KR20010101077A

KR20010101077A - 사료 첨가용 색소 함유물

Info

Publication number: KR20010101077A
Application number: KR1020017006548A
Authority: KR
Inventors: 아키라 츠보쿠라; 히사시 요네다; 하루요시 미즈타
Original assignee: 오오자와 히데이로; 니폰 미쓰비시 오일 코포레이션
Priority date: 1999-09-30
Filing date: 2000-09-22
Publication date: 2001-11-14
Also published as: ATE364323T1; NO328768B1; CA2352080C; US6706278B1; IL143391A0; DE60035175T2; DE60035175D1; DK1138208T3; EP1138208A1; KR100711288B1; NO20012629D0; CN1337854A; WO2001022833A1; CA2352080A1; AU781683C; NO20012629L; EP1138208B1; JP2001095500A; IL143391A; AU781683B2

Abstract

카로티노이드 화합물을 고농도로 함유하는 미생물 배양 침전물에서 만들어지는 사료 첨가용 색소 함유물을 제공한다. 이 사료 첨가용 색소 함유물은, 산소나 빛 등에 대하여 내성을 나타내고, 장기간 안정적으로 보존하는 것이 가능하다.

Description

사료 첨가용 색소 함유물{A Pigment-containing Substance for Feed Additives}

카로티노이드 화합물은 장쇄의 폴리엔 구조를 가지고, 대부분은 탄소수 40의 테트라터페노이드(tetraterpenoid)를 가지며, 노란색, 오렌지색, 보라색을 나타내는 색소군의 총칭이며, 구체적으로는 β-카로틴(β-carotene), 아스타크산틴(astaxanthin), 칸타크산틴(canthaxanthin), 제아크산틴(zeaxanthin), 에키네논(echinenone), 아도니루빈(adonirubin), 아도니크산틴(adonixanthin) 등의 화합물을 일컫는다. 이들 화합물은 천연색소로서 사료첨가물, 식품첨가물, 의약품 등으로 유용하다.

예를 들면, 아스타크산틴은 양식어인 연어, 송어, 참도미 등의 체색 개선 효과가 있는 사료 첨가물로서, 또한 안전한 천연 식품 첨가물로 상업상 가치가 높다. 아도니크산틴은 공업적 제조방법이 확립되어 아스타크산틴과 같은 양상으로사료첨가물, 식품첨가물, 의약품으로 사용이 기대되고 있다. 칸타크산틴은 사료첨가물, 식품첨가물, 화장품 등으로 사용되고, 제아크산틴은 사료첨가물, 식품첨가물로 사용되고 있다. 또한, 에키네논, 아도니루빈 역시 사료첨가물, 식품첨가물로서의 사용이 기대되고 있다.

이들 카로티노이드 화합물의 제조방법으로는 화학 합성법, 미생물에 의한 생산방법, 천연물로부터의 추출법 등이 알려져 있고, 이미 아스타크산틴, 칸타크산틴에 대해서는 화학 합성품이 시판되고 있다. 미생물에 의한 생산 방법은 화학 합성법에 비교하여, 금속촉매, 용제를 이용하지 않고 제조가 가능하기 때문에 안전성이 높은 이점이 있다. 일반적으로, 카로티노이드 화합물은 산소와 빛에 불안정하지만, 미생물이 생산하는 카로티노이드 화합물은 미생물 균체의 내부에 축적되기 때문에, 세포막, 세포벽, 그 외 산화방지제에 의해 안정적으로 보존된다. 사료첨가물 등으로 이용되는 경우, 보존 안정성이 높은 점이 이점이며, 균체내의 카로티노이드 화합물을 추출 정제해서 이용하면 안전성에 문제가 있는 염소계 용매 등을 이용할 필요성이 있다. 이상에서와 같이, 카로티노이드 화합물을 함유하는 미생물에 의해 미생물 배양 침전물을 사료 첨가물 등으로 이용하는 경우에 큰 이점이 있다. 이때, 카로티노이드 화합물을 생산하는 미생물의 세포벽이 딱딱한 경우 그대로 균체에 공급해도 흡수효율은 극히 낮아 균체를 기계적으로 분석, 혹은 화학 약품, 효소 등으로 분석해야 하며, 비용면에서 문제가 있다. 게다가, 균체를 분해한 상태에서 카로티노이드 화합물의 안정성이 저하되는 문제도 있다. 또한, 미생물 배양 침전물 중의 카로티노이드 화합물의 함유량이 낮을 때 사료를 제조하는 경우,미생물 배양 침전물이 많은 양 필요로 하여, 조작성이 나쁘며, 높은 운송비용과, 사료의 영양학적으로 균형이 파괴되는 문제도 있다.

그러나, 딱딱한 세포벽을 가지고 있지 않아서 균체 내부에 축적되는 카로티노이드 화합물이 용이하게 이용되기 쉬운 장점을 가진 미생물에서 만들어지면서 카로티노이드 화합물을 3질량% 이상 함유하는 미생물 배양 침전물에 의해 형성되는 사료 첨가용 색소 함유물은 발견되지 않았다.

카로티노이드 화합물 가운데도 아스타크산틴은 연어, 송어, 참돔 등의 어류, 새우, 게 등의 갑각류에 포함되는 적색계의 색소를 가지고, 색조가 아름다운 점에서 유용하며, 상술한 바와 같이 사료 첨가물, 천연 식품 첨가물로 널리 이용되어지고 있다. 아스타크산틴을 생산하는 것으로 알려져 있는 적색 효모 파피아 로도자이머(Phaffia rhodozyma)은 효모이기 때문에 세포벽이 딱딱하다는 문제가 있다. 세균에 의한 아스타크산틴의 생산은 이하의 것이 알려져 있으나, 모두 건조 균체 중량당 함유량이 낮다. 브레비박테리아(Brevibacterium) 속에 속하는 세균 Brevibacterium No. 103주는 건조 균체 중량당 겨우 0.003%의 아스타크산틴을 생산하는 것에 지나지 않는다(참조: Journal of General and Applied Microbiology, 15, 127, 1969). 또, 파라코커스(Paracoccus)속에 속하는 세균 Paracoccus marcusii DSM 11574주는 건조 균체 중량당 겨우 0.022%의 아스타크산틴을 생산하는데 지나지 않는다(참조: WO 99/6586).

본 발명은 천연색소로 유용한 카로티노이드 화합물을 고농도로 함유하는 미생물 배양 침전물에 의해 만들어지는 사료 첨가용 색소 함유물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 카로티노이드 화합물을 함유하는 미생물 배양 침전물에 의해 제조되는 사료 첨가용 색소 함유물에 관한 것이다.

[발명의 개시]

상기 과제를 해결하기 위해 본 발명은 이하의 수단을 제공한다.

카로티노이드 화합물을 3질량% 이상 함유하는 미생물 배양 침전물에 의해 만들어지는 사료 첨가용 색소 함유물.

카로티노이드 화합물 중의 40중량비 이상이 아스타크산틴인 것을 특징으로 하는 상기의 사료 첨가용 색소 함유물.

미생물 배양 침전물 중의 미생물의 16S 리보좀RNA에 대응하는 DNA의 염기서열이 서열번호 1에 기재된 염기서열과 98% 이상의 상동성을 가지는 것을 특징으로 하는 상기의 사료 첨가용 색소 함유물.

미생물 배양 침전물 중의 미생물이 E-396주 또는 그 변이주인 것을 특징으로 하는 상기의 사료 첨가용 색소 함유물.

또한, 본 명세서는 본원의 우선권의 기초인 일본국 특허출원(특원평 11-279337호)의 명세서에 기재된 내용을 포함한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 사료 첨가용 색소 함유물은 미생물 배양 침전물에 의해 만들어진다. 우선 본 발명의 미생물 배양 침전물을 설명한다. 본 발명의 미생물 배양 침전물은, 카로티노이드 화합물을 생산하는 미생물, 주로 균체를 배양하여 카로티노이드 화합물을 생산하여, 그 배양액을 여과, 원심분리기 등으로 처리하여 어느 정도 수분을 제거한 것을 의미한다. 카로티노이드 화합물을 생산하는 균주의 배양방법은 카로티노이드 화합물을 생성하는 조건이면 어떠한 방법도 무방하나, 예를 들어 이하와 같은 방법을 사용할 수 있다. 즉, 배지로는 생산균이 생육에 필요한 탄소원, 질소원, 무기염, 및, 필요하면 특수한 요구물질(예를 들어, 비타민, 아미노산, 핵산염기 등)을 포함한 것을 사용한다. 탄소원으로는 글루코스, 슈크로스, 프럭토스, 트레할로스, 만노스, 만니톨, 말토스 등의 당류, 초산, 퓨말산(fumaric acid), 구연산, 프로피온산(propionic acid), 말산(malic acid), 말론산(malonic acid) 등의 유기산, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 펜탄올, 헥산올, 이소부탄올 등의 알코올류 등을 예로 들 수 있다. 첨가 비율은 탄소원의 종류에 따라 다르나, 통상 배지 1L당 1 내지 100g, 바람직하게는 2 내지 50g이다. 질소원으로는 예를 들어 질산칼륨, 질산 암모늄, 염화 암모늄 황산암모늄, 인산 암모늄, 암모니아, 요소 등에서 1종 또는 2종 이상이 이용된다. 첨가 비율은 질소원의 종류에 따라 다르나, 통상 배지 1L에 대해 0.1 내지 10g, 바람직하게는 1 내지 3g이다. 무기염으로는 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 인산수소이나트륨, 황산마그네슘, 염화마그네슘, 황산철, 염화철, 황산망간, 염화망간, 황산아연, 염화아연, 황산동, 염화 칼슘, 탄산칼슘, 탄산나트륨 등을 1종 또는 2종 이상 이용할 수 있다. 첨가 비율은 무기염의 종류에 따라 다르나, 통상 배지 1L에 대해 0.001 내지 10g이다.

특수한 요구 물질로는 비타민류, 핵산류, 효소엑기스, 펩톤, 고기 엑기스, 맥아 엑기스, 옥수수 전분 침출 폐액(corn steep liquor), 건조효모, 대두분, 대두유, 올리브유, 옥수수유, 아마인유(linseed oil) 등의 1종 또는 2종 이상이 이용된다. 첨가 비율은 특수한 요구물질의 종류에 따라 다르지만, 통상, 배지 1L에 대해 1 내지 200g, 바람직하게는 10 내지 100g이다. 배지의 pH는 2 내지 12, 바람직하게는 6 내지 10에 조정한다. 배양조건은 15 내지 80℃, 바람직하게는 20 내지 35℃의 온도이고, 통상 1 내지 20일간, 바람직하게는 2 내지 8일간 진탕배양을 하거나 통기교반배양을 한다.

다음으로, 이상의 방법에 따라 얻어진 배양액으로부터 수분을 제거하는 작업을 행한다. 본 발명의 사료 첨가용 색소 함유물을 얻기 위해서 어느 정도의 수분제거가 필요한가는 배양액의 상태에 따라 다르나, 일반적으로 우선 여과의 작업을 행하고, 수분의 제거가 필요하다면 침전물을 건조시킨다. 여과 방법은 통상의 여과법, 원심분리법 등에 의해 행할 수 있다. 얻어진 침전물은 염류, 당류 등의 배지 성분이 용해된 물 및, 침전물을 포함하기 때문에, 침전물 중 카로티노이드 화합물을 함유량을 더욱 향상시키기 배양액에서 분리된 침전물에 물을 가하여 현탁시킨 후, 다시 침전물을 분리하는 것도 유효하다. 이 공정을 거치게 되면, 물에 용해되어 있는 배지 성분 등을 어느 정도 제거하는 것이 가능하다. 또한, 침전물 중 카로티노이드 화합물의 함유량을 높일 필요가 있는 경우에는, 침전물을 건조시켜 수분을 제거하는 방법이 가능하다. 건조방법으로는 통상의 분무건조, 드럼건조(drum drying), 동결건조 등을 예로 들 수 있다.

이상의 방법으로 얻어진 미생물 배양 침전물은 사료 첨가용 색소 함유물로 양호하게 사용하는 것이 가능하다. 본 발명의 사료 첨가용 함유물은 카로티노이드화합물의 분해를 방지하기 위하여 BHT(부틸히드록시톨루엔, butylated hydroxytoluene), 에톡시퀸(ethoxyquin), 비타민 E 등의 산화방지제를 첨가하는 것이 가능하며 이들 표면을 젤라틴 등으로 피복을 하여도 좋다.

다음으로 본 발명에서 사용되는 미생물에 대하여 설명한다. 본 발명에서 사용되는 미생물은 세균, 효모 등 배양에 의해 카로티노이드 화합물을 생산하고, 그 배양 침전물 중에 3질량% 이상의 카로티노이드 화합물을 함유할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않으나, 배양 중에 미생물내에 축적된 카로티노이드 화합물을 이용하는 것을 고려하여, 세포벽이 얇고, 효율적으로 색소의 이용이 가능한 세균을 사용하는 것이 바람직하다. 특히, 증식속도의 빠르기, 카로티노이드 화합물의 생산성에서부터 16S 리보좀 RNA에 대응하는 DNA의 염기서열이 서열번호 1에 기재된 염기서열과 실질적으로 상동한 것이 특히 바람직하다.

여기서 실질적인 상동이라 함은 DNA의 염기서열 결정시 오류의 빈도 등을 고려하여 98% 이상의 상동성이 있는 것을 의미한다.

상기 서열과 실적적으로 상동인 서열이 있는 세균은, 배양에 의해 균체내에 아스타크산틴, 아도니크산틴, β-카로틴, 에키네논, 칸타크산틴, 제아크산틴, β-크립토크산틴(cryptoxanthin), 3-히드록시에키네논(hydroxyechinenone), 아스테로이데논(asteroidenone), 아도니루빈 등의 카로티노이드 화합물이 혼합물로 축적된다. 균체 중에 포함되는 카로티노이드 화합물의 생성비율은, 예를 들어 배양에 있어서 호기조건을 바꿈으로써 카로티노이드 화합물의 생성비율을 변화시키는 것이 가능하다. 일례로 배양액 중의 용존 산소 농도를 높여 아도니크산틴의 성분비율을높이는 것이 가능하다. 또한, 변이에 의해 카로티노이드 화합물의 생성비율이 변화한 균체를 얻는 것도 가능하다. 변이의 방법으로는 X선 조사, 자외선 조사 등의 물리적 방법, 화학변이제, 예를 들어 NTG(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)과, EMS(ethylmethanesulfonate) 등에 의한 변이처리와 같이 화학적 방법을 이용한 인위적 변이처리 등을 이용하는 것도 가능하다.

이 세균들 중, 생성하는 카로티노이드 화합물 가운데 40질량% 이상이 아스타크산틴인 것으로 E-396주를 예로 들 수가 있다. 이 균주는, 발명자들이 새롭게 분리한 것으로, 공업기술원생명공학공업기술연구소(일본국 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1초메 1반)에 평성 5년 4월 27일에 FERM BP-4283으로 기탁되었다. 이 균주의 균학적 성질은, 특개평 7-79796호 공보, 특개평8-9964호 공보, 특개평 9-308481호 공보에 기재되어 있는 바와 같다. 또한, 이 균주의 16S 리보좀 RNA에 대응하는 DNA의 염기서열은 서열번호 1에 나타낸 것과 같다.

16S 리보좀 RNA에 대응하는 DNA의 염기서열이 본 발명의 특정한 서열과 실질적인 상동인 균주가 생산하는 아스타크산틴은 (3S, 3S')-아스타크산틴의 순도와 거의 100%이다. 천연물인 가재, 헤마토코커스(haematococuss), 연어, 송어, 참돔에 존재하는 아스타크산틴은 (3S, 3S')체의 함유율이 높다는 것이 알려져 있다. 한편, 파피아 로도자이머(Phaffia rhodozyma)는 (3R, 3R')체의 함유율이 높은 천연으로 존재하는 아스타크산틴과는 반대의 절대 배치를 가지는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 균주가 생산하는 아스타크산틴은 100%의 (3S, 3S')아스타크산틴으로 천연에 있어 다수를 점하는 아스타크산틴과 동일의 절대배치를 가지는 것으로 산업상가치가 높다.

이하, 실시예에서 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에만 한정되는 것이 아니다.

[실시예 1]

표 1의 조성에서 만들어지는 배지 6ml을 직경 18mm의 시험관에 넣고, 121℃, 15분간 증기 살균하였다. 여기에 E-396주(PERM BP-4283)을 1백금이(platinum loop)접종하고, 28℃에서 2일간 350rpm 의 왕복진탕배양을 행하였다. 이 배양액 2ml을 위와 같은 조성의 배지가 100ml들어있는 500ml용량의 사카구치(Sakaguchi)플라스크 하나에 접종하여 28℃, 6일간 100rpm의 왕복진탕배양을 행하였다. 배양액 100ml에서부터 원심분리하여 균체(습중량3.2g)를 수득하였다. 이 균체에 이온교환수 50ml을 첨가하여 충분히 현탁시킨 후, 재차 원심분리하여 균체(습중량 3.1g)을 수득하였다. 다음으로, 균체 3.1g을 동결 건조하여 균체 건조물 1.1g을 수득하였다. 건조 균체물 중의 카로티노이드 함유량을 고속액체 크로마토그래피로 분석한 결과를 표 2에 나타내었다. 또한, 균체 건조물 중의 수분함량은 2.5%이었다.

표 1

조성	첨가량(g/L)
효모엑기스	20
펩톤	5
슈크로스	100
KH₂PO₄	1.5
Na₂HPO₄·12H₂O	3.8
MgSO₄· 7H₂O	0.5
FeSO₄·7H₂O	0.01
CaCl₂·2H₂O	0.01
pH7(Na₂CO₃로 조정)

표 2

카로티노이드 화합물	함유량(mg/g)
β-카로틴(β-carotene)	1.6
에키네논(echinenone)	1.9
3-히드록시에키네논(3-hydroxyechinenone)	0.9
칸타크산틴(canthaxanthin)	2.3
아도니루빈(adonirubin)	5.6
아스타크산틴(astaxanthin)	13.0
아스테로이데논(asteroidenone)	0.6
아도니크산틴(adonixanthin)	5.3
제아크산틴(zeaxanthin)	0.01
총 카로티노이드	31.2

[실시예 2]

E-396주(FERM BP-4283)를 NTG(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)로 변이처리를 하고, 적색의 색조가 진한 콜로니를 선택하였다. 이들 주의 배양액 중의 카로티노이드 화합물을 분석하고, 아스타크산틴의 생산량이 향상된 변이주를 선택하였다. 표 1의 조성의 배지 5ml을 직경 18mm의 시험관에 넣고, 121℃, 15분간 증기 살균하였다. 여기에 변이주를 1백금이 접종하여 30℃에서 2일간 300rpm의 왕복진탕배양을 행하였다. 이 배양액 2ml을 위와 동일 조성의 배지가 100ml 들어 있는500ml 용량의 사카구치 플라스크에 접종하여, 29℃, 2일간 120rpm의 왕복진탕배양을 행하였다. 다음으로 이 배양액 800ml 분을 표 3의 조성의 배지가 20L 들어있는 30L 용량의 발효조에 접종하고, 29℃, 400rpm, 1.0vvm의 호기배양을 150시간 행하였다. 배양액 18L에서 샤플(Sharples)형 원심분리기에서 원심분리하여 균체(습중량 600g)을 수득하였다. 이 균체에 수돗물을 20L 첨가하고, 충분히 현탁시킨 후, 재차 샤플형 원심분리기에 의해 균체(습중량 530g)를 수득하였다. 다음으로, 균체 530g에 수돗물을 1.5L 첨가하고 충분히 현탁한 후, 분무 건조기(spray drier)를 이용하여 균체를 건조하고, 균체 건조물 200g을 수득하였다. 운전 조건은 입구 공기 온도 210℃, 출구 공기 온도 105℃, 현탁액 공급 속도 38mL/min으로 행하였다. 건조 균체물 중의 카로티노이드 함유를 고속액체 크로마토그래피에 의해 분석한 결과는 표 4에 나타내었다. 또한, 건조 균체물 중의 수분 함량은 3.1%이었다.

표 3

조 성	첨가량(g/L)
효모엑기스	20
펩톤	5
글루코스	120
KH₂PO₄	1.5
Na₂HPO₄·12H₂O	3.8
MgSO₄·7H₂O	0.5
FeSO₄·7H₂O	0.01
CaCl₂·2H₂O	0.01
pH7(Na₂CO₃로 조정)

표 4

카로티노이드 화합물	함유량(mg/g)
β-카로틴	0.7
에키네논	1.1
3-히드록시에키네논	0.6
칸타크산틴	1.7
아도니루빈	5.4
아스타크산틴	19.4
아스테로이데논	0.8
아도니크산틴	5.5
제아크산틴	0.02
총 카로티노이드	35.2

[발명의 효과]

본 발명의 사료 첨가용 색소 함유물은, 카로티노이드가 미생물의 세포막, 세포벽 등의 작용에 의해 안정화되어 있기 때문에, 산소나 빛 등에 대해 내성을 나타내고, 장기간 안정적인 보존이 가능하다.

또한, 본 명세서에 인용된 모든 간행물, 특허 및, 특허출원을 그대로 참고로 하여 본 명세서에 사용하였다.

Claims

카로티노이드 화합물을 3 질량% 이상 함유하는 미생물 배양 침전물에 의해 제조되는 사료 첨가용 색소 함유물.
제 1항에 있어서,

카로티노이드 화합물 중의 40질량% 이상이 아스타크산틴인 것을 특징 으로 하는

사료 첨가용 색소 함유물.
제 1항 또는 2항에 있어서,

미생물 배양 침전물 중의 16S 리보좀 RNA에 대응하는 DNA의 염기서열 이 서열번호 1에 기재된 염기서열과 98%이상 상동성을 가지는 것을 특징으로 하는

사료 첨가용 색소 함유물.
제 3항에 있어서,

미생물 배양 침전물 중의 미생물이 E-396주, 또는 그의 변이주인 것을 특징으로 하는

사료 첨가용 색소 함유물.