JP2007529536A - 抗体カリケアマイシン結合体 - Google Patents

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Abstract

抗ルイスＹ抗体が記載される。以前に報告された手順におけるよりも有意に高い薬物ローディングの、かつ低凝集物、かつ低結合体画分（ＬＣＦ）の、単量体の細胞毒性薬物／キャリア結合体を調製するための方法が記載される。細胞毒性薬物誘導体／抗体結合体、この結合体を含む組成物およびこの組成物の使用も開示される。詳細には、単量体のカリケアマイシン誘導体／抗ルイスＹ抗体結合体、この結合体を含む組成物、およびこの結合体の使用も記載される。

Description

（発明の分野）
本発明は、より高い薬物ローディング、および実質的に減少した低結合体画分（ＬＣＦ）を有する、ＩｇＧ１抗体に結合体化された単量体のカリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）細胞毒性薬物の生成のための方法に関する。詳細には、本発明は、カリケアマイシンに結合体化された抗ルイスＹ抗体に関する。本発明はまた、これらの結合体の使用に関する。
（発明の背景）
細胞毒性の化学療法の使用によって、種々のタイプの癌に罹患している患者の生存は改善している。例えば、若年者における急性リンパ球性白血病（Ｋａｌｗｉｎｓｋｙ，Ｄ．Ｋ．（１９９１）、３：３９−４３，１９９１）およびホジキンリンパ腫（非特許文献１）のような選択された新生物性疾患に対する使用では、細胞毒性薬物のカクテルは、完全な治癒を誘導し得る。不幸にも、現在承認されている化学療法では、ほとんどの癌では完全な寛解は生じない。有効性のこの相対的な欠如は複数の理由によって説明できる（概説については、非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４を参照のこと）。これらのなかでも、ほとんどの化学療法の低い治療指数は、おそらく薬学的な改善の標的である。低い治療指数は、腫瘍を根絶して治癒効果を得るのに必要な十分に高い用量の投与を妨げ得る、薬物の有効性の用量と毒性の用量との間の狭い範囲を反映している。
この問題を回避するための１つのストラテジーは、いわゆる特効薬（ｍａｇｉｃ ｂｕｌｌｅｔ）の使用である。特効薬は、Ｅｈｒｌｉｃｈ（非特許文献５）によって着想されて、抗体に化学的に結合される細胞毒性化合物からなる。腫瘍関連抗原を認識する抗体に対して細胞毒性抗癌薬物を結合することによって、薬物の治療指数が改善され得る。この抗体は理想的には、腫瘍細胞の表面で排他的に発現される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を認識すべきである。このストラテジーによって、正常な組織の曝露を最小限にしながら腫瘍部位に細胞毒性因子を送達することが可能になる。この抗体は、特に腫瘍に対して細胞毒性因子を送達し、それによって全身の毒性を軽減し得る。
全身的な薬物学的治療のために開発された薬物結合体は、標的特異的な細胞毒性因子である。この概念は、規定の標的細胞集団に対して特異性を有するキャリア分子に対して治療因子を結合することを包含する。抗原について高い親和性を有する抗体は、標的性部分としての天然の選択肢である。このような抗原の１つは、正常な組織で発現されるが発現のレベルが特定の腫瘍タイプにおいてより高い、ルイスＹ抗原である。ルイスＹ（Ｌｅｙ）抗原は、いくつかの乳房、結腸、胃、食道、膵臓、十二指腸、肺、膀胱および腎臓の癌、ならびに胃および島細胞の神経内分泌腫瘍の細胞で見出される。いくつかの腫瘍細胞上でのその存在は、その血清レベルの増大は伴わず、従って、投与されたルイスＹ特異的抗体は、可溶性抗原に多くは結合されない。
高い親和性のモノクローナル抗体のアベイラビリティーによって、抗体標的療法の見通しが有望となった。モノクローナル抗体に結合体化されている毒性物質としては、毒素、低分子量細胞毒性薬物、生物学的応答修飾因子および放射性核種が挙げられる。抗体−毒素結合体は頻繁に、免疫毒素と呼ばれるが、抗体ならびにメトトレキサートおよびアドリアマイシンのような低分子量薬物からなる免疫結合体は、化学免疫結合体（ｃｈｅｍｏｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）と呼ばれる。免疫調節因子は、リンホカイン、増殖因子および補体活性化コブラ毒因子（ＣＶＦ）のような、調節機能を有することが公知である生物学的応答修飾因子を含む。放射性免疫結合体は、放射性同位体からなり、この放射性同位体は、その放射線によって細胞を殺傷するための治療剤として用いられても、または画像化のために用いられてもよい。腫瘍細胞に対する細胞毒性薬物の抗体媒介性の特異的送達は、それらの抗腫瘍効力を増強するだけでなく、正常な組織による非標的化された取り込みを妨げ、これによってそれらの治療指数を向上させると期待される。
カリケアマイシンまたはＬＬ−Ｅ３３２８８複合体として集合的に公知である、抗菌および抗腫瘍因子の強力なファミリーのメンバーを用いる免疫結合体は、癌の処置における使用のために開発された。最も強力なカリケアマイシンは、γ１と命名されて、本明細書では単にγと称される。これらの化合物は、メチルトリスルフィドを含み、これは適切なチオールと反応されてジスルフィドを形成し得、同時にキャリアに対してカリケアマイシン誘導体を結合させるのに有用であるヒドラジドまたは他の官能基のような官能基を導入する。カリケアマイシンは、二本鎖ＤＮＡの破壊を生じる−Ｓ−Ｓ−結合の還元によって活性化されるエネジエン弾頭（ｅｎｅｄｉｙｎｅ ｗａｒｈｅａｄ）（図１）を含む。
ＣＭＡ−６７６またはＣＭＡとも呼ばれているＭＹＬＯＴＡＲＧ（登録商標）（非特許文献６）は、この原理に従って作用する唯一の市販の薬物である。ＭＹＬＯＴＡＲＧ（登録商標）（ゲムツズマブオゾカマイシン）は現在、高齢患者での急性の骨髄球性白血病の処置に承認されている。この薬物は、酸性の加水分解性リンカーによってカリケアマイシンに結合するＣＤ３３に対する抗体からなる。半合成のＮ−アセチルγカリケアマイシンのジスルフィドアナログが結合体化に用いられた（特許文献１、特許文献２）。この分子であるＮ−アセチルγカリケアマイシンジメチルヒドラジドは、本明細書において以降ではＣＭと省略される。
いくつかの系統の実験的な証拠によって、ＣＤ３３とは異なるＴＡＡを認識する抗体を用いることは、特効薬のアプローチの適用範囲を拡大できるという概念が補強される。抗体および化学療法剤の多数の結合体（免疫結合体）は、異種移植片の腫瘍のホストを治療する能力が証明されている。標的されたＴＡＡのいくつかの例は：ＨＥＲ２／ｎｅｕ（非特許文献７；非特許文献８；ＰＳＣＡ（非特許文献９）；ムチン型糖タンパク質（ＭＩＲＡＣＬ−２６４５７）（非特許文献１０；非特許文献１１）；ＥＧＦＲ（非特許文献１２）；ＣＥＡ（非特許文献１３）；ＣＤ２２（非特許文献１４）およびルイスｙ−抗原（Ｌｅｙ）（非特許文献１５）である。細胞毒性効果を達成するために、これらの表面抗原に対する抗体を緑膿菌外毒素（非特許文献８）、マイタシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）（非特許文献９；非特許文献１０）、カリケアマイシン（非特許文献１１；非特許文献１４），ＲＮａｓｅ（非特許文献１２）、ビンカ・アルカロイド（非特許文献１３）またはドキソルビシン（非特許文献１５）に対して結合体化させた。
広範な種々の癌のための治療の開発における単量体のカリケアマイシン誘導体／キャリア結合体の使用は、特定の標的因子（キャリア）のアベイラビリティーと、このキャリアに結合体化されるカリケアマイシン誘導体の量（すなわち薬物ローディング）が増大される場合にタンパク質凝集物の形成を生じる結合体化方法との両方によって、制限されている。薬物ローディングが高いほど、結合体の固有の力価が増大されるので、キャリアタンパク質の親和性を保持する限りキャリア上にできるだけ多くの薬物をローディングさせることが所望される。
カリケアマイシンを含む多くの細胞毒性薬物の天然の疎水性の性質によって、良好な薬物ローディングおよび合理的な収率を有する単量体の薬物結合体の調製をすることが困難になる。結合の疎水性の増大およびキャリア（抗体）から治療因子を隔てる共有結合的な距離の増大は、この問題を増悪させるようである。非特異的に毒性かつ免疫原性であり得、従って治療用途には除去されるべきである、凝集されたタンパク質の存在によって、これらの結合体の産生のための大規模処理がさらに困難になり、この生成物の収率が低下される。
キャリアタンパク質上にローディングされたカリケアマイシンの量（薬物ローディング）、この結合体化反応で形成される凝集物の量、および得られ得る最終精製された単量体の結合体の収率は全て関連している。ある場合には、特許文献３に開示された反応条件を用い、治療適用のために有用なローディング、有用な収率で結合体を作製することは、過剰な凝集のせいでしばしば困難である。これらの反応条件は、結合体化反応における共溶媒としてＤＭＦを利用した。従って、凝集および物質の元々の損失なしに、より高い薬物ローディング／収率を可能にする方法が必要である。凝集を減少させるための改良は、その全体が本明細書に援用されている、特許文献４および特許文献５、ならびに特許文献６および特許文献７に記載されている。
カリケアマイシン結合体が凝集する傾向は、結合体化反応が、本明細書にその全体が援用される特許文献８および特許文献９に記載されるリンカーで行われる場合に、特に問題である。この場合、生成された結合体は高い割合で凝集型であり、これらのプロセスによって（例えば、治療用途のために、特許文献８に記載されるプロセスを用いて）作製される結合体を精製することはかなり困難である。いくつかのキャリアタンパク質に関しては、適度なローディングを有する結合体でさえ、小規模で以外は作製することが事実上不可能である。これは、抗体のアイソタイプおよび異なるグリコシル化パターンが結合体化プロセスに影響する抗体には特にあてはまる。結果として、特定の抗体に対してカリケアマイシンを結合体化させて、それによって凝集の量を最小化して生成物の合理的な収量とともにできるだけ高い薬物ローディングを可能にするため、新規でかつ改善された方法を考案する必要がある。
米国特許第５，６０６，０４０号明細書 米国特許第５，７７０，７１０号明細書 米国特許第５，０５３，３９４号明細書 米国特許第５，７１２，３７４号明細書 米国特許第５，７１４，５８６号明細書 米国特許出願公開第２００４／００８２７６４号明細書 米国特許出願公開第２００４／０１９２９００号明細書 米国特許第５，８７７，２９６号明細書 米国特許第５，７７３，００１号明細書 Ｄｕｓｅｎｂｅｒｙ，Ｋ．Ｅら，「Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ」，１９８８年，第２８巻，ｐ．２４６−２５１ Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｍ．Ｍ．，「Ａｎｎ．Ｒｅｖ．ｏｆ Ｍｅｄ．」，２００２年，第５３巻，ｐ．６１５〜６２ Ｍａｓｈｉｍａ，Ｔ．ら，「Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ」，１９９８年，第１２巻、第６号，ｐ．９４７〜９５２ Ｍａｒｅｅｌ，Ｍ．Ｍ．ら，「Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ」，１９８６年，第６巻，ｐ．１３５〜１４２ Ｅｈｒｌｉｃｈ，Ｐ．，「Ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ」，第２巻，ｐ．４４２〜４４７ Ｓｉｅｖｅｒｓ，Ｅ．Ｌ．ら，「Ｂｌｏｏｄ」，１９９９年，第９３巻，ｐ．３６７８〜３６８４ Ｓｔａｒｌｉｎｇ，Ｊ．Ｊら，「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，１９９２年，第３巻，第４号，ｐ．３１５〜３２２ ＤｉＪｏｓｅｐｈ，Ｊ．Ｆ．ら，「Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ」，２００２年，第３８巻（補遺７），Ｓ１５０ Ｓｊｏｇｒｅｎ，Ｈ．Ｏら，「Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．」，１９９７年，第５７巻，ｐ．４５３０〜４５３６ Ｚｈａｎｇ，Ｓ．ら，「Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ」，１９９７年，第７３巻：ｐ．５０〜５６ Ｗａｈｌ，Ａ．Ｆ．ら，「Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ」，２０００年，第９３巻：ｐ．５９０〜６００ Ｆｕｒｏｋａｗａ，Ｋ．ら，「Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」，１９９０年，第２７巻：ｐ．７２３〜７３２ Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｋ．ら，「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．」，１９９４年，第９１巻：ｐ．１２９５７〜１２９６１ Ｃｌａｒｋｅ，Ｋ．ら，「Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．」，２０００年，第６０巻：ｐ．４８０４〜４８１１ Ｍｏｒｇａｎ，Ａ．ら，「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」，１９９５年，第８６巻：ｐ．３１９〜３２４
（発明の要旨）
本発明は、デオキシコール酸ファミリーのメンバーまたはその塩の存在下において約７〜約９（好ましくは約８．２）のｐＨで、（ｉ）活性化されたカリケアマイシン−加水分解性リンカー誘導体と、（ｉｉ）ＩｇＧ１抗体とを反応させる工程を包含する、カリケアマイシン結合体を調製するためのプロセス、ならびにこのプロセスによって調製された結合体を提供する。本発明によってまた、抗ルイスＹ抗体に対して共有結合されたカリケアマイシン−加水分解性リンカー誘導体の結合体を含む組成物も提供される。
１実施形態では、上記デオキシコール酸ファミリーのメンバーは、以下の構造：
Figure 2007529536
 であって、ここで
Ｘ１〜Ｘ５のうちの２つがＨまたはＯＨであり、そして他の３つが独立してＯまたはＨのいずれかであり；
Ｒ１が（ＣＨ２）ｎであって、ｎが０〜４であり、そして
Ｒ２がＯＨ、ＮＨ（ＣＨ２）ｍＣＯＯＨ、ＮＨ（ＣＨ２）ｍＳＯ３Ｈ、またはＮＨ（ＣＨ２）ｍＰＯ３Ｈ２であって、ｍが１〜４である、（Ａ）、
あるいは
Figure 2007529536
 であって、ここで
Ｘ１〜Ｘ４のうちの１つがＨまたはＯＨであり、そして他の３つが独立してＯまたはＨのいずれかであり；
Ｒ１が（ＣＨ２）ｎであって、ｎが０〜２であり、そして
Ｒ２がＯＨ、ＮＨ（ＣＨ２）ｍＣＯＯＨ、またはＮＨ（ＣＨ２）ｍＳＯ３Ｈであって、ｍが２である、（Ｂ）、
あるいは、
Figure 2007529536
 であって、ここで
Ｘ１〜Ｘ４のうちの１つがＯＨであり、そして他の３つがＨであり；
Ｒ１が（ＣＨ２）ｎであって、ｎが０〜２であり、そして
Ｒ２がＯＨ、ＮＨ（ＣＨ２）２ＳＯ３Ｈである、（Ｃ）、
のうち１つを有する。
このデオキシコール酸ファミリーのメンバーはまた、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロウルソデオキシコール酸またはタウロケノデオキシコール酸であってもよい。好ましくはこのデオキシコール酸ファミリーのメンバーは約１０ｍＭの濃度のデオキシコール酸である。
別の実施形態では、前記カリケアマイシン誘導体は、ＩｇＧ１抗体の約３〜約９重量％、好ましくはＩｇＧ１抗体の約７重量％である。
このＩｇＧ１抗体は、１実施形態では、抗ルイスＹ抗体であり、好ましくは、抗ルイスＹ抗体は、Ｇ１９３またはＨｕ３Ｓ１９３である。
別の実施形態では、カリケアマイシン誘導体は、カリケアマイシンのＮ−アシル誘導体またはカリケアマイシンのジスルフィドアナログである。好ましくはこのカリケアマイシン誘導体は、Ｎ−アセチルγカリケアマイシンジメチル
ヒドラジド（Ｎ−アセチルカリケアマイシンＤＭＨ）である。
さらに別の実施形態では、この加水分解性リンカーは、４−（４−アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）である。
このプロセスは必要に応じて、カリケアマイシン結合体を精製する工程をさらに包含する。このような精製は、クロマトグラフィー分離および限外濾過／ダイアフォルトレーションを含んでもよい。好ましくは、このクロマトグラフィー分離はサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）または疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）である。この精製工程後、好ましくは、結合体の平均ローディングは、ＩｇＧ１抗体１モルあたり、カリケアマイシン約５〜約７モルであり、この結合体の低結合体化画分（ＬＣＦ）は１０％未満である。
本発明のカリケアマイシン結合体は好ましくは、約１×１０−７Ｍ〜約４×１０−７ＭのＫＤ、そしてより好ましくは、約３．４×１０−７ＭのＫＤを有する。このような結合体は、ルイスＹ抗原に結合し、そして、ルイスＸおよびＨ−２血液型群抗原には結合せず、細胞毒性活性を有し、そして抗腫瘍活性を有する。好ましくは、この結合体は、治療有効量で組成物中に存在する。
従って、本発明は、Ｇ１９３に共有結合されたＮ−アセチルγカリケアマイシンジメチチルヒドラジド−４−（４−アセチルフェノキシ））ブタン酸（Ｎ−アセチルカリケアマイシンＤＭＨ−ＡｃＢｕｔ）の結合体を含む組成物であって、上記平均ローディングが、１モルのＧ１９３あたり約５〜約７モルのＮ−アセチルカリケアマイシンＤＭＨであり、かつ上記結合体の低結合体化画分（ＬＣＦ）が約１０％未満である、組成物を提供する。
本発明はまた、これらの組成物の生物学的活性を保存するためのプロセスであって：溶液中においてこの組成物と、凍結保護物質、界面活性物質、緩衝化剤、および電解質とを接触させる工程と；この溶液を凍結乾燥させる工程、とを包含するプロセスを提供する。
１実施形態では、上記結合体は、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約２ｍｇ／ｍＬの濃度である。好ましくは、この結合体は、１ｍｇ／ｍＬの濃度である。
別の実施形態では、上記凍結保護物質は、約１．５重量％〜約６重量％の濃度である。上記凍結保護物質は、糖アルコールであっても、または炭水化物であってもよい；好ましくは、この凍結保護物質はトレハロース、マンニトールまたはソルビトールであり、そしてさらに好ましくは、この凍結保護物質は約５％の濃度のスクロースである。
界面活性物質は１実施形態では、約０．００５％〜約０．０５％の濃度である。好ましくは、この界面活性物質は、０．０１重量％の濃度のＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０または約０．０１％の濃度のＴｗｅｅｎ８０である。
別の実施形態では、上記緩衝化剤は約５ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度である。好ましくはこの緩衝化剤は約２０ｍＭの濃度のＴｒｉｓである。
上記電解質は別の実施形態では、約５ｍＭ〜約１００ｍＭの濃度である。好ましくは、この電解質は、ナトリウム塩またはカリウム塩であり、さらに好ましくはこの電解質は約１０ｍＭの濃度のＮａＣｌである。
凍結乾燥の前に、１実施形態では、ｐＨは約７．８〜約８．２であり、そして好ましくはこのｐＨは約８．０である。
１実施形態では、凍結乾燥は：約−３５℃〜約−５０℃の温度で溶液を凍結させる工程；約２０〜約８０ミクロンの初期乾燥圧力で、約−１０℃〜約−４０℃の保管温度で、２４〜７８時間の間、この凍結した溶液を最初に乾燥させる工程；ならびに、約２０〜約８０ミクロンの二次乾燥圧力で、約＋１０℃〜約＋３０℃の保管温度で、１５〜３０時間の間、この凍結乾燥した生成物を二次乾燥させる工程；を包含する。好ましくは、凍結は約−４５℃で行われ；上記最初の凍結乾燥は約６０ミクロンの初期乾燥圧力で、約−３０℃の保管温度で、６０時間の間であり；かつ、上記第二の乾燥工程は約６０ミクロンの乾燥圧力で、約＋２５℃の保管温度で、約２４時間の間である。
上記プロセスはさらに、凍結乾燥前に充填剤を添加する工程を包含してもよい。好ましくは、この充填剤は約０．５〜約１．５重量％の濃度であり、さらに好ましくは、この充填剤が、約０．９重量％の濃度のＤｅｘｔｒａｎ ４０または、約０．９重量％の濃度のヒドロキシエチルデンプン４０である。
本発明はさらに、上記のカリケアマイシン−抗ルイスＹ抗体結合体組成物、凍結保護物質、界面活性物質、緩衝化剤および電解質を含む処方物を提供する。
癌または別の増殖性障害を処置する方法も本発明によって提供され、この方法は、本明細書に記載の組成物の治療有効量を投与する工程を包含し、癌を処置するための医薬の製造においても用いられ得る。
これらの組成物は、セカンドラインの単独療法として投与されても、またはファーストラインの併用療法として投与されてもよい。
好ましくは、上記の癌はルイスＹ抗原について陽性であり、さらに好ましくはこの癌は癌腫である。または、好ましくは、この癌は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、乳癌、前立腺癌または結腸直腸癌である。
本発明の方法は、例えば、抗癌剤のような生物活性因子と組み合わせて行われてもよい。
本発明によってまた（ｉ）本発明の処方物のいずれかを保持する容器と；（ｉｉ）希釈剤を用いて上記処方物を再構成し、この再構成された処方物中での結合体濃度を約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬの範囲内とするための説明書、とを備えるキットが提供される。
（発明の詳細な説明）
本発明は、カリケアマイシン結合体を調製するためのプロセスを提供する。このプロセスは、デオキシコール酸ファミリーのメンバーまたはその塩の存在下において約７〜約９のｐＨで（ｉ）活性化されたカリケアマイシン−加水分解性リンカー誘導体と、（ｉｉ）ＩｇＧ１抗体（例えば、抗ルイスＹ抗体）とを反応させる工程、ならびにこれらによって生成された結合体を包含する。本発明によってまた、抗ルイスＹ抗体に対して共有結合されたカリケアマイシン−加水分解性リンカー誘導体の結合体を有する組成物も提供される。溶液中においてこの組成物と、凍結保護物質、界面活性物質、緩衝化剤、および電解質とを接触させる工程と；この溶液を凍結乾燥させる工程とを包含する、これらの組成物の生物学的活性を保存するためのプロセスも提供される。カリケアマイシン−抗ルイスＹ抗体結合体、凍結保護物質、界面活性物質、緩衝化剤および電解質の処方物がさらに提供され、製品も同様に提供される。最後に、本発明は、このような組成物／処方物の治療有効量を投与することによって癌または他の増殖性障害を処置する方法を提供し、この方法は、癌または他の増殖性疾患の処置のための医薬の製造におけるこれらの組成物／処方物の使用を包含する。以下に、本発明の種々の実施形態を記載する。
確立された結合体化条件が、ヒト化抗ＣＤ２２抗体Ｇ５／４４カリケアマイシン結合体である、ＭＹＬＯＴＡＲＧ（ＣＭＡ−６７６またはＣＭＡとも呼ばれる）およびＣＭＣ−５４４の処方物に適用されている。これらの両方がＩｇＧ４抗体である。ＭＹＬＯＴＡＲＧの導入から、カリケアマイシンはこれらのタイプの抗体に均一な様式で分配されないということが、イオン交換クロマトグラフィーの使用を通じて、確認されている。これらの結合体の平均ローディングは、抗体１モルあたり０．１〜１０または１５モルのカリケアマイシンであるが、ほとんどのカリケアマイシンは、この抗体の約半分にあり、他の半分は、少量のカリケアマイシンしか含まない低結合画分（ＬＣＦ）に存在する。
キャリアに対してカリケアマイシンのような細胞毒性薬物を結合体化させて、これによって凝集物の量を最小化させて、結合体産物の有意に改善された収率を伴う高度に均一な薬物ローディングを可能にするための改良方法は、ＣＭＣ−５４４の開発の間に達成された。特異的な例は、Ｇ５／４４−ヒト化抗ＣＤ２２抗体−ＮＡｃ−γカリケアマイシンＤＭＨ ＡｃＢｕｔ結合体（すなわち、ＣＭＣ−５４４）のものである。総抗体の１０％未満までのＬＣＦの量の減少がＣＭＣ−５４４の改善について所望され、そしてＬＣＦのレベルの減少のための種々の選択肢が考慮された。抗原結合および細胞毒性のような免疫結合体の他の特性は、最終的な解決策によって影響されてはならない。考慮される選択肢としては、抗体分子の遺伝的改変または物理的改変、クロマトグラフィー分離技術、または反応条件の改変が挙げられた。
古い反応条件（ＣＭＡ−６７６ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）を用いるＮＡｃ−γカリケアマイシン−ＤＭＨ−ＡｃＢｕｔ−ＯＳｕとのＧ５／４４抗体の反応によって、ＣＭＡ−６７６と同様の物理的特性（薬物ローディング、ＬＣＦ）および凝集を有する産物が得られた。しかし、結合後に存在する高レベル（５０〜６０％）のＬＣＦは、望ましくないとみなされた。最適反応条件は、統計学的な実験デザイン方法論を通じて決定し、ここでは重要な反応の変数、例えば温度、ｐＨ、カリケアマイシン誘導体投入、および添加濃度を評価した。ＬＣＦを１０％未満に減少させるために、カリケアマイシン誘導体投入を、反応中で抗体の量に対して３％〜８．５％（ｗ／ｗ）まで増大させた。添加物は、２００ｍＭ（ＣＭＡプロセス）の濃度のオクタン酸またはその塩から、３７．５ｍＭの濃度のデカン酸またはその塩まで変化した。これらの変化を組み込む反応条件によって、ＬＣＦは１０パーセント未満に減少されたが、カリケアマイシンローディングは増大した。この反応条件は、本明細書において以降では、ＣＭＣ−５４４ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎと呼ばれる。
カリケアマイシン投入の増大によって、薬物ローディングは２．５〜３．０重量パーセントから５．０〜９．０（最も代表的には５．５〜８．５）重量パーセントに増大し、反応中のタンパク質凝集では増大を生じなかった。凝集およびＬＣＦ減少に起因して、ＣＭＣ−５４４ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓでは、さらに均一な生成物が生じた。
アミノ酸の配列およびアイソタイプにおける変動に起因して、全ての抗体が同じ物理的特徴を示すわけではないので、反応条件は、各々の特異的な抗体に合わせられなければならない。ＣＭＡ−６７６結合体化反応条件をＩｇＧ１抗体（例えば、抗ルイスＹ抗体）とともに用いた場合、得られた結合体は、ＣＭＡ−６７６と同様の物理的特性（薬物ローディング、ＬＣＦおよび凝集）を有し、そして結合後に存在する高レベル（５０〜６０％）のＬＣＦは望ましくないとみなされた。ＩｇＧ１抗体を有するＣＭＣ−５４４のために開発された改変された条件を用いて、よりＬＣＦの低い生成物を生じたが、反応中で生じた凝集物の量は、高すぎるとみなされた。特異的な胆汁酸であるデオキシコール酸ファミリーまたはそれらの塩は、この場合にはＬＣＦおよび凝集物の両方を減少させる最適の添加物として機能したことが確認された。ＣＭＡ−６７６、ＣＭＣ−５４４の両方および新規な最適化されたプロセスから添加物とともに調製した１つのＩｇＧ１抗体結合体の比較を表１に示す（オクタン酸塩、デカン酸塩およびデオキシコール酸塩の比較）
Figure 2007529536
 従って、本発明は、カリケアマイシン結合体を調製するためのプロセスを提供する。このプロセスでは、活性化カリケアマイシン−加水分解性リンカー誘導体およびＩｇＧ１抗体は、デオキシコール酸ファミリーのメンバーまたはその塩の存在下で反応させられる。このプロセスは、凝集物の量を最小化して、ＩｇＧ１抗体結合体についての薬物ローディングを有意に増大する。
胆汁酸のデオキシコール酸ファミリーの任意の適切なメンバーまたはその塩が、本発明のプロセスにおいて用いられ得る。１実施形態では、デオキシコール酸ファミリーのメンバーは以下の構造を有し：
Figure 2007529536
 ここで
Ｘ１〜Ｘ５のうちの２つがＨまたはＯＨであり、そして他の３つが独立してＯまたはＨのいずれかであり；
Ｒ１が（ＣＨ２）ｎであって、ｎが０〜４であり、そして
Ｒ２がＯＨ、ＮＨ（ＣＨ２）ｍＣＯＯＨ、ＮＨ（ＣＨ２）ｍＳＯ３Ｈ、またはＮＨ（ＣＨ２）ｍＰＯ３Ｈ２であって、ｍが１〜４である。
あるいは、このデオキシコール酸ファミリーのメンバーは、以下の構造を有してもよく：
Figure 2007529536
 ここで
Ｘ１〜Ｘ４のうちの１つがＨまたはＯＨであり、そして他の３つが独立してＯまたはＨのいずれかであり；
Ｒ１が（ＣＨ２）ｎであって、ｎが０〜２であり、そして
Ｒ２がＯＨ、ＮＨ（ＣＨ２）ｍＣＯＯＨ、またはＮＨ（ＣＨ２）ｍＳＯ３Ｈであって、ｍが２である。
また代替的には、このデオキシコール酸ファミリーのメンバーは、以下の構造を有してもよく：
Figure 2007529536
 ここで
Ｘ１〜Ｘ４のうちの１つがＯＨであり、そして他の３つがＨであり；
Ｒ１が（ＣＨ２）ｎであって、ｎが０〜２であり、そして
Ｒ２がＯＨ、ＮＨ（ＣＨ２）２ＳＯ３Ｈである。
好ましくは、このデオキシコール酸ファミリーのメンバーは、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロウルソデオキシコール酸またはタウロケノデオキシコール酸である。さらに好ましくはこのデオキシコール酸ファミリーのメンバーは、デオキシコール酸であり、これは好ましくは約１０ｍＭの濃度で存在する。
以前に考察されたとおり、カリケアマイシンとは、米国特許第４，９７０，１９８号（米国特許第５，１０８，９１２号も参照のこと）に記載されるように、抗菌および抗腫瘍因子のファミリーをいう。本発明のプロセスの１つの好ましい実施形態では、カリケアマイシンは、カリケアマイシンのＮ−アシル誘導体またはカリケアマイシンのジスルフィドアナログである。これらの化合物のジヒドロ誘導体は、米国特許第５，０３７，６５１号に記載され、そしてＮ−アシル化誘導体は、米国特許第５，０７９，２３３号に記載される。本発明においてまた有用である関連の化合物としては、米国特許第４，６７５，１８７号；同第４，５３９，２０３号；同第４，５５４，１６２号；および同第４，８３７，２０６号に記載されるエスペラマイシンが挙げられる。これらの化合物の全てが、メチルトリフルフィドを含み、これは、適切なチオールと反応してジスルフィドを形成し得、同時に、ヒドラジドまたは類似の求核試薬のような官能基を導入する。上述の特許の引用における全ての情報は、参照によって本明細書に援用される。本発明において有用である２つの化合物は、米国特許第５，０５３，３９４号に開示され、そして米国特許第５，８７７，２９６号の表１に、γジメチルヒドラジドおよびＮ−アセチルγジメチルヒドラジドとして示される。
好ましくは、本発明の状況では、カリケアマイシンはＮ−アセチルγカリケアマイシンジメチルヒドラジド（Ｎ−アセチルカリケアマイシンＤＭＨ）である。Ｎ−アセチルカリケアマイシンＤＭＨは、現在の用途では大多数の細胞毒性カリケアマイシン因子よりも少なくとも１０〜１００倍強力である。その力価の高さによって、これは抗体標的化療法の理想的な候補物となり、それによって抗腫瘍活性が最大化され、一方では正常な器官および組織の非特異的な曝露が減少する。
従って、１実施形態では、本発明の結合体は、以下の式を有し：
Ｐｒ（−Ｘ−Ｗ）ｍ
ここで：
ＰｒはＩｇＧ１抗体であり；
ＸはＩｇＧ１抗体と反応し得る任意の反応性基の生成物を含むリンカーであり；
Ｗはカリケアマイシンファミリー由来の細胞毒性薬物であり；
ｍは、カリケアマイシンが結合体の３〜９重量％を構成するような、精製された結合体化生成物についての平均ローディングであり；そして
（−Ｘ−Ｗ）ｍは細胞毒性薬物誘導体であり
好ましくは、Ｘは式
（ＣＯ−Ａｌｋ１-Ｓｐ１−Ａｒ−Ｓｐ２−Ａｌｋ２−Ｃ（Ｚ１）＝Ｑ−Ｓｐ）であり、
ここでＡｌｋ１およびＡｌｋ２は独立して、結合であるか、または分枝もしくは未分枝の（Ｃ１−Ｃ１０）アルキレン鎖であり；
Ｓｐ１は、結合、−Ｓ−、−Ｏ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＮＲ−、−Ｎ（ＣＨ２ＣＨ２）２Ｎ−、または−Ｘ−Ａｒ−Ｙ−（ＣＨ２）ｎ−Ｚであり、ここでＸ、Ｙ、およびＺは、独立して、結合、−ＮＲ−、−Ｓ−、または−Ｏ−であり、ただし、ｎ＝０である場合、ＹおよびＺのうちの少なくとも１つは結合でなければならず、そしてＡｒは、（Ｃ１−Ｃ５）アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ４）チオアルコキシ、ハロゲン、ニトロ、−ＣＯＯＲ、−ＣＯＮＨＲ、−（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ、または−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲのうちの１、２または３つの基で必要に応じて置換された、１，２−フェニレン、１，３−フェニレンまたは１，４−フェニレンであって、ただしＡｌｋ１が結合である場合、Ｓｐ１は結合であり；
ｎが０〜５の整数であり；
Ｒが−ＯＨ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ４）チオアルコキシ、ハロゲン、ニトロ、（Ｃ１−Ｃ３）ジアルキルアミノ、または（Ｃ１−Ｃ３）トリアルキルアンモニウム−Ａ−のうちの１つまたは２つの基によって必要に応じて置換された、分枝もしくは未分枝の（Ｃ１−Ｃ５）鎖であり、ここでＡ−は塩を完成させる薬学的に受容可能な陰イオンであり；
Ａｒは、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ５）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ４）チオアルコキシ、ハロゲン、ニトロ、−ＣＯＯＲ，−ＣＯＮＨＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ、または−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲのうちの１、２または３つの基で必要に応じて置換された、１，２−フェニレン、１，３−フェニレンまたは１，４−フェニレンであり、ここでｎおよびＲは、本明細書において以前に規定されており、あるいは１，２−ナフチリデン、１，３−ナフチリデン、１，４−ナフチリデン、１，５−ナフチリデン、１，６−ナフチリデン、１，７−ナフチリデン、１，８−ナフチリデン、２，３−ナフチリデン、２，６−ナフチリデンまたは２，７−ナフチリデンであるか、または
Figure 2007529536
 であり、ここで各々のナフチリデンまたはフェノチアジンは、必要に応じて、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ５）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ４）チオアルコキシ、ハロゲン、ニトロ、−ＣＯＯＲ、−ＣＯＮＨＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ、または−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲのうちの１、２、３または４つの基で必要に応じて置換され、ここでｎおよびＲは上記で規定されており、ただしＡｒがフェノチアジンである場合、Ｓｐ１は窒素にのみ結合された結合であり；
Ｓｐ２は結合、−Ｓ−または−Ｏ−であり、ただしＡｌｋ２が結合である場合、Ｓｐ２は結合であり；
Ｚ１は、（Ｃ１−Ｃ５）アルキル、（Ｃ１−Ｃ５）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ４）チオアルコキシ、ハロゲン、ニトロ、−ＣＯＯＲ、−ＯＮＨＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲまたは−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲのうちの１、２または３つの基で必要に応じて置換されたＨ、（Ｃ１−Ｃ５）アルキル、またはフェニルであり、ここでｎおよびＲは上記に規定されており；
Ｓｐは、直鎖または分枝鎖の二価または三価の（Ｃ１−Ｃ１８）ラジカル、二価もしくは三価のアリールラジカルまたは二価もしくは三価のヘテロアリールラジカル、二価もしくは三価の（Ｃ３−Ｃ１８）シクロアルキルラジカルまたは二価もしくは三価のヘテロシクロアルキルラジカル、二価または三価のアリール−または二価もしくは三価のヘテロアリール−アリール（Ｃ１−Ｃ１８）ラジカル、二価または三価のシクロアルキル−または二価もしくは三価のヘテロシクロアルキル−アルキル（Ｃ１−Ｃ１８）ラジカル、あるいは二価もしくは三価の（Ｃ２−Ｃ１８）不飽和アルキルラジカルであり、ここでヘテロアリールは、好ましくはフリル、チエニル、Ｎ−メチルピロリル、ピリジニル、Ｎ−メチルイミダゾリル、オキサゾリル、ピリミジニル、キノリル、イソキノリル、Ｎ−メチルカルバゾイル、アミノコルマリニル（ａｍｉｎｏｃｏｕｒｍａｒｉｎｙｌ）、またはフェナジニルであり、ここでＳｐが三価のラジカルである場合、Ｓｐは、低級（Ｃ１−Ｃ５）ジアルキルアミノ、低級（Ｃ１−Ｃ５）アルコキシ、ヒドロキシまたは低級（Ｃ１−Ｃ５）アルキルチオ基によってさらに置換されてもよく；そして
Ｑは＝ＮＨＮＣＯ−、＝ＮＨＮＣＳ−、＝ＮＨＮＣＯＮＨ−、＝ＮＨＮＣＳＮＨ−、または＝ＮＨＯ−である。
好ましくは、Ａｌｋ１は、分枝もしくは未分枝の（Ｃ１−Ｃ１０）アルキレン鎖であり；Ｓｐは、結合、−Ｓ−、−Ｏ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、または−ＮＲであり、ここでＲは本明細書において以前に規定されているとおりであり、ただし、Ａｌｋ１が結合である場合、Ｓｐ１は結合であり；
Ａｒは、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ５）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ４）チオアルコキシ、ハロゲン、ニトロ、−ＣＯＯＲ、−ＣＯＮＨＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ、または−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲのうちの１、２または３つの基で必要に応じて置換された、１，２−フェニレン、１，３−フェニレンまたは１，４−フェニレンであり、ここでｎおよびＲは、本明細書において以前に規定されたとおりであり、あるいはＡｒは、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ５）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ４）チオアルコキシ、ハロゲン、ニトロ、−ＣＯＯＲ、−ＣＯＮＨＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ、または−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲのうちの１、２、３、または４つの基で各々必要に応じて置換された、１，２−ナフチリデン、１，３−ナフチリデン、１，４−ナフチリデン、１，５−ナフチリデン、１，６−ナフチリデン、１，７−ナフチリデン、１，８−ナフチリデン、２，３−ナフチリデン、２，６−ナフチリデン、または２，７−ナフチリデンである。
Ｚ１は、（Ｃ１−Ｃ５）アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ４）チオアルコキシ、ハロゲン、ニトロ、−ＣＯＯＲ、−ＣＯＮＨＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ、または−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲのうちの１、２または３つの基で必要に応じて置換された、（Ｃ１−Ｃ５）アルキルまたはフェニルである。
Ａｌｋ２およびＳｐ２は一緒になって結合である。
ＳｐおよびＱはすぐ上に規定されたとおりである。
本発明のプロセスでは、カリケアマイシンは好ましくは、ＩｇＧ１抗体の約３〜約９重量％で、そしてより好ましくはＩｇＧ１抗体の約７重量％で反応物に添加される。
本発明の結合体は、ＩｇＧ１抗体と反応する任意の反応性基を含むリンカーで誘導体化された細胞毒性薬物カリケアマイシンを利用しており、これは、タンパク質性キャリア標的性因子として用いられて細胞毒性薬物誘導体−抗体結合体を形成する。その全体が本明細書に援用される、米国特許第５，７７３，００１号；同第５，７３９，１１６号および同第５，８７７，２９６号は、カリケアマイシンから調製された、求核性誘導体、特にヒドラジドおよび関連の求核試薬とともに用いられ得るリンカーを開示する。これらのリンカーは特に、薬物とリンカーとの間で形成された結合が加水分解性である場合に良好な活性が得られるという場合に有用である。これらのリンカーは、２つの官能基を含む。１つの基は代表的には、キャリアと反応するために利用されるカルボン酸である。酸官能基は、適切に活性化された場合、キャリアの遊離のアミン基（例えば、抗体または他のタンパク質性キャリアのリジンの側鎖のアミンなど）とアミド結合を形成し得る。他の官能基は一般にカルボニル基、すなわち、アルデヒドまたはケトンであり、これは適切に修飾された治療因子と反応する。カルボニル基は、薬物上のヒドラジド基と反応して、ヒドラゾン結合を形成し得る。この結合は加水分解性であって、これによって、標的細胞に対する結合後に結合体からの治療因子の放出が可能になる。好ましくは、この加水分解性リンカーは４−（４−アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）である。
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＯＳｕ）エステルまたは他の同等に活性化されたエステルは、活性化されたカリケアマイシン−加水分解性リンカー誘導体を生成するために用いられ得る。他の適切な活性化エステルの例としては、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）、スルホ−ＮＨＳ（スルホン化ＮＨＳ）、ＰＦＰ（ペンタフルオロフェニル）、ＴＦＰ（テトレフルオロフェニル）およびＤＮＰ（ジニトロフェニル）が挙げられる。
本発明において用いられ得る抗体の例としては、モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体、再表面化抗体、ヒト抗体およびそれらの生物学的に活性なフラグメントが挙げられる。抗体という用語は、本明細書において用いる場合、他に示さない限り広義には、抗体分子および種々の抗体由来分子の両方を指すとして用いられる。このような抗体由来分子は、少なくとも１つの可変領域（重鎖または軽鎖可変領域のいずれか）を含み、そしてＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆａｂｃフラグメント、Ｓｃ抗体（単鎖抗体）、二価抗体、個々の抗体の軽鎖単鎖、個々の抗体の重鎖、抗体の鎖と他の分子との間のキメラ融合物などの分子を含む。
好ましくは、本発明のＩｇＧ１抗体は、癌のような増殖性障害における標的の細胞および／または組織上に発現された細胞表面抗原に指向する。１実施形態では、ＩｇＧ１抗体は、抗ルイスＹ抗体である。ルイスＹは糖鎖抗原であって、その構造はＦｕｃα１→２Ｇａｌβ１→４［Ｆｕｃα１→３］ＧｌｃＮａｃβ１→３Ｒ（Ａｂｅら（１９８３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５８ １１７９３−１１７９７）である。ルイスＹ抗原は、ヒト上皮腫瘍（乳房、結腸、肺、および前立腺の腫瘍を含む）の６０％〜９０％の表面上で発現され、そのうち少なくとも４０％がこの抗原を過剰発現して、正常な組織では発現が限定されている。
Ｌｅｙを標的し、かつ腫瘍を効率的に標的するために、抗原に対して排他的な特異性を有する抗体が理想的には必要である。従って、好ましくは、本発明の抗ルイスＹ抗体は、１型の構造（すなわち、ラクトシリーズ（ｌａｃｔｏ−ｓｅｒｉｅｓ）の血液型群（ＬｅａおよびＬｅｂ））とは交差反応せず、そして好ましくは、ＬｅｘおよびＨ−２型の構造のような他の２型エピトープ（すなわち、ネオラクト構造（ｎｅｏｌａｃｔｏ−ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）には結合しない。
ここ数十年間の間、Ｌｅｙを認識するいくつかの抗体が生成されている。しかし、これらのほとんどが、Ｌｅｘおよび２型のＨの抗原構造との交差反応性を示す（Ｆｕｒｏｋａｗａ、Ｋら、７２３〜７３２）。好ましい抗ルイスＹ抗体の例は、ｈｕ３Ｓ１９３と命名される（その全体が本明細書に援用される米国特許第６，３１０，１８５号；同第６，５１８，４１５号；同第５，８７４，０６０号を参照のこと）。抗ルイスＹ抗体の他の例（例えば、欧州特許第０ ２８５ ０５９号；米国特許第４，９７１，７９２号および同第５，１８２，１９２号）としては、ＳＧＮ−１５中のドキソルビシン結合体（例えば、米国特許第５，９８０，８９６号）として現在評価されているモノクローナル抗体ＢＲ９６（例えば、米国特許第５，４９１，０８８号；同第５，７９２，４５６号；同第５，８６９，０４５号）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ Ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの外毒素Ａ（ＰＥ）に由来する３８ｋＤの毒性エレメントを含む組換えのジスルフィド安定化抗ルイスＹ ＩｇＧκ免疫毒素である、ＬＭＢ−９のモノクローナル抗体（Ｂ３（ｄｓＦｖ）ＰＥ３８）（例えば、米国特許第５，９８０，８９５号）、およびＩＧＮ３１１ヒト化抗体（例えば、欧州特許第０ ５２８ ７６７号および米国特許第５，５６２，９０３号）が挙げられる。
ヒト化抗体ｈｕ３Ｓ１９３（Ａｔｔｉａ，Ｍ．Ａ．，ら、１７８７〜１８００）は、Ｌｅｙに対して例外的な特異性を有する腺癌細胞に対して惹起されたマウスモノクローナル抗体である３Ｓ１９３からＣＤＲグラフティングによって生成された（Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｋ．，１２９５７〜１２９６１）。Ｈｕ３Ｓ１９３は、Ｌｅｙについて３Ｓ１９３の特異性を保持するだけでなく、補体依存性の細胞毒性（本明細書において以降ではＣＤＣと呼ばれる）および抗体依存性の細胞毒性（本明細書において以降ではＡＤＣＣと呼ばれる）を媒介する能力も得ていた（Ａｔｔｉａ，Ｍ．Ａ．ら，１７８７〜１８００）。この抗体は、１２５Ｉ、１１１Ｉｎ、または１８Ｆで標識されたｈｕ３Ｓ１９３、ならびに１１１Ｉｎ、９９ｍＴｃまたは９０Ｙのようなキレート剤を要する他の放射性標識を用いた生体分布研究によって実証されるとおり、ヌードマウスにおいてＬｅｙを発現する異種移植片を標的する（Ｃｌａｒｋら，４８０４〜４８１１）。
本発明は、マウスモノクローナル抗体のＣＤＲ領域が、ルイスＹ抗原に特異的なヒト組換え抗体を生じるようにヒトアクセプターフレームワークにスプライシングされ得るという発見に基づいて、ルイスＹ抗原に特異的な多数のヒト化抗体を提供する。ＣＤＲは、当該分野で公知の任意の従来の命名法、例えば、Ｋａｂａｔナンバリングシステム、Ｃｈｏｔｈｉａナンバーシステム、またはＯｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ’ｓ ＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって用いられるＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａとの間の折衷であるＡｂＭ定義を用いて既定され得る。本発明の特に好ましい実施形態は、優れた抗原結合特性を有する例示的なヒト化抗体分子である。ルイスＹ抗原に特異的なヒト化組換え抗体を産生するためのプロトコールは、その全体が本明細書に援用される、米国特許第６，５１８，４１５号に説明される。前に考察したとおり、本発明の好ましい実施形態では、ヒト化ルイスＹ特異的抗体のＣＤＲは、マウス抗体３Ｓ１９３に由来する。
ＣＤＲがグラフティングされる場合、マウス、霊長類およびヒトのフレームワーク領域を含む、任意の適切なアクセプター可変領域フレームワーク配列が、ＣＤＲが由来するドナー抗体のクラス／タイプに関して用いられ得る。本発明において用いられ得るヒトフレームワークの例は、ＫＯＬ、ＮＥＷＭ、ＲＥＩ、ＥＵ、ＴＵＲ、ＴＥＩ、ＬＡＹおよびＰＯＭである（Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑ．ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、１：３１０〜３３４（１９９４））。例えば、ＫＯＬおよびＮＥＷＭは、重鎖に用いられ得、ＲＥＩは、軽鎖に用いられ得、そしてＥＵ、ＬＡＹおよびＰＯＭは、重鎖および軽鎖の両方に用いられ得る。
実際には、もとのマウス抗体の特異性を保持する有効なヒト化抗体の生成のためには、単にＣＤＲを代用することは通常十分ではない。ヒト可変領域フレームワークは、少数の重要なマウス抗体残基を含む必要がある。これらの残基の同一性は、もとのマウス抗体およびアクセプターのヒト抗体の両方の構造に依存する。従って、本明細書に記載されるヒト化抗体は、アクセプター抗体のいくつかの変更を含む、すなわち、ドナーモノクローナル抗体の結合特異性を保持するために必要なヒト、重鎖および／または軽鎖の可変ドメインフレームワーク領域。換言すれば、本明細書に記載されるヒト化抗体である、いくつかの実施形態のフレームワーク領域は、天然に存在するヒト抗体可変領域のフレームワーク領域の正確なアミノ酸配列から構成される必要はないが、マウス抗体３Ｓ１９３と同じ標的に特異的であるヒト化抗体領域の結合特性を改善する種々の置換を含む。非ヒトフレームワーク残基の大規模な導入を避けて、かつ最低のヒト化抗体免疫原性を確実にするために、フレームワーク領域に対して最低数の置換を行う。従って、本発明の状況では好ましい抗ルイスＹ抗体はｈｕ３Ｓ１９３およびＧ１９３である。
１実施形態では、本発明の抗体分子の改変体は、ルイスＹに関しており、ルイスＹについて改善された親和性を示す。このような改変体は、ＣＤＲを変異させること（Ｙａｎｇら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５４，３９２〜４０３，１９９５）、鎖シャッフリング（ｃｈａｉｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（Ｍａｒｋｓら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，７７９〜７８３，１９９２）、Ｅ．ｃｏｌｉのミューテーター株の使用（Ｌｏｗら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５０，３５９〜３６８，１９９６）、ＤＮＡシャッフリング（Ｐａｔｔｅｎら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，８，７２４〜７３３，１９９７）、ファージディスプレイ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５６，７７〜８８，１９９６）およびＰＣＲ（Ｃｒａｍｅｒｉら，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，２８８〜２９１，１９９８）を含む多数の親和性成熟プロトコールによって得ることができる。
本発明のヒト化抗体は、ポリペプチドの産生（例えば、インビトロ合成）、組換えＤＮＡ産生などのために有用な種々の方法によって生成され得る。好ましくは、ヒト化抗体は、組換えＤＮＡ技術によって生成される。従って、本発明のヒト化ルイスＹ特異的抗体は、ＤＮＡ技術を用いる組換えタンパク質発現方法によって産生され得る。ＤＮＡ（例えば、ポリヌクレオチド）を操作するための技術は、分子生物学的の当業者に周知である。このような周知の技術の例は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ第２版，Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）に見出すことができる。ヒト化免疫グロブリンを含む、免疫グロブリンの組換え発現のための技術はまた、とりわけ、Ｇｏｅｄｄｅｌら，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１８５巻，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９１），およびＢｏｒｒｅｂａｃｋ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ（１９９２）に見出すことができる。組換え抗体の生成、設計および発現に関するさらなる情報は、Ｍａｙｆｏｒｔｈ，Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（１９９３）に見出すことができる。従来の分子生物学的技術の例としては、限定はしないが、インビトロライゲーション、制限エンドヌクレアーゼ消化、ＰＣＲ、細胞の形質転換、ハイブリダイゼーション、電気泳動、ＤＮＡ配列決定などが挙げられる。
本発明のベクターの構築、本発明の宿主細胞を産生するための細胞のトランスフェクション、本発明の抗体を産生するための細胞の培養のための一般的な方法は全て、従来の分子生物学の方法である。同様に、一旦産生されれば、本発明の組換え抗体は、クロスフロー濾過、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、ダイアフィルトレーションなどを含む、当該分野の標準的な手順によって精製され得る。組換え抗体を発現するために用いられる宿主細胞は、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、または好ましくは真核生物細胞のいずれであり得る。好ましくは、哺乳動物細胞、例えば、ＰＥＲ．Ｃ．６細胞またはチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）を用いる。発現ベクターの選択は、宿主細胞の選択に依存し、そして選択された宿主細胞において所望の発現および調節の特徴を有するように選択される。
分離プロセスと一緒に、特定の共溶媒、添加物および特定の反応条件を使用して、ＬＣＦの有意な減少を伴う単量体の細胞毒性薬物誘導体抗体結合体の形成が得られる。凝集型に対して、この結合体の単量体の形成は、有意な治療価を有しており、そしてＬＣＦの最小化および実質的な凝集の減少は、より高度に結合体化された画分（ＨＣＦ）とＬＣＦが競合することを妨げることによって、治療上有意義な様式での抗体出発材料の利用という結果をもたらす。
本発明の状況では、単量体の細胞毒性薬物結合体とは、抗体の有意な凝集なしに多数のカリケアマイシン分子に対して共有結合される単独の抗体をいう。抗体に対して共有結合されたカリケアマイシン部分の数はまた、薬物ローディングとも呼ばれる。例えば、本発明によれば、平均のローディングは、１抗体あたり０．１〜１０または１５のいずれかのカリケアマイシン部分であり得る。結合体の所与の集団（例えば、組成物または処方物中）は、薬物ローディングに関して異種であっても同種であってもよい。異種の集団では、平均ローディングは、抗体に結合体化された薬物分子の平均数（またはモル）に相当するので、１抗体あたりの薬物部分の実際の数はかなり変化し得る。非結合体化抗体または有意な結合体化に満たない抗体を有する所与の集団における抗体の割合は、低結合画分すなわちＬＣＦと呼ばれる。
非求核性で、タンパク質適合性の緩衝化溶液とのデオキシコール酸の使用によって、より高い薬物ローディング／収率で、かつ凝集の減少をともなう、優れた活性を有する単量体の細胞毒性薬物誘導体／キャリア結合体を一般に生成することが見出された。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＯＳｕ）エステルまたは他の比較的活性化されたエステルから作製された結合体にとって好ましい緩衝溶液は、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ−（４−ブタンスルホン酸）（ＨＥＰＢＳ）またはＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ緩衝液）である。このような結合体化反応において用いられる緩衝化溶液は、遊離のアミンも求核試薬も含むことはできない。当業者は、他のタイプの結合体に関して受容可能な緩衝液を容易に決定することができる。
単量体結合体を効率的に形成するために必要な添加物の量はまた、抗体間で異なる。この量はまた、過度の実験なしに当業者によって決定され得る。本発明の反応では、抗体の濃度は、１〜１５ｍｇ／ｍｌの範囲におよんでもよく、そしてカリケアマイシン誘導体、例えば、Ｎ−アセチルγカリケアマイシンＤＭＨ ＡｃＢｕｔ ＯＳｕエステルの濃度は、抗体の約３〜９重量％におよぶ。
共溶媒は代替的には、エタノールであり得、６〜１１．４％（容積に基づく）の範囲の濃度で良好な結果が実証されている。この反応は、ＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ−（４−ブタンスルホン酸）（ＨＥＰＢＳ）、または他の競合的な緩衝液中で、約７〜約９、好ましくは８〜９のｐＨで、約２５℃〜約４０℃の範囲の温度で、好ましくは約３０℃〜約３５℃で、そして１５分から２４時間の範囲の時間で行なわれ得る。さらに好ましくは、この反応は、約８．２のｐＨで行なわれる。当業者は、他のタイプの結合体について受容可能なｐＨの範囲を容易に決定可能である。種々の抗体に関して、上述の添加物の組み合わせにおけるわずかな変更の利用は、薬物ローディングおよび単量体結合体の収率を改善することが見出されており、そして任意の特定の抗体は、最適の結果を得るには正確な条件または添加物の選択においていくつかのわずかな変更を要し得るということが理解される。
結合体化後、単量体の結合体は、非結合体化反応物（例えば、タンパク質のキャリア分子／抗体および遊離の細胞毒性薬物／カリケアマイシン）から精製されてもよく、そして／または結合体の凝集型から精製されてもよい。精製のための従来の方法（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）、等電点電気泳動（ＣＦ）が用いられ得る。例えば、クロマトグラフィー）による分離後、この結合体は、限外濾過されても、そして／またはダイアフィルトレーションされてもよい。
精製された結合体は、単量体であって、通常、３〜９重量％の細胞毒性薬物／カリケアマイシンを含む。好ましい実施形態では、この結合体は、ＨＩＣを用いて精製される。細胞毒性薬物が、カリケアマイシン誘導体のように高度に疎水性の性質を有し、そして結合体中で用いられる場合、ＨＩＣは結合体化された抗体と非結合体化抗体の有効な分離を得るために好ましい候補である。ＨＩＣは、ＳＥＣを上回る３つの重要な利点がある：（１）ＨＩＣは、ＬＣＦ含量と同様に凝集物を効率的に減少させる能力を有する；（２）ＨＩＣについてのカラムローディング容量はより高い；そして（３）ＨＩＣは生成物の過度の希釈を回避する。ブチル、フェニルおよびオクチルセファロース４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）のような、製造規模での使用に適切な、多数の高容量のＨＩＣ媒体は、結合体化プロセスの後、単量体の結合体化成分から未結合の結合体および結合体の凝集物を効率的に分離し得る。
好ましくは、ＨＩＣは、ローディングを伴うブチルセファロースＦＦ樹脂、および０．６０Ｍのリン酸カリウムの洗浄緩衝液および２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／２５ｍＭ ＮａＣｌの溶出緩衝液を用いて行う。また好ましくは、限外濾過は再生したセルロース膜を用いて行なわれ、ダイアフィルトレーションは、１０倍透析容積の２０ｍＭのＴｒｉｓ／１０ｍＭのＮａＣｌの緩衝液を用いて８．０のｐＨで行われる。
このように、本発明のプロセスによれば、精製工程後、結合体の平均ローディングは、ＩｇＧ１抗体１モルあたりカリケアマイシン約５〜約７モルである。さらに、精製工程後、結合体の低結合体化画分（ＬＣＦ）は、約１０％未満である。
本発明はまた、これらのプロセスによって調製された結合体を提供する。このような結合体は好ましくは、裸の抗体の結合反応速度および特異性を保持している。従って、本発明の結合体は好ましくは、ＢＩＡｃｏｒｅ分析によって決定した場合、約１００〜４００ｎＭ、好ましくは３．４×１０−７ＭのＫＤを有し、ルイスＹ抗原に結合し、そしてルイスＸおよびＨ−２血液型群抗原に結合せず、細胞毒性活性を有し、そして／または抗腫瘍活性を有する。結合体の結合反応速度および特異性を決定するためには、ＦＡＣＳまたはＢＩＡｃｏｒｅ分析のような、任意の公知の方法を用い得る。
本発明のプロセスによって調製された好ましいカリケアマイシン結合体は、抗ルイスＹ抗体Ｇ１９３に共有結合された、加水分解性のリンカー４−（４−アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）に共有結合されたＮ−アセチルγカリケアマイシンジメチルヒドラジド（Ｎ−アセチルカリケアマイシンＤＭＨ）であって（ＣＭＤ−１９３またはＣＭＤと様々に呼ばれる）、このカリケアマイシン結合体の平均ローディングは、抗体１モルあたりカリケアマイシン約５〜約７モルであり、そしてこの結合体の低結合体化画分（ＬＣＦ）は約１０％未満である。
また本発明によって、薬学的に受容可能な賦形剤、希釈剤またはキャリアと一緒になって抗ルイスＹ抗体に共有結合したカリケアマイシン−加水分解性リンカーの結合体を含む組成物が提供される。従って、本発明による好ましい組成物は、Ｇ１９３に共有結合されたＮ−アセチルγカリケアマイシンジメチルヒドラジド−４−（４−アセチルフェノキシ）ブタン酸（Ｎ−アセチルカリケアマイシンＤＭＨ−ＡｃＢｕｔ）の結合体を含み、ここでこの平均ローディングは、Ｇ１９３の１モルあたり、約５〜約７モルのＮ−アセチルカリケアマイシンＤＭＨであり、そしてこの結合体の低結合体化画分（ＬＣＦ）は約１０％未満である。
ヒト化したルイスＹ特異的抗体は、ヒトまたはヒト化モノクローナル抗体のような他の抗体（またはその一部）と組み合わせて、またはそれと結合されて用いられ得る。これらの他の抗体は、本発明の抗体が関連する疾患に対して特徴的な他のマーカー（エピトープ）と反応性であり得、または、例えば疾病状態の細胞に対してヒト免疫系の分子または細胞を補充するための、種々の目的の特性を有してもよい。本発明の抗体（またはその一部）は、別々に投与された組成物として、このような抗体（またはその一部）とともに投与されてもよいし、または従来の化学的方法によってもしくは分子生物学的方法によって結合された２つの因子を有する単独の組成物として投与されてもよい。さらに、本発明の抗体の診断的および治療的な価値は、検出可能シグナルを生じる標識で（インビトロまたはインビボのいずれか）、または治療特性を有する標識で、このヒト化抗体を標識することによって増強され得る。いくつかの標識（例えば、放射性核種）は、検出可能シグナルを生じ、かつ治療特性を有し得る。放射性核種標識の例としては、１２５Ｉ、１３１１、１４Ｃが挙げられる。他の検出可能な標識の例としては、蛍光顕微鏡用の蛍光発色団（例えば、フルオレセイン、フィコビリプロテインまたはテトラエチルローダミン）、電子顕微鏡による実証のための電子高密度生成物を生じる、蛍光、吸光可視色または凝集による検出のための蛍光または着色生成物を生じる酵素；あるいは、直接または間接的な電子顕微鏡可視化のための高電子密度の分子（例えば、フェリチン、ペルオキシダーゼまたは金ビーズ）が挙げられる。治療特性を有する標識としては、メトトレキサートなどのような癌の処置のための薬物が挙げられる。
単量体の細胞毒性薬物誘導体／キャリア結合体は、治療もしくは診断の組成物／処方物における唯一の活性成分であってもよいし、または他の抗体成分（例えば抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ３３、抗Ｔ細胞、抗ＩＦＮγもしくは抗ＬＰＳ抗体）、または非抗体成分（例えば、サイトカイン、増殖因子、ホルモン、抗ホルモン、細胞毒性薬物およびキサンチン）を含む、他の活性成分（例えば、下記の化学療法剤、ホルモン療法剤または生物学的治療剤）をともなってもよい。
これらの組成物／処方物は、癌を処置するために患者に投与され得る。本発明によれば、カリケアマイシン−抗ルイスＹ抗体結合体、凍結保護物質、界面活性物質、緩衝化剤および電解質の治療有効量の組成物または処方物は、それを必要とする患者に投与される。あるいは、この組成物または処方物は、癌の処置のための医薬の製造に用いられる。この方法または医薬は、細胞表面でルイスＹ抗原を発現する細胞によって特徴付けられる増殖性障害を有する任意の患者を処置するために用いられ得るということが理解されるべきである。従って、１実施形態では、処置される癌はルイスＹ抗原に陽性である。癌は好ましくは、多数のルイスＹ抗原を発現するもの（すなわち、高ルイスＹ発現腫瘍）である。処置される癌は、癌腫であり得、好ましくは非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）または乳癌であるか、あるいは前立腺癌または結腸直腸癌である。
好ましくは、ｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭまたはＣＭＤ−１９３は、本明細書に開示される組成物または医薬で処置されている被験体に存在するルイスＹを発現する細胞のレベルを減少させることが所望される、任意の治療で利用され得る。詳細には、この組成物または医薬は、増殖性障害（すなわち細胞表面上でルイスＹ抗原を発現する癌腫）を有するヒトまたは動物を処置するために用いられる。これらのルイスＹ発現細胞は、身体中に循環され得るか、または身体の特定の部位に局在して望ましくないほど多数存在し得る。
本発明の処置方法は、手術、放射線、化学療法、ホルモン療法、生物学的療法、骨髄移植（白血病および極めて高用量の化学療法が必要である他の癌のために）を含む他の癌処置と組み合わせて用いられてもよい。癌の生物学の理解の向上に基づいて新規な処置がまた現在開発中であり、承認される。
２つの一般的なクラスの放射線療法が存在し、そして本発明の方法に用いられ得る。１つのクラスでは、放射性同位体の直接移植である近接照射療法を腫瘍に行って、高用量をその領域に送達させる。他のクラスでは、遠隔療法（ビーム）を用いて、放射線を身体の広い領域に送達するか、または全身照射（ＴＢＩ）で全身に送達する。
任意の適切な化学療法剤が本発明で用いられ得る。これらの化学療法剤は一般に、以下のクラスにおさまる（各々の例を付記する）：代謝アンタゴニスト（例えば、葉酸アンタゴニスト、例えば、メトトレキサート、プリンアンタゴニスト、例えば、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）、およびピリミジンアンタゴニスト、例えば、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ））；アルキル化剤（シクロホスファミド）；ＤＮＡ結合剤（シスプラチンまたはオキサリプラチン）；抗腫瘍抗生物質（ドキソルビシンまたはミトキサントロン）；分裂インヒビター（例えば、タキサンもしくはビンクリスチンのような微小管インヒビター）またはトポイソメラーゼインヒビター（カンプトテカンもしくはタキソール）。さらなる具体例を以下に記載する。
本発明に関するホルモン療法としては、例えば、白血病および骨髄腫のためのコルチコステロイド、乳癌のためのエストロゲンおよび抗エストロゲン、ならびに前立腺癌のためのアンドロゲンおよび抗アンドロゲンが挙げられる。
生物学的治療は、身体由来の物質を使用する。本発明における適切な療法の例としては、抗体（例えば、抗ＥＧＦＲ抗体、例えば、セツキシマブもしくはトラスツズマブ、または抗ＶＥＧＦ抗体、例えば、ベバシズマブ）、Ｔ細胞療法、インターフェロン、インターロイキンおよび造血性増殖因子が挙げられる。
骨髄移植は、いくつかの癌、とりわけ白血病の処置のために用いられ得る。白血病を処置するには、患者の骨髄細胞を化学療法または放射線処置によって破壊する。次いで、細胞表面上のＨＬＡ抗原が適合しているかほぼ適合しているドナー由来の骨髄を患者に導入する。骨髄移植はまた、腫瘍細胞を殺傷するために極めて高用量の放射線または化学療法を要する患者の骨髄を置き換えるために用いられる。移植はドナーの供給源に基づいて分類される。同種異系移植では、骨髄ドナーはしばしば遺伝的に無関係であるが、免疫系によって認識される主要なタンパク質である６つの細胞表面抗原（ＨＬＡ抗原）のうち少なくとも５つが適合している。自家移植では、患者は化学療法または放射線処置後に自分自身の骨髄を戻される。このタイプの骨髄移植は、従来の処置用量では有効性が不完全である、骨髄に無関係な癌に用いられ得る。
さらに、本発明の方法において用いられ得る新規に出現したアプローチ（そのいくつかは承認されるか臨床試験中である）は、ガンおよび疾患の進行の分子的基礎および細胞的基礎の理解の増大に基づいて開発されている。リン酸化カスケードを阻害するプロテインキナーゼインヒビター（低分子および抗体の両方）を用いてもよい（例えば、エルロチニブ（ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）またはイマチニブ（ｉｍａｔｉｎｉｂ）のメシレート）。ガン細胞の伝播および新しい組織の浸潤をブロックする任意の抗転移剤を用いてもよい。腫瘍に栄養を与える血管の発達をブロックする抗血管形成剤を用いてもよい（例えば、サリドマイド）。用いられ得る他の因子は、腫瘍細胞の増殖を生じる異常なタンパク質の産生をブロックするアンチセンスオリゴヌクレオチドである。遺伝子療法はまた、患者に注射されてかつ特定の腫瘍細胞を殺傷するように設計される遺伝子を、Ｔ細胞に導入するために用いられてもよい。ｐ５３はまた、例えば、化学療法薬物に対する感度を再確立するために、変異体のガン細胞に正常なｐ５３遺伝子を導入することによって標的化され得る。
１実施形態では、本発明の組成物／処方物は、生物活性因子と組み合わせて用いられる。一般に用いられる生物活性因子としては、抗体、増殖因子、ホルモン、サイトカイン、抗ホルモン、キサンチン、インターロイキン、インターフェロン、細胞毒性薬物および抗血管新生タンパク質が挙げられる。
ガンのような増殖性障害を処置するために一般に用いられ、カリケアマイシン−抗ルイスＹ抗体結合体と一緒に用いられ得る生物活性の細胞毒性薬物としては以下が挙げられる：アントラサイクリン、例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、アクラルビシン、ゾルビシン、ミトザントロン、エピルビシン、カルビシン（ｃａｒｕｂｉｃｉｎ）、ノガラマイシン（ｎｏｇａｌａｍｙｃｉｎ）、メノガリル（ｍｅｎｏｇａｒｉｌ）、ピタルビシン（ｐｉｔａｒｕｂｉｃｉｎ）およびバルルビシン（ｖａｌｒｕｂｉｃｉｎ）を最大３日間；ピリミジンまたはプリンヌクレオシド、例えば、シタラビン、ゲムシタビン、トリフルリジン、アンシタビン（ａｎｃｉｔａｂｉｎｅ）、エノシタビン、アザシチジン（ａｚａｃｉｔｉｄｉｎｅ）、ドキシフルリジン、ペントスタチン、ブロクスウリジン（ｂｒｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、カペシタビン、クラドリビン、デシタビン（ｄｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、フロクスウリジン、フルダラビン、グウゲロチン（ｇｏｕｇｅｒｏｔｉｎ）、プロマイシン、テガフール、チアゾフリン（ｔｉａｚｏｆｕｒｉｎ）；アルキル化剤、例えば、シクロホスファミド、メルファラン、チオテパ、イホスファミド、カルムスチン、シスプラチン、ＣＫＤ−６０２、レドキサントロン（ｌｅｄｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、ルビテカン（ｒｕｂｉｔｅｃａｎ）、塩酸トポテカン、ＬＥ−ＳＮ３８、塩酸アフェレテカン、ＸＲ−１１５７６およびＸＲ−１１６１２；代謝拮抗剤、例えば、メトトレキサート、５フルオロウラシル、テガフール／ウラシル（ＵＦＴ）、ラリチトレキセド（ｒａｌｉｔｉｔｒｅｘｅｄ）、カペシタビン、ロイコボリン／ＵＦＴ、Ｓ−１、ペメトレキセド二ナトリウム、テザシタビン、グルクロン酸トリメトレキセート、チメクタシン（ｔｈｙｍｅｃｔａｃｉｎ）、デシタビン（ｄｅｃｉｔａｂｉｎｅ）；抗腫瘍抗体、例えば、エドレコロマブ（ｅｄｒｅｃｏｌｏｍａｂ）、マイトマイシン、マイトマイシンＣおよびオキサリプラチン；ビンカ・アルカロイド、例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、無水ビンブラスチン；血管形成阻害薬、例えば、コハク酸ベタラニブ（ｖａｔａｌａｎｉｂ ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）、オグルファニド（ｏｇｌｕｆａｎｉｄｅ）、ＲＰＩ−４６１０；シグナル伝達阻害薬、例えば、ゲフィチニブ、３１７６１５．２ ＨＣＬ、インジスラム（ｉｎｄｉｓｕｌａｍ）、ラパチニブ（ｌａｐａｔｉｎｉｂ）、ソラフェニブ（ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）、ＷＨＩ−Ｐ１３１；アポトーシス誘導因子、例えば、塩酸アルボシジブ（ａｌｖｏｃｉｄｉｂ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、イロフルベン（ｉｒｏｆｕｌｖｅｎ）、フェニル酪酸ナトリウム、ボルテゾミブ（ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ）、エキシスリンド（ｅｘｉｓｕｌｉｎｄ）、ＭＳ−２１６７；エピポドフィロトキシン、例えば、エトポシド；ならびにタキサン、例えば、パクリタキセル、ドセルタキセル、ＤＨＡ−パクリタキセル、イキサベピロン（ｉｘａｂｅｐｉｌｏｎｅ）、ポリグルタミン酸パクリタキセル、またはエポチロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅｓ）。
ｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭまたはＣＭＤ−１９３またはＡＧ Ｇ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭと組み合わせて投与され得る他の化学療法／抗悪性腫瘍剤としては、アドリアマイシン、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、デカルバジン、イホスファミド、ビンデシン、ゲムシタビン、エダトレキセート、イリノテカン、メクロレタミン、アルトレタミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、カルボプラチン、テニポシド、トポテカン、ゲムシタビン、チオテパ、フルクスウリジン（ＦＵＤＲ）、ＭｅＣＣＮＵ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ミトザントロン、ブレオマイシン、メクロレタミン、プレドニゾン、プロカルバジンメトトレキサート、フルオロウラシル、エトポシド、タキソールおよびその種々のアナログ、マイトマイシン、サリドマイドおよびその種々のアナログ、ＧＢＣ−５９０、トロキサシタビン（ｔｒｏｘａｃｉｔａｂｉｎｅ）、ＺＹＣ−３００、ＴＡＵ、（Ｒ）フルルビプロフェン、塩酸ヒスタミン、タリクイダール（ｔａｒｉｑｕｉｄａｒ）、ｄａｖａｎａｔ−１、ＯＮＴ−０９３が挙げられる。投与はこれらの治療因子のうちの１つ以上と同時であってもよいし、あるいはこれらの治療因子のうちの１つ以上と連続してでもよい。
本発明の抗体結合体と投与され得る生物活性抗体としては、限定はしないが、ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）、Ｚｅｖａｌｉｎ、Ｂｅｘｘａｒ、Ｃａｍｐａｔｈ、セツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、ベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、ＡＢＸ−ＥＧＦ、ＭＤＸ−２１０、パーツズマブ（ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）、トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、Ｉ−１３１ ｃｈ−ＴＮＴ−１／ｂ、ｈＬＭ６０９、６Ｈ９、ＣＥＡ−Ｃｉｄｅ Ｙ９０，ＩＭＣ−１Ｃ１１、ＩＮＧ−１、シブロツズマブ（ｓｉｂｒｏｔｕｚｕｍａｂ）、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１ Ｍａｂ、ＹＭＢ−１００３、２Ｃ５、ギバレックス（ｇｉｖａｒｅｘ）およびＭＨ−１が挙げられる。
カリケアマイシン−抗ルイスＹ抗体結合体はまた、単独で投与されても、または増殖因子、サイトカイン、ステロイド、抗体、例えば抗ルイスＹ抗体、リツキシマブおよび化学療法剤のような他の生物活性因子と組み合わせて同時か、もしくは連続して処置レジメンの一部として投与されてもよい。カリケアマイシン−抗ルイスＹ抗体結合体はまた、単独で投与されても、または任意の上記で同定された治療レジメンと同時か、もしくは連続して導入治療段階、地固め療法（ｃｏｎｓｏｌｉｄａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ）段階および維持療法段階の一部として投与されてもよい。
本発明の結合体はまた、再発した侵襲性の癌腫の処置のための併用化学療法レジメンの一部として他の生物活性および化学療法剤と一緒に投与されてもよい。このような処置レジメンとしては以下が挙げられる：ＣＡＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、シスプラチン）、ＰＶ（シスプラチン、ビンブラスチンまたはビンデシン）、ＣＥ（カルボプラチン、エトポシド）、ＥＰ（エトポシド、シスプラチン）、ＭＶＰ（マイトマイシン、ビンブラスチンまたはビンデシン、シスプラチン）、ＰＦＬ（シスプラチン、５−フルオロウラシル、ロイコボリン）、ＩＭ（イホスファミド、マイトマイシン）、ＩＥ（イホスファミド、エトポシド）；ＩＰ（イホスファミド、シスプラチン）；ＭＩＰ（マイトマイシン、イホスファミド、シスプラチン）、ＩＣＥ（イホスファミド、カルボプラチン、エトポシド）；ＰＩＥ（シスプラチン，イホスファミド，エトポシド）；ビオレルビンおよびシスプラチン；カルボプラチンおよびパクリタキセル；ＣＡＶ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン）、ＣＡＥ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、エトポシド）；ＣＡＶＥ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、エトポシド）；ＥＰ（エトポシド、シスプラチン）；ＣＭＣｃＶ（シクロホスファミド、メトトレキサート、ロムスチン、ビンクリスチン）；ＣＭＦ（シクロホスファミド、メトトレキサート、５−フルオロウラシル）；ＣＡＦ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル）；ＣＥＦ（シクロホスファミド、エピルビシン、５−フルオロウラシル）；ＣＭＦＶＰ（シクロホスファミド、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、ビンクリスチン、プレドニゾン）；ＡＣ（ドキソルビシン、シクロホスファミド）；ＶＡＴ（ビンブラスチン、ドキソルビシン、チオテパ）；ＶＡＴＨ（ビンブラスチン ドキソルビシン、チオテパ、フルオシメステロン）；ＣＤＤＰ＋ＶＰ−１６（シスプラチン、エトポシド、マイトマイシンＣ＋ビンブラスチン）。
本発明はまた、ルイスＹを発現する細胞によって特徴付けられる増殖性障害に罹患しているかまたはそのリスクにあるヒト被験体または動物被験体を処置する方法を提供し、この方法は、本発明のカリケアマイシン−抗ルイスＹ抗体結合体の有効量を被験体に投与する工程を包含する。処置するとは、腫瘍増殖の遅延および転移の阻害を含む、ガンの増殖を阻害、予防または遅らせることを意味することが理解されるべきである。
本発明の組成物／処方物は、第二選択（ｓｅｃｏｎｄ−ｌｉｎｅ）の単独療法として投与され得る。第二選択とは、その例が上記されている種々の抗癌処置での処置後に、本発明の組成物／処方物が用いられることを意味する。あるいは、この組成物または処方物は、上記の別の抗癌処置での第一選択（ｆｉｒｓｔ−ｌｉｎｅ）の併用療法として投与されてもよい。
本発明のヒト化抗体組成物は、種々の方法で患者に投与され得る。この組成物の直接送達は一般に、注射によって、皮下に、腹腔内に、静脈内にもしくは筋肉内に達成され、または組織の間質腔に送達される。好ましくは、薬学的組成物は、非経口的に、すなわち、皮下に、筋肉内に、静脈内に投与され得る。この組成物はまた、病変に投与されてもよい。投薬処置は、単回用量スケジュールであっても、複数回用量スケジュールであってもよい。
従って、本発明は、ヒトモノクローナル抗体の溶液、または受容可能なキャリア、好ましくは水性のキャリアに溶解されたそのカクテルを含む、非経口投与のための組成物／処方物を提供する。例えば、カリケアマイシン−抗ルイスＹ抗体結合体、凍結保護物質、界面活性物質、緩衝化剤、および電解質の処方物。
種々の水性キャリア、例えば、水、緩衝化水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシンなどを用いてもよい。これらの溶液は、無菌であり、そして一般には粒子状物質を含まない。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技術によって滅菌され得る。この組成物は、適切な生理学的条件に必要な場合、ｐＨ調節剤および緩衝化剤、毒性調節剤（例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム）など、薬学的に受容可能な補助物質を含んでもよい。これらの処方物中の抗体の濃度は、例えば、約０．５重量％未満、通常は約１重量％または少なくとも約１重量％から、１５重量％または２０重量％程まで広範に変化し得、そして例えば、選択される投与の特定の様式に従って、液体の容積および粘度に主に基づいて選択される。
組成物中の活性成分は抗−ルイスＹ抗体−カリケアマイシン結合体であることが理解される。従って、この組成物は消化管における分解に対して感受性である。従って、この組成物が消化管を用いる経路によって投与されるべき場合、この組成物は分解からタンパク質のキャリアを保護するが、一旦消化管から吸収されればこの結合体を放出させる因子を含む必要がある。
非経口的に投与可能な組成物を調製するための実際の方法および被験体に対する投与に必要な調節は、当業者に公知であるか、または明らかであり、そして、参考として本明細書に援用される、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，第１５版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９８０）にさらに詳細に記載される。薬学的に受容可能なキャリアの詳細な考察は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．１９９１）に利用可能である。
組成物は、患者に個々に投与されてもよいし、または他の因子、薬物またはホルモンと組み合わせて投与されてもよい。ガンのような増殖性障害を処置するために用いられ得、そして本発明の細胞毒性薬物誘導体／キャリア結合体と一緒に用いられ得るサイトカインおよび増殖因子としては、インターフェロン、インターロイキン、例えば、インターロイキン２（ＩＬ−２）、ＴＮＦ、ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦが挙げられる。ガンのような増殖性障害を処置するために一般に用いられ、そして本発明の細胞毒性薬物誘導体／キャリア結合体と一緒に用いられ得るホルモンとしては、エストロゲン（ジエチルスチルベストロール、エストラジオール）、アンドロゲン（テストステロン、ハロテスチン（Ｈａｌｏｔｅｓｔｉｎ））、プロゲスチン（Ｍｅｇａｃｅ、Ｐｒｏｖｅｒａ）、およびコルチコステロイド（プレドニゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン）が挙げられる。抗ホルモン、例えば、抗エストロゲン（タモキシフェン）、抗アンドロゲン（フルタミド）および抗アドレナリン因子が通常、ガンのような増殖性障害を処置するために用いられ、そして本発明の細胞毒性薬物誘導体／キャリア結合体と一緒に用いられてもよい。
さらに、ガンのような増殖性障害を処置するために一般に用いられ、そして本発明の細胞毒性薬物誘導体／キャリア結合体と一緒に用いられ得る化学療法剤／抗腫瘍性因子としては、限定はしないが、アドリアマイシン、シスプラチン、カルボプラチン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、メトトレキサート、ドキソルビシン、フルオロウラシル、エトポシド、タキソールおよびその種々のアナログ、マイトマイシン、サリドマイドおよびその種々のアナログが挙げられる。
薬学的組成物／処方物は好ましくは、治療有効量の本発明の結合体を含むべきである。本明細書において使用される用語、治療有効量は、標的化される疾患もしくは状態を処置、改善もしくは予防するために、または検出可能な治療もしくは予防的な効果を示すために必要な治療因子の量を指す。任意の結合体に関して、治療上有効な用量は最初に、細胞培養アッセイまたは動物モデルのいずれかにおいて、通常はげっ歯類、ウサギ、イヌ、ブタもしくは霊長類において評価され得る。動物モデルはまた、適切な濃度範囲および投与経路を決定するために用いられ得る。次いで、このような情報を用いて、ヒトにおける投与に有用な用量および経路を決定し得る。
ヒト被験体に対する正確な有効量はまた、疾患状態の性質および重篤度、被験体の全体的な健康状態、被験体の年齢、体重および性別、食事、投与の時間および頻度、薬物併用、治療に対する反応感度および耐性／応答に依存する。この結合体が、既存の状態を処置するために予防的に用いられる場合、これも有効量に影響する。この量は慣用的な実験によって決定され得、そして臨床家の判断の範疇内である。一般には、有効用量は、タンパク質のキャリアに基づいて計算して、０．０１ｍｇ／ｍ２〜５０ｍｇ／ｍ２、好ましくは０．１ｍｇ／ｍ２〜２０ｍｇ／ｍ２、より好ましくは約１０〜１５ｍｇ／ｍ２である。
用量の頻度は、この結合体の半減期およびその持続期間に依存する。この結合体が短い半減期（例えば、２〜１０時間）を有する場合、１日あたり１回以上の用量を与えることが必要であり得る。あるいは、この結合体分子が長い半減期（例えば、２〜１５日）を有する場合、１日あたり１回、１週あたり１回、または１もしくは２ヶ月ごとに１回の投薬量を与える必要だけでよい。
組成物はまた、抗体結合体の投与のために薬学的に受容可能なキャリアを含んでもよい。薬学的なキャリアは、患者に対するモノクローナル抗体の送達に適切な任意の適合性の非毒性物質であってもよい。滅菌水、アルコール、脂肪、ろうおよび不活性な固体がキャリアに含まれてもよい。キャリアは、それ自体で、組成物を受容する個体に対して有害な抗体の産生を誘導してはならず、かつ毒性であってもいけない。適切なキャリアとは、大きい、緩徐に代謝される高分子、例えば、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、ポリサッカライド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマーおよび不活性なウイルス粒子であってもよい。薬学的に受容可能なアジュバント（緩衝化剤、分散剤）も薬学的組成物に組み込まれてもよい。
薬学的に受容可能な塩は、例えば、無機酸の塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩および硫酸塩、または有機酸の塩、例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩および安息香酸塩が用いられ得る。
治療用組成物／処方物における薬学的に受容可能なキャリアはさらに、水、生理食塩水、グリセロールおよびエタノールのような液体を含んでもよい。補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤またはｐＨ緩衝化物質が、このような組成物中に存在してもよい。このようなキャリアによって組成物は、患者による摂取のための、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリーおよび懸濁剤として処方することが可能になる。
投与のために好ましい形態としては、例えば、注射または注入による、例えば、ボーラス注射または持続注入による、非経口投与に適切な形態が挙げられる。この生成物が注射または注入のためである場合、これは油状または水性のビヒクル中で懸濁物、溶液またはエマルジョンの形態をとってもよく、そして懸濁剤、保存剤、安定化剤および／または分散剤のような処方剤を含んでもよい。
緩衝化結合体溶液の安定性は、短時間では十分であるが、長期の安定性は乏しい。結合体の安定性を増強するため、そしてその保存期間を延ばすために、抗体−薬物結合体を、適切な無菌の液体による使用前の再構成のための、乾燥形態に凍結乾燥してもよい。タンパク質溶液の凍結乾燥に伴う問題は十分実証されている。二次、三次および四次構造の消失が、凍結および乾燥のプロセスの間に生じ得る。それらを溶液中で凍結保護物質（ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）、界面活性物質、緩衝化剤および電解質と接触させ、次いでその溶液を凍結乾燥させることによって、これらの組成物／処方物の生理学的活性が保存できる。凍結乾燥保護物質（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）も溶液中に添加されてもよい。
安定な処方物とは、その中にある抗体が本質的に、保存の際に、その物理的安定性および化学的安定性ならびに完全性を保持している処方物である。抗体安定性を測定するための種々の分析技術は、当該分野で利用可能であり、そして、Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２４７−３０１，Ｖｉｎｃｅｎｔ Ｌｅｅ Ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｐｕｂｓ．（１９９１）、およびＪｏｎｅｓ，Ａ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．１０：２９−９０（１９９３）に概説される。安定性は、選択された時間にわたって選択された温度で測定され得る。迅速なスクリーニングのために、処方物を、４０℃で２週間〜１ヶ月間保管してもよく、その時点で安定性が測定される。処方物が２〜８℃で保管されるべき場合、一般にはこの処方物は３０℃または４０℃で少なくとも１ヶ月安定であるか、および／または２〜８℃で少なくとも２年間安定でなければならない。処方物が３０℃で保管されるべき場合、一般にはこの処方物は３０℃で少なくとも２年間安定であるか、および／または４０℃で少なくとも６ヶ月間安定でなければならない。凍結乾燥後および保管後の凝集の程度は、抗体安定性の指標として用いられ得る。例えば、安定な処方物とは、抗体の約１０％未満、そして好ましくは約５％未満が、処方物中で凝集物として存在する処方物であり得る。他の実施形態では、凍結乾燥および凍結乾燥された処方物の保管後の凝集物形成のあらゆる増大が決定され得る。例えば、安定な凍結乾燥処方物とは、この凍結乾燥された処方物が、２〜８℃で少なくとも１年間保管されたとき、この凍結乾燥された処方物における凝集の増大が約５％未満、そして好ましくは約３％未満である処方物であり得る。さらに、抗体処方物の安定性は、生理学的な活性のアッセイを用いて測定され得る。
凍結乾燥プロセスの間、この結合体の非晶性の安定化剤として作用するように、そしてタンパク質の構造の完全性を維持するように、凍結保護物質が含まれる必要があり得る。１実施形態では、本発明において有用な凍結保護物質は、糖アルコール、例えば、アルジトール、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、ポリスチレングリコールおよびその組み合わせである。別の実施形態では、凍結保護物質は、糖酸であり、これには、アルドン酸、ウロン酸、アルダン酸およびその組み合わせが含まれる。
本発明の凍結保護物質はまた、炭水化物であってもよい。適切な炭水化物は、２つ以上のヒドロキシル基を含むアルデヒドまたはケトン化合物である。炭水化物は、環状であっても直鎖状であってもよく、これには、例えば、アルドース、ケトース、アミノ糖、アルジオール、イノシトール、アルドン酸、ウロン酸、またはアルダン酸またはその組み合わせが挙げられる。炭水化物はまた、単糖類（ｍｏｎｏ−ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ）、二糖類（ｄｉ−ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ）または多糖類（ｐｏｌｙ−ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ）、例えば、二糖類または多糖類などであってもよい。適切な炭水化物としては、例えば、グリセルアルデヒド、アラビノース、リキソース、ペントース、リボース、キシロース、ガラクトース、グルコース、ヘキソース、イドース、マンノース、タロース、ヘプトース、グルコース、フルクトース、グルコン酸、ソルビトール、ラクトース、マンニトール、メチルαグルコピラノシド、マルトース、イソアスコルビン酸、アスコルビン酸、ラクトース、ソルボース、グルカル酸、エリトロース、トレオース、アラビノース、アロース、アルトロース、グロース、イドース、タロース、エリトルロース、リブロース、キシルロース、プシコース、タガトース、グルクロン酸、グルコン酸、グルカル酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸、グルコサミン、ガラクトサミン、スクロース、トレハロース、もしくはノイラミン酸、またはそれらの誘導体が挙げられる。適切な多糖類としては、例えば、アラビナン類、フルクタン類、フカン類（ｆｕｃａｎｓ）、ガラクタン類、ガラクツロナン類、グルカン類、マンナン類、キシラン類（例えば、イヌリンなど）、レバン、フコイダン、カラギナン、ガラクトカロロース（ｇａｌａｃｔｏｃａｒｏｌｏｓｅ）、ペクチン、ペクチン酸、アミロース、プルラン、グリコーゲン、アミロペクチン、セルロース、デキストラン、プスツラン（ｐｕｓｔｕｌａｎ）、キチン質、アガロース、ケラチン、コンドロイチン、デルマタン、ヒアルロン酸、アルギン酸、キサンチンゴムまたはデンプンが挙げられる。なかでも特に有用な炭水化物は、スクロース、グルコース、ラクトース、トレハロースおよびその組み合わせである。スクロースは特に有用な凍結保護物質である。
好ましくは、本発明の凍結保護物質は、炭水化物または糖アルコールであり、これは多価アルコールであってもよい。多価化合物は、２つ以上のヒドロキシル基を含む化合物である。好ましくはこの多価化合物は直鎖である。適切な多価化合物としては、例えば、グリコール、例えば、エチレングリコール、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコール、グリセロール、またはペンタエリトリトール、またはそれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの好ましい実施形態では、凍結保護物質はスクロース、トレハロース、マンニトールまたはソルビトールである。別の実施形態では、凍結保護物質は、約１．５重量％〜約６重量％の濃度である。好ましくは凍結保護物質は、約５％の濃度のスクロースである。
凍結乾燥前の処方物に界面活性物質を添加することが望まれることが見出されている。あるいは、またさらに、この界面活性物質は、凍結乾燥された処方物および／または再構成された処方物に添加され得る。界面活性物質の例としては、非イオン性界面活性剤、例えば、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０または８０）；ポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）（例えば、ポロキサマー１８８）；Ｔｒｉｔｏｎ；ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）；ラウリル硫酸ナトリウム；オクチルグリコシドナトリウム；ラウリル−、ミリスチル−、リノリル−またはステアリル−スルホベタイン；ラウリル−、ミリスチル−、リノリル−またはステアリル−サルコシン；リノリル−、ミリスチル−、またはセチル−ベタイン；ラウロアミドプロピル−、コカミドプロピル−、リノールアミドプロピル−、ミリスタミドプロピル−、パルニドプロピル−またはイソステアラミドプロピル−ベタイン（例えば、ラウロアミドプロピル）；ミリスタミドプロピル−、パルミドプロピル−、またはイソステアラミドプロピル−ジメチルアミン；ココイルメチルタウリンナトリウム、またはオレイルメチルタウリン二ナトリウム；およびＭＯＮＡＱＵＡＴＴＭシリーズ（Ｍｏｎａ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｔｅｒｓｏｎ，Ｎ．Ｊ．），ポリエチレングリコール、ポリプロピルグリコール、ならびにエチレンおよびプロピレングリコールのコポリマー（例えば、ＰｌｕｒｏｎｉｃｓまたはＰＦ６８）、ならびにＴｗｅｅｎ ８０が挙げられる。界面活性物質は、１実施形態では、約０．００５重量％〜約０．０５重量％の濃度である。好ましい実施形態では、界面活性物質は、０．０１重量％の濃度のポリソルベート８０または約０．０１重量％の濃度のＴｗｅｅｎ ８０である。
再構成された処方物とは、希釈液中で凍結乾燥された抗体処方物を溶解することによって、この抗体が再構成された処方物中で分散されるように、調製されている処方物である。目的の抗体で処置されるべき患者に対する投与（例えば、非経口投与）のために、そして本発明の特定の実施形態で適切である、再構成された処方物とは、皮下投与のために適切である処方物であり得る。
等張性とは、目的の処方物がヒトの血液と本質的に同じ浸透圧を有することを意味する。等張性処方物は一般に、約２５０〜３５０ｍＯｓｍの浸透圧を有する。等張性は、例えば、蒸気圧またはアイスフリージングタイプの浸透圧計を用いて測定され得る。
凍結乾燥保護物質（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）がまた、凍結乾燥前の処方物に添加され得る。凍結乾燥保護物質とは、目的の抗体と組み合わされた場合、凍結乾燥および引き続く保管の際に抗体の化学的および／または物理的な不安定性を有意に防止または軽減する分子である。例示的な凍結乾燥保護物質としては、糖、例えば、スクロースまたはトレハロース；アミノ酸、例えば、グルタミン酸一ナトリウムまたはヒスチジン；メチルアミン、例えば、ベタイン；親液性の塩、例えば、硫酸マグネシウム；ポリオール、例えば、三価またはそれより高い価の糖アルコール、例えば、グリセリン、エリトリトール、グリセロール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトール；プロピレングリコール；ポリエチレングリコール；Ｐｌｕｒｏｎｉｃ；ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。好ましい凍結乾燥保護物質は、非還元糖、例えば、トレハロースまたはスクロースである。
好ましい実施形態では、凍結乾燥保護物質は、非還元糖、例えば、スクロースまたはトレハロースである。凍結乾燥前の処方物における凍結乾燥保護物質の量は一般には、再構成の際に得られる処方物が等張性であるような量である。しかし、高張性の再構成された処方物も安定であり得る。さらに、凍結乾燥保護物質の量は、凍結乾燥の際に生じる抗体の分解／凝集の量が受容できないほど少なすぎてはならない。凍結乾燥保護物質が糖（例えば、スクロースまたはトレハロース）である場合、凍結乾燥前の処方物における例示的な凍結乾燥保護剤の濃度は、約１０ｍＭ〜約４００ｍＭ、好ましくは約３０ｍＭ〜約３００ｍＭ、そして最も好ましくは約５０ｍＭ〜約１００ｍＭである。凍結乾燥保護物質に対する抗体の比は、各々の抗体および凍結乾燥保護物質の組み合わせについて選択される。糖（例えば、スクロースまたはトレハロース）の場合、高い抗体濃度を有する等張性の再構成された処方物を生成するための凍結乾燥保護物質として、抗体に対する凍結乾燥保護物質のモル比は、抗体１モルに対して約１００〜約１５００モルの凍結乾燥保護物質であり、好ましくは抗体１モルに対して約２００〜約１０００モルの凍結乾燥保護物質であり、そしてさらに好ましくは抗体１モルに対して約２００〜約６００モルの凍結乾燥保護物質である。
凍結乾燥保護物質は、凍結乾燥保護量で凍結乾燥前の処方物に添加される。この凍結乾燥保護量とは、この凍結乾燥保護量の凍結乾燥保護物質の存在下における抗体の凍結乾燥後に、この抗体が凍結乾燥および保管の際にその物理的および化学的な安定性および完全性を本質的に保持するということを意味する。
本明細書の目的の希釈剤とは、薬学的に受容可能（ヒトへの投与に安全かつ非毒性）であり、そして再構成された処方物の調製のために有用である希釈剤である。例示的な希釈剤としては、滅菌水、注射のための静菌性の水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝化溶液（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水）、滅菌生理食塩水溶液、リンゲル溶液またはブドウ糖溶液が挙げられる。
保存剤とは、再構成された処方物における細菌の活動を本質的に軽減させて、これによって例えば、多数回使用の再構成された処方物の生成を容易にするために希釈剤に添加され得る化合物である。可能性のある保存剤の例としては、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム（アルキル基が長鎖化合物である、塩化アルキルベンジルジメチルアンモニウムの混合物）および塩化ベンゼトニウムが挙げられる。他のタイプの保存剤としては、芳香族アルコール（例えば、フェノール）、ブチルおよびベンジルアルコール、アリールパラベン（例えば、メチルパラベンまたはプロピルパラベン）、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、およびｍ−クレゾールが挙げられる。本明細書において最も好ましい保存剤はベンジルアルコールである。
充填剤は、凍結乾燥された混合物のかさを増やして、凍結乾燥されたケーキの物理的構造に寄与する（例えば、開放細孔構造を保持する本質的に均一に凍結乾燥されたケーキの生成を容易にする）化合物である。例示的な充填剤としては、マンニトール、グリシン、ポリエチレングリコールおよびキソルビトール（ｘｏｒｂｉｔｏｌ）が挙げられる。
いくつかの場合には、凍結乾燥保護物質（例えば、スクロースまたはトレハロース）および充填剤（例えば、マンニトールまたはグリシン）の混合物を、凍結乾燥前の処方物の調製に用いる。充填剤によって、その中に過度のポケットのない均一に凍結乾燥されたケーキの生成が可能になり得る。従って、充填剤はまた、凍結乾燥の前に添加されてもよい。適切な充填剤は、約０．５〜約１．５重量％の濃度を有してもよい。好ましくは、充填剤は０．９重量％の濃度のデキストラン４０または、０．９重量％の濃度のヒドロキシエチルデンプン４０である。
Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０）に記載されるような他の薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、それが処方物の所望の特徴に有害に影響しないという条件では、凍結乾燥前の処方物（および／または凍結乾燥された処方物および／または再構成された処方物）に含まれてもよい。受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、使用される投薬量および濃度でレシピエントに対して毒性がなく、そしてこれにはさらなる緩衝化剤；保存剤；共溶媒；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；ＥＤＴＡのようなキレート剤；金属錯体（例えば、Ｚｎ−抗体錯体）；生分解性ポリマー、例えば、ポリエステル；ならびに／または塩形成する対イオン、例えば、ナトリウムが挙げられる。
インビボの投与のために用いられるべき処方物は無菌でなければならない。これは、凍結乾燥および再構成の前、または後に滅菌濾過膜による濾過によって容易に達成される。あるいは、混合物全体の無菌性は、例えば、抗体以外の成分を約１２０℃で約３０分間オートクレーブすることによって達成され得る。
目的の抗体の調製後、凍結乾燥前の処方物を生成する。この凍結乾燥前の処方物に存在する抗体の量は、所望の用量の容積、投与の様式を考慮して決定される。この抗体は一般に溶液に存在する。例えば、抗体は、ｐＨ緩衝化溶液中に存在し得る。例示的な緩衝化剤としては、ヒスチジン、リン酸塩、Ｔｒｉｓ、クエン酸塩、コハク酸塩、および他の有機酸が挙げられる。１実施形態では、この結合体は、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約２ｍｇ／ｍＬの濃度で、好ましくは１ｍｇ／ｍＬの濃度である。１実施形態では、緩衝化剤は、約５ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度である。好ましい実施形態では、緩衝化剤は、約２０ｍＭの濃度のＴｒｉｓである。凍結乾燥前に、ｐＨは任意の適切なｐＨ、例えば、約７．８〜約８．２、そして好ましくは約８．０であってもよい。
本処方物の別の実施形態における電解質は、約５ｍＭ〜約１００ｍＭの濃度である。任意の適切な電解質、例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、塩化物、リン酸塩および重炭酸塩などが用いられてもよい。好ましくは電解質はナトリウム塩またはカリウム塩であり、さらに好ましくは電解質は、約１０ｍＭの濃度のＮａＣｌである。
抗体、凍結乾燥保護物質および他の選択的な成分を一緒に混合した後、処方物を凍結乾燥する。Ｈｕｌｌ５０．ＴＭ．（Ｈｕｌｌ，ＵＳＡ）またはＧＴ２０．ＴＭ．（Ｌｅｙｂｏｌｄ−Ｈｅｒａｅｕｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）凍結乾燥機のような、多くの異なる凍結乾燥機がこの目的のために利用可能である。凍結乾燥は、処方物を凍結させ、引き続いて初回の乾燥に適切な温度でこの凍結成分から氷を昇華させることによって達成される。この条件下では、生成物の温度は、処方物の共融点または破壊温度未満である。代表的には、初回の乾燥のための貯蔵温度は、代表的には約５０〜２５０ｍＴｏｒｒにおよぶ、適切な圧力で約−３０℃〜２５℃におよぶ（ただし生成物が初回の乾燥の間に凍結したままである条件）。処方物、サンプルを保持している容器（例えば、ガラスバイアル）のサイズおよびタイプ、ならびに液体の容積が主に、乾燥に必要な時間に影響し、この時間は、２〜３時間から数日（例えば、４０〜６０時間）に及んでもよい。二次乾燥段階は、容器のタイプおよびサイズ、ならびに使用される抗体のタイプに主に依存して、約０〜４０℃で行なわれ得る。しかし、二次乾燥工程はなくてもよいことが、本明細書において見出された。例えば、凍結乾燥の完全な水分除去段階を通じた保管温度は、約１５〜３０℃であってもよい（例えば、約２０℃）。二次乾燥に必要な時間および温度とは、例えば、温度および他のパラメーターに依存して、適切な凍結乾燥ケーキを生じるものである。二次乾燥時間は、生成物中の所望の残留湿度レベルによって影響され、そして代表的には、少なくとも約５時間（例えば、１０〜１５時間）かかる。この圧力は、初回乾燥工程の間に使用される圧力と同じであってもよい。凍結乾燥条件は、処方物およびバイアルのサイズに依存して変化し得る。
本発明による凍結乾燥は、約−３５℃〜約−５０℃の温度で溶液を凍結させる工程と；約−１０℃〜−４０℃の保管温度で２４〜７８時間の間、２０〜８０ミクロンの初回乾燥圧力で凍結溶液をまず乾燥させる工程と；約＋１０℃〜約＋３０℃の保管温度で１５〜３０時間の間、２０〜８０ミクロンの二次乾燥圧力でこの凍結乾燥生成物を二次乾燥させる工程とを包含し得る。凍結は、−４５℃で行われてもよく、ここで初回の凍結乾燥は６０ミクロンの初回乾燥圧力で、−３０℃の保管温度で６０時間であって、二次乾燥工程は６０ミクロンの乾燥圧力で、＋２５℃の保管温度で２４時間である。
移し換えの工程を回避するために、抗体の再構成が行われる容器において抗体処方物を凍結乾燥することが所望され得る。この場合の容器は、例えば、３、５、１０、２０、５０または１００ｃｃのバイアルであってもよい。
一般的な提案として、凍結乾燥によって、その湿度が約５％未満、好ましくは約３％未満である凍結乾燥処方物が生じる。
所望の段階では、代表的には、患者に対する抗体を投与する時点では、凍結乾燥された処方物は、希釈剤で再構成され得、その結果再構成された処方物中の抗体濃度は、少なくとも５０ｍｇ／ｍＬ、例えば、約５０ｍｇ／ｍＬ〜約４００ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは約８０ｍｇ／ｍＬ〜約３００ｍｇ／ｍＬ、そして最も好ましくは約９０ｍｇ／ｍＬ〜約１５０ｍｇ／ｍＬである。再構成された処方物中のこのような高い抗体濃度は、再構成された処方物の皮下送達が意図される場合特に有用であるとみなされる。しかし、静脈内投与のような他の投与経路に関しては、再構成された処方物中では、より低い濃度の抗体が所望され得る（例えば、再構成された処方物中に、約５〜５０ｍｇ／ｍＬ、または約１０〜４０ｍｇ／ｍＬの抗体）。特定の実施形態では、再構成された処方物中の抗体濃度は、凍結乾燥前の処方物中の濃度よりも有意に高い。例えば、再構成された組成物中の抗体濃度は、凍結乾燥前の処方物の濃度の約２〜４０倍、好ましくは３〜１０倍、そして最も好ましくは３〜６倍（例えば、少なくとも３倍または少なくとも４倍）であってもよい。
再構成は一般に、完全な水和を確実にするために約２５℃の温度で行われるが、必要に応じて他の温度が用いられてもよい。再構成のために必要な時間は、例えば、希釈剤のタイプ、賦形剤および抗体の量に依存する。例示的な希釈剤としては、滅菌水、注射のための静菌性の水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝化溶液（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水）、滅菌生理食塩溶液、リンゲル溶液またはブドウ糖溶液が挙げられる。希釈剤は必要に応じて保存剤を含む。例示的な保存剤は、上記されており、芳香族アルコール、例えば、ベンジルアルコールまたはフェノールアルコールが好ましい保存剤である。使用される保存剤の量は、抗体および保存剤の有効性の試験と適合性であるように種々の保存剤の濃度を評価することによって決定される。例えば、保存剤が芳香族アルコール（例えば、ベンジルアルコール）である場合、約０．１〜２．０％、そして好ましくは約０．５〜１．５％、ただし最も好ましくは約１．０〜１．２％の量で存在し得る。好ましくは、この再構成された処方物は、１０μｍのサイズを超える粒子を、１バイアルあたり６０００個未満有する。
再構成された処方物は、抗体での処置の必要なヒトに対して、静脈内投与のような公知の方法に従って、筋肉内経路、腹腔内経路、脳脊髄内経路、皮下経路、関節内経路、滑液嚢内経路、くも膜下腔内経路、経口経路、局所経路または吸入経路による、ボーラスとしてまたは一定期間にわたる持続注入によって投与される。
本発明の凍結乾燥処方物を含み、その再構成および／または使用のための説明書を提供する製品が提供される。この製品またはキットは、（ｉ）本発明の組成物／処方物を保持する容器と；（ｉｉ）凍結乾燥された処方物を、０．５ｍｇ／ｍＬ〜５ｍｇ／ｍＬの範囲内の再構成された処方物中の結合体の濃度まで希釈剤を用いて再構成するための説明書とを有する。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル（例えば、二重チャンバのバイアル）、シリンジ（例えば、二重チャンバのシリンジ）および試験管が挙げられる。この容器は、ガラスまたはプラスチックのような種々の物質から形成され得る。この容器は、凍結乾燥された処方物を保持し、そしてこの容器上のまたはそれに関連した表示は、再構成および／または使用の指示を示し得る。例えば、表示は、凍結乾燥された処方物が上記のような抗体濃度に再構成されることを示し得る。この表示はさらに、この処方物が皮下投与のために有用であるか、またはそれを意図されることを示し得る。この処方物を保持する容器は、再構成された処方物の反復投与（例えば、２〜６回の投与）を可能にする、多数回使用のバイアルであってもよい。この製品はさらに、適切な希釈剤（例えば、ＢＷＦＩ）を含む第二の容器を備えてもよい。希釈剤および凍結乾燥処方物の混合の際に、再構成された処方物中の最終抗体濃度は一般に少なくとも５０ｍｇ／ｍＬである。製品はさらに、商業上および使用者の観点から所望される他の物質を含んでもよく、これには、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、注射針、シリンジ、および使用上の説明を含む添付文書が挙げられる。
一旦処方されれば、本発明の組成物は、被験体に直接投与されてもよい。処置されるべき被験体は動物であってもよい。しかし、この組成物は、ヒト被験体に対する投与に適合していることが好ましい。
本発明の組成物は、限定はしないが、経口経路、静脈内経路、筋肉内経路、関節内経路、髄内経路、くも膜下腔内経路、心室内経路、経皮経路（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、経皮経路（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）（ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９８／２０７３４号を参照のこと）、皮下経路、腹腔内経路、鼻腔内経路、腸内経路、局所経路、舌下経路、膣内経路または直腸経路を含む多数の経路によって投与され得る。皮下噴射器も、本発明の組成物を投与するために用いられ得る。代表的には、組成物は、液体溶液または懸濁物のいずれかのように注射可能に調製され得る。注射の前の液体ビヒクル中の溶液または液体ビヒクル中の懸濁物に適切な固体形態もまた調製され得る。
（実施例）
（一般的な材料および方法）
（ガン細胞）
表面上に種々のレベルのルイスＹ抗原を発現するヒトのガン細胞株を選択した。これらの株としては、ルイスＹ抗原の発現が高い細胞株（Ｌ２９８７肺癌、Ｎ８７胃癌、Ａ４３１／ＬｅＹ類表皮癌、ＡＧＳ結腸癌、およびＬＳ１７４Ｔ結腸癌）、ルイスＹ抗原の発現が低い細胞株（ＬＯＶＯ結腸癌およびＬＮＣａＰ前立腺癌）、ならびにルイスＹ抗原の発現が極めて低いか全くない細胞株（ＰＣ３ＭＭ２前立腺癌、およびＡ４３１類表皮癌）が挙げられた。使用した癌細胞株のルイスＹ発現状態を、フローサイトメトリーによって確認した。用いた細胞株の例は以下のとおりである。
ＤＬＤ−１（ＣＣＬ−２２１）、ＨＣＴ８Ｓ１１、ＨＣＴ８Ｓ１１／Ｒ１およびＬＯＶＯ（ＣＣＬ−２２９）は、細胞膜の上でＬｅｙ抗原を呈示する結腸癌細胞株である。
ＮＣＩ−Ｈ１５７（ＣＲＬ−５８０２）、ＮＣＩ−Ｈ３５８（ＣＲＬ−５８０７）およびＡ５４９（ＣＣＬ−１５９）は、肺癌細胞株である。これら３つの細胞株のうちでも、ＮＣＩ−Ｈ３５８は、細胞表面上に検出可能なレベルのＬｅｙを呈示した。
胃癌Ｎ８７（ＣＲＬ−５８２２）およびＡＧＳ（ＣＲＬ−１７３９）は両方ともＬｅｙを発現する。
Ａ４３１（ＣＲＬ−１５５５）およびＡ４３１／Ｌｅｙは、類表皮の（頸部の）癌細胞である。後者の改変体のみがＬｅｙを発現する。
ＭＤＡ−ＭＢ４３５（Ｌｅｙ−）およびＭＤＡ−ＭＢ−３６１（Ｌｅｙ＋）は乳癌細胞のモデルとして用いられた。
ＰＣ３−ＭＭ２（Ｌｅｙ−）およびＬＮＣａＰ（Ｌｅｙ＋、ＣＲＬ−１７４０）は、前立腺癌に由来した。
ＨＣＴ８Ｓ１１、ＨＣＴ８Ｓ１１／Ｒ１、ＭＤＡ−ＭＢ４３５、ＰＣ３−ＭＭ２およびＡ４３１／Ｌｅｙを除く全ての細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入した。ＡＴＣＣから入手した細胞株を、ＡＴＣＣ−カタログ中に指定される培養培地中で維持した。ＨＣＴ８Ｓ１１およびＨＣＴ８Ｓ１１／Ｒ１は、Ｍ．Ｍａｒｅｅｌ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｇｈｅｎｔ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）から贈呈された。これらの細胞を、１０（ｖ／ｖ）％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび１００Ｕ／ｍｌのペニシリン（本明細書において以後、ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐと呼ぶ）を補充したＲＰＭＩ １６４０中で増殖させた。ＭＤＡ−ＭＢ４３５およびＰＣ３−ＭＭ２は、Ｉ．Ｆｉｄｌｅｒ博士（ＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，ＴＸ）から入手した。これらの細胞を、１０（ｖ／ｖ）％のＦＢＳ、２ｍＭのグルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、０．２ｍＭの非必須アミノ酸、２％のＭＥＭビタミン溶液、およびｐｅｎ／ｓｔｒｅｐを補充した、最小必須培地中で培養した。Ａ４３１／Ｌｅｙは、Ｌｕｄｗｉｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から提供された。それらを、１０％ ＦＢＳ、２ｍＭのグルタミンおよびｐｅｎ／ｓｔｒｅｐを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２中で培養した。
（抗体）
ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）（リツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）；ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ａｎｄ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）は、マウスの重鎖および軽鎖の可変領域と、ヒトＩｇＧ１ｋ定常領域とを組み合わせるキメラ抗体である。この抗体は、Ｂリンパ球マーカーＣＤ２０を認識する、ＦＡＣＳ分析については、ヒトＩｇＧ（ｈｕＩｇＧ，Ｚｙｍｅｄ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）およびＦＩＴＣ−標識ヤギ抗ｈｕＩｇＧ（ＦＩＴＣ／α−ｈｕＩｇＧ，Ｚｙｍｅｄ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）をそれぞれ、コントロール抗体および二次抗体として用いた。ＲＩＴＵＸＡＮは、ネガティブコントロールとして用いた。なぜならＦＡＣＳ分析は、ＲＩＴＵＸＡＮ（ＣＤ２０）によって認識される抗原が、記載された実験に用いられる細胞の表面上に微量に存在したことを示したからである。ＲＩＴＵＸＡＮのカリケアマイシン結合体は、免疫グロブリンのキャリア機能およびカリケアマイシンの加水分解性の放出を制御した。
ＭＹＬＯＴＡＲＧ（登録商標）（ゲムツズマブオゾガミシン（ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）、ＣＭＡ−６７６または単にＣＭＡとも呼ばれる）は、カリケアマイシン結合体（Ｗｙｅｔｈ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＮＪ）である。１ｍｇの抗体に結合体化された、平均量３５μｇのカリケアマイシンを有するバッチを用いた。ＣＭＡまたはＣＭＡ−６７６の抗体部分は、多能性の造血幹細胞および急性骨髄性白血病細胞によって発現される白血球分化抗原である、ＣＤ３３に特異的である。どの記載された実験で用いた細胞でも、有意なレベルのＣＤ３３を発現するものはなかった。実際に、ＦＡＣＳ分析によって、これらの細胞株に結合したＣＭＡの量がＣＤ３３発現の欠失を示すコントロールのｈｕＩｇＧ１の量と同様であったことが示された。ＣＭＡの最大の結合は、ＰＣ３ＭＭ２細胞において確認された（ｒｅ ＭＣＦ＝２．３）。従って、ＣＭＡはまた、結合体の抗原標的化なしに、放出されたＣＭの有効性を制御する。
（プラズモン共鳴分析（ＢＩＡＣＯＲＥ））
ルイス−ＢＳＡ結合体（すなわち、Ｈ型Ｉ−、Ｈ型ＩＩ−、シアリルＬｅａ−、シアリルＬｅｘ−、スルホＬｅａ−、スルホＬｅｘ−、Ｌｅａ−、Ｌｅｂ−、Ｌｅｘ−およびＬｅｙ−ＢＳＡ）は、Ａｌｂｅｒｔａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ（Ｅｄｍｏｎｔｏｎ，Ａｌｂｅｒｔａ，Ｃａｎａｄａ）から購入した。抗原／ＢＳＡローディングは、１モルのＢＳＡあたり２０〜４２モルの間の抗原であった。各々の抗原を、４，０００〜９，０００ ＲＵの密度でＣＭ５バイオセンサーチップの表面に固定した。このチップを、試薬ＥＤＣ／ＮＨＳ［１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド−ＨＣｌ］／［Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド］を５μｌ／分の流速で６分間カップリングし、続いて、５μｌ／分で６分間、５０μｇ／ｍｌの濃度で１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．５中に含有されるルイスＢＳＡ抗原の添加によって活性化した。スルホ−ルイスおよびシアリル−ルイス−ＢＳＡ結合体をｐＨ４．０でカップリングさせた。余剰の結合部位を、１Ｍのエタノールアミン−ＨＣｌ ｐＨ８．５を用いて、５μｌ／分で６分間ブロックした。結合特異性分析をＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｐｐｍのポリソルベート２０）中において、２０μｌ／分の流速で行った。Ｈｕ３Ｓ１９３を、６．６７ｎＭまたは５０ｎＭで３分間注射した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液での３０秒の洗浄後に結合したままの抗体の量を測定した。抗原の表面を、１０ｍＭのＮａＯＨ、２００ｍＭのＮａＣｌによって１分間２０μｌ／分によって再生し、ベースラインを再確立した。
反応速度分析のために、抗体を、１〜１６ｎＭの濃度で用いた。Ｌｅｙ−ＢＳＡの密度は９，０００であった。会合および解離を、３および１５分の間、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中で３０μｌ／分で測定した。
（ＦＡＣＳ−分析）
一連のヒト腫瘍細胞株上のＬｅｙの存在を、ＦＡＣＳ分析によって評価した。１０５個の細胞のアリコートを、１（ｖ／ｖ）％のウシ血清アルブミンを補充した１００μｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ／ＢＳＡ）中に懸濁した。次いで細胞を種々の濃度の一次抗体、ｈｕ３Ｓ１９３もしくはＧ１９３、ｈｕ３Ｓ１９３、またはＣＭ−結合体中で４℃で３０分間インキュベートした。細胞に対する一次抗体の結合を、ＦＩＴＣ標識化／α−ｈｕＩｇＧによって明らかにした。
ＭＣＦ（平均チャネル蛍光（ｍｅａｎ ｃｈａｎｎｅｌ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ））の値は、一次抗体（ｈｕＩｇＧおよびｈｕ３Ｓ１９３）との結合、それに続く蛍光標識した二次抗体での染色後の細胞集団の平均蛍光強度である。ＨｕＩｇＧはネガティブコントロールである。ＭＣＦは結合した一次抗体分子の数に直接比例する。調べた細胞株の過半数（１３のうち８つ）が、ネガティブコントロールのＭＣＦを超えるｈｕ３Ｓ１９３結合後のＭＣＦの少なくとも１０倍の増加（相対的ＭＣＦ、ｒｅＭＣＦ）によって示されるようにＬｅｙを発現した。Ｌｅｙの高い発現を有する細胞株の例は、各々の抑制されずに増殖する組織（ｈｉｓｔｉｏｔｙｐｉｃ）の腫瘍カテゴリーにおいて見出された。結腸直腸および胃に由来する全ての腫瘍細胞がＬｅｙ−陽性であった。
（カリケアマイシンに対して結合体化された抗ルイスＹ抗体のＥＤ５０）
生体色素（ＭＴＳ）染色を用いて、種々の処置への暴露後に生存している細胞の数を決定した。ＭＴＳ（非放射性細胞増殖アッセイキット）は、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から購入して、製造業者の仕様書に従って用いた。各々の細胞株に関しては、較正曲線（２時間後の細胞数対光学密度）を作製して、適切な初期播種密度を見積もった。次いで細胞を、１ウェルあたり７５０個〜５，０００個の細胞の密度で９６マルチウェルのディッシュに播種した。播種の直後に、細胞を種々の濃度（０ｎｇ、０．０１ｎｇ、０．０５ｎｇ、０．１ｎｇ、１ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇおよび５００ｎｇのカリケアマイシン当量／ｍｌ）のＣＭＡ、ｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭもしくはＣＭまたはＰＢＳへ曝露させた。各ウェルに、１０μｌの１００×薬物溶液を与えた。９６時間の薬物曝露を生存した細胞の数の決定後、用量応答曲線から得られた対数回帰パラメーターに基づいてＥＤ５０を算出した。ＥＤ５０を、薬物への９６時間の曝露後に細胞数を５０％減少させる薬物（ＣＭ）のモル濃度として規定した。カリケアマイシン当量（ｃａｌ．ｅｑ．）とは、純粋な物質または結合体のいずれかとして与えられたＣＭの濃度であることに注意すべきである。抗体に結合されたＣＭの量（抗体薬物ローディング）に依存して、種々の結合体のカリケアマイシン当量は、種々のタンパク質濃度を意味し得る。
（実施例１．抗ルイスＹ抗体の生成）
野性型（ｈｕ３Ｓ１９３）および変異体（Ｇ１９３）抗−ルイスＹ抗体を生成した。マウス３Ｓ１９３ ｍＡｂを、ルイスＹ抗原に対して陽性のヒト腺癌細胞によるＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫法によって生成した。３Ｓ１９３抗体のヒト化バージョンを引き続いて生成した（ｈｕ３Ｓ１９３）。詳細な特異性分析によって、ｈｕ３Ｓ１９３は、Ｌｅｙに高度に特異性であって（Ｈ型２またはＨ型１の抗原に結合しない）、Ｌｅｘ三糖類とは最小限の交差反応性しか示さなかったことが実証された。ｈｕ３Ｓ１９３の変異したＩｇＧ１バージョン（Ｇ１９３）は、ＣＨ２ドメインに２つのアミノ酸置換；すなわち：ロイシン（２３４）からアラニン、そしてグリシン（２３７）からアラニンを有するという点でｈｕ３Ｓ１９３とは異なる。上記の２つの変異に加えて、ＩｇＧ１のＣＨ３ドメインには、Ｇｍｚアロタイプに相当する２つのさらなる保存的変異（３５８位のアスパラギン酸からグルタミン酸へ、そして３６０位のメチオニンからロイシンへ）が存在した。従って、ヒト化変異体ＩｇＧ１抗ルイスＹ抗体は、Ｆｃ領域内の４つの残基でｈｕ３Ｓ１９３とは異なった；Ｌ２３６Ａ、Ｇ２３９Ａ、Ｄ３５８ＥおよびＭ３６０Ｌ。抗ルイスＹ抗体のこの変異体ＩｇＧ１形態は、Ｇ１９３と命名され、チャイニーズハムスター卵巣細胞で発現され、そしてＣＭＤ−１９３を作製するために用いられた。図７は、２つの抗体の成熟し分泌された重鎖のアミノ酸配列の比較を示す。この図では、変異残基は、太字でかつ強調しており、ＣＤＲは太字でかつ影付きにしている。
（細胞および培養条件）
ｈｕ３Ｓ１９３抗体を発現するハイブリドーマ細胞を、Ｌｕｄｗｉｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈから入手した。Ｈｕ３Ｓ１９３は、相補性決定領域のみがマウス起源由来であるように操作された、マウスモノクローナル抗体ＭｕＳ１９３由来のヒト化抗Ｌｅｙ抗体（ＩｇＧ１）である。
この細胞株は、コレステロール依存性細胞株であり、そしてＨｙｃｌｏｎｅ ＨｙＱ−ＣＣＭ（登録商標）１増殖培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｓ，Ｌｏｇａｎ，Ｕｔａｈ）中にコレステロールの添加を要する．コレステロールは水溶性ではないので、この培地には、０．２％ ＥｘＣｙｔｅ ＶＬＥ（Ｍｉｌｅｓ Ｐｅｎｔｅｘ，Ｋａｎｋａｋｅ，ＩＬ）を補充した。細胞を、５％のＣＯ２中で３７℃で維持した。ＣＯＳ−７細胞を、ＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）から購入し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および２ｍＭのグルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（本明細書において以後、ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐと呼ぶ）を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で維持した。
ＰＡ−ＤＵＫＸ １５３．８細胞は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）の産生を欠く。これらの細胞を、１０μｇ／ｍｌのアデノシン、デオキシアデノシンおよびチミジン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、１０％のＦＢＳ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１％の炭酸水素ナトリウム、２ｍＭのグルタミンおよびｐｅｎ／ｓｔｒｅｐを補充した最小基本培地（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）（ＭＥＭ−α，Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中で維持した。トランスフェクション後の細胞をヌクレオチドの非存在下で増殖させ、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ）および２５０ｎＭのメトトレキサート（Ｓｉｇｍａ）を選択マーカーとして用いて維持した。
（ベクター）
野性型（ｈｕ３Ｓ１９３）および変異体（Ｇ１９３）の抗−ルイスＹ抗体の重鎖および軽鎖の構築物を作製するために、以下のベクターを用いた：ＰＥＤ６＿ＨＣ＿ＩｇＧ１、ＰＥＤ６＿ＨＣ＿ｍＩｇＧ １およびｐＥＤ６＿ＬＣκベクター。ＰＥＤ６＿ＨＣ＿ｍＩｇＧ １ベクターは、変異したＣＨ２ドメインについてのテンプレートを含む（このベクターは、２３４位のロイシンおよび２３７位のグリシンの両方においてアラニンへの置換をコードする）。ｈｕ３Ｓ１９３の軽鎖の可変領域のＤＮＡを、ｐＥＤ６＿ＬＣκ発現ベクターのＢｓｓＨ ＩＩ制限部位とＰａｃＩ制限部位との間で連結した。ｈｕ３Ｓ１９３の重鎖の可変領域のＤＮＡを、ｐＥＤ６＿ＨＣＩｇＧ１発現ベクターのＢｓｓＨ ＩＩ制限部位とＳａｌＩ制限部位との間で結合した。ベクターｐＥＤ６＿Ｈｃ＿ｍＩｇＧ１を用いてＧ１９３の重鎖を生成した。このベクターはそのドメインの配列においてｐＥＤ６＿ＨＣ＿ＩｇＧ１とは異なった。ｐＥＤ６＿ＨＣ＿ｍＩｇＧ１の発現によって、ロイシン（２３４）およびグリシン（２３７）がアラニン置換された重鎖が得られる。
Ｇ１９３またはｈｕ３Ｓ１９３の軽鎖の可変領域および定常領域をコードするＤＮＡを、ｐＭＥＮ２ベクターのＰｐＵＭ制限部位とＥｃｏＲ Ｉ制限部位との間で連結されたｐＥＤ６＿ＬＣκプラスミドから切り出した。Ｇ１９３またはｈｕ３Ｓ１９３の重鎖の可変領域および定常領域をコードするＤＮＡを、ｐＥＤ６＿ＨＣ＿ＩｇＧ１またはｐＥＤ６＿ＨＣ＿ｍＩｇＧ１ベクターから切り出して、ｐＴＤＭＥＤＬベクターのＢｇｌ ＩＩ制限部位とＸｂａ Ｉ制限部位との間に挿入した。
（抽出およびクローニング）
製造業者の指示に従って、ＲＮＡｚｏｌＢキット（ＲＮＡｚｏｌ Ｂ，ＴＥＬ−ＴＥＳＴ，Ｉｎｃ．，Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ，ＴＸ）によってｈｕ３Ｓ１９３産生細胞からＲＮＡを抽出した。キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて、抽出したＲＮＡを一本鎖ｃＤＮＡに転写した。総ＲＮＡの１０μｇをオリゴｄＴプライマーと混合した。この反応混合物を５分間６５℃に加熱して、２２℃にゆっくり冷却した。第一鎖ｃＤＮＡを、総容積５０μｌ中に、５μｌの１０倍濃縮した第一鎖緩衝液、５μｌ ＤＴＴ、１μｌのＲＮＡｓｅブロック、２μｌのＤＮＴＰｓ（１．２５ｍＭ）および１μｌのＭＭＬＶ逆転写酵素（２０Ｕ／μｌ）を含有する混合物中で合成した。この成分を穏やかに混合して、３７℃で１時間インキュベートした。このｃＤＮＡを用いてｈｕ３Ｓ１９３のＶＨおよびＶＫの両方を増幅した。ポリメラーゼ連鎖（ＰＣＲ）反応には以下のプライマーを用いた：
Ｈｕ３Ｓ１９３ ＶＨ ＵＰ（ＢｓｓＨ ＩＩ）
Figure 2007529536
 Ｈｕ３Ｓ１９３ ＶＨ ＤＮ（Ｓａｌ Ｉ）
Figure 2007529536
 Ｈｕ３Ｓ１９３ ＶＫ ＵＰ（ＢｓｓＨ ＩＩ）
Figure 2007529536
 Ｈｕ３Ｓ１９３ ＶＫ ＤＮ（Ｐａｃ Ｉ）
Figure 2007529536
 ＰＣＲ反応を、総容積５０μｌ中の５μｌの第一鎖ｃＤＮＡ、１００ｎｇのセンスプライマーおよびアンチセンスプライマー、５μｌ １０×ＰＦＵポリメラーゼ緩衝液、５００μＭ ＭｇＣｌ２、１．２５ｍＭ ＤＮＴＰｓおよび１μｌのＰＦＵ酵素（２Ｕ／μｌ）の混合物中で行った。この反応は、３５回の交互のサイクルの変性（９５℃−１分）および合成（７２℃−４分）、ならびに１回の終止サイクル（７２℃−７分）からなった。この反応産物を、１％アガロースでの電気泳動によって分析した。ＰＣＲ産物を精製して、重鎖ＰＣＲ産物をＢｓｓＨ ＩＩおよびＳａｌ Ｉで消化して、ＢｓｓＨ ＩＩ／Ｓａｌ Ｉで消化したｐＥＤ６＿ＨＣ＿ｍＩｇ１またはｐＥＤ６＿ＨＣ＿Ｉｇ１発現ベクターに連結し、それぞれＧ１９３およびｈｕ３Ｓ１９３重鎖構築物を作製した。同様に軽鎖ＰＣＲ生成物をＢｓｓＨ ＩＩ／Ｐａｃ Ｉで消化して、ＢｓｓＨ ＩＩ／Ｐａｃ Ｉ消化したｐＥＤ６＿ＬＣκ発現ベクターに連結し、Ｇ１９３軽鎖構築物を作製した。ｐＥＤベクターを用いて、一過性のトランスフェクション実験において抗体の発現を確認した。
さらに、Ｇ１９３またはｈｕ３Ｓ１９３の重鎖および軽鎖を含むｐＥＤベクターを、ｐＴＤＭＥＤＬ−ＤＨＦＲ／ＶＨおよびｐＭＥＮ２−Ｎｅｏ／ＶＫにサブクローニングした。これらの構築物を作製するために、ｈｕ３Ｓ１９３ ｐＥＤ６＿ＨＣ＿ｍＩｇＧ１ ＶＨ（ｈｕ３Ｓ１９３ ＶＨ＋ＣＨ１＋ｍｔＣＨ２＋ＣＨ３）およびｈｕ３Ｓ１９３ ｐＥＤ６＿ＨＣ＿ＩｇＧ１ ＶＨ（ｈｕ３Ｓ１９３ ＶＨ＋ＣＨＩ＋ＣＨ２＋ＣＨ３）を、Ｂｇｌ ＩＩおよびＸｂａ Ｉで消化して、Ｂｇｌ ＩＩ／Ｘｂａ Ｉで消化したｐＴＤＭＥＤＬベクターに連結し、Ｇ１９３ ＶＨ／ｐＴＤＭＥＤＬ−ＤＨＦＲまたはｈｕ３Ｓ１９３ ＶＨ／ｐＴＤＭＥＤＬ−ＤＨＦＲを作製した。同様にｐＥＤ６＿ＬＣκｈｕ３Ｓ１９３ ＶＫを、ＰｐＵＭおよびＥｃｏＲ Ｉ（ｈｕ３Ｓ１９３ ＶＫ＋ＣＫ）で消化して、ＰｐＵＭおよびＥｃｏＲ Ｉで消化したｐＭＥＮ２ベクターに連結し、Ｈｕ３Ｓ１９３ ＶＫ／ｐＭＥＮ２−Ｎｅｏを作製した。Ｇ１９３ ｍＡｂの配列は、配列番号１３である。
（ライゲーション、形質転換、およびプラスミドの精製）
消化した生成物をＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｇｉｂｃｏ）を用いて１２℃で一晩ライゲーションして、ＤＨ５α細胞に形質転換した。単一のコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンの存在下で２ｍＬのＬＢ培地中に播種して、３７℃で一晩増殖させた。ミニプレップ（ｍｉｎｉｐｒｅｐ）ＤＮＡ上の制限マッピングによってインサートの適切な長さを確認した。確認の際、マキシプレップ（ｍａｘｉｐｒｅｐ）ＤＮＡを、製造業者の推奨に従って、Ｑｉａｇｅｎ−ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて作成した。
（ＶＨおよびＶＫのＤＮＡの配列決定）
マキシプレップＤＮＡを、ｈｕ３Ｓ１９３の可変性の重鎖および軽鎖を配列決定するためにＤＮＡコア施設に送った。ＤＮＡ配列を以下のとおり決定した。Ｑｉａｇｅｎ ９６００ロボット（Ｑｉａｇｅｎ）によって、製造業者によって提供されたターボプレップ法（ｔｕｒｂｏ ｐｒｅｐ ｍｅｔｈｏｄ）に従ってミニプレップを作成した。このミニプレップＤＮＡの５００μｇを１３μｌのＨ２Ｏ中の２０ｐＭのプライマーＤＮＡと混合した。次いで、このＤＮＡを加熱（９８℃、５分）および冷却（４℃、５分）によって変性させた。８μｌのＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ（ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）をこの変性したＤＮＡに添加した。この混合物を９８℃に加熱して、一連の２５サーモサイクル（９６℃、２０秒；５５℃、２０秒；６２℃、１２０秒）および２０サーモサイクル（９６℃、２０秒；６０℃、１２０秒）に供した。この反応混合物を、Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの９６ウェル濾過プレート（Ｅｄｇｅ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を通して濾過して、過剰な色素ターミネーターを除去した。次いで、このＤＮＡフラグメントを３７００キャピラリーアレイシーケンサー（ＡＢＩ）上で分析した。Ｇ１９３およびｈｕ３Ｓ１９３の重鎖および軽鎖の両方の配列を図７および８に示す。
（ＣＯＳ−７細胞の一過性のトランスフェクション）
抗体発現は、ＣＯＳ−７細胞における一過性のトランスフェクション後に確認した。百万個のＣＯＳ−７細胞を、６ウェルのディッシュに入れた。翌日、等モル濃度（各々１μｇの混合物）のいずれかのｈｕ３Ｓ１９３ ｐＥＤ６＿ＨＣ＿ｍＩｇＧ１ ＶＨおよびｈｕ３Ｓ１９３ ｐＥＤ６＿ＨＣ＿ｍＩｇＧ１ ＶＨまたはｈｕ３Ｓ１９３ ｐＥＤ６＿ＨＣ＿ＩｇＧ１ ＶＨおよびｈｕ３Ｓ１９３ ｐＥＤ６＿ＨＣ＿ＩｇＧ１ ＶＨを、２５０μｌの無血清ＤＭＥＭに希釈した。また、６μｌの１ｍｇ／ｍｌのリポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）も、２５０μｌの無血清ＤＭＥＭに希釈した。ＤＮＡおよびリポフェクタミンを混合して、室温で１５分間インキュベートした。この混合物を細胞に添加した（細胞を、ＤＮＡ−リポフェクタミン複合体の曝露の前に無血清培地で洗浄した）。３７℃で８時間のインキュベーション後に、新鮮な培地を細胞に添加した。４８時間細胞に対して曝された培養培地を、ＦＡＣＳおよびＢＩＡｃｏｒｅ分析によって、抗体の存在についてアッセイした。
（安定な細胞株）
抗体発現の確認後、変異（Ｇ１９３）および野性型（ｈｕ３Ｓ１９３）抗ルイスＹＩｇＧ１抗体を発現する安定な株を、以下のようにＰＡ−ＤＵＫＸ １５３．８細胞中で生成した。５百万個の細胞を１０ｃｍの直径を有するディッシュにプレートした。１６時間後、Ｇ１９３ ＶＨ／ｐＴＤＭＥＤＬ（クローン＃１８）およびＶＫ／ｐＭＥＮ２（クローン＃１）またはｈｕ３Ｓ１９３についての等価な構築物のいずれかの等モルの混合物（各々１０μｇ）を、１．５ｍｌの無血清ＭＥＭ−αで希釈した。６０μｌのリポフェクタミンをまた、１．５ｍｌの無血清ＭＥＭαで希釈した。ＤＮＡおよびリポフェクタミンを、混合して、室温で１５分間インキュベートした。この混合物を細胞に添加して、次いでこれを３７℃に８時間おいた。この期間後、この混合物を１５ｍｌの新鮮増殖培地で置き換えた。２４時間後、細胞培養物を１：１０希釈で、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含有し、新鮮なメトトレキサートの濃度が段階的に漸増している（２０、４０、８０、１００、１２０、１６０、２００および２５０ｎＭ／ｍｌ）増殖培地（リボヌクレオシドおよびデオキシリボヌクレオシド非含有）に継いだ。コロニーを採取して増殖させた。これらのクローンからの馴化培養培地をＦＡＣＳ、ＢＩＡｃｏｒｅおよびＥＬＩＳＡによって分析した。次いで、Ｇ１９３またはｈｕ３Ｓ１９３を発現する安定な細胞株を抗体の大量生産および精製のために用いた。
（Ｇ１９３のエフェクター機能）
Ｇ１９３およびその結合体であるＣＭＤ−１９３のエフェクター機能の能力を確認するために、その両方を、ルイスＹ抗原の発現を有するＮ８７胃癌腫細胞およびルイスＹ抗原の発現が極めて低いかまたは存在しないＡ４３１類表皮癌腫細胞の両方を用いて試験した。野性型のヒト化ＩｇＧ１抗ルイスＹ抗体ｈｕ３Ｓ１９３を陽性のコントロールとして用いた。この抗体はＡＤＣＣおよびＣＤＣの両方の活性を媒介することが示されている。新鮮に単離したヒト末梢血単核球細胞（ＰＢＭＮＣ）をＡＤＣＣアッセイの間のエフェクター細胞の供給源として用い、そして新鮮に調製したヒト血清をＣＤＣアッセイにおける補体の供給源として用いた。
Ｇ１９３およびＣＭＤ−１９３のＣＤＣ活性を、補体の供給源として１：１００希釈の新鮮なヒト血清の存在下で種々の濃度の抗ルイスＹ抗体とともに４時間培養した、固定した数の腫瘍細胞を用いて評価した。腫瘍細胞の溶解の結果として放出された乳酸脱水素酵素の活性を測定した。非イオン性界面活性剤によるＬＤＨ活性放出を、全溶解の呈示として測定した。同様の評価を、高レベルのルイスＹ（ＬｅｗｉｓＹ＋＋＋）、すなわち高ルイスＹを発現するＡ４３１細胞で行った。
エフェクター細胞として、５０というエフェクター細胞：標的細胞比で用いた末梢血単核球細胞の存在下または非存在下で、種々の濃度の抗ルイスＹ抗体とともに４時間培養した固定数の腫瘍細胞を用いて、Ｇ１９３およびＣＭＤ−１９３のＡＤＣＣ活性を決定した。腫瘍細胞の溶解の結果として放出された乳酸脱水素酵素活性を測定した。非イオン性界面活性剤によるＬＤＨ活性放出を、総溶解の表示として測定した。同様の評価をルイスＹ＋＋＋Ｎ８７細胞で行った。
野性型ＩｇＧ１抗ルイスＹ抗体および変異体ＩｇＧ１抗ルイスＹ抗体の両方は、等しく、図２４および図２５に示されるように、ルイスＹ抗原の高い発現を有するＮ８７癌腫細胞に対してＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性の両方を媒介することが可能であった。いずれの抗体も、ルイスＹ抗原の発現が極めて低いかまたは全くないＡ４３１細胞に対しては、同様の活性が観察されなかった。対照的に、ｈｕ３Ｓ１９３およびＧ１９３の配列と同一であるＶＨ配列およびＶＫ配列を有する抗ルイスＹ抗体のＩｇＧ４バージョンは、ＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性の両方とも促進できなかった。ヒトＩｇＧ４アイソタイプは、ＡＤＣＣおよびＣＤＣを媒介する能力を欠くことが公知であり、そしてこの概念と一致して、抗ルイスＹ ＩｇＧ４抗体は、ＡＤＣＣアッセイおよびＣＤＣアッセイにおいて不活性である。
これらの結果によって、Ｇ１９３のＦｃにおけるＬ２３６Ａ変異体およびＧ２３９Ａ変異体の導入は、Ｇ１９３をそのエフェクター機能能力において欠損しないということが示唆される。ＣＭＤ−１９３はまた、ルイスＹ抗原の高い発現を有するＮ８７癌細胞に対してＣＤＣ活性を媒介するのにＧ１９３と同じ程度に有効であった。これらの結果によってさらに、カリケアマイシンに対するＧ１９３の結合体化は、Ｇ１９３がＣＤＣ活性を媒介する能力を変更しないことが示される。従ってＧ１９３およびＣＭＤ−１９３の両方ともエフェクター機能活性を媒介し得、そしてＣＭＤ１９３は、エフェクター機能を受容可能な（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）抗体結合体である。
（実施例２．カリケアマイシンに対する抗ルイスＹ抗体の結合）
抗体を最初に以下のようにカリケアマイシン（ＣＭ）に結合体化した。約１０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度の抗体を、高モル濃度の非球核性緩衝液（１Ｍ ＨＥＰＥＳ）を用いてｐＨ８〜８．５に調節した。次に、タンパク質凝集を防止する賦形剤（オクタン酸ナトリウム）を、最終濃度０．１〜０．２Ｍで添加した。最終的に、活性化されたカリケアマイシン誘導体のタンパク質量の５％を、濃縮溶液（１０〜２０ｍｇ／ｍｌ）として有機溶媒（エタノールまたはジメチルホルムアミド）中に添加した。次いで、この反応混合物を２５〜３５℃で１〜２時間インキュベートした。反応の進行を、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによってモニターした。反応の終了後、この結合体を、分取ＳＥＣカラム上で、凝集した抗体および遊離のカリケアマイシンから分離した。呈示した実験で用いた結合体調製物の抗体あたりのＣＭの量は、それぞれ、ｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭおよびＲＩＴＵＸＡＮ−ＡｃＢｕｔ−ＣＭについて、２２〜４７μｇ／ｍｇ、および１７〜３０μｇ／ｍｇにおよんだ。
（結合体化条件の最適化）
代表的な結合体化反応では、ヒト化抗−ルイスＹ抗体（ｈｕ３Ｓ１９３）を、ＮＡｃ−γ−カリケアマイシン−ＤＭＨ−ＡｃＢｕｔ−ＯＳｕ（カリケアマイシン誘導体）に結合体化したが、ここで標的タンパク質の濃度は１０ｍｇ／ｍｌであって、標的カリケアマイシン誘導体ローディングはタンパク質の重量あたり７．０パーセントであった。標的の反応ｐＨは、８．２±０．２であって、他の反応成分の標的濃度は、以下のとおりであった：５０ｍＭのＨＥＰＢＳ、１０ｍＭのデオキシコール酸ナトリウム、および９％（ｖ／ｖ）のエタノール。この反応は、３３±２℃で１時間行った。精製前のこの代表的な反応の分析の結果は以下のとおりであった：タンパク質：９．９２ｍｇ／ｍｌ；カリケアマイシンローディング：７０μｇ／ｍｇ；凝集物：１．９％；非結合体化タンパク質（ＬＣＦ）：０．８１％。
生成物の収率および純度に対する種々の界面活性物質の添加およびその濃度の効果を試験して、ｈｕ３Ｓ１９３の結合体化したモノマーの産生に対するそれらの効果を決定した。結果を以下の表２に示す。添加物およびその濃度を除いて全ての変数を一定に保って反応を行った。これらの反応から生成した結合体を凝集物、ＬＣＦおよびタンパク質の回収について分析した。いくつかの添加物では、低凝集物または低ＬＣＦのいずれかを有する結合体を生じたが、デオキシコール酸塩のみが低凝集物、低ＬＣＦおよび高いタンパク質回収を有する結合体を生じた。
（表２）
Figure 2007529536
 オクタン酸塩は、ＣＭＡ−６７６結合体化反応において用いられる標準的な触媒であるが、デカン酸塩は、ＣＭＣ−５４４結合体化反応において用いられる標準的な触媒である。デオキシコール酸の結果は、５つの反応の平均であって、カッコ内の範囲を伴う。界面活性剤の胆汁酸ファミリーの他のメンバーを試験したところ、同様の結果を得た。
結合体化反応の終わりの凝集物パーセントおよび遊離タンパク質のパーセントを、オクタン酸塩、デカン酸塩およびデオキシコール酸塩を用いて種々のＩｇＧ１抗体およびＩｇＧ４抗体について決定した。試験したＩｇＧ１抗体は、Ｇ１９３およびコントロール抗体（ｍＡｂ０１）であったが、試験したＩｇＧ４抗体は、ＩｇＧ４定常領域を有するＧ１９３（Ｇ１９３−ＩｇＧ４）、ＣＭＡ−６７６結合体由来のｍＡｂ６７６、ＣＭＣ−５４４結合体由来のｍＡｂ Ｇ５４４、およびコントロールの抗体（ｍＡｂ ０２）であった。以下の表３に示されるとおり、デオキシコール酸塩の存在下のＩｇＧ１抗体の結合体化によって、低いパーセントの凝集物および低いパーセントの非結合体化タンパク質（またはＬＣＦ）が得られたが、オクタン酸塩またはデカン酸塩の存在下の結合体化は、高いパーセントの凝集物または高いパーセントの非結合体化タンパク質のいずれかを生じた。これは、デカン酸塩またはデオキシコール酸のいずれかの存在下で結合体化された場合、低いパーセントの凝集物および低いパーセントの非結合体化タンパク質を有するＩｇＧ４抗体と対照的である。
（表３）
Figure 2007529536
 （ＣＭＤ−１９３の種々の薬物ローディング）
１つの抗ルイスＹ抗体（Ｇ１９３）あたりのカリケアマイシンの種々の薬物ローディングを評価した。Ｇ１９３抗体タンパク質の１ミリグラムあたり、３０、６０または９０ｍｇのＮａｃ−γカリケアマイシンＤＭＨの薬物ローディングを有するＣＭＤ−１９３調製物を生成して、Ｎ８７異種移植されたマウスにおける１キログラムあたり１６０ｍｇのカリケアマイシン当量の用量でＩＰ Ｑ４Ｄ×３で投与した。ＣＭＤ−１９３の抗腫瘍有効性は、薬物ローディングにおける相違によっては影響されなかった。
図２３に示されるように、種々のカリケアマイシンローディングを有するＣＭＤ−１９３の抗腫瘍有効性を本質的に同定した。非結合体化標的抗体Ｇ１９３は抗腫瘍活性を媒介することにおいて無効であるので、ＣＭＤ−１９３の全体的な抗腫瘍有効性は、カリケアマイシンの腫瘍細胞に対して標的された送達に起因し得る。これらの結果によって、３０〜９０μｇ／ｍｇのＣＭＤ−１９３の範囲では、カリケアマイシン結合体（ローディング）の程度は、その治療転帰に影響しないことが示唆される。
（クロマトグラフィーの精製）
精製のための出発物質は、７０μｇ／ｍｇというカリケアマイシン誘導体ローディングでタンパク質１ｍＬあたり９．９２ｍｇを含有する結合反応混合物であって、これは１．９％という凝集物含量（ＨＰＬＣによる領域パーセント）、そして０．８２％のＬＣＦ含量（ＨＰＬＣによる領域パーセント）である。結合体化反応が終了した後、この反応混合物を、０．６Ｍの最終リン酸濃度（ｐＨ８．２）までリン酸カリウム溶液の添加によって１０倍に希釈した。混合後、この溶液を０．４５ミクロンのフィルターを通して濾過した。希釈された溶液を、ブチルセファロース（Ｂｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ ｃｏｌｕｍｎ上にロードした。このカラム上にロードしたタンパク質の総量は、１ｍｌのベッド容積あたり２０ｍｇであった。０．６Ｍのリン酸カリウムでの洗浄後、このカラムを、０．６Ｍ〜４ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ８．２の段階的勾配を用いて溶出した（あるいは、このカラムは、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／２５ｍＭ ＮａＣｌで溶出され得てもよい）。段階的勾配からのこの画分をプールした。そのプールは、以下を含んだ：タンパク質８．３ｍｇ／ｍＬ；カリケアマイシン６９．３μｇ／ｍｇ；凝集物０．４２％；ＬＣＦ：０．３１％。
緩衝液の交換を、再生されたセルロース膜での限外濾過／ダイアフィルトレーションを用いて達成した。この結合体を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／１０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ ８．０（１０倍透析容積）に対してダイアフィルトレーションした。このプールを処方物に適切な緩衝液に処理するには、サイズ排除クロマトグラフィーまたは限外濾過／ダイアフィルトレーションのいずれを用いてもよい。
（実施例３．抗ルイスＹ抗体カリケアマイシン結合体の特異性および反応速度論）
野性型（ｈｕ３Ｓ１９３）抗ルイスＹおよび変異体（Ｇ１９３）抗ルイスＹに対するカリケアマイシンの結合体化がＬｅｙに対する結合を抹消することを確認するために、これらの抗体およびそれらのそれぞれの結合体を、プラズモン共鳴分析（ＢＩＡｃｏｒｅ）および／またはＦＡＣＳ分析に供した。ｈｕ３Ｓ１９３およびｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭは、Ｌｅｙ−ＢＳＡのみを認識し、以下のオリゴヌクレオチド抗原のいずれも認識しない：Ｈ−Ｉ型、Ｈ−ＩＩ型、シアリル−Ｌｅａ、シアリル−Ｌｅｘ、スルホ−Ｌｅａ、スルホ−Ｌｅｘ、Ｌｅａ、Ｌｅｂ、またはＬｅｘ。ｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭの結合の反応速度論は、ｈｕ３Ｓ１９３の反応速度論とは異なった。抗体のＫａおよびＫｄもまた、ＣＭへの結合体化によって変更された。
まとめると、ＢＩＡｃｏｒｅおよびＦＡＣＳの分析からの結果によって、ｈｕ３Ｓ１９３またはＧ１９３に対するＣＭの結合体化は、Ｌｅｙ−ＢＳＡについて、またはＬｅｙ陽性細胞についての特異性には影響しなかったことが示された（データ示さず）。ｈｕ３Ｓ１９３と比較した場合のｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭの変更された反応速度論のパラメーターは、Ｎ８７細胞に対して結合し得る結合体または抗体の種々の量に変換される必要はなかった。
（ＢＩＡｃｏｒｅ分析）
ＬｅｙについてのＧ１９３、ｈｕ３Ｓ１９３、ｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭおよびＣＭＤの特異性を確認するために、種々のＬｅｙ関連抗原についての抗体およびそれらのＣＭ結合体の親和性を、ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００を用いて表面プラズモン共鳴分析を用いることによって評価した。ルイスＹ−ＢＳＡ（３０モルのルイスＹ／ＢＳＡのモル）を、バイオセンサーチップ上に固定して、種々の濃度（２、４、８、１２および１６ｎＭ）の種々のルイスＹ反応性因子に曝した。Ｇ１９３、ｈｕ３Ｓ１９３、ｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭおよびＣＭＤ−１９３は、ｈｕ３Ｓ１９３と同一の親和性および特異性でＬｅｙ−ＢＳＡに結合する。ＢＩＡｃｏｒｅによって決定した反応速度論のパラメーターは、人工的なＬｅｙ−ＢＳＡ基質に対する抗体または結合体の結合に依存する。
３つの抗体が同一の反応速度論の定数を有した。これらの評価によって、非結合体化抗ルイスＹ抗体、非結合体化Ｇ１９３および非結合体化ｈｕ３Ｓ１９３が、中程度の親和性（ＫＤは１００〜３００ｎＭにおよぶ）でルイスＹ−ＢＳＡに結合することが示された。下の表４に示されるように、カリケアマイシンに対する結合体化は、この人工的な系において抗体のルイスＹ結合強度におけるこれらのわずかな減少を生じた。ＣＭＤ−１９３は、低い親和性および高いナノモルＫＤでルイスＹ抗原に結合する。
（表４）
Figure 2007529536
 この抗体および結合体は、Ｌｅｙのみを認識し、関連の多糖類のいずれも認識しなかった。また、ルイスＹに構造的に関連する種々の炭水化物抗原に対するＧ１９３、ｈｕ３Ｓ１９３およびそれらのカリケアマイシン結合体の結合を、バイオセンサー分析を用いて検討した。ＢＳＡに結合体化された種々のルイスＹ関連抗原を、バイオセンサーチップ上に固定して、抗ルイスＹ抗体およびそれらのカリケアマイシン結合体に曝した。図２０に示されるこれらの結果によって、Ｇ１９３およびＣＭＤ−１９３は、ルイスＹ抗原に特異的であり、そしてルイスＹに構造的に近い抗原であるルイスＸおよびＨ−２血液群抗原に対してさえ結合を示さないことが示された。これらの結果によってもさらに、カリケアマイシンに対する結合体化は抗ルイスＹ抗体の抗原特異性を変更しないことが示唆される。
（ＦＡＣＳ分析）
結合体化が、Ｌｅｙ細胞に対するｈｕ３Ｓ１９３の結合に影響したか否かを確認するために、Ｎ８７細胞に結合したｈｕ３Ｓ１９３およびｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭの量を、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって比較した。種々の濃度のｈｕ３Ｓ１９３またはｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭのいずれかに対してＮ８７の曝露後に得られた、平均のチャネル蛍光（ｍｅａｎ ｃｈａｎｎｅｌ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）（ＭＣＦ）は、類似した。Ｎ８７細胞を、種々の濃度のｈｕ３Ｓ１９３およびｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭとともにインキュベートした。結合した結合体または抗体の量をＭＣＦとして表した。下の表５は、種々の癌腫細胞株に対するｈｕ３Ｓ１９３の結合のフローサイトメトリーの検出を示す（ヒトＩｇＧ１をコントロールの抗体として用いた）。ルイスＹ発現状態を、抗ルイスＹ抗体でのＭＣＦ／コントロール抗体でのＭＣＦの比に基づいて任意に割り当てた。３〜１０の範囲の比は、＋のレベルを表し、１０〜１００がルイスＹ発現の＋＋レベルを表し、１００〜３００が＋＋＋のレベルを表し、そして＞３００が＋＋＋＋レベルを表す。この最初の評価に基づいて、ルイスＹ高発現癌腫細胞株および低発現癌腫細胞株をさらなる研究に用いた。
（表５）
Figure 2007529536
 Ｇ１９３およびｈｕ３Ｓ１９３結合体は、ｈｕ３Ｓ１９３と同様に培養中のＬｅｙ＋胃癌腫細胞（Ｎ８７）に結合する。種々の濃度のｈｕ３Ｓ１９３またはＧ１９３に対してＮ８７単層を曝露した後決定したＭＣＦ（平均チャネル蛍光：ｍｅａｎ ｃｈａｎｎｅｌ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）値もまた、同一であった。従って、ＢＩＡｃｏｒｅで実証されたＬｅｙ−ＢＳＡに対する等しい結合に加えて、天然に呈示されたＬｅｙに対するｈｕ３Ｓ１９３，Ｇ１９３およびｈｕ３Ｓ１９３の結合も同一であった。
（薬物動態）
ＣＭＤ−１９３での薬物動態研究は以下から構成された：ＣＭＤ１９３（ラット）、Ｇ１９３抗体（ラット、イヌ）、非結合体化カリケアマイシン誘導体（ラット、イヌ）、総カリケアマイシン誘導体（ラット、イヌ）の濃度、ならびにラット血清におけるＣＭＤ−１９３に特異的な抗体、そしてイヌ血清におけるＧ１９３抗体に特異的な抗体の存在を決定するための酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）のバリデーション；雌性ヌードマウスにおけるＣＭＤ−１９３の単回腹腔内（ＩＰ）投薬の投与後のＧ１９３抗体の薬物動態評価；ヒト肝臓ミクロソームおよびシトゾールにおけるＮａｃγカリケアマイシンジメチルヒドラジド（ＣＭ）のインビトロ代謝、ならびにＮａｃγカリケアマイシンＤＭＨ ＡｃＢｕｔのインビトロ代謝、およびＨＬ６０前骨髄球性白血病細胞におけるＮａｃγカリケアマイシンＤＭＨのインビトロ代謝。
ヌードマウスにおけるインビボの薬物動態研究のために、５％スクロース、０．０１％ポリソルベート８０、２．９２ｍｇ／ｍＬ（５０ｍＭ）塩化ナトリウム、２．４２ｍｇ／ｍＬ（２０ｍＭ）Ｔｒｉｓ、および注射用滅菌水を含む、８．０にｐＨ調整されたビヒクル中で、ＣＭＤ−１９３をＩＰ投与した。この研究では、ローディングは、抗体の１ｍｇあたり約７５ｍｇのカリケアマイシン誘導体であって、これは、抗体の１モルあたり約６モルのカリケアマイシンに等価である。
雌性ヌードマウスにおいて１ｋｇあたり１５ｍｇというカリケアマイシン当量の用量（最小有効用量（ＭＥＤ））でのＣＭＤ１９３の単回用量のＩＰ投与後のＧ１９３抗体の薬物動態は、中程度の吸収速度および長期の見かけ上の終末半減期（ｔ１／２）によって特徴付けられた。Ｇ１９３抗体の平均の濃度下面積対時間の曲線（ＡＵＣ０−￥）は２２２ｍｇ・ｈ／ｍＬであった。
ＮＡｃγカリケアマイシンＤＭＨおよびＮＡｃγカリケアマイシンＤＭＨ ＡｃＢｕｔの代謝的運命を、ヒトの肝臓ミクロソームおよびサイトゾル中でインビトロで検査して、Ｎａｃ−γカリケアマイシンＤＭＨの代謝運命を、ＨＬ−６０前骨髄球性細胞中で検査した。ヒトの肝臓ミクロソームおよびサイトゾル中でのインキュベーション後に多くの代謝物を見出した。ミクロソーム中の生体内変換経路は、水酸化および脱メチルであるが、ＮＡｃ−εカリケアマイシンおよびその誘導体の形成は、サイトゾル中の主要な経路であると考えられた。Ｎａｃ−εカリケアマイシンおよびそのアイソマーを含むいくつかの代謝物が、ＨＬ−６０白血病細胞でのインキュベーションの間に生じた。肝臓および白血病細胞調製物の両方において共通の代謝物が観察された。このことは、カリケアマイシン誘導体の代謝が細胞特異的ではないかもしれないことを示唆している。細胞中のＮＡｃ−εカリケアマイシンおよびその誘導体の検出によって、ＮＡｃεカリケアマイシンの反応性のジラジカル種はおそらく、細胞内のＮＡｃ−γカリケアマイシンＤＭＨのジスルフィド結合のグルタチオン依存性の還元を介して形成されるという仮説が支持される。
（実施例４．ヒト癌腫細胞株のインビトロ増殖に対する抗ルイスＹ抗体カリケアマイシン結合体の有効性）
ヒト癌細胞株のインビトロ増殖に対する、ｈｕ３Ｓ１９３（ｈｕ３Ｓ１９３−ＣＭ）およびＧ１９３（ＣＭＤ−１９３）の両方に結合体化したカリケアマイシンの効果を、ヒト癌腫細胞株に対して評価した。評価した細胞株としては、ルイスＹ抗原の高発現または低発現のいずれかを有する癌腫、ならびに乳房、結腸、肺および前立腺からの癌腫が挙げられた。ｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭおよびＣＭＤ−１９３の有効性を、両方とも、ＣＭ（遊離の薬物）および／または種々のコントロールの結合体の有効性に対してインビトロで比較した。
下の表６および７に示されるとおり、ｈｕ３Ｓ１９３およびＣＭＤ−１９３の両方とも、ルイスＹ発現癌腫細胞に対してコントロール結合体（例えば、ＣＭＡ−６７６）よりも一貫して有効であった。対照的に、ｈｕ３Ｓ１９３およびＣＭＤ−１９３はいずれも、ルイスＹ抗原の発現が低いかまたはほとんどない細胞に対して、コントロール結合体よりも有効であるか有効性が低いかのいずれかであった。
（ｈｕ３Ｓ１９３−ＣＭ）
ｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭはインビトロでＬｅｙ発現癌腫細胞の増殖を特異的に阻害する。遊離のｈｕ３Ｓ１９３抗体は、１×１０−４〜６．９μｇタンパク質／ｍｌにおよぶ範囲の濃度で用いた場合、ＬＯＶＯ、Ｌ２９８７、Ｎ８７またはＡＧＳの増殖に影響しなかった。このタンパク質濃度の範囲は、結合体として与えられた抗体の量と等価であった。ＥＤ５０は、ＣＭに対してまたは結合体に対して９６時間曝露された後に細胞培養のうち５０％が生存する用量（ｎｇ／ｍｌ）を示す。ｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭのＥＤ５０は、ＣＭＡのＥＤ５０よりもＬｅｙ陽性細胞（ｒｅ ＭＣＦ＞１０）において一貫して低かった。ｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭのＥＤ５０は、ＣＭＡのＥＤ５０よりもＬｅｙ陽性細胞（ｒｅＭＣＦ＞１０）において一貫して低かった。
両方の結合体のＥＤ５０の実験内の変動が観察された。しかし、ｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭのＥＤ５０範囲は、Ｌｅｙ＋ ＡＧＳ細胞に対するこの結合体の有効性を試験した場合、ＣＭＡのＥＤ５０よりも一貫して低かった。対照的に、これらの範囲は、両方の結合体の有効性をＬｅｙ−ＰＣ３ＭＭ２細胞上で決定した場合、重複した。この結果が、２つの細胞株の選択によって生じた可能性は、低かった。Ｌｅｙ＋細胞を用いる平行実験でのＣＭＡおよびｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭのＥＤ５０の比較によって、ＣＭＡについてよりもｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭについて平均して低いＥＤ５０が示された（ＣＭＡ倍数は１未満）。この知見は、細胞株の起源、カリケアマイシンに対するその感度、およびＬｅｙのその相対量とは独立していた。パラメーターであるＣＭＡ倍数は、種々のＬｅｙ−細胞を用いた場合１以上であった。種々のｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭ結合体調製物をこれらの実験に用いたところ（タンパク質１ｍｇあたり２２μｇおよび４７μｇのカリケアマイシン）、この観察はこの変数とは独立していたことが示された。まとめると、この結果によって、Ｌｅｙに対するカリケアマイシンの標的化に起因する、ｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭの選択的な細胞毒性が例示される。
この知見を、異なるバッチのｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭでの一連の実験によって確認した。これらの実験に用いタンパク質結合体調製物は、タンパク質１ｍｇあたり２２〜４７μｇのＣＭを有した。ｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭおよびＭＹＬＯＴＡＲＧ（ＣＭＡ）のＥＤ５０値を、９つの実験からプールして、その出現度数の関数としてプロットした（図２Ａおよび２Ｂを参照のこと）。Ｌｅｙ＋細胞に対する有効性（ＡＧＳ、図２Ａ）を、Ｌｅｙ−細胞に対する有効性と比較した（ＰＣ３ＭＭ２、図２Ｂ）。１０個の細胞株の群について、ｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭのＥＤ５０値をまた、各々の実験における最初のコントロールとして用いたＣＭＡのＥＤ５０値に対して評価した（ＣＭＡ倍数）。ここでｎは、独立したＥＤ５０測定の回数である（図２Ｃを参照のこと）。ＥＤ５０のある程度の実験間の変動にかかわらず、ｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭは一貫して、Ｌｅｙ陽性細胞に対してＣＭＡよりも有効性のままであった（ＡｃＢｕｔ−ＣＭＡ倍数は１より大きい）。この結果によって、Ｌｅｙに対してＣＭを標的することに起因する選択的な細胞毒性が実証される。
（表６）
Figure 2007529536
 この実験では、ヒト癌細胞を、漸増濃度の非結合体化カリケアマイシンまたは結合体化カリケアマイシン（ＣＭＡ−６７６またはＣＭＤ−１９３）の存在下で９６時間培養して、その後に各々の培養物中の生きた細胞をＭＴＳアッセイキットを用いて計数した。上の表６では、ＣＭとはＮＡｃ−Ｃａｌｉｃｈ ＤＭＨを指し、ＣＭＡ−６７６およびＣＭＤ−１９３の両方の濃度がカリケアマイシン当量（ｎＭ）として表されており、そして選択性比の倍数は、ＣＭＡのＥＤ５０対ＣＭＤのＥＤ５０の比として表される。６．７ｍｇ／ｍＬ（試験した最高濃度）の非結合体体化抗ルイスＹ抗体は、検査した腫瘍細胞株のいずれの増殖にも影響を有さなかった。
（ＣＭＤ−１９３）
遊離のＧ１９３抗体は、１ｍｌあたり５，７００〜６，９００ｎｇのタンパク質の範囲の濃度で用いた場合、いずれの検査した細胞型の増殖にも影響しなかった。ｈｕ３Ｓ１９３の場合と同様に、ＣＭＤのＥＤ５０は、ＣＭＡのＥＤ５０よりもＬｅｙ陽性細胞において一貫して低かった。これらの実験に用いた結合体の調製物は、タンパク質１ｍｇあたり５６〜８８μｇのＣＭを有した。ＥＤ５０のある程度の実験間の変動にかかわらず、ＣＭＤはＬｅｙ陽性細胞に対してＣＭＡよりも一貫して有効であるままであった（ＡｃＢｕｔ−ＣＭＡ倍数は１より大きい）。この結果によって、Ｌｅｙに対してＣＭを標的することに起因する選択的な細胞毒性が例示される。
ＣＭＤ−１９３の選択性は、ＣＭＡおよびＣＭＤでの処置後のＡ４３１およびＡ４３１／Ｌｅｙの減衰プロットの比較によって最もよく図示された（図９）。この実験では、Ａ４３１細胞およびＡ４３１／Ｌｅｙ細胞の単層を、ＣＭＤまたはＣＭＡの存在下で９６時間培養した。処置後に残った細胞の数を、生体染色色素法（ｖｉｔａｌ ｄｙｅ ｍｅｔｈｏｄ）によって確認して、コントロールのパーセンテージとして表した。２つの型のＡ４３１細胞がＣＭに対して同様の感度を有した。ＣＭＤ減衰曲線の、ＣＭＡに関して有意な左方向シフトが、図９Ｂに示されるように、Ｌｅｙ陽性細胞株（Ａ４３１／Ｌｅｙ）の処置後に観察され、そして図９Ａに示されるように、Ｌｅｙ陰性細胞株（Ａ４３１）の処置後に観察された。
（表７）
Figure 2007529536
 これらの実験では、ヒト癌腫細胞を、漸増濃度の非結合体化カリケアマイシンまたは結合体化カリケアマイシン（ＣＭＡ−６７６またはＣＭＤ−１９３）の存在下で９６時間培養して、その後に各々の培養物中の生きた細胞をＭＴＳアッセイキットを用いて計数した。上の表７では、ＣＭとはＮＡｃ−Ｃａｌｉｃｈ ＤＭＨを指し、ＣＭＡ−６７６およびＣＭＤ−１９３の両方の濃度がカリケアマイシン当量（ｎＭ）として表されており、そして選択性比の倍数は、ＣＭＡのＥＤ５０対ＣＭＤのＥＤ５０の比として表される。６．７μｇ／ｍＬ（試験した最高濃度）の非結合体化抗ルイスＹ抗体は、検査した腫瘍細胞株のいずれの増殖にも影響を有さなかった。
（実施例５．ヒト癌腫細胞異種移植片のインビボ増殖に対する抗ルイスＹ抗体カリケアマイシン結合体の有効性）
抗ルイスＹ抗体に結合体化されたカリケアマイシンの抗腫瘍有効性を、ヌードマウスにおいて皮下（ＳＣ）で確立したヒト癌腫異種移植片に対して評価した。評価した異種移植片は、ルイスＹ抗原の高発現または低発現のいずれかを有する癌腫、ならびに乳房、結腸、肺および前立腺由来の癌腫を含んだ。１５０〜３００ｍｇという平均質量を有する固形腫瘍を有するマウスを、種々の処置群に無作為化した。
（ｈｕ３Ｓ１９３−ＣＭ）
ｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭのインビボでの有効性を、胃癌腫（Ｎ８７、図３）、前立腺癌腫（ＬＮＣａＰ、図４）および結腸癌腫（ＬＯＶＯ、図５および６）由来の皮下の異種移植片で試験した。Ｎ８７、ＬＯＶＯおよびＬＮＣａＰの皮下腫瘍を、無胸腺ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）で増殖させた。１．５〜３ヶ月齢の雌性マウスに、マウス１匹あたり５×１０６個のＮ８７細胞または１０７個のＬＯＶＯ細胞をそれぞれ注射した。ＬＮＣａＰ細胞を、３ヶ月齢の雄性ヌードマウスに注射した。腫瘍を増殖させるために、Ｎ８７細胞およびＬＮＣａＰ細胞を、注射の前に、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｅｌｆｏｒｄ，ＭＡ）と混合（１：１のｖｏｌ／ｖｏｌ）しなければならなかった。腫瘍の２つの直行する直径を、ノギスを用いて週に少なくとも１回測定した。Ａｔｔｉａ ＆ Ｗｅｉｓｓの式：Ａ２×Ｂ×０．４に従って腫瘍容積を算出した。
他に示さない限り、各々の結合体およびコントロールの３用量を、４日の間隔で腹腔内に与えた（Ｑ４Ｄ×３）。インビボで、ｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭは、これらの３つの別々のモデルにおいて腫瘍増殖を阻害した。ｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭは、ルイスＹ抗原の高い発現を有する胃癌腫の異種移植片（Ｎ８７）からマウスを治癒させた（図３）。前立腺癌腫異種移植片（ＬＮＣａＰ）は、ｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭの投与後の増殖を停止させ、そして腫瘍増殖の阻害は、結腸癌腫異種移植片（ＬＯＶＯ）で得られた（それぞれ、図５および６）。ＬＯＶＯモデルでは、ｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭの有効性は、結合体の量を増大することによって改善された（図５）。
（Ｎ８７胃癌腫異種移植片）
１００ｍｍ３のＮ８７（Ｌｅｙ＋、ＣＤ３３−およびＣＤ２０−）異種移植片を保有するマウスを、コントロールの結合体（ＣＭＡ、ＲＩＴＵＸＡＮ−ＡｃＢｕｔ−ＣＭ）、ＰＢＳ、ｈｕ３Ｓ１９３またはｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭで処置した。各々の群のマウスに、３回の用量をｉ．ｐ．で投与した。結合体およびコントロールを、１日目、５日目および９日目に注射した。図３Ａは、コントロール結合体の有効性を示しており、そして図３Ｂは、ｈｕ３Ｓ１９３およびそのカリケアマイシン結合体の効果を図示する。誤差棒は、各々の時点での平均腫瘍容積の標準偏差を表す。腫瘍保有マウスの処置群における腫瘍サイズの相違は、両側検定のＳｔｕｄｅｎｔｓのｔ検定によって証明され、２８日目のｐ値はＣに示されており、そしてｎは、１群あたりのマウスの数に相当する。１μｇ、２μｇおよび４μｇのカリケアマイシン当量／用量／マウスでは、ｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭは、Ｎ８７異種移植片の腫瘍増殖を有意に阻害した（図３）。１００％、６０％および１０％の治癒率がまた、それぞれ、４μｇ、２μｇおよび１μｇのカリケアマイシン当量／用量／マウスで観察されており、このことは、異種移植片のサイズが減少して、処置後１００日の間、最初の平均腫瘍容積を決して超えないことを示している。
（ＬＮＣａＰ前立腺癌腫異種移植片）
ＬＮＣａＰ前立腺腫瘍保有マウスを、ｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭ、ＰＢＳまたはコントロールの結合体ＣＭＡで処置した。凡例におけるカッコ内の数は、１マウスあたりの１用量あたりのカリケアマイシンの量を示す。処置した群における腫瘍サイズの相違は、両側スチューデントｔ検定によって証明されている。３０日目のｐ値が報告されており、ｎはマウスの数に相当する。図４に示されるように、コントロール結合体は、等用量以下の用量で、ｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭよりも低い程度に腫瘍増殖を阻害した。さらに、コントロール結合体での処置後、０％の治癒率が観察された。ｈｕ３Ｓ１９３は、４μｇカリケアマイシン当量のｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭとともに与えられるタンパク質量（１２０μｇ）に対して等価な用量およびレジメンで投与された場合、効果を有さなかった。以前の実験は、ｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭに等価な用量のカリケアマイシンの投与は、いままで試験した腫瘍モデルのいずれも阻害しなかったことを示した。従って、カリケアマイシンの投与は本研究におけるコントロールとしては省略されている。
（ＬＯＶＯ結腸癌腫異種移植片）
また、ｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭが腫瘍増殖を阻害する能力を、結腸癌腫（ＬＯＶＯ）モデルで実証した。１００ｍｍ３のＬＯＶＯ異種移植片を保有するマウスを、コントロール結合体（ＲＩＴＵＸＡＮ−ＡｃＢｕｔ−ＣＭ、図５Ａ）、ＰＢＳ（図５Ａおよび図５Ｂ）、ｈｕ３Ｓ１９３（図５Ｂ）またはｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭ（図５Ｂ）で処置した。ｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭを４μｇ／用量で用いて処置した群を除いて、各々の群のマウスには３回の用量をｉ．ｐ．で与えた。カリケアマイシン当量における各々の投薬の量を、凡例に特定する。結合体およびコントロールを、１日目、５日目および９日目に注射した。この群は以下のように割り当てた：４３日目に３用量のさらなるレジメンを投与されたｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭ、４７日目に３用量のさらなるレジメンを投与されたｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭ、および５１日目に３用量のさらなるレジメンを投与されたｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭ。１群あたりのマウスの数（ｎ）を、Ｃに報告する。３０日の腫瘍サイズの相違を、両側スチューデントｔ検定によって統計学的有意性について証明した。
Ｈｕ３Ｓ１９３は、Ｎ８７異種移植片で観察されるよりも少ない程度までＬＯＶＯ異種移植片の増殖を阻害した。コントロール結合体（ＲＩＴＵＸＡＮ−ＡｃＢｕｔ−ＣＭまたはＣＭＡ）は、無視できる程度の腫瘍阻害しか生じなかった。ｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭによって生じる阻害は、コントロール結合体の阻害よりも長かった。従って、一方でのマウスあたり４μｇおよび２μｇのカリケアマイシン当量の用量（Ｑ４Ｄ×３）でのＲＩＴＵＸＡＮ−ＡｃＢｕｔ−ＣＭでの処置後の腫瘍サイズと、他方でのＰＢＳでの処置後の腫瘍サイズとの間の相違は、１６日目でのみ有意であった（ｐ＜０．０５）。
対照的に、マウス１匹あたり４μｇ、２μｇおよび１μｇのカリケアマイシン当量の用量のｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭでの処置（Ｑ４Ｄ×３）によって、それぞれ４３、２２および１６日間のＰＢＳ処置から統計上の相違が生じた。１００ｍｍ３のＬＯＶＯ異種移植片を保有するマウスを、コントロールの結合体：ＲＩＴＵＸＡＮ−ＡｃＢｕｔ−ＣＭおよびＣＭＡ（図６Ａ）、ＰＢＳまたはｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭ（図６Ｂ）で処置した。各々の群のマウスに、３用量または４用量のｉ．ｐ．を投与した。カリケアマイシン等量における各々の用量は、凡例に特定される。結合体およびコントロールを、１日目、５日目および９日目に注射した。この群を、ｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭ＊と命名し、１３日目にさらなる用量を投与した。１群あたりのマウスの数はｎに相当し、そして両側スチューデントｔ検定のｐ値を決定した。
（ＨＣＴ８Ｓ１１結腸癌腫異種移植片）
ＨＣＴ８Ｓ１１結腸癌腫異種移植片を保有するマウスを試験して、ｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭのインビボ活性を測定した。ＣＤ２０−標的化カリケアマイシン結合体化リツキシマブを、非結合コントロールとして用いた。結合体を、ＩＰ Ｑ４Ｄ×３で８０または１６０ｍｇ／ｋｇで投与した。図２１によって、カリケアマイシン結合体化ｈｕ３Ｓ１９３は、小さい腫瘍および大きい腫瘍の両方でＨＣＴ８Ｓ１１結腸癌腫異種移植片の増殖の強力な阻害を引き起こし得たことが示される。ルイスＹ標的化結合体の抗腫瘍活性は常に、ＣＤ２０またはＣＤ３３のいずれかに標的化された非特異的な非結合結合体の活性よりも大きかった。
（ＣＭＤ−１９３）
ＣＭＤ−１９３のインビボ有効性を胃癌腫（Ｎ８７）、肺癌腫（Ｌ２９８７）、子宮頸部癌腫／類表皮癌腫（Ａ４３１／Ｌｅｙ）および結腸癌腫（ＬＳ１７４ＴおよびＬＯＶＯ）由来の皮下の異種移植片で試験した。他に示さない限り、全ての結合体およびコントロールを、Ｑ４Ｄ×３のスケジュールに従って腹腔内に注射した。免疫グロブリンのキャリア機能に起因する腫瘍標的化についてモニタリングするために、ＣＭＡを陰性のコントロールとして用いた。下に記載する研究に基づいて、１５ｍｇ／ｋｇというＣＭＤ−１９３の用量（５６２〜８０３ｍｇ／ｍ２という範囲で結合体化した抗体タンパク質の用量に等価）が、最小有効用量（ＭＥＤ）であるとみなした。
（Ｎ８７胃癌腫異種移植片）
１５０ｍｍ３のＮ８７異種移植片を保有するマウスを、コントロール結合体（ＣＭＡ）、ＰＢＳ、Ｇ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭ、ｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭ、Ｇ１９３またはｈｕ３Ｓ１９３で処置した。各々の群のマウスには３用量をｉ．ｐ．投与した。カリケアマイシン当量での量を、凡例に特定する。結合体およびコントロールを、１日目、５日目および９日目に注射した。図１０Ａは、コントロール結合体の有効性を示す。図１０Ｂは、ＣＭＤ−１９３およびｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭの効果を図示するが、図１０Ｃは、遊離の抗体の有効性がないことを実証する。誤差棒は、各々の時点での平均腫瘍容積の標準偏差を表す。
ＣＭＡは、当量用量で、ｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭまたはＣＭＤのいずれよりも有意に増殖阻害が少なかった。マウス１匹あたり１用量あたり４μｇのカリケアマイシン当量では、ｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭおよびＧ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭ（ＣＭＤ）は、Ｎ８７異種移植片からマウスを治癒させた（図１０）。具体的には、マウスのうち４０％および６０％が、それぞれ、ｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭまたはＣＭＤの４μｇのカリケアマイシン当量の投与後にそれらの腫瘍から治癒した。この治癒という用語は、異種移植片のサイズが減少し、処置後１００日の間最初の平均腫瘍容積を決して超えないことを示す。さらに、ｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭまたはＣＭＤによって生じる腫瘍増殖阻害はまた、２μｇのカリケアマイシン当量／用量／マウスの用量の用量で等価であった（図１０）。初期の実験によって、ｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭに等価な用量でのＣＭの投与は、現在記載される腫瘍モデルのいずれも決して阻害しなかったことが示された（データ示さず）。従って、ＣＭの投与はコントロールとしては省略されている。
Ｇ１９３およびｈｕ３Ｓ１９３は、Ｎ８７異種移植片の増殖を阻害しなかった。
（Ｌ２９８７肺癌腫異種移植片）
１００ｍｍ３のＬ２９８７異種移植片を保有するマウスを、コントロール結合体（ＣＭＡ）、ＰＢＳまたはＣＭＤで処置した。各々の群におけるマウスに、３用量をｉ．ｐ．で与えた。各々の用量のカリケアマイシン当量での量を、凡例に特定する。結合体およびコントロールを、１日目、５日目および９日目に注射した。図１１Ａは、コントロール結合体の有効性を示し、そして図１１Ｂは、ＣＭＤの効果を図示する。誤差棒は、各々の時点の平均腫瘍容積の標準偏差を表す。各々の群の最初の腫瘍平均よりも小さい腫瘍サイズを有するマウスの数（パーセンテージで表す）を、図１２において観察期間の関数としてプロットした。ＣＭＡ（図１２Ａ）またはＣＭＤ（図１２Ｂ）での処置を、ビヒクルコントロール（ＰＢＳ）での処置と比較する。
図１２は、ＣＭＤが０．３７５〜３μｇ／用量／マウスの用量範囲でＬ２９８７増殖を阻害したことを示す。この阻害の選択性の解釈は、２つの要因によって妨げられた。まず第一に、ＣＭＡは、この腫瘍モデルにおいて有意な増殖阻害効果を発揮した（図１２）。低用量では、この阻害は、ＣＭＤによって生じる阻害よりも小さかった。第二に、コントロール群の１０匹のマウスのうち２匹で腫瘍の自然な緩解が生じた（図１２）。それにもかかわらず、１群あたりの緩解した腫瘍の数は、ＣＭＡで処置された群においてよりもＣＭＤで処置された群において際立って高かった。ＣＭＤはまた、樹立されたＬ２９８７異種移植片の増殖を阻害した。
図１３に示される実験について、１０匹のマウスにＬ２９８７異種移植片を投与した。これらの腫瘍を、１．２５ｃｍ３という平均容積に達するまで増殖させた。０．５ｃｍ３より大きい腫瘍容積を有する３匹のマウス（すなわち、０．６６ｃｍ３、１．９７ｃｍ３および１．１１ｃｍ３）を、３用量の４μｇのカリケアマイシン当量のＣＭＤ（Ｑ４Ｄ×３）で処置した。これらの腫瘍は、初回用量後に３０日の期間の間退縮した。しかし、腫瘍の再増殖を可能にするのに十分な残留疾患が残っていた。２．３１ｃｍ３の腫瘍を有する１匹のマウスにも、４μｇのカリケアマイシン当量のＣＭＤ（Ｑ４Ｄ×３）を投与した。この大きい腫瘍は、治療に応答せず、マウスは、三回目の注射の前に倫理的な理由で殺傷しなければならなかった。従って、３回の用量の４μｇのカリケアマイシン当量のＣＭＤ（Ｑ４Ｄ×３）は、０．６６〜１．９７ｃｍ３の容積を有するＬ２９８７腫瘍の腫瘍増殖を阻害するには十分であったが、治癒には不十分であった。誤差棒は、各々の時点での平均腫瘍容積の標準偏差を表す。
（Ａ４３１／ＬＥＹ類表皮癌腫異種移植片）
また、Ａ４３１／Ｌｅｙ類表皮癌腫のＣＭＤ−１９３増殖阻害を評価した。約３００ｍｍ３のＡ４３１／Ｌｅｙ異種移植片を保有するマウスを、ＰＢＳまたはＣＭＤのいずれかで処置した。各々の群のマウスに、３用量をｉ．ｐ．で投与した。各々の用量のカリケアマイシン当量の量を、凡例に特定する。結合体およびコントロールを、１日目、５日目および９日目に注射した。誤差棒は、各々の時点の平均腫瘍容積の標準偏差を表す。結果を図１４に示す。約１００ｍｍ３のＡ４３１／Ｌｅｙ異種移植片を保有するマウスをまた、コントロールの結合体（ＣＭＡ）、ＰＢＳまたはＣＭＤで処置した。各々の群のマウスに、３用量をｉ．ｐ．で投与した。各々の用量のカリケアマイシン当量の量を、凡例に特定する。結合体およびコントロールを、１日目、５日目および９日目に注射した。結果を図１５に示す。図１５Ａは、コントロール結合体の有効性を示し、そして図１５Ｂは、ＣＭＤの効果を図示する。誤差棒は、各々の時点の平均腫瘍容積の標準偏差を表す。
図１４および１５に示されるように、Ａ４３１／ＬｅｙのＣＭＤ腫瘍阻害の特異性の解釈はまた、腫瘍の自然な退縮によって、およびＣＭＡによって生じる増殖阻害によって複雑になった。等価な用量のＣＭＤまたはＣＭＡでの処置後に治癒したマウスの数の比較（図１６）によって、ＣＭＤ処置の選択的な利点が示された。
（ＬＳ１７４Ｔ結腸癌腫異種移植片）
ＣＭＤでの処置後のＬＳ１７４Ｔ異種移植片の増殖阻害は、前者の腫瘍ほど顕著ではなかった；それにもかかわらず、これは、コントロール結合体よりも有効であった（図１７）。１５０ｍｍ３のＬＳ１７４Ｔ異種移植片を保有するマウスを、コントロール結合体（ＣＭＡ）、ＰＢＳまたはＣＭＤで処置した。各々の群のマウスに、３用量をｉ．ｐ．で投与した。各々の用量のカリケアマイシン当量での量を、凡例に特定する。結合体およびコントロールを、１日目、５日目および９日目に注射した。ＬＳ１７４Ｔ腫瘍は、コントロール群では全てのマウスが、大きい腫瘍負荷（＞２．５ｃｍ３）のせいで５１日の期間内に殺傷されなければならないほど、早く増殖した。４μｇカリケアマイシン当量ＣＭＤ（Ｑ４Ｄ×３）で処置した群では、５匹のマウスのうち３匹が、大きい腫瘍負荷（１／３）のせいで、または腫瘍の壊死（２／３）のせいで、４４日内に殺傷された。他の２匹のマウスのうち１匹は１２５日間腫瘍なしのままであったが、他の一匹は小さい腫瘍を発症した。２μｇカリケアマイシン当量ＣＭＤ（Ｑ４Ｄ×３）または４μｇカリケアマイシン当量ＣＭＡ（Ｑ４Ｄ×３）のいずれかで処置した群では治癒は観察されなかった。対照的に、２μｇカリケアマイシン当量のＣＭＡ（Ｑ４Ｄ×３）で処置した５匹のマウスのうち１匹が治癒した。図１７Ａは、コントロール結合体の有効性を示し、そして図１７Ｂは、ＣＭＤの効果を図示する。誤差棒は、各々の時点の平均腫瘍容積の標準偏差を表す。
（ＬＯＶＯ結腸癌腫異種移植片）
ＬＯＶＯ異種移植片を保有するマウスを試験して、４μｇカリケアマイシン当量／用量／マウスでＱ４Ｄ×３とは異なるレジメンの潜在的な利点を検討した。約１００ｍｍ３のＬＯＶＯ異種移植片を保有するマウスをＰＢＳ、Ｇ１９３または種々のレジメンのコントロール結合体（ＣＭＡまたはＣＭＤ）で処置した。各々の用量のカリケアマイシン当量での量を、凡例に特定する。４μｇのカリケアマイシン当量でＱ４Ｄ×３でみられたわずかな有効性という理由でこの型の実験にはＬＯＶＯ−モデルを選択した。
図１８Ａは、ＣＭＡおよびＧ１９３の有効性がないことを示す。図１８Ｂおよび１８Ｃは、それぞれＱ４Ｄ×３およびＱ４Ｄ×４でのＣＭＤの効果を図示する。図１８Ｄおよび１８Ｅは、種々の間隔で与えられた場合のＣＭＤの有効性を示す。誤差棒は、各々の時点の平均腫瘍容積の標準偏差を表す。ＣＭＤでの処置後のＬＯＶＯ異種移植片の増殖阻害は、前者の腫瘍ほど顕著ではなかった。しかし、４回目の用量の追加、注射の間隔を減少すること、および低用量をより高頻度に投与することは、ＣＭＤの有効性を増強したことが示唆された。
（ＭＸ１ 乳癌腫異種移植片）
ルイスＹ抗原の低い発現を有する癌腫の樹立された異種移植片の増殖に対するＣＭＤ−１９３の効果をまた、ＭＸ１乳癌腫で検査した。ＣＭＡ−６７６を、非結合コントロール結合体として用いた。ＭＸ１乳癌腫を外植されたヌードマウスを種々の用量のＣＭＤ−１９３（４０〜２４０ｍｇ／ｋｇ）またはＣＭＡ−６７６（陰性コントロール）で処置した。腫瘍増殖を少なくとも３５日間記録した。ＣＭＤ−１９３は８０ｍｇ／ｋｇ程度の低用量で、図２２に示されるように、ＭＸ１異種移植片の増殖の有意な増殖阻害を生じた。対照的に、ＣＭＡ−６７６は、試験した最高用量（１６０ｍｇ／ｋｇ）でのみ有効であった。
（ＣＭＤ−１９３の最大非致死用量）
図１９に例示される実験について、１０匹のマウスの８つの群を用いた。各々の群は、０〜９．９μｇカリケアマイシン当量（０〜３９６μｇ／ｋｇ）の範囲の漸増用量でＣＭＤを４日ごとに全部で３回（Ｑ４Ｄ×３）投与して、それらの生存を１０５日間にわたってモニタリングした。ビヒクルで処置したコントロール群は、観察期間全体にわたって１死亡率を有した。同様の致死率を生じた最高用量は５．７μｇカリケアマイシン当量のＣＭＤであった。この致死率はコントロール群においてよりも早期に生じたので、これは薬物関連の毒性に起因したことが主張できる。２８４μｇ／ｋｇ以上の用量によって、処置したマウスにおける有意に高い頻度の致死率が生じ、そして７．１μｇ、８．５μｇおよび９．９μｇカリケアマイシン当量での処置は、際立って高い頻度の致死率だけでなく、ビヒクルコントロールでの処置よりも早期の致死性の発生を生じた。２２８μｇ／ｋｇ以下の用量のＣＤＭ−１９３で処置したマウスの生存は、ビヒクルコントロールマウスでの生存と同様であった。これらのデータをまとめると、ＣＭＤの最大致死用量（ＭＮＤ）は、５．７μｇのカリケアマイシン当量（２２８μｇ／ｋｇであり、これは、８．５〜１２．２ｍｇ／ｍ２の範囲では結合体化抗体タンパク質用量に等価である）Ｑ４Ｄ×３であった。このＭＮＤは、ほとんどの腫瘍モデルにおいて、有効な用量（ＭＥＤ）よりかなり高く、例えばＬ２９８７モデルでの１５μｇ／ｋｇというＭＥＤを考えれば、ＣＭＤ−１９３は、１９という治療指数（ＭＮＤ／ＭＥＤ）を有する強力な抗腫瘍活性を示す。
（実施例６．毒物学）
結合体ＣＭＤ１９３の毒性を、マウスおよびラットにおける単回用量の静脈内（ＩＶ）毒性研究において、そしてラットおよびイヌにおける用量の範囲ＩＶ毒性研究および４サイクルの反復用量（１サイクルは１用量／２週）ＩＶ毒性研究において、評価した。毒物動態学および免疫原性の評価はまた、ラットおよびイヌでの４サイクルの毒性研究の一部として行なった。ＣＭＤ−１９３の遺伝毒性潜在性を、細菌の復帰変異およびマウスの小核試験において評価した。
ラットおよびイヌ（ルイスＹ抗癌の発現について選択した）におけるＣＭＤ−１９３の単回および反復の用量の投与によって、一般的に類似の生存効果（骨髄毒性およびリンパ系器官毒性の指標である体重および食物消費の減少および血液学の変化）および標的器官毒性が生じた。全体的に、ＣＭＤ−１９３の毒性は、ラットおよびイヌで一致した。同程度の化合物関連の知見が、雄および雌で観察された。両方の種における毒性の標的器官は骨髄、胸腺および雄性の生殖器官であった。肝臓（ラットにおける）および消化管（ＧＩ）（イヌにおける）もまた標的器官であった。ラットおよびイヌにおける複数の標的器官におけるＣＭＤ−１９３関連の効果の観察は、ＣＭＤ１９３における未結合のカリケアマイシン誘導体に起因し得る非特異的な細胞毒性と一致している；しかしＣＭＤ−１９３処置したイヌでのＧＩの変化はまた、組織の交差反応性研究において観察されるようなＧＩ管上皮に対するＧ１９３抗体の結合、および細胞毒性の非結合体化カリケアマイシン誘導体の引き続く遊離を反映し得る。
（単回用量のＩＶ研究）
ラットにおける単回用量の静脈内（ＩＶ）安全性薬理学研究において、１．１８ｍｇタンパク質／ｍ２、３．５４ｍｇタンパク質／ｍ２、または１０．６９ｍｇタンパク質／ｍ２の用量のＣＭＤ−１９３は、中枢神経系（ＣＮＳ）にも呼吸器系にもなんら有害な影響を生じなかった。イヌでの単回用量の心血管系の安全性薬理学研究では、ＣＭＤ１９３は、１．３ｍｇタンパク質／ｍ２または６．７ｍｇタンパク質／ｍ２のＩＶ用量で、心拍にも動脈血圧にも有害な変化を生じなかった。形態学的な異常の証拠も、異常な心房性不整脈の証拠も心室性不整脈の証拠も、６．７ｍｇのタンパク質／ｍ２で試験したいかなる心電図（ＥＣＧ）における化合物関連のＱＴｃ延長の証拠も、存在しなかった（ＥＣＧは１．３ｍｇタンパク質／ｍ２では試験しなかった）。
単回用量としてＩＶ投与した場合、ＣＭＤ−１９３の最高の非致死用量は、マウスでは１５．３０ｍｇタンパク質／ｍ２であって、ラットでは３０．０９ｍｇタンパク質／ｍ２であった；これらは、７６ｍｇ／ｍＬの最大濃度（カリケアマイシン当量）および５ｍＬ／ｋｇの最大用量容量に基づく、最大の実行可能用量であった。有害効果を生じない用量は、マウスについては１５．３０ｍｇタンパク質／ｍ２であって、ラットについては１５．８１ｍｇタンパク質／ｍ２であった。
（用量範囲の研究）
ＣＭＤ−１９３での用量設定研究において、試験した最高単回用量１２ｍｇタンパク質／ｍ２で１匹のイヌが、安楽死を要する瀕死状態となった；瀕死性（ｍｏｒｉｂｕｎｄｉｔｉｙ）は、軽度から中程度の粘膜の変性および壊死というＣＭＤ １９３に関連する胃腸の変化に起因した。試験したいずれの用量（最大３０．０９ｍｇタンパク質／ｍ２）でもラットの死亡や選択的な安楽死はなかった。
（４−サイクル研究）
４サイクルの毒性研究では、投与されたＣＭＤ−１９３の用量は、ラットでは０．５５、１．９８または５．５５ｍｇタンパク質／ｍ２／サイクルであって、イヌでは、０．３６、１．２または３．５９ｍｇタンパク質／ｍ２／サイクルであった。これらの研究では、Ｇ１９３抗体単独を、ラットでは５．５５ｍｇタンパク質／ｍ２／サイクルで投与して、イヌでは３．５９ｍｇタンパク質／ｍ２／サイクルで投与した。ＣＭＤ−１９３の最大耐容用量（ＭＴＤ）は、ラットでは５．５５ｍｇタンパク質／ｍ２／サイクルであって、イヌでは３．５９ｍｇタンパク質／ｍ２／サイクル（投与された最高用量）であった；これらの用量は、用量を限定する毒性もまたは生命を脅かす毒性も誘発しなかった。ラットでの４サイクル研究では、０．５５ｍｇ／タンパク質／ｍ２／サイクルで観察された顕微鏡的な知見（精巣管萎縮）に基づき、雄では、ＣＭＤ−１９３の無毒性量（ｎｏ−ｏｂｓｅｒｖｅｄ−ａｄｖｅｒｓｅ−ｅｆｆｅｃｔ ｌｅｖｅｌ）（ＮＯＡＥＬ）は確立されなかった。５．５５ｍｇのタンパク質／ｍ２／サイクルで雄性および雌性の両方における肝細胞の巨大核／巨大細胞に基づいて、ラットでの４サイクル研究の雌でのＮＯＡＥＬは、１．９８ｍｇタンパク質／ｍ２／サイクルであった。イヌの４サイクル研究では、０．３６ｍｇ／タンパク質／ｍ２／サイクルでの顕微鏡的な知見（精巣管の変性であって、二次的な精巣上体の精液過少症およびわずかな精巣上体の上皮の変性を伴う）に基づき、雄では、ＣＭＤ−１９３のＮＯＡＥＬは確立されなかった。３．５９ｍｇのタンパク質／ｍ２／サイクルで雄性および雌性の両方におけるＧＩ管における粘膜上皮変性の顕微鏡的知見に基づいて、イヌにおける４サイクル研究では雌でのＣＭＤ−１９３のＮＯＡＥＬは、１．２ｍｇタンパク質／ｍ２／サイクルであった。
ラットでの４サイクルの毒性研究では、試験した５．５５ｍｇタンパク質／ｍ２／サイクルの用量のＧ１９３抗体単独では、なんらＧ１９３抗体に関する毒性を生じなかった。イヌでの４サイクル毒性研究では、試験した３．５９ｍｇタンパク質／ｍ２／サイクルの用量のＧ１９３抗体単独では、用量を制限する毒性も生命を脅かす毒性も生じなかった。イヌでのこの研究のＧ１９３関連毒性としては、わずかな精巣管の変性およびわずかな胃粘膜の変性が含まれた。
Ｇ１９３抗体、非結合体化（遊離の）カリケアマイシン誘導体および総カリケアマイシン誘導体（ラットのみ）の毒物動態学的評価、ならびにラット血清におけるＣＭＤ−１９３に特異的な抗体の存在の決定そしてイヌ血清におけるＧ１９３抗体に特異的な抗体の存在の決定を、４サイクル反復用量ＩＶ毒性研究の一部として行なった。
（遺伝毒性研究）
ＣＭＤ−１９３は、細菌の復帰変異アッセイにおいて変異原性については陰性であったが、インビボのマウス小核アッセイでは染色体異常誘発性であった。このアッセイにおいては陽性の応答が予測され、そしてカリケアマイシンおよび他のエンジイン抗腫瘍性抗生物質によるＤＮＡ破壊（染色体異常誘発能）の誘導と一致している。
（交差反応性研究）
交差反応性研究では、非結合体化Ｇ１９３抗体は、ラットおよびイヌの唾液腺およびＧＩ管において、そしてイヌのみの膵臓および肝臓（胆管上皮）において、特異的な染色を示した。さらなる研究では、Ｇ１９３抗体により、最も強くかつ一貫した染色が、ラット、イヌおよびヒトのＧＩ管（大腸および胃の上皮）、膀胱（上皮）、膣（上皮）および下垂体（下垂体前葉の内分泌細胞）にあった。ＣＭＤ−１９３のＧ１９３の抗体成分は、ラット、イヌおよびヒトにおいてルイスＹ抗原の発現に関連する組織と交差反応したので、これらの結果によって、ラットおよびイヌがＣＭＤ１９３で行われた非臨床研究についての適切な種であることが示された。
（実施例７．抗ルイスＹ抗体カリケアマイシン結合体の安定な処方物）
抗ルイスＹ抗体カリケアマイシン結合体（ｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭおよびＣＭＤ−１９３）のインビボ投与のための安定な処方物を調製した。２０ｍＭのＴＲＩＳ（ｐＨ８．０）および１００ｍＭの塩化ナトリウム中の約１９ｍｇのＣＭＤ−１９３を、表８または９に従って以下のように処方した。
（表８）
Figure 2007529536
 （表９）
Figure 2007529536
 ２つのバッチのＣＭＤ−１９３を凍結乾燥させた。処方物の相違はｐＨであって、一方はｐＨ７．５に、そしてもう一方はｐＨ８．０に緩衝化した。ｐＨ８．０の処方物の４つのバイアルを、注射用水で再構成して、ポリプロピレンチューブ中で合わせた。ｐＨを測定し、次いでその溶液を４つの部分に分けて、２５℃においた。同様に４つのバイアルを用いてｐＨ７．５で同様の研究を設定した。溶液をあわせた場合、ｐＨは、０．１Ｎの塩酸を用いて７．５に再調節しなければならなかった。４つのさらなるバイアルをまた用いて、溶液をｐＨ７．０にした。この溶液を最初の分析のために与えて、その残りを安定なチャンバ中で２５℃で保持した。次いでこの溶液を２日および７日後に分析した。結果を表１０に示す（１週間にわたる２５℃でのｐＨ７．０、ｐＨ７．５、およびｐＨ８．０でのＣＭＤ−１９３バルク溶液の安定性）。この溶液は、濁っていることが観察され、そして１週間後、透明な沈殿物がｐＨ７．０およびｐＨ７．５の溶液中で２５℃で観察された。この結果に基づいて、ｐＨ８．０で緩衝化された溶液は、３つの場合のうち最高の安定性を生じた。そしてＴＲＩＳを緩衝液として選択した。
（表１０）
Figure 2007529536
 別の実施例では、２０ｍＭ ＴＲＩＳ（ｐＨ８．０）および１００ｍＭの塩化ナトリウム中約３５ｍｇのＣＭＤ−１９３を用いた。これから、ＣＭＤ−１９３の２つのさらなる処方物を製造した。第一の処方物は、５％のスクロースを含み、そしてＴＲＩＳを用いてｐＨ８．０に緩衝化された。この最終処方物は、下の表１１に記載される。
（表１１）
Figure 2007529536
 第二の処方物を製造するために、用いられるＣＭＤ−１９３の濃度（総タンパク質、２．２３ｍｇ／ｍＬ）を、タンパク質の濃度が１ｍｇ／ｍＬであるように注射用水で希釈した。次いでこの溶液を、３０，０００ダルトン未満の分子を透過可能なセントリコン・フィルター・ユニット（ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ ｆｉｌｔｅｒ ｕｎｉｔ）を用いて遠心分離した。溶液の容量を半分にした場合、これを５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％スクロース溶液で希釈した。最終処方物を下の表１２に記載する。
（表１２）
Figure 2007529536
 ｐＨ７．５およびｐＨ８．０で製造したＣＭＤ−１９３のバイアルを、表１３に列挙される種々の溶液で再構成した（第二の処方物）。表１３は、種々の溶液で再構成されたＣＭＤ−１９３の可視検査を示し、そしてこのバイアルを可視の粒子について観察した。全ての場合に、ｐＨ８．０に緩衝化した溶液は、ｐＨ７．５の溶液よりも透明であった。界面活性物質の添加は全ての場合に有益であった。注射用水（ｗｆｉ）で再構成したバイアル中の沈殿物を濾過して、顕微鏡検査のために収集した。
（表１３）
Figure 2007529536
 上記に基づいて、溶液への界面活性物質の添加は、溶解度を確保するために必須であることが見出された。選んだＴｗｅｅｎ ８０（０．０１％）を用いて、１ｍｇ／ｍｌの溶解度を維持した。最終処方物は５％スクロース、０．０１％のＴｗｅｅｎ ８０、２０ｍＭのＴＲＩＳ（ｐＨ８．０）、および５０ｍＭ塩化ナトリウム）を含んだ。
ＣＭＤ−１９３の２つのさらなるバッチを用いた。最初のバッチをＨＩＣ、続いて限外濾過を用いて精製して、その第二のバッチを結合体化後に限外濾過プロセスを直接通した。この２つの処方物を、下の表１３および１４のように処方した。
（表１４）
Figure 2007529536
 ５℃でのバルク溶液の安定性（表１５）および２５℃での凍結乾燥製品の安定性（表１６）を、下にまとめる。
（表１５）
Figure 2007529536
 （表１６）
Figure 2007529536
 （希釈および投与）
注射用のＣＭＤ−１９３を、無菌の白色の保存剤非含有の凍結乾燥された粉末として２０ｍＬの琥珀色のガラスバイアルとして供給する。各々の単回バイアルのパッケージは、５ｍｇのＣＭＤ １９３凍結乾燥粉末を含む。注射用のＣＭＤ−１９３は、凍結されて（２〜８℃／３６〜４６°Ｆ）、光から保護されてもよい。
この薬物製品は、光感受性であって、調製および投与の両方の間に直接および間接の日光および未遮光の蛍光から保護され得る。全ての調製は好ましくは、生物学的に安全なフードの内側で行われる。凍結乾燥された薬物は、室温に対するバイアルの平衡なしで再構成されてもよい。無菌のシリンジを用いて、５ｍＬのＵＳＰの滅菌注射水で各々のバイアルの内容物を再構成する。ゆるやかな回旋を用いてこのプロセスを補助してもよい。再構成の後および投与の前に、各々のバイアルの薬物を粒子状物質および変色について視覚的に検査する。再構成溶液の最終濃度は１ｍｇ／ｍＬである。
ベンジルアルコールまたは任意の他の保存剤を含むＵＳＰの滅菌注射水は、注射用のＣＭＤ−１９３の再構成には推奨されない。
一旦再構成されれば、薬物溶液はさらに、ＵＳＰの０．９％塩化ナトリウム注射水に希釈されて、バイアルの再構成後４時間内に投与される。注射のためのＣＭＤ−１９３の再構成されたバイアルは、決して凍結されてはならない。
投与のための最終用量を生成するために、再構成された薬物の適切な量を、十分なＵＳＰの０．９％の塩化ナトリウム注射液に注入して、５０ｍＬの最終容積にする。混合バッグまたは容器は、ポリオレフィンから構成されるか、またはポリエチレン裏層のある接触表面を備え、そして紫外ＵＶ光プロテクターを備える。
注射用ＣＭＤ−１９３は、ＩＶプッシュ（ｐｕｓｈ）またはボーラスとして投与されてはならない。
患者は、プログラム可能な輸液ポンプを介して１時間（±１５分）にわたって一定速度でＩＶ輸液によって混合溶液（総用量）を投与される。輸液容器は光から保護されなければならないが、輸液の配管を光から保護する必要はない。輸液の配管は、ポリオレフィンであってもポリエチレンで裏打ちされていてもよい。インラインフィルターは、ＣＭＤ−１９３投与に用いられるべきではない。
上記の全ての引用文献および特許は、参照によって本明細書中に援用される。本発明の多数の改変および変更は、上記に特定された明細書に含まれており、そして当業者に明白であると考えられる。結合体化プロセス、このプロセスによって作製される結合体、および結合体を含む組成物／処方物に対するこのような改変および変更は、特許請求の範囲内に包含されると考えられる。
図１は、カリケアマイシンに結合体化された抗ルイスＹ抗体（ｈｕ３Ｓ１９３）の構造を示す（ｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭ）。 図２Ａおよび２Ｂは、ＥＤ５０（ｎｇ／ｍｌ）に対する出現の頻度のグラフとしてＬｅｙ＋およびＬｅｙ−細胞に対しての、カリケアマイシンに対して結合体化させた抗ルイスＹ抗体（ｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭ）の効果を示す；図２Ａは、Ｌｅｙ＋細胞株ＡＧＳを示し、そして図２Ｂは、Ｌｅｙ−細胞株ＰＣ３ＭＭ２を示す。図２Ｃは、細胞（すなわち、Ｌｅｙ＋細胞株ＬＯＶＯ、Ｎ８７、ＨＣＴ８／Ｓ１１−Ｒ１、ＡＧＳ、ＬＮＣａＰ、ＮＣＩ−Ｈ３５８およびＬｅｙ−細胞株ＰＣ３−ＭＭ２、Ａ４３１、およびＰＡＮＣ−１）の表面上でのルイスＹの発現に対するＣＭＡの倍数のグラフとしてＬｅｙ＋およびＬｅｙ−細胞に対するｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭの効果を示しており、ここでｎは独立したＥＤ５０測定の回数である。 図３は、腫瘍増殖の期間（日数）に対する腫瘍容積（ｃｍ３）のグラフとして、Ｎ８７胃の癌腫異種移植片に対する、カリケアマイシンに結合体化された抗ルイスＹ抗体（ｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭ）のインビボ活性を示す；図３Ａは、コントロールの結合体ＣＭＡおよびＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）−ＡｃＢｕｔ−ＣＭを示し、そして図３Ｂは、ｈｕ３Ｓ１９３およびｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭを示す。 図４は、腫瘍増殖の期間（日数）に対する腫瘍容積（ｃｍ３）のグラフとして、ＬＮＣａＰ前立腺癌腫に対する、カリケアマイシンに結合体化された抗ルイスＹ抗体（ｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭ）のインビボ活性を示す。 図５は、腫瘍増殖の期間（日数）に対する腫瘍容積（ｃｍ３）のグラフとして、ＬＯＶＯ結腸癌腫異種移植片に対する、カリケアマイシンに結合体化された抗ルイスＹ抗体（ｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭ）のインビボ活性を示す；図５Ａは、コントロールの結合体ＲＩＴＵＸＡＮ−ＡｃＢｕｔ−ＣＭを示し、そして図５Ｂは、ｈｕ３Ｓ１９３およびｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭを示す。 図６は、腫瘍増殖の期間（日数）に対する腫瘍容積（ｃｍ３）のグラフとして、ＬＯＶＯ結腸癌腫異種移植片に対する、カリケアマイシンに結合体化された抗ルイスＹ抗体（ｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭ）のインビボ活性を示す；図６Ａは、コントロールの結合体ＣＭＡおよびＲＩＴＵＸＡＮ−ＡｃＢｕｔ−ＣＭを示し、そして図６Ｂは、４μｇのＱ４Ｄ×３またはＱ４Ｄ×４で投与されたｈｕ３Ｓ１９３およびｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭを示す。 図７は、成熟した分泌型抗ルイスＹ抗体ｈｕ３Ｓ１９３（ｗｔ）およびＧ１９３（ｍｔ）ＩｇＧ１重鎖のアミノ酸配列の比較を示しており、ここでは変異部位を、太字でかつ強調しており、そしてＣＤＲを太字でかつ影付きにしている。 図８は、ＩｇＧ１重鎖のｈｕ３Ｓ１９３（Ｗｙｅｔｈ ｗｔ）およびｈｕ３Ｓ１９３（Ｌｕｄｗｉｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、本明細書において以降ではＬＩＣＲ ｗｔと呼ぶ）のアミノ酸配列の比較を示しており、ここではＣＤＲを太字でかつ影付きにしており、そしてアロタイプの相違を強調してかつ太字にしている。 図９は、カリケアマイシンの濃度（計算上の当量、ｎｇ／ｍｌ）に対するコントロールの割合（ＣＭＡ）のグラフとして、カリケアマイシンに結合体化された抗ルイスＹ抗体（ＣＭＤ−１９３）による、インビトロのＡ４３１（図９Ａ）およびＡ４３１／Ｌｅｙ（図９Ｂ）類表皮癌腫（ｅｐｉｄｅｒｍｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）細胞の増殖阻害を示す。 図１０は、腫瘍増殖の期間（日数）に対する腫瘍容積（ｃｍ３）のグラフとして、Ｎ８７胃の癌腫異種移植片に対するカリケアマイシンに結合体化された抗ルイスＹ抗体（ｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭおよびＣＭＤ−１９３）のインビボ増殖阻害を示す；図１０Ａは、コントロールの結合体ＣＭＡを示し、図１０Ｂは、ＣＭＤ−１９３およびｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭを示し、そして図１０Ｃは、遊離の抗体を示す。 図１１は、腫瘍増殖の期間（日数）に対する腫瘍容積（ｃｍ３）のグラフとして、Ｌ２９８７肺癌腫異種移植片に対するカリケアマイシンに結合体化された抗ルイスＹ抗体（ｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭおよびＣＭＤ−１９３）のインビボの増殖阻害を示す；図１１Ａは、コントロールの結合体ＣＭＡを示し、そして図１１Ｂは、ＣＭＤ−１９３を示す。 図１２は、腫瘍増殖の期間（日数）に対する、各々の群の初期平均容積よりも少ない腫瘍容積を有するマウスの数（％）のグラフとして、Ｌ２９８７肺癌腫異種移植片に対する、カリケアマイシンに結合体化された抗ルイスＹ抗体（ｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭおよびＣＭＤ−１９３）のインビボの増殖阻害を示す；図１２Ａは、コントロールの結合体ＣＭＡを示し、そして図１２Ｂは、ＣＭＤ−１９３を示す。 図１３は、腫瘍増殖の期間（日数）に対する腫瘍容積（ｃｍ３）のグラフとして、Ｌ２９８７肺癌腫異種移植片に対する、カリケアマイシンに結合体化された抗ルイスＹ抗体（ＣＭＤ−１９３）のインビボの増殖阻害を示す。 図１４は、腫瘍増殖の期間（日数）に対する腫瘍容積（ｃｍ３）のグラフとして、Ａ４３１／Ｌｅｙ類表皮癌腫異種移植片に対する、カリケアマイシンに結合体化された抗ルイスＹ抗体（ＣＭＤ−１９３）のインビボの増殖阻害を示す。 図１５は、腫瘍増殖の期間（日数）に対する腫瘍容積（ｃｍ３）のグラフとして、Ａ４３１／Ｌｅｙ類表皮癌腫異種移植片に対する、カリケアマイシンに結合体化された抗ルイスＹ抗体（ＣＭＤ−１９３）のインビボの増殖阻害を示す。図１５Ａは、コントロールの結合体ＣＭＡの有効性を示し、そして図１５Ｂは、ＣＭＤの有効性を示す。 図１６は、腫瘍増殖の期間（日数）に対する、各々の群の初期平均容積よりも少ない腫瘍容積を有するマウスの数（％）のグラフとして、Ａ４３１／Ｌｅｙ類表皮癌腫異種移植片に対する、カリケアマイシンに結合体化された抗ルイスＹ抗体（ＣＭＤ−１９３）のインビボの増殖阻害を示す；図１６Ａは、コントロールの結合体ＣＭＡの有効性を示し、そして図１６Ｂは、ＣＭＤの有効性を示す。 図１７は、腫瘍増殖の期間（日数）に対する腫瘍容積（ｃｍ３）のグラフとして、ＬＳ１７４Ｔ結腸癌腫細胞異種移植片に対する、カリケアマイシンに結合体化された抗ルイスＹ抗体（ＣＭＤ−１９３）のインビボの増殖阻害を示す。図１７Ａは、コントロールの結合体ＣＭＡの有効性を示し、そして図１７Ｂは、ＣＭＤの有効性を示す。 図１８は、腫瘍増殖の期間（日数）に対する腫瘍容積（ｃｍ３）のグラフとして、ＬＯＶＯ結腸癌腫異種移植片に対する、カリケアマイシンに結合体化された抗ルイスＹ抗体（ＣＭＤ−１９３およびｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭ）のインビボの増殖阻害を示す。図１８Ａは、コントロールの結合体ＣＭＡおよびＧ１９３の有効性を示し、図１８Ｂおよび１８Ｃは、それぞれＣＭＤのＺ４Ｄ×３およびＱ４Ｄ×４での有効性を示し、そして図１８Ｄおよび１８Ｅは、ＣＭＤの有効性を種々の時間間隔で示す。 図１９は、観察期間（日数）に対する生存パーセントのグラフとして、カリケアマイシンに結合体化した抗ルイスＹ抗体（ＣＭＤ−１９３）の種々の用量での注射後のヌードマウスの生存を示す。 図２０は、ＢＩＡｃｏｒｅ共鳴単位に対するルイスＹ抗原および構造的に関連の抗原のグラフとして、ルイスＹ抗原に対する、カリケアマイシンに結合体化された抗ルイスＹ抗体（ＣＭＤ−１９３）の結合特異性を示す。 図２１は、腫瘍増殖の期間（日数）に対する腫瘍質量（ｇ）のグラフとして、ＨＣＴ８Ｓ１１結腸癌腫異種移植片に対する、カリケアマイシンに結合体化された抗ルイスＹ抗体（ｈｕ３Ｓ１９３−ＡｃＢｕｔ−ＣＭ）のインビボ活性を示す；図２１Ａは、小さい腫瘍を示し、そして図２１Ｂは大きい腫瘍を示す。 図２２は、腫瘍増殖の期間（日数）に対する相対的な腫瘍増殖のグラフとして、ＭＸ１乳癌異種移植片に対する、カリケアマイシンに結合体化された抗ルイスＹ抗体（ＣＭＤ−１９３）のインビボ活性を示す。 図２３は、腫瘍増殖の期間（日数）に対する腫瘍質量（ｇ）のグラフとして、Ｎ８７胃の癌腫異種移植片に対する、カリケアマイシンに結合体化された抗ルイスＹ抗体（ＣＭＤ−１９３）の種々の薬物ローディングに基づくインビボ活性を示す。 図２４は、抗体濃度（μｇ／ｍｌ）に対する細胞毒性パーセントのグラフとして、Ｎ８７胃癌腫細胞に対する、抗ルイスＹ抗体（Ｇ１９３）およびそのカリケアマイシン結合体（ＣＭＤ−１９３）のインビトロにおける補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）活性を示す。 図２５は、Ａ４３１／Ｌｅｙ類表皮癌腫細胞に対する、抗ルイスＹ抗体（Ｇ１９３）およびそのカリケアマイシン結合体（ＣＭＤ−１９３）のインビトロにおける抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）活性を示す；図２５Ａは、ルイスＹ＋＋＋Ａ４３１癌腫細胞に対する活性を示し、そして図２５Ｂは、ルイスＹ陰性Ａ４３１癌細胞に対する活性を示す。

Claims (100)

  1. カリケアマイシン結合体を調製するためのプロセスであって、デオキシコール酸ファミリーのメンバーまたはその塩の存在下において、約７〜約９のｐＨにおいて、（ｉ）活性化されたカリケアマイシン−加水分解性リンカー誘導体と、（ｉｉ）ＩｇＧ１抗体とを反応させる工程を包含する、プロセス。
  2. 請求項１に記載のプロセスであって、前記デオキシコール酸ファミリーのメンバーが以下の構造：
    Figure 2007529536
     であって、ここで
    Ｘ１〜Ｘ５のうちの２つがＨまたはＯＨであり、そして他の３つが独立してＯまたはＨのいずれかであり；
    Ｒ１が（ＣＨ２）ｎであって、ｎが０〜４であり、そして
    Ｒ２がＯＨ、ＮＨ（ＣＨ２）ｍＣＯＯＨ、ＮＨ（ＣＨ２）ｍＳＯ３Ｈ、またはＮＨ（ＣＨ２）ｍＰＯ３Ｈ２であって、ｍが１〜４である、（Ａ）、
    あるいは
    Figure 2007529536
     であって、ここで
    Ｘ１〜Ｘ４のうちの１つがＨまたはＯＨであり、そして他の３つが独立してＯまたはＨのいずれかであり；
    Ｒ１が（ＣＨ２）ｎであって、ｎが０〜２であり、そして
    Ｒ２がＯＨ、ＮＨ（ＣＨ２）ｍＣＯＯＨ、またはＮＨ（ＣＨ２）ｍＳＯ３Ｈであって、ｍが２である、（Ｂ）、
    あるいは、
    Figure 2007529536
     であって、ここで
    Ｘ１〜Ｘ４のうちの１つがＯＨであり、そして他の３つがＨであり；
    Ｒ１が（ＣＨ２）ｎであって、ｎが０〜２であり、そして
    Ｒ２がＯＨ、ＮＨ（ＣＨ２）２ＳＯ３Ｈである、（Ｃ）、
    のうち１つを有する、プロセス。
  3. 前記デオキシコール酸ファミリーのメンバーが、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロウルソデオキシコール酸、またはタウロケノデオキシコール酸である、請求項１に記載のプロセス。
  4. 前記デオキシコール酸ファミリーのメンバーが、約１０ｍＭの濃度のデオキシコール酸である、請求項１に記載のプロセス。
  5. 前記カリケアマイシン誘導体が、ＩｇＧ１抗体の約３〜約９重量％である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のプロセス。
  6. 前記カリケアマイシン誘導体が、ＩｇＧ１抗体の約７重量％である、請求項５に記載のプロセス。
  7. 前記ＩｇＧ１抗体が、抗ルイスＹ抗体である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のプロセス。
  8. 前記抗ルイスＹ抗体が、Ｇ１９３またはＨｕ３Ｓ１９３である、請求項７に記載のプロセス。
  9. 前記カリケアマイシン誘導体が、カリケアマイシンのＮ−アシル誘導体またはカリケアマイシンのジスルフィドアナログである、請求項１〜８のいずれか１項に記載のプロセス。
  10. 前記カリケアマイシン誘導体が、Ｎ−アセチルγカリケアマイシンジメチルヒドラジド（Ｎ−アセチルカリケアマイシンＤＭＨ）である、請求項９に記載のプロセス。
  11. 前記加水分解性リンカーが、４−（４−アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のプロセス。
  12. ｐＨが約８．２である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のプロセス。
  13. 前記プロセスがさらにカリケアマイシン結合体を精製する工程を包含する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のプロセス。
  14. 前記精製が、クロマトグラフィー分離および限外濾過／ダイアフォルトレーションを含む、請求項１３に記載のプロセス。
  15. 前記クロマトグラフィー分離が、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）または疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）である、請求項１４に記載のプロセス。
  16. 前記精製工程後、前記結合体の平均ローディングが、ＩｇＧ１抗体１モルあたりカリケアマイシン約５〜約７モルである、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載のプロセス。
  17. 前記精製工程後、前記結合体の低結合体化画分（ＬＣＦ）が、約１０％未満である、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載のプロセス。
  18. 請求項１〜１７のいずれか１項に記載のプロセスによって調製された、カリケアマイシン結合体。
  19. 請求項１３のプロセスによって調製された、カリケアマイシン結合体。
  20. 請求項１３のプロセスによって調製されたカリケアマイシン結合体であって、前記カリケアマイシン誘導体が、Ｎ−アセチルγカリケアマイシンジメチルヒドラジド（Ｎ−アセチルカリケアマイシンＤＭＨ）であり、前記加水分解性リンカーが、４−（４−アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）であり、前記デオキシコール酸ファミリーのメンバーが、約１０ｍＭの濃度のデオキシコール酸であり、前記ｐＨが約８．２であり、そして前記精製工程後、前記カリケアマイシン結合体の平均ローディングが、ＩｇＧ１抗体１モルあたりカリケアマイシン約５〜約７モルであり、該結合体の低結合体化画分（ＬＣＦ）が、約１０％未満である、カリケアマイシン結合体。
  21. 抗ルイスＹ抗体に対して共有結合されたカリケアマイシン−加水分解性リンカー誘導体の結合体を含む、組成物。
  22. 前記カリケアマイシン誘導体が、カリケアマイシンのＮ−アシル誘導体またはカリケアマイシンのジスルフィドアナログである、請求項２１に記載の組成物。
  23. 前記カリケアマイシン誘導体が、Ｎ−アセチルγカリケアマイシンジメチルヒドラジド（Ｎ−アセチルカリケアマイシンＤＭＨ）である、請求項２２に記載の組成物。
  24. 前記加水分解性リンカーが、４−（４−アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）である、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の組成物。
  25. 前記抗ルイスＹ抗体が、Ｇ１９３またはＨｕ３Ｓ１９３である、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の組成物。
  26. 前記平均ローディングが、抗ルイスＹ抗体１モルあたりカリケアマイシン約５モル〜約７モルである、請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の組成物。
  27. 前記結合体が、約１×１０−７Ｍ〜約４×１０−７ＭのＫＤを有する、請求項２１〜２６のいずれか１項に記載の組成物。
  28. 前記結合体が、約３．４×１０−７ＭのＫＤを有する、請求項２１〜２６のいずれか１項に記載の組成物。
  29. 前記結合体が、前記ルイスＹ抗原に結合し、ルイスＸ抗原およびＨ−２血液型群抗原には結合しない、請求項２１〜２８のいずれか１項に記載の組成物。
  30. 前記結合体が細胞毒性活性を有する、請求項２１〜２９のいずれか１項に記載の組成物。
  31. 前記結合体が抗腫瘍活性を有する、請求項２１〜２９のいずれか１項に記載の組成物。
  32. 前記結合体が治療有効量で存在する、請求項２１〜３１のいずれか１項に記載の組成物。
  33. Ｇ１９３に共有結合されたＮ−アセチルγカリケアマイシンジメチルヒドラジド−４−（４−アセチルフェノキシ））ブタン酸（Ｎ−アセチルカリケアマイシンＤＭＨ−ＡｃＢｕｔ）の結合体を含む組成物であって、前記平均ローディングが、１モルのＧ１９３あたり約５〜約７モルのＮ−アセチルカリケアマイシンＤＭＨであり、かつ前記結合体の低結合体化画分（ＬＣＦ）が約１０％未満である、組成物。
  34. 請求項２１〜３３のいずれか１項に記載の組成物の生物学的活性を保存するためのプロセスであって、
    溶液中において該組成物と、凍結保護物質、界面活性物質、緩衝化剤、および電解質とを接触させる工程；ならびに
    該溶液を凍結乾燥させる工程
    を包含する、プロセス。
  35. 前記結合体が、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約２ｍｇ／ｍＬの濃度である、請求項３４に記載のプロセス。
  36. 前記結合体が、１ｍｇ／ｍＬの濃度である、請求項３５に記載のプロセス。
  37. 前記凍結保護物質が、約１．５重量％〜約６重量％の濃度である、請求項３４〜３６のいずれか１項に記載のプロセス。
  38. 前記凍結保護物質が、糖アルコールまたは炭水化物である、請求項３４〜３７のいずれか１項に記載のプロセス。
  39. 前記凍結保護物質が、トレハロース、マンニトールまたはソルビトールである、請求項３８に記載のプロセス。
  40. 前記凍結保護物質が、約５％の濃度のスクロースである、請求項３８に記載のプロセス。
  41. 前記界面活性物質が、約０．００５％〜約０．０５％の濃度である、請求項３４〜４０のいずれか１項に記載のプロセス。
  42. 前記界面活性物質が、０．０１重量％の濃度のＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０または約０．０１％の濃度のＴｗｅｅｎ８０である、請求項４１に記載のプロセス。
  43. 前記緩衝化剤が、約５ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度である、請求項３４〜４２のいずれか１項に記載のプロセス。
  44. 前記緩衝化剤が、約２０ｍＭの濃度のＴｒｉｓである、請求項４３に記載のプロセス。
  45. 前記電解質が、約５ｍＭ〜約１００ｍＭの濃度である、請求項３４〜４４のいずれか１項に記載のプロセス。
  46. 前記電解質が、ナトリウム塩またはカリウム塩である、請求項４５に記載のプロセス。
  47. 前記電解質が、約１０ｍＭの濃度のＮａＣｌである、請求項４５に記載のプロセス。
  48. 凍結乾燥の前に、ｐＨが約７．８〜約８．２である、請求項３４〜４７のいずれか１項に記載のプロセス。
  49. 前記凍結乾燥の前のｐＨが、約８．０である、請求項４８に記載のプロセス。
  50. 請求項３４〜４９のいずれか１項に記載のプロセスであって、凍結乾燥が、
    約−３５℃〜約−５０℃の温度で溶液を凍結させる工程；
    約２０〜約８０ミクロンの初期乾燥圧力で、約−１０℃〜約−４０℃の保管温度で、２４〜７８時間の間、該凍結した溶液を最初に乾燥させる工程；および
    約２０〜約８０ミクロンの二次乾燥圧力で、約＋１０℃〜約＋３０℃の保管温度で、１５〜３０時間の間、該凍結乾燥した生成物を二次乾燥させる工程；
    を包含する、プロセス。
  51. 凍結が約−４５℃で行われ；前記最初の凍結乾燥が、約６０ミクロンの初期乾燥圧力で、かつ約−３０℃の保管温度で、６０時間の間であり；そして、前記第二の乾燥工程が、約６０ミクロンの乾燥圧力で、かつ約＋２５℃の保管温度で、約２４時間の間である、請求項５０に記載のプロセス。
  52. 前記プロセスがさらに、凍結乾燥前に充填剤を添加する工程を包含する、請求項３４〜５１のいずれか１項に記載のプロセス。
  53. 前記充填剤が、約０．５〜約１．５重量％の濃度である、請求項５２に記載のプロセス。
  54. 前記充填剤が、約０．９重量％の濃度のＤｅｘｔｒａｎ ４０または、約０．９重量％の濃度のヒドロキシエチルデンプン４０である、請求項５２に記載のプロセス。
  55. 前記結合体が細胞毒性活性を有する、請求項３４〜５４のいずれか１項に記載のプロセス。
  56. 前記結合体が抗腫瘍活性を有する、請求項３４〜５４のいずれか１項に記載のプロセス。
  57. 前記結合体が、治療有効量で存在する、請求項３４〜５６のいずれか１項に記載のプロセス。
  58. 前記結合体が、Ｇ１９３に共有結合されたＮ−アセチルγカリケアマイシンジメチルヒドラジド−４−（４−アセチルフェノキシ）ブタン酸（Ｎ−アセチルカリケアマイシンＤＭＨ−ＡｃＢｕｔ）であって、前記平均ローディングが、１モルのＧ１９３あたり約５〜約７モルのＮ−アセチルカリケアマイシンＤＭＨであり、かつ前記結合体の低結合体化画分（ＬＣＦ）が、約１０％未満である、請求項３４に記載のプロセス。
  59. カリケアマイシン−抗ルイスＹ抗体結合体、凍結保護物質、界面活性物質、緩衝化剤、および電解質を含む、処方物。
  60. 前記結合体が、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約２ｍｇ／ｍＬの濃度である、請求項５９に記載の処方物。
  61. 前記結合体が、約１ｍｇ／ｍＬの濃度である、請求項６０に記載の処方物。
  62. 前記凍結保護物質が、約１．５重量％〜約６重量％の濃度である、請求項５９〜６１のいずれか１項に記載の処方物。
  63. 前記凍結保護物質が、糖アルコールまたは炭水化物である、請求項６２に記載の処方物。
  64. 前記凍結保護物質が、トレハロース、マンニトールまたはソルビトールである、請求項６３に記載の処方物。
  65. 前記凍結保護物質が、約５％の濃度のスクロースである、請求項６３に記載の処方物。
  66. 前記界面活性物質が、約０．００５％〜約０．０５％の濃度である、請求項５９〜６５のいずれか１項に記載の処方物。
  67. 前記界面活性物質が、約０．０１重量％の濃度のＴｗｅｅｎ８０である、請求項６６に記載の処方物。
  68. 前記緩衝化剤が、約５ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度である、請求項５９〜６７のいずれか１項に記載の処方物。
  69. 前記緩衝化剤が、約２０ｍＭの濃度のＴｒｉｓである、請求項５９〜６８のいずれか１項に記載の処方物。
  70. 前記電解質が、約５ｍＭ〜約１００ｍＭの濃度である、請求項５９〜６９のいずれか１項に記載の処方物。
  71. 前記電解質が、ナトリウム塩またはカリウム塩である、請求項５９〜７０のいずれか１項に記載の処方物。
  72. 前記電解質が、約１０ｍＭの濃度のＮａＣｌである、請求項５９〜７１のいずれか１項に記載の処方物。
  73. 前記ｐＨが約７．８〜約８．２である、請求項５９〜７２のいずれか１項に記載の処方物。
  74. 前記ｐＨが約８．０である、請求項７３に記載の処方物。
  75. 前記カリケアマイシンが、カリケアマイシンのＮ−アシル誘導体またはカリケアマイシンのジスルフィドアナログである、請求項５９〜７４のいずれか１項に記載の処方物。
  76. 前記カリケアマイシンが、Ｎ−アセチルγカリケアマイシンジメチルヒドラジド（Ｎ−アセチルカリケアマイシンＤＭＨ）である、請求項７５に記載の処方物。
  77. 前記加水分解性リンカーが、４−（４−アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）である、請求項５９〜７６のいずれか１項に記載の処方物。
  78. 前記抗ルイスＹ抗体が、Ｇ１９３またはＨｕ３Ｓ１９３である、請求項５９〜７７のいずれか１項に記載の処方物。
  79. 前記平均ローディングが、抗ルイスＹ抗体１モルあたりカリケアマイシン約５モル〜約７モルである、請求項５９〜７８のいずれか１項に記載の処方物。
  80. 前記結合体が、約１×１０−７Ｍ〜約４×１０−７ＭのＫＤを有する、請求項５９〜７９のいずれか１項に記載の処方物。
  81. 前記結合体が、約３．４×１０−７ＭのＫＤを有する、請求項５９〜７９のいずれか１項に記載の処方物。
  82. 前記結合体が、ルイスＹ抗原に結合し、ルイスＸ抗原およびＨ−２血液型群抗原には結合しない、請求項５９〜８１のいずれか１項に記載の処方物。
  83. 前記結合体が細胞毒性活性を有する、請求項５９〜８２のいずれか１項に記載の処方物。
  84. 前記結合体が抗腫瘍活性を有する、請求項５９〜８２のいずれか１項に記載の処方物。
  85. 前記結合体が治療有効量で存在する、請求項５９〜８４のいずれか１項に記載の処方物。
  86. 前記結合体が、Ｇ１９３に共有結合されたＮ−アセチルγカリケアマイシンジメチルヒドラジド−４−（４−アセチルフェノキシ））ブタン酸（Ｎ−アセチルカリケアマイシンＤＭＨ−ＡｃＢｕｔ）であって、前記平均ローディングが、１モルのＧ１９３あたり約５〜約７モルのＮ−アセチルカリケアマイシンＤＭＨであり、かつ該結合体の低結合体化画分（ＬＣＦ）が、約１０％未満である、請求項５９に記載の処方物。
  87. 前記結合体が、１ｍｇ／ｍＬの濃度であり、前記凍結保護物質が約５％の濃度のスクロースであり、前記界面活性物質が、約０．０１重量％の濃度のＴｗｅｅｎ ８０であり、前記緩衝化剤が約２０ｍＭの濃度のＴｒｉｓであり、かつ前記電解質が、約１０ｍＭの濃度のＮａＣｌであり、前記ｐＨが約８．０である、請求項８６に記載の処方物。
  88. 請求項２１〜３２のいずれか１項に記載の組成物の治療有効量を投与する工程を包含する、癌を処置する方法。
  89. 前記癌がルイスＹ抗原について陽性である、請求項８８に記載の方法。
  90. 前記癌が癌腫である、請求項８８または８９に記載の方法。
  91. 前記組成物が、セカンドラインの単独療法として投与される、請求項８８〜９０のいずれか１項に記載の方法。
  92. 前記組成物が、ファーストラインの併用療法として投与される、請求項８８〜９０のいずれか１項に記載の方法。
  93. 前記癌が、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）または乳癌である、請求項８８〜９２のいずれか１項に記載の方法。
  94. 前記癌が前立腺癌または結腸直腸癌である、請求項８８〜９２のいずれか１項に記載の方法。
  95. 前記組成物が、生物活性因子と組み合わせて投与される、請求項８８〜９４のいずれか１項に記載の方法。
  96. 前記生物活性因子が抗癌剤である、請求項９５に記載の方法。
  97. 請求項２１〜３２のいずれか１項に記載の組成物を投与する工程を包含する、ＮＳＣＬＣを処置する方法。
  98. 請求項２１〜３２のいずれか１項に記載の組成物を投与する工程を包含する、乳癌を処置する方法。
  99. 請求項２１〜３２のいずれか１項に記載の組成物の治療有効量を投与する工程を包含する、増殖性障害を有する患者を処置する方法。
  100. キットであって、以下：（ｉ）請求項５９〜８６のいずれか１項に記載の処方物を保持する容器と；（ｉｉ）希釈剤を用いて該処方物を再構成し、該再構成された処方物中での結合体濃度を約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬの範囲内とするための説明書、とを備える、キット。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009292810A (ja) * 2008-04-24 2009-12-17 Immatics Biotechnologies Gmbh ワクチン用のヒト白血球抗原（ｈｌａ）クラスｉまたはｉｉ分子に結合する腫瘍関連ペプチドの新規組成物
JP2013028621A (ja) * 2008-04-24 2013-02-07 Immatics Biotechnologies Gmbh ワクチン用のヒト白血球抗原（ｈｌａ）クラスｉまたはｉｉ分子に結合する腫瘍関連ペプチドの新規組成物
JP2018525346A (ja) * 2015-06-29 2018-09-06 ウィリアム マーシュ ライス ユニバーシティＷｉｌｌｉａｍ Ｍａｒｓｈ Ｒｉｃｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ シシジマイシンａ及びその類似体の全合成

Families Citing this family (74)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW200616662A (en) * 2004-09-10 2006-06-01 Wyeth Corp Humanized anti-5t4 antibodies and anti-5t4 antibody/calicheamicin conjugates
US8008453B2 (en) 2005-08-12 2011-08-30 Amgen Inc. Modified Fc molecules
AU2006321975A1 (en) * 2005-12-06 2007-06-14 Wyeth Interleukin-11 compositions and methods of use
PL1994055T3 (pl) 2006-03-10 2015-02-27 Wyeth Llc Przeciwciała anty-5T4 i ich zastosowanie
UY32560A (es) 2009-04-29 2010-11-30 Bayer Schering Pharma Ag Inmunoconjugados de antimesotelina y usos de los mismos
FR2947269B1 (fr) 2009-06-29 2013-01-18 Sanofi Aventis Nouveaux composes anticancereux
ES2728115T3 (es) * 2009-10-30 2019-10-22 Janssen Biotech Inc Antagonistas de IL-17A
WO2012065161A2 (en) 2010-11-12 2012-05-18 Scott & White Healthcare Antibodies to tumor endothelial marker 8
DK2668210T3 (da) 2011-01-26 2020-08-24 Celldex Therapeutics Inc Anti-kit antistoffer og anvendelser deraf
SG194875A1 (en) 2011-05-08 2013-12-30 Legochem Biosciences Inc Protein-active agent conjugates and method for preparing the same
RU2011132483A (ru) * 2011-08-02 2013-02-10 Елена Александровна Моренко Биологически активный продукт для применения в ветеринарии и животноводстве, способ его получения и способы повышения выживаемости, стимуляции роста, иммуностимуляции и повышения общей неспецифической резистентности организма сельскохозяйственных животных
SG11201406943XA (en) 2012-04-27 2014-12-30 Cytomx Therapeutics Inc Activatable antibodies that bind epidermal growth factor receptor and methods of use thereof
US20130309223A1 (en) * 2012-05-18 2013-11-21 Seattle Genetics, Inc. CD33 Antibodies And Use Of Same To Treat Cancer
JP6268173B2 (ja) 2012-07-19 2018-01-24 第一三共株式会社 抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体
SG11201500489YA (en) 2012-07-25 2015-02-27 Kolltan Pharmaceuticals Inc Anti-kit antibodies and uses thereof
KR102306490B1 (ko) 2013-03-15 2021-09-28 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 생물학적 활성 분자, 그의 접합체 및 치료 용도
KR102252925B1 (ko) 2013-08-26 2021-05-18 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 마크롤라이드 디아스테레오머를 포함하는 약제학적 조성물, 이의 합성 방법 및 치료학적 용도
US9540440B2 (en) 2013-10-30 2017-01-10 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable antibodies that bind epidermal growth factor receptor and methods of use thereof
WO2015089283A1 (en) 2013-12-11 2015-06-18 Cytomx Therapeutics, Inc. Antibodies that bind activatable antibodies and methods of use thereof
CN106459199B (zh) 2014-03-11 2021-01-01 瑞泽恩制药公司 抗-egfrviii抗体及其用途
CN107995912A (zh) 2015-03-27 2018-05-04 里珍纳龙药品有限公司 美登素类衍生物、其偶联物和使用方法
BR112017027582A2 (pt) 2015-07-06 2018-08-28 Regeneron Pharma método para inibição do crescimento de uma célula tumoral ou promoção da eliminação de uma célula tumoral, e, composição farmacêutica.
MA45326A (fr) 2015-10-20 2018-08-29 Genentech Inc Conjugués calichéamicine-anticorps-médicament et procédés d'utilisation
KR20180079452A (ko) 2015-11-25 2018-07-10 주식회사 레고켐 바이오사이언스 자기-희생기를 포함하는 접합체 및 이의 제조방법
EP4335851A3 (en) * 2015-11-25 2024-06-05 ImmunoGen, Inc. Pharmaceutical formulations and methods of use thereof
CN108602890A (zh) 2015-12-11 2018-09-28 瑞泽恩制药公司 用于减少或预防对egfr和/或erbb3阻滞剂具有抗性的肿瘤生长的方法
SG11201806322QA (en) 2016-01-25 2018-08-30 Regeneron Pharma Maytansinoid derivatives, conjugates thereof, and methods of use
EP3442584B1 (en) 2016-03-15 2021-07-28 Seagen Inc. Combinations of pbd-based antibody drug conjugates with bcl-2 inhibitors
CN105726527B (zh) * 2016-03-25 2018-05-11 苏州大学 小分子化合物的用途及其组合物
EP3448891A1 (en) 2016-04-28 2019-03-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of making multispecific antigen-binding molecules
EP3463463A4 (en) 2016-06-03 2020-01-15 Seattle Genetics, Inc. COMBINATION OF CD33 ANTIBODY-ACTIVE SUBSTANCE CONJUGATES WITH CHEMOTHERAPEUTICS
US11191771B2 (en) 2016-06-09 2021-12-07 Seagen Inc. Combinations of PBD-based antibody drug conjugates with FLT3 inhibitors
EP3478324A1 (en) 2016-07-01 2019-05-08 GlaxoSmithKline Intellectual Property (No.2) Limited Antibody-drug conjugates and therapeutic methods using the same
CA3037732A1 (en) 2016-09-23 2018-03-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-steap2 antibodies, antibody-drug conjugates, and bispecific antigen-binding molecules that bind steap2 and cd3, and uses thereof
WO2018067331A1 (en) 2016-09-23 2018-04-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Bi specific anti-muc16-cd3 antibodies and nti-muc16 drug conjugates
WO2018089373A2 (en) 2016-11-08 2018-05-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Steroids and protein-conjugates thereof
TWI782930B (zh) 2016-11-16 2022-11-11 美商再生元醫藥公司 抗ｍｅｔ抗體，結合ｍｅｔ之雙特異性抗原結合分子及其使用方法
KR102085798B1 (ko) 2016-12-28 2020-03-06 주식회사 인투셀 베타-갈락토사이드가 도입된 자가-희생 기를 포함하는 화합물
IL270595B2 (en) 2017-05-18 2023-09-01 Regeneron Pharma Bi-octahydrophenanthrene carboxamides and their protein conjugates
JP7364471B2 (ja) 2017-05-18 2023-10-18 レゲネロン ファーマシューティカルス，インコーポレーテッド シクロデキストリンタンパク質薬物コンジュゲート
JP7426931B2 (ja) 2017-11-07 2024-02-02 レゲネロン ファーマシューティカルス，インコーポレーテッド 抗体薬物コンジュゲートのための親水性リンカー
KR20200108002A (ko) 2018-01-08 2020-09-16 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 스테로이드 및 이의 항체-접합체
US12037411B2 (en) 2018-04-30 2024-07-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Antibodies, and bispecific antigen-binding molecules that bind HER2 and/or APLP2, conjugates, and uses thereof
US11377502B2 (en) 2018-05-09 2022-07-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-MSR1 antibodies and methods of use thereof
JP7477462B2 (ja) 2018-05-17 2024-05-01 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 抗ｃｄ６３抗体、コンジュゲート、及び、それらの使用
HUE053616T2 (hu) 2018-05-30 2021-07-28 Abbvie Stemcentrx Llc Anti-SEZ6 antitest-hatóanyag konjugátumok és alkalmazási eljárások
MA53455B1 (fr) 2018-11-20 2022-11-30 Regeneron Pharma Dérivés de bis-octahydrophénanthrène carboxamide et leurs conjugués protéiques destinés à être utilisés en tant qu'agonistes de lxr
CA3123607A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Rifamycin analogs and antibody-drug conjugates thereof
EP3898651A2 (en) 2018-12-21 2021-10-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Tubulysins and protein-tubulysin conjugates
EP3908323A2 (en) 2019-01-08 2021-11-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Traceless linkers and protein-conjugates thereof
CN113474360A (zh) 2019-02-18 2021-10-01 伊莱利利公司 治疗性抗体制剂
WO2020172475A1 (en) 2019-02-21 2020-08-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating ocular cancer using anti-met antibodies and bispecific antigen binding molecules that bind met
WO2020222573A1 (ko) 2019-05-02 2020-11-05 주식회사 레고켐 바이오사이언스 트리스 구조를 가지는 링커를 포함하는 리간드-약물 접합체
GB201910899D0 (en) * 2019-07-31 2019-09-11 Scancell Ltd Binding members
JP2022547274A (ja) 2019-09-16 2022-11-11 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 免疫ｐｅｔ撮像のための放射標識されたｍｅｔ結合タンパク質
US11814428B2 (en) 2019-09-19 2023-11-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-PTCRA antibody-drug conjugates and uses thereof
CN115348874A (zh) 2020-01-24 2022-11-15 里珍纳龙药品有限公司 蛋白质-抗病毒化合物偶联物
US11958910B2 (en) 2020-02-28 2024-04-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Bispecific antigen binding molecules that bind HER2, and methods of use thereof
EP4135775A1 (en) 2020-04-16 2023-02-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Diels-alder conjugation methods
MA58646A1 (fr) 2020-06-24 2023-08-31 Regeneron Pharma Tubulysines et conjugués tubulysines-protéines
KR20240038138A (ko) 2020-07-13 2024-03-22 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 단백질에서 글루타민 잔기에 접합된 캄토테신 유사체 및 그의 용도
KR20230067632A (ko) * 2020-09-14 2023-05-16 암젠 인크 동결건조된 단백질 제형의 제조 방법
CA3191304A1 (en) 2020-09-14 2022-03-17 Amy Han Antibody-drug conjugates comprising glp1 peptidomimetics and uses thereof
KR20230095070A (ko) 2020-10-22 2023-06-28 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 항-fgfr2 항체 및 이의 사용 방법
AU2022320713A1 (en) 2021-07-28 2023-11-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Protein-antiviral compound conjugates
WO2023129518A1 (en) 2021-12-29 2023-07-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Tubulysins and protein-tubulysin conjugates
AU2023207960A1 (en) 2022-01-12 2024-07-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Camptothecin analogs conjugated to a glutamine residue in a protein, and their use
AU2023208050A1 (en) 2022-01-14 2024-07-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Verrucarin a derivatives and antibody drug conjugates thereof
KR20230132640A (ko) 2022-03-04 2023-09-15 앱티스 주식회사 티올 반응성 에디티브를 이용한 항체-약물 컨쥬게이트의 제조 수율을 높이는 방법
AU2023231305A1 (en) 2022-03-11 2024-09-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-GLP1r antibody-tethered drug conjugates comprising GLP1 peptidomimetics and uses thereof
US20240218011A1 (en) 2022-07-21 2024-07-04 Firefly Bio, Inc. Glucocorticoid receptor agonists and conjugates thereof
WO2024118785A2 (en) 2022-11-30 2024-06-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Tlr7 agonists and antibody-drug-conjugates thereof
US20240269308A1 (en) 2022-12-21 2024-08-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Prodrugs of topoisomerase i inhibitor for adc conjugations and methods of use thereof
WO2024168199A1 (en) 2023-02-09 2024-08-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Antibody-drug conjugates via inverse electron demand diels-alder reactions

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5822085B2 (ja) * 1977-07-19 1983-05-06 株式会社ミドリ十字 静注用ガンマ・グロブリン製剤
US4675187A (en) * 1983-05-16 1987-06-23 Bristol-Myers Company BBM-1675, a new antibiotic complex
US4554162A (en) * 1984-05-04 1985-11-19 Warner-Lambert Company CL-1724 Antibiotic compounds, their production and use
US4539203A (en) * 1984-11-13 1985-09-03 Warner-Lambert Company CL-1577D And CL-1577E antibiotic/antitumor compounds, their production and use
US4970198A (en) * 1985-10-17 1990-11-13 American Cyanamid Company Antitumor antibiotics (LL-E33288 complex)
US5037651A (en) * 1987-01-30 1991-08-06 American Cyanamid Company Dihydro derivatives of LL-E33288 antibiotics
US5079233A (en) * 1987-01-30 1992-01-07 American Cyanamid Company N-acyl derivatives of the LL-E33288 antitumor antibiotics, composition and methods for using the same
US5108912A (en) * 1987-01-30 1992-04-28 American Cyanamid Company Antitumor antibiotics (LL-E33288 complex)
US5182192A (en) * 1987-03-27 1993-01-26 The Wistar Institute Monoclonal antibodies against glycolipid antigens, methods of producing these antibodies, and use therefor
US4971792A (en) * 1987-03-27 1990-11-20 The Wistar Institute Monoclonal antibodies against glycolipid antigens
US4837206A (en) * 1987-04-29 1989-06-06 Bristol-Myers Company Esperamicin derivatives
US5606040A (en) * 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
US5053394A (en) * 1988-09-21 1991-10-01 American Cyanamid Company Targeted forms of methyltrithio antitumor agents
JPH01146826A (ja) * 1987-12-03 1989-06-08 Nippon Kayaku Co Ltd 白金化合物の凍結乾燥製剤
US5980896A (en) * 1989-06-30 1999-11-09 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies reactive with human carcinomas
US6020145A (en) * 1989-06-30 2000-02-01 Bristol-Myers Squibb Company Methods for determining the presence of carcinoma using the antigen binding region of monoclonal antibody BR96
IL94872A (en) * 1989-06-30 1995-03-30 Oncogen Monoclonal or chimeric antibodies that react with human carcinoma, recombinant proteins that contain their anti-binding site, pharmaceutical preparations and kits that contain the
ES2145004T3 (es) * 1991-08-21 2000-07-01 Novartis Ag Derivados de anticuerpos.
US6310185B1 (en) * 1994-03-08 2001-10-30 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Recombinant human anti-Lewis Y antibodies
US5773001A (en) * 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
JP3687993B2 (ja) * 1994-06-24 2005-08-24 シスメックス株式会社 インシュリン標準液
US5792456A (en) * 1994-08-04 1998-08-11 Bristol-Myers Squibb Company Mutant BR96 antibodies reactive with human carcinomas
US5712374A (en) * 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5714586A (en) * 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US6267958B1 (en) * 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
EP0861091B1 (en) * 1995-10-13 2003-08-20 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services Immunotoxin containing a disulfide-stabilized antibody fragment
AU3657899A (en) * 1998-04-20 1999-11-08 James E. Bailey Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
US20030175884A1 (en) * 2001-08-03 2003-09-18 Pablo Umana Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
WO2002034790A1 (en) * 2000-10-20 2002-05-02 Idec Pharmaceuticals Corporation Variant igg3 rituxan r and therapeutic use thereof
CN101724075B (zh) * 2001-10-10 2014-04-30 诺和诺德公司 肽的重构和糖缀合
DK1507556T3 (en) * 2002-05-02 2016-09-12 Wyeth Holdings Llc Calicheamicin derivative-carrier conjugates
ES2542885T3 (es) * 2003-01-22 2015-08-12 Roche Glycart Ag Constructos de fusión y uso de los mismos para producir anticuerpos con mayor afinidad de unión al receptor de Fc y función efectora
TW200616662A (en) * 2004-09-10 2006-06-01 Wyeth Corp Humanized anti-5t4 antibodies and anti-5t4 antibody/calicheamicin conjugates

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009292810A (ja) * 2008-04-24 2009-12-17 Immatics Biotechnologies Gmbh ワクチン用のヒト白血球抗原（ｈｌａ）クラスｉまたはｉｉ分子に結合する腫瘍関連ペプチドの新規組成物
JP2013028621A (ja) * 2008-04-24 2013-02-07 Immatics Biotechnologies Gmbh ワクチン用のヒト白血球抗原（ｈｌａ）クラスｉまたはｉｉ分子に結合する腫瘍関連ペプチドの新規組成物
JP2018525346A (ja) * 2015-06-29 2018-09-06 ウィリアム マーシュ ライス ユニバーシティＷｉｌｌｉａｍ Ｍａｒｓｈ Ｒｉｃｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ シシジマイシンａ及びその類似体の全合成

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