CN116103357A - 以柠檬酸为碳源利用粘红酵母发酵产β-胡萝卜素的方法及其包埋工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种以柠檬酸为碳源利用粘红酵母发酵产β‑胡萝卜素的方法及其包埋工艺。本发明以柠檬酸为唯一碳源培养粘红酵母并且利用粘红酵母生产β‑胡萝卜素，通过最佳发酵条件的优化，提高β‑胡萝卜素产量；此外，本发明通过抗氧剂和β‑环糊精耦合包埋的方法提高β‑胡萝卜素稳定性，增加保留率。本发明工艺较简单、成本较低、无污染，容易实现工业化生产。

Description

以柠檬酸为碳源利用粘红酵母发酵产β-胡萝卜素的方法及其包埋工艺
技术领域
本发明属于生物制造技术领域，具体涉及一种以柠檬酸为碳源利用粘红酵母发酵产β-胡萝卜素的方法及其包埋工艺。
背景技术
β-胡萝卜素(β-carotene.)是类胡萝卜素之一，是一种橘黄色脂溶性化合物，是自然界中最普遍存在且最稳定的天然色素。其广泛存在于植物体内，可在哺乳动物体内转化为维生素A，并且还具有抗氧化的能力。它能有效清除动物体内有毒的氧自由基，增强抵抗力。禽畜自身不能合成类胡萝卜素，需要从饲料中来获取，因此在畜禽养殖的饲料中添加β-胡萝卜素不但可增强动物的免疫能力，提高成活率，而且可以改善动物饲料产品的色泽。
β-胡萝卜素可通过植物提取、化学合成和微生物发酵的方法制备获得，其中利用微生物发酵法生成天然β-胡萝卜素是一条安全有效的途径。粘红酵母(Rhodotorulaglutinis.)为生产类胡萝卜素的重要菌种之一。然而目前粘红酵母发酵生产β-胡萝卜素最大的问题是产量偏低，成本较高，无法满足工业化生产水平。
粘红酵母广泛分布在陆地、淡水和海洋环境中，能够利用各种碳源(如葡萄糖、木糖、纤维二糖、蔗糖等)以满足生长。粘红酵母利用不同的碳源的过程中需产生不同的酶类来催化该生化过程，从而导致β-胡萝卜素不同合成水平，因此通过碳源的筛选提高β-胡萝卜素合成水平，并降低制备成本是重要方法。
近年来，为了改善β-胡萝卜素遇氧、热和光易发生氧化还原反应，失去生物活性的问题，研究人员利用不同的包埋技术来包埋β-胡萝卜素。常见的β-胡萝卜素剂型有油悬浮液、乳液、分散性干粉等，但稳定性都不理想，必须有新的方法来提高它的稳定性。
为此本发明提供一种以柠檬酸提供了一种以柠檬酸为碳源利用粘红酵母发酵产β-胡萝卜素的方法及其包埋工艺。
发明内容
本发明针对现有技术所存在的问题，提供了一种以柠檬酸为碳源利用粘红酵母发酵产β-胡萝卜素的方法及其包埋工艺。本发明以柠檬酸为唯一碳源培养粘红酵母并且利用粘红酵母生产β-胡萝卜素，对其最佳发酵条件进行了优化，以提高β-胡萝卜素产量。此外，本发明以β-环糊精，维生素E和乙二胺四乙酸二钠进行混合包埋β-胡萝卜素提高其稳定性，增加产量。本发明工艺较简单、成本较低、无污染，容易实现工业化生产。
本发明以柠檬酸为碳源利用粘红酵母发酵产β-胡萝卜素的方法，包括如下步骤：
步骤1：将粘红酵母冻干粉(粘红酵母ACCC20030购于中科院微生物菌种保存中心)按菌种说明活化(取出冻干粉，用1ml的无菌水溶解并混匀)接种至自制的YPD琼脂培养基(成分为蛋白胨20.0g，酵母浸粉10.0g，葡萄糖20.0g，琼脂15.0g，1000ml水，pH 6.5±0.2(25℃))斜面培养，30℃培养48h；
步骤2：用接种环挑取步骤1获得的粘红酵母菌落接种至种子培养基中，装液量为50/250mL，30℃、180r/min恒温振荡培养1d；
步骤3：按5％的接种量将步骤2种子培养基中的种子接种到发酵培养基中，装液量为50/250mL，30℃、180r/min恒温振荡培养3d-4d；
步骤4：取步骤3的发酵液于3000r/min离心15min，去除上清液，所得沉淀为粘红酵母，清洗后60℃烘干至恒重；
步骤5：采取酸热法破碎细胞，石油醚提取β-胡萝卜素。称取0.1g干燥的粘红酵母于5mL的盐酸中，盐酸浓度为3moL/L，振荡60min后，沸水浴6min，用冰水快速冷却破除细胞外壁，3000r/min离心15min，将破碎的粘红酵母菌体沉淀用蒸馏水洗涤；用5mL石油醚于20-30℃下提取30min，4000r/min离心15min，上清液淡黄色，即为β-胡萝卜素提取液。450nm处测定上清液吸光度，通过标准曲线公式计算发酵所得β-胡萝卜素产量为383.799ug/L。
步骤2中，所述种子培养基的配方为：葡萄糖40g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉10g/L，pH值自然。
步骤3中，所述发酵培养基的配方为：柠檬酸35-45g/L，牛肉膏20-30g/L，KH2PO41g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，NaCl 0.4g/L，加入6mg/L的番茄汁为促进剂，补足自来水(添加微量元素)，制作发酵培养基。
本发明还提供了β-胡萝卜素的包埋工艺，包括如下步骤：
将β-胡萝卜素提取液旋转蒸发至暗红色，加入少量植物油继续蒸发，直至除尽有机溶剂，得到β-胡萝卜素植物油；将8gβ-环糊精，0.01g维生素E和0.01g乙二胺四乙酸二钠分别作抗氧剂和抗氧辅助剂，可提高药物的包裹率。加入80mL 60℃的蒸馏水中搅拌溶解，制得β-环状糊精饱和溶液；调整磁力搅拌器至1000r/min，将1mLβ-胡萝卜素植物油缓慢地滴加到β-环糊精饱和溶液中，避光，50℃搅拌4-5h，冷藏1d后抽滤，蒸馏水洗涤固体产品，冷冻干燥后即得包合物粉末。
进一步地，β-胡萝卜素与β-环糊精的摩尔比例为1:4。
包合温度若太高则会导致包合率下降，包合时间过长或过短导致包合效果不理想，β-胡萝卜素与β-环糊精的摩尔比例对包合率也会产生影响，利用β-环糊精，维生紊E和乙二胺四乙酸二钠进行混合，更好的提高了包埋效率。
将β-胡萝卜素植物油放入透明塑料袋中，测定β-胡萝卜素含量，每2d测定一次，与原始含量相比计算出保留率提高了48.569％。
本发明的有益效果体现在：
第一，发现了当柠檬酸作为碳源能明显提高β-胡萝卜素产量，较对照组相比β-胡萝卜素产量提高了29.67％；
第二，通过用柠檬酸作为碳源构建粘红酵母产β-胡萝卜素最佳的培养基，发现柠檬酸浓度为40g/L，β-胡萝卜素产量最高，较对照β-胡萝卜素产量提高了62.23％；
第三，发现用柠檬酸作为唯一碳源时β-胡萝卜素产量最高，且根据上述碳源市场价格所产相同β-胡萝卜素的所用碳源成本最低，工艺更简单。
第四，以β-环糊精、维生素E和乙二胺四乙酸二钠包埋β-胡萝卜素，第10天时包埋的保留率相对于未包埋的提高了38.569％，β-胡萝卜素稳定性提高。因此该方法具有提高产量，成本低，稳定性高的优点。
附图说明
图1是不同碳源种类对粘红酵母发酵产β-胡萝卜素的影响。
图2是柠檬酸浓度对粘红酵母产β-胡萝卜素的影响。
图3是不同碳源复合情况对粘红酵母发酵产β-胡萝卜素的影响。
图4是不同碳源复合产β-胡萝卜素与成本费用比值的对比。
图5是β-胡萝卜素包埋与未包埋保留率对比。
图6是冷藏后包埋物照片。
图7是冷冻干燥后包埋物照片。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明技术方案作进一步说明。
实施例1：
1、将粘红酵母冻干粉(粘红酵母ACCC20030购于中科院微生物菌种保存中心)按菌种说明活化，取出冻干粉，用1ml的无菌水溶解并混匀接种至自制的YPD琼脂培养基斜面培养，30℃培养48h；
2、取长势较好的粘红酵母菌落，用接种环挑取接种至种子培养基(葡萄糖40g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉10g/L，pH值自然)中，装液量为50/250mL，30℃、180r/min恒温振荡培养1d；
3、按5％的接种量将步骤2种子培养基中的种子接种到发酵培养基中，装液量为50/250mL，30℃、180r/min恒温振荡培养80h；发酵培养基配方：分别用40g/L的葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、柠檬酸作为发酵培养基的唯一碳源，牛肉膏20g/L、KH2PO41g/L，MgSO4·7H2O0.4g/L，NaCl 0.4g/L，加入6mg/L的番茄汁为促进剂，补足自来水(添加微量元素)，制作发酵培养基。
4、取步骤3的发酵液于3000r/min离心15min，去除上清液，所得沉淀为粘红酵母，清洗后60℃烘干至恒重；
5、采取酸热法破碎细胞，石油醚提取β-胡萝卜素。称取0.1g干燥的粘红酵母于5mL的盐酸中，盐酸浓度为3moL/L，振荡60min后，沸水浴6min，用冰水快速冷却破除细胞外壁，3000r/min离心15min，将破碎的粘红酵母菌体沉淀用蒸馏水洗涤；用5mL石油醚常温提取30min，4000r/min离心15min，上清液淡黄色，即为β-胡萝卜素提取液。450nm处测定上清液吸光度，通过标准曲线公式计算发酵所得β-胡萝卜素产量。发现用柠檬酸作为碳源时β-胡萝卜素产量最高，为383.799ug/L。
实施例2：
1、将粘红酵母冻干粉(粘红酵母ACCC20030购于中科院微生物菌种保存中心)按菌种说明活化，取出冻干粉，用1ml的无菌水溶解并混匀接种至自制的YPD琼脂培养基斜面培养，30℃培养48h；
2、取长势较好的粘红酵母菌落，用接种环挑取接种至种子培养基(葡萄糖40g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉10g/L，pH值自然)中，装液量为50/250mL，30℃、180r/min恒温振荡培养1d；
3、按5％的接种量将步骤2种子培养基中的种子接种到发酵培养基中，装液量为50/250mL，30℃、180r/min恒温振荡培养80h；发酵培养基配方：分别以柠檬酸30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L作为碳源，牛肉膏20g/L、KH2PO41g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，NaCl 0.4g/L，加入6mg/L的番茄汁为促进剂，补足自来水(添加微量元素)，制作发酵培养基。
4、取步骤3的发酵液于3000r/min离心15min，去除上清液，所得沉淀为粘红酵母，清洗后60℃烘干至恒重；
5、采取酸热法破碎细胞，石油醚提取β-胡萝卜素。称取0.1g干燥的粘红酵母于5mL的盐酸中，盐酸浓度为3moL/L，振荡60min后，沸水浴6min，用冰水快速冷却破除细胞外壁，3000r/min离心15min，将破碎的粘红酵母菌体沉淀用蒸馏水洗涤；用5mL石油醚常温提取30min，4000r/min离心15min，上清液淡黄色，即为β-胡萝卜素提取液。450nm处测定上清液吸光度，通过标准曲线公式计算发酵所得β-胡萝卜素产量。发现柠檬酸浓度为40g/L，β-胡萝卜素产量最高为372.015ug/L。
实施例3：
1、将粘红酵母冻干粉(粘红酵母ACCC20030购于中科院微生物菌种保存中心)取出冻干粉，用1ml的无菌水溶解并混匀接种至自制的YPD琼脂培养基接种至自制的YPD琼脂培养基斜面培养，30℃培养48h；
2、取长势较好的粘红酵母菌落，用接种环挑取接种至种子培养基(葡萄糖40g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉10g/L，pH值自然)中，装液量为50/250mL，30℃、180r/min恒温振荡培养1d；
3、按5％的接种量将步骤2种子培养基中的种子接种到发酵培养基中，装液量为50/250mL，30℃、180r/min恒温振荡培养80h；发酵培养基配方：分别用40g/L的葡萄糖和柠檬酸复合碳源(质量浓度比1:1)、40g/L蔗糖和柠檬酸复合碳源(质量浓度比1:1)、40g/L麦芽糖和柠檬酸(质量浓度比1:1)、40g/L淀粉和柠檬酸复合碳源(质量浓度比1:1)、40g/L豆油和柠檬酸(质量浓度比1:1)、40g/L葵花籽油和柠檬酸复合碳源(质量浓度比1:1)、40g/L棉籽油和柠檬酸复合碳源(质量浓度比1:1)、40g/L柠檬酸唯一碳源作为发酵培养基的碳源，牛肉膏20g/L、KH2PO41g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，NaCl 0.4g/L，加入6mg/L的番茄汁为促进剂，补足自来水(添加微量元素)，制作发酵培养基。
4、取步骤3的发酵液于3000r/min离心15min，去除上清液，所得沉淀为粘红酵母，清洗后60℃烘干至恒重；
5、采取酸热法破碎细胞，石油醚提取β-胡萝卜素。称取0.1g干燥的粘红酵母于5mL的盐酸中，盐酸浓度为3moL/L，振荡60min后，沸水浴6min，冰水快速冷却破除细胞外壁，3000r/min离心15min，将破碎的粘红酵母菌体沉淀用蒸馏水洗涤；用5mL石油醚在20-30℃提取30min，4000r/min离心15min，上清液淡黄色，即为β-胡萝卜素提取液。450nm处测定上清液吸光度，通过标准曲线公式计算发酵所得β-胡萝卜素产量。发现用柠檬酸作为唯一碳源时β-胡萝卜素产量最高，为386.052ug/L(图3)，且根据上述碳源市场价格所产相同β-胡萝卜素的所用碳源成本最低(图4)，工艺更简单。
实施例4：
1、将粘红酵母冻干粉(粘红酵母ACCC20030购于中科院微生物菌种保存中心)按菌种说明活化，取出冻干粉，用1ml的无菌水溶解并混匀接种至自制的YPD琼脂培养基斜面培养，30℃培养48h；
2、取长势较好的粘红酵母菌落，用接种环挑取接种至种子培养基(葡萄糖40g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉10g/L，pH值自然)中，装液量为50/250mL，30℃、180r/min恒温振荡培养1d；
3、按5％的接种量将步骤2种子培养基中的种子接种到发酵培养基中，装液量为50/250mL，30℃、180r/min恒温振荡培养80h；发酵培养基配方：柠檬酸40g/L、牛肉膏20g/L、KH2PO41g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，NaCl 0.4g/L，加入6mg/l的番茄汁为促进剂，补足自来水(添加微量元素)，制作发酵培养基。
4、取步骤3的发酵液于3000r/min离心15min，去除上清液，所得沉淀为粘红酵母，清洗后60℃烘干至恒重；
5、采取酸热法破碎细胞，石油醚提取β-胡萝卜素。称取0.1g干燥的粘红酵母于5mL的盐酸中，盐酸浓度为3moL/L，振荡60min后，沸水浴6min，用冰水快速冷却破除细胞外壁，3000r/min离心15min，将破碎的粘红酵母菌体沉淀用蒸馏水洗涤；用5mL石油醚常温提取30min，4000r/min离心15min，上清液淡黄色，即为β-胡萝卜素提取液。450nm处测定上清液吸光度，通过标准曲线公式计算发酵所得β-胡萝卜素产量为372.015ug/L。
6、将β-胡萝卜素浸提液用旋转蒸发器蒸发到暗红色，加入少量植物油继续蒸发，直至除尽有机溶剂，得到胡萝卜素植物油；将8gβ-环糊精0.01g维生素E和0.01g乙二胺四乙酸二钠分别作抗氧剂和抗氧辅助剂。加入60℃的80mL蒸馏水中搅拌溶解，制备β-环状糊精饱和溶液。调整磁力搅拌器至1000r/min，将1mLβ-胡萝卜素植物油，缓慢地滴加到β-环糊精饱和溶液中，避光，50℃搅拌4.5h，冷藏1d后抽滤(图6)，蒸馏水洗涤固体产品，冷冻干燥后即的包合物粉末(图7)。将β-胡萝卜素植物油放入透明塑料袋中，测定β-胡萝卜素含量，每2d测定一次，与原始含量相比计算出保留率为63.746％。
实施例5：包埋与未包埋对比
将β-胡萝卜素浸提液用旋转蒸发器蒸发到暗红色，加入少量植物油继续蒸发，直至除尽有机溶剂，得到胡萝卜素植物油；称取8gβ-环糊精0.01g维生素E和0.01g乙二胺四乙酸二钠分别作抗氧剂和抗氧辅助剂。加入60℃的80mL蒸馏水中搅拌溶解，制备β-环状糊精饱和溶液。调整磁力搅拌器至1000r/min，将1mLβ-胡萝卜素植物油，缓慢地滴加到β-环糊精饱和溶液中，避光，50℃搅拌4.5h，冷藏1d后抽滤，蒸馏水洗涤固体产品，冷冻干燥后即的包合物粉末。将β-胡萝卜素植物油放入透明塑料袋中，测定β-胡萝卜素含量，每2d测定一次，并与原始含量相比计算出保留率。
未进行包埋的β-胡萝卜素油中β-胡萝卜素含量下降很快，10d后只有29.183％，其中在第2天和第6天保留率明显下降，第6天到第10天的保留率基本趋于稳定。而经β-环糊精包埋后的β-胡萝卜素的保留率为67.752％，第10天时包埋的保留率相对于未包埋的提高了38.569％。从实验的结果可以发现当β-胡萝卜素经包合后，其稳定性比未包合的β-胡萝卜素样品有较大的提高，说明被包合后，能起到提高β-胡萝卜素稳定性的作用。
实施例6：抗氧化剂添加对包埋效果影响
将β-胡萝卜素浸提液用旋转蒸发器蒸发到暗红色，加入少量植物油继续蒸发，直至除尽有机溶剂，得到胡萝卜素植物油；称取8gβ-环糊精0.01g维生素E和0.01g乙二胺四乙酸二钠分别作抗氧剂和抗氧辅助剂。加入60℃的80mL蒸馏水中搅拌溶解，制备β-环状糊精饱和溶液。调整磁力搅拌器至1000r/min，将1mLβ-胡萝卜素植物油，缓慢地滴加到β-环糊精饱和溶液中，避光，50℃搅拌4.5h，冷藏1d后抽滤，蒸馏水洗涤固体产品，冷冻干燥后即的包合物粉末。将β-胡萝卜素植物油放入透明塑料袋中，测定β-胡萝卜素含量，每2d测定一次，并与原始含量相比计算出保留率。
将β-胡萝卜素浸提液用旋转蒸发器蒸发到暗红色，加入少量植物油继续蒸发，直至除尽有机溶剂，得到胡萝卜素植物油；称取8gβ-环糊精加入60℃的80mL蒸馏水中搅拌溶解，制备β-环状糊精饱和溶液。调整磁力搅拌器至1000r/min，将1mLβ-胡萝卜素植物油，缓慢地滴加到β-环糊精饱和溶液中，避光，50℃搅拌4.5h，冷藏1d后抽滤，蒸馏水洗涤固体产品，冷冻干燥后即的包合物粉末。将β-胡萝卜素植物油放入透明塑料袋中，测定β-胡萝卜素含量，每2d测定一次，并与原始含量相比计算出保留率。
未添加抗氧化剂和抗氧辅助剂的β-胡萝卜素油中β-胡萝卜素含量下降相比较快，10d后的保留率为52.135％。而经β-环糊精包埋后的β-胡萝卜素的保留率为67.752％，第10天时包埋的保留率相对于未加抗氧化剂的提高了15.59％。从实验的结果可以发现当有抗氧化剂的添加β-胡萝卜素经包合后，其稳定性比未添加的β-胡萝卜素样品有较大的提高，能起到提高β-胡萝卜素稳定性的作用。
实施例7：
将β-胡萝卜素提取液旋转蒸发至暗红色，加入少量植物油继续蒸发，直至除尽有机溶剂，得到β-胡萝卜素植物油；将8gβ-环糊精，0.01g维生素E和0.01g乙二胺四乙酸二钠分别作抗氧剂和抗氧辅助剂，可提高药物的包裹率。加入80mL 60℃的蒸馏水中搅拌溶解，制得β-环状糊精饱和溶液；调整磁力搅拌器至1000r/min，将1mLβ-胡萝卜素植物油缓慢地滴加到β-环糊精饱和溶液中，避光，50℃搅拌4-5h，发现当超过5h后发现包合效果在下降，选择5h为最佳包合时间，冷藏1d后抽滤，蒸馏水洗涤固体产品，冷冻干燥后即得包合物粉末。进一步地，β-胡萝卜素与β-环糊精的摩尔比例为1:4，将β-胡萝卜素植物油放入透明塑料袋中，测定β-胡萝卜素含量，每2d测定一次，并与原始含量相比计算出保留率。第10d的保留率为67.752％。当使用β-胡萝卜素与β-环糊精的摩尔比例为1:3和1:5时，第10d的保留率分别为51.564％和46.785％。因此β-胡萝卜素与β-环糊精的摩尔比例对包合率也会产生影响，最佳摩尔比例为1:4。

Claims (8)

1.以柠檬酸为碳源利用粘红酵母发酵产β-胡萝卜素的方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤1：将粘红酵母冻干粉按菌种说明活化接种至YPD琼脂培养基斜面培养，30℃培养48h；
步骤2：用接种环挑取步骤1获得的粘红酵母菌落接种至种子培养基中，30℃、180r/min恒温振荡培养1d；
步骤3：按5％的接种量将步骤2种子培养基中的种子接种到发酵培养基中，30℃、180r/min恒温振荡培养3d-4d；
步骤4：取步骤3的发酵液离心并去除上清液，所得沉淀为粘红酵母，清洗后烘干至恒重；
步骤5：采取酸热法破碎细胞，石油醚提取β-胡萝卜素；称取0.1g干燥的粘红酵母于5mL的盐酸中，振荡60min后，沸水浴6min，用冰水快速冷却破除细胞外壁，离心，将破碎的粘红酵母菌体沉淀用蒸馏水洗涤；用5mL石油醚于20-30℃下提取30min，离心，上清液淡黄色，即为β-胡萝卜素提取液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤1中，所述YPD琼脂培养基的配方为：蛋白胨20.0g，酵母浸粉10.0g，葡萄糖20.0g，琼脂15.0g，1000ml水，pH6.5±0.2，25℃。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤1中，所述粘红酵母为粘红酵母ACCC20030。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤2中，所述种子培养基的配方为：葡萄糖40g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉10g/L，pH值自然。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤3中，所述发酵培养基的配方为：柠檬酸35-45g/L，牛肉膏20-30g/L，KH2PO41g/L，MgSO4·7H2O0.4g/L，NaCl0.4g/L，加入6mg/L的番茄汁为促进剂，补足自来水添加微量元素，制作发酵培养基。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：
步骤3中，所述发酵培养基的配方中柠檬酸的含量为40g/L。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤5中，盐酸浓度为3moL/L。
8.一种β-胡萝卜素的包埋工艺，其特征在于包括如下步骤：
(1)将β-胡萝卜素提取液旋转蒸发至暗红色，加入植物油继续蒸发，直至除尽有机溶剂，得到β-胡萝卜素植物油；
(2)将8gβ-环糊精，0.01g维生素E和0.01g乙二胺四乙酸二钠进行混合，加入80mL60℃的蒸馏水中搅拌溶解，制得β-环状糊精饱和溶液；
(3)将1mLβ-胡萝卜素植物油滴加到β-环糊精饱和溶液中，避光，50℃搅拌4-5h，冷藏1d后抽滤，蒸馏水洗涤固体产品，冷冻干燥后即得包合物粉末。
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