NO328768B1 - Pigmentholdig substans for fôrtilsetningsstoffer. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en pigmentholdig substans for for-tilsetningstoffer.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig en pigmentholdig substans for fortilsetningsstoffer, kjennetegnet ved at den omfatter et bakteriekultur-prespitat som inneholder minst 3 masse% karotenoidforbindelser, idet minst 40 masse % er astaxantin.

«Karotenoidforbindelser» er et generisk navn på en gruppe pigmenter som har langkjedet polyenstruktur, hvorav hovedandelen har et C40-tetraterpenoid og viser gul, oransje, rød eller purpur-farge. Mer spesifikt angir det forbindelsene så som (3-karoten, astaxantin, canthaxantin, zeaxantin, echinenon, adonirubin og adonixantin. Disse forbindelser kan anvendes som naturlige pigmenter som er nyttige som fortilsetningsstoffer, matvaretilsetningsstoffer, farmasøytiske preparater osv. For eksempel er astaxantin verdifull ut fra et industri-synspunkt som fortilsetningsstoff så som som fargeforbedrende middel for oppdrettsfisk så som laks, ørret, rød flekkpagell osv., og dessuten som et trygt naturlig matvaretilsetningsstoff. Adinoxantin er like lovende som astaxantin som fortilsetningsstoff, matvaretilsetningsstoff og farmasøytisk preparat, hvis det kan etableres en industriell produksjonsprosess for det. Canthaxantin er blitt anvendt som fortilsetningsstoff, matvaretilsetningsstoff, kosmetisk middel osv., og zeaxantin er blitt anvendt som et fortilsetningsstoff og matvaretilsetningsstoff. Videre er det ventet at echinenon og adonirubin også kan anvendes som fortilsetningsstoffer, matvaretilsetningsstoffer osv. Som produksjonsprosesser for disse karotenoidforbindelser er det kjent kjemisk syntese, produksjon ved hjelp av mikroorganismer, ekstraksjon fra naturlige produkter osv., og når det gjelder astaxantin og canthaxantin, er deres kjemiske synteseprodukter allerede i salg. Sammenliknet med kjemisk syntese er produksjonsprosessen for karotenoid-forbindelser med mikroorganismer fordelaktig på grunn av det høye sikkerhetsnivå, siden det verken anvendes metallkatalysatorer eller løsningsmidler i dem. Vanligvis er karotenoidforbindelser ustabile i nærvær av oksygen og lys. Siden karotenoidforbindelser dannet av mikroorganismer opphopes inne i cellen hos en mikroorganisme, sikres imidlertid deres stabilitet av cellemembranen, celleveggen og andre antioksidanter. Når karotenoid-forbindelser anvendes som fortilsetningsstoffer eller liknende, er det fordelaktig med et høyt nivå av lagringsstabilitet, og hvis selve mikroorganismen kan anvendes, vil dette være en

stor fordel. Hvis derimot intercellulære karotenoid-forbindelser anvendes etter at de er blitt ekstrahert og renset, er det nødvendig å anvende klorholdige løsningsmidler eller liknende, noe som kan være utrygt. Følgelig er anvendelse av et utfelt mikroorganismekultur-materiale bestående av en mikroorganisme som inneholder karotenoidforbindelser som fortilsetningsstoff, meget fordelaktig. I det tilfelle hvor mikroorganismen som danner karotenoidforbindelser, har en hard cellevegg, er absorpsjonseffektiviteten særdeles lav hvis det er tilveiebrakt en naturlig celle. Følgelig bør cellen sprenges mekanisk eller dekomponeres med kjemiske midler eller enzymer, og dette fører til en kostnadsulempe. Det er dessuten et problem at stabiliteten av karotenoidforbindelser reduseres etter at cellen er sprengt. Når dessuten innholdet av karotenoidforbindelser som finnes i et utfelt mikroorganismekultur-materiale, er lavt, er det nødvendig med en stor mengde utfelt materiale i produksjonsprosessen for foret, og dette forårsaker andre problemer så som dårlig opererbarhet, høye transportomkostninger og næringsmiddel-ubalanse i foret. Det er imidlertid ikke kjent noen pigmentholdig substans bestående av en mikroorganisme hvis mangel på hard cellevegg muliggjør lettvint anvendelse av de opphopede karotenoidforbindelser; og som videre består av et utfelt mikroorganismekultur-materiale som inneholder minst 3 masse% karotenoidforbindelser.

WO 9320183A1 beskriver en pigment-inneholdende substans omfattende sopp inneholdende minst 17,4% B-karoten.

JP 09308481A beskriver fremstilling av astaxantin for anvendelse som fortilsetningsmiddel fra E-396 bakteriestamme.

Blant karotenoidforbindelser er astaxantin et rødt pigment som finnes i fisker så som laks, ørret, rød flekkpagell osv., og krepsdyr så som reker, krabber osv., og det er nyttig på grunn av sin vakre farge, og som angitt ovenfor, er det blitt anvendt i stor utstrekning som fortilsetningsstoff og naturlig matvaretilsetningsstoff. Når det gjelder den røde gjærsopp Phaffia rhodozyma, som er kjent for å danne astaxantin, er det et problem at, siden den er en gjærsopp, har den hard cellevegg. Som fremgangsmåter for fremstilling av astaxantin ved hjelp av bakterier er følgende kjent, men for hver av dem er innholdet på vektbasis, basert på tørre celler, lav: en bakteriestamme Brevibacterium nr. 103 som hører til slekten Brevibacterium, danner bare 0,003% astaxantin pr. tørrcelle-vekt ( Journal of General and Applied Microbiology, 15,127,1969). En annen bakteriestamme Partacoccus marcusii DSM11574, som hører til slekten Paracoccus, danner bare 0. 022. astaxantin på tørrcellevekt-basis (WO 99/6586).

Formålet med foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en pigmentholdig substans for fortilsetningsstoffer bestående av et utfelt mikroorganismekultur-materiale som inneholder en høy konsentrasjon av karotenoidforbindelser som er nyttige som naturlig pigment.

For oppnåelse av ovennevnte formål tilveiebringer foreliggende oppfinnelse følgende hjelpemidler. 1. En pigmentholdig substans for fortilsetningsstoffer, kjennetegnet ved at den omfatter et bakteriekultur-prespitat som inneholder minst 3 masse% karotenoidforbindelser, idet minst 40 masse % er astaxantin. 2. Den pigmentholdige substans for fortilsetningsstoffer ifølge krav 1, kjennetegnet ved at en DNA-nukleotidsekvens svarende til 16S ribosomal-RNA bakterien i bakteriekultur-prespitatet har minst 98% homologi med nukleotidsekvensen vist i SEKV ID NR: 1. 3. Den pigmentholdige substans for fortilsetningsstoffer ifølge krav 3, kjennetegnet ved at bakterien i bakteriekultur-prespitatet er E-396-stamme eller en mutant derav.

Foreliggende oppfinnelse er beskrevet mer spesifikt som følger.

Den pigmentholdige substans for fortilsetningsstoffer ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter et utfelt mikroorganismekultur-materiale. For det første er det utfelte mikroorganismekultur-materiale beskrevet. Det utfelte mikroorganismekultur-materiale som er beskrevet kan oppnås ved hjelp av en fremgangsmåte hvor hovedsakelig cellen av mikroorganismen som danner karotenoidforbindelser, dyrkes under dannelse av disse forbindelser, og den resulterende kultur behandles ved filtrering, sentrifugering osv., fulgt av fjerning av en viss mengde fuktighet. Hvilken som helst metode for dyrking av en stamme som danner karotenoidforbindelser, kan anvendes på den betingelse at det dannes karotenoidforbindelser. For eksempel kan følgende metode tilpasses. Som medium anvendes ett som inneholder følgende: karbonkilder, nitrogenkilder, uorganisk salt, som er nødvendig for vekst av bakterier som danner karotenoid-forbindelser, og spesielt fordrede substanse (f.eks. vitaminer, aminosyrer, nukleinsyrebaser osv.) etter som det er behov for dette. Karbonkildene som anvendes, innbefatter karbohydrat så som glukose, sakkarose, fruktose, trehalose, mannose, mannitol og maltose: organiske syrer så som eddiksyre, fumarsyre, citronsyre, propionsyre, eplesyre og malonsyre; alkoholer så som etanol, propanol, butanol, pentanol, heksanol og isobutanol; og liknende. Andelen av tilsatte karbonkilder avhenger av typen av karbonkilder, men vanligvis tilføres 1-100 g pr. liter medium, fortrinnsvis 2-50 g. Nitrogenkildene som anvendes, innbefatter én eller flere valgt blant kaliumnitrat, ammoniumnitrat, ammonium-klorid, ammoniumsulfat, diammoniumhydrogenfosfat, ammoniakk, urea og liknende. Andelen av tilsatte nitrogenkilder avhenger av typen nitrogenkilder, men vanligvis tilføres 0,1-10 g pr. liter medium, fortrinnsvis 1-3 g. Det uorganiske salt som anvendes, innbefatter ett eller flere valgt blant kaliumdihydrogenfosfat, dikaliumhydrogenfosfat, dinatriumfosfat, magnesiumsulfat, magnesiumklorid, jern(ll)sulfat, jern(ll)klorid, manganosulfat, manganoklorid, sinksulfat, sinkklorid, kobber(ll)sulfat, kalsiumklorid, kalsiumkarbonat, natrium karbonat og liknende. Andelen av tilsatte uorganiske salter avhenger av typen uorganisk salt, men vanligvis tilføres fra 0,001 til 10 g pr. liter medium. De spesielt fordrede substanser som anvendes, innbefatter én eller flere valgt blant vitaminer, nukleinsyrer, gjærekstrakt, pepton, kjøttekstrakt, maltekstrakt, maisuttrekksvæske, tørr gjær, soyakake, soyaolje, olivenolje, maisolje, linfrøolje og liknende. Andelen av tilsatte spesielt fordrede substanser avhenger av typen substanser, men vanligvis tilføres fra 1 til 200 g pr. liter medium, fortrinnsvis 10-100 g. pH i mediet er 2-12, og det justeres fortrinnsvis til 6-10. Som dyrkningsbetingelser utføres en ristekultur eller en gjennomluftings-agitasjonskultur ved 15-80°C, fortrinnsvis ved 20-35°C, vanligvis i 1 -20 dager, fortrinnsvis i 2-8 dager.

Deretter fjernes fuktighet fra kulturen oppnådd ved hjelp av ovennevnte metode. Mengden fuktighet fjernet for oppnåelse av den pigmentholdige substans for fortilsetningsstoffer ifølge foreliggende oppfinnelse avhenger av dyrkings-mediets tilstand (f.eks. pigmentinnhold), men som en generell prosess utføres det først filtrering, og hvis det er behov for ytterligere fjerning av fuktighet, følger tørking av det utfelte materiale. Filtreringsmetodene innbefatter vanlig filtrering, sentrifugering og liknende. Siden det oppnådde utfellingsprodukt inneholder vann og utfelt materiale omfattende oppløste medium-bestanddeler så som salt og karbohydrat, er det effektivt at vann tilsettes til utfellingsproduktet som er fjernet fra dyrkningsmediet, dette oppslemmes, og deretter separeres utfellingsproduktet igjen, slik at mengden av karotenoidforbindelser i dette øker. Ved denne metode kan medium-bestanddelene som er oppløst i vann, fjernes i en viss grad. I det tilfelle hvor mengden av karotenoidforbindelser bør økes, er det mulig å anvende en metode for fjerning av fuktighet ved tørking av utfellingsproduktet. Metodene for tørking av utfellingsproduktet innbefatter vanlig sprøytetørking, trommeltørking, frysetørking og liknende.

Det utfelte mikroorganismekultur-materiale oppnådd ved hjelp av ovennevnte metode kan anvendes med hell som pigmentholdig substans. For det formål å forhindre dekomponering av karotenoidforbindelser kan det tilsettes antioksidanter så som BHT (butylert hydroksytoluen), etoksyquin og vitamin E til det utfelte kulturmateriale. Videre kan overflaten av mikroorganismen dekkes med gelatin eller liknende.

Mikroorganismen som anvendes for foreliggende oppfinnelse, vil nå bli beskrevet. Mikroorganismen som anvendes for foreliggende oppfinnelse, er ikke spesifikt begrenset så lenge den kan danne karotenoidforbindelser ved dyrking av mikroorganismer så som bakterier og gjærsopp, og kan inneholde minst 3 masse% karotenoidforbindelser i sitt utfelte kulturmateriale. Ved at man imidlertid tar i betraktning anvendelse av karotenoidforbindelser som er opphopet i mikroorganismen under dyrkningen, er det foretrukket å anvende en bakterie hvis cellevegg er tynn nok til å utnytte pigmentet effektivt. På bakgrunn av karotenoidforbindelsers veksthastighet og produktivitet, er det spesielt foretrukket at en DNA-nukleotidsekvens svarende til 16S-ribosomal-RNA i det vesentlige er homolog med nukleotidsekvensen vist i SEKV ID NR: 1.

Idet man tar i betraktning hyppigheten av forekomst av feil ved bestemmelse av DNA-nukleotidsekvenser, betyr betegnelsen «hovedsakelig homolog» anvendt i det foreliggende minst 98% homologi.

I bakteriene hvor sekvensen hovedsakelig er homolog med ovennevnte sekvens, opphopes karotenoidforbindelser så som astaxantin, adonixantin, karoten, echinenon, canthaxantin, zeaxantin, p-cryptoxantin, 3-hydroksy-echinenon, asteroidenon, adonirubin ved dyrkning som en blanding. Andelen av dannede karotenoidforbindelser som finnes i cellen, kan forandres, for eksempel ved forandring av aerobe dyrkningsbetingelser. Som eksempel kan andelen av dannet adonixantin forandres ved øking av konsentrasjonen av oppløst oksygen i dyrkningsmediet. Dessuten kan cellen med forandret andel av dannelse av karotenoidforbindelser oppnås ved mutasjon. Metodene for mutasjon innbefatter fysikalske metoder så som røntgenbestråling og bestråling med ultrafiolett lys, anvendelse av kjemiske mutagener, samt kunstige mutasjoner innbefattende en kjemisk mutasjonsmetode så som behandling med NTG (N-metyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin) og EMS (etylmetansulfonat).

Blant nevnte bakterier er E-396-stammen en stamme hvor astaxantin utgjør minst 40 masse% av de dannede karotenoidforbindelser. Denne stamme er nylig blitt isolert av de nærværende oppfinnere, og ble deponert i National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (1 Higashi 1 chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan) under adkomstnr. FERM BP-4283 27. april 1993. De mykologiske egenskaper hos denne stamme er beskrevet i japanske utlagte patentsøknader (kokai) nr. 7-79796, 8-9964 og 9-308481. En DNA-nukleotidsekvens svarende til 16S ribosomal-RNA fra denne stamme er som vist i SEKV ID NR: 1.

Astaxantin dannet av stammen hvis DNA-nukleotidsekvens svarer til 16S ribosomal-RNA, er i det vesentlige homolog med sekvensen spesifisert ved foreliggende oppfinnelse, er (3S, 3'S)-astaxantin, og renheten er nesten 100%. Astaxantin som finnes i naturlige produkter så som kreps, hematococcus, laks, ørret og rød flekkpagell er kjent for å inneholde en høy prosent av (3S, 3'S). I motsetning til dette, er Phaffia rhodozyma kjent for å inneholde en høy andel av (3R, 3'R), som har en absolutt konfigurasjon som er det motsatte av astaxantin som finnes i naturen. Astaxantinet dannet av stammen ifølge foreliggende oppfinnelse er 100% (3S, 3'S)-astaxantin, og det er verdifullt ut fra et industrielt synspunkt at det har den samme absolutte konfigurasjon som hovedandelen av astaxantiner i naturen.

En del eksempler er tilveiebrakt nedenfor for å beskrive foreliggende oppfinnelse mer spesifikt.

Eksempel 1:

Et medium i en mengde på 6 ml, bestående av preparatet ifølge tabell 1, ble innført i et testrør med diameter 18 mm, og vanndampsterilisering ble utført ved 121 °C i 15 minutter. Én platinasløyfe av E-396-stamme (FERM BP-4283) ble inokulert i dette, og dyrking i kultur med risting fram og tilbake ble utført ved 350 omdr. pr. min. ved 28°C i 2 dager. 2 ml av denne kultur ble overført til en 500 ml Sakaguchi-kolbe inneholdende 100 ml av mediet som har samme sammensetning som ovenfor, og dyrkning i kultur med risting fram og tilbake ble utført ved 100 omdr. pr. min. ved 28°C i 6 dager. Celler (våtvekt 3,2 g) ble tatt fra 100 ml av det dyrkede medium ved sentrifugering. Etter at cellene var blitt tilsatt til 50 ml ionebyttet vann og fullstendig oppslemmet, ble det igjen utført sentrifugering under oppnåelse av celler (våtvekt 3,1 g). Deretter ble 3,1 g av cellene frysetørket, hvorved man fikk 1,1 g tørkede celler. Karotenoidinnholdet i de tørkede celler ble analysert ved hjelp av høyytelses-væskekromatografi. Sammensetningen av karotenoidforbindelsene er vist i tabell 2. Vanninnholdet i de tørkede celler var 2,5%.

Eksempel 2:

E-396-stamme (FERM BP-4283) ble mutert med NTG (N-metyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin), og intenst rødfargede kolonier ble selektert. Karotenoid-forbindelser i det dyrkede metidum ble analysert, og mutante stammer med øket astaxantinutbytte ble selektert. 5 ml av mediet med sammensetning ifølge tabell 1 ble innført i et testrør med diameter 18 mm, og vanndampsterilisering ble utført ved 121°C i 15 minutter. Én platinasløyfe av den mutante E-396-stamme ble inokulert i dette, og dyrkning i kultur med risting fram og tilbake ble utført med 300 omdr. pr. min. ved 30°C i 2 dager. 2 ml av denne kultur ble overført til en 500 ml Sakaguchi-kolbe inneholdende 100 ml av mediet som har samme sammensetning som ovenfor, og dyrkning i kultur med risting fram og tilbake ble utført ved 120 omdr. pr. min. ved 29°C i 2 dager. Deretter ble 800 ml av denne kultur inokulert i en 30 liters fermenteringsinnretning inneholdende 20 liter av mediet med sammensetning ifølge tabell 3, og det ble utført aerob fermentering ved 400 omdr. pr. min. ved 1,0 vm ved 29°C i 150 timer. Celler (våtvekt 600 g) ble uttatt fra 18 liter av det dyrkede medium ved hjelp av en Sharples-sentrifuge. Etter at cellene var blitt tilsatt til 20 liter vann fra springen og oppslemmet fullstendig, ble celler (våtvekt 530 g) igjen uttatt ved anvendelse av den samme Sharples-sentrifuge. Etter at 1,5 liter vann fra springen var blitt tilsatt og cellene (våtvekt 530 g) var fullstendig oppslemmet, ble cellene tørket med et sprøytetørkingsapparat under oppnåelse av 200 g tørkede celler. Følgende driftsbetingelser ble anvendt: lufttemperaturen var 210°C ved innføringen og 105°C ved utgangen, og hastigheten ved hvilken suspensjonen ble tilført, var 38 ml/min. Karotenoidinnholdet i de tørkede celler ble analysert ved hjelp av høyytelses-væskekromatografi. Sammensetningen av karotenoidforbindelser er vist i tabell 4. Vanninnholdet i de tørkede celler var 3,1%.

Siden karotenoidet som finnes i den pigmentholdige substans for fortilsetningsstoffer ifølge foreliggende oppfinnelse er stabilisert ved funksjonen av cellemembranen, celleveggen og liknende i en mikroorganisme, er de pigmentholdige substanser for fortilsetningsstoffer bestandige overfor oksygen, lys osv. og kan lagres stabilt i et langt tidsrom.

Claims (3)

1. Pigmentholdig substans for fortilsetningsstoffer, karakterisert ved at den omfatter et bakteriekultur-prespitat som inneholder minst 3 masse% karotenoidforbindelser, idet minst 40 masse % er astaxantin.

2. Pigmentholdig substans for fortilsetningsstoffer ifølge krav 1, karakterisert ved at en DNA-nukleotidsekvens svarende til 16S ribosomal-RNA bakterien i bakteriekultur-prespitatet har minst 98% homologi med nukleotidsekvensen vist i SEKV ID NR: 1.

3. Pigmentholdig substans for fortilsetningsstoffer ifølge krav 3, karakterisert ved at bakterien i bakteriekultur-prespitatet er E-396-stamme eller en mutant derav.