MXPA06010556A - Focalizacion pasiva de agentes citotoxicos. - Google Patents

Focalizacion pasiva de agentes citotoxicos.

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Nitin Krishnaji Damle
Erwin Raymond Arsene Boghaert
Kiran Manohar Khandke
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Abstract

La presente invencion suministra metodos para tratar celulas cancerosas que comprenden administrar a un paciente que lo necesita una cantidad terapeuticamente efectiva de un conjugado de anticuerpo no especifico a una citotoxina, en donde las celulas cancerosas no expresan un antigeno al cual el anticuerpo no especifico diga. En una modalidad, el anticuerpo no especifico es un anticuerpo anti-CD33 (por ejemplo, hp67.6), un anticuerpo anti -CD22 (por ejemplo, g5/44), o un anticuerpo anti-CD20 (por ejemplo, rituximab). En otra modalidad, el anticuerpo no especifico no se liga a un antigeno humano. Las celulas cancerosas tratadas pueden ser, por ejemplo, celulas gastricas, de colon, celulas de pulmon no pequenas (NSCLC), celulas de pecho, celulas epidermoides, o celulas del carcinoma de prostata. En otra modalidad, la citotoxina es calicheamicina. La calicheamicina puede ser conjugada al antigeno no especifico usando un acido 4-(4'-acetilfenoxi) butanoico (AcBut) o un enlazador de acido (3-Acetilfenil) acetico (AcPAc). En otra modalidad, el anticuerpo al antigeno no especifico conjugado a una citotoxina es administrado en combinacion con un agente bioactivo, por ejemplo, un agente anti-cancer.

Description

FOCALIZACIÓN PASIVA DE AGENTES C1TOTÓX1COS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con la focalización pasiva de agentes citotóxicos conjugados a un anticuerpo no específico.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El uso de quimioterapia citotóxica ha mejorado la supervivencia de pacientes que sufren de diversos tipos de cánceres. Usado contra enfermedades neoclásicas seleccionadas tales como, por ejemplo, leucemia linfocítica aguda en población joven y linfomas Hodgkin, cócteles de drogas citotóxicas pueden inducir curas completas. Desafortunadamente, la quimioterapia, como se aplica actualmente, no resulta en remisiones completas en una mayoría de cánceres. Múltiples razones pueden explicar esta carencia relativa de eficacia. Entre estas, el índice bajo terapéutico de la mayoría de los quimioterapéuticos es una posibilidad de objetivo para mejoras farmacéuticas. El índice terapéutico bajo refleja el margen estrecho entre la eficacia y la dosis tóxica de una droga, que puede impedir la administración de dosis suficientemente altas necesarias para erradicar un tumor y obtener un efecto curativo.
Una estrategia para solucionar este problema es el uso de la llamada bala mágica. La bala mágica consiste de un compuesto citotóxico que es enlazado químicamente a un anticuerpo. Ligar una droga anticáncer citotóxica a un anticuerpo que reconozca un antígeno asociado a un tumor puede mejorar el índice terapéutico de la droga. Este anticuerpo debería reconocer idealmente un antígeno asociado a tumor (TAA) que es exclusivamente expresado en la superficie de las células tumorales. Esta estrategia permite el suministro del agente citotóxico al sitio del tumor mientras que se minimiza la exposición de los tejidos normales. El anticuerpo puede suministrar el agente citotóxico específicamente al tumor y por lo tanto reducir la toxicidad sistémica.
Los conjugados de drogas desarrollados para farmacoterapia sistémica son agentes citotóxicos específicos a objetivo. El concepto involucra acoplar un agente terapéutico a una molécula portadora con especificidad para una población de células objetivo definidas. Los anticuerpos con una alta afinidad para os antígenos son una escogencia natural como partes de focalización. Con la disponibilidad de los anticuerpos monoclonales de alta afinidad, los prospectos de terapéuticos de focalización en anticuerpo se han convertido en promisorios. Las sustancias tóxicas que han sido conjugadas a anticuerpos monoclonales incluyen toxinas, drogas hercitotóxicas de bajo peso molecular, modificadores de respuestas biológicas, y radionuclidos. Los conjugados anticuerpo-toxina son llamados frecuentemente inmunotoxinas, mientras que los inmunoconjugados que consisten de anticuerpos y de drogas de bajo peso molecular tales como el metotrexato y la adriamicina son llamados quimioinmunoconjugados. Los inmunomoduladores contienen modificadores de respuesta biológica que son conocidos como que tienen funciones regulatorias, tales como linfocinas, factores de crecimiento, y factor del veneno de cobra activado por complemento (CVF). Los radioinmunoconjugados consisten de isótopos radioactivos, que pueden ser usados como terapéuticos para matar las células por su radiación o uso de imagen. El suministro específico mediado por anticuerpo de drogas citotóxicas a células tumorales es esperado que no solamente aumente su eficacia antitumor, sino que también impida la toma no focalizada para tejidos normales, incrementando así sus índices terapéuticos.
Los inmunoconjugados que usan un miembro de la familia potente de agentes antibacterianos y antitumor, conocidos colectivamente como calicheamicinas o el complejo LL-E33288, fueron desarrollados para usarse en el tratamiento de los canceres. La más potente de las calicheamicinas es designada como µi1, que es referida aquí simplemente como gama. Estos compuestos contienen metiltrisulfuro que puede hacerse reaccionar con tioles apropiados para formar disulfuros, al mismo tiempo se introduce un grupo funcional tal como una hidracida u otro grupo funcional que es útil para sujetar un derivado de calicheamicina a un portador. Las calicheamicinas contienen una cabeza de batalla enediyna que es activada por la reducción del enlace -S-S-que causa rupturas en el ADN del doble hélice.
MYLOTARG®, también llamado como CMA-676 o CMA, es la única comercialmente disponible que trabaja de acuerdo con este principio. El MYLOTARG® (gemtuzumab ozogamicin) es actualmente aprobado para el tratamiento de leucemia mieloide aguda en pacientes de edad avanzada. La droga consiste en un anticuerpo contra el CD33 que es ligado a la calicheamicina por medio de un enlazador hidrolizable ácido. El análogo de disulfuro de la N-acetil gama calicheamicina semisintética fue usada para la conjugación (Patentes Estadounidenses Nos. 5,606,040 y 5,770,710, que son incorporadas aquí en su totalidad). Esta molécula, de hidracida de N-acetil gama calicamecin dimetilo, se llama de aquí en adelante abreviadamente como CM.
El uso citotoxinas focalizadas en el desarrollo de terapias para un amplia variedad de canceres ha sido limitada tanto por la disponibilidad de agentes de focalización específicos (portadores), como también de metodologías de conjugación que resultan en la formación de agregados de proteína cuando la cantidad del derivado de calicheamicina que es conjugada al portador (es decir la carga de la droga) es incrementada. Por ejemplo, aunque la calicheamicina es un quimioterapútico potente con un índice terapéutico bajo, esta requiere focalizar a las células del tumor para su uso en la clínica. La dependencia de esta estrategia de focalización sobre la expresión del antígeno específico por las células del tumor (objetivación activa) estrecha su rango de aplicación. Consecuentemente, existe una necesidad de dislumbrar métodos nuevos y mejorados para administrar citotoxinas por ejemplo, calicheamicina, conjugada a anticuerpos.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 demuestra la inhibición del crecimiento del CD33 negativo (CD33") como senoinjertos de carcinoma epidermoide por hp67.6-AcBut-CalichDMH como un gráfico de volumen de tumor (mm3) contra período de crecimiento de tumor (días); la Figura 1A Muestra la calicheamicina conjugada con un enlazador de AcBut de ácido lábil al hp67.6, la Figura 1 B muestra la calicheamicina conjugada con un enlazador de amina de ácido estabile al hp67.6, y la Figura 1C muestra la calicheamicina libre como un control. Los símbolos representan los volúmenes de tumor promedio de 10 (tratamiento PBS) o 5 animales (tratamientos con calicheamicina o conjugado), mientras que las barras de error indican la desviación estándar. Todos los grupos de ratones recibieron un régimen de una dosis por ratón, dada tres veces intraperitonealmente con un intervalo de 4 días (Q4Dx3). El número entre paréntesis en las leyendas de la figura indica la cantidad de calicheamicina (µg/ratón) dada en una dosis única como droga libre o en forma conjugada.
La Figura 2 demuestra la distribución del hp67.6 AcBut-CalichDMH marcado con 125l como una función del tiempo en ratones que tienen el tumor CD33"; La figura 2A muestra el tumor, la Figura 2B muestra sangre, la Figura 2C muestra hígado, la Figura 2D muestra cerebro, la Figura 2E muestra piel, La Figura 2F Muestra vaso, La Figura 2G muestra músculo estriado, La Figura 2H mustra pulmón, La Figura 21 muestra riñon, la Figura 2J muestra corazón y La Figura 2K muestra intestino. Las cantidades de hp67.6-AcBut-CalichDMH en los diversos tejidos normal y de tumor (A431) como seno injertos son presentados en relación con la cantidad de conjugado en la sangre total (círculos abiertos, eje Y1, %sangre) o ia cantidad inyectada (círculos cerrados, eje Y2, %ID/g). Todos los puntos de datos reflejan la media de 5 muestras, mientras que las barras de error indican las desviaciones estándar.
La Figura 3 demuestra la inhibición del crecimiento de tumor por focalización pasiva de la calicheamicina usando hp67.6, g5/44 y rituximab como portadores; La Figura 3A muestra los seno injertos hp67.6-AcBut-CalichDMH y rituximab-AcBut-CalichDMH contra N87; La figura 3B muestra g5/44-AcBut-CalichDMH y hp67.6-AcBut-CalichDMH contra N87, y la Figura 3C muestra g5/44-AcBut-CalichDMH y hp67.6-AcBut-CalichDMH contra MDAMB435/5T4. Todos los grupos de ratones tratados con el conjugado recibieron un régimen de una dosis de 4µg CalichDMH por ratón, dada tres veces ¡ntraperitonialmente con un intervalo de 4 días (Q4Dx3). Cada punto representa el promedio de n medidas de tumor (ver las leyendas), mientras que las barras de error reflejan la desviación estándar.
La Figura 4 demuestra la inhibición de crecimiento de tumor por conjugados de calicheamicina de HSA, Fe PEGylado hp67.6. La influencia del MOPC-21- AcPAc-CalichDMH (Figura 4A) sobre el crecimiento de seno injertos A431 fue comparada con aquella de HSA- AcPAc-CalichDMH (Figura 4B). Cada punto representa el volumen de tumor promedio de 5 (tratamientos conjugado) o 10 (PBS) seno injertos. Todos los grupos de ratones recibieron un régimen de una dosis por ratón dada tres veces intraperitonialmente con un intervalo de 4 días (Q4Dx3). El número entre paréntesis en las leyendas de la figura indica la cantidad de calicheamicina (µg/ratón) dada en una dosis única. La Figura 4C, la inhibición del crecimiento del seno injerto A431 por los conjugados de calicheamicina de fragmentos Fe PEGylados fue comparada con aquella del hp67.6-AcBut-CalichDMH. Cada punto representa el volumen promedio de tumor de 5 (tratamientos de conjugado) o 10 seno injertos (PBS). La eficacia de los conjugados de calicheamicina de hp67.6-AcBut-CalichDMH y la forma PEGylada del anticuerpo (hp67.6PEGB) también se muestra contra los seno injertos de tumor N87 (Fig.4D). Cada punto representa el promedio de volúmenes de tumor para grupos de 10 ratones con PBS o hp67.6-AcBut-Ca!ichDMH y el promedio de 7 para el grupo de ratones tratados con hp67.6-AcBut-Ca!ichDMH. En las Figuras 4C y 4D, todos los grupos de ratones tratados con el conjugado recibieron el régimen de una dosis de 4µg CalichDMH por ratón, dada 3 veces intraperitonialmente con un intervalo de 4 días (Q4Dx3). Las barras de error en todos los paneles refleja la desviación estándar.
La Figura 5 demuestra la inhibición del crecimiento de tumor por focalización pasiva de la calicheamicina que se correlaciona con la sensibilidad de las células tumorales a la calicheamicina in vitro. La sensibilidad de las líneas celulares de tumor (eje X, Figuras 5A y 5B) a la calicheamicina es presentada como el valor Ed50 de cada CalichDMH (ejes Y1 , Figura 5A) o hp67.6-AcBut-CalichDMH (eje Y1 , Figura 5B). La altura de cada barra refleja la mediana de por lo menos 3 determinaciones independientes de ED50. La sensibilidad de los seno injertos de tumor al hp67.6-AcBut-CalichDMH es expresada como T/Cm¡n (ejes Y2, Figuras 5A y 5B). Los valores T/Cmin (diamantes negros, curva de regresión exponencial en rayas) son determinaciones obtenidas de un experimento único (A431/Ley, PC3MM2, KB 8.5, HT29) o la mediana de múltiplex experimentos (N87 [n=6], PC14PE6 [n=3], LOVO [n=3], L2987 [n=2], MDAMB435/5T4 [n=2], A431 [n=3], LNCaP [n=2]). Todos los valores T/Cmin" para hp67.6-AcBut-CalichDMH fueron determinados siguiendo el tratamiento con un régimen de una dosis de 4µg hp67.CalichDMH por ratón, dada 3 veces intraperitonialmente con un intervalo de 4 días (4QDx3).
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención suministra un método para tratar células cancerosas que comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad terapéuticamente efectiva de un conjugado de anticuerpo no específico a una citotoxina, en donde las células cancerosas no expresan un antígeno al cual el anticuerpo no específico se liga. En una modalidad, el anticuerpo no específico es un anticuerpo anti-CD33 (por ejemplo, hp67.6) y las células cancerosas no expresan CD33, un anticuerpo anti-CD22 (por ejemplo, g5/44) y las células cancerosas no expresan el CD22, un anticuerpo anti-CD20 (por ejemplo, rituximab) y las células cancerosas no expresan CD20. En otra modalidad, el anticuerpo no específico no se liga al antígeno humano. Las células cancerosas tratadas pueden ser, por ejemplo, carcinoma gástrico, carcinoma de colon, carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), carcinoma de pecho, carcinoma epidermoide, o células de carcinoma de próstata.
En una modalidad de los presentes métodos, la citotoxina es calicheamicina. La calicheamicina puede ser conjugada al anticuerpo no específico usando un ácido 4-(4'-acetilfenoxi) butanóico (AcBut) o un enlazador de ácido (3-Acetilfenil) acético (AcPAc).
En otra modalidad, el anticuerpo al antígeno no específico conjugado a una citotoxina es administrado en combinación con una agente bioactivo, por ejemplo, un agente anti-cáncer.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente solicitud se relaciona con la habilidad de los conjugados de citotoxina-anticuerpo que causan una regresión de tumor en diversos tumores humanos. Estos tumores no muestran cantidades detectables del antígeno reconocido por el anticuerpo. Así, este tratamiento es referido como focalización pasiva. En la focalización pasiva, un conjugado de un anticuerpo no específico y una citotoxina se acumulan en un tumor humano en la ausencia de cantidades detectables del antígeno focalizado. Por lo tanto, la focalización pasiva de la calicheamicina, por ejemplo, por medio de un portador de anticuerpo o ¡nmunoglobulina es una estrategia potencial para administrar de manera segura una cantidad terapéuticamente efectiva de calicheamicina.
Una estrategia de focalización pasiva puede estar basada en la permeabilidad mejorada y el efecto de retención (EPR) de un tumor. Aunque no se tiene el propósito de estar limitado a cualquier método particular de acción, este efecto puede permitir la acumulación de partículas o de macromoléculas solubles en agua en un tumor porque la fugabilidad del endotelio fenestrado de sus vasos sanguíneos combinado con un drenaje linfático inadecuado.
La focalización pasiva de los conjugados de calicheamicina producen beneficios terapéuticos en una variedad de tumores humanos. Las características moleculares de la molécula IgG y el uso de un enlazador lábil de ácido puede ser de importancia para permitir la eficacia por la focalización pasiva. Los conjugados de calicheamicina designados para la focalización pasiva pueden probar ser activos clínicos en suministro focalizado cuando los tumores no expresan el antígeno asociado al tumor o cuando las expresiones extratu morales de estos antígenos impiden el uso de conjugado de calicheamicina focalizado activamente.
Los agentes terapéuticos adecuados para el uso en la presente invención son drogas citotóxicas que inhiben o rompen la polimerización de tubulina, agentes alquilantes que ligan a y rompen el ADN, y agentes que inhiben la síntesis de proteína o las proteínas celulares esenciales tales como las kinazas de proteína, enzimas y ciclinas. Ejemplos de tales drogas citotóxicas incluyen, pero no se limitan a thiotepa, taxanos, vincristina, daunorubicina, doxorubicina, epirubicina, actinomycina, authramycina, azaserinas, bleomicinas, tamoxifen, idarubicina, dolastatinas/auristatinas, hemiasterlinas, esperamicinas and maitansinoides.
Las drogas citotóxicas preferidas son las calicheamicinas, que son un ejemplo de los antibióticos antitumorales de trisulfuro de metilo. Como se discutió previamente, la calicheamicina se refiere a una familia de agentes antibacteriales y antitumor, como se describió en la Patente Estadounidense No.4,970, 98 (ver también Patente Estadounidense No. 5,108,912, ambas se incorporan aquí en su totalidad). En una modalidad preferida del presente proceso, la calicheamicina es un derivado N-acilo de calicheamicina o un análogo de disulfuro de calicheamicina. Los derivados dihidro de estos compuestos son descritos en la patente estadounidense No. 5,037,651 y los derivados N-acilados están descritos en la Patente Estadounidense No. 5,079,233, ambos se incorporan aquí en su totalidad. Los compuestos relacionados, que son también útiles en esta invención, incluyen las esperamicinas, descritas en las patentes estadounidenses Nos. 4,675,187; 4,539,203; 4,554,162; y 4,837,206, todas de las cuales se incorporan aquí como en su totalidad. Todos de estos compuestos contienen un trisulfuro de metilo que puede hacerse reaccionar con tioles apropiados para formar disulfuros, al mismo tiempo introducir un grupo funcional tal como una hidracida o un nucleófilo similar. Dos compuestos que son útiles en la presente invención se han descrito en la patente Estadounidense No. 5,053,394, y se muestran en la Tabla 1 de la Patente Estadounidense No. 5,877,296, hidracida de gama dimetilo e hidracida de N-acetil gama dimetilo. Toda la información en las citaciones de patentes antes mencionadas se incorpora aquí como referencia.
Preferiblemente, en el contexto de la presente invención, la calicheamicina es hidracida de N-acetil gama calicheamicina dimetilo (N-acetil calicamicin DMH). N-acetil calicamicin DMH es por lo menos 10 a 100 veces más potente que la mayoría de agentes quimioterapéuticos citotóxicos de uso actual. Su alta potencia lo hace un candidato ideal para la terapia focalizada en anticuerpo, maximizando así la actividad ántitumor mientras que se reduce la exposición no específica de órganos y tejidos normales.
Así, en una modalidad, los conjugados de la presente invención tienen la fórmula: Pr(-X— W)m En donde: Pr es un anticuerpo; X es un enlazador que comprende un producto de cualquier grupo reactivo que pueda reaccionar con el anticuerpo; W es una droga citotóxica de la familia de la calicheamicina. m es la carga promedio para un producto de conjugación purificado tal que la calicheamicina constituye 3 a 9% del conjugado en peso; y (-X-W)m es un derivado de droga citotóxica Preferiblemente, X tiene la fórmula (CO - Alk1 - Sp1 - Ar - Sp2 - Alk2 - C(Z1) = Q - Sp) en donde Alk1 y Alk2 son independientemente un enlace o una cadena de Alquileno con (C1-C10) ramificada o no ramificada; Sp1 es un enlace, -S-, -O-, -CONH-, -NHCO-, -NR-, -N(CH2CH2)2N-, o -X-Ar-Y- (CH2)p-Z en donde X, Y, y Z son independientemente un enlace, -NR-, -S-, o -O-, con la condición de que cuando n = 0, entonces por lo menos uno de Y y Z debe ser un enlace y Ar es 1 ,2-, 1 ,3-, o 1 ,4-fenileno opcionalmente sustituido con uno, dos, o tres grupos de alquilo (C1-C5) alkyl, (C1-C4) alcoxi, (C-1-C4) tioalkoxiico, halógeno, nitro, -COOR, -CONHR, - (CH2)nCOOR, -S(CH2)nCOOR, -O(CH2)nCONHR, o -S(CH2)nCONHR, con la condición de que cuando Alk1 es un enlace, Sp1 es un enlace; n es un entero entre O a 5; R es una cadena ramificada o no ramificada de (C1-C5) opcionalmente sustituida por uno o dos grupos de -OH, alcoxi (C1-C4) tioalcoxi (C-1-C4), halógeno, nitro, dialquilamino con(C-?-C3), o trialquilamonio de-A" con (C1-C3) en donde A" es un anión farmacéuticamente aceptable que completa un sal; Ar es 1 ,2-, 1 ,3-, o 1 ,4-fenileno opcionalmente sustituido con uno, dos o tres grupos entre alquilo (C-I-CT), alcoxi (C1-C5), tioalcoxi (C1-C4), halógeno, nitro, -COOR, - CONHR, -O(CH2)nCOOR, -S(CH2)nCOOR, -O(CH2)nCONHR, o - S(CH2)nCONHR en donde n y R son como se definió aquí anteriormente o 1 ,2-, 1 ,3-, 1 ,4-, 1 ,5-, 1 ,6-, 1 ,7-, 1 ,8-, 2,3-, 2,6-, o 2,7-naftilideno o Con cada naftilideno o fenotiazina opcionalmente sustituida con uno, dos, tres o cuatro grupos de alquilo (C Ce), alcoxi(C?-C5), tioalcoxi (C1-C4), halógeno, nitro, -COOR, -CONHR, -O(CH2)nCOOR, -S(CH2)nCOOR, o -S(CH2)nCONHR en donde n y R son como se definió anteriormente, con la condición de que cuando Ar es fenotiazina, Sp1 es un enlace conectado solamente a nitrógeno; Sp2 es un enlace, -S-, o -O-, con la condición que cuando Alq2 es un enlace, Sp2 es un enlace; Z1 es H, alquilo (C1-C5), o fenilo opcionalmente sustituido con uno, dos o tres grupos entre alquilo (C1-C5), alcox C Cs), tioalcoxi (C1-C4), halógeno, nitro, -COOR, - ONHR, -O(CH2)nCOOR, -S(CH2)nCOOR, -O(CH2)nCONHR, o -S(CH2)nCONHR en donde n y R son como se definió anteriormente; Sp es una cadena ramificada de radical divalente o trivalente con (C-i-ds) radical, divalente o trivalente arilo o radical heteroarilo, cicloalquilo radical con(C3- C18) divalente o trivalente o heterocicloalquilo radical, aril- o heteroaril-aril con radical (C-i-Cis) divalente o trivalente, cicloalquilo- o heterocicloalquilo-alquilo (C-i- C18) de radical divalente o trivalente o radical alquilo no saturado con (C2-C?s) divalente o trivalente, cuando el heteroarilo es preferiblemente furilo, ttienilo, N-metilpirrolilo, piridinilo, N-metilimidazolilo, oxazolilo, pirimidinilo, quinolilo, isoquinolilo, N-metilcarbazoilo, aminocourmarinilo, o fenazinilo y en donde si Sp es un radical trivalente, Sp puede ser adicionalmente sustituido por dialquilamino con (C1-C5) menor, alcoxi, hidroxi, o grupos alquiltio con (C1-C5) inferior; y Q es =NHNCO-, =NHNCS-, =NHNCONH-, =NHNCSNH-, o =NHO-.
Preferiblemente, Alq1 es una cadena de alquileno con (C1-C10) ramificada o no ramificada; Sp es un enlace -S-, -0-, -CONH-, -NHCO-, o -NR en donde R es según se definió anteriormente, con la condición en que cuando Alq1 es un enlace, Sp1 es un enlace; Ar es 1 ,2-, 1 ,3-, o 1 ,4-fenileno sustituido opcionalmente con uno, dos o tres grupos de alquilo con (C-i-Cß), alcoxi (C C5), tioalcoxi (C1-C4), halógeno, nitro, -COOR, - CONHR, -O(CH2)nCOOR, -S(CH2)nCOOR, -O(CH2)nCONHR, o -S(CH2)nCONHR en donde n y R son como se definió anteriormente, o Ar es un 1 ,2-, 1 ,3-, 1 ,4-, 1 ,5-, 1 ,6-, 1 ,7-, 1 ,8-, 2,3-, 2,6-, o 2,7- naftilideno cada uno opcionalmente sustituido con uno, dos, tres, o cuatro grupos de alquilo (C?-C6), alcoxi (CrC5), tioalcoxi (C C4), halógeno, nitro, -COOR, - CONHR, -O(CH2)nCOOR, -S(CH2)nCOOR, -O(CH2)nCONHR, o -S(CH2)nCONHR.
Z1 es alquilo (C-pCs), o fenil sustituido opcionalmente con uno, dos o tres grupos de alquilo (C-pCs), alcoxi (C1-C4), tioalcoxi (C1-C4), halógeno, nitro, -COOR, -CONHR, -O(CH2)nCOOR, -S(CH2)nCOOR, -O(CH2)nCONHR, o -S(CH2)nCONHR.
Alq2 y Sp2 son juntos un enlace.
Sp y Q son como se definió inmediatamente anterior.
En una modalidad, los conjugados de la presente invención utilizan la droga citotóxica de calicheamicina derivada con un enlazador que incluye cualquier grupo reactivo que reacciona con un anticuerpo, que es usado como un agente focalizado de portador proteináceo para formar un conjugado de derivado de droga citotóxica-anticuerpo. Las Patentes Estadounidenses Nos. 5,773,001; 5,739,116 y 5,877,296, incorporados aquí en su totalidad, describen enlazadores que pueden ser usados con derivados nucleofílicos, particularmente hidracinas y nucleófilos relacionados, preparados a partir de las calicheamicinas. Estos enlazadores son especialmente útiles en aquellos casos en donde una mejor actividad es obtenida cuando el enlace formado entre la droga y el enlazador es hidrolizable. Estos enlazadores contienen dos grupos funcionales. Un grupo típicamente es un ácido carboxílico que es utilizado para reaccionar con el portador. El grupo funcional ácido, cuando es activado apropiadamente, puede formar un enlace de amida con un grupo amina libre del portador, de modo que, por ejemplo, la amina en la cadena lateral de una lisina de un anticuerpo otro portador proteináceo. El otro grupo funcional comúnmente es un grupo carbonilo, es decir, un aldehido o una acetona, que reaccionará con el agente terapéutico modificado apropiadamente. Los grupos carbonilo pueden reaccionar con un grupo hidracida sobre la droga para formar un enlace hidrazona. Este enlace es hidrolizable (específicamente, el enlazador es ácido lábil), permitiendo la liberación del agente terapéutico del conjugado después del ligado a las células objetivo. Preferiblemente, el enlazador hidrolizable es ácido 4-(4-acetilfenoxi) ácido butanóico (AcBut) o ácido (3-acetilfenil) acético (AcPAc).
Aparte de la función portador de la inmunoglobulina, el uso de un enlazador de ácido lábil es relevante a la eficacia del conjugado de calicheamicina. Aunque no se desea estar sujeto por cualquier teoría en particular o mecanismo de acción en particular, después de acumular el conjugado de calicheamicina en el tumor, el ambiente acídico pericelular puede ser responsable de la liberación de la calicheamicina. Este mecanismo puede estar relacionado con el hecho de que los efectos oncolíticos del conjugado de calicheamicina in vivo fueron congruentes con la sensibilidad de las células tumorales a la calicheamicina in vitro. Adicionalmente, la pinocitosis puede también estar relacionada a un mecanismo para la incorporación del conjugado de calicheamicina. Sin embargo, ya que un enlazador de ácido estábil fue inefectivo en la ausencia de un antígeno focalizado, esta contribución puede ser menos relevante.
Los anticuerpos de la presente invención son anticuerpos no específicos. Tales anticuerpos son específicos para un antígeno que no está presente sobre las células tumorales a las cuales el conjugado citotóxico es administrado. Cualquier método conocido puede ser usado para determinar la presencia o ausencia de un antígeno de las células tumorales, tal como el análisis FACS o BIAcore como por ejemplo. Por medio de sustituir inmunoglobulina en el conjugado por otras macromoléculas, las características del portador fueron identificadas subyacente a la actividad terapéutica del conjugado de calicheamicina. Ejemplos de portadores generalmente adecuado para la focalización activa son los liposomas, albúmina, textran o polímeros de polietilen glicol (PEG). Consistente con el hallazgo de que la acumulación de inmunoglobulina en tumores injertados no era más pronunciada que la acumulación de albúmina, el anticuerpo no podría ser ni reemplazado por albúmina ni por fragmentos Fe PEGilados sin la reducción o pérdida de la eficacia del conjugado.
Ejemplos de anticuerpos que pueden ser usados en la presente invención incluyen los anticuerpos monoclonales (mAbs), por ejemplo, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos primatizados, anticuerpos resuperficializados, anticuerpos humanos y fragmentos biológicamente activos de los mismos, sin importar la especificidad, isotipo o punto isoeléctrico. El término anticuerpo, como se usa aquí, a menos que indique de otra manera, es usado ampliamente para referirse tanto a moléculas de anticuerpo y una variedad de moléculas derivadas del anticuerpo. Tales moléculas derivadas del anticuerpo comprenden por lo menos una región variable (sea una región variable de cadena pesada o cadena liviana) e incluye moléculas tales como fragmentos Fab, F(ab')2, fragmentos Fd, fragmentos Fabc, anticuerpos Se (anticuerpos de cadena única), diacuerpos, cadenas únicas livianas de anticuerpos individuales, cadenas pesadas de anticuerpo individuales, fusiones quiméricas entre cadenas de anticuerpo y otras moléculas, y similares.
Preferiblemente, los anticuerpos usados en la presente invención son una inmunoglobulina de competencia que tiene dos cadenas pesadas y dos cadenas livianas. Por ejemplo, la masa molecular y la estructura de proteína general de la molécula IgG puede ser necesaria para focalizar suficientes cantidades de calicheamicina al tumor sin causar la letalidad en los ratones.
Los anticuerpos de la presente invención pueden ser específicos para cualquier TAA, incluyendo por ejemplo, CD22, CD33, HER2/neu; EGFR; PSMA; PSCA; MIRACL-26457; CEA; Lewis Y (Ley) o 5T4. Los anticuerpos ilustrativos incluyen el hp67.6 y g5/44, que son anticuerpos lgG4 humanizados que reconocen específicamente el CD33 o CD22, respectivamente (ver Patente Estadounidense No. 5,773,001 y las solicitudes Estadounidenses Nos. 2004/0082764A1el, y 2004/01929000 A1 , que se incorporan aquí en su totalidad). El RITUXAN (rituximab)(IDEC Pharmaceuticals Corporation and Genentech), que es un anticuerpo lgG1-k quimérico que reconoce el CD20, también es un anticuerpo ilustrativo. Otro ejemplo es un anticuerpo anti-Lewis Y designado hu3S193 (ver Patentes Estadounidenses Nos. 6,310,185; 6,518,415; 5,874,060, que se incorporan aquí en su totalidad) o, alternativamente, el G193, que es descrito en la solicitud copendiente titulada "conjugados de calicheamicina" (AM101462). Como los TAAs son productos raramente exclusivos de células tumorales y de expresión de estos antígenos (por ejemplo, Ley, EGFR, o Her2/neu) en tejidos normales pueden colocar dosis terapéuticas que limiten la toxicidad para los conjugados de calicheamicina que reconozcan estos antígenos usando un conjugado de calicheamicina con un anticuerpo portador que falla en reconocer cualquier antígeno humano que podría sobrepasar este problema.
Los anticuerpos del objeto de la invención pueden ser producidos por una variedad de métodos útiles para la producción de polipéptidos, por ejemplo síntesis in vitro, producción de ADN recombinante y similares. Preferiblemente, los anticuerpos son producidos por la tecnología de ADN recombinante y los métodos de expresión de proteínas. Las técnicas para la manipulación de ADN (por ejemplo, polinucleótidos) son bien conocidos a la persona basada en la técnica de la biología molecular. Ejemplos de tales técnicas bien conocidas pueden encontrarse en Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Edition, Sambrook et al, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989). Las técnicas para la expresión recombinante de las inmunoglobulinas incluyen inmunoglobulinas humanizadas, también pueden ser encontradas, entre otros lugares en Goeddel et al, Gene Expression Technology Methods in Enzymology, Vol. 185, Academic Press (1991), y Borreback, Antibody Engineering, W. H. Freeman (1992). Información adicional relacionada con la generación, diseño y expresión de anticuerpos recombinantes pueden encontrarse en Mayforth, Designing Antibodies, Academic Press, San Diego (1993). Ejemplos de técnicas de biología molecular convencionales incluyen, pero no se limitan a, ligación in vitro, digestión de endonucleasa por restricción, PCR, transformación celular, hibridación, electroforesis, secuenciamiento de ADN, y similares.
Los métodos generales para la construcción de vectores, transfección de células a células anfitrionas producidas, cultivo de células para producir anticuerpos son todos métodos de biología molecular convencionales. Similarmente, una vez producidos, los anticuerpos recombinantes pueden ser purificados por procedimientos estándar de la técnica, incluyendo filtración de flujo cruzado, precipitación de sulfato de amonio, cromatografía de columna de afinidad, electroforesis de gel, diafiltración y similares. Las células anfitrionas usadas para expresar el anticuerpo recombinante puede ser una célula bacteriana, tal como el E.coli, o preferiblemente una célula eucariótica. Preferiblemente, células de mamíferos tales como la célula PER.C.6 o una célula de ovario de hámster chino (CHO) es usada. La escogencia del vector de expresión es dependiente de la escogencia de la célula anfitriona, y se selecciona de modo que tenga la expresión deseada y las características regulatorias en la célula seleccionada.
Preferiblemente, los conjugados usados en los métodos presentes mantienen las cinéticas de ligado y especificidad del anticuerpo desnudo.
Cualquier método conocido puede ser usado para determinar las cinéticas de ligado y la especificidad del conjugado, tal como el análisis FACS o el BIAcore, por ejemplo.
Los anticuerpos no específicos pueden ser usados en conjunto con, o unidos a otros anticuerpos (o partes de ellos) tal como anticuerpos monoclonales humanos o humanizados. Estos otros anticuerpos pueden ser reactivos con otros marcadores (epítopes) característicos para la enfermedad contra la cual los anticuerpos de la invención son dirigidos o pueden tener diferentes especificidades escogidas, por ejemplo, para reclutar, moléculas o células del sistema inmune humano para las células enfermas. Los anticuerpos de la invención (o partes de ellos) pueden ser administrados con tales anticuerpos (o partes de ellos) como composiciones administradas separadamente o como una composición única con los dos agentes enlazados por métodos químicos convencionales o biológicos moleculares. Adicionalmente, el valor de diagnóstico y terapéutico de los anticuerpos de la invención puede ser aumentado por medio de marcar los anticuerpos humanizados con marcadores que producen una señal detectable (sea in vitro o in vivo) o con un marcador que tenga un propiedad terapéutica. Algunos marcadores, por ejemplo, radionúclidos pueden producir una señal detectable y tienen una propiedad terapéutica. Ejemplos de marcadores de radionúclido incluyen el 25l, 131l, 14C. Ejemplos de otros marcadores detectables incluyen un cromoforo fluorescente, tal como la fluoresceína, la ficobiliproteína o la rodamina de tetraetilo para la microscopía de fluorescencia, una enzima que produce un producto fluorescente o coloreado para ser detectado por fluorescencia, color de absorbancia visible o aglutinación, lo que produce un producto denso en electrones para la demostración por microscopía de electrones; o una molécula densa en electrones tal como la ferritina, la peroxidasa, o bolitas de oro para la visualización directa o indirecta microscópica de electrón. Los marcadores tienen propiedades terapéuticas que incluyen drogas para el tratamiento del cáncer, tal como el metotrexato y similares.
Los conjugados usados en los presentes métodos pueden ser el ingrediente único activo en la composición/formulación terapéutica o de diagnóstico o pueden estar acompañados por otros ingredientes activos (por ejemplo, agentes de quimioterapia, agentes de terapia de hormonas, o agentes de terapia biológica como se describe más adelante), incluyendo otros ingredientes de anticuerpo, por ejemplo, anticuerpos anti-CD19, anti-CD20, anti-CD33, anti-célula T, anti-IFN? o anti-LPS, o ingredientes no anticuerpo tales como citocinas, factores de crecimiento, hormonas, anti-hormonas, drogas citotóxicas y xantinas.
Estas composiciones/formulaciones pueden ser administradas a los pacientes para el tratamiento del cáncer. De acuerdo con la presente invención, una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo no específico conjugado a una citotoxina es administrado a un paciente que lo necesita. Alternativamente, la composición o formulación es usada para fabricar un medicamento para el tratamiento del cáncer. Debería apreciarse que este método o medicamento puede ser usado para tratar cualquier paciente con células cancerosas que no expresen el antígeno al cual los anticuerpos no específicos se ligan. Puede sin embargo haber una correlación entre la eficacia del tratamiento y la sensibilidad de las células cancerosas para la calícheamicina. En una modalidad, el cáncer tratado es carcinoma gástrico, carcinoma de colón, carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), carcinoma de pecho, carcinoma epidermoide, o carcinoma de próstata.
Los presentes métodos de tratamiento pueden ser usados en combinación con otros tratamientos de cáncer, incluyendo cirugía, radiación, quimioterapia, terapia hormonal, terapias biológicas, trasplante de médula de hueso (para leucemias y otros cánceres en donde muy alta dosis de quimioterapia son necesarias). Nuevos tratamientos también son actualmente desarrollados y aprobados con base en un entendimiento incrementado de la biología de cáncer.
Dos clases generales de terapia de radiación existen y pueden ser usados en los presentes métodos. En una clase, braquioterapia, implantes dirigidos de un radioisótopo son colocados dentro del tumor para suministrar una dosis concentrada en esa área. En la otra clase, teleterapia, un rayo es usado para suministra radiación a un área grande del cuerpo o al cuerpo completo en irradiación de cuerpo total (TBI).
Cualquier agente quimioterapéutico adecuado puede ser usado en los presentes métodos. Estos agentes quimioterapéuticos generalmente caen en las siguientes clases (con ejemplos de cada uno): antimetabolitos (por ejemplo, antagonistas de ácido fólico tales como metotrexato, antagonistas de purina tales como 6-mercaptopurina (6-MP), y antagonistas de pirimidina tales como 5-fluoruracil (5-FU)); agentes alquilantes (ciclofosfamida); agentes de ligado al ADN (cisplatina o oxaliplatina); antibióticos anti-tumor (doxorubicina o mitoxantrona); inhibidores mitóticos (por ejemplo, los taxanos o inhibidores de microtubulo tales como la vincristina) o inhibidores de topoisomerasa (camptotecan o taxol). Ejemplos más específicos se describen adelante.
Las terapias hormonales relevantes a los presentes métodos incluyen, por ejemplo, corticosteroides para leucemias y mielomas, estrógenos y antiestrógenos para cánceres de pecho, y andrógenos y anti-andrógenos para cánceres de próstata.
La terapia biológica usa sustancias derivadas del cuerpo. Ejemplos de terapias adecuadas en los presentes métodos incluyen anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos anti-EGFR, tales como cetuximab o trastuzumab, o anticuerpos anti- VEGF, tales como bevacizumab), terapias de células T, interferonas, interleucinas, y factores de crecimiento hematopoiéticos.
El trasplante de médula de hueso puede ser usado para tratamiento en algunos cánceres, particularmente leucemias. Para tratar leucemias, las células de la médula del paciente son destruidas por quimioterapia o tratamiento de radiación. La médula de hueso de un donante que case o case cercanamente con los antígenos HLA de la superficie celular es entonces introducida en el paciente. El trasplante de médula de hueso también es usado para reemplazar la medula en pacientes que requieren dosis muy altas de radiación o quimioterapia para matar las células tumorales. Los trasplantes son clasificados con base en la fuente del dolor. En trasplantes alogenéicos, el dolor de médula no está frecuentemente relacionado genéticamente pero casa con por lo menos 5 de 6 antígenos de superficie celular que son la proteínas principales reconocidas por el sistema inmune (antígenos HLA). En el trasplante autólogo, los pacientes reciben su propia médula de nuevo después de tratamiento por quimioterapia o radiación. Este tipo de trasplante de médula de hueso puede ser usado para cánceres no relacionados con la médula para los cuales las dosis de tratamiento convencionales han sido incompletamente efectivas.
Adicionalmente, nuevas enseñanzas que emergen que pueden ser usadas en los presentes métodos, algunas de las cuales son aprobadas o están en ensayos clínicos, están siendo desarrolladas con base en un entendimiento incremental de las bases moleculares y celulares del cáncer y la progresión de la enfermedad. Los inhibidores de proteína de quinasa (tanto de moléculas pequeñas y anticuerpos) que inhiben la cascada de fosforilación pueden ser usados, (por ejemplo, erlotinib o mesilato de imatinib). Cualquier agente anti-metástasis puede ser usado de modo que bloquee el esparcimiento de de las células cancerosas y la invasión de nuevos tejidos. Agentes anti-angiogénesis pueden se usados para bloquear el desarrollo de vasos sanguíneos que nutran un tumor (por ejemplo, la talidomida) otros agentes que pueden ser usados son los oligonucleótidos antisentido, que bloquean la producción de proteínas aberrantes que causan la proliferación de células tumorales. La terapia de genes también ' puede ser usada para introducir genes en la células T que son inyectados dentro del paciente y son diseñados para matar células tumorales específicas. También, el p53 puede ser focalizado por medio de introducción normal de genes p53 en células de cáncer mutantes, por ejemplo, para reestablecer la sensibilidad a las drogas quimioterapéuticas.
En una modalidad, las composiciones/formulaciones de la presente invención son usadas en combinación con agentes bioactivos. Los agentes bioactivos comúnmente usados incluyen anticuerpos, factores de crecimiento, hormonas, citocinas, anti-hormonas, xantinas, interleucinas, ¡nterferonas, drogas citotóxicas y proteínas anti-angiogénicas.
Las drogas citotóxicas bioactivas comúnmente usadas para tratar desórdenes proliferativos tales como el cáncer, y que pueden ser usadas junto con los conjugados de calicheamicin-anticuerpo anti-Lewis Y incluyen: antraciclinas tales como doxorubicina, daunorubicina, idarubicina, aclarubicina, zorubicina, mitoxantrona, epirubicina, carubicina, nogalamicina, menogarii, pitarubicina, y valrubicina hasta durante tres días; la pirimidina o nucleósidos de purina tales como citarabina, gemcitabina, trifluridina, ancitabina, enocitabina, azacitidina, doxifluridina, pentostatina, broxuridina, capecitabina, cladribina, decitabina, floxuridina, fludarabina, gougerotina, puromicina, tegafur, tiazofurina; agentes alquilantes tales como ciclofosfamida, melfalan, tiotepa, ifosfamida, carmustina, cisplatina, CKD-602, ledoxantrona, rubitecan, clorhidrato de topotecan, LE-SN38, clorhidrato de afeletecan, XR-11576 y XR-11612; antimetabolitos tales como metotrexato, 5 flurouracil, tegafur/uracil (UFT), ralititrexado, capecitabina, leucovorin/UFT, S-1 , disodio pemetrexado, tezacitabina, glucuronato de trimetrexato, timectacina, decitabina; anticuerpos anti-tumor tales como edrecolomab, mitomicina, mitomicina C y oxaliplatina; alcaloides vinca tales como vincristina, vinblastina, vinorelbina, anhidrovinblastina; inhibidores de angiogénesis tales como succinato de vatalanib, oglufanida, RPI-4610; inhibidores de transducción de señal tales como gefitinib, 317615.2 HCl, indisulam, lapatinib, sorafenib, WHI-P131 ; inductores de apoptosis tales como clorhidrato de alvocidib, irofulven, fenilbutirato de sodio, bortezomib, exisulind, MS-2167; epipodofilotoxinas tales como etoposida; y taxanos tales como paclitaxel, doceltaxel, DHA-paclitaxel, ixabepilona, paclitaxel poliglutamato, o epotilonas.
Otros agentes quimioterapéuticos/antineoplásicos que pueden ser administrados en combinación con hu3S193-AcBut-CM o CMD-193 o AG G193-AcBut-CM incluyen adriamicina, cisplatina, carboplatina, ciclofosfamida, dacarbazina, ifosfamida, vindesina, gemcitabina, edatrexato, irinotecan, mecloretamina, altretamina, carboplatina, teniposida, topotecan, gemcitabina, tiotepa, fluxuridina (FUDR), MeCCNU, vinblastina, vincristina, mitoxantrona, bleomicina, mecloretamina, prednisona, metotrexato de procarbazina, flurouracilos, etoposida, taxol y sus varios análogos, mitomicina, talidomida y sus varios análogos, GBC-590, troxacitabina, ZYC-300, TAU, (R) flurbiprofen, clorhidrato de histamina, tariquidar, davanat-1 , ONT- 093. La administración puede ser concurrentemente con uno o más de estos agentes terapéuticos o, alternativamente, secuencialmente con uno o más de estos agentes terapéuticos.
Los anticuerpos bioactivos que pueden ser administrados con los conjugados de anticuerpo de la invención incluyen, pero no se limitan a Herceptina, Zevalin, Bexxar, Campat, cetuximab, bevacizumab, ABX-EGF, MDX-210, pertuzumab, trastuzumab, 1-131 ch-TNT-1/b, hLM609, 6H9, CEA-Cide Y90, IMC-1C11 , ING-1 , sibrotuzumab, TRAIL-R1 Mab, YMB-1003, 2C5, givarex y MH-L Los conjugados de calicheamicina- anticuerpo anti-Lewís Y pueden también ser administrados solos, concurrentemente, o secuencialmente con una combinación de otros agentes bioactivos tales como factores de crecimiento, citocinas, esteroides, anticuerpos tales como el anticuerpo anti- Lewis Y, rituximab y agentes quimioterapéuticos como parte de un régimen de tratamiento. Los conjugados de Calicheamicina-anticuerpo anti-Lewis Y pueden también ser suministrados solos concurrentemente, o secuencialmente con cualquiera de los regímenes de terapia identificados anteriores como una parte de fase de terapia de inducción, una fase de terapia de consolidación y una fase de terapia de mantenimiento.
Los conjugados de la presente invención también pueden ser administrados juntos o con otros agentes bioactivos o quimioterapéuticos como una parte de un régimen de quimioterapia de combinación para el tratamiento de carcinoma agresivo de recurrencia. Tal régimen de tratamiento incluye: CAP (Ciclofosfamida, Doxorubicina, Cisplatina), PV (Cisplatina, Vinblastina o vindesina), CE (Carboplatina, Etoposida), EP (Etoposida, Cisplatina), MVP (Mitomicina, Vinblastina o Vindesina, Cisplatina), PFL (Cisplatina, 5-FIurouracil, Leucovorina), IM (Ifosfamida, Mitomicina), IE (Ifosfamida, Etoposida); IP (Ifosfamida, Cisplatina); MIP (Mitomicina, Ifosfamida, Cisplatina), ICE (Ifosfamida, Carboplatina, Etoposida); PIE (Cisplatina, Ifosfamida, Etoposida); Viorelbina y Cisplatina; Carboplatina y Paclitaxel; CAV (Ciclofosfamida, Doxorubicina, Vincristina), CAE (Ciclofosfamida, Doxorubicina, Etoposida); CAVE (Ciclofosfamida, Doxorubicina, Vincristina, Etoposida); EP (Etoposida, Cisplatina); CMCcV (Ciclofosfamida, Metotrexato, Lomustina, Vincristina); CMF (Ciclofosfamida, Metotrexato, 5-Flurouracil); CAF (Ciclofosfamida, Doxorubicina, 5-Flurouracil); CEF (Ciclofosfamida, Epirubicina, 5-Flurouracil); CMFVP (Ciclofosfamida, Metotrexato, 5-Flurouracil, Vincristina, Prednisona); AC (Doxorubicina, Ciclofosfamida); VAT (Vinblastina, Doxorubicina, Tiotepa); VATH (Vinblastina, Doxorubicina, Tiotepa, Fluosimesterona); CDDP + VP-16 (Cisplatina, Etoposida, Mitomicina C + Vinblastina).
Debería apreciarse que en el contexto de la presente invención, tratar significa inhibir, prevenir, o disminuir el crecimiento del cáncer, incluyendo retardación del crecimiento de tumor e inhibición de la metástasis.
Las composiciones/formulaciones de la presente invención pueden ser administradas como una monoterapia de segunda línea. Por segunda línea se quiere dar a entender que las composiciones/formulaciones presentes son usadas después del tratamiento con un tratamiento anti-cáncer diferentes, ejemplos de los cuales se describieron anteriormente. Alternativamente, las composiciones o formulaciones pueden ser administradas como una terapia de combinación de primera línea con otro tratamiento anti-cáncer según se describió anteriormente.
Las composiciones de anticuerpo pueden ser administradas a un paciente en una variedad de vías. El suministro directo de las composiciones generalmente será llevado a cabo por inyección, subcutáneamente, intraperitonealmente, intravenosamente o intramuscularmente, o suministrados al espacio intersticial de un tejido. Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas pueden ser administradas parenteralmente, es decir, subcutáneamente, intramuscularmente o intravenosamente. Las composiciones también pueden ser administradas dentro de una lesión. El tratamiento de dosis puede ser un programa de dosis única o un programa de dosis múltiples.
La focalización pasiva de la calicheamicina puede ser menos eficaz que la focalización activa. Esta diferencia relativa se manifiesta en si misma por la duración más corta de la remisión del tumor y las dosis mayores necesarias para obtener la eficacia con un conjugado de calicheamicina que usa un mecanismo de focalización pasiva. Todavía, una estrategia de focalización pasiva puede en ciertas circunstancias ser indicada porque estas se sobreponen a la necesidad de la expresión homogénea o sobre expresión de un antígeno asociado al tumor. Sin embargo, la dosis tolerada máxima de un conjugado de calicheamicina diseñado para focalización pasiva puede ser mayor que para un conjugado de calicheamicina de focalización activa.
Una variedad de portadores acuosos pueden ser usados, por ejemplo, agua, agua amortiguada, 0.4% solución salina, 0.3% glicina y similares. Estas soluciones son estériles y generalmente libres de materias particuladas. Estas composiciones pueden ser esterilizadas por técnicas de esterilización convencionales bien conocidas. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para las condiciones fisiológicas aproximadas tales como ajuste de pH y agentes amortiguadores, agentes de ajuste de toxicidad y similares, por ejemplo acetato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, lactato de sodio. Las concentraciones de anticuerpo en estas formulaciones pueden variar ampliamente, por ejemplo, desde menos de cerca de 0.5%, usualmente hasta o por lo menos cerca de 1 % y tanto como 15 a 20% en peso y serán seleccionadas principalmente con base en los volúmenes de fluido y viscosidades, por ejemplo, de acuerdo con un modo particular de administración seleccionado.
Los métodos de la presente invención involucran la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un conjugado. El término cantidad terapéuticamente efectiva como se usa aquí se refiere a una cantidad de un agente terapéutico necesario para tratar, mejorar o impedir una enfermedad o condición focalizada, o para exhibir un efecto terapéutico o prevenible detectable. Para cualquier conjugado, la dosis terapéuticamente efectiva puede ser estimada inicialmente sea en ensayo de cultivo celular o en modelos animales, usualmente en roedores, conejos, perros, cerdos o primates. El modelo animal también puede ser usado para determinar el rango de concentración apropiado y la vía de administración. Tal información puede entonces ser usada para determinar las dosis útiles y vías de administración en humanos.
La cantidad efectiva precisa para un sujeto humano también dependerá de la naturaleza y severidad del estado de la enfermedad, la salud general del sujeto, la edad, el peso, el género del sujeto, la dieta, el tiempo y frecuencia de la administración, la combinación de drogas, las sensibilidades a la reacción y tolerancia/respuesta a la terapia. Si el conjugado está siendo usado profilácticamente para tratar una condición existente, esta también afectará la cantidad efectiva. Esta cantidad puede ser determinada por experimentación de rutina y está dentro del juzgamiento del médico. Generalmente, una dosis efectiva estará entre 0.01 mg/m2 hasta 50 mg/m2, preferiblemente 0.1 mg/m2 hasta 20 mg/m2, más preferiblemente cerca de 10 a 15 mg/m2 calculado sobre la base del portador proteináceo.
La frecuencia de la dosis dependerá de la vida promedio del conjugado y la duración de su efecto. Si el conjugado tiene una vida promedio corta (por ejemplo, de 2 a 10 horas) puede ser necesario dar una o más dosis por día. Alternativamente, si la molécula de conjugado tiene una vida promedio larga (por ejemplo, 2 a 15 días) puede se necesario solo dar una dosificación una vez por día, una vez por semana o aun una vez cada 1 o 2 meses.
Una composición también puede contener un vehículo farmacéuticamente aceptable para la administración del conjugado de anticuerpo. Un portador farmacéutico puede ser cualquier sustancia compatible no tóxica adecuada para suministrar los anticuerpos monoclonales al paciente. Agua estéril, alcohol, grasas, ceras y sólidos inertes pueden ser incluidos en el portador. El portador no debería por si mismo inducir la producción de anticuerpos dañinos al individuo que recibe la composición y no debería ser tóxico. Portadores adecuados pueden ser macromoléculas grandes, metabolizadas lentamente tales como proteína, polipéptidos, liposomas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, ácidos amino poliméricos, copolímeros de aminoácido, y partículas de virus inactivas. Los adyuvantes farmacéuticamente aceptados (agentes de amortiguación, agentes de dispersión) pueden también ser incorporados dentro de la composición farmacéutica.
Las sales farmacéuticamente aceptables que pueden ser usadas, por ejemplo, sales de ácido mineral, tales como clorohidratos, bromohidratos, fosfatos y sulfatos, o sales de ácidos orgánicos, tales como acetatos, propionatos, malonatos y benzoatos.
Los portadores farmacéuticamente aceptables en composiciones/formulaciones terapéuticas pueden contener adicionalmente líquidos tales como agua, salina, glicerol, y etanol. Las sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsificantes o sustancias amortiguadoras de pH, pueden estar presentes en tales composiciones. Tales portadores permiten a las composiciones ser formuladas como tabletas, pildoras, grajeas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones y pastas, para ingestión por parte del paciente.
Las formas preferidas para la administración incluyen formas adecuadas para administración parenteral, por ejemplo, por inyección o infusión, por ejemplo, por inyección de bolo o infusión continua. En donde el producto es para inyección o infusión, este puede tomar la forma de una suspensión, solución o emulsión en un vehículo aceitoso o acuoso y está puede contener los agentes formuladores, tales como agentes de suspensión, de preservación, estabilizadores y/o dispersantes.
Aunque la estabilidad de las soluciones conjugadas amortiguadas es adecuada para una estabilidad a corto tiempo, de largo término es pobre. Para mejorar la estabilidad del conjugado y para incrementar su vida en estante o almacenamiento, el conjugado anticuerpo-droga puede ser liofilizado a una forma seca, para su reconstitución antes del uso con un líquido estéril apropiado. Los problemas asociados con la liofilización de una solución de proteína son bien documentados. La pérdida de estructura secundaria, terciaria o cuaternaria puede ocurrir durante el congelamiento y el proceso de secado. Poner en contacto con un crioprotector, un tensoactivo, un agente de amortiguación, y un electrolito en una solución y luego liofilizar la solución puede preservar la actividad biológica de estas composiciones/formulaciones. Un lioprotector puede también ser agregado a la solución.
Los conjugados pueden ser administrados por cualquier número de vías incluyendo, pero sin limitarse a oral, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intramedularmente, intratecal, intraventricular, transdérmica, transcutánea (ver la Publicación PCT No.: WO98/20734), subcutánea, intraperitoneal, intranasal, enteral, tópica, sublingual, intravaginal o vías rectales. El hiporociado también puede ser usado para administrar las composiciones de la invención. Típicamente, la composición puede ser preparada como soluciones o suspensiones inyectables en líquido. Las formas sólidas adecuadas para solución en o suspensión en, vehículos líquidos antes de la inyección pueden también ser preparadas.
EJEMPLOS Ejemplo 1 : Materiales y Métodos Conjugados de Calicheamicina Los análogos de calicheamicina fueron conjugados en varias moléculas portadoras con ácido lábil o enlazadores de ácido estábil. El ácido lábil ácido 4-(4'-acetilfenox¡) butanoico(AcBut) o ácido (3-Acetilfenil) acético (AcPAc) permite la hidrólisis acida del grupo hidrazona y la reducción del disulfuro en los lisosomas. El ácido estábil ácido 4-mercapto-4-metil-pentanoico (Amida) permite solamente la disociación del grupo disulfuro. Los análogos de calicheamicina, N-acetil-?-calicheamicin dimetil hadrazida (CalichDMH) o ácido N-acetil-?-calicheamicin dimetilo (CalichDMA) fueron conjugados con enlazadores de ácido lábil o ácido estábil, respectivamente.
Células y condiciones de cultivo N87 (CRL-5822), HT29 (HTB-38), LOVO (CCL-229), A431 (CRL-1555) y LNCaP (CRL-1740) fueron comprados de la American Type Culture Collection (ATCC). Las líneas celulares obtenidas del ATCC fueron mantenidas en medio de cultivo como se específico en el catálogo ATCC. El L2987 fue un regalo del Dr. C. Siegall (Seattle Genetics, Bothell, WA). Estas células se hicieron crecer en RPMI 1640 suplementado con 10% de FBS, 2 mM de gln, 100 IU de penicilina y 100 µg de estreptomicina (llamada de aquí en adelante pen/estrep) y 0.05 mg de gentamicina. PC14PE6, PC3MM2 y MDAMB435 fueron obtenidos del Dr. I. Fidler (MD Anderson, Houston, TX). PC14PE6 y PC3MM2 fueron mantenidos en un medio mínimo esencial suplementado con 10% v/v de FBS, 2 mM de gln, 1 mM de piruvato de sodio, 0.2 mM de aminoácidos no esenciales, 2% de solución de vitamina MEM, y pen/estrep. Las células MDAMB435/5T4 y MDAMB435 que fueron transfectadas con un plásmido que codifica la proteína oncofetal, 5T4, y el marcador de resistencia a la neomicina. Estas células fueron cultivadas en un medio esencial mínimo con sales Earle suplementadas con 10% v/v de FBS, 2 mM de gln, 1 mM de piruvato de sodio, 0.2 mM de aminoácidos no esenciales, 2% de solución de vitamina MEM, y 50% pen/estrep y 1.5 mg/ml G418. El Dr. Scott A. (Ludwig Institute for Cáncer Research, Melbourne, Australia) suministra células A431/Ley y son variantes del Lewis Y positivo de A431. Estas fueron cultivadas en DMEM/F12 suplementadas con 10% v/v de FBS, 2 mM de gln y pen/estrep. Las células KB 8.5 fueron obtenidas del Dr. Shen y cultivadas en DMEM (alta glucosa) suplementadas con 20% v/v de FBS 2 mM de gln, 10 µM de piruvato de sodio, 10% de pen/estrep y 0.25 mM de colchicinas.
Anticuerpos y Conjugados El Hp67.6 y g5/44 son anticuerpos lgG4 humanizados que reconocen específicamente el CD33 o CD22 humanos, respectivamente. Rituxan (IDEC Pharmaceuticals Corporation and Genentech) es un anticuerpo IgGI-K quimérico que reconoce el CD20. MOPC es un anticuerpo de ratón lgG1- monoclonal con especificidad desconocida que es comúnmente usado como control negativo en métodos de inmunodetección.
Para análisis FACS, el IgG humano (hulgG, Zymed, San Francisco, CA) y el IgG de ratón y el anti-hulgG de cabra marcado con FITC (FITC/a-hulgG, Zymed, San Francisco, CA) fueron usados como anticuerpo de control y anticuerpo secundario, respectivamente. La conjugación de N, acetil ?- calicheamicin dimetil hidrazida (CalichDMH) fue hecha por medio del ácido lábil AcBut (ácido 4-(4'-acetilfenoxi)butanoico) o AcPAc (ácido (3-Acetilfenil)acético como enlazadores. Los conjugados de ácido estábil fueron obtenidos por el medio de enlazar N, acetil ?-calicheamicin dimetil amida (CalichDMA) con un enlazador de amida (ácido 4-mercapto-4-metil-pentanoico) a los anticuerpos. La proporción molar de la calicheamicina con respecto al anticuerpo mostró una variación entre 2:1 y 6:1 mokmol. Los procesos para conjugar calicheamicina a anticuerpos se describen en la Patentes Estadounidenses Nos. 5,773,001 ; 5,739,116; y 5,877,296 (toda la información de estas citas de patentes se incorporan aquí como referencia).
Macromoléculas Sintéticas (FcPEGL y FcPEGB) Fragmentos de (Fab)2 de hp67.6 fueron generados por digestión de 2.8 g de anticuerpo con 2.8 mg de pepsina (Worthing Biochem. Corp., Freehold, NJ) en 10 mM de amortiguador de citrato (pH 3.5, 37° C) durante 40 min y se neutraliza hasta pH 7 con K2HPO4. La digestión fue fraccionada usando la columna de alto Q Macroprep (160 ml) cromatografía en 10 mM de acetato Tris pH 8. El (Fab)2 eluido en la fracción no ligada.
Fragmentos de (Fab)2 de hp67.6 fueron entonces PEGilados. Veinte mg de (Fab)2 se mezclan con 40 mg de 20 kDa PEG lineal (Éster de N-Hidroxisuccinimidilo de ácido Metoxi poli (etilen glicol)propiónico) o 60 mg de PEG ramificado (10 kDa )2 (Éster de N-Hidroxisuccinimidilo de Metoxi poliYetilen glicol)) en 10 mM de amortiguador de fosfato de potasio pH 8.0. Ambos materiales PEG fueron hechos en agua y usados inmediatamente. La reacción se le permite proceder a 20° C durante 60 min.
El peso molecular aparente fue determinado por SDS-PAGE y cromatografía de permeación. El peso molecular promedio con base en la posición de elusión del (Fab)2 PEGilado -250 kDa del PEG ramificado (10 kDa)2 PEG y -300 kDa para el (Fab)2 PEGilado lineal de 20 kDa. El SDS-PAGE indica que las especies predominantes fueron el (Fab)2: PEG a una proporción molar de 1 :2 y 1:3.
Para el hp67.6 PEGilado, 50 mg del anticuerpo fue mezclado con 100 mg de PEG (0.5 ml de 200 mg/ml de material de PEG ramificado (10 kDa )2) en 40 mM de amortiguador HEPES pH 8.0, a una concentración de proteína final 10.6 mg/ml. La reacción se le permite proceder a 20° C durante 60 min.
Análisis FACS Alícuotas de 105 células fueron suspendidas en 100 µl de salina amortiguada con fosfato suplementada con 1 % v/v de albúmina de suero bovino (PBS/BSA). Las células fueron entonces incubadas a 4o C durante 30 minutos es 10 µ?/ml de anticuerpo primario (hp67.7, hg544, Rituxan o MOPC) o conjugados de estos anticuerpos según se específico en la sección de resultados. El ligado del anticuerpo primario a las células fue revelado por FIAC/a-hulgG.
Determinación del ED50 in vitro Una marca con tinta vital (MTS) fue usado para determinar el número de células sobrevivientes luego de la exposición a varios tratamientos. El MTS (kit de ensayo de proliferación de células no radioactivas fue comprado de Promega (Madison, Wl) y se usa de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Para cada línea celular una curva de calibración (número de células contra densidad óptica después de 2h) fue establecido para estimar una densidad de sembrado inicial apropiado. Las células fueron entonces sembradas en 96 platos multipozos a una densidad de 750 a 5000 células por pozo. Inmediatamente después del sembrado, las células fueron expuestas a diversas concentraciones (rango de 0 a 500 ng de equivalentes de calicheamicina/ml) de hp67.6-AcBut-CaüchDMH y CalichDMH. Luego de la determinación del número de células sobrevivientes a 96 h de exposición de la droga, el ED50 fue calculado con base en los parámetros de regresión logística derivados de las dosis-curvas de respuesta. El ED50 se define como la concentración de droga ((ng/ml de CalichDMH) que causa un 50% de reducción en el número de células después de 96 horas.
Ejemplo 2: Eficacia del HU3S193-DMH In Vivo Tumores subcutáneos de N87, LOVO, A431/Ley, LS174T y L2987 se hicieron crecer en ratones desnudos atímicos (Charles River, Wilmington, MA). Ratones hembra de dos meses de nacidos fueron inyectados con 5X106 N87, LOVO, A431/Ley o LS174T respectivamente por ratón. Las células L2987 se inyectaron en ratones desnudos macho que tenían entre 7 a 8 semanas de nacidos. Para crecer los tumores, las células N87 tenían que ser mezcladas (1 :1 , v/v) con MATRIGEL® (Collaborative Biomedical Products, Belford, MA) antes de la inyección. Dos diámetros perpendiculares de tumor se miden por medio de medidores de precisión a intervalos de tiempo especificada en la sección de resultados. El volumen de tumor fue calculado de acuerdo con la fórmula de Attia&Weiss: A2XBx0.4. A y B son símbolos para los diámetros de tumor más pequeño y más grande, respectivamente. Los programas de tratamiento, dosis y número de ratones por grupos son especificados en la sección de resultados y en las leyendas de la figura.
Ejemplo 3: distribución in vivo de conjugado 125l-Marcado El gemtuzumab ozogamicina fue marcado con 125l usando el reactivo Bolton - Hunter (NEN, Boston, MA). Un grupo de 30 ratones desnudos hembra que llevan tumores fueron inyectados en la vena lateral de la cola con el conjugado marcado con 125l 20 µCi/200 mg. El peso del tumor en el momento de la inyección era de aproximadamente 1 g. Los grupos de 5 ratones fueron muertos por inhalación con CO2 en 2, 6, 24, 48, 72 y 96 horas luego de la inyección. La cantidad de radiación ? en los tejidos como se especificó en la figura 2 fue determinada en estos puntos del tiempo. La biodistribución del conjugado fue expresada como un porcentaje de la dosis inyectada por gramo de tejido (% ID/g) o como un porcentaje del nivel de sangre en un punto de tiempo dado (% de sangre). Las concentraciones increméntales estables de hp67.6-AcBut-CalichDMH fueron observadas exclusivamente en tejido de tumor. El tiempo doblado de acumulación es de 150 h para los tumores A431.
Ejemplo 4: Focalización pasiva del hp67.6-AcBut-Ca!ichDMH El Hp67.6-AcBut-CalichDMH inhibe el crecimiento de diversos xenoinjertos subcutáneos a pesar de las cantidades no detectables del antígeno focalizado, CD33, sobre las células tumorales.
El efecto oncolítico del hp67.6-AcBut-CalichDMH se demuestra en múltiples modelos de xenoinjertos. La Tabla 1 (expresión del CD33 sobre células de carcinoma in vitro) da una lista de las líneas de células usadas para generar los xenoinjertos en ratones desnudos y su expresión de CE33 como se mide por citometría de flujo. La señal obtenida usando hp67.6 o hp67.6-AcBut-CalichDMH como anticuerpo primario fue coincidente principalmente (reMCF se aproximó a 1) con la señal obtenida después de usar un anticuerpo de control negativo, hulgG4. Como se ilustra en la figura 1 , el hp67.6-AcBut-CalichDMH inhibe el crecimiento de tumor de los xenoinjertos de carcinoma epidermoide A431 sin importar la ausencia del CD33 sobre las membranas celulares de estas células. Todos los grupos de ratones en el presente experimento fueron tratados de acuerdo con un régimen de una dosis por ratón dada 3 veces intraperitonealmente con un intervalo de 4 días (Q4Dx3). Los ratones con xenoinjertos de aproximadamente 80 mm3 fueron seleccionados antes del tratamiento. Las cantidades de calichDMH o de conjugado son expresadas en equivalentes de calicheamicina. Hasta los 27 días luego de tratamiento, el crecimiento de los xenoinjertos A431 fue inhibido significativamente (p= 0.03) luego de la administración de 3 dosis de 4 µg de hp67.6-AcBut-CalichDMH. La evaluación después de 27 días no fue posible ya que el tamaño del tumor en el grupo de control se volvió tan grande y fue necesario matar estos ratones por razones humanitarias.
Tabla 1 [a} = mediana relativa de fluorescencia de canal usando hp67.6 como anticuerpo principal [b] = número de determinaciones independientes [c] = mínimo y máximo de determinaciones n [d] = mediana relativa de fluorescencia de canal usando CMA-676 como anticuerpo principal [e] = carcinoma de pulmón de células no pequeñas El ligado de la calicheamicina con un enlazador de ácido lábil AcBut al hp67.6 produce un conjugado que inhibe de manera efectiva el tumor (figura 1A); si embargo, el enlazador sustituyendo AcBut por un enlazador de amida de ácido estábil anihilada la eficacia del conjugado (Figura 1 B) y la administración de calicheamicina libre no causa la inhibición del crecimiento del tumor (Figura 1C). Específicamente, los xenoinjertos tratados con 2 µg/dosis de hp67.6-AcBut-CalichDMH solo permanecieron significativamente más pequeños (p=0.004) que los controles durante 21 días (Figura 1A). La administración de hp67.6-Amida-CalichDMA o CalichDMH en dosis equivalentes o mayores que las de hp67.6-AcBut-CalichDMH no inhibieron el crecimiento del tumor (Figuras 1B y 1C). Los resultados representados en la figura 1 demuestran que no solamente una inhibición significativa del crecimiento del tumor por el hp67.6-AcBut-CalichDMH sino también la dependencia de este efecto sobre el enlazador usado para la conjugación. El control de calichDMH es inefectivo.
Para determinar se la eficacia del hp67.6-AcBut-CalichDMH estuvo relacionada con la liberación lenta del calichDMH desde el peritoneo, el experimento fue repetido usando una vía intravenosa para la administración de las drogas mientras se mantuvo la misma dosis, frecuencia e intervalo de los tratamientos. La inhibición de crecimiento significativa fue observada luego del tratamiento con hp67.6-AcBut-CalichDMH. 27 días luego del establecimiento de la terapia, los tamaños promedio del tumor de los ratones tratados con 4 o 2 µg de este conjugado fueron respectivamente el 11 o el 23% con respecto de los tumores de control. La administración intravenosa de hp67.6-Amida-CaIichDMA o CalichDMH no produjo inhibición de crecimiento de tumos significativo.
Como se muestra en la Tabla 2 (la reducción del volumen del tumor de xenoinjertos de tumor de CD33 luego del tratamiento (T) con hp67.6-AcBut-CalichDMH y expresados como un porcentaje de los controles tratados con el vehículo (T/C%)), hp67.6-AcBut-CalichDMH inhibieron el crecimiento del tumor de xenoinjertos de tumor humano con origen histiotípico diverso. La inhibición del crecimiento del tumor es presentada como un valor T/C. Este valor es el volumen promedio de tumor de un grupo de ratones que fueron tratados con hp67.6-AcBut-CalichDMH (T) expresados como un porcentaje del volumen de tumor promedio de un grupo de control (C). Tanto T y C son determinados el mismo día luego de la iniciación del tratamiento. Los valores T/C en la Tabla 2 fueron derivados de 27 experimentos independientes y fueron determinados entre 17 y 34 días después de la inyección de la primera dosis de hp67.6-AcBut-CalichDMH. A pesar de la variabilidad en la magnitud de la respuesta, los datos demuestran claramente que el hp67.6-AcBut-CalichDMH en una dosis de 4 µg/ratón y un régimen de Q4Dx3 inhibió significativamente el crecimiento del tumor en la mayoría de los xenoinjertos. La inhibición significativa también fue observada cuando se administraron cantidades más baja del conjugado.
Tabla 2 Ejemplo 5: Acumulación del conjugado hp67.6-AcBut-CalichDMH marcado con 125? La cinética del hp67.6-AcBut-CalichDMH en diversos tejidos de ratón y en tumores xenoinjertados de CD33- negativo A431 -tumor fueron comparados. Luego de la inyección de 200 µg (20 µCI) del conjugado marcado con 125l, la cantidad de marca radioactiva fue medida en diversos tejidos en 2, 6, 24, 48, 72 y 96 h (Figura 2). La cantidad de material radioactivo fue expresado con relación a la cantidad presente en la sangre total en el tiempo de la medición (% de Sangre, ejes Y1 en la figura 2). El porcentaje de sangre (% Sangre) es dado por la fórmula, 100xBq por gramo de tejido/Bq por gramo de sangre. En adición, la cantidad de material radioactivo también fue expresada con relación a la cantidad total de conjugado dado (% ID/g, ejes Y2 en la figura 2). Solamente una cantidad marginal de conjugado marcado con 125l es retenida en el cerebro. La acumulación de conjugados en el cerebro no varió significativamente dentro de las 96 horas. El porcentaje de sangre fue en promedio 3.5%. Por lo tanto, este valor no debería ser interpretado como el resultado de la toma de conjugado por el tejido porque la barrera sangre/cerebro es impenetrable para los anticuerpos.
Durante un periodo de 96 horas, la cantidad de hp67.6-AcBut-CalichDMH en tejidos de tumor con relación a la cantidad en la sangre total se incrementa de 6 a 28%. Este incremento estable fue encontrado exclusivamente en tejidos de tumor. El porcentaje de valor de sangre del corazón, intestino y el bazo fueron las más altas 2 horas después de la inyección y luego disminuyeron establemente en función del tiempo. En el hígado y en el músculo estriado, el pico de porcentaje de valor de sangre estuvo a las 48 horas. En la piel, este valor alcanzó el nivel después de 24 horas. El incremento del porcentaje de valor de sangre en el tejido de tumor no fue solamente el resultado del espacio de la clarificación de hp67.6-AcBut-CalichDMH desde la sangre. Esto fue evidenciado por un incremento estable en el valor de % ID/g, que es un mejor indicador de la cantidad absoluta de hp67.6-AcBut-CalichDMH en el tejido.
En contraste al tejido en el tumor, el % de ID/g disminuyó en función del tiempo en todos los otros tejidos que fueron examinados. El tejido de tumor fue entonces excepcional en su capacidad para retener y acumular el hp67.6-AcBut-CalichDMH. El experimento anterior demuestra la acumulación del anticuerpo en el tejido de tumor. El marcado 125l indica la presencia del anticuerpo pero no demuestra si el calichDMH del conjugado siguió una tendencia de acumulación similar. La distribución del tejido de hp67.6 conjugado al calichDMH marcado con 3H fue similar a aquel del conjugado marcado con 125l.
Así, la parte citotóxica del conjugado fue distribuida similarmente como el portador de inmunoglobulina tanto en tejidos normales como neoplásicos.
Ejemplo 6: Focalización pasiva de los conjugados de RITUXIMAB y G5/44 Los conjugados de calicheamicina de rituximab y G5/44 inhiben el crecimiento del tumor al mismo grado que el hp67.6-AcBut-CalichDMH.
Para verificar si la inhibición del crecimiento del tumor causada por el hp67.6-AcBut-CalichDMH fue restringida al hp67.6 como portador para focalización pasiva, diversos experimentos fueron conducidos los cuales compararon la eficacia de los conjugados de hp67.6 con aquellos de los conjugados de rituximab y G5/44. Ninguno de los tres anticuerpos ligó con alta avidez al N87 o al MDAMB435/5T4. Los valores reMCF después de probar el N87 o MDAMB435/5T4 con rituximab fueron de 0.96 y y 0.89 respectivamente. Después de probar estas células con G5/44, los valores reMCF estuvieron entre 0.76 y 1.60. A pesar de la baja avidez de los anticuerpos por las líneas de células, sus conjugados de calicheamicina causaron una inhibición significativa del crecimiento del tumor (Figura 3). La figura también ilustra que la eficacia equivalente fue lograda con los conjugados sin importar la especificidad y su isotipo o punto isoeléctrico del anticuerpo usado para la conjugación. El hp67.6 y el G5/44 son moléculas de lgG4 completamente humanizadas. El rituximab es una quimera de lgG1 de ratón-humana. Los puntos isoeléctricos del hp67.6, G5/44 y rituximab son 7.5, 8.4 y >9, respectivamente.
Ejemplo 7: Albúmina de suero humano o conjugados de Fe PEGilados Al sustituir el anticuerpo sea con albúmina de suero humano o con fragmentos de Fe PEGilados reduce la eficacia de los conjugados de calicheamicina.
Los datos presentados en la figura 4 indican que para un que conjugado de calicheamicina sea eficaz, ni la albúmina de suero humano ni el Fe PEGilado puede reemplazar el anticuerpo portador. La figura 4a muestra la inhibición de crecimiento del conjugado MOPC-21 -AcPAc- CalichDMH: El MOPC-21 un anticuerpo monoclonal de ratón (!gG1) con especificidad desconocida que es comúnmente usado como control negativo en métodos de inmunodetección. Para conjugar la calicheamicina a este anticuerpo de ratón el enlazador de ácido lábil AcPAc fue usado. Esta eficacia del conjugado indica que usar el enlazador AcPAc no impide los efectos oncolíticos del conjugado. En comparación, la eficacia de HSA-AcPAc-CalichDMH fue marginal dentro del mismo experimento (figura 4B). Aunque estos conjugados fueron más eficaces en otro experimento (es decir T/C = 39% 20 días después de la administración de 4 g/ratón Q4Dx3), esto no tenía una eficacia mayor que la del conjugado de anticuerpo de control (es decir T/C = 21%). También el hecho de que una amplia variación interexperimental fue observada con el HSA-AcPAc-CalichDMH indicó que el HSA no era tan apropiado como portador como la ¡nmunoglobulina para mediar la focalización pasiva.
La utilidad de un anticuerpo completo fue ilustrada adicionalmente en la figura 4C. En este experimento, la inhibición del crecimiento del tumor por el hp67.6-AcBut-CalichDMH es comparada a la eficacia de un conjugado que consiste de un fragmento Fe PEGilado enlazado con la calicheamicina por medio de un enlazador de AcBut. Dos tipos de PEG fueron usados para incrementar el radio de Stoke del conjugado. El FcPEGL (peso molecular aparente 300 kDa) fue PEGilado con el éster de N-Hidroxisuccinimidilo de Metoxi poli (etilen glicol) ácido propiónico. El FcPEGB fue PEGilado con una forma ramificada de esta molécula (peso molecular aparente = 250 kDa). Sin importar la naturaleza de la PEGilación, los conjugados de Fe fallaron en causar cualquier inhibición de crecimiento.
Alternativamente, con un anticuerpo completo PEGilado (PEG ramificado) (hp67.6PEGB, peso molecular aparente = 300 kDa) que fue conjugado a la calicheamicina una inhibición de crecimiento similar a la del hp67.6-AcBut-CalichDMH fue observada indicando que la PEGilación per se no abroga la eficacia de un conjugado (figura 4D). Tomados juntos, la evidencia presentada en la figura 4 subregistra la propensión única del anticuerpo completo como un portador efectivo de la calicheamicina.
Ejemplo 8: Correlación Con la Sensibilidad de la Calicheamicina El grado de eficacia causado por la focalización pasiva del p67.6-AcBut-CalichDMH de correlaciona con la sensibilidad de las células tumorales a la calicheamicina in vitro.
La sensibilidad de 11 líneas celulares de tumor a la calichDMH o al hp67.6-AcBut-CalichDMH fue ensayada in vitro. El ED5o de estas dos drogas fue definido como la concentración más baja (ng/ml) que redujo el número de células en una monocapa después de 96 h a 50% de un cultivo de control no tratado. El orden del rango de las diversas líneas celulares fue similar si el ED50 del calichDMH o el ED50 del hp67.6-AcBut-CalichDMH fue usado como criterio de clasificación (comparar la figura 5A con la figura 5B). La sensibilidad de los xenoinjertos subcutáneos al p67.6-AcBut-CalichDMH fue reflejada por el valor T/Cm¡n. Este parámetro es el valor T/C mínimo observado durante un experimento dado y refleja por lo tanto el beneficio terapéutico máximo del conjugado determinado. Por lo tanto, el valor T/Cm¡n permitió una comparación de la eficacia del hp67.6-AcBut-Ca!ichDMH sobre varios xenoinjertos.
La figura 5 demuestra que el valor T/Cmin de estos xenoinjertos fue directamente proporcional a los ED50s determinados después de la adición de calichDMH (figura A) o hp67.6-AcBut-CalichDMH (figura 5B) a las células recíprocas. Esta correlación sugirió que la sensibilidad al calichDMH fue un determinante para la eficacia del hp67.6-AcBut-CalichDMH. Sin embargo, el valor T/Cm¡n excepcionalmente alto encontrado para el carcinoma de colón LOVO subregistra que la sensibilidad al calichDMH sola puede no ser suficiente para explicar la eficacia por focalización pasiva.
Todas las referencias y patentes citadas anteriormente son incorporadas aquí como referencia. Numerosas modificaciones de la presente invención se incluyen en la especificación anteriormente identificada y son obvias para aquellos versados en la técnica y están involucradas dentro del alcance de las reivindicaciones.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un método para tratar células cancerosas que comprende administra a un paciente que lo necesita una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo no específico conjugado a una citotoxina, en donde las células cancerosas no expresan un antígeno al cual el anticuerpo no específico se liga.
2. El método de la reivindicación 1 , en donde el anticuerpo no específico es un anticuerpo anti- CD33 y las ululas de cáncer no expresan el CD33.
3. El método de la reivindicación 2, en donde el anticuerpo no específico es hp67.6.
4. El método de la reivindicación 1 , en donde el anticuerpo no específico es un anticuerpo anti- CD22 y las células de cáncer no expresan el CD22.
5. El método de la reivindicación 4, en donde el anticuerpo no específico es G5/44.
6. El método de la reivindicación 1 , en donde el anticuerpo no específico es un anticuerpo anti-CD20 y las células de cáncer no expresan el CD20.
7. El método de la reivindicación 6, en donde el anticuerpo no específico es rituximab.
8. El método de la reivindicación 1 , en donde el anticuerpo no específico no liga a un antígeno humano.
9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde las células de cáncer son carcinoma gástrico, carcinoma de colón, carcinoma de pulmón de célula no pequeña (NSCLC), carcinoma de pecho, carcinoma epidermoide, o células de carcinoma de próstata.
10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la citotoxina es calicheamicina.
11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde la calicheamicina es conjugada al anticuerpo no específico usando un enlazador de ácido 4-(4'-acetilfenoxi) butanoico (AcBut) o ácido (3- Acetilfenil) acético (AcPAc).
12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 , en donde el anticuerpo al antígeno no específico a la citotoxina es administrado en combinación con un agente bioactivo.
13. El método de la reivindicación 12, en donde el agente bioactivo es un agente anti-cáncer.
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