CZ392297A3

CZ392297A3 - Deriváty rapamycinu, způsob jejich přípravy a farmaceutický prostředek, který je obsahuje

Info

Publication number: CZ392297A3
Application number: CZ973922A
Authority: CZ
Inventors: Sylvain Cottens; Richard Sedrani
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 1995-06-09
Filing date: 1996-06-05
Publication date: 1998-03-18
Also published as: FI973991A0; CO4440629A1; PL323310A1; MX9709555A; ATE228135T1; TR199701567T1; DK0833828T3; US6200985B1; HU228234B1; CA2219659A1; JP2000510815A; HUP9802200A2; KR19990022780A; NZ311647A; FI973991L; NO975432L; FI113051B; US5985890A; AU6300696A; DE69624921D1

Description

Deriváty raparnyčinu

Oblast-techniky

Vynález se týká derivátů rapamycinu, způsobu jejich výroby, jejich použití jako léčiva a farmaceutických kompozic, které je obsahují.

Dosavadní_stav^techniky

Rapamycin je známé makrolidové antibiotikum, produkované mikroorganismem Streptomyces hygroscopicus, které má strukturu znázorněnou vzorcem A

/A/

Viz například. J. B. McAlpine se sp., J. Antibiotics /1991/ 44: 688; S. L. Schreiber se sp. , J. Am. Chem. Soc. /1991/ 113: 7433; USA patentový spis č. 3 929 992./Ve vzorci rapamycinu byla navržena různá schémata číslování. Aby se předešlo záměně, když jsou zde jmenovány specifické deriváty rapamycinu, jsou názvy vybírány s odkazem na schéma číslování rapamycinu ve vzorci A./ Rapamycin je účinné imunósupresivum a také bylo prokázáno, že má protinádorovou a protihoubovou účinnost. Jeho použitelnost jako léčiva je však omezena velmi nízkou a proměnlivou biologickou dostupností. Rapamycin je navíc nerozpustný a nestálý, což stěžuje přípravu stabilních galenických kompozic.

• «

Je známo mnoho derivátů rapamycinu. Některé 40-0-substituované rapamyciny jsou popsány například v USA patentovém spise č.

258 389 a ve spise WO 94/09010 /0-alkyIraparnyčiny/; ve spise WO 92/05179 /estery karboxylových kyselin/, v USA patentovém spise č. 5 118 677 /amidestery/, v USA patentovém spise č. 5 118 678 /karbamáty/, v USA patentovém spise, č. 5 100 883 /fluorované estery/, v USA patentovém spise č. 5 151 413 /acetaly/ a v USA patentovém spise č. 5 120 842 /silylethery/.

Podstata vynálezu

Nyní bylo s překvapením objeveno, že některé nové deriváty raparnycinu mají lepší farmakologický profil než rapamycin a vykazují vyšší stabilitu.

Podle vynálezu se získává sloučenina obecného vzorce I

ve kterém

R-|_ Je skupina alkylová, skupina alkenylová, skupina alkinylová, skupina hydroxyalkylová, skupina hydroxyalkenylová, skupina hydroxyalkinylová, skupina benzylová, skupina alkoxybenzylová nebo skupina chlorbenzylová, ^2 J^e vybrán bu.3. z obecného vzorce II nebo z obecného vzorce III

R^ J^e vybrán ze souboru, který zahrnuje atom vodíku, skupinu alkylovou, skupinu alkenylovou, skupinu alkinylovou, skupinu arylovou, skupinu thioalkylovou, skupinu arylaikylovou, skupinu hydroxyarylalkylovou, skupinu hydroxyarylovou, skupinu hydroxyalkylovou, skupinu dihydroxyalkylovou, skupinu hydroxyalkoxyalkylovou, skupinu hydroxyalkylarylalkylovou, skupinu dihydroxyalkylarylalkylovou, skupinu alkoxyalkylovou·, skupinu alkylkarbonyloxyalkylovou, skupinu aminoalkylovou, skupinu alkylaminoalkylovou, skupinu alkoxykarbonylaminoalkylovou, skupinu alkylkarbonylaminoalkylovou, skupinu arylsulfonamidoalkylovou, skupinu allylovou, skupinu dihydroxyalkylallylovou, skupinu dioxolanylallylovou, skupinu karbalkoxyalkylovou a skupinu alkylsilylovou;

R^ značí atom vodíku, skupinu methylovou nebo s R^ tvoří alkylenový řetězec se 2 až 6 atomy uhlíku;

R^ značí seskupení RgO-CHg“» ^ve kterém Rg je vybrán ze souboru, který zahrnuje atom vodíku, skupinu alkylovou, skupinu alkeny lovou, skupinu alkinylovou, skupinu arylovou, skupinu alkylkarbonylovou, skupinu arylkarbonylovou, skupinu heteroarylkarbonylovou, skupinu hydroxyalkylkarbonylovou, skupinu aminoalkylkarbonylovou, skupinu formylovou, skupinu thioalkylovou, skupinu arylalkylovou, skupinu hydroxyarylalkylovou, skupinu hydroxyarylovou, skupinu hydroxyalkylovou, skupinu dihydroxyalkylovou, skupinu hydroxyalkoxyalkylovou, skupinu hydroxyalkylarylalkylovou, skupinu dihydroxyalkylarylalkylovou, skupinu alkoxyalkylovou, skupinu alkylkarbonyloxyalkylovou, skupinu aminoalkylovou, skupinu alkylaminoalkylovou, skupinu al koxykarbonylaminoalkylovou, skupinu alkylkarbonylaminoalkylovou, skupinu arylsulfonamidoalkylovou, skupinu allylovou, skupinu dihydroxyalkylallylovou, skupinu dioxolanylallylovou a skupinu karbalkoxyalkylovou; seskupení R?CO-, ve kterém R? je vybrán ze souboru, který zahrnuje atom vodíku, skupinu alkylovou, skupinu hydroxylovou, skupinu alkoxylovou, skupinu aryloxylovou, skupinu aminovou, skupinu alkylaminovou, zbytek aminokyseliny nebo N,N-disubstituovanou aminoskupinu, ve které substituenty jsou /a/ vybrány ze souboru, který zahrnuje skupinu alkylovou, skupinu arylovou nebo skupinu arylaikylovou, nebo /b/ tvoří heterocyklickou strukturu; seskupení RgNCH-, ve kterém Rg je skupina alkylová, skupina arylová, skupina aminová, skupina alkylaminová, skupina arylaminová, skupina hydroxylová, skupina alkoxylová nebo skupina arylsulfonylaminová; seskupení -O-CH-O-; nebo substituovanou skupinu dioxymethylynovou;

Y je vybráno ze souboru, který zahrnuje atom kyslíku, seskupení /atom vodíku, hydroxylová skupina/ a seskupení /atom vodíku, skupina OR^/, ve které Rq je vybrán ze souboru, který zahrnuje skupinu alkylovou s 1 až 4 atomy uhlíku, skupinu alkylkarbonylovou, skupinu arylkarbonylovou, skupinu heteroarylkarbonylovou, skupinu hydroxyalkylkarbonylovou, skupinu aminoalkylkarbonylovou, skupinu formylovou nebo skupinu arylovou; a

X značí hydroxylovou skupinu nebo atom vodíku; přičemž alk nebo alkyl se týká alifatického substituenta s 1 až 10 atomy uhlíku, popřípadě přerušeného kyslíkovou vazbou; a 'ar'' nebo aryl se týká monocyklického, popřípadě heterocyklického, popřípadě substituovaného aromatického substituenta se 4 až 14 atomy uhlíku, s tou podmínkou, že když X je skupina hydroxylová, R-^ značí alkylovou skupinu a R? je zbytek obecného vzorce II, pak Rj je jiný než atom vodíku.

Součást ''alk'' nebo ' 'alkyl'', zmíněná výše, může být rozvětvená, přímá nebo cyklická; s výhodou to je alifatický substituent s 1 až 6 atomy uhlíku, popřípadě přerušený kyslíkovou vazbou, výhodněji nepřerušený kyslíkovou vazbou.

Příklady součástí z z z z _ z z _ z z ar nebo u.aryl , zmíněných výše a popřípadě substituovaných, zahrnují například skupinu fenylovou, sku pinu benzylovou, skupinu tolylovou, skupinu pyridylovou apod.

Když R^ je skupina chlorbenzylová nebo skupina alkoxybenzylová, je substituent s výhodou v ortho-poloze.

Když seskupení R^CO- značí N,N-disubstituovanou karbamoylovou skupinu, může to být například skupina N-methyl-N-/2-pyridin-2-ylethyl/-karbamoylová, skupina /4-methylpiperazin-l-yl/-karbonylová nebo skupina /morfolin-4-yl/-karbonylová.

Když R._ je substituovaná skupina dioxymethylynová, může to být například skupina O,0-/alkylen/-dioxy-methylynová, tzn. kde 2 atomy kyslíku jsou vázány na alkylenovou skupinu.

Ve sloučeninách obecného vzorce I jsou následující významy preferovány bu3. jednotlivě nebo v jakékoliv kombinaci nebo podkombinaci:

1. X je hydroxylová skupina a R^ je skupina alkinylová se 3 až 10 atomy uhlíku nebo skupina hydroxyalkinylová se 3 až 10 atomy uhlíku, s výhodou skupina alk-2-inylová se 3 až 10 atomy uhlíku nebo skupina hydroxyalk-2-inylová, výhodněji skupina alk-2-inylová se 3 až 6 atomy uhlíkuj

2. X je atom vodíku a R^ je skupina alkylová s 1 až 10 atomy uhlíku, skupina alk-2-enylová se 3 až 10 atomy uhlíku, skupina hydroxyalk-2-enylová se 3 až 10 atomy uhlíku, skupina alk-2-inylová se 3 až 10 atomy uhlíku, skupina hydroxyalk-2-inylová se až 10 atomy uhlíku nebo skupina alkoxyalkylová s 1 až 10 atomy uhlíku v alkoxylové Části a s 1 až 10 atomy uhlíku v alkylové části, s výhodou skupina alkylová s 1 až 6 atomy uhlíku nebo alk-2-inylová se 3 až 10 atomy uhlíku, výhodněji skupina alkylová s 1 až 4 atomy uhlíku, nejvýhodněji skupina methylová;

·· • ·

• · · · ·

3. Rj jako skupina alkinylová se 3 až 6 atomy uhlíku je skupina 2-propinylová nebo skupina pent-2-inylová, s výhodou skupina pent-2-inylová.

4. Y je atom uhlíku, seskupení /atom vodíku, hydroxylová skupina/ nebo seskupení /atom vodíku, alkoxylová skupina s 1 až 4 atomy uhlíku/ s výhodou atom kyslíku.

5. je zbytek obecného vzorce II;

6. ve zbytku obecného vzorce II je R.^ atom vodíku, skupina hydroxyalkylová s 1 až 6 atomy uhlíku, skupina hydroxyalkoxyalkylová s 1 až 6 atomy uhlíku v alkoxylové části a s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, skupina /alkyl/-karbonyl-aminoalkylová s 1 až 6 atomy uhlíku v obou alkylových částech, skupina alkoxyalkoxylová s 1 až 6 atomy uhlíku v obou alkoxylových částech nebo skupina aminoalkylová s 1 až 6 atomy uhlíku, s výhodou atom vodíku, skupina hydroxyethylová, skupina hydroxypropylová, skupina hydroxyethoxyethylová, skupina methoxyethylová nebo acetylaminoethylová; obzvláště to je atom vodíku, když X značí atom vodíku nebo když X značí hydroxylovou skupinu a R^ značí alkinylovou skupinu;

7. ve zbytku obecného vzorce II R^ je methylová skupina;

8. R^ je zbytek obecného vzorce III, kde R- je seskupení RgOCHg-, ve kterém Rg je vybrán ze souboru, který zahrnuje atom vodíku, skupinu alkylovou s 1 až 6 atomy uhlíku, skupinu alk-2-enylovou se 3 až 6 atomy uhlíku, skupinu alk-2-inylovou se 3 až 6 — atomy uhlíku, skupinu arylovou, skupinu alkylkarbonylovou s až 6 atomy uhlíku, skupinu arylkarbonylovou, skupinu hydroxyalkylovou s 1 až 6 atomy uhlíku, skupinu alkoxyalkylovou s 1 až 6 atomy uhlíku v alkoxylové části a s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části nebo skupinu aminoalkylovou s 1 až 6 atomy uhlíku; dále seskupení R^CO-, ve kterém R? je vybrán ze souboru, který zahrnuje atom vodíku, skupinu hydroxylovou, skupinu alkoxylovou s 1 až 6 atomy uhlíku, skupinu aminovou, skupi • · · nu alkylaminovou s 1 až 6 atomy uhlíku, zbytek aminokyseliny nebo N ,N-disubstituovanou aminovou skupinu, ve které substituenty jsou bu3. /a/ alkylové skupiny s 1 až 6 atomy uhlíku nebo arylové skupiny, nebo /b/ tvoří heterocyklickou strukturu; posléze seskupení ΗθΝΟΞ-, ve kterém Ηθ je skupina alkylová, skupina arylová, skupina aminová, skupina alkylaminová, skupina arylaminová, skupina hydroxylová, skupina alkoxylová nebo skupina arylsulfonylaminová; seskupení -O-CH-O-; nebo substituovaná skupina dioxymethylynová.

Výhodnými sloučeninami jsou sloučeniny obecného vzorce Ia

/Ia/, ve kterém R^, R₂ a Y mají význam definovaný výše, přednostně mají některý z výhodných významů uvedených výše v bodech 1. a 3.

až 8;

a sloučeniny obecného vzorce Ib

·· ···· • · · · ve kterém R^, Rg ^{a Y} mají význam definovaný výše, přednostně mají některý z výhodných významů uvedených výše v bodech 2. až 8.

Obzvláště výhodné sloučeniny zahrnují /i/ 32-desoxo-rapamycin;

/ii/ 16-0-pent-2-inyl-32-desoxo-rapamycin;

/iii/ 16-0-pent-2-inyl-32-desoxo-40-0-/2-hydroxyethyl/-rapamycin; / i v/ 16-0-pent-2-iny1-3 2/S/-dihydro-ra parny cin;

/v/ 16-0-pent-2-inyl-32/S/-dihydro-40-0-/2-hydroxyethyl/-rapamycin;

/vi/ 32/S/-dihydro-40-0-/2-methoxy/ethyl-rapamycin;

/ vi i/ 3 2/S/-dihydro-40-0-/2-hydro xye thy1/-raparny c in.

Sloučeniny obecného vzorce i' mohou vykazovat isomerii a existují v následujících isomemích formách. Rozumí se, že tento vynález zahrnuje sloučeniny obecného vzorce I, jednotlivé isomery obecného vzorce i'

γ ve kterém R^, Rg, Y a X mají význam definovaný výše, jakož i smě si jejich isomerů.

Jednotlivé isomery mohou být oddělovány analogicky podle známých metod.

Tento vynález se také týká způsob přípravy sloučenin.obechého vzorce I a vyznačuje se tím, že se

9 9999

Φ· · a/ připravuje sloučenina obecného vzorce I, ve kterém X značí atom vodíku, reduktivní eliminací karbonylové skupiny v po loze 32 u sloučeniny obecného vzorce IVa

ve kterém R^, R₂ a Y mají význam definovaný výše, v chráněné nebo nechráněné formě, a pokud je to žádoucí, odstraněním přítomných chráničích skupin; nebo že se d/ připravuje sloučenina hydroxylovou skupinu, skupiny v poloze 32 u váné výše, nebo že se c/ konvertuje sloučenina obecného vzorce I, ve kterém X značí stereoselektivní redukcí karbonylové sloučeniny obecného vzorce IVa defino obecného vzorce I, ve kterém R^ značí alkylovou skupinu, aby se získala sloučenina obecného vzorce I, ve kterém R^ je jiný než alkylová skupina.

Při způsobu je ve stupni a/ sloučenina obecného vzorce IVa s výhodou v chráněné formě, tzn. že obsahuje chránící skupiny na funkčních skupinách, které se neúčastní reakce, například hydroxylové skupiny v poloze ,28 a popřípadě v poloze 40, když R₂ značí zbytek obecného vzorce II, nebo v poloze 39, když značí zbytek obecného vzorce III.

Redukce ve stupni a/ na 32-desoxosloučeninu obecného vzorce I se obvykle může provádět ve dvou stupních:

i/ reakcí sloučeniny obecného vzorce IVa, s výhodou v chráněné formě, s hydridem, například diisobutylaluminiumhydridem nebo s výhodou lithium-tri-terc.-butoxyaluminiumhydridem, za vzniku odpovídající 32-dihydrosloučeniny. Další metody a činidla, pokud jsou známa k redukci ketonů, mohou být použita k přípravě 32-dihydrosloučeniny z odpovídajícího ketonu. Zahrnují například hydrogenaci, redukci kovy, redukci hydridy kovů, jak je popsána například v publikaci Comprehensive Organic Transformations, R. C. Larock, VCH Publishers lne. , New York, 1989, str. 527 - 555, sekce 7.1.1-7.1<»4, a metody asymetrické redukce ketonů, jak je například uvedeno v publikaci Comprehensive Organic Transformations, R. C. Larock, VCH Publishers lne., New York, 1989, str. 540 - 547, sekce 7.1.15.

Redukční stupeň i/ je potom následován ii/ konverzí 32-dihydrosloučeniny v odpovídající 32-halogenderivát, například 32-brom- nebo s výhodou 32-jodderivát, který se potom redukuje například hydridem, v žádaný 32-desoxoderivát, a pokud je to žádoucí, odstraní se ze získané sloučeniny chránící skupiny. Mohou být použita i jiná činidla, než která byla použita prdjredukci halogenderivátů; jsou to napři klaď kovy s nízkým mocenstvím /například lithium, sodík, hořčík a zinek/ a hydridy kovů / aluminiumhydridy, borohydridy, silany, hydridy mědi//viz Comprehensive Organic Transformations, R. C. Larock, VCH Publishers lne., New York, 1989, str. 18 - 20, sekce 1.5.1 a 1.5.2./.

Alternativně lze redukce halogenderivátů dosáhnout s použitím vodíku nebo zdroje vodíku /například kyseliny mravenčí nebo její soli/ v přítomnosti vhodného kovového katalyzátoru /například Raneyova niklu, kovového paladia nebo komole·· ···· ·· ···· xů paladia, komplexů rhodia nebo ruthenia//viz Comprehensive Organic Transformations, R. C. Larock, VCH Publishers lne. , New York, 1989 , str. 20 - 24, sekce 1.5.3./. Dále mohou být rovněž použity metody, které jsou známé pro transformaci alkoholu v odpovídající desoxysloučeninu. Tyto metody zahrnují například přímou redukci nebo redukci fosforečného meziproduktu, sulfonátu, thiokarbonátu, thiokarbamátu nebo xantátu, a jsou popsány například v Comprehensive Organic Transformations, R. C. Larock, VCH Publishers lne., New York, 1989, str. 27 - 31, sekce 1.9.1.-1.9.4.

Skupiny vhodné pro chránění hydroxylových skupin, metody tvorby chránících skupin a jejich odstraňování jsou známy, viz například Protective Groups in Organic Synthesis, druhé vyd., T. W. Greene, P. G. M. Wuts, John Wiley and Sons, New York, 1991, kapit. 2 a reference tamtéž. Takovými výhodnými skupinami pro chránění hydroxylových skupinu jsou například triorganosilylové skupiny, jako je skupina trialkylsilylová s 1 až 6 atomy uhlíku /například skupina trimethylsilylová nebo skupina triethylsilylová/, skupina triisopropylsilylová, skupina isopropyldimethylsilylová, skupina terč.-butyldimethylsilylová, skupina triarylsilylová /například trifenylsilylová/ nebo skupina triaralkylsilylová /například tribenzylsilylová/. Odstraňování chránících skupin se může provádět za mírně kyselých podmínek.

Redukční stupeň i/ se může běžně realizovat za nízké teploty, například od teploty -10 až do -80 °C.

Ve¹ stupni ii/ se 32-dihydrosloučenina, popřípadě v chráněné formě, s výhodou 32/R/-diastereoisomer, převádí v ester, s výhodou sulfonát, například mesylát, tosylát, nosylát nebo triflát, následuje záměna vhodným halogenidem, například jodidem nebo bromidem sodným, tetrabutylamonium^jodidem nebo -bromidem, s výhodou v přítomnosti báze, například aminu. Získaný 32/R/-diastereoisomer se izoluje z reakční směsi známou separační technikou, například chromatografií .

Hydridy, které jsou vhodné k redukci 32-halogensloučenin, zahrnují například radikálové hydridy, jako jsou tributylcínhydrid nebo tris-/trimethylsilyl/-silan. Redukci lze také uskutečnit v nepřítomnosti nebo v přítomnosti radikálového iniciátoru, například 2,2'-azobisisobutyronitrilu nebo výhodněji triethylboranu,. obvykle při teplotě od 0 do 80 °C.

Po redukčním stupni podle bodu i/ nebo ii/, pokud je to žádoucí, se obvykle může přidat oxidační činidlo, jako je octan měčinatý, aby reoxidovalo v karbonylovou skupinu nežádoucí vedlejší produkt redukce, která může nastat například v poloze 9.

Alternativně se může 32-dihydroderivát převádět přímo v halogenderivát známými metodami, například s použitím trifenylfosfinu v kombinaci s N-bromsukcinimidem nebo N-jodsukcinimidem, tetrabrommethanem nebo tetrajodmethanem, 1,2-dibromtetrachlorethanem,

2,4,5-tribromimidazolem nebo 2,4,5-trijodimidazolem, jodem, 1,2-dijodethanem, nebo s použitím thionylbromidu nebo methyltrifenoxyfosfoniumjodidu.

Redukce karbonylové skupiny v poloze 52 na 32-desoxoderivát se může rovněž provádět tvorbou tosylhydrazonu, následovanou reakcí s boranem, například katecholboranem, nebo tvorbou dithianu, následovanou vhodnou redukcí, například Raneyovým niklem nebo hydridem, například tributylcínhydridem. Mohou být použity též další známé metody převádění ketonu v odpovídající alkan; tyto metody zahrnují například přímou redukci /viz Comprehensive Organic Transformations, R. C. Larock, VCH Publishers lne., New York, 1989, str. 35 - 37, sekce 1.12.1./ nebo redukci přes hydrazony /viz Comprehensive Organic Transformations, R. C. Larock, VCH Publishers lne. , New York, 1989 , str. 37 - 38, sekce 1.12.2./ nebo přes deriváty síry a selenu /viz Comprehensive Organic Transformations, R. C. Larock, VCH Publishers lne., New York, 1989, str 34 35, sekce 1.10. a 1.11./.

Redukční stupeň b/ v 32/S/-dihydrosloučeninu obecného vzorce I se provádí za zvláštních podmínek. Přednostně se používá takové re·· 4444 • · · ···· · * · • · 4 44 4 4 44 4

44 4 444444 dukční činidlo, které signifikantně favorizuje redukci v 32/S/-derivát, například natriumtriethylborohydrid. Redukce se provádí obvykle při nízké teplotě, například od -50 až do -80 C, v netečném rozpouštědle, například v tetrahydrofuranu, diethyletheru, glymu, diglymu nebo methyl-terc.-butyletheru. Oddělení 32/S/-dihydrosloučeniny od malého množství vzniklé 32/R/-dihydrosloučeniny se může realizovat známými metodami, například sloupcovou chromatografií nebo chromatografií s reverzní fází.

Je-li to žádoucí, mohou být hydroxylové skupiny v poloze 28 a popřípadě v poloze 40 chráněny před provedením redukce a uvolněny po ní, například tak, jak je zmíněno výše. S výhodou se redukční stupeň b/ provádí bez ochrany hydroxylových skupin.

Konverze ve stupni c/ se může provádět známými metodami. Například sloučenina obecného vzorce I, ve kterém R^ značí alkylovou skupinu, s výhodou methylovou skupinu, může reagovat se sloučeninou R_X-OH, kde R je skupina alkinylová nebo skupina hydroxyalkinylová a νζηίϊΊΌ sloučenina obecného vzorce I, ve kterém R^ značí skupinu alkinylovou nebo skupinu hydroxyalkinylovou. Reakce se obvykle provádí v aprotickém rozpouštědle, například v dichlormethanu, toluenu, acetonitrilu nebo tetrahydrofuranu, za kyselých podmínek.

Redukce v poloze 32, zejména redukční stupeň b/, se s výhodou provádí se sloučeninou obecného vzorce IVa, ve kterém R^ má již žádaný význam, například Rj je skupina alkinylová, čímž se zabrání pozdější konverzi po redukci. Sloučenina obecného vzorce IVa, ve kterém R^ značí skupinu alkinylovou nebo hydroxyalkinylovou, kte- „ rá je použita jako výchozí materiál, se může připravit s použitím sloučeniny R_X~OH, jak je uvedeno výše.

Sloučeniny, které jsou používány jako výchozí materiál, se mohou připravovat analogicky podle známých a realizovaných metod, jak je uvedeno například v USA patentovém spise č. 5 258 389, ve spisech WO 94/09010 a WO 95/16691 a v USA petentovém spise č. 5 120 842 apod.

Následující příklady provedení způsob podle vynálezu blíže ilustrují. Uvedená zkratka TES znamena skupinu triethylsilylovou.

Příklady.provedení_vynálezu

Příklad 1

32-desoxorapamycin /R^ = methylová skupina; Rg = zbytek obecného vzorce II, ve kterém R^ = atom vodíku a R^ = methylová skupina;

X = atom vodíku, Y = atom kyslíku/

K míchanému a chlazenému /-78 °C/ roztoku 26,1 g /22,85 mmol/ 28,40-bis-0-TSS-rapamycinu ve 260 ml tetrahydrofuranu se přidá

50,3 ml /50,3 mmol/ 1 M roztoku lithium-tri-terc.-butoxyaluminiumhydridu v tetrahydrofuranu. Získaný roztok se v průběhu 2 h nechá ohřát na -15 °C. Potom se chladicí lázeň nahradí ledovou lázní, která teplotu zvedne na 0 °C a v míchání při této teplotě se pokračuje 1 h. Reakční směs se nalije do dělicí nálevky, která obsahuje 750 ml ethylacetátu a 400 ml ledově studeného 2 N vodného roztoku kyseliny citrónové a krátce se protřepe. Vodná vrstva se oddělí a extrahuje 2x studeným ethylacetátem. Spojené organické roztoky se promyjí ledově studeným 2 N vodným roztokem kyseliny citrónové, vodou, nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a 2x nasyceným vodným roztokem chloridu sodného, potom se vysuší nad bezvodým uhličitanem sodným, zf^itrují a odpaří za sníženého tlaku. Odparek, který sestává ze směsi 32/R/-dihydro-28,40-bis-0-TES-raparnyčinu a /32R/9,32-bis-dihydro-28,40-bis-0-TES-rapamycinu, se rozpustí bez dalšího čištění ve 260 ml methanolu. Tento roztok se ochladí na 0 °C a nechá reagovat se 6,85 g /34,31 mmol/ octanu měčínatého. Po 1 h míchání se vzniklá suspenze zředí methyl-terc.-butyletherem_? promyje 2x vodou a 2x nasyceným vodným roztokem chloridu sodného. Vodná vrstva se reextrahuje methyl-terc.-butyletherem. Spojené organické roztoky se vysuší nad bezvodým síranem sodným, zfiltrují a odpaří za sníženého tlaku. Odparek se čistí chromatografií na silikagelu /60 : 40, hexan-methyl-terc.-butylether/ a poskytne čistý 32/R/-dihydro-28,40-bis-0-TES-raparnycin jako pevnou bílou látku.

9999 ·· 9

NMR /CDCiy 4 : 1 směs rotamerů, chemické posuny v závorkách se týkají minoritního rotamerů delta 0,72 /13, dd, H-38ax/, 1,63 /1,60/ /53, s, ΟΙΪ-ΟΗ^, 1,66 /1,69/ /3H, s, C.29-CH5/, 1,77 a 1,81 /H-33/, 2,46 /15, m, 5-31/, 2,82 /2,91/ /15,- m, H-25/, 2,91 /15, m, H-39/, 3,13 /53, s, CI6-OCH5/, 3,26 /53, s, 027-OCHy, 3,41 /15, m, H-40/, 3,43 /3H, s, C39-OCH5/, 3,62 /13, m, H-32/,

3,75 /3,57/ /1H, d, H-27, 4,10 /13, d, H-28/, 4,81 /15, široké s, C10-0H/, 5,05 /13, d, H-34/, 5,27 /13, d, H-30/, 5,36 /15, d,

5-2/, 5,69 /18, dd, 3-22/, 6,03 /5,96/ /15, d, 5-18/, 6,15 /15, dd, H-21/, 6,33 /15, dd, 5-20/, 6,40 /35, dd, 5-19/ MS /FAB, Lil matrice/ m/z 1150 /(M 4 Lij⁺/ /rel. intenzita 100/

K míchanému a chlazenému /-15 °C/ roztoku 20,69 g /18,10 mmol/ 32/R/-dihydro-28,40-bis-O-TES-rapamycinu a 7,55 ml /54,27 mmol/ triethylaminu ve 200 ml dichlormethanu se přidá 2,10 ml /27,02 mmol/ methansulfonylchloridu. Směs se míchá 20 min, potom se zředí ethylacetátem a přidá se nasycený vodný roztok hydrogenuhličitanu sodného. Vrstvy se oddělí a vodná vrstva se extrahuje 3x ethylacetátem. Spojené organické fáze se promyjí nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a nasyceným vodným roztokem chloridu sodného, vysuší nad bezvodým síranem sodným, zfiltrují a zahustí za sníženého tlaku. Odparek se může vyčistit sloupcovou chromatografií na silikagelu /80 : 20, hexan-ethylacetát/ a poskytne čistý 32/R/-dihydro-32-0-mesyl-28,40-bis-0-TES-rapamycin jako bílou pevnou látku, ale zpravidla se surový produkt použije v následujícím stupni bez dalšího čištění.

4l NMR /CDCI5/ delta 0,77 /15, dd, E-38ax/, 1,67 /33, s, C17-CHy, 1,72 /3H, s, C-29-CH5/, 2,77 /15, M, H-25/, 2,92 /.15, m, H-39/, 3 ,-03-/-33^ s , C16-OCH₅/ , 3,17 / 35, s, C27-UCH,/ , 3,21 / 3Ξ, s, C 39 -~ OCHy, 3,42 /15, m, H-40/, 3.45 /3H, s, CHjSOy , 3,91 /1H, d, H27/, 4,10 /1H, d, H-28/, 4,72 /15, m, 5-32/, 4,94 /15, s, C1005/, 5,12 /15, m, 5-34/, 5,25 /15, d, 5-30/, 5,43 /15, d, H-2/, 5,88 /15, dd, H-22/, 6,03 /15, d, H-18/, 6,18 /15,dd, H-21/, 6,37 /15, dd, H-20/, 6,44 /1H, dd, Ξ-19/ MS /FAB, Lil matrice/ m/z 1228 /'jM + LiJ⁺/ /rel. intenzita 68/, 1132 /[/M - CH^SOy/ + Lij⁺/ /rel. intenzita 100/ • · · · · · • · • · • · · • Φ i

• ·· • ·· ·· • ·· • ··

Směs 22,55 g /18,50 mmol/ 32/R/-d.ihydro-32-0-mesyl-28,40-bis-O-TES rapamycinu, 27,50 g /185,55 mmol/ jodidu sodného a 6,5 ml /56,68 mmol/ diisopropylethylaminu ve 400 ml tetrahydrofuranu se vaří pod zpětným chladičem 6 h, potom se nechá vychladnout na teplotu místnosti. Získaná směs se zředí ethylacetátem a smíchá s 58,4% vodným roztokem hydrogensiřičitanu sodného. Vrstvy se oddělí. Organická fáze se promyje 3x nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a lx nasyceným vodným roztokem chloridu sodného, potom se vysuší nad bezvodým síranem sodným, zfiltruje a zahustí za sníženého tlaku. Odparek se čistí sloupcovou chromatografií na silikagelu /83 : 17, hexan-ethylacetát/ a poskytne čistý 32/S/-desoxo-32-jod-28,40-bis-0-TES-rapamycin.

NMR /CDC1-/ 1,5 : 1 směs rotamerů, chemické posuny v závorkách se týkají minoritního rotamerů delta 0,73 /15, dd, H-38ax/, 1,68 /1,66/ /65, s, C17-CH₃ a 029-05^, 2,72 /15, m, H-25/, 2,91 /2H, m, 5-32 a 5 39/, 3,15 /33, s, Cló-OCHy , 3,30 /3,31/ /3H, s, C27-OCH₃/, 3,43 /3,41 /35, s, C39~OCH₃/, 3,77 /3,91//18, ů, H27/, 4,21 /4,25 /15, d, 5-28/, 4,51 /15, s, C10-0H/, 5,45 /5,48/ /15, d, 5-30/, 5,60 /5,79/ /15, dd, 5-22/, 6,02 /5,85/ /15, d,

5-18

MS /FAB, Lil matrice/ m/z 1260 /ΓΜ + Lij⁺/ /rel. intenzita 100/

K míchanému a chlazenému /0 °C/ roztoku 16,79 g /13,19 mmol/ 32/S/-desoxo-32-jod-28,40-bis-0-TES-rapamycinu ve 190 ml toluenu se přidá 7 ml /26,38 mmol/ tributylcínhydridu a potom 1,3 ml /1,30 mmol/ 1 M roztoku triethylboranu v hexanu. Směs se míchá 30 min a smíchá s nasyceným vodným roztokem chloridu amonného. Vrstvy se oddělí a vodná vrstva se extrahuje 2x ethylacetátem. Spojené organické vrstvy se promyjí vodou, nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vodou a 3x nasyceným vodným roztokem chloridu sodného, potom se vysuší nad bezvodým síranem sodným, zfiltrují, ..zahustí za sníženého tlaku a odparek se čistí šloupcovou chromatografií na silikagelu /75 : 25, hexan-methyl-terc.-butylether/ a poskytne čistý 52-desoxo-28,40-bis-0-TESrapamycin jako bílou pevnou látku.

,5 : 1 směs rotamerů, chemické posuny v závorkách se týkají minoritního rotamerů delta 0,73 /15, dd, H-38ax/, 1,62 ·· • · · ·

/1,57/ /3H, s, 017-03^, 1,68 /1,72/ /53, s, C29-CHy, 2,77 /2,91/ /13, m, 3-25/, 2,91 /1Ή, m, 3-39/, 3,15 /38, s, C16-OCH₃/, 3,27/3,25/ /5H, s, C27-0C3₃/, 3,43 /3,45/ /33, s, C39-0CH₃/, 3,70 /3,67/ /31, d, 3-27/, 4,11 /4,07 /13, d, 3-28/, 4,57/13, široké s, ClO-OH/, 4,87 /4,67//13, d, 3-34/, 5,19 /5,08/ /13, d, 3-30/, 5,32 /13, d, 3-2/, 5,60 /5,66/ /13, dd, 3,22/, 6,01 /5,92 /15, d, 3-18/, 6,17 /13, dd, H-21/, 6,30 /13, dd, 3-20/, 6,40 /13, dd, 3-19/

MS /FAB, Lil matrice/ m/z 1134 /QM * Li]⁺/ /rel. intenzita 100/

K míchanému, a chlazenému /-15 °C/ roztoku. 10,73 g /9,52 mmol/ 32-desoxo-28,40-bis-O-TES-rapamycinu. v 85 ml methanolu se přikapává 9,5 ml 2 N vodné kyseliny sírové. Po ukončeném přikapávání se reakční směs ohřeje na 0 °C a míchá 1,5 h, potom se zředí ethylacetátem a smíchá s nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného. Vrstvy se oddělí a vodná vrstva se extrahuje 3x ethylacetátem. Spojené organické fáze se promyjí 3x nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a nasyceným vodným roztokem chloridu sodného, potom se vysuší nad bezvodým síranem sodným, zfiltrují a zahustí za sníženého tlaku. Odparek se rozpustiv diethyletheru, načež žádaný 32-desoxo-rapamycin vykrystaluje /bezbarvé krystaly/.

NMR /CDCl^/ 3 : 1 směs rotamerů, chemické posuny v závorkách se^- týkají minoritního rotamerů delta 0,70 /13, dd, 3~38ax/, 1,14 a 1,32 /3-32/, 1,56 /3-33/, 1,65 /1,62/ /33, s, 017-03^, 1,68 /1,70/ /53, s, 029-03^, 2,31 /23, m, 3-23 a 3 31/, 2,82 /2,95/ /13, m, 3-25/, 2,95 /13, m, 3-39/, 3,14 /33, s, ClŮ-OCSy , 3,32 /33, s, C27-0C3₃/, 3,38 /13, m, 3-40/, 3,43 /3,41/ /33, s, C39-0C3₃/ , 3,61 /13, d, 3-27/ , 4,12/13, d , 3-28/ , 4,80/4,71//31, “ d, 3-34/, 5,22 /13,d, 3-30/, 5,31 /31, d, 3-2/, 5,56 /13, dd, H

-22/, 5,95 /5,87/ /13, d, 3-18/, 6,16 /13, dd, 3-21/, 6,36 /13, dd, 3-20/, 6,41 /13, dd, 3-19/

MS /FAB, Lil matrice/ m/z 906 /[M + Li] ⁺/ /rel. intenzita 100/

- 18 Příklad 2

16-pent-2-inyloxy-32/S/-dihydrorapamycin /R^ = pent-2-inylová skupina; Hg = zbytek obecného vzorce II, ve kterém R5 = atom vodíku a R^ = methylová skupina; X = hydroxylová skupina; I = atom kyslíku ·· ····

K míchanému a chlazenému /0 °C/ roztoku 970 mg /1,06 mmol/ 32/S/dihydrorapamycinu a 1, 39 ml /15,00 mmol/ 2-pentin-l-olu ve 20 ml dichlormethanu se přidá 0,50 ml /6,50 mmol/ trifluoroctové kyseliny. Směs se míchá při 0 °C 3 h a potom se přidá nasycený vodný roztok hydrogenuhličitanu sodného. Vrstvy se oddělí a vodná vrstva se extrahuje 3x ethylacetátem. Spojené organické roztoky se promyjí nasyceným vodným roztokem chloridu sodného, vysuší nad bezvodým síranem sodným, zfiltrují a zahustí za sníženého tlaku. Surová směs se čistí sloupcovou chromátografií na silikagelu /20 :

80, hexan-e thy láce tát/, potom HPLC s reverzní fází /RP 18, 81 :

19, methanol-voda/ a poskytne titulní sloučeninu jako bílou amorfní látku.

NMR /CDClj/ 2,5 : 1 směs rotamerů, chemické posuny v závorkách se týkají minoritního rotameru delta 0,71 /LH, dd, H-38 ax/, 1,13 /1,05//38, t, CH₃CH₂CCCH₂0/, 1,67 /38, s, 17-CHy, 1,69 /38, s, 29-CHj/, 2,21/28, qt, CHjCHgCCCHgO/, 2,96/18, m, H-39/, 3,33 /3,37//3H, s, 27-0085/, 3,41 /3,39//38, s, 39-OCB5/, 3,78 /18, dt, CHjCSgCCCHHO/, 4,0 /1H, dt, CHjCHgCCCHHO/, 5,52 /5,71/ /18, dd, H-22/, 5,98 /5,83/ /18, d, H-18/, 6,15 /18, m, 8-21/, 6,30 /1H, dd, 8-20/, 6,40 /1Ή, dd, 8-19/ MS /FAB/ m/z 974 / [M + Lij ⁺/

Příklad 3

16-pent-2-inyloxy-32/S/-dihydrorapamycin /alternativní cesta/

Rapamycin reakcí s 2-pentin-l-olem analogickým postupem jako v příkladu 2 poskytne 16-pent-2-inyloxyrapamycin. K míchanému a chlazenému /-77 °C/ roztoku 17,5 g /18,1 mmol/ 16-demethoxy-16-pent-2-inyloxyrapamycinu ve 180 ml tetrahydrofuranu se přidá 21,7 ml /21,7 mmol/ 1 M roztoku triethylborohydridu sodného v tetrahydrof uranu. Po 1 h při teplotě -77 °C se reakce přeruší a ne- 19 -

··	····	• ··	4· ····
• ·	•	·· · 4	• · ·
•	•	···	• ·	• · ·
•	•	• ·	• ·	• ··· ·
• ·	•	• ·	• ·
• 4	···	··· ····	·· 4

utralizuje 10% vodným roztokem kyseliny citrónové. Reakční směs se potom nechá ohřát na teplotu místnosti a většina tetrahydrofuranu se odstraní odpařením za sníženého tlaku. Zbývající roztok se extrahuje 2x ethylacetátem, organické fáze se spojí a vysuší nad síranem sodným. Po odpaření rozpouštědla se surový reakční produkt chromatografuje na silikagelu a eluuje směsí hexan -aceton /7 : 3/. Konečného vyčištění se dosáhne preparativní HPLC /RP-18, 76 : 24, methanol-voda/ a získá se titulní sloučeni na jako amorfní bílá látka.

Spektrální data jsou shodná s daty produktu, který byl získán jinou cestou.

Příklad 4

32/S/-dihydro-40-0-/2-methoxy/ethylrapamycin /R^ = methylová skupina; Rg s zbytek obecného vzorce II, ve kterém R^ = 2-methoxyethylová skupina a R^ = methylová skupina; X = hydroxylová skupina; I = atom kyslíku

K míchanému a chlazenému /0 °C/ roztoku 2,17 g /2,00 mmol/ 40-0-/2-methoxy/ethyl-28-0-TES-rapamycinu ve 20 ml tetrahydrofuranu se přikapou 4,4 ml /4,4 mmol/ 1 M roztoku L-Selectridu^R v tetrahydrofuranu. Vzniklý žlutý roztok se míchá 3 h při 0 °C a přebytečné hydridové činidlo se rozloží přídavkem 2 ml methanolu. Roztok se zředí methyl-terc.-butyletherem a přidá se nasycený vodný roztok Ročhellovy soli. Směs se nechá ohřát na teplotu místnosti a v míchání se pokračuje 15 min. Vrstvy se oddělí a organický roztokse promyje studenou 1 N kyselinou chlorovodíkovou, na- ’ syceným vodným roztokem chloridu sodného, 1 N roztokem hydrogenuhličitanu sodného a opět roztokem chloridu sodného. Vodné promývací podíly se ještě reextrahují methyl-terc.-butyletherem. Spojené organické vrstvy se vysuší nad bezvodým síranem sodným, zfiltrují a zahustí za sníženého tlaku, čímž se získá surová směs 32S a 32R isoinerů. 32-dihydro-40-0-/2-methoxy/ethyl-28-0-TES-rapamyčinu.

Výše získaný surový produkt se rozpustí ve 20 ml acetonitrilu a ochladí na 0 °C. K tomuto roztoku se přidají 2 ml komplexu fluorovodík-pyridin. V míchání se pokračuje lha přidá se 1 N roztok hydrogenúhliěitanu sodného. Směs se extrahuje 3x methyl-terc.-butyletherem. Spojené organické roztoky se promyjí 1 N roztokem hydrogenuhličitanu sodného a nasyceným vodným roztokem chloridu sodného, vysuší nad bezvodým síranem sodným, zfiltrují a zahustí za sníženého tlaku. Čištění se provede HPLC s reverzní fází /RP18, 5jom, 50 : 50 až 100 : 0, acetonitril-voda po dobu 60 min/ a získá se 32/S/-dihydro-40-0-/2-methoxy/ethylrapamycin a 32/B/-dihydro-40-0-/2-methoxy/ěthýlrapamycin jako vedlejší produkt.

32/S/-dih.ydro-40-0-/2-meth.oxy/ethy Ira parny ein: NMR /CDCiy : 1 směs rotamerů, chemické posuny v závorkách se týkají minoritního rotameru delta 0,77 /1H, dd, H-38 ax/, 1,67 / 65, s, C17

-CH₅ a 029-CHy, 2,50 /15, m, H-3L/, 3,01 /15, m, H-25/, 3,12 /2Ξ, m, H-39 a H-40/, 3,14/3,15/ /35, s, OCH^, 3,28 /lH, .m_r H-32/, 3,36 /3,34/ /35, s, OCSy, 3,39 / 35, s, OCSj/, 3,48 /3,46/ /35, s, ocsy, 3,55 a 3,75 /4H, 2m, 0CH₂CH₂0/, 3,84 /15, m, H-14/, 3,84 /1H, m, H-14/, 4,12 / ,16/ /15, d, H-28/, 4,73 /15, s,

C10-CE/, 5,03 /1H, m, H-34/

MS /RAB/ m/z 980 /[M + Lij*/

Příklad 5 /32S/-dihydro-40-0-/2-hydroxy/ethylrapamycin /R^ = methylová skupina; R₂ = zbytek obecného vzorce II, ve kterém R^ = 2-hydroxyethylová skupina a R^ = methylová skupina; X = hydroxylová sku‘pinay^Y^^atom^kyslíku/ —— - — — - —™

Analogicky podle postupu v příkladu 4, avšak, s použitím vhodných výchozích látek, se získá titulní sloučenina.

/32S/-dihydro-40-0-/2-h.ydroxy/ethylrapamycin: NMR /CDCl^/

1,7 : 1 směs rotamerů, chemické posuny v závorkách se týkají minoritního roti^aeru delta 0,76 /15, dd, H-38ax/, 2,50 /15, m, H-31/, 3,10 /15, m, H-39/, 3,13 / 3,14 / 35, s, Cló-OCSj/, 3,20 • •9 9

- 21 /1H, m, H-40/, 3,28 /1H, m, H-32/, 3,36 /3,38/ /5EL_t s, C27-0CHy, 3,45 /3,43/ 3,41/ /3H, s, 039-OCHy, 3,50 /1H, d, H-27/,

3,58 a 3,70 /4H, m, OCHgCHgOH/, 4,12 /4,16/ /1H, d, H-28/, 5,06 /1H, m, H-34/, 5,60 /2H, dd, H-22/, 5,99 /1H, d, H-18/, 6,17 /1Ή, dd, H-21/, 6,33 /1H, dd, H-20, 6,42, dd, H-19/

MS /FAB, Lil matrice/ m/Z 966 /pí 4- Lij */ rel. intenzita 100/

Příklad 6

16-pent-2-inyloxy-32-desoxorapamycin /Rj = pent-2-inylová skupina; R₂ = zbytek obecného vzorce II, ve kterém R^ * atom vodíku a R^ = methylová skupina; X = atom vodíku; Y = atom kyslíku/

Analogicky podle postupů v příkladech 1 a 2 nebo 3, avšak s použitím vhodných výchozích látek, se získá titulní sloučenina. *3NMR /CDCiy delta 0,70 /1H, dd, H-38ax/, 1,23 /3H, t, CHjCH₂CCCH₂O/, 2,21 /2Ξ, ddq., CHjCHgCCCHgO/, 2,78 /1H, m, H-25/, 2,94/lH, m, H-39/, 3,31 /3H, s, C27-0CHy, 3,42/32, s, C39-OCHy, 3,62 /1H, d, H-27/, 3,78 /1H, ddd, CHjCHgCCCHgO/, 4,02 /IH, ddd, CH₃CH₂CCCH₂O/, 4,12 /1H, d, H-28/, 4,79 /1H, m, H-34/, 5,20 /1H, d, H-30/, 5,28 /IH, široký d, H-2/, 5,50 /1H, dd, H-22/, 5,97 /13, d, H-18/, 6,14 /1H, dd, H-21/, 6,30 /1H, dd, H-20/, 6,38 /1H, dd, H-19

MS /FAB, Lil matrice/ m/z 958 / |M + Lij⁴/ /rel. intenzita 100/

Sloučeniny obecného vzorce I vykazují farmaceutickou aktivitu a jsou proto upotřebitelné jako léčiva.

Sloučeniny obeeného vzorce tiproliferativní účinnost, vacích metod in vitro a in

I mají zejména imunosupresivní a anjak je zřejmé z následujících testoví vo.

•0 ···· *· ···· ····· · · · · · ϊ « · · · ·····# * · · · · · · _ 22 - .........*.....

1. Smíšená reakce lymfocytů /MLR/

Smíšená reakce lymfocytů /Mixed Lympbocyte Reaction, MLB/ byla původně vyvinuta v souvislosti s alloštěpy, aby se zjistila kompatibilita tkáně mezi potenciálními dárci orgánu a příjemci, a je to jeden z nejlépe zavedených modelů imunitní reakce in vitro. Myší model MLR, například jak jej popsal T. Meo v immunological Methods, L. Lefkovits a B. Pernis, Eds., Academie press, N.Y, str. 227-239 /1979/, je použit k prokázání imunosupresivního efektu sloučenin obecného vzorce I. Slezinné buňky /2 x 10^ v jamce/ z myší kmene Balb/c /samice, 8 až 10 týdnů staré/, se inkubují na mikrotitračních plotnách 5 dnů se slezinnými buňkami z myší kmene CBA /samice, 8 až 10 týdnů staré/ v množství 0,5 x 10^, ozářených /2000 rad/ nebo prepárovaných mytomycinem C. Ozářené allogenetické buňky vyvolávají proliferativní odpověď ve slezinných buňkách z myší Balb/c, což lze měřit inkorporací značeného prekursoru do DNA. Po ozáření /nebo po preparaci mytomycinem C/ nereagují buňky stimulátora na buňky Balb/c proliferací, ale udržují si svou antigenitu. Antiproliferativní efekt sloučenin obecného vzorce I na buňky Balb/c se měří při různých zředěních a vypočítává se koncentrace, která vyvolává 50ji inhibici proliferace buněk /IC^q/. Inhibiční kapacita testovaného vzorku se může srovnat s rapamycinem a vyjádřit jako relativní IC^q /tj. IC^q zkoušeného vzorku : IC^q rapamycinu/ U sloučenin z příkladů 1 a 2 bylo nalezeno, že mají v tomto testu relativní IC^q od 0,5 až do 0,08.

2. Proliferace přenášená IL-'6 /IL-6 PROL/_______ ___

Kapacita interference sloučenin obecného vzorce I s růstovým faktorem asociovaného signálního pochodu, se zjištuje s použitím hybridní linie myších buněk, závislých na interleukinu 6 /IL-6/. Ťest se provádí na mikrotiračních deskách s 96 jamkami. Kultivuje se 5000 buněk/jamka, v mediu bez séra /jak popsal Μ. H. Schreier a R. Tees v Immunological Methods,

I. Lefkovits a B. Pernis, Eds., Academie Press 1981,’ sv. II, str. 265 - 275/, doplněném 1 ng rekombinantního IL-6/ ml. Po 66 h inkubace v nepřítomnosti nebo v přítomnosti zkoušeného

- 25 vzorku, se buňky ozáří 1 p.Ci / 3·Ή/-thymidinu/jamka, po dalších 6 h se sklidí a měří kapalinovou scintilací. Inkorporace /3-fl/-thymidinu do DNA odpovídá vzrůstu počtu buněk a je tedy měřítkem proliferace buněk. Zřeňovací série zkoušeného vzorku umožňuje výpočet koncentrace, jejímž výsledkem je 50% inhibice proliferace buněk /IC^q/. Inhibiční kapacita zkoušeného vzorku může být srovnána s rapamycinem a vyjádřena jako relativní IC_5Q /tj. zkoušený vzorek : IC^q rapamycinu/. Bylo nalezeno, že sloučeniny z příkladu 1 a 2 mají v tomto testu relativní IC^q od 0,2 do 0,09.

3. Test vazby na makrofilin /MBA/ ramapycinu a o strukturně blízké imunosupresivní. látce FK-506 je známo, že se in vivo vážou na makrofilin-12 /rovněž známý jako bílkovina vázající FK-506 nebo FKBP-12/, a o této vazbě se předpokládá/ že má vztah k imunosupresivní aktivitě zmíněných sloučenin. Sloučeniny obecného vzorce I se též pevně vážou na makrofilin-12, jak to ukazuje test kompetitivní vazby. V tomto testu se používá FK-506, vázaný na BSA, k zakrytí mikrotitračních jamek. Rekombinantní lidský makrofilin-12 s biotinem /biot-MAP/ se nechá vázat v přítomnosti nebo nepřítomnosti testovaného vzorku na imóbilizovaný FK-506. Po promyťí /aby se odstranil nespecificky vázaný makrofilin/ se navázaný biot-MAP zjišíuje inkubací s konjugátem streptavidinu s alkalickou fosfátázou, potom následuje promytí a další adice p-nitrofenylfosfátu jako substrátu. OD se odečítá při 405 nm. Výsledkem vazby zkoušeného vzorku na biot-MAP je pokles množství biot-MAP vázaného na FL-506 á tím i pokles OĎ 405. Zřeňovací série zkoušeného vzorku umožňuje stanovení koncentrace, která způsobí 50% inhibici vazby biot-MAP na imobilizovaný FK-506 /IC^q/. Inhibiční kapacita zkoušeného vzorku se srovnává s IC_crx volného FK-506 jako standardu a vyjadřuje se jako relativní ΙΟ^θ /tj. jako IC_5Q zkoušeného vzorku : IC₅₀ volného FK-506/. V tomto testu bylo nalezeno, že sloučeniny z příkladů 1, 2 a 5 mají relativní IC₅₀ 1, 2,8 a 2,5.

<·· ···· • « 9 9 9 li 9 999 9 • 99 9 9 · ·

Π A ·· ··· ··· ···♦ 99 ♦

4. Lokalizovaná reakce štěpu proti příjemci /GvH/

Účinnost sloučenin obecného vzorce I in vivo se prokazuje na vhodném modelovém zvířeti, jak například popsal Ford se sp. , TRANSPLAŇTATION 10 /1970/ 258. Slezinné buňky /1 x 10⁷/ ze 6 týdnů starých krysích samic kmene Wistar/Furth /iYF/ se podkožně injikují v den 0 do levé zadní tlapky krysích samic kmene /F344 x WF/F^ , o hmotnosti asi 100 g. Injekce se dávají zvířatům 4 dny po sobě a 7. den se odejmou popliteální lymfatické uzliny a zváží. Rozdíly ve hmotnosti mezi oběma lymfatickými uzlinami slouží jako parametr pro vyhodnocení reakce.

5. . Reakce alloštěpů ledvin u krysy

Jedna ledvina z dárcovské krysy kmene DA/RT1 / nebo Brown-Norway /BN/ /RTlⁿ/ se transplantuje do renální cévy jednostranně /na levé straně/ nefrektomované krysy-příjemce /Lewis RTl^/, s použitím anostomózy sešitím konci k sobě. Anostornoza močovodu je provedena stejně. Medikace začína v den transplantace a pokračuje po dobu 14 dnů. Kontralaterální nefrektomie se uskuteční 7 dní po transplantaci, přičemž příjemce je odkázán na funkci dárcovy ledviny. Přežití příjemce štěpu slouží jako parametr pro funkční štěp.

6. Experimentálně vyvolaná alergická encefalomyelitida /EAE/ u krys

Účinnost sloučenin obecného vzorce I při EAE se měří například postupem, který popsali Levine a ffenk, AMER. J. PATH. 47 /1965/ 61; MeParlin^se-sp.-,.^J,-1100101.-112-/1974/ 712; Borel, TRANSPLANT. and CLIN. IMMUNOL 1J /1981/ 5. EAE je široce přijímaný model roztroušené sklerózy. Samci kmene ffistar dostávají do zadních tlapek injekce směsi míchy s kompletním Freundovým adjuvans. Symptomy onemocnění /paralýza ocasu a obou zadních tlapek/ se obvykle vyvinou v průběhu 16 dnů. Počet onemocnělých zvířat, jakož i doba začátku onemocnění, se zaznamená. ^z • · ·· • · • ·

·· ··· • « · ♦ ·····«· · · ·

7. Artritis s Freundovým adjuvans

Je popsána účinnost proti experimentálně vyvolané artritidě s použitím postupu, který například popsali Winter a Nuss, ARTHRITIS and RHEUMATISM £ /1966/ 394; Billingham a Davies, HANDBOOK OF EXPERIMENTAL PHARMACOL /Vane and Ferreira. . Eds., Springer-^Verlag, Berlin/ £0/11 /1979/108-144. Krysy kmene Wistar a OFA /samci nebo samice, 150 g tělesné hmotnosti/ dostávají podkožní injekce do začátku ocasu nebo do zadní tlapky, s 0,1 ml minerálního oleje, který obsahuje 0,6 mg lyofilizováného, teplem usmrceného mikroorganismu Mycobacterium smegmatis. Při vývoji modelové artritidy se medikace zahájí ihned po injekci adjuvans /dny 1 až 18/; v prokázaném modelu artritidy se medikace zahájí 14. den, kdy je sekundární zánět dobře vyvinut /dny 14 až 20/. Na konci pokusu se otok kloubů měří posuvným mikroměřítkem. ED^q je perorální dávka v mg/kg, která zmenší otok /primární nebo sekundární/ na poloviční hodnotu kontroly.

8. Protinádorová aktivita a aktivita MDR

Protinádorová aktivita sloučenin obecného vzorce I a jejich schopnost zvýšit účinnost protinádorově aktivních látek snížením mnohočetné lékové rezistence je demonstrována například podáváním protinádorově aktivní látky, například kolchicinu nebo etoposidu, buňkám s mnohočetnou lékovou rezistencí, jakož i buňkám citlivým na léčiva, in vitro nebo zvířatům, která mají mnohočetnou lékovou rezistenci._nebo citlivost na léčiva u svých nádorů, nebo infekcí, se současným podáváním ne_ bo bez současného podávání s loučenin ob e cného vzorcel, k te ré mají být testovány a podáváním sloučenin obecného vzorce I samotných.

Takové testování in vitro se provádí s použitím vhodné rezistentní buněčné linie a kontrolní /parenterálně/ buněčné linie, generované např. tak, jak popsali Ling se sp., J. Cell.Physiol. 8g, 103-116 /1974/ a Bečh-Hansen se sp.„_t J. Cell. Physiol. 88, 23-32 /1976/. Určité vybrané klony jsou

- 26 mnohočetně lékově rezistentní /například rezistentní proti koléhicinu/ linie CHR /subklon C5S3.2/ a parenterální senzitivní linie AUX B1 Sil/.

In vivo se protinádorová a anti-MDR aktivita prokazuje například u myší, kterým se injikují mnohočetně lékově rezistentní a na léky senzitivní rakovinové buňky. Sublinie Ehrličhova ascitického karcinomu /EA/, které jsou rezistentní proti substancím DR, VC, AM, ET, TE nebo CC, se vyvíjejí postupným přenášením buněk EA následným generacím hostitelských myší kmene BALB/c, v souhlase s metodou, kterou popsal Slater se sp., J. Clin. Invest. 70, 1131 /1982/.

Rovnocenné výsledky se mohou získat při použití sloučenin obecného vzorce I ve zkušebních modelech srovnatelného vzoru, například in vitro, popřípadě s použitím zkušebních zvířat, infikovaných mnohočetně lékově rezistentními a senzitivními kmeny virů, bakteriálními kmeny rezistentními proti antibiotikům /například penicilinu/, antimykoticky rezistentními a citlivými kmeny hub a rovněž kmeny protozoí, které jsou rezistentní proti lékům, jako jsou například kmeny Plasmodií, například přírodně se vyskytující podkmeny Plasmodium falciparum, které vykazují získanou rezistenci proti chemoterapeutikům a antimalarikům.

9. Inhibice Mip a faktorů podobných Mip

Sloučeniny obecného vzorce I navíc vážou a blokují různé druhy Mip /macrofage infectivity potentiator/ a faktory podobné Mip, které se strukturně podobají makrofilinu. Mip a faktory podobné Mip jsou virulentní faktory, které jsou produkovány celou řadou patogenů, včetně rodů Chlamidia, například Chlamidia trachomatisj Neisseria, například Neisseria meningitidis; a Legionella, například Legionella pneumophilia; a rovněž obvyklými parazitickými členy řádu Rickettsiales. Tyto faktory hrají kritickou úlohu při vytváření intracelulární infekce. Účinnost sloučenin obecného vzorce I při

- 27 redukci infekční aktivity patogenů, které produkují Mip nebo faktory podobné Mip, lze prokázat srovnáváním infekční aktivity patogenů v buněčné kultuře v přítomnosti a nepřítomnosti makrolidů, například s použitím metod, které popsal

Lundemose se sp., Mol. Microbiol. /1993/ 7: 777.

10. Chronická rejekce alloštěpů

Ledvina krysího samce kmene DA RT1 / se ortotopieky transplantuje do příjemce, krysího samce kmene Lewis /RTl^/.

Celkem je transplantována do 24 zvířat. Všem zvířatům se podává cyklosporin A perorálně v dávce 7,5 mg/kg/den, po dobu 14 dní, počínaje dnem transplantace, aby se předešlo akutní celulámí rejekci. Kontralaterální nefrektomie se neprovádí. Každá pokusná skupina, které jsou podávány různé dávky sloučenin obecného vzoree I nebo placebo, sestává ze 6 zvířat. Počínaje dnem 53-64 po transplantaci dostávají zvířata-příjemci perorálně po dobu dalších 69-72 dní sloučeniny obecného vzorce I nebo placebo. Za 14 dní po transplantaci se zvířata podrobí¹ hodnocení štěpu působením magnetické rezonance /MRI/ s měřením perfuze ledvin /se srovnáním štěpované ledviny a vlastní kontralaterální ledviny/. To se opakuje 53-64 dní po transplantaci a na konci pokusu. Zvířata se potom pitvají. Parametry rejekce, jako je skóre MRI, relativní rychlost perfuze štěpované ledviny a histologické skóre alloštěpu ledviny pro celulámí rejekci a změny cév se stanoví a statisticky analyzují. Podávání sloučeniny obecného vzorce I, například sloučeniny podle příkladu 1 nebo 2, v dávce ₌ 0,5 do 2,5 mg/kg v tomto modelu alloštěpů ledviny vyvo-_ lává snížení ve všech výše zmíněných parametrech rejekce.

11. Angioplastika

Provede se katetrizace balónkem v den 0, v podstatě tak, jak popsal Powell se sp. /1989/. Při anestezii Isofluranem se katetr Fogarty 2F zavede do levé arteria carotis communis přes vnější karotidu a nafoukne /rozšíření = 10)11 vody/. Nafouknutý balónek se protáhne třikrát po délce carotis commu·· ···>

- 28 nis, naposled dvakrát s jemným otáčením, aby se stejnoměrně odstranil endotel. Katetr se potom vyjme, okolo karotidy se upraví ligatura, aby se předešlo krvácení a zvířata se nechají zotavit.

Dvě skupiny po 12 krysách kmene RoRo /hmotnost 400 g, asi 24 týdnů staré/ se použijí pro studii: první kontrolní skupina a druhá skupina, která dostává zkoušenou sloučeninu. Krysy jsou vybírány namátkově v průběhu celé manipulace, experimentálních procedur a analýz.

Zkoušené sloučeniny se podávají perorálně 3 dny před poškozením balónkem /den -3/ až do konce studie, 14 dní po poškození balónkem /den -14/. Krysy jsou umístěny v samostatných klecích s přístupem ke krmivu a vodě ad libitum. Krysy se anestezují Isofluranem, perfuzní katetr se zasune skrze levou komoru a zajistí v levém oblouku aorty a aspirační kanyla se zasune do pravé komory. Zvířata se perfundují perfuzním tlakem 150 mm Hg, . nejprve po dobu 1 min 0,1 M roztokem chloridu sodného s fosfátovým pufrem /PBS, pH 7,4/ a potom po dobu 15 min 2,5% glutaraldehydem ve fosfátovém pufru / pH 7,4/. Perfuzní tlak je 150 mm Hg na hrotu kanyly /asi 100 mm Hg v karotidě, jak bylo zjištěno v předchozím pokuse zavedením kanyly, spojené s převaděčem tlaku do vnější karotidy/. Karotidy se potom vyříznou, oddělí od okolní tkáně, vloží do 0,1 M kakodylového pufru /pH 7,4/ s obsahem 7 % sacharózy a inkubují přes noc při 4 °C. Následující den se karotidy ponoří do 0,05% roztoku manganistanu draselného v 0,1 M kakodylovém pufru a třepají 1 h při teplotě místnosti a potom se dehydratují ethanolem 2x 10 min v 75%, 2x 10 min v 85%, 3x 10 min v 95% a 3x 10 min ve 100% ethanolu. Dehydratované karotidy se potom uloží do Tečhnovitu 7100 podle doporučení výrobce. Úložné medium se nechá polymerovat přes noc v exsikátoru v atmosféře argonu, poněvadž kyslík inhibuje správné tvrzení bloků.

fiezy o síle 1 až 2 jam se odkrojí ze střední části každé karotidy tvrdým kovovým nožem na rotačním mikrotomu a obarví ·· ···· ·· ···· · · · · · · · · · ····· · · · · * • · · · · ······

za 2 min Giemsovým barvivém. Asi 5 řezů z každé karotidy se takto preparuje a střední areál medie, neointimy a lumen se morfometricky hodnotí pomocí zobrazovacího analytického systému /MCID, Toronto, Kanada/. V tomto testu sloučeniny obecného vzorce I, například sloučenina z příkladu 1 nebo 2, inhibují myointimální proliferaci, když se podávají perorálně v denních dávkách 0,5 do 2,5 mg/kg.

Sloučeniny obecného vzorce I jsou rovněž upotřebitelné v testech při hledání přítomnosti nebo množství sloučenin, které vážou makrofilin, například v kompetitivních testech za účelem diagnózy nebo screeningu. V jiné formě se vynález týká použití sloučenin obecného vzorce I jako pomůcek při screeningu zjišťování přítomnosti sloučenin, které se vážou na makrofilin ve zkoušeném roztoku, například v krvi, krevním séru nebo v testovací půdě. S výhodou je sloučenina obecného vzorce imobilizována v mikrotitračníčh jamkách, aby se mohla vázat v přítomnosti nebo nepřítomnosti testovacího roztoku na značený makrofilin-12 /FKBP-12/. Alternativně FKBP-12 imobilizovaný v titračních jamkách, aby se mohl vázat v přítomnosti nebo nepřítomnosti testovacího roztoku na sloučeninu obecného vzorce I, která byla značena, například fluorem, enzymaticky nebo ozařováním, například na sloučeninu obecného vzorce I, ve kterém R^ je značkovací skupina. Desky se omyjí a změří se množství vázané značené sloučeniny. Množství látky vázající makrofilin v testovacím roztoku je zhruba, nepřímo úměrné množství vázané značené sloučeniny. Pro kvantitatvní analýzu se sestrojí standardní křivka s využitím známých koncentrací sloučeniny vázající makrofilin.

Sloučeniny obecného vzorce I jsou tedy upotřebitelné za těchto podmínek:

a/ Léčení a prevence akutní nebo chronické rejekce transplantovaného orgánu nebo tkáně, například při léčení příjemců transplantátu, například srdce, plic, kombinace srdce-plíce, jater, ledvin, pankreatu, kůže nebo rohovky. Jsou též indikovány při prevenci choroby odmítnutí štěpu příjemcem, jaká následuje po ·· ····

- 30 ·· ···· • · · ···· · · · ····· · · · · · • · ♦ · · ♦····· • · · « · 0 · po transplantaci kostní dřeně.

b/ Léčení a prevence transplantační vaskulopatie, například aterosklerózy.

c/ Lé čení a prevence proliferace buněk hladkého svalstva a migrace, vedoucí k vnitřnímu zesílení cév, obstrukci cév, obstrukční koronární ateroskleróze, restenóze.

d/ Léčení a prevence autoimunitních onemocnění nebo zánětlivých stavů, jejichž etiologie zahrnuje autoimunitní složku, jako je artritida /například reumatoidní artritida, progresivní chronická artritida a arthritis deformans/ a revmatická onemocnění. Specifická autoimunitní onemocnění, proti kterým mohou být sloučeniny obecného vzorce I používány, zahrnují autoimunitní hematologické poruchy /včetně například hemolytické anemie, aplastické anemie, čisté anemie červených krvinek a idiopatické trombocytopenie/, systémový lupus erythematosus, polyčhondritidu, sklerodoma, Wegenerovu granulamatózu, dermatomyositidu, chronickou aktivní hepatitidu, myasthenii gravis,. psoriázu, Steven-Johnsonův syndrom, idiopatický maladsorpční syndromautoimunitní zánětlivá onemocnění střev /včetně například ulcerativní kolitidy a Crohnovy nemoci/, endokrinní oftalmopatii, Gravesovu nemoc, sarkoidózu, mnohočetnou sklerózu, primární cirhózu žlučníku, juvenilní diabetes /diabetes mellitus typu 1/, uveitis /přední a zadní/, keratokonjunktivitidu /suchou a vemální/, intersticiální plicní fibrózu, psoriatickou artritidu, glomerulonefritidu /s nefrotickým syndromem a bez něho, například včetně idiopatického nefritického syndromu a bez něho, nebo nefropatii s minimální změnou/ a juvenilní dermatomyositidy.

e/ Léčení a prevence astmatu.

f/ Léčení mnohočetné lékové rezistence /MDR/. Sloučeniny obecného vzorce I potlačují P-glykoproteiny /Pgp/, což jsou přenosové molekuly membrán blízké MDR. MDR je především problematická u pacientů s rakovinou a AIDS, kteří nereagují na běžnou chemoterapii, poněvadž je léčivo vyplavováno z buněk pomocí Ppg. Sloučeniny obecného vzorce I jsou proto upotřebitelné pro zvýšení účinnosti dalších chemoterapeutik při léčení a kontrole podmínek mnohočetné lé·· ···· ♦ · «···

kové rezistence, jako je monohočetně lékově rezistentní rakovina nebo AIDS.

g/ Léčení proliferativních. poruch, například nádorů., hyperproliferativníoh poruch pokožky apod.

h/ Léčení houbových, infekcí.

i/ Léčení a prevence zánětů, zejména potenciací steroidů.

j/ Léčení a prevence infekcí, zejména infekcí patogeny, které máji Mip nebo Mip podobné faktory.

Pro výše uvedené indikace se potřebné dávkování může samozřejmě měnit, například v závislosti na stavu, který má být léčen /například na typu onemocnění a povaze rezistence/, na žádoucím účinku a na způsobu podávání. Obecně lze dosáhnout uspokojujících výsledků při perorálním podávání dávek od 0,05 do 5 nebo až do 10 mg/kg/ den, například od 0,1 do 2 nebo až do 7,5 mg/kg/den, aplikovaných, jednou nebo v dělených dávkách, 2x až 4* denně, nebo při parenterálním podávání, například intravenózně, a to intravenózní injekcí nebo infuzí, v dávkách od 0,01 do 2,5 až do 5 mg/kg/den, například od 0,05 nebo 0,1 až do 1,0 mg/kg/den. Vhodné denní dávky pro pacienty jsou tedy obvykle 500 mg perorálně, například v rozmezí od 5 do 100 mg perorálně nebo v rozmezí od 0,5 do 125 až do 250 mg intravenózně, například v rozmezí od 2,5 do 50 mg intravenózně.

Alternativně a mnohdy výhodně je dávkování uspořádáno specificky pro pacienta, aby se zjistila nejnižší hladina v krvi, například stanovením technikou RIA. Tak lze upravit dávkování pro pacienta ^se dosáhlo pravidelné nepřerušované hladiny v krvi, jak _ bylo změřeno pomocí RIA v rozmezí od 50 nebo 150 do 500 nebo 1000 ng/ml, tj. analogicky podle metod dávkování běžně používaných při imunosupresivní terapii cyklosporinem.

Sloučeniny obecného vzorce I mohou být podávány jako jediná aktivní složka nebo spolu s jinými léčivy. Například při imunosupresivní aplikaci, jako je prevence a léčení choroby odmítnutí Štěpu příjemcem, rejekce transplantátu nebo autoimunitní onemocnění, by sloučeniny obecného vzorce I mohly být užívány v kombinaci s cyk·* ··*· · ·· ·· ···· « « · · · ♦ · · · · • ♦ ··· · ♦ · · · • · ♦ · · ♦····· « · · · · ·' ·

- 32 - ** ’** ........* * losporiny nebo askomyciny, nebo s jejich, imunosupresivními analogy, například cyklosporinem A, cyklosporinem G, FK-506 apod., dále jsou možné kortikosteroidy, cyklofosfamid, azathioprin, methotrexat, brequinar, leflunomid, mizoribin, mykofenolová kyselina, mykofenolát mofetil, imunosupresivní monoklonální protilátky, například monoklonální protilátky receptorů. leukocytů, například MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD28, CTLA4, B7, CD-45 nebo CD58 nebo jejich ligandy nebo další imuno-modulační sloučeniny. Při protizánětlivých aplikacích mohou být sloučeniny obecného vzorce I užívány s protizánětlivě účinnými látkami, například kortikosteroidy. Při protiinfekčních aplikacích se sloučeniny obecného vzorce I mohou podávat v kombinaci s jinými protiinfekčně účinnými látkamim například protivirově účinnými léčivy nebo antibiotiky.

Sloučeniny obecného vzorce I se podávají jakoukoliv obvyklou cestou, zejména enterálně, například perorálně, například v podobě roztoků nebo nápojů, tablet nebo tobolek, nebo parenterálně, například v podobě injikovatelných roztoků nebo suspenzí. Vhodné jednotkové dávkovači formy pro perorální podávání obsahují například od 1 do 50 mg sloučeniny obecného vzorce I, obvykle 1 až 10 mg. Farmaceutické kompozice, které obsahují sloučeniny obecného vzorce I lze vyrábět běžným způsobem, například analogicky jako farmaceutické kompozice obsahující rapamycin, jak je popsáno například ve; spise EPA 0 041 795.

S výhodou obsahují farmaceutické kompozice některou sloučeninu obecného vzorce I a nosné prostředí, které obsahuje hydrofilní fázi, lipofilní fázi a smáčedlo. Mohou být ve formě emulze nebo před= koncentrátu emulz e. Takové emulz e nebo předkoncentráty emulzí j sou uvedeny například v britské patentové přihlášce č. 2 278 780 A. Lipofilní fáze obsahuje s výhodou 10 až 85 hmot. nosného media, smáčedlo obsahuje 5 až 80 jí nosného media, hydrofilní fáze obsahuje 10 až 50 $ hmot. nosného media. Sloučenina obecného vzorce I je obsažena s výhodou v množství od 2 do 15 hmot.

Obzvláště výhodná farmaceutická kompozice sestává z nosného media v podobě mikroemulzního předkoncentrátu, který obsahuje:

- 33 1/ reakční produkt ricinového oleje s ethylenoxidem, ii/ produkt transesterifikace rostlinného oleje glycerolem, který obsahuje převážně linolovou kyselinu nebo olejovou kyselinu, mono-, di- a triglyceridy nebo polyoxyalkylovaný rostlinný olej.

iii/ 1,2 propylenglykol a iv/ ethanol.

V souhlase s předešlým se tento vynález tedy týká:

A. sloučeniny obecného vzorce I jako léčiva, například při prevenci nebo léčení výše uvedených poruch;

B. farmaceutické kompozice, která obsahuje sloučeninu obecného vzorce I v kombinaci s farmaceuticky přijatelným zřečLovadlem nebo nosičem;

C. metody prevence nebo léčení poruch, jak je uvedeno výše, u subjektu, který<takové- opatření potřebuje, kterážto metoda zahrnuje podávání účinného množství sloučeniny obecného vzorr ce I zmíněnému subjektu;

D. výbavu nebo balení k použití při imunosupresi, zánětu nebo infekcích, jak je uvedeno výše, obsahující farmaceutickou kompozici, která obsahuje sloučeninu obecného vzorce I a farmaceutickou kompozici, sestávající bučí z imunosupresivního léčiva nebo z protizánětlivě nebo protiinfekčně účinné látky.

S překvapením bylo také“nalezeno, že sloučeniny obecného vzorce I, ve kterém Σ značí hydroxylovou skupinu, tj. J2/S/-dihyd.rosloučeniny mají vyšší aktivitu, například ve výše uvedených testech a jsou mnohem stabilnější než odpovídající enantiomery, tj. 32/R/-dihydrosloučeniny, jsou-li například podrobeny tomuto testu:

- 34 testované sloučeniny se inkubují v krysím séru a jejich vazná afinita k FKBP12 se měří testem MBA po různých dobách inkubace. Když afinita klesá, nominální IC^q stoupá. Pokles afinity se obecně přisuzuje nestabilitě sloučeniny v krysím séru.

Průmyslo vá _využi telnos t

Nové sloučeniny obecného vzorce I, které se mohou připravovat způsobem podle tohoto vynálezu, představují významnou skupinu léčiv, vhodných k aplikaci při mnoha onemocněních, resp. poruchách, jako jsou například rejekce transplantátů, proliferativní poruchy, záněty, infekční choroby a mnoho jiných.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Sloučenina obecného vzorce I ve kterém

R]_ je skupina alkylová, skupina alkenylová, skupina alkinylová, skupina hydroxyalkylová, skupina hydroxyalkenylová, skupina hydroxyalkinylová, skupina benzylová, skupina alkoxybenzylová nebo skupina chlorbenzylová,

Rg je vybrán bud z obecného vzorce II nebo z obecného vzorce III kde

Rj je vybrán ze souboru, který zahrnuje atom vodíku, skupinu alkylovou, skupinu alkenylovou, skupinu alkinylovou, skupinu arylovou, skupinu thioalkylovou, skupinu arylalkylovou, skupinu hydroxyarylalkylovou, skupinu hydroxyarylovou, skupinu hydroxyalkylovou, skupinu dihydroxyalkylovou, skupinu hydroxy

- 36 alkoxyalkylovou, skupinu hydroxyalkylarylalkylovou, skupinu dihydroxyalkylarylaikylovou, skupinu alkoxyalkylovou, skupinu alkylkarbonyloxyalkylovou, skupinu aminoalkylovou, skupinu alkylaminoalkylovou, skupinu alkoxykarbonylaminoalkylovou, skupinu alkylkarbonylaminoalkylovou, skupinu arylsulfonamidoalkylovou, skupinu allylovou, skupinu dihydroxyalkylallylovou, skupinu dioxolanylallylovou, skupinu karbalkoxyalkylovou a skupinu alkylsilylovou;

R4 značí atom vodíku, skupinu methylovou nebo s R^ tvoří alkylenový řetězec se 2 až 6 atomy uhlíku;

R^ značí seskupení RgO-CH2“, ve kterém Rg je vybrán ze souboru, který zahrnuje atom vodíku, skupinu alkylovou, skupinu alkenylovou, skupinu alkinylovou, skupinu arylovou, skupinu alkylkarbonylovou, skupinu arylkarbonylovou, skupinu heteroarylkarbonylovou, skupinu hydroxyalkylkarbonylovou, skupinu aminoalkylkarbonylovou, skupinu formylovou, skupinu thioalkylovou, skupinu arylalkylovou, skupinu hydroxyarylalkylovou, skupinu hydroxyarylovou, skupinu hydroxyalkylovou, skupinu dihydroxyalkylovou, skupinu hydroxyalkoxyalkylovou, skupinu hydroxyalkylarylalkylovou, skupinu dihydroxyalkylarylalkylovou, skupinu alkoxyalkylovou_r skupinu alkylkarbonyloxyalkylovou, skupinu aminoalkylovou, skupinu alkylaminoalkylovou, skupinu alkoxykarbonylaminoalkylovou, skupinu alkylkarbonylaminoalkylovou, skupinu arylsulfonamidoalkylovou, skupinu allylovou, skupinu dihydroxyalkylallylovou, skupinu dioxolanylallylovou a skupinu karbalkoxyalkylovou; seskupení R?CO-, ve kterém Ry je vybrán ze souboru, který zahrnuje atom vodíku, skupinu alkylovou, skupinu hydroxylovou, skupinu alkoxylovou, skupinu aryloxylovou, skupinu aminovou, skupinu alkylaminovou, zbytek aminokyseliny nebo N,N-disubstituovanou aminoskupinu, ve které substituenty jsou /a/ vybrány ze souboru, který zahrnuje skupinu alkylovou, skupinu arylovou nebo skupinu arylalkylovou, nebo /b/ tvoří heterocyklickou strukturu; seskupení RgNCH-, ve kterém Rg je skupina alkylová, skupina arylová, skupina aminová, skupina alkylaminová, skupina arylaminová, skupina hydroxylová, skupina alkoxylová nebo skupina arylsulfonylaminová; seskupení -O-CH-O-; nebo substituovanou skupinu dioxy··. ···«

- 37 methylynovou;

Y je vybráno ze souboru, který zahrnuje atom kyslíku, seskupení /atom vodíku, hydroxylová skupina/ a seskupení /atom vodíku, skupina ORg/, ve které Rg je vybrán ze souboru, který zahrnuje skupinu alkylovou s 1 až 4 atomy uhlíku, skupinu alkylkarbonylovou, skupinu arylkarbonylovou, skupinu heteroarylkarbonylovou, skupinu hydroxyalkylkarbonylovou, skupinu aminoalkylkarbonylovou, skupinu formylovou nebo skupinu arylovou; a značí hydroxylovou skupinu nebo atom vodíku;

přičemž a.lk nebo alkyl'' se týká alifatického substituentfc s 1 až 10 atomy uhlíku, popřípadě přerušeného kyslíkovou vazbou; a ' ’ ' nebo ' 'aryl se týká mono cyklického, popřípadě heterocyklického, popřípadě substituovaného aromatického substituenty se 4 až 14 atomy uhlíku, s tou podmínkou, že když X je skupina hydroxylová, R-^ značí alkylovou skupinu a Rg je zbytek obecného vzorce II, pak R^ je jiný než. atom vodíku. ..
2. Sloučenina obecného vzorce Ia /Ia/, ve kterém

Rjl skupinu alk-2-inylovou se 3 až 10 atomy uhlíku nebo skupinu hydroxyalk-2-inylovou se 3 až 10 atomy uhlíku,

Rg je zbytek obecného vzorce II nebo III, definovaný v nároku 1 a Y značí atom kyslíku.
3. Sloučenina obecného vzorce lb ♦ · ···· ·· ···· /lb/ ve kterém

R^ značí skupinu alkylovou s 1 až 10 atomy uhlíku, skupinu alkenylovou se 3 až 10 atomy uhlíku, skupinu hydroxyalkenylovou se 3 až 10 atomy uhlíku, skupinu alk-2-inylovou se 3 až 10 atomy uhlíku,-skupinu hydroxyalk-2-inylovou se 3 až 10 atomy uhlíku nebo skupinu-alkoxyalkylovou s. l až 10 atomy uhlíku v alkoxylové části a s 1 až 10 atomy uhlíku v alkylová části, J^e zbytek obecného vzorce II nebo III, definovaný v nároku 1 a Y značí atom kyslíku.
4. Sloučenina, kterou je 16-pent-2-inyloxy-32/S/-dihydrorapamycin nebo 16-pent-2-inyloxy-32/S/-dihydro-40-0-/2-hydroxyethyl/-rapamycin.
5. Sloučenina, kterou je 32-desoxorapamycin nebo 16-pent-2-inyl- _,₌. oxy-52-desoxorapamycin. — —— ___=. —-
6. Způsob přípravy sloučeniny obecného vzorce I podle nároku 1, vyznačující se tím , že se a/ připravuje sloučenina obecného vzorce I, ve kterém X značí atom vodíku, redukční eliminací karbonylové skupiny v poloze 32 u sloučeniny obecného vzorce IVa • · ··♦· • · · /IVa/, ve kterém R^, Rg a Y mají význam definovaný výše, v chráněné nebo nechráněné formě, a pokud je to žádoucí, odstraněním přítomných chránících skupin; nebo že se b/ připravuje sloučenina obecného vzorce I, ve kterém X značí hydroxylovou skupinu, stereoselektivní redukcí karbonylové skupiny v poloze 32 u sloučeniny obecného vzorce IVa defino- . váné vý še, nebo že se c/ konvertuje sloučenina obecného vzorce I, ve kterém R^ značí ₌ __ alkylovou skupinu, tak, aby se zí skala sloučenina obecného vzorce I, ve kterém R^ je jiný než alkylová skupina.
7. Sloučenina podle některého z nároků 1 až 5 k použití jako léčivo.
8. Farmaceutická kompozice vyznačující se tím, že obsahuje sloučeninu podle některého z nároků 1 až 5, v kombinaci s farmaceuticky přijatelným zřeČLovadlem nebo nosičem.

·♦ ····
9. Výbava nebo balení k použití při imunosupresi, zánětu nebo infekcích, obsahující farmaceutickou kompozici, která sestává ze sloučeniny podle některého z nároků 1 až 5 a z farmaceutické kompozice, která sestává z imunosupresi vního nebo imunomodulačního léčiva nebo z protizánětlivě nebo protiinfekčně účinné látky.

vedoucí k vnitřníkterý takové léčeí m , že se subněkterého z nároků
10. Způsob prevence nebo léčení akutní nebo chronické rejekce transplantovaného orgánu nebo tkáně, transplantační vaskulopatie, proliferace buněk hladkého svalstva a migrace mu zesilování cév nebo k nádorům, u subjektu, ní potřebuje, vyznačující se t jektu podává účinné množství sloučeniny podle