CN1659279A - 角黄素的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种制备角黄素的方法，其特征在于所述方法包括下述步骤：诱导产虾青素微生物对应于16S核糖体RNA的DNA碱基序列发生突变，所述DNA碱基序列与SEQ ID NO：1所示的碱基序列基本同源；筛选如此产生的角黄素相对于类胡萝卜素总产量的比率(质量百分比)比亲本菌株高的突变株；培养所获得的产角黄素菌株；以及从如此获得的培养基中回收角黄素或含角黄素的类胡萝卜素混合物。

Description

角黄素的制备方法

技术领域

本发明涉及用微生物制备角黄素或含有角黄素的类胡萝卜素混合物的方法，该角黄素可用作饲料添加剂、食品添加剂等的天然红色素。

背景技术

作为一种改善蛋黄、肉类和家禽例如鸡的皮肤色泽的方法，在动物饲料中添加角黄素已在全球广泛使用。角黄素也用于动物饲料工业，以改善肉类的色泽或海产品如鲑鱼、鳟鱼、红海鱼或虾的皮肤色泽，并且在食品工业中也可用作食品或饮料的着色剂。

已知某些种类的蘑菇(Botanical Gazette，112，228-232，1950)、鱼类和甲壳纲动物中含有角黄素。已知的产角黄素微生物的实例为那些属于短杆菌属(Brevibacterium)的微生物(Applied and EnvironmentalMicrobiology，55(10)，2505，1989)，属于红球菌属(Rhodococcus)的微生物(日本专利(未审查的申请)公告第2-138996号)，属于棒杆菌属(Corynebacterium)的微生物(日本专利(未审查的申请)公告第6-343482号)和属于一新种属的E-396菌株(日本专利(未审查的申请)公告第2001-95500号)。作为化学合成方法，已知的有β-胡萝卜素的氧化(J.Amer.Chem.Soc.，78，1427，1956)和由3-氧代-C15鏻盐合成(Pure Appl.Chem.，51，875，1979)。

发明内容

然而，前面提及的化学合成角黄素的方法要使用有机溶剂。因此，这个方法在安全性及现在优选天然产物的年代是有疑问的。常规的微生物培养也存在产率低和从天然产物中提取成本较高的问题。

关于E-396菌株，已知它是产类胡萝卜素化合物微生物，其安全性已经确定，制备高浓度的含虾青素的类胡萝卜素化合物的方法已有报导。然而，角黄素占产生的总类胡萝卜素的比率较低。

作为角黄素的替代物，从红辣椒植物中提取出的辣椒红可用于改善鸡蛋黄的色泽。由于辣椒红对热、光等条件非常不稳定，以及红辣椒的生长明显地受到天气的影响，所以它很难提供稳定工业水平的辣椒红。

因此，需要十分安全并以低价格稳定地提供角黄素的制备方法。

针对前述问题的解决方案的广泛而深入的研究，本发明人发现通过使产虾青素微生物发生突变，可以容易地获得其中角黄素比例相对于类胡萝卜素总产量高的微生物，因而完成了本发明。

准确地讲，本发明提供了下列方法。

(1)制备角黄素的方法，所述方法包括下述步骤：诱导产虾青素微生物发生突变，其中对应于其16S核糖体RNA的DNA核苷酸序列与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列基本同源；通过筛选角黄素的产率(质量百分比)相对于类胡萝卜素的产量比亲本菌株高的突变株，获得产角黄素的微生物；以及从产角黄素微生物的培养物中回收角黄素或含角黄素的类胡萝卜素化合物。

(2)依照上述(1)的方法，其中产角黄素微生物的角黄素产率相对于类胡萝卜素总产量的质量百分比至少为40％。

(3)依照上述(1)的方法，其中产角黄素微生物所产生的β-隐黄素、玉米黄素、3-羟基海胆酮、海星酮(asteroidenone)、阿东玉红(adonirubin)、阿东黄素(adonixanthin)和虾青素等，每一种的产率相对于类胡萝卜素总产量的质量百分比小于20％。

(4)依照上述(1)-(3)中任一项的方法，其中所述产虾青素微生物选自E-396菌株(已于1993年4月27日保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(现称独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心；日本国茨城县筑波市东1丁目1番1中央第6)，(the National Institute of Bioscience and Human Technology(theInternational Patent Organism Depository of the National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology；AIST Tsukuba Central 6，1-1-1，Higashi，Tsukuba，Ibaraki，Japan，保藏号FERM BP-4283)及其突变株，以及A-581-1菌株(已于1994年5月20日保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(现称独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心；日本国茨城县筑波市东1丁目1番1中央第6)，保藏号FERM BP-4671)及其突变株。

本发明以下作更详细地描述。

依照本发明的方法，产虾青素微生物用作突变的亲本菌株。此类微生物的实例是产虾青素微生物，其中对应于其16S核糖体RNA的DNA核苷酸序列与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列基本同源。鉴于例如DNA核苷酸测序的错误频率，本文所用的术语“基本同源的”代表98％或更高的同源性。

其序列与以上序列基本同源的产虾青素微生物的具体实例包括E-396菌株(FERM BP-4283)、A-581-1菌株(FERM BP-4671)、通过突变或改进E-396或A-581-1菌株获得的多种突变株及其相关菌种。如SEQ ID NO：1所示的DNA核苷酸序列对应于E-396菌株的核糖体RNA，而如SEQ ID NO：2所示的DNA核苷酸序列对应于A-581-1菌株的核糖体RNA。E-396菌株和A-581-1菌株间的16S核糖体RNA核苷酸序列的同源性为99.4％，这表明它们为紧密相关的菌株。因此，这些菌株形成一组产类胡萝卜素细菌。依照本发明方法，用于突变的亲本菌株定义为产虾青素微生物，即E-396菌株、A-581-1菌株、E-396菌株或A-581-1菌株的突变株及其相关菌种，其中对应于其16S核糖体RNA的DNA核苷酸序列与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的同源性为98％或更高。

本发明将E-396菌株作为产虾青素微生物的范例进行描述。该菌株为本发明人最新分离并已于1993年4月27日保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(现称独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心)，保藏号FERM BP-4283。另一微生物的更具体的实例是A-581-1菌株。该菌株为本发明人最新分离并已于1994年5月20日保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(现称独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心)，保藏号FERM BP-4671。

在本发明中，对使产虾青素微生物发生突变的方法并无具体限制，只要所述方法可以诱导突变即可。可利用的方法的实例包括：利用突变剂如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或者甲磺酸乙酯(EMS)的化学方法、利用如紫外照射或X-射线照射的物理方法和利用基因重组或转座子的生物学方法。这种突变可以进行一次。或者，突变可进行两次或更多次，如通过该突变制备产虾青素微生物的突变株，由该突变株进一步突变，直至获得最终突变株。

在本发明中，角黄素的产率相对于类胡萝卜素总量显著高的突变株可通过使产虾青素微生物发生突变，并分析突变株的培养液中的类胡萝卜素化合物，从突变株中筛选获得。

例如，该培养方法按下列方式进行。具体地讲，培养在培养基中进行，该培养基含有产角黄素微生物生长和产生类胡萝卜素化合物必需的组分。培养方法可以是用试管、烧瓶等进行振荡培养或通过通气搅拌培养。只要可分离并检测出类胡萝卜素化合物，从而可用任何方法对类胡萝卜素化合物进行分析。例如，可利用高效液相层析、薄层层析或纸层析。

在本发明中，可以筛选角黄素的比率相对于类胡萝卜素总量高的突变株，获得产角黄素微生物。本文所用的术语“类胡萝卜素总量”代表类胡萝卜素化合物如虾青素、角黄素、阿东黄素、β-胡萝卜素、海胆酮、玉米黄素、β-隐黄素、3-羟基海胆酮、海星酮或阿东玉红等的总量。

产虾青素微生物如E-396菌株同时产生多种类胡萝卜素化合物如虾青素、角黄素、阿东黄素、β-胡萝卜素、海胆酮、玉米黄素、β-隐黄素、3-羟基海胆酮、海星酮或阿东玉红等。因此，角黄素相对于类胡萝卜素总量的比率较低，它通常为2％到20％。

本发明中筛选到的突变株在产虾青素微生物中诱导突变，且角黄素相对于类胡萝卜素总量的产率特别高。作为最低的角黄素比率的筛选标准条件是该比率比其亲本菌株进行产角黄素突变前的高。基于类胡萝卜素总产量，可以筛选产生的类胡萝卜素优选含有至少40％(质量)角黄素，更优选含有至少60％(质量)角黄素的突变株。

推断虾青素的生物合成如下。酮酶和羟化酶修饰β-胡萝卜素两端的6元环。如果该羟化酶完全缺失，则推断仅可产生β-胡萝卜素、海胆酮和角黄素，而β-隐黄素、玉米黄素、3-羟基海胆酮、海星酮、阿东玉红、阿东黄素和虾青素等，因需要羟化酶，所以不会产生。如果该羟化酶缺失不完全，则推断相对于类胡萝卜素总量的β-隐黄素、玉米黄素、3-羟基海胆酮、海星酮、阿东玉红、阿东黄素和虾青素等的比率降低了。因此，作为另一种从突变株中筛选产角黄素微生物的有效方法，可基于相对于类胡萝卜素总量的β-隐黄素、玉米黄素、3-羟基海胆酮、海星酮、阿东玉红、阿东黄素和虾青素等比率较低的现象进行筛选。可基于每一化合物相对于总类胡萝卜素的质量比率优选低于20％，更优选低于10％的现象进行筛选。

在本发明中，只要产生角黄素，培养产角黄素微生物并回收角黄素或含角黄素的类胡萝卜素化合物的方法可以是任何方法。可利用的方法的实例如下。具体地讲，培养基含有碳源、氮源、无机盐且必要时含有产角黄素微生物生长所需的特殊营养需要(例如维生素、氨基酸或核酸)。碳源的实例包括：糖类如葡萄糖、蔗糖、果糖、海藻糖、甘露糖、甘露醇和麦芽糖；有机酸如乙酸、富马酸、柠檬酸、丙酸、苹果酸和丙二酸；和醇类如乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇和异丁醇。加入碳源的量因种类而变化，通常为每升培养基1-100克，优选为2-50克。氮源的实例包括：硝酸钾、硝酸铵、氯化铵、硫酸铵、磷酸铵、氨水和尿素。这些可以单独使用或联合两个或两个以上使用。加入氮源的量因种类而变化，通常为每升培养基0.1-20克，优选为1-10克。无机盐的实例包括：磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、硫酸镁、氯化镁、硫酸铁、氯化铁、硫酸锰、氯化锰、硫酸锌、氯化锌、硫酸铜、氯化钙、碳酸钙和碳酸钠。这些可以单独使用或联合两个或两个以上使用。加入无机盐的量因种类而变化，通常为每升培养基0.1毫克到10克。特殊的营养需要的实例包括维生素、核酸、酵母提取物、蛋白胨、肉膏、麦芽汁、玉米浆、干酵母、大豆饼、大豆油、橄榄油、玉米油和亚麻子油。这些可以单独使用或联合两个或两个以上使用。加入的特殊营养需要的量因种类而变化，通常为每升培养基0.01毫克到100克。培养基的pH调整到介于2和12之间，优选介于6和9之间。振荡培养或通气搅拌培养可在10℃到70℃，优选在20℃到35℃间进行，通常进行1-20天，优选为2-9天。

随后，除去从如此获得的培养液中的水分。为获得含角黄素的物质而应除去培养液中水分的量根据条件如培养液中的色素成分而变化。通常，首先进行过滤，如果应进一步除去水分，则使沉淀物脱水。可通过通常使用的方法如过滤或离心法进行过滤。如果将沉淀进行脱水除去水分，则沉淀中的类胡萝卜素化合物应该增加。脱水方法的实例包括通常的喷雾干燥、滚筒干燥和冷冻干燥。

如此获得的含角黄素的微生物的培养物沉淀可用作所述的含色素的饲料添加剂。如果通过本发明的方法获得的角黄素和类胡萝卜素化合物用作饲料等的着色剂，可以添加抗氧化剂如丁基羟基甲苯、乙氧基喹或维生素E等保护角黄素和类胡萝卜素化合物免于降解。此外，其表面可用明胶等包衣。

本说明书包括公开于日本专利申请第2002-112240号说明书中的部分或全部内容，这是本发明优先权的基础。

实施本发明的优选方式

在下文参考实施例，更详细地描述本发明，但并不限于此。

[实施例1]

让E-396菌株(FERM BP-4283，角黄素的质量百分比产率：7.4％)在28℃静置30分钟并用150mg/L的NTG(N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍)进行突变。将具有如表1所示成份的培养基(6ml)置入试管(内径：18mm)中并于121℃蒸汽灭菌15分钟，制备成试管培养基。将经过菌落分离的400个突变株中的每一个用接种环接种至试管培养基上，并且在28℃进行往复式振荡培养(300转/分钟)达4天。随后，将该培养物离心，并且用高效液相层析分析所得细胞的类胡萝卜素化合物。结果，获得一株其角黄素的产率相对于类胡萝卜素总产量的质量百分比为60％或更高的菌株，该菌株中类胡萝卜素化合物的分析结果示于表2中。

表1

成份	加入量，g/L
		酵母提取物蛋白胨蔗糖KH2PO4Na2HPO4·12H2OMgSO4·7H2OFeSO4·7H2OCaCl2·2H2ONa2CO3	205501.53.80.50.010.01加入的量使培养基的pH达到7

表2

类胡萝卜素化合物	每种培养液的产物浓度mg/L	产物质量百分比
			β-胡萝卜素海胆酮3-羟基海胆酮角黄素阿东玉红β-隐黄素虾青素海星酮阿东黄素玉米黄素	0.30.50.02.70.60.00.10.00.00.0	7.111.90.064.314.30.02.40.00.00.0

[实施例2]

用NTG突变E-396菌株(FERM BP-4283)，筛选深红色菌落，获得增强的虾青素生产力变异株Y-1071(角黄素的质量百分比产率：6.5％)。该Y-1071进一步用NTG突变。将具有如表1所示成份的培养基(6ml)置入试管(内径：18mm)中并于121℃蒸汽灭菌15分钟，制备成试管培养基。将经过菌落分离的1000个突变株中的每一个用接种环接种至试管培养基上，并且在28℃进行往复式振荡培养(300转/分钟)达4天。随后，将该培养物离心，并且用高效液相层析分析所得细胞的类胡萝卜素化合物。结果，获得两株其中每一株的β-隐黄素、玉米黄素、3-羟基海胆酮、海星酮、阿东玉红、阿东黄素和虾青素的产率相对于其产生的类胡萝卜素总量的质量百分比小于10％的菌株，这两个菌株中类胡萝卜素化合物的分析结果示于表3和表4中。

表3

类胡萝卜素化合物	每种培养液的产物浓度mg/L	产物质量百分比
			β-胡萝卜素海胆酮3-羟基海胆酮角黄素阿东玉红β-隐黄素虾青素海星酮阿东黄素玉米黄素	0.81.10.07.00.90.00.10.00.00.0	8.111.10.070.79.10.01.00.00.00.0

表4

类胡萝卜素化合物	每种培养液的产物浓度mg/L	产物质量百分比
			β-胡萝卜素海胆酮3-羟基海胆酮角黄素阿东玉红β-隐黄素虾青素海星酮阿东黄素玉米黄素	0.60.70.09.60.00.00.00.00.00.0	5.56.40.088.10.00.00.00.00.00.0

[实施例3]

通过利用紫外灯的紫外光照射，可突变A-581-1菌株(FERM BP-4671，角黄素的质量百分比产率：5.3％)。将具有如表1所示成份的培养基(6ml)置入试管(内径：18mm)中并于121℃蒸汽灭菌15分钟，制备成试管培养基。将经过菌落分离的300个突变株中的每一个用接种环接种至试管培养基上，并且在28℃进行往复式振荡培养(300转/分钟)达4天。随后，将该培养物离心，并且用高效液相层析分析所得细胞的类胡萝卜素化合物。结果，获得一株其中角黄素的产率相对于类胡萝卜素总量的质量百分比为60％或更高的菌株，该菌株中类胡萝卜素化合物的分析结果示于表5中。

表5

类胡萝卜素化合物	每种培养液的产物浓度mg/L	产物质量百分比
			β-胡萝卜素海胆酮3-羟基海胆酮角黄素阿东玉红β-隐黄素虾青素海星酮阿东黄素玉米黄素	0.20.30.01.50.20.00.10.00.00.0	8.713.00.065.28.70.04.30.00.00.0

本文引用的所有出版物、专利和专利申请都通过引用全部结合到本文中。

工业应用性

本发明提供了一种制备角黄素的方法，该方法廉价、可稳定供给并十分安全。

                          序列表

<110>新日本石油株式会社(Nippon Oil Corporation)

<120>角黄素的制备方法

<130>PH-1759

<140>

<141>

<160>2

<170>PatentIn Ver.2.0

<210>1

<211>1452

<212>DNA

<213>未知

<220>

<223>未知生物体的描述：E-396

<400>1

agtttgatcc tggctcagaa cgaacgctgg cggcaggctt aacacatgca agtcgagcga 60

gaccttcggg tctagcggcg gacgggtgag taacgcgtgg gaacgtgccc ttctctacgg 120

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agaaggatcg gcccgcgttg gattaggtag ttggtggggt aatggcccac caagccgacg 240

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<210>2

<211>1426

<212>DNA

<213>未知

<220>

<223>未知生物体的描述：A-581-1

<400>2

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ccacggtagg atcagcgact ggggtgaagt cgtaacaagg tagcca                1426

Claims (4)

1.一种制备角黄素的方法，所述方法包括下述步骤：诱导产虾青素微生物发生突变，其中对应于其16S核糖体RNA的DNA核苷酸序列与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列基本同源；通过筛选角黄素的质量百分比产率相对于类胡萝卜素的产量比亲本菌株高的突变株，获得产角黄素的微生物；以及从产角黄素微生物的培养物中回收角黄素或含角黄素的类胡萝卜素混合物。

2.权利要求1的方法，其中产角黄素微生物的角黄素产率相对于类胡萝卜素总产量的质量百分比至少为40％。

3.权利要求1的方法，其中产角黄素微生物所产生的β-隐黄素、玉米黄素、3-羟基海胆酮、海星酮、阿东玉红、阿东黄素和虾青素等，每一种的产率相对于类胡萝卜素总产量的质量百分比小于20％。

4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述产虾青素微生物选自E-396菌株(FERM BP-4283)及其突变株和A-581-1菌株(FERM BP-4671)及其突变株。