CN1337854A - 加入饲料的含色素的物质 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及加到饲料中的含高浓度类胡萝卜素化合物的微生物培养物沉淀的含色素的物质。因为这些物质对氧气、光等具有抵抗力,可以在稳定状态下长时间贮存。

Description

加入饲料的含色素的物质
技术领域
本发明涉及一种用于饲料添加剂的含色素的物质，其包括含类胡萝卜素化合物的微生物培养物沉淀。
背景技术
“类胡萝卜素化合物”是具有长链聚烯结构(其大多数具有C40四萜)并且呈现黄色、橙色、红色或紫色的一组色素的通称。更具体指诸如β-胡萝卜素、虾青素、角黄素、玉米黄质、海胆酮、adonimbin和adonixanthin的化合物。这些化合物可用作对饲料添加剂、食品添加剂、药品等有用的天然色素。例如，从工业观点来看，虾青素作为饲料添加剂(如作为饲养各种鱼诸如鲑鱼、鳟鱼、黄鲷等的颜色改良剂)是有价值的，同时也用作一种安全的天然食品添加剂。如果建立adonixanthin的工业生产方法，它与虾青素一样有前途，一样用作饲料添加剂、食品添加剂和药品。角黄素已用作饲料添加剂、食品添加剂、化妆品等，并且玉米黄质已用作饲料添加剂和食品添加剂。另外，预料海胆酮和adonirubin也可用作饲料添加剂、食品添加剂等。人们已经知道这些类胡萝卜素化合物的生产方法：化学合成、通过微生物生产、从天然产物中萃取等，关于虾青素和角黄素，它们的化学合成产品已经有售。相比于化学合成，类胡萝卜素化合物的微生物生产法因高水平的安全性因而是有利的，因为其中没有使用到金属催化剂和溶剂。一般来说，类胡萝卜素化合物在氧气和光的存在下不稳定。但是，因为通过微生物生产的类胡萝卜素化合物聚集在微生物细胞的内部，所以细胞膜、细胞壁和其他抗氧化剂保证了它们的稳定性。当类胡萝卜素化合物用作饲料添加剂或其它用途时，高水平储存稳定性是一个优势，并且如果微生物自身也能被用到，这将是一个大的优势。相反，如果细胞间的类胡萝卜素化合物在萃取和净化后使用，就有必要用到含氯溶剂或其它可能不安全的溶剂。因此，使用包括含有作为饲料添加剂的类胡萝卜素化合物的微生物的微生物培养物沉淀有大的优势。在生产类胡萝卜素化合物的微生物具有硬的细胞壁的情况下，如果提供的是天然细胞，吸收效率非常低。所以应该对细胞进行机械破坏或用化学试剂或酶分解，这样导致成本劣势。另外，存在的问题是：细胞被破坏后，类胡萝卜素化合物的稳定性降低。而且，当存在于微生物培养物沉淀中的类胡萝卜素化合物的含量低时，饲料的生产过程需要大量的沉淀物，这就引起其它的问题，如饲料的低操作性、高运输成本和营养不均衡。但是，有一种不为人知的含色素的物质，其包括一种没有硬细胞壁的微生物，这就允许了聚集的类胡萝卜素化合物的简单使用，另外还包括至少含3％(质量)的类胡萝卜素化合物的微生物培养物沉淀。
在类胡萝卜素化合物中，虾青素是鱼纲(如鲑鱼、鳟鱼、黄鲷等)和甲壳纲(如虾、蟹等)含有的红色色素，因为其漂亮的颜色而有使用价值，如上所述，它已广泛用作饲料添加剂和天然食品添加剂。关于已知用来生产虾青素的红酵母Phaffia rhodozyma，存在的问题是，作为酵母，它有硬的细胞壁。在以细菌生产虾青素的方法中，下面的描述已为人知，但是关于其中的每一种，单位干细胞重量的含量低：一种属于短杆菌属(Brevibacterium)的细菌(短杆菌属103号菌株)仅生产干细胞重量的0.003％的虾青素(Journal of General and AppliedMicrobiology，15，127，1969)。同时另一种属于副球菌属(Paracoccus)的细菌Paracoccus marcusii DSM11574菌株生产干细胞重量的0.022％的虾青素(WO 99/6586)。
本发明的目的是提供一种用于饲料添加剂的含色素的物质，其包括含有用作天然色素的高浓度类胡萝卜素化合物的微生物培养物沉淀。
本发明公开
为了获得上述目的，本发明提供以下方法：
1.用于饲料添加剂的含色素的物质，包括含有至少3％(质量)的类胡萝卜素化合物的微生物培养物沉淀。
2.用于饲料添加剂的含色素的物质，其特征在于至少40％(质量)的类胡萝卜素化合物是虾青素。
3.用于饲料添加剂的含色素的物质，其特征在于对应于微生物培养物沉淀中微生物的16S核蛋白体RNA的DNA核苷酸序列至少98％与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列同源。
4.用于饲料添加剂的含色素的物质，其特征在于微生物培养物沉淀中的微生物是E-396菌株或其突变体。
本说明书包括日本专利申请第11-279337号说明书中所公开的部分或所有内容，它是本申请的优先权文件。
本发明更具体描述如下。
本发明中用于饲料添加剂的含色素的物质包括微生物培养物沉淀。首先公开微生物培养物沉淀。本发明中微生物培养物沉淀可以通过一种方法获得，在这种方法里，大部分生产类胡萝卜素化合物的细胞被培养来生产这些化合物，由此产生的培养物通过过滤、离心过滤等处理，接着去除一定量的水分。任何培养生产类胡萝卜素化合物的菌株的方法都可以使用，条件是产生类胡萝卜素化合物。例如，可采用下面的方法。关于培养基，使用含有碳源、氮源、无机盐(对生产类胡萝卜素化合物的细菌的生长是必要的)和所需特别需要的物质(如维生素、氨基酸、核酸基等)的培养基。可用的碳源包括碳水化合物(如葡萄糖、蔗糖、果糖、海藻糖、甘露糖、甘露糖醇和麦芽糖)、有机酸(如乙酸、富马酸、柠檬酸、丙酸、苹果酸和丙二酸)、醇类(如乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇和异丁醇)等。所加碳源的比例依据碳源的类型，但通常每升培养基加入1到100克，优选2到50克。可用的氮源包括选自下列的一种或多种：硝酸钾、硝酸铵、氯化铵、硫酸铵、磷酸氢二铵、氨、尿素等。所加氮源的比例依据氮源的类型，但通常每升培养基加入0.1到10克，优选1到3克。可用的无机盐包括选自下列的一种或多种：磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二钠、硫酸镁、氯化镁、硫酸亚铁、氯化亚铁、硫酸锰、氯化锰、硫酸锌、氯化锌、硫酸铜、氯化钙、碳酸钙、碳酸钠和其它。所加无机盐的比例依据无机盐的类型，但通常每升培养基加入0.001到10克。可用的特别需要的物质包括选自下列的一种或多种：维生素、核酸、酵母提取物、胨、肉膏、麦精、玉米浆、干酵母、大豆饼、豆油、橄榄油、玉米油、亚麻子油和其它。所加特别需要物质的比例依据物质的类型，但通常每升培养基加入1到200克，优选10到100克。培养基的pH值为2-12，优选将其调节至6-10。就培养条件而言，在15-80℃，优选在20-35℃下，通常1-20天，优选2-8天，实施振动培养或曝气搅拌培养。
其次，将水分从上面方法所获得培养物中去除。要获得本发明中用于饲料添加剂的含色素的物质而去除水分的量依据培养基(如色素含量)的状态，但就通常方法而言，首先实施过滤，当需要进一步去除水分时，再接着干燥沉淀物。过滤方法包括一般过滤、离心和其它。由于所获得的沉淀物含有水和包括溶解的培养基成分(如盐水和碳水化合物)的沉淀物，这样做是有效的：将水加到从培养基中去除的沉淀物中，悬浮，随后沉淀再次沉淀分离，以便增加其中类胡萝卜素化合物的量。通过该方法，可一定程度地去除溶解于水中的培养基组分。在应该增加类胡萝卜素化合物量的情况下，可以应用一种通过干燥沉淀物而去除水分的方法。干燥沉淀物的方法包括普通喷雾干燥、转鼓式干燥、冷冻干燥等。
通过上面方法获得的微生物培养物沉淀可成功用作含色素的物质。为了防止类胡萝卜素化合物的分解，可在培养物沉淀中加入抗氧化剂(如BHT(丁基化羟基甲苯)、乙氧基喹和维生素E)。另外，可以用明胶或其它覆盖微生物的表面。
现在已经描述了用于本发明的微生物。对于用于本发明的微生物并没有特别限制，只要可以通过微生物(如细菌和酵母)培养物可获得类胡萝卜素化合物，并在其培养物沉淀中含有至少3％(质量)的类胡萝卜素化合物。但是，考虑到培养时聚集在微生物上的类胡萝卜素化合物的使用，优选使用细胞壁足够薄而能有效利用色素的细菌。鉴于类胡萝卜素化合物的生长速度和生产率，特别优选对应16S核蛋白体RNA的DNA核苷酸序列基本与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列同源。
考虑到在测定DNA核苷酸序列时发生错误的频率，这里用的术语“基本同源”指至少98％同源。
在具有与上述序列基本同源的序列的细菌中，类胡萝卜素化合物(如虾青素、adonixanthin、β-胡萝卜素、海胆酮、角黄素、玉米黄质、β-玉米黄质、3-羟基海胆酮、asteroidenone、adonimbin)以混合物培养聚集。细胞内含有所产生的类胡萝卜素化合物的比率可以变化，如通过改变需氧培养条件。作为例子，可以通过增加培养基中溶解氧的浓度来改变产生adonixanthin的比率。同时，可以通过突变获得改变了类胡萝卜素化合物产量比率的细胞。突变的方法包括物理方法(如X光照射和紫外线照射)、使用化学诱变剂和人造突变，其中化学方法突变诸如以NTG(N-甲基-N’-nitoro-N-亚硝基胍)和EMS(乙基甲烷磺酸)处理。
所述细菌中，E-396菌株中虾青素至少占所产生的类胡萝卜素化合物的40％(质量)。该菌株最近被本发明者分离，保藏于国立生命科学和人体技术研究所，Agency of Industrial Science and Technology(1Higashi1 chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)，保藏号为1993年4月27目的FERM BP-4283号。该菌株的真菌学特点公开于日本专利申请公开第7-79796号、第8-9964号和第9-308481号。对应该菌株16S核蛋白体RNA的DNA核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
对应16S核蛋白体RNA的DNA核苷酸序列基本与本发明所述的序列同源的菌株所生产的虾青素是(3S，3’S)-虾青素，纯度几乎是100％。人们知道天然产品(如小龙虾、鞭毛藻(haematococuss)、鲑鱼、鳟鱼、黄鲷)中的虾青素含有高比率的(3S，3’S)。相反，人们知道Phaffiarhodozyma含有高比率的(3R，3’R)，其绝对构型与自然界中存在的虾青素相反。本发明中菌株生产的虾青素是100％(3S，3’S)-虾青素，从工业观点来看是有价值的，因为它与自然界大多数虾青素有相同的绝对构型。
下面提供了一些实施例来更具体地描述本发明，但本发明并不由此受到限制。实施本发明的最好方法
实施例1：
将含有表1组成的6毫升培养基放入直径为18毫米的试管，在121℃下实施蒸汽灭菌15分钟。将一个E-396菌株(FERM BP-4283)的白金环接种在里面，在28℃下，以350转/分钟实施往复摇动培养2天。将2毫升该培养液转移到含100毫升有上述相同组成的培养基的500毫升Sakaguchi烧瓶中，在28℃下，以100转/分钟实施往复摇动培养6天。通过离心过滤，从100毫升培养基获得细胞(湿重3.2克)。将细胞加到50毫升离子交换水并完全悬浮后，再次实施离心过滤，获得细胞(湿重3.1克)。随后，冷冻干燥3.1克该细胞获得1.1克干细胞。存在于干细胞中的类胡萝卜素通过高效液相色谱分析。类胡萝卜素化合物的组成显示在表2中。干细胞的水含量为2.5％。表1
组成               添加量(克/升)
酵母提取物          20
胨                  5
蔗糖                100
KH2PO4            1.5
Na2HPO4·12H2O   3.8
MgSO4·7H2O       0.5
FeSO4·7H2O       0.01
CaCl2·2H2O       0.01
pH7(用Na2CO3调节至该值)表2
类胡萝卜素化合物    含量(毫克/克)
β-胡萝卜素         1.6
海胆酮              1.9
3-羟基海胆酮        0.9
角黄素              2.3
adonirubin          5.6
虾青素              13.0
asteroidenone       0.6
adonixanthin        5.3
玉米黄质            0.01
总的类胡萝卜素      31.2
实施例2：
以NTG(N-甲基-N’-nitoro-N-亚硝基胍)使E-396菌株(FERM BP-4283)突变，并选择浓红色的菌落。分析培养基中的类胡萝卜素化合物，选择增加虾青素产量的突变菌株。将含有表1组成的5毫升培养基放入直径为18毫米的试管，在121℃下实施蒸汽灭菌15分钟。将一个E-396菌株(FERM BP-4283)的白金环接种在里面，在30℃下，以300转/分钟往复摇动培养2天。将2毫升该培养液转移到含100毫升具有上述相同组成的培养基的500毫升Sakaguchi烧瓶中，在29℃下，以120转/分钟实施往复摇动培养2天。随后，将800毫升该培养液接种到含有20升包括表3的组成的培养基的30升发酵罐内，在1.0vm和29℃下，以400转/分钟实施需氧发酵150小时。通过连续式高速离心机，从18升培养基中获得细胞(湿重600克)。将细胞加到20升自来水并完全悬浮后，再次使用同样的连续式高速离心机，获得细胞(湿重530克)。随后，加入1.5升自来水，细胞(湿重530克)完全悬浮后，用喷雾干燥器干燥细胞以获得200克干细胞。就操作条件而言，空气入口温度是210℃，出口时是105℃，悬浮液加入的速率是38毫升/分钟。存在于干细胞中的类胡萝卜素通过高效液相色谱分析。类胡萝卜素化合物的组成显示在表4中。干细胞的水含量为3.1％。表3
组成                添加量(克/升)
酵母提取物          20
胨                  5
葡萄糖              120
KH2PO4            1.5
Na2HPO4·12H2O   3.8
MgSO4·7H2O       0.5
FeSO4·7H2O       0.01
CaCl2·2H2O       0.01
pH7(用Na2CO3调节至该值)表4
类胡萝卜素化合物    含量(毫克/克)
β-胡萝卜素         0.7
海胆酮              1.1
3-羟基海胆酮        0.6
角黄素              1.7
adonirubin          5.4
虾青素              19.4
asteroidenone       0.8
adonixanthin        5.5
玉米黄质            0.02
总的类胡萝卜素      35.2
本发明的优点
由于存在于本发明中用于饲料添加剂的含色素的物质的类胡萝卜素在微生物细胞膜、细胞壁等的作用下保持稳定，所以用于饲料添加剂的含色素的物质对氧气、光等具有抵抗力，可长时间稳定贮存。本文中引用的所有公开、专利和专利申请以参考形式全部在此加入。
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Claims (4)

1.一种用于饲料添加剂的含色素的物质，其包括含有至少3％(质量)类胡萝卜素化合物的微生物培养物沉淀。
2.按照权利要求1的用于饲料添加剂的含色素的物质，其特征在于至少40％(质量)的类胡萝卜素化合物是虾青素。
3.按照权利要求1或2的用于饲料添加剂的含色素的物质，其特征在于对应微生物培养物沉淀中微生物的16S核蛋白体RNA的DNA核苷酸序列至少98％与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列同源。
4.按照权利要求3的用于饲料添加剂的含色素的物质，其特征在于微生物培养物沉淀中的微生物是E-396菌株或其突变种。
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