pożywce Eagle firmy Dulbecco, wolnej od surowicy - zawierającej około 50 μ/ml albuminy z surowicy bydlęcej (BSA).
Przy użyciu płytek do mikromiareczkowania, dodano do każdego wgłębienia około 100 μL Ang-2/wgłębienie i płytki inkubowano przez około 2 godziny, po czym płytki przemyto czterokrotnie solanką buforowaną fosforanami (PBS) zawierającą około 0,1% Tween-20. Następnie wgłębienia zablokowano przy użyciu około 250 mikrolitrów na wgłębienie około 5% BSA w PBS, po czym płytki inkubowano w temperaturze pokojowej przez około 2 godziny. Po inkubowaniu, nadmiar roztworu do blokowania usunięto i dodano około 100 mikrolitrów kandydackiego ciała peptydowego anty-Ang-2 do każdego wgłębienia w seryjnych rozcieńczeniach, wychodząc od stężenia około 40 nanomolarnego, a następnie czterokrotnie prowadząc seryjne rozcieńczanie przy użyciu PBS zawierającym około 1% BSA. Płytki następnie inkubowano przez noc w temperaturze pokojowej. Po inkubowaniu, płytki przemyto PBS zawierającym około 0,1% Tween-20. Przemycie powtórzono dodatkowo czterokrotnie, po czym dodano 100 μL na wgłębienie koziej anty-ludzkiej IgG(Fc)-HRP (Pierce Chemical Co., numer katalogowy 31416) uprzednio rozcieńczonej 1:5000 w PBS zawierającym 1% BSA (albumina z surowicy bydlęcej). Płytki inkubowano przez około 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie płytki przemyto pięciokrotnie PBS zawierającym około 0,1% Tween-20, po czym dodano około 100 mikrolitrów na wgłębienie podłoża TMB (3,3’,5,5’-tetrametylobenzydyna, Liquid Substrate System; Sigma Chemical, St. Louis, MO, numer katalogowy T8665) i płytki inkubowano przez około 5-15 minut aż do pojawienia się niebieskiego zabarwienia. Następnie odczytano absorbancję na spektrofotometrze przy około 370 nm.
Próba neutralizacji ELISA
Płytki do mikromiareczkowania, z którymi związany został ludzki polipeptyd Ang -2 wytworzono w sposób opisany w przypadku próby Powinowactwa ELISA. Kandydackie ciała peptydowe anty-Ang-2 miareczkowano w seryjnych rozcieńczeniach od 1000 nM do 0,2 pM w czterokrotnych rozcieńczeniach w roztworze PBS, zawierającym około 1% BSA oraz około 1 nM Tie2 (dostarczonego jako cząsteczka Tie2-Fc, gdzie część Tie2 zawiera jedynie rozpuszczalną zewnątrzkomórkową część cząsteczki - R & D Systems, numer katalogowy 313-TI). Po dodaniu około 100 mikrolitrów roztworu przeciwciało/Tie2 do każdego wgłębienia, płytki inkubowano przez noc w temperaturze pokojowej, po czym przemyto pięciokrotnie w PBS zawierającym około 0,1% Tween-20. Po przemyciu, dodano około 100 mikrolitrów na wgłębienie przeciwciała anty-Tie2 (Pharmingen Inc., numer katalogowy 557039) do końcowego stężenia około 1 mikrograma na mililitr i płytki inkubowano przez około 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie, dodano około 100 mikrolitrów na wgłębienie koziego anty-mysiegoIgG-HRP (Pierce Chemical CO., numer katalogowy 31432) w rozcieńczeniu 1:10.000 w PBS zawierającym około 1% BSA. Płytki inkubowano w temperaturze pokojowej przez około 1 godzinę, po czym przemyto je pięciokrotnie przy użyciu PBS zawierającym około 0,1% Tween-20. Następnie dodano około 100 mikrolitrów na wgłębienie podłoża TMB (wyżej opisanego) i pozostawiono do pojawienia się koloru. Następnie odczytano absorbancję na spektrofotometrze przy około 370 nm.
Próba powinowactwa BIAcore
Analizę powinowactwa każdego kandydackiego ciała peptydowego Ang-2 przeprowadzono metodą BIAcore®2000 (Biacore, Inc., Piscataway, NJ) przy użyciu PBS oraz 0,005% powierzchniowo czynnego środka P20 (BIAcore, Inc.) jako buforu przepływającego. Rekombinacyjną Proteinę G (Repligen, Needham, MA) immobilizowano łącząc z chipem sensorowym CM5 jakość - do prac badawczych (Biacore, Inc.) przez pierwszorzędowe grupy aminowe, przy użyciu zestawu do sprzęgania amin (Biacore, Inc.) według protokołu sugerowanego przez wytwórcę.
Próby na wiązania prowadzono w ten sposób, że najpierw wychwytywano około 100 Ru każdego kandydackiego ciała peptydowego anty-Ang-2 na unieruchomionej Proteinie G, po czym przez iniekcję podawano na powierzchnię ze związanym ciałem peptydowym huAng-2 lub mAng-2 w różnych stężeniach (0-100 nM) z szybkością przepływu około 50 μl/minutę przez około 3 minuty. Ustalano kinetykę wiązania ciała peptydowego wyznaczając ka (stała szybkości asocjacji), kd (stała szybko62
PL 224 701 B1 ści dysocjacji) oraz KD (stała równowagi dysocjacji) stosując obliczeniowy program komputerowy BIA 3.1 (BIAcore, Inc.). Niższe stałe równowagi dysocjacji wskazywały wyższe powinowactwo ciała pept ydowego względem Ang-2.
P r z y k ł a d 3. Identyfikacja peptydów wiążących Ang-2
1. Wytwarzanie perełek magnetycznych powleczonych Ang-2
A. Immobilizowanie Ang-2 na perełkach magnetycznych
W przypadku nie-specyficznej elucji, biotynylowaną proteinę Ang-2 (Biotinylated Recombinant Human Angiopoietin-2, R&D Systems, Inc.; numer katalogowy BT 623) immobilizowano na perełkach typu Streptavidin Dynabeads (Dynal, Lake Success, NY) w stężeniu około 4 μg biotynylowanej proteiny Ang-2 na 100 μl porcji perełek postaci formie dostarczanej przez producenta, przez wszystkie trzy rundy selekcji. W przypadku elucji antygenu (Ang-2) oraz receptora (Tie-2), immobilizowano 2 μg biotynylowanej proteiny Ang-2 na 50 μl perełek typu Streptavidin Dynabeads, w drugiej rundzie selekcji. Stężenie powleczenia zmniejszono do około 1 μg biotynylowanej proteiny Ang-2 na 50 μl porcji perełek w trzeciej rundzie selekcji. Przez przesunięcie perełek na jeden koniec probówki przy zastosowaniu magnesu oraz odpipetowanie cieczy, perełki przemyto pięciokrotnie solanką buforowaną fosforanem (PBS) oraz ponownie rozprowadzono w PBS. Biotynylowaną proteinę Ang-2 dodano do przemytych perełek z powyższym stężeniem i inkubowano z rotacją przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie inkubowano przez od kilku godzin do całonocnej inkubacji w temperaturze 4°C z rotacją. Perełki pokryte Ang-2 następnie zablokowano dodając BSA do około 1% końcowego stężenia i inkubowano przez noc w temperaturze 4°C z rotacją. Otrzymane perełki pokryte Ang-2 przemyto następnie pięciokrotnie PBS przed poddaniem ich procedurom selekcji.
B. Przygotowanie perełek do negatywnej selekcji.
Dodatkowe perełki przygotowano także dla negatywnych selekcji. Dla każdych warunków procesu, 500 μl porcji perełek postaci formie dostarczanej przez producenta poddano powyższej procedurze (sekcja 1A) z tą jedynie różnicą, że pominięto etap inkubowania z biotynylowaną Ang-2. W ostatnim etapie przemywania, perełki podzielono na pięć 100 μl porcji.
2. Selekcja fagu wiążącego Ang-2.
A. Ogólna strategia.
Trzy biblioteki fagów włóknistych, oznaczone jako „TN8-IX” (5 x 109 niezależnych transformantów), „TN12-I” (1,4 x 109 niezależnych transformantów), oraz „Liniowe” (2,3 x 109 niezależnych transformantów) (wszystkie z firmy Dyax Corp.) użyto do wyselekcjonowania faga wiążącego Ang-2. Każdą bibliotekę poddano następnie bądź nie-specyficznej elucji Ang-2, albo elucji receptorowej (Tie-2). Przeprowadzono dziewięć różnych procesów dla Ang-2 (TN8-IX przy użyciu nie-specyficznej metody elucji, TN8-IX przy użyciu metody elucji Ang-2, TN8-IX przy użyciu metody elucji Tie-2, TN12-I przy użyciu nie-specyficznej metody elucji, TN12-I przy użyciu metody elucji Ang-2 oraz TN12-1 przy użyciu metody elucji Tie-2, „Liniowe” przy użyciu nie-specyficznej metody elucji, „Liniowe” przy użyciu metody elucji Ang-2 oraz „Liniowe” przy użyciu metody elucji Tie-2). W przypadku wszystkich trzech bibliotek, fagi z pierwszej rundy selekcji eluowano tylko w sposób nie-specyficzny dla dalszych rund selekcji. Elucje Ang-2 oraz Tie-2 zastosowano w drugiej i trzeciej rundzie selekcji. W przypadku biblioteki „Liniowe”, selekcję przeprowadzono tylko do drugiej rundy elucji Ang-2 oraz Tie-2.
B. Negatywna selekcja
W przypadku każdego typu warunków procesu, pobrano próbki około 100 losowych równoważników bibliotekowych dla bibliotek TN8-IX oraz TN12-I (około 5 x 1011 pfu dla TN8-IX oraz około 1,4 x 1011 pfu dla TN12-I) oraz około 10 losowych równoważników bibliotekowych dla biblioteki „Liniowe” (około 1 x 1011 pfu) z roztworów zasobowych bibliotek i rozcieńczono do około 400 μl przy użyciu PBST (PBS z 0,05% Tween-20). Po ostatnim przemyciu, odciągnięto ciecz z pierwszej 100 μl próbki perełek wytworzonej dla negatywnej selekcji (sekcja 1B), a do perełek dodano około 400 μl rozcieńczenia roztworu zasobowego w/w biblioteki. Otrzymaną mieszaninę inkubowano przez około 10 minut w temperaturze pokojowej z rotacją. Fagowy supernatant oddzielono stosując magnes i dodano do drugiej 100 μl próbki dla kolejnego etapu negatywnej selekcji. W ten sposób, przeprowadzono pięć etapów negatywnej selekcji.
PL 224 701 B1
C. Selekcja przy użyciu perełek powleczonych proteiną Ang-2
Fagowy supernatant po ostatnim etapie negatywnej selekcji (sekcja IB) dodano do perełek powleczonych Ang-2 (sekcja 1A). Mieszaninę tę inkubowano z rotacją przez jedną do dwóch godzin w temperaturze pokojowej, pozwalając na związanie faga z docelową proteiną. Po odrzuceniu supernatantu, perełki przemyto około 10-krotnie przy użyciu PBST, a następnie dwukrotnie przy użyciu PBS.
D. Eluowanie nie-specyficzne
Po odciągnięciu cieczy po końcowym etapie przemywania (sekcja 2C), do perełek dodano około 1 ml roztworu soli Min A (60 mM K2HPO4, 33 mM KH2PO4, 7,6 mM (NH4)SO4, oraz 1,7 mM cytrynian sodu). Tę mieszaninę perełkową dodano bezpośrednio do stężonej próbki bakteryjnej do infekcji (patrz poniżej sekcja 3A oraz 3B).
E. Antygenowe (Ang-2) eluowanie związanego faga
W rundzie 2, po ostatnim etapie przemywania (sekcja 2C), związany fag eluowano z perełek magnetycznych dodając kolejno 100 μl 1 pM, 0,1 nM oraz 10 nM rekombinacyjnej proteiny Ang-2 (Recombinant Human Angiopoietin-2, R&D Systems, Inc., Minneapolis, Minnesota), z 30-minutowym inkubowaniem dla każdego stężenia. Pozostałą ilość faga eluowano nie-specyficznie (sekcja 2D). Wyeluowany fag z 10 nM elucji oraz z nie-specyficznej elucji połączono i poddano trzeciej rundzie selekcji (patrz sekcja 4, poniżej).
W rundzie 3, po ostatnim etapie przemywania (sekcja 2C), związany fag eluowano z perełek magnetycznych dodając około 1 nM rekombinacyjnej proteiny Ang-2 oraz 10 nM rekombinacyjnej proteiny Ang-2, z 30-minutowym inkubowaniem dla każdego stężenia. Ponadto, fag eluowano 1 ml 100 mM roztworu trietyloaminy (Sigma, St. Louis, Missouri) przez około 10 minut w wirówce. Roztwór trietyloaminy zawierający fag zobojętniono dodając 0,5 ml 1 M Tris-HCl (pH 7,5). Po ostatniej elucji z 100 mM roztworu trietyloaminy, pozostający fag eluowano przez dodanie perełek do bakterii (sekcja 2D).
F. Receptorowe (Tie-2) eluowanie związanego faga
W rundzie 2, po ostatnim etapie przemywania (sekcja 2C), związany fag eluowano z perełek magnetycznych dodając kolejno około 100 pl 1 pM, 0,1 nM, oraz 10 nM rekombinacyjnej proteiny Tie-2 (Recombinant Human Tie-2-Fc Chimera, R&D Systems, Inc., Minneapolis, Minnesota), z 30-minutowym inkubowaniem dla każdego stężenia. Pozostający fag eluowano nie-specyficznie (sekcja 2D). Fag wyeluowany w elucji 10 nM oraz w nie-specyficznej elucji połączono i poddano trzeciej rundzie selekcji (patrz sekcja 4, poniżej).
W rundzie 3, po ostatnim etapie przemywania (sekcja 2C), związany fag eluowano z perełek magnetycznych dodając kolejno około 1 nM rekombinacyjnej proteiny Ang-2 oraz 10 nM rekombinacyjnej proteiny Tie-2, z 30-minutowym inkubowaniem dla każdej operacji. Dodatkowo, fag eluowano 1 ml 100 mM roztworu trietyloaminy (Sigma, St. Louis, Missouri) przez około 10 minut na wirówce. Roztwór trietyloaminy zawierający fag zobojętniono dodając 0,5 ml 1 M Tris-HCl (pH 7,5). Po ostatniej elucji 100 mM roztworem trietyloaminy, pozostałą ilość faga eluowano dodając perełki do bakterii (sekcja 2D).
3. Amplifikacja
A. Wytwarzanie komórek do powleczenia
Prowadzono wzrost świeżej hodowli E. Coli. (XL-1 Blue MRF') do wartości OD600 około 0,5 w pożywce LB zawierającej około 12,5 pg/ml tetracykliny. Dla każdych warunków procesu, około 20 ml tej pożywki oziębiono w lodzie i odwirowano. Zbitą grudkę bakterii ponownie przeprowadzono w zawiesinę w około 1 ml roztworu soli Min A.
B. Transdukcja
Każdą mieszaninę z każdej odmiennej metody elucji podanej powyżej (sekcje 2D, 2E oraz 2F) dodano do stężonej próbki bakteryjnej (sekcja 3A) i inkubowano w temperaturze około 37°C przez około 15 minut. Do każdej mieszaniny dodano około 2 ml pożywki NZCYM (2XNZCYM, 50 pg/ml ampicyliny) i inkubowano w temperaturze około 37°C przez 15 minut. Otrzymane 4 ml roztworu naniesi ono na dużą płytkę agarową NZCYM zawierającą około 50 pg/ml ampicyliny i inkubowano przez noc w temperaturze 37°C.
PL 224 701 B1
C. Zbieranie faga
Każdą mieszaninę bakteria/fag poddano wzrostowi przez noc na dużej płytce agarowej NZCYM (sekcja 3B), po czym ją zeskrobano do około 35 ml pożywki LB. Płytkę agarową przemyto następnie dodatkowymi 35 ml pożywki LB. Otrzymaną mieszaninę bakteria/fag w pożywce LB odwirowano aby oddzielić bakterie w formie zbitej grudki. Następnie około 50 ml fagowego supernatantu transferowano do świeżej probówki, dodano około 12,5 ml roztworu PEG (20% PEG8000, 3,5M octan amonu) i ink ubowano w lodzie przez 2 godziny aby wytrącić fag. Wytrącony fag odwirowano i ponownie przeprowadzono w zawiesinę stosując 6 ml buforu do ponownego zawieszania fagu (250 mM NaCl, 100 mM Tris pH 8,1 mM EDTA). Ten roztwór fagowy poddano dalszemu oczyszczaniu przez odwirowanie pozostałych bakterii i wytrącenie faga po raz drugi przez dodania około 1,5 ml roztworu PEG. Po odwirowaniu, zbitą grudkę fagową zawieszono ponownie w około 400 μl PBS. Roztwór ten poddano końcowemu odwirowaniu oczyszczając roztwór z wszelkich pozostałych szczątków bakterii. Oznaczono miano otrzymanego preparatu fagowego stosując standardową próbę na tworzenie płytek.
4. Dodatkowa selekcja i amplifikacja
W drugiej rundzie, zamplifikowany preparat fagowy (około 10 pfu) z pierwszej rundy (sekcja 3C) stosowano jako fag „wsadowy” do przeprowadzenia etapów selekcji i amplifikacji (sekcje 2 oraz 3). W przypadku elucji Ang-2 oraz Tie-2, fag z elucji 10 nM oraz z elucji nie-specyficznej połączono i zamplifikowano do wykorzystania w trzeciej rundzie selekcji. Zamplifikowany preparat fagowy (około 109 pfu) z drugiej rundy zastosowano z kolei jako „wsadowy” fag do przeprowadzenia trzeciej rundy selekcji i amplifikacji (sekcje 2 oraz 3). Po etapach elucji (sekcje 2D, 2E, oraz 2F) w trzeciej rundzie, małą frakcję wyeluowanego faga rozprowadzono jak w próbie na tworzenie płytek (sekcja 3C). Poszczególne wytworzone płytki wybrano i umieszczono na płytkach do mikromiareczkowania o 96 wgłębieniach zawierających 100 μl buforu TE w każdym wgłębieniu. Te płytki główne inkubowano w temperaturze 4°C przez noc aby umożliwić fagom przejście do buforu TE.
5. Analiza klonów
Klony fagowe analizowano stosując test fagowy ELISA oraz sekwencjonowanie DNA. Sekwencje uszeregowano w oparciu o połączone wyniki z tych dwóch prób.
A. Test fagowy ELISA
Prowadzono wzrost hodowli XL-1 Blue MRF' do osiągnięcia wartości OD600 około 0,5. Około 30 μl tej hodowli odmierzono do każdego wgłębienia płytki do mikromiareczkowania o 96 wgłębieniach. Do każdego wgłębienia dodano około 10 μl wyeluowanego faga (sekcja 4) i pozwolono na infekcję bakterii przez około 15 minut w temperaturze pokojowej. Do każdego wgłębienia dodano około 100 μl pożywki LB zawierającej około 12,5 ng/ml tetracykliny i około 50 μg/ml ampicyliny. Płytkę do mikromiareczkowania następnie inkubowano z wytrząsaniem przez noc w temperaturze około 37°C. Rekombinacyjnej proteinie Ang-2 (około 1 μg/ml w PBS) pozwolono na związanie z płytkami o 96 wgłębieniach typu Maxisorp (NUNC) przez noc w temperaturze około 4°C. Jako kontrolę, czystą streptawidyną pokryto oddzielną płytkę typu Maxisorp w ilości około 2 μg/ml w PBS.
Następnego dnia, usunięto ciecz z płytek typu Maxisorp powleczonych proteiną i każde wgłębienie zablokowano przy użyciu około 300 μl 5% roztworu mleka w temperaturze około 4°C przez noc (alternatywnie, przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej). Następnie roztwór mleka usunięto, a wgłębienia przemyto trzykrotnie roztworem PBST. Po ostatnim etapie przemywania, do każdego wgłębienia płytek typu Maxisorp powleczonych proteiną dodano około 50 μl 4% roztworu mleka w PBST. Około 50 μl prowadzonych przez noc hodowli z każdego wgłębienia w płytce do mikromiareczkowania o 96 wgłębieniach przeniesiono do odpowiednich wgłębień płytek powleczonych Ang-2, a także do płytek kontrolnych powleczonych streptawidyną. Mieszaninę 100 μl w każdym rodzaju płytki inkubowano przez około 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Ciecz usunięto z płytek typu Maxisorp, a wgłębienia przemyto około trzykrotnie przy użyciu PBST. Sprzężone z HRP przeciwciało antyM13 (Amersham Pharmacia Biotech) rozcieńczono do około 1:7.500 i około 100 μl rozcieńczonego roztworu dodano do każdego wgłębienia płytek typu Maxisorp na około 1 -godzinne inkubowanie w temperaturze pokojowej. Ciecz ponownie usunięto, a wgłębienia przemyto około pięciokrotnie przy użyciu PBST. Następnie dodano do każdego wgłębienia około 100 μl podłoża TMB (Sigma) i reakcję zatrzymano dodając około 50 μl 5N roztworu H2SO4. Na spektrofotometrze (Molecular Devices) odczytano wartość OD450.
PL 224 701 B1
B. Sekwencjonowanie klonów fagowych
Dla każdego klonu fagowego, przygotowano wzorzec do sekwencjonowania stosując PCR. Następującą parę oligonukleotydów stosowano do amplifikacji około 500-nukleotydowego fragmentu: Primer 1: 5’-CGGCGCAACTATCGGTATCAAGCTG-3’ (SEQ ID NO: 54)
Primer 2: 5’-CATGTACCGTAACACTGAGTTTCGTC-3’ (SEQ ID NO: 55)
Dla każdego klonu przygotowano następującą mieszaninę:
Reagenty Objętość (pŁ)/probówkę
dH2O 26,25
50% gliceryna 10
10x bufor PCR (bez MgCl2) 5
25 mM MgCl2 4
10 mM mieszanka dNTP 1
100 pM primer 1 0,25
100 ι/M primer 2 0,25
polimeraza Taq 0,25
Fag w TE (sekcja 4) 3
Końcowa objętość mieszaniny reakcyjnej 50
Do reakcji PCR, zastosowano termocykler (GeneAmp PCR System 9700, Applied Biosystems) do realizacji następującego programu: temperatura 94°C przez 5 minut; (temperatura 94°C przez 30 sekund, temperatura 55°C przez 30 sekund, temperatura 72°C przez 45 sekund) x 30 cykli; temperatura 72°C przez 7 minut; ochłodzenie do temperatury 4°C. Produkt PCR z każdej reakcji oczyszczono stosując zestaw typu QIAquick Multiwell PCR Purification (Qiagen), i postępując według zaleceń producenta. Oczyszczony produkt PCR następnie zanalizowano wylewając około 10 μl każdej mieszaniny reakcyjnej PCR na 1% żel agarozowy z około 1 μl barwnika (10x BBXS żel agarozowy załadowany barwnikiem). Pozostałą część produktu PRC poddano następnie sekwencjonowaniu stosując sekwe ncer typu ABI 377 (Perkin Elmer) według protokołu zalecanego przez producenta.
6. Ranking sekwencji oraz oznaczenie sekwencji zgodnej
A. Ranking sekwencji i analizy
Sekwencje peptydowe, które translowano ze zmiennych sekwencji nukleotydowych (sekcja 5B) skorelowano z danymi z testów ELISA. Klonom, które wykazały dużą wartość OD450 w przypadku wgłębień powleczonych Ang-2, oraz niską wartość OD450 w przypadku wgłębień powleczonych streptawidyną przyznano pierwszeństwo w rankingu. Sekwencjom, które wystąpiły wielokrotnie także prz yznano pierwszeństwo w rankingu. W oparciu o te kryteria wybrano sekwencje kandydackie do dalszych analiz w charakterze peptydów lub ciał peptydowych.
B. Oznaczenie sekwencji zgodnej
Trzy różne klasy motywów zgodnych wygenerowano z biblioteki TN8-IX, jak następuje:
KRPCEEXWGGCXYX (SEQ ID NO: 56)
KRPCEEXFGGCXYX (SEQIDNO: 57)
XXXCXDXYWYCXXX (SEQ ID NO: 61)
XXXCXDXYTYCXXX (SEQ ID NO: 62)
XXXCXDXFWYCXXX (SEQ ID NO: 63)
XXXCXDX FTYCXXX (SEQ ID NO: 64)
XXXCXWDPWTCEXM (SEQ ID NO: 58)
Jeden motyw zgodny wygenerowano z biblioteki TN12-I:
WSXCAWFXGXXXXXCRRX (SEQ ID NO: 59)
Dla wszystkich sekwencji motywów zgodnych, podkreślone „rdzeniowe sekwencje aminokwasowe” z każdej sekwencji zgodnej uzyskano przez określenie aminokwasu najczęściej występującego w każdej pozycji. Symbol „X” oznacza dowolny aminokwas występujący w naturze. Dwie reszty cyste66
PL 224 701 B1 inowe sąsiednie względem sekwencji rdzeniowych były stałymi aminokwasami w bibliotekach TN8-IX oraz TN12-1.
Peptydy zidentyfikowane jako wiążące się Ang-2 podano w poniższej Tablicy 3.
T a b l i c a 3: Peptydy wiążące Ang-2
Peptyd Seq Id No. Sekwencja
TN8-8 1 KRPCEEMWGGCNYD
TN8-14 2 HQICKWDPWTCKHW
TN8-Con1 3 KRPCEEIFGGCTYQ
TN8-Con4 4 QEECEWDPWTCEHM
TN12-9 5 FDYCEGYEDPFTFGCDNH
L1 6 KFNPLDELEETLYEQFTFQQ
C17 7 QYGCDGFLYGCMIN
P r z y k ł a d 4. Konstruowanie DNA kodującego ciała peptydowe
Zmodyfikowane peptydy wybrane jako potencjalnie inhibitujące wiązanie Ang-2:Tie-2 (patrz Tablica 3) zastosowano do skonstruowania protein fuzyjnych, w których monomer każdego peptydu lub dimer tandemowy każdego peptydu (z linkerem między jednostkami monomeru) sprzężono w ramce z DNA kodującym linker, po którym następuje obszar Fc ludzkiej IgG1. Każdy zmodyfikowany peptyd skonstruowano przez annealing par oligonukleotydów („oligos”) w celu generowania dupleksu polinukleotydowego kodującego peptyd razem z linkerem zawierającym - w zależności od peptydu, 5 reszt glicynowych, 8 reszt glicyno wy ch lub 1 resztę lizynową; konstrukty te generowano jako fragmenty od Ndel do Xhol. Te dupleksowe cząsteczki polinukleotydowe ligowano do wektora (N-końcowy pAMG21-Fc, opisany poniżej) zawierającego ludzki gen Fc, który uprzednio wytrawiono Ndel oraz Xhol. Otrzymane mieszaniny ligacyjne transformowano przez elektroporację do komórek E. coli szczepu 2596 (GM221, opisany poniżej) stosując standardowe procedury. Klony poddano skriningowi na zdo lność wytwarzania rekombinacyjnego produktu proteinowego oraz na posiadanie fuzji genowej posiadającej poprawną sekwencję nukleotydową. Dla każdego spośród zmodyfikowanych peptydów (to znaczy produktów fuzyjnych Fc-peptyd) wybrano pojedynczy taki klon.
Konstruowanie N-końcowego wektora pAMG21 -Fc pAMG21
Plazmid ekspresji pAMG21 (ATCC No. 98113) wyprowadza się z wektora w ekspresji pCFM1656 (ATCC No. 69576) i systemu wektora ekspresji opisanego w patencie nr US 4,710,473, postępując zgodnie z procedurę opisano w opublikowanym międzynarodowym zgłoszeniu patentowym WO 00/24782 (tamże, patrz część Przykładu 2, strony 100-103, a także rysunki Fig. 17A oraz 17B).
Wektor Fc N-końcowy
Wytworzono N-końcowy wektor Fc stosując jako wzorzec monomer pAMG21 Tpo_Gly5_Fc z E. coli szczep 3788. Informację o klonowaniu tego szczepu można znaleźć w publikacji WO 00/24782 (tamże, patrz Przykład 2 oraz rysunek Fig. 10). Primer 5' PCR (opisany poniżej) zaprojektowano tak by usunąć sekwencję peptydu Tpo z pAMG Tpo Gly5 i zastąpić ją polilinkerem zawierającym miejsca ApaLI oraz XhoI. Stosując szczep 3788 jako wzorzec, reakcję PCR przeprowadzono z polim erazą Expand Long Polymerase, stosując oligonukleotyd SEQ ID NO: 8, poniżej, jako primer 5' oraz uniwersalny primeru 3', SEQ ID NO: 9, poniżej. Otrzymany produkt PCR oczyszczono na żelu i wytr awiono enzymami restrykcyjnymi NdeI oraz BsrGI. Zarówno plazmid, jak i polinukleotyd kodujący przedmiotowy peptyd wraz z jego linkerem oczyszczono na żelu stosując kolumny spinowe do oczyszczania na żelu typu Qiagen (Chatsworth, CA). Następnie plazmid oraz insert ligowano stosując standardowe procedury ligowania, a otrzymaną mieszaninę ligacyjną transformowano do komórek E. coli (szczep 2596). Wybrano pojedyncze klony i przeprowadzono sekwencjonowanie DNA. Zidentyfikowano prawidłowy klon i zastosowano jako źródło wektora dla opisanych tu zmodyfikowanych peptydów.
5' Primer:
ACAAACAAACATATGGGTGCACAGAAAGCGGCCGCAAAAAAACT
CGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACA (SEQ ID NO: 8)
PL 224 701 B1
3' Primer:
GGTCATTACTGGACCGGATC (SEQ ID NO: 9)
Poza wytworzeniem tych zmodyfikowanych peptydów jako N-końcowych fuzji z Fc (N-końcowe ciała peptydowe), niektóre z nich wytworzono także jako C-końcowe produkty fuzyjne (C-końcowe ciała peptydowe). Wektor stosowany do wytwarzania C-końcowych fuzji opisano poniżej.
Konstruowanie C-końcowego wektora Fc
Wytworzono C-końcowy wektor Fc dla modyfikowanych peptydów stosując monomer pAMG21 Fc_Gly5_ Tpo z E. coli szczep 3728, jako wzorzec. Informację o klonowaniu tego szczepu można znaleźć w publikacji WO 00/24782 (tamże, patrz Przykład 2 oraz rysunek Fig. 7). Primer 3' PCR (SEQ ID NO: 10) zaprojektowano tak by usunąć sekwencję peptydową Tpo i zastąpić ją polili nkerem zawierającym miejsca ApaLI oraz XhoI. Stosując szczep 3728 jako wzorzec, reakcję PCR przeprowadzono z polimerazą Expand Long Polymerase, stosując uniwersalny primer 5' (SEQ ID NO: 11) oraz wyżej wymieniony primer 3'. Otrzymany produkt PCR oczyszczono na żelu i wytrawiono enzymami restrykcyjnymi BsrGI oraz BamHI. Zarówno plazmid, jak i polinukleotyd kodujący każdy z przedmiotowych peptydów wraz z jego linkerem oczyszczono na żelu stosując kolumny spinowe do oczyszczania na żelu typu Qiagen. Następnie plazmid oraz insert ligowano stosując standardowe procedury ligowania, a otrzymaną mieszaninę ligacyjną transformowano do komórek E. coli (szczep 2596). Wybrano pojedyncze klony i przeprowadzono sekwencjonowanie DNA. Zidentyfikowano prawidłowy klon i zastosowano jako źródło wektora dla opisanych tutaj zmodyfikowanych peptydów.
5' Primer:
CGTACAGGTTTACGCAAGAAAATGG (SEQIDNO: 10)
3' Primer:
TTTGTTGGATCCATTACTCGAGTTTTTTTGCGGCCGCTTTCTGTGCA
CCACCACCTCCACCTTTAC (SEQ ID NO: 11)
GM221 (#2596). Szczepem gospodarza #2596, stosowanym do ekspresji protein fuzyjnych Fcpeptyd, jest szczep E. coli K-12 modyfikowany tak aby zawierał promotor Iux oraz zarówno represora lambda wrażliwy na temperaturę cI857s7 we wczesnym obszarze ebg, oraz represora lacIQ w późniejszym obszarze ebg. Obecność tych dwóch genów represorowych umożliwia wykorzystywanie tego gospodarza w różnych systemach ekspresji. Numer dostępu w kolekcji ATCC dla tego szczepu jest: 202174.
P r z y k ł a d 5. Wytwarzanie ciał peptydowych
Ekspresja w E. coli.: Prowadzono wzrost hodowli każdego z konstruktów fuzyjnych pAMG21-Fc w E. coli GM221 w temperaturze 37°C w pożywce Terrific Broth (patrz Tartof i Hobbs, „Improved media for growing plasmid and cosmid clones”, Bethesda Research Labs Focus, Tom 9, strona 12, 1987, cytowany w wyżej wymienionym odnośniku literaturowym Sambrook i wsp.). Indukcję ekspresji produktu genowego z promotora IuxPR osiągnięto po dodaniu syntetycznego autoinducera - laktonu N-(3-oksoheksanoilo)-DL-homoseryny, do pożywki wzrostowej, do końcowego stężenia 20 nanogramów na mililitr (ng/ml). Hodowle inkubowano w temperaturze 37°C przez dodatkowe sześć godzin. Hodowle bakteryjne następnie przebadano pod mikroskopem pod kątem obecności ciał inkluzyjnych i zebrano przez odwirowanie. Refraktylowe ciała inkluzyjne obserwowano w indukowanych h odowlach, co wskazuje, że Fc-fuzje były najprawdopodobniej wytwarzane w nierozpuszczalnej frakcji w E. coli. Płytki komórkowe poddano lizie bezpośrednio przez resuspensję w próbce buforu Laemmi'ego zawierającego 10% β-merkaptoetanolu, po czym analizowano je metodą SDS-PAGE. W większości przypadków obserwowano pasmo intensywnie wybarwione coomassie, o odpowiedniej masie cząsteczkowej na żelu SDS-PAGE.
Oczyszczanie: Komórki rozerwano w wodzie (1/10) stosując homogenizację z wysokim ciśnie2 niem (dwa przebiegi przy 980 kg/cm2 - 14,000 psi) i zebrano ciała inkluzyjne przez odwirowanie (4000 obrotów/minutę w wirówce typu J-6B, przez jedną godzinę). Ciała inkluzyjne solubilizowano w 6 M guanidynie, 50 mM Tris, 10 mM DTT, pH 8,5, przez jedną godzinę w stosunku 1/10. W przypadku liniowych peptydów przyłączonych do Fc, solubilizowaną mieszaninę rozcieńczono 25 razy w 2 M mocznika, 50 mM Tris, 160 mM argininy, 2 mM cysteiny, pH 8,5. Zezwolono na zachodzenie utleniania przez dwa dni w temperaturze 4°C, co pozwoliło na wytworzenie związku połączonego wiązaniem dwusiarczkowym (to znaczy homodimer Fc-peptyd). W przypadku cyklicznych peptydów przyłączonych do Fc, postępowano zgodnie z tym samym protokołem, z dodatkiem trzech warunków fałdowania: (1) 2 M mocznik, 50 mM Tris, 160 mM arginina, 4 mM cysteina, 1 mM cystamina, pH 8,5; (2) 4 M mocznik, 20% gliceryna, 50 mM Tris, 160 mM arginina, 2 mM cysteina, pH 8,5; oraz (3) 4 M mocznik, 20% gliceryna, 50 mM Tris, 160 mM arginina, 4 mM cysteina, 1 mM cystamina, pH 8,5. Proteinę po
PL 224 701 B1 ponownym sfałdowaniu dializowano wobec: 1,5 M mocznik, 50 mM NaCl, 50 mM Tris, pH 9,0. Wartość pH tej mieszaniny obniżono do pH 5 przy użyciu kwasu octowego. Osad usunięto przez odwirowanie, a supernatant doprowadzono do pH od 5 do 6,5, w zależności od punktu izoelektrycznego każdego produktu fuzyjnego. Proteinę przefiltrowano i załadowano w temperaturze 4°C na kolumnę typu SP- Sepharose HP zrównoważoną 20 mM NaAc, 50 mM NaCl przy pH określonym dla każdego konstruktu. Proteinę eluowano stosując liniowy gradient od 50 mM NaCl do 500 mM NaCl w tym samym buforze przy objętości eluenta odpowiadającej 20- krotnej objętości kolumny. Pik zebrano i filtrowano.
Ciała peptydowe wygenerowane przy zastosowaniu powyższych procedur podano poniżej w Tablicy 4.
T a b l i c a 4
Ciało peptydowe Sekwencja ciała peptydowego
L1 (N) MGAQKFNPLDELEETLYEQFTFQQLEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 12)
L1 (N) WT MKFNPLDELEETLYEQFTFQQLEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 13)
L1 (N) 1K WT MKFNPLDELEETLYEQFTFQQGSGSATGGSGSTASSGSGSATHLEG GGGG-Fc (SEQ ID NO: 14)
2xL1(N) MGAQKFNPLDELEETLYEQFTFQQGGGGGGGGKFNPLDELEETLY EQFTFQQLEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 15)
2xL1(N) WT MKFNPLDELEETLYEQFTFQQGGGGGGGKFNPLDELEETLYEQFTF QQLEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 16)
Con4(N) MGAQQEECEWDPWTCEHMLEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 17)
Con4 (N) 1K-WT MQEECEWDPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHLEGGGGG- Fc (SEQ ID NO: 18)
2xCon4 (N) 1K MGAQQEECEWDPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECEWDPWTCEHMLEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 19)
L1 (C) M-Fc-GGGGGAQKFNPLDELEETLYEQFTFQQLE (SEQ ID NO: 20)
L1 (C) 1K M-Fc-GGGGGAQGSGSATGGSGSTASSGSGSATHKFNPLDELEETLYEQFTFQQLE (SEQ ID NO:21)
2xL1 (C) M-Fc- GGGGGAQKFNPLDELEETLYEQFTFQQGGGGGGGGKFNPLDELEETLYEQFTFQQLE (SEQ ID NO: 22)
Con4 (C) M-Fc-GGGGGAQQEECEWDPWTCEHMLE (SEQ ID NO: 23)
Con4(C) 1K M-Fc- GGGGGAQGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECEWDPWTCEHMLE (SEQ ID NO:24)
2xCon4 (C) 1K M-Fc- GGGGGAQQEECEWDPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECEWDPWTCEHMLE (SEQIDNO: 25)
Con4-L1 (N) MGAQEECEWDPWTCEHMGGGGGGGGKFNPLDELEETLYEQFTFQ QGSGSATGGSGSTASSGSGSATHLEGGGGG-Fc (SEQ IDNO: 26)
Con4-L1 (C) M-Fc- GGGGGAQGSGSATGGSGSTASSGSGSATHKFNPLDELEETLYEQFT FQQGGGGGQEECEWDPWTCEHMLE (SEQ ID NO: 27)
TN-12-9 (N) MGAQ-FDYCEGVEDPFTFGCDNHLE-GGGGG-Fc (SEQ ID NO: 28)
C17(N) MGAQ-QYGCDGFLYGCMINLE-GGGGG-Fc (SEQ ID NO: 29)
TN8-8 (N) MGAQ-KRPCEEMWGGCNYDLEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 30)
TN8-14 (N) MGAQ-HQICKWDPWTCKHWLEGGGGG-Fc (SEQ IDNO: 31)
Con1 (N) MGAQ-KRPCEEIFGGCTYQLEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 32)
PL 224 701 B1
W Tablicy 4, „Fc” odnosi się do sekwencji ludzkiej domeny Fc IgG1. W drugiej kolumnie podano sekwencję aminokwasową ciała peptydowego. Jego część Fc oznaczona jest jako „Fc” i ma budowę podaną jako SEQ ID NO: 60, poniżej. Należy rozumieć, że tam, gdzie stosowane jest znakowanie, przykładowo, „Con4” lub „Con-4”, odnosi się to do peptydu Con-4, podczas gdy końcówki „C”, „(C)” lub „-C”; bądź „N”, „(N)” lub „-N” wskazują, że cząsteczka jest ciałem peptydowym, tu opisanym. Końcówki „N”, „(N)”, lub „-N” w nazwie ciała peptydowego wskazują, że peptyd wiążący Ang-2 (lub peptydy) jest/są N-końcowe względem domeny Fc, a końcówki „C”, „(C)” lub „-C” wskazują, że peptyd wiążący Ang-2 (lub peptydy) jest/są C-końcowe względem domeny Fc. Ponadto, związek 2xCon4 (C) 1K, jaki zdefiniowano w SEQ ID NO: 25, można również określać taką samą nazwą lecz bez końcówki „1K”.
Sekwencja aminokwasowa części Fc każdego ciała peptydowego jest następująca (od końca amino do końca karboksylowego):
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV
SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL
HQDWLNGKEYKCKVSNKALP APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS
RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL
DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS
LSPGK (SEQ ID NO: 60)
Poniżej podano sekwencję DNA (SEQ ID No: 33-53) kodującą ciała peptydowe odpowiadające, odpowiednio, ciałom peptydowym SEQ ID No: 12-32, w Tablicy 4):
PL 224 701 B1
SEQ ID NO: 33:
ATGGGTGCACAGAAATTCAACCCGCTGGACGAACTGGAAGAAACTCTGTACGAAC
AGTTCACTTTCCAGCAGCTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAACTCACACATG
TCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCC
CAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGT
GGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGC
GTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACG
TACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGG
AGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCAT
CTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCC
CGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCT
ATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACT
ACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAG
CTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGA
TGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGG
TAAATAATGGATCC
SEQ ID NO:34
ATGAAATTCAACCCGCTGGACGAACTGGAAGAAACTCTGTACGAACAGTTCACTT
TCCAGCAGCTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTG
CCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCA
AGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGT
GAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTG
CATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTG
GTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGT
GCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGC
CAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAG
CTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCG
ACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCA
CGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTG
GACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGG
CTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAA
SEQ ID NO:35
ATGAAATTCAACCCGCTGGACGAACTGGAAGAAACTCTGTACGAACAGTTCACTT
TCCAGCAGGGATCCGGTTCTGCTACTGGTGGTTCCGGCTCCACCGCAAGCTCTGGT
TCAGGCAGTGCGACTCATCTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAACTCACACAT
GTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCC
CCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGG
TGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGG
CGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCAC
GTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAG
GAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCA
TCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATC
CCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTC
TATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAAC
TACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAA
GCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTG
ATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGG
GTAAATAA
PL 224 701 B1
SEQ ID NO:36
ATGGGTGCACAGAAATTCAACCCGCTGGACGAACTGGAAGAAACTCTGTACGAAC
AGTTCACTTTCCAGCAGGGTGGTGGTGGTGGTGGCGGTGGTAAGTTCAACCCACT
GGATGAGCTGGAAGAGACTCTGTATGAACAGTTCACTTTCCAGCAACTCGAGGGT
GGAGGCGGTGGGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCC
TGGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATC
TCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTG
AGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAA
GCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTC
CTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAA
GCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAG
AACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGT
CAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGG
GAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGAC
TCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGC
AGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTA
CACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAA
SEQ ID NO:37
ATGAAATTCAACCCGCTGGACGAACTGGAAGAAACTCTGTACGAACAGTTCACTT
TCCAGCAGGGTGGTGGTGGTGGCGGTGGTAAGTTCAACCCACTGGATGAGCTGGA
AGAGACTCTGTATGAACAGTTCACTTTCCAGCAACTCGAGGGTGGAGGCGGTGGG
GACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGT
CAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCT
GAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCA
ACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGG
AGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGA
CTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCC
CCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTG
TACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCT
GCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGG
GCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCC
TTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACG
TCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAG
CCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAA
SEQ ID NO:38
ATGGGTGCACAGCAGGAAGAATGCGAATGGGACCCATGGACTTGCGAACACATG
CTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCAC
CTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACC
CTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACG
AAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGC
CAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGT
CCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTC
TCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGC
AGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAA
PL 224 701 B1
GAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCC
GTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCC
GTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAG
CAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCAC
AACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAA
SEQ ID NO:39
ATGCAGGAAGAATGCGAATGGGACCCATGGACTTGCGAACACATGGGATCCGGTT
CTGCTACTGGTGGTTCCGGCTCCACCGCAAGCTCTGGTTCAGGCAGTGCGACTCAT
CTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCAC
CTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACC
CTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACG
AAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGC
CAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGT
CCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTC
TCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGC
AGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAA
GAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCC
GTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCC
GTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAG
CAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCAC
AACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAA
SEQ ID NO:40
ATGGGTGCACAGCAGGAAGAATGCGAATGGGACCCATGGACTTGCGAACACATG
GGATCCGGTTCTGCTACTGGTGGTTCCGGCTCCACCGCAAGCTCTGGTTCAGGCAG
TGCGACTCATCAGGAAGAATGCGAATGGGACCCATGGACTTGCGAACACATGCTC
GAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTG
AACTCCTGGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTC
ATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAG
ACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAA
GACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTC
ACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCA
ACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCC
CCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAAC
CAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGG
AGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGC
TGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAG
GTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAAC
CACTACAC GCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAA
SEQ ID NO:41
ATGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGAC
CGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACC
CCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGT
TCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGG
AGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCA
GGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCA
GCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAG
PL 224 701 B1
GTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGA
CCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAA
TGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGC
TCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGA
ACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAA gagcctctccctgtctccgggtaaaggtggaGgtggtggtgcacagaaattcaac
CCGCTGGACGAGCTGGAAGAGACTCTGTACGAACAGTTTACTTTTCAACAGCTCG
AGTAA
SEQ ID NO:42
ATGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGAC
CGTCAGTTTTCCTCTTCCCCeCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACC
CCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGT
TCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGG
AGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCA
GGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCA
GCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAG
GTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGA
CCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAA
TGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGC
TCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGA
ACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAA
GAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAGGTGGAGGTGGTGGTGCACAGGGATCCGGT
TCTGCTACTGGTGGTTCCGGCTCCACCGCAAGCTCTGGTTCAGGCAGTGCGACTCA
TAAATTCAACCCGCTGGACGAACTGGAAGAAACTCTGTACGAACAGTTCACTTTC
CAGCAACTCGAGTAA
SEQ ID NO:43
ATGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGAC
CGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACC
CCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGT
TCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGG
AGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCA
GGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCA
GCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAG
GTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGA
CCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAA
TGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGC
TCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGA
ACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAA
GAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAGGTGGAGGTGGTGGTGCACAGAAATTCAAC
CCGCTGGACGAACTGGAAGAAACTCTGTACGAACAGTTCACTTTCCAGCAGGGTG
GTGGTGGTGGTGGCGGTGGTAAGTTCAACCCACTGGATGAGCTGGAAGAGACTCT
GTATGAACAGTTCACTTTCCAGCAACTCG AGTAA
SEQ ID NO:44
ATGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGAC
CGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACC
CCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGT
PL 224 701 B1
TCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGG
AGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCA
GGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCA
GCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAG
GTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGA
CCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAA
TGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGC
TCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGA
ACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAA
GAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAGGTGGAGGTGGTGGTGCACAGCAGGAAGAA
TGCGAATGGGACCCATGGACTTGCGAACACATGCTCGAGTAA
SEQ ID NO:45
ATGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGAC
CGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACC
CCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGT
TCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGG
AGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCA
GGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCA
GCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAG
GTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGA
CCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAA
TGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGC
TCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGA
ACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAA
GAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAGGTGGAGGTGGTGGTGCACAGGGATCCGGT
TCTGCTACTGGTGGTTCCGGCTCCACCGCAAGCTCTGGTTCAGGCAGTGCGACTCA
TCAGGAAGAATGCGAATGGGACCCATGGACTTGCGAACACATGCTCGAGTAA
SEQ ID NO:46
ATGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGAC
CGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACC
CCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGT
TCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGG
AGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCA
GGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCA
GCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAG
GTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGA
CCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAA
TGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGC
TCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGA
ACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAA
GAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAGGTGGAGGTGGTGGTGCACAGCAGGAAGAA
TGCGAATGGGACCCATGGACTTGCGAACACATGGGATCCGGTTCTGCTACTGGTG
GTTCCGGCTCCACCGCAAGCTCTGGTTCAGGCAGCGCGACTCATCAGGAAGAATG
CGAATGGGACCCATGGACTTGCGAACACATGCTCGAGTAA
PL 224 701 B1
SEQ ID NO:47
ATGGGTGCACAGGAAGAATGCGAATGGGACCCATGGACTTGCGAACACATGGGT
GGTGGTGGTGGTGGCGGTGGTAAATTCAACCCGCTGGACGAACTGGAAGAAACTC
TGTACGAACAGTTCACTTTCCAGCAGGGATCCGGTTCTGCTACTGGTGGTTCCGGC
TCCACCGCAAGCTCTGGTTCAGGCAGTGCGACTCATCTCGAGGGTGGAGGCGGTG
GgGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACC
GTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCC
CTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTT
CAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGA
GGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAG
GACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAG
CCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGG
TGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGAC
CTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAAT
GGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCT
CCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAA
CGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAG
AGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAA
SEQ ID NO:48
ATGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGAC
CGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACC
CCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGT
TCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGG
AGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCA
GGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCA
GCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAG
GTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGA
CCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAA
TGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGC
TCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGA
ACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAA
GAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAGGTGGAGGTGGTGGTGCACAGGGATCCGGT
TCTGCTACTGGTGGTTCCGGCTCCACCGCAAGCTCTGGTTCAGGCAGTGCGACTCA
TAAATTCAACCCGCTGGACGAACTGGAAGAAACTCTGTACGAACAGTTCACTTTC
CAGCAGGGTGGTGGCGGTGGTCAGGAAGAATGCGAATGGGACCCATGGACTTGC
GAACACATGCTCGAGTAA
SEQ ID NO:49
ATGGGTGCACAGTTCGACTACTGCGAAGGTGTTGAAGACCCGTTCACTTTCGGTTG
CGACAACCACCTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAACTCACACATGTCCACCT
TGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACC
CAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGAC
GTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGG
TGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTG
TGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAA
GTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAA
GCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATG
PL 224 701 B1
AGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAG
CGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGAC
CACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCG
TGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGA
GGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAA
SEQ ID NO:50
ATGGGTGCACAGCAGTACGGTTGCGACGGTTTTCTGTACGGTTGCATGATCAACCT
CGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCT
GAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCT
CATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAA
GACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCA
AGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCC
TCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTC
CAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAG
CCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGA
ACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGT
GGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGT
GCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGC
AGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACA
ACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAA
SEQ IDN0:51
ATGGGTGCACAGAAACGCCCATGCGAAGAAATGTGGGGTGGTTGCAACTACGACC
TCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACC
TGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCC
TCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGA
AGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCC
AAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTC
CTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCT
CCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCA
GCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAG
AACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCG
TGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCG
TGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGC
AGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACA
ACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAA
SEQ ID NO:52
ATGGGTGCACAGCACCAGATCTGCAAATGGGACCCGTGGACCTGCAAACACTGGC
TCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACC
TGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCC
TCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGA
AGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCC
AAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTC
CTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCT
CCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCA
GCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAG
AACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCG
PL 224 701 B1
TGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCG
TGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGC
AGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACA
ACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAA
SEQ ID NO:53
ATGGGTGCACAGAAACGTCCATGCGAAGAAATCTTCGGTGGTTGCACCTACCAGC
TCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACC
TGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCC
TCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGA
AGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCC
AAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTC
CTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCT
CCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCA
GCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAG
AACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCG
TGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCG
TGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGC
AGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACA
ACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAA
P r z y k ł a d 6. Próby z ciałami peptydowymi
Czternaście ciał peptydowych przebadano stosując próbę neutralizacji ELISA i trzy ciała peptydowe przebadano stosując próbę z powinowactwem ELISA.
Wyniki przedstawiono w Tablicy 5.
T a b l i c a 5
Hang-2 mAng-2 Hang-1
Ciało peptydowe IC 50 (nM) IC 50 (nM) IC 50 (nM) IC 50 (nM) IC 50 (nM) IC 50 (nM)
2xCon4 (C) 1K 0,04 0,02
Con4-L1 (C) 0,05 0,04
Con4(C) 0,20 0,30
2xL1 (N) 0,65 0,80
Con4(N) 0,85 0,03 0,72 0,07 Brak inhibitowania Brak wiazania
2xL1 (C) 0,90 1,0
Con4 (N) 1K-WT 1,9
L1 (N) 6 11 Brak inhibitowania
C17(N) 9 13 Brak inhibitowania
12-9(N) 21 7,7 Brak inhibitowania
Con1 (N) 26 ~ 200 Brak inhibitowania
8-14 (N) 45 33 Brak inhibitowania
L1 (C) 65 37
8-8 (N) 80 ~ 700 Brak inhibitowania
Kontrola negat. Ciało peptydowe 4883 Brak inhibitowania Brak wiązania Brak inhibitowania Brak wiązania Brak inhibitowania Brak wiązania
PL 224 701 B1
Sekwencja aminokwasowa negatywnej kontroli - ciała peptydowego 4883, przedstawia się następująco (część Fc jest podkreślona, linkerem jest sekwencja „GGGGG”, a część peptydowa jest wytłuszczona):
MDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV
SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH
QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRD
ELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG
SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGG-CTAGYHWNSDCECCRRN (SEQ ID NO: 243)
Należy rozumieć, że stosowane tutaj określenie „brak inhibitowania” nie oznacza wskazania, że związki nie mają właściwości inhibitorowych. Raczej, „brak inhibitowania” w znaczeniu tu użytym odnosi się do tych związków, które - jeżeli badane są przy zastosowaniu próby neutralizacji ELISA w warunkach tutaj opisanych - wykazywały wartość IC50 większą niż 1000 nM, które stanowiło najwyższe stężenie w jakim związki poddawano skriningowi. Podczas gdy znaczących właściwości inhibitorowych nie obserwowano w przypadku cząsteczek oznaczonych jako wykazujące „brak inhibitowania”, należy rozumieć, że te cząsteczki mogą faktycznie demonstrować właściwości inhibitorowe w innych warunkach prowadzenia próby lub w innych testach. Należy rozumieć, że w korzystnym wykonaniu wynalazek odnosi się do ciał peptydowych, posiadających właściwości inhibitorowe w warunkach stosowania prób tu opisanych.
Dwa spośród obecnych ciał peptydowych badano stosując próbę powinowactwa BIAcore (opisaną w Przykładzie 2). Wyniki zestawiono poniżej w Tablicy 6.
T a b l i c a 6. Powinowactwo ciała peptydowego (Pb) do hAng-2 oraz mAng-2
hAng-2 mAng-2
Ciało peptydowe Kd (nM) ka (1/Ms) kd(1/s) Kd (nM) ka (1/Ms) kd(1/s)
Pb L1 (N) 3,1 2,9 x 105 9,1 x 10'4 0,42 5,6 x 105 2,3 x 10'4
Con4(N) 0,67 3,3 x 105 2,2 x 10'4 0,60 7,3 x 105 4,4 x 10'4
TN12-9 (N) 8,2 1,2 x 105 1,0 x 10'3 0,32 7,2 x 105 2,3 x 10'4
P r z y k ł a d 7. Badania terapeutycznej skuteczności ciała peptydowego Ang-2 przy podawaniu układowym
Ciało peptydowe Ang-2, TN8-Con4-C, podawano podskórnie myszy z nowotworem A431 w dawce raz dziennie od 72 godziny po wprowadzeniu nowotworu. Stosowane dawki ciała peptyd owego wynosiły 1000, 200, 40 oraz 8 μg/mysz/dzień. Wszystkim zwierzętom podano po 20 dawek. Objętości nowotworu oraz masę ciała rejestrowano trzy razy na tydzień. Po koniec badań, zwierzęta uśmiercono, a ich surowicę zebrano i zmierzono poziom ciała peptydowego w surowicy stosując test ELISA. Guzy oraz próbki zdrowych tkanek pobrano od zwierząt ze wszystkich grup.
Wyniki przedstawiono na rysunku Fig. 1 . Jak można zobaczyć, znaczące różnice we wzroście guza obserwowano między grupą otrzymującą ciało peptydowe Ang-2 oraz kontrolną grupą otrzymującą sam nośnik. Wszystkie cztery dawki ciała peptydowego Ang-2 inhibitowały wzrost nowotworu w porównaniu z kontrolą otrzymującą nośnik (p <0,0001 względem grupy kontrolnej otrzymującej n ośnik, stosując powtarzalne pomiary metodą ANOVA). W przeciwieństwie do tego, nowotwory w grupie kontrolnej kontynuowały wzrost ze znacznie większą szybkością. Leczenie tym ciałem peptydowym nie miało znaczącego wpływu na końcową masę ciała, masę organów lub parametry hematologiczne zwierząt leczonych ciałem peptydowym w powyższych dawkach.
P r z y k ł a d 8
1. Konstrukcja wtórnych bibliotek peptydowych Ang-2
A. Elektrokompetentne komórki E. coli
Komórki kompetentne w zakresie elektroporacji typu Epicurian Coli® XL1-Blue MRF' (Stratagene #200158) zakupiono w firmie Stratagene (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA).
PL 224 701 B1
B. Modyfikacja wektora pCES1
Reakcję PCR prowadzono stosując systemy Extend Long Template PCR Systems (Roche Diagnostics Corp., Indianapolis, IN) oraz 1 μg wektora pCES1 (TargetQuest Inc.) jako wzorca. Objętość mieszaniny PCR wynosiła 100 μl i zawierała 1x buforu PCR, 200 nM każdego z dwóch primerów:
5'-CAAACGAATGGATCCTCATTAAAGCCAGA-3' (SEQ ID NO: 244) oraz
5'-GGTGGTGCGGCCGCACTCGAGACTGTTGAAAGTTGTTTAGCA-3' (SEQ ID NO: 245),
200 nM dNTP, i 3 jednostki (U) polimerazy Tag DNA. System PCR TRIO-Thermoblock (Biometra) pracował jak następuje: temperatura 94°C przez 5 minut; 30 cykli temperatura 94°C przez 30 sekund, temperatura 50°C przez 30 sekund, temperatura 12°C przez 45 sekund; oraz temperatura 72°C przez 10 minut; oziębienie do temperatury 4°C.
Produkty reakcji PCR wprowadzono na 1% żelu agarozowy i oczyszczano stosując kolumnę spinową typu QIAGEN Spin Column (QIAGEN Inc., Valencia, CA) według protokołów producenta. Drugą reakcję PCR przeprowadzono stosując 5 μl produktów PCR oraz 200 nM każdego z dwóch primerów:
5'-CAAACGAATGGATCCTCATTAAAGCCAGA-3' (SEQ ID NO: 246), oraz
5'-AACACAAAAGTGCACAGGGTGGAGGTGGTGGTGCGGCCGCACT-3' (SEQ ID NO: 247), w takich samych warunkach reakcji PCR jak opisano powyżej.
Produkty PCR oraz oryginalny wektor pCES1 trawiono następnie oddzielnie w 100 μl mieszaniny reakcyjnej zawierającej 1x buforu NEB2, 60 jednostek ApaLI (New England Biolabs, Beverly, MA), 60 jednostek BamHI (New England Biolabs) w temperaturze 37°C przez 1 godzinę. Wytrawiony DNA następnie oczyszczano stosując kolumnę spinową QIAGEN Spin Column i razem ligowano w 40 μl mieszaniny reakcyjnej zawierającej 1x bufor do ligowania oraz 40 jednostek ligazy T4 DNA (New England Biolabs) w temperaturze pokojowej przez noc.
Wektory transfekowano do E. coli i inkubowano w temperaturze 37°C przez noc. Wyizolowano oddzielnie pojedyncze kolonie, po czym oczyszczono plazmid na kolumnie typu QIAGEN Spin Column. Prawidłowy insert został potwierdzony przez sekwencjonowanie DNA.
C. Wytwarzanie wektorowego DNA
Jeden mikrogram DNA zmodyfikowanego wektora pCES1 (z sekcji IB powyżej) transformowano do 40 μl elektrokompetentnego XL1-blue E. coli (z sekcji 1A powyżej) stosując Gene Pulser II (BIORAD, Hercules, CA), przy zachowaniu następujących parametrów: 2500V, 25 μΡ, oraz 200 omów. Transformowaną próbkę bakteryjną przeniesiono następnie niezwłocznie do probówki zawierającej 960 μl SOC (2% trypton, 0,5% ekstrakt drożdży, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 20 mM glukozy, 10 mM MgSO4, 10 mM MgCl2), i hodowlę pozostawiono do wzrostu w temperaturze 37°C, z jednoczesnym wytrząsaniem, przez 1 godzinę.
Komórkami następnie pokryto płytkę agarową z 2xYTAGT (2xYT z 100 μg/ml ampicyliny, 12,5 μg/ml tetracykliny oraz 2% glukozy) i inkubowano w temperaturze 37°C przez noc. Pojedynczą kolonię potwierdzono przez sekwencjonowanie i zastosowano do zaszczepienia 2 litrów pożywki 2xYTAGT w temperaturze 37°C z wytrząsaniem przez noc. DNA plazmidowego wektora oczyszczono stosując zestaw typu QIAGEN Plasmid Maxi Kit według protokołów producenta.
D. Trawienie DNA wektora
Całą ilość około 2000 mikrogramów DNA wektora (z sekcji 1C powyżej) trawiono w 5000 μl mieszaniny reakcyjnej zawierającej 1x bufor-2 NEB, 300 jednostek ApaLI oraz 300 jednostek XhoI, w temperaturze 37°C przez noc. Tę mieszaninę reakcyjną restrykcyjnego trawienia inkubowano przez noc w temperaturze 37°C i analizowano na handlowym, gotowym do użycia 0,8% żelu agarozowym (Embi Tec, San Diego, CA). Zlinearyzowany wektorowy DNA następnie wycięto z żelu i ekstrahowano stosując zestaw typu QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN Inc.) według zaleceń producenta.
E. Wytwarzanie biblioteki oligonukleotydów
Sześć bibliotekowych oligonukleotydów (1 ustalony oraz 5 domieszkowanych) zaprojektowano w oparciu o sekwencje, które pochodziły z wyników wyżej opisanych. Jednym z ustalonych oligonukleotydów bibliotekowych był:
5'-CACAGTGCACAGGGTNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKS
ARTGGGATCCGTGGASCNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKCATT
CTCTCGAGATCA-3' (numer biblioteki 20) (SEQ ID NO: 248);
PL 224 701 B1 a dwa z 70% domieszkowanych bibliotekowych oligonukleotydów były następujące:
5’-CACAGTGCACAGGGTNNKNNKNNKaaKcgKccKNNKga
KgaKatKttKggKggKNNKacKtaKcaKNNKNNKNNKCATTCTC
TCGAGATCA-3’ (numer biblioteki 27); (SEQ ID NO: 249);
5’-CACAGTGCACAGGGTNNKaaKttKaaKccKctKgaKgaKctKgaKga
KacKctKtaKgaKcaKttKacKttKcaKcaKNNKCATTCTCTCGAGATCA-3’ (numer biblioteki 99); (SEQ ID NO: 250);
Małe litery oznaczają mieszaninę 70% wskazanej zasady oraz 10% każdego z trzech innych nukleotydów). Inne trzy z 91% domieszkowanych bibliotekowych oligonukleotydów były następujące:
5’-CACAGTGCACAGGGTNNKNNKNNKcaKgaKgaKTGCgaKtg
KgaKccKtgKacKTGCgaKcaKatKNNKNNKNNKCATTCTCTCGAGATCA-3’ (numer biblioteki 94); (SEQ ID NO: 251);
5’CACAGTGCACAGGGTNNKttKgaKtaKNNKgaKggKgtKgaKgaKccKttKacKttKggKNNKgaKaaKcaKNNK
CATTCTCTCGAGATCA-3’ (numer biblioteki 25); (SEQ ID NO: 252); oraz
5’CACAGTGCACAGGGTNNKaaKttKaaKccKctKgaKgaKctKgaKgaKacKctKtaKgaKcaKttKacKttKcaKcaK NNKCATTCT CTCGAGATCA-3 ’ (numer biblioteki 26); (SEQ ID NO: 253);
W przypadku powyższych oligonukleotydów, jest zrozumiałe dla biegłego w sztuce, że „N” wskazuje, że każdy z czterech nukleotydów (A, T, C oraz G) jest w równym stopniu reprezentowany podczas syntezy oligonukleotydu, zaś „K” wskazuje, że nukleotydy G oraz T były w równym stopniu reprezentowane podczas syntezy oligonukleotydu. Małe litery oznaczają mieszaninę 91% wskazanej zasady oraz 3% każdego z trzech innych nukleotydów. Każdy z tych oligonukleotydów stosowano jako wzorzec w reakcji PCR.
Zestaw Expand High Fidelity PCR System (Roche Diagnostics Corp.) zastosowano dla przeprowadzenia reakcji PCR. Każdą z bibliotek oligonukleotydowych amplifikowano w 96 wgłębieniach z 50 pl mieszaniny reakcyjnej reakcji PCR, która zawierała 1 nM oligonukleotydu bibliotekowego, 1 x bufor PCR, 300 nM każdego z primerów:
5’-CACAGTGCACAGGGT-3’ (SEQ ID NO: 254); oraz
5’-TGATCTCGAGAGAATG-3 (SEQ ID NO: 255);
200 pM dNTP, 1,5 mM MgCl2 oraz 350 jednostek polimerazy typu Expand. Do realizacji poniższego programu zastosowano termocykler (GeneAmp PCR System 9700, Applied Biosystems): temperatura 94°C przez 5 minut; 25 cykli (temperatura 94°C przez 30 sekund, temperatura 52,5°C przez 60 sekund, temperatura 72° przez 30 sekund); temperatura 72°C przez 10 minut; oziębienie do temperatury 4°C. Następnie usunięto wolne nukleotydy stosując zestaw typu QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN Inc. numer katalogowy 28104) według protokołów producenta.
F. Trawienie bibliotekowych oligonukleotydów
Dla każdej biblioteki produkty PCR (sekcja 1E) trawiono w 1200 pl mieszaniny reakcyjnej zawierającej 1 x bufor2 NEB, 750 jednostek (U) ApaLI oraz 750 jednostek (U) XhoI, w temperaturze 37°C przez noc. Wytrawiony DNA oddzielono na wcześniej przygotowanym 3% żelu agarozowym (Embi Tec). Interesujące pasmo DNA z każdej reakcji wycięto z żelu i ekstrahowano przy użyciu filtru COSTAR Spin-X centrifuge tube filter, 0,22 pm octanu celulozy (Corning Inc., numer katalogowy 8160).
G. Ligowanie wektora z oligonukleotydami bibliotekowymi
W 450 pl mieszaniny do ligowania zawierającej 1x NEB bufor do ligowania, oraz 20,000 jednostek ligazy T4 DNA, ligowano zlinearyzowany wektor (sekcja 1D) oraz każdy wytrawiony bibliotekowy produkt PCR (sekcja 1F) w stosunku molowym 1:5, w temperaturze 16°C przez noc. Ligowane produkty inkubowano w temperaturze 65°C przez 20 minut by zdezaktywowawać ligazę T4 DNA i dalej inkubowano ze 100 jednostkami NotI w temperaturze 37°C przez 2 godziny by zminimalizować samoligowanie wektora. Produkty ligowania oczyszczono następnie stosując standardową ekstrakcję w układzie fenol/chloroform (Molecular Cloning: A Laboratory Manua l, Maniatis i wsp., 3-cie wyPL 224 701 B1 danie, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2000) i ponownie przeprowadzono w stan zawiesiny w 120 gl H2O.
H. Transformacja przez elektroporację
Przeprowadzono dwanaście reakcji elektroporacji dla każdej biblioteki. W przypadku każdej transformacji, zmieszano 10 gl ligowanego DNA wektora (sekcja 1G) oraz 300 gl komórek XL1-BLUE MRF' (sekcja 1A) w 0,2-cm kuwecie (BIO- RAD). Otrzymaną mieszaninę poddano pulsacji w urządzeniu Gene Pulser II przy ustawionych parametrach: 2500 V, 25 gF oraz 200 omów. Transformowane bakterie z każdej z dwunastu reakcji elektroporacji połączono oraz przeniesiono do kolby zawierającej 26 ml SOC celem inkubacji w temperaturze 37°C w ciągu 1 godziny. Komórki dodano następnie do 450 ml 2xYTAG i prowadzono ich wzrost w temperaturze 37°C z wytrząsaniem przez 5 godzin. Komórki odwirowano przy 4000 obrotów na minutę przez 15 minut w temperaturze 4°C. Zbite grudki komórek ponownie rozproszono w 12 ml układu 15% gliceryna/2xYT i przechowywano w temperaturze -80°C. Był to pierwotny zapas bibliotek. Wielkość bibliotek określona wartością miana wynosiła 5,0 x 109 (numer biblioteki 20), 3,3 x 1010 (numer biblioteki 94), 4,7 x 109 (numer biblioteki 25), 5,0 x 109 (numer biblioteki 26), 3,0 x 109 (numer biblioteki 27) oraz 4,2 x 109 (numer biblioteki 99) niezależnych transformantów.
2. Amplifikacja bibliotek
A. Wytwarzanie wtórnego zapasu bibliotek
Z pierwotnego zapasu komórek biblioteki (z sekcji 1 H powyżej), do zaszczepienia pożywki 2xYTAGT (2YT z 100 gg/ml ampicyliny, 12,5 gg/ml tetracykliny oraz 2% glukozy) użyto wystarczającej ilości komórek aby zapewnić 10-krotny nadmiar względem wielkości każdej biblioteki tak, że wyjściowa wartość OD600 wynosiła 0,1. Hodowle poddano wzrostowi w temperaturze 37°C z wytrząsaniem przez kilka godzin do czasu, gdy OD600 = 0,5. Pobrano próbki stanowiące jedną dziesiątą część każdej biblioteki i poddano wzrostowi w oddzielnych kolbach przez kolejne dwie godziny w temperaturze 37°C. Te pod-hodowle odwirowano następnie przy 4000 obrotów na minutę stosując wirówkę typu Beckman JA-14 w ciągu 10 minut w temperaturze 4°C, a zbite grudki bakterii ponownie przeprowadzono w zawiesinę w 7,0 ml (w przypadku każdej biblioteki) mieszaniny 15% gliceryna/2xYT, do przechowywania w temperaturze -80°C.
B. Indukcja fagowa
Próbki fagów helper M13KO7 (Amersham Pharmacia Biotech) dodano do pozostałej części hodowli bakteryjnych przy OD600 = 0,5 (z sekcji 2A powyżej) do końcowego stężenia 3 x 109 pfu/ml. Fagom helper pozwolono zainfekować bakterie w temperaturze 37°C w ciągu 30 minut bez wytrząsania oraz w ciągu 30 minut z powolnym wytrząsaniem. Zainfekowane komórki odwirowano przy 5000 obrotów na minutę w ciągu 15 minut w temperaturze 4°C. Zbite grudki komórek ponownie zawieszono w takiej samej objętości (z sekcji 2A powyżej) pożywki 2xYTAK (2YT z 100 gg/ml ampicyliny oraz 40 gg/ml kanamycyny). Całość pozostawiono do wytwarzania fagemidu w temperaturze 30°C przez noc, z jednoczesnym wytrząsaniem.
C. Zebranie fagów
Hodowle bakteryjne z sekcji 2B powyżej odwirowano przy 5000 obrotów na minutę w ciągu 15 minut w temperaturze 4°C. Następnie supernatanty przeniesiono do nowych kolb i dodano 0,2 objętości 20% PEG/2,5M NaCl i inkubowano w lodzie przez 1 godzinę do wytrącenia osadu fagemidów. Wytrącone fagemidy odwirowano przy 10.000 obrotów na minutę w ciągu 30 minut w temperaturze 4°C i ostrożnie ponownie rozproszono w 100 ml zimnego roztworu PBS. Roztwór fagemidowy oczyszczano dalej przez odwirowanie, odrzucając pozostałe komórki przy 4000 obrotów na minutę w ciągu 10 minut w temperaturze 4°C i wytrącono fagemidy dodając 0,2 objętości 20% mieszaniny PEG/2,5M NaCl. Fagemidy odwirowano przy 10.000 obrotów na minutę w ciągu 30 minut w temperaturze 4°C, i zbite grudki fagemidów rozproszono w 18 ml zimnego roztworu PBS. Do roztworu fagemidów dodano sześć mililitrów 60% roztworu gliceryny do przechowywania w temperaturze -80°C. Miana fagemidów oznaczono stosując standardową procedurę (Klonowanie Molekularne, Maniatis i wsp., 3-cie wydanie).
3. Selekcja fagów wiążących ludzką Ang-2
A. Immobilizacja Ang-2 na perełkach magnetycznych
Biotynylowaną Ang-2 (z sekcji 3A powyżej) unieruchomiono na perełkach Dynabead M-280 Streptavidin (DYNAL, Lake Success, NY) w stężeniu 2000 ng proteiny Ang-2 na 100 gl porcji perełek
PL 224 701 B1 od wytwórcy. Po odciągnięciu perełek na jedną stronę probówki przy użyciu magnesu oraz odpipetowaniu cieczy, perełki przemyto dwukrotnie przy użyciu roztworu solanki buforowanej fosforanem (PBS) i ponownie rozproszono w PBS. Biotynylowaną proteinę Ang-2 dodano do przemytych perełek o powyższym stężeniu oraz inkubowano z ciągłym obracaniem w ciągu 1 godziny w temperaturze pokojowej. Perełki powleczone Ang-2 następnie zablokowano dodając BSA do końcowego stężenia 2% oraz inkubowano przez noc w temperaturze 4°C z ciągłym obracaniem. Otrzymane perełki powleczone Ang-2 przemyto następnie dwukrotnie przy użyciu PBST (PBS z 0,05% Tween-20) przed poddaniem ich procedurom selekcji.
B. Selekcja przy zastosowaniu perełek powleczonych Ang-2
Około 1000-krotną ilość bibliotekowych równoważników fagemidów (z sekcji 2C powyżej) blokowano przez jedną godzinę 1 ml PBS zawierającym 2% BSA. Zablokowaną próbkę fagemidową poddano trzem etapom negatywnej selekcji dodając ją do czystych perełek (takie same perełki jak w sekcji 3A, lecz nie powleczone proteiną Ang-2) i mieszaninę tę inkubowano w temperaturze pokojowej w ciągu 15 minut z ciągłym obracaniem. Supernatant zawierający fagemid odciągnięto wykorzystując magnes oraz przeniesiono do nowej kolby zawierającej czyste perełki (takie same perełki jak opisano powyżej w sekcji 3A, lecz nie powleczone proteiną Ang-2) i mieszaninę tę inkubowano w temperaturze pokojowej przez 15 minut z ciągłym obracaniem.
Procedurę powtórzono. Następnie odciągnięto supernatant zawierający fagemid wykorzystując magnes oraz przeniesiono do nowej kolby zawierającej perełki powleczone proteiną Ang-2 (z sekcji 3A) i mieszaninę tę inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę z ciągłym obracaniem. Po usunięciu supernatantu, perełki pokryte fagemidem przemyto 10-krotnie przy użyciu mieszaniny 2% mleka w PBS; 10-krotnie przy użyciu mieszaniny 2% BSA-PBS; 10-krotnie przy użyciu PBST, oraz dwukrotnie przy użyciu PBS. Następnie fagemidy eluowano przy użyciu 1 ml roztworu 100 mM triet yloaminy (Sigma, St. Louis, MO) w ciągu 10 minut na wirówce. Roztwór zawierający fagemid zoboję tniono dodając 0,5 ml mieszaniny 1 M Tris-HCl (pH 7,5). Otrzymane fagemidy stosowano do zainfekowania 10 ml świeżo wyhodowanej bakterii XL1-Blue MRF' (OD600 około 0,5) w temperaturze 37°C w ciągu 30 minut bez wytrząsania i 30 minut z powolnym wytrząsaniem. Wszystkie zainfekowane komórki XL1-BLUE MRF' umieszczono na płytce 2xYTAG o wymiarach 15 x 15 cm i inkubowano w temperaturze 30°C przez noc.
C. Indukcja oraz zbiór fagów
Próbkę 10 ml pożywki 2xYTAGT umieszczono na płytce (z sekcji 3B) w celu ponownego wytworzenia zawiesiny komórek XL1-BLUE MRF'. Wszystkie komórki XL1-BLUE MRF' zebrano w probówce, a próbkę 250 μl tych komórek dodano do 25 ml 2xYTAGT i poddano wzrostowi w temperaturze 37°C do osiągnięcia OD600 = 0,5. Fagi helper M13KO7 dodano do końcowego stężenia 3 x 109 cfu/ml i inkubowano w temperaturze 37°C przez 30 minut bez wytrząsania i 30 minut z łagodnym wytrząsaniem. Komórki odwirowano przy 5000 obrotów na minutę w ciągu 10 minut w temperaturze 4°C i ponownie przeprowadzono w zawiesinę w 25 ml 2xYTAK. Bakterie te pozostawiono do wzrostu w temperaturze 30°C przez noc, z wytrząsaniem. Indukowane fagemidy zebrano i oczyszczono jak w sekcji 2C.
D. Drugi cykl selekcji
Drugi cykl selekcji przeprowadzono w sposób podany w sekcjach od 3B do 3C z następującymi różnicami. Około 100-krotną ilość bibliotekowych równoważników fagemidów otrzymanych w sekcji 3C stosowano jako fagemid wejściowy. Ilość biotynylowanej proteiny Ang-2 (sekcja 3A) pokrywającej perełki Dynabead M-280 Streptavidin obniżono do 20 ng. Następnie perełki z przyczepionym fagiem przemyto 10-krotnie przy użyciu mieszaniny 2% mleka w PBS; 10-krotnie przy użyciu mieszaniny 2% BSA-PBS; 10-krotnie PBST, a ostatnie przemycie obejmowało inkubowanie przez 60 minut w temperaturze pokojowej w PBST. Perełki przemyto dwukrotnie przy użyciu PBS. Warunki elucji były takie same jak w pierwszym cyklu (sekcja 3B).
E. Trzeci cykl selekcji
Trzeci cykl selekcji przeprowadzono w sposób podany w sekcjach od 3B do 3C z następującymi różnicami. Około 10-krotną ilość bibliotekowych równoważników fagemidów otrzymanych w sekcji 3D stosowano jako fagemid wejściowy. Około 2 ng biotynylowanej proteiny Ang-2 (z sekcji 3A) stosowano do naniesienia na perełki Dynabead M-280 Streptavidin. Perełki z przyczepionym fagiem przemyto 10-krotnie przy użyciu mieszaniny 2% mleka w PBS; 10-krotnie przy użyciu mieszaniny 2% BSA-PBS; 10-krotnie PBST, a ostatnie przemycie obejmowało inkubowanie przez 60 minut w temperaturze pokoPL 224 701 B1 jowej w PBST. Perełki przemyto dwukrotnie przy użyciu PBS. Warunki eluowania były takie same jak w pierwszym cyklu (sekcja 3B).
F. Czwarty cykl selekcji
Czwarty cykl selekcji przeprowadzono w sposób podany w sekcjach od 3B do 3C z następującymi różnicami. Bibliotekowe równoważniki fagemidów otrzymane w sekcji 3E stosowano jako fagemid wejściowy. Ilość biotynylowanej proteiny Ang-2 (sekcja 3A) (sekcja 3A) naniesionej na perełki Dynabead M-280 Streptavidin obniżono do 0,4 ng w przypadku bibliotek 25, 26, oraz 27. W przypadku bibliotek 20 i 94 ilość biotynylowanej proteiny Ang-2 do pokrycia perełek utrzymano jak w trzecim cyklu na poziomie 2 ng. Biblioteka 99 nie była poddana czwartemu cyklowi selekcji. Warunki eluowania były takie same jak w pierwszym cyklu (sekcja 3B).
3. Analiza klonalna
A. Wytwarzanie płytki głównej
Wybrano pojedyncze kolonie z drugiego cyklu selekcji i zaszczepiono na płytkach o 96 wgłębieniach zawierających 120 μl 2xYTAGT na wgłębienie. Te płytki o 96 wgłębieniach inkubowano w temperaturze 30°C z wytrząsaniem przez noc. Dodano 40 mikrolitrów 60% roztworu gliceryny na wgłębienie do przechowywania w temperaturze -80°C.
B. Testy ELISA dla fagemidu
Około 2 μl próbek komórek z płytki głównej (z sekcji 4A powyżej) zaszczepiono na świeżej płytce typu Costar® o 96 wgłębieniach (Corning Incorporated, Corning, NY, numer katalogowy 9794) zawierającej 100 μl 2xYTAGT na wgłębienie i komórki na tej nowej płytce poddano wzrostowi w temperaturze 37°C, do osiągnięcia OD600 około 0,5.
Dodano do każdego wgłębienia 40 mikrolitrów 2xYTAGT zawierającego fag helper M13KO7 (1,5 x 10 cfu/ml) i płytkę o 96 wgłębieniach inkubowano w temperaturze 37°C w ciągu 30 minut bez wytrząsania i przez kolejne 30 minut z powolnym wytrząsaniem. Płytkę odwirowano przy 2000 obrotów na minutę (wirówka stołowa typu Beckman CS-6R) w ciągu 10 minut w temperaturze 4°C. Supernatanty usunięto z wgłębień i każdą zbitą grudkę komórek ponownie rozproszono stosując 150 μl 2xYTAK na wgłębienie. Płytkę inkubowano w temperaturze 30°C przez noc w celu ekspresji fagemidu.
Ludzką proteinę Ang-2 (NUNC) naniesiono na płytkę o 96 wgłębieniach typu Maxisorp (NUNC) w ilości 1 μg/ml w 1xPBS w temperaturze 4°C przez noc. Jako kontrolę, oddzielną płytkę typu Maxisorp powleczono 2% BSA (Sigma). Następnego dnia odwirowano komórki hodowane przez noc przy 2000 obrotów na minutę w ciągu 10 minut w temperaturze 4°C. Dziesięć mikrolitrów supernatantu z każdego wgłębienia przeniesiono na nową płytkę o 96 wgłębieniach zawierających roztwór BSA/PBS, rozcieńczając supernatant w stosunku 1:10. Otrzymane mieszaniny inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem blokując fagemidy. Tymczasem, powleczoną proteiną Ang-2 płytkę zablokowano przy użyciu 400 μl roztworu 2% BSA/PBS na wgłębienie w ciągu 1 godziny w temperaturze pokojowej z jednoczesnym wytrząsaniem. Roztwór BSA usunięto, a każde wgłębienie przemyto trzykrotnie przy użyciu roztworu PBS. Po ostatnim etapie przemywania, do każdego wgłębienia płytki powleczonej proteiną Ang-2 dodano 100 μl roztworów z zablokowanymi fagemidami, podobnie jak do płytki kontrolnej i inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem. Ciecz usunięto, a każde wgłębienie przemyto trzykrotnie przy użyciu roztworu PBST. Do każdego wgłębienia płytki powleczonej proteiną Ang-2 oraz płytki kontrolnej, dodano 100 μl antyM13 mAb skoniugowanego z HRP (Amersham Pharmacia Biotech) w rozcieńczeniu 1:15.000 i płytki te inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z jednoczesnym wytrząsaniem. Ciecz usunięto ponownie, a każde wgłębienie przemyto trzykrotnie przy użyciu roztworu PBST. Do wgłębień dodano 100 μl substratów chemiluminescencyjnych LumiGLO (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) i dokonano odczytu dla każdego wgłębienia na urządzeniu Luminoskan Ascent DLRearly (Labsystems, Franklin, MA).
C. Sekwencjonowanie klonów fagowych
Reakcję PCR przeprowadzono stosując jak wzorzec 1 μl bakterii z każdego wgłębienia płytki głównej (sekcja 4A). Objętość każdej mieszaniny PCR wynosiła 50 μl i zawierała 1x bufor PCR, 300 nM każdego z dwóch primerów:
5'-GTTAGCTCACTCATTAGGCAC-3' (SEQ ID NO: 256) oraz
5'-GTACCGTAACACTGAGTTTCG-3', (SEQ ID NO: 257);
PL 224 701 B1
200 gM dNTP, 2 mM MgCl2 oraz 2,5 jednostek (U) taq polimerazy DNA (Roche Molecular Biochemicals). Do zrealizowania poniższego programu zastosowano procedurę GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems): temperatura 94°C przez 5 minut; 40 cykli (temperatura 94°C przez 45 sekund, temperatura 55°C przez 45 sekund, temperatura 72°C przez 90 sekund); temperatura 72°C przez 10 minut; oziębienie do temperatury 4°C. Produkty PCR oczyszczono stosując zestaw QIAquick 96 PCR Purification Kit (QIAGEN Inc.) według zaleceń producenta. Wszystkie oczyszczone produkty PCR sekwencjonowano przy użyciu primera 5'-TTACACTTTATGCTTCCG-3' (SEQ ID NO: 258) stosując urządzenie ABI Sekwencer 3770 (Perkin Elmer) i postępując według zaleceń producenta.
4. Ranking sekwencji
Sekwencje peptydowe, które translowano z sekwencji nukleotydowych (z sekcji 4C powyżej) skorelowano z danymi ELISA. Klony, które wykazały wysoki odczyt OD we wgłębieniach pokrytych Ang-2 oraz niski odczyt OD we wgłębieniach pokrytych BSA uznano za ważne (doniosłe). Sekwencje, które występują wielokrotnie również uznano za ważne. Dwadzieścia cztery sekwencje peptydowe z biblioteki 20, 26 sekwencji peptydowych z biblioteki 94, 7 sekwencji peptydowych z biblioteki 25, 18 sekwencji peptydowych z biblioteki 26, 6 sekwencji peptydowych z biblioteki 27, oraz 4 sekwencje peptydowe z biblioteki 99 wybrano do dalszych analiz oraz generowania ciała peptydowego. Ponadto, jedenaście sekwencji zgodnych z bibliotek 20 oraz 94, trzy zgodne sekwencje z bibliotek 26 oraz 99, oraz dwie z biblioteki 25 wywnioskowano i zastosowano do generowania ciał peptydowych. Ciała peptydowe w Tablicy 7 oceniono stosując protokół neutralizacji ELISA opisany tutaj w przykładzie 10. Wyniki przedstawiono w Tablicy 7.
PL 224 701 B1
T a b l i c a 7
Dojrzałe ciała peptydowe z powinowactwem pochodne Con4 hAng-2:Tie2 ICjo(nM) Sekwencja przeciwciała (Seq Id No:)
Con4-44 (C) 0,09 M-Fc-GGGGGAQPIRQEECDWDPWTCEHMWEV-LE (SEQ ID NO: 259)
Con4-40 (C) 0,10 M-Fc-GGGGGAQTNIQEECEWDPWTCDHMPGK-LE (SEQ ID NO: 260)
Con4-4 (C) 0,12 M-Fc-GGGGGAQ- WYEQDACEWDPWTCEHMAEV-LE (SEQ ID NO: 261)
Con4-31 (C) 0,16 M-Fc-GGGGGAQNRLQEVCEWDPWTCEHMENV-LE (SEQ ID NO: 262)
Con4-C5 (C) 0,16 M-Fc-GGGGGAQAATQEECEWDPWTCEHMPRS-LE (SEQ ID NO: 263)
Con4-42 (C) 0,17 M-Fc-GGGGGAQLRHQEGCEWDPWTCEHMFDW-LE (SEQ ID NO: 264)
Con4-35 (C) 0,18 M-Fc-GGGGGAQ- VPRQKDCEWDPWTCEHMYVG-LE (SEQ ID NO: 265)
Con4-43 (C) 0,18 M-Fc-GGGGGAQSISHEECEWDPWTCEHMQVG-LE (SEQ ID NO: 266)
Con4-49 (C) 0,19 M-Fc-GGGGGAQ- WAAQEECEWDPWTCEHMGRM-LE (SEQ ID NO: 267)
Con4-27 (C) 0,22 M-Fc-GGGGGAQTWPQDKCEWDPWTCEHMGST-LE (SEQ ID NO: 268)
Con4-48 (C) 0,26 M-Fc-GGGGGAQ- GHSQEECGWDPWTCEHMGTS-LE, (SEQ ID NO: 269)
Con4-46 (C) 0,26 M-Fc-GGGGGAQQHWQEECEWDPWTCDHMPSK-LE (SEQ ID NO: 270)
Con4-41 (C) 0,26 M-Fc-GGGGGAQNVRQEKCEWDPWTCEHMPVR-LE (SEQ ID NO: 271)
Con4-36 (C) 0,28 M-Fc-GGGGGAQKSGQVECNWDPWTCEHMPRN-LE (SEQ ID NO: 272)
PL 224 701 B1
Con4-34 (C) 0,28 M-Fc-GGGGGAQ- VKTQEHCDWDPWTCEHMREW-LE (SEQ ID NO: 273)
Con4-28 (C) 0,30 M-Fc-GGGGGAQ- AWGQEGCDWDPWTCEHMLPM-LE (SEQ ID NO: 274)
Con4-39 (C) 0,30 M-Fc-GGGGGAQPVNQEDCEWDPWTCEHMPPM-LE (SEQ ID NO: 275)
Con4-25 (C) 0,31 M-Fc-GGGGGAQRAPQEDCEWDPWTCAHMDIK-LE (SEQ ID NO: 276)
Con4-50 (C) 0,38 M-Fc-GGGGGAQHGQNMECEWDPWTCEHMFRY-LE (SEQ ID NO: 277)
Con4-38 (C) 0,40 M-Fc-GGGGGAQPRLQEECVWDPWTCEHMPLR-LE (SEQ ID NO: 278)
Con4-29 (C) 0,41 M-Fc-GGGGGAQRTTQEKCEWDPWTCEHMESQ-LE (SEQ ID NO: 279)
Con4-47 (C) 0,44 M-Fc-GGGGGAQQTSQEDCVWDPWTCDHMVSS-LE (SEQ ID NO: 280)
Con4-20 (C) 0,48 M-Fc-GGGGGAQQVIGRPCEWDPWTCEHLEGL-LE (SEQ ID NO: 281)
Con4-45 (C) 0,48 M-Fc-GGGGGAQ- WAQQEECAWDPWTCDHMVGL-LE (SEQ ID NO: 282)
Con4-37 (C) 0,49 M-Fc-GGGGGAQLPGQEDCEWDPWTCEHMVRS-LE (SEQ ID NO: 283)
Con4-33 (C) 0,52 M-Fc-GGGGGAQPMNQVECDWDPWTCEHMPRS-LE (SEQ ID NO: 284)
AC2-Con4 (C) 0,52 M-Fc-GGGGGAQ- FGWSHGCEWDPWTCEHMGST-LE (SEQ ID NO: 285)
PL 224 701 B1
Con4-32 (C) 0,75 M-Fc-GGGGGAQKSTQDDCDWDPWTCEHMVGP-LE (SEQ ID NO: 286)
Con4-17(C) 0,96 M-Fc-GGGGGAQGPRISTCQWDPWTCEHMDQL-LE (SEQ ID NO: 287)
Con4-8 (C) 1,20 M-Fc-GGGGGAQSTIGDMCEWDPWTCAHMQVD-LE (SEQ ID NO: 288)
AC4-Con4 (C) 1,54 M-Fc-GGGGGAQVLGGQGCEWDPWTCRLLQGW-LE (SEQ ID NO: 289)
Con4-1 (C) 2,47 M-Fc-GGGGGAQVLGGQGCQWDPWTCSHLEDG-LE (SEQ ID NO: 290)
Con4-Cl (C) 2,75 M-Fc-GGGGGAQTTIGSMCEWDPWTCAHMQGG-LE (SEQIDNO: 291)
Con4-21 (C) 3,21 M-Fc-GGGGGAQ- TKGKSVCQWDPWTCSHMQSG-LE (SEQ ID NO: 292)
Con4-C2 (C) 3,75 M-Fc-GGGGGAQ- TTIGSMCQWDPWTCAHMQGG-LE (SEQ ID NO: 293)
Con4-18(C) 4,80 M-Fc-GGGGGAQ- WVNEVVCEWDPWTCNHWDTP-LE (SEQ ID NO: 294)
Con4-19 (C) 5,76 M-Fc-GGGGGAQ- WQVGMCQWDPWTCKHMRLQ-LE (SEQ ID NO: 295)
Con4-16 (C) 6,94 M-Fc-GGGGGAQAVGSQTCEWDPWTCAHLVEV-LE (SEQ ID NO: 296)
Con4-ll (C) 9,70 M-Fc-GGGGGAQQGMKMFCEWDPWTCAHIVYR-LE (SEQ ID NO: 297)
Con4-C4 (C) 9,80 M-Fc-GGGGGAQTTIGSMCQWDPWTCEHMQGG-LE (SEQ ID NO: 298)
PL 224 701 B1
Con4-23 (C) 9,88 M-Fc-GGGGGAQTSQRVGCEWDPWTCQHLTYT-LE (SEQ ID NO: 299)
Con4-15(C) 15,00 M-Fc-GGGGGAQQWSWPPCEWDPWTCQTVWPS-LE (SEQ ID NO: 300)
Con4-9 (C) 20,11 M-Fc-GGGGGAQGTSPSFCQWDPWTCSHMVQG-LE (SEQ ID NO: 301)
Con4-10(C) 86,61 M-Fc-GGGGGAQTQGLHQCEWDPWTCKVLWPS-LE (SEQ ID NO: 302)
Con4-22 (C) 150,00 M-Fc-GGGGGAQ- VWRSQVCQWDPWTCNLGGDW-LE (SEQ ID NO: 303)
Con4-3 (C) 281,50 M-Fc-GGGGGAQDKILEECQWDPWTCQFFYGA-LE (SEQ ID NO: 304)
Con4-5 (C) Brak inhibitowania M-Fc-GGGGGAQ- ATFARQCQWDPWTCALGGNW-LE (SEQ ID NO: 305)
Con4-30 (C) Brak inhibitowania M-Fc-GGGGGAQGPAQEECEWDPWTCEPLPLM-LE (SEQ ID NO: 306)
Con4-26 (C) Brak inhibitowania M-Fc-GGGGGAQ- RPEDMCSQWDPWTWHLQGYC-LE (SEQ ID NO: 307)
Con4-7 (C) Brak inhibitowania M-Fc-GGGGGAQLWQLAVCQWDPQTCDHMGAL-LE (SEQ ID NO: 308)
Con4-12(C) Brak inhibitowania M-Fc-GGGGGAQTQLVSLCEWDPWTCRLLDGW-LE (SEQ ID NO: 309)
Con4-13 (C) Brak inhibitowania M-Fc-GGGGGAQ- MGGAGRCEWDPWTCQLLQGW-LE (SEQ ID NO: 310)
Con4-14 (C) Brak inhibitowania M-Fc-GGGGGAQMFLPNECQWDPWTCSNLPEA-LE (SEQ ID NO: 311)
PL 224 701 B1
Con4-2 (C) Brak inhibitowania M-Fc-GGGGGAQ- FGWSHGCEWDPWTCRLLQGW-LE (SEQ ID NO: 312)
Con4-6 (C) Brak inhibitowania M-Fc-GGGGGAQ- WPQTEGCQWDPWTCRLLHGW-LE (SEQ ID NO: 313)
Con4-24 (C) Brak inhibitowania M-Fc-GGGGGAQ- PDTRQGCQWDPWTCRLYGMW-LE (SEQ ID NO: 314)
ACl-Con4(C) Brak inhibitowania M-Fc-GGGGGAQ- TWPQDKCEWDPWTCRLLQGW-LE (SEQ ID NO: 315)
AC3-Con4 (C) Brak inhibitowania M-Fc-GGGGGAQDKILEECEWDPWTCRLLQGW-LE (SEQIDNO: 316)
AC5-Con4 (C) Brak inhibitowania M-Fc-GGGGGAQAATQEECEWDPWTCRLLQGW-LE (SEQ ID NO: 317)
Dojrzałe ciała peptydowe z powinowactwem pochodne Ll hAng-2:Tie2 IC50(nM) Sekwencja ciała peptydowego (Seq Id No:)
Ll-7 (N) 0,3 MGAQ-TNFMPMDDLEQRLYEQFILQQG- LEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 318)
AC6-L1 (N) 0,03 MGAQ-TNYKPLDELDATLYEHWILQHS LEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 319)
Ll-15 (N) 0,04 MGAQ-QKYQPLDELDKTLYDQFMLQQG LEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 320)
Ll-2 (N) 0,04 MGAQ-LNFTPLDELEQTLYEQWTLQQS LEGGGGG-Fc (SEQIDNO: 321)
Ll-10(N) 0,05 MGAQ-QKFQPLDELEQTLYEQFMLQQA LEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 322)
PL 224 701 B1
Ll-13 (N) 0,05 MGAQ-QEYEPLDELDETLYNQWMFHQR LEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 323)
LI-5 (N) 0,05 MGAQ-VKYKPLDELDEILYEQQTFQER LEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 324)
L1-C2 (N) 0,05 MGAQ-TKFQPLDELDQTLYEQWTLQQR LEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 325)
L1-C3 (N) 0,06 MGAQ-TNFQPLDELDQTLYEQWTLQQR LEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 326)
Ll-11(N) 0,07 MGAQ-QNFKPMDELEDTLYKQFLFQHS LEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 327)
Ll-17 (N) 0,08 MGAQ-VKYKPLDELDEWLYHQFTLHHQ LEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 328)
L1-12(N) 0,08 MGAQ-YKFTPLDDLEQTLYEQWTLQHV LEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 329)
Ll-1 (N) 0,08 MGAQ-QNYKPLDELDATLYEHFIFHYT LEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 330)
L1-4(N) 0,08 MGAQ-VKFKPLDALEQTLYEHWMFQQA LEGGGGG-Fc (SEQ IDNO: 331)
Ll-20(N) 0,09 MGAQ-EDYMPLDALDAQLYEQFILLHG LEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 332)
LI-22 (N) 0,09 MGAQ-YKFNPMDELEQTLYEEFLFQHA LEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 333)
L1-14(N) 0,11 MGAQ-SNFMPLDELEQTLYEQFMLQHQ LEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 334)
L1-16(N) 0,11 MGAQ-QKFQPLDELEETLYKQWTLQQR LEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 335)
PL 224 701 B1
Ll-18 (Ν) 0,16 MGAQ-QKEMPLDELDEILYEQFMFQQS LEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 336)
Ll-3 (N) 0,16 MGAQ-TKFNPLDELEQTLYEQWTLQHQ LEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 337)
LI-21 (N) 0,17 MGAQ-HTFQPLDELEETLYYQWLYDQL LEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 338)
LI-Cl (N) 0,56 MGAQ-QKFKPLDELEQTLYEQWTLQQR LEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 339)
L1-19(N) 1,26 MGAQ-QTFQPLDDLEEYLYEQWIRRYH LEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 340)
Ll-9 (N) 1,62 MGAQ-SKFKPLDELEQTLYEQWTLQHA LEGGGGG-Fc (SEQIDNO: 341)
Dojrzale ciała peptydowe z powinowactwem pochodne Conl hAng-2:Tie2 IC5o(nM) Sekwencja ciała peptydowego (Seq Id No:)
Conl-4 (C) 1,68 M-Fc-GGGGGAQSGQLRPCEEIFGCGTQNLAL-LE (SEQ ID NO: 342)
Conl-1(C) 3,08 M-Fc-GGGGGAQ- AGGMRPYDGMLGWPNYDVQA-LE (SEQ ID NO: 343)
Conl-6 (C) 8,60 M-Fc-GGGGGAQGQDLRPCEDMFGCGTKDWYG-LE (SEQ ID NO: 344)
Conl-3 (C) 16,42 M-Fc-GGGGGAQAPGQRPYDGMLGWPTYQRIV-LE (SEQ ID NO: 345)
Conl-2 (C) Brak inhibitowania M-Fc-GGGGGAQQTWDDPCMHILGPVTWRRCI-LE (SEQ ID NO: 346)
Conl-5 (C) Brak inhibitowania M-Fc-GGGGGAQFGDKRPLECMFGGPIQLCPR-LE (SEQ ID NO: 347)
PL 224 701 B1
Rodzime Conl (C) 26,00 M-Fc-GGGGGAQ-KRPCEEIFGGCTYQ-LE (SEQ ID NO: 348)
Dojrzałe ciała peptydowe z powinowactwem pochodne 12-9 hAng-2 :Tie2 IC50(nM) Sekwencja ciała peptydowego (Seq Id No:)
12-9-3 (C) 0,81 M-Fc-GGGGGAQ- LQEWCEGVEDPFTFGCEKQR-LE (SEQ ID NO: 349)
12-9-7 (C) 0,93 M-Fc-GGGGGAQ- MLDYCEGMDDPFTFGCDKQM-LE (SEQ ID NO: 350)
12-9-6 (C) 0,95 M-Fc-GGGGGAQ- HQEYCEGMEDPFTFGCEYQG-LE (SEQIDNO: 351)
12-9-C2 (C) 1,41 M-Fc-GGGGGAQ- LQDYCEGVEDPFTFGCENQR-LE (SEQ ID NO: 352)
12-9-5 (C) 1,56 M-Fc-GGGGGAQ- LLDYCEGVQDPFTFGCENLD-LE (SEQ ID NO: 353)
12-9-1 (C) 1,84 M-Fc-GGGGGAQ- GFEYCDGMEDPFTFGCDKQT-LE (SEQ ID NO: 354)
12-9-4 (C) 2,05 M-Fc-GGGGGAQ- AQDYCEGMEDPFTFGCEMQK-LE (SEQ ID NO: 355)
12-9-C1 (C) 2,68 M-Fc-GGGGGAQ- LQDYCEGVEDPFTFGCEKQR-LE (SEQ ID NO: 356)
12-9-2 (C) 8,42 M-Fc-GGGGGAQ- KLEYCDGMEDPFTQGCDNQS-LE (SEQ ID NO: 357)
Rodzime: 12-9 (C) 15,00 M-Fc-GGGGGAQ-FDYCEGVEDPFTFGCDNH- LE (SEQ ID NO: 358)
PL 224 701 B1
P r z y k ł a d 9
Sześć próbek ciał peptydowych anty-Ang2 przebadano na ich aktywność wiązania z huAng2 (R&D Systems, BNO12103A) przy wykorzystaniu BIAcore. Proteinę G immobilizowano na chipie CM5, postępując zgodnie ze standardową procedurą sprzęgania amin (BIAcore Inc.), po czym ciała pept ydowe podano iniekcyjnie na powierzchnię proteiny G w celu ich wychwycenia (RL ~ 100 Ru). Aby zbadać wiązanie między hAng2 a wychwyconym ciałem peptydowym, 0,3 nM do 40 nM huAng2 wstrzyknięto na powierzchnie z wychwyconymi ciałami peptydowymi i sensogramy wiązania analizowano z wykorzystaniem programu BIAevaluation 3.0 (BIAcore Inc.). W Tablicy 8 podsumowano wyniki tego eksperymentu.
T a b l i c a 8
Ciało peptydowe Partia nr KD(M) ka (1/Ms) kd (1/s)
Con4-44 (C) 011702 2,1E-10 2,9E+05 5.9E-05
L1-7 (N) 022102 2,4E-10 3,7E+05 8,7E-05
L1-10 (N) 021302 7,7E-10 1,5E+05 1,1E-04
L1-21 (N) 021802 2,4E-10 5,6E+05 1,4E-04
Con4(C) 33456-77 3,8E-10 5,3E+05 2,0E-04
2xCon4(C) 1K 092501 3,4E-10 4,8E+05 1,6E-04
P r z y k ł a d 10. Neutralizacja ELISA
Pożywkę kondycjonowaną ludzką, mysią, psią i szczurzą Ang-2 oraz ludzką i mysią Ang-1 rozcieńczono w DMEM/50 pg/ml BSA jak następuje: hAng-2 - rozcieńczenie 1:64; mAng-2 - rozcieńczenie 1:64; szczurza Ang-2 - nierozcieńczona; psia Ang-2 - rozcieńczenie 1:32; hAng-1 - rozcieńczenie 1:4; zaś mAng-1 - rozcieńczenie 1:4.
Stopień, w jakim rozcieńczono każdą z tych kondycjonowanych pożywek, określono na podstawie ich zdolności do wiązania 1 nM hTie2-Fc (dostarczonym jako cząsteczka Tie-2-Fc, gdzie część Tie-2 zawiera tylko rozpuszczalną zewnątrzkomórkową część cząsteczki; R&D Systems, numer katalogowy 313-T1) przy 50% maksymalnego osiągalnego wiązania (to znaczy plateau). Płytki do mikromiareczkowania pokryto 100 pl rozcieńczonej kondycjonowanej pożywki. W przypadku prób neutralizacji ELISA względem Ang-2, ciała peptydowe kandydata anty-Ang-2 były miareczkowane od 62,5 nM do 0,015 pM w 4-krotnych rozcieńczeniach w roztworze PBS zawierającym około 1% BSA oraz około 1 nM Tie-2 (dostarczonym jako cząsteczka Tie-2-Fc, gdzie część Tie-2 zawiera tylko rozpuszczalną, zewnątrzkomórkową część cząsteczki; R&D Systems, numer katalogowy 313-TI). W przypadku prób neutralizacji ELISA względem Ang-1, kandydackie ciała peptydowe anty-Ang-2 były miareczkowane od 1000 nM do 0,2 pM w 4-krotnych rozcieńczeniach w roztworze PBS zawierającym około 1% BSA oraz około 1 nM Tie-2 (dostarczonym jako cząsteczka Tie-2-Fc, gdzie część Tie-2 zawiera tylko rozpuszczalną, zewnątrzkomórkową część cząsteczki; R&D Systems, numer katalogowy 313-TI).
Po dodaniu do każdego wgłębienia około 100 mikrolitrów roztworu ciało peptydowe/Tie-2, płytki inkubowano przez noc w temperaturze pokojowej, po czym przemyto pięciokrotnie PBS zawierającym około 0,1% Tween-20. Po przemyciu, dodano około 100 mikrolitrów na wgłębienie przeciwciała antyTie-2 (Pharmingen Inc., numer katalogowy 557039) do końcowego stężenia około 1 mikrogram na mililitr i płytki inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie, dodano około 100 mikrolitrów na wgłębienie koziej anty-mysiej-IgG-HRP (Pierce Chemical Co., numer katalogowy 31432) w rozcieńczeniu 1:10.000 w PBS zawierającym około 1% BSA.
Płytki inkubowano w temperaturze pokojowej przez około 1 godzinę, po czym przemyto pięciokrotnie PBS zawierającym około 0,1% Tween-20. Następnie dodano 100 mikrolitrów na wgłębienie podłoża TMB (SIGMA, numer katalogowy T8665) i pozostawiono do wystąpienia niebieskiego zabarwienia. Następnie odczytano absorbancję na spektrofotometrze przy 370 nm. Wyniki podano poniżej w Tablicy 9.
PL 224 701 B1
T a b l i c a 9. Neutralizacja oddziaływań Angiopoetyna:Tie2 mediowana przez ciało peptydowe
hAng-2 mAng-2 rAng-2 cAng-2 hAng-1 mAng-2
Ciało peptydowe IC50 (nM) IC50 (nM) IC50 (nM) IC50 (nM) IC50 (nM) IC50 (nM)
2xCon4 (C) 0,026 0,035 0,024 0,047 3,0 3,2
Con4(C) 0,197 0,289 0,236 0,540 200 300
Con4-44 (C) 0,08 0,16 0,22 - 43 -
Con4-40 (C) 0,20 0,27 0,35 - > 1000 -
L1-7 (N) 0,046 0,063 0,035 0,108 > 1000 > 1000
L1-21 (N) 0,179 0,249 0,204 0,608 > 1000 > 1000
L1-10 (N) 0,06 0,06 0,06 - > 1000 -
P r z y k ł a d 11. Badania PK
Protokół badań
Myszy CD-1 płci męskiej, ważące 20-30 g, podzielono losowo na grupy i poddawano działaniu każdego z ciał peptydowych (2xCon4-C, L1-7-N oraz L1-21-N). Zwierzęta otrzymały dożylnie jednorazową dużą dawkę uderzeniową (n = 38/na grupę) lub pojedynczą, podaną podskórnie dawkę 50 μg ciała peptydowego (n = 34/na grupę). Wstrzyknięć dokonano przez żyłę ogonową oraz podskórnie nad łopatkami, odpowiednio w przypadku podawania dożylnego i podskórnego.
Pobieranie próbek krwi oraz metody analityczne
Próbki krwi pobierano celem zmierzenia stężenia każdego ciała peptydowego anty-Ang2 przed podaniem w/w dawki oraz w 1,2, 4, 8, 16, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 216, 264, 312 i w 336 godzin po podaniu dawki w grupach zwierząt którym ciało to podawano podskórnie (SC) i dożylnie (IV). D odatkowe próbki pobrano w 5 oraz w 30 minut po podaniu dawki w grupach IV. W każdym punkcie czasowym skrwawiano dwa osobniki i uśmiercono je po pobraniu próbek krwi. Krew (około 0,50 mL) pobierano przez przebicie serca i zbierano do polipropylenowych probówek microtainer® do oddzielania surowicy. Próbki umieszczono w lodzie na około 20 minut lub do czasu utworzenia skrzepu. Oddzielono surowicę z próbek krwi przez odwirowanie przez około 10 minut w temperaturze 2-8°C i przechowywano w temperaturze około -70°C przed oznaczeniem. Próbki poddano pomiarom stosując próbę na weryfikowalną w czasie zmienną fluorescencję (TRF) z dolną granicą oznaczenia ilościowego (LLOQ) równą 100 ng/mL. Płytki do mikromiareczkowania typu NUNC fluoroMaxisorp pokryto rekombinacyjną mysią proteiną Ang-2. Płytki następnie zablokowano roztworem proteiny w celu zredukowania niespecyficznego wiązania. Wzorce, jakościowe próbki kontrolne oraz próbki nieznane (badane) przygotowano jako roztwory w 10% buforze do badania surowicy mysiej i pipetowano do wgłębień płytek do mikromiareczkowania. Ciała peptydowe związały się specyficznie z immobilizowaną Ang-2. Po wymyciu wszelkich niezwiązanych substancji (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc.), do wgłębień dodano biotynylowane kozie monoklonalne przeciwciało anty-ludzkiej IgG (H+L) (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.). Następnie po etapie wymycia niezwiązanego biotynylowanego monoklonalnego przeciwciała, do wgłębień dodano znakowaną europem streptawidynę. Po odmyciu niezwiązanej streptawidyny znakowanej europem, związany europ wydzielono ze znakowanej streptawidyny przy użyciu kwaśnego roztworu, który pipetowano do każdego wgłębienia. Wygenerowano sygnał fluorescencyjny i odczytano stosując fluorometryczny czytnik Wallac'a. Zakres testu do analizy ciała peptydowego anty-Ang-2 w surowicy mysiej wynosi od 0,078 do 5 μg/mL.
Analiza farmakokinetyczna
Złożone średnie dane stężenie-czas uzyskane w każdej grupie poddano analizie bezprzedziałowej stosując program WinNonlin Professional (Version 3.3, Pharsight Corp., Mountain View, CA). Nominalne czasy pobierania próbek użyto w analizie PK, bowiem próbki były pobierane w obrębie 10% czasu nominalnego. Wszystkie wartości stężenia mniejsze niż LLOQ wyzerowano przed analizą PK. Ustalono następujące parametry PK:
PL 224 701 B1 z \ In (21
Końcowy czas półtrwania (t1/2 ) obliczono jako t1/2 = gdzie kei oznacza stałą pierwszego rzędu końcowej szybkości (first-order terminal rate constant) oszacowaną metodą liniowej regresji końcowej log-liniowej fazy spadkowej.
Powierzchnię pod krzywą stężenie surowicy-czas (AUC(0-last) oszacowano stosując metodę liniowo/log-trapezoidalną od czasu „zero” do końca, to jest do czasu ostatniego ilościowo oznaczonego stężenia (Clast).
Powierzchnię pod powyższą krzywą od czasu “0” do nieskończoności (AUC(0-m) oszacowano jako sumę odpowiedniego AUC(0-last) oraz przewidywanych wartości Clast/kel:
4t/C(Q_oo) — AUCfd_ (O-last) przewidywane Ciast • Bezwzględną biodostępność (F) po podawaniu SC obliczono jako:
AUC,
AUC, (O—oo)SC (0-oo)/y
Wyniki podano na rysunku Fig. 2.
P r z y k ł a d 12
Bezwłosym myszom płci żeńskiej wstrzyknięto podskórnie 1x107 komórek A431 w „zerowym” dniu badań. W trzecim dniu podano podskórnie ciało peptydowe Ang-2 2xCon4-C w dawce 200 pg/mysz/dzień. Objętości guza oraz wagę ciał mierzono w regularnych odstępach czasu, jak to przedstawiono na rysunku. Znaczące różnice we wzroście guza obserwowano między grupą leczoną ciałem peptydowym Ang-2 w porównaniu z grupą kontrolną, której podawano nośnik i z grupą której podawano kontrolne ciało peptydowe (p <0,0001 vs. każdej kontroli stosując powtarzalne pomiary ANOVA, z testem Scheffe'a post hoc). Podawanie tego ciała peptydowego nie miało znaczącego wpływu na masę ciała zwierząt. Wyniki przedstawiono na rysunku Fig. 3.
P r z y k ł a d 13
Krzywa wzrostu A431 in vitro
Komórki A431 rozsiano w płytkach do hodowli tkankowej o 96 wgłębieniach w ilości 2000 komórek na wgłębienie, w 200 pl DMEM wzbogaconej 10% bydlęcą surowicą płodową (FBS). Pożywkę usunięto w 16 godzin po rozsianiu. Następnie do wgłębień dodano ponownie (zawsze do trzech ró wnoległych prób): 100 pl na wgłębienie DMEM, 10% FBS, 1 mg/ml ciała peptydowego 4883 stanowiącego kontrolę negatywną lub ciała peptydowego TN8-Con4. Taką samą procedurę powtórzono na pięciu płytkach. Po 24, 48, 72, 96 oraz 120 godzin po naniesieniu ciała peptydowego, odsysano pożywkę z jednej płytki. Następnie dodano 100 pl 10% roztworu kwasu trichlorooctowego (TCA) na wgłębienie, po czym płytki pozostawiono w temperaturze 4°C. Wszystkie płytki zebrano kiedy ostatnia płytka była pokryta 10% roztworem TCA przez minimum 4 godziny. 10% roztwór TCA wytrząśnięto, a wgłębienia przemyto 5 razy przy użyciu wody kranowej. Komórki następnie wybarwiono przy użyciu 100 pl 0,4% roztworu sulforodaminy B (Sigma S-9012) w 1% roztworze kwasu octowego (Sigma A-6283) przez 10 minut w temperaturze pokojowej, po czym przemyto 5 razy przy użyciu 1% roztworu kwasu octowego. Następnie płytki suszono na powietrzu. Barwnik solubilizowano przy użyciu 300 pl 20 mM niebuforowanego Tris (pH>10) przez 2 godziny na wytrząsarce obrotowej. Następnie odczytano gęstość optyczną (OD) przy 540 nm przy użyciu czytnika płytek do mikromiareczkowania. Wyniki przedstawiono na rysunku na Fig. 4.
P r z y k ł a d 14
Bezwłosym myszom płci żeńskiej wstrzyknięto podskórnie 2 x 106 komórek Colo-205 z dodatkiem żelu Matrigel (2:1) w „zerowym” dniu badań. W trzecim dniu podano podskórnie ciała peptydowe Ang-2 L1-7-N, L1-21-N, Con4-C oraz 2xCon4-C w dawce 14 pg/mysz, dwa razy na tydzień. Przeciwciało anty-Ang-2 Ab536, w dawce 47 pg/mysz, podano trzy razy w tygodniu, jako pozytywną kontrolę. Objętości guza oraz wagę ciał mierzono w regularnych odstępach czasu.
Znaczące różnice we wzroście guza obserwowano między każdą grupą leczoną ciałem pept ydowym Ang-2 w porównaniu z grupą kontrolną otrzymującą sam nośnik oraz grupą otrzymującą kontrolne ciało peptydowe (p <0,0001 względem każdej grupy kontrolnej stosując powtarzalne pomiary ANOVA, z testem Scheffe'a post hoc). Podawanie tych ciał peptydowych nie miało znaczącego wpływu na masę ciała (wyników nie przedstawiono). Wyniki podano na rysunku Fig. 5.
PL 224 701 B1
P r z y k ł a d 15
Bezwłosym myszom płci żeńskiej wstrzyknięto podskórnie 2 x 106 komórek Colo-205 z dodatkiem żelu Matrigel (2:1) w „zerowym” dniu badań. W trzecim dniu podano podskórnie Ang-2 ciało peptydowe 2xCon4-C w dawkach 14, 2, 8, oraz 0,56 μg/mysz, dwa razy na tydzień. Objętości guza oraz wagę ciała mierzono w regularnych odstępach czasu, jak przedstawiono na rysunku. Znaczące różnice we wzroście guza obserwowano między grupami traktowanymi najwyższymi dawkami ciała peptydowego Ang-2 względem kontroli otrzymującej sam nośnik oraz grupy kontrolnej otrzymującej kontrolne ciało peptydowe (p = 0,003 w przypadku pośredniej dawki, oraz p<0,0001 w przypadku wyższej dawki, stosując powtarzalne pomiary ANOVA, z testem Scheffe'a post hoc). Podawanie tych ciał peptydowych nie miało znaczącego wpływu na masę ciała. Przerywana linia przedstawia zmniejszenie całkowitej wartości n dla grupy: z 10 na 9 myszy, w wyniku śmierci jednej myszy z nieznanych powodów. Wyniki podano na rysunku Fig. 6.
P r z y k ł a d 16. Ciała peptydowe anty-Ang-2 przeciw ksenograftom nowotworu Colo-205
Bezwłosym myszom płci żeńskiej wstrzyknięto podskórnie 2 x 106 komórek Colo-205 z dodatkiem żelu Matrigel (2:1) w „zerowym” dniu badań. W trzecim dniu podano podskórnie Ang-2 ciało peptydowe 2xCon4-C lub kontrolne ciało peptydowe w dawce 350 μg/dzień. Guzy z grup leczonych kontrolnym ciałem peptydowym (jak opisano w Tablicy 5) wypreparowano w czternastym dniu (grupa kontrolna uwzględniająca dopasowanie wielkości guza) lub w osiemnastym dniu (grupa kontrolna uwzględniająca dopasowanie czasu). Guzy z grupy leczonej 2xCon4(C) wypreparowano następnie w dniu osiemnastym. Objętości guza mierzono w regularnych odstępach czasu, jak to przedstawiono na rysunku. Znaczące różnice we wzroście guza obserwowano pomiędzy grupą kontrolną dopasowana ze względu na czas oraz grupą leczoną 2xCon4-C (p=0,0154 przy powtarzalnych pomiarach ANOVA, stosując test Scheffe'a post hoc). Podawanie tych ciał peptydowych nie miało znaczącego wpływu na masę ciała.
Guzy wypreparowane do analizy obrazowej przepołowiono koronalnie i połowę zamrożono w OCT (Sakura Finetek USA Inc., Torrance, CA). Krio-wycinki wybarwiono immunohistochemicznie stosując anty-mysi CD31 (numer katalogowy 553370, BD PharMingen, San Diego, CA) w stężeniu 2 μg/ml, z DAB jako chromogenem. Wycinki guza sfotografowano cyfrowo stosując obiektyw powiększający 20-krotnie. Dla każdego guza wykonane cztery ujęcia w obszarach określanych jako „punkty kompasowe” przy dziesięciu guzach na grupę poddawaną takiej samej terapii. Zastosowano system analizy obrazu MetaMorph (Universal Imaging Corporation, Downington, PA) w celu wykrycia naczyń krwionośnych wybarwionych CD31 odpowiadających założonej wartości progowej. Powierzchnię pozytywnie wybarwioną CD31 wyrażono w stosunku do całej tkanki nowotworowej w każdym polu. W yniki przedstawiono na rysunku Fig. 7.
P r z y k ł a d 17
Bezwłosym myszom płci żeńskiej wstrzyknięto podskórnie 2 x 106 komórek Colo-205 plus Matrigel (2:1) w „zerowym” dniu badań. Podawanie podskórne w ilości 350 μg/mysz, dwa razy na tydzień, ciała peptydowego Ang-2 2xCon4-C lub równoważnego kontrolnego ciała peptydowego rozpoczęto w dniu badań 3, 10 albo 15. Objętości guza oraz wagę ciała zwierząt mierzono w regularnych odstępach czasu. Znaczące różnice we wzroście guza obserwowano między całą grupą leczoną ciałem peptydowym Ang-2 w porównaniu z kontrolą otrzymującą sam nośnik (p=0,089 w przypadku grupy z dnia „15” oraz p<0,0001 w przypadku grup z dnia „3” oraz „10”, stosując powtarzalne pomiary ANOVA, z testem Scheffe'a post hoc). Podawanie tych ciał peptydowych nie miało znaczącego wpływu na masę ciała. Wyniki przedstawiono na rysunku Fig. 8 (masy ciała nie zilustrowano).
P r z y k ł a d 18
Podsumowanie dotyczące udziału całkowitej odpowiedzi (CR) otrzymano stosując przeciwciało Ab536 w ilości 47 μg/bezwłosą mysz płci żeńskiej, podawane dootrzewnowo trzy razy na tydzień, lub ciało peptydowe 2xCon4(C), podawane podskórnie w programie stosowania dawki wielokrotnej, w odrębnych długookresowych badaniach (> 10 tygodni dawkowania) zarówno w modelu ksenograftów A431, jak i w modelu ksenograftów Colo-205. Wartość CR w znaczeniu tutaj użytym odnosi się do takiego wyniku, przy którym po leczeniu nie pozostał żaden mierzalny guz. Wyniki przedstawiono na rysunku Fig. 9.
P r z y k ł a d 19
a) Kombinacja ciała peptydowego (Pb) z preparatem Taxotere w modelu guza Colo-205
Bezwłosym myszom płci żeńskiej wstrzyknięto podskórnie 2x106 komórek Colo-205 plus Matrigel (2:1) w „zerowym” dniu badania. W czternastym dniu badania, rozpoczęto leczenie przez podawaPL 224 701 B1 nie: a) ciało peptydowe Ang-2 2xCon4-C - 350 μg/mysz, podskórnie, dwa razy na tydzień, b) preparat Taxotere - 20 mg/kg qwx3, dootrzewnowo lub c) kombinacja obu powyższych. Objętość guza oraz wagę ciała zwierząt mierzono w regularnych odstępach czasu. Znaczące różnice we wzroście guza obserwowano między wszystkimi badanymi grupami w porównaniu z kontrolą otrzymującą sam nośnik (p<0,0001, stosując powtarzalne pomiary ANOVA, z testem Scheffe'a post hoc). Ponadto, grupa z terapią łączoną znacząco różniła się od każdej grupy leczonej środkami monoterapeutycznymi (p<0,0001 w porównaniu z 2xCon-4-C oraz p=0,0122 względem w porównaniu z preparatem Taxotere). Linia przerywana dotyczy zmniejszenia ogólnej ilości n osobników w grupie, z 10 na 9 myszy, w związku ze śmiercią jednej z myszy z nieznanych powodów. Podawanie tych ciał peptydowych nie miało znaczącego wpływu na masę ciała zwierząt. Wyniki przedstawiono na rysunku Fig. 10a.
b) Kombinacja ciała peptydowego (Pb) z 5-FU w modelu guza Colo-205
Bezwłosym myszom płci żeńskiej wstrzyknięto podskórnie 2x106 komórek Colo-205 plus Matrigel (2:1) w „zerowym” dniu badań. W czternastym dniu badań, rozpoczęto leczenie przez podawanie a) ciało peptydowe Ang-2 2xCon4-C - 350 μg/mysz, podskórnie, dwa razy na tydzień, b) 5-FU - 50 mg/kg qdx5, dootrzewnowo lub c) kombinacja obu powyższych. Objętość guza oraz wagę ciała zwierząt mierzono w regularnych odstępach czasu, jak to przedstawiono.
Znaczące różnice we wzroście guza obserwowano między wszystkimi grupami poddawanymi leczeniu w porównaniu z kontrolą otrzymującą sam nośnik (p<0,0001, stosując powtarzane pomiary ANOVA, z testem Scheffe'a post hoc). Ponadto, grupa poddawana terapii łączonej znacząco różniła się od każdej grupy leczonej monoterapeutycznie (p=0,0375 w porównaniu z 2xCon-4-C oraz p=0,0453 w porównaniu z 5-FU). Przejściowe obniżenie masy ciała zaobserwowano w przypadku grupy leczonej 5-FU (18% w dwudziestym dniu badań), jak również w przypadku grupy poddanej terapii łączonej (16% w dwudziestym dniu badań), a po tym okresie nastąpiło całkowite odzyskanie m asy ciał. Wyniki przedstawiono na rysunku Fig. 10b.
P r z y k ł a d 20. Model adiuwantowego zapalenia stawu
Szczury Lewis'a płci męskiej (o masie 120-130 gramów, Charles River, Wilmington MA) trzymano po dwa w klatkach z zamknięciem z filtrem w pomieszczeniu z kontrolowanymi warunkami środowiska (temperatura 23 ± 2°C, wilgotność względna 50 ± 20%) z zachowaniem 12-godzinnego cyklu światło/ciemność. Zwierzęta karmiono dostępną w handlu karmą dla szczurów (Formulation 8640; Tek Lab, Madison, WI), a do picia podawano im filtrowaną wodę kranową ad libitum. Dieta zawierała odpowiednio 1,2% wapnia oraz 1,0% fosforu.
Adiuwantowe zapalenie stawu indukowano podając śródskórnie pojedynczy zastrzyk zawierający 0,5 mg zabitych termicznie bakterii Mycobacterium tubereulosis H37Ra (Difco Laboratories, Detroit, MI) w postaci zawiesiny w 0,05 mL oleju parafinowego (Crescent Chemical Co., Hauppauge, NY) w podstawę ogona. Kliniczny początek choroby zapalenia stawów objawił się w 9. dniu opuchnięciem tylnej łapy oraz trudnościami w chodzeniu. Z wyjątkiem grupy leczonej 2xCon4(c) (którą leczono p ocząwszy od pierwszego dnia po immunizacji), leki podawano w postaci codziennych zastrzyków podskórnych począwszy od 9. dnia po immunizacji (przed pojawieniem się początkowych objawów zapalenia stawów) i kontynuowano do 18. dnia.
Kliniczny monitoring adiuwantowego zapalenia stawu
Postęp rozwoju stanu zapalnego szacowano klinicznie prowadząc okresowe pomiary objętości tylnej łapy, stosując metodę wodnej pletysmografii opisaną przez Feige i wsp., Cellular Molec. Life Sci., 57:1457-1470 (2000). Inhibitowanie stanu zapalnego łapy obliczano w oparciu o pole powierzchni pod krzywą (AUC) stosując trapezoidalną regułę według wzoru:
(leczone adiuwantowe zapalenie stawu) — normalny stan zdrowia (nieleczone adiuwantowe zapalenie stawu) — normalny stan zdrowia
Poza tym codziennie określano całkowitą masę ciała podczas 9-dniowego okresu prowadzenia kuracji dla wyznaczenia dodatkowego punktu końcowego, ponieważ okazało się, że utrata masy następuje równolegle do postępu w rozwoju zapalenia stawu w tym modelu zapalenia stawu. Zwierzęta uśmiercono w 18. dniu zmieniając atmosferę na CO2.
Utratę gęstości mineralnej kości (BMD) badano w czasie sekcji zwłok (w 18. dniu po immunizacji). Tylne łapy odcięto na granicy futra (w bezpośrednim sąsiedztwie kolana (pęcina)), zanurzono w 70% etanolu, a następnie skanowano w pozycji horyzontalnej stosując gęstościomierz z wachla-
xl00
PL 224 701 B1 rzową wiązką promieniowania rentgenowskiego (Model QDR-4500A; Hologic, Waltham, MA). Patrz Feige i wsp., jak wyżej. Po skanowaniu, ustawiono prostokątną ramkę (29x25 mm) wyśrodkowaną na piętę aby odgraniczyć miejsce analizy i stosując właścicielskie algorytmy (oprogramowanie Hologic) obliczono powierzchnię kości, skład mineralny kości oraz gęstość mineralną kości.
Wszystkie wyniki wyrażono w postaci średniej ± błąd standardowy. Przyjęto wartość p równą 0,05 aby odgraniczyć znaczące różnice między grupami. Na danych klinicznych (zmienne ciągłe) przeprowadzono pomiar Kruskal-Wallis ANOVA oraz test Mann-Whitney U. wykorzystując dostępne w handlu oprogramowanie do analiz statystycznych (StatSoft v3.0; StatSoft, Tulsa, OK).
Wyniki przedstawiono, odpowiednio, na rysunkach Fig. 11a, 11b oraz 11c.
P r z y k ł a d 21. Model angiogenezy w obrębie rogówki
Wpływ CON4(C) na indukowaną przez VEGF angiogenezę u szczurów
Ciało peptydowe Ang-2 CON4(C) poddawano ocenie stosując model angiogenezy w obrębie rogówki u szczurów. Angiogenezę indukowano przez zaimplantowanie nasyconego VEGF- (lub BSA w grupie kontrolnej) nylonowego krążka do tkanki śródmiąższowej rogówki (n=8/grupę). Ciało pept ydowe TN8CON4-C podawano przez podskórne iniekcje w ilości 1,0 lub 0,1 mg/szczura/dzień przez siedem dni. Dwóm innym grupom zwierząt podawano taką samą dawkę ciała peptydowego 4883 jako kontrolę negatywną. Wszystkim grupom na wstępie podano pojedynczą dawkę obciążeniową 3,0 lub 0,3 mg, stanowiącą potrójną dawkę podtrzymującą 1,0 lub 0,1 mg (patrz rysunek). Po siedmiu dniach leczenia, ustalono dwa naczyniowe parametry dla każdego cyfrowego obrazu rogówki szczura: ilość naczyń przecinających punkt środkowy pomiędzy zaimplantownym krążkiem i rąbkiem rogówki oraz powierzchnię naczyń krwionośnych. Podawanie TN8CON4-C znacząco inhibitowało indukowaną przez VEGF angiogenezę w sposób zależny od dawki (p<0,04), podczas gdy podawanie kontrolnego ciała peptydowego nie wpływało znacząco na żaden końcowy parametr. Brak było jawnych objawów toksyczności wyrażających się utratą wagi leczonych zwierząt. Wyniki przedstawiono na rysunku Fig. 12.
P r z y k ł a d 22. Mapowanie epitopów
Proteiny ludzkiej Ang-2 (hAng-2) o pełnej długości (aminokwasy 1-495), N-końcowe (aminokwasy 1 -254) oraz C-końcowe (aminokwasy 255-495) klonowano do ssaczego wektora ekspresji opartego na CMV, z C-końcowymi tagami 6xHis. Trzy wynikowe konstrukty plus wektor kontrolny przejściowo ekspresjonowano w komórkach 293T. Następnie zebrano kondycjonowaną pożywkę z hodowli transfekowanych komórek i obliczono poziom ekspresji Ang-2 w pożywce stosując prób anty-6xhis ELISA oraz Western blotting.
Wiążący epitop przeciwciał anty-Ang-2 oraz ciał peptydowych oznaczono metodą ELISA na podstawie ich zdolności do wiązania trzech wersji ludzkiej hAng-2, według następującego protokołu: silnie wiążącą płytkę do prób o 96 wgłębieniach pokryto kondycjonowaną pożywką w ilości 100 pl na wgłębienie i inkubowano w temperaturze 37°C przez 1 godzinę. Pożywkę następnie odessano, a płytkę zablokowano 5% BSA w PBS w ilości 200 pl na wgłębienie, w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Roztwór blokujący został następnie odessany. Następnie wprowadzono przeciwciało, ciało peptydowe lub Tie2-Fc w stężeniu 1 pg/ml w 1% BSA w PBS w ilości 100 pl na wgłębienie i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Wgłębienia przemyto 4 razy przy użyciu 200 pl 0,1% Tween w PBS. Dodano sprzężonej z HRP koziej anty-ludzkiej IgG, lub koziej anty-mysiej IgG w ilości 100 pl na wgłębienie i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 45 minut. Następnie wgłębienia 4-krotnie przemyto przy użyciu 200 pl 0,1 % Tween w PBS. Następnie dodano podłoża TMB w ilości 100 pl na wgłębienie. Odczytano OD przy 370 nm.
Wyniki przedstawiono na rysunkach Fig. 13a, Fig. 13b, oraz Fig. 13c.
P r z y k ł a d 23
W związku z pewnymi inherentnymi ograniczeniami czułości w próbie BiaCore, powinowactwo wiążące oznaczono także stosując próbę Sepidyne KinExA.
Wiązanie 2xCON4-C (Pb5714) z huAng-2 przebadano na KinExA (Sapidyne, Boise, ID). Perełki Reacti-Gel 6x (Pierce, Rockford, IL) wpierw pokryto huAng-2 i zablokowano przy użyciu BSA. Próbki 10 pM i 30 pM 2xCON4-C inkubowano z różnymi stężeniami (0,3 pM - 3 nM) huAng-2 w temperaturze pokojowej przez 8 godzin, przed wprowadzeniem na perełki powleczone huAng-2. Ilość związanego z perełkami ciała peptydowego obliczono stosując fluorescencyjnie (Cy5) znakowane królicze przeciwciało anty-ludzkiej-Fc (Jackson Immuno Research, West Grove, PA). Sygnał wiążący jest proporcjonalny do stężenia wolnego ciała peptydowego w stanie równowagi.
PL 224 701 B1
Stałą równowagi dysocjacji (KD) otrzymano z nieliniowej regresji krzywych porównawczych stosując model homogenicznego wiązania w jednym miejscu z podwójną krzywą (oprogramowanie KinEx™). Następnie określono wartość KD wynoszącą około 2 pM w przypadku 2xCON4-C wiążącego się z huAng-2.
Jak wynika z rysunku Fig. 14, stosując próbę KinExA wykazano, że ciało peptydowe 2xCon4 ma powinowactwo około ~2 pM względem hAng-2.
P r z y k ł a d 24. Pegylowane peptydy
Peptyd L1-7 zsyntezowano stosując syntetyzer 431 ABI stosując standardowy protokół sprzęgania oraz podwójnego sprzęgania od reszty 14 (met) do N-końcowej reszty 1 (Cys), licząc od N-końca do C-końca.
Sprzężenie peptydu L1 -7 z metoksy-poli(glikol etylenowy)-maleimidem; masa cząsteczkowa: 5 KDa; określony jako „mPEG5K-(L1-7 peptyd)”
Roztwór 0,8 mg peptydu L1-7 w 400 μl buforu-1 (20 mM fosforan, 5 mM EDTA, pH 6,5) zadano 13,5 mg metoksy-poli(glikol etylenowy)-maleimidu (ciężar cząsteczkowy = 5 KDa; Shearwater Corp.), 0,27 ml - roztwór o stężeniu 50,0 mg/mL w buforze-1. Mieszaninę reakcyjną inkubowano w temperaturze 4°C przez noc, po czym rozcieńczono stosując 1,6 mL buforu A (20 mM Tris-chlorowodorek, pH 7,2) i dializowano w kasecie typu Slide-A-Lyzer (3500 MWCO, Pierce) wobec tego samego buforu. Dializowaną mieszaninę reakcyjną oczyszczono metodą chromatografii jonowymiennej na 1,0 ml k olumnie typu HiTrap Q Sepharose HP (Amersham Biosciences Corp.). Pik produktu wyeluowano w dwóch frakcjach po 1,0 mL z gradientem od 100% buforu A do 100% buforu B (bufor A + 0,5 M NaCl) stosując 40 objętości kolumnowych. Połączone frakcje produktu zatężono do objętości 250 μL o stężeniu 0,23 mg proteiny/mL w urządzeniu typu Microsep 1K Centrifugal Device (Pall Life Sciences).
Sprzężenie peptydu L1 -7 z 1,11-bis-maleimidotetraetylenoglikolem; określony jako „PEO4(L1 -7 peptyd)2”
Roztwór 1,0 mg peptydu L1-7 w 500 μL buforu-1 (20 mM fosforan, 5 mM EDTA, pH 6,5) poddano obróbce stosując 0,0375 mg 1,11-bis-maleimidotetraetylenoglikolu (Pierce) (0,375 mL roztwór o stężeniu 0,1 mg/mL w buforze-1). Mieszaninę reakcyjną inkubowano w temperaturze 4°C przez 3,33 godziny, po czym zdializowano w kasecie typu Slide-A-Lyzer (3500 MWCO, Pierce) względem buforu-A (20 mM Tris, chlorowodorek, pH 7,2). Dializowaną mieszaninę reakcyjną oczyszczono metodą chromatografii jonowymiennej na 1,0 mL kolumnie typu HiTrap Q Sepharose HP (Amersham Biosciences Corp.). Pik dimerycznego produktu wyeluowano w trzech 1,0 mL frakcjach stosując gradient od 100%) buforu-A do 100%) buforu-B (bufor-A + 0,5 M NaCl) stosując 40 objętości kolumnowych. Połączone frakcje produktu zatężono do objętości 550 μL zawierającej 0,12 mg proteiny/mL stosując urządzenie typu Microsep 1K Centrifugal Device (Pall Life Sciences).
Sprzężenie peptydu L1 -7 z poli(glikol etylenowy)-bis-maleimidem: ciężar cząsteczkowy 3,4 KDa; określony jako „PEG3.4K(L1 -7 peptyd)2”
Roztwór 3,0 mg peptydu L1-7 w 1,5 mL buforu-1 (20 mM fosforan, 5 mM EDTA, pH 6,5) zadano 1,125 mg poli(glikol etylenowy)-bis-maleimidem (ciężar cząsteczkowy = 3,4 KDa, Shearwater Corp.); 0,563 mL 2,0 mg/mL roztworu w buforze-1. Mieszaninę reakcyjną inkubowano w temperaturze 4°C przez noc, po czym dializowano w kasecie typu Slide-A-Lyzer (3500 MWCO, Pierce) względem buforu-A (20 mM Tris, chlorowodorek, pH 7,2). Dializowaną mieszaninę reakcyjną oczyszczono metodą chromatografii jonowymiennej na 5,0 mL kolumnie typu HiTrap Q Sepharose HP (Amersham Biosciences Corp.). Pik produktu eluowano w trzech 3,0 mL frakcjach z gradientem od 100% buforu-A do 100% buforu-B (bufor A + 0,5 M NaCl) stosując 40 objętości kolumnowych. Połączone frakcje produktu zatężono do objętości 850 μL roztworu o stężeniu 0,24 mg proteiny/mL, stosując dwa urządzenia wirówkowe typu Microsep 1K Centrifugal Device (Pall Life Sciences).
Wyniki spektroskopii masowej MALDI-TOF były następujące:
100
PL 224 701 B1
numer próbki tożsamość MS przewidywanie MS obserwacja
1 L1-7 (niePEGylowany peptyd) 3.545 3.538,7
2 mPEG5K-(peptyd L1--7) 8.500 8.851
3 PEO4(peptyd L1-7)2 7.443 7.446,29
4 PEG3.4K(peptyd L1-7)2 10.550 10.552 6.882,61 3.550,13
Jest zrozumiałe, że indeks „2” w przypadku PEG3.4K(L1-peptyd 7) oraz PEO4(peptyd L1-7) wskazuje, że na każdy łańcuch polimeru występują dwa peptydy, po jednym na każdym końcu polimeru.
Oznaczenie IC50
Wartość IC50 dla inhibitowania oddziaływania hAng2:hTie2-Fc, dla wolnego L1-7 oraz PEG-ylowanych peptydów, oznaczono próbą neutralizacji ELISA, jak to opisano w przykładzie 2. W przypadku próby neutralizacji, płytki do mikromiareczkowania, do których związano ludzki polipeptyd Ang-2, wytworzono jak opisano w przykładzie 2 w przypadku próby na powinowactwo ELISA. Kandydackie PEG-ylowane anty-Ang-2 L1-7 oraz wolne peptydy miareczkowano od 1000 nM do 0,2 pM w 4-krotnych rozcieńczeniach w roztworze PBS zawierającym około 1% BSA oraz około 1nM Tie-2 (wprowadzonego w postaci cząsteczki Tie-2-Fc, gdzie część Tie-2 zawiera tylko rozpuszczalną zewnątrzkomórkową część cząsteczki; R&D Systems, numer katalogowy 313-TI). Po dodaniu do każdego wgłębienia około 100 mikrolitrów roztworu przeciwciało/Tie-2, płytki inkubowano przez noc w temperaturze pokojowej, po czym przemyto pięciokrotnie PBS zawierającym około 0,1 % Tween-20. Po przemyciu, dodano około 100 mikrolitrów na wgłębienie przeciwciała anty-Tie-2 (Pharmingen Inc., numer katalogowy 557039), do końcowego stężenia około 1 mikrograma na mililitr i płytki inkubowano przez około 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie, dodano około 100 mikrolitrów na wgłębienie koziej anty-mysiej-IgG-HRP (Pierce Chemical CO., numer katalogowy 31432) w rozcieńczeniu 1:10,000 w PBS zawierającym około 1% BSA. Płytki inkubowano w temperaturze pokojowej przez około 1 godzinę, po czym przemyto pięciokrotnie przy użyciu PBS zawierającym około 0,1% Tween20. Następnie dodano około 100 mikrolitrów na wgłębienie podłoża TMB (opisany powyżej) i pozostawiono do wystąpienia koloru. Następnie, na spektrofotometrze odczytano absorbancję przy 370 nm.
Peptydy L1-7 (C-GGGGG-AQ-TNFMPMDDLEQRLYEQFILQQG-LE) (SEQ ID NO: 359) zawierały: N-końcową cysteinę zdolną do sprzęgania z PEG oraz linker 5Gly. Sekwencje flankujące AQ oraz LE występowały zarówno w oryginalnym klonie fagu, jak i w ciele peptydowym. Wyniki IC50 inhibitowania hAng-2:Tie2 przedstawiały się jak następuje:
Peptyd IC50 (nM)
Peptyd L1-7 0,49
mPEG5K-(peptyd L1-7) 11,7
PE04(peptyd L1-7)2 0,064
PEG3.4K(peptyd L1-7)2 0,058
PL 224 701 B1
101
LISTA SEKWENCJI <110> AMGEN INC.
<120> ŚRODKI WIĄŻĄCE SIĘ SPECYFICZNIE Z LUDZKĄ ANGIOPOETYNĄ-2 <130> A-801B <140> zostanie dopiero nadany <141> 2002-10-11 <150> US 60/414,155 <151> 2002-09-27 <150> US 60/328,624 <151> 2001-10-11 <160> 359 <170> Patentln version 3.2 <210> 1 <211> 14 <212> PRT <213> szuczna sekwencja <220>
<223> peptydy wiążące Ang-2 <400> 1
Lys Arg Pro Cys Glu Glu Met Trp Gly Gly Cys Asn Tyr Asp 15 10 <210> 2 <211> 14 <212> PRT <213> szuczna sekwencja <220>
<223> peptydy wiążące Ang-2 <400> 2
His Gin Ile Cys Lys Trp Asp Pro Trp Thr Cys Lys His Trp 15 10 <210> 3 <211> 14 <212> PRT <213> szuczna sekwencja <220>
<223> polipeptydy wiążące Ang-2 <400> 3
Lys Arg Pro Cys Glu Glu Ile Phe Gly Gly Cys Thr Tyr Gin 15 10
102
PL 224 701 B1 <210> 4 <211> 14 <212> PRT <213> sztuczna sekawencja <220>
<223> polipeptydy wiążące Ang-2 <400> 4
Gin Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met
1 5 10
<210> 5 <211> 18 <212> PRT <213> sztuczna sekawencja <220> <223> polipeptydy wiążące Ang-2 <400> 5 Phe Asp Tyr Cys Glu Gly Val Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys Asp
1 5 10 15
Asn His <210> 6 <211> 20 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> polipeptydy wiążące Ang-2 <400> 6
Lys Phe Asn Pro Leu Asp Glu Leu Glu Glu Thr Leu Tyr Glu Gin Phe
1 5 10
Thr Phe Gin Gin
20
<210> 7
<211> 14
<212> PRT
<213> sztuczna sekwencja
<220>
<223> peptydy wiążące Ang-2
<400> 7
Gin Tyr Gly Cys Asp Gly Phe Leu Tyr Gly Cys Met
1 5 10
<210> 8
<211> 67
PL 224 701 B1
103 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> oligonukleotyd <400> 8 acaaacaaac atatgggtgc acagaaagcg gccgcaaaaa aactcgaggg tggaggcggt 60 ggggaca 67 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> oligonukleotyd <400> 9 ggtcattact ggaccggatc 20 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <22 0>
<223> oligonukleotyd <400> 10 cgtacaggtt tacgcaagaa aatgg 25 <210> 11 <211> 66 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> oligonukleotyd <400> 11 tttgttggat ccattactcg agtttttttg cggccgcttt ctgtgcacca ccacctccac 60 ctttac 66 <210> 12 <211> 32 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <22 0>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <22 0>
104
PL 224 701 B1 <221> inna cecha <222> (32)..(32) <223> Xaa = Fc <400> 12
Met Gly Ala Gin Lys Phe Asn Pro Leu Asp Glu Leu Glu Glu Thr Leu
1 5 10 15
Tyr Glu Gin Phe Thr Phe Gin Gin Leu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Xaa
25 30 <210> 13 <211> 29 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <22 0>
<221> inna cecha <222> (29)..(29) <223> Xaa = Fc <400> 13
Met Lys Phe Asn Pro Leu Asp Glu Leu Glu Glu Thr Leu Tyr Glu Gin 15 10 15
Phe Thr Phe Gin Gin Leu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Xaa 20 25 <210> 14 <211> 51 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <22 0>
<221> inna cecha <222> (51)..(51) <223> Xaa = Fc <400> 14
Met 1 Lys Phe Asn Pro 5 Leu Asp Glu Leu Glu 10 Glu Thr Leu Tyr Glu 15 Gin
Phe Thr Phe Gin 20 Gin Gly Ser Gly Ser 25 Ala Thr Gly Gly Ser 30 Gly Ser
Thr Ala Ser 35 Ser Gly Ser Gly Ser 40 Ala Thr His Leu Glu 45 Gly Gly Gly
Gly Gly Xaa
PL 224 701 B1
105 <210> 15 <211> 60 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (60)..(60) <223> Xaa = Fc <400> 15
Met 1 Gly Ala Gln Lys 5 Phe Asn Pro Leu Asp 10 Glu Leu Glu Glu Thr 15 Leu
Tyr Glu Gln Phe 20 Thr Phe Gln Gln Gly 25 Gly Gly Gly Gly Gly 30 Gly Gly
Lys Phe Asn 35 Pro Leu Asp Glu Leu 40 Glu Glu Thr Leu Tyr 45 Glu Gln Phe
Thr Phe Gln Gln Leu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Xaa
55 60 <210> 16 <211> 56 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja
<22 0> <223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220> <221> inna cecha
<222> <223> (56) . Xaa = (56) Fc
<400> 16
Met Lys Phe Asn Pro Leu Asp Glu Leu Glu Glu Thr Leu Tyr Glu Gln
1 5 10 15
Phe Thr Phe Gln Gln Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Lys Phe Asn Pro
20 25 30
Leu Asp Glu Leu Glu Glu Thr Leu Tyr Glu Gln Phe Thr Phe Gln Gln
35 40 45
Leu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Xaa
50 55
<210> 17
<211> 26
<212> PRT
<213> sztuczn sekwencja
<220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2
106
PL 224 701 B1 <220>
<221> inna cecha <222> (26) . . (26) <223> Xaa = Fc <400> 17
Met Gly Ala Gin Gin Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu 15 10 15
His Met Leu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Xaa 20 25 <210> 18 <211> 45 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <22 0>
<221> inna cecha <222> (45)..(45) <223> Xaa = Fc <400> 18
Met Gin Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Gly
1 5 10 15
Ser Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly Ser
20 25 30
Gly Ser Ala Thr His Leu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Xaa
40 45 <210> 19 <211> 62 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cech <222> (62). . (62) <223> Xaa - Fc <400> 19
Met 1 Gly Ala Gin Gin 5 Glu Glu Cys Glu Trp 10 Asp Pro Trp Thr Cys 15 Glu
His Met Gly Ser 20 Gly Ser Ala Thr Gly 25 Gly Ser Gly Ser Thr 30 Ala Ser
Ser Gly Ser 35 Gly Ser Ala Thr His 40 Gin Glu Glu Cys Glu 45 Trp Asp Pro
Trp Thr Cys Glu His Met Leu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Xaa
55 60
PL 224 701 B1
107 <210> 20 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 20
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Lys Phe Asn Pro Leu Asp Glu
1 5 10 15
Leu Glu Glu Thr Leu Tyr Glu Gin Phe Thr Phe Gin Gin Leu Glu
25 30 <210> 21 <211> 53 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <22 0>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 21
Met 1 Xaa Gly Gly Gly 5 Gly Gly Ala Gin Gly 10 Ser Gly Ser Ala Thr 15 Gly
Gly Ser Gly Ser 20 Thr Ala Ser Ser Gly 25 Ser Gly Ser Ala Thr 30 His Lys
Phe Asn Pro 35 Leu Asp Glu Leu Glu 40 Glu Thr Leu Tyr Glu 45 Gin Phe Thr
Phe Gin Gin Leu Glu
<210> 22 <211> 59 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <22 0>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc
108
PL 224 701 B1 <400> 22
Met 1 Xaa Gly Gly Gly 5 Gly Gly Ala Gin Lys 10 Phe Asn Pro Leu Asp 15 Glu
Leu Glu Glu Thr 20 Leu Tyr Glu Gin Phe 25 Thr Phe Gin Gin Gly 30 Gly Giy
Gly Gly Gly 35 Gly Gly Lys Phe Asn 40 Pro Leu Asp Glu Leu 45 Glu Glu Thr
Leu Tyr Glu Gin Phe Thr Phe Gin Gin Leu Glu
55 <210> 23 <211> 25 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <22 Ο>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 23
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Gin Glu Glu Cys Glu Trp Asp 15 10 15
Pro Trp Thr Cys Glu His Met Leu Glu 20 25 <210> 24 <211> 47 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 24
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ala Thr His Gin
20 25 30
Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Leu Glu
40 45
PL 224 701 B1
109 <210> 25 <211> 61 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania 2 Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 25
Met 1 Xaa Gly Gly Gly 5 Gly Gly Ala Gin Gin 10 Glu Glu Cys Glu Trp 15 Asp
Pro Trp Thr Cys 20 Glu His Met Gly Ser 25 Gly Ser Ala Thr Gly 30 Gly Ser
Gly Ser Thr 35 Ala Ser Ser Gly Ser 40 Gly Ser Ala Thr His 45 Gin Glu Glu
Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Leu Glu
His
Glu
Gly
Ser
110
PL 224 701 B1 <220>
<223> ciako peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 27
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Gly Ser Gly Ser Ala Thr 15 10 15
Gly Ser Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ala Thr His 20 25 30
Phe Asn Pro Leu Asp Glu Leu Glu Glu Thr Leu Tyr Glu Gin Phe 35 40 45
Phe Gin Gin Gly Gly Gly Gly Gly Gin Glu Glu Cys Glu Trp Asp 50 55 60
Trp Thr Cys Glu His Met Leu Glu
70
Gly
Lys
Thr
Pro <210> 28 <211> 30 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciako peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (30)..(30) <223> Xaa = Fc <400> 28
Met Gly Ala Gin Phe Asp Tyr Cys Glu Gly Val Glu Asp Pro Phe Thr 15 10 15
Phe Gly Cys Asp Asn His Leu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Xaa 20 25 30 <210> 29 <211> 26 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciako peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (26) . , (26) <223> Xaa = Fc
PL 224 701 B1
111 <400> 29
Met Gly Ala Gln Gln Tyr Gly Cys Asp Gly Phe Leu Tyr Gly Cys Met 15 10 15
Ile Asn Leu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Xaa 20 25 <210> 30 <211> 26 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (26).,(26) <223> Xaa = Fc <400> 30
Met Gly Ala Gln Lys Arg Pro Cys Glu Glu Met Trp Gly Gly Cys Asn 15 10 15
Tyr Asp Leu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Xaa 20 25 <210> 31 <211> 26 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (26)..(26) <223> Xaa = Fc <400> 31
Met Gly Ala Gln His Gln Ile Cys Lys Trp Asp Pro Trp Thr Cys Lys 15 10 15
His Trp Leu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Xaa 20 25 <210> 32 <211> 26 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (26) . , (26) <223> Xaa = Fc
112
PL 224 701 B1 <400> 32
Met Gly Ala Gin Lys Arg Pro Cys Glu Glu Ile Phe Gly Gly Cys Thr 15 10 15
Tyr Gin Leu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Xaa 20 25 <210> 33 <211> 784 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <22 0>
<223> DNA kodujący ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 33
atgggtgcac agaaattcaa cccgctggac gaactggaag aaactctgta cgaacagttc 60
actttccagc agctcgaggg tggaggcggt ggggacaaaa ctcacacatg tccaccttgc 120
ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gttttcctct tccccccaaa acccaaggac 180
accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 240
gaccctgagg tcaagttcaa ctggtaegtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 300
aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 360
caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 420
gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 480
aocctgccce catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 540
aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 600
aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 660
ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 720
gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaataatgg 780
atcc 784 <210> 34 <211> 768 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujący ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 34 atgaaattca acccgctgga cgaactggaa gaaactctgt acgaacagtt cactttccag 60 cagctcgagg gtggaggcgg tggggacaaa actcacacat gtccaccttg cccagcacct 120
PL 224 701 B1
113
gaactcotgg ggggaccgte agttttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg 180
atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag 240
gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg 300
gaggagcagt. acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac 360
tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agcccccatc 420
gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc 480
ccatcccggg atgagctgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc 540
tatcccagcg aoatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag 600
accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg 660
gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg 720
cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctgtctccgg gtaaataa 768
<210> 35 <211> 834 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujący ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 35
atgaaattca acccgctgga cgaactggaa gaaactctgt acgaacagtt cactttccag 60
cagggatccg gttctgctac tggtggttcc ggctccaccg caagctctgg ttcaggcagt 120
gcgactcatc tcgagggtgg aggcggtggg gacaaaactc acacatgtcc accttgccca 180
gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtt ttcctcttcc ccccaaaaco caaggacacc 240
ctoatgatot cccggaccco tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 300
cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 360
ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac ogtcctgcac 420
caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc 480
cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 540
ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacotg cc tggtcaaa 600
ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 660
tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 720
accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 780
gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa ataa 834
114
PL 224 701 B1 <210> 36 <211> 861 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujący ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 36
atgggtgcac agaaattcaa cccgctggac gaactggaag aaactctgta cgaacagttc 60
actttccagc agggtggtgg tggtggtggc ggtggtaagt tcaacccact ggatgagctg 120
gaagagactc tgtatgaaca gttcactttc cagcaactcg agggtggagg cggtggggac 180
aaaactcaca catgtccacc ttgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagttttc 240
ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 300
gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 360
gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 420
gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 480
aaggtctcca acaaagccct cccagcccce atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 540
cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac 600
caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 660
gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 720
ggctccttct tectctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 780
gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 840
tccctgtctc cgggtaaata a 861
<210> 37 <211> 849 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja
<220> <223> DNA kodujący ciało peptydowe zdolne do wiązania z : Ang-2
<400> 37 atgaaattca acccgctgga cgaactggaa gaaactctgt acgaacag tt cactttccag 60
cagggtggtg gtggtggcgg tggtaagttc aacccactgg atgagctgga agagac tctg 120
tatgaacagt tcactttcca gcaactcgag ggtggaggcg gtggggacaa aactcacaca 180
tgtccacett gcccagcacc tgaactcctg gggggaccgt cagttttcct cttcccccca 240
aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac 300
PL 224 701 B1
115
gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat 360
aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc 420
ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 480
aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa 540
ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg 600
acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg 660
cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc 720
ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc 780
tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg 840
ggtaaa taa 84 9 <210> 38 <211> 759 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujący ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 38
atgggtgcac agcaggaaga atgcgaatgg gacccatgga cttgcgaaca catgctcgag 60
ggtggaggcg gtggggacaa aactcacaca tgtccacctt gcccagcacc tgaactcctg 120
gggggaccgt cagttttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 180
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 240
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 300
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 360
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 420
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 480
gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 540
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 600
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 660
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 720
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaataa 759
116
PL 224 701 B1 <210> 39 <211> 816 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <22 0>
<223> DNA kodujący ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 39
atgcaggaag aa tgcgaa tg ggacccatgg act tgcgaac acatgggatc cggttctgct 60
actggtggtt ccggctccac cgcaagctct ggttcaggca gtgcgactca tctcgagggt 120
ggaggcggtg gggacaaaac tcacacatgt ccaccttgcc cagcacctga actcctgggg 180
ggaccgtcag ttttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 240
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 300
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 360
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 420
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 480
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat 540
gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 600
atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 660
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 720
tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 780
acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaataa 816
<210> 40 <211> 867 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja
<220> <223> DNA kodujący ciało peptydowe zdolne do wiązania z : Ang-2
<400> 40 atgggtgcac agcaggaaga atgcgaatgg gaccca tgga cttgcgaaca ca tgggatcc 60
ggttctgcta ctggtggttc oggctecacc gcaagctctg gttcaggcag tgcgactcat 120
caggaagaat gcgaatggga cccatggact tgcgaacaca tgctcgaggg tggaggcggt 180
ggggacaaaa ctcacaca tg tccaccttgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 240
gttttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 300
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 360
PL 224 701 B1
117
gacggcgtgg aggtgca taa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 420
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 480
aagtgcaagg tctccaacaa agocctccca gcccccatcg agaaaaccat etccaaagcc 540
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc ca tcccggga tgagctgacc 600
aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 660
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 720
tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 780
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 840
agcctctccc tgtctccggg taaataa 867
<210> 41 <211> 774 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujący ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 41
atggacaaaa ctcacacatg tccaccttgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 60
gttttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 120
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 180
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 240
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 300
aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 360
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 420
aagaac cagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 480
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 540
tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 600
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 660
agcctctccc tgtctccggg taaaggtgga ggtggtggtg cacagaaatt caaccogctg 720
gacgagctgg aagagactct gtacgaacag tttacttttc aacagctcga gtaa 774
<210> 42 <211> 840 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja
118
PL 224 701 B1 <220>
<223> DNA kodujący ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 42
atggacaaaa ctcacacatg tccaccttgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 60
gttttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcocggac ccctgaggtc 120
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 180
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagoaog 240
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 300
aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 360
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 420
aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 480
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 540
tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 600
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 660
agcctctccc tgtctccggg taaaggtgga ggtggtggtg cacagggatc cggttctgct 720
actggtggtt ccggctccac cgcaagctct ggttcaggca gtgcgactca taaattcaac 780
ccgctggacg aactggaaga aactctgtao gaacagttca atttccagca actcgagtaa 840
<210> 43 <211> 858 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja
<220> <223> DNA kodujący ciało peptydowe zdolne do wiązania e : Ang-2
<400> 43 atggacaaaa ctcacacatg tccaccttgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 60
gttttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctoccggac ccctgaggtc 120
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 180
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 240
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 300
aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 360
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 420
aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 480
PL 224 701 B1
119
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 540
tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 600
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 660
agcctctccc tgtctccggg taaaggtgga ggtggtggtg cacagaaatt caacccgctg 720
gacgaactgg aagaaac tct gtacgaacag ttcactttcc agcagggtgg tggtggtggt 780
ggcggtggta agttcaaccc actggatgag ctggaagaga ctctgtatga acagttcact 840
ttccagcaac tcgagtaa 858
<210> 44 <211> 756 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujący ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 44
atggacaaaa ctcacacatg tccaccttgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 60
gttttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 120
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagt tcaa ctggtaegtg 180
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 240
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 300
aagtgcaagg tctccaacaa agccc tccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 360
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 420
aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 480
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 540
tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 600
gggaacgtct tctcatgc tc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 660
agcctctccc tgtctccggg taaaggtgga ggtggtggtg cacagcagga agaatgcgaa 720
tgggacccat ggacttgcga acacatgctc gagtaa 756
<210> 45 <211> 822 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujący ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 45 '
120
PL 224 701 B1
atggacaaaa otcacacatg tccaccttgc ccagcaoctg aactcctggg gggaccgtca 60
gttttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 120
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 180
gacggcgtgg aggtgca taa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 240
taccgtgtgg tcagcgtcet cacegtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 300
aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat oteeaaagcc 360
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 420
aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 480
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 540
tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 600
gggaacg tct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta oacgcagaag 660
agcctctccc tgtctccggg taaaggtgga ggtggtggtg cacagggatc cggttctgct 720
actggtggtt ccggctccac cgcaagctct ggttcaggca gtgcgactca tcaggaagaa 780
tgcgaatggg acccatggac ttgcgaacac atgctcgagt aa 822
<210> 46 <211> 864 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujący ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 46
atggacaaaa ctcacacatg tccaccttgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 60
gttttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 120
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 180
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 240
taccgtgtgg tcagcgtcct cacegtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 300
aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 360
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 420
aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 480
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 540
tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 600
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 660
PL 224 701 B1
121
agcctctccc tgtctccggg taaaggtgga ggtggtggtg cacagcagga agaa tgcgaa 720
tgggacccat ggacttgcga acacatggga tccggttctg ctactggtgg ttccggctcc 780
accgcaagct ctggttcagg cagcgcgact catcaggaag aatgcgaatg ggacccatgg 840
acttgcgaac acatgctcga gtaa 864
<210> 47 <211> 906 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <22 0>
<223> DNA kodujący ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 47
atgggtgcac aggaagaatg cgaatgggac ccatggactt gcgaacacat gggtggtggt 60
ggtggtggcg gtggtaaatt caacccgctg gacgaactgg aagaaactct gtacgaacag 120
ttcactttcc agcagggatc cggttctgct actggtggtt ccggctccac cgcaagctct 180
ggttcaggca gtgcgactca tctcgagggt ggaggcggtg gggacaaaac tcacacatgt 240
ccaccttgcc cagcacctga actcctgggg ggaccgtcag ttttcctctt ccccccaaaa 300
cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg 360
agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 420
gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 480
accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 540
gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca 600
caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc 660
tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 720
ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc 780
tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc 840
gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt 900
aaataa 90 6 <210> 48 <211> 897 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujący ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2
122
PL 224 701 B1
<400> 48
atggacaaaa ctcacacatg tccaccttgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 60
gttttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 120
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 180
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 240
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 300
aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 360
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 420
aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 480
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 540
tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 600
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 660
agcctctccc tgtctccggg taaagg tgga ggtggtggtg cacagggatc cggttctgct 720
actggtggtt ccggctccac cgcaagctct ggttcaggca gtgcgactca taaattcaac 780
ccgctggacg aactggaaga aactctgtac gaacagttca ctttccagca gggtggtggc 840
ggtggtcagg aagaatgcga atgggaccca tggacttgcg aacacatgct cgagtaa 897
<210> 49 <211> 771 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujący ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 49
atgggtgcac agttcgacta ctgcgaaggt gttgaagacc cgttcacttt cggttgcgac 60
aaccacctcg agggtggagg cggtggggac aaaactcaca catgtccacc ttgcccagca 120
cc tgaactcc tggggggacc gtcagttttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc 180
atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct 240
gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 300
cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcc tcaccgt cctgcaccag 360
gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc 420
atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg 480
cccccatccc gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 540
PL 224 701 B1
123
ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 600
aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct toctctacag caagctcacc 660
gtggacaaga gcaggtggca goaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 720
ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaata a 771
<210> 50 <211> 759 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujący ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 50
atgggtgcac agcagtacgg ttgcgacggt tttctgtacg gttgcatgat caacctcgag 60
ggtggaggcg gtggggacaa aactcacaca tgtccacctt gcccagcacc tgaactcctg 120
gggggaccgt eagttttect cttcccccca aaaccoaagg aoaccctcat gatctcccgg 180
acccctgagg tcacatgogt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 240
aaotggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 300
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 360
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccocat cgagaaaacc 420
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 480
gatgagctga ccaagaacoa ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 540
gacategccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 600
cccgtgctgg actccgacgg ctocttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 660
aggtggcagc aggggaacgt ottctcatgo tccgtgatge atgaggctct gcacaaccac 720
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaataa 759
<210> 51 <211> 759 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujący ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 51
atgggtgcac agaaacgccc atgcgaagaa atgtggggtg gttgcaacta cgacc tegag 60
ggtggaggcg gtggggacaa aactcacaca tgtccacctt gcccagcacc tgaactcctg 120
gggggaccgt eagttttect cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 180
124
PL 224 701 B1
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 240
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 300
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 360
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 420
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 480
gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 540
gacatcgccg tggagtggga gagaaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 600
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 660
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 720
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaataa 759
<210> 52 <211> 759 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja
<220> <223> DNA kodujący ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2
<400> 52 atgggtgcac agcaccagat ctgcaaatgg gacccgtgga cctgcaaaca ctggctcgag 60
ggtggaggcg gtggggacaa aactcacaca tgtccacctt gcccagcacc tgaactcctg 120
gggggaccgt cagttttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 180
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 240
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 300
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 360
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 420
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 480
gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 540
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 600
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 660
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 720
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaataa 759
PL 224 701 B1
125 <210> 53 <211> 759 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA encoding peptibodies capable zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 53
atgggtgcac agaaacgtcc atgcgaagaa atcttcggtg gttgcaccta ccagctcgag 60
ggtggaggcg gtggggacaa aactcacaca tgtccacctt gcccagcacc tgaactcctg 120
gggggaccgt cagttttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 180
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 240
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 300
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 360
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 420
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 480
gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 540
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 600
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 660
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 720
tacacgcaga agagcctc tc cctgtctccg ggtaaataa 759
<210> 54 <211> 25 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> oligonukleotyd
<400> 54 cggcgcaact atcggtatca agctg 25
<210> 55 <211> 26 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220> <223> oligonukleotyd <400> 55 catgtaccgt aacactgagt ttcgtc 26
126
PL 224 701 B1 <210> 56 <211> 14 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> zgodne motywy generowane z biblioteki ΤΝ8-ΙΧ <220>
<221> inna cecha <222> (7, 12 and)..(14) <223> Xaa oznacza dowolny spośród aminokwasów występujących w naturze <400> 56
Lys Arg Pro Cys Glu Glu Xaa Trp Gly Gly Cys Xaa Tyr Xaa
5 10 <210> 57 <211> 14 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> zgodne motywy generowane z biblioteki ΤΝ8-ΙΧ <220>
<221> inna cecha <222> (7, 12 and)..(14) <223> Xaa oznacza dowolny spośród aminokwasów występujących w naturze <400> 57
Lys Arg Pro Cys Glu Glu Xaa Phe Gly Gly Cys Xaa Tyr Xaa
10 <210> 58 <211> 14 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> zgodne motywy generowane z biblioteki ΤΝ8-ΙΧ <220>
<221> inna cecha <222> (1, 2, 3, 5 and)..(13) <223> Xaa oznacza dowolny spośród aminokwasów występujących w naturze <400> 58
Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu Xaa Met
10 <210> 59 <211> 18 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> zgodne motywy generowane z biblioteki ΤΝ12-ΙΧ
PL 224 701 B1
127 <220>
<221> inna cecha <222> (3, 8, 10-14 and)..(18) <223> Xaa oznacza dowolny spośród aminokwasów występujących w naturze <400> 59
Trp Ser Xaa Cys Ala Trp Phe Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Arg 15 10 15
Arg Xaa <210> 60 <211> 227 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ludzka domena Fc IgGl <400> 60
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100
105
110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val
115
120
125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser
130
135
140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145
150
155
160
Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165
170
175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180
185
190
Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195
200
205
128
PL 224 701 B1
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220
Pro Gly Lys
225 <210> 61 <211> 14 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> zgodne motywy generowane z biblioteki ΤΝ8-ΙΧ <220>
<221> inna cecha <222> (1-3, 5, 7, 12, 13 and)..(14) <223> Xaa oznacza dowolny spośród aminokwasów występujących w naturze <400> 61
Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Asp Xaa Tyr Trp Tyr Cys Xaa Xaa Xaa
10 <210> 62 <211> 14 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <22 0>
<223> zgodne motywy generowane z biblioteki ΤΝ8-ΙΧ <220>
<221> inna cecha <222> (1-3, 5, 7, 12, 13 and) . . (14) <223> Xaa oznacza dowolny spośród aminokwasów występujących w naturze <400> 62
Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Asp Xaa Tyr Thr Tyr Cys Xaa Xaa Xaa
10 <210> 63 <211> 14 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> zgodne motywy generowane z biblioteki ΤΝ8-ΙΧ <220>
<221> inna cecha <222> (1-3, 5, 7, 12, 13 and)..(14) <223> Xaa oznacza dowolny spośród aminokwasów występujących w naturze <400> 63
Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Asp Xaa Phe Trp Tyr Cys Xaa Xaa Xaa
10
PL 224 701 B1
129 <210> 64 <211> 14 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> zgodne motywy generowane z biblioteki ΤΝ8-ΙΧ <220>
<221> inna cecha <222> (1-3, 5, 7, 12, 13 and)..(14) <223> Xaa oznacza dowolny spośród aminokwasów występujących w naturze <400> 64
Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Asp Xaa Phe Thr Tyr Cys Xaa Xaa Xaa 15 10 <210> 65 <211> 5 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 65
Trp Asp Pro Trp Thr 1 5 <210> 66 <211> 6 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 66
Trp Asp Pro Trp Thr Cys
5 <210> 67 <211> 7 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa oznacza kwasową lub neutralną polarną resztę aminokwasową <400> 67
Cys Xaa Trp Asp Pro Trp Thr 1 5
130
PL 224 701 B1 <210> 68 <211> 8 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <22 0>
<223> ciało polipeptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <22 0>
<221> inna cecha <222> (2).,(2) <223> Xaa oznacza kwasową lub neutralną polarną resztę aminokwasową <400> 68
Cys Xaa Trp Asp Pro Trp Thr Cys
5 <210> 69 <211> 14 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (1, 2 and)..(3) <223> Xaa są każdy niezależnie resztami aminokwasów <220>
<221> inna cecha <222> (5)..(5) <223> Xaa jest resztą aminokwasową <22 0>
<221> inna cecha <222> (12)..(12) <223> Xaa nie występuje lub jest resztą aminokwasową <220>
<221> inna cecha <222> (13)..(13) <223> Xaa nie występuje lub jest neutrlną hydrofobową, neutralną polarną lub zasadową resztą aminokwasową <22 0>
<221> inna cecha <222> (14)..(14) <223> Xaa jest neutrlną hydrofobową lub neutralną polarną resztą aminokwasową <400> 69
Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Trp Asp Pro Trp Thr Cys Xaa Xaa Xaa
10 <210> 70 <211> 20 <212> PRT
PL 224 701 B1
131 <213> sztuczna sekwencja <22 0>
<223> ciało polipeptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (1 and)..(15) <223> Xaa nie występuje lub jest resztą aminokwasową <220>
<221> inna cecha <222> (2 and)..(16) <223> Xaa nie występuje lub jest neutrlną hydrofobową, neutralną polarną lub zasadową resztą aminokwasową <220>
<221> inna cecha <222> (3-6, 18, 19 and)..(20) <223> Xaa niezależnie nie występuję lub są resztami aminokwasowymi <220>
<221> inna cecha <222> (8)..(8) <223> Xaa jest resztą aminokwasową <220>
<221> inna cecha <222> (17)..(17) <223> Xaa nie występuje lub jest neutrlną hydrofobową lub neutralną polarną resztą aminokwasową <400> 70
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Trp Asp Pro Trp Thr Cys Xaa Xaa
10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa 20 <210> 71 <211> 10 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa jest neutralną hydrofobową resztą aminokwasową <220>
<221> inna cecha <222> (4)..(4) <223> Xaa oznacza A, D lub E <22 0>
<221> inna cecha
132
PL 224 701 B1 <222> (6)..(6) <223> Xaa jest kwasową resztą aminokwasową <220>
<221> inna cecha <222> (7)..(7) <223> Xaa jest resztą aminokwasową <220>
<221> inna cecha <222> (8)..(8) <223> Xaa jest neutrlną hydrofobową, neutralną polarną lub zasadową resztą aminokwasową <400> 71
Pro Xaa Asp Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Leu Tyr
10 <210> 72 <211> 22 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (1, 4 and ),.(20) <223> Xaa nie występuje lub jest resztą aminokwasową <220>
<221> inna cecha <222> (2, 15, 16 and)..(21) <223> Xaa nie występuję lub jest neutralną polarą, kwasową lub zasadową resztą aminokwasową <220>
<221> inna cecha <222> (3, 17 and) , . (18) <223> Xaa nie występuję lub jest neutralną hydrofobową, neutralną polarą resztą aminokwasową <220>
<221> inna cecha <222> (6)..(6) <223> Xaa jest neutralna hydrofobową reszta aminokwasową <220>
<221> inna cecha <222> (8) . . (8) <223> Xaa oznacza A, D lub E.
<220>
<221> inna cecha <222> (10),,(10) <223> Xaa jest kwasową reszta aminokwasową
PL 224 701 B1
133 <220>
<221> inna cecha <222> (11)..(11) <223> Xaa jest reszta aminokwasową <220>
<221> inna cecha <222> (12)..(12) <223> Xaa jest neutrlną hydrofobową, neutralną polarną lub zasadową resztą aminokwasową <220>
<221> inna cecha <222> (19 and)..(22) <223> Xaa nie występuje lub jest neutrlną hydrofobową, neutralną polarną lub zasadową resztą aminokwasową <400> 72
Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Asp Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Leu Tyr Xaa Xaa
10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 <210> 73 <211> 8 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (3)..(3) <223> Xaa jest naturalną polarną resztą amionokwasową <220>
<221> inna cecha <222> (4)..(4) <223> Xaa jest kwasową resztą amionokwasową <220>
<221> inna cecha <222> (5)..(5) <223> Xaa jest naturalną polarna lub kwasową resztą amionokwasową <220>
<221> inna cecha <222> (6 and)..(7) <223> Xaa jest naturalną hydrofobową resztą aminokwasową <400> 73
Arg Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly
5 <210> 74 <211> 20
134
PL 224 701 B1 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (1, 2, 4, 13, 14, 19 and)..(20) <223> Xaa jest naturalną hydrofobową lub neutralną polarną reszta aminokwasową <220 <221> inna cecha <222> (3, 9 and)..(17) <223> Xaa jest neutralną polarną lub kwasową resztą aminokwasową <220>
<221> inna cecha <222> (7, 15 and)..(16) <223> Xaa jest neutralną polarną resztą aminokwasową <220 <221> inna cecha <222> (8)..(8) <223> Xaa jest kwasową resztą aminokwasową <220 <221> inna cecha <222> (10 and)..(11) <223> Xaa jest naturalną hydrofobowa resztą aminokwasową <220 <221> inna cecha <222> (18)..(18) <223> Xaa jest naturalną hydrofobową lub zasadową resztą aminokwasową <400 74
Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa 20 <210 75 <211> 13 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220 <223> ciało polipeptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa jest kwasową resztą aminokwasową <220>
<221> inna cecha <222> (4)..(4) <223> Xaa jest naturalną hydrofobową resztą aminokwasową
PL 224 701 B1
135 <220>
<221> inna cecha <222> (5)..(5) <223> Xaa oznacz Ε, D lub Q.
<220>
<221> inna cecha <222> (10)..(10) <223> Xaa jest neutralną hydrofobową lub neutralną polarną resztą aminokwasową <220>
<221> inna cecha <222> (13)..(13) <223> Xaa jest resztą kwasową <400> 75
Cys Xaa Gly Xaa Xaa Asp Pro Phe Thr Xaa Gly Cys Xaa
10 <210> 76 <211> 20 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 76
Pro Ile Arg Gin Glu Glu Cys Asp Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His 15 10 15
Met Trp Glu Val 20 <210> 77 <211> 20 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 77
Thr Asn Ile Gin Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Asp His 15 10 15
Met Pro Gly Lys 20 <210> 78 <211> 20 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja
136
PL 224 701 B1 <220>
<223> ciało polipeptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 78
Trp Tyr Glu Gin Asp Ala Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His 15 10 15
Met Ala Glu Val 20 <210> 79 <211> 20 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 79
Asn Arg Leu Gin Glu Val Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His 15 10 15
Met Glu Asn Val 20 <210> 80 <211> 20 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 80
Ala Ala Thr Gin Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His 15 10 15
Met Pro Arg Ser 20
<210> <211> <212> <213> 81 20 PRT sztuczna sekwencja
<220>
<223> ciało polipeptydowe zdolne do wiązania z Ang-2
<400> 81
Leu Arg His Gin Glu Gly Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys
1 5 10 ~
Met Phe Asp Trp
20
<210> 82
<211> 20
PL 224 701 B1
137 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 82
Val Pro Arg Gln Lys Asp Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His 15 10 15
Met Tyr Val Gly 20 <210> 83 <211> 20 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 83
Ser Ile Ser His Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His 15 10 15
Met Gln Val Gly 20 <210> 84 <211> 20 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 84
Trp Ala Ala Gln Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His 15 10 15
Met Gly Arg Met 20 <210> 85 <211> 20 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 85
Thr Trp Pro Gln Asp Lys Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His 15 10 15
Met Gly Ser Thr 20
138
PL 224 701 B1 <210> 86 <211> 20 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 86
Gly His Ser Gin Glu Glu Cys Gly Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His 15 10 15
Met Gly Thr Ser 20 <210> 87 <211> 20 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 87
Gin His Trp Gin Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Asp His 15 10 15
Met Pro Ser Lys 20 <210> 88 <211> 20 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 88
Asn Val Arg Gin Glu Lys Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His 15 10 15
Met Pro Val Arg 20 <210> 89 <211> 20 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <22 0>
<223> ciało polipeptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 89
Lys Ser Gly Gin Val Glu Cys Asn Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His 15 10 15
PL 224 701 B1
139
Met Pro Arg Asn 20 <210> 90 <211> 20 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 90
Val Lys Thr Gin Glu His Cys Asp Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His 15 10 15
Met Arg Glu Trp 20 <210> 91 <211> 20 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 91
Ala Trp Gly Gin Glu Gly Cys Asp Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His 15 10 15
Met Leu Pro Met 20 <210> 92 <211> 20 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 92
Pro Val Asn Gin Glu Asp Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His 15 10 15
Met Pro Pro Met 20 <210> 93 <211> 20 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowe zdolne do wiązania z Ang-2
140
PL 224 701 B1 <400> 93
Arg Ala Pro Gin Glu Asp Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ala His 15 10 15
Met Asp Ile Lys 20 <210> 94 <211> 20 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 94
His Gly Gin Asn Met Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His 15 10 15
Met Phe Arg Tyr 20 <210> 95 <211> 20 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <22 0>
<223> ciało polipeptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 95
Pro Arg Leu Gin Glu Glu Cys Val Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His 15 10 15
Met Pro Leu Arg 20 <210> 96 <211> 20 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 96
Arg Thr Thr Gin Glu Lys Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His 15 10 15
Met Glu Ser Gin 20 <210> 97 <211> 20 <212> PRT
PL 224 701 B1
141 <213> sztuczna sekwencja <22 0>
<223> ciało polipeptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 97
Gin Thr Ser Gin Glu Asp Cys Val Trp Asp Pro Trp Thr Cys Asp His 15 10 15
Met Val Ser Ser 20 <210> 98 <211> 20 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 98
Gin Val Ile Gly Arg Pro Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His 15 10 15
Leu Glu Gly Leu 20 <210> 99 <211> 20 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 99
Trp Ala Gin Gin Glu Glu Cys Ala Trp Asp Pro Trp Thr Cys Asp His 15 10 15
Met Val Gly Leu 20 <210> 100 <211> 20 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowa zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 100
Leu Pro Gly Gin Glu Asp Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His 15 10 15
Met Val Arg Ser 20
142
PL 224 701 B1 <210> 101 <211> 20 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowa zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 101
Pro Met Asn Gln Val Glu Cys Asp Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His 15 10 15
Met Pro Arg Ser 20 <210> 102 <211> 20 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowa zdolne do wiązania zAng-2 <400> 102
Phe Gly Trp Ser His Gly Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His 15 10 15
Met Gly Ser Thr 20 <210> 103 <211> 20 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowa zdolne do wiązania zAng-2 <400> 103
Lys Ser Thr Gln Asp Asp Cys Asp Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His 15 10 15
Met Val Gly Pro 20 <210> 104 <211> 20 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowa zdolne do wiązania z Ang-2
PL 224 701 B1
143 <400> 104
Gly Pro Arg Ile Ser Thr Cys Gin Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His 15 10 15
Met Asp Gin Leu ' 20 <210> 105 <211> 20 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowa zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 105
Ser Thr Ile Gly Asp Met Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ala His 15 10 15
Met Gin Val Asp 20 <210> 106 <211> 20 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowa zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 106
Val Leu Gly Gly Gin Gly Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Arg Leu 15 10 15
Leu Gin Gly Trp 20 <210> 107 <211> 20 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowa zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 107
Val Leu Gly Gly Gin Gly Cys Gin Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ser His 15 10 15
Leu Glu Asp Gly 20 <210> 108 <211> 20 <212> PRT
144
PL 224 701 B1 <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowa zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 108
Thr Thr Ile Gly Ser Met Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ala His 15 10 15
Met Gin Gly Gly 20 <210> 109 <211> 20 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowa zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 109
Thr Lys Gly Lys Ser Val Cys Gin Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ser His 15 10 15
Met Gin Ser Gly 20 <210> 110 <211> 20 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowa zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 110
Thr Thr Ile Gly Ser Met Cys Gin Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ala His 15 10 15
Met Gin Gly Gly 20 <210> 111 <211> 20 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowa zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 111
Trp Val Asn Glu Val Val Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Asn His 15 10 15
Trp Asp Thr Pro 20
PL 224 701 B1
145 <210> 112 <211> 20 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowa zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 112
Val Val Gin Val Gly Met Cys Gin Trp Asp Pro Trp Thr Cys Lys His 15 10 15
Met Arg Leu Gin 20 <210> 113 <211> 20 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <22 0>
<223> ciało polipeptydowa zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 113
Ala Val Gly Ser Gin Thr Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ala His 15 10 15
Leu Val Glu Val 20 <210> 114 <211> 20 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowa zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 114
Gin Gly Met Lys Met Phe Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ala His 15 10 15
Ile Val Tyr Arg 20 <210> 115 <211> 20 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowa zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 115
Thr Thr Ile Gly Ser Met Cys Gin Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His 15 10 15
146
PL 224 701 B1
Met Gin Gly Gly 20 <210> 116 <211> 20 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowa zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 116
Thr Ser Gin Arg Val Gly Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Gin His 15 10 15
Leu Thr Tyr Thr 20 <210> 117 <211> 20 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowa zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 117
Gin Trp Ser Trp Pro Pro Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Gin Thr 15 10 15
Val Trp Pro Ser 20 <210> 118 <211> 20 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowa zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 118
Gly Thr Ser Pro Ser Phe Cys Gin Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ser His 15 10 15
Met Val Gin Gly 20 <210> 119 <211> 22 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowa zdolne do wiązania z Ang-2
PL 224 701 B1
147 <400> 119
Gin Asn Tyr Lys Pro Leu Asp Glu Leu Asp Ala Thr Leu Tyr Glu His 15 10 15
Phe Ile Phe His Tyr Thr 20 <210> 120 <211> 22 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowa zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 120
Leu Asn Phe Thr Pro Leu Asp Glu Leu Glu Gin Thr Leu Tyr Glu Gin 15 10 15
Trp Thr Leu Gin Gin Ser 20 <210> 121 <211> 22 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowa zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 121
Thr Lys Phe Asn Pro Leu Asp Glu Leu Glu Gin Thr Leu Tyr Glu Gin 15 10 15
Trp Thr Leu Gin His Gin 20 <210> 122 <211> 22 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowa zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 122
Val Lys Phe Lys Pro Leu Asp Ala Leu Glu Gin Thr Leu Tyr Glu His 15 10 15
Trp Met Phe Gin Gin Ala 20 <210> 123 <211> 22 <212> PRT
148
PL 224 701 B1 <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowa zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 123
Val Lys Tyr Lys Pro Leu Asp Glu Leu Asp Glu Ile Leu Tyr Glu Gln 15 10 15
Gln Thr Phe Gln Glu Arg 20 <210> 124 <211> 22 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowa zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 124
Thr Asn Phe Met Pro Met Asp Asp Leu Glu Gln Arg Leu Tyr Glu Gln 15 10 15
Phe Ile Leu Gln Gln Gly 20 ’ <210> 125 <211> 22 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowa zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 125
Ser Lys Phe Lys Pro Leu Asp Glu Leu Glu Gln Thr Leu Tyr Glu Gln 15 10 15
Trp Thr Leu Gln His Ala 20 <210> 126 <211> 22 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowa zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 126
Gln Lys Phe Gln Pro Leu Asp Glu Leu Glu Gln Thr Leu Tyr Glu Gln
10 15
Phe Met Leu Gln Gln Ala 20
PL 224 701 B1
149 <210 127 <211> 22 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowa zdolne do wiązania z Ang-2 <400 127
Gin Asn Phe Lys Pro Met Asp Glu Leu Glu Asp Thr Leu Tyr Lys Gin 15 10 15
Phe Leu Phe Gin His Ser 20 <210 128 <211> 22 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <22 0>
<223> ciało polipeptydowa zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 128
Tyr Lys Phe Thr Pro Leu Asp Asp Leu Glu Gin Thr Leu Tyr Glu Gin 15 10 15
Trp Thr Leu Gin His Val 20 <210> 129 <211> 22 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowa zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 129
Gin Glu Tyr Glu Pro Leu Asp Glu Leu Asp Glu Thr Leu Tyr Asn Gin 15 10 15
Trp Met Phe His Gin Arg 20 <210> 130 <211> 22 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220 <223> ciało polipeptydowa zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 130
Ser Asn Phe Met Pro Leu Asp Glu Leu Glu Gin Thr Leu Tyr Glu Gin 15 10 15
150
PL 224 701 B1
Phe Met Leu Gin His Gin 20 <210> 131 <211> 22 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowa zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 131
Gin Lys Tyr Gin Pro Leu Asp Glu Leu Asp Lys Thr Leu Tyr Asp Gin 15 10 15
Phe Met Leu Gin Gin Gly 20
<210> 132 <211> 22 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja
<220>
<223> ciało polipeptydowa zdolne do wiązania z Ang-2
<400> 132
Gin Lys Phe Gin Pro Leu Asp Glu Leu Glu Glu Thr Leu Tyr Lys Gin
1 5 10 15
Trp Thr Leu Gin Gin Arg
20
<210> 133 <211> 22 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowa zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 133
Val Lys Tyr Lys Pro Leu Asp Glu Leu Asp Glu Trp Leu Tyr His Gin 15 10 15
Phe Thr Leu His His Gin 20 <210> 134 <211> 22 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
PL 224 701 B1
151 <223> ciało polipeptydowa zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 134
Gin Lys Phe Met Pro Leu Asp Glu Leu Asp Glu Ile Leu Tyr Glu Gin 15 10 15
Phe Met Phe Gin Gin Ser 20 <210> 135 <211> 22 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowa zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 135
Gin Thr Phe Gin Pro Leu Asp Asp Leu Glu Glu Tyr Leu Tyr Glu Gin 15 10 15
Trp Ile Arg Arg Tyr His 20 <210> 136 <211> 22 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowa zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 136
Glu Asp Tyr Met Pro Leu Asp Ala Leu Asp Ala Gin Leu Tyr Glu Gin 15 10 15
Phe Ile Leu Leu His Gly 20 <210> 137 <211> 22 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowa zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 137
His Thr Phe Gin Pro Leu Asp Glu Leu Glu Glu Thr Leu Tyr Tyr Gin 15 10 15
Trp Leu Tyr Asp Gin Leu 20 <210> 138
152
PL 224 701 B1 <211> 22 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowa zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 138
Tyr Lys Phe Asn Pro Met Asp Glu Leu Glu Gin Thr Leu Tyr Glu Glu 15 10 15
Phe Leu Phe Gin His Ala 20 <210> 139 <211> 22 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowa zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 139
Thr Asn Tyr Lys Pro Leu Asp Glu Leu Asp Ala Thr Leu Tyr Glu His 15 10 15
Trp Ile Leu Gin His Ser 20 <210> 140 <211> 22 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowa zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 140
Gin Lys Phe Lys Pro Leu Asp Glu Leu Glu Gin Thr Leu Tyr Glu Gin 15 10 15
Trp Thr Leu Gin Gin Arg 20 <210> 141 <211> 22 <212> PRT <2I3> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowa zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 141
Thr Lys Phe Gin Pro Leu Asp Glu Leu Asp Gin Thr Leu Tyr Glu Gin 15 10 15
Trp Thr Leu Gin Gin Arg 20
PL 224 701 B1
153 <210> 142 <211> 22 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowa zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 142
Thr Asn Phe Gin Pro Leu Asp Glu Leu Asp Gin Thr Leu Tyr Glu Gin 15 10 15
Trp Thr Leu Gin Gin Arg 20 <210> 143 <211> 20 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowa zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 143
Ala Gly Gly Met Arg Pro Tyr Asp Gly Met Leu Gly Trp Pro Asn Tyr 15 10 15
Asp Val Gin Ala 20 <210> 144 <211> 20 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowa zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 144
Gin Thr Trp Asp Asp Pro Cys Met His Ile Leu Gly Pro Val Thr Trp 15 10 15
Arg Arg Cys Ile 20 <210> 145 <211> 20 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowa zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 145
Ala Pro Gly Gin Arg Pro Tyr Asp Gly Met Leu Gly Trp Pro Thr Tyr
10 15
154
PL 224 701 B1
Gln Arg Ile Val 20 <210> 146 <211> 20 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowa zdolne do wiazania z Ang-2 <400> 146
Ser Gly Gln Leu Arg Pro Cys Glu Glu Ile Phe Gly Cys Gly Thr Gln 15 10 15
Asn Leu Ala Leu 20 <210> 147 <211> 20 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowa zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 147
Phe Gly Asp Lys Arg Pro Leu Glu Cys Met Phe Gly Gly Pro Ile Gln 15 10 15
Leu Cys Pro Arg 20 <210> 148 <211> 20 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowa zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 148
Gly Gln Asp Leu Arg Pro Cys Glu Asp Met Phe Gly Cys Gly Thr Lys 15 10 15
Asp Trp Tyr Gly 20 <210> 149 <211> 20 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
PL 224 701 B1
155 <223> ciało polipeptydowa zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 149
Gly Phe Glu Tyr Cys Asp Gly Met Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys 15 10 15
Asp Lys Gin Thr 20 <210> 150 <211> 20 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowa zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 150
Lys Leu Glu Tyr Cys Asp Gly Met Glu Asp Pro Phe Thr Gin Gly Cys 1 5 10 15
Asp Asn Gin Ser 20 <210> 151 <211> 20 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowa zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 151
Leu Gin Glu Trp Cys Glu Gly Val Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys 15 10 15
Glu Lys Gin Arg 20 <210> 152 <211> 20 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowa zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 152
Ala Gin Asp Tyr Cys Glu Gly Met Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys
10 15
Glu Met Gin Lys 20
156
PL 224 701 B1 <210> 153 <211> 20 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowa zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 153
Leu Leu Asp Tyr Cys Glu Gly Val Gin Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys 15 10 15
Glu Asn Leu Asp 20 <210> 154 <211> 20 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowa zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 154
His Gin Glu Tyr Cys Glu Gly Met Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys 15 10 15
Glu Tyr Gin Gly 20 <210> 155 <211> 20 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowa zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 155
Met Leu Asp Tyr Cys Glu Gly Met Asp Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys 15 10 15
Asp Lys Gin Met 20 <210> 156 <211> 20 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowa zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 156
Leu Gin Asp Tyr Cys Glu Gly Val Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys
10 15
PL 224 701 B1
157
Glu Asn Gin Arg 20 <210> 157 <211> 20 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowa zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 157
Leu Gin Asp Tyr Cys Glu Gly Val Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys 15 10 15
Glu Lys Gin Arg 20 <210> 158 <211> 20 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało polipeptydowa zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (1).. (1) <223> Xaa nie występuje lub jest neutralną hydrofobową, neutralną polarną lub zasadową resztą aminokwasową <220>
<221> inna cecha <222> (2, 4, 14)..(19) <223> Xaa jest neutralną hydrofobową lub neutralną polarną resztą kwasową <220>
<221> inna cecha <222> (3, 6)..(17) <223> Xaa jest kwasową reszta aminokwasową <22 0>
<221> inna cecha <222> (8)..(8) <223> Xaa jest naturalną hydrofobową reszta aminokwasową <220>
<221> inna cecha <222> (9)..(9) <223> Xaa oznacza E, D lub Q.
<220>
<221> inna cecha <222> (18)..(18) <223> Xaa jest neutralną hydrofobową, neutralną polarną lub zasadową resztą aminokwasową
158
PL 224 701 B1 <220>
<221> inna cecha <222> (20)..(20) <223> Xaa nie występuje lub jest resztą aminokwasową <400> 158
Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Gly Xaa Xaa Asp Pro Phe Thr Xaa Gly Cys
10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa 20 <210> 159 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 159 cogatcegtc aggaagaatg cgactgggac ccgtggacct gcgaacacat gtgggaagtt 60 <210> 160 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 160 accaacatcc aggaagaatg cgaatgggac ccgtggacct gcgaocaoat gccgggtaaa 60 <210> 161 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 161 tggtacgaac aggacgcttg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacat ggctgaagtt 60 <210> 162 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 162 aaccgtctgc aggaagtttg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacat ggaaaacgtt 60
PL 224 701 B1
159 <210> 163 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne 'do wiązania z Ang-2 <400> 163 gctgctaccc aggaagaatg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacat gccgcgttcc 60 <210> 164 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 164 ctgcgtcacc aggaaggttg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacat gttcgactgg 60 <210> 165 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 165 gttccgcgtc agaaagactg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacat gtacgttggt 60 <210> 166 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 166 tgggctgctc aggaagaatg cgaatgggat ccgtggactt gcgaacacat gggtcgtatg 60 <210> 167 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 167 acttggccgc aggacaaatg cgaatgggat ccgtggactt gcgaacacat gggttctact 60 <210> 168 <211> 60 <212> DNA
160
PL 224 701 B1 <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 168 ggtcactccc aggaagaatg cggttgggac ccgtggacct gcgaacacat gggtacgtcc 60 <210> 169 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 169 cagcactggc aggaagaatg cgaatgggac ccgtggacct gcgaccaoat gccgtccaaa 60 <210> 170 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 170 aacgttcgtc aggaaaaatg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacat gccggttcgt 60 <210> 171 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 171 aaatccggtc aggttgaatg caactgggac ccgtggacct gcgaacacat gccgcgtaac 60 <210> 172 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 172 gttaaaaccc aggaacactg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacat gcgtgaatgg 60 <210> 173 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja
PL 224 701 B1
161 <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 173 gcttggggtc aggaaggttg cgactgggac ccgtggacct gcgaacacat gctgccgatg 60 <210> 174 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 174 ccggttaacc aggaagactg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacat gccgccgatg 60 <210> 175 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA encoding peptide capable zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 175 cgtgctccgc aggaagactg cgaatgggac ccgtggacct gcgctcacat ggacatcaaa 60 <210> 176 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 176 cacggtoaga acatggaatg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacat gttccgttac 60 <210> 177 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 177 ccgcgtctgc aggaagaatg cgtttgggao ccgtggacct gcgaacacat gccgctgcgt 60 <210> 178 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja
162
PL 224 701 B1 <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 178 cgtaccaccc aggaaaaatg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacat ggaatcccag 60 <210> 179 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 179 oagacotcoc aggaagactg cgtttgggao ccgtggacct gcgaccacat ggtttcctcc 60 <210> 180 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 180 caggttatcg gtcgtccgtg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacct ggaaggtctg 60 <210> 181 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 181 tgggctcagc aggaagaatg cgcttgggac cogtggacct gcgaooacat ggttggtotg 60 <210> 182 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 182 ctgccgggtc aggaagactg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacat ggttcgttcc 60 <210> 183 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <22 0>
PL 224 701 B1
163 <223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 183 ccgatgaacc aggttgaatg cgaotgggac ocgtggacct gcgaacacat gccgcgttcc 60 <210> 184 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 184 ttcggttggt ctcacggttg cgaatgggat ccgtggactt gcgaacacat gggttctacc 60 <210> 185 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 185 aaatccaccc aggacgactg cgaotgggac ccgtggacct gcgaacacat ggttggtccg 60 <210> 186 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 186 ggtccgcgta tctccacctg ccagtgggac ccgtggacct gcgaacacat ggaccagctg 60 <210> 187 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 187 tccaccatcg gtgacatgtg cgaatgggac ccgtggacct gcgctcacat gcaggttgac 60 <210> 188 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja
164
PL 224 701 B1 <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 188 gttctgggtg gtcagggttg cgaatgggac ccgtggacct gccgtctgot gcagggttgg 60 <210> 189 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 189 gttctgggtg gtcagggttg ccagtgggac ccgtggacct gctcccacct ggaagacggt 60 <210> 190 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 190 accaccatcg gttccatgtg cgaatgggac ccgtggacct gcgctcacat gcagggtggt 60 <210> 191 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 191 accaaaggta aatccgtttg ccagtgggac ccgtggacct gctcccacat gcagtccggt 60 <210> 192 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 192 accaccatcg gttccatgtg ccagtgggac ccgtggacct gcgctcacat gcagggtggt 60 <210> 193 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
PL 224 701 B1
165 <223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 193 tgggttaacg aagttgtttg cgaatgggac ccgtggacct gcaaccactg ggacaccccg 60 <210> 194 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 194 gttgttcagg ttggtatgtg coagtgggao ccgtggacct gcaaacacat gogtctgcag 60 <210> 195 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 195 gctgttggtt cccagacctg cgaatgggac ccgtggacct gcgctcacot ggttgaagtt 60 <210> 196 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 196 cagggtatga aaatgttctg cgaatgggac ccgtggacct gcgctcacat cgtttaccgt 60 <210> 197 <211> 60 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 197 accaocatog gttccatgtg coagtgggao cogtggaoct gcgaacacat goagggtggt 60 <210> 198 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
166
PL 224 701 B1 <223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 198 acctcccagc gtgttggttg cgaatgggac ccgtggacct gccagcacct gacctacacc 60 <210> 199 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe e zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 199 cagtggtcct ggccgccgtg cgaatgggac ccgtggacct gccagaccgt ttggccgtcc 60 <210> 200 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 200 ggtacctccc cgtccttctg ccagtgggac ccgtggacct gctcccacat ggttcagggt 60 <210> 201 <211> 42 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 201 caggaagaat gcgaatggga cccatggact tgcgaacaca tg 42 <210> 202 <211> 66 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 202 cagaactaca aaccgctgga cgaactggac gctaccctgt acgaacactt catcttccac 60 tacacc 66 <210> 203 <211> 66 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 203
PL 224 701 B1
167 ctgaacttca ccccgctgga cgaactggaa cagaccctgt acgaacagtg gaccctgcag 60 cagtcc 66 <210> 204 <211> 66 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 204 accaaattca acccgctgga cgaactggaa cagaccctgt acgaacagtg gaccctgcag 60 caccag 66 <210> 205 <211> 66 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 205 gttaaattca aaccgctgga cgctctggaa cagaccctgt acgaacactg gatgttccag 60 caggct 66 <210> 206 <211> 66 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 206 gttaaataoa aaccgctgga cgaactggac gaaatcctgt acgaacagca gaccttccag 60 gaacgt 6 6 <210> 207 <211> 66 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 207 accaacttca tgccgatgga cgacctggaa cagcgtctgt acgaacagtt catcctgcag 60 cagggt 66 <210> 208 <211> 66 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 208 tccaaattca aaccgctgga cgaactggaa cagaccctgt acgaacagtg gaccctgcag 60 cacgct 66
168
PL 224 701 B1 <210> 209 <211> 66 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 209 cagaaattcc agccgotgga cgaactggaa cagaccctgt acgaacagtt oatgctgcag 60 caggct 66 <210> 210 <211> 66 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 210 cagaacttca aaccgatgga cgaattggaa gacaccctgt acaaacagtt cctgttocag 60 cactcc 66 <210> 211 <211> 66 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 211 tacaaattca ccocgctgga cgacctggaa cagaccctgt aogaacagtg gaccctgcag 60 cacgtt 66 <210> 212 <211> 65 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 212 aggaatacga accgctggac gaactggacg aaaccctgta caaccagtgg atgttccacc 60 agcgt 65 <210> 213 <211> 66 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 213
PL 224 701 B1
169 tccaacttca tgccgctgga cgaactggaa cagaccctgt acgaacagtt catgctgcag 60 caccag 66 <210> 214 <211> 66 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 214 cagaaatacc agccgctgga cgaactggac aaaaccctgt acgatcagtt catgctgcag 60 cagggt 66 <210> 215 <211> 66 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <22 0>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 215 cagaaattcc agccgctgga cgaactggaa gaaaccctgt acaaacagtg gaccctgcag 60 cagcgt 66 <210> 216 <211> 66 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 216 gttaaataca aaccgctgga cgaactggac gaatggctgt accaccagtt caccctgoac 60 oaccag 66 <210> 217 <211> 67 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 217 cagaaattca tgccgctgga cgaactggac gaaatcctgt acgaacagtt catgttccag 60 cagtccc 67 <210> 218 <211> 66 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
170
PL 224 701 B1 <223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 218 cagaccttcc agccgctgga cgacctggaa gaatacttgt acgaacagtg gatccgtcgt taccac <210> 219 <211> 66 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 219 gaagactaca tgccgctgga cgctctggac gotcagctgt acgaacagtt catcctgctg 60 cacggt 66 <210> 220 <211> 66 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 220 cacaccttcc agccgctgga cgaactggaa gaaaccctgt actaccagtg gctgtacgac 60 cagctg 66 <210> 221 <211> 66 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 221 tacaaattca acccgatgga cgaactggaa cagaccctgt acgaagaatt cctgttccag 60 cacgct 66 <210> 222 <211> 66 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 222 accaactaca aaocgctgga cgaactggac gctaccctgt acgaacactg gatcctgcag 60 cactco 66 <210> 223 <211> 66 <212> DNA
PL 224 701 B1
171 <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 223 cagaaattca aaccgctgga cgaactggaa cagaccctgt acgaacagtg gaccctgcag 60 cagcgt 6 6 <210> 224 <211> 66 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <22 0>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 224 accaaattcc agccgctgga cgaactggac cagaccctgt acgaacagtg gaccctgcag 60 cagcgt 66 <210> 225 <211> 66 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 225 accaacttcc agccgctgga cgaactggac cagaccctgt acgaacagtg gaccctgcag 60 cagcgt 66 <210> 226 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 226 aaattcaacc cgctggacga gctggaagag actctgtacg aacagtttac ttttcaacag 60 <210> 227 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 227 gctggtggta tgcgtccgta cgacggtatg ctgggttggc cgaactacga cgttcaggct 60 <210> 228 <211> 60
172
PL 224 701 B1 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 228 cagacttggg acgatccgtg catgcacatt ctgggtccgg ttacttggcg tcgttgcatc 60 <210> 229 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 229 gctccgggtc agcgtccgta cgacggtatg ctgggttggc cgacctacca gcgtatcgtt 60 <210> 230 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA encoding peptide capable zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 230 tccggtcagc tgcgtccgtg cgaagaaatc ttcggttgcg gtacccagaa cctggctctg 60 <210> 231 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 231 ttcggtgaca aacgtccgct ggaatgcatg ttcggtggtc cgatccagct gtgcccgcgt 60 <210> 232 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 232 ggtcaggacc tgcgtccgtg cgaagacatg ttcggttgcg gtaccaaaga ctggtacggt 60 <210> 233 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja
PL 224 701 B1
173 <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 233 ggtttcgaat actgcgacgg tatggaagac ccgttcacct tcggttgcga caaacagacc 60 <210> 234 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 234 aaactggaat actgcgacgg tatggaagac ccgttcaccc agggttgcga caaocagtcc 60 <210> 235 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 235 ctgcaggaat ggtgcgaagg tgttgaagac ccgttcacct tcggttgcga aaaacagcgt 60 <210> 236 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 236 gctcaggaot actgcgaagg tatggaagac ccgttcacct tcggttgcga aatgcagaaa 60 <210> 237 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 237 ctgctggaot actgcgaagg tgttcaggac ocgttoaoat tcggttgcga aaacctggac 60 <210> 238 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2
174
PL 224 701 B1 <400> 238 caccaggaat actgcgaagg tatggaagac ccgttcacct tcggttgcga ataccagggt 60 <210> 239 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 239 atgctggact actgcgaagg tatggacgac ccgttcacct tcggttgcga caaacagatg 60 <210> 240 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 240 otgcaggaot actgcgaagg tgttgaagac ccgttcacct tcggttgcga aaaccagcgt 60 <210> 241 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 241 otgcaggaot actgcgaagg tgttgaagac ccgttcacct tcggttgcga aaaacagcgt 60 <210> 242 <211> 54 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 242 ttcgactact gcgaaggtgt tgaagacccg ttcactttcg gctgtgataa coac 54 <210> 243 <211> 250 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> DNA kodujące ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2
PL 224 701 B1
175
<400> 243 Leu Leu 15
Met Asp 1 Lys Thr His 5 Thr Cys Pro Pro Cys 10 Pro Ala Pro Glu
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
20 25 30
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
35 40 45
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
50 55 60
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn
85 90 95
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
100 105 110
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin
115 120 125
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val
130 135 140
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
145 150 155 160
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
165 170 175
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
180 185 190
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
195 200 205
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu
210 215 220
Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly Cys Thr Ala Gly Tyr His Trp
225 230 235 240
Asn Ser Asp Cys Glu Cys Cys Arg Arg Asn
245 250
<210> 244
<211> 29
<212> DNA
<213> sztuczna sekwencja
<220>
<223> oligonukleotyd
<400> 244
caaacgaatg gatcctcatt aaagccaga
176
PL 224 701 B1 <210> 245 <211> 42 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> oligonukleotyd <400> 245 ggtggtgcgg ccgcactcga gactgttgaa agttgtttag ca <210> 246 <211> 29 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <22 0>
<223> oligonukleotyd <400> 246 caaacgaatg gatcctcatt aaagccaga <210> 247 <211> 43 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <22 0>
<223> oligonukleotyd <400> 247 aacacaaaag tgcacagggt ggaggtggtg gtgcggccgc act <210> 248 <211> 91 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> oligonukleotyd <400> 248
Cys Ala Cys Ala Gly Thr Gly Cys Ala Cys Ala Gly Gly Gly Thr Asn
Asn Lys Asn Asn Lys Asn Asn Lys Asn Asn Lys Asn Asn Lys Asn Asn
Lys Asn Asn Lys Ser Ala Arg Thr Gly Gly Gly Ala Thr Cys Cys Gly
Thr Gly Gly Ala Ser Cys Asn Asn Lys Asn Asn Lys Asn Asn Lys Asn
Asn Lys Asn Asn Lys Asn Asn Lys Asn Asn Lys Cys Ala Thr Thr Cys
Thr Cys Thr Cys Gly Ala Gly Ala Thr Cys Ala
PL 224 701 B1
177 <210> 249 <211> 91 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> oligonukleotyd <400> 249
Cys Ala Cys Ala Gly Thr Gly Cys Ala Cys Ala Gly Gly Gly Thr Asn 15 10 15
Asn Lys Asn Asn Lys Asn Asn Lys Ala Ala Lys Cys Gly Lys Cys Cys 20 25 30
Lys Asn Asn Lys Gly Ala Lys Gly Ala Lys Ala Thr Lys Thr Thr Lys 35 40 45
Gly Gly Lys Gly Gly Lys Asn Asn Lys Ala Cys Lys Thr Ala Lys Cys 50 55 60
Ala Lys Asn Asn Lys Asn Asn Lys Asn Asn Lys Cys Ala Thr Thr Cys 65 70 75 80
Thr Cys Thr Cys Gly Ala Gly Ala Thr Cys Ala 85 90 <210> 250 <211> 95 <212> RT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> oligonukleotyd <400> 250
Cys Ala Cys Ala Gly Thr Gly Cys Ala Cys Ala Gly Gly Gly Thr Asn 15 10 15
Asn Lys Ala Ala Lys Thr Thr Lys Ala Ala Lys Cys Cys Lys Cys Thr 20 25 30
Lys Gly Ala Lys Gly Ala Lys Cys Thr Lys Gly Ala Lys Gly Ala Lys 35 40 45
Ala Cys Lys Cys Thr Lys Thr Ala Lys Gly Ala Lys Cys Ala Lys Thr 50 55 60
Thr Lys Ala Cys Lys Thr Thr Lys Cys Ala Lys Cys Ala Lys Asn Asn 65 70 75 80
Lys Cys Ala Thr Thr Cys Thr Cys Thr Cys Gly Ala Gly Ala Thr 85 90 95 <210> 251 <211> 91
178
PL 224 701 B1 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> oligonukleotyd <400> 251 Cys Ala Cys Ala Gly Thr Gly Cys Ala Cys Al*a Gly Gly Gly Thr Asn
1 5 10 15
Asn Lys Asn Asn Lys Asn Asn Lys Cys Ala Lys Gly Ala Lys Gly Ala
20 25 30
Lys Thr Gly Cys Gly Ala Lys Thr Gly Lys Gly Ala Lys Cys Cys Lys
35 40 45
Thr Gly Lys Ala Cys Lys Thr Gly Cys Gly Ala Lys Cys Ala Lys Ala
50 55 60
Thr Lys Asn Asn Lys Asn Asn Lys Asn Asn Lys Cys Ala Thr Thr Cys
65 70 75 80
Thr Cys Thr Cys Gly Ala Gly Ala Thr Cys Ala
90 <210> 252 <211> 89 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja
<220> <223> oligonukleotyd
<400> 252 Cys Ala Cys Ala Gly Thr Gly Cys Ala Cys Ala Gly Gly Gly Thr Asn
1 5 10 15
Asn Lys Thr Thr Lys 20 Gly Ala Lys Thr Ala 25 Lys Asn Asn Lys Gly Ala 30
Lys Gly Gly 35 Lys Gly Thr Lys Gly 40 Ala Lys Gly Ala Lys Cys Cys Lys 45
Thr Thr Lys 50 Ala Cys Lys Thr Thr 55 Lys Gly Gly Lys Asn Asn Lys Gly 60
Ala Lys Ala Ala Lys Cys Ala Lys Asn Asn Lys Cys Ala Thr Thr Cys
65 70 75 80
Thr Cys Thr Cys Gly Ala Gly Ala Thr 85 <210> 253 <211> 95 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
PL 224 701 B1
179 <223> oligonukleotyd <400> 253
Cys 1 Ala Cys Ala Gly 5 Thr Gly Cys Ala Cys 10 Ala Gly Gly Gly Thr 15 Asn
Asn Lys Ala Ala 20 Lys Thr Thr Lys Ala 25 Ala Lys Cys Cys Lys 30 Cys Thr
Lys Gly Ala 35 Lys Gly Ala Lys Cys 40 Thr Lys Gly Ala Lys 45 Gly Ala Lys
Ala Cys 50 Lys Cys Thr Lys Thr 55 Ala Lys Gly Ala Lys 60 Cys Ala Lys Thr
Thr 65 Lys Ala Cys Lys Thr 70 ihr Lys Cys Ala Lys 75 Cys Ala Lys Asn Asn 80
Lys Cys Ala Thr Thr 85 Cys Thr Cys Thr Cys 90 Gly Ala Gly Ala Thr 95
<210> 254 <211> 15 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> oligonukleotyd <400> 254 cacagtgcac agggt 15 <210> 255 <211> 16 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> oligonukleotyd <400> 255 tgatctcgag agaatg 16 <210> 256 <211> 21 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> oligonukleotyd <400> 256 gttagctcac tcattaggoa c 21 <210> 257 <211> 21 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <22 0>
<223> oligonukleotyd
180
PL 224 701 B1 <400> 257 gtaccgtaac actgagtttc g 21 <210> 258 <211> 18 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> oligonukleotyd <400> 258 ttacacttta tgcttccg 18 <210> 259 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 259
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Pro Ile Arg Gin Glu Glu Cys 15 10 15
Asp Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Trp Glu Val Leu Glu 20 25 30 <210> 260 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 260
Met 1 Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Thr Asn Ile Gin Glu Glu Cys 15
5 10
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Asp His Met Pro Gly Lys Leu Glu
20 25 30
<210> 261 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja
PL 224 701 B1
181 <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 261
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Trp Tyr Glu Gin Asp Ala Cys
1 5 10 15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Ala Glu Val Leu Glu
25 30 <210> 262 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 262
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Asn Arg Leu Gin Glu Val Cys
1 5 10 15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Glu Asn Val Leu Glu
25 30 <210> 263 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 263
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Ala Ala Thr Gin Glu Glu Cys
1 5 10 15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Pro Arg Ser Leu Glu
25 30 <210> 264 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
182
PL 224 701 B1 <223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 264
Met 1 Xaa Gly Gly Gly 5 Gly Gly Ala Gin Leu Arg 10 His Gin Glu Gly 15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Phe Asp Trp Leu Glu
<210> 265 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha
<222> <223> (2) . . Xaa = (2) Fc
<400> 265
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Val Pro Arg Gin Lys Asp Cys
1 5 10 15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Tyr Val Gly Leu Glu
20 25 30
<210> 266 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 266
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Ser Ile Ser His Glu Glu
1 5 10 15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Gin Val Gly Leu Glu
<210> 267 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
PL 224 701 B1
183 <223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 267
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Trp Ala Ala Gin Glu Glu Cys
1 5 10 15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Gly Arg Met Leu Glu
25 30 <210> 268 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 268
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Thr Trp Pro Gin Asp Lys Cys
1 5 10 15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Gly Ser Thr Leu Glu
25 30 <210> 269 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 269
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Gly His Ser Gin Glu Glu Cys
1 5 10 15
Gly Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Gly Thr Ser Leu Glu
25 30 <210> 270 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
184
PL 224 701 B1
<223> ciało peptydowe zdolne do <220> <221> inna cecha wiązania z Ang-2
<222> <223> (2) . . Xaa = (2) Fc
<400> 270
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Gln His Trp Gln Glu Glu Cys
1 5 10 15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Asp His Met Pro Ser Lys Leu Glu
20 25 30
<210> 271
<211> 31
<212> PRT
<213> sztuczna sekwencja
<220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-22
<22 0>
<221> inna cecha
<222> (2) . . (2)
<223> Xaa = Fc <400> 271
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Asn Val Arg Gln Glu Lys Cys 15 10 15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Pro Val Arg Leu Glu 20 25 30 <210> 272 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 272
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Lys Ser Gly Gln Val Glu
1 5 10 15
Asn Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Pro Arg Asn Leu Glu
20 25 30
<210> 273 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2
PL 224 701 B1
185 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 273
Met 1 Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Val Lys Thr Gin Glu His Cys 15
5 10
Asp Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Arg Glu Trp Leu Glu
20 25 30
<210> 274 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 274
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Ala Trp Gly Gin Glu Gly Cys
1 5 10 15
Asp Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Leu Pro Met Leu Glu
25 30 <210> 275 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 275
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Pro Val Asn Gin Glu Asp Cys
1 5 10 15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Pro Pro Met Leu Glu
25 30 <210> 276 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2
186
PL 224 701 B1 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 276
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Arg Ala Pro Gin Glu Asp Cys
1 5 10 15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ala His Met Asp Ile Lys Leu Glu
20 25 30
<210> 277 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 277
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin His Gly Gin Asn Met Glu Cys
1 5 10 15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Phe Arg Tyr Leu Glu
25 30 <210> 278 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 278
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Pro Arg Leu Gin Glu Glu Cys
1 5 10 15
Val Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Pro Leu Arg Leu Glu
25 30 <210> 279 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
PL 224 701 B1
187 <221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 279
Met 1 Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Arg Thr Thr Gin Glu Lys Cys
5 10 15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Glu Ser Gin Leu Glu
20 25 30
<210> 280 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2).. (2) <223> Xaa = Fc <400> 280
Met 1 Xaa Gly Gly Gly 5 Gly Gly Ala Gin Gin 10 Thr Ser Gin Glu Asp Cys 15
Val Trp Asp Pro Trp Thr Cys Asp His Met Val Ser Ser Leu Glu
25 30 <210> 281 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2) .. (2) <223> Xaa = Fc <400> 281
Met 1 Xaa Gly Gly Gly 5 Gly Gly Ala Gin Gin 10 Val Ile Gly Arg Pro Cys 15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Leu Glu Gly Leu Leu Glu
25 30 <210> 282 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2
188
PL 224 701 B1 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 282
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Trp Ala Gin Gin Glu Glu Cys
1 5 10 15
Ala Trp Asp Pro Trp Thr Cys Asp His Met Val Gly Leu Leu Glu
25 30 <210> 283 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 283
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Leu Pro Gly Gin Glu Asp Cys
1 5 10 15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Val Arg Ser Leu Glu
25 30 <210> 284 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 284
Met 1 Xaa Gly Gly Gly 5 Gly Gly Ala Gin Pro 10 Met Asn Gin Val Glu Cys 15
Asp Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Pro Arg Ser Leu Glu
25 30 <210> 285 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja
PL 224 701 B1
189 <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 285
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Phe Gly Trp Ser His Gly Cys
1 5 10 15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Gly Ser Thr Leu Glu
25 30 <210> 286 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 286
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Lys Ser Thr Gin Asp Asp Cys
1 5 10 15
Asp Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Val Gly Pro Leu Glu
25 30 <210> 287 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2) . . (2) <223> Xaa = Fc <400> 287
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Gly Pro Arg Ile Ser Thr Cys 15
1 5 10
Gin Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Asp Gin Leu Leu Glu
20 25 30
<210> 288 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja
190
PL 224 701 B1 <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 288
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Ser Thr Ile Gly Asp Met Cys
1 5 10 15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ala His Met Gln Val Asp Leu Glu
25 30 <210> 289 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 289
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Val Leu Gly Gly Gln Gly Cys 15 10 15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Arg Leu Leu Gln Gly Trp Leu Glu 20 25 30 <210> 290 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 290
Met 1 Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Val Leu Gly Gly Gln Gly Cys 15
5 10
Gln Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ser His Leu Glu Asp Gly Leu Glu
20 25 30
<210> 291 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja
PL 224 701 B1
191 <220 <223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220 <221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400 291
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Thr Thr Ile Gly Ser Met Cys
1 5 10 15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ala His Met Gin Gly Gly Leu Glu
20 25 30
<210 292 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220 <223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220 <221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 292
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Thr Lys Gly Lys Ser Val Cys
1 5 10 15
Gin Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ser His Met Gin Ser Gly Leu Glu
25 30 <210> 293 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 293
Met 1 Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Thr Thr Ile Gly Ser Met Cys 15
5 10
Gin Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ala His Met Gin Gly Gly Leu Glu
20 25 30
<210> 294 <211> 31 <212> PRT
192
PL 224 701 B1 <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 294
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Trp Val Asn Glu Val Val Cys
1 5 10 15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Asn His Trp Asp Thr Pro Leu Glu
25 30 <210> 295 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 295
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Val Val Gin Val Gly Met Cys
1 5 10 15
Gin Trp Asp Pro Trp Thr Cys Lys His Met Arg Leu Gin Leu Glu
25 30 <210> 296 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 296
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Ala Val Gly Ser Gin Thr Cys
1 5 10 15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ala His Leu Val Glu Val Leu Glu
25 30
PL 224 701 B1
193 <210> 297 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 297
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Gin Gly Met Lys Met Phe Cys
1 5 10 15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ala His Ile Val Tyr Arg Leu Glu
25 30 <210> 298 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 298
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Thr Thr Ile Gly Ser Met Cys
1 5 10 15
Gin Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Gin Gly Gly Leu Glu
25 30 <210> 299 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 299
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Thr Ser Gin Arg Val Gly Cys
1 5 10 15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Gin His Leu Thr Tyr Thr Leu Glu
25 30
194
PL 224 701 B1 <210> 300 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <22 0>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z' Ang-2 <22 0>
<221> inna cecha <222> (2) .. (2) <223> Xaa = Fc <400> 300
Met 1 Xaa Gly Gly Gly 5 Gly Gły Ala Gin Gin 10 Trp Ser Trp Pro Pro Cys 15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Gin Thr Val Trp Pro Ser Leu Glu
25 30 <210> 301 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc
<400> 301
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Gly Thr Ser Pro Ser Phe
1 5 10 15
Gin Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ser His Met Val Gin Gly Leu Glu
25 30 <210> 302 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 302
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Thr Gin Gly Leu His Gin
1 5 10 15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Lys Val Leu Trp Pro Ser Leu Glu
20 25 30
PL 224 701 B1
195 <210> 303 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 303
Met 1 Xaa Gly Gly Gly 5 Gly Gly Ala Gln Val 10 Trp Arg Ser Gln Val Cys 15
Gln Trp Asp Pro Trp Thr Cys Asn Leu Gly Gly Asp Trp Leu Glu
25 30 <210> 304 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 304
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Asp Lys Ile Leu Glu Glu Cys 15 10 15
Gln Trp Asp Pro Trp Thr Cys Gln Phe Phe Tyr Gly Ala Leu Glu 20 25 30 <210> 305 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 305
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Ala Thr Phe Ala Arg Gln Cys 15 10 15
196
PL 224 701 B1
Gin Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ala Leu Gly Gly Asn Trp Leu Glu 20 25 30 <210> 306 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 306
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Gly Pro Ala Gin Glu Glu Cys 15 10 15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu Pro Leu Pro Leu Met Leu Glu 20 25 30 <210> 307 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 307
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Arg Pro Glu Asp Met Cys Ser 15 10 15
Gin Trp Asp Pro Trp Thr Trp His Leu Gin Gly Tyr Cys Leu Glu 20 25 30 <210> 308 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc
PL 224 701 B1
197 <400> 308
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Leu Trp Gin Leu Ala Val Cys
1 5 10 15
Gin Trp Asp Pro Gin Thr Cys Asp His Met Gly Ala Leu Leu Glu
25 30 <210> 309 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 309
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Thr Gin Leu Val Ser Leu Cys
1 5 10 15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Arg Leu Leu Asp Gly Trp Leu Glu
25 30 <210> 310 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 310
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Met Gly Gly Ala Gly Arg Cys 15 10 15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Gin Leu Leu Gin Gly Trp Leu Glu 20 25 30 <210> 311 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha
198
PL 224 701 B1 <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 311
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Met Phe Leu Pro Asn Glu Cys
1 5 10 15
Gin Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ser Asn Leu Pro Glu Ala Leu Glu
25 30 <210> 312 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fo <400> 312
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Phe Gly Trp Ser His Gly Cys
1 5 10 15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Arg Leu Leu Gin Gly Trp Leu Glu
25 30 <210> 313 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 313
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Trp Pro Gin Thr Glu Gly Cys
1 5 10 15
Gin Trp Asp Pro Trp Thr Cys Arg Leu Leu His Gly Trp Leu Glu
25 30 <210> 314 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2)
PL 224 701 B1
199 <223> Xaa = Fc <400> 314
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Pro Asp Thr Arg Gin Gly Cys
1 5 10 15
Gin Trp Asp Pro Trp Thr Cys Arg Leu Tyr Gly Met Trp Leu Glu
25 30 <210> 315 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2). . (2) <223> Xaa = Fc <400> 315
Met Xaa Gly 1 Gly Gly Gly Gly Ala Gin Thr Trp Pro Gin Asp Lys Cys
5 10 15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Arg Leu Leu Gin Gly Trp Leu Glu
20 25 30
<210> 316 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 316
Met 1 Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Asp Lys Ile Leu Glu Glu Cys 15
5 10
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Arg Leu Leu Gin Gly Trp Leu Glu
20 25 30
<210> 317 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc
200
PL 224 701 B1 <400> 317
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Ala Ala Thr Gln Glu Glu Cys
1 5 10 15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Arg Leu Leu Gln Gly Trp Leu Glu
25 30 <210> 318 <211> 34 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (34)..(34) <223> Xaa = Fc <400> 318
Met 1 Gly Ala Gln Thr 5 Asn Phe Met Pro Met 10 Asp Asp Leu Glu Gln 15 Arg
Leu Tyr Glu Gln Phe Ile Leu Gln Gln Gly Leu Glu Gly Gly Gly Gly
25 30
Gly Xaa <210> 319 <211> 34 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (34)..(34) <223> Xaa = Fc <400> 319
Met 1 Gly Ala Gln Thr 5 Asn Tyr Lys Pro Leu 10 Asp Glu Leu Asp Ala 15 Thr
Leu Tyr Glu His Trp Ile Leu Gln His Ser Leu Glu Gly Gly Gly Gly
25 30
Gly Xaa
<210> 320
<211> 34
<212> PRT
<213> sztuczna sekwencja
<220>
PL 224 701 B1
201 <223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (34) . . (34) <223> Xaa = Fc <400> 320
Met 1 Gly Ala Gin Gin 5 Lys Tyr Gin Pro Leu 10 Asp Glu Leu Asp Lys 15 Thr
Leu Tyr Asp Gin Phe Met Leu Gin Gin Gly Leu Glu Gly Gly Gly Gly
25 30
Gly Xaa <210> 321 <211> 34 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (34)..(34) <223> Xaa = Fo <400> 321
Met 1 Gly Ala Gin Leu 5 Asn Phe Thr Pro Leu 10 Asp Glu Leu Glu Gin 15 Thr
Leu Tyr Glu Gin Trp Thr Leu Gin Gin Ser Leu Glu Gly Gly Gly Gly
25 30
Gly Xaa <210> 322 <211> 34 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (34)..(34) <223> Xaa = Fc <400> 322
Met 1 Gly Ala Gin Gin 5 Lys Phe Gin Pro Leu 10 Asp Glu Leu Glu Gin 15 Thr
Leu Tyr Glu Gin Phe Met Leu Gin Gin Ala Leu Glu Gly Gly Gly Gly
25 30
Gly Xaa
202
PL 224 701 B1 <210> 323 <211> 34 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (34)..(34) <223> Xaa = Fc <400> 323
Met Gly Ala Gin Gin Glu Tyr Glu Pro Leu Asp Glu Leu Asp Glu Thr 15 10 15
Leu Tyr Asn Gin Trp Met Phe His Gin Arg Leu Glu Gly Gly Gly Gly 20 25 30
Gly Xaa <210> 324 <211> 34 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (34)..(34) <223> Xaa = Fc <400> 324
Met Gly Ala Gin Val Lys Tyr Lys Pro Leu Asp Glu Leu Asp Glu Ile 15 10 15
Leu Tyr Glu Gin Gin Thr Phe Gin Glu Arg Leu Glu Gly Gly Gly Gly 20 25 30
Gly Xaa <210> 325 <211> 34 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (34)..(34) <223> Xaa = Fc
PL 224 701 B1
203 <400> 325
Met 1 Gly Ala Gin Thr 5 Lys Phe Gin Pro Leu 10 Asp Glu Leu Asp Gin 15 Thr
Leu Tyr Glu Gin Trp Thr Leu Gin Gin Arg Leu Glu Gly Gly Gly Gly
25 30
Gly Xaa <210> 326 <211> 34 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (34)..(34) <223> Xaa = Fc <400> 326
Met Gly Ala Gin Thr Asn Phe Gin Pro Leu Asp Glu Leu Asp Gin Thr
1 5 10 15
Leu Tyr Glu Gin Trp Thr Leu Gin Gin Arg Leu Glu Gly Gly Gly Gly
25 30
Gly Xaa <210> 327 <211> 34 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (34)..(34) <223> Xaa = Fc <220>
<221> 'inna cecha <222> (34)..(34) <223> Xaa = Fc <400> 327
Met 1 Gly Ala Gin Gin 5 Asn Phe Lys Pro Met Asp 10 Glu Leu Glu Asp 15
Leu Tyr Lys Gin Phe Leu Phe Gin His Ser Leu Glu Gly Gly Gly
25 30
Thr
Gly
Gly Xaa <210> 328
204
PL 224 701 B1 <211> 34 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (34)..(34) <223> Xaa = Fc <400> 328
Met 1 Gly Ala Gin Val Lys 5 Tyr Lys Pro Leu Asp Glu Leu Asp Glu Trp
10 15
Leu Tyr His Gin Phe Thr Leu His His Gin Leu Glu Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Xaa <210> 329 <211> 34 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (34)..(34)
<223> Xaa = Fc
<400> 329 Met Gly Ala 1 Gin Tyr 5 Lys Phe Thr Pro Leu 10 Asp Asp Leu Glu Gin 15 Thr
Leu Tyr Glu Gin 20 Trp Thr Leu Gin His 25 Val Leu Glu Gly Gly 30 Gly Gly
Gly Xaa
<210> 330 <211> 34 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (34)..(34) <223> Xaa = Fc <400> 330
Met Gly Ala Gin Gin Asn Tyr Lys Pro Leu Asp Glu Leu Asp Ala Thr 15 10 15
PL 224 701 B1
205
Leu Tyr Glu His Phe Ile Phe His Tyr Thr Leu Glu Gly Gly Gly Gly 20 25 30
Gly Xaa <210> 331 <211> 34 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (34)..(34)
<223> Xaa = Fc
<400> 331
Met Gly Ala Gln Val Lys Phe Lys Pro Leu Asp Ala Leu Glu Gln Thr
1 5 10 15
Leu Tyr Glu His Trp Met Phe Gln Gln Ala Leu Glu Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Xaa <210> 332 <211> 34 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> oiało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (34) . . (34) <223> Xaa = Fo
<400> 332
Met Gly Ala Gln Glu Asp Tyr Met Pro Leu Asp Ala Leu Asp Ala Gln
1 5 10 15
Leu Tyr Glu Gln Phe Ile Leu Leu His Gly Leu Glu Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Xaa <210> 333 <211> 34 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (34) . . (34) <223> Xaa = Fo
206
PL 224 701 B1 <400> 333
Met Gly Ala Gin Tyr Lys Phe Asn Pro Met Asp Glu Leu Glu Gin Thr
1 5 10 15
Leu Tyr Glu Glu Phe Leu Phe Gin His Ala Leu Glu Gly Gly Gly Gly
25 30
Gly Xaa <210> 334 <211> 34 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (34)..(34) <223> Xaa = Fc <400> 334
Met 1 Gly Ala Gin Ser 5 Asn Phe Met Pro Leu 10 Asp Glu Leu Glu Gin 15 Thr
Leu Tyr Glu Gin Phe Met Leu Gin His Gin Leu Glu Gly Gly Gly Gly
25 30
Gly Xaa <210> 335 <211> 34 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (34)..(34) <223> Xaa = Fc <400> 335
Met 1 Gly Ala Gin Gin 5 Lys Phe Gin Pro Leu 10 Asp Glu Leu Glu Glu 15 Thr
Leu Tyr Lys Gin Trp Thr Leu Gin Gin Arg Leu Glu Gly Gly Gly Gly
25 30
Gly Xaa
<210> 336
<211> 34
<212> PRT
<213> sztuczna sekwencja
<220>
PL 224 701 B1
207 <22 3> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (34)..(34) <223> Xaa = Fc <400> 336
Met Gly Ala Gin Gin Lys Phe Met Pro Leu Asp Glu Leu Asp Glu Ile
1 5 10 15
Leu Tyr Glu Gin Phe Met Phe Gin Gin Ser Leu Glu Gly Gly Gly Gly
25 30
Gly Xaa <210> 337 <211> 34 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (34)..(34) <223> Xaa = Fc <400> 337
Met 1 Gly Ala Gin Thr 5 Lys Phe Asn Pro Leu 10 Asp Glu Leu Glu Gin 15 Thr
Leu Tyr Glu Gin Trp Thr Leu Gin His Gin Leu Glu Gly Gly Gly Gly
25 30
Gly Xaa <210> 338 <211> 34 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (34)..(34) <223> Xaa = Fc <400> 338
Met 1 Gly Ala Gin His 5 Thr Phe Gin Pro Leu 10 Asp Glu Leu Glu Glu 15 Thr
Leu Tyr Tyr Gin Trp Leu Tyr Asp Gin Leu Leu Glu Gly Gly Gly Gly
25 30
Gly Xaa
208
PL 224 701 B1 <210> 339 <211> 34 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (34)..(34) <223> Xaa = Fc <400> 339
Met 1 Gly Ala Gin Gin 5 Lys Phe Lys Pro Leu 10 Asp Glu Leu Glu Gin 15 Thr
Leu Tyr Glu Gin Trp Thr Leu Gin Gin Arg Leu Glu Gly Gly Gly Gly
25 30
Gly Xaa <210> 340 <211> 34 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (34)..(34) <223> Xaa = Fc <400> 340
Met 1 Gly Ala Gin Gin 5 Thr Phe Gin Pro Leu 10 Asp Asp Leu Glu Glu 15 Tyr
Leu Tyr Glu Gin Trp Ile Arg Arg Tyr His Leu Glu Gly Gly Gly Gly
25 30
Gly Xaa <210> 341 <211> 34 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (34)..(34) <223> Xaa = Fc <400> 341
Met Gly Ala Gin Ser Lys Phe Lys Pro Leu Asp Glu Leu Glu Gin Thr 15 10 15
PL 224 701 B1
209
Leu Tyr Glu Gin Trp Thr Leu Gin His Ala Leu Glu Gly Gly Gly Gly 20 25 30
Gly Xaa <210> 342 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 342
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Ser Gly Gin Leu Arg Pro Cys
1 5 10 15
Glu Glu Ile Phe Gly Cys Gly Thr Gin Asn Leu Ala Leu Leu Glu
20 25 30
<210> 343 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fo <400> 343
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Ala Gly Gly Met Arg Pro Tyr 15 10 15
Asp Gly Met Leu Gly Trp Pro Asn Tyr Asp Val Gin Ala Leu Glu 20 25 30 <210> 344 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha
210
PL 224 701 B1 <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 344
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Gly Gin Asp Leu Arg Pro Cys 15 10 15
Glu Asp Met Phe Gly Cys Gly Thr Lys Asp Trp Tyr Gly Leu Glu 20 25 30 <210> 345 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 345
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Ala Pro Gly Gin Arg Pro Tyr
1 5 10 15
Asp Gly Met Leu Gly Trp Pro Thr Tyr Gin Arg Ile Val Leu Glu
25 30 <210> 346 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 346
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Gin Thr Trp Asp Asp Pro Cys
1 5 10 15
Met His Ile Leu Gly Pro Val Thr Trp Arg Arg Cys Ile Leu Glu
25 30 <210> 347 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
PL 224 701 B1
211
<221> inna cecha
<222> (2).. <223> Xaa = (2) Fc
<400> 347 Met Xaa Gly 1 Gly Gly Gly 5 Gly Ala Gin Phe 10 Gly Asp Lys Arg Pro 15
Glu Cys Met Phe 20 Gly Gly Pro Ile Gin 25 Leu Cys Pro Arg Leu 30 Glu
<210> 348 <211> 25 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 348
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Lys Arg Pro Cys Glu Glu Ile 15 10 15
Phe Gly Gly Cys Thr Tyr Gin Leu Glu 20 25 <210> 349 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 349
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Leu Gin Glu Trp Cys Glu Gly
1 5 10 15
Val Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys Glu Lys Gin Arg Leu Glu
20 25 30
<210> 350 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2
212
PL 224 701 B1 <220>
<221> inna cecha <222> (2). . (2) <223> Xaa = Fc <400> 350
Met 1 Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Met Leu Asp Tyr Cys Glu Gly
5 10 15
Met Asp Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys Asp Lys Gin Met Leu Glu
20 25 30
<210> 351 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 351
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin His Gin Glu Tyr Cys Glu Gly
1 5 10 15
Met Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys Glu Tyr Gin Gly Leu Glu
25 30 <210> 352 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2). . (2) <223> Xaa = Fc <400> 352
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Leu Gin Asp Tyr Cys Glu Gly
1 5 10 15
Val Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys Glu Asn Gin Arg Leu Glu
25 30 <210> 353 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2
PL 224 701 B1
213 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 353
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Leu Leu Asp Tyr Cys Glu Gly
1 5 10 15
Val Gln Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys Glu Asn Leu Asp Leu Glu
25 30 <210> 354 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 354
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Gly Phe Glu Tyr Cys Asp Gly
1 5 10 15
Met Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys Asp Lys Gln Thr Leu Glu
25 30 <210> 355 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 355
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Ala Gln Asp Tyr Cys Glu Gly
1 5 10 15
Met Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys Glu Met Gln Lys Leu Glu
25 30 <210> 356 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
214
PL 224 701 B1 <223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 356
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Leu Gin Asp Tyr Cys Glu Gly 15 10 15
Val Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys Glu Lys Gin Arg Leu Glu 20 25 30 <210> 357 <211> 31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 357
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Lys Leu Glu Tyr Cys Asp Gly
1 5 10 15
Met Glu Asp Pro Phe Thr Gin Gly Cys Asp Asn Gin Ser Leu Glu
25 30 <210> 358 <211> 29 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> ciało peptydowe zdolne do wiązania z Ang-2 <220>
<221> inna cecha <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 358
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Phe Asp 10 Tyr Cys Glu Gly Val 15
1 5
Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys Asp Asn His Leu Glu
20 25
<210> 359 <211> 32 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja
PL 224 701 B1
215 <220>
<223> ciało polipeptydowa zdolne do wiązania z Ang-2 <400> 359
Cys Gły Gly Gly Gly Gly Ala Gin Thr Asn Phe Met Pro Met Asp Asp 15 10 15
Leu Glu Gin Arg Leu Tyr Glu Gin Phe Ile Leu Gin Gin Gly Leu Glu 20 25 30

Claims (43)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Polipeptyd, znamienny tym, że zawiera sekwencję aminokwasową wybraną z grupy, którą stanowią sekwencje SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oraz SEQ ID NO: 76 do SEQ ID NO: 118 włącznie, który to polipeptyd jest zdolny do wiązania z Ang-2, oraz jego fizjologicznie akceptowalne sole.
  2. 2. Polipeptyd fuzyjny, znamienny tym, że zawiera polipeptyd według zastrz. 1 oraz podłoże, który to polipeptyd fuzyjny jest zdolny do wiązania z Ang-2, oraz jego fizjologicznie akceptowalne sole.
  3. 3. Polipeptyd fuzyjny według zastrz. 2, znamienny tym, że wskazane podłoże jest wybrane z grupy, którą tworzą: domena Fc, glikol polietylenowy, lipid, grupa cholesterolowa, węglowodan oraz oligosacharyd.
  4. 4. Polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że jest polipeptydem cyklicznym.
  5. 5. Polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że jest dimerem lub multimerem tego polipeptydu.
  6. 6. Związek o wzorze:
    (X1)a-F1-(X2)b oraz jego multimery, gdzie:
    F1 oznacza podłoże, które to podłoże jest domeną Fc, glikolem polietylenowym, lipidem, grupą cholesterolową, węglowodanem lub oligosacharydem;
    1 2
    X oraz X - każdy niezależnie, jest wybrany z grupy obejmującej -(L1)c-P1;
    -(L1)c-P1-(L2)d-P2;
    -(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3; oraz -(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)fP4;
    gdzie jeden lub więcej niż jeden spośród P1, P2, P3 oraz P4 - każdy niezależnie, zawiera polipeptyd wybrany z grupy obejmującej sekwencje SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oraz SEQ ID NO: 76 do SEQ ID NO: 118 włącznie,
    L1, L2, L3 oraz L4 - każdy niezależnie, jest linkerem; oraz a, b, c, d, e oraz f - każdy niezależnie, oznacza 0 lub 1, z takim zastrzeżeniem, że co najmniej jeden spośród a oraz b oznacza 1;
    oraz jego fizjologicznie akceptowalne sole.
  7. 7. Związek według zastrz. 6, o wzorze:
    X1-F1 lub F1-X2 oraz jego fizjologicznie dopuszczalne sole.
  8. 8. Związek według zastrz. 6, o wzorze:
    F1-(L1)c-P1 oraz jego fizjologicznie akceptowalne sole.
  9. 9. Związek według zastrz. 6, o wzorze:
    F1-(L1)c-P1-(L2)d-P2 oraz jego fizjologicznie akceptowalne sole.
  10. 10. Związek według zastrz. 6, o wzorze:
    P1-(L1)c-F1-(L2)d-P2 oraz jej fizjologicznie akceptowalne sole.
    1
  11. 11. Związek według zastrz. 6, znamienny tym, że F1 oznacza domenę Fc lub jej fragment.
    216
    PL 224 701 B1
  12. 12. Związek według zastrz. 6, znamienny tym, że F zawiera sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 60.
  13. 13. Polinukleotyd, znamienny tym, że koduje polipeptyd według zastrz. 1.
  14. 14. Wektor ekspresji, znamienny tym, że zawiera polinukleotyd według zastrz. 13.
  15. 15. Komórka gospodarza, znamienna tym, że zawiera wektor ekspresji według zastrz. 14.
  16. 16. Komórka gospodarza według zastrz. 15, znamienna tym, że komórka ta jest komórką prokariotyczną lub komórką eukariotyczną.
  17. 17. Komórka gospodarza według zastrz. 16, znamienna tym, że wskazana komórka prokariotyczna jest komórką E. coli.
  18. 18. Polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że jest wybrany z grupy, którą tworzą sekwencje: SEQ ID NO: 2 oraz SEQ ID NO: 4.
  19. 19. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera skuteczną ilość polipeptydu według zastrz. 1 w mieszaninie z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.
  20. 20. Polipeptyd według zastrz. 2 albo 6, znamienny tym, że jest stosowany w sposobie leczenia angiogenezy, u pacjenta.
  21. 21. Polipeptyd według zastrz. 20, znamienny tym, że jest stosowany w sposobie inhibitowania niepożądanej angiogenezy, u ssaka.
  22. 22. Polipeptyd według zastrz. 20, znamienny tym, że jest stosowany w sposobie modulowania angiogenezy, u ssaka.
  23. 23. Polipeptyd według zastrz. 20, znamienny tym, że jest stosowany w sposobie inhibitowania wzrostu guza nowotworowego, przejawiającego niepożądaną angiogenezę, u ssaka.
  24. 24. Kompozycja, znamienna tym, że zawiera polipeptyd według zastrz. 2 albo 6 oraz środek chemoterapeutyczny, do stosowania w sposobie leczenia raka, u ssaka.
  25. 25. Polipeptyd oraz chemoterapeutyczny środek według zastrz. 24, znamienny tym, że wskazany środek chemoterapeutyczny jest wybrany z grupy, którą tworzą: fluorouracyl, kamptotecyna oraz docetaksel w postaci trójwodzianu.
  26. 26. Polipeptyd według zastrz. 2 albo 6, znamienny tym, że jest stosowany w sposobie modulowania co najmniej jednego spośród następujących stanów: nieszczelności naczyniowej lub wycieku osocza, u ssaka.
  27. 27. Polipeptyd według zastrz. 2 albo 6, znamienny tym, że jest stosowany w sposobie leczenia co najmniej jednego spośród następujących stanów: choroby neo-unaczynienia gałki ocznej, otyłości, naczyniaka niedojrzałego, naczyniaka jamistego, stwardnienia tętnic, zapalenia, stanów zapalnych, miażdżycy naczyń, endometriozy (gruczolistości), choroby nowotworowej, chorób kości lub łuszczycy, u ssaka.
  28. 28. Polipeptyd zdolny do wiązania z Ang-2, znamienny tym, że zawiera sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO: 25), oraz jego fizjologicznie akceptowalne sole.
  29. 29. Polipeptyd według zastrz. 28, znamienny tym, że sekwencja aminokwasowa domeny Fc w sekwencji SEQ ID NO: 25 jest sekwencją SEQ ID NO: 60.
  30. 30. Polinukleotyd, znamienny tym, że koduje polipeptyd według dowolnego spośród zastrz. 28-29.
  31. 31. Polinukleotyd według zastrz. 30, znamienny tym, że zawiera sekwencję SEQ ID NO: 46.
  32. 32. Wektor ekspresji, znamienny tym, że zawiera polinukleotyd według zastrz. 30 albo 31.
  33. 33. Komórka gospodarza, znamienna tym, że zawiera wektor ekspresji według zastrz 32.
  34. 34. Komórka gospodarza według zastrz. 33, znamienna tym, że jest komórką E. coli.
  35. 35. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera polipeptyd według dowolnego spośród zastrz. 28-29 w mieszaninie z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.
  36. 36. Polipeptyd według zastrz. 28-29, znamienny tym, że jest stosowany w sposobie inhibitowania angiogenezy, u ssaka.
  37. 37. Polipeptyd według zastrz. 28-29, znamienny tym, że jest stosowany w sposobie leczenia angiogenezy, u pacjenta.
  38. 38. Polipeptyd według zastrz. 28-29, znamienny tym, że jest stosowany w sposobie modulowania angiogenezy, u ssaka.
  39. 39. Polipeptyd według zastrz. 28-29, znamienny tym, że jest stosowany w sposobie inhibitowania wzrostu guza nowotworowego, przejawiającego niepożądaną angiogenezę, u ssaka.
  40. 40. Kompozycja, znamienna tym, że zawiera polipeptyd według zastrz. 28-29 oraz środek chemoterapeutyczny, do stosowania w sposobie leczenia raka u ssaka.
    PL 224 701 B1
    217
  41. 41. Kompozycja według zastrz. 40, znamienna tym, że wskazany środek chemoterapeutyczny jest wybrany z grupy, którą tworzą: fluorouracyl oraz docetaksel w postaci trójwodzianu.
  42. 42. Polipeptyd według zastrz. 28-29, znamienny tym, że jest stosowany w sposobie modulowania co najmniej jednego spośród następujących stanów: nieszczelności naczyniowej lub wycieku osocza, u ssaka.
  43. 43. Polipeptyd według zastrz. 28-29, znamienny tym, że jest stosowany w sposobie leczenia co najmniej jednego spośród następujących stanów: choroby neo-unaczynienia gałki ocznej, otyłości, naczyniaka niedojrzałego, naczyniaka jamistego, stwardnienia tętnic, zapalenia, stanów zapalnych, miażdżycy naczyń, endometriozy (gruczolistości), choroby nowotworowej, chorób kości lub łuszczycy, u ssaka.
PL372671A 2001-10-11 2002-10-11 Środki specyficznie wiążące ludzką angiopoetynę-2 PL224701B1 (pl)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US32862401P 2001-10-11 2001-10-11
US60/328,624 2001-10-11
US41415502P 2002-09-27 2002-09-27
US60/414,155 2002-09-27
US10/269,695 US7138370B2 (en) 2001-10-11 2002-10-10 Specific binding agents of human angiopoietin-2
US10/269,695 2002-10-10

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL372671A1 PL372671A1 (pl) 2005-07-25
PL224701B1 true PL224701B1 (pl) 2017-01-31

Family

ID=27402210

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL372671A PL224701B1 (pl) 2001-10-11 2002-10-11 Środki specyficznie wiążące ludzką angiopoetynę-2

Country Status (25)

Country Link
US (7) US7138370B2 (pl)
EP (5) EP1434791B1 (pl)
JP (3) JP4573238B2 (pl)
KR (2) KR20100038238A (pl)
CN (3) CN1596266B (pl)
AT (1) ATE444967T1 (pl)
AU (2) AU2002365179B2 (pl)
BR (1) BRPI0213223B8 (pl)
CA (2) CA2462610C (pl)
CY (1) CY1110571T1 (pl)
DE (1) DE60233955D1 (pl)
DK (1) DK1434791T3 (pl)
EA (1) EA008248B1 (pl)
ES (3) ES2402918T3 (pl)
HU (1) HUP0402162A3 (pl)
IL (2) IL161016A0 (pl)
ME (2) MEP32008A (pl)
MX (1) MXPA04003342A (pl)
NO (1) NO336004B1 (pl)
NZ (4) NZ554023A (pl)
PL (1) PL224701B1 (pl)
PT (1) PT1434791E (pl)
RS (1) RS51898B (pl)
SI (1) SI1434791T1 (pl)
WO (1) WO2003057134A2 (pl)

Families Citing this family (210)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK1783222T3 (da) 1998-10-23 2012-07-09 Kirin Amgen Inc Dimere trombopoietiske peptidomimetika, der binder til MPL-receptor og har trombopoietisk aktivitet
US6660843B1 (en) * 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
US7205275B2 (en) * 2001-10-11 2007-04-17 Amgen Inc. Methods of treatment using specific binding agents of human angiopoietin-2
US7138370B2 (en) * 2001-10-11 2006-11-21 Amgen Inc. Specific binding agents of human angiopoietin-2
KR101025143B1 (ko) 2002-12-31 2011-04-01 넥타르 테라퓨틱스 가수분해상으로 안정한 말레이미드－종결 중합체
US7432331B2 (en) 2002-12-31 2008-10-07 Nektar Therapeutics Al, Corporation Hydrolytically stable maleimide-terminated polymers
RS53476B (sr) 2003-07-18 2014-12-31 Amgen Fremont Inc. Sredstva za specifično vezivanje faktora rasta hepatocita
US7605120B2 (en) * 2003-10-22 2009-10-20 Amgen Inc. Antagonists of the brandykinin B1 receptor
US8110665B2 (en) 2003-11-13 2012-02-07 Hanmi Holdings Co., Ltd. Pharmaceutical composition comprising an immunoglobulin FC region as a carrier
BRPI0406606A (pt) 2003-11-13 2005-12-06 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Composição farmacêutica compreendendo uma região fc de imunoglobulina como um veìculo
US20060080092A1 (en) * 2004-07-28 2006-04-13 Sherman Edward S Telecommunication device and method
WO2006036834A2 (en) * 2004-09-24 2006-04-06 Amgen Inc. MODIFIED Fc MOLECULES
EP1909831A4 (en) 2005-06-14 2013-02-20 Amgen Inc SELF-BUFFING PROTEIN FORMULATIONS
WO2008020827A2 (en) * 2005-08-01 2008-02-21 Biogen Idec Ma Inc. Altered polypeptides, immunoconjugates thereof, and methods related thereto
US8008453B2 (en) 2005-08-12 2011-08-30 Amgen Inc. Modified Fc molecules
US7723477B2 (en) 2005-10-31 2010-05-25 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting Wnt-dependent solid tumor cell growth
PT2500360E (pt) 2005-10-31 2015-10-15 Oncomed Pharm Inc Composições e métodos para diagnóstico e tratamento do cancro
JP5179373B2 (ja) * 2005-12-15 2013-04-10 アストラゼネカ アクチボラグ 癌を治療するためのアンジオポエチン−２アンタゴニストとＶＥＧＦ−Ａ、ＫＤＲ、及び／又はＦｌｔ１アンタゴニストの組合せ
AR059066A1 (es) 2006-01-27 2008-03-12 Amgen Inc Combinaciones del inhibidor de la angiopoyetina -2 (ang2) y el inhibidor del factor de crecimiento endotelial vascular (vegf)
DOP2007000020A (es) * 2006-01-31 2007-09-15 Bayer Schering Pharma Ag Modulación de la actividad de mdl-1 para el tratamiento de enfermedades inflamatorias
US7873029B2 (en) * 2006-03-06 2011-01-18 At&T Intellectual Property I, L.P. System and method of providing multimedia communication services
JO3324B1 (ar) 2006-04-21 2019-03-13 Amgen Inc مركبات علاجية مجففة بالتبريد تتعلق بالعصارة الهضمية
US7981425B2 (en) * 2006-06-19 2011-07-19 Amgen Inc. Thrombopoietic compounds
WO2008051383A2 (en) * 2006-10-19 2008-05-02 Amgen Inc. Use of alcohol co-solvents to improve pegylation reaction yields
KR20120043028A (ko) * 2006-11-10 2012-05-03 씨오브이엑스 테크놀로지스 아일랜드 리미티드 혈관 신생 억제 화합물
EP2162540A2 (en) 2007-05-22 2010-03-17 Amgen Inc. Compositions and methods for producing bioactive fusion proteins
TWI595005B (zh) 2007-08-21 2017-08-11 安健股份有限公司 人類ｃ－ｆｍｓ抗原結合蛋白質
MX2010002249A (es) * 2007-08-31 2010-03-17 Amgen Inc Formulacion de proteina de estado solido.
CA2701032C (en) 2007-09-27 2021-01-26 Amgen Inc. Pharmaceutical formulations
EP3381445B1 (en) 2007-11-15 2023-10-25 Amgen Inc. Aqueous formulation of antibody stablised by antioxidants for parenteral administration
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US8557242B2 (en) 2008-01-03 2013-10-15 The Scripps Research Institute ERBB2 antibodies comprising modular recognition domains
GEP20156390B (en) * 2008-01-03 2015-11-10 Scripps Research Inst Antibody targeting through a modular recognition domain
US8574577B2 (en) 2008-01-03 2013-11-05 The Scripps Research Institute VEGF antibodies comprising modular recognition domains
US8557243B2 (en) 2008-01-03 2013-10-15 The Scripps Research Institute EFGR antibodies comprising modular recognition domains
US8454960B2 (en) 2008-01-03 2013-06-04 The Scripps Research Institute Multispecific antibody targeting and multivalency through modular recognition domains
JO2913B1 (en) 2008-02-20 2015-09-15 امجين إنك, Antibodies directed towards angiopoietin-1 and angiopoietin-2 proteins and their uses
AU2009262199B2 (en) 2008-06-27 2012-08-09 Amgen Inc. Ang-2 inhibition to treat multiple sclerosis
MX2011003183A (es) 2008-09-26 2011-04-21 Oncomed Pharm Inc Agentes que se unen a receptor encrespado y usos de los mismos.
US8268314B2 (en) 2008-10-08 2012-09-18 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific anti-VEGF/anti-ANG-2 antibodies
US8133979B2 (en) 2008-12-16 2012-03-13 Hoffmann-La Roche Inc. Antibodies against human angiopoietin 2
CA2755133A1 (en) 2009-03-20 2010-09-23 Amgen Inc. Selective and potent peptide inhibitors of kv1.3
BRPI1014089A2 (pt) 2009-04-02 2016-04-19 Roche Glycart Ag anticorpos multiespecíficos que compreendem anticorpos de comprimento completo e fragmentos fab de cadeia simples
DK2417156T3 (en) 2009-04-07 2015-03-02 Roche Glycart Ag Trivalent, bispecific antibodies
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
JP5808323B2 (ja) 2009-06-22 2015-11-10 アムジエン・インコーポレーテツド 化学的に制御されたレドックス状態を用いたタンパク質のリフォールディング
TWI513465B (zh) 2009-06-25 2015-12-21 Regeneron Pharma 以ｄｌｌ４拮抗劑與化學治療劑治療癌症之方法
EP3660032B1 (en) 2009-06-25 2025-10-22 Amgen Inc. Capture purification processes for proteins expressed in a non-mammalian system
US20120189635A1 (en) 2009-07-29 2012-07-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for Treating or Preventing Malaria by Administering an Antibody that Specifically Binds Angiopoietin-2 (Ang-2)
US8980268B2 (en) 2009-07-29 2015-03-17 Regeneron Pharamceuticals, Inc. Methods for treating cancer by administering an anti-Ang-2 antibody
JO3182B1 (ar) * 2009-07-29 2018-03-08 Regeneron Pharma مضادات حيوية بشرية عالية الالفة مع تولد الاوعية البشرية - 2
CA2781519A1 (en) 2009-09-16 2011-03-24 Genentech, Inc. Coiled coil and/or tether containing protein complexes and uses thereof
WO2011038139A1 (en) 2009-09-23 2011-03-31 Amgen Inc. Treatment of ovarian cancer using a specific binding agent of human angiopoietin-2 in combination with a taxane
AU2010310457B2 (en) 2009-10-23 2015-07-02 Amgen Inc. Vial adapter and system
TWI535445B (zh) 2010-01-12 2016-06-01 安可美德藥物股份有限公司 Ｗｎｔ拮抗劑及治療和篩選方法
JO3183B1 (ar) 2010-01-29 2018-03-08 Regeneron Pharma طرق لمعالجة أمراض المناعة الذاتية مضادات dll4
TWI426920B (zh) 2010-03-26 2014-02-21 Hoffmann La Roche 雙專一性、雙價抗－ｖｅｇｆ／抗－ａｎｇ－２抗體
TW201138821A (en) 2010-03-26 2011-11-16 Roche Glycart Ag Bispecific antibodies
KR20130043102A (ko) 2010-04-01 2013-04-29 온코메드 파마슈티칼스, 인크. 프리즐드-결합 작용제 및 그의 용도
DK2560683T4 (da) 2010-04-23 2022-08-29 Hoffmann La Roche Fremstilling af heteromultimeriske proteiner
KR102513760B1 (ko) 2010-06-07 2023-03-27 암젠 인크 약물 전달 장치
WO2012009705A1 (en) 2010-07-15 2012-01-19 Zyngenia, Inc. Ang-2 binding complexes and uses thereof
RU2013110844A (ru) 2010-08-13 2014-09-20 Дженентек, Инк. АНТИТЕЛА ПРОТИВ IL-1β И IL-18, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ
CA2807278A1 (en) 2010-08-24 2012-03-01 F. Hoffmann - La Roche Ag Bispecific antibodies comprising a disulfide stabilized - fv fragment
CA2885176C (en) 2010-09-22 2018-10-23 Amgen Inc. Carrier immunoglobulins and uses thereof
WO2012085111A1 (en) 2010-12-23 2012-06-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Polypeptide-polynucleotide-complex and its use in targeted effector moiety delivery
US10689447B2 (en) 2011-02-04 2020-06-23 Genentech, Inc. Fc variants and methods for their production
JP6161540B2 (ja) 2011-02-04 2017-07-12 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｆｃ変異体及びそれらの生産方法
CA2827170A1 (en) 2011-02-11 2012-08-16 David M. Hilbert Monovalent and multivalent multispecific complexes and uses thereof
JP5764677B2 (ja) 2011-02-28 2015-08-19 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗原結合タンパク質
CN103403025B (zh) 2011-02-28 2016-10-12 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 单价抗原结合蛋白
EP2691065B1 (en) 2011-03-31 2017-03-01 Amgen Inc. Vial adapter and system
CA2833748C (en) 2011-04-20 2019-07-16 Amgen Inc. Autoinjector apparatus
CN106432506A (zh) 2011-05-24 2017-02-22 泽恩格尼亚股份有限公司 多价和单价多特异性复合物及其用途
US9938353B2 (en) 2011-06-24 2018-04-10 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Compositions, methods and uses for alpha-1 antitrypsin fusion molecules
JP6069312B2 (ja) 2011-06-29 2017-02-01 アムジェン インコーポレイテッド 腎細胞癌の治療における生存の予測バイオマーカー
EP2744828A4 (en) 2011-08-16 2014-12-31 Univ Emory JAML-SPECIFIC BINDING AGENTS, ANTIBODIES AND USES THEREOF
ES2971444T3 (es) 2011-10-11 2024-06-05 F Hoffmann Lar Roche Ag Ensamblaje mejorado de anticuerpos biespecíficos
EP3335747B1 (en) 2011-10-14 2021-04-07 Amgen Inc. Injector and method of assembly
JP6526414B2 (ja) 2011-10-26 2019-06-05 アムジエン・インコーポレーテツド Ｕｖ光曝露から生じるタンパク質の改変と分解を減ずるまたは排除する方法
US10478508B2 (en) * 2012-01-10 2019-11-19 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Compositions, methods and uses for alpha-1 antitrypsin fusion molecules
MY164611A (en) * 2012-01-23 2018-01-30 Regeneron Pharma Stabilized formulations containing anti-ang2 antibodies
WO2013119966A2 (en) 2012-02-10 2013-08-15 Genentech, Inc. Single-chain antibodies and other heteromultimers
AR090263A1 (es) 2012-03-08 2014-10-29 Hoffmann La Roche Terapia combinada de anticuerpos contra el csf-1r humano y las utilizaciones de la misma
RU2639287C2 (ru) 2012-06-27 2017-12-20 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Способ отбора и получения высокоселективных и мультиспецифичных нацеливающих групп с заданными свойствами, включающих по меньшей мере две различные связывающие группировки, и их применения
KR20150030744A (ko) 2012-06-27 2015-03-20 에프. 호프만-라 로슈 아게 표적에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 결합 단위를 포함하는 항체 Ｆｃ－영역 접합체의 제조 방법 및 그의 용도
SG11201408538PA (en) 2012-07-13 2015-02-27 Roche Glycart Ag Bispecific anti-vegf/anti-ang-2 antibodies and their use in the treatment of ocular vascular diseases
JP2015533483A (ja) * 2012-09-07 2015-11-26 サノフイ メタボリックシンドロームを治療するための融合タンパク質
KR101967345B1 (ko) 2012-10-18 2019-04-09 삼성전자주식회사 안지오포이에틴-2와 인테그린 간의 결합을 저해하는 펩타이드 및 그 용도
HK1212216A1 (en) 2012-10-23 2016-06-10 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating neuroendocrine tumors using wnt pathway-binding agents
AR093445A1 (es) 2012-11-14 2015-06-10 Regeneron Pharma Metodos para tratar el cancer de ovario con antagonistas de dll4
EP3072548B1 (en) 2012-11-21 2019-03-06 Amgen, Inc Drug delivery device
WO2014108854A1 (en) 2013-01-09 2014-07-17 Fusimab Ltd. Monospecific anti-hgf and anti-ang2 antibodies and bispecific anti-hgf/anti-ang2 antibodies
HK1211887A1 (en) 2013-02-04 2016-06-03 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods and monitoring of treatment with a wnt pathway inhibitor
US9168300B2 (en) 2013-03-14 2015-10-27 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. MET-binding agents and uses thereof
JP6336564B2 (ja) 2013-03-15 2018-06-06 アムゲン・インコーポレーテッド 薬物カセット、自動注入器、および自動注入器システム
CN111617347B (zh) 2013-03-15 2023-09-29 安进公司 身体轮廓可调适的自动注射器装置
EP3424530A1 (en) 2013-03-15 2019-01-09 Zyngenia, Inc. Multivalent and monovalent multispecific complexes and their uses
US10492990B2 (en) 2013-03-15 2019-12-03 Amgen Inc. Drug cassette, autoinjector, and autoinjector system
EP2976117B1 (en) 2013-03-22 2020-12-30 Amgen Inc. Injector and method of assembly
KR102131371B1 (ko) 2013-07-02 2020-07-08 삼성전자주식회사 Ang-2 특이적 항체 및 그의 용도
US9902767B2 (en) 2013-07-29 2018-02-27 Samsung Electronics Co., Ltd. Method of blocking vascular leakage using an anti-ANG2 antibody
KR102196450B1 (ko) 2013-09-17 2020-12-30 삼성전자주식회사 Tie2와 결합을 유도하는 항 Ang2 항체를 포함하는 항암제
RU2016115866A (ru) 2013-10-11 2017-11-16 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Мультиспецифические антитела с обменянными доменами и одинаковыми вариабельными доменами легкой цепи
SG11201602876WA (en) 2013-10-24 2016-05-30 Amgen Inc Injector and method of assembly
WO2015061389A1 (en) 2013-10-24 2015-04-30 Amgen Inc. Drug delivery system with temperature-sensitive control
WO2015090234A1 (en) * 2013-12-19 2015-06-25 Beijing Anxinhuaide Biotech. Co., Ltd Improving pharmacokinetic profile for angiopoietin-2 inhibiting polypeptide or thymalfasin
KR102206029B1 (ko) 2014-01-27 2021-01-20 삼성전자주식회사 Ang-2에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도
US10994112B2 (en) 2014-02-05 2021-05-04 Amgen Inc. Drug delivery system with electromagnetic field generator
ES2955736T3 (es) 2014-05-06 2023-12-05 Hoffmann La Roche Producción de proteínas heteromultiméricas usando células de mamífero
SG10201811702TA (en) 2014-05-07 2019-01-30 Amgen Inc Autoinjector with shock reducing elements
AR100270A1 (es) * 2014-05-19 2016-09-21 Lilly Co Eli Anticuerpos ang2
MX387194B (es) 2014-06-03 2025-03-18 Amgen Inc Sistemas y metodos para procesar de manera remota datos recolectados por un dispositivo de suministro de farmaco.
US9616114B1 (en) 2014-09-18 2017-04-11 David Gordon Bermudes Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity
EP3943135B1 (en) 2014-10-14 2025-09-24 Amgen Inc. Drug injection device with visual and audible indicators
PL3227332T3 (pl) 2014-12-03 2020-06-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Wielospecyficzne przeciwciała
US10799630B2 (en) 2014-12-19 2020-10-13 Amgen Inc. Drug delivery device with proximity sensor
EP3689394A1 (en) 2014-12-19 2020-08-05 Amgen Inc. Drug delivery device with live button or user interface field
ES2748750T3 (es) 2015-02-17 2020-03-17 Amgen Inc Dispositivo de administración de fármacos con sujeción asistida por vacío y/o realimentación
US11806509B2 (en) 2015-02-27 2023-11-07 Amgen Inc. Drug delivery device having a needle guard mechanism with a turnable threshold of resistance to needle guard movement
US10857229B2 (en) 2015-04-30 2020-12-08 Amgen Inc. Treatment of ovarian cancer in patients with ascites using a specific binding agent of human angiopoietin-2 in combination with a taxane
US10676723B2 (en) 2015-05-11 2020-06-09 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
WO2016209972A1 (en) 2015-06-26 2016-12-29 Amgen Inc. Biomarker of survival in the treatment of renal cell carcinoma with a vegfr inhibitor and an ang2 inhibitor
EP3334747B1 (en) 2015-08-13 2023-09-27 Amgen Inc. Charged depth filtration of antigen-binding proteins
WO2017039786A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Amgen Inc. Syringe assembly adapter for a syringe
US11351308B2 (en) 2015-12-09 2022-06-07 Amgen Inc. Auto-injector with signaling cap
US11154661B2 (en) 2016-01-06 2021-10-26 Amgen Inc. Auto-injector with signaling electronics
CA3014466A1 (en) * 2016-03-03 2017-09-08 Cue Biopharma, Inc. T-cell modulatory multimeric polypeptides and methods of use thereof
ES2906782T3 (es) * 2016-03-15 2022-04-20 Idp Discovery Pharma S L Péptidos con actividad antineoplásica
EP3429663B1 (en) 2016-03-15 2020-07-15 Amgen Inc. Reducing probability of glass breakage in drug delivery devices
US11541168B2 (en) 2016-04-29 2023-01-03 Amgen Inc. Drug delivery device with messaging label
US11389588B2 (en) 2016-05-02 2022-07-19 Amgen Inc. Syringe adapter and guide for filling an on-body injector
JP7309363B2 (ja) 2016-05-13 2023-07-18 アムジエン・インコーポレーテツド バイアル・スリーブ組立体
US10654922B2 (en) * 2016-05-13 2020-05-19 Askgene Pharma Inc. Angiopoietin 2, VEGF dual antagonists
US11059885B2 (en) * 2016-05-13 2021-07-13 Askgene Pharma Inc. Angiopoietin 2, VEGF dual antagonists
US11238150B2 (en) 2016-05-16 2022-02-01 Amgen Inc. Data encryption in medical devices with limited computational capability
WO2017209899A1 (en) 2016-06-03 2017-12-07 Amgen Inc. Impact testing apparatuses and methods for drug delivery devices
EP3478342B1 (en) 2016-07-01 2025-03-12 Amgen Inc. Drug delivery device having minimized risk of component fracture upon impact events
WO2018034784A1 (en) 2016-08-17 2018-02-22 Amgen Inc. Drug delivery device with placement detection
US20200261643A1 (en) 2016-10-25 2020-08-20 Amgen Inc. On-body injector
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
AU2017379900B2 (en) 2016-12-22 2024-12-05 Cue Biopharma, Inc. T-cell modulatory multimeric polypeptides and methods of use thereof
CN109071656B (zh) 2017-01-05 2021-05-18 璟尚生物制药公司 检查点调节物拮抗剂
MX2019008432A (es) 2017-01-17 2019-11-18 Amgen Inc Dispositivos de inyeccion y metodos relacionados de uso y ensamblaje.
US11752258B2 (en) 2017-02-17 2023-09-12 Amgen Inc. Drug delivery device with sterile fluid flowpath and related method of assembly
MX2019009755A (es) 2017-02-17 2019-10-07 Amgen Inc Mecanismo de insercion para dispositivo de suministro de farmacos.
WO2018165143A1 (en) 2017-03-06 2018-09-13 Amgen Inc. Drug delivery device with activation prevention feature
WO2018164829A1 (en) 2017-03-07 2018-09-13 Amgen Inc. Needle insertion by overpressure
IL268386B2 (en) 2017-03-09 2023-11-01 Amgen Inc Insertion mechanism for a drug delivery device
PL3600491T3 (pl) 2017-03-28 2024-03-04 Amgen Inc. Układ i sposób montażu trzonu tłoka i strzykawki
WO2018226515A1 (en) 2017-06-08 2018-12-13 Amgen Inc. Syringe assembly for a drug delivery device and method of assembly
EP3634546A1 (en) 2017-06-08 2020-04-15 Amgen Inc. Torque driven drug delivery device
WO2018236619A1 (en) 2017-06-22 2018-12-27 Amgen Inc. Device activation impact/shock reduction
JP7475860B2 (ja) 2017-06-23 2024-04-30 アムジエン・インコーポレーテツド スイッチアセンブリにより起動されるキャップを含む電子薬物送達デバイス
EP3651832B1 (en) 2017-07-14 2023-12-13 Amgen Inc. Needle insertion-retraction system having dual torsion spring system
US11672733B2 (en) 2017-07-21 2023-06-13 Amgen Inc. Gas permeable sealing member for drug container and methods of assembly
JP7242562B2 (ja) 2017-07-25 2023-03-20 アムジエン・インコーポレーテツド 容器アクセスシステムを有する薬物送達デバイス及び関連する組立方法
JP2020528296A (ja) 2017-07-25 2020-09-24 アムジエン・インコーポレーテツド ギヤモジュールを有する薬物送達デバイス及び関連する組立方法
US12318593B2 (en) 2017-08-09 2025-06-03 Amgen Inc. Hydraulic-pneumatic pressurized chamber drug delivery system
EP3668567A1 (en) 2017-08-18 2020-06-24 Amgen Inc. Wearable injector with sterile adhesive patch
US11103636B2 (en) 2017-08-22 2021-08-31 Amgen Inc. Needle insertion mechanism for drug delivery device
US11759565B2 (en) 2017-10-04 2023-09-19 Amgen Inc. Flow adapter for drug delivery device
EP3691716B1 (en) 2017-10-06 2023-11-29 Amgen Inc. Drug delivery device with interlock assembly and related method of assembly
IL273323B2 (en) 2017-10-09 2024-10-01 Amgen Inc Drug delivery device with drive assembly and related assembly method
US11826480B2 (en) 2017-11-03 2023-11-28 Amgen Inc. Systems and approaches for sterilizing a drug delivery device
MA50553A (fr) 2017-11-06 2020-09-16 Amgen Inc Dispositif d'administration de médicament avec détection de positionnement et de débit
MA50569A (fr) 2017-11-06 2020-09-16 Amgen Inc Ensembles de remplissage-finition et procédés associés
SG11202002966QA (en) 2017-11-10 2020-05-28 Amgen Inc Plungers for drug delivery devices
AU2018368340B2 (en) 2017-11-16 2024-03-07 Amgen Inc. Door latch mechanism for drug delivery device
JP7747438B2 (ja) 2017-11-16 2025-10-01 アムジエン・インコーポレーテツド 失速及び終点検出を有するオートインジェクタ
US10835685B2 (en) 2018-05-30 2020-11-17 Amgen Inc. Thermal spring release mechanism for a drug delivery device
US11083840B2 (en) 2018-06-01 2021-08-10 Amgen Inc. Modular fluid path assemblies for drug delivery devices
WO2020006516A1 (en) 2018-06-29 2020-01-02 Gensun Biopharma, Inc. Antitumor immune checkpoint regulator antagonists
EP3826701A1 (en) 2018-07-24 2021-06-02 Amgen Inc. Delivery devices for administering drugs
MX2021000749A (es) 2018-07-24 2021-03-29 Amgen Inc Dispositivos de suministro para administrar farmacos.
WO2020023336A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with grip portion
WO2020023220A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with tacky skin attachment portion and related method of preparation
WO2020028009A1 (en) 2018-07-31 2020-02-06 Amgen Inc. Fluid path assembly for a drug delivery device
JP2022500095A (ja) 2018-09-24 2022-01-04 アムジエン・インコーポレーテツド インターベンション投薬システム及び方法
IL281469B2 (en) 2018-09-28 2024-08-01 Amgen Inc Muscle wire escapement activation assembly for a drug delivery device
EP3860685A1 (en) 2018-10-02 2021-08-11 Amgen Inc. Injection systems for drug delivery with internal force transmission
US12151089B2 (en) 2018-10-05 2024-11-26 Amgen Inc. Drug delivery device having dose indicator
MA53912A (fr) 2018-10-15 2022-01-19 Amgen Inc Dispositif d'administration de médicament comprenant un mécanisme d'amortissement
SG11202101824VA (en) 2018-10-15 2021-03-30 Amgen Inc Platform assembly process for drug delivery device
CA3115296A1 (en) 2018-10-23 2020-04-30 Amgen Inc. Automatic calibration and automatic maintenance of raman spectroscopic models for real-time predictions
EP3873566B1 (en) 2018-11-01 2024-11-27 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
TWI831847B (zh) 2018-11-01 2024-02-11 美商安進公司 部分針頭縮回之藥物遞送裝置及其操作方法
AU2019370159B2 (en) 2018-11-01 2025-05-29 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
US20220160972A1 (en) 2019-04-24 2022-05-26 Amgen Inc. Syringe sterilization verification assemblies and methods
KR102400401B1 (ko) * 2019-05-22 2022-05-24 (주)셀인바이오 항염증 펩타이드 및 항염증 조성물
WO2020263312A1 (en) 2019-06-28 2020-12-30 Gensun Biopharma, Inc. ANTITUMOR ANTAGONIST CONSISTING OF A MUTATED TGFβ1 - RII EXTRACELLULAR DOMAIN AND AN IMMUNOGLOBULIN SCAFFOLD
JP7608439B2 (ja) 2019-08-23 2025-01-06 アムジエン・インコーポレーテツド 構成可能な針シールド係合構成要素を備えた薬物送達デバイス及び関連方法
KR102195957B1 (ko) * 2019-11-19 2020-12-28 삼성전자주식회사 Tie2와 결합을 유도하는 항 Ang2 항체
KR102312922B1 (ko) * 2019-11-19 2021-10-13 삼성전자주식회사 Tie2와 결합을 유도하는 항 Ang2 항체
US20230071627A1 (en) 2020-02-03 2023-03-09 Amgen Inc. Multivariate Bracketing Approach for Sterile Filter Validation
CN115996946A (zh) 2020-04-30 2023-04-21 免疫靶向有限公司 可活化il2组合物和使用方法
EP4149534A4 (en) 2020-05-12 2024-09-04 Cue Biopharma, Inc. MULTIMERIC POLYPEPTIDES MODULATING T CELLS AND METHODS OF USE THEREOF
CN112126671B (zh) * 2020-08-18 2021-08-31 中山大学附属第五医院 无乳链球菌Streptococus agalactiae治疗子宫内膜异位症的应用
EP4201957A4 (en) * 2020-08-19 2025-01-22 Pharmabcine Inc. MODIFIED ANTIBODY AND PROCESS FOR PRODUCTION THEREOF
WO2022197971A1 (en) * 2021-03-19 2022-09-22 Cue Biopharma, Inc. T-cell modulatory polypeptides and methods of use thereof
KR20230163462A (ko) * 2021-03-31 2023-11-30 항저우 엑제제네시스 바이오 엘티디. Vegf 및 안지오포이에틴을 표적화하는 융합 분자 및 이의 용도
US20240208680A1 (en) 2021-05-21 2024-06-27 Amgen Inc. Method of optimizing a filling recipe for a drug container
WO2022256820A1 (en) 2021-06-03 2022-12-08 Gensun Biopharma Inc. Multispecific antagonists
WO2023076318A1 (en) 2021-10-27 2023-05-04 Amgen Inc. Deep learning-based prediction for monitoring of pharmaceuticals using spectroscopy
US20250197448A1 (en) 2022-03-11 2025-06-19 University Of Rochester Cyclopeptibodies and uses thereof
WO2024085632A1 (ko) * 2022-10-18 2024-04-25 고려대학교 산학협력단 인간 항체 fc 도메인 변이체 및 그 용도
WO2025037108A2 (en) 2023-08-15 2025-02-20 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Modified thrombopoietin
WO2025237264A1 (en) * 2024-05-14 2025-11-20 Shanghai Affamed Therapeutics Limited A method for treating retinal and choroidal vascular diseases with a chimeric molecule

Family Cites Families (91)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US3691016A (en) 1970-04-17 1972-09-12 Monsanto Co Process for the preparation of insoluble enzymes
NL154598B (nl) 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
US3817837A (en) 1971-05-14 1974-06-18 Syva Corp Enzyme amplification assay
CA1023287A (en) 1972-12-08 1977-12-27 Boehringer Mannheim G.M.B.H. Process for the preparation of carrier-bound proteins
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US3939350A (en) 1974-04-29 1976-02-17 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Fluorescent immunoassay employing total reflection for activation
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4195128A (en) 1976-05-03 1980-03-25 Bayer Aktiengesellschaft Polymeric carrier bound ligands
US4330440A (en) 1977-02-08 1982-05-18 Development Finance Corporation Of New Zealand Activated matrix and method of activation
CA1093991A (en) 1977-02-17 1981-01-20 Hideo Hirohara Enzyme immobilization with pullulan gel
US4229537A (en) 1978-02-09 1980-10-21 New York University Preparation of trichloro-s-triazine activated supports for coupling ligands
US4263428A (en) 1978-03-24 1981-04-21 The Regents Of The University Of California Bis-anthracycline nucleic acid function inhibitors and improved method for administering the same
US4277437A (en) 1978-04-05 1981-07-07 Syva Company Kit for carrying out chemically induced fluorescence immunoassay
US4289872A (en) 1979-04-06 1981-09-15 Allied Corporation Macromolecular highly branched homogeneous compound based on lysine units
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
DE3374837D1 (en) 1982-02-17 1988-01-21 Ciba Geigy Ag Lipids in the aqueous phase
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
US4710473A (en) 1983-08-10 1987-12-01 Amgen, Inc. DNA plasmids
EP0143949B1 (en) 1983-11-01 1988-10-12 TERUMO KABUSHIKI KAISHA trading as TERUMO CORPORATION Pharmaceutical composition containing urokinase
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
EP0206448B1 (en) 1985-06-19 1990-11-14 Ajinomoto Co., Inc. Hemoglobin combined with a poly(alkylene oxide)
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
US5229490A (en) 1987-05-06 1993-07-20 The Rockefeller University Multiple antigen peptide system
EP0315456B1 (en) 1987-11-05 1994-06-01 Hybritech Incorporated Polysaccharide-modified immunoglobulins having reduced immunogenic potential or improved pharmacokinetics
US6018026A (en) * 1988-01-22 2000-01-25 Zymogenetics, Inc. Biologically active dimerized and multimerized polypeptide fusions
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5116964A (en) * 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5225538A (en) * 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
DE10399023I2 (de) 1989-09-12 2006-11-23 Ahp Mfg B V TFN-bindende Proteine
US5723286A (en) 1990-06-20 1998-03-03 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening systems
US6565841B1 (en) 1991-03-15 2003-05-20 Amgen, Inc. Pulmonary administration of granulocyte colony stimulating factor
US5733731A (en) 1991-10-16 1998-03-31 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening method
US5270170A (en) 1991-10-16 1993-12-14 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening method
US5955291A (en) * 1992-01-09 1999-09-21 Alitalo; Kari Antibodies recognizing tie receptor tyrosine kinase and uses thereof
US5470582A (en) 1992-02-07 1995-11-28 Syntex (U.S.A.) Inc. Controlled delivery of pharmaceuticals from preformed porous polymeric microparticles
US6004555A (en) 1992-03-05 1999-12-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for the specific coagulation of vasculature
US5877289A (en) 1992-03-05 1999-03-02 The Scripps Research Institute Tissue factor compositions and ligands for the specific coagulation of vasculature
DK1225226T3 (da) 1992-03-13 2008-04-14 Biomerieux Bv Peptider og nucleinsyresekvenser beslægtet med Epstein-Barr-virus
WO1993021259A1 (en) 1992-04-14 1993-10-28 Cornell Research Foundation Inc. Dendritic based macromolecules and method of production
WO1993024135A1 (en) 1992-05-26 1993-12-09 Immunex Corporation Novel cytokine that binds cd30
WO1994000469A1 (en) * 1992-06-26 1994-01-06 Immunex Corporation Novel tyrosine kinase
US5922545A (en) 1993-10-29 1999-07-13 Affymax Technologies N.V. In vitro peptide and antibody display libraries
AU8143094A (en) 1993-11-12 1995-05-29 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. (tie-2), a novel receptor tyrosine kinase
US5879672A (en) * 1994-10-07 1999-03-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Tie-2 ligand 1
US5643755A (en) * 1994-10-07 1997-07-01 Regeneron Pharmaceuticals Inc. Nucleic acid encoding tie-2 ligand
WO1995021258A1 (en) 1994-02-01 1995-08-10 United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Fusion proteins that include antibody and nonantibody portions
AUPM379494A0 (en) 1994-02-10 1994-03-03 Ludwig Institute For Cancer Research Immunointeractive molecules - ii
US6309853B1 (en) 1994-08-17 2001-10-30 The Rockfeller University Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof
US5814464A (en) * 1994-10-07 1998-09-29 Regeneron Pharma Nucleic acids encoding TIE-2 ligand-2
US5650490A (en) * 1994-10-07 1997-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Tie-2 ligand 2
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5854202A (en) 1995-01-24 1998-12-29 Dedhar; Shoukat Peptide fragments of calreticulin, peptide mimetics thereof, and pharmaceutical compostions comprising same
EP0821728B1 (en) * 1995-04-06 2004-08-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Tie-2 ligands, methods of making and uses thereof
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
US5670110A (en) 1995-12-21 1997-09-23 The Procter & Gamble Company Method for making three-dimensional macroscopically-expanded webs having improved functional surfaces
US6369027B1 (en) 1995-12-22 2002-04-09 Amgen Inc. Osteoprotegerin
WO1997034631A1 (en) 1996-03-18 1997-09-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobin-like domains with increased half lives
US6265564B1 (en) 1996-08-02 2001-07-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Expressed ligand-vascular intercellular signalling molecule
CA2267139A1 (en) 1996-10-08 1998-04-16 Ton Logtenberg Methods and means for selecting peptides and proteins having specific affinity for a target
BR9806793A (pt) 1997-01-22 2000-05-16 Univ Texas Processos e composições de fator tissular para coagulação e tratamento de tumores.
US6133426A (en) 1997-02-21 2000-10-17 Genentech, Inc. Humanized anti-IL-8 monoclonal antibodies
WO1998039027A2 (en) 1997-03-05 1998-09-11 John Wayne Cancer Institute Sialyl lewis antigens as targets for immunotherapy
WO2001062891A2 (en) 2000-02-24 2001-08-30 Human Genome Sciences, Inc. 207 human secreted proteins
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
US5972338A (en) * 1997-09-19 1999-10-26 Genentech, Inc. Tie ligands homologues
US6030831A (en) * 1997-09-19 2000-02-29 Genetech, Inc. Tie ligand homologues
US6077934A (en) 1997-12-24 2000-06-20 University Of Utah Research Foundation Contryphan peptides
GB9804121D0 (en) 1998-02-26 1998-04-22 Cancer Res Campaign Tech Anti-angiogenic vaccines: materials and methods relating thereto
US6387663B1 (en) 1998-07-31 2002-05-14 University Of Southern California Targeting pharmaceutical agents to injured tissues
CA2354862A1 (en) 1998-10-19 2000-04-27 Yeda Research And Development Co. Ltd. Treatment of systemic lupus erythematosus by down-regulating the autoimmune response to autoantigens
US6660843B1 (en) * 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
US6521593B1 (en) * 1999-02-01 2003-02-18 Childrens Hospital Los Angeles Methods for inhibiting brain tumor growth
US6455035B1 (en) * 1999-03-26 2002-09-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Angiopoietins and methods of use thereof
CA2368670C (en) 1999-03-26 2012-06-05 Chitra Suri Modulation of vascular permeability by means of tie2 receptor activators
JP2004507202A (ja) * 1999-03-31 2004-03-11 キュラジェン　コーポレイション ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸；「ｏｒｆｘ」
ES2262518T5 (es) 1999-06-07 2009-05-08 Immunex Corporation Antagonistas de tek.
CA2372511C (en) 1999-06-15 2011-11-22 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
AU2001238347A1 (en) * 2000-02-28 2001-09-12 Hyseq, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
AU4347701A (en) * 2000-03-01 2001-09-12 Corixa Corp Compositions and methods for the detection, diagnosis and therapy of hematological malignancies
WO2001071042A2 (en) 2000-03-23 2001-09-27 Pe Corporation (Ny) Detection kits, such as nucleic acid arrays, for detecting the expression of 10,000 or more drosophila genes and uses thereof
EP1160321A1 (en) 2000-05-31 2001-12-05 Sanofi-Synthelabo Kidney Injury Novel Gene-1: Isolation and therapeutic applications
US7521053B2 (en) 2001-10-11 2009-04-21 Amgen Inc. Angiopoietin-2 specific binding agents
US7205275B2 (en) * 2001-10-11 2007-04-17 Amgen Inc. Methods of treatment using specific binding agents of human angiopoietin-2
US7138370B2 (en) 2001-10-11 2006-11-21 Amgen Inc. Specific binding agents of human angiopoietin-2
US9401875B2 (en) 2012-06-01 2016-07-26 Nippon Telegraph And Telephone Corporation Packet transfer processing method and packet transfer processing device
US9300829B2 (en) 2014-04-04 2016-03-29 Canon Kabushiki Kaisha Image reading apparatus and correction method thereof
EP3035305B1 (en) 2014-12-18 2016-11-16 Axis AB Enclosure and arrangement for recess mounting of a camera or camera head

Also Published As

Publication number Publication date
ATE444967T1 (de) 2009-10-15
MXPA04003342A (es) 2004-07-08
HUP0402162A3 (en) 2009-03-30
IL161016A (en) 2014-07-31
EP2316845B1 (en) 2013-01-16
EA200400526A1 (ru) 2005-06-30
NZ554021A (en) 2009-02-28
ES2396272T3 (es) 2013-02-20
WO2003057134A2 (en) 2003-07-17
EA008248B1 (ru) 2007-04-27
KR20040068119A (ko) 2004-07-30
EP2316845A1 (en) 2011-05-04
US20120141499A1 (en) 2012-06-07
US7723499B2 (en) 2010-05-25
IL161016A0 (en) 2004-08-31
AU2009202513C1 (en) 2010-03-11
JP2010189394A (ja) 2010-09-02
US20130158234A1 (en) 2013-06-20
CN101787072B (zh) 2015-07-15
EP1434791A4 (en) 2006-04-26
US20100286060A1 (en) 2010-11-11
CN101787072A (zh) 2010-07-28
CN101812118A (zh) 2010-08-25
HK1145692A1 (zh) 2011-04-29
EP1434791B1 (en) 2009-10-07
AU2009202513B2 (en) 2009-08-27
HK1076113A1 (zh) 2006-01-06
EP2070944A1 (en) 2009-06-17
CA2767061C (en) 2014-03-18
NO20041917D0 (no) 2004-05-10
CA2462610A1 (en) 2003-07-17
AU2009202513A1 (en) 2009-07-16
US20140275479A1 (en) 2014-09-18
US20060122370A1 (en) 2006-06-08
CN1596266B (zh) 2010-04-28
MEP32008A (en) 2010-10-10
BR0213223A (pt) 2005-04-26
RS51898B (sr) 2012-02-29
JP2005514024A (ja) 2005-05-19
HK1133017A1 (en) 2010-03-12
NO336004B1 (no) 2015-04-20
BRPI0213223B1 (pt) 2019-05-21
US20090054323A1 (en) 2009-02-26
CN1596266A (zh) 2005-03-16
ES2402918T3 (es) 2013-05-10
ME00185B (me) 2010-10-10
CA2462610C (en) 2012-09-18
US20030229023A1 (en) 2003-12-11
DE60233955D1 (de) 2009-11-19
EP1434791A2 (en) 2004-07-07
WO2003057134A3 (en) 2004-04-29
NZ554023A (en) 2009-02-28
NZ543687A (en) 2008-04-30
KR20100038238A (ko) 2010-04-13
HUP0402162A2 (hu) 2005-01-28
PL372671A1 (pl) 2005-07-25
YU37304A (sh) 2006-08-17
EP2070944B1 (en) 2012-09-26
NO20041917L (no) 2004-07-08
ES2334118T3 (es) 2010-03-05
JP5432777B2 (ja) 2014-03-05
EP2311849B1 (en) 2017-08-16
KR100976915B1 (ko) 2010-08-18
SI1434791T1 (sl) 2010-01-29
CY1110571T1 (el) 2015-04-29
US7138370B2 (en) 2006-11-21
PT1434791E (pt) 2009-12-30
AU2002365179B2 (en) 2006-02-23
EP2157097A1 (en) 2010-02-24
JP2009273457A (ja) 2009-11-26
WO2003057134A8 (en) 2004-08-19
AU2002365179A1 (en) 2003-07-24
US9200040B2 (en) 2015-12-01
CA2767061A1 (en) 2003-07-17
BRPI0213223B8 (pt) 2021-05-25
JP4573238B2 (ja) 2010-11-04
US8129331B2 (en) 2012-03-06
NZ554022A (en) 2010-01-29
DK1434791T3 (da) 2010-02-15
EP2311849A1 (en) 2011-04-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101787072B (zh) 人血管生成素-2的特异结合剂
US20030236193A1 (en) Methods of treatment using specific binding agents of human angiopoietin-2
JP6495884B2 (ja) 改変抗ｔｇｆベータ抗体および抗原結合フラグメント
TWI317281B (en) Specific binding agents of human angiopoietin-2
HK1144949A (en) Specific binding agents of human angiopoietin-2
HK1076113B (en) Specific binding agents of human angiopoietin-2
HK1145692B (en) Specific binding agents of human angiopoietin-2
AU2006200977B2 (en) Specific binding agents of human angiopoietin-2
HK1133017B (en) Specific binding agents of human angiopoietin-2