DE69624921T2

DE69624921T2 - Rapamycinderivate

Info

Publication number: DE69624921T2
Application number: DE69624921T
Authority: DE
Inventors: Sylvain Cottens; Richard Sedrani
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1995-06-09
Filing date: 1996-06-05
Publication date: 2003-09-11
Anticipated expiration: 2016-06-06
Also published as: RU2158267C2; ATE228135T1; CA2219659C; WO1996041807A1; CZ292233B6; KR100400620B1; AR003426A1; CN1124276C; PE4598A1; EP0833828B1; SK168297A3; SK284529B6; EP0833828A1; NO975432D0; DK0833828T3; FI113051B; AU6300696A; MY145291A; KR19990022780A; JP3226545B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Rapamycinderivate, ein Verfahren zu ihrer Herstellung, ihre Verwendung als Pharmazeutikum und pharmazeutische Zusammensetzungen, die sie enthalten.
Rapamycin ist ein bekanntes Makrolidantibiotikum, das von Streptomyces hygroscopicus gebildet wird und die folgende in Formel A gezeigte Struktur aufweist
Siehe beispielsweise J. B. McAlpine, J. Antibiotics (1991) 44: 688, S. L. Schreiber et al., J. Am. Chem. Soc. (1991) 113: 7433 und US 3 929 992 A. (Es existierten verschiedene Nummerierungsschemata, die für Rapamycin vorgeschlagen wurden. Um eine Verwirrung zu vermeiden, wenn hierin spezifische Rapamycinderivate benannt werden, werden die Bezeichnungen in Bezug auf Rapamycin mittels des Nummerierungschemas von Formel A angegeben.) Rapamycin ist ein starkes Immunsuppressivum und es wurde auch gezeigt, daß es Antitumor- und Antipilzaktivität aufweist. Seine Brauchbarkeit als Pharmazeutikum ist jedoch durch seine sehr niedrige und variable Bioverfügbarkeit beschränkt. Darüberhinaus ist Rapamycin unlöslich und ihm fehlt Stabilität, was die Formulierung von stabilen galenischen Zusammensetzungen erschwert.
Es sind viele Rapamycinderivate bekannt. Bestimmte 40-O-substituierte Rapamycine sind beispielsweise beschrieben in US 5 258 389 A und WO 94/09010 (O-Arylrapamycine), WO 92/05179 A (Carbonsäureester), US 5 118 677 A (Amidester), US 5 118 678 A (Carbamate), US 5 100 883 A (fluorierte Ester), US 5 151 413 A (Acetale) und US 5 120 842 A (Silylether).
Es wurde nun überraschenderweise festgestellt, daß bestimmte neue Rapamycinderivate ein verbessertes pharmakologisches Profil gegenüber Rapamycin aufweisen und eine größere Stabilität zeigen.
Gemäß der Erfindung wird eine Verbindung der Formel I bereitgestellt
worin
R&sub1; für Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Hydroxyalkyl, Hydroxylalkenyl, Hydroxyalkinyl, Benzyl, Alkoxybenzyl oder Chlorbenzyl steht,
R&sub2; ausgewählt ist aus Formel II oder Formel III
worin
R&sub3; ausgewählt ist aus H, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Arylalkyl, Hydroxyarylalkyl, Hydroxyaryl, Hydroxyalkyl, Dihydroxyalkyl, Hydroxyalkoxyalkyl, Hydroxyalkylarylalkyl, Dihydroxyalkylarylalkyl, Alkoxyalkyl, Alkylcarbonyloxyalkyl, Aminoalkyl, Alkylaminoalkyl, Alkoxycarbonylaminoalkyl, Alkylcarbonylaminoalkyl, Arylsulfonamidoalkyl, Allyl, Dihydroxyalkylallyl, Dioxolanylallyl, Carbalkoxyalkyl und Alkylsilyl,
R&sub4; für H oder Methyl steht oder zusammen mit R&sub3; C&sub2;-C&sub6; Alkylen bildet,
R&sub5; steht für R&sub6;O-CH&sub2;-, worin 1% ausgewählt ist aus H, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Alkylcarbonyl, Arylcarbonyl, Heteroarylcarbonyl, Hydroxyalkylcarbonyl, Aminoalkylcarbonyl, Formyl, Arylalkyl, Hydroxyarylalkyl, Hydroxyaryl, Hydroxyalkyl, Dihydroxyalkyl, Hydroxyalkoxyalkyl, Hydroxyalkylarylalkyl, Dihydroxyalkylarylalkyl, Alkoxyalkyl, Alkylcarbonyloxyalkyl, Aminoalkyl, Alkylaminoalkyl, Alkoxycarbonylaminoalkyl, Alkylcarbonylaminoalkyl, Arylsulfonamidoalkyl, Allyl, Dihydroxyalkylallyl, Dioxolanylallyl und Carbalkoxyalkyl, R&sub7;CO-, worin R&sub7; ausgewählt ist aus H, Alkyl, Hydroxy, Alkoxy, Aryloxy, Amino, Alkylamino oder N,N-disubstituiertem Amino, worin die Substituenten ausgewählt sind aus Alkyl, Aryl, Arylalkyl, R&sub8;NCH-, worin R&sub8; für Alkyl, Aryl, Amino, Alkylamino, Arylamino, Hydroxy, Alkoxy oder Arylsulfonylamino, -O-CH-O- oder substituiertes Dioxymethylin steht,
Y ausgewählt ist aus O und (H, OH)
X für OH oder H steht,
worin "Alk" oder "Alkyl" für einen aliphatischen C&sub1;-C&sub1;&sub0; Substituenten steht, der wahlweise durch eine Sauerstoffbindung unterbrochen ist und "Ar" oder "Aryl" für Phenyl, Benzyl, Tolyl und Pyridyl steht,
mit der Maßgabe, daß wenn X für OH steht, R&sub1; für Alkyl steht und R&sub2; für einen Rest der Formel II steht, R&sub3; dann nicht für H steht.
Jeder oben erwähnte "Alk" oder "Alkyl" Rest kann verzweigt, linear oder cyclisch sein, vorzugsweise ist es ein aliphatischer C&sub1;-C&sub6; Substituent, der wahlweise durch eine Sauerstoffbindung unterbrochen ist, bevorzugter aber nicht durch Sauerstoff unterbrochen ist.
Wenn R&sub1; für Chlorbenzyl oder Alkoxybenzyl steht ist der Substituent vorzugsweise in ortho.
Wenn R&sub5; für substituiertes Dioxymethylin steht kann dies beispielsweise O,O-Alkylendioxymethylin sein, worin nämlich die 2 Sauerstoffe durch eine Alkylengruppe verbunden sind.
In den Verbindungen der Formel I sind die folgenden Bedeutungen entweder einzeln oder in jeder Kombination oder Unterkombination bevorzugt:
1. X steht für OH und R&sub1; steht C&sub3;-C&sub1;&sub0; Alkinyl oder C&sub3;-C&sub1;&sub0; Hydroxyalkinyl, vorzugsweise C&sub3;-C&sub1;&sub0; Alk-2-inyl oder C&sub3;- C&sub1;&sub0; Hydroxyalk-2-inyl, bevorzugter C&sub3;-C&sub6; Alk-2-inyl.
2. X steht für H und R&sub1; steht für C&sub1;-C&sub1;&sub0; Alkyl, C&sub3;-C&sub1;&sub0; Alk-2-enyl, C&sub3;-C&sub1;&sub0; Hydroxyalk-2-enyl, C&sub3;-C&sub1;&sub0; Alk-2-inyl, C&sub3;- C&sub1;&sub0; Hydroxyalk-2-inyl oder C&sub1;-C&sub1;&sub0; Alkoxy-C&sub1;-C&sub1;&sub0;-alkyl, vorzugsweise C&sub1;-C&sub6; Alkyl oder C&sub3;-C&sub6; Alk-2-inyl, bevorzugter C&sub1;-C&sub4; Alkyl, am bevorzugtesten Methyl.
3. C&sub3;-C&sub6; Alkinyl steht als R&sub1; für 2-Propinyl oder Pent-2-inyl, vorzugsweise Pent-2-inyl.
4. Y steht für O oder (H, OH), vorzugsweise O.
5. R&sub2; steht für einen Rest der Formel II.
6. Im Rest der Formel II steht R&sub3; für H, C&sub1;-C&sub6; Hydroxyalkyl, Hydroxy-C&sub1;-C&sub6;-alkoxy-C&sub1;-C&sub6;-alkyl, C&sub1;-C&sub6; Alkylcarbonylamino-C&sub1;-C&sub6;-alkyl, C&sub1;-C&sub6; Alkoxy-C&sub1;-C&sub6;-alkoxy oder Amino-C&sub1;-C&sub6;-alkyl, vorzugsweise H, Hydroxyethyl, Hydroxypropyl, Hydroxyethoxyethyl, Methoxyethyl oder Acetylaminoethyl, speziell H, wenn X für H steht oder wenn X für OH steht und R&sub1; für Alkinyl steht.
7. Im Rest der Formel II steht R&sub4; für Methyl.
8. R&sub2; steht für einen Rest der Formel III, worin R&sub5; für R&sub6;OCH&sub2;- steht, worin R&sub6; ausgewählt ist aus H, C&sub1;-C&sub6; Alkyl, C&sub3;-C&sub6; Alk-2-enyl, C&sub3;-C&sub6; Alk-2-inyl, Aryl-C&sub1;-C&sub6;-alkylcarbonyl, Arylcarbonyl, Hydroxy-C&sub1;-C&sub6;-alkyl, C&sub1;-C&sub6; Alkoxy- C&sub1;-C&sub6;-alkyl oder Amino-C&sub1;-C&sub6;-alkyl, R&sub7;CO-, worin R&sub7; ausgewählt ist aus H, Hydroxy, C&sub1;-C&sub6; Alkoxy, Amino, C&sub1;-C&sub6; Alkylamino oder N,N-disubstituiertes Amino, worin die Substituenten ausgewählt sind aus C&sub1;-C&sub6; Alkyl oder Aryl, R&sub8;NCH-, worin R&sub8; für Alkyl, Aryl, Amino, Alkylamino, Arylamino, Hydroxy, Alkoxy oder Arylsulfonylamino steht, -O-CH-O oder substituiertes Dioxymethylin.
Bevorzugte Verbindungen sind Verbindungen der Formel Ia
worin
R&sub1;, R&sub2; und Y wie oben definiert sind und vorzugsweise eine der oben unter 1. und 3. bis 8. angegebene Bedeutung haben, und
der Formel Ib
worin
R&sub1;, R&sub2; und Y wie oben definiert sind und vorzugsweise eine der oben unter 2. bis 8. angegebene Bedeutung haben,
Besonders bevorzugte Verbindungen umfassen:
(i) 32-Desoxyrapamycin,
(ii) 16-O-Pent-2-inyl-32-desoxo-rapamycin,
(iii) 16-O-Pent-2-inyl-32-desoxo-40-O-(2-hydroxyethyl)-rapamycin
(iv) 16-O-Pent-2-inyl-32(S)-dihydro-rapamycin,
(v) 16-O-Pent-2-inyl-32(S)-dihydro-40-O-(2-hydroxyethyl)-rapamycin,
(vi) 32(S)-Dihydro-40-O-(2-methoxy)ethyl-rapamycin,
(vii) 32(S)-Dihydro-40-O-(2-hydroxyethyl)-rapamycin.
Die Verbindungen der Formel I können eine Isomerie aufweisen und demnach existieren isomere Formen. Es ist verständlich, daß die vorliegende Erfindung die Verbindungen der Formel I und die einzelnen Isomere der Formel I' umfaßt
worin R&sub1;, R&sub2; und Y und X wie oben definiert sind, wie auch die isomeren Gemische hiervon.
Die einzelnen Isomere können durch Analogie zu in der Technik bekannten Verfahren getrennt werden.
Die vorliegende Erfindung liefert auch ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel I, wobei das Verfahren umfaßt
a) zur Herstellung einer Verbindung der Formel I, worin X für H steht, reduktive Eliminierung des Carbonyls in Position 32 einer Verbindung der Formel IVa
worin R&sub1;, R&sub2; und Y wie oben definiert sind, in geschützter oder ungeschützter Form,
und erforderlichenfalls Entfernung der vorhandenen Schutzgruppen, oder
b) zur Herstellung einer Verbindung der Formel I, worin X für OH steht, stereoselektive Reduktion des Carbonyls in Position 32 einer Verbindung der Formel IVa, wie dies oben definiert ist, oder
c) Umwandlung einer Verbindung der Formel I, worin R&sub1; für Alkyl steht, unter Bildung einer Verbindung der Formel I, worin R&sub1; nicht für Alkyl steht.
In Verfahren a) liegt die Verbindung der Formel IVa vorzugsweise in geschützter Form vor, das heißt sie kann Schutzgruppen an funktionellen Gruppen enthalten, die nicht an der Reaktion teilnehmen, beispielsweise OH in Position 28 und wahlweise in Position 40, wenn R&sub2; für einen Rest der Formel II steht, oder in Position 39, wenn R&sub2; für einen Rest der Formel III steht.
Die Reduktion a) zur 32-Desoxoverbindung der Formel I kann bequem in 2 Schritten ausgeführt werden:
i) durch Umsetzung einer Verbindung der Formel IVa, vorzugsweise in geschützter Form, mit einem Hydrid, beispielsweise Diisobutylaluminiumhydrid oder vorzugsweise Lithium-tri-tert-butoxyalumiiumhydrid, unter Bildung einer entsprechenden 32-Dihydroverbindung. Andere Verfahren und Reagenzien, wie sie in der Technik zur Reduktion von Ketonen verwendet werden, können zur Herstellung der 32-Dihydroverbindung aus dem entsprechenden Keton verwendet werden. Sie umfassen beispielsweise Hydrierung, Reduktion durch Metalle, Metallhydridreduktion, wie dies beschrieben ist in Comprehensive Organic Transformations, R. C. Larock, VCH Publishers Inc., New York, 1989, Seiten 527-535, Abschnitt 7.1.1-7.1.4 und asymmetrische Reduktionsmethoden für Ketone, wie dies beispielsweise beschrieben ist in Comprehensive Organic Transformations, R. C. Larock, VCH Publishers Inc., New York, 1989, Seiten 540-547, Abschnitt 7.1.15. Dem Reduktionsschritt i) folgt dann
ii) Umwandlung der 32-Dihydroverbindung in das entsprechende 32-Halogenderivat, beispielsweise 32-Brom- oder (vorzugsweise) 32-Iodderivat, das dann beispielsweise durch ein Hydrid in das gewünschte 32-Desoxoderivat reduziert wird und erforderlichenfalls Abspaltung der Schutzgruppen von der entstehenden Verbindung. Weitere Reagenzien, wie sie zur Reduktion der Halogenide verwendet werden, können verwendet werden und umfassen beispielsweise niedrigvalente Metalle (das heißt Lithium, Natrium, Magnesium und Zink) und Metallhydride (Aluminiumhydride, Borhydride, Silane, Kupferhydride) (siehe Comprehensive Organic Transformations, R. C. Larock, VCH Publishers Inc., New York, 1989, Seiten 18-20, Abschnitt 1.5.1 und 1.5.2.).
Alternativ dazu kann die Halogenidreduktion durch die Verwendung von Wasserstoff oder einer Wasserstoffquelle (das heißt Ameisensäure oder einem Salz hiervon) in Gegenwart eines geeigneten Metallkatalysators (das heißt Raney Nickel, Palladiummetall oder Palladiumkomplexe, Komplexe aus Rhodium oder Ruthenium) erreicht werden (siehe Comprehensive Organic Transformations, R. C. Larock, VCH Publishers Inc. New York, 1989, Seiten 20-24, Abschnitt 1.5.3.). Darüberhinaus können auch bekannte Verfahren verwendet werden, die zur Transformation eines Alkohols in die entsprechende Desoxyverbindung verwendet werden. Diese Verfahren umfassen beispielsweise die direkte Reduktion oder die Reduktion einer Zwischenphosphorverbindung, eines Sulfonats, Thiocarbonats, Thiocarbamats oder Xanthats und werden beispielsweise beschrieben in Comprehensive Organic Transformations, R. C. Larock, VCH Publishers Inc., New York, 1989, Seiten 27-31, Abschnitt 1.9.1-1.9.4.
Geeignete Hydroxyschutzgruppen und Verfahren zu ihrer Bildung und Entfernung sind in der Technik bekannt, siehe beispielsweise Protective Groups in Organic Synthesis, zweite Ausgabe, T. W. Greene und P. G. M. Wuts, John Wiley & Sons, New York, 1991, Abschnitt 2 und hierin beschriebene Literaturangaben. Bevorzugte OH- Schutzgruppen sind beispielsweise Triorganosilylgruppen, wie Tri-C&sub1;-C&sub6;-alkylsilyl (beispielsweise Trimethylsilyl, Triethylsilyl), Triisopropylsilyl, Isopropyldimethylsilyl, t-Butyldimethylsilyl, Triarylsilyl (beispielsweise Triphenylsilyl) oder Triarylsilyl (beispielsweise Tribenzylsilyl). Die Schutzgruppenabspaltung kann unter milden, sauren Bedingungen ausgeführt werden.
Der Reduktionsschritt i) kann bequemerweise bei niedriger Temperatur ausgeführt werden, beispielsweise von -10ºC bis -80ºC.
In Schritt ii) wird die 32-Dihydroverbindung, wahlweise in geschützer Form, vorzugsweise das 32(R)- Diastereomer, in einen Ester, vorzugsweise ein Sulfonat, beispielsweise Mesylat, Tosylat, Nosylat oder Triflat gefolgt von einer Verdrängung mit einem geeigneten Halogenid, beispielsweise Natriumiodid oder Natriumbromid, Tetrabutylammoniumiodid oder -bromid, vorzugsweise in Gegenwart einer Base, wie eines Amins, umgewandelt. Das 32(R)-Diastereomer kann gemäß bekannter Trenntechniken, beispielsweise Chromatographie, aus dem Gemisch abgetrennt werden.
Geeignete Hydride zur Reduktion der 32-Halogenverbindung umfassen beispielsweise radikalische Hydride, wie Tributylzinnhydrid oder Tristrimethylsilylsilan. Die Reduktion kann auch in Abwesenheit oder Anwesenheit eines Radikalstarters, beispielsweise 2,2'-Azobisisobutyronitril oder vorzugsweise Et&sub3;B, bequemerweise bei einer Temperatur von 0ºC bis 80ºC ausgeführt werden.
Es kann ein Oxidationsmittel, wie Kupferacetat, bequemerweise nach dem Reduktionsschritt i) oder ii) erforderlichenfalls zugegeben werden, um eine unerwünschte Nebenreduktion selektiv zum Carbonyl zurückzuoxidieren, die beispielsweise in Position 9 auftreten kann.
Alternativ dazu kann das 32-Dihydroderivat direkt durch in der Technik bekannte Verfahren in ein Halogenid umgewandelt werden, wobei beispielsweise Triphenylphosphin in Kombination mit N-Brom- oder N- Iodsuccinimid, Tetrabromkohlenstoff oder Tetraiodkohlenstoff, 1,2-Dibromtetrachlorethan, 2,4,5-Tribrom- oder - triiodimidazol, Iod, 1,2-Diodethan oder mittels Thionylbromid oder Methyltriphenoxyphosphoniumiodid verwendet wird.
Die Reduktion des Carbonyls in Position 32 zum 32-Desoxoderivat kann auch durch die Bildung eines Tosylhydrazons gefolgt von einer Behandlung mit einem Boran ausgeführt werden, wie beispielsweise Catecholboran oder durch die Bildung eines Dithians gefolgt von einer geeigneten Reduktion, beispielsweise mit Raney Nickel oder einem Hydrid, beispielsweise Tributylzinn. Es können andere bekannte Verfahren zur Transformation eines Ketons in das entsprechende Alkan verwendet werden, wobei die Verführen beispielsweise die direkte Reduktion (siehe Comprehensive Organic Transformations, R. C. Larock, VCH Publishers Inc., New York, 1989, Seiten 35-37, Abschnitt 1.12.1.) oder die Reduktion über Hydrazone (Comprehensive Organic Transformations, R. C. Larock, VCH Publishers, Inc., New York, 1989, Seiten 37-38, Abschnitt 1.12.2.) und über Schwefel- und Selenderivate (Comprehensive Organic Transformations, R. C. Larock, VCH Publishers, Inc., New York, 1989, Seiten 34-35, Abschnitte 1.10. und 1.11.) umfassen.
Der Reduktionsschritt b) zur 32(S)-Dihydroverbindung der Formel I wird unter ausgewählten Bedingungen ausgeführt. Vorzugsweise wird ein Reduktionsmittel verwendet, das die Reduktion zu 32(S) signifikant bevorzugt, beispielsweise Natriumtriethylborhydrid. Die Reduktion kann bequemerweise bei einer niedrigen Temperatur ausgeführt werden, beispielsweise von -50ºC bis -80ºC in einem inerten Lösemittel, beispielsweise THF, Diethylether, Glyme, Diglyme oder Methyl-t-butylether. Die Abtrennung der 32(S)-Dihydroverbindung von den geringen Mengen an gebildeter 32(R)-Dihydroverbindung kann durch Verfahren ausgeführt werden, die in der Technik bekannt sind, beispielsweise Säulenchromatographie oder Umkehrphasenchromatographie.
Erforderlichenfalls können die Hydroxygruppen in Position 28 und wahlweise in Position 40 vor der Reduktion geschützt und anschließend von den Schutzgruppen befreit werden, wie dies beispielsweise oben beschrieben ist. Vorzugsweise wird der Reduktionsschritt b) ohne OH-Schutz ausgeführt.
Der Umwandlungsschritt c) kann gemäß in der Technik bekannter Verfahren ausgeführt werden. Beispielsweise kann eine Verbindung der Formel I, worin R&sub1; für Alkyl, vorzugsweise Methyl steht, mit einer Verbindung Rx-OH umgesetzt werden, worin Rx für Alkinyl oder Hydroxyalkinyl steht, um eine Verbindung der Formel I bereitzustellen, worin R&sub1; für Alkinyl oder Hydroxyalkinyl steht. Die Umsetzung kann bequemerweise in einem aprotischen Lösemittel ausgeführt werden, wie beispielsweise Dichlormethan, Toluol, Acetonitril oder THF unter sauren Bedingungen.
Vorzugsweise wird die Reduktion in Position 32, insbesondere der Reduktionsschritt b) mit einer Verbindung der Formel IVa ausgeführt, worin R&sub1; bereits die gewünschte Bedeutung hat, wobei R&sub1; beispielsweise für Alkinyl steht, und man so eine spätere Umwandlung nach der Reduktion vermeidet. Eine Verbindung der Formel IVa, worin R&sub1; für Alkinyl oder Hydroxyalkinyl steht, die als Ausgangsmaterial verwendet wird, kann mittels einer Verbindung Rx-OH hergestellt werden, wie dies oben beschrieben ist.
Verbindungen, die als Ausgangsmaterialien verwendet werden, können analog zu Verfahren hergestellt werden, die in der Technik bekannt sind und ausgeführt werden, wie dies beispielsweise beschrieben ist in US 5 258 389 A, WO 94/09010 A, WO 95/16691 A, US 5 120 842 A usw.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Alle Temperaturen sind in ºC angegeben. Es werden die folgenden Abkürzungen verwendet:
THF = Tetrahydrofuran
TES = Triethylsilyl

Beispiel 1: 32-Desoxorapamycin (R&sub1; = CH&sub3;, R&sub2; = II, worin R&sub3; = H und R&sub4; = CH&sub3;, X = H, Y = O)

Zu einer gerührten, gekühlten (-78ºC) Lösung aus 26,1 g (22,85 mmol 28,40-Bis-O-TES-Rapamycin in 260 ml THF werden 50,3 ml (50,3 mmol) einer 1 M Lösung aus Lithium-tri-t-butoxyaluminiumhydrid in THF gegeben. Das entstehende Gemisch kann sich dann über 2 Stunden auf -15ºC erwärmen. Das Kühlbad wird dann durch ein Eisbad ersetzt, wobei die Temperatur auf 0ºC gebracht wird und das Rühren wird für 1 Stunde bei dieser Temperatur fortgesetzt. Dieses Reaktionsgemisch wird in einen Trenntrichter gegossen, der 750 ml Ethylacetat und 400 ml eiskalte 2 N wäßrige Citronensäure enthält und wird kurz geschüttelt. Die wäßrige Phase wird abgetrennt und zweimal mit kaltem Ethylacetat extrahiert. Die vereinigte organische Lösung wird mit eiskalter wäßriger 2 N Citronensäure, Wasser, gesättigtem Natriumbicarbonat und zweimal mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, dann über wasserfreiem Natriumcarbonat getrocknet, filtriert und unter verringertem Druck konzentriert. Der Rückstand, der aus einem Gemisch aus 32(R)-Dihydro-28,40-bis-O-TES-rapamycin und 32(R)-9,32-Bis-dihydro-28,40-bis-O-TES- rapamycin besteht, wird ohne weitere Reinigung in 260 ml Methanol gelöst. Diese Lösung wird auf 0ºC abgekühlt und mit 6,85 g (34,31 mmol) Kupferacetat behandelt. Nach dem Rühren für 1 Stunde wird die entstehende Suspension mit Methyl-t-butylether verdünnt und zweimal mit Wasser und zweimal mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Die wäßrigen Phasen werden mit Methyl-t-butylether rückextrahiert. Die vereinigte organische Lösung wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und unter verringertem Druck konzentriert. Der Rückstand wird durch Silicagelchromatographie (60 : 40 Hexan/Methyl-t-butylether) unter Bildung von reinem 32(R)-Dihydro- 28,40-bis-O-TES-rapamycin als weißer Feststoff gereinigt.
¹H NMR (CDCl&sub3;) 4 : 1 Gemisch aus Rotameren, die chemischen Verschiebungen in Klammern beziehen sich auf die untergeordneten Rotamere: δ 0,72 (1H, dd, H-38ax), 1,63 (1,60) (3H, s, C17-CH&sub3;), 1,66 (1,69) (3H, s, C29-CH&sub3;), 1,77 und 1,81 (H-33), 2,46 (1H, m, H-31), 2,82 (2,91) (1H, m, H-25), 2,91 (1H, m, H-39), 3,13 (3H, s, C16-OCH&sub3;), 3,26 (3H, s, C27-OCH&sub3;), 3,41 (1H, m, H-40), 3,43 (3H, s, C39-OCH&sub3;), 3,62 (1H, m, H-32), 3,75 (3,57) (1H, d, H- 27), 4,10 (1H, d, H-28), 4,81 (1H, breites s, C10-OH), 5,05 (1H, d, H-34), 5,27 (1H, d, H-30), 5,36 (1H, d, H-2), 5,69 (1H, dd, H-22), 6,03 (5,96) (1H, d, H-18), 6,15 (1H, dd, H-21), 6,33 (1H, dd, H-20), 6,40 (1H, dd, H-19).
MS (FAB, LiI Matrix) m/z 1150 ([M + Li]&spplus; (rel. Intensität 100).
Zu einer gerührten, gekühlten (-15ºC) Lösung aus 20,69 g (18,10 mmol) aus 32(R)-Dihydro-28,40-bis-O- TES-rapamycin und 7,55 ml (54,27 mmol) Triethylamin in 200 ml Methylenchlorid werden 2,10 ml (27,02 mmol) Methansulfonylchlorid gegeben. Das Gemisch wird für 20 Minuten gerührt, dann mit Ethylacetat verdünnt und es wird gesättigtes, wäßriges Natriumbicarbonat zugegeben. Die Phasen werden getrennt und die wäßrige Phjase wird dreimal mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigte organische Phase wird mit gesättigtem, wäßrigem Natriumbicarbonat und Kochsalzlösung gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und unter verringertem Druck konzentriert. Der Rückstand kann durch Säulenchromatographie auf Silicagel (80 : 20 Hexan/Ethylacetat) unter Bildung von reinem 32(R)-Dihydro-32-O-mesyl-28,40-bis-O-TES-rapamycin als weißer Feststoff gereinigt werden, aber routinemäßig wird das Rohprodukt im anschließenden Schritt ohne weitere Reinigung verwendet.
¹H NMR (CDCl&sub3;) δ 0,77 (1H, dd, H-38ax), 1,67 (3H, s, C17-CH&sub3;), 1,72 (3H, s, C29-CH&sub3;), 2,77 (1H, M, H-25), 2,92 (1H, m, H-39), 3,03 (3H, s, C16-OCH&sub3;), 3,17 (3H, s, C27-OCH&sub3;), 3,21 (3H, s, C39-OCH&sub3;), 3,42 (1H, m, H-40), 3,45 (3H, s, CH&sub3;SO&sub3;), 3,91 (1H, d, H-27), 4,10 (1H, d, H-28), 4,72 (1H, m, H-32), 4,94 (1H, s, C10-OH), 5,12 (1H, m, H-34), 5,25 (1H, d, H-30), 5,43 (1H, d, H-2), 5,88 (1H, dd, H-22), 6,03 (1H, d, H-18), 6,18 (1H, dd, H-21), 6,37 (1H, dd, H-20), 6,44 (1H, dd, H-19)
MS (FAB, LiI Matrix) m/z 1228 ([M + Li]&spplus; (rel. Intensität 68), 1132 ([M - CH&sub3;SO&sub3;H) + Li]&spplus;) (rel. Intensität 100).
Ein Gemisch aus 22,35 g (18,30 mmol) 32(R)-Dihydro-32-O-mesyl-28,40-bis-O-TES-rapamycin, 27,50 g (183,33 mmol) Natriumiodid und 6,3 ml (36,68 mmol) Diisopropylethylamin in 400 ml THF wird für 6 Stunden auf Rückfluß erhitzt und kann sich dann auf Raumtemperatur abkühlen. Das entstehende Gemisch wird mit Ethylacetat verdünnt und mit 38,4% wäßrigem Natriumbisulfit behandelt. Die Phasen werden getrennt. Die organische Phase wird dann dreimal mit gesättigtem, wäßrigem Natriumbicarbonat und einmal mit gesätztigter Kochsalzlösung gewaschen, dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und unter verringertem Druck konzentriert. Der Rückstand wird durch Säulenchromatographie auf Silicagel (83 : 17 Hexan/Ethylacetat) unter Bildung von reinem 32(S)-Desoxo-32-iod-28,40-bis-O-TES-rapamycin gereinigt.
¹H NMR (CDCl&sub3;) 1,5 : 1 Gemisch aus Rotameren, chemische Verschiebungen in Klammen beziehen sich auf das untergeordnete Rotamer: δ 0,73 (1H, dd, H-38ax), 1,68 (1,66) (6H, s, C17-CH&sub3; und C29-CH&sub3;), 2,72 (1H, m, H-25), 2,91 (2H, m, H-32 und H-39), 3,15 (3H, s, C16-OCH&sub3;), 3,30 (3,31) (3H, s, C27-OCH&sub3;), 3,43 (3,41) (3H, s, C39- OCH&sub3;), 3,77 (3,91) (1H, d, H-27), 4,21 (4,25) (1H, d, H-28), 4,51 (1H, s, C10-OH), 5,45 (5,48) (1H, d, H-30), 5,60 (5,79) (1H, dd, H-22), 6,02 (5,85) (1H, d, H-18)
MS (FAB, LiI Matrix) m/z 1260 ([M + Li]&spplus;) (rel. Intensität 100)
Zu einer gerührten, gekühlten (0ºC) Lösung aus 16,79 g (13,19 mmol) 32(5)-Desoxy-32-iod-28,40-bis-O- TES-rapamycin in 190 ml Toluol werden 7 ml (26,38 mmol) Tributylzinnhydrid gefolgt von 1,3 ml (1,30 mmol) einer 1 M Lösung aus Triethylboran in Hexan gegeben. Dieses Gemisch wird für 30 Minuten gerührt und mit gesättigtem, wäßrigem Ammoniumchlorid gestoppt. Die Phasen werden getrennt und die wäßrige Phase wird zweimal mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit Wasser, gesättigtem, wäßrigem Natriumbicarbonat, Wasser und dreimal mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und unter verringertem Druck konzentriert. Der Rückstand wird durch Säulenchromatographie auf Silicagel (75 : 25 Hexan/Methyl-t-butylether) unter Bildung von reinem 32-Desoxo-28,40-bis-O-TES-rapamycin als weißer Feststoff gereinigt.
¹H NMR (CDCl&sub3;) 2,5 : 1 Gemisch der Rotameren, chemische Verschiebungen in Klammern beziehen sich auf das untergeordnete Rotamer, δ 0,73 (1H, dd, H-38ax), 1,62 (1,57) (3H, s, C17-CH&sub3;), 1,68 (1,72) (3H, s, C29-CH&sub3;), 2,77 (2,91) (1H, m, H-25), 2,91 (1H, m, H-39), 3,15 (3H, s, C16-OCH&sub3;), 3,27 (3,25) (3H, s, C27-OCH&sub3;), 3,43 (3,45) (3H, s, C39-OCH&sub3;), 3,70 (3,67) (1H, d, H-27), 4,11 (4,07) (1H, d, H-28), 4,57 (1H, breites s, C10-OH), 4,87 (4,67), (1H, d, H-34), 5,19 (5,08), (1H, d, H-30), 5,32 (1H, d, H-2), 5,60 (5,66) (1H, dd, H-22), 6,01 (5,92) (1H, d, H-18), 6,17 (1H, dd, H-21), 6,30 (1H, dd, H-20), 6,40 (1H, dd, H-19).
MS (FAB, LiI Matrix) m/z 1134 ([M + Li]&spplus;) (rel. Intensität 100).
Zu einer gerührten, gekühlten (-15ºC) Lösung aus 10,73 g (9,52 mmol) 32-Desoxo-28,40-bis-O-TES- rapamycin in 85 ml Methanol werden tropfenweise 9,5 ml 2 N wäßrige Schwefelsäure gegeben. Nachdem die Zugabe vollständig ist wird das Reaktionsgemisch auf 0ºC erwärmt und für 1,5 Stunden gerührt, dann mit Ethylacetat verdünnt und mit gesättigtem Natriumbicarbonat gestoppt. Die Phasen werden getrennt und die wäßrige Phase wird mit drei Portionen Ethylacetat extrahiert. Die vereinigte organische Phase wird dreimal mit gesättigtem Natriumbicarbonat und mit Kochsalzlösung gewaschen, dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und unter verringertem Druck konzentriert. Der Rückstand wird in Diethylether gelöst, wobei das gewünschte 32-Desoxorapamycin kristallisiert (farblose Kristalle).
¹H NMR (CDCl&sub3;) 3 : 1 Gemisch aus Rotameren, die chemischen Verschiebungen in Klammern beziehen sich auf das untergeordnete Rotamer, δ 0,70 (1H, dd, H-38ax), 1,14 und 1,32 (H-32), 1,56 (H-33), 1,65 (1,62) (3H, s C17-CH&sub3;), 1,68 (1,70) (3H, s, C29-CH&sub3;), 2,31 (2H, m, H-23 und H-31), 2,82 (2,95) (1H, m, H-25), 2,95 (1H, m, H-39), 3,14 (3H, s, C16-OCH&sub3;), 3,32 (3H, s, C27-OCH&sub3;), 3,38 (1H, m, H-40), 3,42 (3,41) (3H, s, C39-OCH&sub3;), 3,61 (1H, d, H- 27), 4,12 (1H, d, H-28), 4,80 (4,71) (1H, d, H-34), 5,22 (1H, d, H-30), 5,31 (1H, d, H-2), 5,56 (1H, dd, H-22), 5,95 (5,87) (1H, d, H-18), 6,16 (1H, dd, H-21), 6,36 (1H, dd, H-20), 6,41 (1H, dd, H-19).
MS (FAB, LiI Matrix) m/z 906 ([M + Li]&spplus;) (rel. Intensität 100).

Beispiel 2: 16-Pent-2-inyloxy-32(S)-dihydro-rapamycin (R&sub1; = Pent-2-inyl, R&sub2; = II, worin R&sub3; = H und R&sub4; = CH&sub3;, X = OH, Y = O)

Zu einer gerührten, gekühlten (0ºC) Lösung aus 970 mg (1,06 mmol) 32(S)-Dihydrorapamycin und 1,39 ml (15,00 mmol) 2-Pentin-1-ol in 20 ml Methylenchlorid werden 0,50 ml (6,50 mmol) Trifluoressigsäure gegeben. Das Gemisch wird dann bei 0ºC für 3 Stunden gerührt und mit gesättigtem, wäßrigem Natriumbicarbonat gestoppt. Die Phasen werden getrennt und die wäßrige Phase wird mit drei Portionen Ethylacetat extrahiert. Die vereinigte organische Lösung wird mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und unter verringertem Druck konzentriert. Das rohe Gemisch wird durch Säulenchromatographie auf Silicagel (20 : 80 Hexan - Ethylacetat) und dann durch Umkehrphasen HPLC (RP18, 81 : 19 Methanol - Wasser) unter Bildung der Titelverbindung als weißer, amorpher Feststoff gereinigt.
¹H NMR (CDCl&sub3;) 2,5 : 1 Gemisch der Rotameren, die chemischen Verschiebungen in Klammern beziehen sich auf das untergeordnete Rotamer, δ 0,71 (1H, dd, H-38 ax), 1,3 (1,05) (3H, t-CH&sub3;CH&sub2;CCCH&sub2;O), 1,67 (3H, s, 17-CH&sub3;), 1,69 (3H, s, 29-CH&sub3;), 2,21 (2H, qt, CH&sub3;CH&sub2;CCCH&sub2;O), 2,96 (1H, m, H-39), 3,33 (3,37) (3H, s, 27-OCH&sub3;), 3,41 (3,39) (3H, s, 39-OCH&sub3;), 3,78 (1H, dt, CH&sub3;CH&sub2;CCCHHO), 4,0 (1H, dt, CH&sub3;CH&sub2;CCCHHO), 5,52 (5,71) (1H, dd, H- 22), 5,98 (5,83) (1H, d, H-18), 6,15 (1H, m, H-21), 6,30 (1H, dd, H-20), 6,40 (1H, dd, H-19).
MS (FAB) m/z 974 ([M + Li]&spplus;).

Beispiel 3: 16-Pent-2-inyloxy-32(S)-dihydro-rapamycin (Alternativer Weg)

Rapamycin wird mit 2-Pentin-1-ol in einem Verfahren umgesetzt, das zu dem von Beispiel 2 analog ist, um 16-Pent-2-inyloxyrapamycin zu erhalten.
Zu einer gerührten, gekühlten (-77ºC) Lösung aus 17,5 g (18,1 mmol) 16-Demethoxy-16-pent-2-inyloxyrapamycin in 180 ml THF werden 21,7 ml (21,7 mmol) einer 1 M Lösung aus Natriumtriethylborhydrid in THF gegeben. Nach 1 h bei -77ºC wird die Reaktion gestoppt und mit einer wäßrigen 10% Citronensäurelösung neutralisiert. Das Reaktionsgemisch kann sich dann auf Raumtemperatur erwärmen und das meiste THF wird durch Eindampfen unter verringertem Druck entfernt. Die entstehende Lösung wird zweimal mit Ethylacetat extrahiert, die organischen Phasen werden vereinigt und über Natriumsulfat kombiniert. Nach dem Eindampfen des Lösemittels wird das rohe Reaktionsprodukt über Silicagel chromatographiert, wobei mit Hexan/Aceton 7/3 eluiert wird. Die schließliche Reinigung wird durch präparative HPLC (RP-18, 76 : 24 Methanol: Wasser) unter Bildung der Titelverbindung als weißer, amorpher Feststoff erreicht.
Die Spektraldaten sind zu denen des auf den anderen Weg erhaltenen Produkts identisch.

Beispiel 4: 32(S)-Dihydro-40-O-(2-methoxy)ethyl-rapamycin (R&sub1; = CH&sub3;, R&sub2; = II, worin R&sub3; = 2-Methoxyethyl und R&sub4; = CH&sub3;, X = OH, Y = O)

Zu einer gerührten, gekühlten (0ºC) Lösung aus 2,17 g (2,00 mmol) 40-O-(2-Methoxy)ethyl-28-O-TES- rapamycin in 20 ml THF werden tropfenweise 4,4 ml (4,4 mmol) einer 1 M Lösung an L-Selectrid® in THF gegeben. Die entstehende gelbe Lösung wird für 3 Stunden bei 0ºC gerührt und überschüssiges Hydridreagenz wird durch die Zugabe von 2 ml MeOH zerstört. Die Lösung wird mit Methyl-t-butylether verdünnt und es wird gesättigte, wäßrige Rochellesalzlösung zugegeben. Dieses Gemisch kann sich auf Raumtemperatur erwärmen und das Rühren wird für 15 Minuten fortgesetzt. Die Phasen werden getrennt und die organische Lösung wird mit kalter 1 N HCl, gesättigter Kochsalzlösung, 1 N Natriumbicarbonat und erneut mit Kochsalzlösung gewaschen. Die wäßrigen Waschlösungen werden mit Methyl-t-butylether rückextrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und unter verringertem Druck unter Bildung eines rohen Gemisches der 32S und 32R Isomere an 32-Dihydro-40-O-(2-methoxy)ethyl-28-O-TES-rapamycin konzentriert.
Das oben erhaltene Rohprodukt wird in 20 ml Acetonitril gelöst und auf 0ºC abgekühlt. Zur entstehenden Lösung werden 2 ml HF-Pyridinkomplex gegeben. Das Rühren wird für 1 Stunde fortgesetzt und 1 N Natriumbicarbonat wird zugegeben. Dieses Gemisch wird dreimal mit Methyl-t-butylether extrahiert. Die vereinigte organische Lösung wird mit 1 N Natriumbicarbonat und gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und unter verringertem Druck konzentriert. Die Reinigung wird durch Umkehrphasen HPLC (RP 18,5 um, 50 : 50-100 : 0 Acetonitril - Wasser über 60 Minuten) unter Bildung von 32(S)-Dihydro-40-O-(2- methoxy)ethyl-rapamycin und 32(R)-Dihydro-40-O-(2-methoxy)ethyl-rapamycin als Nebenprodukt ausgeführt.
32(S)-Dihydro-40-O-(2-methoxy)ethyl-rapamycin: ¹H NMR (CDCl&sub3;) 2 : 1 Gemisch aus Rotameren, die chemischen Verschiebungen in Klammern beziehen sich auf die untergeordneten Rotamere, δ 0,77 (1H, dd, H-38 ax), 1,67 (6H, s, C17-CH&sub3; und C29-CH&sub3;), 2,50 (1H, m, H-31), 3,01 (1H, m, H-25), 3,12 (2H, m, H-39 und H-40), 3,14 (3,15) (3H, s, OCH&sub3;), 3,28 (1H, m, H-32), 3,36 (3,34) (3H, s, OCH&sub3;), 3,39 (3,38) (3H, s, OCH&sub3;), 3,48 (3,46) (3H, s, OCH&sub3;), 3,55 und 3,75 (4H, 2 m, OCH&sub2;CH&sub2;O), 3,84 (1H, m, H-14), 4,12 (4,16) (1H, d, H-28), 4,73 (1H, s, C10-OH), 5,03 (1H, m, H-34).
MS (FAB) m/z 980 ([M + Li]&spplus;).

Beispiel 5: 32(S)-Dihydro-40-O-(2-hydroxy)ethyl-rapamycin (R&sub1; = CH&sub3;, R&sub2; = II, worin R&sub3; = -CH&sub2;CH&sub2;OH und R&sub4; = CH&sub3;, X = OH, Y = O).

Gemäß dem Verfahren von Beispiel 4, aber unter Verwendung des geeigneten Ausgangsmaterials erhält man die Titelverbindung.
32(S)-Dihydro-40-O-(2-hydroxy)ethyl-rapamycin: ¹H NMR (CDCl&sub3;) 1,7 : 1 Gemisch aus Rotameren, die chemischen Verschiebungen in Klammen beziehen sich auf das untergeordnete Rotamer, δ 0,76 (1H, dd, H-38ax), 2,50 (1H, m, H-31), 3,10 (1H, m, H-39), 3,13 (3,14) (3H, s, C16-OCH&sub3;), 3,20 (1H, m, H-40), 3,28 (1H, m, H-32), 3,36 (3,38) (3H, s, C27-OCH&sub3;), 3,45 (3,43) (3,41) (3H, s, C39-OCH&sub3;), 3,50 (1H, d, H-27), 3,58 und 3,70 (4H, m, OCH&sub2;CH&sub2;OH), 4,12 (4,16) (1H, d, H-28), 5,06 (1H, m, H-34), 5,60 (1H, dd, H-22), 5,99 (1H, d, H-18), 6,17 (1H, dd, H-21), 6,33 (1H, dd, H-20), 6,42 (1H, dd, H-19).
MS (FAB, LiI Matrix) m/z 966 ([M + Li]&spplus;) (rel. Intensität 100)

Beispiel 6: 6-Pent-2-inyloxy-32-desoxo-rapamycin (R&sub1; = Pent-2-inyl, R&sub2; = II, worin R&sub3; = H und R&sub4; = CH&sub3;, X = H, Y = O)

Gemäß dem Verfahren der Beispiele 1 und 2 oder 3, aber unter Verwendung der geeigneten Ausgangsmaterialien erhält man die Titelverbindung.
¹H NMR (CDCl&sub3;) δ 0,70 (1H, dd, H38ax), 1,23 (3H, t, CH&sub3;CH&sub2;CCCH&sub2;O), 2,21 (2H, ddq, CH&sub3;CH&sub2;CCCH&sub2;O), 2,78 (1H, m, H-25), 2,94 (1H, m, H-39), 3,31, s, C27-OCH&sub3;), 3,42, (3H, s, C39-OCH&sub3;), 3,62 (1H, d, H-27), 3,78 (1H, ddd, CH&sub3;CH&sub2;CCCH&sub2;O), 4,02 (1H, ddd, CH&sub3;CH&sub2;CCCH&sub2;O), 4,12 (1H, d, H-28), 4,79 (1H, m, H-34), 5,20 (1H, d, H- 30), 5,28 (1H, breites d, H-2), 5,50 (1H, dd, H-22), 5,97 (1H, d, H-18), 6,14 (1H, dd, H-21), 6,30 (1H, dd, H-20), 6,38 (1H, dd, H-19).
MS (FAB, LiI Matrix) m/z 958 ([M + Li]&spplus;) (rel. Intensität 100).
Die Verbindungen der Formel I zeigen eine pharmazeutische Aktivität und sind daher als Pharmazeutika brauchbar.
Insbesondere haben die Verbindungen der Formel I eine immunsuppressive und antiproliferative Aktivität, wie dies in den folgenden in vitro und in vivo Testverfahren angegeben ist.

1. Gemischte Lymphozytenreaktion (MLR)

Die gemischte Lymphozytenreaktion wurde ursprünglich in Zusammenhang mit Allotranplantaten entwickelt, um die Gewebekompatibilität zwischen potentiellen Organspendern und Empfängern zu ermitteln und ist eines der am besten etablierten Modelle der Immunreaktion in vitro. Eine MLR im Mausmodell, wie dies beispielsweise beschrieben wurde durch T. Meo in "Immunological Methods", L. Lefkovits und B. Pernis, Herausgeber, Academic Press, N.Y., Seiten 227-239 (1979), wird zur Demonstration der immunsuppressiven Wirkung der Verbindungen der Formel I verwendet. Milzzellen (0,5 · 10&sup6;) aus Balb/c Mäusen (weiblich, 8-10 Wochen), werden für 5 Tage mit 0,5 · 10&sup6; bestrahlten (2000 rad) oder Mitomycin C behandelten Milzzellen aus CBA Mäusen (weiblich, 8-10 Wochen) auf Mikrotiterplatten co-inkubiert. Die bestrahlten allogenen Zellen induzieren eine proliferative Reaktion in Balb/c Milzzellen, die durch den Einbau eines markierten Vorläufers in die DNA gemessen werden kann. Da die stimulierenden Zellen bestrahlt (oder Mitomycin C behandelt) sind, reagieren sie nicht auf die Balb/c Zellen mit Proliferation, aber behalten ihre Antigenität. Die antiproliferative Wirkung der Verbindungen der Formel I auf die Balb/c Zellen wird bei verschiedenen Verdünnungen gemessen und die Konzentration, die zu 50% Hemmung der Zellproliferation führt (HK&sub5;&sub0;) wird berechnet. Die hemmende Wirkung der Testprobe kann mit Rapamycin verglichen und als relative HK&sub5;&sub0; (das heißt HK&sub5;&sub0; Testprobe/HK&sub5;&sub0; Rapamycin) ausgedrückt werden. Die Verbindungen der Beispiele 1 und 2 haben jeweils in diesem Test eine relative HK&sub5;&sub0; von 0,3 und 0,08.

2. IL-6 vermittelte Proliferation (IL-6 PROL)

Das Vermögen der Verbindungen der Formel I, mit den Wachstumsfaktor-assoziierten Signalwegen wechselzuwirken, wird in einer Interleukin 6 (IL-6) abhängigen Maushybridomzellinie untersucht. Der Test wird in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen durchgeführt. 5000 Zellen/Vertiefung werden in serumfreiem Medium kultiviert (wie dies von M. H. Schreier und R. Tees in Immunological Methods, Herausgeber I. Lefkovits und B. Pernis, Academic Press 1981, Band IL, Seiten 263-275 beschrieben ist), das mit 1 ng rekombinantem IL-6/ml versetzt ist. Nach einer Inkubation für 66 Stunden in Gegenwart oder Abwesenheit einer Testprobe werden die Zellen mit 1 uCi (³H)-Thymidin/Vertiefung für weitere 6 Stunden versetzt, geerntet und durch Flüssigscintillation gezählt. Der (³H)- Thymidineinbau in die DNA korreliert mit dem Anstieg der Zellzahl und ist daher ein Maß für die Zellproliferation. Eine Verdünnungsreihe der Testprobe erlaubt die Berechnung der Konzentration, die zu einer Zellproliferationshemmung von 50% führt (HK&sub5;&sub0;). Das Hemmvermögen der Testprobe kann mit Rapamycin verglichen und als relative HK&sub5;&sub0; (das heißt HK&sub5;&sub0; Testprobe/HK&sub5;&sub0; Rapamycin) ausgedrückt werden. Die Verbindungen der Beispiele 1 und 2 haben in diesem Test eine relative HK&sub5;&sub0; von jeweils 0,2 und 0,09.

3. Makrophilinbindungstest (MBA)

Von Rapamycin und dem strukturell verwandten Immunsuppressivum FK-506 ist bekannt, daß sie beide in vivo an Makrophilin-12 binden (auch bekannt als FK-506 Bindungsprotein oder FKBP-12) und diese Bindung dürfte mit der immunsuppressiven Aktivität dieser Verbindungen zusammenhängen. Die Verbindungen der Formel I binden auch stark an Makrophilin-12, wie dies in einem Konkurrenzbindungstest gezeigt wird.
In diesem Test wird ein an RSA gekuppeltes FK-506 verwendet, um Mikrotiterplatten zu beschichten. Biotinyliertes rekombinantes humanes Makrophilin-12 (biot-MAP) kann in Gegenwart oder Abwesenheit einer Testprobe an das immobilisierte FK-506 binden. Nach dem Waschen (uni nicht spezifisch gebundenes Makrophilin zu entfernen), wird gebundenes biot-MAP durch eine Inkubation mit einem Konjugat aus Streptavidin und alkalischer Phosphatase, gefolgt von einem Waschen und einer anschließenden Zugabe von p-Nitrophenylphosphat als Substrat ausgetestet. Die Auswertung erfolgt durch die OD bei 405 nm. Die Bindung einer Testprobe an biot-MAP führt zu einer Abnahme der Menge an biot-MAP, das an das FK-506 gebunden ist und somit zu einer Verringerung in der OD405. Eine Verdünnungsreihe der Testprobe erlaubt die Bestimmung der Konzentration, die zu 50% Hemmung der biot-MAP Bindung an das immobilisierte FK-506 führt (HK&sub5;&sub0;). Die Hemmkapazität einer Testprobe wird mit der HK&sub5;&sub0; von freiem FK506 als Standard verglichen und wird als relative HK&sub5;&sub0; (das heißt HK&sub5;&sub0; Testprobe/HK&sub5;&sub0; freies FK506) ausgedrückt. In diesem Test haben die Verbindungen der Beispiele 1, 2 und 5 eine relative HK&sub5;&sub0; von jeweils 1, 2,8 und 2,5.

4. Lokalisierte Graft-versus-Host Reaktion (GvH)

Die in vivo Wirksamkeit der Verbindungen der Formel I wird in einem geeigneten Tiermodell bewiesen, wie dies beispielsweise beschrieben ist in Ford et al., Transplantation 10 (1970) 258. Milzzellen (1 · 10&sup7;) von 6 Wochen alten weiblichen Wistar/Furth (WF) Ratten werden am Tag 0 subkutan in die linke hintere Pfote von weiblichen (F344 · WF)F&sub1; Ratten injiziert, die etwa 100 g wiegen. Die Tiere werden für 4 aufeinanderfolgende Tage behandelt und die poplitealen Lymphknoten werden am Tag 7 entfernt und gewogen. Der Gewichtsunterschied zwischen den zwei Lymphknoten wird als Parameter für die Ermittlung der Reaktion verwendet.

5. Nierenallotransplantatreaktion in der Ratte

Eine Niere aus einer DA (RT1a) oder Brown-Norway (BN) (RT1a) Donorratte wird auf das Nierengefäß einer unilateral (linke Seite) nephrektomierten Lewis (RT1¹) Empfängerratte mittels einer End-zu-End Anastomose transplantiert. Die Harnleiteranastomose ist ebenfalls End-zu-End. Die Behandlung beginnt am Tag der Transplantation und wird für 14 Tage fortgesetzt. Eine contralaterale Nephrektomie wird sieben Tage nach der Transplantation durchgeführt, wodurch der Empfänger auf die Funktionsfähigkeit der Spenderniere angewiesen ist. Das Überleben des Transplantatempfängers wird als Parameter für ein funktionsfähiges Transplantat verwendet.

6. Experimentell induzierte allergische Encephalomyelitis (EAE) bei Ratten

Die Wirksamkeit der Verbindungen der Formel I bei der EAE wird beispielsweise durch das in Levine und Wenk, Amer. J. Path. 47 (1965) 61, McFarlin et al., J. Immunol. 113 (1974) 712, Borel, Transplant. & Clin. Immunol. 13 (1981) 3 beschriebene Verfahren gemessen. Die EAE ist ein breit akzeptiertes Modell für die Multiple Sklerose. Männliche Wistar Ratten injiziiert man in die hinteren Pfoten ein Gemisch aus Rückenmarkstrang vom Rind und komplettem Freund'schem Adjuvans. Die Symptome dieser Erkrankung (Paralyse des Schwanzes und beider Hinterbeine) entwickeln sich gewöhnlich innerhalb von 16 Tagen. Die Anzahl an erkrankten Tieren wie auch der Zeitpunkt des Einsetzens der Erkrankung werden aufgezeichnet.

7. Arthritis durch Freund'sches Adjuvans

Die Wirksamkeit gegen experimentell induzierte Arthritis wird unter Verwendung des Verfahrens gezeigt, das beispielsweise beschrieben ist in Winter und Nuss, Arthritis & Rheumatism 9 (1966), 394, Billingham und Davies, Handbook of experimental Pharmacol. (Herausgeber Vane und Ferreira, Springer Verlag, Berlin) 50/II (1979) 108-144. OFA und Wistar Ratten (männlich oder weiblich, 150 g Körpergewicht) injiziert man i.c. am Schwanzansatz oder in die hintere Pfote 0,1 ml Mineralöl, das 0,6 mg lyophilisiertes hitze-getötetes Mycobacterium smegmatis enthält. Bei der Entwicklung des Arhritismodells wird die Behandlung unmittelbar nach der Injektion des Adjuvans (Tage 1-18) begonnen, beim ausgebildeten Arthritismodell wird die Behandlung am Tag 14 begonnen, wenn die sekundäre Entzündung gut entwickelt ist (Tage 14-20). Am Ende des Experiments wird die Schwellung der Gelenke durch ein Mikrometer gemessen. Die ED&sub5;&sub0; ist die orale Dosis in mg/kg, die die Schwellung (primär oder sekundär) auf die Hälfte der Kontrollen verringert.

8. Antitumor und MDR Aktivität

Die Antitumoraktivität der Verbindungen der Formel I und deren Fähigkeit zur Förderung der Wirksamkeit der Antitumormittel durch die Linderung der Multiarzneimittelresistenz wird beispielsweise gezeigt durch die Verabreichung eines Antikrebsmittels, beispielsweise Colchizin oder Etoposid, an Multiarzneimittel-resistente Zellen und Arzneimittel-empfindliche Zellen in vitro oder an Tiere, die Multiarzneimittel-resistente oder Arzneimittel- empfindliche Tumoren oder Infektionen aufweisen, mit oder ohne gleichzeitiger Verabreichung der zu testenden Verbindungen der Formel I und durch die Verabreichung der Verbindung der Formel I alleine.
Solche in vitro Tests werden mittels jeder geeigneten Arzneimittel-resistenten Zellinie und Kontrollzellinie (Ausgangszellinie) durchgeführt, die erzeugt werden, wie dies beispielsweise beschrieben ist in Ling et al., J. Cell. Physiol. 83, 103-116 (1974) und Bech-Hansen et al., J. Cell. Physiol. 88, 23-32 (1976). Bestimmte ausgewählte Klone sind die Multiarzneimittel-resistente (beispielsweise Colchizin resistente) Linie CHR (Subklon C5S3.2) und die ursprüngliche, empfindliche Linie AUX B1 (Subklon AB1 S11).
Die in vivo Antitumor- und Anti-MDR-Aktivität wird beispielsweise bei Mäusen gezeigt, denen Multiarzneimittel-resistente und Arzneimittel-empfindliche Krebszellen injiziert werden. Ehrlichs Ascitescarcinomsublinien (EA), die gegenüber der Arzneimittelsubstanz DR, VC, AM, ET, TE oder CC resistent sind, werden durch aufeinanderfolgenden Transfer von EA Zellen auf aufeinanderfolgende Generationen an Balb/c Wirtsmäusen gemäß den von Slater et al., J. Clin. Invest. 70, 1131 (1982) beschriebenen Verfahren entwickelt.
Äquivalente Ergebnisse können erhalten werden, wenn die Testmodelle der neuen Verbindung mit vergleichbarem Design verwendet werden, beispielsweise in vitro, oder durch die Verwendung von Testtieren, die infiziert sind mit arzneimittelresistenten und arzneimittelempfindlichen Virusstämmen, antibiotikumresistenten (beispielsweise Penicillin) und empfindlichen Bakterienstämmen, Antipilzmittel-resistenten und empfindlichen Pilzstämmen wie auch arzneimittelresistenten Protozoenstämmen, beispielsweise Plasmodienstämme, wie natürlich vorkommende Unterstämme von Plasmodium falciparum, die eine erworbene Resistenz gegen Chemotherapie und Antimalariaarzneimittel zeigen.

9. Hemmung des Mip- oder Mip-ähnlichen Faktors

Zusätzlich bindet und blockiert die Verbindungen der Formel I eine Vielzahl an Mip (Makrophageninfektiositätspotenzierer) und Mip-ähnliche Faktoren, die zu Makrophilin strukturell ähnlich sind. Mip und Mip-ähnliche Faktoren sind Virulenzfaktoren, die von einer großen Vielzahl an Pathogenen gebildet werden, einschließlich denen der Gattung Chlamydia, beispielsweise Chlamydia trachomatis, Neisseria, beispielsweise Neisseria meningitidis und Legionella, beispielsweise Legionella pneumophilia und auch von den obligat parasitären Vertretern der Ordnung Rickettsiales. Diese Faktoren spielen eine kritische Rolle bei der Etablierung einer intrazellulären Infektion. Die Wirksamkeit der neuen Verbindung bei der Verringerung der Infektiosität von Pathogenen, die Mip oder Mip- ähnliche Faktoren bilden, kann durch den Vergleich der Infektiosität der Pathogenen in Zellkulturen in Gegenwart und Abwesenheit der Makrolide gezeigt werden, indem man beispielsweise die in Lundemose et al., Mol. Microbiol. (1993) 7: 777 beschriebenen Verfahren verwendet.

10. Chronische Allotransplantatabstoßung

Die Niere einer männlichen DA Ratte (RT1a) wird orthotopisch in einen männlichen Lewis Empfänger (RT1¹) transplantiert. Insgesamt werden 24 Tiere transplantiert. Alle Tiere werden mit 7,5 mg/kg/Tag Cyclosporin A oral für 14 Tage vom Tag der Transplantation an behandelt, tun eine akute zelluläre Abstoßung zu verhindern. Es wird keine kontralaterale Nephrektomie ausgeführt. Jede Experimentalgruppe, die aus 6 Tieren besteht, wird mit einer bestimmten Dosis einer Verbindung der Formel I oder einem Plazebo behandelt.
Beginnend am Tag 53-64 nach der Transplantation werden die Empfängertiere oral für weitere 69-72 Tage mit der Verbindung der Formel I behandelt oder erhalten ein Plazebo. 14 Tage nach der Transplantation werden die Tiere einer Transplantatuntersuchutg durch Magnetresonanzbildgebung (MR1) mit einer Perfusionsmessung der Nieren unterzogen (mit einem Vergleich der transplantierten Niere und der eigenen kontralateralen Niere). Dies wird an den Tagen 53-64 nach der Transplantation und am Ende des Experiments wiederholt. Die Tiere werden dann einer Autopsie unterzogen. Die Abstoßungsparameter, wie MR1 Bewertung, relative Perfusionsrate der transplantierten Niere und histologische Bewertung des Nierenallotransplantats auf eine zelluläre Abstoßung und Gefäßveränderungen werden bestimmt und statistisch analysiert. Die Verabreichung einer Verbindung der Formel I, beispielsweise der Verbindung von Beispiel I oder 2 mit einer Dosis von 0,5 bis 2,5 mg/kg ergibt in diesem Rattennierenallotransplantatmodell eine Verringerung aller oben erwähnten Abstoßungsparameter.

11. Angioplastie

Es wird eine Ballonkatheterisierung am Tag 0 ausgeführt, wie sie im wesentlichen von Powell et al. (1989) beschrieben ist. Unter Isofluoranbetäubung wird ein Fogarty 2F Katheter in die linke Arteria carotis communis durch die externe Carotis eingeführt und aufgeblasen (Distension = 10 ul H&sub2;O). Der aufgeblasene Ballon wird dreimal entlang der Länge der Arteria carotis communis gezogen, die letzten zwei Male während einer leichten Drehung, um eine gleichförmige Deendothelialisierung zu erhalten. Der Katheter wird dann entfernt, es wird eine Ligation um die externe Carotis angebracht, um die Blutung zu verhindern und die Tiere können sich erholen.
2 Gruppen an 12 RoRo Ratten (400 g, etwa 24 Wochen alt) werden für die Studie verwendet: Eine Kontrollgruppe und eine Gruppe, die eine erfindungsgemäße Verbindung erhält. Die Ratten werden während des Umgangs, der experimentellen Verfahren und der Analyse vollständig randomisiert.
Die zu testende Verbindung wird p. o. (orale Verabreichung) 3 Tage vor der Ballonverletzung (Tag -3) bis zum Ende der Studie 14 Tage nach der Ballonverletzung (Tag +14) verabreicht. Die Ratten werden in einzelnen Käfigen gehalten und haben freien Zugang zu Futter und Wasser.
Die Ratten werden dann mit Isofluoran betäubt, ein Perfusionskatheter wird durch den linken Ventrikel eingeführt und im Aortenbogen verankert und eine Ansaugkanüle wird in den rechten Ventrikel eingebracht. Die Tiere werden unter einem Perfusionsdruck von 150 mm Hg zuerst für 1 Minute mit 0,1 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) und dann für 15 Minuten mit 2,5% Glutaraldehyd in Phosphatpuffer (pH 7,4) perfundiert. Der Perfusionsdruck beträgt 150 mm Hg an der Spitze der Kanüle (~100 mm Hg in der Arteria carotis, wie dies in einem vorrübergehenden Experiment durch die Einführung einer Kanüle in die externe Arteria carotis bestimmt wurde, die an einen Druckumwandler angeschlossen ist). Die Arteria carotis wird dann herausgeschnitten, vom umgebenden Gewebe befreit und in einen 0,1 M Cacodylatpuffer (pH 7,4) getaucht, der 7% Saccharose enthält, und über Nacht bei 4ºC inkubiert. Am folgenden Tag wird die Arteria carotis für 1 h bei Raumtemperatur in 0,05% KMnO&sub4; in 0,1 M Cacodylat getaucht und geschüttelt. Die Gewebe werden in einer abgestuften Ethanolreihe 2 · 10 Minuten in 75%, 2 · 10 Minuten in 85%, 3 · 10 Minuten in 95% und 3 · 10 Minuten in 100% Ethanol dehydriert. Die dehydrierte Arteria carotis wird dann gemäß den Angaben des Herstellers in Technovit 7100 eingebettet. Das Einbettungsmedium kann in einem Exsikkator unter Argon über Nacht polymerisieren, da festgestellt wurde, daß Sauerstoff die richtige Aushärtung der Blöcke hemmt.
Schnitte mit 1-2 um Dicke werden aus der Mittelsektion jeder Arteria carotis mit einem harten Metallmesser auf einem Rotationsmikrotom geschnitten und für 2 Minuten mit Giemsa-Färbung gefärbt. Etwa 5 Schnitte aus jeder Arteria carotis werden so hergestellt und die Querschnittsfläche der Media, Neointima und des Lumens wird morphometrisch durch ein Bildanalysesystem evaluiert (MCID, Toronto, Canada). In diesem Test hemmen die Verbindungen der Formel I, beispielsweise die Verbindung von Beispiel 1 oder 2 die myointimale Proliferation, wenn sie per os mit einer Tagesdosis von 0,5 bis 2,5 mg/kg verabreicht werden.
Die Verbindungen der Formel I sind auch brauchbar in Tests, um das Vorkommen oder die Menge von Makrophilin-bindenden Verbindungen zu detektieren, beispielsweise in Konkurrenztests für diagnostische oder Screeningzwecke. Daher liefert die vorliegende Erfindung in einer weiteren Ausführungsform die Verwendung der Verbindungen der Formel I als Screeningwerkzeug, um das Vorkommen von Makrophilin-bindenden Verbindungen in einer Testlösung zu bestimmen, beispielsweise im Blut, Blutserum oder einer zu screenenden Testlösung. Vorzugsweise wird eine Verbindung der Formel I in Mikrotiterplatten immobilisiert und kann dann in Gegenwart und Abwesenheit einer Testlösung an markiertes Makrophilin-12 (FKBP-12) binden. Alternativ dazu wird das FKBP-12 in Mikrotiterplatten immobilisiert und kann in Gegenwart und Abwesenheit einer Testlösung an eine Verbindung der Formel I binden, die markiert wurde, beispielsweise fluoreszierend, enzymatisch oder radioaktiv, wie eine Verbindung der Formel I, worin R&sub1; eine Markierungsgruppe umfaßt. Die Platten werden gewaschen und die Menge an gebundener markierter Verbindung wird gemessen. Die Menge an Makrophilin bindender Substanz in der Testlösung ist grob umgekehrt proportional zur Menge an gebundener markierter Verbindung. Für eine quantitative Analyse wird eine Standardbindungskurve mittels bekannter Konzentrationen an Makrophilin bindender Verbindung erstellt.
Die Verbindungen der Formel I sind insbesondere brauchbar für die folgenden Zustände:
a) Behandlung und Verhinderung einer Organ- oder Gewebetransplantatabstoßung, beispielsweise für die Behandlung von Empfängern von beispielsweise Herz-, Lungen-, kombinierten Herz-Lungen-, Leber-, Nieren-, Pankreas-, Haut- oder Korneatransplantaten. Sie sind auch indiziert für die Verhinderung der Graft-versus-Host Erkrankung, wie sie nach einer Knochenmarkstransplantation auftritt.
b) Behandlung und Prävention von Transplantationsvaskulupathien, beispielsweise Atherosklerose.
c) Behandlung und Prävention der Proliferation und Migration von glatten Muskelzellen, die zur Verdickung der Gefäßintima, der Blutgefäßobstruktion, obstruktiven Koronaratherosklerose und Restenose führen.
d) Behandlung und Verhinderung einer Autoimmunerkrankung und von Entzündungszuständen, insbesondere Entzündungszuständen mit einer Ätiologie, die eine Autoimmunkomponente umfassen, wie Arthritis (beispielsweise rheumatoide Arthritis, chronische progrediente Arthritis und Arthritis deformans) und rheumatischen Erkrankungen. Bestimmte Autoimmunerkrankungen, für die die Verbindungen der Formel I verwendet werden können, sind unter anderem autoimmune hämatologische Störungen (einschließlich beispielsweise hämolytischer Anämie, aplastischer Anämie, reiner Erythrozytenanämie und idiopathischer Thrombozytopenie), systemischer Lupus erythematodes, Polychondritis, Sklerodermie, Wegener'scher Granulomatose, Dermatomyositis, chronisch aktive Hepatitis, Myasthenia gravis, Psoriasis, Steven-Johnson Syndrom, idiopathische Sprue, autoimmune entzündliche Darmerkrankungen (einschließlich beispielsweise Colitis ulcerosa und Morbus Crohn), endokrine Ophthalmopathie, Graves Erkrankung, Sarkoidose, Multiple Sklerose, primär biliäre Zirrhose, juveniler Diabetes (Diabetes mellitus Typ I), Uveitis (vordere und hintere), Keratokonjuktivitis sicca und Frühlingskonjunktivitis, interstitielle Lungenfibrose, psoriatische Arthritis, Glomerulonephritis (mit und ohne nephrotischem Syndrom, beispielsweise einschließlich einem idiopathisch nephrotischem Syndrom oder der Minimal change Nephropathie) und juvenile Dermatomyositis.
e) Behandlung und Verhinderung von Asthma.
f) Behandlung der Multiarzneimittelresistenz (MDR). Die Verbindungen der Formel I unterdrücken P- Glykoproteine (Pgp), die die mit MDR zusammenhängenden Membrantransportmoleküle sind. MDR ist insbesondere bei Krebspatienten und AIDS Patienten problematisch, die nicht auf die herkömmliche Chemotherapie ansprechen, da die Medikation durch Pgp aus den Zellen gepumpt wird. Die Verbindungen der Formel I sind daher brauchbar zur Steigerung der Wirksamkeit von anderen chemotherapeutischen Mitteln bei der Behandlung und Kontrolle von Multiarzneimittel-resistenten Zuständen, wie Multiarzneimittel-resistentem Krebs oder Multiarzneimittel-resistentem AIDS.
g) Behandlung von proliferativen Störungen, beispielsweise Tumoren, hyperproliferativen Hautstörungen und dergleichen.
h) Behandlung von Pilzinfektionen
i) Behandlung und Verhinderung von Entzündungen, insbesondere bei der Potenzierung der Wirkung von Steroiden.
j) Behandlung und Verhinderung von Infektionen, insbesondere Infektionen durch Pathogene mit Mip oder Mip- ähnlichen Faktoren.
Für die obigen Indikationen variiert die erforderliche Dosis beispielsweise in Abhängigkeit vom zu behandelnden Zustand (beispielsweise dem Krankheitstyp oder der Art der Resistenz), dem gewünschten Effekt und dem Verabreichungsweg. Im allgemeinen erhält man jedoch befriedigende Ergebnisse bei der oralen Verabreichung in Dosierungen im Bereich von 0,05 bis 5 oder bis zu 10 mg/kg/Tag, beispielsweise im Bereich von 0,1 bis 2 oder bis zu 7,5 mg/kg/Tag einmal oder in verteilten Dosierungen 2 bis 4 · pro Tag oder bei der parenteralen Verabreichung beispielsweise intravenös, wie durch i. v. Tropf oder Infusion in Dosierungen im Bereich von 0,01 bis 2,5 bis zu 5 mg/kg/Tag, beispielsweise im Bereich von 0,05 oder 0,1 bis zu 1,0 mg/kg/Tag. Geeignete Tagesdosen für Patienten liegen daher im Bereich von 500 mg p. o., beispielsweise im Bereich vom 5 bis 100 mg p. o. oder im Bereich von 0,5 bis 125 bis zu 250 mg i. v., beispielsweise im Bereich von 2,5 bis 50 mg i. v..
Alternativ dazu und sogar bevorzugt wird die Dosierung in einer patientenspezifischen Art durchgeführt, um vorbestimmte Mindestblutspiegel bereitzustellen, wie sie beispielsweise durch die RIA Technik bestimmt werden. Daher wird die Patientendosierung so eingestellt, daß man normale Mindestblutspiegel im Bereich von 50 oder 150 bis zu 500 oder 1000 ng/ml erreicht, wie dies durch RIA gemessen wird, das heißt analog zu Dosierungsverfahren, die derzeit für die immunsuppressive Therapie mit Ciclosporin verwendet werden.
Die Verbindungen der Formel I können als alleiniger Wirkstoff oder zusammen mit anderen Arzneimitteln verabreicht werden. Beispielsweise können bei immunsuppressiven Anwendungen, wie der Verhinderung und Behandlung der Graft-versus-Host Erkrankung, der Transplatatabstoßung oder der Autoimmunerkrankung, die Verbindungen der Formel I in Kombination mit Cyclosporinen oder Ascomycinen oder ihren immunsuppressiven Analoga, beispielsweise Cyclosporin A, Cyclosporin G, FK-506 usw., Corticosteroiden, Cyclophosphamid, Azathiopren, Methotrexat, Brequinar, Leflunomid, Mizoribin, immunsuppressiven monoklonalen Antikörpern, beispielsweise monoklonalen Antikörpern gegen Leukozytenrezeptoren, beispielsweise MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD25, CD28, CTLA4, B7, CD45 oder CD58 oder ihren Liganden, oder anderen immunmodulatorischen Verbindungen verwendet werden. Für antientzündliche Anwendungen können die Verbindungen der Formel I auch zusammen mit antientzündlichen Verbindungen verwendet werden, beispielsweise Corticosteroiden. Für Antinfektionsanwendungen können die Verbindungen der Formel I in Kombination mit anderen Antiinfektionsmitteln verwendet werden, beispielsweise antiviralen Arzneimitteln oder Antibiotika.
Die Verbindungen der Formel I werden durch jeden herkömmlichen Weg verabreicht, insbesondere enteral, beispielsweise oral in Form von Lösung zum Trinken, Tabletten oder Kapseln oder parenteral beispielsweise in Form von injizierbaren Lösungen oder Suspensionen. Geeignete Einheitsdosierungsformen zur oralen Verabreichung umfassen beispielsweise 1 bis 50 mg einer Verbindung der Formel I, gewöhnlich 1 bis 10 mg. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die die Verbindungen der Formel I enthalten, können analog zu pharmazeutischen Zusammensetzungen hergestellt werden, die Rapamycin enthalten, wie dies beispielsweise in EP 0 041 795 A beschrieben ist.
Vorzugsweise umfassen die pharmazeutischen Zusammensetzungen eine Verbindung der Formel I und ein Trägermedium, das eine hyrophile Phase, eine lipophile Phase und ein oberflächenaktives Mittel umfaßt. Sie können in Form einer Emulsion oder eines Mikroemulsionspräkonzentrats vorliegen. Solche Emulsionen oder Mikroemulsionspräkonzentrate sind beispielsweise in GB 2 278 780 A beschrieben. Vorzugsweise umfaßt die lipophile Phase 10 bis 85 Gewichtsprozent des Trägermediums, das oberflächenaktive Mittel umfaßt 5 bis 80 Gewichtsprozent des Trägermediums und die hydrophile Phase umfaßt 10 bis 50 Gewichtsprozent des Trägermediums. Die Verbindung der Formel I ist vorzugsweise in einer Menge von 2 bis 15 Gewichtsprozent vorhanden.
Eine besonders bevorzugte pharmazeutische Zusammensetzung umfaßt ein Mikroemulsionspräkonzentratträgermedium, das umfaßt
i) ein Reaktionsprodukt eines Rizinusöls und Ethylenoxid,
ii) ein Umesterungsprodukt eines Pflanzenöls und Glycerin, das vorwiegend Linolensäure oder Ölsäure, Mon-, Di- und Triglyceride oder ein polyoxyalkyliertes Pflanzenöl enthält,
iii) 1,2-Propylenglycol, und
iv) Ethanol.
Gemäß dem Vorangehenden liefert die vorliegende Erfindung auch:
A. Eine Verbindung der Formel I zur Verwendung als Pharmazeutikum, beispielsweise zur Prävention oder Behandlung der oben angegebenen Störungen.
B. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung der Formel I zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel oder Träger hierfür enthält.
C. Einen Kit oder eine Packung zur Verwendung bei der Immunsuppression, Entzündung oder Infektion, wie dies oben angegeben ist, welche eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung der Formel I enthält, und eine pharmazeutische Zusammensetzung enthält, die entweder ein immunsuppressives oder immunmodulatorisches Arzneimittel oder ein antientzündliches Mittel oder Antiinfektionsmittel enthält.
Es wurde nun überraschenderweise festgestellt, daß die Verbindungen der Formel I, worin X für OH steht, das heißt die 32(S)-Dihydroverbindungen eine verbesserte Aktivität beispielsweise in den oben beschriebenen Tests aufweisen und stabiler sind als die entsprechenden Enantiomere, das heißt die 32(R)-Dihydroverbindungen, wenn sie beispielsweise im dem folgenden Test unterzogen werden:
Die zu testenden Verbindungen werden in Rattenserum inkubiert und ihre Bindungsaffinität für FKBP12 wird im MBA Test nach unterschiedlichen Inkubationszeiten gemessen. Wenn die Affinität abnimmt, nimmt die nominelle HK&sub5;&sub0; zu. Eine Abnahme der Affinität wird im allgemeinen einer Instabilität der Verbindung in Rattenserum zugeschrieben.

Claims

1. Verbindung der Formel I

worin

R&sub1; für Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Hydroxyalkyl, Hydroxyalkenyl, Hydroxyalkinyl, Benzyl, Alkoxybenzyl oder Chlorbenzyl steht,

R&sub2; ausgewählt ist aus Formel II oder Formel III

worin

R&sub3; ausgewählt ist aus H, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Arylalkyl, Hydroxyarylalkyl, Hydroxyaryl, Hydroxyalkyl, Dihydroxyalkyl, Hydroxyalkoxyalkyl, Hydroxyalkylarylalkyl, Dihydroxyalkylarylalkyl, Alkoxyalkyl, Alkylcarbonyloxyalkyl, Aminoalkyl, Alkylaminoalkyl, Alkoxycarbonylaminoalkyl, Alkylcarbonylaminoalkyl, Arylsulfonamidoalkyl, Allyl, Dihydroxyalkylallyl, Dioxolanylallyl, Carbalkoxyalkyl und Alkylsilyl,

R&sub4; für H oder Methyl steht oder zusammen mit R&sub3; C&sub2;-C&sub6; Alkylen bildet,

R&sub5; steht für R&sub6;O-CH&sub2;-, worin R&sub6; ausgewählt ist aus H, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Alkylcarbonyl, Arylcarbonyl, Heteroarylcarbonyl, Hydroxyalkylcarbonyl, Aminoalkylcarbonyl, Formyl, Arylalkyl, Hydroxyarylalkyl, Hydroxyaryl, Hydroxyalkyl, Dihydroxyalkyl, Hydroxyalkoxyalkyl, Hydroxyalkylarylalkyl, Dihydroxyalkylarylalkyl, Alkoxyalkyl, Alkylcarbonyloxyalkyl, Aminoalkyl, Alkylaminoalkyl, Alkoxycarbonylaminoalkyl, Alkylcarbonylaminoalkyl, Arylsulfonamidoalkyl, Allyl, Dihydroxyalkylallyl, Dioxolanylallyl und Carbalkoxyalkyl, R&sub7;CO-, worin R&sub7; ausgewählt ist aus H, Alkyl, Hydroxy, Alkoxy, Aryloxy, Amino, Alkamino oder N,N-disubstituiertem Amino, worin die Substituenten ausgewählt sind aus Alkyl, Aryl, Arylalkyl, R&sub8;NCH-, worin R&sub8; für Alkyl, Aryl, Amino, Alkylamino, Arylamino, Hydroxy, Alkoxy oder Arylsulfonylamino, -O-CH-O- oder substituiertes Dioxymethylin steht,

Y ausgewählt ist aus O und (H, OH)

X für OH oder H steht,

worin "Alk" oder "Alkyl" für einen aliphatischen C&sub1;-C&sub1;&sub0; Substituenten steht, der wahlweise durch eine Sauerstoffbindung unterbrochen ist und "Ar" oder "Aryl" filz Phenyl, Benzyl, Tolyl und Pyridyl steht,

mit der Maßgabe, daß wenn X für OH steht, R&sub1; für Alkyl steht und R&sub2; für einen Rest der Formel II steht, R&sub3; dann nicht für H steht.

2. Verbindung der Formel Ia

worin

R&sub1; für C&sub3;-C&sub1;&sub0; Alk-2-inyl oder C&sub3;-C&sub1;&sub0; Hydroxyalk-2-inyl steht,

R&sub2; für einen Rest der Formel II oder III nach Anspruch 1 steht und Y für O steht.

3. Verbindung der Formel Ib

worin

R&sub1; für C&sub1;-C&sub1;&sub0; Alkyl, C&sub3;-C&sub1;&sub0; Alkenyl, C&sub3;-C&sub1;&sub0; Hydroxyalkenyl, C&sub3;-C&sub1;&sub0; Alk-2-inyl, C&sub3;-C&sub1;&sub0; Hydroxyalk-2-inyl oder C&sub1;- C&sub1;&sub0; Alkoxy-C&sub1;-C&sub1;&sub0;-alkyl steht,

4. Verbindung, die 16-Pent-2-inyloxy-32(S)-dihydro-rapamycin oder 16-Pent-2-inyloxy-32(S)-dihydro-40-O-(2- hydroxyethyl)-rapamycin ist.

5. Verbindung, die 32-Desoxorapamycin oder 16-Pent-2-inyloxy-32-desoxo-rapamycin ist.

6. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel I nach Anspruch 1, wobei das Verfahren umfaßt

a) zur Herstellung einer Verbindung der Formel I, worin X für H steht, reduktive Eliminierung des Carbonyls in Position 32 einer Verbindung der Formel IVa

worin R&sub1; und Y wie oben definiert sind, in geschützter oder ungeschützter Form,

und erforderlichenfalls Entfernung der vorhandenen Schutzgruppen, oder

b) zur Herstellung einer Verbindung der Formel I, worin X für OH steht, stereoselektive Reduktion des Carbonyls in Position 32 einer Verbindung der Formel IVa, wie dies oben definiert ist, oder

c) Umwandlung einer Verbindung der Formel I, worin R&sub1; für Alkyl steht, unter Bildung einer Verbindung der Formel I, worin R&sub1; nicht für Alkyl steht.

7. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Verwendung als Pharmazeutikum.

8. Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel oder Träger hierfür enthält.

9. Kit oder Packung zur Verwendung bei der Immunsuppression, Entzündung oder bei Infektionen, einschließlich einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 und eine pharmazeutische Zusammensetzung umfaßt, welche ein immunsuppressives oder immunmodulatorisches Arzneimittel oder ein antientzündliches Mittel oder ein Antiinfektionsmittel enthält.

10. Kit oder Packung nach Anspruch 9, worin das immunsuppressive oder immunmodulatorische Arzneimittel Cyclosporin A, FK 506, Mycophenolsäure, Mycophenolatmofetil oder ein monoklonaler Antikörper gegen Leukozytenrezeptoren oder gegen ihre Liganden ist.