NO317058B1 - Rapamycinderivater, fremgangsmate for fremstilling derav, farmasoytisk preparat omfattende et slikt derivat, kit omfattende et preparat samt anvendelse av derivatene - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører rapamycinderivater, en fremgangsmåte for deres fremstilling, deres anvendelse som et farmasøytisk middel og farmasøytiske preparater inneholdende disse, samt et kit eller en forpakning omfattende et farmasøytisk preparat.

Rapamycin er et kjent makrolidantibiotikum produsert av Streptomvces h<yg>roscopicus som har strukturen angitt i formel A:

Se f.eks. McAlpine, J.B., et al., J. Antibiotics (1991) 44: 688; Schreiber, S.L., et al., J. Am. Chem. Soc. (1991) H3: 7433; US Patent Nr. 3 929 992. (Det har vært foreslått forskjellige nummereringsfremgangsmåter for rapamycin. For å unngå forvirring, når spesifikke rapamycinderivater her navngis er de angitte navnene med referanse til rapamycin ved anvendelse av nummereringsfremgangsmåten i formel A.) Rapamycin er et virkningsfullt immunundertrykkende middel og er også vært vist å ha antitumor- og antisoppaktivitet. Dets anvendelighet som et farmasøytisk middel er imidlertid begrenset ved dets meget lave og variable biotilgjengelighet. Videre er rapamycin uoppløselig og mangler stabilitet, hvilket gjør det vanskelig å formulere stabile galeniske preparater.

Tallrike derivater av rapamycin er kjente. Visse 40-O-substituerte rapamyciner er beskrevet f.eks. i US 5 258 389 og WO 94/09010 (O-alkylrapamyciner); WO 92/05179 (karboksylsyreestere), US 5 118 677 (amidestere), US 5 118 678 (karbamater), US 5

100 883 (fluorerte estere), US 5 151 412 (acetaler) og US 5 120 842 (silyletere).

Det er nå overraskende oppdaget at visse nye deri våtere av rapamycin har en forbedret farmakologisk profil sammenlignet med rapamycin og viser større stabilitet.

Ifølge oppfinnelsen tilveiebringes en forbindelse av formel I

hvori

R, er Ci-io-alkyl, C3-io-alkynyl, hydroksy-C3-io-alkynyl,

R2 er en rest av formel II;

hvori

R3 er valgt fra H, Ci-4-alkyl, hydroksy-C2-6-alkyl, hydroksy-Ci^-alkoksy-C2-6-alkyl

eller Ci-6-alkoksy-C2-6-alkyl;

R4 er H eller metyl;

Y er O,

X er OH eller H,

Ri er forskjellig fra Ci.1 o-alkyl når X er OH.

Hvilken som helst "alk" enhet eller "alkyl" omtalt ovenfor kan være forgrenet, lineær eller cyklisk; fortrinnsvis er den en Cj.6 alifatisk substituent eventuelt avbrutt av et oksybindeledd, mer foretrukket uavbrutt ved oksy.

Foretrukne forbindelser er forbindelser med formel Ia

hvor Ri er C3_i0alk-2-ynyl; R2 er en rest av formel II som definert ovenfor og Y = O;

og av formel Ib

hvor Ri er C3_i0alk-2-ynyl; R2 er en rest av formel II som definert ovenfor og Y = O.

Spesielt foretrukne forbindelser innbefatter

(i) 32-deokso-rapamycin; (ii) 16-0-pent-2-ynyl-32-deokso-rapamycin; (iii) 16-0-pent-2-ynyl-32(S)-dihydro-rapamycin; (iv) 16-O-pent-2-ynyl-32(S)-dihydro-40-O-(2-hydroksyetyl)-rapamycin. Forbindelser av formel I kan vise isomeri, og følgelig vil ytterligere isomere former eksistere. Det vil være åpenbart at foreliggende oppfinnelse omfatter forbindelser av formel I, de individuelle isomerene av formel F

hvor Ri, R2, Y og X er som definert ovenfor, såvel som isomerblandinger derav.

De individuelle isomerene kan separeres analogt i fremgangsmåter kjent innen teknikken.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en fremgangsmåte for fremstilling av forbindelsene av formel I som innbefatter

a) for å fremstille en forbindelse av formel I hvor X er H, reduktiv eliminering av karbonyl i stilling 32 av en forbindelse av formel IVa

hvor Ri, R2 og Y er som definert ovenfor, i beskyttet eller ubeskyttet form,

og, om nødvendig, fjernelse av de beskyttende gruppene som er tilstede; eller

b) for å fremstille en forbindelse av formel I hvor X er OH, stereoselektiv reduksjon av karbonyl i stilling 32 av en forbindelse av formel IVa som definert ovenfor; eller c) omdanning av en forbindelse av formel I hvor Ri er alkyl for å tilveiebringe en forbindelse av formel I hvor Ri er forskjellig fra alkyl.

I fremgangsmåtetrinn a) er forbindelsen av formel IVa fortrinnsvis i beskyttet form, dvs den kan innbefatte beskyttende grupper på funksjonelle grupper som ikke deltar i reaksjonene, f.eks. OH i stilling 28 og eventuelt i stilling 40 når R2 er en rest av formel n.

Reduksjonen a) til 32-deoksoforbindelsen av formel I kan hensiktsmessig utføres i to trinn: i) ved å omsette en forbindelse av formel IVa fortrinnsvis i beskyttet form med et hydrid, f.eks. diisobutylaluminiumhydrid eller fortrinnsvis litium tri-tert-butoksyalumi-niumhydrid, for å fremstille en tilsvarende 32-dihydroforbindelse. Andre fremgangsmåter og reagenser som er kjente innen teknikken for reduksjon av ketoner kan anvendes for fremstilling av 32-dihydroforbindelsen fra det tilsvarende ketonet. De innbefatter f.eks. hydrogenering, reduksjon med metaller, metallhydridreduksjon, som beskrevet i "Comprehensive Organic Transformations," R.C. Larock, VCH Publishers Inc., New York, 1989, pp. 527-535, sections 7.1.1-7.1.4 og asymmetrisk reduksjonsmetoder for ketoner, f.eks. som beskrevet i "Comprehensive Organic Transformations," R.C.Larock, VCH Publishers Inc., New York, 1989, pp. 540-547, section 7.1.15. Reduksjonstrinnet i) følges deretter av

ii) omdanning av 32-dihydroforbindelsen til det tilsvarende 32-halogenderivatet,

f.eks. 32-brom- eller (fortrinnsvis) 32-jodderivatet, som deretter reduseres f.eks. ved hjelp av et hydrid til det ønskede 32-deoksoderivatet, og når det er påkrevet, avbeskyttelse av den resulterende forbindelsen. Ytterligere reagenser som anvendt for reduksjon av halogenider kan anvendes og innbefatter f.eks. metaller

av lav valens (dvs. litium, natrium, magnesium og zink) og metallhydrider (aluminiumhydrider, borhydrider, silaner, kopperhydrider) (se "Comprehensive Organic Transformation," R.C. Larock, VCH Publishers, Inc., New York, 1989, pp. 18-20, sections 1.5.1. og 1.5.2.).

Alternativt kan halogenidreduksjon oppnås ved anvendelse av hydrogen eller en hydrogenkilde (dvs maursyre eller et salt derav) i nærvær av en egnet metallkatalysator (Raney-nikkel, palladiummetall eller palladiumkomplekser, komplekser av rhodium eller ruthenium) (se "Comprehensive Organic Transformations," R.C.Larock, VCH Publishers Inc., New York, 1989, pp. 20-24, section 1.5.3). Ytterligere kjente fremgangsmåter som anvendt for transformering av en alkohol til den tilsvarende deoksyforbindelsen kan også anvendes. Disse fremgangsmåtene innbefatter f.eks. direkte reduksjon eller reduksjon av en mellomliggende fosforforbindelse, sulfonat, tiokarbonat, tiokarbamat eller xantat og er beskrevet f.eks. i "Comprehensive Organic Transformations," R.C. Larock, VCH Publishers Inc., New York, 1989, pp. 27-31, sections 1.9.1.-1.9.4.

Egnede hydroksybeskyttende grupper og fremgangsmåter for deres dannelse og fjernelse er kjent innen teknikken, se f.eks. "Protective Groups in Organic Synthesis", andre utgave T.W. Greene og P.GM. Wuts, John Wiley & Sons, New York, 1991, kapittel 2 og referansene deri. Foretrukne OH-beskyttende grupper er triorganosilylgrupper, såsom tri(C|.6)alkylsilyl (f.eks. trimetylsilyl, trietylsilyl), triiso-propylsilyl, isopropyldimetyl-silyl, t-butyldimetylsilyl, triarylsilyl (f.eks. trifenylsilyl) eller triaralkylsilyl (f.eks. tribenzylsilyl). Avbeskyttelse kan utføres under mildt sure betingelser.

Reduksjons trinnet i) kan hensiktsmessig bevirkes ved en lav temperatur, f.eks. fra -10 til -80°C.

I trinn ii) omdannes 32-dihydroforbindelsen eventuelt i beskyttet form, fortrinnsvis 32(R)-diastereoisomeren, til en ester, fortrinnsvis et sulfonat, f.eks. mesylat, tosylat, nosylat eller triflat, etterfulgt av fortrengning med et egnet halogenid, f.eks. natriumiodid eller bromid, tetrabutylammoniumiodid eller bromid, fortrinnsvis i nærvær av en base, f.eks. et amin. 32(R)-diastereoisomeren kan separeres fra blandingen i henhold til kjente separasjonsteknikker, f.eks. kromatografi.

Egnede hydrider for å redusere 32-halogenforbindelsen innbefatter f.eks. radikal-hydrider, såsom tributyltinnhydrid eller tris-(trimetylsilyl)-silan. Reduksjon kan også utføres i fravær eller nærvær av en radikalinitiatior, f.eks. 2,2'-azobisisobutyronitril eller fortrinnsvis Et3B, hensiktsmessig ved en temperatur fra 0 til 80°C.

Et oksydasjonsmiddel, såsom kopper (H) acetat, kan hensiktsmessig tilsettes etter reduksjonstrinnet av i) eller ii), om påkrevet, for selektivt å reoksidere til karbonyl en uønsket bireaksjon som kan forekomme f.eks. i stilling 9.

Alternativt kan 32-dihydroderivatet direkte omdannes til et halogenid ved fremgangsmåter som er kjente innen teknikken, f.eks. ved anvendelse av trifenylfosfin i kombinasjon med N-brom- eller N-jod-succinimid, karbontetrabromid eller tetraiodid, 1,2-dibromtetrakloretan, 2,4,5-tribrom- eller -trijodimidazol, jod, 1,2-dijodetan, eller ved anvendelse av tionylbromid eller metyltrifenoksyfosfoniumjodid.

Reduksjonen av karbonyl i stilling 32 til 32-deoksoderivatet kan også utføres ved dannelsen av et tosylhydrazon etterfulgt av behandling med et boran, f.eks. katekolboran, eller ved dannelsen av et ditian etterfulgt av egnet reduksjon, f.eks. med Raney-nikkel eller hydrid, f.eks. tributyltinnhydrid. Andre kjente fremgangsmåter for transformering av et keton til det tilsvarende alkanet kan anvendes; slike fremgangsmåter innbefatter f.eks. direkte reduksjon (se "Comprehensive Organic Transformations", R.C.Larock. VCH Publishers, Inc., New York, 1989, pp. 35-37, section 1.12.1.) eller reduksjon via hydrazoner ("Comprehensive Organic Transformations", R.C. Larock, VCH Publishers Inc., New York, 1989, pp. 37-38, section 1.12.2.) og via svovel- og selenderivater ("Comprehensive Organic Transformations", R.C. Larock, VCH Publishers Inc., New York, 1989, pp.34-35, sections 1.10. og 1.11.).

Reduksjonstrinnet b) til 32(S)-dihydroforbindelsen av formel I utføres under utvalgte betingelser. Fortrinnsvis anvendes et reduksjonsmiddel som i betydelig grad fremmer reduksjonen til 32(S), f.eks. natriumtrietylborhydrid. Reduksjonen kan hensiktsmessig

utføres ved en lav temperatur, f.eks. fra -50 til -80°C, i et inert oppløsningsmiddel, f.eks. THF dietyleter, glym, diglym eller metyl t-butyleter. Separasjonen av 32(S)-dihydroforbindelsen fra de lave mengdene av 32(R)-dihydroforbindelsen produsert kan utføres ved fremgangsmåter kjente innen teknikken, f.eks. kolonnekromatografi, reversfasekromato-grafi.

Om ønsket kan hydroksygruppene i stilling 28 og eventuelt i stilling 40 beskyttes før reduksjonen og avbeskyttes deretter, f.eks. som beskrevet ovenfor. Fortrinnsvis utføres reduksjonstrinnet b) uten OH-beskyttelse.

Omdanningstrinnet c) kan utføres i henhold til fremgangsmåter kjente innen teknikken. For eksempel kan en forbindelse av formel I, hvor Rj er alkyl, fortrinnsvis metyl, omsettes med en forbindelse Rx-OH hvor Rx er alkenyl eller hydroksyalkynyl for å tilveiebringe en forbindelse av formel I hvor R, er alkynyl eller hydroksyalkynyl. Reaksjonen kan hensiktsmessig utføres i et aprotisk oppløsningsmiddel, f.eks. diklor-metan, toluen, acetonitril eller THF under sure betingelser.

Fortrinnsvis utføres reduksjonen i stilling 32, spesielt reduksjonstrinnet b) på en forbindelse av formel IVa hvor R\ allerede har den ønskede betydningen, hvor f.eks. Rx er alkynyl, for derved å unngå en senere omdanning etter reduksjon. En forbindelse av formel IVa hvor Rj er alkynyl eller hydroksyalkynyl, anvendt som utgangsmateriale, kan fremstilles ved anvendelse av en forbindelse Rx-OH som beskrevet ovenfor.

Forbindelser anvendt som utgangsmateriale kan fremstilles analogt fremgangsmåter kjente og praktisert innen teknikken, f.eks. som beskrevet i USP 5 258 389, WO 94/09010, WO 95/16691, USP 5 120 842 osv.

De følgende eksemplene illustrerer oppfinnelsen. Alle temperaturer er angitt i °C. Følgende forkortelser anvendes:

THF = tetrahydrofuran

TES = trietylsilyl

EKSEMPEL 1;

32-Deoksorapamycin (R) = CH3; R2 = hvor R3 = H og R4 = CH3;

X = H; Y = 0)

Til en omrørt, avkjølt (-78°) oppløsning av 26,1 g (22,85 mmol) av 28,40-bis-O-TES-rapamycin i 260 ml THF tilsettes det 50,3 ml (50,3 mmol) av en IM oppløsning av litium-tri-t.-butoksyaluminiumhydrid i THF. Den resulterende blandingen tillates å oppvarmes til -15°C iløpet av to timer. Deretter erstattes avkjølingsbadet av et isbad, som bringer temperaturen til 0°, og omrøring fortsettes i 1 time ved denne temperaturen. Reaksjonsblandingen helles i en skilletrakt inneholdende 750 ml etylacetat og 400 ml iskald 2N vandig sitronsyre og ristes kort. Det vandige laget separeres og ekstraheres to ganger med kald etylacetat. Den kombinerte organiske oppløsningen vaskes med iskald 2N vandig sitronsyre, vann, mettet vandig natriumbikarbonat og to ganger med mettet saltvannsoppløsning, tørkes deretter over vannfritt natriumkarbonat, filtreres og konsentreres under redusert trykk. Resten, bestående av en blanding av 32(R)-dihydro-28,40bis-O-TES-rapamycin og (32R) 9,32-bis-dihydro-28,40-bis-O-TES-rapamycin, oppløses uten ytterligere rensing i 260 ml metanol. Oppløsningen avkjøles til 0°C og behandles med 6,85 g (34,31 mmol) av kopper (II) acetat. Etter omrøring i en time fortynnes den resulterende suspensjonen med metyl-t.-butyleter og vaskes to ganger med vann og to ganger med mettet saltvannsoppløsning. De vandige lagene tilbakeekstraheres med metyl-t-butyleter. Den kombinerte organiske oppløsningen tørkes over vannfritt natriumsulfat, filtreres og konsentreres under redusert trykk. Resten renses ved silikagelkromatografi (60:40 heksan/metyl-t-butyleter) for å gi rent 32(R)-dihydro-28,40-bis-O-TES-rapamycin som et hvitt faststoff.

<]>H NMR (CDC13) 4:1 blanding av rotamerer, kjemiske forskyvninger i parenteser refererer til den minste rotameren 6 0,72(1H, dd, H-38ax), 1,63 (1,60) (3H, s, C17-CH3), 1,66 (1,69) (3H, s, C29-CH3), 1,77 og 1,81 (H-33), 2,46 (1H, m, H-31), 2,82 (2,91) (1H, m, H-25), 2,91 (1H, m, Y-39), 3,13 (3, s, CI6-OCH3), 3,26 (3H, s, C27-OCH3), 3,41 (1H, m, H-40), 3,43 (3H, s, C39-OCH3), 3,62 (1H, m, H-32), 3,75 (3,57) (1H, d, H-27), 4,10 (1H, d, H-28), 4,81( 1H, bred s, C10-OH), 5,05 (1H, d, H-34), 5,27 (1H, d, H-30), 5,36 (1H, d, H-2), 5,69 (1H, dd, H-22), 6,03 (5,96) (1H, d, H-18), 6,15 (1H, dd, H-21), 6,33 (1H, dd, H-20), 6,40 (1H, dd, H-19)

MS (FAB, Lii matriks) m/z 1150 ([M + Lif) (rel. intensitet 100)

Til en omrørt, avkjølt (-15°C) oppløsning av 20,69 g (18,10 mmol) av 32(R> dihydro.28,40-bis-O-TES-rapamycin og 7,55 ml (54,27 mmol) trietylamin i 200 ml metylenklorid tilsettes det 2,10 ml (27,02 mmol) av metansulfonylklorid. Blandingen omrøres i 20 minutter, fortynnes deretter med etylacetat og mettet vandig natrium-bikarbonat tilsettes. Lagene separeres og det vandige laget ekstraheres tre ganger med etylacetat. Den kombinerte organiske fasen vaskes med mettet vandig natriumbikarbonat og saltvannsoppløsning, tørkes over vannfritt natriumsulfat, filtreres og konsentreres under redusert trykk. Resten kan renses ved kolonnekromatografi på silikagel (80:to heksan/etylacetat) slik at det oppnås rent 32(R)-dihydro-32-0-mesyl-28,40-bis-O-TES-rapamycin som et hvitt faststoff, men rutinemessig anvendes råproduktet i det etterfølgende trinnet uten ytterligere rensing.

<*>H NMR (CDCI3) 5 0,77 (1H, dd, H-38ax), 1,67 (3H, s, C17-C3), 1,72 (3H, s, C29-CH3), 2,77 (1H, M, H-25), 2,92 (1H, m, H-39), 3,03 (3H, s, C16-OCH3), 3,17 (3H, s, C27-OCH3), 3,21 (3H, s, C39-OCH3), 3,42 (1H, m, H-40), 3,45 (3H, s, CH3S03), 3,91 (1H, d, H-27), 4,10 (1H, d, H-28), 4,72 (1H, m, H-32), 4,94 (1H, s, C10-OH), 5,12 (1H, m, H-34), 5,25 (1H, d, H-30), 5,43 (1H, d, H-2), 5,88 (1H, dd, H-22), 6,03 (1H, d, H-18), 6,18 (1H, dd, H-21), 6,37 (1H, dd, H-20), 6,44 (1H, dd, H-19)

MS (FAB, Lii matriks) m/z 1228 ([M + Li]<+>) (rel. Intensitet 68), 1132 ([M - CH3S=3H) + Li]<4>) (rel. intensitet 100)

En blanding av 22,35 g (18,30 mmol) av 32(R)-dihydro-32-O-mesyl-28,40-bis-O-TES-rapamycin, 27,50 g (183,33 mmol) natriumiodid og 6,3 ml (36,68 mmol) i isopropyl-etylamin i 400 ml THF oppvarmes til tilbakeløp i 6 timer, og tillates deretter å avkjøles til romtemperatur. Den resulterende blandingen fortynnes med etylacetat og behandles med 38,4% vandig natriumbisulfitt. Lagene separeres. Den organiske fasen vaskes tre ganger med mettet vandig natriumbikarbonat og en gang med mettet saltvannsopp-løsning, tørkes deretter over vannfritt natriumsulfat, filtreres og konsentreres under redusert trykk. Resten renses ved kolonnekromatografi på silikagel (83:17 heksan/etylacetat) for å gi rent 32(S)-deokso-32-iodo-28,40-bis-O-TES-rapamycin.

<*>H NMR (CDC13) 1,5:1 blanding av rotamerer, kjemiske forskyvninger i parenteser refererer til den mindre rotameren 8 0,73 (1H, dd, H-38ac), 1,68 (1,66) 6H, s, C17-CH3 og C29-CH3), 2,72 (1H, m, H25), 2,91 (2H, m, H-32 og H-39) 3,15 (3H, s, C16-OCH3) 3,30 (3,31) (3H, s, C27-OCH3), 3,43 (3,41) (3H, s, C30-OCH3), 3,77 (3,91) 1H, d, H-27), 4,21 (4,25) (1H, d, H-28), 4,51 (1H, s, C10-OH), 5,45 (5,48) 11H, d, H-30), 5,60 (5,79) (1H, dd, H-22), 6,02 (5,85) 1H, d, H18)

MS(FAB, Lii matriks) m/z 1260 ([M + Li]"<1>) (rel. Intensitet 100)

Til en omrørt, avkjølt (0°) oppløsning av 16,79 g (13,9 mmol) av 32(S)-deokso-32-iodo-28,40-bis-O-TES-rapamycin i 190 ml toluen tilsettes det 7 ml (26,38 mmol) tributyltin-hydrid etterfulgt av 1,3 ml (1,30 mmol) av en IM oppløsning av trietylboran i heksan. Blandingen omrøres i 30 minuter og bråkjøles med mettet vandig ammoniumklorid. Lagene separeres, og det vandige laget ekstraheres to ganger med etylacetat. De kombinerte organiske lagene vaskes med vann, mettet vandig natrium-bikarbonat, vann og tre ganger med mettet saltvannsoppløsning, tørkes deretter over vannfritt natriumsulfat, filtreres og konsentreres under redusert trykk. Resten renses ved kolonnekromatografi på silikagel (75:22 heksan/metyl-t-butyleter) for å gi rent 32-deokso-28,40-bis-O-TES-rapamycin som et hvitt faststoff.

'h NMR (CDC13) 2,5:1 blanding av rotamerer, kjemiske forskyvninger i parenteser referer til den mindre rotameren 8 0,73 (1H, dd, H-38ax), 1,62 (1,57) (3H, s, C17-CH3), 1,68 (1,72) 3H, s, C29-CH3), 2,77 (2,91) (1H, m, H-25), 2,91 (1H, m, H-39), ,15 (3H, s, C16-OCH3), 3,70 (3,67) (1H, d, H-27), 4,11 (4,07) (1H, d, H-28), 4,57 (1H, bred s, C10-OH), 4,87 (4,67) 1H, d, H-34), 5,19 (5,08) (1H, d, H-30), 5,32 (1H, d, H-2), 5,60 (5,66)

(1H, dd, H-22), 6,01 (5,92) (1H, d, H-18), 6,17 (1H, dd, H-21), 6,30 (1H, dd, H-20), 6,40 (1H, dd, H-19)

MS (FAB, Lii matriks m/z 1134 ([M + Li]<*>) (rel. intensitet 100)

Til en omrørt, avkjølt (-15°C) oppløsning av 10,73 g (9,52 mmol) av 32-deokso-28,40-bis-O-TES-rapamycin i 85 ml metanol tilsettes det dråpevis 9,5 ml 2N vandig svovel-syre. Etter at tilsatsen er fullført oppvarmes reaksjonsblandingen til 0° og omrøres i 1,5 timer, fortynnes deretter med etylacetat og "stoppes" med mettet natriumbikarbonat. Lagene separeres og det vandige laget ekstraheres med tre porsjoner etylacetat. Den kombinerte organiske fasen vaskes tre ganger med mettet natriumbikarbonat og med saltvannsopp-løsning, tørkes deretter over vannfritt natriumsulfat, filtreres og konsentreres under redusert trykk. Resten oppløses i dietyleter hvorpå det ønskede 32-deokso-rapamycinet krystalliseres (fargeløse krystaller).

<*>H NMR (CDC13) 3:1 blanding av rotamerer, kjemiske forskyvninger i parenteser refererer til den mindre rotameren 8 0,70 (1H, dd, H-38ac), 1,14 og 1,32 (H32), 1,56 (H-33), 1,65 (1,62) (3H, s, C17-CH3), 1,68 (1,70) (3H, s, C29-CH3), 2,31 (2H, m, H-23 og H-31), 2,82 (2,95) (1H, m, H-25), 2,95 (1H, m, H-39), 3,14 (3H, s, C16-OCH3), 3,32 (3H, s, C27-OCH3), 3,38 (1H, m, H-40), 3,43 (3,41) (3H, s, C39-OCH3), 3,61 (1H, d, H-27), 4,12 (1H, d, H-28), 4,80 (4,71) (1H, d, H-34), 5,22 (1H, d, H-30), 5,21 (1H, d, H-2), 5,56 (1H, dd, H-22), 5,95 (5,87) (1H, d, H-18), 6,16 (1H, dd, H-21), 6,36 (1H, dd, H-20), 6,41 (1H, dd, H-19)

MS (FAB, Lii matriks) m/z 906 ([M + Li]<*>) (rel. intensitet 100)

Eksempel 2: 16-pent-2-vnvloksy-32(S)-dihydro rapamycin (Rj = pent-2-ynyl;R2 = n hvor R3 = H og R4 = CH3;X = OH;Y = 0)

Til en omrørt, avkjølt (0°) oppløsning av 970 mg (1,06 mmol) av 32(S)-dihydro-rapamycin og 1,39 ml (15,00 mmol) av 2-pentyn-l-ol i 20 ml metylenklorid tilsettes det 0,50 ml (6,50 mmol) trifluoreddiksyre. Blandingen omrøres ved 0° i tre timer og "stoppes" med mettet vandig natriumbikarbonat. Lagene separeres, og det vandige laget ekstraheres med tre porsjoner etylacetat. Den kombinerte organiske oppløsningen vaskes med mettet saltvannsoppløsning, tørkes over vannfritt natriumsulfat, filtreres og konsentreres under redusert trykk. Råblandingen renses ved kolonnekromatografi på silikagel (20:80 heksan-etylacetat), deretter ved reversfase HPLC (RP18, 81:19 metanol-vann) for å gi forbindelsen i overskriften som en hvitt amorft faststoff.

'H NMR (CDC13) 2,5:1 blanding av rotamerer, kjemiske forskyvninger i parenteser refererer til den mindre rotameren 8 0,71 (1H, dd, H-38 ac), 1,14 (1,05) (3H, t, CH3CH2CCCH20), 1,67 (3H, s, 17-CH3), 1,69 (3H, s, 29-CH3) 2,21 (sH, qt, CH3CH2CCCH20), 2,96 (1H, m, H-39), 3,33 (3,37) (3H, s, 27-OCH3), 3,41 (3,39) (3H, S, 39-OCH3), 3,78 (1H, dt, CH3CH2CCCH//0), 4,0 (1H, dt, CH3CH2CCHHO), 5,52 (5,71) (1H, dd, H-22), 5,98 (5,83) (1H, d, H-18), 6,15 (1H, m, H-21), 6,30 (1H, dd, H-20), 6,40 (1H, dd, H-19) MS (FAB) m/z 974 ([M +Li]<*>)

Eksempel 3: 16-pent-2-ynyloksy-32(S)-dihydrorapamycin (alternativ fremgangsmåte)

Rapamycin omsettes med 2-pentyn-l-ol i en fremgangsmåte analog den i eksempel 2 for å gi 16-pent-2-ynyloksy-rapamycin.

Til en omrørt, avkjølt (-77°) oppløsning av 17,5 g (18,1 mmol) av 16-demetoksy-16-pent-2-ynyloksy-rapamycin i 180 ml THF tilsettes det 21,7 ml (21,7 mmol) av en IM oppløsning av natriumtrietylborhydrid i THF. Etter 1 time ved -77° stoppes reaksjonen og nøytraliseres med en vandig oppløsning av 10% sitronsyre. Reaksjonsblandingen tillates deretter å komme til romtemperatur, og det meste THF fjernes ved fordampning under redusert trykk. Den resulterende oppløsningen ekstraheres to ganger med etyl-cetat, de organiske fasene kombineres og tørkes over natriumsulfat. Etter avdampning av oppløsningsmiddelet, kromatograferes det rå reaksjonsproduktet over silikagel ved eluering med heksan/aceton 7/3. Den endelige rensingen oppnås ved preparativ HPLC (RP-18, 76:24 metanol:vann) for å gi forbindelsen i overskriften som et hvitt amort faststoff.

De spektrale data er identiske med de som ble oppnådd ved den andre fremgangsmåten.

Eksempel 4: 32(SVdihvdro-40-O-(2-metoksv)eM-rapamvcin (Ri = CH3;R2 =n

hvor R3 = 2-metoksy-etyl) og R4 = CH3; X = OH; X = O)

Til en omrørt, avkjølt (0°) oppløsning av 2,17 g( 2,00 mmol) av 40-O-(2-metoksy)etyl-28-O-TES-rapamycin i 20 ml THF tilsettes det dråpevis 4,4 ml (4,4 mmol) av en IM oppløsing av "L-selektrid" i THF. Den resulterende gule oppløsningen omrøres i tre timer ved 0° og overskuddet hydridreagens stoppes ved tilsetning av 2 ml MeOH. Oppløsningen fortynnes med metyl-t-butyleter og mettet vandige Rochelle's salt-ppløsning tilsettes. Denne blandingen tillates å oppvarmes til romtemperatur og omrøring fortsettes i 15 minutter. Lagene separeres og den organiske oppløsningen vaskes med kald IN HC1, mettet saltvannsoppløsning, IN natriumbikarbonat og igjen med saltvannsoppløsning. De vandige vaskeoppløsningene tilbakeekstraheres med metyl-t-butyleter. De kombinerte organiske lagene tørkes over vannfritt natriumsulfat, filtreres og konsentreres under redusert trykk for å gi en råblanding av 32S og 32R isomerene av 32-dihydro.40-O-(2-metoksy)etyl-28.O-TES-rapamycin.

Råproduktet oppnådd ovenfor oppløses i 20 ml acetonitril og avkjøles til 0°. Til den resulterende oppløsningen tilsettes det 2 ml HF-pyridinkompleks. Omrøring fortsettes i 1 time og IN natriumbikarbonat tilsettes. Blandingen ekstraheres tre ganger med metyl-t-butyleter. Den kombinerte organiske oppløsningen vaskes med IN natriumbikarbonat og mettet saltvannsoppløsning, tørkes over vannfritt natriumsulfat, filtreres og konsentreres under redusert trykk. Rensing utføres ved reversfase HPLC (RP 18,5 5(j,m, 50:50-100:0 acetonitril-vann iløpet av 60 minutter) for å gi 32(S)-dihydro-40-O-(2-metoksyjetyl-rapamycin og 32(R)-dihydro-40-O-(2-metoksy)etyl-rapamycin som biprodukt.

32(S)-dihydro-40-O-(2-metoksy-etyl-rapamycin: <*>H NMR (CDC13) 2:1 blanding av rotamerer, kjemiske forskyvingen i parenteser refererer til den mindre rotameren 5 0,77 (1H, dd, H-38 ax), 1,67 (H, s, C17-CH3 og C29-CH3), 2,50 (1H, m, H-31), 3,01 (1H, m, H-25), 3,12 (2H, m, H-39 og H-40), 3,14 (3,15) (3H, s, OCH3), 3,28 (1H, m, H-32), 3,36 (3,34) (3H, 2, OCH3), 3,39 (3,38) (2H, s, OCH3), 3,48 (3,46) (3H, s, OCH3), 3,55 og 3,75 (4H, 2m, OCH2CH20), 3,84 (1H, m, H-14), 4,12 (4,16) (1H, d, H-28), 4,73 (1H, s, C10-OH), 5,03 (1H, m, H-34)

MS (FAB) m/z 980 ([M + Li]<*>)

Eksempel 5: (32S)-dihydro-40-O-(2-hydroksy)etyl-rapamycin (Ri = CH3;R2 =H

hvor R3 = CH2CH2OH og R4 = CH3; X = OH; Y = O)

Ved å følge fremgangsmåten i eksempel 4, men ved å anvende det egnede utgangs-materialet, oppnås forbindelsen i overskriften.

(32S)-dihydro-40-O-(2-hydroksy)etyl-rapamycin: <]>H NMR (CDC13) 1,7:1 blanding av rotamerer, kjemiske forskyvninger i parenteser refererer til den mindre rotameren 8 0,76 (1H, dd, H-38ax), 2,50 (1H, m, H-31), 3,10 (1H, m, H-39), 3,13 (3,14) (3H, s, C16-OCH3), 3,20 (1H, m, H.40), 3,28 (1H, m, H-32), 3,36 (3,38) (3H, s, C27-OCH3), 3,45 (3,43) (3,41) (3H, s, C39-OCH3), 3,50 (1H, d, H-27), 3,58 og 3,70 (4H, m, OCH2CH2OH), 4,12 (4,16) (1H, d, H-28), 5,06 (1H, m, H-34), 5,60 (1H, dd, H-22), 5,99 (1H, d, H-18), 6,17 (1H, dd, H-21), 6,33 (1H, dd, H-20), 6,42 (1H, dd, H-19)

MS (FAB, Lii matriks) m/z 966 ([M + Li]<*>) (rel. intensitet 100)

Eksempel 6: 16-pent-2-ynyloksy-32-deokso rapamycin (R) = pent-2-ynyl; R2 = II

hvor R3 = H og R4 = CH3; X = H;

Y = 0)

Ved å følge fremgangsmåten i eksemplene 1 og 2 eller 3, men ved å anvende de egnede utgangsmaterialene oppnås forbindelsen i overskriften.

'H NMR (CDC13) 8 0,70 (1H, dd, H-38ax), 1,23 (3H, t, CH3CH2CCCH20), 2,21 (2H, ddq, CH3CH2CCCH20), 2,78 (1H, m, H-25), 2,94 (1H, m, H-39), 3,31 (3H, s, C27-OCH3), 3,41 (3H, s, C39-OCH3), 3,62 (1H, d, H-27), 3,78 (1H, ddd, CH3CH2CCCH20), 4,02 (1H, ddd, CH3CH2CCCH20), 4,12 (1H, d, H-28), 4,79 (1H, m, H-4), 5,20 (1H, d, H.30), 5,28 (1H, bred d, H-2), 5,50 (lh, dd, H-22), 5,97 (1H, d, H-18), 6,14 (1H, dd, H-21), 6,30 (1H, dd, H-20), 6,38 (1H, dd, H-19)

MS (FAB, Lii matriks m/z ([M + Li]<*>) (rel. intensitet 100)

Forbindelsene av formel I viser farmasøytisk aktivitet og er derfor nyttige som farmasøytiske midler.

Spesielt har forbindelsen av formel I immunosupressiv og antiproliferativ aktivitet som angitt i det følgende in vitro og vivo forsøksmetodene.

1. Blandet lymfocyttreaksjon (MLR)

Den blandede lymfocyttreaksjonen ble opprinnelig utviklet i forbindelse med allografter, for å bedømme vevskompatibilitet mellom potensielle organdonorer og mottakere, og er en av de best etablerte modellene for immunreaksjon in vitro. En murin modell MLR, f.eks. som beskrevet av T. Meo i "Immunological Methods", L. Lefkovits og B. Pemis, redaktører, Academic Press, N.Y. side 227-239 (1979), anvendes for å demonstrere den immunsupressive effekten av forbindelsene av formel I. Miltceller (2 x lOVbrønn) fra Balb/c mus (hunmus, 8 - 10 uker) koinkuberes på mikrotiterplater i 5 dager med 0,5 x IO6 bestrålte (2000 rad) eller mitomycin C-behandlede miltceller fra CBA-mus (hunmus, 8-10 uker). De bestrålte allogeniske cellene induserer en proliferativ respons i Balb/c miltcellene som kan måles ved hjelp av merket forstadie inkorporering i DNA. Siden stimulatorcellene er bestrålt (eller mitomycin C-behandlet) viser de ikke respons på Balb/c celler med proliferasjon, men de bevarer sin antigenisitet. Den antiproliferative effekten av forbindelsene av formel I på Balb/c cellene måles ved forskjellige fortynninger og konsentrasjonen som resulterer i 50% inhibering av celleproliferasjonen (IC50) beregnes. Den inhibitoriske kapasitet av forsøksprøven kan sammenlignes med rapamycin og uttrykkes som en relativ IC50 (dvs. IC50 forsøksprøve/ICso rapamycin). Forbindelsene i eksemplene 1 og 2 i denne testen er funnet å ha en relativ ICjo på henholdsvis 0,3 og 0,08.

2. IL-6 formidlet proliferasjon (IL-6PROL)

Evnene av forbindelsene av formel I til å interferere med vekstfaktor assosierte signalveier bedømmes ved å anvende en interleukin-6 (IL-6)-avhengig muse-hybridomcellelinje. Analysen utføres i 96-brønns mikrotiterplater. 5000 celler/brønn dyrkes i serumfritt medium (som beskrevet av M. H. Schreier og R. Tees i Immunological Methods, I, Lefkovits og B. Pernis, Red., Academic Press 1981, Bind II, side 263-275), supplert med 1 ng rekombinant IL-6/ml. Etter 66 timers inkubering i fråvær eller nærvær av en forsøksprøve pulses cellen med l^i Ci (3-H)-tymidin/brønn i ytterligere 6 timer, høstes og telles ved væske-scintillasjon. (3-H)-tymidin inkorporering i DNA korrelerer med økningen i celleantall og er følgelig et mål for celleproliferasjon. En fortynningsserie av forsøksprøven tillater beregning av konsentrasjonen som resulterer i 50% inhibering av celleproliferasjon (IC50). Den inhibitoriske kapasiteten av forsøksprøven kan sammenlignes med rapamycin og uttrykkes som en relativ IC50 (dvs. forsøksprøve/ICso rapamycin). Forbindelsene i eksemplene 1 og 2 er i denne testen funnet å ha en relativ IC50 på henholdsvis 0,2 og 0,09.

3. Makrofilin bindingsanalyse (MBA)

Rapamycin og det strukturelt beslektede immunoundertrykkende middelet, FK-506, er begge kjent for å bindes in vivo til makrofilin-12 (også kjent som FK-506 bindende protein eller FKBP-12), og denne bindingen anses å være forbundet med den immunundertrykkende aktiviteten av disse forbindelsene. Forbindelsene av formel I bindes også sterkt til makrofilin-12, som demonstrert i en kompetitiv bindingsanalyse. I denne analysen anvendes FK-506 koplet til BSA for å belegge mikrotiterbrønner. Biotinylert rekombinant humant makrofilin-12 (biot-MAP) tillates å bindes i nærvær eller fravær av en forsøksprøve til det i mobiliserte FK-506. Etter vasking (for å fjerne ikke-spesifikt bundet makrofilin), bedømmes bundet biot-MAP ved inkubering med et streptavidin-alkalisk fosfatasekonjugat, etterfult av vasking og etterfølgende tilsetning av p-nitrofenylfosfat som et substrat. Avlesningen er OD ved 405nm. Binding av en forsøksprøve til biot-MAP resulterer i en reduksjon i mengden av biot-MAP bundet til FK-506 og følgelig i en reduksjon i OD405. En fortynningsserie av forsøksprøven tillater bestemmelse av konsentrasjonen som resulterer i 50% inhibering av biot-MAP-bindingen til det immobiliserte FK-506 (IC50). Den inhibitoriske kapasiteten av en forsøksprøve sammenlignes med IC50 av fritt FK506 som en standard og uttrykkes som en relativ IC50 (dvs. IC5o-forsøksprøve/IC5o-fri FK506). I denne analysen er forbindelsene ifølge eksemplene 1,2 og 5 funnet å ha en relativ IC50 på henholdsvis 1,2,8 og 2,5.

4. Lokalisert Graft-versus-Vert (GvH) reaksjon

In vivo virkningsfullhet av forbindelsene av formel I bevises i en egnet dyre-modell, f.eks. som beskrevet i Ford et al, TRANSPLANTATION K) (1970) 258. Miltceller (1 x IO<7>) fra 6 uker gamle Wistar/Furth (WF) hunrotter injiseres subkutant på dag 0 i den venstre bakpoten av (F344 x WF)Fj hunrotter med vekt ca 100 g. Dyrene behandles i 4 etter hverandre følgende dager og de popliteliske lymfeknutene fjernes og veies på dag 7. Forskjellen i vekt mellom de to lymfeknutene tas som parameteren for bedømmelse av reaksjonen.

5. Nyreallograftreaksjon i rotte

En nyre fra en DA(RTl<a>) eller Brown-Norway (BN) (RTl<n>) donorrotte transplanteres på det renale karet av en unilateralt (venstre side) nefrektomisert (Lewis RT1') mottakerrotte ved å anvende en ende-til-ende anastomose. Urinleder-anastomose er også ende-til-ende. Behandling starter på dagen for transplantasjon og fortsettes i 14 dager. En kontralateral nefrektomi utføres 7 dager etter transplantasjon, og etterlater mottakeren som beroende på virkningen av donornyren. Overlevelse av poderesepienten anses som parameter for en funksjonell poding.

6. Eksperimentell indusert allergisk encefalomyelitt (EAE) i rotter

Virkningsfullhet av forbindelsen av formel I i EAE måles f.eks. ved fremgangsmåten beskrevet i Levine & Wenk, AMER J PATH 47 (1965) 61; McFarlin et al, JIMMUNOL H3 (1974) 712; Borel, TRANSPLANT. & CLIN. IMMUNOLH

(1981) 3. EAE er en vidt akseptert modell for multippelsklerose. Wistar-hanrotter

injiseres i bakpoten med en blanding av bovin ryggmarg og fullstendig Freund's adjuvants. Symptomer på sykdommen (paralyse av halen og begge bakben) utvikles vanligvis iløpet av 16 dager. Antallet syke dyre såvel som tidspunktet for start av sykdommen registreres.

7. Freund's adjuvants artritt

Virkningsfullhet mot eksperimentelt indusert artritt vises ved å anvende fremgangsmåten beskrevet f.eks. i Winter «fe Nuss, ARTHRITIS & RHEUMATISM 9

(1966) 394; BILLINGHAM & DAVIES, HANDBOOK OF EXPERLMENTAL

PHARMACOL (Vane & Ferreira Eds, Springer-Verlag, Berlin) 50/11 (1979) 108-144. OFA og Wistar-rotter (hanrotter eller hunrotter, 150 g kroppsvekt) injiseres i.c. ved haleroten eller i bakpoten med 0,1 ml mineralolje inneholdende 0,6 mg lyofilisert varmeavlivet Mycobacterium smegmatis. I den utviklende artritismodellen startes behandling umiddelbart etter injeksjon av hjelpestoffet (dager 1 - 18); i den etablerte artritismodellen startes behandling på dag 14, når den sekundære betennelsen er godt utviklet (dager 14 -20). Ved avslutningen av forsøket måles svellingen av leddene ved hjelp av mikro-passer. ED50 er den orale dosen i mg/kg som reduserer svellingen (primær eller sekundær) til halvparten av den for kontrolldyrene.

8. Antitumor og MDR aktivitet

Antitumoraktiviteten av forbindelsene av formel I og deres evne til å fremme virkningen av antitumormidler ved å svekke multilegemiddelresistens demonstreres f.eks. ved administrering av et anti-kreftmiddel, f.eks. kolkicin eller etoposid til en multilegemiddelresistent celle og legemidellsensitive celler in vitro eller til dyr som har multilegemiddelresistente eller legemiddelsensitive tumorer eller infeksjoner, med eller uten samtidig administrering av forbindelsene av formel I som skal undersøkes, og ved administrering av forbindelsen av formel I alene.

Slik in vitro testing utføres ved å anvende en hvilken som helst egnet legemiddelresistent cellelinje og kontroll (parenteral) cellelinje, generert f.eks. som beskrevet av Ling et al., J. Cell. Physiol. 83,103-116 (1974) og Bech-Hansen et al. J. Cell. Physiol. 88,23-32 (1976). Spesielle kloner som velges er den multi-legemiddelresistente (f.eks. kolkisin resistente) linjen CHR (subklon CSS3.2) og den

parenterale, sensitive linjen AUX Bl (subklon AB1 Sil).

In vivo antitumor og anti-MDR aktivitet vises f.eks. i mus injisert med multilegemiddelresistente og legemiddelsensitive kreftceller. Ehrlich bukvæskekarsinom (EA) underlinjer resistente mot legemiddelstoff DR, VC, AM, ET, TE eller CC utvikles ved trinnvis overføring av EA-celler til etterfølgende generasjoner av BALB/c vertsmus i henhold til fremgangsmåtene beskrevet av Slater et al., J. Clin. Invest,70,1131 (1982).

Ekvivalente resultater kan oppnås ved å anvende forbindelsene av formel 1 i forsøksmodeller av sammenlignbar utførelse, f.eks. in vitro, eller ved å anvende forsøksdyr infisert med legemiddelresistente eller legemiddelfølsomme virale stammer, antibiotiske, (f.eks. penicillin) resistente og sensitive bakteriestammer, antimykotisk resistente og sensitive soppstammer såvel som legemiddelresistente protozolstammer, f.eks. plasmodialstammer, f.eks. naturlig forekommende understammer av Plasmodium falciparum som viser ervervet kjemoterapeutisk, antimalaria legemiddelresistens.

9. Mip og Mip-lignende faktorinhibering

I tillegg binder og blokkerer forbindelsene av formel I en rekke Mip (makrofag infektivitetpotensiator) og Mip-lignende faktorer, som strukturelt ligner makrofilin. Mip og Mip-lignende faktorer er virulensfaktorer som produseres av en lang rekke patogener, inbefattende de av genera Clamidia. f.eks. Clamidiatrachomatis: Neisseria. f.eks. Neisseria meningitidis: og Legionella, f.eks. Legionella pneumofhilia; og også av de obligate parasittiske medlemmene av ordenen Rickettsiales. Disse faktorene spiller en kritisk rolle i etableringen av intracellulær infeksjon. Virkningsfullheten av forbindelsen av formel I ved reduksjon av infektiviteten av patogener som produserer Mip eller Mip-lignende faktorer kan vises ved å sammenligne infektiviteten av patogener i cellekultur i nærvær og fravær av makrolidene, f.eks. ved å anvende fremgangsmåtene beskrevet i Lundemose, et al., Mol. Microbiol. (1993) 7: 777.

10. Kronisk allograftawisning

Nyren fra en DA (RTl<a>) hannrotte transplanteres ortotopisk til en Lewis (RT1<1>) hannmottaker. Totalt 24 dyr transplanteres. Alle dyr behandles med cyklosporin A ved 7,5 mg/kg/dag pr. os i 14 dager ved start på dagen for transplantasjon, for å forhindre akutt cellulær avvisning. Kontralateral nefrektomi utføres ikke. Hver forsøksgruppe behandles med en distinkt dose av en forbindelse av formel I eller placebo omfatter seks dyr.

Ved start på dag 53-64 etter transplantasjon behandles mottakerdyrene pr. os i ytterligere 69-72 dager med en forbindelse av formel I eller mottar placebo. Ved 14 dager etter transplantasjon underkastes dyrene podebedømmelse ved magnetisk resonnans billeddannelse (MRI) med perfusjonsmåling av nyrer (med sammen-ligning av den podede nyren og den egne kontralaterale nyren). Dette gjentas ved dager 53-64 etter transplantasjon og ved avslutningen av forsøket. Dyrene ble deretter obdusert. Avvisningsparameteret såsom MRI-skåring, relativ perfusjons-rate av den podede nyren og histologisk skåring for nyreallograftet for cellulær avvisning og karendringer bestemmes og analyseres statistisk. Administrering av en forbindelse av formel I, f.eks. forbindelsen ifølge eksempel 1 eller 2, ved en dose på 0,5 til 2,5 mg/kg i denne rottenyre-allograftmodellen gir en reduksjon i alle de ovenfor nevnte awisningsparametrene.

11. Angioplastisk

Ballongkateterisering utføres på dag 0, i det vesentlige som beskrevet av Powell et al. (1989). Under "Isofluoran"-bedøvelse innføres et "Fogarty 2F"-kateter i den venstre vanlige karotidarterien via den eksterne karotid og blåses opp (distensjon æ 10 jai H20). Den opplåste ballongen trekkes tilbake langs lengden av den felles karotiden tre ganger, de siste to gangene under forsiktig vridning for å oppnå en uniform de-endotelialisering. Kateteret fjernes så, en ligatur plasseres rundt det eksterne karotid for å forhindre blødning og dyrene får anledning til å komme seg. 2 grupper på 12 RoRo-rotter (400 g, ca 24 uker gamle) anvendes for under-søkelsen: en kontrollgruppe og en gruppe som mottar forbindelsen som skal undersøkes. Rottene randomiseres fullstendig under all håndtering, eksperi-mentelle prosedyrer og analyser.

Forbindelsen som skal undersøkes administreres p.o. (gavage) ved start 3 dager før ballongskade (dag -3) inntil avslutningen av undersøkelsen, 14 dager etter ballongskade (dag +14). Rotter holdes i individuelle bur og gis tilgang til mat og vann ad Iibidum.

Rottene bedøves deretter med "Isofluoran" et perfusjonskateter innføres gjennom den venstre ventrikkelen og festes i den aortiske buen, og en aspireringskanyle innføres i den venstre ventrikkelen. Dyr perfunderes under et perfusjonstrykk på 150 mmHg, først i 1 min. med 0,1 M fosfatbuffret saltvannsoppløsning (PBS, pH 7,4) og deretter i 15 min. med 2,5% glutaraldehyd i fosfatbuffer (pH 7,4). Perfusjonstrykket er 105 mmHg ved tuppen av kanylen (« 100 mmHg i karotidarterien, som bestemt i et preliminert forsøk ved innføring av en kanyle festet til en trykktransduser i den eksterne karotiden). Karotidarterier skjæres deretter opp, separeres fra omgivende vev og neddykkes i 0,1 M kakodylatbuffer (pH 7,4) inneholdende 7% sakkarose og inkuberes over natten ved 4°C. Den følgende dagen neddykkes karotiden og ristes i 1 time ved romtemperatur i 0,05% KMn04 i 0,1 M kakodylat. Vevene dehydratiseres deretter i en gradinndelt etanolserie; 2x10 min i 75%, 2x10 min i 85%, 3x10 min i 95% og 3 x 10 min i 100% etanol. De dehydrerte karotidene innstøpes deretter i 'Teknovit 7100" i henhold til fabrikantens anbefalinger. Innstøpingsmediet får polymerisere over natten i en eksikator under argon, siden oksygen er funnet å inhibere riktig herding av blokkene.

Seksjoner av tykkelse 1-2 um skjæres fra midtseksjonen av hver karotid med en hård metallkniv på en roterende mikrotom og farges i 2 min med Giemse-farge. Ca. 5 seksjoner fra hver karotid repareres på denne måten og tverrsnittsarealet av media, neointima og lumen bedømmes morfometrisk ved hjelp av et billed-analyse-system (MCID, Toronto, Canada). I denne analysen inhiberer forbindelsene av formel I, f.eks. forbindelsen i eksempel 1 eller 2, myointimal proliferasjon når de administres per os ved en daglig dose på fra 0,5 til 2,5 mg/kg.

Forbindelsene av formel I er også nyttig i analyser for å detektere nærværet eller mengden av makrofilin-forbindelser, f.eks. i kompetitive analyser for diagnostiske formål eller screening-formål. Følgelig kan forbindelser av formel I anvendes som screening-verktøy for å bestemme nærværet at makrofilinbindende forbindelser i en forsøksoppløsning, f.eks. blod, blodserum eller forsøksvæske som skal screenes. Fortrinnsvis immobiliseres en forbindelse av formel I i mikrotiterbrønner og tillates deretter å bindes i nærvær eller fråvær av en forsøksoppløsning til merket makrofilin-12 (FKBP-12). Alternativt immobiliseres FKBP-12 i mikrotiterbrønner og tillates å bindes i nærvær og fravær av en forsøksoppløsning til en forbindelse av formel I som er merket, f.eks. fluor-, enzymatisk- eller radiomerket, f.eks. en forbindelse av formel I hvor R[ innbefatter en merkende gruppe. Platene vaskes og mengden av bundet, merket forbindelse måles. Mengden av makrofilinbindende stoff i forsøksoppløsningen er tilnærmet omvendt proporsjonal med mengden av bundet merket forbindelse. For kvantitative analyser dannes en standard bindende kurve ved anvendelse av kjente konsentrasjoner av makrofilinbindende forbindelse.

Forbindelsene av formel I er derfor nyttige i forbindelse med følgende tilstander:

a) Behandling og forebyggelse av akutt eller kronisk organ- eller vevstransplantat-avvisning, f.eks. behandlingen av mottakere av f.eks. hjerte, lunge, kombinert

hjerte-lunge, lever, nyre, bukspyttkjertel, hud eller hornhinnetransplantater. De er også indikert for forebyggelse av pode-versus-vertssykdom, som som følge av benmargs-transplantasjon.

b) Behandling og forebyggelse av transplantatvaskulopatier, f.eks. aterosklerose.

c) Behandling og forebyggelse av glattmuskelcelleproliferasjon og migrering som fører til vevsintimal fortykning, blodkarobstruksjon, obstruktiv koronaratero-sklerose, restenose. d) Behandling og forebyggelse av autoimmunsykdom og av inflammatoriske tilstander, spesielt inflammatoriske tilstander med en etiologi som innbefatter en

autoimmunkomponent, såsom artritis (for eksempel rheumatoid arthritis, arthritis chronika progrediente og arthritis deformans) og reumatisk sykdom. Spesifikke

autoimmunsykdommer for hvilke forbindelsene med formel I kan anvendes innbefatter autoimmunhematologiske tilstander (innbefattende f.eks. hemolytisk anemi, aplastisk anemi, ren rødcelleanemi og idiopatisk trombocytopeni), systemisk lupus erytermatosus, polykondritis, skleroderma, Wegener granulamatose, dermatomysis, kronisk aktiv hepatitt, myasteniagravis, psoriasis, Steven-Johnson syndrom, idiopatisk psilose, autoimmun inflammatorisk tarmsykdom (innbefattende f.eks. ulcerativ kolitt og Crohns's sykdom), endokrinotfalmopati, Graves sykdom, sarkoidosis, multippelsklerose, primær billiær cirrose, juvenil diabetes (diabetes mellitus type I) uveitis (anterior og posterior), keratokonjunktivitis sicca og vernal keratokonjunkti vitis, interstitiell lungefibrose, psoriatisk artritt, glomerulonefritt (med og uten nefrotisk syndrom, f.eks. innbefattende idiopatisk nefrotisk syndrom eller minimal endringsnefropati) og juvenil dermatomyosis.

e) Behandling og forebyggelse av astma.

f) Behandling av multi-legemiddelresistens (MDR). Forbindelsene av formel I undertrykker P-glykoproteiner (Pgp), som er membrantransportmolekylene forbundet med MDR. MDR er spesielt problematisk i kreftpasienter og AJDS-pasienter som ikke viser respons på konvensjonell kjemoterapi fordi medisin-eringen pumpes ut av cellene ved Pgp. Forbindelsene av formel I er derfor nyttige for å fremme virkningsfullheten av andre kjemoterapeutiske midler ved behandlingen og kontroll av multi-legemiddelresistenstilstander såsom multi-legemiddelresistent kreft eller multi-legemiddelresistent AIDS. g) Behandling av proliferative tilstander, f.eks. tumorer, hyperproliferative hud-sykdommer og lignende.

h) Behandling av soppinfeksjoner.

i) Behandling og forebyggelse av inflammasjon, spesielt ved potensiering av

virkningen av steroider.

j) Behandling og forebyggelse av infeksjon, spesielt infeksjon ved patogener som har Mip eller Mip-lignende faktorer.

For de ovenfor nevnte indikasjonene vil den påkrevede dosen naturligvis variere, f.eks. avhengig av tilstanden som skal behandles (f.eks. typen sykdom eller naturen av

resistensen), den ønskede effekten og administreirngsmåten. Generelt oppnås imidlertid tilfredsstillende resultater ved administrering oralt ved dosering av størrelsesorden på fra 0,05 til 5 eller opp til 10 mg/kg/dag, f.eks.av størrelsesorden fra 0,1 til 2 eller opp til 7,5 mg/kg/dag administrert en gang eller, i oppdelte doser, 2 til 4 ganger pr. dag, eller ved administrering parenteralt, f.eks. intravenøst, f.eks. ved i.v. drypp eller infusjon, ved doser av størrelsesorden på fra 0,01 til 2,5 opp til 5 mg/kg/dag, f.eks. av størrelsesorden på fra 0,05 til 0,1 opp til 1,0 mg/kg/dag. Egnede daglige doser for pasienter er følgelig av størrelsesorden 500 mg p.o., f.eks. av størrelsesorden på fra 5 til 100 mg p.o., eller av størrelsesorden på fra 0,5 til 125 opp til 250 mg i.v., f.eks. av størrelsesorden på fra 2,5 til 50 mg i.v..

Alternativt, og sogar foretrukket, arrangeres doseringen på pasientspesifikk måte for å tilveiebringe på forhånd bestemte regulære pågående kanalblodnivåer som målt ved RIA av størrelsesorden på fra 50 eller 150 opp til 500 eller 1000 ng/ml, dvs analogt med fremgangsmåter for dosering av idag anvendt cyklosporinimmunundertrykkende behandling.

Forbindelsene av formel I kan administreres som eneste aktive bestanddel eller sammen med andre legemidler. For eksempel i immunsupressive anvendelser som en forebyggelse og behandling av pode versus vertssykdom, transplantatawisning eller autoimmun-sykdom, kan forbindelsene med formel I anvendes i kombinasjon med cyklosporiner eller askomysiner, eller deres immunusupressive analoger, f.eks. cyklosprin A, cyklosporin G, FK-506, osv.: kortikosterioder; cyklofosfamider; azatioprin; metotreksat; brequinar, leflunomid; mizoribin, mykofenolsyre; mykofenolatmofetil; immunsupressive monoklonale antistoffer, f.eks. monoklonale antistoffer til leukocyttreseptorer, f.eks. MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, DC25, CD28, CTLA4, B7, CD45 eller CD58 eller dere ligander; eller andre immunmodulerende forbindelser. For anti-inflammatoriske avendelser kan forbindelsene av formel I anvendes sammen med anti-inflammatoriske midler, f.eks. kortikosteroider. For anti-infektive anvendelser kan forbindelsene av formel I anvendes i kombinasjon med andre anti-infektive midler, f.eks. antivirale legemidler eller antibiotika. Forbindelsene av formel I administreres ved en hvilken som helst konvensjonell fremgangsmåte, spesielt enteralt, f.eks. oralt, for eksempel i oppløsninger for drikke, tabletter eller kapsler eller parenteralt, for eksempel i form av injiserbare oppløsninger eller suspensjoner. Egnede enhetsdoseformer for oral administrering innbefatter f.eks. fra 1 til 50 mg av en forbindelse av formel I, vanligvis 1 til 10 mg. Farmasøytiske preparater innbefattende forbindelsene av formel I kan fremstilles på konvensjonell måte, f.eks. analogt farmasøytiske preparater innbefattende rapamycin, f.eks. som beskrevet i EP A 0 041 795.

Fortrinnsvis innbefatter de farmasøytiske preparatene en forbindelse av formel I og et bæremedium, hvilket medium innbefatter en hydrofil fase, en lipofil fase og et over-flateaktivt middel. De kan være i form av en emulsjon eller et mikroemulsjonsforkonsentrat. Slike emulsjoner eller mikroemulsjonsforkonsentrater er beskrevet f.eks. i GB patentpublikasjon 2 278 780 A. Fortrinnsvis innbefatter den lipofilefasen 10 til 85 vekt% av bæremediet; det overflateaktive middelet innbefatter 5 til 80 vekt% av bæremediet; den hydrofile fasen innbefatter 10 5il 50 vekr% av bæremediet. Forbindelsen av formel I er fortrinnsvis tilstede i en mengde på 2 til 15 vekt%.

Et spesielt foretrukket farmasøytisk preparat innbefatter et mikroemulsjonsforkonsentrat bæremedium som omfatter

i) et reaksjonsprodukt av en risinusolje og etylenoksyd,

ii) et transforestirngsprodukt av en vegetabilsk olje og glyserol innbefattende hovedsakelig linoleinsyre eller oleinsyre, mono-, di- og triglyserider eller en

polyoksyalkylert vegetabilsk olje,

iii) 1,2-propylenglykol, og

iv) etanol.

I henhold til foregående tilveiebringer foreliggende oppfinnelse også:

A. Et farmasøytisk preparat innbefattende en forbindelse av formel I sammen med et

farmasøytisk akseptabelt fortynningsmiddel eller en bærer for dette.

B. En kit eller forpakning for anvendelse ved immunosupresjon, inflammasjon eller infeksjoner, omfattende et farmasøytisk preparat som omfatter en forbindelse med formel I og et farmasøytisk preparat omfattende et immunosupresjonsmiddel eller immunmodulerende legemiddel eller et anti-inflammatorisk legemiddel eller et anti-infektivt astmamiddel.

C. Anvendelse av en forbindelse med formel I for fremstilling av et medikament for å forebygge eller behandle akutt eller kronisk organ- eller vevstransplantasjons-avvisning, transplantasjonsvakulopatier, restenose, autoimmunsykdommer, inflammatoriske lidelser eller astma.

Det er også overraskende funnet at forbindelsen av formel I hvor X er OH, dvs 32(S)-dihydroforbindelser har en forbedret aktivitet, f.eks.i de ovenfor omtalte analysene, og er mer stabile enn de tilsvarende enantiomerene, dvs 32(R)-dihydroforbindelsene, f.eks. når de underkastes følgende test: Forbindelsene som skal testes inkuberes i rotteserum og deres bindingsaffinitet for FKBP12 måles i MB-analysen etter forskjellige inkuberingstider. Ettersom affiniteten avtar øker den nominelle ICSO. En reduksjon i affinitet tilskrives generelt instabilitet av forbindelsen i rotteserum.

Claims (10)

1. Forbindelse, karakterisert ved formell hvori Ri er Ci-io-alkyl, C3-io-alkynyl, hydroksy-C3-io-alkynyl, R2 er en rest av formel II; hvori R3 er valgt fra H, CM-alkyl, hydroksy-C2-6-alkyI, hydroksy-C|.6-alkoksy-C2-6-alkyl eller Ci-6-alkoksy-C2-6-alkyl; R4 er H eller metyl; Y er O, X er OH eller H, Ri er forskjellig fra Ci.io-alkyl når X er OH.

2. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at den har formel Ia hvori Ri er C3_ioalk-2-ynyl, R2 er en rest av formel II som definert i krav 1 og Y er O.

3. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved den er av formel Ib hvori Ri er C3.i0alk-2-ynyl, R2 er en rest av formel II som definert i krav 1 og Y er O.

4. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at den utgjøres av 16-pent-2-ynyloksy-32(S)-dihydro-rapamycin eller 16-0-pent-2-ynyl-32(S)-dihydro-40-O-(2-hydroksyetyl)rapamycin.

5. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at den er 32-deokso-rapamycin eller 16-0-pent-2-ynyI-32-deokso-rapamycin.

6. Fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse av formel I ifølge krav 1, karakterisert ved at den omfatter a) for fremstilling av en forbindelse av formel I hvor X er H, reduktiv eliminering av karbonyl i stilling 32 av en forbindelse av formel IVa hvor R[, R.2 og Y er som definert i krav 1, i beskyttet eller ubeskyttet form, og, om nødvendig, fjernelse av tilstedeværende beskyttende grupper; eller b) for fremstilling av en forbindelse av formel I hvor X er OH, stereoselektiv reduksjon av karbonyl i stilling 32 av en forbindelse av formel IVa som definert ovenfor; eller c) omdanning av en forbindelse av formel I hvor R] er alkyl for å tilveiebringe en forbindelse av formel I hvor Ri er forskjellig fra akyl.

7. Forbindelse ifølge hvilke som helst av krav 1 til 5, for anvendelse som et farmasøytisk middel.

8. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det omfatter en forbindelse ifølge hvilket som helst av krav 1 til 5, sammen med et farmasøytisk akseptabelt fortynningsmiddel eller en bærer for denne.

9. Kit eller forpakning for anvendelse ved immunosupresjon, inflammasjon eller infeksjoner, karakterisert ved at det omfatter et farmasøytisk preparat som omfatter en forbindelse ifølge hvilket som helst av krav 1 til 5 og et farmasøytisk preparat omfattende et immunosupresjonsmiddel eller immunmodulerende legemiddel eller et anti-inflammatorisk legemiddel eller et anti-infektivt astmamiddel.

10. Anvendelse av en forbindelse ifølge hvilket som helst av krav 1 til 5, for fremstilling av et medikament for å forebygge eller behandle akutt eller kronisk organ- eller vevstransplantasjonsavvvisning, transplantasjonsvaskulopatier, restenose, autoimmunsykdommer, inflammatoriske lidelser eller astma.