WO2001022833A1 - Matieres contenant des pigments ajoutees a des aliments - Google Patents

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Akira Tsubokura
Hisashi Yoneda
Haruyoshi Mizuta
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Nippon Mitsubishi Oil Corporation
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    • A23L5/46—Addition of dyes or pigments, e.g. in combination with optical brighteners using dyes or pigments of microbial or algal origin

Definitions

  • the present invention relates to a pigment-containing material for feed addition comprising a microorganism culture precipitate containing a carotenoid compound.
  • Carotenoid compounds are a general term for a group of pigments that have a long-chain polyene structure, often have 40 carbon tetraterbenoids, and exhibit yellow, orange, red, or purple colors.
  • 3-carotene and astaxanthin are useful as feed additives, food additives, pharmaceuticals, etc. as natural pigments.
  • astaxanthin has high industrial value as a feed additive, such as body color improvers for cultured fish such as salmon, trout, and red sea bream, and as a safe natural food additive.
  • Adonixanthin is expected to be used as a feed additive, food additive, or medicinal product, similar to astaxanthin, by establishing an industrial manufacturing method.
  • Canthaxanthin is used as a feed additive, food additive, cosmetics, etc.
  • zeaxanthin is used as a feed additive, food additive.
  • Echinenone and adonirubin are also expected to be used as feed additives and food additives.
  • Known methods for producing these carotenoid compounds include a chemical synthesis method, a production method using microorganisms, and an extraction method from natural products. Chemically synthesized products of astaxanthin and canthaxanthin are already on the market.
  • the production method using microorganisms has the advantage of high safety because it can be produced without using metal catalysts and solvents.
  • carotenoid compounds are unstable to oxygen and light, but carotenoid compounds produced by microorganisms accumulate inside microbial cells, so they are stabilized by cell membranes, cell walls, and other antioxidants. Is kept.
  • high storage stability is an advantage, and it is a great advantage if microbial cells themselves can be used.
  • carotenoid compounds in the cells are extracted and purified for use. If this is the case, it is necessary to use a chlorinated solvent that has safety problems.
  • the use of a microorganism culture sediment composed of a microorganism containing a carotenoid compound as a feed additive has a great advantage.
  • the cell wall of the microorganism producing the carotenoid compound is strong, the absorption efficiency is extremely low even if supplied as it is, and it is necessary to pulverize the cell mechanically or decompose it with chemicals, enzymes, etc.
  • the stability of the carotenoid compound is reduced when the cells are decomposed.
  • astaxanthin is a red pigment itself contained in fish such as salmon, trout, and red sea bream, and in crustaceans such as shrimp and rikiji, and is useful in that it has a beautiful color tone. Widely used as feed additives and natural food additives.
  • the red yeast Phaffia hodozima which is known to produce astaxanthin, has a problem that the cell wall is strong because it is yeast. The following are known to produce astaxanthin by bacteria, but the content is low per dry cell weight in all cases. Brevibacterium (B. revibacteri urn No.
  • An object of the present invention is to provide a feed additive-containing pigment comprising a microorganism culture precipitate containing a high concentration of a carotenoid compound useful as a natural pigment. Disclosure of the invention
  • the present invention provides the following means.
  • a pigment-containing substance for feed addition consisting of a microbial culture precipitate containing at least 3% by mass of a carotenoid compound.
  • astaxanthin 40% by mass or more of astaxanthin in the carotenoid compound is astaxanthin, wherein the pigment is added to feed.
  • the pigment-containing material for feed addition of the present invention comprises a microorganism culture precipitate.
  • the microorganism culture precipitate of the present invention refers to a microorganism that produces a carotenoid compound, mainly a cell cultured to produce a carotenoid compound, and the culture solution is filtered, centrifuged, etc., and treated to a certain degree with water.
  • the method of culturing the strain producing the carotenoid compound may be any method as long as it produces the carotenoid compound. For example, the following method can be employed.
  • a culture medium containing a carbon source, a nitrogen source, an inorganic salt, and, if necessary, special required substances (eg, vitamins, amino acids, nucleic acid bases, etc.) necessary for the growth of the producing bacteria is used.
  • the carbon source include sugars such as glucose, sucrose, fructoses, trehalose, mannose, mannitol, and maltose; organic acids such as acetic acid, fumaric acid, cunic acid, propionic acid, malic acid, and malonic acid; Alcohols such as tanol, propanol, butanol, pentanol, hexanol and isobutanol.
  • the addition ratio depends on the type of carbon source However, the amount is usually 1 to 100 g, preferably 2 to 50 g per liter of the medium.
  • the nitrogen source for example, one or more of potassium nitrate, ammonium nitrate, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium phosphate, ammonia, urea and the like are used.
  • the addition ratio varies depending on the type of nitrogen source, but is usually 0.1 lg to 10 g, preferably 1 to 3 g per liter of medium.
  • Inorganic salts include potassium dihydrogen phosphate, rhodium hydrogen phosphate, disodium hydrogen phosphate, magnesium sulfate, magnesium chloride, iron sulfate, iron chloride, manganese sulfate, manganese chloride, zinc sulfate, zinc chloride, copper sulfate
  • calcium chloride, calcium carbonate, sodium carbonate and the like are used. The addition ratio varies depending on the type of inorganic salt. It is usually 0.001 to 10 g per liter of normal medium.
  • Specially required substances include vitamins, nucleic acids, yeast extract, peptone, meat extract, malt extract, corn steep liquor, dried yeast, soybean meal, soybean oil, olive oil, corn oil, linseed oil, etc. Species or two or more are used.
  • the addition ratio varies depending on the type of special required substance, but is usually lg to 200 g, preferably 10 to 100 g per liter of medium.
  • the pH of the medium is adjusted to 2 to 12, preferably 6 to 10.
  • the culturing condition is a temperature of 15 to 80 ° C, preferably 20 to 35 ° C, and the shaking culture or the aeration stirring culture is usually performed for 1 to 20 days, preferably 2 to 8 days.
  • the amount of water removal required to obtain the pigment content for feed addition of the present invention depends on the state of the culture solution (color content, etc.).
  • the precipitate is dried.
  • the filtration can be performed by a usual filtration method, a centrifugal separation method, or the like.
  • the resulting precipitate contains water and precipitates in which medium components such as salts and sugars are dissolved.
  • water is added to the precipitates separated from the culture solution. After adding and suspending, it is also effective to separate the precipitate again.
  • the medium components and the like dissolved in water can be removed to some extent.
  • it is necessary to increase the content of carotenoid compounds in the precipitate it is possible to take a method of drying the precipitate to remove water. Examples of the drying method include ordinary spray drying, drum drying, and freeze drying.
  • the microorganism culture precipitate obtained by the above method is excellent as a pigment content for feed addition.
  • the feed additive of the present invention may contain an antioxidant such as BHT (butylhydroxytoluene), ethoxyquin, and vitamin E for the purpose of preventing the decomposition of carotenoid compounds. Further, these surfaces may be coated with gelatin or the like.
  • the microorganism used in the present invention is not particularly limited as long as it produces a licarotenoid compound by culturing a bacterium, yeast, or the like, and can contain 3% by mass or more of the carotenoid compound in the culture precipitate.
  • the nucleotide sequence of the DNA corresponding to the 16S ribosome RNA is substantially homologous to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 from the viewpoint of the growth rate and the productivity of the carotenoid compound.
  • substantially homologous means that the homology is 98% or more in consideration of the error frequency and the like when determining the DNA base sequence.
  • a bacterium having a sequence substantially homologous to the above sequence can be cultured in a bacterial cell with astaxanthin, adonixanthin, ⁇ -carotene, echinenone, canthaxanthin, zeaxanthin, 3-cryptoxanthin, 3-hydroxyxynenone.
  • Carotenoid compounds such as asteroidenone and adironrubin, accumulate as a mixture.
  • the generation ratio of the carotenoid compound contained in the cells can be changed, for example, by changing the aerobic conditions in the culture. As an example, by increasing the dissolved oxygen concentration in the culture solution, the production ratio of liadonixanthin can be increased.
  • the mutation method include physical methods such as X-ray irradiation and ultraviolet irradiation, and chemical treatment with a chemical mutagen such as NTG (N-methyl-N'-nitoro-N-ni trosoguanidine and EMS (ethylmethane sul fonate)). It is possible to use an artificial mutation treatment using a chemical method such as
  • E-396 strain can be mentioned as one in which 40% by mass or more of the carotenoid compound produced is astaxanthin.
  • This strain was newly isolated by the inventors, and has been published by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology.
  • FERM BP-4283 was deposited on April 1, 1993 at Higashi 1-chome, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture.
  • the bacteriological properties of this strain are as described in JP-A-7-79796, JP-A-8-9964, and JP-A-9-308481.
  • the nucleotide sequence of the DNA corresponding to the 16S ribosomal RNA of this strain is as shown in SEQ ID NO: 1.
  • Astaxanthin produced by a strain in which the nucleotide sequence of the DNA corresponding to the 16S ribosome RNA is substantially homologous to the specific sequence of the present invention is (3S, 3'S) -astaxanthin. Its purity is almost 100%. It is known that astaxanthin, which exists in the natural products crayfish, hematococcus, salmon, trout, and red sea bream, has a high content of (3S, 3, S) form. On the other hand, it is known that the content of (3R, 3, R) -form is high in Puffer orchid dog and has an absolute configuration opposite to that of naturally occurring astaxanthin. Astaxanthin produced by the strain of the present invention is 100% (3S, 3'S) -astaxanthin, and having the same absolute configuration as astaxanthin, which accounts for a large number in nature, is of industrial value. high.
  • the E-396 strain (FERM BP-4283) was mutated with NTG (N-methy1-N'-nitro-N-nitrosoguanidine) to select colonies with a deep red color tone.
  • the carotenoid compounds in the cultures of these strains were analyzed, and mutants with improved astaxanthin production were selected.
  • 5 mL of a medium having the composition shown in Table 1 was placed in a test tube having a diameter of 18 mm, and steam sterilized at 121 ° C for 15 minutes.
  • a platinum loop was inoculated with the mutant strain and cultured at 30 ° C for 2 days with reciprocating shaking at 300 rpm.
  • Carotenide compound content mg / g

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Description

糸田 »
飼料添加用色素含有物 技術分野
本発明は、 カロテノィド化合物を含有する微生物培養沈殿物よりなる飼料添加 用色素含有物に関する。 背景技術
カロテノィ ド化合物は長鎖のポリェン構造、 多くは炭素数 4 0のテトラテルべ ノイドを持ち、 黄、 橙、 赤ないし紫色を呈する色素群の総称であり、 具体的には 3—カロテン、 ァスタキサンチン、 カンタキサンチン、 ゼアキサンチン、 ェキネ ノン、 アド二ルビン、 アドニキサンチン等といった化合物をさす。 これらの化合 物は天然色素として飼料添加物、 食品添加物、 医薬品等として有用である。 例え ば、 ァスタキサンチンは養殖魚であるサケ、 マス、 マダイ等の体色改善剤のごと き飼料添加物として、 また安全な天然食品添加物として産業上価値が高い。 アド ニキサンチンは工業的製造法が確立することによりァスタキサンチンと同様に飼 料添加物、 食品添加物、 医薬品としての使用が期待される。 カンタキサンチンは 飼料添加物、 食品添加物、 化粧品等として使用され、 ゼアキサンチンは飼料添加 物、 食品添加物として使用されている。 さらにェキネノン、 アド二ルビンも飼料 添加物、 食品添加物等としての使用が期待される。 これらカロテノイド化合物の 製造方法としては、 化学合成法、 微生物による産生方法、 天然物からの抽出法な どが知られており、 すでにァスタキサンチン、 カンタキサンチンについては化学 合成品が市販されている。 微生物による産生方法は化学合成法に比較して、 金属 触媒、 溶剤を用いず製造できることから安全性が高いことが利点である。 一般的 にカロテノイ ド化合物は酸素、 光に不安定であるが、 微生物が産生するカロテノ イ ド化合物は微生物菌体の内部に蓄積されるため、 細胞膜、 細胞壁、 その他の酸 化防止剤によって安定的に保たれる。 飼料添加物等として用いる場合、 保存安定 性が高いことは利点であり、 微生物菌体そのものを用いることができれば大きな 利点である。 さらに、 菌体内のカロテノイ ド化合物を抽出精製して用いるのであ れば、 安全性に問題のある塩素系溶媒などを用いる必要がある。 以上よりカロテ ノィド化合物を含有する微生物よりなる微生物培養沈殿物を飼料添加物等に用い ることは大きな利点を有する。 その際、 カロテノイド化合物を生産する微生物の 細胞壁が強固である場合はそのままの菌体で供給しても吸収効率は極めて低く菌 体を機械的に粉砕、 あるいは化学薬品、 酵素などで分解する必要があリコストの 面で問題がある。 しかも菌体を分解した状態ではカロテノィ ド化合物の安定性が 低下する問題もある。 さらに、 微生物培養沈殿物中のカロテノイド化合物の含有 量が低い場合、 飼料を製造する際に、 微生物培養沈殿物が多く必要とされ操作性 がわるく運送コストも嵩む、飼料の栄養学的なバランスも崩すという問題もある。 しかしながら、 強固な細胞壁を持たないことから菌体内部に蓄積されるカロテノ ィ ド化合物が容易に利用され易 、長所を有する微生物よりなリ、 さらにカロテノ ィ ド化合物を 3質量％以上含有する微生物培養沈殿物よりなる飼料添加用色素含 有物は見いだされていなかった。
カロテノィド化合物の中でもァスタキサンチンはサケ、 マス、 マダイ等の魚類、 ェビ、 力二等の甲殻類に含まれる赤色系の色素そのものであり、 色調が美しい点 で有用であり、 上述のように飼料添加物、 天然食品添加物として広く使用されて いる。 ァスタキサンチンを生産するとして知られている赤色酵母ファフィァ · 口 ドチ一マ (P h a f f i a r h o d o z yma) は酵母であるために、 細胞壁 が強固であるという問題を有する。 細菌によるァスタキサンチンの生産は以下の ものが知られているがいずれも乾燥菌体重量当たりの含有量は低い。 ブレビパク テリゥム (B r e v i b a c t e r i um 属に属する細菌 B r e v i b a c t e r i urn No. 1 03株は乾燥菌体重量当たりわずか 0. 003%のァスタ キサンチンを生産するにすぎない （ J 0 u r n a I o f Ge n e r a l a n d Ap p l i e d M i c r o b i o l o gy, 1 5, 1 27, 1 969 )0 またノ ラコッカス (P a r a c o e c u s) 属に属する細菌 P a r a c o c c u _s_ ma r c u s i i D SM 1 1 574株は乾燥菌体重量当たりわずか 0. 02 2 %のァスタキサンチンを生産するにすぎない （WO 99/6586).
本発明は、 天然色素として有用なカロテノィド化合物を高濃度含有する微生物 培養沈殿物よりなる飼料添加用色素含有物を提供することを目的とするものであ る, 発明の開示
上記課題を解決するため、 本発明は、 以下の手段を提供する。
1 . カロテノイ ド化合物を 3質量％以上含有する微生物培養沈殿物よりなる飼 料添加用色素含有物。
2 . カロテノィ ド化合物中の 4 0質量％以上がァスタキサンチンであることを 特徴とする上記の飼料添加用色素含有物。
3 . 微生物培養沈殿物中の微生物の 1 6 Sリボソーム R N Aに対応する D N A の塩基配列が配列番号 1記載の塩基配列と 9 8 %以上の相同性を有することを特 徴とする上記の飼料添加用色素含有物。
4 . 微生物培養沈殿物中の微生物が E— 3 9 6株もしくはその変異株であること を特徴とする上記の飼料添加用色素含有物。
なお、 本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 （特願平 1 1 一 2 7 9 3 3 7号） の明細書に記載される内容を包含する。
以下、 本発明を詳細に説明する。
本発明の飼料添加用色素含有物は微生物培養沈殿物よりなる。 まず最初に、 本 発明の微生物培養沈殿物を説明する。 本発明の微生物培養沈殿物とは、 カロテノ ィド化合物を生産する微生物、 主に菌体を培養してカロテノィド化合物を生産さ せ、 その培養液を濾過、 遠心分離機等により処理し、 ある程度水分を除去したも のを指す。 カロテノィド化合物を生産する菌株の培養方法はカロテノィ ド化合物 を生成する条件であればいずれの方法でもよいが、 例えば、 以下のような方法を 採用できる。 すなわち、 培地としては生産菌が生育に必要な炭素源、 窒素源、 無 機塩、 および必要であれば特殊な要求物質 （例えば、 ビタミン、 アミノ酸、 核酸 塩基等） を含むものを使用する。 炭素源としてはグルコース、 シュ一クロース、 フルク ト一ス、 トレハロース、 マンノース、 マンニトール、 マルト一ス等の糖類、 酢酸、 フマル酸、 クェン酸、 プロピオン酸、 リンゴ酸、 マロン酸等の有機酸、 ェ タノール、 プロパノール、 ブタノール、 ペンタノ一ル、 へキサノール、 イソブタ ノール等のアルコール類等が挙げられる。 添加割合は炭素源の種類により異なる が、 通常培地 1L当たり l〜100g、 好ましくは 2~50gである。 窒素源としては、 例えば硝酸カリウム、 硝酸アンモニゥム、 塩化アンモニゥム、 硫酸アンモニゥム、 リン酸アンモニゥム、 アンモニア、 尿素等の 1種または 2種以上が用いられる。 添加割合は窒素源の種類により異なるが、 通常培地 1Lに対し 0. lg〜10g、 好まし くは l〜3gである。 無機塩としてはリン酸二水素カリウム、 リン酸水素二力リウ ム、 リン酸水素ニナトリウム、 硫酸マグネシウム、 塩化マグネシウム、 硫酸鉄、 塩化鉄、 硫酸マンガン、 塩化マンガン、 硫酸亜鉛、 塩化亜鉛、 硫酸銅、 塩化カル シゥム、炭酸カルシウム、 炭酸ナトリゥム等の 1種または 2種以上が用いられる。 添加割合は無機塩の種類により異なる力 通常培地 1Lに対し 0. 001〜10gである。 特殊な要求物質としてはビタミン類、 核酸類、 酵母エキス、 ペプトン、 肉エキス、 麦芽エキス、 コーンスチープリカ一、 乾燥酵母、 大豆粕、 大豆油、 ォリーブ油、 トウモロコシ油、 アマ二油、 等の 1種または 2種以上が用いられる。 添加割合は 特殊な要求物質の種類により異なるが、 通常、 培地 1Lに対し lg〜200g、 好まし くは 10〜100gである。 培地の pHは 2〜12、 好ましくは 6〜10に調整する。 培養 条件は 15〜80°C、 好ましくは 20〜35°Cの温度であり、 通常 1 日〜 20日間、 好ま しくは 2〜8日間振とう培養あるいは通気撹拌培養を行う。
次に、 以上の方法により得られた培養液から水分を除去する作業を行う。 本発 明の飼料添加用色素含有物を得るために、 どの程度の水分除去が必要かは培養液 の状態 （色素含有量等） により異なるが、 一般にまず濾過の作業を行いさらに水 分の除去が必要であれば沈殿物の乾燥を行う。 濾過の方法は、 通常の濾過法、 遠 心分離法などにより行うことができる。 得られた沈殿物は塩類、 糖類などの培地 成分が溶解した水および沈殿物を含むため、 沈殿物中のカロテノィド化合物の含 有量をさらに向上させるため、培養液から分離した沈殿物に水を加え懸濁した後、 再度沈殿物を分離することも有効である。 この工程により、 水に溶解している培 地成分等をある程度除去することができる。 さらに沈殿物中のカロテノィド化合 物の含有量を上げる必要がある場合には、 沈殿物を乾燥して水分を除去する方法 をとることが可能である。 乾燥の方法としては、 通常の噴霧乾燥、 ドラム乾燥、 凍結乾燥などが挙げられる。
以上の方法で得られた微生物培養沈殿物は飼料添加用色素含有物として良好に 使用することができる。 本発明の飼料添加用含有物はカロテノィ ド化合物の分解 を防止する目的で B H T (プチルハイ ドロキシトルエン）、 エトキシキン、 ビタミ ン Eなどの酸化防止剤を添加することも可能である。 さらにこれらの表面をゼラ チンなどで被覆しても良い。
次に本発明で使用される微生物について説明する。 本発明で使用される微生物 は、 細菌、 酵母等培養によリカロテノイ ド化合物を生産し、 その培養沈殿物中に 3質量％以上のカロテノィド化合物を含有できるものであれば特に限定されない 力 \ 培養中に微生物内に蓄積されたカロテノィド化合物を利用することを考え、 細胞壁が薄く色素の有効な利用が可能である細菌を用いることが好ましい。特に、 増殖速度の速さ、 カロテノイド化合物の生産性から、 1 6 Sリボソーム R N Aに 対応する D N Aの塩基配列が配列番号 1記載の塩基配列と実質的に相同であるこ とが特に好ましい。
ここで言う実質的に相同とは D N Aの塩基配列決定の際のエラー頻度等を考慮 し 9 8 %以上の相同性であることを意味する。
上記配列と実質的に相同な配列を有する細菌は、 培養により、 菌体中にァスタ キサンチン、 アドニキサンチン、 ^—カロテン、 ェキネノン、 カンタキサンチン、 ゼアキサンチン、 3—クリプトキサンチン、 3 -ヒドロキシェキネノン、 ァステロ イデノン、 アド二ルビン等のカロテノイ ド化合物が混合物として蓄積する。 菌体 中に含まれるカロテノイド化合物の生成比率は、 例えば、 培養における好気条件 を変えることにより、 カロテノイド化合物の生成比率を変えることができる。 一 例として培養液中の溶存酸素濃度を高めることによリァドニキサンチンの生成比 率を高めることができる。 また、 変異により、 カロテノイ ド化合物の生成比率の 変化した菌体を得ることも可能である。 変異の方法としては、 X線照射、 紫外線 照射等の物理的方法、 化学変異剤、 例えば N T G ( N-methyl-N' -ni toro-N- ni trosoguanidineと E M S (ethylmethane sul fonate)等による変異処理のような 化学的方法を用いた人為的変異処理等を用いることが可能である。
該細菌のうち、 生成するカロテノィド化合物のうちの 4 0質量％以上がァスタ キサンチンであるものとして、 E- 396 株を挙げることができる。 この株は、 発明 者らが新しく単離したものであり、 工業技術院生命工学工業技術研究所 （日本国 茨城県つくば市東 1丁目 1番） に平成 5年 4月 27日に FERM BP- 4283として寄託 された。 この菌株の菌学的性質は、 特開平 7-79796号公報、 特開平 8- 9964号公報、 特開平 9-308481号公報に記載されている通りである。 また、 この菌株の 16Sリボ ソ一ム RNAに対応する DNAの塩基配列は、 配列番号 1に示すとおりである。
1 6 Sリボソーム RN Aに対応する DN Aの塩基配列が本発明の特定の配列 と実質的に相同である菌株が生産するァスタキサンチンは （ 3 S， 3' S) —ァ スタキサンチンでありその純度はほぼ 1 00%である。 天然物であるザリガニ、 へマトコッカス、 サケ、 マス、 マダイに存在するァスタキサンチンは （3 S， 3， S) 体の含有率が高いことが知られている。 一方ファフィァ · 口ドチ一マは （ 3 R, 3， R) 体の含有率が多く天然に存在するァスタキサンチンとは反対の絶対 配置を持つことが知られている。 本発明の菌株が生産するァスタキサンチンは 1 00%の （3 S， 3' S) —ァスタキサンチンであり天然において多数を占める ァスタキサンチンと同一の絶対配置を有することは産業上価値が高い。
以下、 実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、 本発明はこれらの実施 例のみに限定されるものではない。 発明を実施するための最良の形態
〔実施例 1〕
第 1表の組成からなる培地 6 mLを直径 18mmの試験管に入れ 121°C、 15分間蒸 気殺菌した。 これに E- 396株（FERM BP- 4283)を 1白金耳植菌し 28°Cで 2日間 3 5 Orpraの往復振とう培養を行った。 この培養液 2 mLを上と同組成の培地が 1 0 OmL入った 50 OmL容量の坂口フラスコ 1本に植菌し 28°C、 6日間 lOOrpmの 往復振とう培養を行った。培養液 1 0 OmLから遠心分離によリ菌体（湿重量 3. 2g) を得た。 この菌体にイオン交換水 5 OmLを添加し十分懸濁した後、 再度遠 心分離機を行い菌体 （湿重量 3. l g) を得た。 次いで菌体 3. 1 gを凍結乾燥し 菌体乾燥物 1. lg を得た。 乾燥菌体物中のカロテノイド含有量を高速液体クロ マトグラフィ一により分析したところ第 2表の組成であった。 また菌体乾燥物中 の水分含量は 2. 5%であった。 表 1
組成 添加量 g / L
酵母エキス 20
ペプトン 5
しょ糖 1 00
KH2 P 04 1. 5
N a 2H P O 1 2 H90 3 8
M g S 04 · 7 H20 0 5
F e S〇4 · 7 H 20 0 0 1
Figure imgf000008_0001
P H 7 _(N a2C03で調整）
表 2
カロテノィド化合物 含有量 mg/g
0—力口テン 1. 6
ェキネノン 1， 9
3-ヒドロキシェキネノン 0. 9
カンタキサンチン 2. 3
ァドニルビン 5. 6
ァスタキサンチン 1 3. 0
ァステロイデノン 0. 6
ァドニキサンチン 5. 3
ゼアキサンチン 0. 0 1
総力口テノィ ド 3 1. 2
〔実施例 2〕
E-396株（FERM BP-4283)を NTG(N-methy 1-N' -ni toro- N-ni trosoguanidine)で変 異処理し、 赤色の色調が濃いコロニーを選択した。 これらの株の培養液中のカロ テノィド化合物を分析し、 ァスタキサンチンの生産量が向上した変異株を選択し た。第 1表の組成からなる培地 5 mLを直径 18mmの試験管に入れ 121°C、 15分間 蒸気殺菌した。 これに変異株を 1 白金耳植菌し 30°Cで 2日間 300rpmの往復振と う培養を行った。 この培養液 2 mLを上と同組成の培地が lOOmL入った 500mL容量 の坂口フラスコに植菌し 29°C、 2日間 1 2 Orpm の往復振とう培養を行った。 次にこの培養液 80 OmL分を表 3の組成の培地が 20L入った 30L容量の発酵槽 に植菌し 29t：、 40 Orpm、 l.Ovvmの好気培養を 1 50時間行った。 培養液 18L からシャープレス型遠心分離機により菌体 （湿重量 60 Og) を得た。 この菌体に 水道水を 20L 添加し十分懸濁した後、 再度シャープレス型遠心分離機によリ菌 体 （湿重量 53 Og) を得た。 次いで菌体 53 Ogに水道水を 1. 5 L添加し十分 懸濁後、 スプレードライヤーを用いて菌体を乾燥し菌体乾燥物 200 gを得た。 運転条件は入口空気温度 2 1 0t：、 出口空気温度 1 05°C、 懸濁液供給速度 38 mL/minで行った。乾燥菌体物中のカロテノィド含有を高速液体クロマトグラフィ —によリ分析したところ第 4表の組成であった。 また乾燥菌体物中の水分含量は 3. 1 %であった。
表 3
組成 添加量 g Z L
酵母エキス 20
ペプトン 5
グルコース 1 20
KH2P04 1. 5
N a 2H P 0 1 2 H20 3. 8
Mg SO4 · 7 H2 ,0 0. 5
Figure imgf000009_0001
C a C 1 2 H,0 0. 0 1
p H 7 (N a2CO,で調整）
表 4
カロテノィド化合物 含 ¾量 mg/g
/3—力口テン 0.7
ェキネノン 1.1
3-ヒドロキシェキネノン 0.6
カンタキサンチン 1.7
ァドニルビン 5.4
ァスタキサンチン 19.4
ァステロイデノン 0.8
ァドニキサンチン 5.5
ゼアキサンチン 0.02
総力口テノィド 35.2

Claims

言青求の範囲
1. カロテノィド化合物を 3質量％以上含有する微生物培養沈殿物よりなる飼料 添加用色素含有物。
2. カロテノィド化合物中の 40質量％以上がァスタキサンチンであることを特 徴とする請求項 1に記載の飼料添加用色素含有物。
3. 微生物培養沈殿物中の微生物の 1 6 Sリボソーム RNAに対応する DNAの 塩基配列が配列番号 1記載の塩基配列と 98 %以上の相同性を有することを特徴 とする請求項 1または 2に記載の飼料添加用色素含有物。
4. 微生物培養沈殿物中の微生物が E— 396株もしくはその変異株であること を特徴とする請求項 3に記載の飼料添加用色素含有物。
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