RS51898B - Specifični agensi koji vezuju humani angiopoetin-2 - Google Patents

Abstract

SPECIFIČNI AGENSI KOJI VEZUJU HUMANI ANGIOPOETIN-2. Polipeptid koji sadrži najmanje jednu aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID. NO 2, SEQ ID. NO.: 4 i SEQ ID. NO: 76 do SEQ ID.NO.: 118 zaključno, pri čemu je dati polipeptid sposoban da se veže za Ang-2, i njegovefiziološki prihvatljive soli.Prijava sadrži još 43 patentna zahteva.

Description

Ova primena,u potpunosti, koristi prava U.S. Povisione patentne prijave Br.60/328,624 podnete 11. oktobra 2001.

OBLAST PRONALASKA

Ovaj pronalazak se tiče specifičnih vezujućih agenasa koji prepoznaju vezuju angiopoetin-2 (Ang-2). Pronalazak se, još specifičnije, tiče stvaranja, dijagnostičke primene i terapeutske primene specifičnih vezujućih agenasa i njihovih fragmenata, koji specifično vezuju Ang-2.

STANJE TEHNIKE

Angiogeneza, stvaranje novih krvnih sudova iz postojećih, je neophodna za mnoge fiziološke i patološke procese. Angiogeneza je, uobičajeno, regulisana proangiogenim i antiangiogenim faktorima, ali u slučaju oboljenja kao što su kancer, okularna neovaskularna bolest, artritis i psorijaza, proces može poprimiti pogrešan tok.

Folkman, J., Nat. Med., 1:27-31(1995).

Postoje brojna poznata oboljenja koja su udružena sa poremećenom ili neželjenom angiogenezom. Ove bolesti uključuju, ali nisu ograničene samo na, okularnu neovaskularizaciju, kao što su retinopatije (uključujući i dijabetesnu retinopatiju), makularnu degeneraciju povezanu sa godinama, psorijazu, hemangioblastom, hemangiom, arteriosklerozu, inflamacijske bolesti, kao što su reumatoidne ili reumatske inflamacijske bolesti, posebno artritisi (uključujući reumatoidni artritis), ili druge hronične zapaljenske poremećaje, kao što su hronična astma, arterijska ili posttransplantacijska ateroskleroza, endometrioza i neoplastične bolesti, na primer takozvane solidne tumore i tečne (ili hematopoezne) tumore (kao što su leukemije i limfomi). Ostala oboljenja koja su udružena sa neželjenom angiogenezom biće očigledna stručnjacima iz oblasti.

Iako su mnogi signalni prenosni sistemi uključeni u regulaciju angiogeneze, jedan od najhitnijih i najselektivnijih sistema za endotelnu ćeliju uključuje Tie-2 tirozinkinazni receptor (na koji se odnosi "Tie-2" ili "Tie-2R" (na koji se odnosi "ORK")); Mišji Tie-2 o kome reč kao o "tek"-u) i njegove Ugande, angiopoetine (Gale,N.W. and Yancopoulos,G.D.,Ge«e5Z)ev.l3:1055-1066[1999]). Postoje 4 poznata angiopoetina; angiopoetin-l("Ang-l") do angiopoetin-4 ("Ang-4"). Ovi angiopoetini su još označeni kao "Tie-2 ligandi". (Davis,S.,e/al, Cell,87:1161-1169[ 1996]; Grosios, K., etal, Cytogenet Cell Genet,84:118-120[ 1999]; Holash, J.,et al., Investigative Ophtalmology & Visual Science, A2:\617-1625[ 1999];Koblizek, T.I.,et al., Current Biology,8:529-532 [1998]; Lin,P .,et al, Proc Nati Acad Sci USA,95:8829-8834

[1998];Maisonpierre,P. C,et al., Science,277:55-60 [1997]; Papapetropoulos, A.,et al., Lablnvest,79:213-223 [1999]; Sato, T. N.,et al., Nature,375:70-74 [1998]; Shyu, K. G.,et al., Circulation,95:2081-2087 [1998]; Suri, C,et al, Cell,57:1171-1180

[1996]; Suri,C, et al, Science,252:468-471 [1998];Valenzuela, D. M.,et al, Proceedings of the National academy of Sciences of the USA,96:1904-1909 [1999]; Witzenbichler, B.,et al, J Biol Chem,273:18514-18521 [1998]). Budući da Ang-1 vezan za Tie-2 stimuliše fosforilaciju receptora u kultivisanim endotelnim ćelijama, primećeNO je da Ang-2 istovremeNO agonizuje i antagonizuje fosforilaciju Tie-2 receptora. (Daviš, S.,et al,[1996],supra;Maisonpierre, P.C.,et al,[1997],supra;Kim, I., J.H. Kim,et al,Oncogene 19(39): 4549-4552 (2000); Teichert-Kuliszevvska, K., P.C. Maisonpierre,et al.Cardiovascular Research 49(3): 659-70 (2001)).

FeNOtipi miševa bez Tie-2 i bez Ang-1 su slični i navodi se da Tie-2 fosforilacija koja je stimulisana Ang-1 posreduje u remodelovanju i stabilizaciji razvoja krvnih sudova in utero uz podršku ćelijske adhezije koja je podstaknuta endotelnom ćelijom. (Dumont, D.J.,et al, Genes & Development,8:1897-1909[ 1994]; Sato, T.N.,et al, Nature,376:70-74[1995];Suri, C.,et al, [\ 996\ supra).Uloga Ang-1 u stabilizaciji suda bi mogla biti sačuvana u odrasih, gde je naširoko i značajno potisnuta. (Hanahan, D.,Science,277:48-50 [1997]; Zagzag, D.,et al. Experimental Neurology,159:391-400[1999]). Nasuprot tome, Ang-2 ekspresija je primarno ograničena na mesta vaskularnog remodelovanja, gde se smatra da blokira funkciju Ang-1, pri čemu indukuje stanje vaskularne plastičnosti koja dovodi do angiogeneze. (Hanahan, D.,

[1997],5«pra;Holash,J.,et al, Science,284:1994-1998 [1999]; Maisonpierre, P. C.et

al, [1997], supra).

Mnoge objavljene studije su direktno pokazale sud-selektivnu ekspresiju Ang-2 u bolesnim stanjima udruženim sa angiogenezom. Ova patološka stanja uključuju, na primer, psorijazu, makularnu degeneraciju i kancer. (Bunone, G.,et al, American Journal of Pathology,155:1967-1976 [1999]; Etoh, T.,et al. Cancer Research,61:2145-2153 [2001]; Hangai, M.,et al. Investigative Ophthalmology & Visual Science,42:1617-1625 [2001]; Holash, J.,et al,[1999]supra;Kuroda, K.,et al. Journal of Investigative Dermatology,116:713-720 [2001]; Otani, A.,et al. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 40:1912-1920[1999]; Stratmann, A.,et al, American Journal of Pathology,153:1459-1466 [1998]; Tanaka, S.,et al, J Clin Invest,103:34-345 [1999]; Yoshida, Y.,et al. International Journal of Oncology,15:1221-1225[1999]; Yuan, K.,et al. Journal ofPeriodontal Research,35:165-171 [2000];Zagzag, D.,et al,[1999]supra).Mnoge od ovih studija su fokusirane na rak, pri tome da u mnogih tipova tumora dolazi do pojave Ang-2 ekspresije. Nasuprot njenoj pojavi kod patološke angiogeneze, Ang-2 ekspresija je u normalnim tkivima izrazito ograničena. (Maisonpierre, P. C,et al,[1997],supra;Mezquita, J.,et al, Biochemical and Biophysical Research Communications,260:492-498 [1999]). U zdravih odraslih, tri glavna mesta angiogeneze su ovarijum, placenta i uterus; Ovo su prvobitna, normalna (nekancerska) tkiva u kojih je pronađena Ang-2 mRNA.

Izvesne fukcionalne studije navode da Ang-2 može biti uključen u tumorsku angiogenezu. Ahmadet al ( Cancer Res.,61:1255-1259 [2001]) opisuju prekomernu ekspresiju Ang-2 i pokazuju da je ona direktno udružena sa rastom tumora u mišjem ksenograftskom modelu. Pogledati takođe Etohet al, supra,i Tanakaet al, supra,gde izloženi podaci prikazuju direktnu udruženost prekomerne ekspresije Ang-2 sa tumorskom hipervaskularizacijom. Međutim, nasuprot tome,Yu et al. ( Am. J. Path.,158:563-570 [2001]) objavljuju podatke koji pokazuju da povećana ekspresija Ang-2 u Lewisovom karcinomu pluća i u TA3 ćelijama karcinoma dojke direktno produžuje preživljavanje miševa kojima su ubrizgani odgovarajući zaraženi transplantati (transfektanti).

U proteklih nekoliko godina, različite publikacije navode Ang-1, Ang-2 ili/i Tie-2 kao moguće mete za antikancersku terapiju. Na primer, svaki od U.S. Patent NOs. 6,166,185, 5,650,490, and 5,814,464 otkriva koncept anti-Tie-2 ligand antitela i tela receptora. U srodnoj studiji, Linet al ( Proc. Natl Acad. Sci USA,95:8829-8834

[1998]) su ubrizgali miševima adenovirus koji eksprimira rastvorljivi Tie-2; Rastvorljivi Tie-2 direktNO smanjuje broj i veličinu tumora koji se razvijaju u miševa. U sličnoj studiji, Linet al, ( J. Clin. Invest.,100:2072-2078[1997]) su pacovima ubrizgali rastvorljivi oblik Tie-2; Ovo jedinjenje je direktno smanjilo veličinu tumora u pacova. Siemeister et al. (Cancer Res., 59:3185-3189[ 1999]) su stvorili ćelijske linije humanog melanoma koje eksprimiraju vanćelijski domen Tie-2, i ubrizgavali su ove ćelijske linije nagim miševima, i zaključili su da solubilni Tie-2 direktno dovodi do "značajne inhibicije" rasta tumora i tumorske angiogeneze. Pri pogledu na ovu informaciju i uz podatak da su i Ang-1 i Ang-2 vezani za Tie-2, nije jasno, iz ovih studija, da li bi Ang-1, Ang-2 ili Tie-2 bili atraktivni za antikancersku terapiju.

Fuzija nekih peptida sa stabilnim proteinom plazme, kakav je konstantni region Ig ,da bi se produžilo vreme poluživota ovih molekula, opisana je na primer u, PCT publikaciji WO 00/24782, objavljenoj 4.maja.2000.

Fuzija proteina ili njegovog fragmenta sa stabilnim proteinom plazme, kakav je konstantni region Ig, da bi se produžilo vreme poluživota ovih molekula je različito opisana (pogledati, na primer, U.S. Patent 5,480,981; Zhenget al, J. Itnmunol.,154:5590-5600, (1995); Fisheret al, N. Engl. J. Med.,334:1697-1702, (1996); Van Zee, K.et al, J. ImmuNOl,156:2221-2230, (1996); U.S. Patent 5,808,029, izdat 15. septemnoa 1998; Caponet al. Nature,337:525-531, (1989);Harvillet al, Immunotech.,1:95-105, (1995); WO 97/23614, objavljeNO 3. jula 1997; PCT/US 97/23183, fajl objavljen 11. decemnoa 1997; Linslev,J. Exp. Med.,174:561-569, (1991); WO 95/21258, izdat 10. avgusta 1995.).

WO 00/57901 se odnosi na sdminsitraciju aktivatora receptora TIE2 ili nati-Ang-w neutralizujućeg antitela za smanjenje ili inhibiciju surenja plazme kod sisara.

Delotvorna anti-Ang-2 terapija može koristiti širokoj populaciji pacijenata obolelih od raka, zato stoje većini solidnih tumora, da bi porasli više od 1-2 milimetra u promeru, neophodna neovaskularizacija. Takva terapija može imati širu primenu i kod drugih bolesti koje su udružene s angiogenezom kao što su retinopatije, artritis i psorijaza.

Postoji, nedovoljno iskorišćena, potreba da se otkriju novi agensi koji specifično prepoznaju i vezuju Ang-2. Takvi agensi bi bili korisni za dijagnostički skrining i terapeutsku intervenciju u bolesnim stanjima koja su udružena sa Ang-2 aktivnošću.

Prema tome, predmet predstavljenog pronalaska je da obezbedi posebne agense koji vezuju Ang-2 tako da modulišu Ang-2 aktivnost. Takvi agensi iz predstavljenog pronalaska su u obliku peptidnih tela, to jest, peptida koji su fuzionisani sa drugim molekulima kakav je Fc domen nekog antitela, gde peptidna polovina specifično vezuje Ang-2.

OPIS PRONALASKA

Ovaj pronalazak usmeren u jednom svom aspektu na peptide (o kojima je takođe ovde reč kao o polipeptidima) koji vezuju Ang-2. U predstavljeni pronalazak su uključeni i varijante i derivati takvih peptida.

Sledeći aspect ovog pronalaska je da su peptidi i njihove varijante i derivati iz predstavljenog pronalaska pridodati nosaču.

Još jedan aspekt je da peptidi mogu biti fuzionisani sa Fc domenom, s tim da obezbeđuju antitela. Eventualno, peptidna tela sadrže najmanje jedan peptid od, na primer, SEKV ID BR :3 - SEKV ID BR :6, ili SEKV ID BR :76 - SEKV ID BR :157, isto tako i njihove varijante i derivate. Dalje peptidi mogu uključivati najmanje jedan peptid koji odgovara formulama prikazanim u SEKV ID BR :65-SEKVID BR :75, i SEKVID BR :158.

Sledeći aspekt pronalaska obezbeđuje molekule nukleinske kiseline uključujući specifične vezujuće agense, i njihove varijante i derivate.

Još jedan aspect ovog pronalaska obezbeđuje molekule nukleinske kiseline koje kodiraju peptidna tela, kao i njihove varijante i derivate. Eventualno, takvi molekuli nukleinske kiseline uključuju SEKV ID BR :33- SEKV ID BR :53.

Sledeći aspekt pronalaska obezbeđuje metod smanjenja tumora primenom efektivne doze specifičnog vezujućeg agensa iz predstavljenog pronalaska subjektu kojem je potreban. Pronalazak takođe obezbeđuje metod inhibicije angiogeneze u subjektu uključujući primenu efektivne doze specifičnog vezujućeg agensa iz predstavljenog pronalaska subjektu kojem je potreban. Pronalazak dalje obezbeđuje metod lečenja subjekta, koji sadrži davanje efektivne doze specifičnog vezujućeg agensa iz predstavljenog pronalaska subjektu kojem je potreban.

Pronalazak se takođe tiče polipeptida koji može vezati Ang-2, pri čemu polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencuWDPWT(SEKV ID BR :65), pri čemu se polipeptid sastoji od 5 do 50 aminokiselina u dužini, kao i njegove fiziološki prihvatljive soli. Polipeptid takođe može da sadrži amino kiselinsku sekvencu:

i njene fiziološki prihvatljive soli. Još, polipeptid može da sadrži aminokiselinsku sekvencu: pri čemu je z<2>kiselinski ili neutralni polarni amino kiselinski ostatak i njene fiziološki prihvatljive soli. Polipeptid dalje može da sadrži amino kiselinsku sekvencu:

pri čemu je z<2>kiselinski ili neutralni polarni amino kiselinski ostatak i njene fiziološki prihvatljive soli.

Još jedna suština pronalaska se tiče polipeptida koji je sposoban da veže Ang-2 i koji sadrži amino kiselinsku sekvencu formule:

pri čemu:

a<1>,a<2>ia<3>su svaki za sebe nezavisno amino kiselinski ostaci; a5 je amino kiselinski ostatak; a<12>ne postoji ili je amino kiselinski ostatak; a<13>ne postoji ili je neutralni hidrofobni, neutralni polarni ili bazniamino kiselinski ostatak; a<14>je neutralni hidrofobni ili neutralni amino kiselinski ostatak i njihove fiziološki prihvatljive soli. Omilji aspect je da: a<1>je V,I,P,W,G,S,Q,N,E,K,R ili H;

a<2>je V,P,M,G,S,Q,D,E,K,R ili H;

a<3>je A,V,P,M,F,T,G,D,E,K ili H;

a8 je A,V,G,Q,N,D, ili E;

a12jeS,Q,N,D,E,K, ili R;

a13 je L,T, ili H; i

a14 je V,L,I,W, ili M

Još omiljenija suština je da: a 1 je Q, a 2 je E; a 3 je E; a S je D ili E;a 12 je D ili E; a 13 je H;ia<14>jeM.

Smatra se vrednim napomenuti daje upotreba malih slova sa gore napisanim brojevima (kao što su a<1>ili b<1>) zamišljena da označi amino kiselinska mesta, ali ne označava jednoslovne skraćenice za datu aminokiselinu. Jednoslovne skraćenice za date amino kiseline su ovde prikazane velikim slovom.

Pronalazak se dalje tiče polipeptida koji je sposoban da veže Ang-2 i koji sadrži amino kiselinsku sekvencu formule:

Pri čemu:

b<1>ne postoji ili je amino kiselinski ostatak,

b<2>ne postoji ili je neutralni hidrofobni, neutralni polarni ili bazniamino kiselinski ostatak;

b<3>,b4,b<5>i b<6>svaki za sebe nezavisno ne postoje ili su amino kiselinski ostaci;

b8 je amino kiselinski ostatak;

b<15>ne postoji ili je amino kiselinski ostatak;

b<16>ne postoji ili je neutralni hidrofobni, neutralni polarni ili bazniamino kiselinski ostatak;

b<17>ne postoji ili je je neutralni hidrofobni ili neutralni polarni amino kiselinski ostatak;

b ,b i b svaki za sebe nezavisno ne postoje ili su amino kiselinski ostatci; i njihove fiziološki prihvatljive soli. Omiljeni aspekt je da: b<1>ne postoji ili je A,V,L,P,W,F,T,G,S,Q,N,K,R, ili H;

b<2>ne postoji ili je A,V,L,I,P,W,M,T,G,S,Y,N,K,R, ili H;

b<3>ne postoji ili je A,L,I,P;W,M,T,G,S,Q,N,E,R, ili H;

b4 je V,I,P,W,G,S,Q,N,E,K,R, ili H;

b<s>je V,P,M,G,S,Q,D,E,K,R ili H;

b6 je A,V,P,M,F,T,G,D,E,K ili H;

b8 je A,V,G,Q,N,D, ili E;

b15jeS,Q,N,D,E,K ili R;

b<16>jeL,T,iliH;

bl7je V,L,I,W ili M;

b<18>ne postoji ili je A,V,L,P,W,F,T,G,Y,Q,D,E ili R;

b<19>ne<p>ostoji ili je V,L,I,P,T,G,S,Y,Q,N,D,E ili R; i

b2<0>ne<p>ostoji ili je V,L,P,W.M,T,G,S,Y,Q,N,D,K ili R.

Još jedan omiljeni aspekt je da: b 1 ne postoji, ili je P ili T;b 2 ne postoji ili je I ili N; b<3>ne postoji ili je R ili I; b<4>je Q; b<5>je E; b<6>je E; b<8>je D ili E; b<15>je D ili E; b<16>je H; b<17>je M; b<18>ne<p>ostoji ili je W ili P; b<19>ne postoji ili je G ili E; i b<20>ne postoji ili je V ili K.

Ceniće se to što se pronalazak najradije tiče polipeptida koji sadrži najmanje jednu aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe sastavljene od SEKV ID BR :4, i od SEKV ID BR :76 do uključujući SEKV ID NO: 118, pri čemu je polipeptid sposoban da veže Ang-2, kao i njegove fiziološki prihvatljive soli. Peptidne sekvence su prikazane ispod:

U sledećoj realizaciji, pronalazak se odnosi na sastav supstance (kompoziciju) formule:

i njegovih multimera, pri čemu je:

F<1>nosač;

X<1>i X<2>susvaki za sebe nezavisno izabrani od:

-(L')c-P<1>;-(LVP^LVP2; -(LVP^L2)d-P2-(L3)e-P3;-(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)rP4; pri čemu jedan ili više P',P<2>,P<3>i P<4>svaki za sebe nezavisno sadrže gore opisan polipeptid. Na primer, omiljeni aspekt je da P',P<2>,P<3>i P<4>mogu svaki za sebe nezavisno da sadrže polipeptid od SEKV ID BR :3 do SEKV ID BR :6, i/ili SEKV ID BR:76 do SEKV ED BR : 157. Sledeći aspect je da je jedinjenje od interesa formule." ili i njegove fiziološki prihvatljive soli, gde su X,,F<1>i X<2>ovde definisani. Sledeći aspect je da je jedinjenje od interesa formule: i njegove fiziološki prihvatljive soli, gde su Ll, Fl i P<l>ovde definisani. Još jedan aspekt je daje jedinjenje od interesa formule: i njegove fiziološki prihvatljive soli, gde su L\F\P\P<2>, i c i d ovde definisani. Sledeći aspekt je da je jedinjenje od interesa formule:

i njegove fiziološki prihvatljive soli. Najomiljeniji aspekt je da je F , Fc domen ili njegov fragment.

U najpreferentnijoj realizaciji, pronalazak se oddnsi na kompoziciju formule:

i njegovih multimera, pri čemu je:

F<l>nosač;

X<1>i X<2>su svaki za sebe nezavisno izabrani od

-dA-P<1>; -(lVp'-vLVp2; -(LV<p>'-tLVP^LVP<3>; -(L<1>)s-P'-(L<2>)t-P<2->(L<3>)u-P<3->(L<4>)v-P<4>; pri čemu jedan ili više P^P^P3 i P<4>svaki za sebe nezavisno sadrže polipeptid koji je izabran iz grupe koja se sastoji od: (a) aminokiselinske sekvence WDPWT (SEKV ID BR :65), pri čemu se polipeptid o kome je reč sastoji od 5 do 50 aminokiselina u nizu; (b) aminokiselinske sekvence WDPWT (SEKV ID BR :66); (c) aminokiselinske sekvence Cz<2>WDPWT (SEKV ID BR:67), pri čemu je z<2>kiseli ili neutralni polarni amino kiselinski ostatak; (d) aminokiselinske sekvence Cz<2>WDPWTC (SEKV ID BR:68), pri čemu je z<2>kiseli ili neutralni polarni amino kiselinski ostatak; (e) aminokiselinske sekvence:Pc<2>Dc4Lc6c7c<8>LY (SEKV ID BR:71) pri čemu je c<2>neutralni amino kiselinski ostatak;c<4>je A,D ili E; c<6>je kiseli amino kiselinski ostatak; c 7 je kiselinski ostatak; i c 8 je neutralni hidrofobni, neutralni polarni ili bazniamino kiselinski ostatak; (f) aminokiselinske sekvence Rpe3e<4>e<5>e<6>e<7>G (SEKV ID BR:73), pri čemu je e<3>neutralni polarni amino kiselinski ostatak; e<4>je kiseli amino kiselinski ostatak; e<5>je neutralni polarni ili kiseli amino kiselinski ostatak; e<6>je neutralni hidrofobni amino kiselinski ostatak; i e<7>je neutralni hidrofobni amino kiselinski ostatak; (g) aminokiselinske sekvence Cg<2>Gg<4>g<5>DPFTg<10>GCg<13>(SEKV ID BR:75) pri čemu je g<2>kiseli amino kiselinski ostatak; g<4>je neutralni hidrofobni amino kiselinski ostatak; g5 je neutralni polarni ili kiseli aminokiseinski ostatak; g10 je neutralni hidrofobni ili neutralni polarni amino kiselinski ostatak; i g13 je kiseli ostatak;

(i) polipeptida od SEKV ID BR:2; i

Pri čemu su L^L^L<3>i L<4>svaki za sebe nezavisno kopče; a q,r,s,t,u i v su svaki za sebe nezavisno 0 ili 1, pod uslovom daje najmanje jedan od q ili r jednak 1; i njihove fiziološki prihvatljive soli.

Treba uzeti u obzir to da se pronalazak dalje tiče fuzionog polipeptida koji sadrži najmanje jedan od opisanih peptida i nosač kao što je gore opisano, pri čemu je fuzioni polipeptid sposoban da veže Ang-2, i njegovih fiziološki prihvatljivih soli. U fuzionom polipeptidu, najbolje je, da je nosač najmanje jedan Fc domen, polietilen glikol, lipid, holesterolska grupa, ugljeni hidrat ili neki oligosaharid. Ostale podobne nosače, kakav je albumin ili slično, proceniće oni koji se razumeju u struku i oni su sadržani u opsegu pronalaska.

Onaj koji se razume u struku vrednovaće različite molekule koji mogu biti umetnuti u strukturu specifičnog vezujućeg agensa. Prema tome, dati molekul može biti umetnut, na primer između peptidnog dela i nosača specifičnog vezujućeg agensa, ili umetnut unutar samog peptidnog dela, sve dok podražava željenu aktivnost specifičnog vezujućeg agensa. Neki od molekula se, na primer, mogu odmah umetnuti, kao što su neki Fc domen ili njegov fragment, propilen glikol ili ostali srodni molekuli kakvi su dekstran, masna kiselina, lipid, holesterolska grupa, mali ugljeni hidrat, peptid, citotoksični agensi, terapeutski agensi, detektibilna sredina kao što je ovde opisano (uključujući fluorescentne agense, radioobeleživače kakvi su radioizotopi), oligosaharid, oligonukleotid, polinukleotid, interferentna (i druge) RNA, enzimi, hormoni i slično. Ostale molekule pogodne za dodavanje u ovaj oblik proceniće oni koji se razumeju u struku, i oni su sadržani u opsegu pronalaska. Ovo, na primer, uključuje inserciju jednog željenog molekula između dve konsekutivne amino kiseline, eventualno pripojene pogodnoj kopči. Prateći primer insercije u Con4(C) sekvencu peptidnog tela:

M-Fc-GGGGGAQQEECEWDPWTCEHMLE (SEKV ID BR :23)

Onaj koji se razume u struku može lako umetnuti željeni molekul između, na primer, dva susedna glutaminska ("QQ") ostatka da bi postigao željenu strukturu ili/i funkciju, sve dok se podržava mogućnost peptida da veže Ang-2. Dakle, ova sekvenca može biti modifikovana kao što sledi:

M-Fc-GGGGGAQ-[molekuI]-QEECEWDPWTCEHMLE

Podobni vezni molekuli mogu biti dodati ako se želi. Dalje će se uzeti u obzir da molekul može biti dodat na brojna mesta na molekulu uključujući prikladne bočne lance, između nosača i peptidne sekvence kao što sledi:

M-Fc-[molekul]- GGGGGAQQEECEWDPWTCEHMLE

ili na bilo kojem drugom mestu koje poželi onaj koji se razume u struku. Ostale pogodni aspekti mogu biti pridodati od onih koji se razumeju u struku.

Još jedan aspekt pronalaska se tiče polinukleotida koji kodira specifične vezujuće agense (uključujući, ali koji nisu ograničeni na peptide i peptidna tela) iz pronalaska, kako je ovde opisano. Onaj koji se razume u struku smatraće vrednim to što se tamo gde postoji poznata amino kiselinska sekvenca, mogu lako odrediti odgovarajuće nukleotidne sekvence primenom poznatih tehnika. Pogledati na primer Suzuki, D.,An Introduction to Genetic Analysis,W.H. Freeman Pub.Co. (1986). Primeri nukleotidnih sekvenci koje kodiraju peptide iz pronalaska su prikazani dole. Onaj koji se razume u struku će prepoznati da data aminokiselina može kodirati više od jednog kodona, tako da se opis odnosi bilo koju nukleotidnu sekvencu koja kodira peptide ili/i peptidna tela iz pronalaska.

U narednoj realzaciji, pronalazak se odnosi na vektore ekspresije koji sadrže najmanje jedan polinukleotid iz pronalaska. Još jedan aspekt pronalaska se tiče ćelija domaćina koje sadrže vektor ekspresije. Treba uzeti u obzir to da je najbolje da su ćelije domaćin prokariotske ćelije (kao što su E.coli ćelije) ili eukariotske ćelije.

Pronalazak se takođe odnosi na farmaceutske kompozicije koji sadrže efektivnu dozu ovde opisanih jedinjenja, z smeši sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.

Pronalazak se takođe odnosi na metod inhibicije neželjene angiogeneze u sisara, koji se sastoji u primeni efektivne terapeutske doze polipeptida ili jedinjenja kao što je gore opisano. Pronalazak se takođe odnosi na metod modulacije angiogeneze u sisara koja se sastoji u primeni terapeutski efektivne doze polipeptida ili jedinjenja, kao što je gore opisano. Pronalazak se dalje tiče metode inhibicije tumorskog rasta koja je praćena neželjenom angiogenezom u sisara, i koja se sastoji u primeni terapeutski efektivne doze polipeptida ili jedinjenja kao što je gore opisano. Još se pronalazak tiče i metode lečenja kancera u sisara, koja se sastoji u primeni terapeutski efektivne doze polipeptida ili jedinjenja kao što je gore opisano i jednog hemoterapeutskog agensa. Jedan od aspekata pronalaska je da je hemoterapeutski agens najmanje jedan 5-FU,CPT-ll i Taxotere. Smatraće se vrednim, međutim, što ostali podobni hemoterapeutski agensi i ostala antikancerska terapija mogu biti korišćeni.

Pronalazak se takođe tiče metoda modulacije bilo vaskularne permeabilnosti bilo isticanja plazme u sisara koja se sastoji u primeni terapeutski efektivne doze polipeptida ili jedinjenja kao što je gore opisano. Pronalazak se dalje tiče metoda lečenja bar jedne od očnih neovaskularnih bolesti, gojaznosti, inflamacijskih bolesti, inflamacijskih poremećaja, ateroskleroze, endometrioze, neoplastične bolesti, bolesti povezane s kostima, ili psorijaze u sisara koja se sastoji u primeni terapeutski efektivne doze polipeptida ili jedinjenja kao što je gore opisaNO.

Treba uzeti u obzir to što specifični vezujući agensi iz pronalaska mogu biti korišćeni u terapiji mnogih bolesti udruženih sa neregularnom ili neželjenom angiogenezom. Ove bolesti uključuju, ali nisu ograničene na, okularnu neovaskularizaciju, kakva je retinopatija (uključujući dijabetesnu retinopatiju i makularnu degeneraciju zavisnu od godina), psorijazu, hemangioblastom, hemangiom, aterosklerozu, inflamacijske bolesti, kao što su reumatoidne ili reumatske bolesti, posebno artritis (uključujući reumatoidni artritis), ili druge hronične hronične inflamacijske poremećaje, kao što su hronična astma, arterijska i posttraumatska ateroskleroza, endometrioza ili neoplastične bolesti, na primer, takozvane solidne tumore i tečne tumore (kakva je leukemija). Ostala oboljenja koja mogu biti tretirana priiv.enom specifičnih vezujućih agenasa biće jasne onima koji se razumeju u struku. Takva dodatna oboljenja uključuju, ali nisu ograničena na, gojaznost, vaskularnu permeabilnost, isticanje plazme i bolesti povezane s kostima, uključujući osteoporozu. Dakle, pronalazak se dalje odnosi na popipeptide i kompozicije za upotrebu u metodama lečenja ovih oboljenja koja su udružena sa poremećenom ili neželjenom angiogenezom.

Ostali aspekti ovog pronalaska biće, bez muke, jasni iz ovde prikazanog otkrića.

KRATAK OPISSLIKA

Slika1 prikazuje grafik zapremine tumora (y-osa) u odnosu na vreme (x-osa) u miševa koji imaju A-431 tumor i koji su tretirani peptidnim telom TN8-Con4-C iz predstavljenog pronalaska ili fosfatnim puferovanim slanim rastvorom (PBS). Detalji su objašnjeni u Primerima.

Slika2 prikazuje grafik koncentracije peptidnog tela (y-osa) u odnosu na vremensku post-dozu (x-osa) u miševa divljeg tipa koji su tretirani dozom od 50p,g bilo 2xCon4-C, L1-7-N bilo L1-21-N peptidnim telom. Detalji su objašnjeni u Primerima.

Slika3 prikazuje grafik zapremine tumora (y-osa) u odnosu na vreme (x-osa) u miševa koji imaju A431 tumor i koji su tretirani peptidnim telom 2xCon4-C prema predstavljenom pronalasku, ili fosfatnim puferovanim slanim rastvorom (PBS) ili kontrolnim peptidnim telom. Detalji su objašnjeni u Primerima.

Slika4 prikazuje grafik koji predstavlja rast, in vitro kultiviranih ćelija tumora A431, koje su tretirane peptidnim telom Con4-C prema predstavljenom pronalasku, kontrolnim peptidnim telom, ili su netretirane. Detalji su objašnjeni u Primerima.

Slika5 prikazuje grafik zapremine tumora (y-osa) u odnosu na vreme (x-osa) u Colo205 tumorskim ćelijama koje su tretirane peptidnim telom Con4-C, peptidnim telom L1-7-N, peptidnim telom L1-21-N, ili peptidnim telom 2xCon4-C prema predmetnom opisu, ili sa fosfatnim puferovanim slanim rastvorom (PBS), anti-Ang-2-antitelom (ab536) ili Fc-om.

Detalji su opisani u Primerima.

Slika 6 prikazuje grafik tumorske zapremine (y-osa) u odnosu na vreme (x-osa) u ksenograftu Colo205 tumora koji imaju miševi i koji su tretirani različitim dozama peptidnog tela 2xCon4-C koji odgovara predstavljenom pronalasku ili sa fosfatnim puferovanim slanim rastvorom(PBS) ili Fc. Detalji su opisani u Primerima.

Slika7 prikazuje grafik tumorske zapremine (y-osa) u odnosu na vreme (x-osa) u ksenograftu Colo205 tumora koji imaju miševi i koji su tretirani peptidnim telom 2xCon4-C koji odgovara predstavljenom pronalasku ili kontrolnim peptidnim telom. Slika 7 osim toga, prikazuje grafik CD-31 obojene oblasti (celokupna oblast tumora za ovapeptidna tela). Detalji su opisani u Primerima.

Slika8 prikazuje grafik tumorske zapremine (y-osa) u odnosu na vreme (x-osa) u ksenograftu Colo205 tumora koji imaju miševi i koji su tretirani peptidnim telom 2xCon4-C koji odgovara predstavljenom pronalasku ili sa fosfatnim puferovanim slanim rastvorom ili kontrolnim peptidnim telom. Detalji su opisani u Primerima. Ovaj grafik pokazuje da su anti-Ang-2 peptidna tela sposobna da inhibiraju rast Colo205 tumora nezavisno od vremena početka doziranja.

Slika9 prikazuje sažetak odnosa potpunog odgovora (CR- complete response) postignutog u golih mišica korišćenjem antitela Ab536 ili peptidnog tela 2xCon4-C, kod oba ksenografska modela A431 i Colo-205. Detalji su opisani u Primerima.

Slika 10A prikazuje grafik tumorske zapremine (y-osa) u odnosu na vreme (x-osa) u kseno graftu Colo205 tumora koji imaju miševi koji su tretirani peptidnim telom 2xCon4-C koji odgovara predstavljenom pronalasku, ili kombinacijom 2xCon4-C i taksotera, ili fosfatnim puferovanim slanim rastvorom (PBS), ili sa PBS plus taksotere. Detalji su opisani u Primerima.

Slika10B prikazuje grafik tumorske zapremine (y-osa) u odNOsu na vreme (x-osa) u kseNOgraftu Colo205 tumora koji NOse miševi koji su tretirani peptidnim telom 2xCon4-C koji odgovara predstavljenom pronalasku, ili kombinaciju 2xCon4-C i 5-FU, ili sa fosfatnim puferovanim slanim rastvorom (PBS) ili sa PBS plus 5-FU. Detalji su opisani u Primerima.

Slika11 prikazuje grafik porast nivoa (AUC±SE) u šapi pacova, model sa dodatno izazvanim artritisom, koji su tretirani peptidnim telom 2xCon4-C koji odgovara predstavljenom pronalasku, ili sa fosfatnim puferovanim slanim rastvorom (PBS) ili kontrolnim peptidnim telom ili normalnom ili artritis kontrolom. Detalji su opisani u Primerima.

Slika11B prikazuje grafik mineralne gustine kostiju šape kod modela pacova sa dodatno izazvanim artritisom, koji su tretirani sa peptidnim telom 2xCon4-C koji odgovara predstavljenom pronalasku, ili sa fosfatnim puferovanim slanim rastvorom, ili sa kontrolnim peptidnim telom ili normalnom ili artritis kontrolom. Detalji su opisani u Primerima.

Slika 11C prikazuje grafik promene telesne mase u modelu pacova sa dodatno indukovanim artritisom, koji su tretirani sa peptidnim telom 2xCon4-C koji odgovara predstavljenom pronalasku, ili sa fosfatnim puferovanim slanim rastvorom, ili sa kontrolnim peptidnim telom ili normalnom ili artritis kontrolom. Detalji su opisani u Primerima.

Slika 12 prikazuje dva grafika koji prikazuju inhibiciju VEGF-izazvane kornealne angiogeneze u pacova. Prvi grafik prikazuje nooj krvnih sudova izmerenih u pacova koji su tretirani goveđim serumskim albumiNOm (BSA), VEGF plus fosfatni puferovanii slani rastvor (PBS), ili VEGF plus PEPTIDNO TELO Con4-C iz pronalaska. Drugi grafik prikazuje površinu krvnog suda (mm2) u pacova koji su tretirani goveđim serumskim albumiNOm (BSA), VEGF plus fosfatnim puferovanim slanim rastvorom (PBS), ili VEGF plus peptidnim telom Con4-C iz pronalaska. Detalji su opisani u Primerima.

Slike 13A,13B i 13C prikazuju epitop koji mapira podatke (O.D: 370) za celokupnu dužinu humaNOg Ang-2 (hAng-2), od N-treminalnog kraja hAng-2, i do C-terminalnog kraja hAng-2, odnosno, za peptidna tela TN8-Con4-C, Li-7-N, i 12-9-3-C prema opisu, isto kao i za kontrolno peptidno telo , Tie2-Fc, C2B8 ili 5B12. Detalji su opisani u Primerima.

Slika 14 prikazuje vezujući afinitet (KD) peptidnog tela 2xCon-4-C koji odgovara pronalasku, primenom Sapidvne KinExA analize. Detalji su objašnjeni u Primerima.

Detaljan opis pronalaska

Podnaslovi se ovde koriste samo u organizacione svrhe, i ni na koji način ne ograničavaju predmet opisane prijave.

Za dobij anje rekombinantnog molekula DNK, proteina i antitela, kao i za transformacije kulture tkiva i ćelija, mogu se koristiti standardne tehnike. Enzimatske reakcije kao i tehnike prečišćavanja tipično se koriste prema specifikacijama navedenim od strane proizvođača, ili kako je to uobičajeno u datoj oblasti koristeći postupke navedene u Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratorv Manual. Cold Spring Harbor Laboratorv Press, Coid Spring Harbor, NY [1989]), ili kako je ovde to prikazano. Ukoliko nisu data posebna objašnjenja, upotrebljena nomenklatura, i ovde opisani laboratorijski postupci i tehnike analitičke hernije, sintetičke organske hernije, i medicinske i farmaceutske hernije, spadaju u one dobro poznate i uobičajeno korišćene u oblasti. Standardne tehnike se mogu koristiti u svrhe hemijske sinteze, hemijske analize, farmaceutskih preparacija, formulacija, i načina primene i u lečenju pacijenata.

Definicije

Izrazi koji se koriste u celokupnom tekstu definisani su kako sledi, osim ukoliko to nije na neki drugi način ograničeno u pojedinim slučajevima.

Termnin "Ang-2" odnosi se na polipeptid dat na slici 6 U.S. patenta br. 6,166,185 ("Tie-2 ligand-2") ili njegovih fragmenata kao i sličnih polipeptida koji uključuju alelične varijante, kombinovane (splice) varijante, derivate, supstitucije, deletacije, i / ili umetnute varijante, fuzione peptide i polipeptide, i homologe različitih vrsta. Polipeptid Ang-2 može, ili ne, sadržavati dodatne terminalne ostatke, na pr., sekvence vodilje, ciljane sekvence, amino terminalni metioninski, amino terminalni metioninski i lizinski ostke, i / ili tag ili fuzione proteinske sekvence, u zavisnosti od načina dobivanja.

Kada se izraz "biološki aktivan" koristi u vezi Ang-2 ili Ang-2 specifično vezujućeg agensa odnosi se na peptid ili polipeptid čija je najmanje jedna vrsta aktivnosti karakteristična za Ang-2 ili Ang-2 specifično vezujući agens. Specifično vezu jući agens Ang-2 može imati agonističku, antagonističku, ili neutrališuću ili blokirajuću aktivnost u odnosu na najmanje jednu od aktivnosti Ang-2.

Izraz "specifično vezujući agens" odnosi se na molekul, poželjno proteinu srodan molekul, koji se specifično vezuje za Ang-2, njegove varijante i derivate, kako je to ovde definisano. Specifično vezujući agens možl biti protein, nukleinska kiselina, ugljeni hidrat, lipid, ili jedinjenje male molekulske težine koje se preferencijalno vezuje za Ang-2. U poželjnoj realizaciji, specifično vezujući agens prema sadašnjem pronalasku jeste peptid ili peptibodj (peptidno telo), kao i fragmenti, varijante ili njihovi derivati, samostalni ili u kombinaciji drugim aminokiselinskim sekvencama, što se dobivaju poznatim tetmikama. Takve tehnike uključuju, ali nisu ograničene na, enzimatska raskidanja, hemijska raskidanja, peptidnu sintezu ili rekombinantne tehnike. Anti-Ang-2 specifično vezujući agensi predmetnog pronalaska sposobni su da se vezuju za delove Aqg-2 koji modulišu, na pr., inhibiraju, ili potpomažu, biološku aktivnost Ang-2 i / ili neku od drugih Ang-2 aktivnosti.

Izraz "varijante", kako se ovde koristi, uključuje one peptide i polipeptide gde su ammokiselinski ostaci insertovani, obrisani i / ili supstituisani u prirodnu (ili bar u poznatu) aminokiselinsku sekvencu u vezujući agens. Varijante predmetnog pronalaska uključuju fuzione proteine kako je dole opisano.

"Derivati" uključuju one vezujuće agense koji su hemijski modifikovani na bilo koji način koji je različit od insercionih, obrisanih ili suptitucionih varijanti.

"Specifično se vezuje za Ang-2" odnosi se na sposobnost specifično vezujućeg agensa (kao stoje peptibodi, ili njegov peptidni deo) predmetnog pronalaska da prepozna i da se veže za maturisani, humani Ang-2 polipeptid pune ili parcijalne dužine, ili je njegov ortolog, kao stoje njegov afinitet (određen pomoću Affinitv ELISA ili BIAcore ovde opisanim testovima)) ih njegovom neutralizacioom sposobnošću (određenom na pr., ELISA neutjraJizacionim testom ovde opisanim, ili sličnim testovima) od najmanje 10 puta većom, ali opciono 50 puta većom, 100,250 ili 500 puta većom ih Čak najmanje 1000 puta većom od afiniteta ili neutralizacione sposobnosti iste od bilo kog drugog angiopoietina ili drugog peptida ili polipeptida, gde je peptidni deo peptibodi prvo fuzionisan za humani Fc deo radi evaluacije takvim testom.

Izraz "epitop" odnosi se na deo bilo kog molekula koji može biti prepoznat i vezan specifično vezujućim agensom, na pr., peptibodi, najednom ili više antigen vezujućih regiona vezujućeg agensa. Epitopi se obično sastoje od hemijski aktivnih provršinskih grupacija molekula, kao što su na primer, aminokiseline, sporedni nizovi ugljenih hidrata, i imaju specifične trodimenzionalni: strukturalne karakteristike kao i specifične karakteristike naelektrisanja. Epitopi koji se ovde koriste mogu biti susedni ili ne.

Izraz "inhibirajući i / ili neutralizujući epitop" je epitop koji, kada je vezan za specifično vezujući agens kao stoje peptibodi, prouzrokuje gubitak (ili bar smanjenje) biološke aktivnosti molekula, ćelije, ili organizma koji sadrži takav epitop, in vivo, in vitro, ili in situ. U kontekstu sadašnjeg pronalaska, neutralizujući epitop se nalazi na, ili je povezan sa, biološki aktivnom konformaicjom Ang-2. Alternativno, izraz "aktivirajući epitop" je epitop koji kada je vezan za specifično vezujući agens sadašnjeg pronalaska, kao stoje antitelo, prouzrokuje aktivaciju, ili najmanje zadržavanje biološki aktivne konformacije Ang-2.

Izraz "peptibodi fragment" odnosi se na peptid ili poiipeptid koji uključuje manje od komplefnog, netaknutog peptidnog tela (peptibodi).

Izraz "prirodni" kada se koristi u vezi biološkog materijala kao što su molekuli nukleinskih kiselina, polipeptidi, ćelije domaćini, i slično, odnosi se na one koji se nalaze u prirodi i nisu modifikovani od strane ljudi.

Izraz "izolovani" kada se koristi u vezi Ang-2 ili u veži specifično vezujućeg agensa Ang-2, odnosi se na jedinjenje kome je uklonjen najmanje jedan kontaminirajući polipeptid ili jedinjenje koje se nalazi u prirodi, i poželjno suštinski očišćeno od drugih kontaminirajućih polipeptida sisara koji bi mogli da ometaju njegovu terapeutsku ili dijagnostičku upotrebu.

Izraz "zreli" kada se koristi u vezi Ang-2 peptibodi ili njegovog fragmenta, ili bilo kog specifično proteinu srodnog vezujućem agensu Ang-2 odnosi se na peptid ili polipetid kome nedostaje sekvenca vodilja ili signaMia sekvenca. Kada se vezujući agens predmetnog pronalaska ekspresuje, na primer, u prokariotskim ćelijama domaćina, "zreli" peptid ili polipeptid mogu takođe Uključivati dodatne aminokiselinske ostatke (ali njima još uvek nedostaje sekvenca vodilja) kao što su amino terminalni metionin, ili jedan ili više metioninskih ili lizmskih ostataka. Na ovakav način dobijeni peptid ili polipeptid može se koristiti sa ili bez navedenih i uklonjenih dodatnih aminokiselinskih ostataka.

Izrazi "efektivna količina" i " terapeutski efektivna količina " kada se koriste u vezi sa specifično vezujućim agensom Ang-2 odnosi se na količinu specifično vezujućeg agensa koja je korisna ili neophodna za podržavanje primetne promene na nivou jedne ili više od bioloških aktivnosti Ang-2. Promjena može biti povećanje ili smanjenje nivoa aktivnosti Ang-2. Poželjno je daje navtdena promena smanjenje ativnosti Ang-2.

Izraz "peptibodi" (peptidno telo), odnosi se na molekul koji uključuje Fc domen antitela vezan za najmanje jedan peptid. Proizvodnja peptibodi je uopšteno opisana u PCT publikaciji WO 00/24782, objavljene 4. maja, 2000.

Izraz "varijante," kako se ovde koristi, uključuje one molekule kao što su peptidi ili kombinacije peptid - nosač kao što su peptibodi predmetnog pronalaska gde su aminokiselinski ostaci insertovani u, obrisani iz, i / ili supstituisani, aminokiselinsku sekvencu molekula. Varijante koje imaju jednu ili više insertovanih aminokiselina uključuju fuzione proteine kako je dole opisano.

"Derivati" uključuje one peptide i / ili kombinacije peptid - nosač kao što su peptibodi koji su hemijski modifikovani na način koji se razlikuje od insercionih, obrisanih ili susptitucionih varijanti.

Izraz "fragment" odnosi se na peptid ili kombinaciju pfptid - nosač koja uključuje sekvencu manju od pune aminokiselinske sekvencei takvih peptida i / ili kombinacija peptid - nosač. Takvi fragmenti mogu nastati, na primer, skraćivanjem amino terminusa, skraćivanjem karboksi terminusa i / ili internom deletacijom ostatka (ostataka) aminokiselinske sekvence peptida ili kombinacije peptid - nosač. Fragmenti se mogu dobiti alternativnim RNK splajsovanjem ili iz in vivo ili in vitro aktivnosti proteaze. Takvi fragmenti se mogu konstruisati i koristeći hemijske sinteze peptida, ili modi likovanjem polinukleotida kojim se enkodira peptid, kombinaciju peptid - nosač, ili Fc deo i / ili peptidni deo peptibodi.

Izraz " Fc" odnosi se na jedan tip nosača sadašnjeg pronalaska, i uključuje sekvencu ne-antigen-vezujućeg fragmenta antitela nastalog proteolitičkom digestijom celog antitela, bez obzira na to da lije u monomernom ili multimernom obliku. Poželjno je daje izvor Fc u sadašnjem pronalasku pofpuno humani Fc, i može biti bilo koji od imunoglobulina, mada su IgGl i IgG2 om koji su poželjni. Međutim, ovde su uključeni Fc molekuli delimično humanog-porekla, kao i oni koji nisu humanog porekla. Fc se sastoje od monomernih polipeptida koji mogu biti vezani u dimerne ili multimeme forme ko valentnim (tj., disulfidnim) vezama, kao i neko valentnim asocijacijama. Broj intermolekuiskih disuliidnih veza između monomernih podjedinica nativnih Fc molekula je od 1 do 4, u zavisnosti od klase (na pr., IgG, IgA, IgE) ili podklase (na pr., IgGl, IgG2, IgQ3, IgAl, IgGA2). Jedan takav primer nativne Fc je disulfidno vezani dimer nastao jpapainskom digestijom IgG [videti Ellison et al. (1982), Nucl. Kiselinus. Res. 10:4071-9]. Izraz "nativni Fc" kako se ovde koristi je generičan monomernim, dimernim i multimernim oblicima.

Izraz "Fc domen" obuhvata nativni Fc i Fc varijantnf molekule i sekvence kako su gore opisani. Kao i kod Fc varijanti i nativnih Fc, izraz "Fc domen" uključuje molekule monomernih ili multimernih oblika, bez obzira da li su digestovani iz celokupnog antitela ili su dobiveni na neki drugi način.

Izraz "multimer" kada se primeni na Fc domene ili molekule koji uključuju Fc domene odnosi se na molekule koji imaju dva ili više pojlipeptidna niza kovalentno povezana, nekovalentno asocirana, ili povezana kovalentnim ili nekovalentnim interakcijama. IgG molekuli tipično formiraju dimere; IgM, pentamere; IgD, dimere; a IgA, monomere, dimere, trimere, ili tetramere. Multimeri mogu nastati korišćenjem sekvence i nastale aktivnosti nativnog Ig izvora Fc ili derivatizacijom (kako je defmisano dole ispod) takvog nativnog Fc.

Izraz "dimer" kada se primeni na Fc domene ili molekule koji uključuju Fc domene odnosi se na molekule koji imaju dva polipeptidna niza kovalentno ili nekovalentno vezana.

Izraz "nosač" odnosi se na molekul koji sprečava degradaciju i / ili povećava polu-život, redukuje toksičnost, redukuje imuni odgovor, ili povećava biološku aktivnost terapeutskog proteina. Primeri nosača ukjpučuju Fc domen kao i linearni polimer (na pr., polietilen glikol (PEG), polilizin, dekstran itd.); polimer račvastog niza (videti na primer, U.S. patent br. 4,289,872, Denkemvalter et al, izdat 15. septembra 1981.; U. S. patent br. 5,229,490, Tam, izdat 20. jula 1993.; WO 93/21259, Frechet etal. objavljen 28. oktobra 1993.); lipid, holesterolska grupa (steroid); ugljeni hidrat ili oligosaharid; ili bilo koji prirodni ili sintetički protein, polipeptid ili peptid koji se vezuje za receptor. Nosapi su dalje opisani dole.

Izraz "derivatizacija" i "derivat" ili "derivatizovan" uključuje procese i nastala jedinjenja pri čemu (1) jedinjenje ima ciklični deo; na primer, ukršteno povezivanje preko cisteinil ostataka u okviru jedinjenj a; (2) jedinjenje je ukršteno povezano ili ima ukršteno povezana mesta; na primer, jedinjenje ima cisteinil ostatak tako formirajući ukršteno povezane dimere u kulturi ili in vivo; (3) jedna ili više peptdil veza je zamenjeno ne-peptidil vezama; (4) N -terminus je zamenjen sa -NRR1, NRC(0)R1, - NRC(0)ORl, -NRS(0)2R1, -NHC(0)NHR, a sukcinimidnom grupom, ili supstituisanom ili nesupstituis&nom benziloksikarbonil-NH-, pri čemu su R i Rl supstituenti na prstenu defmisani dole; (5) C-terminus je zamenjen sa -C(0)R2 ili - NR3R4 pri čemu su R2, R3 and R4 definisani dole; i (6) jedinjenja kod kojih su pojedinačne aminokiselinske grupe modifikovane delovanjem agenasa sposobnih da reaguju sa odabranim sporednim nizovima ili terminalnim ostacima. Derivati su opisani u daljem tekstu.

Izraz "peptid" odnosi se na molekule koji sadrže 3 do oko 75 aminokiselina, sa poželjnim molekulima od 5 do 50 aminokiselina, poželjnijim sa 8 do 40 aminokiselina, a najpoželjniji su oni što sadrže 10 do 25 (aminokiselina. Peptidi mogu imati prirodnu ili veštačku (tj., onu koja se ne nalaziu prirodi) aminokiselinsku sekvencu. Egzemplarni peptidi mogu se generisati bilo kojim od ovde datih postupka, kao onim iz peptidne biblioteke (na pr., biblioteka fagi), generisanjem hemijskom sintezom, dobijenih digestijom pfoteina, ili generisanih pomoću rekombinantnih DNK tehnika.

Izraz "farmakološki aktivan" označava da tako opisapa supstanca ima aktivnost koja utiče na medicinske parametre (na pr., krvni pritisak, broj krvnih ćelija, nivo holesterola) ili stanje bolesti (na pr., rak, autoimuna oboljenja, itd.).

Izrazi "antagonistički peptid" ili "inhibitorski peptid" odnose se na peptid koji blokira ili na neki način ometa biološku aktivnost posm<A>tranog asociranog proteina, ili ima biološku aktivnost koja se može uporediti sa onom poznatog antagonista ili inhibitora posmatranog asociranog proteina. Tako izraz " Ang-2-antagonistički peptid" uključuje peptide koji se mogu identifikovati, ili dovesti u vezu sa, kao da imaju Ang-2 antagonističke karakteristike.

Dodatno, fiziološke prihvatljive soli jedinjenja predmetnog pronalaska su ovde takođe obuhvaćene. Izrazom "fiziološki prihvatljive soli" obuhvaćene su bilo koje poznate soli, ili one za koje će kasnije biti utvrđeno da su fiziološki prihvatljive. Neki specifični primeri su: acetat; trifluoroacetat. hidrohalogenidi, kao što su hidrohlorid i hidrobromid; sulfat; citrat; tartarat; gliko »olat; i oksalat, mezilat i fosfat.

Peptibodi

Jedan aspekt predmetnog pronalaska odnosi se na razvoj Ang-2 peptibodi. Često do interakcije proteinskog Uganda sa svojim receptorom dolazi na relativno velikoj površini. Međutim, kako je pokazano za humani hormon rasta i njegov receptor, samo nekoliko ključnih ostataka na međufazi najviše doprinosi energiji vezivanja. Clacksonet al, Science267: 383-6 (1995). Najveći deo proteinskog Uganda jedva da iskazuje vezujuće epitope u ispravnoj topologiji ili ima funkciju koja nije povezana sa funkcijom vezivanja. Tako se molekuli samo "peptidne" dužine (obično 2 do 40 aminokiselina) mogu vezati za receptor proteina datog velikog proteinskog Uganda. Takvi peptidi mogu podražavati bioaktivnost velikog proteinskog Uganda ("peptidni agonisti") ili, kroz kompetitivno vezivanje, inliibiiati bioaktivnost velikog proteinskog Uganda ("peptidni antagonisti").

Displej tehnologija fagi pojavila se kao važna metoda identifikovanja takvih peptidnih agonista i antagonista. Videti, na primer, Scottet al. Science249: 386 (1990); Devlinet al, Science249: 404 (1990); U.S. patent br. 5,223,409, izdat 29. juna, 1993.; U.S. patent br. 5,733,731, izdat 31. marta , 1998.; U.S. patent br. 5,498,530, izdat 12. marta, 1996.; U.S. patent br. 5,432,018, izdat 11. julal995.; U.S. patent br. 5,338,665, izdat 16. avgusta 1994.; U.S. patent br. 5,922,545, izdat 13. jula 1999.; WO 96/40987, objavljen 19. decembra 1996.; i WO 98/15833, objavljen 16. aprila 1998. (svi su ovde inkorporisani kao reference). Kod peptidnih fagi displej biblioteka, nasumične peptidne sekvence mogu se izložiti fuzijom sa pokrovnim proteinima filamentinih faga. Ukoliko se to želi, peptidi na displeju mogu se afinitetno eluirati naspram ekstracelularnog domena receptora imobilisanog antitelom. Zadržani fag može se obogatiti sukcesivnim afinitetnim prečišćavanjem i repropagacijom. Peptidi koji se najviše vezuju mogu biti sekvencionisani radi identifikacije ključnih ostataka u okviru jedne ili više strukturno povezane familije peptida Videti, na primer, Cwirlaet al, Science276: 1696-9 (1997), gde je prikazana identifikacija dve različite familije. Sekvenca peptida može takođe sugerisati koji od ostataka može biti slobodno zamenjen alaninskim skeniranjem ili mutagenezom na nivou DNK. Mutagenetske biblioteke mogu se dobiti i biti analizirane radi dalje optimizacije sekvence najbolje vezujućih molekula. Lowman,Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct,26: 401-24 (1997).

Strukturna analiza interakcije protein - protein može se takođe upotrebiti u cilju određivanja peptida koji podražavaju vezujuću aktivnost velikih proteinskih liganada. Pri takvoj analizi, kristalna struktura može sugerisati identitet i relativnu orijentaciju kritičnih ostataka velikog proteinskog Uganda, na osnovu koga bi se on mogao zamisliti. Videti, na primer, Takasakiet ah, Nature Biotech15: 1266-70 (1997). Ovi analitički postupci se mogu takođe upotrebiti radi istraživanja interakcija između receptorskog proteina i peptida odabranih na osnovu fagi displej postupka, što može sugerisati dalje modifikacije peptida u cilju povećanja afiniteta vezivanja.

Drugi postupci su konkurentni sa fagi displej postupkom u polju istraživanja peptida. Peptidna biblioteka se može fuzionisati za karboksilni terminus (završetak) lac represora i ekspresovatiu E. coli.Drugi postupak zasnovan naE. coliomogućava displej na ćelijskoj spoljnoj membrani fuzijom sa lipoproteinom asociranim sa peptidoglikanom (PAL). U kasnijem tekstu ove i slične metode nazivaju se zajedničkim imenom" E. colidisplej." Jednim drugim postupkom, translacija nasumične RNK se zaustavlja pre oslobađanja ribozoma, što rezultuje bibliotekom polipeptida sa svojim još uvek vezanom asociranom RNK. U kasnijem tekstu ove i slične metode nazivaju se zajedničkim imenom "ribozomski displej." Druge metode koriste hemijsku vezu peptida za RNK. Videti, na primer, Roberts i Szostak,Proc Natl Acad Sci USA,94: 12297-303

(1997). U kasnijem tekstu ove i slične metode nazivaju se zajedničkim imenom "RNK peptidni skrining." Razvijene su hemijski izvedene peptidne biblioteke gde su peptidi imobilizovani na stabilnim, ne-biološkim materijalima, kao što su polietilenske šipke ili za rastvarač propustljive smole. Jedna druga hemijski izvedena peptidna biblioteka koristi se fotolitografijom da bi se skenirali peptidi imobilisani na staklenim slajdovima. U kasnijem tekstu ove i slične metode nazivaju se zajedničkim imenom "hemijski peptid skrining." Postupak - hemijski peptid skrining - može biti koristan iz razloga što je njime omogućena upotreba D-aminokiselina, i drugih analoga koji se ne nalaze u prirodi, kao i ne-peptidnih elemenata. Pregled bioloških i hemijskih postupaka dat je u Wells i

Lowman,Curr. Opin. Biotechnol,3: 355-62 (1992).

Konceptualno, mogu se otkriti peptidni mimetici bilo kog proteina upotrebljavajući fagi displej i druge gore opisane postupke. Ovi postupci korišćeni su za mapiranje epitopa, za identifikaciju kritičnih aminokiselina u interakcijama protein - protein, i kao vodilje za otkrivanje novih terapeutskih agenasa. Videti na pr., Cortese et ah, Curr. Opin. Biotech. 7: 616-21 (1996). Danas se peptidne biblioteke najčešće koriste za imunološka istraživanja, kao što je mapiranje epitopa. Videti Kreeger, The Scientist 10(13): 19-20(1996).

Peptidi identifikovani skriningom pomoću fagi displej biblioteke radije se smatraju vodiljama (engl., leads) prilikom razvijanja terapeutskih agenasa, nego što su sami terapeutski agensi. Kao i drugi proteini i peptidi, oni bi se mogli lako i brzo uklonitiin vivofiltracijom u bubregu, celularnim mehanizmom prečišćavanja u retikuloendotelialnom sistemu ili proteolitičkom degradacijom [Francis,( supra) J.Kao rezultat toga, u oblasti se sada koriste peptidi u cilju validacije cilja nekog leka, ili kao pomoćno sredstvo prilikom osmišljavanja (dizajniranja) organskih jedinjenja do kojih se ne bi lako došlo, ili koja ne bi bila tako brzo identifikovana, skriningom hemijske biblioteke [Lowman,( supra) ;Kayet al, ( supra)].Korisno bi bilo za oblast od procesa kojim bi takvi peptidi u većem prinosu davali terapeuske agense za lečenje angiogeneze.

Struktura peptibodi

U farmaceutskim oblicima supstance dobijei e u skladu sa predmetnim pronalaskom peptid se može vezati za nosač preko peptidnog N - terminusa ili C - terminusa. Tako se molekuli nosač - peptid predmetnog pronalaska mogu opisati pomoću sledećih oet formula i njihovim multimerima:

Fi je nosač (poželjno Fc domen);

svaki Xii X2su nezavisno odabrani od -(Li)c-Pi, -(L|)c-P|-(L2)d-P2, -(Li)c-Pr(L2)d-P2-(L3)e-P3, and -(L,)c-P,-(L2)d-<p>2-(L3)e-P3-(L4)rP4,

svaki Pi, Pa, P3, i P4nezavisno predstavlja sekvence farmakološki aktivnih peptida kao što je ovde opisano;

svaki Li, L2, L3, i L4nezavisno predstavlja linkere; i

svaki "a", "b", "c", "d", "e", i "f su nezavisno 0 ili 1, uz uslov da bar jedan od "a" i "b" je 1.

Peptidi

Predmetni pronalazak obuhvata peptide koji se selektivno vezuju ili specifično vezuju za Ang-2. Bilo koji broj takvih peptida se može upotrebiti u skladu sa sadašnjim pronalaskom. Fagi displej je posebno koristan za generisanje peptida za potrebe sadašnjeg pronalaska, iz razloga što je pokazano da se afinitetna selekcija iz biblioteka nasumičnih peptida može identifikaciju peptidnih liganada na bilo kom mestu bilo Dedman et al, J. Biol. Client. 268: 23025-30 (1993).

Peptidi ovog pronalaska se mogu dobiti bilo kc|im postupkom koji je otkriven u oblasti. Upotrebljavaju je jednoslovne skraćenice aminokiselina. Oznaka "X" u bilo kojoj sekvenci (i kroz celokupnu specifikaciju, osim ukoliko se drugačije ne specificira u nekom trenutku) označava da može biti prisutan bilo koji od 20 prirodnih aminokiselinskih ostataka, ili bilo koja aminokiselina koja se na nalazi u prirodi

(opisane dole pod naslovom"Varijante"). Bilo koji od ovih peptida može biti vezan u nizu (tj., sekvencijalno). sa ili bez (inkera, a primeri u nizu vezanih primera dati su u tabeli. Linkeri su navedeni feao "L" mogu predstavljati bilo koji od onih ovde opisanih. Vezani niz se ponavlja i, radi jasnosti, linkeri su prikazani odvojeni crticama. Bilo koji peptid koji sadrži eisteinil ostatak može biti ukršteno povezan sa drugim peptidom koji sadrži Cys, a bilo koji od njih, ili oba mogu biti vezani za nosač. Bilo koji peptid što sadrži više od jednog Cys ostatka može graditi i intrapeptidnu disulfidnu vezu. Bilo koji od navedenih peptida može se derivatizovati, kakp je ovde to opisano. Kod derivata gde karboksilni završetak može biti zatvoren amino grupom, ta grupa jeste -NH2. Kod derivata gde su aminokiselinski ostaci supstituisane grupe supstitucije se označavaju sa S, što označava bilo koju funkcionalnost opisanu u Bhatnagar et al, J. Med, Chem. 39: 3814-9 (1996), i Cuthbertson et al, J. Med. Chem. 40: 2876-82 (1997), koje su ovde date kao reference. Svi peptidi su povezani peptidnim vezama, osim ukoliko to nije drugačije navedeno.

Nosači

U jednom svom aspektu, predmetni pronalazak omogućava da najmanje jedan peptid bude vezan za za najmanje jedan nosač (Fi, F2) preko N- terminusa (završetka), C-terminusa ili bočnog niza nekog aminokiselinskog ostatka jednog ili više peptida. Mogu se koristiti i multipli nosači; na pr., Fc na svakom terminusu ili Fc na terminusu i PEG grupa na drugom terminusu ili bočnom nizu.

Fc domen je poželjni nosač. Fc domen se može vezati zaN ili C terminuse peptida ili za oba, N i C terminuse.

Kako je gore napomenuto, Fc varijante su pogodni nosači u okviru obima pedmetnog pronalaska. Nativni Fc može se značajno modifikovati da bi se dobile Fc varijante u skladu sa sadašnjim pronalaskom, uz uslov daje zadržano vezivanje za receptor spasioc. Videti naprimer, WO 97/34631 i WO 96/32478.

Iz takvih Fc varijanti, može se ukloniti jedan ili više položaja iz nativne Fc, a koji doprinose strukturnim karakteristikama ili funkcionalnoj aktivnosti koja nije neophodna, fuzijom molekula sadašnjeg pronalaska. Ovi položaji mogu se ukloniti, naprimer, supstitucijom ili deletacijom (brisanjem) ostataka, insertovanjem ostataka u dati položaj, ili skraćivanjem delova gde se nalazi dati položaj. Insertovani ili supstituisani ostaci mogu takođe sadržavati izmenjene aminokiseline, kao što su peptidomimetici ili D-aminokiseline. Fc varijante su poželjne iz nekoliko razloga, od kojih su neke date dole. Primeri Fc varijanti uključuju molekule i sekvence u kojima: 1. Uklanjaju se položaji sa kojima se formiraju disulfidne veze. Takvim uklanjanjem mogu se izbeći reakcije sa drugim proteinima koji sadrže cistein u ćelijama domaćinima a koje služe za dobivanje molekula sadašnjeg pronalaska. U ovu svrhu, segment koji sadrži cistein na N-terminusu može se skratiti ili se cisteinski ostaci mogu obrisati ili susptituisati drugim aminokiselinama (na pr., alanil, ili seril). Čak i kada se cisteinski ostaci uklone, pojedinačni nizovi Fc domena još uvek mogu formirati dimerne Fc domene koji se drže zajedno nekovaltnim vezama. 2. Nativna Fc se modifikuje da bi bila kompatibilnija sa odabranom ćelijom domaćinom. Na primer, može se ukloniti PA sekvenca blizu N-terminusa tipične nativne Fc, koji se može prepoznati digestivnim enzimom izE. colikao što je prolin iminopeptidaza. Takođe se može dodati N-terminalni metionil ostatak, posebno kada se molekul rekombinantno ekspresuje u bakterijskoj( E. coli)ćeliji. 3. Uklanja se deo N-terminusa nativne Fc da bi se sprečila N-terminalna heterogenost prilikom ekspresije u odabranoj ćeliji domaćinu. U tu svrhu, može se obrisati bilo koji od prvih 20 aminokiselinskih ostataka na N-terminusu, posebno oni iz položaja 1, 2, 3,4 i 5. 4. Uklonjeno je jedno ili više mesta u kojima se vrši glikozilovanje. Ostaci koji se tipično glikoziluju (na pr., asparaginski) moga dati citolitički odgovor. Takvi ostaci se mogu obrisati ili supstituisati neglikozilovanim ostacima (na pr. alaninskim). 5. Uklanjaju se položaji koji stupaju u interakcije saikomplementom, kao što je vezivni položaj Clq. Na primer, može se obrisati ili supstituisati EKK sekvenca humanog IgGl. Dodavanje komplementa može biti da nije od koristi za molekule sadašnjeg pronalaska, te se na taj način izbegavaju takve Fc varijante. 6. Uklanjaju se položaji koji utiču na vezivanje za Fc receptore a koji ne predstavljaju receptor spasioc. Nativna Fc može posedovati položaje za interakciju sa određenim belim krvnim ćelijama a koji nisu neophodni molekulima koji se vezuju, tako da se oni mogu ukloniti. 7. Uklanja se ADCC položaj. ADCC položaji su poznati u oblasti. U vezi ADCC položaja kod IgGl, videti na primer, Molec. Immunoi 29 (5):633-9 (1992). Ni ovi položaji nisu potrebni fuzionim molekulima predmetnog pronalaska i mogu se ukloniti. 8. Kada se nativna Fc dobije iz antitela koje nije humanog porekla, nativna Fc se može humanizovati. U cilju humanizacije nativne Fc tipično se supstituišu odabrani ostaci, nativne Fc koja nije humanog porekla, ostacima koji se normalno nalaze u humanoj nativnoj Fc. Tehnike koje se koriste za humanizaciju antitela sa dobro poznate prosečnom stručnjaku.

Alternativni nosač može biti protein, polipeptid, peptid, antitelo, fragment antitela, ili mali molekul (na pr., peptidomimetičko jedinjenje) sposoban da se veže za receptor spasioc. Na primer, kao nosač bi se mogao upotrebiti polipeptid opisan u Presta et al, U.S. patent br. 5,739,277, izdat 14. aprila 19f 8. Peptidi se mogu takođe odabrati pomoću fagi displej za vezivanje za FcRn receptor spasioc. Takva jedinjenja koja se vezuju za receptor spasioc takođe su uključena u termin "nosač" spadaju u oblast sadašnjeg pronalaska. Takvi nosači bi trebalo da se odabiraju radi produženog poluživota (na pr., izbegavanjem sekvenci koje prepoznaju proteaze) i smanjenom imunogeničnošću (na pr., favorizovanjem ne-imununogenskih sekvenci, kako je to otkriveno kod humanizacije antitela).

Kako je gore naglašeno, polimerni nosači se mogu takođe upotrebiti za Fii F2. Sada su raspoloživi različiti postupci za vezivanje herojskih grupa kao nosača, videti na pr., Patent Cooperation Treatv "PCT" International Publication br. WO 96/11953, pod naslovom "N-Terminally Chemically Modified Protein Compositions and Methods," ovde navedene kao reference u svoj svojoj celokupnosti. U ovoj PCT publikaciji otkriva se, između ostalog, postupak selektivnog vezivanja u vodi rastvornih polimera za N-terminus proteina.

Poželjni polimer je polietilen glikol (PEG). Grupa PEG može biti bilo koje prihvatljive molekulske težine i može biti linearna ili račvasta. Prosečna molekulska težina PEG poželjno je u opsegu od oko 2 kiloDaltona ("kDa") do oko 100 kDa, poželjnije od oko 5 kDa do oko 50 kDa, najpoželjnije od oko 5 kDa do oko 10 kDa. Grupe PEG se obično vezuju za jedinjenja predmetnog pronalaska acilovanjem ili reduktivnim alkilovanjem reaktivnih grupa na PEG funkcionalnostima (na pr., aldehidna, amino, tiolna ili estarska grupa).

Prihvatljiva strategija PEGilovanja sintetičkih peptida sastoji se u kombinovanju, stvaranjem konjugovanih veza u rastvoru, peptida i PEG grupa od kojih svaki sadrži posebnu, međusobno reaktivnu, funkcionalnost. Peptidi se lako mogu dobiti koristeći konvencionalnu sintezu na čvrstoj fazi, stoje poznato u oblasti. Specifični položaj peptida se prethodno aktivira odgovarajućom funkcionalnom grupom. Prekursori se prečiste i potpuno okrarakterišu pre reakcije sa PEG grupom. Ligacija peptida sa PEG obično se vrši u vodenoj fazi i može se lako pratiti reversno faznom analitičkom HPLC. PEGilovani peptidi se lako prečišćavaju preparativnom HPLC i karakterišu analitičkom HPLC, analizom aminokiselina i lasersko desorpcionom masenom spektrometrijom.

Polisaharidni polimeri predstavljaju drugi tip u vodi rastvornih polimera koji se mogu koristiti za modifikaciju proteina. Dekstrani su polisaharidni polimeri koji se sastoje od pojedinačnih podjedinica glukoze uglavnom vezanih pomoću al-6-veza. Sam dekstran je raspoloživ u opsegu većeg broja molekulskih težina, a dekstran molekulskih težina od ok 1 kDa do oko 70 kDa je lako pristupačan. Dekstran je pogodan u vodi rastvorni polimer, koji se sam koristi u sadašnjem pronalasku kao nosač, ili u kombinaciji sa nekim drugim nosačem (na pr., Fc). Videti, na primer, WO 96/11953 and WO 96/05109. Objavljena je upotreba dekstrana konjugovanog za terapeutske ili dijagnostičke imunoglobuline, videti na primer, European Patent Publication br. 0 315 456, koja je pvde inkorporisana kao referenca. Dekstran molekulske težine od oko 1 kDa do okp 20 kDa je prioritetan, kada se dekstran koristi kao nosač u skladu sa sadašnjim pronalaskom.

Linkeri

Opciona je bilo koja grupa "linkera". Kada je prisutna, hemijska struktura linkera nije od kritične važnosti jer prvenstveno služi kao spejser. Poželjno je da se linker sastoji od aminokiselina međusobno povezanih peptidmm vezama. Tako, u poželjnim realizacijama linker sačinjavaju od 1 do 20 aminokiselina povezane peptidnim vezama, pri čemu su aminokiseline odabrane od 20 prirodnih aminokiselina. Jedna ili više od ovih aminokiselina se mogu glikozilovati, stoje vrlo poznato onima obučenim u oblasti. U poželjnijim realizacijama 1 do 20 aminokiselina su odabrane od glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina, i lizina. Još više poželjno, linker se sastoji najvećim delom od aminokiselina koje nisu sterno zaštićene, kao što su glicin i alanin. Tako su poželjni linkeri poliglicini (posebno (Gly)5, (Gly)s), poly(Gly-Ala) i polialamni. Kombinacije Gly i Ala su takođe poželjne, kao što ima linker na koji se ovde pozivamo kao Kl i ima aminokiselinsku sekvencu navedenu u ovde datim Primerima

Mogući su i linkeri koji nisu peptidi. Na primer, mogu se upotrebiti alkil linkeri kao stoje NH-(CH2)s-C(0)-, pri čemu s - 2-20. Ovi alkil linkeri se mogu dalje supstituisati bilo kojom grupom koja nije sterno zahtevna, kao stoje niža alkil grupa (na pr., Ci-Cg), niža acil grupa, halogen (na pr.. Cl, Br), CN, NH2, fenil grupa, itd. Primer ne-peptidnog linkera je PEG linker, i on je molekulske težine od 100 do 5000 kDa, poželjno 100 do 500 kDa. Peptidni linke 1 se mogu derivatizovati na isti način kako je gore opisano.

Varijante i derivati

Varijante i derivati specifično vezujućih agenasa su uključeni unutar polja sadašnjeg pronalaska. Od varijanti uključene su insercione, dtletacione i supstitucione varijante. Podrazumeva se da posebni specifično vezujući agensPCT/US02/32657 predmetnog pronalaska može sadržavati jednu, dve ili sve tri vrste varijanti. Insercione i supstitucione varijante mogu sadržavati prirodne aminokiseline, nekonvencionalne aminokiseline (kako je dole dato), ili obe vrste.

U jednom primeru su date insercione varijante pri čemu jedan ili više aminokiselinskih ostataka, prirodnih ili nekonvencionalnih aminokiselina, dopunjava aminkiselinsku sekvencu peptida ili peptibodi. Insertovani delovi se mogu nalaziti na bilo kom ili oba terminusa proteina, ili se mogu nalaziti unutar unutrašnjih oblasti aminokiselinske sekvence peptibodi. Insercione varijante sa dodatnim ostacima na bilo kom ili oba terminusa mogu uključivati, na primer, fuzione proteine i proteine koji uključuju obeležavanja amku»kiselinama. Insercione varijante uključuju peptide i peptibodi pri čemu se jedan ili više aminokiselinskih ostataka dodaje aminokiselinskoj sekvenci peptida ili peptibodi, ili njihovom fragmentu.

Varijantni proizvodi predmetnog pronalaska uključuju i maturisane peptide ili peptibodi gde su sekvenca vodilja ili signalna sekvenca ukloniene, a dobiveni proteini imaju dodatne aminokiselinske ostatke koji se sastoje od prirodnih aminokiselina ili onih koje to nisu. Zamišljeni su specifično vezujući agensi (kakvi su peptibodi) sa dodatnim metionil ostatkom u aminokiselinskom položaju -1 (Mef' -peptibodi), kao i specifično vezujući agensi sa dodatnim metioninskim i lizinskim ostacima u položajima -2 i -1 (Met"2-Lys '"-). Varijante sa dodatnim Met, Met-Lys, Lys ostacima (ili jednim ili više baznih ostataka) su posebno korisni u svrhu povećane proizvodnje rekombinantnih proteina u bakterijskim ćelijama domaćinima.

Pronalazak takođe obuhvata varijante specifično vezujućih agenasa sa dodatnim aminokiselinskim ostacima koji nastaju upotrebom specifičnih sistema ekspresije. Na primer, upotrebom komercijalno dostupnih vektora kojima se ekspresuje željeni polipeptid kao deo glutation-S-transferaze (GST) fuzionog proizvoda omogućava dobijanje željenog polipeptida sa dodatnim glicinskim ostatkom u aminokiselinskom položaju -1 posle uklanjanja GST komponente sa željenog polipeptida. Zamišljene su i varijante koje nastaju ekspresijom drugih vektorskih sistema, uključujući one gde su polihistiđinski obeleživači ugrađeni u aminokiselinsku sekvencu, obično na karboksilnom i / ili amino terminusu sekvence.

Insercione varijante uključuju i fuzione proteine gde su amino i / ili karboksilni terminusi peptida ili peptibodi vezani za drugi poiipeptid, njegov fragment ili aminokiseline koje nisu obično prepoznate kao delovi bilo koje specifične sekvence proteina. Primeri fuzionih proteina su polipeptidi koji seodnose na ili proizvode imuni odgovor, proteini sa dugačkim poluživotom cirkulacije, kao što su imunoglobulinski konstantni regioni, marker proteini, proteini ili polipeptidi koji olakšavaju prečišćavanje željenog peptida ili peptibodi, i polipeptidne sekvence koje potpomažu nastajanje multimernih proteina (kao što su leucinski ziper motiv, korisni u formiranju i za stabilnost dimera).

Ova vrsta insercionih varijanti obično se sastoji od, ili sadrži značajni deo nativnog molekula vezanog za N- i C-završetke, za celokupni drugi peptid ili za njegov deo. Na primer, fuzioni proteini tipično koriste sekvence vodilje drugih vrsta da bi se omogućila rekombinantna ekspresija proteina u heterolognom domaćinu. Drugi korisni fuzioni protein uključuje adiciju imunološki aktivnog domena, kao stoje epitop antitela, da bi se olakšalo prečišćavanje fuzionog proteina. Uključivanje mesta raskidanja na, ili blizu, mesta fuzije olakšaće uklanjanje nevažnog polipeptida posle prečišćavanja.

Druge korisne fuzije uključuju povezivanje funkcionalnih domena, kakvi su aktivna mesta enzima, domeni glikozilovanja, ćelijski ciljni signali ili transmembranske oblasti.

Postoje različiti komercijalno dostupni ekspresioni sistemi fuzionih proteina koji se mogu koristiti u skladu sa sadašnjim pronalaskom. Posebno korisni sistemi uključuju, ali nisu ograničeni na, glutation-S-transferaza (GST) sistem (Pharmacia), maltoza vezujući proteinski sistem (NEB, Beverlev, MA), FLAjG sistem (IBI, New Haven, CT), i 6xHis sistem (Qiagen, Chatsvvorth, CA). Ovi sistemi sposobni su da proizvode rekombinantne peptide i / ili peptibodi sa samo malim brojem dodatnih aminokiselina, za koje se ne čini da mogu značajno uticati na aktivnost peptida ili peptibodi. Na primer, oba, FLAG sistem i 6xHis sistem dodaju samo kratke sekvence, za koje se zna da su slabo antigenične i koje ne utiču nepovoljno na uvijanje polipetida u svoju nativnu konformaciju. Razmatrana je druga N-terminalna fuzija za koju se smatra daje korisna u fuziji Met-Lys dipeptida na N-terminalnom regionu proteina ili peptida. Takva fuzija može rezultovati povoljnim povećanjem proteinske ekspresije ili aktivnosti.

Kada je poželjno da se iseče fuzioni partner od željenog peptida ili peptibodi, drugi fuzioni sistemi proizvode polipeptidne hibride. U jednoj realizaciji, fuzioni partner je vezan za rekombinantni peptibodi peptidnom sekvencom koja sadrži specifičnu sekvencu prepoznavanja proteaze. Primeri pogodnih sekvenci su one koje prepoznaje Tobaeeo Etch Virus proteaza (Life 5 Technologies, Gaithersburg, MD) ili Factor Xa (New England Biolabs, Beverlev, MA).

Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje fuzione polipeptide koji uključuju sve ili delove peptibodi ili peptida sadašnjeg pronalaska, u kombinaciji sa skraćenim tkivnim faktorom (tTF). tTF je vaskularni ciljni agens koji se sastoji od skraćenog oblika humanog proteina koji indukuje koagulaciju i koji deluje kao agens za zgrušavanje krvi u tumorskim krvnim sudovima, kako je opisano u U.S. patentima br.: 5,877,289; 6,004,555; 6,132,729; 6,132,730; 6,156,321; i Evropskom patentu br. EP 0988056. Fuzija tTF za anti-Ang-2 peptibodi ili peptid, ili njegov fragment, olakšava isporuku anti-Ang-2 ciljanim ćelijama.

U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje deletacione varijante gde su uklonjeni jedan ili više aminokiselinskih ostataka u peptidu ili peptibodi. Deletacije (brisanja) se mogu izvršiti najednom ili oba terminusa peptibodi, ili uklanjanjem jednog ili više ostataka unutar aminokiselinske sekvence peptibodi. Deletacione varijante obavezno uključuju sve fragmente peptida ili peptibodi.

U još jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje supstitucione varijante peptida ili peptibodi sadašnjeg pronalaska. Supstitucione varijante uključuju one peptide i peptibodi gde su jedan ili više aminokiselinskih ostataka uklonjeni ili zamenjeni jednom ili više alternativnih aminokiselina, a aminokiseline mogu biti prirodne ili one koje se ne nalaze u prirodi. Supstitucione varijante generišu peptide ili peptibodi koji su "slični" originalnom peptidu ili peptibodi, pri čemu dva molekula imaju određen procenat identičnih aminokiselina. Supstitucione varijante uključuju supstitucije 1, 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,15, 20, 25, 30, aminokiselina unutar peptida ili peptibodi, pri čemu broj supstitucija može biti i do deset procenata, ili veći, peptida ili peptibodi. U jednom aspektu, supstitucije su po prirodi umerene, međutim, predmetni pronalazak obuhvata i supstitucije koje nisu umerene i koje uključuju i nekonvencionalne aminokiseline.

Identičnost i sličnost srodnih peptida i peptibodi može se lako izračunati poznatim metodama. Takvi postupci uključuju, ati nisu ograničeni na, one opisane u Computational Molecular Biologv, Lesk, A.M., ed., Oxford LJniversitv Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York (1993); Computer Analvsis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersev (1994); Sequence Analvsis in Molecular Biologv, von Heinje, G., Academic Press (1987); Sequence Analvsis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds„ M. Stockton Press, New York

(1991); i Carillo etal, SLAM J. ApplieiMath., 48:1073 (1988).

Poželjne metode određivanja sličnosti ili procenta identičnosti dva peptida ili polipeptida, ili polipeptida i peptida, osmišljene su da daju najveći broj poklapanja (match) upoređenih sekvenci. Metode za određivanje identiteta opisane su u javno dostupnim kompjuterkim programima. Poželjne kompjuterske metode za određivanje identičnosti dve sekvence uključuju, ali nisu ograničene na, GCG programski paket, uključujući GAP (Devereux et al., Nucl. Kiselinu. Res., 12:387 (1984); Genetics Computer Group, Universitv of Wisconsin, Madison, WI, BLASTP, BLASTN, and FASTA (Altschul et al, J. Mol. BioL, 215:403-410 (1990)). BLASTX program je javno dostupan od National Center for Biotechnologv Information (NCBI) i drugih izvora (BLASTManual, Altschul et al. NCB / NLM / NIH Bethesda, MD 20894; Altschul et al, supru (1990)). Dobro poznati Smith Waterman algoritam se takođe može upotrebiti za određivanje identičnosti.

Neke sheme poklapanja dve sekvence aminofeiselina mogu rezultovati poklapanjem dve sekvence u samo malom obimu, i ta mala poklopljena oblast može imati vrlo visoku identičnost sekvenci iako ne postoji značajna povezanost između pune dužine dve date sekvence. Shodno tome, u nekim realizacijama, odabrani metod za određivanje poklapanja (GAP program) daće poklapanje u rasponu od deset procenata pune dužine ciljanog polipetida koji se upoređuje, tj., najmanje 40 susednih aminokiselina u slučaju gde se uporeduju sekvence od najmanje 400 aminokiselina, 30 susednih aminokiselina u slučaju gde se 30 uporeduju sekvence od najmanje 300 do oko 400 aminokiselina, najmanje 20 susednih aminokiselina u slučaju gde se uporeduju sekvence od najmanje 200 do oko 300 aminokiselina, i najmanje 10 susednih aminokiselina u slučaju gde se uporeduju sekvence od najmanje 100 do 200 aminokiselina.

Na primer, upotrebom kompjuterskog algoritma GAP (Genetics Computer Group, Universitv of Wisconsin, Madison, WI), dva polipeptida, čiji se procenat identičnosti sekvence određuje, se porede u cilju optimalnog poklapanja njihovih odgovarajućih aminokiselina ("raspon poklapanja", stoje određeno algoritmom). U nekim realizacijama, zajedno sa algoritmom koristi se i hendikep praznine otvaranja (koji se tipično izračunava kao 3X prosečne dijagonale, "prosečna dijagonala" je prošek dijagonale upotrebljene matrice za poređenje; "dijagonala" je mnoštvo ili broj pripisan svakom savršenom aminokiselinskom poklapanju datom matricom za poređenje), hendikep praznine produženja (koji je obično 1/10 hendikepa praznine otvaranja), kao i matrice za poređenje kao što su PAM 250 ili BLOSUM 62. U nekim realizacijama, algoritam koristi i standardnu matricu za poređenje (videti Davhoff et al., Atlas of Protein Seguence and Structure, 5(3) (1978) za PAM 250 matricu poređenja; Henikoff et ah, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89:10915-10919 (1992) za BLOSUM 62 matricu poređenja).

U nekim realizacijama parametri za upoređenje polipeptidnih sekvenci uključuju sledeće: algoritam: Needleman et al, J. MolBioi, 48:443-453 (1970);

matrica za poređenje: BLOSUM 62 od Henikoff et a , supra (1992);

Gap Penalty (hendikep praznine):12

Gap Lenght Penalty(dužine hendikep praznine): 4

prag sličnosti: 0

Program GAP može biti koristan uz upotrebu gore datih parametara. U nekim realizacijama gore pomenuti parametri su zadati parametri za uporedenja polipeptida (zajedno sa izostankom hendikepa u slučaju praznine završetka) pomoću GAP algoritma.

U nekim realizacijama parametri za upoređenje sekvenci polinukleotidnih molekula (nasuprot aminokiselinskoj sekvenci) uključuju sledeće: algoritam: Needleman et al, supra (1970);

matrica za poređenje: poklapanja = +10,

promašaj=0

Gap Penalty(hendikep praznine): 50

Gap Lenght Penalty(dužine hendikep praznine): 3

Program GAP može biti koristan uz upotrebu gore datih parametara. Gore pomenuti parametri su zadati parametri za upoređenja polinukleotidnih molekula.

Drugi primeri algoritama, hendikepi praznine otvaranja, hendikep praznine, produženja, matrice upoređenja, prag sličnosti, itd., mogu se koristiti, uključujući one date u programskom priručniku Wisconsin Package, Version 9, September, 1997. Sta posebno odabrati biće jasno onome obučenom u oblasti i zavisiće od specifičnosti traženog upoređenja, kao stoje DNK-prema-DNK, protein-prema- protein, protein-prema-DNK; i dodatno, porede li se dati parovi sekvenci (u kom slučaju su obično poželjni GAP i BestFit) ili između jedne sekvence i velike baze podataka sekvenci (u kom slučaju su obično poželjni FASTA ili BLASTA).

Kako se ovde koristi, dvadeset konvencionalnih aminokiselina i njihove skraćenice slede konvencionalnu upotrebu. Videti Immunology~A Svnthesis (2"d 15

Edition, E. S. Golub and D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates<*>Sunderland, Mass. (1991)), koja je sadržana ovde kao referenca u bilo koju svrhu.

Aminokiseline mogu imati L ili D stereohemiju (osim Gly, koji nije ni L ni D) i polipeptidi i farmaceutske forme predmetnog pronalaska mogu uključivati stereohemijsku kombinaciju jedinjenja. Međutim, poželjna je L stereohemja jedinjenja. Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje reversne molekule pri čemu je sekvenca od amino završetka ka karboksi terminusu reversna. Na primer, reversnost molekula normalne sekvence Xt-X2-X3je X3-X2-Xi. Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje retro-reversne molekule pri čemu je, kao i gore, sekvenca od amino završetka ka karboksi terminusu reversna, a ostaci koji su obično "L" enantiomeri promenjeni su u "D" oblik.

Stereoizomeri (napr., D-aminokiseline) dvadeset konvencionalnih aminokiselina, aminokiselina koje nisu prirodne kao što su a-, a-disupstituisane aminokiseline, N-alkil aminokiseline, mlečna kiselina, i druge nekonvencionalne aminokiseline mogu takođe biti pogodne komponente za građenje polipeptida sadašnjeg pronalaska. Primeri nekonvencionalnih aminokiselina uključuju, bez ograničenja : aminoadipinsku kiselinu, beta-alanin, beta-aminopropansku kiselinu, aminobuternu kiselinu, piperidinsku kiselinu, aminokaprinsku kiselinu,aminoheptansku kiselinu, aminoizobuternu kiselinu, aminopimelinsku kiselinu, diaminobutemu kiselinu, desmozin, diaminopimelinsku kiselinu, diaminopropansku kiselinu, N-etilglicin, N-etilaspargin, hiroksilizin, allo-hidroksilisin, hidroksiprolin, izodesmozin, allo-izoleucin, M-metilglicin, sarkosin, N-metilizoleucin, N-metilvalin, norvalin, norleucin, oritin, 4-hidroksiprolin, y-karboksiglutamat, s-N,N,N-trimetillizin, s-N-acetillizin, O-fosfoserin, N-acetilserin, N-formilmetionin, 3-metilhistidin, 5-hidroksilizin. a-N-metilarginin, i druge slične aminokiseline i aminokiseline (na pr., 4-hidroksiprolin).

Slično, ukoliko se drugačije ne specificira, levi završetak polinukleotidne sekvence koja se sastoji od jednog niza naziva se 5' završetak; levi završetak polinukleotidne sekvence koja se sastoji od dva niza naziva se 5' direkcija (smer). Smer od 5' ka 3' adicije nascentnog RNK transkripta naziva se transkripcioni smer; oblasti sekvence DNK niza koji imaju istu sekvencu kao RNK i koji su 5' ka 5' završetku RNK transkripta nazivaju se "uzvodne sekvence"; oblasti sekvence DNK niza koji imaju imaju istu sekvencu kao RNK i koji su 3' ka 3' završetku RNK transkripta nazivaju se "nizvodne( nishodne)sekvence".

Podrazumevaće se da se aminokiselinski ostaci mogu podeliti na klase zasnovane na zajedničkim osobinama bočnog niza : 1. neutralni hidrofobni: Alanin (Ala; A), Valin (Val; V), Leucin (Leu; L),

Izoleucin (He; I), Prolin (Pro; P), Triptofan (Trp;; W), Fenilalanin (Phe; F), i Metionin (Met, M).

2. neutralni polarni: Glicin (Gly; G); Serin (Ser; S), Treonin (Thr; T),

Tirosin (Tyr; Y), Cistein (Cys;<*>), Glutamin (Glu; Q), Asparagin (Asn; N), i Norleucin.

3- kiseli: Asparaginska Kiselina (Asp; D), Glutaminska Kiselina (Glu; E); 4. bazni: Lizin (Lys; K), Arginin (Arg; R), Histidin (His; H). Vicleti Lewin, FJ., Genes V, Oxford University Press (1994), str. 11.

Konzervativne supstitucije aminokiselina mogu obuhvatiti nekonvencionalne aminokiselinske ostatke, koji se tipično radije ugrađuju hemijskom sintezom peptida nego sintezom u biološkim sistemima. One uključuju, bez ograničenja, peptidomimetike i druge reversne ili invertovane forme aminokiselmskih grupa. Supstitucije koje nisu umerene mogu uključivati izmenu člana jedne od ovih klasa članom druge klase.

Prilikom izvođenja ovakvih promena prema nekim realizacijama sadašnjeg pronalaska, uzima se u obzir hidropatični indeks aminokiselina. Svakoj aminokiselini pripisan je hidropatični indeks na osnovu karakteristika hidro fobnosti i naelekrisanja. Hidropatični indeksi aminokiselina su: izoleucin (+4.5); valin (+4.2); leucin (+3.8); fenilalanin (+2.8); cistein/cistin (+2.5); metionin (+1.9); alanin (+1.8); glicin (-0.4); treonin (-0.7); serin (-0.8); triptofan (-0.9): tirosin (-1.3); prolin (-1.6); histidin (-3.2); glutamat (-3.5); glutamin (-3.5); aspartat (-3.5); asparagin (-3.5); lizin (-3.9); i arginin (-4.5).

Važnost hidropatičnog aminokiselinskog indeksa u cilju dodeljivanja biološke funkcije proteinu poznato je u oblasti. Kyte et ah, J. Mol. Biol, 157:105-131 (1982). Poznato je da neke aminokiseline mogu biti supsfituisane drugim aminokiselinama sličnog hidropatičnog indeksa ili broja, i da i dalje zadrže sličnu biološku aktivnost. Prilikom izvođenja promena zasnovanih na hidropatičnom indeksu, u nekim realizacijama su uključene supstitucije aminokiselina čiji je hidropatični indeks unutar ±2. U nekim realizacijama su uključene one unutar ±1, a u nekim realizacijama one unutar ±0.5.

Takođe se podrazumeva u oblasti da se supstitucija sličnih aminokiselina može efikasno izvršiti na osnovu hidrofilnosti, posebno kada je tako stvoreni biološki funkcionalna peptibodi ili peptid namenjen upotrebi u imunološkim realizacijama, kao stoje to u sadašnjem slučaju. U nekim realizacijama, najveća lokalna prosečna hidrofilnost proteina, regulisana hidrofilnošću susednih aminokiselina, nalazi se u uzajamnom odnosu sa svojom imunogeničnošću i antigeničnošću, tj., sa biološkim osobinama proteina.

Sledeće vrednosti hidrofilnsoti su pripisane datim aminokiselinskim ostacima : arginin (+3.0); lizin (+3.0); aspartat (+3.0 ±1); glutamat (+3.0 ±1); serin (+0.3); asparagin (+0.2); glutamin (+0.2); glicin (0); treonin (-0.4); prolin (-0.5 ± 1); alanin (-0.5); histidin (-0.5); cistem (-1.0); metionin (-13); valin (-1.5); leucin (-1.8); izoleucin (-1.8); tirozin (-2.3); fenilalanin (-2.5) i triptofan (-3.4).

Prilikom izvođenja promena zasnovanih na sličnim vrednostima hidrofilnosti, u nekim realizacijama, uključena je supstitucija aminokiselina čije su vrednosti unutar ±2, u nekim realizacijama uključene su one unutar ±1, a u nekim realizacijama uključene su one unutar ±0.5. Mogu se identifikovati epitopi primarnih aminokiselinskih sekvenci na osnovu hidrofilnosti. Ovakve oblasti nazivaju se "oblasti jezgra epitopa."

Primeri aminokiselinskih supstitucija navedeni su dole u tabeli 2.

Tabela 2 Supstitucije aminokiselina

Prosečan stručnjak može da odredi ovde navedene pogodne varijante polipeptida koristeći dobro poznate tehnike. U nekim realizacijama, prosečan stručnjak može da definiše pogodne površine molekula koji se mogu promeniti bez uništavanja aktivnosti od strane oblasti za koje se veruje da nisu važni za aktivnost.

U nekim realizacijama, mogu se identifikovati ostaci i delovi molekula koji se čuvaju među sličnim peptidima ili polipeptidima. U nekim realizacijama, čak i površine koje mogu biti važne za biološku aktivnost ili strukturu mogu se podvrći umerenim supstitucijama aminokiselina bez uništavanja biološke aktivnosti ili bez nepovoljnog uticaja na polipeptidnu strukturu.

Dodatno, prosečan stručnjak može razmotriti studije struktura-funkcija i identifikovati ostatke iz sličnih polipeptida koji su važni za aktivnost ili strukturu. Imajući u vidu takva poređenja, može se predvideti važnost aminokiselinskih ostataka u proteinu koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima važnih za aktivnost u sličnim proteinima. Prosečan stručnjak može birati hemijski slične aminokiselinske supstitucije takvih važnih aminokiselinskih ostataka.

Prosečan stručnjakmože takođe analizirati trodimenzionalnu strukturu i aminokiselinsku sekvencu u odnosu na takvu strukturu u sličnim polipeptidima. U svetlu takve informacije, prosečan stručnjak može predvideti poklapanje aminokiselinskih ostataka u antitelu u odnosu na njenu trodimenzionalnu strukturu.

U nekim realizacijama, prosečan stručnjak može odabrati da ne čini radikalne izmene na aminokiselinskim ostacima za koje je predviđeno da se nalaze na površini proteina, jer bi takvi ostaci mogli biti uključeni u važne interakcije sa drugim molekulima. Štaviše, prosečan stručnjak može generisati test varijante sa jednom aminokiselinskom supstitucijom na svakom željenom aminokiselinskom ostatku. Varijante se zatim mogu testirati pomoću testova aktivnosti poznatim onima obučenim u oblasti. Navedene varijante mogu se iskoristiti za sakupljanje informacija o pogodnim varijantama. Na primer, ukoliko se otkrije da promena nekog aminokiselinskog ostatka rezultuje uništenom, nepoželjno smanjenom, ili nepogodnom aktivnosti, varijante sa takvim promenama se mogu izbeći. Drugim recima, na osnovu informacija sakupljenih rutinskim eksperimentima, prosečan stručnjak može lako odrediti aminokiseline čije bi dalje supstitucije trebalo izbegavati, zajedno ili u kombinaciji sa drugim mutacijama. Izvestan broj naučnih publikacija posvećenje predviđanju sekundarne strukture. Videti Moult L, Curr. Op. in Biotech., 7(4):422-427 (1996), Chou etal, Biochemistrv, 13(2):222-245 (1974); Chou et al, Biochemistrj, 113(2):211 -222 (1974); Chou et al, Adv. Enzvmol Relat. Areas Mol. Biol, 47:45-148 (1978); Chou etal.,Ann. Rev. Biochem., 47:251-276 i Chou etal, Biophvs. J., 26:367-384 (1979). Staviše, sada su dostupni kompjuterski programi koji pomažu predviđanju sekundarne strukture. Jedna od metoda za predviđanje sekundarne strukture zasnovana je na modelovanju homologijom. Na primer, dva polipeptida ili proteina sa identičnošću sekvence većom od 30 %, ili sličnošću od 40 % često imaju slične struturne topologije. Skori porast strukturne databaze proteina (PDB) omogućio je poboljšano predviđanje sekundarne strukture, uključujući mogući broj savijanja unutar strukture polipeptida ili proteina. Videti Holm et al, Nucl Acid. Res., 27(l):244-247 (1999). Predloženo je (Brenner et al, Curr. Op. Struct. Biol, 7(3):369-376 (1997)) da postoji ograničeni broj savijanja u datom polipetidu ili proteinu, i da će rešavanjem kritičnog broja struktura predviđanje struktura postati značajno preciznije.

Dodatne metode predviđanja sekundarne strukture uključuju "threading" (Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol, 7(3):377-87 (1997); Sippl et al, Structure, 20 4(1): 15-19

(1996)), "analizuprofilall (Bowie et al, Science, 253:164- 170 (1991); Gribskov etal, Meth. Enzym., 183:146-159 (1990); Gribskov etal, Proc. Nat. Acad. Set, S4(13): 4355-4358 (1987)), i "evolucionarao povezivanje" (Videti Holm, supra (1999), i Brenner, supra (1997)). U nekim realizacijama, varijante peptibodi uključuju glikozilovane varijante gde jedan ili više glikozilovanih položaja, kao stoje N- vezani položaj glikozilovanja, dodaju peptibodi. N-Vezani položaj glikozolovanja karakterisan je sekvencom Asn-X-Ser ili Asn-X-Thr, gde aminokiselinski ostatak označen kao X može biti bilo koji aminokiselinski ostatak osim prolina. Supstitucijom ili adicijom aminokiselinskih ostataka u cilju građenja ovakve sekvence nastaje potencijalno novi položaj za adiciju N-vezanog ugljovodoničnog niza. Alternativno, supstitucije kojima se eliminiše navedena sekvenca ukloniće i postojeći N-vezani ugljovodonični niz. Predmetnim pronalaskom takođe je obezbeđeno premeštanje N-vezanih ugljovodoničnih nizova pri čemu se jedan ili više N-vezanih položaja glikozilovanja (pretežno oni prirodni) jeliminišu a nastaje jedan ili više novih N-vezanih položaja. Pronalazak takođe obezbeđuje "derivate" koji uključuju peptibodi modifikovane drugačije od, ili kao dodatak, insercijama, deletacijama, ili supstitucijama aminokiselinskih ostataka. Poželjno je da su modifikacije kovalentne prirode i da uključuju, naprimer, hemijsku vezu sa polimerima, lipidima, drugim organskim i neorganskim grupama. Derivati predmetnog pronalaska dobijaju se radi povećanja poluživota peptibodi, ili se mogu dizajnirati u cilju poboljšanja ciljanja peptibodi željenih ćelija, tkiva ili organa. Primeri derivata uključuju grupe pri čemu su izvršene jedna ili više sledećih modifikacija: Jedna ili više peptidnih [-C(0)NR-] veza zamenjeno je vezom koja nije peptidna, kao stoje veza -CH2-karbamat [-CH2-0C(0)NR-]; fosfonatna veza; -CH2-sulfonamidna [-CH2-S(0)2NR-] veza; a urea [-NHC(0)NH-] veza; -CH2-sekundarna amino veza; ili alkilovana peptidil veza [-C(0)NR<6->gde R<6>predstavlja niži alkil]; • Peptidi gde je N-terminus derivatizovan u -NRR grupu ; u -NRC(0)R grupu; u - NRC(0)OR grupu; u -NRS(0)2R grupu; u -NHC(0)NHR grupu, pri čemu R i R, predstavljaju vodonik ili niži alkil, uz uslov da oba R i R| ne predstavljaju vodonik; u sukcinimidnu grupu; u benziloksikarbonil -NH- (CBZ-NH-) grupu; ili u benziloksikarbonil-NH- grupu za koju je vezano 1 do 3 supstituenta za fenil prsten odabranih od grupe koja se sastoji od niže alkil, niže alkoksi, hlora, i broma; i Peptidi gde je slobodni C terminus derivatizovan u -C(0)R<2>pri čemu je R odabrano od grupe koja se sastoji od niže alkoksi i -NR<3>R4pri čemu su R<3>i R<4>nezavisno odabrane od grupe koja se sastoji od vodonika i niže alkil. Pod "niža" podrazumevaju se grupe sa 1 do 6 ugljenikovih atoma. Dodatno, modifikacije individualnih aminokiselina mogu se uvesti u polipeptide ili formulacije predmetnog pronalaska reakcijom ciljanih aminokiselinskih ostataka peptida sa organskim sredstvom za derivatizaciju koje može reagovati sa odabranim bočnim nizovima ili terminalnim ostacima. Dati su sledeći primeri: Lizinil i amino terminalni ostaci mogu reagovati sa anhidridima ćilibarne ili drugih karboksilnih kiselina. Derivatizaeija ovim agensima uslovljava promenu šarže lizinil ostataka. Drugi pogodni reagensi za derivatizaciju alfa-amino-ostataka uključuju imidoestre kao što su metil pikolinimidat; piridoksaf fosfat; piridoksal; hlorborhidrid; trinitrobenzensulfonska kiselina; O-metilizourea; 2,4 pentandion; i transaminazom-katalizovana reakcija sa glioksilatom. Arginil ostaci se mogu modifikovati reakcijom sa jednim ili više konvencionalnih reagenasa, između ostalih fenilglioksalom, 2,3-butandionom, 1,2-cikloheksandionom, i ninhidrinom. Derivatizaeija argininskih ostataka zahteva da se reakcija izvodi pod alkalnim uslovima zbog visoke pKa guanidinske funkcionalne grupe. Nadalje, ovi reagensi mogu reagovati sa lizinskim grupama kao. Detaljno je proučavana specifična modifikacija tirozil ostataka per se , sa posebnim osvrtom na uvođenje spektralnih obeleživača u tirozil ostatke reakcijom sa aromatičnim diazonijum jedinjenjima ili tetranitrometanom. Obično se N-acetilimidizol i tetranitrometan mogu koristiti u cilju građenja O-acetil tirozil reakcionih vrsta i 3-nitro derivata. Karboksilne bočne grupe (aspartil ili glutamil) mogu se selektivno modifikovati reakcijom sa karbođiimidima (R'-N==C=N-R1) kgo što su 1 -cikloheksil-3-(2-morfolinil-(4-etil) karbođiimiđ ili l-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil) karbođiimiđ. Dalje, aspartil i glutamil ostaci mogu se tranformisati u asparagin i l i glutaminil ostatke reakcijom sa aaionijuni jonitna. Glutaminil i asparaginil ostaci se često deaminuju u odgovarajuće glutamil i aspartil ostatke. Alternativno, ovi ostaci se mogu deamidovati pod blago kiselim uslovima. Jedan i drugi oblik ovih ostataka su obuhvaćeni obimom predmetnog pronalaska. Derivatizaeija pomoću bifukcionalnih agenasa je korisna u cilju umrežavanja peptida ili njihovih funkcionalnih derivata u u vođi nerastvomu podržavajucu matricu ili u druge rnakromolekulske nosače. Uobičajeno korišćeni agensi za umrežavanje uključuju na pr., 1, l-bis(diazoacetil)-2-feniletan, glutaraldehid, N-hiđrok^kukdnhmidnfi estrc, na primer, estre 4-azidosahcilne kiseline, homobifunkcionalne imidoestre, uključujući disukcinimidil estre kao što je 3,3'-ditioMs(si^cinirnidilpropiomt), i bi funkcionalne imide maleinske kiseline kao stoje bis-N-maleitniđo-1,8-oktan. Agensi za denvatizaciju kao stoje metil-3-[(p-aziđofenil)đitio]propiormidat daju int^rnedijei« koji se mogu aktivirati svetlošću a koji grade ukrštene veze u prisustvu svetlosti. Alternativno, reaktivne matrice koje su nerastvome u vodi kao što su ugljeni hidrati aktivirani cijanogen bromiđom, kao i reaktivni supstrati opisani u U.S. pat. br. 3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537; i 4,330,440 mogu se koristiti u cilju tmobilizacije proteina. Druge moguće modifikacije uključuju hidroksilovanje prolina i lizina, fosforilovanje hidroksilnih grupa seril i treonil ostataka, oksidaciju sumporovog atoma u Cys, metilovanje alfa-amino grupa lizinskih, argininskih, i histidinskih bočnih nizova (Creighton, T.E., Protcins: Structure and Molecule Properties, W. H. Freeman & Co.sSan Francisco, str. 79-86 (1983)), acetilovanje N-terminalnih amina, i, u nekim slučajevima amidovanje C-terminalnih karboksilnih grupa. Poželjno je da tako modifikovane grupe poboljšavaju jednu ili više karakteristika jedinjenja, uključujući anti-angeniogeničnu aktivnost, rastvorljivost, apsorpciju, biološki poluživot i slično. Alternativno, derivatizovan} e grupa može rezultivati i time da jedinjenja imaju iste, suštinski iste, karakteristike i / ili osobine nederivatizovanog jedinjenja. Grupe mogu alternativno eliminisati ili prigušiti bilo koji sporedni efekat jedinjenj a, i slično.

Jedinjenja predmetnog pronalaska mogu se menjati i na DNK nivou. DNK

r--'kvenca bilo kog dela jedinjenja ino:": se promcniti u kodone kompatibilnije sa izabranom ćelijom domaćinom. Za E. coli, koja je poželjna ćelija domaćin, optimizovani kodoni su poznati u oblasti. Kodoni mogu biti supstituisani da bi se eliminisali restrikcioni položaji ili da bi se ubacili tihi restrikcioni položaji, koji mogu pomoći obradi DNK u odabranoj ćeliji domaćinu. Nosač, linker, i peptidne DNK sekvence mogu se modifikovati da uključe bilo koju od prethodnih promena sekvence. Tako su ovde diskutovane sve modifikacije, supstitucije, derivatizacije, itd., podjednako primenjene na sve aspekte sadašnjeg pronalaska, uključujući ali ne ograničavajući se na peptide, peptidne dimere, i multimere, linkere i nosače.

Dodatno, prosečan stručnjak može pregledati studije struktura-funkcija i identifikovati ostatke kod sličnih peptida važnih za aktivnost ili strukturu. Imajući u vidu takva poređenja, može se predvideti važnost aminokiselinskih ostataka u peptidu a koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima važnim za aktivnost ili strukturu sličnih peptida.

Prosečan stručnjak može izabrati hemijski slične aminokiselinske supstitucije predviđenih važnih aminokiselinskih ostataka peptida. Prosečan stručnjak takođe može analizirati trodimenzionalnu strukturu i aminokiselinsku sekvencu u odnosu na strukturu sličnih polipeptida. Imajući u vidu takvu informaciju, prosečan stručnjak može predvideti pružanje aminokiselinskih ostataka peptida u odnosu na svoju trodimenzionalnu strukturu. Prosečan stručnjak može odabrati da ne čini radikalne izmene aminokiselinskih ostataka za koje je predviđeno da će se nalaziti na površini proteina, jer ti ostaci mogu učestvovati u važnim interakcijama sa drugim molekulima. Staviše, prosečan stručnjak može generisati test varijante koje sadrže jednu supstituisanu aminokiselinu na bilo kom željenom aminokiselinskom ostatku. Varijante se zatim mogu testirati pomoću testova aktivnosti poznatim onima obučenim u oblasti. Dobijem podaci mogu se koristiti radi sakupljanja informacije o pogodnim varijantama. Na primer, ukoliko se otkrije da promena nekog posebnog aminokiselinskog ostatka vodi nestaloj, neželjeno redukovanoj ili neodgovarajućoj aktivnosti, varijante dobijene takvim izmenama se izbegavaju. Drugim recima, zasnovano na informaciji sakupljenoj takvim rutinskim eksperimentima, prosečan stručnjak može lako odrediti na kojima aminokiselinama bi trebalo izbegavati supstitucije, samostalne ili u kombinaciji sa drugim mutacijama.

Veći broj naučnih publikacija posvećenje predviđanju sekundarne strukture. Videti Moult J.. Curr. Op. in Biotech., 7(4): 422-427 (1996). Chou et al, Biochemistra, 13(2): 222-245 (1974); Chou et al., Biochemisitrv, 113(2): 211-222 (1974); Chou et al., Adv. Enzvmol. Relat. Areas Mol. Biol, 47: 45-148 (1978); Chou et al., Ann. Rev. Biochem., 47: 251-276 and Chou et al., Biophvs. J., 26: 367-384 (1979). Štaviše, sada su dostupni kompjuterski programi koji pomažu predviđanju sekundarne strukture. Jedna od metoda za predviđanje sekundarne strukture zasnovana je na modelovanju homologijom. Na primer, dva polipeptida ili proteina čija je identičnost sekvence veća od 30 %, ili sličnost veća od 40 %, često imaju slične strukturne topologije. Skori porast strukturne databaze proteina (PDB) omogućio je poboljšano predviđanje sekundarne strukture, uključujući mogući broj savijanja unutar strukture polipeptida ili proteina, Videti Holm et al., Nucl Acid. Res., 27(l):244-247 (1999). Predloženo je (Brenner et al., Curr. Op. Struct. Biol, 7(3):369-376 (1997)) da postoji ograničeni broj savijanja u datom polipetidu ili proteinu, i da će rešavanjem kritičnog broja struktura predviđanje struktura postati značajno preciznije.

Dodatne metode predviđanja sekundarne strukture uključuju" threading"(Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3):377-87 (1997); Sippl et al, Structure, 20 4(1): 15-19

(1996)), "analizu profila" (Bowie et al., Science, 253:164-170 (1991); Gribskov et al., Meth. Enzym., 183:146-159 (1990); Gribskov et al, Proc. Nat. Acad. Set, S4(13): 4355-4358 (1987)), i "evolucionarno povezivanje" (Videti Holm, supra (1999), i Brenner, supra (1997)). Predmetni pronalazak dalje obuhvata derivate specifično vezujućeg agensa, na pr., peptibodi, kovalentno modifikovane da uključe jedan ili više u vodi rastvorne polimerne dodatke, kao što su polietilen glikol, polioksietilen glikol, ili polpropilen glikol, kako je opisano u U.S. patent br.: 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192; i 4,179,337. Drugi korisni polimeri poznati u oblasti uključuju monometoksi-polietilen glikol, dekstran, celulozu ili druge polimere zasnovane na ugljenim hidratima, poli-(N-vinil pifolidon)-polietilen glikol, propilen glikol homopolimere, a polipropilen oksid /etilen oksid kopolimer, polioksietilovane poliole (na pr, glicerol) i polivinil alkohol, kao i smese ovih polimera. Posebno poželjni su peptibodi kovalentno modifikovani pomoću polietilen glikolnih (PEG) podjedinica. U vodi rastvorni polimeri mogu se vezati za specifične položaje, na primer za amino terminus peptibodi, ili nasumično vezati za jedan ili više bočnih nizova polipeptida. Upotreba PEG u cilju poboljšanja terapeutskog kapaciteta specifično vezujućih agenasa, na pr., pcptibod'. i posebno za humanizovana antitela. opisan je US patentom br. 6,133,426 (Gonzales et al.) izdat 17. oktobra 2000. Predmetnim pronalaskom takođe je razmatrana derivatizaeija peptida i / ili dela nosača jedinjenja. Takvi derivati mogu poboljšati rastvorljivost, apsorpciju, biološki poluživot, i slične osobine jedinjenja. Grupe se mogu alternativno eliminasti ili mogu prigušiti njihov bilo kakav sporedni, ili sličan, efekat. Primeri derivata uključuju jedinjenja kod kojih: 1. Jedinjenje ili neki njegov deo su ciklični. Na primer, peptidni deo se može tako modifikovati da sadrži dva ili više Cys ostatka (nit pr., u linkeru), koji mogu ciklizovati formiranjem disulfidne veze. 2. Jedinjenje je povezano ukrštanjem ili je tako napravljeno da može doći do ukrštanja između molekula. Na primer, peptidni deo se može modifikovati tako da sadrži Cys ostatak i stoga je sposobno da gradi intermolekulgku disulfidnu vezu sa sličnim molekulom. Jedinjenje se takođe može ukršteno pov zati preko svojih C-terminusa. 3. Jedna ili više peptidnih [-C(0)NR-] veza zamenjeiio je vezom koja nije peptidna. Primeri ne-peptidnih veza su -CH2-karbamat [-CH2-OC(0)NR-]; fosfonatna; - CH2-sulfonamidna [-CH2-S(0)2NR-] i urea [-NHC(0)NH-]; -CH2- sekundarna amino; ili alkilovana peptidil veza [-C(0)NR<6->gde predstavlja Rg niži alkil]. 4. N-terminus je derivatizovan. Tipično, N-terminus može biti acilovan ili modifikovan u supstituisani amin. Primeri N-termjnamih derivatnih grupa uključuju - NRRi(različitu od -NH2), -NRC(0)R,, -NRC(0)ORl, -NRS(0)2R1, - NHC(0)NHRi, sukcinimidnu, benziloksikarbonil-NH- (CBZ-NH-) grupu; pri čemu R i Rinezavisno predstavljaju vodonik ili niži alkil i gde fenil prsten može biti supstituisan pomoću 1 do 3 supstituenta odabranih grupe koja se sastoji od Cl - C4 alkil, C1-C4 alkoksi, hlora, i broma. 5. Slobodni C-terminus je derivatizovan. Tipično C-terminus se esterifikuje ili prevodi u amid. Na primer, mogu se upotrebiti postupci opisani u oblasti u cilju dodavanja grupe (NH-CH2-CH2-NH2)2- jedinjenju predmetnog pronalaska na C-terminus. Slično tome, mogu se koristiti metode opisane u oblasti u cilju dodavanja - NH2grupe jedinjenju predmetnog pronalaska na C-terminus. Primeri C-terminalnih derivata uključuju, na primer, -C(0)R.2 pri čemu R predstavlja nižu alkoksi ili -NR3R4pri čemu su R3i R4nezavisno predstavljaju vodonik i Ci-Csalkil grupu (poželjno C1-C4

■■'!-;! jr-ou).

6. Disulfidna veza zamenjuje se drugom, poželjno stabilnijom, grupom kojom se vrši ukrštanje (na pr., alkilenskom). Videti, na pr., Bhatnagar (supra); Alberts et al, Thirteenth Am. Pep. Symp., 357-9 (1993). 7. Jedan ili više pojedinačnih aminokiselinskih ostataka se modifikuje. Poznato je da različita sredstva za derivatizaciju specifično reaguju sa odabranim bočnim nizovima ili terminalnim ostacima, kako je to detaljno opisano u dlajem tekstu.

Lizinil ostaci i amino terminalni ostaci mogu reagovati sa anhidridima ćilibarne ili drugih karboksilnih kiselina. Derivatizaeija ovim agensima uslovljava promenu šarže lizinil ostataka. Drugi pogodni reagensi za defivatizaciju alfa-amino-ostataka uključuju imidoestre kao što su metil pikolinimidat; piridoksal fosfat; piridoksal; hlorborhidrid; trinitrobenzensulfonska kiselina; O-mefilizourea; 2,4 pentandion; i transaminaza-katalizovana reakcija sa glioksilatom.

Arginil ostaci se mogu modifikovati reakcijom sa jednim ili kombinacijom više konvencionalnih reagenasa, uključujući fenilglioksal, 2 t-butandion, 1,2-cikloheksandion, i ninhidrin. Derivatizaeija argininskih ostataka zahteva da se reakcija izvodi pod alkalnim uslovima zbog visoke pKa guamdinske funkcionalne grupe. Nadalje, ovi reagensi mogu reagovati sa lizinskim grupama kao i guanidino grupom arginina.

Specifična modifikacija tirozii ostataka per seje ekstenzivno proučavana, sa posebnim osvrtom na uvođenje spektralnih obeleživača u tirozii ostatke reakcijom sa aromatičnim diazonijum jedinjenjima ili tetranitrometanom. Obično se N-acetilimidizol i tetranitrometan koriste u cilju građenja O-acetil tirozil vrsta i 3-nitro derivata.

Karboksilne bočne grupe (aspartil ili glutamil) mogu se selektivno modifikovati reakcijom sa karbodiimidima (R'-N=C=N-R') kao što su 1-cikloheksil- 3-(2-morfolinil-(4-etil) karbođiimiđ ili l-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil) karbođiimiđ. Dalje, aspartil i glutamil ostaci mogu se tranformisati u asparaginil i glutaminil ostatke reakcijom sa amonijum jonima.

Glutaminil i asparaginil ostaci se često deaminuju u odgovarajuće glutamil i aspartil ostatke. Alternativno, ovi ostaci se mogu deamidovati pod blago kiselim uslovima. Jedan i drugi oblik ovih ostataka je obuhvaćen predmetnim pronalaskom.

Cisteinil ostaci se mogu zameniti aminokiselinskim ostacima ili drugim grupama radi eliminisanja disulfidnog vezivanja, ili, nasuprot tome, radi stabilizovanja ukrštenih veza. Videti, na pr., Bhatnagar,{ supra).

Derivatizaeija pomoću bifukcionalnih agenasa je korisna u cilju umrežavanja peptida ili njihovih funkcionalnih derivata u u vodi nerastvornu podržavajuću matricu ili u druge makromolekulske nosače. Uobičajeno korišćeni agensi za umrežavanje uključuju na pr., 1, l-bis(diazoacetil)-2-feniletan, glutaraldehid, N-hidroksisukcinimidne estre, na primer, estre 4-azidosalicilne kiseline, homobifunkcionalne imidoestre, uključujući disukcinimidil estre kao što je 3,3'-ditiobis(sukcinimidilpropionat), i bifunkcionalne imide maleinske kiseline kao stoje bis-N-maleimido-l,8-oktan. Agensi za derivatizaciju kao stoje metil-3- (p-azidofenil)ditio]propioimidat daju intermedijere koji se mogu aktivirati svetlošću a koji grade ukrštene veze u prisustvu svetlosti. Alternativno, reaktivne matrice koje su nerastvome u vodi kao što su ugljeni hidrati aktivirani cijanogen bromidom, kao i reaktivni supstrati opisani u U.S. pat. br. 3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537; i 4,330,440 mogu se koristiti u cilju imobilizacije proteina.

Ugljenohidratne (oligosaharidne) grupe mogu se pogodno vezati za položaje koji su poznati kao mesta glikozilovanja proteina. Obično, O-vezani oligosaharidi se vezuju za serinske (Ser) ili treoninske (Thr) ostatke dok se ponovo vezani oligosaharidi vezuju za asparaginske (Asn) ostatke kada su deo sekvence Asn-X-Ser / Thr, gde X može predstavljati bilo koju aminokiselinu osim prolina. X je poželjno jedna od 19 prirodnih aminokiselina a koja nije prolin. Strukture N-vezanih i O-vezanih oligosaharida i ostataka šećera nađenih u svakom od datih tipova je različit. Jedan tip šećera koji se uobičajeno nalazi u oba je N-acetilneuraminska kiselina (zove se i sialinska kiselina). Sialinska kiselina se obično nalazi kao terminalni ostatak kod oba, N-vezanih i O-vezanih oligosaharida i, usled svoje negativne šarže, uslovljava kisele osobine glikozilovanom jedinjenju. Tako mesto (mesta) mogu se ugraditi u linker koda jedinjenja predmetnog pronalaska i prvenstveno se glikoziliju u ćeliji za vreme rekombinantnog dobijanja polipeptidnih jedinjenja (na pr., u ćelijama sisara kao što su CHO, BHK, COS). Međutim, takva mesta se mogu dalje glikozilovati sintetičkim i polu-sintetičkim postupcima poznatim u oblasti tehnike.

Druge moguće modifikacije uključuju hidroksilovanje prolina i lizina, fosforilovanje hidroksilnih grupa seril i treonil ostataka, oksidaciju sumporovog atoma u Cys, metilovanje alfa-amino grupa lizinskih, argininskih, i histidinskih bočnih nizova [Creighton, T.E., Proteins: Structure and Molecule Properties (W. H. Freeman & Co., San Francisco) str. 79-86 (1983)].

Jedinjenja predmetnog pronalaska mogu se menjati i na DNK nivou. DNK sekvenca bilo kog dela jedinjenja može se promeniti u kodone kompatibilnije sa izabranom ćelijom domaćinom. Z&E. coli, koja je poželjna ćelija domaćin, optimizovani kodoni su poznati u oblasti. Kodoni mogu biti supstituisani da bi se eliminisali restrikcioni položaji ili da bi se ubacili tihi restrikcioni položaji, koji mogu pomoći obradi DNK u odabranoj ćeliji domaćinu. Nosač, linker, i peptidne DNK sekvence mogu se modifikovati da uključe bilo koju od prethodnih promena sekvence.

Maturaciia afiniteta

Jedna realizacija predmetnog pronalaska uključuje 'afinitetno zrele" peptide i peptibodi. Postupak ima u vidu povećanje afiniteta ili bioaktivnosti peptida i peptibodi predmetnog pronalaska koristeći fagi displej ili neku drugu tehnologiju za selekciju. Zasnovano na konsenzus sekvenci (koje se generiše za skup srodnih peptida), dirigovane sekundarne fagi displej biblioteke se mogu generisati pri čemu su "ćore" aminokiseline (određene na osnovu konsenzus sekvence) konstantne ili se menjaju sa učestalošću pojavljivanja. Alternativno, pojedinačne peptidne sekvence se mogu upotrebiti za generisanje pomerene, dirigovane fagi displej biblioteke. Ispiranjem takvih biblioteka dobivaju se peptidi (koji se mogu tensformisati u peptibodi) sa poboljšanom mogućnošću vezivanja zaAng-2 ili sa poboljšanom bioaktivnošću.

Ne-peptidni analozi / mimetika proteina

Dalje, zamišljeni su i ne-peptidni analozi kojima se omogućava stabilizovanje strukture ili postiže smanjena biodegradacija. Dobivanje analoga peptidomimetika se može izvršiti na osnovu odabranog inhibitornog peptida zamenjujući jedan ili više ostataka ne-peptidnim grupama. Prioriteno je da ne-peptidne grupe omoguće prirodne konformacije datog peptida, ili da stabilizuju poželjnu, na pr., bioaktivnu, konformaciju čime se zadržava sposobnost prepoznavanja i vezivanja za Ang-2. U jednom aspektu, dobiveni analog / mimetik ispoljava afinitet prema Ang-2. Jedan primer metoda za dobivanje ne-peptidnih mimetičkih analoga iz peptida opisan je u in Nachman et al, ?cgvl. Pcpt. 57:351>-.':70 (1995). Ukoliko:cželi. peptidi predmetnog pronalaska mogu se modifikovati, na primer, glikozilovanjem, amidovanjem, karboksilovanjem ili fosforilovanjem, ili transformacijom u kiselinske adicione soli, amide, estere, poželjno C-terminalne estre, i N-acil derivate peptida sadašnjeg pronalaska. Peptibodi se takođe mogu modifikovati i dobiti peptidni derivati građenjem kovalentnih ili nekovalentnih kompleksa sa drugim grupama. Kovalentno vezani kompleksi mogu se dobiti vezivanjem hemijskih grupa za funkcionalne grupe bočnih nizova aminokiselina uključujući peptibodi, za N- ili C-terminus.

Posebno, podrazumeva se da peptidi mogu biti vezani za reporter grupu, uključujući, ali ne ograničavajući se na radiomarker, fluorescentni marker, enzim (napr., onaj koji katalizuje kolorimetrijsku ili fluorometrijsku reakciju), supstrat, čvrstu matricu, ili nosač (na pr., biotin ili avidin). Predmetni pronalazak shodno tome obezbeđuje molekul koji uključuje molekul peptibodi, pri čemu dati molekul dalje uključuje reporter grupu odabranu od grupa što sadrže radiomarker, fluorescentni marker, enzim, supstrat, čvrstu matricu, i nosač. Takvi marker su dobro poznati prosečnom stručnjaku, na pr., biotinski marker su posebno planirani. Upotreba takvih marker je dobro poznata prosečnom stručnjaku i opisana je u, napr., U.S. patentima br.3,817,837; 3,850,752; 3,996,345; i 4,277,437. Ostali korisni markeri uključuju, ali ne ograničavajući se na, radioaktivne markere, fluorescentne markere i hemiluminiscentne markere. U.S. patenti u vezi navedenih markere uključuju, na primer, U.S. patent br. 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; i 3,996,345. Bilo koja peptibodi predmetnog pronalaska može uključiti jedan, dva ili više, bilo kog od navedenih markera.

Postupci za dobiiarrje peptida

Peptidi koji su predmet predmetnog pronalaska mogu se dobiti koristeći veliki broj različitih tehnika poznatih u oblasti. Na primer, navedeni peptidi mogu se sintetisati u n.stvoru ili na čvrstom nosaču u skladu sa konvencionalnim tehnikama. Komercijalno su dostupni različiti automatski smtesajzeri i mogu se upotrebiti u skladu sa poznatim protokolima. Videti, na primer, Stewart and Young (supra); Tam et al, J. Am. Chem. Soc, 105:6442, (1983); Merrifield, Science 232:341-347 (1986); Baranv and Merrifield, The Peptides, Gross and Meienhofer, eds, Academic Press, New York, 1-284; Baranv et al., Int. J. Pep. Protein Res., 30:705-739 (1987); i U.S. patent br. 5,424,398, svaki ovde unet kao referenca.

U postupcima sinteze peptida na čvrstoj fazi koristi se kopoli(stiren-divinilbenzen) koji sadrži 0.1 -1.0 mM amina / g polimera. U ovim postupcima za sintezu amina protekcija alfa-amino grupa se vrši butiloksikarbonil (t-BOC) ili 9-fluorenilmetiloksi-karbonil (FMOC) grupama. Oba postupka uključuju postupnu sintezu gde se jedna aminokiselina dodaje u svakom koraku polazeći od C-terminusa peptida (videti, Coligan et al., Curr. Prot. Immunol, Wiley Interscience, 1991, Unit 9). Po završetku sintezie, sintetički peptid se deprotektuje uklanjanjem t-BOC ili FMOC aminokiselinskih zaštitnih grupa i skida se sa polimera tretiranjem kiselinom na sniženoj temperaturi (na pr., tečna HF -10 % anizol u toku oko 0.25 do oko 1 sat na 0 °C). Posle uparavanja reagenasa, peptidi se ekstrahuju sa polimera rastvorom 1 % sirćetne kiseline koji se zatim liofilizuje i dobiva se sirovi materijal. On se normalno može prečistiti tehnikama kao što su gel filtrovanje na Sephadex G-15 nosaču koristeći 5 % sirćetnu kiselinu kao rastvarač. Liofilizacijom odgovarajućih frakcija eluiranih sa kolone dobivaju se homogeni peptidi ili peptidni derivati, koji zatim mogu biti karakterisani standardnim tehnikama kao što su analiza ammokiselina, tankoslojna hromatografija, HPLC, ultraljubičasta apsorpciona spektroskopija, molarna rotacija, rastvorljivost, i može se kvantifikovati Edmanovom degradacijom na čvrstoj fazi.

Postoje i drugi postupci, kao što je odabiranje peptida iz fagi displej biblioteke. Biblioteke se mogu pripremiti od seta aminokiselina kao je ovde opisano. Fagi displej može biti posebno efikasan u identifikovanju peptida korisnih u skladu sa sadašnjim pronalaskom. Ukratko, biblioteka faga se priprema (koristeći na pr., ml 13 fd, ili lambda fagi), prikazujući umetke (insercije) od 4 do oko 80 aminokiselinskih ostataka. Umetci mogu predstavljati, na primer, potpuno degenerisani ili pristrasan raspored. Zatim se mogu izabrati umetci koji nose fage koje se vezuju za željeni antigen. Ovaj proces se može ponoviti u nekoliko ponovnih selekcija fage koja se vezuje za željeni antigen. Ponavljanja dovode do obogaćivanja specifičnih sekvenci koje nose fag. Može se izvesti anali/a DNK sekvence u cilju identifikacije sekvenci eksprese;.anih peptida. Može se odrediti minimalni linearni deo sekvence koja se vezuje za željeni antigen. Postupak se može ponoviti koristeći devijantnu biblioteku koja sadrži umetke sa delimičnim ili celokupnim minimalnim linearnim delom plus jednim ili više dodatnih degenerisanih ostataka uzvodno ili nizvodno od njega. Ovim tehnikama mogu se identifikovati peptidi predmetnog pronalaska koji poseduju još veći vezujući afinitet prema Ang-2 od agenasa koji su ovde već identifikovani.

Bez obzira na način na koji se dobivaju peptidi, molekul nukleinske kiseline što enkodira svaki takav peptid i peptibodi se može generisati pomoću standardnog postupka koristeći rekombinantnu DNK. Nukleotidnom sekvencom takvog DNK molekula može se pogodno manipulisati ne menjajući aminokiselinsku sekvencu koju oni kodiraju na račun degenerisanosti koda nukleinske kiseline kao i na račun preference kodona u specifičnoj ćeliji domaćinig.

Tehnike rekombinantne DNK predstavljaju pogodan postupak za dobijanje peptibodi pune dužine, kao i drugih velikih specifičnih vezujućih agenasa predmetnog pronalaska , koji jesu proteini ili podsjećaju na proteine, ili njihovih fragmenata. DNK molekul koji kodira peptibodi ili fragment može se insertovati u ekspresioni vektor, koji se potom može insertovati u ćeliju domaćina u cilju proizvodnje antitela ili fragmenta.

Generalno se DNK molekul koji enkodira peptid ili peptibodi može dobiti koristeći ovde opisane postupke u Primerima. Probe i tipični uslovi hibridizacije su dati u Ausubel et dl. (Current Protocols in Molecular Biologv, Current Protocols Press

[1994]). Posle hibridizacije ispitivani blot se ispira uz odgovarajuću rigoroznost, u zavisnosti od faktora kao što su veličina probe, očekivana homologija probe u odnosu na klon, vrsta biblioteke koja se ispituje, i broja klonova koje se ispituju. Primeri testiranja velike strogoće su 0.1 X SSC, i 0.1 procenat SDS na temperaturi 50-65 °C.

Dvohibridne metode testiranja (skrining) koje koriste kvasac mogu se upotrebiti za identifikaciju peptida predmetnog pronalaska koji se vezuju za Ang-2. Tako se antigen, ili njegov fragment, mogu koristiti za testiranje peptidnih biblioteka, uključujući displej biblioteke faga, za identifikaciju i selekciju Ang-2 vezujućih agenasa, na pr., peptibodi, predmetnog pronalaska .

Alternativno, različiti ekspresioni vektori / sistemi domaćini se mogu koristiti lokalizaciju i ekspresiju peptida predmetnog pronalaska . Takvi sistemi uključuju ali nisu ograničeni na mikroorganizme kao što su transformisane bakterije pomoću rekombinantne bakteriofage, plasmiđ ili kozmid DNK ekspresionih vektora, transformisani kvasac pomoću ekspresionih vektora kvasca, ćelijskih sistema insekata inficiranih ekspresionim vektorima virusa (na pr., bakulovirusom), ćelijskim sistemom biljaka transfektovanih ekspresionim vektorima virusa (na pr., mozaičnim virusom karfiola, CaMV, mozaičnim virusom duvana, TMV) ili transformisanih pomoću bakterijskih ekspresionih vektora (na pr., Ti ili pBR322 plazmid); ili ćelijskim sistemima životinja. Ćelije sisara korisne za dobivanje rekombinantnih proteina uključuju, ali nisu ograničene na, VERO ćelije, HeLa ćelije, ćelijske linije jajnika Kineskog hrčka (CHO), COS ćelije (kao što su COS-7), W138, BHK, HepG2,3T3, RIN, MDCK, A549, PC 12, K562 i 293 ćelije. Primeri protokola za rekombinantnu ekspresiju peptida opisani su dole.

Izraz "ekspresioni vektor" odnosi se na plazmid, j igi, virus ili vektor, za ekspresiju polipeptida iz DNK (RNK) sekvence. Ekspresioni vektor može uključivati transkripcionu jedinicu koja uključuje skup (1) genetičkog elementa ili elemenata koji sadrže regulatorsku ulogu u ekspresiji gena, na primer, promotori ili pospešivači, (2) strukturu ili sekvencu koja enkodira vezujući agens koja je transkribovana u mRNK i translatovana u protein, i (3) odgovarajuće transkripcione sekvence inicijacije i terminacije. Strukturne jedinice koje se koriste u ekspresionim sistemima kvasca ili eukariotskim ekspresionim sistemima prvenstveno uključuju sekvencu vodilju čime se omogućava ekstracelulama sekrecija translatovanog proteina od strane ćelije domaćina. Alternativno, u slučaju kada je rekombinantni protein ekspresovan bez sekvence vodilje ili transportne sekvence, on može sadržavati amino terminalni metioninskiOstatak. Ovaj ostatak može, ili ne, biti potom uklonjen sa ekspresovanog rekombinantnog proteina pri čemu se dobiva krajnji peptidni proizvod.

Na primer, peptidi se mogu rekombinantno ekspresovati u kvascu koristeći komercijalno dostupni ekspresioni sistem, na pr., the PichiaExpression Svstem (Invitrogen, San Diego, CA), sledeći instrukcije proizvođača. Ovaj sistem se oslanja na pre-pro-alfa sekvencu radi upravljanja sekrecijom, ali je transkripcija insercija vođena promotorom alkohol oksidaze (AOXI) kada se izvrši indukcija metanolom.

Sekretovani peptid se prečišćava od medijuma rasta kvasca pomoću, na pr., metoda koje se koriste za prečišćavanje peptida od bakterijskih i humanih ćelijskih supernatanata. Alternativno, cDNK kodirajući peptid se može klonirati u bakulovirus ekspresioni vektor pVL1393 (PharMingen, San Diego, CA). Takav vektor se može upotrebiti prema proizvođačkim uputstvima (PharMingen) radi infekcije ćelija Spodoptera frugiperda u sF9 od proteina: slobodnom medijumu čime se dobiva rekombinantni protein. Rekombinantni protein se može prečistiti i koncentrovati iz medijuma koristeći kolonu heparin-sefaroza (Pharmacia).

Alternativno, peptid se može ekspresovati u sistemu insekta. Sistemi insekata za ekspresiju proteina su dobro poznati prosečnom stručnjaku. Jedan takav sistem, Autographa californica nuclear polvhedrosis virus (AcNPV) može se koristiti kao vektor za ekspresiju stranih gena ujcelijama Spodoptera frugiperda ili u Trichoplusia larvae. Kodirajuća sekvenca peptida se mofže klonirati u neesencijalnu oblast virusa, kao stoje polihedrin gen, i kontrolisati polihedron promotorom. Uspešna insercija peptida inaktivira polihedrin gen i dobiva se rekombinantni virus bez zaštitnog protenskog omotača. Rekombinantni virusi se mogu koristiti za infekciju S. frugiperda ćelija ili Trichoplusia larvac u kojima se ekspresuje peptid. Smith et ah, J. Virol. 46: 584

(1983); Engelhard et al, Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 91: 3224-7 (1994).

U drugom primeru, DNK sekvenca koja enkodira peptid može se amplifikovati pomoću PCR i klonirati u pogodni vektor, na primer, pGEX-3X (Pharmacia). Vektor pGEX je dizajniran da proizvodi fuzioni protein uključujući glutation-S-transferazu (GST), kodiranu vektorom, i protein kodiran DNK fragmentom insertovanim u mesto za kloniranje u vektoru. Prajmeri za PCR mogu se generisati i uključuju na primer, pogodno mesto za raskidanje. Kada se koristi fuziona grupa isključivo da bi se olakšala ekspresija, ili inače nije poželja kao dodatak željenom peptidu, rekombinantni fuzioni protein može tada biti razdvojen od GST dela fuzionog proteina. Peptid dobiven pomoću The pGEX-3X/specifično vezujućeg agensa se transformiše u E. coli XL-1 Blue ćelije (Stratagene, La Jolla CA), i izoluju se pojedinačni transformanti i uzgajaju. Plazmidna DNK iz individualnih transformanata se može prečistiti i delimično sekvencionisati koristeći aparat za automatsko sekvencionisanje da bi se potvrdilo prisustvo željenog specifično vezujućeg agensa koji enkodira insert nukleinske kiseline u ispravnu orijentaciju.

Neke peptidne kompozicije predmetnog pronalaska jesu one u kojima je peptibodi konjugovana za bilo koji antitumorski peptid kao stoje to tumor necrosis faktor (TNF). U posebno prioritetnom postupku, TNF-specifično vezujući agens generiše peptidne himere kao rekombinantne fuzije sa peptidom kodiranim sekvencama stopljeni u ram za TNF (Novagen, Madison, WI) kodirajuće sekvence. Peptid- TNF cDNA se može klonirati u pET-1 lb vektor (Novagen) i može se indukovati ekspresija TNF peptida u BL21E. coliprema instrukcijama proizvođača pETl lb vektora. Rastvorni TNF peptidi mogu se od bakterijskih lizata prečistiti amonijum sulfatnim rastvorom, hidrofobnom interaktivnom hromatografijom na Phenvl-Sepharose 6 Fast Flow, jonoizmenjivačkom hromatografijom na DEAE-Sepharose Fast Flow, i gel filtraciono hromatografijom na Sephacryl-S-300 HR.

Fuzioni protein, koji se može dobiti kao nerastvorno inkluziono telo u bakteriji, može se dobiti na način koji sledi. Ćelija domaćin se sakrifikuje centrifugiranjem, ispere pomoću 0.15 M NaCl, 10 mM Tris, pH 8,1 mM EDTA; i tretira pomoću 0.1 mg/ml lizozima (Sigma, St. Louis, MO) u toku 15 min na sobnoj temperaturi. Lizat se izbistri sonifikovanjem, a ostaci ćelije se pretvore u kuglice centrifugiranjem tokom 10 min na 12,000 X g. Fuzioni protein što sadrži kuglicu ponovo se suspenduje u 50 mM Tris, pH 8, i 10 mM EDTA, prevodi u sloj iznad 50 % glicerola i centrifugira tokom 30 min na 6000 X g. Kuglica se može ponovo suspendovati u standardnom fosfatnom puferovanom rastvoru soli (PBS) u kome nema Mg++ i Ca++. Fuzioni protein može dalje biti prečišćavan frakcionisanjem ponovno suspendovane kuglice u denaturisanom SDS-PAGE (Sambrook et al, supra). Gel se može potopiti u 0.4 M KC1 da bi se vizualizovao protein, koji se može iseći i eluirati pomoću struje u gel protočnom puferu bez SDS. Ukoliko se GST / fuzioni protein dobiva iz bakterije kao rastvorni protein, može se prečistiti pomoću GST Purification Module-a (Pharmacia).

Fuzioni protein se može podvrći digestiji radi raskidanja GST od peptida predmetnog pronalaska . Reakcija digestacije (20-40 mg fuzionog proteina, 20-30 jedinica humanog trombina (4000 U/mg, Sigma) u 0.5 ml PBS inkubira se 16-48 h na sobnoj temperaturi i nanese na denaturisani SDS-PAGE gel radi frakcionisanja reakcionih proizvoda. Gel se može potopiti u 0.4 M KC1 u cilju vizualizacije proteinskih traka. Identitet proteinske trake koja odgovara očekivanoj molekulskoj težini peptida može se potvrditi analizom aminokiselinske sekvence koristeći aparat za automatsko sekvencionisanje (Applied Biosvstems Model 473A, Foster City, CA). Alternativno, identitet se može potvrditi pomoću HPLC i / ili masene spektrometrije peptida.

Alternativno, DNK sekvenca što enkodira peptid može se klonirati u plazmid koji sadrži željeni promotor i, opciono, sekvencu vodilju [Eetter ei al.,Science 240:1041-43 (1988)]. Sekvenca proizvoda može se potvrditi automatskim sekvencionisanjem. Plazmid se zatim može transformisati u soj MCI061 E. coli pomoću standardnih postupaka koristeći CaC12 inkubaciju i tretiranje bakterije toplotnim šokom (Sambrook et al., supra). Transformisana bakterija može se gajiti u LB medijumu uz dodatak karbenicilina, a dobivanje prekomerno ekspresovanog proteina može se indukovati rastom u pogodnom medijumu. Ukoliko je prisutna, sekvenca vodilja može izazvati sekreciju peptida i može biti uklonjena tokom sekrecije.

Sekretovani rekombinantni protein se može prečistiti od kulture bakterijskog medijuma dole opisanim postupcima.

Sistemi kod domaćina sisara za ekspresiju rekombinantnog proteina su dobro poznati prosečnom stručnjaku. Sojevi ćelija domaćina se mogu odabrati prema specifičnoj sposobnosti da procesuje ekspresovani protein ili proizvede neke post-translacione modifikacije, korisne za aktivnost proteina. Takve modifikacije proteina uključuju, ali nisu ograničene na, acetilovanje, karboksilovanje, glikozilovanje, fosforilovanje, lipidaciju i acilovanje. Različite ćelije domaćini kao što su CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38, i slične, poseduju posebnu celularnu mašinu i karakteristične mehanizme za takvu post-translacionu aktivnost i mogu se odabrati radi osiguranja ispravne modifikacije i procesovanje uvedenog, stranog proteina.

Poželjno je da se transformisane ćelije mogu dugo koristiti, da daju visok prinos proteina i da omogućavaju stabilnu ekspresiju. Kada se jednom takve ćelije transformišu vektorima koji sadrže markere koji se mogu izabirati zajedno sa željenom ekspresionom kasetom, ćelije se ostave da rastu 1 -2 dana u obogaćenom medijumu. Marker koji se može odabrati je dizajniran omogući rezistenciju prema selekciji i njegovo prisustvo omogućava rast i povraćaj ćelija koje uspešno ekspresuju uvedene sekvence. Rezistentni grumeni stabilno transformisanih ćelija mogu se razmnožiti koristeći tehnike uzgajanja u tkivu koje odgovara ćeliji.

Može se upotrebiti veći broj selekcionih sistema za povraćaj ćelija koje su transformisane radi proizvodnje rekombinantnog proteina. Takvi selekcioni sistemi uključuju, ali nisu ograničeni na, HSV timidin kinazu, hipoksantin-guanin fosforiboziltransferaza i adenin fosforiboziltranferaza gen, u tk-, hgprt-ili aprt- ćelije. Takođe, antimetabolička rezistencija se može upotrebiti kao osnova selekcije DHFR koja prenosi rezistenciju prema metotreksatu; gpt koji prenosi rezistenciju prema mikofe;-:olnoj kiselini: nco koji prenosi rezistenciju prema aminoglikozidu G418 i prenosi rezistenciju prema hiorsulfuronu; i hygro koji prenosi rezistenciju prema higromicinu. Dodatni geni što se mogu odabrati i koji mogu biti korisni uključuju trpB, koji omogućava ćelijama da koriste indol namesto triptofana, ili hisD, koji omogućava ćelijama da koriste histinol namesto histidina. Markeri koji daju vizuelnu indikaciju identifikacije transformanata uključuju antocijanine, (3-glukuronidazu i njen supstrat, GUS, i luciferazu i njen supstrat, luciferin.

Prečišćavanje i ponovno nabiranje specifično vezujućih agenasa

U nekim slučajevima može biti potrebno da se specifično vezujući agensi kao što su peptidi i / ili peptibodi predmetnog pronalaska podvrgnu "ponovnom nabiranju" i da se oksiduju u pogodnu tercijarnu strukturu i generišu disulfidne veze u cilju da postanu biološki aktivni. Ponovno nabiranje se može postići koristeći neke postupke dobro poznate u oblasti. Takvi postupci uključuju, na primer, izlaganje solubilisanog polipeptidnog agensa pH vrednosti obično iznad 7 u prisustvu haotropnog agensa. Odabir haotropnog agensa slično je načinu izbora za uključivanje solubilizacije tela, međutim, haotrpni agens se obično koristi pri manjim koncentracijama. Primer aotropnog agensa je guanidin. U najvećem broju slučajeva rastvor u kome se vrši ponovno nabiranje / oksidacija sadrži i redukciono sredstvo zajedno sa svojim oksidovanim oblikom u specifičnom odnosu radi generisanja specifičnog redoks potencijala koji omogućava da dođe do reverzibilnog nastajanja disulfida u cilju uspostavljanja cisteinskih mostova. Neki uobičajeno korišćeni redoks parovi uključuju cistein / cistamin, glutation / ditiobisGSH, kupri hlorid, ditiotreitol DTT / đitian DTT, i 2-merkaptoetanol (bME) / ditio-bME. U mnogim slučajevima upotrebljava se ko-rastvarač da bi se povećala efikasnost ponovnog nabiranja. Uobičajeno korišćeni ko-rastvarači uključuju glicerol, polietilen glikol različitih molekulskih težina, i arginin.

Može biti poželjno da se prečiste peptidi i peptibodi predmetnog pronalaska . Tehnike prečišćavanja proteina dobro su poznate prosečnom stručnjaku. Takve tehnike uključuju, najednom nivou, sirovo frakcionisanje frakcija koje sadrže, ili ne sadrže, proteine. Kada se peptid i / ili peptibodi razdvoji od drugih proteina, željeni peptid ili polipeptid se može dalje prečišćavati hromatografskim tehnikama ili tehnikama elektroforeze u cilju postizanja parcijalnog ili potpunog prečišćavanja (ili prečišćavanja do homogenosti). Posebno pogodne analitičke metode za dobijanje peptibodi ili peptida predmetnog pronalaska su jonoizmenjivačka hromatografija, ekskluziona hromatografija; elektroforeza na poliakrilamidnom gelu; izoelektrično fokusiranje. Posebno efikasna metoda za prečišćavanje peptida brza tečna hromatografija proteina ili čak HPLC.

Pojedini aspekti predmetnog pronalaska tiču se prečišćavanja, i u specifičnim realizacijama, znatnim prečišćavanjem, peptibodi ili peptida predmetnog pronalaska .

Izraz "prečišćena peptibodi ili peptid" kako se ovde koristi, odnosi se na jedinjenja, koja se mogu izolovati iz drugih komponenti, pri čemu se peptibodi ili peptid prečišćavaju do bilo kog stepena u odnosu na svoj prirodni oblik. Prečišćeni peptid ili peptibodi se stoga odnosi i na peptibodi ili peptid koji je oslobođen okoline u kojoj se nalazi u prirodi.

U opštem slučaju, "prečišćen" se odnosi na smesu peptida ili peptibodi koja su bila podvrgnuta frakcionisanju radi uklanjanja različitih drugih komponenti, a koja zadržavaju u velikoj meri svoju ekspresovanu biološku aktivnost. Kada se koristi izraz "značajno prečišćen", ovaj izraz se odnosi na smesu peptida ili peptibodi gde peptibodi ili peptid čini glavnu komponentu smese, sadržavajući oko 50 %, oko 60 %, oko 70 %, oko 80 %, oko 90 %, oko 95 % , ili više, proteina u kompoziciji.

Različiti postupci za kvantifikovanje stepena prečišćavanja peptida ili peptibodi biće poznati prosečnom stručnjaku u svetlu predmetnog pronalaska . Oni uključuju, na primer, određivanje specifične aktivnosti vezivanja aktivne frakcije, ili određivanje količine peptida ili peptibodi u frakcijama SDS / PAGE analizom.

Poželjan postupak za određivanje čistoće frakcije peptida ili peptibodi jeste izračunavanje aktivnosti vezivanja date frakcije, njeno uporedivanje sa aktivnošću vezivanja početnog ekstrakta, i na osnovu toga izračunavanja stepena prečišćavanja, ovde određenog kao "-n-ti broj prečišćenosti." Stvarne jedinice upotrebljene za iskazivanje veličine aktivnosti vezivanja, naravno, zavisiće od odabrane specifične tehnike testiranja za praćenje prečišćavanja, i od toga iskazuje li, ili ne, peptibodi ili peptid merljivu aktivnost vezivanja. Različite tehnike pogodne za prečišćavanje poznate su prosečnom stručnjaku. One uključuju, na primer, taloženje amonijum sulfatom, PEG, antitelima (imunoprecipitacija), i slične, ili denaturaciju toplotom za čime sledi centrifugiranje, hromatografski koraci kao što su afinitetna hromatografija (na pr.,Protein-A-Sepharose), jonoizmenjivačka, gel filtracija, reversno-fazna, hidroksiapatitna i afinitetna hromatografija, izoelektrično fokusiranje, gel elektroforeza, i njhove kombinacije i druge tehnike. Kako je opšte poznato u oblasti, veruje se da se redosled izvođenja različitih faza prečišćavanja može menjati, ili da se neke faze mogu izostaviti, pri čemu se i nadalje zadržava pogodni postupak za dobijanje značajno prečišćenog specifično vezujućeg agensa.

Ne postoji opšti zahtev da se peptid ili peptibodi predmetnog pronalaska uvek obezbede u svom najprečišćenijem obliku. Naravno, ima se u vidu da će dobijeni bitno manje specifično vezujući agensi biti od koristi u nekim realizacijama. Delimično prečišćavanje može se postići u manje faza u kombinaciji, ili koristeći različite oblike iste opšte sheme prečišćavanja. Na primer, podrazumeva se da hromatografija na katjonskoj izmenjivačkoj koloni na HPL p aparatu obično daje veći "-nti broj" nego ista tehnika koja koristi hromatografski sistem pod niskim pritiskom. Postupci koji daju niži stepen relativne prečišćenosti mogu imati prednost u ukupnom bilansu peptida ili peptibodi, ili u zadržavanju aktivnosti vezivanja peptida ili peptibodi.

Poznato je da migracija peptida ili polipeptida može varirati, neki put značajno, u zavisnosti od različitih uslova od SDS / PAGE [Capaldi et cd., Biochem. Biophvs. Res. Comm., 76: 425 (1977)]. Stoga će se smatrati da pod različitim uslovima elektroforeze mogu varirati nađene molekulske težine prečišćenih ili delimično prečišćenih proizvoda ekspresije specifično vezujućih agenasa.

Testovi fprobel vezivanja

U imunološkim testovima vezivanja tipično se koriste agensi za hvatanje u cilju specifičnog vezivanja za, i često za imobilizaciju, analit ciljnog antigena. Sredstvo za hvatanje je grupa koja se specifično vezuje za analit. U jednoj realizaciji predmetnog pronalaska, agens za hvatanje je peptid ili peptibodi ili njihov fragment koji se specifično vezuje za Ang-2. Ovi imunološki testovi vezivanja su dobro poznati u oblasti [Asai, ed., Methods in Cell Biologv, Vol. 37, Antibodies in Cell Biologv, Academic Press, Inc., New York (1993)].

U imunološkim testovima vezivanja često se koriste agensi za markiranje koji signaliziraju egzistenciju vezivnog kompleksa nastalog od agensa za hvatanje i antigena. Agens za obeležavanje može biti jedan od molekula uključen u vezivni kompleks, tj., on može biti obeleženi specifično vezujući agens ili obeleženi anti-specifični vezujući agens antitela. Alternativno, agens za obeležavanje može biti treći molekul, obično drugo antitelo, koje se vezuje za vezivni kompleks. Agens za obeležavanje može biti, na primer, anfi-specifični vezujući agens antitela sa markerom. Drugo antitelo, specifično za vezivni kompleks, može biti bez obeleživača, ali može biti vezano četvrtim molekulom specifičnim za vrste antitela a čiji je član drugo antitelo. Na primer, drugo antitelo može biti modifikovano grupom koja se može detektovati, kao što je biotin, a koje se može vezati za četvrti molekul, kao stoje enzimom obleženi streptavidin. Drugi proteini sposobni za specifično vezivanje za konstantne regione imunoglobulina, kao što su protein A ili protein G, mogu se takođe upotrebiti kao sredstva za markiranje. Ovi vezujući proteini su normalni konstituenti ćelijskih zidova bakterija streptokoka i iskazuju jaku ne-imunogenu reaktivnost sa konstantnim regionima imunoglobulina iz različitih vrsta. Akerstrom/.Immunol, 135:2589-2542

(1985); Chaubert, Mod. PathoL, 10:585-591 (1997).

Tokom testiranja, posle upotrebe svake kombinacije agenasa može biti potrebna detaljna analiza, inkubacija i / ili faze ispiranja. Inkubacione faze mogu varirati od oko 5 sekundi do nekoliko sati, prioritetno od oko 5 minuta do oko 24 sata. Međutim, inkubaciono vreme zavisiće od formata analize, analita, zapremine rastvora, koncentracije i slično. Obično, testovi se izvode na sobnoj temperaturi, iako se mogu izvoditi na različitim temperaturama.A.

A.. Nekompetitivni testovi ( probe) vezivanja:

Imunološki testovi vezivanja mogu biti nekompetitivnog tipa. Ovi testovi sadrže količinu kaptiranog analita koji se direktno analizira. Na primer, u prioritetnom "sendvič" testu, agens za kaptiranje (antitelo ili peptibodi) mogu se direktno vezati za

čvrsti supstrat gde su imobilisani. Imobilisani agensi za kaptiranje zatim hvataju (vezuju se za) antigen prisutan u testiranom uzorku. Tako imobilisani protein se zatim vezuje za sredstvo za obeležavanje, kao što je drugo antitelo sa markerom. U drugom prioritetnom "sendvič" testu, drugom antitelu nedostaje marker, ali se može vezati za antitelo obeleženo specifičnim markerom za vrstu antitela iz koje je drugo antitelo izvedeno. Drugo antitelo može se takođe modifikovati grupom koja se može detektovati, kao stoje biotin, za koji se treći obeleženi molekul, kao stoje streptavidin, može specifično vezati. Videti Harlow i Lane, Antibodies, A Laboratorv Manual, Ch 14, Cold SpriEg Harbor Laboratorv, NY (1988), ovde sadržana kao referenca.

B. Kompetitivni testovi vezivanja:

Imunološki testovi vezivanja mogu biti kompetitivnog tipa. Količina prisutnog analita u uzorku indirektno se određuje merenjenl količine zamenjenog

dodatog analita, ili konkurentno uklonjenog, iz agensa za hvatanje (antitela ili peptibodi) analitom prisutnim u uzorku. U jednom prioritetnom kompetitivnom testu vezivanja, poznata količina analita, obično obeleženog, dodaje se uzorku i uzorak se zatim dovodi u kontakt sa agensom za hvatanje. Količina obeleženog analita vezanog za antitelo obrnuto je proporcionalna koncentraciji analita prisutnog u uzorku. (Videti, HarIow i Lane, Antibodies, A Laboratorv Manual, Ch 14, str. 579-583, supra). U sledećem prioritetnom kompetitivnom testu vezivanja, agens za hvatanje se imobiliše na čvrstom supstratu. Količina proteina vezana za agens za hvatanje može se odrediti ili merenjem količine prisutnog proteina u kompleksu protein /antitelo, ili alternativno merenjem količine preostalog nekompleksiranog proteina. Količina proteina može se detektovati obezbeđivanjem obeleženog proteina. Harlow i Lane (supra).

U još jednom poželjnom kompetitivnom testu vezivanja koristi se inhibicija haptena. U ovom testu se poznati analit imobiliše na čvrstom supstratu. Uzorku se dodaje poznata količina antitela, a zatim uzorak dolazi u dodir sa imobilisanim analitom. Količina antitela vezana za imobilisani analit obrnuto je proporcionalna količini analita prisutnog u uzorku. Količina imobilisanog antitela može se odrediti detektovanjem imobilisane frakcije antitela ili frakcije koja zaostaje u rastvoru. Detekcija može biti direktna kada je antitelo obeleženo, ili indirektna kada se potom doda obeležena grupa koja se specifično vezuje za antitelo, kako je gore opisano.

C. Upotreba kompetitivnih testova vezivanja:

Kompetitivni testovi vezivanja mogu se koristiti za određivanje ukrštene reaktivnosti čime se omogućava prosečnom stručnjaku da odredi da lije proteinski ili enzimski kompleks, koji je prepoznat od strane peptibodi predmetnog pronalaska, poželjan protein a ne ukršeno reagujući molekul, ili da odredi da li je peptibodi specifična za antigen ne vezujući se za antigene koji nisu u vezi. U testovima ovog tipa antigen se imobiliše za čvrstu podlogu i analizi se doda nepoznata smesa proteina, koja se takmiči u vezivanju peptibodi za imobilisani protein. Molekul koji se takmiči vezuje se za jedan ili više antigena koji nisu u vezi sa datim antigenom. Sposobnost proteina da se takmiče u vezivanju peptibodi za imobilisani antigen poredi se sa vezivanjem istog proteina koji je bio imobilisan za čvrstu podlogu da bi se odredila ukrštena reaktivnost smese proteina.

D. Drugi testovi vezivanja

Predmetni pronalazak obezbeđuje i VVestern blot me ode za detekciju ili kvantifikaciju prisustva Ang-2 u uzorku. Primenjena tehnika obično uključuje razdvajanje proteina iz uzorka gel elektroforezom na osnovu molekulskih težina i vezivanjem proteina za pogodnu čvrstu podlogu, kao stoje nitrocelulozni filter, najlonski filter, ili derivatizivani najlonski filter. Uzorak se inkubira zajedno sa peptibodi, ili njenim fragmentima, koja se specifično vezuje za Ang-2 a detektuje se nastali kompleks. Ove peptibodi se mogu direktno obeležiti, ili se alternativno mogu potom detektivati pomoću obeleženih antitela koja se specifično vezuju za peptibodi.

Dijagnostični testovi

Derivatni vezujući agensi, kao što su peptidi i peptibodi, ili njihovi fragmenti, predmetnog pronalaska su korisni za dijagnozu uslova ili bolesti karakterisanom ekspresijom Ang-2 ili podjedinica, ili u testovima kojima se prate pacijenti koji su tretirani sredstvima za indukovanje Ang-2, njegovih fragmenata, antagonsita ili inhibitora aktivnosti Ang-2. Dijagnostični testovi za Ang-2 uključuju metode u kojima se koriste peptibodi i obeleživač za detekciju Ang-2 u tečnostima ljudskog organizma ili ekstraktima ćelija ili tkiva. Peptibodi predmetnog pronalaska mogu se koristiti modifikovane ili nemodifikovane. U prioritetnom dijagnostičkom testu peptibodi se obeležavaju vezivanjem na pr., markera ili reporter molekula. Poznato su mnogo različitih obeleživača i reporter molekula, neki od njih su već opisani ovde. Prioritetno, predmetni pronalazak je koristan za dijagnozu bolesti ljudi.

U tehnici su poznati različiti protokoli za merenje Ang-2 proteina pomoću peptibodi specifičnih za dati protein. Primeri uključuju testove : enzimski vezani imunosorbentni test (ELISA), radioimunotest (RIA) i sortiranje fluorescencom ktiviranih ćelija (FACS). Poželjan je dvopoložajni monoklonalno zasnovani imunotest koji koristi monoklonalna antitela koja reaguju sa dva epitopa, što se međusobno ne ometaju, sa Ang-2, ali može se upotrebiti i test vezivanja. Ovi testovi opisani su, na primer, u Maddox et at, J. Exp. Med., 158:1211 (1983).

U cilju da obezbeđivanja osnove za dijagnozu, obično se određuju normalne ili standardne vrednosti humane Ang-2 ekspresije. Ovo određivanje može se ostvariti kombinovanjem telesnih tečnosti ili ćelijskim ekstraktima iz normalnih subjekata, poželjno ljudi, sa peptibodi za Ang-2, pod uslovima pogodnim za formiranje kompleksa koji su dobro poznati u oblasti. Količina nastajanja standardnog kompleksa može se kvantifikovati uporedenjem vezivanja peptibodi za poznate količine Ang-2 proteina, sa kontrolnim i uzorkom oboljenja. Zatim se standardne vrednosti dobijene iz normalnih uzoraka uporeduju sa vrednostirna dobijenim iz uzoraka iz potencijalno obolelih subjekata. Devijacija između standardne vrednosti i vrednosti dobijene iz uzorka subjekta navodi na ulogu Ang-2 u obolelom stanju.

U dijagnostičke svrhe, u nekim realizacijama tipično će peptibodi ili peptidi predmetnog pronalaska biti obeleženi grupom koja se može detektovati.

Grupa koja se može detektiovati može biti bilo koja sposobna da proizvede,direktno, ili indirektno, signal koji se može detektovati. Na primer, grupa koja se može detektovati može biti radioizotop, kao stoje 3H, 14C, 32P, 35S, ili !25I, fluorescentno ili hemiluminiscentno jedinjenje, kao stoje fluorescein izotiocijanat, rodamin, ili luciferin, ili neki enzim, kao stoje alkalna fosfataza, P-galaktozidaza, ili peroksidaza iz rena. Bayer et al, Meth. Enz., 184: 138-1 I, (1990).

Bolesti

Predmetni pronalazak obezbeđuje vezujući agens kao stoje peptid, peptibodi, ili fragment, varijante ili njihove derivate koji se vezuju za Ang-2 koji je koristan u lečenju humanih oboljenja i patoloških stanja. Agensi koji moduliraju vezujuću aktivnost Ang-2, ili druge celularne aktivnosti, mogu se koristiti u kombinaciji sa drugim terapeutskim agensima u cilju povećanja njhovih terapeutskih efekata ili u cilju smanjenja potencijalnih sporednih efekata.

U jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje reagense i metode korisne u lečenju oboljenja i stanja karakterisanim nestabilnim ili nenormalnim nivoima aktivnosti Ang-2 u ćeliji. Ova oboljenja uključuju rak, i druga hiperproliferativna stanja, kao stoje hiperplazija, psorijaza, kontaktni dermatitis, imunološka oboljenja, i neplodonost.

Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje metode lečenja raka kod životinja, uključujući ljude, uključujući primenu efektivne količine specifično vezujućeg agensa životinji, kao što su peptibodi, koja inhibira ili smanjuje aktivnost Ang-2. Pronalazak je dalje usmeren na postupke za inhibiranje rasta ćelija raka, uključujući procese celularne proliferacije, invazivnosti, i metastaza u biološkim sistemima. Metode uključujulpotrebu jcđinjenj a p/cdmetnog pronalaska kao inhibitora rasta ćelija raka. Poželjnije, primenjenim postupcima se inhibira ili smanjuje rast ćelija raka, invazivnosti, metastaza, ili učestalost tumora u životinjama, kao što su sisari. Postupci predmetnog pronalaska lako se mogu adaptirati za upotrebu u sistemima za testiranje na pr., testiranje rasta ćelija raka i njihove osobine, kao i identifikovanje jedinjenja koja deluju na rast ćelija raka.

Kanceri koji se mogu lečiti metodama predmetnog pronalaska poželjno se javljaju kod sisara. Sisari uključuju, na primer, ljude i druge primate, kao i ljubimce ili družbene životinje kao što su kučići i mačke, laboratorijske životinje kao što su pacovi, miševi i zečevi, i domaće životinje kao što su konji, svinje, ovce i stoka. Tumori i neoplazme uključuju rast ćelija tkiva kod kojih je multiplikacija nekontrolisana i progresivna. Neki rast je benignog karaktera, ali drugi su maligni i mogu dovesti do smrti organizma. Maligne neoplazme ili rak se razlikuju od benignog rasta po tome što, pored iskazane agresivne celularne proliferacije, one mogu napasti okolno tkivo i metastazirati. Staviše, maligne neoplazme sc karakterišu time što pokazuju veći gubitak u diferencijaciji (veća dediferencijacija), i po svojoj organizaciji u odnosu jedne na drugu i okolna tkiva. Ova osobina zove se "anaplazija."

Neoplazme koje se mogu lečiti sadašnjim pronalaskom uključuju i čvrste tumore, fj., karcinome i sarkome. Karcinomi uključuju one maligne neoplazme izvedene iz epitelinih ćelija koje se infiltriraju (upadaju) u okolna tkiva i rezultuju metastazama. Adenokarcinomi su karcinomi izvedeni iz tkiva žljezda, ili koji čine prepoznatljive strukture žljezda. Jedan druga široka kategorija raka uključuje sarkome, koji su tumori čije su ćelije uklopljene u fibrilalrnu ili homogenu supstancu sličnu embrionskom veznom tkivu. Pronalazak takođe omogućava lečenje raka mijelidnih ili limfoidnih sistema, uključujući leukemije, limfome i druge vrste raka koji se tipično ne javljaju kao masivni tumor, već se distribuiraju vaskularnim ili limforetikularnim sistemima.

Vrste ćelija raka ili tumora koji se mogu lečiti prema sadašnjem pronalasku uključuju, na primer, tumor što proizvodi ACTH, akutnu limfocitnu leukemiju, akutnu nelimfocitnu leukemiju, rak adrenalnog korteksa, rak bešike, rak mozga, rak dojke, cervikalni rak, hroničnu limfocitnu leukemiju, hroničnu mijelocitnu leukemiju, rak debelog creva, kutanu limfomu T ćelija, rak endometrijuma, rak jednjaka, Ewing-ov sarkom, rak žučnog mehura, leukemiju vlaknastih ćelija, rak glave i vrata, Hodgkin-ov limfom, Kaposi-jev sarkom, rak bubrega, rak jetre, rak pluća (malih ćelija i ne-malih ćelija), maligno izlivunje trbušne maramice, maligno izlivanje plućne maramice, melanom, mezoteliom, multipli mijelom, neuroblastom, gliom, ne-Hodgkin-ov limfom, osteosarkom, rak jajnika (ćelije klice), rak pankreasa, rak penisa, rak prostate, retmoblastom, rak kože, sarkom mekog tkiva, karcinome ljuspastih ćelija, rak stomaka, rak testisa, rak tiroidee, trofoblastne neoplazme, rak uterusa, rak vagine, rak stidnjce, i Wilms-ov tumor.

Predmetni pronalazak je ovde ilustrovan upućivanjem na lečenje nekih tipova eksperimentalno definisanih tipova raka. U ovim ilustrativnim lečenjima koriste se vrhunski in vitro i in vivo modeli. Ovi postupci se mogu koristiti za identifikaciju agenasa za koje se može očekivati da su efikasni u in vivo protokolima lečenja. Međutim, smatraće se da postupak predmetnog pronalaska nije ograničen na date tipove tumora, već se proširuje na bilo koji čvrsti tumor izveden iz bilo kod sistema organa. Tipovi raka čija je invazivnost ili metastaza povezana sa Ang-2 ekspresijom ili aktivnošću je posebno podložna inhibisanju ili čak je indukovana regresija sredstvima predmetnog pronalaska.

Pronalazak se može izvoditi uključivanjem jedinjenja predmetnog pronalaska kao stoje peptibodi u kombinaciji sa drugim hemoterapeutskim sredstvom protiv raka, kao stoje bilo koji hemoterapeutski agens. Kombinacija specifično vezujućeg agensa sa takvim drugim agensima može potencirati hemoterapeutski protokol. Brojni hemoterapeuski protokoli će se sami prikazati u glavi obučenih lekara kao pristupačni za inkorporaciju u postupak predmetnog pronalaska . Može se koristiti bilo koji hemoterapeuski agens, uključujući alkilujuće agense, antimetabolite, hormone i antagoniste, radioizotope, kao i prirodne proizvode. Na primer, jedinjenje predmetnog pronalaska može se administrirati zajedno sa antibioticima kao stoje doksorubicin i drugi antraciklinski analozi, azotove slačice kao stoje ciklofosfamid, primidinovi analozi kao stoje 5-fluorouracil, cisplatina, hidroksiurea, taksol i njegovi prirodni i sintetički derivati, i slično. Kao drugi primer, u slučaju mešovitih tumora, kao stoje adenokarcinoma dojke, gde tumori uključuju gonadotropin-zavisne i gonadotropin-nezavisne ćelije, jedinjenje se može adminisriraiti zajedno sa leuprolidom ili goserelinom (sintetički peptidni analozi LH-RH). Drugi antineoplastični protokoli uključuju upotrebu tetraciklinskih jedinjenja uz drugi modalitet lečenja, na pr., hirurgijom, radijacijom, itd., ovde nazvano i "pomoćni antincoplastični modaliteti." Tako, postupak predmetnog pronalaska se može adminisriraiti zajedno sa takvim konvencionalnim protokolom što je dobro za smanjivanje sporednih efekata i povećanje efikasnosti.

Predmetni pronalazak tako obezbeđuje jedinjenja i postupke korisne u lečenju velikog broja tipova raka, uključujući čvrste tumore i leukemije. Tipovi raka koji se mogu lečiti, uključuju ali nisu ograničeni na, adenokarcinome dojke, prostate, i debelog creva, sve oblike brohnogenih karcinoma pluća; mijeloida; melanoma; hepatoma,' neuroblastoma; papiloma; apudoma; horistoma; branhioma; malignog karcinoidnog sindroma; karcinoidno oboljenja srca; karcinoma (na pr., Walker, bazalnih ćelija, bazoskvamni, Brown-Pearce, ditktalni, Ehrlich-ov tumor, Krebs 2, merkel ćelija, mucinozne, ne-male ćelije pluća, ovsena ćelija, bradavica, tvrdi, bronhiolarni, bronhogeni, skvarnoidnih ćelija, i tranzicionih ćelija); histiocitnih oboljenja; leukemija; maligna histiocitoza; Hodgkin-ova bolest; karcinom imunoproliferativnih malih ćelija pluća; ne-Hodgkin-ovog Iimfoma; plazmacitoma; retikuloendotelioza; melanoma; hondroblastoma; hondroma; hondrosarkoma; fibroma; fibrosarkoma; tumori velikih ćelija; histiocitoma; Uporna; liposarkoma; mezotelioma; miksoma; miksosarkorna; osteoma; osteosarkoma; hordoma; kraniofairngioma; disgerminoma; hamartoma; mezenhimoma;meooneffoma; miosarkoma; ameloblastoma; cementoma; odontoma; teratoma; timoma; tofoblastični tumor. Dalje, sledeći tipovi raka mogu se takođe lečiti: adenom; holangiom; holesteatom; ciklindrom; eistađenokarcmom; cistadenom; tumor granuloznih ćelija; ginandroblastom; hepatom; hidradenom; tumor ostrvca-ćelija; tumor Leydig-ovih ćelija; papilom; tumor Sertoli ćelija; tumor tbeca ćelija; leiomiom; leiomiosarkom; mioblastom; miom; miosarkom; rabdomiom; rabdorniosarkom; ependimom; ganglioneurom; gliom: meduloblastom; meningiom; neurilemmom; neuroblastom; neuroepiteliom; neurofibrom; neurom; paragangliom; paragangliom nonhromafm; angiokeratom; angiolimphoidna hiperplazia sa eosinofilijom; skleroza angiom; angiomatozis; glomangiom; hemangioendoteliom; hemangtom; hemangiopericitom; hemangiosarkom; limfangiom; limfangiomiom; limfangiosarkom; pinealom; karcinosarkom; hondrosarkom; cistosarkom filodes; fibrosarkom; hemangiosarkom; leiomiosarkom; leukosarkom; liposarkom; limfangiosarkom; miosarkom; miksosarkom; karcinom jajnika; rabdomiosarkom; sarkom; neoplazme; nerofibromatozis; i cervikalna displazija.

Drugi aspekt predmetnog pronalaska koristi materijale i metode predmetnog pronalaska u cilju sprečavanja i / ili lečenja bilo kog hiperproliferativnog stanja kože uključujući psorijazu i kontaktni dermatitis ili druga hiperproliferativna oboljenja. Pokazano je da pacijenti sa psorijazom ili kontaktnim dermatitisom imaju povišenu aktivnost Ang-2 unutar tih ozleda [Ogoshi et ah, J. Inv. DermatoL, 110:818-23 (1998)]. Poželjno je da se specifično vezujući agensi specifični za Ang-2 koriste u kombinaciji sa drugim farmaceutskim agensima u lečenju ljudi koji ispoljavaju ove kliničke simptome. Specifično vezujući agensi mogu se administrirati koristeći bilo koji od različitih nosača ovde opisanim putevima administracije kao i drugim nosačima koji su dobro poznati prosečnom stručnjaku.

Drugi aspekti predmetnog pronalaska uključuju lečenje različitih retinopatija

(uključujući dijabetsku retinopatiju i makularnu degeneraciju izazvanu starenjem)

povezanih sa angiogenezom, kao i oboljenjima / bolestima ženskog reproduktivnog trakta kao što je endometrioza, materični fibroidi, i druga takva stanja povezana sa disfunkcijom vaskularne proliferacije (uključujući mikrovakularni rast endomerrijuma) tokom ženskog reproduktivnog ciklusa.

Još jedan aspekt predmetnog pronalaska odnosi se na lečenje abnormalnog vaskularnog rasta uključujući cerebralne arteriovenske nakaznosti (AVMs) gastrointestinalne povrede i oporavka mukoze, ulceracije gastroduodenalne mukoze kod pacijenata sa istorijom peptičnog oboljenja grizlice, uključujući ishemiju usled kapi, široki spektar plućnih vaskularnih oboljenja kod bolesti jetre i portalne hipertenzije kod pacijenata sa nehepatičnom portalnom hipertenzijom.

Drugi aspekt predmetnog pronalaska jeste prevencija:raka koristeći jedinjenja i metode obezbeđenim sadašnjim pronalaskom. Takvi reagensi uključuju specifično vezujuće agense kao što su peptibodi protiv Ang-2.

Farmaceutske kompozicije

Farmaceutske kompozicije Ang-2 specifično vezujućih agenasa kao što su peptibodi spadaju u polje predmetnog pronalaska . Farmaceutske kompozicije uključujući antitela detaljno su opisane u, na primer, US patentu 6,171,586, Lam et al, izdat 09. januara 2001. Takve kompozicije uključuju terapeutsku ili profilaktički efektivnu količinu specifično vezujućeg agensa kao stoje antitelo, ili fragment, varijanta, derivate, ili njegove fuzioni derivate kako je ovde opisano, u srnesi sa farmaceutski prihvatljivim agensom. U prioritetnoj realizaciji, farmaceutske kompozicije uključuju antagonističke specifično vezujuće agense koji modulišu parcijalno ili potpuno najmanje jednu biološku aktivnost Ang-2 u srnesi sa faimaceutski prihvatljivim agensom. Tipično, specifično vezujući agensi su dovoljno prečišćeni u cilju primene u životinji.

Farmaceutska kompozicija može sadržavati materijal za formulisanje - modifikovanje, održavanje ili prezervaciju, na primer, pH, osrnolarnostjL viskoznosti, bistrine, boje, izotomčnosti, mirisa, sterilnosti, stabilnosti, brzine rastvaranja ili oslobađanja, adsorpciju ili penetraciju kompozicije. Pogodni materijali za kompoziciju uključuju, ali nisu ograničeni na, aminokiseline (kao što je glicin, glutamin, asparagin, arginin ili lizin), antimikrobna sredstva, antioksidante (kao stoje askotbhtska kiselina, natrijum sulfit ili natijum hidrogensulfit), pufere, (kao stoje boratni, bikarbonatni, Tris-HC1, citratni, fbsfatni, druge organske kiseline), agensi za povećavanje zapremine (kao stoje manitol ili glicin), heiataciona sredstva [kao stoj>etilendiamintetrasirćetea kiselina (EDTA)]; kompleksirajuća sredstva (kao stoje kofein, poMvinilpiroliđoji, beta-ciklodekstrin ili rad^ok^propl-beta-dklo^ek^trin); punioci, monosaharidi; proteini (kao što je serum albumin, gelatine ili imunoglobulini); boje; začini i sredstva za razblažrvanje; emulzifikatori; hidrofIM polimeri (kao stoje polivimlpirolidon); polipeptidi niske molekulske težine; kontrajoni koji formiraju soli (kao stoje natrijum); konzervansi (kao stoje benzalkonijum hlorid), benzoeva kiselina, salicilna kiselina timerosal, fenetil alkohol, metilparaben, propilparaben, hlorheksidin, sorbinska kiselina ili vodonik peroksid<*>), rastvarači (kao stoje glicerin, propilen glikol ili polietilen glikol), šećerni alkoholi (kao stoje manitol ili sorbitol), agensi za suspenđovanje, površinski aktivni i vlažeći agensi (kao što su pluronici, PEG, sorbitanski estri, polisorbati kao stoje polisorbat 20, polisorbat 80, triton, trometamin, lecitin, holesterol, tiloksapal); agensi što povećavaju stabilnost (saharoza ih sorbitol); agensi što povećavaju tonus (kao što su halogenidi alkalnih metala (poželjno natrijum ili kalij um hlorid, manitol sorbitol); sredstva za transport (deliverv vehicles); razblaživaći; ekscipijenti; i / ili farmaceutski ađuvanti (pomoćna sredstva). (Remington's Pharraaceutical Sciences, 18th Edition, A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company, 1990).

Prosečan stručnjak odrediće optimalnu farmaceutsku kompoziciju u zavisnosti od, na primer, nameravanog načina administracije, formata distribucije i željene doze. Videti na primer, Remington's Pharmaceutical Sciences, supra. Takve kompozicije mogu uticati na fizičko stanje, stabilnost, brzinu oslobađanja in vivo. brzinu in vivo klirensa specifično vezujućeg agensa.

Primarni transporter ili nosač u farmaceutskoj kompoziciji može biti po svojoj prirodi vodeni ili ne-vodeni. Na primer, pogodni transporter ili nosač može biti voda za injektiranje, fiziološki rastvor soli ili veštačka cerebrospinalna tečnost, po potrebi sa dodatim drugim materijalima uobičajenim za kompozicije namenjene parenteralnoj administraciji. Neutralni puferovani rastvor soli ili rastvor soli pomešan sa serum albuminom su dalji primeri transportera. Drugi primeri farmaceutskih kompozicija uključuju Tris pufer pH 7.0-8.5, ili acetatni puffer pH 4.0-5.5, koji mogu dalje uključivati sorbitol ili njegovu pogodnu zamenu. U jednoj realizaciji predmetnog pronalaska kompozicije vezujućeg agensa mogu se pripremati za skladištenje mešanjem odabranih jedinjenja željenog stepena čistoće sa opcionim agensima za formulisanje (Remington's Pharmaceutical Sciences, supra) u obliku liofilizovanog kolača ili vodenog rastvora. Dalje, proizvod, vezujući agens, može biti formulisan kao lioftlizat koristeći odgovarajuće excipijente kao npr. saharoza.

Framaceutske kompozicije se mogu odabrati za parenteralnu administraciju. Alternativno, kompozicije se mogu odabrati za inhalaciju ili za enteralnu administraciju kao što su oralna, slušna, oftalmološka, rektalna ili vaginalna. Preparacija takvih farmaceutski prihvatljivih kompozicija jeste unutar u oblasti tehnike.

Komponente za kompoziciju prisutne su u koncentracijama prilagođenim mestu primene. Na primer, puferi se koriste da održe kompoziciju na fiziološkom pH ili na nešto nižem pH, tipično unutar pH opsega od oko 5 do oko 8.

Kada se ima u vidu parenteralna administracija terapeuske kompozicije za upotrebu predmetnog pronalaska mogu biti u ne-pirogenom obliku, parenteralno prihvatljivom vodenom rastvoru uključujući željeni specifično vezujući agens u farmaceutski prihvatljivom nosaču. Naročito pogodan nosač za parenteralno injektiranje jeste sterilna destilovana voda u kojoj se vezujući agens formuliše kao sterilni, izotoni rastvor koji se dobro čuva. Još jedan preparat može uključiti kompoziciju željenog molekula sa agensom, kao što su injektabilne mikrosfere, biodegradativne čestice, polimerna jedinjenja (polimlečna kiselina, poliglikolna kiselina), perle, ili lipozomi, koji omogućavaju kontrolisano ili podržano oslobađanje proizvoda koji se onda može isporučiti (primeniti) injektiranjem depoa. Hijaluronska kiselina se može takođe upotrebiti, i to može imati efekta u ostvarivanju podržanog delovanja u cirkulaciji. Drugi pog..>Jni načini unošenja željenog molekula uključuju implantiranc sprave za distribuciju (administraciju) leka.

U drugom aspektu, farmaceutske kompozicije pogodne za parenteralnu administraciju mogu se formulisati kao vodeni rastvori, poželjno u fiziološki pogodnim puferima kao što su Hanks-ov rastvor, ringer.ov rastvor ili fiziološki puferovani rastvor soli. Vodene suspenzije za injektiranje mogu sadržavati supstance koje povećavaju viskozitet suspenzije, kao što su natrij um karboksimetil celuloza, sorbitol ili dekstran. Dodatno, suspenzije aktivnih jedinjenja se mogu pripraviti kao odgovarajuće uljne suspenzije za injektiranje. Pogodni lipofllni rastvarači ili nosači uključuju masne kiseline, kao što su sezamovo ulje ili sintetički estri masnih kiselina, kao što su etil oleat, trigliceridi ili lipozomi. Ne-lipidni polikafjoni amino polimera se takođe mogu koristiti za administraciju. Opciono, suspenzija može takođe sadržavati pogodne stabilizatore ili agense radi povećanja rastvorijivosti jedinjenja i time omogućiti preparaciju visoko koncentrovanih rastvora.

U narednoj realizaciji, farmaceutske kompozicije se mogu formulisati kao suvi prah za inhalaciju. Na primer, vezujući agens može biti formulisan kao suvi prah za inhalaciju. Inhalacioni rastvori polipetidnog molekula ili molekula nukleinske kiseline mogu se formulisati i sa propelantom za aerosol. U još jednoj realizaciji, rastvori se mogu pretvoriti u fini sprej. Plućna primena je dalje opisana u PCT prijavi br. PCT / US94/001875, u kojoj je opisana plućna primena hernij siti mođifikovanih proteina.

Isto tako se ima u vidu da se neke kompozicije mogu oralno primeniti. U jednoj realizaciji predmetnog pronalaska, molekuli vezujućeg agensa koji se administriraju na ovaj način mogu se formulisati sa ili bez onih nosača koji se obično upotrebljavaju u sastavljanju čvrstih doza kao što su tablete i kapsule. Na primer, kapsule se mogu osmisliti da otpuštaju aktivni deo kompozicije na mestu u gastrointestinalnom traktu kada je maksimalna bioraspoloživost i minimalna pre-sistemska degradacija. U cilju olakšanja apsorpcije molekula vezujućeg agensa mogu se uključiti dodatna sredstva. Razblaživači, začini, voskovi niske tačke topljenja, biljna ulja, podmazivači, agensi za suspendovanje, agensi za dezintegraciju tableta, a mogu se uporebiti i vezivna sredstva.

Farmaceutske kompozicije za oralnu administraciju se mogu formulisati i koristeći farmaceutski prihvatljive nosače dobro poznate u oblasti doziranja pogodnih za oralnu administraciju. Takvi nosači omogućavaju da se farmaceutske kompozicije u cilju gutanjavđstrane pacijenta formulišu kao tablete, pilule, dražee, kapsule, tečnosti, gelovi, sirupi, guste suspenzije, suspenzije i slično.

Farmaceutske kompozicije za oralnu upotrebu mogu se dobiti kombinovanjem aktivnih jedinjenja sa čvrstim ekscipijentom i preradom dobije smese u granule (opciono posle mlevenja) u cilju dobijanja srži tablete ili dražee. Mogu se dodati, ukoliko se to želi, pogodna pomoćna sredstva. Pogodni ekscipijenti uključuju ugljenohidratne ili proteinske ponioce, kao što su šećeri, uključujući laktozu, saharozu, manitol i sorbitol, kukuruzni škrob, pšenicu, pirinač, krompir, i druge biljke; celulozu, ako stoje metil celuloza, hidroksipropilmetil celuloza, ili natrijum karboksimetilceluloza; gume, uključujući arabiku i tragant gumu, i proteine, kao što su želatin i kolagen. Po potrebi, mogu se dodati dezintegracioni agensi ili rastvarači, kao što su ukršteno vezani polivinil pirolidon, agar, ili alginska kiselina ili njena so, kao stoje natrijim alginat.

Jezgro dražee može se upotrebiti zajedno sa pogodnim zaštitnim slojem, kao što su koncentrovani rastvori soli, koji takođe mogu sadržavati gumu arabiku, talk, polivinilpirolidon, karbopol gel, polietilen glikol i / ili titanijum dioksid, rastvore laka i pogodne organske rastvarače ili smese rastvarača. Boje ili pigmenti mogu se dodati tabletama ili oblogama dražearadi identifikacije proizvoda ili u cilju obeležavanja količine aktivnog jedinjenja, tj., doze.

Farmaceutski preparati koje se oralno upotrebljavaju uključuju i kapsule koje se gurnu napravljene od želatina, kao i meke, zatopljene kapsule napravljene od želatina i zaštitnog sloja, kao što je glicerol ili sorbitol. Kapsule koje se gurnu mogu sadržavati aktivne sastojke pomešane sa poniocima ili vezivnim sredstvima, kao što su laktoza ili različite vrste škroba, podmazivačima, kao što je talk ili magnezijum stearat, L opciono, stabilizatorima. U mekim kapsulama aktivna jedinjenj a mogu biti rastvorena ili suspenđovana u pogodnim tečnostima, kao što su masna ulja, tečnost ili tečni polietilen glikol sa, ili bez, stabilizatora.

Druga farmaceutska kompozicija može uključiti efektivnu količinu vezujućeg agensa u srnesi sa netoksičnim ekscipijentima pogodnim za proizvodnju tableta. Rastvarajući tablete u sterilnoj vodi, ili drugom pogodnom nosaču, rastvori se mogu pripraviti u obliku jediničnih doza. Pogodni ekscipijenti uključuju, ali nisu ograničeni na, inertne razblaživače, kao što su kalcijum karbonat, natrijum karbonat ili bikarbonat, Iaktoza, ili kalcijum fosfat; ili vezivni agensi, kao što su škrob, stearinska kiselina, ili talk.

Dodatna farmaceutska kompozicija biće očigledna prosečnom stručnjaku, uključujući kompozicije koje uključuju molekule vezujućeg agensa u kompozicijama podržane ili kontrolisane isporuke. Tehnike za formulisanje različitih drugih podržanih ili kontrolisanih načina transporta, kao što su lipozomski nosači, biodegradativne mikročestice ili porozne perlice i injektirani depoi, takođe su poznati prosečnom stručnjaku. Videti naprimer, PCT/US93/00829 u kome je opisano kontrolisano otpuštanje poroznih polimernih mikročestica za isporuku farmaceutskih kompozicija. Dodatni primeri preparacija podržanog otpuštanja iključuju polupropustljive polimerne matrice u obliku oblikovanih predmeta, na pr., fdmova, ili mikrokapsula. Matrice za podržano otpuštanje uključuju poliestre, hidrogele, polilaktide (U.S. 3,773,919, EP 58,481), kopolimere L-glutaminske kiseline i gama-etil L glutamat [Sidman et al, Biopolvmers, 22:547-556 (1983)], poli (2-hidroksietil-metakrilat) [Langer et al, J5Biomed. Mater. Res., 15:167-277, (1981)] i [Langer et al, Chem. Tech., 12:98-105(1982)], etilen vinil acetat (Langer et al, supra) ili poli-D(-)-3-hidroksibuternu kiselinu (EP. 133,988). Kompozicije podržanog otpuštanja takođe uključuju lipozome, koji se mogu pripraviti bilo kojom od nekoliko metoda poznatih u oblasti. Videti na pr., Eppstein et al, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 82:3688-3692 (1985); EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949.

Za farmaceutske kompozicije koje se koriste za in vivo primenu je tipično da moraju biti sterilne. To se može postići filtrovanjem kroz sterilne membrane za filtraciju. Kada se kompozicija liofilizuje, sterilizacija se može izvršiti pre ili posle liofilizacije i rekonstitucije. Kompozicija za parenteralnu administraciju može se čuvati i liofilizovanom obliku ili kao rastvor. Dodatno, parenteralne kompozicije obično se čuvaju u kontejnerima snabdevenim sterilnim pristupom, na primer, vrećica ili bočica sa intravenoznim rastvorom snabdevena je zapušačem koji se može probiti iglom za supkutano injektiranje.

Kada se jednom izvrši formulacija farmaceutske kompozicije, može se čuvati u sterilnim bočicama kao rastvor, suspenzija, gel, emulzija, čvrsti materijal, ili kao dehidratisani ili liofilizovani prah. Takve kompozicije mogu sc čuvati kao gotovi oblici pripremljeni za upotrebu, ili u obliku (na pr., liofilizovanom) koji zahteva rekonstituciju pre primene.

U specifičnoj realizaciji, predmetni pronalazak usmeren je na pribor za produkciju jedinica jediničnih doza. Svaki pojedinačni pribor s;:drži prvi kontejner sa suvim proteinom i drugi kontejner sa vodenom kompozicijom. U okviru predmetnog pronalaska uključeni su i pribori koji sadrže prethodno napunjene špriceve sa jednim ili više pregrada (na pr., tečni spricevi i lio-špricevi).

Efektivna količina farmaceutske kompozicije koja se terapeutski koristi

razumeće da će pogodni nivoi doziranja za lečenje varirati delimično u zavisnosti od od molekula koji se isporučuje, indikacije za koji molekul se koristi vezujući agens, načina primene, i veličine (telesne težine, telesne površine ili veličineorgana) i stanja (godina i opšteg zdravlja) pacijenta. Prema tome, lekar može titrovati dozu i kodifikovati način primene da bi se dobio optimalni terapeutski efekat. Tipično doziranje može biti u opsegu od oko 0.1 mg/kg do oko 100 mg/kg ili više, u zavisnosti od gore spomenutih faktora. U drugim realizacijama, doza može varirati od 0.1 mg/kg do oko 100 mg/kg; ili 1 mg/kg do oko 100 mg/kg; ili 5 mg/kg do oko 100 mg/kg.

Terapeuski efektivna doza se može za svako jedinjenje inicijalno odrediti u testovima ćelijske kulture ili na životinjskim modelima kao što su miševi, pacovi, zečevi, psi, svinje ili majmuni. Zivotinjiski model može se takođe upotrebiti za određivanje odgovarajućeg opsega koncentracije u načina primene. Takva informacija se može iskoristiti za određivanje korisnih doza i načina primene kod ljudi.

Tačna doza određuje se u svetlu činioca vezanih za subjekat koji se leči. Doziranje i primena se podešavaju da bi se omogućili dovoljni nivoi aktivnog jedinjenja ili da se održi željeni efekat. Faktori koji mogu biti uzeti u obzir uključuju ozbiljnost stanja bolesti, opšte zdravlje subjekta, godine, težinu, u pol subjekta, vreme i frekvencu primene, kombijaciju(e) lekova, osetljivost reakcije, i odgovor na terapiju. Farmaceutske kompozicije dugog trajanja mogu se primenjivati svaka 3 do 4 dana, sveke nedelje, ili dvonedeljno, u zavisnosti od poluživota i brzine ekskrecije svake posebne kompozicije.

Frekvenca doziranja zavisiće od farmakokinetičkih parametara molekula vezujućeg agensa koji se koristi u kompoziciji. Tipično, kompozicija se primenjuje sve dok se ne dostigne doza koja obezbeđuje željeni efekat. Kompozicija se stoga može primeniti kao jedinična doza, ili kao multiple doze (u istoj ili različitim koncentracijama / dozama) tokom vremena, ili kao kontinuirana infuzija. Rutinski se vrši dalje usklađivanje odgovarajućeg doziranja. Odgovarajuća doziranja se mogu odrediti upotrebom pogodnih podataka iz odgovora na dozu( dose- response).

Ncčin administracije farmaceutske kompozicije je u skladu sa poznatim metodama, na pr., oralnim, intravenoznim injektiranjem, intraperitonealnim, intracerebralnim (intra-parenhimaln im), intracerebroventrikularnim, intramuskularnim, intra-okularnim, intraarterijskim, intraportalnim, intralezionalnim, intramedularnim, intratekalnim, intraventrilulamim, transdermalnim, subkutanim, intraperitonealnim, intranazalnim, enteralnim, topikalnim, sublingvalnim, uretralnim, vaginalnim,ili rektalnim načinom, sa sustained asistemima oslobađanja ili pomoću implantiranih uređaja. Po potrebi, kompozicije se mogu administrirati bolus injekcijom ili kontinulano infuzijom, ili pomoću implantiranog uređaja.

Alternativno ili dodatno, kompozicija se može administrirati implantacijom membrane, sunđera, ili drugog odgovarajućeg materijala na koji se apsorbuje željeni molekul ili se enkapsulira. Kada se koristi uređaj za implantaciju, može se implantirati u bilo koje pogodno tkivo ili organ, a distribucija željenog molekula može se vršiti difuzijom, bolusom sa vremenskim oslobađanjem, ili kontinulanom administracijom.

U nekim slučajevim, poželjno je upotrebiti farmaceutske kompozicijeex vivo.U takvim slučajevima, ćelije, tkiva, ili organi koji su ukklonjeni iz pacijenta i izloženi dejstvu farmaceutske kompozicije, posle čega se ćelije, tkiva i/ili organi or organs are simpantiraju nazad u pacijenta.

U drugim slučajevima, vezujući agens predmetnog pronalaska kao što je peptibodi može se distribuirati implantacijom određenih ćelija koje su dobijene genetskim inžinjeringom, primenom metoda koje su ovde opisanem u cilju eksprecije i sekrecije polipeptida. Ove ćelije mogu biti ćelije životinje ili ćelije čoveka, mogu da budu autologne, heterologne, ili kseenogene. Po izboru, ćelije mogu da učiniti besmrnim. Da bi se smanjila šansa imunološkog odgovora, ćelij se mogu enkapsulirati u cilju izbegavanja infiltracije okolnih tkiva. Materijali za enkapsulaciju materials su obično biokompatiblna, semi-permeablna polimerna kućišta ili membrane koje omogućavaju oslobađanje proteinskog proizvoda ali i sprečavaju destrukciju ćelkija od strane imunog sistema pacijentaili drugih štetnih faktora iz okolnih tkiva.

Kombinovana terapija

Specifični vezujući agensi predmetnog pronalaska kao što su peptibodi mogu se koristiti u kombinaciji sa drugim terapeuticima u lečenju boelsti pvezanih sa ekrpesijom Ang-2. Ovi drugi terapeutici su, na primer, lečenje radijacijom, hemoterapija, i ciljane terapije kao što su: Herceptin'Rituxan ', Cleevec™, i slični. Dodatne kombinovane terapipje nisu ove posebno navedene, ali su takođe obuvhaćene predmetnim pronalaskom.

U lečenju hemoterapijom mogu se koristiti antinepolastični agensi uključujući, naprimer, alkihjjuće agense uključujući: azotove slačice, kao što su mehlor-etamin, ciklofosfamid, ifosfamid, melfalan i hlorambucil; nitrozouree, kao što su karmustin (BCNU), lomustin (CCNU), i semustin (metil-CCNU); etilenimine / metilmelamine kao što su trietilenmelamin (TEM), trietilen, tiofosforamid (tiotepa), heksametilmelamin (HMM, altretamin); alkil sulfonate kao što su busulfan; triazine kao što su dakarbazin (DTIC); antimetabolite uključujući analoge folne kiseline kao što su metotreksat i trimetreksat; pirimidinske analoge kao što su 5-fluoruracil, fluordeoksiuridin, gemcitabin, citozin arabinozid (AraC, citarabm), 5-azacitidin, 2,2'-difluordeoksicitidin, purinske analoge kao što su 6-merkaptopurin, 6-tioguanin, azatioprin, 2'-deoksikoformicin (pentostatin), eritrohidroksinoniladenin (EHNA), fludarabin fosfat, i 2-hlordeoksiadenozin (clađribin, 2-CdA); prirodne proizvode uključujući antimitotičke lekove kao što su paklitaksel, vinka alkaloide uključujući vinblastin (VLB), vinkristin, i vinorelbin, taksoter, estramustin, i estramustin fosfat; ppipodofilotoksine kao što su etoposid i teniposid; antibiotike kao što su aktimomicin D, đaunomicin (rubidomicin), doksorubicin, mitoksantron, idarubicin, bleomicini, plikamicin (mitramicin), mitomicinC, i aktinomicin; enzime kao što su L-asparaginaze; modifikatore biološkog odgovora kao što su interferon-alfa, IL-2, G-CS F i GM-CSF; različite agense uključujući platinske koordinacione komplekse kao što su cisplatina i karboplatina, antracendione kao što su mitoksantron, supstituisanu ureee kao stoje hidroksiurea, metilhidrazinske derivate uključujući N-metilhidrazin (MJH) i prokarbazin, adrenokortikoidne supresante kao što su mitotan (o,p'-DDD) i aminoglutetimid; hormone i antagoniste uključujući adrenokortikosteroidne antagoniste kao što su prednison i njegovi ekvivalenti, deksametazon i aminoglutetimid; progestin kao stoje hidroksiprogesteron kapToat, medroksiprogesteron acetat i megestrol acetat; estrogen kao stoje dietilstilbestrol i etinil estradiolski ekvivalenti; antiestrogen kao stoje tamoksifen; androgeni uključujući testosteron propionat i fluoksimesteron / ekvivalenti; antianđrogene kao što su flutamid, gonadotropin-otpuštajući hormonski analozi i leuprolid; i ne-steroidne antianđrogene kao stoje flutamid.

Kombinaciona terapija pomoću faktora rasta može uključiti citokine, limfokine, fuktore rasta, ili druge hematopoietične faktore kao što su M-CSF, GM-CSF, TNF, 1L-1, IL-2, IL-3, EL-4, DL-5, IL-6, IL-7, EL-8, DL-9, IL-10, EL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IFN, TNFO, TNF1, TNF2, G-CSF, Meg- CSF, GM-CSF, trombopoietin, faktor stem (nespecijalizovanih) ćelija, i eritropoietin. Druge kompozicije mogu sadržavati poznate angiopoietine, na primer Ang-1, -2, -4, -Y, i / ili humani Ang-slični polipeptid, i / ili vaskularni endotelialni faktor rasta (VEGF). Faktori rasta uključuju angiogenin, morfogeni protein-1 kostiju, morfogeni protein-2 kostiju, morfogeni protein-3 kostiju, morfogeni protein-4 kostiju, morfogeni protein-5 kostiju, morfogeni protein-6 kostiju, morfogeni protein-7 kostiju, morfogeni protein-8 kostiju, morfogeni protein-9 kostiju, morfogeni protein-10 kostiju, morfogeni protein-11 kostiju, morfogeni protein-12 kostiju, morfogeni protein-13 kostiju, morfogeni protein-14 kostiju, morfogeni protein-15 kostiju, koštani morfogeni proteinski receptor IA, koštani morfogeni proteinski receptor IB, iz mozga derivatizovani neurotrofhi faktor, ciliarni neutrofni faktor, receptor ciliarnog neutrofhog faktora, citokinom indukovani neutrofilni hemotaktični faktor 1, citokinom indukovani neutrofil, hemotaktični faktor, citokinom indukovani neutrofilni hemotaktični faktor 2, faktor rasta ndotelialnih ćelija, endotelin 1, faktor epidermalnog rasta, epitelium derivatizovani neutrofilni atraktant, faktor 4 rasta fibroblasta, faktor rasta fibroblasta, faktor 6 rasta fibroblasta, faktor 7 rasta fibroblasta, faktor 8 rasta fibroblasta, faktor 8b rasta fibroblasta, faktor 8c rasta fibroblasta, faktor 9 rasta fibroblasta, faktor 10 rasta fibroblasta, kiseli faktor rasta fibroblasta, bazni faktor rasta fibroblasta, iz glialne ćelijske linije izvedeni neutrofni faktor receptor-1, iz glialne ćelijske linije izvedeni neutrofni faktor receptor-2, protein povezan sa rastom, protein-1 povezan sa rastom, protein-2 povezan sa rastom, protein-3 povezan sa rastom, heparin vezujući epidermalni faktor rasta, faktor rasta hepatocita, receptor faktor rasta hepatocita, insulinu sličan faktor I rasta, receptor insulinu sličnog faktora rasta, insulinu sličan faktor II rasta, vezujući protein insulinu sličnog faktora rasta, faktor rasta keratinocita, inhibitorski faktor leukemije, receptor-1 inhibitorskog faktora leukemije, faktor rasta nerva, receptor faktora rasta nerva, neurotropin-3, neurotropin-4, faktor rasta placente, faktor 2 rasta placente, iz krvnih pločica izvedeni faktor rasta endotelialnih ćelija, iz krvnih pločica izvedeni faktor rasta, iz krvnih pločica izvedeni faktor rasta A niz, iz krvnih pločica izvedeni faktor rasta AA, iz krvnih pločica izvedeni faktor rasta AB, iz krvnih pločica izvedeni faktor rasta B niz, iz krvnih pločica izvedeni faktor rasta BB, receptor-1 iz krvnih pločica izvedenog faktora rasta, receptor-2 iz krvnih pločica izvedenog faktora rasta, stimulišući faktor rasta pre-B ćelija, faktor stem (nespecijalizovanih) ćelija, receptor faktora stem (nespecijalizovanih) ćelija, transformišući faktor-1 rasta, transformišući faktor-2 rasta, transformišući faktor-1 rasta, transformišući faktor-1.2 rasta, transformišući faktor-2 rasta, transformišući faktor-3 rasta, transformišući faktor-5 rasta, latentni transformišući faktor-1 rasta, vezivni protein 1 transformišućeg faktora-1 rasta, vezivni protein II transformišućeg faktora-1 rasta, vezivni protein III transformišućeg faktora-1 rasta, receptor tip I tumor faktora nekroze, receptor tip II tumor faktora nekroze, aktivatorski receptor plazminogena tipa urokinaze, vaskularni endotelialni faktor rasta, i himerni proteini i biološki ili njihovi imunološki aktivni fragmenti.

Imunoterapeutici

Imunoterapeutici se obično oslanjaju na upotrebu imunih (rezistentnih) efektorskih ćelija i molekula da ciljaju i unište ćelije raka. Imuni efektori mogu biti, na primer, peptibodi predmetnog pronalaska koje prepoznaju neke markere na površini ciljanih ćelija. Sama peptibodi može služiti kao efektor za terapiju ili može angažovati (regrutovati) druge ćelije da ubiju ciljanu ćeliju. Peptibodi može biti konjugovana za lek ili toksin (hemoterapeutik, radionuklid, niz ricina A, kolera toksin, toksin velikog kašlja, itd.) i tako može samo služiti kao agens za ciljanje.

Prema sadašnjem pronalasku, mutantni oblici Ang-2 mogu se ciljati (napasti) imuno terapijom pomoću peptibodi ili konjugata peptibodi predmetnog pronalaska . Naročito se ima u vidu da se peptibodi kompozicije predmetnog pronalaska mogu koristiti u kombinovanom prilazu terapiji u konjugaciji sa Ang-2 ciljanom terapijom. Pasivna imunoterapija se pokazala daje posebno efikasna protiv nekoliko vrsta raka. Videti, na primer, WO 98/39027. Sledeći primeri su dati samo u ilustrativne svrhe, i ne bi trebalo da budu protumačeni na bilo koji način kao limitirajući polja predmetnog pronalaska.

Primer 1

Ang- 2 ekspresija u patološkom i normalnom tkivu

Ang-2 ekspresija je analizirana u normalnom i patološkom tkivu koristeći in siru hibriđizaciju. Fragmenti humanih (Genbank Accession Number: AF004327, nukleotidi 1274-1726) Ang-2 sekvenci, i mišjih Ang-2 sekvenci (Genbank Accession Number: AF004326, nukleotidi 1135-1588), su amplifikovani reversnom transkriptazom-PCR iz humane ili mišje fetalne plućne cDNK, klonirani u pGEM-T plazmid i verifikovani sekvencionisanjem. Izvršenje prepis 33P obeleženih antisens RNK proba iz linearizovanog plazmidnog templata pomoću 33P-UTP i RNK polimeraze. Blokovi u formaldehidu fiksiranih, u parafin ugrađenih tkiva su sekcirani na 5 um i sakupljani na naelektrisanim slajdovima. Pre in situ hibridizacije tkiva su se permeabilizovala pomoću 0.2 M HC1, za čime sledi digestija koristeći Proteinazu K, i acetilovanje pomoću trietanolamina i anliidrida sirćetne kiseline. Delići (sekcije) su hibridizovani preko noći na 55 °C koristeći radio obeležene probe, a zatim podvrgnute digestiji RNaze i iscrpnom ispiranju u oko 0.1 X SSC na 55 °C. Slajdovi su uronjeni u emulziju Kodak NTB2, eksponirani na 4°C tokom 2-3 nedelje, razvijeni, i obojeni na način za bojenje mikroskopskih uzoraka. Sekcije su pregledane tamnim poljem i standardnim osvetlenjem da bi se omogućila simultana procena morfologije tkiva i

Rezultati indiciraju daje u normalnom postanatalnom humanom biću Ang-2 ekspresija ograničena na nekoliko vrsti tkiva što sadrže angiogene vaskulature, kao što su jajnici, placenta i uterus. Ang-2 ekspresija nije detektovana u normalnom odraslom srcu ljudi, mozgu, buregu, jetri, plućima, pankreasu, slezini, mišićima, krajnicima, timusu, šlepom crevu, limfnim čvorovima, žučnom mehuru, prostati ili testisima. U mišu starom pet nedelja (ali ne i u odraslom majmunu niti čoveku), bubrezi su ispoljavali izraženu Ang-2 ekspresiju u rektalnom kanalu. Radi određivanja da lije ekspresija zaostatak embrionskog razvoja, ovaj eksperiment je i ponovljen na bubrezima miševa čija je starost varirala do jedne godine koristeći mišju Ang-2 probu i gore opisane uslove. Promećeno je da Ang-2 ekspresija opada tokom neonatalnog razvoja, ali je još uvek bila očigledna u bubrezima jednogodišnjih miševa. Ang-2 ekspresija je takođe detektovana u praktično svim testiranim tipovima tumora, uključujući, primarne humane tumore kao što su karcinom debelog creva (5 slučajeva), karcinom dojke (10 slučajeva), karcinom pluća (8 slučajeva), glioblastom (1 slučaj), metastatske humane tumore kao što su karcinom dojke (2 slučaja), karcinom pluća (2 slučaja) i karcinom jajnika (2 slučaja) koji su metastazirali u mozgu, i tumorskim modelima glodara kao što su C6 (gliom pacova), HT29 (humani karcinom debelog creva), Colo-205 (humani karcinom debelog creva), HCT116 (humani karcinom debelog creva), A431 (humani karcinom epiderma), A673 (humani rabdomiosarkom), HT1080 (humani iibrosarkom), PC-3 (humani karcinom prostate), B16F10 (mišji melanom), MethA (mišji sarkom), i Levvis karcinom pluća mets. Dodatno, ekspresija Ang-2 je detektovana u novim sudovima koji urastaju u Matrigel plug kao odgovor na VEGF i u mišjem modelu hipoksije retinopatije pre zrelosti.

Primer 2

Molekulski modeli za evaluaciju Ang- 2 peptibodi

Razvijeni su molekulski testovi (Afinitetna ELISA, Neutralizaciona ELISA, i BIAcore) za direktno određivanje vezivanja peptibodi za Ang-2 i povezane članove familije, i na efekat peptibodi na Ang-2 :Tie-2 interakciju. Ovi in vi tro testovi su dole opisani.

Afinitetna ELIS A

Za inicijalni skrining kandidata anti-Ang-2 peptibodi, upotrebi]eni su prečišćeni humani Ang-2 (R&D Svstems, Ine; kataloški broj 623-AN; Ang-2 nabavlja ka osmesa 2 skraćene verzije) ili mišji Ang-2 polipeptid (pripremljen kako je gore opisano). Za potvrdne testove vezivanja humani Ang-2 je dobijen iz kondicioniranih medija humanih 293T ćelija sa prepisanim humanim Ang-2 DNK pune dužine i uzgajanje u Dulbecco-vom Modified Eagle Medium (DMEM) bez seruma, koji sadrži oko 50 mikrograma na ml albumina seruma govečeta (BSA).

Koristeći mikrotitarske ploče, približno 100 mikrolitara na sudić Ang-2 je dodat svakom sudiću i ploče su inkubirane oko 2 sata posle čega su isprane četiri puta fosfatom puferovanim vodenim rastvorom soli (PBS) koji sadrži oko 0.1 procenat Tween-20. Ležišta su potom blokirani koristeći oko 250 mikrolitara na sudić približno 5 procentni BSA u PBS, ploče su inkubirane na sobnoj temperaturi oko 2 sata. Posle inkubacije, višak rastvora sredstva za blokiranje je odbačeno, i oko 100 mikrolitara svakog kandidata anti-Ang-2 peptibodi je dodat sudiću u seriji razblaženja polazeći od koncentracija od oko 40 nanomolarne i zatim serijski razblaživanoj 4-struko u PBS koji sadrži 1 procenat BSA. Ploče su zatim inkubirane preko noći na sobnoj temperaturi. Posle inkubacije, ploče su isprane pomoću PBS koji sadrži oko 0.1 procenat Tween-20. Ispiranje j e ponovljeno j oš četiri puta, posle čega je svakom sudiću dodato oko 100 mikrolitara kozjeg anti-humanog IgG(Fc)-HRP (Pierce Chemical Co., kataloški br.

31416) prethodno razblaženog u odnosu 1:5000 u PBS koji sadrži I procenat BSA. Ploče su inkubirane približno 1 sat na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane pet puta pomoću PBS koji sadrži oko 0.1 procenat Tween-20, posle čega je dodato oko 100 mikrolitara na sudić TMB (3,3',5,5'-Tetrametilbenzidinski Liquid Substrate Svstem; Sigma Chemical Companv, St. Louis, MO, kataloški broj T8665), i ploče su inkubirane oko 5-15 minuta dok se nije razvila plava boja. Apsorbanca je zatim određena spektrofotometrom na oko 370 nm.

Neutralizaciona ELISA

Mikrotitarske ploče u kojima je vezan humani Ang-2 polipeptid su pripremljene kako je opisano u poglavlju Afinitetna ELISA. Kandidati anti-Ang-2 peptibodi su titrovani od 1000 nM do 0.2 pM u 4-strukim razblaženjima PBS koji sadrži oko 1% BSA i oko 1 nM Tie-2 (koji se nabavlja kao Tie-2-Fc molekul gde Tie-2 deo sadrži samo rastvorni ektracelularni deo molekula; R&D Svstems, kataloški broj 313-TI). Posle dodavanja oko 100 mikrolitara antitelo / Tie-2 rastvora svakom sudiću, ploče su inkubirane preko noći na sobnoj temperaturi, a zatim isprane pet puta pomoću PBS koji sadrži oko 0.1 procenat Tween-2§. Posle ispiranja dodato je oko 100 mikrolitara na sudić anti-Tie-2 antitela (Pharmingen Inc., kataloški br. 557039) do krajnje koncentracije od oko 1 mikrogram na ml, i ploče su inkubirane oko 1 sat na sobnoj temperaturi. Zatim je dodato oko 100 mikrolitara na sudić kozjeg anti-miš-IgG-HRP (Pierce Chemical CO., kataloški br. 31432) pri razblaženju od 1:10,000 u PBS koji sadrži oko 1 procenat BSA. Ploče su inkubirane oko 1 sat na sobnoj temperaturi, a zatim isprane pet puta pomoću PBS koji sadrži oko 0.1 procenat Tween-20. Dodato je oko 100 mikrolitara TMB supstrata (opisano gore) na sudić ostavljeno je da se razvije boja. Apsorbanca je zatim određena spektrofotometrom na oko 370 nm.

Afinitetna BIAcore

Afinitetna analiza svakog kandidata Ang-2 peptibodi izvršena na BIAcore®2000 (Biacore, Inc., Piscataway, NJ) koristeći PBS i 0.005 procentni P20 Površinski aktivni rastvor (Biacore, Inc.) kao pufer. Recombinant Protein G (Repligen, Needham, MA) je imobilisan na senzorski čip CM5 istraživačke čistoće (Biacore, Inc.) preko primarnih amino grupa koristeći Amine Coupling Kit (Biacore, Inc.) prema proizvođačkom protokolu.

Testovi vezivanja su izvršeni prvo hvatanjem oko Ru svakog kandidata anti-Ang-2 peptibodi za imobilisani Protein G, posle čega su različite koncentracije (0-100 nM) huAng-2 ili mAng-2 injektirane preko vezane površine antitela pri brzini protoka od 50 nl/min tokom 3 minuta. Određeni su vezujući parametri, uključujući ka (konstantu brzine asocijacije), kj (konstantu brzine disocijacije) i Kq (konstantu ravnoteže disocijacije) koristeći BIA evaluation 3.1 computer program (Biacore, Inc.). Niže vrednosti konstanti ravnoteže disocijacije indicirale su veći afinitet peptibodi prema Ang-2.

Primer 3

Identifikacija Ang- 2 vezujućih peptida 1.

1. Pobijanje Ang- 2- obloženih ma<g>netnih perlica

A. Imobilizacija Ang- 2 na ma<g>netnim perlicama

U cilju nespecifičnog eluiranja imobilisan je biotinilovani protein Ang-2 (Biotinvlated Recombinant Human Angiopoietin-2, R&D Svstems, Inc.; kataloški broj BT 623) na Streptavidin Dvnabeads (Dynal, Lake Success, NY) pri koncentracijama od oko 4 p.g biotinilovanog Ang-2 proteina na 1001x1 perlica nabavljenih od proizvođača za sva tri kruga selekcije. Za eluiranje antigena (Ang-2) i receptora (Tie-2), 2 ug biotinilovanog Ang-2 proteina imobilisano je na 50 ul Streptavidin Dvnabeads za druge krugove selekcije. Koncentracija oblaganja je za treći krug selekcije smanjena na 1 \ ig biotinilovanog Ang-2 proteina na 50 ul perlica. Povlačeći perlice pomoću magneta na jednu stranu epruvetice i uklanjajući tečnost pipetom, perlice su isprane pet puta fosfatnim puferom vođenog rastvora soli (PBS) i ponovo su suspendovane u PBS. Biotinilovani protein Ang-2 je dodat ispranim perlicama na gornjim koncentracijama i inkubiran uz rotiranj e na sobnoj temperaturi, za čime sledi inkubiranje od nekoliko sati do preko noći na 4 °C uz rotiranje. Ang-2-obložene perlice su blokirane dodavanjem BSA do oko 1 % krajnje koncentracije i inkubirane su preko noći na 4 °C uz rotiranje. Dobivene Ang-2-obložene perlice su zatim isprane pet puta sa PBS pre nego što su podvrgnute selekciji.

B. Pobijanje negativnom selekcijom perlica

Dodatne perlice pripreljene su i za negativnu selekciju. Za svaki uslov ispiranja, 500 ul perlica nabavljenih od proizvođača podvrgnuto je gore datom postupku (odeljak

1 A) osim stoje izostavljena inkubaciona faza sa biotinilovanim Ang-2. U poslednjoj fazi ispiranja, perlice su podeljene u pet alikvota od po 100 ul

Sclckc'ia Anu- 2 vc/ ujuee Tane

A. Opšta strategija

Za izbor Ang-2 vezujući fagi upotrebljene su tri filamentozne biblioteke faga, označenih kao "TN8-IX" (5xl0<9>nezavisnih transformanata), "TN12-I" (1.4xl0<9>nezavisnih transformanata), and "Linear" (2.3x10<9>nezavisnih transformanata) (sve od Dyax Corp.). Svaka biblioteka se zatim podvrgnuta ili nespecifičnom eluiranju, Ang-2 eluiranju, i receptorskom eluiranju (Tie-2). Za Ang-2 je primenjeno devet različitih uslova ispiranja (TN8-IX koji koristi nespecifični metod ispiranja, TN8-IX koji koristi Ang-2 metod ispiranja, TN8-IX koji koristi Tie-2 metod ispiranja, TN12-I koji koristi nespecifični metod ispiranja, TN12-I koji koristi Ang-2 metod ispiranja, i TN12-I koji koristi Tie-2 metod ispiranja, Linearni koji koristi nespecifični metod ispiranja, Linearni koji koristi Ang-2 metod ispiranja, i Linearni koji koristi Tie-2 metod ispiranja). Za sve tri biblioteke, fage iz prvog kruga selekcije su za dalje krugove selekcije eluirane samo nespecifičnim načinom. Ang-2 i Tie-2 eluiranja su korišćena u drugom i trećem krugu selekcije. U slučaju Linearne biblioteke je selekcija izvršena samo do drugog kruga Ang-2 i Tie-2 eluiranja.

B. Negativna selekcija

Za svaki od uslova ispiranja alikvotirano je oko 100 nasumičnih bibliotečkih

ekvivalenata TN8-IX i TN12-I biblioteka (oko 5 X 101' pfu za TN8-IX, i oko 1.4 X 10 pfu za TN12-I) i oko 10 nasumičnih bibliotečkih ekvivalenata linearne biblioteke (oko 1 X 1011 pfu) iz bibliotečke zalihe razblaženo na oko 400 ul pomoću PBST (PBS sa 0.05 % Tween-20). Posle poslednjeg ispiranja tečnost je odstranjena iz prvog alikvota od 100 ul perlica dobivenih negativnom selekcijom (odeljak 1B), potom je perlicama dodato približno 400 ul rablažene zalihe biblioteke. Dobivena smesa je inkubirana oko 20 minuta na sobnoj temperaturi uz rotiranje. Supernatani fag je odstranjen magnetom i dodat je drugom alikvotu od 100 ul za još jednu negativnu selekcionu fazu. Na ovaj način izvršeno je pet negativnih selekcionih faza.

C. Selekcija pomoću perlica obloženih Ang-2 proteinom

Posle negativnog selekcionog koraka (odeljak 1B) supematant faga je dodat Ang-2 obloženim perlicama (odeljak 1 A). Ovakva smesa inkubirana je uz rotaciju tokom jednog do dva sata na sobnoj temperaturi, omogućavajući da se fage vežu za ciljni protein. Pošto se odbaci supematant, perlice se isperu oko deset puta sa PBST za čime slede dva ispiranja sa PBS.

D. Nespecifično eluiranje

Posle finalnog ispiranja tečnost je odstranjena (odeljak 2C) a perlicama je dodato oko 1 ml rastvora soli Min A (60 mM K2HP04,33 mM KH2PO 4, 7.6 mM (NH4)S04, i 1.7 mM natrijum citrata). Smesa perlica je direktno dođata koncentrovanom uzorku bakterije koja se inficira (videti dole odeljak 3A i 3B).

E. Antigen (Ang-2) eluiranje vezane fage

U drugom krugu, posle poslednjeg ispiranja (odeljak, C), vezane fage su eluirani sa magnetnih perlica dodatkom 100 ul 1 pM, 0.1 nM, i 10 nM rekombinantnog Ang-2 proteina (Recombmant Human Angiopoietin-2, R&D Svstems, Inc., Minneapolis, Minnesota) sukcesivno sa 30 minutnom inkubacijom za svaki od datih uslova. Preostale fage su nespecifmo eluirani (odeljak 2D). Fage iz 10 nM i nespecifičnih eluiranja su kombinovane, i podvrgnute trećem krugu selekcije (videti odeljak 4, dole).

U selekcionom krugu 3, posle posleđnje faze ispiranja (odeljak 2C), vezane fage su eluirani sa magnetnih perlica dodatkom 1 nM rekombinantnog Ang-2 proteina, i 10 nM rekombinantnog Ang-2 proteina sa 30 minutnom inkubacijom za svaki od datih uslova. Dodatno, fage su eluirane pomoću 1 ml 100 mM rastvora trietilamina (Sigma, St. Louis, Missouri) oko 10 minuta u rotatoru. pH rastvora koji sadrži fage i trietilamin neutralisan je pomoću 0.5 ml 1 M Tris-HCl (pH 7.5). Posle poslednjeg eluiranja pomoću 100 mM rastvora trietilamina, preostale fage su eluirane dodatkom perlica bakteriji (ođeljak2D).

F. Eluiranje vezanih faga pomoću receptora (Tie-2)

U drugom krugu, posle poslednjeg ispiranja (odeljak 2C), vezane fage su eluirane sa magnetnih perlica dodatkom oko 100 ul 1 pM, 0.1 nM, i 10 nM rekombinantnog Tie-2 proteina (Recombinant Human Tie-2-Fc Chimera, R&D Svstems, Inc., Minneapolis, Minnesota) sukcesivno sa 30 minutnom inkubacijom za svaki od datih uslova. Preostali fagi su nespecifino eluirani (odeljak 2D). Fagi iz 10 nM i nespecifičnih eluiranja su kombinovane, i podvrgnute trećem krugu selekcije (videti odeljak 4, dole).

U selekcionorn krugu 3, posle poslednje faze ispiranja (odeljak 2C), vezane fage su eluirane sa magnetnih perlica dodatkom 1 nM rekombinantnog Ang-2 proteina, i 10 nM rekombinantnog Tie-2 proteina sa 30 minutnom inkubacijom za svaki od datih uslova. Dodatno, fage su eluirane pomoću 1 ml 100 mM rastvora trietilamina (Sigma, St. Louis, Missouri) oko 10 minuta u rotatoru. pH rastvora koji sadrži fage i trietilamin neutralisan je pomoću 0.5 ml 1 M Tris-HCl (pH 7.5). Posle poslednjeg eluiranja pomoću 100 mM mM rastvora trietilamina, preostali fage su eluirane dodatkom perlica bakteriji (odeljak 2D)3.

3. Amplifikacija

A. Pripremanje ćelija za oblaganje

Sveža kulturaE. Coi(XL-l Blue MRF) je gajena do OD600 od oko 0.5 u LB medij umu koji je sadržavao oko 12.5 ug / ml tetraciklina. Za svaki od uslova ispiranja je oko 20 ml ove kulture ohlađeno na ledu i centrifugirano. Bakterijska perlica je ponovo suspendovana u oko 1 ml rastvora Min A Salts (Soli).

B. Transdukcija

Svaka smesa iz svakog različitog postupka eluiranja datih gore (odeljci 2D, 2E i 2F) dodata je uzorku koncentrovane bakterije (odeljak 3A) i inkubirana na oko 37 °C oko 15 minuta. Približno 2 ml medijuma NZCYM (2XNZCYM, 50 ug / ml Ampicillin) je dodato svakoj od smesa i inkubirano na oko 37 °C tokom 15 minuta. 4 ml nastalog rastvora je nanesen na veliku NZCYM agar ploču koja sadrži oko 50 ug / ml ampicilina i izvršena je inkubacija preko noći na 37 °C.

C. Sakupljanje fa<g>a

Svaka smesa bakterija / fage je uzgajana preko noći na velikoj NZCYM agar ploči (odeljak 3B), posle čega su zgrebane u oko 35 ml LB medijuma. Agar ploča je dalje isprana sa dodatnih 35 ml LB medijuma. Dobivena smesa bakterija / fage u LB medijumu je centrifugirana da bi se kuglice odstranile. Približno 50 ml supernatanta fage je zatim preneto u novu epruveticu, i oko 12.5 rastvora PEG (20% PEG8000, 3.5M amonijum acetat) je dodato i inkubirano na ledu tokom 2 sata da se fage precipituju. Staložene fage su odvojene centrifugiranjem i ponovo su suspendovani u 6 ml pufera za ponovno suspendovanje faga (250 mM NaCl, 100 mM Tris pH8, 1 mM EDTA). Ovakav rastvor fage je dalje prečišćavan centrifugiranjem preostalih bakterija i taloženjem fage po drugi put dodatkom oko 1.5 ml rastvora PEG. Posle faze centrifugiranja, kuglice faga su ponovo suspendovane u oko 400 ul PBS. Dobiveni rastvor je podvrgnut posleđnjem centrifugiranju da se odstrane bilo kakvi ostaci bakterija. Nastali preparat fage je titrovan standardnim testom u kome se formiraju pločice.

4. Dodatna selekcija i amplifikaciia

U drugom krugu, amplifikovani preparati faga (oko 10<10>pfu) iz prvog kruga (odeljak 3C) se koriste kao inputne fage u selekcionim i amplifikacionim fazama (odeljci 2 i 3). U slučaju Ang-2 i Tie-2 eluiranih rastvora, fage iz 10 nM i nespecifičnih eluiranih rastvora se kombinuju i amplifikuju za treći krug selekcije. Amplifikovane preparati faga (oko I O9 pfu) iz 2. kruga po redu je korišćen kao fagi input za 3. krug selekcije i amplifikacije (odeljci 2 i 3). Posle faza eluiranja (odeljci 2D, 2E, i 2F) 3. kruga, mala frakcija eluiranih fagi je nanesena kao u testu formiranja pločica (odeljak 3C). Pojedinačne pločice su izvađene i stavljene u ploču sa 96 mikrotitarskih ležišta koji su u svakom sudiću sadržavali 100 plTE pufera. Ove glavne ploče su inkubirane na 4 °C preko noći da se fagi eluiraju u TE pufer.

5. Klonalna analiza

Klonovi faga analizirani su pomoćna ELISA faga i DNK sekvencionisanj em. Sekvence su poredane prema kombinovanim rezultatima ova dva testa.

A. ELISA Faga

XL-1 Blue MRF kultura je gajena dok nije postigla OD600oko 0.5. Oko trideset ul ove kulture je alikvotirano u svaki sudić mikrotitarske ploče od 96 ležišta. Oko 10 jal eluiranih faga (odeljak 4) je dodato svakom sudiću i ostavljeno oko 15 minuta da inficira bakteriju na sobnoj temperaturi. Oko 100 ul LB medijuma što sadrži približno 12.5 ug / ml tetraciklina i približno 50 ug / ml ampicilina je dodato svakom sudiću. Mikrotitarska ploča je zatim inkubirana uz mućkanje preko noći na oko 37 °C. Rekombinantni Ang-2 protein (oko 1 ug / ml u PBS) je ostavljen da se veže za Maxisorp ploče sa 96 ležišta (NUNC) preko noći na oko 4 °C. U kontrolnoj probije čisti streptavidin obložen u odvojene Maxisorp ploče sa oko 2 ug/ml u PBS.

Sledećeg dana je tečnost u Maxisorp pločama obloženim proteinom odbačena, i svaki sudić je blokiran sa oko 300 ul 5 % rastvorom mleka na oko 4 °C preko noći (alternativno, 1 sat na sobnoj temperaturi). Rastvor mleka je zatim odbačen, i ležišta su isprana tri puta pomoću PBS T rastvora. Posle poslednje faze ispiranja, svakom sudiću Maxisorp ploča obloženih proteinom dodato je oko 50 ul PBST - 4 % mleka. Oko 50 ul kultura ostavljenih preko noći iz svakog ležišta, iz mikrotitarske ploče sa 96 ležišta, preneto je u odgovarajuće sudiće ploče obložene Ang-2 kao i u kontrolnu, sa streptavidinom obložene ploče. 100 ul smese u svakoj od tipova ploča je inkubirano oko 1 sat na sobnoj temperaturi. Tečnost je tada iz Maxisorp ploča odbačena, i ležišta su isprani oko tri puta pomoću PBST. HRP konjugovana anti-M13 antitela (Amersham Pharmacia Biotech) su razblažena to oko 1 : 7,500, i oko 100 ul razblaženog rastvora je dodato svakom sudiću iz Maxisorp ploča i inkubirano oko 1 sat na sobnoj temperaturi. Tečnost je tada odbačena i ležišta su isprani oko pet puta pomoću PB ST. Oko 100 ul TMB supstrata (Sigma) je tada dodato svakom sudiću, i reakcija je zaustavljena koristeći 50 fxl 5N rastvora H2SO4 . The OD45o je očitano spektrofotometrom (Molecular Devices).

B. Sekvencionisanje klonova faga

Za svaki klon faga, templat za sekvencionisanje je dobi e pomoću PCR. Sledeći oligonukleotidni par je upotrebljen za amplifikaciju približno 500 nukleotidnih fragmenata:

Za svaki od klonova pripremljena je sledeća smeša:

Za PCR, korišćen je termocikler (GeneAmp PCR Svstem 9700, Applied Biosvstems) izvođenje sledećeg programa: 94 °C tokom 5 minuta; (94 °C 30 sec, 55 °C 30 sec, 72 °C 45 sec) x 30 ciklusa; 72 °C tokom 7 minuta; ohladiti na 4° C. PCR proizvod svake reakcije je prečišćavan pomoću QIAquick Multiwell PCR Purification kit (Qiagen), sledeći proizvođački protokol. Prečišćeni PCR proizvod je zatim testiran koristeći oko 10 ug svake PCR reakcione smese sa oko 1 ul boje (10 X BBXS agarozni gel koji prima boju) na 1 % agaroznom gelu. Preostali proizvod je sekvencionisan pomoću ABI377 Sequencer (Perkin Elmer) sledeći od proizvođača preporučeni protokol.

6. Rangiranje sekvenci i određivanje konsenzus sekvence

A. Rangiranje sekvenci i analiza

Peptidne sekvence koje su prevedene iz različitih nukleotidnih sekvenci (odeljak 5B) su korelisane na ELISA podatke. Klonovi koji su pokazivali visoku OD45o u Ang-2 obloženim ležištima i nisku OD450 u streptavidin obloženim ležištma dobili su najviši prioritet prilikom rangiranja. Sekvence koje su se pojavile nekoliko puta su takođe dobile visoki prioritet prilikom rangiranja. Sekvence kandidati su izabrane na osnovu ovih kriterijuma z i dalju analizu kao peptidi ili peptibodi.

B. Određivanje konsenzus sekvence

Iz TN8-IX biblioteke generisano je tri različite kla e konsenzus motiva:

Iz TN12-1 biblioteke generisan je jedan konsenzus motiv:

U svim motivima konsenzus sekvenci, podvučene su "osnovne (engl.ćore)aminokiselinske sekvence " iz kojih je dobijena svaka konsenzus sekvenca određivanjem one aminokiseline koja se najčešće nalazi na svakom mestu. "X" se odnosi na bilo koju prirodnu aminokiselinu. Dva cisteina u susedstvu ćore sekvenci su fiksirane aminokiseline u bibliotekama TN8-IX i TN12-I.

Peptidi iden ti riko vani kao oni koji se vezuju za Ang-2 su navedeni dole u tabeli 3.

Primer 4

Konstrukcija DNK enkodiranih peptibodi

Modifikovani peptidi odabrani kao potencijalni ihibitori Ang-2:Tie-2 vezivanja (videti tabelu 3) korišćeni su za konstrukciju fuzionih proteina gde je bilo monomer svakog peptida ili tandem dimer svakog peptida (sa linkerom između monomernih jedinica) podv rgnut fuziji za DNK. koji enkodira linker praćen Fc regionom humanog IgGl. Svaki modifikovani peptid je konstruisan anelacionim parovima oligonukleotida ("oligos") za generisanje polinukleotidnog dupleksa koji enkodira peptid zajedno sa uključenim linkerom, u zavisnosti od peptida, od bilo pet glicinskih ostataka, osam glicinskih ostataka ili jednog lizinskog ostatka; ove konstrukcije su generisane kao Ndel do Xhol fragmenti. Ovi dupleks polinukleotidni molekuli su ligirani u vektor (pAMG21-Fc N-terminalni, dalje opisaiji dole) koji sadrži humani Fc gen, koji je prethodno bio digestiran sa Ndel i Xhol. Nastale ligacione (vezane) smese su transformisane elektroporacijom u E. coli soja 2596 ćelije (GM221,dalje opisane dole) standardnim postupcima. Testirana je sposobnost klonova da proizvedu rekombinantni proteinski proizvod, i da li sadrže gensku fuziju koja ima ispravnu nukleotidnu sekvencu. Po jedan od takvih klonova je izabran za svaki od modifikovanih peptida (tj., Fc-peptidnih fuzionih proizvoda).

Konstrukcija pAMG21- Fc N- terminalnog vektora PAMG21

Ekspresioni plasmid pAMG21 (ATCC br. 98113) je izveden iz ekspresionog vektora pCFM1656 (ATCC No. 69576) i ekspresionog vektorskog sistema opisanog u United States patent br. 4,710,473, sledeći postupak opisan u publikovanoj International Patent Application WO 00/24782 (videti deo primera 2 koji se nalazi na stranama 100-103, kao i slike 17Ai 17B).

Fc N- terminalni vektor

Fc N-terminalni vektor je stvoren koristeći E. coli soj 3788, pAMG21 Tpo Gly5_Fc monomer, kao templat. Informacija o kloniranju ovog soja može se naći u WO 00/24782 (Videti tamo primer 2 i sliku 10). Za 5' PCR prajmer (opisan dalje dole) je određeno da ukloni Tpo peptidnu sekvenevi u pAMG Tpo Gly5 i zameni je polilinkerom koji sadrži ApaLI i Xhol položaje. Koristeći soj 3788 kao templat, PCR je izvršena pomoću Expand Long Polvmerase, koristeći oligonukleotid sa SEQ ID NO: 8, dole, kao 5' prajmer i univerzalni 3' prajmer, SEQ ID NO: 9, dole. Nastali PCR proizvod je prečišćen na gelu i digestiran koristeći restrikcione enzime Ndel and BsrGI. Oba, plasmid i polinukleotid koji enkodira željeni peptid, zajedno sa svojim linkerom su prečišćeni na gelu koristeći Qiagen (Chatsvvorth, CA) spin kolone za gel prečišćavanje. Piazmid i insert su zatim ligirani pomoću standardnih ligacionih postupaka, i dobivena ligaciona smesa je transformisana u E. coli ćelije (soj 2596). Odabrani su pojedinačni klenovi i izvršeno je DNK sekvencionisanje. Identifikovanje ispravan klon i upotrebljenje kao izvor vektora za ovde opisane modifikovane peptide.'

5' Prajmer;

3' Praimer:

Kao dodatak dobijanju ovako modifikovanih peptida kao N-terminalnih fuzija za Fc (N-terminalne peptibodi), neki od njih su dobiveni kao C-terminalni fuzioni proizvodi (C-terminalne peptibodi). Vektor koji korišćen za pravljenje C-terminalnih fuzionih proizvoda opisan je dole.

Konstrukcija Fc C-terminalnog vektora

Fc C-terminalni vektor za modifikovane peptide je kreiran koristeći kao templatis. coli soj 3728, pAMG21 Fc_Gly5_Tpo monomer. Informacija o kloniranju ovog soja može se naći u WO 00/24782 (Videti tamo primer 2 i sliku 7). Za 3' PCR prajmer (SEQ ID NO: 10) je određeno da ukloni Tpo peptidnu sekvencu i daje zameni polilinkerom koji sadrži ApaLI i Xhol položaje. Koristeći soj 3728 kao templat, PCR je izvršena pomoću Expand Long Polvmerase, koristeći univerzalni 5' prajmer (SEQ ID NO: 11) i gore pomenuti 3' prajmer. Nastali PCR proizvod je prečišćen na gelu i digestiran koristeći restrikcione enzime Ndel and BsrGI. Oba, plasmid i polinukleotid koji enkodira svaki željeni peptid zajedno sa svojim linkerom su prečišćeni na gelu koristeći Qiagen (Chatsvvorth, CA) spin kolone za gel prečišćavanje. Plazmid i insert su zatim ligirani pomoću standardnih ligacionih postupaka, i dobivena ligaciona smesa je transformisana u E, coli ćelije (soj 2596). Odabrani su pojedinačni klonovi i izvršeno je DNK sekvencionisanje. Identifikovan je ispravan klon i upotrebljen je kao izvor vektora za ovde opisane modifikovane peptide.

5' Prajmer:

3' Prajmer:

GM221 (# 2596). Soj domaćin #2596, upotrebljen za ekspresiju Fc-peptid fuzionih peptida, je E. coli K-12 soj modifikovan tako da sadrži luks promotor, i oba, temperaturno osetljivi lambda represor cI857s7 u ranom ebg regionu, i the lacl<A>represor u kasnom ebg regionu. Prisustvo ova dva represorska gena omogućava upotrebu ovog domaćina sa različitim ekspresionim sistemima. ATCC oznaka ovog soja je 202174.

Primer 5

Pobijanje peptibodi

Ekspresija uE . coli .Kulture svake od pAMG21 -Te fuzionih konstrukcija u E. coli GM221 su gajene na 3 °C Terrific Broth medijumu (videti Tartof i Hobbs, "Improved media for growing plasmid and cosmid clones", Bethesda Research Labs Focus, volumen 9, strana 12, 1987, citirano u gore pomenutoj Sambrook et al. referenci). Indukcija ekspresije genskog proizvoda luxPR promotorom je postignuta posle dodatka sintetičkog sredstva za samoindukovanje, N-(3-oksoheksanoil)-DL-homoserin laktona, medijumu za uzgajanje kulture do krajnje koncentracije od 20 nanograma na mililitar (ng / ml). Kulture su inkubirane na 3 7 °C dodatnih šest sati. Bakterijske kulture su zatim ispitivane mikroskopijom na prisustvo inkluzionih tela i sakupljane centrifugiranjem Refraktilna inkluziona tela su primećena u indukovanim kulturama, ukazujući da su Fc-fuzije najverovatnije nastale u nerastvornoj frakciji E. coli. Ćelijske kuglice su direktno lizirane resuspendovanjem u Laemmli uzorku pufera koji sadrži 10% (3-merkaptoetanola a zatim analizirane pomoću SDS-PAGE. U najvećem broju slučajeva, intenzivna coomassie-obojena traka odgovarajuće molekulske težine primećuje se na SDS-PAGE gelu.

Prečišćavanje. Ćelije su smrskane u vodi (1/10) koristeći homogenizator visokog pritiska (dva prolaza pri 14,000 PSI), i inkluziona tela sakupljena su centrifugiranjem (4000 RPM u J-6B centrifugi, tokom jednog sata). Inkluziona tela su solubilizovana u 6 M guanidinu, 50 mM Tris, 10 m M DTT, pH 8.5, tokom jednog sata pri odnosu 1/10. U slučaju linearnih peptida fuzionisanih sa Fc, solubilisana smesa je razmažena dvadesetpet puta u 2 M uree, 50 mM Tris, 160 mM arginina, 2 mM cisteina, pH 8.5. Ostavljeno je da se vrši oksidacija dva dana na 4 °C, uz nastajanje disulfidom povezanog jedinjenja (tj., Fc-peptid homdimera). U slučaju cikličnih peptida fuzionisanih sa Fc, upotrebljen je isti protokol uz dodatak sledeća tri uslova za foldovanje (savijanje): (1) 2 M urea, 50 mM Tris, 160 mM arginin, 4 mM cistein, 1 mM cistamin, pH 8.5; (2) 4 M urea, 20 % glicerol, 50 mM Tris, 160 mM arginin, 2 mM cistein, pH 8.5; i (3) 4 M urea, 20 % glicerol, 50 mM Tris, 160 mM arginfn, 4 mM cistein, 1 mM cistamin, pH 8.5. Ponovo savijeni protein je dijalizovan protiv 1.5 M uree, 50 mM NaCl, 50 mM Tris, pH 9.0. pH ove smese je spuštena na pH 5 sirćetnom kiselinom. Precipitatje uklonjen centrifugiranjem, a pH supernatantaje podešeno na 5 do 6.5, u zavisnosti od izoelektrične tačke svakog od fuzionih proizvoda. Protein je filtrovan i štavljenje na 4°C na SP-Sepharose HP kolonu uravnoteženu u 20 mM NaAc, 50 mM NaCl na pH određenom za svaki proizvod. Protein je eluiran koristeći linearni gradijent na 20 zapreminskih kolona u istom puferu u opsegu od 50 mM NaCl do 500 mM NaCl. Pik je odvojen i filtrovan.

Peptibodi generisane koristeći navedenu proceduru date su u tabeli 4 dole.

U tabeli 4, "Fc" se odnosi na humanu Fc IgGl sekvencu. U koloni dva daje se aminokiselinska sekvenca peptibodi. Njen Fc deo je obeležen kao "Fc", dat je u SEQ ID NO: 60, dole. Smatraće se da kada se koristi oznaka, na primer, "Con4" ili "Con-4", to se odnosi na peptid Con-4, dok upotreba sufiksa "C", "(C)", ili "-C"; ili "N", "(N)", ili "-N" uz oznaku, označava daje molekul peptibodi onakav kakav je tu opisan. Sufiksi "N", "(N)", ili "-N" u imenu peptibodi označavaju da Ang-2 vezujući peptid (ili peptidi) je /su N-terminalni prema Fc domenu, a sufiksi "C", "(C)" ili "-C označavaju da Ang-2 vezujući peptid (ili peptidi) je /su C-terminalni prema Fc domenu. Dalje, 2xCon4 (C) 1K, kako je definisano u SEQ ID NO: 25, može se obeležavati i bez sufiksa "1K". kiselinska sekvenca Fc dela svake peptibodi data je kako sledi (od amino terminusa prema karboksilnom terminusu):

DNK sekvenca (SEQ ID Nos: 33-53) koja enkodira peptibodi odgovara peptibodi SEQ ID NOs: 12-32, redom, u tabeli 4) navedena je dole:

Primer 6

Peptibodi testovi

[0294JČetrnaest peptibodi je testirano koristeći neutralizacionu ELISA, i tri peptibodi je testirano pomoću afinitetne ELISA. Rezultati su dati u Tabeli Table 5.

Aminokiselinska sekvenca negativne kontrole peptibodi 4883 je sledeća (Fc deo je podvučen, linker je "GGGGG", i peptidni deo je napisan masnim slovima):

Ovde će se smatrati da upotreba izraza "bez inhibicije" ne znači da jedinjenja nemaju inhibitorna svojstva. Umesto toga, "bez inhibicije" kako se ovde koristi odnosi se na ona jedinjenja koja su, kada se testiraju kogisteći neutralizacioni ELISA test pod ovde opisanim uslovima, iskazala IC50 vrednosti veće od 1000 nM, što je najviša koncentracija na kojoj su ova jedinjenja testirana. Iako nisu detektovana značajna inhibitorna svojstva molgkula koji su obeleženi sa "bez inhibicije", smatraće se da ti molekuli mogu u stvari iskazati inhibitorna svojstva pod drugim uslovima testiranja, ili u drugim testovima. U prioritetnoj manifestaciji, smatraće se da se pronalazak odnosi na peptibodi koja imaju inhibitome kvalitete pod uslovima testiranja koji su ovde opisani.

Dve peptibodi su testirane koristeći afinštetni BIAcore test (kako je opisano u primeru 2). Rezultati su dati u tabeli 6 dole.

Primer 7

Proučavanje terapeutske efikasnosti sistematičnom primenom Ang- 2 peptibodi

Ang-2 peptibodi, TN8-Con4-C, su subkutano primenjeni u miševe sa A431 tumorom prema rasporedu jednom dnevno 72 sata posle izazivanja tumora. Upotrebljene doze peptibodi bile su 1000, 200, 40 i 8 ug/mišu/dan. Svim životinjama dato je ukupno 20 doza. Zapremina tumora i telesna težina beležene su tri puta nedeljno. Na kraju studije životinje su žrtvovaije, i njihovi serumi su sakupljeni u cilju određivanja nivo peptibodi ELISA eksperimentom. Tumori i grupa normalnih tkiva su sakupljeni iz svih grupa.

Rezltati su prikazani na slici 1. Kako se može videti, primećene su značajne razlike u rastu tumora između grupe tretirane pomoću Ang-2 peptibodi i kontrolne grupe. Sve četiri doze Ang-2 peptibodi inhibirale su rast tumora u poređenju sa kontrolnom grupom (p <0.0001 vs. kontrolne grupe koristeći ponovljeno merenje ANPVA). Nasuprot tome, tumori u kontrolnoj grupi su nastavili da rastu mnogo vtćom brzin©m. Lečenje ovim peptibodi nije imalo značajnog efekta na krajnju telesiu težinu, tfžinu organa ili hematološke parametre životinja tretiranih gore navedenim dozama.

Primer 8

1. Konstrukcija Ang- 2 sekundarnih peptidnih biblioteka

A. Elektrokompetentne ćelije E. coli

Epicurian Coli® XL1-Blue MRF' za elektroporaciju sposobne ćelije (Stratagene #200158) su kupljene od Stratagene (Stratagene Cloning Svstems, La Jolla, CA).

B. Modifikacija pCESl vektora

PCR je izvršen koristeći Extend Long Templatf PCR Svstems (Roche Diagnostics Corp., Indianapolis, IN) sa 1 p.g CES1 vektora (TargetQuest Inc.) kao templatom. Zapremina PCR smese bila je 100 fil i ona je sadržavala lx PCR pufer, 200 nM svakog od dva prajmera5-CAAACGAATGGATCCTCATTAAAGCCAGA-3' (SEQ ID NO: 244) i 5'-GGTGGTGCGGCCGCACTCGAGACTGTTGAAAGTTGTTTAGCA-3'

(SEQ ID NO: 245), 200 nM dNTP, i 3 jedinice (U) Tag DNK palimeraze. TRIO-Thermoblock (Biometra) PCR sistem je radio kako sledi: 94 °C tokom 5 minuta; 30 ciklusa na 94 °C tokom 30 sekundi, 50 °C tokom 30 sekundi, 72 °C tokom 45 sekundi; i 72°C tokom 10 minuta; ohladiti na 4 °C.

PCR proizvodi su stavljeni na 1% agarozni gel i prečišćeni na QIAGEN spin koloni (OJAGEN Inc., Valencia, CA) prema proizvođačkim protokolima. Druga PCR reakcija je izvršena sa 5 ul PCR proizvoda i 200 nM svakog od dva prajmera 5'-CAAACGAATGGATCCTCATTAAAGCCAGA-3' (SEQ ID NO: 246) i 5'-AACACAAAAGTGCACAGGGTGGAGGTGGTGGTGCGGCCGCACT-3' (SEQ

ID NO: 247) pod istim PCR uslovima opisanim gore.

PCR proizvodi i originalni pCES 1 vektor su zatim odvojeno digestovani u 100 ul reakciji koja je sadržavala lx NEB2 pufer, 60 U ApaJLI (New England Biolabs, Beverlv, MA), 60 U BamHI (New Englaad Biolabs) na 37 °C tokom 1 sata. Digestovana DNK je zatim prečišćena na OIAGEN spin koloni i ligirana zajedno u 40 ul reakciji koja sadrži lx ligacioni pufer i 40 U T4 DNK ligaze (New England Biolabs), preko noći na sobnoj temperaturi.

Vektori su transfektovaniu E. colii inkubijani na 37 °C preko noći.

Izolovane pojedinačne kolonije su odabrane i plazmid je zatijn prečišćen na

OJAGEN spin koloni. Isprani insert je potvrđen DNK sekvencionisanjem.

C. Pobijanje vektorske DNK

Jedan mikrogram modifikovanog pCESl vektora DNK (iz odeljka 1B gore) je transformisan u 40 jul elektrokompetentne XLl-blueE. coli(iz odeljka 1A gore) koristeći Gene Pulser II (BIO-RAD, Hercules, CA) setovan na 2500V, 25 u.F, i 200 oma. Transformisani uzorak bakterije zatim je odmalt prenesen epruveticu koja sadrži 960 jul SOC (2 % triptona, 0.5 % ekstrakta kvasca, 10 mM NaCl, 2,5 mM KC1, 20 mM glukoze, 10 mM MgS04, 10 mM MgS04), i kultura je ostavljena da raste na 37 °C uz mućkanje tokom 1 sata.

Ćelije su zatim nanete na 2xYTAGT (2xYT sa 100 ug / ml ampicilina, 12.5 p,g/ml tetraciklina i 2 % glukoze) agar ploču i inkubirane na 37 °C preko noći. Pojedinačna kolonija je potvrđena sekvencionisanjem i upotrebljena za inokulaciju 2 litra 2xYTAGT medijuma na 37 °C uz mućkanje preko noći. Plazmidni vektor DNK je prečišćen koristeći OJAGEN Plasmid Maxi Kit prema protokolima proizvođača.

D. Digestiia vektorske DNK

Ukupno oko 2000 mikrograma vektorske DNK (iz odeljka 1C iznad) je digestirano u 5000 ul reakciji koja sadrži lx NEB pufer2, 300 U ApaLI, i 300 U Xhol na 37 °C preko noći. Reakcija restrikcionog digestif&nja je inkubirana preko noći na 37°C i analizirana na gotovom 0.8 % agarozfrom gelu (Embi Tec, San Diego, CA). Linearizovani vektor DNK je zatim iseče» sa gela i ekstrahovan koristeći QIAquick Gel Extraction Kit (OJAGEN Inc.) preipa proizvođačkim uputstvima.

E. Pobijanje biblioteke oligonukleotida

Šest biblioteka oligonukleotida (1 fiksirana i 5 dopifanih) je projektovano na osnovu sekvenci izvedenih iz gore opisanih rezultata. Jeflna fiksirana biblioteka oligonukleotida bila je:

(broj biblioteke 20)

a dve od 70% dopiranih biblioteka oligonukleotida su sledeće:

(broj biblioteke 99);

Mala slova predstavljaju kombinaciju od 70 % od naznačenih baza i 10 % od svakog od preostala tri nukleotida). Druge tri od 91 % dopirane biblioteke oligonukleotida su kako sledi: (broj biblioteke 94);

(broj biblioteke 25);

i

(broj biblioteke 26);

U gore datim oligonukleotidima prosečan stručnjak razumeće da "N" označava da su svaki od četiri nukleotida (A, T, C, i G) podjednako zastupljeni tokom sinteze oligonukleotida, a "K" označava da su nukleetidi G i T zastupljeni tokom sinteze oligonukleotida. Mala slova predstavljaju smesu od 91 % od naznačenih baza i 3 % od svakog od preostala tri nukleotida. Svaki od ovih oligonukleotida je upotrebljen kao templat u PCR.

Za PCR reakcije je upotrebljen Expand High Fidelitv PCR Svstem kit (Roche Diagnostics Corp.). Svaka biblioteka je amplifikovana u devedestšest ležišta u 50 ul PCR reakciji kojaje sadržavala 1 nM bibliotečkih oligonukleotida, IX PCR pufer, 300 nM od svakog prajmera:

200 uM dNTP, 1.5 mM MgCb, i 350 U Expand polimeraze. Termocikler (GeneAmp PCR Svstem 9700, Applied Biosivstems) je upotrebljen za rad sledećeg programa: 94 °C tokom 5 minuta; 25 ciklusa (94 °C tokom 30 sekundi, 52.5 °C tokom 60 sekundi, 72 °C tokom 30 sekundi); 72 °C tokom 10 minuta; ohladiti na 4 °C. Slobodni nukleotidi su zatim uklonjeni koristeći QIAquick PCR Purification Kit (OJAGEN Inc. Cat#28104) prema protokolima proizvođača.

F. Digestiia biblioteke oligonukleotida

Za svaku biblioteku su PCR proizvodi (odeljak 1E) digestirani u reakciji od 1200 ul kojaje sadržavala lx NEB pufer2, 750 U ApaLI, i 750 U Xhol na 37 °C preko noći. Digestirana DNK je razdvojena na gotovom 3 % agaroznom gelu (Embi Tec, San Diego, CA). Željena DNK traka iz svake reakcije je isečena sa gela i ekstrahovana koristeći COSTAR Spin-X centrifugu sa filterom u cevčici, 0.22 um acetat celuloze (Corning Inc., Cat# 8160).

G. Li gacija vektora sa bibliotekom oligonukleotida

Reakcija ligacije od 450 ul sadržavala je linearizo vani vektor (odeljak ID) i svaka digestirana boblioteka PCR proizvoda (odeljak 1F) u 1:5 molarnom odnosu, lx NEB ligacioni pufer, i 20,000 U T4 DNK ligaze na 16 °C preko noći. Ligirani proizvodi su inkubirani na 65 °C tokom 20 minuta da se inaktivira T4 DNK ligaza i dalje su inkubirani sa 100 U Noti na 37 °C tokom 2 sata (Ja se minimizira samo-ligacija vektora. Ligirani proizvodi su zatim prečišćeni standardnom ekstrakcijom fenolom i hloroformom (Molecular Cloning: A Laboratorv Manual, Maniatiset. al,3<lđ>Edition, Cold Spring Harbor Laboratorv Press, 2000) i ponovo suspendovani u 120ulH2O.

H. Elektroporaciona transformacija

Dvanaest elektroporacionih reakcija je iivršeno za« svaku biblioteku. U svakoj transformaciji je 10 ul ligiranog vektora DNK (odeljak IG) i 300 jul XL1-BLUE MRF' ćelija (odeljak 1 A) pomešane u 0.2 cm kiveti (BIO-RAD). Nastala smeša je pulsovana Gene Pulser II podešeno na 2500 V, 25 uF, i 200 oma. Transformisane bakterije iz dvanaest reakcija elektroportacije su zatim kombinovane i prenesene u balon koji je sadržavao 26 ml SOC za inkubiranje na 37 °C tokom 1 sata. Ćelije su dodate u 450 ml 2xYTAG i gajene na 37 °C uz mućkanje tokom 5 sati. Ćelije su centrifugirane na 4000 rpm tokom 15 minuta na 4 °C. Ćelijske kuglice su zatim ponovo suspendovane u 12 ml 15 % glicerol / 2xYT i čuvane na -80 °C. Ovo je bila primarna zaliha biblioteka, Titar je pokazao daje veličina biblioteke 5.0xl0<9>(broj biblioteke 20), 3.3 xl0<10>(broj biblioteke 94), 4.7 x IO<9>(broj biblioteke 25), 5.0 x 10<9>(broj biblioteke 26), 3.0 x IO<9>(broj biblioteke

27), i 4.2 x IO<9>(broj biblioteke 99) nezavisnih transformanata.

2. Amplifikacija biblioteka

A. Pobijanje sekundarnih zaliha biblioteka

Iz primarnih biblioteka ćelijskih zaliha (iz odeljka ljH iznad), dovoljno ćelija

da se pokrije 10X višak biblioteka svake veličine, je upotrebljeno za inokulaciju 2xYTAGT (2YT sa 100 ug/ml ampicilina, 12. 5ug/ml tetraciklina i 2 % glukoze) medija tako daje polazni OD600 iznosio 0.1. Kulture su ostavljene da rastu na 37 °C

uz mućkanje tokom nekoliko sati sve do ODćoo= 0.5. Jedna desetina alikvota iz svake biblioteke je uzeta i uzgajana je u razdvojenim balonima sledeća dva sata na 37 °C. Ove subkulture su zatim centfifugirane (na 4000 rpm koristeći Beckman JA-

i4 rotor tokom 10 minuta na 4 3C, i kuglice bakterija su ponovo suspendovane u 7.0 ml (za svaku biblioteku) 15 % glicerol / 2xYT radi čuvanja na -80 °C.

B. Indukcija faga

Alikvoti M13K07 helper faga (Amershaifi Pharmaqia Biotech) su dodati preostalim bakterijskim kulturama pri ODeoo = 0.5 (iz odeljta 2A iznad) do krajnje koncentracije od 3 x IO9 u/ml. Helper fage su ostavljene da inficiraju bakterije na 37 °C tokom 30 minuta bez mućkanja i 30 minuta uz blago mućkanje. Inficirane ćelije su centrifugirane na 5000 rpm tokom 15 minuta na 4 °C. Ćelijske kuglice su ponovo suspendovane u istoj zapremini (iz odeljka 3 A iznad) medijuma 2xYTAK (2YT sa 100 ug/ml ampicilina i 40 ug / ml kanumicina). Produkcija faga vršena je na 30 °C preko noći uz mućkanje.

C. Sakupljanje fagemida

Kulture bakterija iz odeljka 2B iznad su centrifugirane na 5000 rpm tokom 15 minuta na 4 °C. Supernatanti su zatim preneseni u nove flaše, i 0.2 zapremine 20 % PEG/2.5M NaCl je dodato i inkubirano na ledu tokom 1 sata da se stalože fagemidi. Staloženi fagemidi su centrifugirani na 10,000 cpm tokom 30 minuta na 4 °C i pažljivo ponovo suspendovani u 100 ml hladnog PBS. Rastvor fagemida je dalje prečišćavan uklanjanjem preostalih ćelija eentrifugirenjem na 4000 rpm tokom 10 minuta na 4 °C taloženjem fagemida dodavanjem 0.2 zapremine od 20 % PEG/2.5M NaCl. Fagemidi su centrifugirani na 10,000 rpm tokom 30 minuta na 4°C, a kuglice fagemida su ponovo suspendovane u 18 ml hladnog PBS. Šest ml 60 % rastvora glicerola solution je dodato rastvoru fagemida radi čuvanja na -80 °C. Titar fagemida je određen standardnim postupkom (Moleoular Cloning, Maniatis et al 3<*1>Edition).

3. Selekcija Ang- 2 vezujuće fage

A. Imobilizacija Ang- 2 na magnetne perlice

Biotinilovani Ang-2 (iz odeljka 3 A iznad) je imobilisan na Dvnabead M-280 Streptavidin (DYNAL, Lake Success, NY) pri koncentraciji od 2000 ng Ang-2 proteina na lOOul zalihe perlica dobivenih od proizvođača. Povlačeći perlice pomoću magneta na jednu stranu epruvetice i uklanjajući tečnost pipetom, perlice su isprane dva puta fosfatnim puferom vodenog rastvora spli (PBS) i ponovo su suspendovane u PBS. Biotinilovani protein Ang-2 je dodat ispranim perlicama na gornjim koncentracijama i inkubiran uz rotiranje na sobnog temperaturi 1 sat. Ang-2-obložene perlice su blokirane dodavanjem. BSA do oko 2 % krajnje koncentracije i inkubirane su preko noći na 4°C uz rotiranje. Dobivene Ang-2-obložene perlice su zatim isprane dva puta sa PBST (PBS sa 0.05% Tween-20) pre nego što su podvrgnute selekciji.

B. Selekcija pomoću Ang- 2 obloženih perlicaOko 1000-struki bibliotečki ekvivalent fagemida (iz odeljka 2C iznad) je blokiran tokom jednog sata pomoću 1 ml PBS koji sadrži 2 % A. Uzorak blokiranog fagemida je u tri koraka negativno selekcionisan dodajući ga praznim perlicama (iste perlice kao u odeljku 3 A, ali bez Ang-2 proteinske obloge), i ova smesa je inkufoirana na sobnoj temperaturi tokom 15 minuta uz rotiranje. Supematant koji sadrži fagemid je izvučen pomoću magneta i prenesen u drugu epruveticu kojaje sadržavala prazne perlice (iste perlice kao u odeljku 3 A, ali bez Ang-2 proteinske obloge), i ova smesa je inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 15 minuta uz rotiranje.

Ovaj postupak je ponovljen. Supematant koji sadrži fagemid je izvučen pomoću magneta i prenesen u novu epruveticu kojaje sadržavala perlice obložene Ang-2 proteinom (iz odeljka 3 A), i ova smesa je inkubiraoa na sobnoj temperaturi tokom 15 minuta uz rotiranje. Postoje supematant odbačen, perlice vezane za fagemid su isprane 10 puta sa 2 % mleko-PBS; 10 puta sa 2 % BSA-PBS; 10 puta sa PBST i dva puta sa PBS. Fagemidi su ostavljeni da se ejuiraju u 1 ml 100 mM trietilaminskog rastvora (Sigma, St. Louis, MO) tokom lO.minuta uz rotiranje. pH rastvora koji sadrži fagemid je neutralisan dodatkom 0.5 ml 1 M Tris-HCl (pH 7.5). Dobijeni fagemidi su upotrebljeni za infekciju 10 ml sveže odgajenih XL1-Blue MRF bakterija (ODĆOOoko 0.5) na 37 °C tokom 30 minuta bez mućkanja i 30 minuta uz slabo mućkanje. Sve inficirane XL1 - BLUE MRF' ćelije su zatim nanete na 15X15cm 2xYTAG ploču i inkubirane na 30 °C preko noći.

C. Indukcija i sakupljanje fage

10 ml alikvot medijuma 2xYTAGTje dodat ploči (iz odeljka 3B) da se ponovo suspenduju XL1-BLUE MRF' ćelije. Sve XL1-BUJE MRF' ćelije su sakupljene u epruveticu, i alikvot od 250 ul ovih ćelija je dodat u 25 ml 2xYTAGT i uzgajanje na 37 °C do OD600= 0.5. M13K07 helper fagi su dodate do krajnje koncentracije od 3 x 10<9>cfu/ml i inkubirane su na 37 °C tokom 30 minuta bez mućkanja i 30 minuta uz slabo mućkanje. Ćelije su centrifugirane na 5000 lpm tokom 10 minuta na 4 °C i ponovo suspendovane u 25 ml 2xYTAK. Ove bakterije su ostavljene da rastu na 30 °C preko noći uz mućkanje. Indukovani fagemidi su sakupljeni i prečišćeni kako se dati u odeljku 2C.

D. Drugi krug selekcije

Drugi krug selekcije je izvršen kao stoje opisano u odeljcima 3B do 3C osim sledećeg. Oko 1000-struki bibliotečki ekvivalent fagemida iz odeljka 3C je upotrebljen kao input fagemid. Količina biotinilovane Aijg-2 proteinske (odeljak 3 A) obloge na Dvnabead M-280 Streptavidin je opala na 20 ng. Za fage vezane perlice su zatim isprane 10 puta sa 2 % mleko-PBS; 10 puta sa 2 % BSA-PBS; 10 puta sa PBST, pri čemu je poslednje ispiranje uključivalo 60 minuta inkubacije na sobnoj temperaturi u PBST. Perlice su isprane dva puta sa PBS. Elucioni uslovi bili su isti kao i prvom krugu (odeljak 3B).

E. Treći krug selekcije

Treći krug selekcije je izvršen kao stoje opisano u odeljcima 3B do 3C osim sledećeg. Oko 10 -struki bibliotečki ekvivalent fagemida iz odeljka 3D je upotrebljen kao input fagemid. Oko 2 ng biotinilovane Ang-2 proteinske (iz odeljka 3 A) obloge na Dvnabead M-280 Streptavidin. Za fagi vezane perlice su zatim isprane 10 puta sa 2 % mleko-PBS; 10 puta sa 2 % BiSA-PBS; 10 puta sa PBST, pri čemu je poslednje ispiranje uključivalo 60 minuta inkubacije na sobnoj temperaturi u PBST. Perlice su isprane dva puta sa PBS. Elucioni uslovi bili su isti kao i provom krugu (odeljak 3B).

F. Četvrti krug selekcije

Četvrti krug selekcije je izvršen kao stoje opisano u odeljcima 3B do 3C osim sledećeg. Bibliotečki ekvivalent fagemida iz odeljka 3P je upotrebljen kao input fagemid. Količina biotinilovane Ang-2 proteinske (odeljak 3A) obloge na Dvnabead M-280 Streptavidin je opala na 0.4 ng u slučaju biblioteka 25, 26, i 27.

U bibliotekama 20 i 94, količina za oblaganje zadržana je na 2 ng. Biblioteka 99 nije uzeta za četvrti krug selekcije. Uslovi eluiranja bili su isti kao i u prvom krugu (odeljak 3B).

4. KLONALNA ANALIZA

A. Pobijanje glavne ploče

Pojedinačne kolonije iz drugog kruga selekcije su uzete i inokulirane u ploču sa 96 ležišta koje sadrže 120 ul 2xYTAGT po ležištu. Ploče sa 96 ležišta su inkubirane na mućkalici na 30 °C preko noći. Četrdeset mikrolitara 60 % glicerola je dodato po ležištu radi čuvanja na -80°C.

B. Fa<g>emid ELISA

Oko 2 ul alikvota ćelija iz glavne ploče (iz odeljka 4A iznad) su inokulirani u svezi Costar® ploču sa 96 ležišta (Corning ineorporated, Corning, NY, cat. #9794) koji su sadržavali 100 ui 2xYTAGT po ležištu, ova nova ploča sa ćelijama je uzgajana na 37 °C do približne ODćoo= 0.5.

Četrdeset ul 2xYTAGT koji je sadržavao Ml3K07 helper fagi (1.5 x 10<13>cfu/ml) je dodat svakom ležištu, i ploča sa 96 ležišta je inkubirana na 37 °C tokom 30 minuta bez mućkanja i 30 minuta uz slabo mućkanje. Ploča je centrifugirana na 2000 rpm (Beckman CS-6R tabletop centrifuge) tokom 10 minuta na 4 °C. Supernatanti su uklonjeni iz ležišta, i svaka ćelijska kuglica je ponovo suspendovana koristeći 150 ul 2xYTAK po ležištu. Ploča je inkubirana na 30 °C preko noći radi ekspresije fagemida.

Humani Ang-2 protein je obložen na Maxisorp ploču sa 96 ležišta (NUNC) na

1 ug/ml u lxPBS na 4 °C preko noći. Kao kontrola, odvojena Maxisorp ploča je obložena sa 2 % BSA (Sigma). Sledećeg dana, ćelijske kulture inkubirane preko noći su centrifugirane na 2000 rpm tokom 10 minuta na 4 °C. Deset jal supernatanta iz svakog ležišta je preneseno u novu ploču sa 96 ležišta koji su sadržavali BSA/PBS rastvor da razblaže supematant na 1:10. Dobivene smese su inkubirane tokom 1 sata na sobnoj temperaturi uz mućkanje radi blokiranja fagemida. U međuvremenu, Ang-2 proteinima obložena ploča je blokirana sa 400 ul rastvora 2 % BSA / PBS po ležištu tokom 1 sata na sobnoj temperaturi uz mućkanje. Rasvor BSA je odbačen, i svako ležište je dobro isprano tri puta pomoću PBS rastvora. Posle poslednje faze ispiranja, 100 ul rastvora blokiranog fagemida je dodato svakom ležištu ploče obložene Ang-2 proteinom, kao i kontrolnoj ploči, i one su inkubirane tokom 1 sata na sobnoj temperaturi iz mućkanje. Tečnost je odbačena, i svako ležište je dobro isprano tri puta rastvorom PBST. Sto ul HRP-konjugovanog anti-M13 mAb (Amersham Pharmacia Biotech) pri razblaženju od 15,000 je dodato svakom ležištu ploče obložene Ang-2 proteinom, kao i kontrolnoj ploči, i one su inkubirane tokom 1 sata na sobnoj temperaturi iz mućkanje. Tečnost je opet odbačena, i svako ležište je dobro isprano tri puta rastvorom PBST. Sto ul LumiGLO hemiluminiscentnih supstrata (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) je dodato ležištima, i svako ležište je očitano koristeći Luminoskan Ascent DLRearly aparat (Labsystems, Franklin, MA).

C. Sekvencionisanje klonova faga

Izvršena je PCR reakcija koristeći kao templat 1 ul bakterija iz svakog

ležišta glavne ploče (odeljak 4A). Zapremina svake PCR sfiesebila je 50 ul i sadržavala je lx PCR pufer, po 300 nM od svakog prajmera:

200 uM dNTP, 2 mM MgCl2, i 2.5 U taq DNK polimeraze (Roche Molecular Biochemicals). GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) je upotrebljen za izvršenje sledećeg programa: 94 °C tokom 5 minuta; 40 ciklusa (94 °C tokom 45 sekundi, 55°C tokom 45 sekundi, 72 °C tokom 90 sekundi); 72 °C tokom 10 minuta; ohladiti na 4 °C. PCR prozvodj su prečišćeni pomoću QIAquick 96 PCR Purification Kit (QIAGEN Inc.) prema uputstvu proizvođača. Svi prečišćeni PCR proizvodi su sekvencionisani pomoću prajrmera 5'-TTACACTTTATGCTTCCG-3' (SEQ ID NO: 258) koristeći ABI3770 Sequencer (Perkin Elmer) prema uputstvu proizvođača.

5. Rangiranje sekvenci

Peptidne sekvence koje su translatovane iz nukleotidnih sekvenci (iz

odeljka 4C iznad) su korelisane sa ELISA podacima. Važnijim su smatrani klonovi koji su pokazali visoko OD čitanje u Ang-2 obloženim ležištima i nisko OD čitanje u BSA obloženim ležištima. Sekvence koje suše pojavljivale više puta takođe su smatrane važnim. Dvadesetčetiri peptidnih sekvenci iz biblioteke 20, 26 peptidnih sekvenci iz biblioteke 94, 7 peptidnih sekvenci iz biblioteke 25, 18 peptidnih sekvenci iz biblioteke 26, 6 peptidnih sekvenci iz biblioteke 27, i 4 peptidnih sekvenci iz biblioteke 99 su izabrane za dalju analizu i generaciju peptibodi. Dodatno, za jedanaest konsenzus sekvenci iz biblioteka 20 i 94, tri konsenzus sekvenci iz biblioteka

26 i 99, i dve iz biblioteke 25 je određena sekvenca i one su upotrebljene za generisanje peptibodi. Peptibodi iz tabele 7 su evaluirane koristeći protokol netralizacione ELISA opisan u primeru 10. Rezultati su prikazani u tabeli 7.

Primer 9

Šest primera anti-Ang2 peptibodi su testirane na aktivnost vezivanja za huAng2 (R&D Svstems, BNO12103A) na BIAcore. Protein G je imobilisan na CM5 čipu prema standardnom aminskom protokolu za kuplovanje (BIAcore Inc.), i peptibodi su zatim u cilju vezivanja, injektirane preko površine proteina G (RL -130 Ru). Radi testiranja vezivanja hAng2 i kaptiranog peptidnog tela, 0.3 nM do 40nM huAng2 je

ubrizgan preko zahvaćene površine i vezujući senzorgrami su analizirani primenjbm BI A evaluacije 3.0 (BIAcore Inc.). LI Tabeli 8 su sažeti rezultati eksperimenta.

Primer 10

ELISA neutralizacija

Pripremljeni medijumi humanog, mišjeg, makaki i pacovskog Ang-2 i humanog i mišjeg Ang-1 su razblaženi u DMEM/50ug/ml BSA kao što sledi: hAng-2-razblaženje 1:64; mAng-2-razblaženje 1:64; pacovski Ang-2-nerazblažen; makaki Ang-2 razblaženje 1:32; hAng-l-razblaženje 1:4; i mAng-l-razblaženje 1:4.

Stepen razblaženja ovih pripremljenih medijuma je određen njihovom sposobnošću da vežu lnM hTie2-Fc (koji je obezbeđen kao Tie-2-Fc molekul, g4e Tie-2 deo sadrži samo solubilni ekstraćelijski deo molekula; R&D Svstems, kataloški broj: 313-T1) do oko 50% od maksimalne sposobnosti vezivanja (to jest platoa). Mikrotitarske pločice su obložene sa lOOul razblaženog pripremljenog medijuma. Za neutralizaciju Akig-2 ELISA metodom, predložena anti-Ang-2 peptidna tela su titrirana, od 62nM do 0.013pM u 4-stepena razblaženja, u rastvor PBS koji sadrži 1% BSA i oko lnM Tie-2 (koji je obezbeđen je kao Tie-2-Fc molekul, gde Tie-2 deo sadrži samo solubilni ekstraćelijski deo molekula; R&D Svstems, kataloški broj 313-T1). Za neutralizaciju AngJ ELISA metodom, predložena PEPTIDNA TELA anti-Ang-2-antitela su titrirana od lOOOnM do0.2pM u 4-stepena razblaženja u rastvor PBS koji sadrži 1% BSA i oko lnM Tie-2 (pripremljen je kao Tie-2- Fc molekul, gde Tie-2 deo sadrži samo solubilni ekstraćelijski deomolekula; R&D Svstems, kataloški broj 313-TI).

Nakon dodavanja oko 100 mikrolitara rastvora peptidno telo/Tie-2usvako ležište, pločice su inkubirane preko noći na sobnoj temperaturi, a potom|)et puta isprane sa PBS koji sadrži oko 0.1 procenat Tween-20. Nakon ispiranja, jeoko 100 mikrolitara anti-Tie-2 antitela (Pharmigen Inc., katalog #557039) dodato po ležištu do konačne koncentracije od oko 1 mikrograma na ml, a pločice su inkubirane oko 1 sat na sobnoj temperaturi. Zatim, je oko 100 mikrolitara rastvora kozjih anti-mišji-IgG-HRP,:razblaženja 1:10000 u PBS koji i sadrži 1%BSA (Pierce Chemical Co., catalog #31432) dfdato po ležištu.

Pločice su inkubirane na sobnoj temperaturi oko 1 sata, a potom pet puta isprane sa PBS koji sadrži oko 0.1 procenat Tween-20. Oko 100 mikrolitara TMB supstrata (SIGMA, katalog #T8665) je zatim dodato po ležištu što je;dovelo nastanka plave boje. Apsopcija je zatim čitana sa spektrofotometra na 370nm. Rezu<A>ali su prikazani ispod u Tabeli 9.

Primer 11

PK studija

Plan studije

Mužjaci CD-1 miševa, težine 20-3Og, su rupumično podeljeni u svaku od terapijskih grupa peptidno telo - (2xCon4-C,Ll-7-N, i L1-21-N). Životinje su dobijale pojedinačni IV bolus (n=38/ po grupi) ili pojedifačnu sujjkutanu dozu od 50ug peptibody(n=34 po grupi). Injekcije su davane preko repne venei i ispod kože na leđima za IV i SC administraciju.

L' zorkovanja krvi i Anal' tičke metode

Uzorci krvi su sakupljani, za svaku koncentraciju ang-Ang-2 peptidnog tela, merenjem prvobitne doze (predoze) i na 1,2,4,8,16,24,48,72,96,120,144,168,216,264,312 i 336 sati nakon primenjene doze (post-doza) za SC i IV grupe. Dodatni uzorci su sakupljani za sve IV grupe kao post-doza 5-og i 30-og minuta. Dve 2 životinje su iskrvarile u pokazanom vremenu, i one su eutanazirane nakon uzorkovanja. Krv (oko 0.50 mL) je sakupljana punkcijom srca u cevčice polipropilenskog microtain serumskog separatora. Uzorci su držani na ledu oko 20 minuta ili sve dok se nije pojavila grudvasta formacija. Serum je izdvojen iz krvnih uzoraka centrifugiranjem tpkom oko 10 min., na 2-8 C, i čuvan do testiranja na okoe -70 C. Uzorci su mereni pomoću vremenski potvrđene rezolutne fluorescencije (TRF) sa donjom granicomzakoličinu (LLOQ) od 100 ng/mL. NUNC fluoroMaxisorp mikrotitarske pločice su obložene rekombmantnim mišjim Ang-2 proteinom. Pločice su potom blokirane proteinskim rastvorom da bi se smanjilo nespecifično vezivanje. Standardi, kontrole kvaliteta i nepoznati uzorci su pripremljeni kao 10% puferovani uzorci mišjeg seruma i pipetirani su u odeljlje mikrotitarskih pločica, eptidna tela su bila posebno vezana za nepokretni Ang-2. Nakon ispiranja svih ne vezanih supstanci (Kirkegaard&Perrv Laboratories Inc.), biotinilovana monoklonalna kozja anti-Humana IgG(H+L) antitela (Jackson ImmuNOReaseafch Laboratories Inc.) su dodata u odeljke. Nakon ispiranja nevezanog evropijum steptavidina, vezani evropijum je oslobođen od streptavidina kiselim rastvorom koji je pipetiran u svako ležište. Fluorescentni signal je dobijen i očitan na VVallacovom fluoromedu. Uzorak za analiziranje anti-Ang-2 peptidnog tela iz mišjeg seruma je u opsegu pd 0.078-5ug/mL.

Farmakokinetske analize.

Glavne koncentracije jedinjenja, znači podaci odnosa kqsncentracij|i-vreme za svaku grupu podvrgnutu su analizama upotrebom VVinNOnlin Profesfional (Verzija 3.3, Pharsight Corp., Mountain View, CA). Navedena vremena uzorkofanja koja su korišćena za PK 5 analize, su kao uzorci prikupljana, unutar 10% navedenog vremena. Sve vrednosti koncentracija koje su manje od LLOQ su poništene pre BJC analiza. Sledeći PK parametri su procenjeni: Završno poluvreme (t) je računato kao t = ln(2)/kc|, gde je kcivrednost završne konstante prvog reda kojaje procenjena linearnom regresijom završne 10 linearno-logaritamske faze raspada.

Površina ispod serumske koncentracija-vreme lfrive (AUK 0-last)) je procenjena korišćenjem linearnologaritamskog trapezoidnog metoda od nultog; v remena do poslednjeg, vremene poslednje merljive koncentracije (Ciast).

Površina ispod krive od nultog vremena do beskonačnosti (AUC(o-co)) je procenjena kao zbir odgovarajućeg (AUC(oiast)) i predviđene vrednosti C]ast/kei:

AUC(oo-0c)=AUC(o-iast) + predpostavljeni Ciast/kel

Apsolutna bioraspoloživost (F) nakon SC primene je izračunata kao:

F=AUC(o.co)sc/AUC(o-oo)iv x 100

Rezultati su prikazani na Slici.2

Primer 12

Ženkama miša bez dlake je prema studiji, nultog dana, pobožno ubrizgano 1x10 A431 ćelija. Ang-2 antitela 2xCon4-C su u dozi od 200ul mišica/dan potkožno primenjena trećeg dana. Zapremine tumora i telesne težine su zapisifane u pravilnim intervalima, kao 5 što je prikazano na slici. Značajne razlike u tumorskom rastu su zapažene između grupe tretirane Ang-2 peptidnim telom i kontrolne grupe nosača i kontrolne grupe peptidnog tela (p<0.0001 u odnosu na svaku kontrolu korišćenjem ponovljenog ANOVA merenjaa Scheffeovim post hoc testom). Terapija ovim peptidnim tflom nije imala značajano dejstvo na telesne težine. Rezultati su prikazani na Slici 3.

Primer 13

Kriva porasta A431in vitro

2000 A431 ćelija je zasejano po ležištu na pločici za gajenje kulture sa 96 ležišta, u 200ul DMEM kome je dodat 10% fetalni goveđi serum (FE|S). Medijum je zatim

aspiriran 16 sati nakon zasejavanja. Potom su sledeći mfdijumi vrfćcni nazad u ležišta i organizovani su u triplikate: 100 (0,1 DMEM po ležištu 10% FBS. Negativne kontrole 1 mg/ml peptidnog tela 4883 ili peptidnog tela TN8-Con4. Iste postavke su ponovljene na 5 pločica. Medij um sa jedne pločice je aspiriran 24,48,72 Hi 120 sati nakon terapije. Sto ul 10% trihlorsirćetne kiseline (TCA) je dodato po ležištu , a pločice su čuvane na 4C. Sve pločice su sakupljene onda kada je poslednja pločica b|a najmaiše 4 sata u 10% TCA. 10% TCA je protrešena, a odeljci su 5 puta isprani vodom iz česme. Ćelije su potom bojene tokom 10 minuta sa lOOul 0.4% sulforodaminaM(Sigma $-9012) u 1% sirćetnoj kiselini (Sigma A-6283) na sobnoj temperaturi, a potonj 5 puta ishrane sa 1% sirćetnom kiselinom. Pločice su zatim sušene na vazduhu. Boja je rastvarana sa 300ul 20mM nepuferisanog Trisa (pH>10) tokom 2 sata u centrifugi. Optička gustina (OD) je očitana na 540nm na čitaču za mikrotitarske pločice. Rezultati su prikazani na Slici 4.

Primer 14

Ženkama miša bez dlake je prema studiji potkožno ubrizgano nultog dana 2xl06 30 Colo-205 ćelija plus Matrigel (2:1). Trećeg dana su Ang-2 peptidna tela L1-7-N, Ll-21-N, Con4-C, i 2xCon4-C u dozi od 14(o,g/mišica supkutano primeićena, dvaput nedeljno. 47ug/mišica Anti-Ang-2 antitela Ab536 je primenjeno kao pozitivna kontrola, tri puta nedeljno. Zapremine tumora i telesne težine su zapilivane u pravilnim intervalima.Značajne razlike u tumorskom rastu su zapažene između svake ocj grupa tretiranih Ang-2 peptidnim telom i kontrole nosača i kontrolnog peptidiiog tela to-0.0001 u odnosu na svaku kontrolu korišćenjem ponovljenog ANOVA merenja Scheff-ovim post hoc testom). Lečenje ovim peptidnim telima nema značajno dejstvoj na telesnu težinu (rezultati nisu 5 prikazani). Rezultati su prikazani na Slici 5.

Primer 15

Ženkama miša bez dlake je prema studiji nultog; dana potkožno ubrizgano 2xl06 Colo-205 ćelija plus Matrigel (2:1). Trećeg dana je Ang-2 pdblidno telo 2xCon4-C potkožno primenjeno u dozama od 14, 2.8 i 0.56ug/mi|ica, dvapgit nedeljno. Zapremine tumora i telesne težine su zapisivane u pravilnim i|itervalima| Značajne razlike u tumorskom rastu su zapažene između grupa sa srećkom i vjjsukom

dozom Ang-2 peptidnog tela i grupa nosača i kontrolnog peptidnog fela (p=0<A>)03 za srednju dozu i p<0.0001 za visoku dozu korišćenjem ponovljenog ANfJVA merMa sa Scheffeovim post hoc testom). Lečenje ovim peptidnim telima nema znčajno dejstvo na telesnu težinu. Isprekidana linija predstavlja smanjenje ukupnog n grupa sa 10 na 9 ženki miša, usled uginuća jedne od ženki zbog nepoznatog uzroka. Rezultati su dati na Slici 6.

Primer 16

Anti- Ang- 2 peptidno telo protiv Colo- 205 kseno<g>raft tumora

Ženkama miša bez dlake je prema studiji potkožno ubrizgano nultog dana 2xl0<6>Colo-205 ćelija plus Matrigel (2:1).Ang-2 peptidno telo 2xCon4 ili kontrolno peptidno telo u dozi od 350ug/đan trećeg dana. Tumori iz grijpa koje sli tretirane kontrolnim peptidnim telom (kao što je opisano na tabeli 5) su sakupljani 14-og dana (kontrola prema veličini) i 18-og dana (kontrola u skladu sa vremenom). Tumori iz grupe tretirane 2xCon4(C) su sakupljeni 18-og dana. Zaprremine tumora su zapisivane u pravilnim intervalima, kao što je prikazano. Značajno razlike u tumorskom rastu su zapažene između kontrolne grupe u skladu sa vremeniDm i grufe tretirane 2xCon4-C (p=0.0154 ponovljenim ANOVA merenjem Scheffeovim post hoc testom). Lečenje ovim peptidnim telima nema značajno dejstvo na telesnu težinu.

Tumori koji su pripremljeni za image analize sp sečeni u vidu krune i njihovi komadići su zamrznuti u OCT-u (Sakura Ffcetek USK Inc., Torrance,CA). Krio-sekcije su bojene imunohistohemijski korišćenjfm 2ug/ml anti-mišjeg CD31 (katalog#553370, BD PharMingen, San Diego, CA) sa EfcAB kao hromogenom. Tumorski isečci su digitalno fotografisani na objektivu uveličanju od 20x. Četiri

ciljana polja su zahvaćena po tumoru, sa 10 tumora po terapijskoj grupi. MetaMorph (Universal Imaging Corporation, Downington,PA) analizni sistem slika je korišćen od mesta ulaza krvnih sudova obojenih sa CD31. Područja koja su pozitivna za CD31 bojenje prikazana su kao odnos ukupnog tumorskog tkiva u svakom polju. Rezultati su dati na Slici 7.

Primer 17

Ženkama miša bez dlake je prema studiji nultog dana potkožno ubrizgano 2x10<6>Colo-205 ćelija plus Matrigel (2:1). Terapija u dozi od 350 ug/mišu , dvaput nedeljno, Ang-2 peptidnim telom 2xCon4-C ili ekvivalentnim kontfolnim pedtidnim telom u dozi od 350 |j.g/ženki miševa je započeta 3, 10 ili 15 dan a. Zapremine tumora i telesne težine su zapisivane u pravilnim intervalima. Značajne razlike u tumorskom rastu zapažene su između svih grupa tretiranih Ang-2 peptidnim telom i grupe nosačj (p=0.089 za grupu od 15-og dana i pO.OOOl za grupu od 3-eg i 10-og dana korišćenjem ponovljenog ANOVA merenje sa Scheffeovim post hoc testom). Lečenje ovim speptidninitelima nema značajno dejstvo na telesne težine. Rezultati su dati na Slici 8 .(telesne težine nisu prikazane).

Primer 18

Pregled vrednosti potpunog odgovora (CR) je poptignut korišćenjem 47p.g Ab536 antitela/ ženkama miša bez dlake, koje je primenjeno inteperitonealno tri puta nedeljno, ili 2xCon4(C), koji je primenjen supkutano kao raspored multiplih doza u različitim dugotrajnim studijama (>10 nedelja doziranja) kod oba mopdela i A4J31 i Colo-205. CR koji se ovde koristi se odnosi na posledicu gde nakon lečenja ostaje tumor koji se ne može izmeriti. Rezultati su dati na Slici 9.

Primer 19

a) Kombinaciia Pb i taksotera u Colo- 205 tumorskom tkivu

Ženkama miša bez dlake je prema studiji nultog; dana potkožno ubrizgano 2x10 Colo-205 ćelija plus Matrigel (2:1). Terapije su započete sa 350ug /mišu Ang-2 peptidnim

telom 2xCon4-C i to dvaput nedeljno, b) 20mg/kg qwx3 i.p taksoterom, ili c) njihovom kombinacijom 14-og dana ispitivanja. Zapremine tumora i telesne težine su zapisivane u pravilnim intervalima. Značajne razlike rastu tumora zapažene su između svih tretiranih grupa i grupe nosača (pO.OOOl korišćenjemi ponovljenog ANOVA merenja sa Scheffeovim post hoc testom). Osim toga, grupa kombinovane terapije je bila značajno različita od obe grupe monoterapeutskih agenafa (pO.OOOl u odnosu na 2xCon- 4-C i p=0.0122 u odnosu na taksoter). Isprekidana linija predstavila smanjenje ukupnog na 5 grupa, sa 10 na 9, usled uginuća jedne od ženki iz nepoznator razloga. Lečenje ovim peptidnim telima nema značajno dejstvo na telesne težile. Rezultati su prikazani na Slici 10a.

bi Kombinacija Pb sa 5- FU na Colo- 205 tumorskom modelu.

Ženkama miša bez dlake je prema studiji nultog dana potkožno je ubrizgano 2xl0<6>Colo-205 ćelija plus Matrigel (2:1). Terapije su započete sa a) 350ug/mišu Ang-2 peptidnim telom 2xCon4-C i to dvaput nedeljno, b) 50mgfkg qdx5 i.p. 5-FU ili c) njihovom kombinacijom 14-og dana studije. Tumorske zapremine i telesne jtežine su zapisivane u pravilnim intervalima, kako je prikazano.

Značajne razlike u tumorskom rastu su zapaženi između fivih tretiranih grupa i grupe nosača (pO.OOOl korišćenjem ponovljenog ANOVA merenjem, sa Scheffeovim post hoc testom). Osim toga, grupa kombinovane terapije je bip značajnoj različita od obe grupe monoterapeutskih agenasa (p=0.0375 u odnosu na 2xCon-4-C i p=0.0453 u odnosu na 5-FU). Prolazno smanjenje telesne težine koje je zapaženo u grupi treniranoj 5-FU (18% 20-og studijskog dana), kao i u grupi sa kombinovanom tfrapijom (16% 20-og studijskog dana), bilo je praćeno potpunim ponovnim dobijanjem u telesnoj težini. Rezultati su prikazani na Slici 10b.

Primer 20

Model adjunvasnog artritisa

Po dva mužjaka Levvisovih pacova (120-130g, Charles River Wilmington MA) su smešteni u kaveze pokrivene filterom u sobu sa kontrolisanom sredinom (temperatura 23±2C, relativna vlažnost 50±20%) sa dvanaestočasovnim cikluisom svetla i tame. Životinje su hranjene komercijalnom hranom za glodare (Formulacija 8640; Tek Lab, 30 Madison, WI) i dobijale su filtriranu vodu iz česmead libitum.Sadržaji dijetnog kalcijuma i fosfora su bili svaki pojedinačno 1.2% odnosno 1.0%.

Adjuvansni artritis je izazvan pojedinačnom intradarmalnom injekcijom u začetak repa

0.5mg Mycobacterium tuberculosisH37Ra (Difco Laboratories, Detroit, MI) suspendovano je u 0.05mL parafmskog ujlja (Crescent Chemical Co., Hauppauge, NY). Klinički početak artritisa je zapažem 9-og dana otokom zadnje šape i teškoćama pri kretanju. Izuzevši grupu tretiranu sp 2xCon4 (c) (kojaje tretirana od prvog dana nakon imunizacije), terapije su primenjene kao dnevne supkutane injekcije počevši od 9 dana nakon imunizacije (pre početka artritis), a nastavljajući dol8 dana.

Klinički monitoring pridodatog artritisa.

Širenje inflamacije je bilo klinički proccnjivano neprekidniii merenjem zapremine zadnje šape primenom vodene pletizmografije prema metodama koje je opisao Feige et al, Cellular Molec. Life Sci., 57:1457-1470 (2000). Inhibicija zapaljlenja šape, bazirana na površini ispod krive (AUC), i računata je primenom trapezoidnog pravila prema formuli:

[1-{(tretirani AdA)- normalan)/(netretirani Ada-normalan)}]xlOO

Osim toga, telesna težina je određivana dnevno tokom devetodnevnog terapijskog režima, kao dopunska krajnja tačka jer je gubitak telefne težinej prikazan paralelno sa širenjem zapaljenja zgloba kod ovog modela artritisa. 18og dana životinje su žrtvovane pomoću CO2.

Gubitak mineralne gustine kostiju (BMD) je ispitivan na obdukciji (18-ti dan nakon imunizacije). Zadnje šape su uklonjene do granice krzna (nešto bliže skočnom zglobu) i potopljene u 70% etanol, a potom snimane u horizontalnom položaju korišćenjem denzitometra sa X-zracima sa lepezastim snopomj (Model QDR-4500A; Hologic, Waltham, MA). Pogledati Feigeet al, supra,.Nakon snimanja, pravougaona kutija (29x25mm) kojaje centrirana na petnu kost je postavljena tako da predstavi mesto koje treba analizirati, a vlastitim algoritmima (Hologic softvvare) izračunata je površina kosti, mineralni sadržaj kosti i mineralna gustina kosti.

Svi rezultati su predstavljeni kao srednja vrednost standardna greška.A pvrednost od 0.05 je korišćena da ocrta značajna razlika među grupama. Kruskal-Wallis ANOVA i Mann-Whitney U. test, koji koriste komercijalni statističfti softver (Statsoft v3.0; Statsoft, Tulsa, OK), su sprovedeni u kliničkim podacima (neprekidne varijable). Rezultati su prikazani pojedinačno na Slikama 11 a, 1 lb i 11c.

Primer 21 Model koinealne angiogeneze

Dejstvo CON4( Q na an<g>iogenezu u pacova izazvanu VEGF- om

Ang-2 peptidno telo CON4(C) je procenjivano u kornealnom modelu angiogeneze u pacova. Angiogeneza je indukovana implantacijom najlonske pločice natopljene VEGF-om (ili BSA-kontrolom) u stromu rožnjače (n=8/grupa). Peptidno lelo TN8CON4-C je primenjivano supkutanom injekcijom 1.0 ili O.lmg/pacovu/dan tokom sedam dana. Druge dve grupe životinja su tretirane istom dozom peptidtiog tela 4883 kao negativnom kontrolom. Sve grupe su prethodno tretirane pojedinačnofi početnoin dozom bilo od 3.0 ili 0.3mg što je tri puta više od uobičajene doze od 1.0 ili O.lmg (pogledati sliku). Nakon sedam dana lečenja, dve vaskularne krajnje tačke su utvrđene iz svake od digitalnih slika rožnjače pacova: broj krvnih sudova koji presecaju srednji tačku između diska i limbusa, i površina krvnog suda. Lečenje TN8CON4-C značajno inhiibira angiogenezu indukovanu VEGF-om na način zavisan od doze (p<0.04), budući da lečenje kontrolnim peptidnim telom nema značajno dejstvo na obe krajnje tačke. Nep<ptoji dokafe očigledne toksičnosti koji je zasnovan na telesnim težinama tretiranih životinji. Rezultafi su prikazani na Slici 12.

Primer 22

Mapiranje epitopa

Puna dužina (aminokiseline 1-495), N-terminalni deo (amitokiseline 1-254) i C-terminalni deo (aminokiseline 255-495) humanih Ang-2 :(hAng-2) proteina su klonirani u vektor ekspresije sisara koji je vođen CMV sa C-terminalim delom od 6xHis ostataka. Tri dobijena konstrukta plus vektorska kontrola su kratkotrajno eksprimirane u 293T

ćelijama. Navedeni medijumi su onda sakupljani iz transfektiranih ćelija, a nivo ekspresije Ang-2 u medijumima je procenjivano anti-6xhis EMSA i Western blotom.

Vezujući epitop anti-Ang-2 antitela i peptidnih tela je određen prema njegovoj sposobnosti da veže tri oblika humanog hAng-2, ELISA metodom prema sledećem protokolu: visoko vezujuća pločica sa 96 ležišta je obložena sa lOOul medijuma po ležištu i inkubirana na 37 C tokom 1 sata.Medijum je aspiriran, a pločica je blokirana sa 200ul 5%BSA u PBS po ležištu na sobnij temperaturi tokom 1 sata. Potom je aspiriran rastvor za blokiranje. 100(4.1 antitela, peptidiog tela ili Tie2-Fc je dodato u lug/ml u 1%BSA u PBS i inkubirano na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Ležištai su isprana četiri puta sa 200ul 0.1 % Tween-a u PBS. 100 jil HRP-konjugovanog kozjeg antihumanog IgG ili kozjeg antimišjeg IgG je dodato po ležištu i inkubirano na sobnoj temperaturi 45 minuta. Ležišta su potom isprana 4 puta sa 200 ul 0 1 % Tween-a u PBS. Potom je dodatolOOul TMB supstrata po ležištu . Optička gustina je čitana na 370nm. Rezultati su prikazani na Slici 13a, Slici 13b i Slici 13c.

Primer 23

Usled izvesnih ograničenja u osetljivosti koja su sastavni deo BiaCore eseja, vezujući afinitet je takođe procenjen korišćenjem Sepvdine KinRxA eseja.

Vezivanje 2xCON4-C (Pb5714) za huAng-2 je testirano na KinExA i(Sapyđine, Boise, DD). Zrnca Reacti-Gela 6x (Pierce, Rockford,IL) su prethodno obložena sa hu-Ang-2 i blokirana sa BSA. Uzorci od lOpM i 30 pM 2xCON4-C su inkubirdhi u različitim koncentracijama hu-Ang-2 (0.3 pM-3nM) na sobnoj temperaturi 8 sati pre prolaska kroz hu-Ang-2-obložena zrnca. Količina zrno-vezujućeg peptidnog tela je merena fluorescentno obeleženim kozjim antihumanim Fc-antitelom (Jackson Immuno Research, West Grove, PA). Vezujući signal je proporcionalan koncentraciji slobodnog peptidnog tela u ravnoteži.

Ravnotežna konstata disocijacije (Kd) je dobijena nelinearnom regresijom konkurentnih krivi korišćenjem jednostranog homogenog vezujućeg modela dvostruka-kriva (KinExTM softver). KD je potom određena tako da bude približno 2pM za vezivanje 2xCON4-C sa hu-Ang-2.

Kako je prikazano na Slici 14, korišćenjem KinExA eseja, za peptidno telo 2xCon4 je pokazano da ima~2pM afinitet za hAng-2.

Primer 24

PlatedPeptidi

LI-7 peptid je sintetisan pomoću sintetizatora 431 ABI korišćenjem standardnog protokola kuplovanja i dvostrukog kuplovanja od ostatka 14 (met) do N-terminalnog dela 1 (Cys), brojeći od N-terminalnog dela do C-terminalnog dela.

Konju<g>acija eptida Ll- 7 sa MetoksipolifetilenglikoD- maleirtndom; MW:5Kda; koji je

označen kao " mPEG5K-( Li- 7 peptidi"

Rastvor 0.8mg peptida LI-7 u 400ul pufera 1 (20mM fosfat, 5mM EDTA, pH 6.5) je tretiran sa 13.5mg metoksipoli (etilenglikol)-maleimida (MW=5KDa; Sheanvater Corp.); 0.27 ml 50.0mg/ml rastvora u puferu 1. Reakciona smeša je inkubirana na 4°C preko noći, potom razblažena sa 1.6mL pufera A (20mM tris hidrohlorida i 7.2) i dijalizirana u Slide-A-Lyzer kaseti (3500 MWCO,Pierce) nasuprot istom puferu. Dijalizirana reakciona smeša je pročišćena jonoizmenjivačkom hromatografijom na 1.0 mL HiTrap Q Sepharoza HP koloni (Amersham Biosciences Corp.). Pik proizvoda je podeljeu u dve frakcije od 1.0 mL pomoću gradijenta od 100% pufera A do 100% pufera B (pufer 1+0.5M NaCl) iz 40 zapreminekolona. Kombinovane frakcije proizvoda su koncentrovane na 250j.il koje sadrže 0.23 mg proteina/mL pomoću Microsep 1K centrifugalnog uređaja (Pali Life Sciences).

Konjugacija peptida LI - 7 sa 1. 11- bis- maleimidotetraetilenglikolom; koji je

označen kao " PEQ4( Ll- 7peptid) 7".

Rastvor 1.0 mg peptida Ll-7 u 500ul pufera 1 (20mM fosfat, 5mM EDTA,pH 6.5) je tretiran sa 0.0375 mg 1,11-bis-maleimidotetraetilenglikola (Pierce) (0.375mL u 0.1 mg/mL rastvora u puferu 1). Reakciona smeša je inkubirana na 4°C tokom 3.33 sata, potom je dijalizirana u Slide-A-Lyzer kaseti (3500MVVCO, Pierce) nasuprot puferu A (20mM Tris hidrohlorid, pH 7.2). Dijalizirana reakciona smeša je pročišćena jonoizmenjivačkom hromatografijom na 1.0 mL HiTrap Q Seraphose HP koloni (Amersham Biosciences Corp.). Pik proizvoda je podeljen i tri frakcije od l.Oml pomoću gradijenta od 100% pufera A do 100% pufera B (pufer A plus NAC1) preko 40 zapremina kolona. Kombinovane frakcije proizvoda su koncentrovane do 550ul koji sadrži 0.12 mg proteina /ml pomoću Micropep 1K centrifugalnog uređaja (Pali Life Sciences).

Konju<g>acija peptida Ll- 7 sa poli( etilenglikoD- bis- maleimidom; MW 3. 4, KDa; koji je

označen kao " PEG3. 4K( Ll- 7peptid) ? "

Rastvor 3.0 mg Ll-7 peptida u 1.5 mL pufera 1 (20mM fosfata, 5 mM EDTA, pH 6.5) je tretiran sa 1.125 mg poli(etilenglikol)-bis-maleimida (MW- .4 Kda, Sheanvater Corp.); 0.563 ml 2.0 mg/ml rastvora pufera 1. Reakciona smeša je inkubirana na 4 °C tokom noći, a potom dijalizirana u Slide-Lyzer kaseti (3500 MWC0, PieJbe) nasuprot puferu A (20 mM Tris hidrohlorida,pH 7.2). Dijalizirana reakciona smešći je pročišćena jon izmenjivom hromatografijom na 5.0 ml HiTrap Q .sepharose kolona (Amersham Biosciences Corp.). Pik proizvoda je podeljen u tri frakcije od 3.0 ml pomoću gradijenta od 100% pufera A do 100% pufera B (pufer A plus NaCl) preko 40zapremina kolona. Kombinovane frakcije proizvoda su koncentrovane u Micron p 1K centrifugalnom uređaju(Pall Life Sciences) do 850ul koji sadrži 0.24 mg proteina/ml.

Rezultati MALDITOF mass spektoskopije su sledeći:

Vrednovaće se to što indeks "2" za PEG3.4K (LI -7 peptid) i PI04(Ll-7peptid) označava da postoje dva peptida po polimernom lancu, pojedinačno smeštena na svakom od krajeva polimera.

Određivanje ICso

IC50za inhibiciju hAng-2 :hTie2-Fc interakcije ; za peptide bez Ll-7 i peptide sa PEG, IC50su određene ELISA neutralizacijom kako je opisano u himeru 2. Za ELISA neutralizaciju, mikrotitarske pločice na koje je vezan humani Ang 2 su pripremljene za ELISA neutralizaciju kao što je opisano u Primeru 2. Izabrani anti-Ang-2 Ll-7 PEG ilovani peptidi i peptidi bez Ll-7 su titrirani od lOOOnM do 0.2 pM u 4-stepenska razblaženja u rastvoru PBS koji sadrži oko 1% BSA i oko lnM Tie-2 (koji je obezbeđen kao Tie-2-Fc molekul gde Tie-2 deo sadrži samo solubilni ekstraćelijski deo molekula; R&D Svstems, kataloški broj 313-TI). Posle dodavanja oko 100 mikrolitara rastvora antitel/Tie-2 u svako ležište, pločice su inkubirane preko noći na sobnoj temperaturi, i potom pet puta isprane u PBS koji sadrži oko 0.1 % Tween-20. Nakon ispiranja, dodato je oko 100 mikrolitara anti-Tie-2 antitela (Pharmingen., catalog#557039) u svako ležište do konačne koncentracije od oko 1 mikrograma na ml, a pločice su inkubirane oko 1 sat na sobnoj temperaturi. Zatim je oko 100 mikrolitara kozjih anti-mišjih-IgG-HRP (Pierce Chemical CO., catalog #31432) dodato u rastvor 1:10,000 PBS koji sadrži oko 1% BSA. Pločice su inkubirane na sobnoj temperaturi oko 1 sat, nakon čegi su isprane pet puta sa PBS koji sadrži oko 0.1 % Tween-20. Zatim je oko i 100 mikrolitara TMB supstrata (opisanog gore) dodato po ležištu i došlo je do razvoja boje. Apsorpcija je potom čitana na spektrofotometru na 370nm.

LI-7 peptidi (C-GGGGG-AQ-TNFMPMDDLEQRLYEQFILQQG-LE) (SEQ ID NO: 359) sadrže: N-terminalni cistein za sparivanje sa PEGlom i 5Gly linker. AQ i LE bočne sekvence su obe predstavljene u originalnom klonu fage i peptidnom telu. Rezultati IC50inhibicije sa hAng-2:Tie2 su sledeći:

Claims (44)

1 Polipeptid koji sadrži najmanje jednu aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID. NO 2, SEQ ID. NO.: 4 i SEQ ID. NO: 76 do SEQ ID. NO.: 118 zaključno, pri čemu je dati polipeptid sposoban da se veže za Ang-2, i njegove fiziološki prihvatljive soli.

2. Fuzioni polipeptid koji se sastoji od najmanje jednog polipeptida prema zahtevu 1 i nosača, naznačen time, što je dati fuzioni polipeptid sposoban da se vezuje za Ang-2, i njegove fiziološki prihvatljive soli.

3. Fuzioni polipeptid prema zahtevu 2 naznačen time, što je dati nosač bar jedan od Fc domena, polietilen glikol, lipid, holcstcrol grupa, ugljeni hidrat i oligosaharid.

4. Polipeptid prema zahtevu 1, naznačen time, što je cikličan.

5. Dimer ili multimer polipeptida prema zahtevu 1.

6. Sastav supstance formule : i njeni multimeri, gde : F<1>je nosač; pri čemu je nosač, Fc domen, polietilen glikol, lipid, holesterol grupa, ugljeni hidrat ili oligosaharid; X<1>i X' su svaki nezavisno odabrani od -(L')c-P<1>;-(L'je-P<1>-(L2)d-P2 ; -(L')o-P<1>-(L<V>P2-(L3)<e>-P3<;>i -(lVp1 -(L<2>)d-P<2->(L<3>)e-P<3>-(lVp4; gde jedan ili više od P<1>, P<2>, P<3>i P<4>svaki nezavisno sadrži polipeptid odabran iz grupe koja se sastoji od: SEQ ID. NO 2,, SEQ ID. NO 4 i SEQ ID. NO: 76 do SEQ ID. NO.

118 zaključno L<1>,L<2>, L<3>i L4 je svaki nezavisno linkeri; i a, b, c, d, e, i f su svaki nezavisno 0 ili 1, pod uslovom da bar jedan od a ili b je 1; i njene fiziološki prihvatljive soli.

7. Sastav supstance prema zahtevu 6 formule: ili i njene fiziološki prihvatljive soli.

8. Sastav supstance prema zahtevu 6 formule: i njene fiziološki prihvatljive soli.

9. Sastav supstance prema zahtevu 6 formule: i njene fiziološki prihvatljive soli.

10. Sastav supstance prema zahtevu 6 formule: i njene fiziološki prihvatljive soli.

11. Sastav supstance prema zahtevu 6, naznačena time, što F<1>je Fc domen ili njegov fragment.

12. Sastav supstance prema zahtevu 6, naznačena time, što F<1>sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID. NO: 60.

13. Polinukleotid koji kodira polipeptid prema zahtevu 1.

14. Ekspresioni vektor koji sadrži polinukleotid iz zahteva 13.

15. Ćelija domaćin koja sadrži ekspresioni vektor iz zahteva 14.

16. Ćelija domaćin prema zahtevu 15, naznačena time, što je to prokariotska ćelija.

17. Ćelija domaćin prema zahtevu 16, naznačena time, što je toE. colićelija.

18. Ćelija domaćin prema zahtevu 15, naznačena time, što je to eukariotska ćelija.

19. Polipeptid prema jednoj od SEQ ID. NO: 2 ili SEQ ID. NO: 4.

20. Farmaceutska kompozicija koja sadrži efikasnu količinu jednjenja prema zahtevu 1 u smeši sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.

21. Polipeptid prema zahtevu 2 ili 6 za upotrebu u postupku lečenja angiogeneze kod subjekta, gde postupak obuhvata administriranje terapeutski efektivne količine polipeptida.

22. Polipeptid prema zahtevu 21 za upotrebu u postupku lečenja aniogeneze, koji obuhvata inhibiciju neželjene angiogeneze kod sisara, a obuhvata administriranje terapeutski efektivne količine polipeptida.

23. Polipeptid prema zahtevu 21 za upotrebu u postupku lečenja angiogeneze, gde dati postupak obuhvata modulaciju angiogeneze kod sisara koja obuhvata administriranje terapeutski efektivne količine polipeptida.

24. Polipeptid prema zahtevu 21 za upotrebu u postupku lečenja angiogeneze, gde dati postupak obuhvata inhibiciju rasta tumora karakterističan po neželjenoj angiogenezi kod sisara, koja obuhvata administriranje terapeutski efektivne količine polipeptida.

25. Kompozicija koja sadrži polipeptid prema zahtevu 2 ili 6 i hemoterapeutski agens za upotrebu u postupku lečenja raka kod sisara, koji obuhvata administriranje terapeutski efektivne količine polipeptida i hemoterapeutskog agensa.

26. Polipeptid i hemoterapeutski agens prema zahtevu 25, naznačeni time, što je hemoterapeutski agens je bar jedan od: 5-FU, CPT- 11 i Taxoterc.

27. Polipeptid prema zahtevu 2 ili 6 za upotrebu u postupku modulacije bar jedne od vaskulame permeabilnosti ili isticanja plazme kod sisara koji obuhvata administriranje terapeutski efektivne količine polipeptida.

28. Polipeptid prema zahtevu 2 ili 6 za upotrebu u postupku lečenja bar jedne od okularnih neovaskularnih bolesti, kliničke gojaznosti, inflamatornih bolesti, inflamatornih poremećaja, ateroskleroze, endometrioze, neoplastične bolesti, bolesti povezane s kostima, ili psorijaze kod sisara koji obuhvata administriranje efektivne količine polipeptida.

29. Polipeptid koji može da veže Ang-2 , naznačen time, što dati polipeptid obuhvata aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID. NO. 25) i njegove fiziološki prihvatljive soli.

30. Polipeptid prema zahtevu 29, naznačen time, što je aminokiselinska sekvenca Fc u SEQ ID. NO. 25 kao što je dato u SEQ ID. NO. 60.

31. Polinukleotid koji kodira polipeptid prema jednom od zahteva 29-30.

32. Polinukleotid prema zahtevu 31 kao što je dato u SEQ ID. NO. 46.

33. Ekspresioni vektor koji sadrži polinukleotid iz zahteva 31 ili 32.

34. Ćelija domaćin koja sadrži ekspresioni vektor iz zahteva 33.

35. Ćelija domaćin prema zahtevu 34, naznačena time, što je ćelija,E. coli.

36. Farmaceutska kompozicija koja sadrži efikasnu količinu polipeptida prema jednom od zahteva 29-30 u smeši sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.

37. Polipeptid prema zahtevima 29-30 za upotrebu u postupku inhibicije angiogeneze kod sissara, koji obuhvata administriranje terapeutski efikasne količine polipeptida.

38. Polipeptid prema zahtevima 29-30 za upotrebu u postupku lečenja angiogeneze kod subjekta, koji obuhvata administriranje terapeutski efikasne količine polipeptida.

39. Polipeptid prema zahtevima 29-30 za upotrebu u postupku modulacije angiogeneze kod sisara, koji obuhvata administriranje terapeutski efikasne količine polipeptida.

40. Polipeptid prema zahtevima 29-30 za upotrebu u postupku inhibicije rasta tumora okarkaterisan neželjenom angiogenezom kod sisara, koji obuhvata administriranje terapeutski efikasne količine polipeptida.

41. Kompozicija koja sadrži polipeptid prema zahtevima 29-30 i hemoterapeutski agens za upotrebu u postupku lečenja raka kod sisara koji obuhvata administriranje terapeutski efikasne količine polipeptida i hemoterapeutskog agensa.

42. Kompozicija prema zahtevu 41, gde je hemoterapeutski agens najmanje jedan od5- FU i Taxotere.

43. Polipeptid prema zahtevima 29-30 za upotrebu u postupku za modulaciju bar jedne od vaskularne permabilnosti ili isticanja plazme kod sisara koji obuhvata administriranje terapeutski efikasne količine polipeptida.

44. Polipeptid prema zahtevima 29-30 za upotrebu u postupku lečenja bar jedne od: neovaskulame bolesti, hemangioblastoma, hemangioma, arterioskleroze, inflamatorne bolesti, inflmatornih poremećaja, ateroskleroze, endometrioze, neoplastične bolesti, bolesti povezane sa kostima ili psorijaze kod sisara koji obuhvata administriranje terapeutski efikasne količine polipeptida.