NO328826B1

NO328826B1 - Bicykliske heteroaromatiske forbindelser anvendelige som LH-agonister samt farmasoytiske preparater inneholdende slike

Info

Publication number: NO328826B1
Application number: NO20014824A
Authority: NO
Inventors: Gerrildina Geziena Gerritsma; Nicole Corine Renee Van Straten; Anton Egbert Peter Adang
Original assignee: Organon Nv
Priority date: 1999-04-08
Filing date: 2001-10-04
Publication date: 2010-05-25
Also published as: CA2368834C; US6569863B1; JP4854856B2; BRPI0009558B1; RU2248979C2; NZ514445A; KR100691546B1; PL350964A1; HK1041266A1; KR20010103801A; ID30502A; WO2000061586A1; DE60021262T2; DK1171443T3; US20030212081A1; MXPA01010144A; CZ300832B6; ZA200107917B; ES2245304T3; EP1171443A1

Description

Oppfinnelsen angår forbindelser som har glykoprotein-hormon-agonist- eller antagonistisk aktivitet, spesielt forbindelser som har Luteiniserende Hormon (LH) agonist-aktivitet. Oppfinnelsen angår videre bicykliske heteroaromatiske forbindelser, farmasøytiske preparater inneholdende disse så vel som anvendelse av disse forbindelser i medisinsk terapi, spesielt for anvendelse til kontroll av fertilitet.

Gonadotropiner har viktige funksjoner i en rekke legemsfunksjoner omfattende metabolisme, temperatur-regulering og den reproduktive prosess. Hypofyse-gonadotropin-FSH spiller for eksempel en nøkkelrolle ved stimulering av follikkel-utvikling og modning, mens LH fremkaller eggløsning (Sharp, R.M. Clin Endocrinol. 33:787-807, 1990; Dorrington and Armstrong, Recent Prog. Horm. Res. 35:301-342,1979). For tiden blir LH anvendt klinisk i kombinasjon med FSH for eggstokk-stimulering, dvs. eggstokk-hyperstimulering for in vitro fertilisering (IVF) og induksjon av eggløsning hos ufruktbare anovulatoriske kvinner (Insler, V., Int. J. Fertility 33:85-97, 1988, Navot and Rosenwaks, J. Vitro Fert. Embryo Transfer 5:3-13, 1988), så vel som for hypogonadisme og sterilitet hos menn.

Gonadotropiner virker på spesifikke gonadal-celletyper ved å initiere eggstokk- og testikkel-differensiering og steroid-genese. Virkningene av disse binyrebark- og placenta-hormoner blir mediert av spesifikke plasma-membran-reseptorer som er medlemmer av den store familie av G-protein-koblete reseptorer. De består av et enkelt polypeptid med syv transmembran-domener og er i stand til å reagere med Gs-protein, hvilket fører til aktivering av adenyl-cyklase.

Gonadotropiner bestemt for terapeutiske formål kan isoleres fra menneskeurin-kilder og har lav renhet (Morse et al, Amer. J. Reproduct. Immunol. and Microbiology 17:143,1988). Alternativt kan de fremstilles som rekombinante gonadotropiner.

Som ved andre terapeutiske proteiner er det nødvendig å administrere gonadotropiner enten subkutant eller intra-muskulært. Det ville imidlertid være fordelaktig å aktivere reseptoren med et lite molekyl som kunne administreres ad f.eks. oral eller transdermal vei.

Foreliggende oppfinnelse beskriver fremstilling av slike hormonanaloger med lav molekylvekt som selektivt aktiverer én av gonadotropin-reseptorene. Dette bør betraktes som én av hovedfordelene ved foreliggende oppfinnelse.

Således ligger oppfinnelsen i bicykliske heteroaromatiske derivater i henhold til den generelle formel II eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav,

hvori

R<1> er (6-14C)aryl eventuelt substituert i orto og/eller meta stilling med én eller flere substituenter valgt fra NHR<8>, OR8 hvor R<8> er (6-14C)arylkarbonyl eller (l-8C)alkyl, hvor alkylgruppen eventuelt kan være substituert med én eller flere substituenter valgt fra (6-14C)aryl, (l-8C)alkylkarbonyloksy, (6-14C)arylkarbonylamino, morfolinyl eller pyridyl eller

R<1> er tienyl, furyl eller pyridyl;

R2 er (l-8C)alkyl, eventuelt substituert med én eller flere substituenter valgt fra (6-14C)aryl eller (l-8C)alkoksykarbonyl;

R3 er (l-8C)alkyl, eventuelt substituert med én eller flere substituenter valgt fira (1-8C)alkoksy, (6-14C)aryl(l-8C)alkoksy, tienyl, pyrolidino, (6-14C)aryl, (1-8C)alkoksykarbonyl eller

R3 er (3-8C)cykloalkyl eller (6-14C)aryl begge eventuelt substituert med én eller flere substituenter valgt fra (l-8C)alkoksy;

BerN(H),Oog

Y = CH eller N,

De mest foretrukne forbindelser er forbindelser med generell formel II, hvori B er N(H). R<2> og/eller R<3> er foretrukket (l-4C)alkyl og Y er foretrukket N.

Utelukket fra oppfinnelsen er forbindelsene metyl-5-amino-4-fenyl-2-metyltio-tieno[2,3-d]pyrimidin-6-karboksylat, etyl-5 -amino-4-fenyl-2-metyltio-tieno[2,3-^pyrimidin-6-karboksylat.

Forbeholdet er knyttet til beskrivelsen i Sulfur Lett. 9: 101-108,1989.

Spesielt foretrukne forbindelser ifølge oppfinnelsen er de hvor R er isopropyl eller tert-butyl, idet tert-butyl er mest foretrukket.

Betegnelsen (l-8C)alkyl som blir anvendt i definisjonen med forml II betyr en forgrenet eller uforgrenet alkylgruppe som har 1-8 karbonatomer, for eksempel metyl, etyl, propyl, isopropyl, butyl, sek-butyl, tert-butyl, heksyl og oktyl. (l-6C)alkylgrupper er foretrukket, idet (l-3C)alkyl er mest foretrukket.

Betegnelsen (3-8C)cykloalkyl betyr en cykloalkylgruppe som har 3-8 karbonatomer, som cyklopropyl, cyklobutyl, cyklopentyl, cykloheksyl, cykloheptyl eller cyklo-oktyl.

Betegnelsen (l-8C)alkoksy betyr en alkoksygruppe som har 1-8 karbonatomer, idet alkylgruppen har samme betydning som tidligere definert. (l-6C)alkoksygrupper er foretrukket, idet (l-3C)alkoksy er mest foretrukket.

Betegnelsen (l-8C)alkoksykarbonyl betyr en alkoksykarbonylgruppe, hvis alkylgruppe inneholder 1-8 karbonatomer og har samme betydning som tidligere definert.

Betegnelsen (l-8C)(di)alkylamino betyr en (di)alkylaminogruppe som har 1-8 karbonatomer, hvis alkylgruppe har samme betydning som tidligere definert.

Betegnelsen (6-14C)aryl betyr en aromatisk hydrokarbongruppe som har 6-14 karbonatomer, så som fenyl, naftyl, tetrahydronaftyl, indenyl, antracyl, som eventuelt kan være substituert med én eller flere substituenter så som hydroksy, halogen, nitro, trifluormetyl, cyano, (l-8C)alkylkarbonylamino, (l-8C)alkylaminokarbonyl eller (1-8C)(di)alkylamino, hvilke alkylgrupper har samme betydning som tidligere definert. Den foretrukne aromatisk hydrokarbongruppe er fenyl.

Betegnelsen halogen betyr fluor, klor, brom eller jod.

Betegnelsen (6-14C)aryl(l-8C)alkoksy betyr en arylgruppe inneholdende 6-14 karbonatomer som definert tidligere, bundet til en (l-8C)alkoksygruppe, hvori alkoksy-gruppen har betydningen som er tidligere definert. (4-13C)heteroarylalkoksygrupper er analoger av (6-14C)arylalkoksygruppene, minst omfattende ett heteroatom valgt fra N, Oog S.

Betegnelsen (6-14C)arylkarbonyl betyr en arylkarbonylgruppe, arylgruppen inneholder 6-14 karbonatomer og har samme betydning som tidligere definert.

Betegnelsen (l-8C)alkylkarbonyloksy betyr en alkylkarbonyloksygruppe, hori alkylgruppen som inneholder 1-8 karbonatomer og har samme betydning som tidligere definert.

Betegnelsen (6-14C)arylkarbonylamino betyr en arylkarbonylaminogruppe, hvori arylgruppen inneholder 6-14 karbonatomer og har samme betydning som tidligere definert.

Det har blitt vist at forbindelser med ovennevnte formel II er i stand til å binde til LH-reseptoren og vise agonistisk LH-aktivitet.

Oppfinnelsen ligger videre i et farmasøytisk preparat omfattende en bicyklisk heteroaromatisk forbindelse eller salter derav som har den generelle formel II.

Farmasøytiske preparater som omfatter etyl-5-amino-4-fenyl-2-etoksykarbonylmetyltio-tieno[2,3-(/]pyrimidin-6-karboksylat, metyl-5-amino-4-fenyl-2-metyltio-tieno[2,3-c^pyrimidin-6-karboksylat eller etyl-5-amino-4-fenyl-2-metyltio-tieno[2,3-d]pyrimidin-6-karboksylat er innen omfanget av foreliggende oppfinnelse. Således kan forbindelsene ifølge oppfinnelsen anvendes i terapi. Et ytterligere aspekt ved foreliggende oppfinnelse ligger i anvendelse av en bicyklisk heteroaromatisk forbindelse med den generelle formel I for fremstilling av et medikament for kontroll av fertilitet. Fortrinnsvis blir foreliggende forbindelser anvendt til å aktivere LH-reseptoren.

De bicykliske heteroaromatiske forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse kan ha ett eller flere chirale karbonatomer. Forbindelsene kan derfor oppnås som chiralt rene forbindelser eller som en blanding av diastereomerene og/eller enantiomerene. Metoder for å oppnå de chiralt rene forbindelser er velkjente på området, f.eks. krystallisering eller kromatografi.

For terapeutisk anvendelse er salter av forbindelsene med formel II de hvori motionet er farmasøytisk akseptabelt. Imidlertid kan syreaddisjonssalter av baser i henhold til formel II også anvendes, for eksempel ved fremstillingen eller rensning av en farmasøytisk akseptabel forbindelse. Alle salter, enten de er farmasøytisk akseptable eller ikke, er omfattet innenfor den foreliggende oppfinnelse.

Eksempler på syreaddisjonssalter omfatter de som er avledet fira mineralsyrer så som saltsyre, fosforsyre, svovelsyre, fortrinnsvis saltsyre, og organiske syrer som sitronsyre, vinsyre, eddiksyre, melkesyre, maleinsyre, malonsyre, fumarsyre, glykolsyre, ravsyre og lignende.

Egnete administreringsveier for forbindelsene med formel II eller de farmasøytisk akseptable salter derav, også referert til her som den aktive bestanddel, er intramuskulære injeksjoner, subkutane injeksjoner, intravenøse injeksjoner eller intraperitoneale injeksjoner, oral og intranasal administrering. Fortrinnsvis kan forbindelsene administreres oralt. Den nøyaktige dosen og skjemaet for administrering av den aktive bestanddel eller et farmasøytisk preparat derav vil nødvendigvis være avhengig av den terapeutiske effekt som skal oppnås (behandling av sterilitet; prevensjon) og kan variere med den spesielle forbindelse, administreringsveien og alderen og tilstanden til individet som medikamentet skal administreres til.

Generelt krever parenteral administrering lavere doser enn andre metoder for administrering, som er mer avhengig av adsorpsjon. Imidlertid inneholder en dose for mennesker fortrinnsvis 0,0001-25 mg pr. kg kroppsvekt. Den ønskede dose kan presenteres som én dose eller som multiple subdoser administrert med passende mellomrom i løpet av dagen, eller i tilfellet kvinnelige mottakere, som doser som skal administreres ved passende daglige intervaller gjennom hele menstruasjonscyklusen. Dosen så vel som administreringskjemaet kan avvike mellom en kvinnelig og en mannlig mottager.

I tilfellet in vitro eller ex vivo applikasjoner, liksom ved IVF-applikasjoner, foreligger forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse som skal anvendes i inkuberingsmediet i en konsentrasjon på omtrent 0,01-5 u.g/ ml.

Foreliggende oppfinnelse angår således også farmasøytiske preparater omfattende en bicyklisk heteroaromatisk forbindelse i henhold til formel II, dvs. omfattende farmasøytiske preparater omfattende etyl-5-amino-4-fenyl-2-etoksykarbonylmetyltio-tieno [2,3 -</]pyrimidin- 6-karboksy lat, metyl-5-amino-4-fenyl-2-metyltio-tieno [2,3-d]pyrimidin-6-karboksylat eller etyl-5-amino-4-fenyl-2-metyltio-tieno[2,3-£/]pyrimidin-6-karboksylat i blanding med farmasøytisk akseptable tilsetningsmidler og eventuelt andre terapeutiske midler.

Tilsetningsmidlene må være "akseptable" i betydningen å være kompatible med de andre bestanddeler i preparatet og ikke skadelige for mottagerne derav.

Farmasøytiske preparater omfatter de som er egnet for oral, rektal nasal, topisk (omfattende transdermal, buckal og sublingual), vaginal eller parenteral (omfattende subkutan, intramuskulær, intravenøs og intradermal) administrering. Preparatene kan fremstilles ved hvilken som helst metode som er velkjent på området farmasi, for eksempel ved anvendelse av metoder så som de beskrevet i Gennaro et al., Remington's Pharmaceutical Sciences (18th ed., Mack Publishing company, 1990, se spesielt Del 8: Pharmaceutical Preparations and Their Manufacture).

Slike metoder omfatter trinnet å bringe den aktive bestanddel i forbindelse med hvilket som helst hjelpemiddel. Hjelpemiddel(er) også betegnet tilleggsbestanddeler, omfatter de konvensjonelle på området (Gennaro, supra), så som, fyllmidler, bindemidler, fortynningsmidler, desintegreringsmidler, smøremidler, fargemidler, smaksgivende midler og fuktemidler.

Farmasøytiske preparater egnet for oral administrering kan presenteres som adskilte doseenheter så som piller, tabletter eller kapsler eller som et pulver eller granuler eller som en løsning eller suspensjon. Den aktive bestanddel kan også presenteres som en bolus eller pasta. Preparatene kan videre behandles til et suppositorium eller klyster for rektal administrering.

For parenteral administrering omfatter egnede preparater vandig og ikke-vandig steril injeksjon. Preparatene kan presenteres i enhet-dose- eller multi-dose-beholdere, for eksempel forseglet medisinglass og ampuller og kan lagres i en frysetørket (lyofilisert) tilstand som bare krever tilsetningen av steril flytende bærer, for eksempel vann før anvendelse.

Preparater eller formuleringer egnet for administrering ved nasal inhalering omfatter fint støv eller tåker som kan dannes ved hjelp av oppmålt dose trykksatte aerosol-preparater, forstøvere eller insufflatorer.

De bicykliske heteroaromatiske forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse kan også administreres i form av implantable farmasøytiske anordninger, bestående av en kjerne av aktivt materiale, innkapslet av en frigjøringshastighets-regulerende membran. Slike implantater må appliseres subkutant eller lokalt og vil frigjøre den aktive bestanddel ved en omtrent konstant hastighet over relativt lange tidsrom, for eksempel fra uker til år. Metoder for fremstilling av implantable farmasøytiske anordninger som sådanne er kjent på området, for eksempel som beskrevet i Europeisk Patent 0.303306

(AKZO N.V.).

Således kan forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes for samme kliniske formål som det naturlige LH, med den fordelen at de viser endrete stabilitets-egenskaper og kan administreres forskjellig.

Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse hvor B=NH, representert ved formel (I-a) kan generelt fremstilles ved å følge faglig kjent kondensering av en syre med formel (III) med et amin med formel (IV).

Reaksjonen ovenfor blir typisk utført ved romtemperatur i et egnet løsningsmiddel, f.eks. et aprotisk løsningsmiddel så som 7V-dimetylformamid eller diklormetan, ved anvendelse av et koblingsreagens så som 0-( benzotriazo\- l- yl)- N, N, N', N'-tetrametyluronium-tetrafluorborat (TBTU) eller bromtripyrrolidinofosfonium-heksafluorfosfat (PyBrOP) og en tertiær base, f.eks. 7V-diisopropyletylamin.

Likeledes kan forbindelser med formel (II) hvor B=0, som er representert ved formel (I-b), fremstilles på samme måte som beskrevet ovenfor for forbindelser med formel (I-a) ved å starte fra syrer med den generelle struktur (III) og alkoholer med formel (V).

Alternativt kan forbindelser med formel (I-c), også fremstilles fra tioamider med struktur (VIII) hvor W er som tidligere definert og forbindelser med formel (IX) hvor V=halogen så som bromid eller klorid gjennom den ovennevnte prosedyre.

Beslektete cykliseringer er beskrevet i litteraturen, se for eksempel Y.A. Sharanin, A.M. Shestopalov and V.K. Promonenkov, J. Org. Chem. USSR (Engl. Transl), 20:1828 1984; Z.H. Khalil and A.A. Geies, Phosf. Sulf. Silic. Relat. Elem. 60:223, 1991.

En egnet metode for fremstilling av mellomproduktsyrer (III) er den på området kjente base-medierte forsåpning av etylestere med den generelle struktur (X). Forsåpning finner sted i nærvær av en base så som litiumhydroksyd, kaliumhydroksyd eller natriumhydroksyd i en blanding av vandig dioksan ved forhøyet temperatur (80 °C til tilbakeløp).

Forbindelser med formel (X) kan fremstilles ved cyklisering av pyridylklorider (VI) med HXCH2C(0)OEt som beskrevet tidligere for syntesen av forbindelser (I-c). I visse tilfeller kan et mellomprodukt -ikke-cyklisert- produkt isoleres, som cykliserer etter gjentatt behandling med base. Alternativt kan forbindelser med formel (X) hvor X=S også fremstilles via samme prosedyre beskrevet for syntesen av derivater (I-d) ved cyklisering av (VIII) med VCH2C(0)OEt (IX) hvor V er som tidligere definert.

Beslektete cykliseringer er funnet i litteraturen. For eksempel er tienocykliseringer beskrevet av A.A. Santilli, D.H. Kim and S.V. Wanser, J. Heterocycl. Chem. 8:445, 1971; S. Kohra, Y. Tominaga and A. Hosomi, J. Heterocycl. Chem. 25:959, 1988; H. Vieweg, U. Krasselt, N. B6hm, J. Prantz und G. Wagner, Pharmazie 45:731, 1990; H. Vieweg und G. Wagner, Pharmazie 46:51, 1991; G. Wagner, H. Vieweg und S. Leitner, Pharmazie 48:588, 1993. Pyrrolocykliseringer er beskrevet f.eks. av D.H. Kim og A.A. Santilli, J. Heterocycl. Chem. 6:819, 1969.

Forbindelser med formel (VI) hvor W er som tidligere definert, kan syntetiseres ved å følge litteratur-prosedyrer som beskrevet for eksempel av A.A. Santilli, D.H. Kim and S.V. Wanser, J. Heterocycl. Chem. 8:445, 1971.1 et typisk forsøk blir et amid med den generelle struktur (XI) behandlet med POCI3 ved forhøyet temperatur (80 °C til tilbakeløp). Tilsetningen av et passende løsningsmiddel, f.eks. dioksan og/eller tilsetningen av enten PCI5 eller 7V-dimetylanilin til reaksjonsblandingen kan resultere i kortere reaksjonstider og høyere utbytter av klorider (VI).

I en annen tilnærming kan amider (XI) behandles ved forhøyet temperatur (fortrinnsvis tilbakeløp) med SOCb, hvilket gir forbindelser med formel (VI), som ble beskrevet i litteraturen av D.H. Kim and A.A. Santilli, J. Heterocycl. Chem. 6:819, 1969.

Forbindelser med formel (VIII), hvor W er som tidligere definert, kan fremstilles ved behandling av derivater (XI) med en sulfureringsmiddel, f.eks. P2S5 eller Lawesson's Reagens i et passende løsningsmiddel så som pyridin ved forhøyet temperatur (fortrinnsvis tilbakeløp), se Z.H. Khalil, Phosph. Sulf. Silic. Relat. Elem. 60: 223,1991.

Forbindelser med formel (XI) hvor Y=N, representert ved formel (XI-a), kan fremstilles over mange litteratur-baserte veier.

For eksempel kan derivater med formel (XI-a) hvor R<1=> (6-14C)aryl syntetiseres ved kondensering av etylestere (XVI), hvor W er som tidligere definert, med aldehyder (XVII) og forbindelser (XVIII), hvilke kan være isotiourea (XVIII-a), isourea (XVIII-b), monosubstituerte guanidiner (XVII-c), disubstituerte guanidiner (XVIII-d) eller amidiner (XVHI-e).

I et typisk forsøk blir komponenter (XVI), (XVII) og (XVHIa-e) oppslemmet i et passende løsningsmiddel, f.eks. etanol, metanol, N-dimetylformamid, N-metylpyrrolidinon, tetrahydrofuran eller pyridin, og en base så som kaliumkarbonat, natriumacetat, natriummetoksyd eller natriumetoksyd blir tilsatt. Reaksjon finner sted ved forhøyet temperatur (70 °C til tilbakeløp). Etter filtrering blir rester tatt opp i vann og surgjort (pH 2) hvoretter produkter (XI-a) utfelles (S. Kambe, K. Saito and H. Kishi, Synthesis 287 (1979); A.M. Abd-Elfattah, S.M. Hussain and A.M. El-Reedy, Tetrahedron 39, 3197 (1983); S.M. Hussain, A.A. El-Barbary and S.A. Mansour, J. Heterocycl. Chem. 22, 169 (1985)). I tilfellet W=C(0)OEt forekommer aromatisering ved tilsetningen av en oksydant, så som DDQ eller oksygen. Beslektete cykliseringer kan også utføres på en fast bærer så som Merrifield-harpiks ved anvendelse av en passende linker, se for eksempel A.L. Mrzinzik and E.R. Felder, J. Org. Chem. 63, 723

(1998); T. Masquelin, D. Sprenger, R. Baer, F. Gerber and Y. Mercadal, Heiv. Chim. Acta 81, 646 (1998).

Pyridiner med den generelle formel (XI) hvor Y=CH, A=S og W=CN, representert ved formel (XX) er tilgjengelige ved sekvensiell alkylering av a,P-umettete dinitriler med den generelle struktur (XIV) med karbondisulfid og alkyljodid R<2->I, hvilket gir forbindelser med den generelle formel (XIX), som beskrevet av P. Milart, Tetrahedron 54: 15643-15656, 1998. Cyklisering av forbindelser med formel (XIX) under sure betingelser som beskrevet av K. Peseke, Z. Chem. 29: 442-443 (1989) gir pyridiner med den generelle formel (XX).

Metoder for å bestemme reseptorbinding så vel som in vitro og in vivo forsøk for å bestemme biologisk aktivitet av gonadotropiner er velkjente. Generelt blir uttrykt reseptor bragt i kontakt med forbindelsen som skal testes, og binding eller stimulering eller hemning av en funksjonell respons blir målt.

For å måle en funksjonell respons blir isolert DNA som koder for LH reseptor-genet, fortrinnsvis den humane reseptor, uttrykt i egnete vertsceller. En slik celle kan være Kinesisk hamster-eggstokk-celle, men andre celler er også egnet. Fortrinnsvis stammer cellene fra pattedyr (Jia et al, Mol.Endocrin., 5:759-776,1991.

Metoder for konstruksjon av rekombinant LH som uttrykker cellelinjer er velkjente på området (Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, siste utgave). Ekspresjon av reseptor blir oppnådd ved ekspresjon av DNA'et som koder for det ønskede protein. Teknikker for sete-dirigert mutagenese, ligering av ytterligere sekvenser, PCR og konstruksjon av egnete ekspresjonssystemer er alle nå velkjente på området. Deler av eller fullstendig DNA som koder for det ønskede protein, kan konstrueres syntetisk ved anvendelse av standard fastfase-teknikker, fortrinnsvis som omfatter restriksjonsseter for å gjøre ligering lettere. Egnete kontroll-elementer for transkripsjon og translasjon av den omfattete kode-sekvens kan være bestemt av DNA-kodesekvensene. Som det er velkjent, er ekspresjonssystemer nå tilgjengelige som er kompatible med en rekke verter, omfattende prokaryot-verter så som bakterier, og eukariot-verter så som gjær, planteceller, insektceller, pattedyrceller, fugleceller og lignende.

Celler som uttrykker reseptoren blir deretter deretter bragt i kontakt med testforbindelsen for å observere binding eller stimulering eller hemning av en funksjonell respons.

Alternativt isolerte celle-membraner inneholdende den uttrykte reseptor kan anvendes for å måle binding av forbindelse.

For måling av binding kan radioaktivt eller fluorescensmerkete forbindelser anvendes. Som referanse-forbindelse kan human rekombinant LH anvendes. I alternativet kan også konkurranse-bindingsforsøk utføres.

En annet forsøk involverer screening etter LH reseptor-agonist-forbindelser ved å bestemme stimulering av reseptor-mediert cAMP-akkumulering. Således involverer en slik metode ekspresjon av reseptoren på celleoverflaten av en vertscelle og eksponering av cellen for testforbindelsen. Mengden av cAMP blir deretter målt. Nivået av cAMP vil reduseres eller økes, avhengig av den hemmende eller stimulerende effekt av testforbindelsen på binding til reseptoren.

I tillegg til direkte måling av f.eks. cAMP-nivåer i den eksponerte celle, kan cellelinjer anvendes som i tillegg til transfeksjon med reseptor som koder for DNA også er transfektert med et andre DNA som koder for en rapportørgen, hvis ekspresjon responder på nivået av cAMP. Slike rapportørgener kunne være cAMP-induserbare eller kunne konstrueres på en slik måte at de blir forbundet med nye cAMP-mottagelige elementer. Generelt kunne rapportørgen-ekspresjon kontrolleres med hvilket som helst responselement som reagerer på forandring av nivåer av cAMP. Egnete rapportørgener er f.eks. LacZ, alkalifosfatase, ildflue-luciferase og grønt fluorescensprotein. Prinsippene for slike transaktiveirngsmålinger er velkjente på området og er beskrevet f.eks. i Stratowa, Ch, Himmler, A og Czernilofsky, A.P. (1995) Curr.Opin.Biotechnol, 6:574.

For å velge ut aktive forbindelser må testing ved IO"<5> M resultere i en aktivitet på mer enn 20% av den maksimale aktivitet når LH blir anvendt som en referanse. Et annet kriterium kunne være ECso-verdien, som må være < 10"<5> M, fortrinnsvis < IO"<7> M.

Fagfolk vil forstå at ønskelige ECso-verdier er avhengig av forbindelsen som blir testet. For eksempel blir en forbindelse med en EC50 som er mindre enn 10"<5> M generelt betraktet som en kandidat for medikamentseleksjon. Fortrinnsvis er denne verdi lavere enn IO"<7> M. Imidlertid kan en forbindelse som har en høyere EC50, men er selektiv for den spesielle reseptor, til og med være en bedre kandidat.

Screening etter LH reseptor-agonist-forbindelser kan også utføres ved anvendelse av en muse Leydig celle-biomåling (Van Damme, M, Robersen, D. og Diczfalusy, E.

(1974). Acta Endocrinol. 77: 655-671 Mannaerts, B., Kloosterboer, H. og Schuurs, A.

(1987). Neuroendocrinology of reproduction. R. Rolland et al. Eds., Elsevier Science Publishers B.V., 49-58). I denne målingen kan stimulering av LH-reseptor-mediert testosteron-produksjon måles i Leydig-celler isolert fra hannmus.

For å måle in vivo aktivitet av LH-reseptor-agonist-forbindelser kan eggløsnings-induksjon i umoden mus studeres. I denne måling kan umodne hunnmus primes med urin-FSH og omtrent 48 timer senere behandles med en LH-agonist-forbindelse. Dyrene blir avlivet etter LH-agonist-behandling, og antallet egg i egglederen kan fastslås mikroskopisk.

Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse kan appliseres klinisk i de opplegg hvor nå LH eller hCG blir anvendt. Disse omfatter LH-substitusjon hos individer med hypogonadal hypogonadisme om mann eller kvinne, midcyklus- administrering for å fremkalle eggløsning (eggløsning-induksjon (OI) eller kontrollert hyperstimulering (COH) eller stimulering av corpus luteum.

De følgende eksempler er illustrative for oppfinnelsen.

Eksempler

Eksempel 1

Etvl- 5- amino- 4-( 3- metoksvfenvn- 2- metvltio- tienor2, 3- finpvrimidin- 6- karboksylat

(a). 5- Cvano- 4-( 3- metoksvfenvl)- 2- metvltio- 6- oksopyrimidin

En blanding av S-metylisotioureasulfat (139 mg), 3-metoksybenzaldehyd (243 ul), etyl-cyanoacetat (112 ul) og kaliumkarbonat (145 mg) i abs. etanol (2 ml) ble rørt ved 60°C i 5 timer. Reaksjonsblandingen ble avkjølt til 0°C i et isbad, filtrert og residuet ble oppvarmet i vann inntil en klar løsning ble oppnådd. Løsningen ble surgjort med 2N HC1 til pH 2 og avkjølt til 0°C i et isbad. De resulterende krystaller ble filtrert fra og tørket i vakuum.

Utbytte: 186 mg.

MS-ESI: [M+H]<+> = 274,2.

TLC: Rf = 0,50, silikagel, diklormetan/metanol = 9/1 volum/volum.

( b) . 6- Klor- 5 - cvano- 4-( 3- metoksvfenvl")- 2- metvltiopvrimidin

POCI3 (0,75 ml) ble satt til en omrørt løsning av 5-cyano-4-(3-metoksyfenyl)-2-metyltio-6-oksopyrimidin (305 mg) i tørt dioksan (1 ml). Etter 3 timer ved 80°C ble blandingen avkjølt til 0°C i et isbad og knust is ble langsomt tilsatt. Etter opphør av den eksoterme reaksjon ble vann tilsatt (3 ml), de faste stoffene ble filtrert fra og tørket i vakuum.

Utbytte: 244 mg.

MS-ESI: [M+H]<+> = 292,2.

TLC: Rf = 0,86, silikagel, diklormetan.

(c) . Etyl- 5- amino- 4-( 3- metoksvfenvl)- 2- metvltio- tienor2, 3- c/ lpvrimidin- 6- karboksvlat

Natriumetoksyd (1,4N, 957 ul) ble satt til en omrørt løsning av etyl-2-merkaptoacetat (92 ul) og 6-klor-5-cyano-4-(3-metoksyfenyl)-2-metyltiopyrimidin (244 mg) i tørr etanol (4 ml). Etter 3 timer ved 50°C ble blandingen avkjølt til 0°C i et isbad, fortynnet med vann (5 ml), og de faste stoffene ble oppsamlet ved filtrering og tørket i vakuum.

Utbytte: 260 mg

MS-ESI: [M+H]<+> = 376,2.

TLC: Rf = 0,44, silikagel, diklormetan.

Eksempel 2

Etvl- 5- amino- 2- etvltio- 4- fenvl- tienor2, 3- c/ lpvrimidin- 6- karboksvlat

Cyklisering av S-etylisotiourea.HBr (185 mg), benzaldehyd (203 ul) og etyl-cyanoacetat (117 ul), behandling av produktet med POCI3 og etterfølgende omsetning med etyl-2-merkaptoacetat ble utført i henhold til metodene beskrevet i eksempel 1.

Utbytte: 49 mg.

MS-ESI: [M+H]<+> = 360,2.

TLC: Rf = 0,46, silikagel, diklormetan.

Eksempel 3

Etvl- 5- amino- 2-/ 7- pentvltio- 4- fenvl- tienor2, 3- c/ 1pvrimidin- 6- karboksvlat

Cyklisering av S-«-pentylisotiourea (146 mg), benzaldehyd (203 ul) og etyl-cyanoacetat (112 ul), behandling av produktet med POCI3 og etterfølgende omsetning med etyl-2-merkaptoacetat ble utført i henhold til metodene beskrevet i eksempel 1.

Utbytte: 45 mg.

MS-ESI: [M+H]<+> = 402,4.

TLC: Rf = 0,57, silikagel, diklormetan.

Eksempel 4

Etvl- 5- amino- 2- »- pentvltio- 4-( 3- tienvl)- tienor2, 3-(/ lpyrimidin- 6- karboksvlat Cyklisering av S-w-pentylisotiourea (146 mg), tiofen-3-karboksaldehyd (183 ul) og etyl-cyanoacetat (112 ul), behandling av produktet med POCI3 og etterfølgende omsetning med etyl-2-merkaptoacetat ble utført i henhold til metodene beskrevet i eksempel 1. Utbytte: 4 mg.

MS-ESI: [M+H]<+> = 408,2.

TLC: Rf = 0,65, silikagel, diklormetan.

Eksempel 5

Etvl- 5- amino- 4-( 3- furvl)- 2-/ 7- pentvltio- tienor2, 3- c/ lpvrimidin- 6- karboksvlat Cyklisering av S-w-pentylisotiourea (146 mg), 3-furaldehyd (129 ul) og etyl-cyanoacetat (112 ul), behandling av produktet med POCI3 og etterfølgende omsetning med etyl-2-merkaptoacetat ble utført i henhold til metodene beskrevet i eksempel 1.

Utbytte: 18 mg.

MS-ESI: [M+Hf = 392,2.

TLC: Rf = 0,60, silikagel, diklormetan.

Eksempel 6

Etvl- 5- amino- 2- benzvltio- 4- fenvl- tienor2, 3- c/ 1pvrimidin- 6- karboksylat

Cyklisering av 5-benzylisotiourea (203 mg), benzaldehyd (203 ul) og etyl-cyanoacetat (112 ul), behandling av produktet med POCI3 og etterfølgende omsetning med etyl-2-merkaptoacetat ble utført i henhold til metodene beskrevet i eksempel 1.

Utbytte: 114 mg.

MS-ESI: [M+H]<+> = 422,0.

TLC: Rf = 0,70, silikagel, diklormetan.

Eksempel 7

Elyl- 5- amino- 2- benzvltio- 4-( 3- tienvD- tienor2, 3- c/ 1pvrimidin- 6- karboksvlat

Cyklisering av S-benzylisotiourea (203 mg), tiofen-3-karboksaldehyd (183 ul) og etyl-cyanoacetat (112 ul), behandling av produktet med POCI3 og etterfølgende omsetning med etyl-2-merkaptoacetat ble utført i henhold til metodene beskrevet i eksempel 1. Utbytte: 34 mg.

MS-ESI: [M+H]<+> = 428,3.

TLC: Rf = 0,65, silikagel, diklormetan.

Eksempel 8

Etvl- 5- amino- 2- benzvltio- 4-( 3- furyl)- tienor2, 3- cf1pvrimidin- 6- karboksvlat

Cyklisering av 5-benzylisotiourea (203 mg), 3-furaldehyd (129 ul) og etyl-cyanoacetat (112 ul), behandling av produktet med POCI3 og etterfølgende omsetning med etyl-2-merkaptoacetat ble utført i henhold til metodene beskrevet i eksempel 1.

Utbytte: 38 mg.

MS-ESI: [M+H]<+> = 412,2.

TLC: Rf = 0,60, silikagel, diklormetan.

Eksempel 9

Etvl- 5- amino- 2- benzvltio- 4-( 3- metoksvfenyl)- tienor2. 3-(/ lpvrimidin- 6- karboksvlat Cyklisering av S-benzylisotiourea (203 mg), 3-metoksybenzaldehyd (243 ul) og etyl-cyanoacetat (112 ul), behandling av produktet med POCI3 og etterfølgende omsetning med etyl-2-merkaptoacetat ble utført i henhold til metodene beskrevet i eksempel 1. Utbytte: 31 mg.

MS-ESI: [M+Hf = 452,2.

TLC: Rf = 0,52, silikagel, diklormetan.

Eksempel 10

Etvl- 5- amino- 2- etoksvkarbonvlmetvltio- 4-( 3- metoksvfenvl")- tienor2, 3- c/ lpvrimidin- 6-karboksvlat

Cyklisering av S-metylisotioureasulfat (139 mg), 3-metoksybenzaldehyd (243 ul) og etyl-cyanoacetat (112 ul), behandling av produktet med POCI3 og etterfølgende omsetning med etyl-2-merkaptoacetat ble utført i henhold til metodene beskrevet i eksempel 1.

Utbytte: 37 mg.

MS-ESI: [M+H]<+> = 448,2.

TLC: Rf = 0,12, silikagel, diklormetan.

Eksempel 11

Etvl- 5- amino- 2- metvltio- 4-( 3- tienvl)- tienor2, 3-(/ lpvrimidin- 6- karboksylat

Cyklisering av S-metylisotioureasulfat (695 mg), tiofen-3-karboksaldehyd (910 ul) og etyl-cyanoacetat (580 ul), behandling av produktet med POCI3 og etterfølgende omsetning med etyl-2-merkaptoacetat ble utført i henhold til metodene beskrevet i eksempel 1.

Utbytte: 176 mg.

MS-ESI: [M+H]<+> = 352,2.

TLC: Rf = 0,52, silikagel, diklormetan.

Eksempel 12

Etvl- 5- amino- 4-( 3- furvD- 2- metvltio- tienor2. 3-(/ 1pvrimidin- 6- karboksvlat

Cyklisering av S-metylisotioureasulfat (139 mg), 3-furaldehyd (129 ul) og etyl-cyanoacetat (112 ul), behandling av produktet med POCI3 og etterfølgende omsetning med etyl-2-merkaptoacetat ble utført i henhold til metodene beskrevet i eksempel 1. Utbytte: 32 mg.

MS-ESI: [M+H]<+> = 336,2.

TLC: Rf = 0,38, silikagel, diklormetan.

Eksempel 13

Etvl- 5- amino- 2- metvltio- 4-( 4- pvridvl)- tienor2, 3- c/ 1pvrimidin- 6- karboksvlat

Cyklisering av S-metylisotioureasulfat (139 mg), 4-pyridinekarboksaldehyd (191 ul) og etyl-cyanoacetat (112 ul), behandling av produktet med POCI3 og etterfølgende omsetning med etyl-2-merkaptoacetat ble utført i henhold til metodene beskrevet i eksempel 1.

Utbytte: 29 mg.

MS-ESI: [M+Hf = 347,2.

TLC: Rf = 0,54, silikagel, diklormetan.

Eksempel 14

Elyl- 5- amino- 2- meMtio- 4-( 2- pvridvl>- tienor23- c/ 1pvrimidin- 6- karboksvlat

Cyklisering av S-metylisotioureasulfat (139 mg), 2-pyridinekarboksaldehyd (190 ul) og etyl-cyanoacetat (112 ul), behandling av produktet med POCI3 og etterfølgende omsetning med etyl-2-merkaptoacetat ble utført i henhold til metodene beskrevet i eksempel 1.

Utbytte: 73 mg.

MS-ESI: [M+Hf = 347,2.

TLC: Rf = 0,50, silikagel, diklormetan.

Eksempel 15

Etvl- 5- amino- 2- metvltio- 4-( 2- tienvl)- tienor2, 3- c/ 1pvrimidin- 6- karboksylat

Cyklisering av S-metylisotioureasulfat (139 mg), tiofen-2-karboksaldehyd (189 ul) og etyl-cyanoacetat (112 ul), behandling av produktet med POCI3 og etterfølgende omsetning med etyl-2-merkaptoacetat ble utført i henhold til metodene beskrevet i eksempel 1.

Utbytte: 106 mg.

MS-ESI: [M+Hf = 381,2.

TLC: Rf = 0,67, silikagel, diklormetan.

Eksempel 16

Etvl- 5- amino- 2- metvltio- 4- fenvl- tieno[ 2, 3- c/ 1pvrimidin- 6- karboksvlat

Cyklisering av S-metylisotioureasulfat (8,35 g), benzaldehyd (12,2 ml) og etyl-cyanoacetat (6,70 ml), behandling av produktet med POCI3 og etterfølgende omsetning med etyl-2-merkaptoacetat ble utført i henhold til metodene beskrevet i eksempel 1. Utbytte: 7,98 g.

MS-ESI: [M+H]<+> = 346,2.

TLC: Rf = 0,92, silikagel, diklormetan

Eksempel 17

5- Ammo- 2- metyltio- 4- fenvl- tieno[ 23-(/ 1Pwimidin- 6- karboksvlsvre Litiumhydroksyd (923 mg) ble satt til en omrørt løsning av 760 mg etyl-5-amino-2-metyltio-4-fenyl-tieno[2,3-£/]pyrimidin-6-karboksylat (se eksempel 16) i dioksan/vann = 9/1 (volum/volum), og blandingen ble oppvarmet ved 80°C i 24 timer.

Reaksjonsblandingen ble hellet i vann og ekstrahert med etylacetat ved pH 2. Det organiske sjiktet ble vasket med vann og saltvann og tørket over natriumsulfat. Filtratet ble inndampet til tørrhet.

Utbytte: 766 mg.

MS-ESI: [M+H]<+> = 318,0.

TLC: Rf = 0,49, silikagel, diklormetan/metanol = 9/1 volum/volum.

Eksempel 18

Fenvl- 5- amino- 2- metvltio- 4- fenvl- tienor2. 3-(/ 1pvrimidin- 6- karboksvlat

Til en omrørt løsning av 40 mg 5-amino-2-metyltio-4-fenyl-tieno[2,3-</]pyrimidin-6-karboksylsyre, som var syntetisert via metoden beskrevet i eksempel 17, i diklormetan (2 ml) sattes AyV-diisopropyletylamin (100 ul), fenol (13 mg) og bromtripyrrolidinofosfonium-heksafluorfosfat (79 mg). Etter 20 timer ble vann (2 ml) tilsatt, og blandingen ble kraftig rørt og deretter filtrert gjennom et PE-filter. Den organiske fasen ble inndampet i vakuum, og residuet ble kromatografert på silikagel (Isolute, 2 g) i diklormetan som elueringsmiddel.

Utbytte: 16 mg.

MS-ESI: [M+Hf = 394,2.

TLC: Rf = 0,32, silikagel, diklormetan.

Eksempel 19

/ 7- Butvl- 5- amino- 2- metvltio- 4- fenvl- tieno[ 2, 3- cf1pvrimidin- 6- karboksvlat Forestring av 5-amino-2-metyltio-4-fenyl-tieno[2,3-£/]pyrimidin-6-karboksylsyre (40 mg) med w-butanol (13 ul) ble utført i henhold til metoden beskrevet i eksempel 18. Residuet ble kromatografert på silikagel (Isolute, 2 g) i diklormetan som elueringsmiddel.

Utbytte: 7 mg.

MS-ESI: [M+Hf = 374,2.

TLC: Rf = 0,66, silikagel, diklormetan.

Eksempel 20

Cvkloheksvl- 5- amino- 2- metvltio- 4- fenvl- tieno[ 2, 3- cf1pvrimidin- 6- karboksvlat Forestring av 5-amino-2-metyltio-4-fenyl-tieno[2,3-£/]pyrimidin-6-karboksylsyre (40 mg) med cykloheksanol (14 ul) ble utført i henhold til metoden beskrevet i eksempel 18. Residuet ble kromatografert på silikagel (Isolute, 2 g) i diklormetan som elueringsmiddel.

Utbytte: 14 mg.

MS-ESI: [M+H]<+> = 400,2.

TLC: Rf = 0,66, silikagel, diklormetan.

Eksempel 21

Benzvl- 5- amino- 2- metvltio- 4- fenvl- tienor2, 3- c/ lpvrimidin- 6- karboksvlat Forestring av 5-amino-2-metyltio-4-fenyl-tieno[2,3-</]pyrimidin-6-karboksylsyre (40 mg) med benzylalkohol (14 ul) ble utført i henhold til metoden beskrevet i eksempel 18. Residuet ble kromatografert på silikagel (Isolute, 2 g) i diklormetan som elueringsmiddel.

Utbytte: 10 mg.

MS-ESI: [M+Hf = 408,2.

TLC: Rf = 0,66, silikagel, diklormetan.

Eksempel 22

4- Metoksvfenvl- 5- amino- 2- metvltio- 4- fenyl- tieno[ 2, 3- c/ 1pvrimidin- 6- karboksvlat Forestring av 5-amino-2-metyltio-4-fenyl-tieno[2,3-£/]pyrimidin-6-karboksylsyre (40 mg) med 4-metoksyfenol (17 mg) ble utført i henhold til metoden beskrevet i eksempel 18. Residuet ble kromatografert på silikagel (Isolute, 2 g) med heptan/diklormetan 1/1 (volum/volum) som elueringsmiddel.

Utbytte: 26 mg.

MS-ESI: [M+Hf = 424,2.

TLC: Rf = 0,64, silikagel, diklormetan.

Eksempel 23

3- Metoksvfenvl- 5- amino- 2- metvltio- 4- fenvl- tieno[ 2, 3- c/ 1pvrimidin- 6- karboksvlat Forestring av 5-amino-2-metyltio-4-fenyl-tieno[2,3-£/]pyrimidin-6-karboksylsyre (40 mg) med 3-metoksyfenol (17 mg) ble utført i henhold til metoden beskrevet i eksempel 18. Residuet ble kromatografert på silikagel (Isolute, 2 g) med heptan/diklormetan 1/1 (volum/volum) som elueringsmiddel.

Utbytte: 29 mg.

MS-ESI: [M+Hf = 424,2.

TLC: Rf = 0,60, silikagel, diklormetan.

Eksempel 24

2- Metoksvfenvl 5- amino- 2- metvltio- 4- fenvl- tienor2, 3- c/ 1pvrimidin- 6- karboksylat Forestring av 5-amino-2-metyltio-4-fenyl-tieno[2,3-</]pyrimidin-6-karboksylsyre (40 mg) med 2-metoksyfenol (17 mg) ble utført i henhold til metoden beskrevet i eksempel 18. Residuet ble kromatografert på silikagel (Isolute, 2 g) med heptan/diklormetan 1/1 (volum/volum) som elueringsmiddel.

Utbytte: 19 mg.

MS-ESI: [M+Hf = 424,2.

TLC: Rf = 0,60, silikagel, diklormetan.

Eksempel 25 2. 3- Dimetoksvfenvl- 5- amino- 2- metvltio- 4- fenvl- tieno[ 2, 3- c/ 1pvrimidin- 6- karboksvlat Forestring av 5-amino-2-metyltio-4-fenyl-tieno[2,3-</]pyrimidin-6-karboksylsyre (40 mg) med 2,3-dimetoksyfenol (21 mg) ble utført i henhold til metoden beskrevet i eksempel 18. Residuet ble kromatografert på silikagel (Isolute, 2 g) med heptan/diklormetan 1/1 (volum/volum) som elueringsmiddel.

Utbytte: 12 mg.

MS-ESI: [M+Hf = 454,2.

TLC: Rf = 0,36, silikagel, diklormetan.

Eksempel 26 2. 4- Dimetoksvfenvl- 5- amino- 2- metvltio- 4- fenvl- tieno[ 2, 3- c/ 1pvrimidin- 6- karboksvlat Forestring av 5-amino-2-metyltio-4-fenyl-tieno[2,3-£/]pyrimidin-6-karboksylsyre (40 mg) med 2,4-dimetoksyfenol (21 mg) ble utført i henhold til metoden beskrevet i eksempel 18. Residuet ble kromatografert på silikagel (Isolute, 2 g) med heptan/diklormetan 1/1 (volum/volum) som elueringsmiddel.

Utbytte: 20 mg.

MS-ESI: [M+Hf = 454,4.

TLC: Rf = 0,38, silikagel, diklormetan.

Eksempel 27

3. 5- Dimetoksvfenvl 5- amino- 2- metvltio- 4- fenvl- tieno[ 2, 3- c/ 1pvrimidin- 6- karboksylat

Forestring av 5-ammo-2-me1<y>ltio-4-fen<y>l-tieno[23-fi0pyriniidin-6-karboksylsyre (40 mg) med 3,5-dimetoksyfenol (21 mg) ble utført i henhold til metoden beskrevet i eksempel 18. Residuet ble kromatografert på silikagel (Isolute, 2 g) med heptan/diklormetan 1/1 (volum/volum) som elueringsmiddel.

Utbytte: 18 mg.

MS-ESI: [M+H]<+> = 454,2.

TLC: Rf = 0,60, silikagel, diklormetan.

Eksempel 28

Isopropvl- 5- amino- 2- metvltio- 4- fenvl- tienor2, 3-(/ lpyrimidin- 6- karboksvlat Forestring av 5-amino-2-metyltio-4-fenyl-tieno[2,3-£/]pyrimidin-6-karboksylsyre (40 mg) med 2-propanol (10 ul) ble utført i henhold til metoden beskrevet i eksempel 18. Residuet ble kromatografert på silikagel (Isolute, 2 g) med heptan/diklormetan 1/1 (volum/volum) som elueringsmiddel.

Utbytte: 12 mg.

MS-ESI: [M+H]<+> = 360,2.

TLC: Rf = 0,66, silikagel, diklormetan.

Eksempel 29

2- Tienvlmetvl- 5- amino- 2- metvltio- 4- fenvl- tienor2. 3-(/ 1pvrimidin- 6- karboksvlat Forestring av 5-amino-2-metyltio-4-fenyl-tieno[2,3-£/]pyrimidin-6-karboksylsyre (40 mg) med 2-tiofenemetanol (17 ul) ble utført i henhold til metoden beskrevet i eksempel 18. Residuet ble kromatografert på silikagel (Isolute, 2 g) med heptan/diklormetan 1/1 (volum/volum) som elueringsmiddel.

Utbytte: 18 mg.

MS-ESI: [M+H]<+> = 414,2.

TLC: Rf = 0,74, silikagel, diklormetan.

Eksempel 30 3 - Tienvlmetyl- 5 - amino- 2- metvltio- 4- fenvl- tieno \ 2 , 3 - c/ lpvrimidin- 6- karboks vlat Forestring av 5-ammo-2-metyltio-4-fenyl-tieno[2,3-^pyrimidin-6-karboksylsyre (40 mg) med 3-tiofenemetanol (15 mg) ble utført i henhold til metoden beskrevet i eksempel 18. Residuet ble kromatografert på silikagel (Isolute, 2 g) med heptan/diklormetan 1/1 (volum/volum) som elueringsmiddel.

Utbytte: 12 mg.

MS-ESI: [M+H]<+> = 414,2.

TLC: Rf = 0,74, silikagel, diklormetan.

Eksempel 31

2- A^- Pvrrolidino- l- etyl- 5- amino- 2- metvltio- 4- fenvl- tienor2, 3-(/ lpvrimidin- 6- karboksylat Til en omrørt løsning av 40 mg 5-amino-2-metyltio-4-fenyl-tieno[2,3-£/]pyrimidin-6-karboksylsyre, som var syntetisert ved metoden beskrevet i eksempel 17, i diklormetan (2 ml) sattes N,.Y-diisopropyletylamin (40 ul), l-(2-hydroksyetyl)pyrrolidin (20 ul) og 0-(benzotriazol-l-yl)-A^A^A^',A^'-tetrametyluroniimi-tetrafluorborat (40 mg). Etter 20 timer ble løsningsmidlet avdampet, og residuet ble kromatografert på silikagel (Isolute, 2 g) i heptan/diklormetan = 100/0 (volum/volum) => 0/100 (volum/volum) som elueringsmiddel.

Utbytte: 13 mg.

MS-ESI: [M+H]<+> = 415,0.

TLC: Rf = 0,07, silikagel, diklormetan/metanol = 98/2 volum/volum.

Eksempel 32

Isopropvl- 5- amino- 2- metvltio- 4- fenvl- tienor2, 3- c/ 1pyrimidin- 6- karboksamid Omsetning av 5-amino-2-metyltio-4-fenyl-tieno[2,3-</]pyrimidin-6-karboksylsyre (40 mg) med 2-aminopropan (12 ul) ble utført i henhold til metoden beskrevet i eksempel 18. Residuet ble kromatografert på silikagel (Isolute, 2 g) i diklormetan som elueringsmiddel.

Utbytte: 7 mg.

MS-ESI: [M+H]<+> = 359,2.

TLC: Rf = 0,23, silikagel, diklormetan.

Eksempel 33

Benzvl- 5- amino- 2- metvltio- 4- fenyl- tienor2. 3- finpvrimidin- 6- karboksamid

Omsetning av 5-amino-2-metyltio-4-fenyl-tieno[2,3-</]pyrimidin-6-karboksylsyre (40 mg) med benzylamin (15 ul) ble utført i henhold til metoden beskrevet i eksempel 18. Residuet ble kromatografert på silikagel (Isolute, 2 g) i diklormetan som elueringsmiddel.

Utbytte: 32 mg.

MS-ESI: [M+H]<+> = 407,2.

TLC: Rf = 0,24, silikagel, diklormetan.

Eksempel 34

/ 7- Butvl- 5- amino- 2- metvltio- 4- fenyl- tienor2. 3-(/ 1pvrimidin- 6- karboksamid Omsetning av 5-amino-2-metyltio-4-fenyl-tieno[2,3-</]pyrimidin-6-karboksylsyre (40 mg) med 1-aminobutan (13 ul) ble utført i henhold til metoden beskrevet i eksempel 18. Residuet ble kromatografert på silikagel (Isolute, 2 g) i diklormetan som elueringsmiddel.

Utbytte: 18 mg.

MS-ESI: [M+H]<+> = 373,2.

TLC: Rf = 0,25, silikagel, diklormetan.

Eksempel 35

Cvklopropvl- 5- amino- 2- metvltio- 4- fenvl- tienor2, 3- cf1pvrimidin- 6- karboksamid Omsetning av 5-amino-2-metyltio-4-fenyl-tieno[2,3-</]pyrimidin-6-karboksylsyre (40 mg) med cyklopropylamin (9 ul) ble utført i henhold til metoden beskrevet i eksempel 18. Residuet ble kromatografert på silikagel (Isolute, 2 g) i diklormetan som elueringsmiddel.

Utbytte: 9 mg.

MS-ESI: [M+H]<+> = 357,2.

TLC: Rf = 0,14, silikagel, diklormetan.

Eksempel 36

Cvkloheksvl- 5- amino- 2- metvltio- 4- fenvl- tienor2, 3- cf1pvrimidin- 6- karboksamid Omsetning av 5-amino-2-metyltio-4-fenyl-tieno[2,3-</]pyrimidin-6-karboksylsyre (40 mg) med cykloheksylamin (16 fal) ble utført i henhold til metoden beskrevet i eksempel 18. Residuet ble kromatografert på silikagel (Isolute, 2 g) i diklormetan som elueringsmiddel.

Utbytte: 11 mg.

MS-ESI: [M+Hf = 399,2.

TLC: Rf = 0,32, silikagel, diklormetan.

Eksempel 37

4- Metoksvbenzvl 5- amino- 2- metvltio- 4- fenvl- tienor2, 3- c/ 1pvrirnidin- 6- karboksamid

Omsetning av 5-amino-2-metyltio-4-fenyl-tieno[2,3-</]pyrimidin-6-karboksylsyre (40 mg) med 4-metoksybenzylamin (18 ul) ble utført i henhold til metoden beskrevet i eksempel 18. Residuet ble kromatografert på silikagel (Isolute, 2 g) i diklormetan som elueringsmiddel.

Utbytte: 25 mg.

MS-ESI: [M+H]<+> = 437,2.

TLC: Rf = 0,20, silikagel, diklormetan.

Eksempel 38

1 - Naftylmetyl- 5 - amino- 2- metvltio- 4- fenvl- tieno \ 2 , 3 - c/ lpvirmidin- 6- karboksamid

Omsetning av 5-amino-2-metyltio-4-fenyl-tieno[2,3-</]pyrimidin-6-karboksylsyre (40 mg) med 1-naftylmetylamin (20 ul) ble utført i henhold til metoden beskrevet i eksempel 18. Residuet ble kromatografert på silikagel (Isolute, 2 g) i diklormetan som elueringsmiddel.

Utbytte: 20 mg.

MS-ESI: [M+Hf = 457,2.

TLC: Rf = 0,32, silikagel, diklormetan.

Eksempel 39

Fenvl- 5- amino- 2- metvltio- 4- fenvl- tieno[ 2, 3- c/ 1pvrimidin- 6- karboksamid

Omsetning av 5-amino-2-metyltio-4-fenyl-tieno[2,3-£/]pyrimidin-6-karboksylsyre (39 mg) med anilin (909 ul) ble utført i henhold til metoden beskrevet i eksempel 18. Residuet ble kromatografert på silikagel (Isolute, 2 g) i diklormetan som elueringsmiddel.

Utbytte: 37 mg.

MS-ESI: [M+Hf = 393,0.

TLC: Rf = 0,95, silikagel, etylacetat/pyridin/eddiksyre/vann = 363/20/6/11 volum/volum/volum/volum.

Eksempel 40

2- Tienvlmetvl- 5- amino- 2- metvltio- 4- fenvl- tieno[ 2, 3- c/ 1pvirmidin- 6- karboksamid

Omsetning av 5-amino-2-metyltio-4-fenyl-tieno[2,3-<30pyrimidin-6-karboksylsyre (40 mg) med 2-tiofenemetylamin(14 ul) ble utført i henhold til metoden beskrevet i eksempel 18, og råproduktet ble renset ved kromatografi på silikagel (Isolute, 2 g) i heptan/diklormetan = 1/1 (volum/volum) som elueringsmiddel.

Utbytte: 12 mg.

MS-ESI: [M+H]<+> = 413,2.

TLC: Rf = 0,23, silikagel, diklormetan.

Eksempel 41

«- Heptyl- 5 - amino- 2- metvltio- 4- fenvl- tieno \ 2 , 3 - c/ lpyrimidin- 6- karboksamid Omsetning av 5-amino-2-metyltio-4-fenyl-tieno[2,3-£/]pyrimidin-6-karboksylsyre (40 mg) med 1-aminoheptan (25 ul) ble utført i henhold til metoden beskrevet i eksempel 31. Residuet ble kromatografert på silikagel (Isolute, 2 g) med heptan/diklormetan 1/1 (volum/volum) som elueringsmiddel.

Utbytte: 37 mg.

MS-ESI: [M+H]<+> = 415,2.

TLC: Rf = 0,87, silikagel, diklormetan/metanol = 98/2 volum/volum.

Eksempel 42

3 - Fenyl- 1 - propvl 5 - amino- 2 - metvltio- 4- fenvl- tieno \ 2 . 3 - c/ lpvrimidin- 6- karboksamid Omsetning av 5-amino-2-metyltio-4-fenyl-tieno[2,3-£/]pyrimidin-6-karboksylsyre (40 mg) med 3-fenyl-l-propylamin (24 ul) ble utført i henhold til metoden beskrevet i eksempel 31. Residuet ble kromatografert på silikagel (Isolute, 2 g) med heptan/diklormetan 1/1 (volum/volum) som elueringsmiddel.

Utbytte: 32 mg.

MS-ESI: [M+H]<+> = 435,2.

TLC: Rf = 0,83, silikagel, diklormetan/metanol = 98/2 volum/volum.

Eksempel 43

1, 1 - Dietoksy- 4- butvl 5 - amino- 2 - metvltio- 4- fenvl- tieno \ 2 , 3 - c/ lpvirmidin- 6- karboksamid Omsetning av 5-amino-2-metyltio-4-fenyl-tieno[2,3-</]pyrimidin-6-karboksylsyre (40 mg) med 4,4-dietoksybutylamin (30 ul) ble utført i henhold til metoden beskrevet i eksempel 31. Residuet ble kromatografert på silikagel (Isolute, 2 g) med heptan/diklormetan 1/1 (volum/volum) som elueringsmiddel.

Utbytte: 47 mg.

MS-ESI: [M+H]<+> = 461,2.

TLC: Rf = 0,38, silikagel, diklormetan/metanol = 98/2 volum/volum.

Eksempel 44

3 - Metoksykarbonyl- 1 - propyl- 5 - amino- 2- metyltio- 4- fenyl- tieno \ 2 , 3 -(/ lpyrimidin- 6-karboksamid

Omsetning av 5-amino-2-metyltio-4-fenyl-tieno[2,3-£/]pyrimidin-6-karboksylsyre (40 mg) med metyl-4-aminobutyrat (26 mg) ble utført i henhold til metoden beskrevet i eksempel 31. Residuet ble kromatografert på silikagel (Isolute, 2 g) med heptan/diklormetan 1/1 (volum/volum) som elueringsmiddel.

Utbytte: 39 mg.

MS-ESI: [M+H]<+> = 417,0.

TLC: Rf = 0,46, silikagel, diklormetan/metanol = 98/2 volum/volum.

Eksempel 45

Isopropvl- 5- amino- 4-( 3- metoksvfenvn- 2- metvltio- tienor2, 3- c/ 1pyrimidin- 6- karboksamid Etyl-5-amino-4-(3-metoksyfenyl)-2-metyltio-tieno[2,3-£/]pyrimidin-6-karboksylat (se eksempel 1) ble først hydrolysert til den tilsvarende syre (248 mg) ved anvendelse av metoden beskrevet i eksempel 17 og deretter omsatt med 2-aminopropan (111 ul) til det tilsvarende amid i henhold til eksempel 31. Tittelforbindelsen ble renset ved kromatografi på silikagel med diklormetan/metanol = 98/2 (volum/volum) som elueringsmiddel fulgt av krystallisasjon fra etanol.

Utbytte: 147 mg.

MS-ESI: [M+H]<+> = 389,0.

TLC: Rf = 0,19, silikagel, diklormetan.

Eksempel 46

Etvl- 5- amino- 7- meM- 2- meMtio- 4- fenvl- pvrrolor2, 3- c/ 1pvrimidin- 6- karboksvlat (a),5- cvano- 6-( etoksvkarbonvlmetvl)( metvl) amino- 2- metvltio- 4- fenylpvrimidin En blanding av natriumbikarbonat (160 mg) og etyl-7V-metylglycinat.HCl (438 mg) i etanol ble oppvarmet under tilbakeløp. Etter 2 timer ble 6-klor-5-cyano-2-metyltio-4-fenylpyrimidin (100 mg, se eksempel lb) tilsatt, og reaksjonsblandingen ble tilbakeløpskokt i 2,5 timer til. De faste stoffene ble fjernet ved filtrering, hvoretter produktet krystalliserte ut fra filtratet.

Utbytte: 65 mg.

MS-ESI: [M+H]<+> = 343,2.

TLC: Rf = 0,52, silikagel, diklormetan.

(b>. Etvl- 5- amino- 7- meM- 2- metvltio- 4- fenvl- pvrrolor2. 3-(/ 1pvrimidin- 6- karboksvlat

Natriumetoksyd (1,4N, 52 ul) ble satt til en omrørt løsning av 5-cyano-6-(etoksykarbonylmetyl)(metyl)amino-2-metyltio-4-fenylpyrimidin i tørr etanol (1 ml). Etter 3 timer ved 60°C ble blandingen avkjølt til 0°C i et isbad, og de faste stoffene ble oppsamlet ved filtrering og tørket i vakuum.

Utbytte: 40 mg

MS-ESI: [M+H]<+> = 343,2.

TLC: Rf = 0,53, silikagel, diklormetan.

Eksempel 47

Etvl- 5- amino- 7- benzvl- 2- meMtio- 4- fenvl- pvrrolor2, 3- c/ lpvrimidin- 6- karboksvlat Kondensering av 6-klor-5-cyano-2-metyltio-4-fenylpyrimidin (100 mg) med etyl-N-benzylglycinat (0,45 ml), og etterfølgende cyklisering av renset 5-cyano-6-7V-(Etyl-Af-benzylglycinat)-2-metyltio-4-fenylaminopyrimidin (kromatografert på silikagel med heptan/diklormetan = 1/3 (volum/volum) => 1/0 (volum/volum)) til sluttproduktet ble utført i henhold til metodene beskrevet i eksempel 46.

Utbytte: 75 mg.

MS-ESI: [M+H]<+> = 419,2.

TLC: Rf = 0,78, silikagel, diklormetan.

Eksempel 48

Etvl- 5- amino- 4-( 3-/ 7- butoksvfenvl)- 2- metvltio- tienor2, 3-(/ lpvirmidin- 6- karboksvlat

(a). 3- M- Butoksvbenzaldehvd

Dietyl-azodikarboksylat (3,31 ml) ble satt dråpevis til en avkjølt (0°C) løsning av 3-hydroksybenzaldehyd (2,44 g), w-butanol (1,83 ml) og trifenylfosfin (5,51 g) i tetrahydrofuran. Etter røring ved romtemperatur i 4 timer ble en løsning av 2N natriumhydroksyd (150 ml) tilsatt og røring fortsatte i 20 min. Reaksjonsblandingen ble ekstrahert med diklormetan (150 ml). Det organiske sjiktet ble vasket med vann, 1% sitronsyre, vann og saltvann, tørket over natriumsulfat og inndampet i vakuum. Til råproduktet sattes etylacetat (3 x 25 ml), og de faste stoffene ble fjernet ved filtrering. Residuet ble kromatografert på silikagel med heptan/etylacetat = 100/0 (volum/volum) => 60/40 (volum/volum) som elueringsmiddel.

Utbytte: 1,64 g.

MS-ESI: [M+H]<+=> 179,2.

TLC: Rf = 0,80, silikagel, heptan/etylacetat = 1/1 volum/volum.

(b). Etvl- 5- amino- 4-( 3-/ 7- butoksvfenvn- 2- metvltio- tienor2, 3- c/ 1pvrimidin- 6- karboksylat Cyklisering av S-metylisotioureasulfat (139 mg), 3-w-butoksybenzaldehyd (357 mg) og etyl-cyanoacetat (112 ul), behandling av produktet med POCI3 og etterfølgende omsetning med etyl-2-merkaptoacetat ble utført i henhold til metodene beskrevet i eksempel 1. Tittelforbindelsen ble renset ved kromathografi on silikagel i heptan/etylacetat = 100/0 (volum/volum) => 80/20 (volum/volum) som elueringsmiddel og krystallisasjon fra etanol.

Utbytte: 78 mg.

MS-ESI: [M+H]<+> = 418,0.

TLC: Rf = 0,61, silikagel, diklormetan.

Eksempel 49

Etvl- 4-( 3- r2- acetoksvetoksvlfenvl)- 5- amino- 2- metvltio- tienor2, 3- c/ 1pvrimidin- 6-karboksvlat

(a) . 3-( 2- Acetoksvetoksv) benzaldehvd

En katalytisk mengde av AyV-dimelylaminopyridin ble satt til en omrørt løsning av 3-(2-hydroksyetoksy)benzaldehyd (1,66 g) i eddiksyreanhydrid (9 ml) og pyridin (3 ml). Etter 2 timer ble reaksjonsblandingen inndampet i vakuum, residuet ble oppløst i etylacetat og vasket med 0,5N saltsyre, vann, 5% natriumbikarbonat, vann og saltvann, tørket over natriumsulfat og inndampet til tørrhet.

Utbytte: 2,16 g.

MS-ESI: [M+H]<+> = 209,2.

TLC: Rf = 0,60, silikagel, heptan/etylacetat = 1/1 volum/volum.

(b) . Etvl- 4-( 3- r2- acetoksvetoksvlfenvl)- 5- amino- 2- metyltio- tienor2. 3- c/ l- pyrimidin- 6-karboksvlat

Cyklisering av S-metylisotioureasulfat (139 mg), 3-(2-acetoksyetoksy)benzaldehyd (357 mg) og etyl-cyanoacetat (112 ul), behandling av produktet med POCI3 og etterfølgende omsetning med etyl-2-merkaptoacetat ble utført i henhold til metodene beskrevet i eksempel 1. Reacetylering av råproduktet (eddiksyreanhydrid/pyridin = 3/1 (volum/volum), 4 h), inndamping av blandingen og etterfølgende rensning ved kromatografi på silikagel med diklormetan ga tittelforbindelsen.

Utbytte: 6,0 mg.

MS-ESI: [M+H]<+> = 448,5.

TLC: Rf = 0,66, silikagel, diklormetan/metanol = 98/2 volum/volum.

Eksempel 50

Etvl- 5- amino- 2- metvltio- 4-( 3- »- oktyloksvfenvl)- tienor2, 3-(/ lpvrimidin- 6- karboksvlat

(a) . 3-( ft- Oktvloksy) benzaldehvd

3-Hydroksybenzaldehyd (977 mg), 1-kloroktan (1,35 ml) og cesiumkarbonat (3,9 g) ble rørt i dioksan ved 80°C. Etter 60 timer ble reaksjonsblandingen avkjølt til romtemperatur, de faste stoffene ble fjernet ved filtrering og vasket med diklormetan. De samlede filtrater ble inndampet i vakuum, oppløst i etylacetat og vasket med vann og saltvann, tørket over natriumsulfat, inndampet til tørrhet og renset ved kromatografi på silikagel med diklormetan/metanol = 100/0 (volum/volum) => 98/2 (volum/volum).

Utbytte: 338 mg.

MS-ESI: [M+H]<+> =235,2.

TLC: Rf = 0,95, silikagel, diklormetan/metanol = 95/5 volum/volum.

(b) . Etvl- 5- amino- 2- metvltio- 4-( 3-/ 7- oktvloksvfenyl)- tienor2, 3- cfl- pyrimidin- 6-karboksvlat

Cyklisering av S-metylisotioureasulfat (139 mg), 3-w-oktyloksybenzaldehyd (338 mg) og etyl-cyanoacetat (112 ul), behandling av produktet med POCI3 og etterfølgende omsetning med etyl-2-merkaptoacetat ble utført i henhold til metodene beskrevet i eksempel 1. Den rene tittelforbindelse ble oppnådd etter kromatografi på silikagel med diklormetan/metanol = 100/0 (volum/volum) => 90/10 (volum/volum) som elueringsmiddel.

Utbytte: 12 mg.

MS-ESI: [M+H]<+> = 474,2.

TLC: Rf = 0,65, silikagel, diklormetan.

Eksempel 51

Etyl- 5- amino- 4-( 3- r2- Ar- benzovlaminoetoksvlfenvl)- 2- metvh^ karboksvlat

Cyklisering av S-metylisotioureasulfat (278 mg), 3-( 2- N-benzoylaminoetoksy)benzaldehyd (538 mg, syntetisert fra 3-hydroksybenzaldehyd (977 mg) og 7V-(2-kloretyl)benzamid (1,47 g) ved metoden beskrevet i eksempel 50a) og etyl-cyanoacetat (224 ul), behandling av produktet med POCI3 og etterfølgende omsetning med etyl-2-merkaptoacetat ble utført i henhold til metodene beskrevet i eksempel 1. Den rene tittelforbindelse ble oppnådd etter kromatografi på silikagel med diklormetan/etylacetat = 100/0 (volum/volum) => 80/20 (volum/volum) som elueringsmiddel.

Utbytte: 3,9 mg.

MS-ESI: [M+H]<+> = 509,2.

TLC: Rf = 0,68, silikagel, diklormetan/metanol = 95/5 volum/volum.

Eksempel 52

Etvl- 5- amino- 2- metvltio- 4-( 3- r2- 7V- morfolinoetoksv1fenvl)- tienor2, 3- c/ 1pvrimidin- 6-karboksvlat

Cyklisering av S-metylisotioureasulfat (209 mg), 3-(2-A^-morfolinoetoksybenzaldehyd (705 mg, syntetisert fra 3-hydroksybenzaldehyd (1,17 g) og N-(2-kloretyi)morfolin (1,44

g) ved metoden beskrevet i eksempel 50a) og etyl-cyanoacetat (168 ul), behandling av produktet med POCI3 og etterfølgende omsetning med etyl-2-merkaptoacetat ble utført i

henhold til metodene beskrevet i eksempel 1.

Utbytte: 35,2 mg.

MS-ESI: [M+H]<+> = 475,2.

TLC: Rf = 0,55, silikagel, diklormetan/metanol = 95/5 volum/volum.

Eksempel 53

?er?- Butvl- 3- amino- 6- metvltio- 4-( 3- metoksvfenvl)- tienor2, 3- 61pvridin- 2- karboksamid

( a). 1, 1 - Dicvano- 2- metvl- 2-( 3- metoksvfenyl)- eten

En løsning av 3'-metoksy-acetofenon (3,46 g) og malonitril (6,89 ml) i benzen (40 ml) ble behandlet med AcOH (2,30 ml) og ammoniumacetat (1,50 g), og reaksjonsblandingen ble oppvarmet under azeotrop destillation i et Dean-Stark apparat. Etter 5 timer ble reaksjonsblandingen avkjølt til omgivelsestemperatur, fortynnet med EtOAc, vasket med vann og saltvann, tørket (MgSCU) og inndampet i vakuum. Residuet ble renset ved silikagel flashkromatografi ved anvendelse av EtOAc/heptan (3/7 volum/volum) som elueringsmiddel. Utbytte: 6,4 g.

MS-ESI: [M+H]<+=> 199,2.

TLC: Rf = 0,6, silikagel, EtOAc/heptan 2/3 volum/volum.

( b) . 1. 1 - Di-( metvltioV3-( 3- metoksvfenylV4. 4- dicvano- butadien

l,l-Dicyano-2-metyl-2-(3-metoksyfenyl)-eten (eksempel 53a, 6,4 g), karbondisulfid (3,85 ml) og metyljodid (9,9 ml) ble satt til en forut fremstilt suspensjon av natriumhydrid (60% dispersjon i mineralolje, 1,60 g) i DMF (200 ml). Etter 7 timer ble reaksjonsblandingen inndampet under redusert trykk, gjenoppløst i EtOAc, vasket med vann og saltvann, tørket (MgSC^) og inndampet i vakuum. Residuet ble renset ved anvendelse av silikagel kromatografi (elueringsmiddel: EtOAc/heptan 3/7 volum/volum). Utbytte: 3,92 g.

MS-ESI: [M+H]<+> = 303,1.

TLC: Rf = 0,5, silikagel, EtOAc/heptan 2/3 volum/volum.

( c) . 2- Metvltio- 4-( 3- metoksvfenvl)- 5- cyano- pvridin- 6- on

En løsning av l,l-di-(metyltio)-3-(3-metoksyfenyl)-4,4-dicyano-butadien (eksempel 53b, 3,92 g) i EtOH (50 ml) ble behandlet med 48% vandig HBr (39 ml), og løsningen ble oppvarmet under tilbakeløp i 3 timer. Etter avkjøling av reaksjonsblandingen i et isbad (0 °C) ble fellingen filtrert fra, vasket med vann og tørket under vakuum.

Utbytte: 2,4 g.

MS-ESI: [M+H]<+> = 273,2.

TLC: Rf = 0,47, silikagel, CH2Cl2/MeOH 9/1 volum/volum.

( d) . fer(- Butvl- 3- amino- 6- metvltio- 4-( 3- metoksvfenyl)- tienor2, 3- 61pvridin- 2-karboksamid

Behandling av 2-metyltio-4-(3-metoksyfenyl)-5-cyano-pyridin-6-on (2,4 g, eksempel 53c) med POCb og etterfølgende omsetning med etyl-2-merkaptoacetat ble utført i henhold til metodene beskrevet i eksempel 1. Den resulterende derivat etyl-3-amino-4-(3-metoksyfenyl)-6-metyltio-tieno[2,3-6]pyrimidin-2-karboksylat (2,6 g) ble først hydrolysert til den tilsvarende syre (2,2 g) ved anvendelse av metoden beskrevet i eksempel 17 og deretter omsatt med tert-butyl amin (2 ml) for å gi de tilsvarende amid i henhold til eksempel 31. Tittelforbindelsen ble renset ved kromatografi på silikagel med heptan/EtOAc = 3/1 (volum/volum) som elueringsmiddel.

Utbytte: 2,11 g.

MS-ESI: [M+H]<+> = 402,3.

TLC: Rf = 0,37, silikagel, heptan/EtOAc = 3/2 (volum/volum).

Eksempel 54

fert- Butvl- 5 - amino- 2- metyltio- 4-( 7V- benzovl- 3 - aminofenvQ- tieno \ 2 , 3 - c/ 1pvrimidin- 6-karboksamid

(a) . Etyl- 5- amino- 2- meMtio- 4-( 3- nitrofenvlVtienor2, 3- c/ 1- pvrirnidin- 6- karboksylat

Cyklisering av S-metylisotioureasulfat (700 mg), 3-nitrobenzaldehyd (750 mg) og etyl-cyanoacetat (560 ul), behandling av produktet med POCI3 og etterfølgende omsetning med etyl-2-merkaptoacetat ble utført i henhold til metodene beskrevet i eksempel 1. Den rene tittelforbindelse ble oppnådd etter kromatografi på silikagel med heptan/EtOAc = 3/2 (volum/volum) som elueringsmiddel.

Utbytte: 780 mg.

MS-ESI: [M+Hf = 391,3.

TLC: Rf = 0,35, silikagel, heptan/EtOAc = 3/2 (volum/volum).

(b) . fert- Butvl- 5- amino- 2- metvltio- 4-( 3- aminofenvl)- tieno[ 2, 3- cf1- pvrimidin- 6-karboksamid

Etyl-5-amino-2-metyltio-4-(3-nitrofenyl)-tieno[2,3-£/]-pyirmidin-6-karboksylat

(eksempel 54a, 780 mg) ble oppløst i 10 ml dioksan. Deretter ble 10 ml EtOH og tinn(H)klorid (1,1 g) tilsatt, og reaksjonsblandingen ble rørt natten over ved 90 °C. Etter inndamping av reaksjonsblandingen i vakuum ble residuet gjenoppløst i EtOAc (50 ml) og vasket med 10 ml 4 M NaOH, tørket (MgSO^ og indampet under redusert trykk. Etylesteren i det resulterende derivat etyl-5-amino-2-metyltio-4-(3-aminofenyl)-tieno[2,3-£/]-pyrimidin-6-karboksylat (558 mg) ble forsåpet til den tilsvarende syre (430 mg) ved anvendelse av metoden beskrevet i eksempel 17 og deretter omsatt med tert-butyl amin (200 ul) for å gi det tilsvarende tert-butylamid (i henhold til eksempel 31). Tittelforbindelsen ble renset ved kromatografi på silikagel med heptan/EtOAc = 3/1 (volum/volum) som elueringsmiddel.

Utbytte: 391 mg.

MS-ESI: [M+Hf = 388,0.

TLC: Rf = 0,43, silikagel, heptan/EtOAc = 3/2 (volum/volum).

(c) fert- Butvl- 5 - amino- 2- metyltio- 4-( A^- benzoyl- 3 - aminofenvD- tieno \ 2 , 3 - c/ lpyrimidin- 6-karboksamid

tert-Butyl-5 -amino-2-metyltio-4-(3 -aminofenyi)-tieno [ 2, 3- d] -pyrimidin-6-karboksamid (eksempel 54b, 391 mg) ble oppløst i 10 ml CH2C12. Deretter ble N, N-diisopropyletylamin (600 ul) og benzoylklorid (210 mg) tilsatt, og reaksjonsblandingen ble rørt i 2 timer. Reaksjonsblandingen ble fortynnet med CH2C12 (50 ml) og vasket med mettet vandig NaHCC*3. Det organiske sjiktet ble tørket (MgSC^) og inndampet under redusert trykk. Tittelforbindelsen ble renset ved kromatografi på silikagel med heptan/EtOAc = 3/1 (volum/volum) som elueringsmiddel.

Utbytte: 348 mg.

MS-ESI: [M+H]<+> = 492,1.

TLC: Rf = 0,50, silikagel, heptan/EtOAc = 3/2 (volum/volum).

Eksempel 55

te^ Butvl- 5- amino- 2- metyltio- 4-( 3- metoksvfenvD- tienor2, 3-(/ 1pwimidin- 6- karboksamid Etyl-5-amino-4-(3-metoksyfenyl)-2-metyltio-tieno[2,3-£/]pyrimidin-6-karboksylat (se eksempel 1, 400 mg) ble først hydrolysert til den tilsvarende syre (340 mg) ved anvendelse av metoden beskrevet i eksempel 17 og deretter omsatt med terr-butylamin (150 ul), hvilket ga det tilsvarende amid i henhold til eksempel 31. Tittelforbindelsen ble renset ved kromatografi på silikagel med heptan/EtOAc = 3/1 (volum/volum) som elueringsmiddel.

Utbytte: 310 mg.

MS-ESI: [M+Hf = 403,0.

TLC: Rf = 0,32, silikagel, heptan/EtOAc = 3/2 (volum/volum).

Eksempel 57

fert- Butvl- 5 - amino- 2- metvltio- 4-( 3 -( 3 -( 3 - pvridvl)- propoksv)- fenyl)- tieno [ 2, 3-c/ lpvrimidin- 6- karboksamid

te^Butyl-5-amino-2-me1yltio-4-(3-metoksyfenyl)-tieno[2,3-£/]pyrimidin-6-karboksamid (400 mg, eksempel 55) ble oppløst i avkjølt (0 °C) CH2C12 (10 ml) og BBr3 (300 ul) ble tilsatt dråpevis. Etter omrøring natten over ved romtemperatur ble reaksjonsblandingen fortynnet med CH2C12 (50 ml) og vasket med mettet vandig NaHCC«3. Det organiske sjiktet ble tørket (MgSC^) og inndampet til nær tørrhet. Den gjenværende oljen ble satt dråpevis til en kolbe med omrørt toluen (50 ml). Det således oppnådde presipitat (360 mg) inneholdende tert-butyl-5 -amino-2 -metyltio-4-(3 -hydroksyfenyl)-tieno [2,3-c^pyrimidin-6-karboksamid ble filtrert fra og tørket i vakuum. Det sistnevnte derivat ble oppløst i THF (10 ml) og PPh3 (600 mg), 3-(3-pyridyl)-propanol (270 mg) og

azodikarbonyldipiperidin (ADDP, 600 mg) ble tilsatt. Etter omrøring natten over ble reaksjonsblandingen fortynnet med CH2CI2 (50 ml), vasket med mettet vandig NaHCC«3, tørket (MgS04) og renset ved silikagelkromatografi (elueringsmiddel: CI^Cb/MeOH = 1/0 til 95/5 (volum/volum)).

Utbytte: 271 mg.

MS-ESI: [M+H]<+> = 508,2.

TLC: Rf = 0,56, silikagel, CH2Cl2/MeOH = 96/4 (volum/volum).

Eksempel 58

In vitro test for LH- bioaktivitet i muse- Levdig- celler

I hannmus fremkaller det luteiniserende hormon (LH) testosteronproduksjon i testikkel-Leydig-celler. Denne aktivitet vises også ved humant chorionisk gonadotrofin (hCG) som binder til samme målcelle-reseptor som LH. ln vitro Leydig-celle-måling (van Damme et al, 1974; modifisert av Mannaerts et al, 1987) blir anvendt for å bestemme LH-bioaktiviteten til forbindelser som binder til Leydig-celle-LH-reseptoren som igjen forårsaker testosteron-produksj on.

For denne måling blir Leydig celler isolert fra testenes fra voksne, 9 til 13 uker gamle mus (stamme: HSD/Cpb: SE, Harlan, Holland). Derfor blir mus avlivet og testenes blir raskt fjernet og avkapslet. Hver testikkel blir overført til en separat brønn i en vevskulturplate inneholdende 0,75 ml dyrkningsmedium pr. brønn. Innholdet av hver brønn blir ført gjennom et 30 cm glassrør (innside-diameter 2,5 mm, innsnevret til 1,2 mm på 4 steder i midten). Suspensjonen som oppnås blir filtrert gjennom en 30 um nylonduk, og filtratet blir pre-inkubert i et 50 ml plastrør i 30 min. ved 37 °C i en inkubator i en vann-mettet atmosfære av 95% luft / 5% C02. Etter pre-inkubering blir røret sentrifugert ved 1600 N/kg i 5 min., og supernatanten blir dekantert. Den resulterende pellet blir resuspendert i dyrkningsmedium (0,5 mg opprinnelig testikkel/ml), og suspensjonen blir holdt homogen ved å røre den meget langsomt på en magnetrører.

Denne Leydig-cellesuspensjon (100 (il) blir satt til brønnene i en mikrotiterplate inneholdende 50 ul referanseforbindelse, testforbindelse eller konstituent (dyrkningsmedium) pr. brønn. Som en referanse blir LH- eller hCG-in-house-standarder anvendt som er kalibrert mot internasjonal referansepreparater av humant LH eller hCG gitt av the National Institute of Biological Standards and Controls (NIBSC, London, UK). Test- og referanseforbindelser oppløses, fortynnes og måles i samme dyrkningsmedium. Platene inneholdende referanse- og testforbindelser blir inkubert i 4 timer ved 37 °C i en inkubator i en vann-mettet atmosfære av 95% luft / 5% CO2. Etter inkubering blir plater forseglet og lagret ved -20 °C inntil testosteron-målingen.

Før testosteron-måling tines innholdet av mikrotiter-platene ved romtemperatur, og platene blir sentrifugert ved 150 N/kg i 5 min. En alikvot av 30 ul supernatant fra hver brønn blir fortynnet med dyrkningsmedium (60x) for å oppnå en egnet fortynning for testosteron-måling. Alikvoter (12,5 (il) av hver fortynnet testprøve blir deretter målt ved anvendelse av etn direkte testosteron-RIA-sett. Resultater er vist i Tabel 1.

Eksempel 59

In vivo eggløsningsinduksjonsmåling for LH bioaktivitet hos umodne hunnmus

Hos umodne hunnmus som blir stimulert med follikkelstimulerende hormon (FSH), kan eggløsning fremkalles ved luteininserende hormon (LH) eller med humant chorionisk gonadotrofin (hCG) som binder til samme LH-reseptor på Graafian-folliklene. Binding til LH-reseptoren initierer en biokjemisk kaskade, som til slutt resulterer i follikulært brudd og ekstrusjon av en moden oocyte. For å måle in vivo aktiviteten til LH-agonist-forbindelser blir umodne 20 dager gamle mus (B6D2F1 stramme, Broekman Institute, Holland) primet med urin-FSH (Humegon; 12,5 IU/1, 0,1 ml s.c.) for å initiere folliculogenese. Førti-åtte timer etter FSH-behandling blir testforbindelse, referanse-forbindelse eller konstituent (10% cremophor-løsning) administrert til dyrene. Testforbindelser (50 mg/kg i 0,1 ml) og konstituent (0,1 ml) blir administrert p.o., referanse-forbindelser (500 IU /kg hCG i 0,1 ml) blir injisert s.c. Som en referanse blir hCG-in-house-standarder anvendt som er kalibrert mot internasjonale referanse preparater av humant hCG gitt av the National Institute of Biological Standards and Controls (NIBSC, London, UK). Tjuefire timer etter administrering av testforbindelse, referanse-forbindelse eller konstituent, blir dyr avlivet med halsdislokasjon. Egglederne blir dissekert og oppsamlet i 0,9% NaCl. Dernest blir egglederne blir plassert mellom to glassplater og undersøkt for nærvær eller fravær av ovulerte egg under et mikroskop. Antallet ovulerte egg til stede i egglederne er indikative for in vivo LH-bioaktivitet. Resultater er gitt i Tabell 1.

Claims

1. Bicyklisk heteroaromatisk forbindelse i henhold til den generelle formel II eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, hvori R<1> er (6-14C)aryl eventuelt substituert i orto og/eller meta stilling med én eller flere substituenter valgt fra NHR<8>, OR<8> hvor R<8> er (6-14C)arylkarbonyl eller (1-8C)alkyl, hvor alkylgruppen eventuelt kan være substituert med én eller flere substituenter valgt fra (6-14C)aryl, (l-8C)alkylkarbonyloksy, (6-14C)arylkarbonylamino, morfolinyl eller pyridyl eller R<1> er tienyl, furyl eller pyridyl; R<2> er (l-8C)alkyl, eventuelt substituert med én eller flere substituenter valgt fra (6-14C)aryl eller (l-8C)alkoksykarbonyl; R<3> er (l-8C)alkyl, eventuelt substituert med én eller flere substituenter valgt fra (l-8C)alkoksy, (6-14C)aryl(l-8C)alkoksy, tienyl, pyrolidino, (6-14C)aryl, (1-8C)alkoksykarbonyl eller R<3> er (3-8C)cykloalkyl eller (6-14C)aryl begge eventuelt substituert med én eller flere substituenter valgt fira (l-8C)alkoksy; BerN(H), Oog Y = CH eller N, med det forbehold at forbindelsen ikke er metyl-5-amino-4-fenyl-2-metyltio-tieno[2,3-</]pyrimidin-6-karboksylat, etyl-5-amino-4-fenyl-2-metyltio-tieno[2,3-</]pyrimidin-6-karboksylat, metyl 5-amino-4-(4-metoksyfenyl)-2-metyltio-tieno[2,3-c/]pyrimidin-6-karboksylat, etyl 5-amino-4-(4-metoksyfenyl)-2-metyltio-tieno [2,3 -cf]pyrimidin-6-karboksylat.

2. Forbindelse ifølge krav 1 hvori B er N(H).

3. Forbindelse ifølge krav enel-2 hvori R<3> er isopropyl eller tert-butyl.

4. Forbindelse ifølge kravene 1-3 hvori Y = N.

5. Forbindelse ifølge kravene 1-4 hvori R<2> = (l-4C)alkyl.

6. Farmasøytisk preparat omfattende en bicyklisk heteroaromatisk forbindelse ifølge kravene 1-5 eller et farmasøytisk akseptabelt salt eller solvat derav i blanding med et farmasøytisk akseptabelt hjelpemiddel.

7. Anvendelse av bicykliske heteroaromatiske forbindelser i henhold til hvert av kravene 1-5 eller et farmasøytisk akseptabelt salt eller solvat derav for fremstilling av et medikament for kontroll av fertilitet