KR20060130737A - 항체 칼리케아미신 컨쥬게이트 - Google Patents

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저스틴 케이쓰 모란
조셉 토마스 루비노
니에라 자인
에르윈 레이몬드 아르센 보가에르트
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마크 에드워드 룹펜
니틴 크리쉬나지 다믈
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Abstract

항-루이스 Y 항체가 기재되어 있다. 종래 보고된 방법에서보다 훨씬 더 높은 약물 로딩을 가지며 감소된 응집 및 저 컨쥬게이트 분획(LCF)을 가진 단량체성 세포독성 약물/캐리어 컨쥬게이트의 제조 방법이 기재되어 있다. 세포독성 약물 유도체/항체 컨쥬게이트, 상기 컨쥬게이트를 포함하는 조성물 및 상기 컨쥬게이트의 용도 또한 기재되어 있다. 구체적으로, 단량체성 칼리케아미신 유도체/항-루이스 Y 항체 컨쥬게이트, 상기 컨쥬게이트를 포함하는 조성물 및 상기 컨쥬게이트의 용도 또한 기재되어 있다.

Description

항체 칼리케아미신 컨쥬게이트{ANTIBODY CALICHEAMICIN CONJUGATES}
본 발명은 높은 약물 로딩 및 실질적으로 감소된 저 컨쥬게이션 분획(low conjugate fraction, LCF)을 가진, IgG1 항체에 컨쥬게이션된 단량체 칼리케아미신 세포 독성 약물을 제조하는 것에 관한 것이다. 구체적으로는, 본 발명은 칼리케아미신에 컨쥬게이션된 항-루이스 Y 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이들 컨쥬게이트의 용도에 관한 것이다.
세포 독성 화학 요법(항암 화학요법이라고도 함)을 사용하여 다양한 유형의 암으로 고통받고 있는 환자들의 생존율이 개선되어 왔다. 세포 독성 약물 칵테일은 선택성 종양(신생물) 질환, 예를 들면 젊은 사람들에게서 나타나는 급성 임파구 백혈병(Kalwinsky, D. K. (1991) 3: 39-43, 1991) 및 비호지킨 림프종(Dusenbery, K. E, 등. (1988) American Journal of Hematology, 28: 246-251)에 대해서는 완전한 치료책(cure)을 유발할 수 있다. 그러나, 불행히도, 현재 사용되고 있는 화학 치료법은 대다수의 암들에 대해서는 완전 경쾌(輕快, remission)를 나타내지 않고 있다. 이와 같이 상대적으로 효능이 부족한 것에 대한 이유들이 많이 제시되어 있다(검토 참조: Gottesman, M.M. (2002) Ann. Rev. of Med. 53, 615-62; Mashima, T. 등. (1998) Biotherapy: 12(6), 947-952; Mareel, M.M. 등. (1986) Radiotherapy 및 Oncology: 6, 135-142). 이들 이유 가운데, 대부분의 화학 치료제의 치료 지수가 낮다는 이유가 약학적으로 개선해야할 대상이 되는 것으로 생각된다. 이 낮은 치료 지수는 약물의 유효 용량과 독성 용량 간에 차이가 크지 않기 때문인데, 이것은 종양을 박멸하여 치료 효과(curative effect)를 얻는데 필요한 충분히 높은 용량의 투여를 하지 못하게 할 수도 있다.
이러한 문제를 해결하는 한 가지 방법은 소위 마법의 탄환이라 불리는 것을 사용하는 것이다. 이 마법의 탄환은 Ehrlich (Ehrlich, P. (Collected Studies on Immunity 2, 442-447)에 의해 제시된 것으로서, 이는 항체에 화학적으로 결합된 세포 독성 화합물로 구성된다. 세포 독성 항암제를 종양 관련 항원을 인식하는 항체에 결합하면 이 항암제의 치료 지수를 개선할 수 있다. 이 항체는 이상적으로는 종양 세포 표면에서만 발현되는 종양-관련 항원(tumor-associated antigen, TAA)을 인식하여야 한다. 이 전략은 정상 조직에 대한 노출은 최소화하면서 세포 독성제를 종양 부위에 전달하는 것을 가능하게 한다. 이 항체는 세포 독성제를 종양에 특이적으로 전달할 수 있으므로 전신 독성을 감소시킬 수 있다.
전신성 약물 요법으로 개발된 약물 컨쥬게이트는 표적-특이적 세포 독성제이다. 이 개념은 규정된 표적 세포군에 대한 특이성을 지닌 캐리어 분자에 치료제를 커플링 시키는 것을 포함한다. 항원에 대해 높은 친화력을 갖는 항체는 표적 부분으로서 천연 재료에서 선택된다. 이러한 항원 중 하나는 루이스 Y 항원으로서, 이는 정상 조직에서는 발현되지 않지만 특정 종양 유형에서는 발현 수준(level)이 높 게 나타나는 항원이다. 루이스 Y (Ley) 항원은 일종의 유방암종, 결장암종, 위암종, 식도암종, 췌장암종, 십이지장암종, 폐암종, 방광암종 및 신장암종, 및 위 및 도세포 (島細胞, islet) 신경 내분비 종양의 세포 중에서 발견된다. 어떤 종양 세포들에서 나타나는 상기 항원의 존재는 이의 혈청 수준의 증가를 수반하지 않기 때문에, 투여된 루이스 Y 특이적 항체가 가용성 항원과는 유의적으로 결합하지는 않는다.
친화력이 높은 단일클론 항체를 사용할 수 있으므로 인해. 항체 표적의 치료제에 대한 전망은 상당히 밝아왔다. 단일클론 항체에 컨쥬게이트 되어온 독성 성분으로는 독소, 저분자량 세포 독성 약물, 생물학적 반응 조절제, 및 방사성 핵종을 포함한다. 항체-독소 컨쥬게이트는 면역 독소라는 용어로 흔히 명명되고 있으며, 메토트렉세이트 및 아드리아마이신과 같은 저 분자량 약물 및 항체로 구성되는 면역 컨쥬게이트는 화학 면역 컨쥬게이트로 불리고 있다. 면역 조절제는 조절 기능을 지닌 생물학적 반응 조절제를 함유하는데, 이러한 면역 조절제의 예로는, 림포키나제, 성장 인자 및 보체-활성 코브라 독액 인자(cobra venom factor (CVF))를 들 수 있다. 방사성 면역 컨쥬게이트는 방사활성 동위원소로 구성되며, 이들은 영상화 목적으로 또는 조사화 목적으로 세포를 사멸시키는 치료제로서 사용될 수도 있다. 종양 세포로의 세포 독성 약물의 항체-중재의 특이적 전달은 이들 약물의 항-종양 효능을 증가시킬 뿐 아니라, 정상 조직에 의한 비표적 이용을 방지시켜, 이들의 치료 지수들을 향상한다.
항균제 및 항종양제의 가능성 있는 구성원을 사용하는 면역 컨쥬게이트는 포괄적으로 칼리케아미신 또는 LL-E33288 복합체로 알려져 있는데, 이는 암 치료에 사용될 목적으로 개발되었다. 칼리케아미신 중에서 가장 강력한 것은 γ1 I로서 본원에서는 이후부터 감마로서 간단히 언급한다. 이들 화합물은 적절한 티올과 반응하여 디설파이드를 형성할 수 있는 메틸트리설파이드를 지니고 있으며, 동시에 칼리케아미신 유도체를 캐리어에 부착하는 데 유용하게 사용되는 다른 작용기 또는 히드라지드와 같은 작용기를 도입한다. 칼리케아미신은 이중 가닥 DNA를 끊는 -S-S- 결합을 감소시키므로서 활성화되는 에네디인 워헤드(enediyne warhead)(도 1)를 함유한다.
CMA-676 또는 CMA로 언급되는 MYLOTARG® (Sievers, E.L. 등. (1999) Blood: 93, 3678-3684)은 상기 원리에 따라 작용하는 상업적으로 시판되는 유일한 약물이다. MYLOTARG® (겜츄주마브 오조가마이신, gemtuzumab ozogamicin)는 노인 환자에게 발생한 급성 골수 백혈병을 치료하는 데 사용하도록 현재 승인을 받은 약물이다. 이 약물은 산-가수분해가능한 링커에 의해 칼리케아미신에 결합되는 CD33에 대한 항체로 구성되어 있다. 컨쥬게이션에는 반(半)-합성 N-아세틸 감마 칼리케아미신의 이황화물 유사체가 사용되었다(미국 특허 제5,606,040호 및 제5,770,710호). 이러한 분자, 즉 N-아세틸 감마 칼리케아미신 디메틸 히드라지드는, 이후부터, CM으로 약칭한다.
몇몇 실험적인 증거들은, CD33과는 다른 TAA를 인식하는 항체를 사용하면 마 술 탄환 접근법의 적용 범위가 확장될 수 있을 것이라는 아이디어를 확증한다. 항체 및 화학 치료제의 다수 컨쥬게이트들(면역컨쥬게이트들)은 이종 이식된 종양 군들을 치료(cure)할 수 있는 능력을 입증받았다. 표적 대상 TAA의 일부 예들은 다음과 같다: HER2/neu (Starling, J.J, 등. (1992) Bioconjugate Chemistry: 3(4), 315-322; DiJoseph, J.F 등. (2002) European Journal of Cancer: 38 (suppl. 7), S150); PSCA (Sjogren, H.O, 등. (1997) Cancer Res.: 57, 4530-4536); 뮤신 타입의 글리코프로테인(MIRACL-26457) (Zhang, S. 등. (1997) Int. J. Cancer, 73: 50-56; Wahl, A.F. 등. (2000) Int. J. Cancer, 93: 590-600); EGFR (Furokawa, K., 등. (1990) Mol. Immunol., 27: 723-732); CEA (Kitamura, K. 등. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91: 12957-12961); CD22 (Clarke, K. 등. (2000) Cancer Res., 60: 4804-4811) 및 루이스-항원(Ley) (Morgan, A.등 (1995) Immunology, 86: 319-324). 세포 독성 효과를 얻기 위해서, 이들 표면 항원에 대한 항체를 슈도모나스 외독소(DiJoseph, J.F 등., S150), 메이탄시노이드(Sjogren, H.O, 등. 4530-4536; Zhang, S. 등. 50-56), 칼리케아미신(Wahl, A.F. 등. 590-600; Clarke, K., 등. 4804-4811), RNase(Furokawa, K., 등. 723-732), 빈카 알카로이드(Kitamura, K., 등., 12957-12961) 또는 독소루비신(Morgan, A., 등 319-324)과 컨쥬게이트하였다.
캐리어에 컨쥬게이션된 칼리케아미신 유도체의 양(즉, 약물 로딩)이 증가되는 경우 단백질 응집체 형성을 유발시키는 컨쥬게이션 방법 및 특이적 표적 항원 (캐리어)의 입수 용이성으로 인해 광범위한 암 치료제 개발에 단량체 칼리케아미신 유도체/캐리어 컨쥬게이트를 사용하는 것은 제한되어왔다. 약물 로딩이 높으면 컨쥬게이트의 고유 잠재 능력이 증가 되기 때문에 캐리어 상에 약물은 많이 부하 되는 것이 좋으며, 이는 캐리어 단백질의 친화도를 보유한다는 것과 일맥상통한다.
칼리케아미신을 비롯한, 많은 세포 독성 약물이 원래부터 지니는 소수성 특성은 양호한 약물 로딩과 합당한 수득량을 지닌 단량체 약물 컨쥬게이트를 제조하는 데 있어서 장애가 되고 있다. 결합의 소수도가 증가하고 또 캐리어(항체)로부터 치료제를 분리시키는 공유결합 거리가 증가하면 이러한 문제가 더욱 악화되는 것으로 보인다. 응집된 단백질은 비특이적 독성 및 면역원성을 나타낼 수 있기 때문에 치료용으로 사용하기 위해서는 이 단백질의 존재를 제거하여야 하므로 이들 컨쥬게이트의 생산 규모를 크게 하는 것은 더욱 어려워질 뿐 아니라 생성물의 수득량도 감소한다.
캐리어 단백질 상에 로딩된 칼리케아미신의 양(약물 로딩), 컨쥬게이션 반응에서 형성된 응집체의 양, 및 얻어질 수 있는 최종 정제된 단량체 컨쥬게이트의 수득량은 모두 서로 상호 관련이 되어 있다. 어떤 경우에 있어서, 과도한 응집 반응으로 인해 미국 특허 제5,035,394호에 기술된 바와 같은 반응 조건을 사용하여 치료 용도용으로 합당한 유리한 약물 로딩 및 유리한 수득량을 제공하는 컨쥬게이트를 제조하는 것은 상당히 어렵다. 상기 반응 조건으로 컨쥬게이션 반응에서 공용매로 DMF가 사용되었다. 그러므로, 응집 반응 및 재료상의 고유 손실 없이 높은 약물 로딩과/높은 수득량을 허용하는 방법이 필요하다. 응집 반응을 감소시키는 개선 방 법에 관하여는 미국 특허 제5,712,374호 및 제5,714,586호, 및 미국 특허 출원 제2004/0082764 A1호 및 제 2004/0192900 A1호에 기술되어 있으며, 이들 특허 문헌들은 그 전체가 본원에 포함된다.
응집체에 대한 칼리케아미신 컨쥬게이트의 성향은 컨쥬게이션 반응이 미국 특허 제5,877,296호 및 제5,773,001호에 기술된 링커들을 사용하는 경우에 특히 문제가 된다. 여기 이 특허 문헌들은 그 전체가 본원에 포함된다. 이 경우에 있어서, 생성된 컨쥬게이트 다량(%)은 응집형이기 때문에 치료용으로 사용하기 위해서 생성된 컨쥬게이트를 이들 공정, 예를 들면, 미국 특허 제5,877,296호에서 제시한 과정을 이용하여 정제하는 것은 어려운 일이다. 일부 캐리어 단백질의 경우, 가장 적당한(modest) 로딩을 지닌 컨쥬게이트라도 소량의 규모에서도 사실상 예외가 없다. 이는 항체 동위원소 및 분화성 글리코실화 패턴이 컨쥬게이션 과정에 영향을 주는 항체의 경우에 특히 그러하다. 따라서, 칼리케아미신를 특정 항체에 컨쥬게이트 했을 때 응집화하는 양을 최소화하고 또한 가능한 한 적절한 생성물의 수득량을 제공하면서도 높은 약물 로딩을 허용하는, 새로우면서도 개선된 방법이 필요하다.
도 1은 칼리케아미신에 컨쥬게이션된 항-루이스 Y 항체(hu3S193)의 구조(hu3S193-AcBut-CM)를 도시한 것이다.
도 2A 및 2B는 칼리케아미신에 컨쥬게이션된 항-루이스 Y 항체(hu3S193)(hu3S193-AcBut-CM)의 Ley + 및 Ley - 세포에 대한 효과를, ED50(ng/㎖)에 대한 발생 빈도의 그래프로서 도시한 것이다; 도 2A는 Ley + 세포주 AGS를 나타내며, 도 2B는 Ley - 세포주 PC3MM2를 나타낸다. 도 2C는 hu3S193-AcBut-CM의 Ley +및 Ley -세포에 대한 효과를, 세포 표면 상에서의 루이스 Y의 발현에 대한 CMA의 폴드(fold)의 그래프로서 도시한 것이며(즉, Ley + 세포주는 LOVO, N87, HCT8/S11-R1, AGS, LNCaP, NCI-H358 이며, Ley - 세포주는 PC3-MM2, A431, 및 PANC-1임), 여기서 n은 독립적인 ED50 측정의 수를 나타낸다.
도 3은 N87 위암종 이종이식물에 대한 칼리케아미신에 컨쥬게이션된 항-루이스 Y 항체(hu3S193-AcBut-CM)의 생체 내 활성을, 종양 성장 기간(일)에 대한 종양의 체적(cm3)의 그래프로서 도시한 것이며; 도 3A는 대조구 컨쥬게이트 CMA 및 RITUXAN®-AcBut-CM를 나타내고, 도 3B는 hu3S193 및 hu3S193-AcBut-CM를 나타낸다.
도 4는 LNCaP 전립선암종 이종이식물에 대한 칼리케아미신에 컨쥬게이션된 항-루이스 Y 항체(hu3S193-AcBut-CM)의 생체 내 활성을, 종양 성장 기간(일)에 대한 종양의 체적(cm3)의 그래프로서 도시한 것이다.
도 5는 LOVO 결장암종 이종이식물에 대한 칼리케아미신에 컨쥬게이션된 항-루이스 Y 항체(hu3S193-AcBut-CM)의 생체 내 활성을, 종양 성장 기간(일)에 대한 종양의 체적(cm3)의 그래프로서 도시한 것이고; 도 5A는 대조구 컨쥬게이트 RITUXAN-AcBut-CM를 나타내고, 도 5B는 hu3S193 및 hu3S193-AcBut-CM를 나타낸다.
도 6은 LOVO 결장암종 이종이식물에 대한 칼리케아미신에 컨쥬게이션된 항-루이스 Y 항체(hu3S193-AcBut-CM)의 생체 내 활성을, 종양 성장 기간(일)에 대한 종양의 체적(cm3)의 그래프로서 나타낸 것이고; 도 6A는 대조구 컨쥬게이트 CMA 및 RITUXAN-AcBut-CM를 나타내고, 도 6B는 4㎍의 Q4Dx3 또는 Q4Dx4 농도로 투여된 hu3S193 및 hu3S193-AcBut-CM를 도시한다.
도 7은 성숙 분비된 항-루이스 Y 항체 hu3S193(wt)와 G193(mt) IgG1 중쇄의 아미노산 서열을 비교한 것으로서, 여기서 변이 부위는 굵고 밝게 표시하였으며, CDR은 굵고 어둡게 표시하였다.
도 8은 hu3S193 (Wyeth wt)와 hu3S193의 IgG1 중쇄의 아미노산 서열을 비교한 것으로서(이후에 루드비그 인슈티튜크 포어 캔서 리서치는 LICR wt로 지칭함), 여기서 CDR은 굵고 어둡게, 그리고 알로 타입의 차이는 밝고 굵게 표시하였다.
도 9는 칼리케아미신에 컨쥬게이션된 항-루이스 Y 항체(CMD-193)에 의한 표피(또는 편평세포) 암종 세포 A431 (도 9A) 및 A431/Ley (도 9B)의 증식 억제율을, 칼리케아미신의 농도(cal. eq., ng/㎖)에 대한 컨트롤(CMA)의 그래프로서 도시하였다.
도 10은 N87 위암종 이종이식물에 대한 칼리케아미신에 컨쥬게이션된 항-루이스 Y 항체(hu3S193-AcBut-CM 및 CMD-193)의 생체 내 증식 억제를, 종양 성장 기간(일)에 대한 종양의 체적(cm3)의 그래프로서 나타낸 것이고; 도 10A는 대조구 컨 쥬게이트 CMA를 나타내고, 도 10C는 유리 항체를 나타낸다.
도 11은 L2987 폐암종 이종이식물에 대한 칼리케아미신에 컨쥬게이션된 항-루이스 Y 항체물(hu3S193-AcBut-CM 및 CMD-193)의 생체 내 증식 억제를, 종양 성장 기간(일)에 대한 종양의 체적(cm3)의 그래프로서 나타낸 것이고; 도 11A는 대조구 컨쥬게이트 CMA를 나타내고, 도 11B는 CMD-193을 나타낸다.
도 12는 L2987 폐암종 이종이식물에 대한 칼리케아미신에 컨쥬게이션된 항-루이스 Y 항체(hu3S193-AcBut-CM 및 CMD-193)의 생체 내 증식 억제를, 종양 성장 기간(일)에 대한 각 군의 초기 평균 체적 미만의 종양의 체적을 보이는 마우스의 수(%)의 그래프로서 나타낸 것이고; 도 12A는 대조구 컨쥬게이트 CMA를 나타내고, 도 11B는 CMD-193을 나타낸다.
도 13은 L2987 폐암종 이종이식물에 대한 칼리케아미신에 컨쥬게이션된 항-루이스 Y 항체(CMD-193)의 생체 내 증식 억제를, 종양 성장 기간(일)에 대한 종양의 체적(cm3)의 그래프로서 나타낸 것이다.
도 14는 A431/Ley 표피암종 이종이식물에 대한 칼리케아미신에 컨쥬게이션된 항-루이스 Y 항체(CMD-193)의 생체 내 증식 억제를, 종양 성장 기간(일)에 대한 종양의 체적(cm3)의 그래프로서 나타낸 것이다.
도 15는 A431/Ley 표피암종 이종이식물에 대한 칼리케아미신에 컨쥬게이션된 항-루이스 Y 항체(CMD-193)의 생체 내 증식 억제를, 종양 성장 기간(일)에 대한 종 양의 체적(cm3)의 그래프로서 나타낸 것이고; 도 15A는 컨트롤 CMA의 효능을 도시한 것이고, 도 15B는 CMD의 효능을 도시한 것이다.
도 16은 A431/Ley 표피암종 이종이식물에 대한 칼리케아미신에 컨쥬게이션된 항-루이스 Y 항체(CMD-193)의 생체 내 증식 억제를, 종양 성장 기간(일)에 대한 각 군의 초기 평균 체적 미만의 종양의 체적을 지닌 마우스의 수(%)의 그래프로서 나타낸 것이고; 도 16A는 대조구 컨쥬게이트 CMA의 효능을 나타내고, 도 11B는 CMD의 효능을 나타낸다.
도 17은 LS174T 결장암종 세포 이종이식물에 대한 칼리케아미신에 컨쥬게이션된 항-루이스 Y 항체(CMD-193)의 생체 내 활성을, 종양 성장 기간(일)에 대한 종양의 체적(cm3)의 그래프로서 나타낸 것이다; 도 17A는 대조구 컨쥬게이트 CMA의 효능을 나타내고, 도 17B는 CMD의 효능을 나타낸다.
도 18은 LOVO 결장암종 세포 이종이식물에 대한 칼리케아미신에 컨쥬게이션된 항-루이스 Y 항체(CMD-193 및 hu3S193-AcBut-CM)의 생체 내 활성을, 종양 성장 기간(일)에 대한 종양의 체적(cm3)의 그래프로서 나타낸 것이며; 도 18A는 다양한 시간 간격에 따른 대조구 컨쥬게이트 CMA 및 G193의 효능을 나타내고, 도 18B 및 18C는 다양한 시간 간격에 따른 Z4DX3 및 Q4DX4에서의 CMD 효능을 각기 도시하며, 도 18D 및 18E는 다양한 시간 간격에 따른 CMD의 효능을 도시한 것이다.
도 19는 칼리케아미신에 컨쥬게이션된 항-루이스 Y 항체(CMD-193)를 다양한 투여량으로 주사한 후, 누드 마우스의 생존을 관찰 시간(일)에 따른 생존률(%)의 그래프로서 도시한 것이다.
도 20은 루이스 Y 항원에 대한 칼리케아미신(CMD-193)에 컨쥬게이션된 항-루이스 Y 항체의 결합 특이성을, BIAcore 공명 유니트에 대한 루이스 Y 및 이와 구조적으로 관련된 항원들의 그래프로서 도시한 것이다.
도 21은 HCT8S11 결장암종 이종이식물에 대한 칼리케아미신에 컨쥬게이션된 항-루이스 Y 항체(hu3S193-AcBut-CM)의 생체 내 활성을, 종양 성장 기간(일)에 대한 종양의 체적(cm3)의 그래프로서 나타낸 것이며; 도 21A는 작은 종양을 도시한 것이며, 도 21B는 커다란 종양을 도시한 것이다.
도 22는 MX1 유방 암종 이종이식물에 대한 칼리케아미신에 컨쥬게이션된 항-루이스 Y 항체(CMD-193)의 생체 내 활성을, 종양 성장 기간(일)에 대한 종양의 체적(cm3)의 그래프로서 나타낸 것이다.
도 23은 N87 위암종 이종이식물에 대한 칼리케아미신에 컨쥬게이션된 항-루이스 Y 항체(CMD-193)의 다양한 약물 로딩을 기준으로 한 생체 내 활성을, 종양 성장 기간(일)에 대한 종양의 질량(g)의 그래프로서 나타낸 것이다.
도 24는 N87 위암종 세포 이종이식물에 대한 항-루이스 Y 항체(G193) 및 이의 칼리케아미신 컨쥬게이트(CMD-193)의 시험관 내 보체-의존 세포 독성도(CDC)를, 항체 농도(㎍/㎖)에 대한 세포 독성률(5)의 그래프로 나타낸 것이다.
도 25는 A431/Ley 표피암종 세포에 대한 항-루이스 Y 항체(G193) 및 이의 칼 리케아미신 컨쥬게이트(CMD-193)의 실험관 내 항체-의존성 세포성 세포 독성(ADCC)을 도시한 것이고; 도 25A는 루이스 Y+++ A431 암종 세포에 대한 활성도를, 도 25B는 루이스 Y 음성 A431 암종 세포에 대한 활성도를 나타낸다.
발명의 개요
본 발명은 약 pH 7 내지 약 9(바람직하게는 약 8.2)에서, (i) 활성화된 칼리케아미신 가수분해가능한 링커 유도체와 (ii) IgG1 항체를 데옥시콜레이트 족 또는 이의 염의 존재하에 반응시키는 단계를 포함하는 칼리케아미신 컨쥬게이트의 제조방법뿐 아니라 이 방법에 의해 제조된 컨쥬게이트를 제공한다. 또한, 본 발명은 항-루이스 Y 항체에 공유결합된 칼리케아미신―가수분해가능한 링커 유도체로 된 컨쥬게이트를 함유하는 조성물을 제공한다.
한 실시양태로서, 데옥시콜레이트 족은 하기 화학식 (A) 내지 (C) 중 하나를 가진다:
화학식 (A)
Figure 112006074065888-PCT00001
(상기 식에서,
X1 내지 X5중 2개는 H 또는 OH이며, 다른 세 개는 독립적으로 O 또는 H이고;
R1은 (CH2)n로서, 여기서 n은 0-4이며; 그리고
R2는 OH, NH(CH2)mCOOH, NH(CH2)mSO3H, 또는 NH(CH2)mPO3H2로서, 여기서 m 은 1-4임),
화학식 (B)
Figure 112006074065888-PCT00002
(상기 식에서,
X1 내지 X4중 하나는 H 또는 OH이며, 다른 세 개는 독립적으로 0 또는 H 이고;
R1은 (CH2)n으로서, 여기서 n은 0 내지 2이며; 그리고
R2는 OH, NH(CH2)mCOOH, 또는 NH(CH2)mSO3H으로서, 여기서 m은 2임),
및
화학식 (C)
Figure 112006074065888-PCT00003
(상기 식에서,
X1 내지 X4중 하나는 OH이고, 다른 세 개는 H이며;
R1은 (CH2)n로서, 여기서 n은 0 내지 2이고;
R2는 OH, NH(CH2)2SO3H임).
데옥시콜레이트 족의 구성원들로는 데옥시콜린산, 케노데옥시콜린산, 히드록시콜레이트, 우로소데옥시콜린산, 글리코데옥시콜린산, 타우로데옥시콜린산, 타우로우르소데옥시콜린산, 또는 타우로케노콜린산일 수 있다. 데옥시콜레이트 족의 구성원은 약 10mM의 데옥시콜린산인 것이 바람직하다.
다른 실시양태에 있어서, 칼리케아미신 유도체는 약 3 중량% 내지 약 9 중량%의 IgG1 항체를 함유하며, 바람직하게는 약 7 중량%의 IgG1 항체를 함유한다.
한 실시양태에 있어서, IgG1 항체는 항-루이스 Y 항체이며, 이 항-루이스 Y 항체는 G193 또는 Hu3S193인 것이 바람직하다.
다른 실시양태에 있어서, 칼리케아미신 유도체는 칼리케아미신의 N-아실 유 도체이거나 또는 칼리케아미신의 이황화물 유사체이다. 칼리케아미신 유도체는 N-아세틸 감마 칼리케아미신 디메틸 히드라지드(N-아세틸 칼리케아미신 DMH)인 것이 바람직하다.
다른 실시양태에 있어서, 가수분해가능한 링커는 4-(4-아세틸에페녹시)부탄산(AcBut)이다.
본 발명의 방법은 칼리케아미신 컨쥬게이트를 정제하는 방법을 더 포함한다. 이 정제 방법은 크로마토그래프에 의한 분리 방법 및 한외여과 방법/정용여과 방법을 포함한다. 크로마토그래프 분리법은 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 이거나 또는 소수성 상호작용 크로마토그래프(HIC)인 것이 바람직하다. 정제 단계 후에, 컨쥬게이트의 평균 로딩은 IgG1 항체 1몰당 칼리케아미신 약 5 내지 약 7몰인 것이 바람직하며, 저 컨쥬게이션 분획은 10% 미만인 것이 바람직하다.
본 발명의 칼리케아미신 컨쥬게이트는 KD가 약 1 x 10-7 M 내지 약 4 x 10-7 M인 것이 바람직하며, KD가 3.4 x 10-7 M인 것이 더욱 바람직하다. 이러한 컨쥬게이트는 루이스 Y 항원과는 결합하지만 루이스 X 및 H-2 혈액 군의 항원과는 결합하지 않으며, 세포 독성 활성을 지니고, 그리고 항 종양 활성을 나타낸다. 컨쥬게이트는 치료 유효량의 양으로 조성물 중에 존재하는 것이 바람직하다.
그러므로, 본 발명은 G193에 공유결합된 N-아세틸 감마 칼리케아미신 디메틸 히드라지드－4-(4-아세틸에페녹시)부탄산(N-아세틸 칼리케아미신 DMH-AcBut)의 컨쥬게이트를 함유하는 조성물을 제공하는데, 여기서 평균 로딩은 G193 1 몰당 약 5 내지 약 7 몰의 N-아세틸 칼리케아미신 DMH 인 양이며, 컨쥬게이트의 저 컨쥬게이션 분획(LCF) 또한 10% 미만으로 존재한다.
본 발명은 이들 조성물의 생물학적 활성을 보존하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 상기 조성물을 용액 중에서 동결보호제, 계면 활성제, 완충제 및 전해질과 접촉시킨 후에 이 용액을 동결건조시키는 단계를 포함한다.
한 실시양태에 있어서, 컨쥬게이트는 약 0.5 mg/㎖ 내지 약 2 mg/㎖의 농도로 존재한다. 컨쥬게이트는 1 mg/㎖의 농도로 존재하는 것이 바람직하다.
다른 실시양태에 있어서, 동결보호제는 약 1.5 중량% 내지 약 6중량%의 농도로 존재한다. 동결보호제는 당 알코올이거나 또는 탄수화물일 수 있으며; 바람직한 동결보호제는 트레할로스, 만니톨, 또는 소르비톨이며, 더욱 바람직한 동결보호제는 약 5% 농도의 슈크로스이다.
한 실시양태에 있어서 계면 활성제는 약 0.005% 내지 약 0.05%의 농도로 존재한다. 바람직한 계면 활성제는 0.01 중량%의 폴리소르베이트 80이거나 또는 약 0.01%의 농도로 존재하는 트윈(Tween) 80이다.
다른 실시양태에 있어서, 완충제는 약 5mM 내지 약 50mM의 농도로 존재한다. 바람직한 완충제는 약 20mM의 농도로 존재하는 트리스이다.
다른 실시양태에 있어서 전해질은 약 5mM 내지 약 100mM의 농도로 존재한다. 바람직한 전해질은 나트륨 염 또는 칼륨 염이며, 더욱 바람직한 전해질은 약 10mM 농도의 NaCl이다.
한 실시양태에 있어서, 동결건조하기 전에, pH는 약 7.8 내지 약 8.2로 존재 하며, 바람직하게는 pH는 약 8.0으로 존재한다.
한 실시양태에 있어서, 동결건조(lyophilization)는 용액을 약 -35℃ 내지 약 -50℃의 온도에서 동결시키고; 약 20 내지 약 80 마이크론의 건조 압력하에서 보관 온도(shelf temperature)가 약 -10℃ 내지 약 -40℃인 온도로 24 시간 내지 78 시간 동안 동결된 용액을 1차 건조하고; 다음에 약 20 내지 약 80 마이크론의 건조 압력하에서 보관 온도가 약 +10℃ 내지 약 +30℃인 온도로 동결된 용액을 15 시간 내지 30 시간 동안 2차 건조하는 단계를 포함한다. 동결은 약 -45℃에서 수행되는 것이 바람직하며; 동결물의 1차 건조는 약 60 마이크론의 1차 건조 압력 에서 보관 온도가 약 -30℃인 온도로 60시간 동안 수행되며; 2차 건조 단계는 약 60 마이크론의 건조 압력에서 보관 온도가 약 +25℃인 온도로 약 24 시간 동안 수행하는 것이 바람직하다.
본 방법은 선택적인 단계로 동결건조 건에 증량제(bulking agent)를 첨가하는 것을 더 포함한다. 바람직한 증량제는 약 0.5중량% 내지 약 1.5중량%이며, 더욱 바람직한 증량제는 약 0.9중량%의 농도의 덱스트란 40이거나 또는 약 0.9중량%의 농도의 히드록시에틸 전분 40이다.
본 발명은 전술한 칼리케아미신-항-루이스 Y 항체 컨쥬게이트 조성물, 동결보호제, 계면 활성제, 완충제 및 전해질을 포함하는 제제를 제공한다.
본 발명은 전술한 조성물을 치료 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 암 또는 다른 증식성 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은 또한 암을 치료하는 의약의 제조에도 또한 사용될 수 있다.
이들 조성물은 2차 단일요법으로서 또는 1차 조합요법으로서 투여될 수 있다.
암은 루이스 Y 항원에 대해서 양성을 나타내는 것이 바람직하며, 암은 암종인 것이 더욱 바람직하다. 또한, 암은 비-소 세포 폐암(NSCLC), 유방암, 전립선암, 또는 대장암인 것이 바람직하다.
본 발명의 방법은 예를 들면 항암제와 같은 생물학적 활성 제제와 조합하여 실시될 수 있다.
본 발명에 의해 제공되는 키트는 (i) 본 발명의 임의의 제제를 수용하는 용기; 및 (ii) 재구성된 제제 중에 존재하는 컨쥬게이트 농도가 약 0.5 mg/㎖ 내지 약 5 mg/㎖ 범위 내가 되도록 제제를 희석제로 재구성할 것을 지시하는 설명서를 포함한다.
본 발명은 약 pH 7 내지 약 9에서, (i) 활성화된 칼리케아미신 - 가수분해가능한 링커 유도체와 (ii) IgG1 항체, 예를 들면 항-루이스 Y 항체를 데옥시콜레이트 족 또는 이의 염의 존재 하에 반응시키는 단계를 포함하는 칼리케아미신 컨쥬게이트를 제조하는 방법과, 이 방법에 의해 생산된 컨쥬게이트를 제공한다. 또한, 본 발명에 의해서 항-루이스 Y 항체에 공유결합한 칼리케아미신-가수분해가능한 링커로 된 컨쥬게이트를 함유하는 조성물이 제공된다. 상기 조성물들의 생물학적 활성을 보전하는 방법이 또한 제공되는데, 이 방법은 상기 조성물과 동결보호제, 계면 활성제, 완충제 및 전해질을 용액 중에서 접촉시키는 단계, 및 이 용액을 동결건조하는 단계를 포함한다. 칼리케아미신 - 항-루이스 Y 항체 컨쥬게이트, 동결보호제, 계면 활성제, 완충제, 및 전해질로 이루어진 제제가 또한 제공될 뿐 아니라, 이들의 제품도 또한 제공된다. 마지막으로, 본 발명은 상기 조성물/제제의 치료 유효량을 투여하여 암 또는 다른 증식성 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 또한 이 방법은 암 또는 다른 증식성 질환을 치료하기 위한 의약의 제조에 이들 조성물/제제를 사용하는 것을 포함한다. 이후 본 발명의 다양한 실시양태에 대해서 후술한다.
인간화된 항-CD22 항체 G5/44 칼리케아미신 컨쥬게이트인 CMC-544 및MYLOTARG (CMA-676 또는 CMA라 언급함)를 제조하는 데는 기존의 컨쥬게이션 조건들이 사용되어 왔다. 이들 두 가지는 IgG4 항체들이다. MYLOTARG가 소개된 이후, 이온 교환 크로마토그래프를 통하여 칼리케아미신이 일정한 방식 또는 균질한 방식으로 상기 유형의 항체들 상에 분포되지 않는다는 것을 알 수 있다. 이들 컨쥬게이트의 평균 로딩은 항체 1 몰당 0.1 내지 10 몰 또는 15 몰이며, 대부분의 칼리케아미신은 항체의 거의 절반에 위치하는 반면, 나머지 절반은 소량만의 칼리케아미신을 함유하는 저 컨쥬게이션 분획(LCF)이 존재한다. 칼리케아미신과 같은 세포 독성 약물을 캐리어에 컨쥬게이션하고, 그럼으로써 응집화 반응을 최소화하면서 유의적으로 개선된 수율과 함께 높은 일정한 약물 로딩을 허용하는 컨쥬게이트 생성물을 제공하는 개선 방법은 CMC-544의 개발시에 이루어졌다. 이의 특정한 예는 G5/44-인간화 항-CD22 항체-NAc-감마 칼리케아미신 DMH AcBut 컨쥬게이트(즉, CMC-544)의 개선 방법이었다. LCF의 양을 전체 항체량의 <10%로 낮추는 것이 CMC-544 개발에 바람직했기 때문에, 이러한 LCF의 수준을 감소시키는 데는 다양한 옵션이 고려되었다. 항원 결합 및 세포 독성과 같은 면역컨쥬게이트가 기여하는 다른 속성들은 이러한 궁극적인 해결책에 의해서 영향받아서는 안 된다. 고려된 가능한 옵션으로는 항체 분자의 유전적 변형 또는 물리적 변형, 크로마토그래피 분리 기술 또는 반응 조건의 변형이 포함되었다.
오래된 반응 조건을 사용하여(CMA-676 공정 조건) G5/44 항체와 NAc-감마 칼리케아미신-DMH-AcBut-OSu을 반응시키면 CMA-676와 유사한 물성(약물 로딩, LCF) 및 응집율을 지닌 생성물이 생성되었다. 하지만, 컨쥬게이션 이후에 존재하는 높은 수준(50-60%)의 LCF는 바람직하지 않은 것으로 간주 되었다. 최적 반응 조건은 통계적 실험 디자인 방법에 따라 결정되었는데, 이 방법에서 주된 반응 변수들, 예를 들면, 온도, pH, 칼리케아미신 유입량, 및 첨가제 농도가 평가되었다. LCF를 <10%로 낮추기 위해서, 칼리케아미신 유도체 유입량을 반응중의 항체 양에 대해서 3%에서 8.5% (w/w)로 증가시켰다. 첨가제는 200mM(CMA 공정)의 옥탄산 또는 그의 염에서 37.5 mM 농도의 데칸 산 또는 그의 염으로 변경하였다. 이러한 변화를 수용한 반응 조건은 LCR를 10% 미만으로 감소시키면서 칼리케아미신 로딩을 증가시켰는바, 이를 후술하는 곳에서 CMC-544 공정 조건으로 간주한다.
칼리케아미신 유입량의 증가는 또한 약물의 로딩을 2.5 내지 3.0 중량%에서 5.0 내지 9.0 중량%(가장 일반적으로는 5.5 내지 8.5 중량%)로 증가시킨 결과 반응시에 단백질 응집율은 증가하지 않는 결과가 나타났다. 응집체의 감소 및 LCF의 감소로 인해, CMC-544 공정 조건은 좀더 균일한 생성물을 생산하였다.
아미노산 서열 변형 및 동위원소의 변형으로 인해, 모든 항체가 동일한 물성을 보이는 것은 아니므로, 반응 조건은 각 특이적 항체에 맞게 조정되어야 한다. CMA-676 컨쥬게이션 반응 조건이 IgG1 항체, 예를 들면, 항-루이스 Y 항체와 함께 사용되는 경우, 생성된 컨쥬게이트는 CMA-676과 유사한 물성(약물 로딩, LCF, 및 응집율)을 나타냈지만, 컨쥬게이션 후의 고 수준(50-60%) LCF는 바람직하지 않은 것으로 간주하였다. IgG1 항체를 지닌 CMC-544의 개발 조건을 변형하여 사용하면 LCF가 낮은 생성물은 생산되지만 반응중에 생성된 응집체의 양은 매우 높은 것으로 나타났다. 이러한 경우에 있어서, 특이적 담즙 산인 데옥시콜레이트 족, 또는 이의 염은 LCF와 응집체를 감소시키는 데 있어서 최적의 첨가제로서 작용하는 것으로 나타났다. CMA-676 및 CMC-544 두 가지로부터 얻은 첨가제들과 새롭게 최적화된 공정을 사용하여 제조된 IgG1 항체 한 가지를 비교한 것을 하기 표 1에 제공한다(옥타노에이트, 데카노에이트, 및 데옥시콜레이트의 비교).
표 1
조건/결과 옥타노에이트 데카노에이트 데옥시콜레이트
칼리케아미신 유도체 유입량 7.0%(w/w) 7.0%(w/w) 7.0%(w/w)
첨가제 농도 200mM 37.5mM 10mM
온도 32(±2)℃ 32(±2)℃ 32(±2)℃
pH 8.2(±0.2)℃ 8.2(±0.2)℃ 8.2(±0.2)℃
로딩(칼리케아미신㎍/항체mg) 65-75 65-75 65-75
낮은 칼리케아미신 분획율 13.5% 5.3% 3.8%
응집율(반응 종결) 25.4% 14.6% 3.2%
그러므로, 본 발명은 칼리케아미신 컨쥬게이트를 제조하는 방법을 제공한다. 이러한 방법에 있어서, 활성화된 칼리케아미신-가수분해가능한 링커 유도체와 IgG1 항체는 다수의 데옥시콜레이트 족 또는 이의 염의 존재 하에 반응한다. 이 방법은 응집을 최소화하면서 IgG1 항체 컨쥬게이트에 대한 약물 로딩을 많이 증가시킨다.
담즙 산의 데옥시콜레이트 족 또는 이의 염의 적합한 구성원이 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 한 가지 실시양태에 있어서, 데옥시콜레이트 족 구성원은 하기 화학식을 가진다.
Figure 112006074065888-PCT00004
상기 식에서,
X1 내지 X5중 2개는 H 또는 OH이며, 다른 세 개는 독립적으로 O 또는 H이고;
R1은 (CH2)n로서, 여기서 n은 0-4이며;그리고
R2는 OH, NH(CH2)mCOOH, NH(CH2)mSO3H, 또는 NH(CH2)mPO3H2로서, 여기서 m 은 1-4이다.
대안으로서, 데옥시콜레이트 족은 하기 화학식을 지닌다.
Figure 112006074065888-PCT00005
상기 식에서,
X1 내지 X4중 하나는 H 또는 OH이며, 다른 세 개는 독립적으로 0 또는 H이고;
R1은 (CH2)n로서, 여기서 n은 0 내지 2이며; 그리고
R2는 OH, NH(CH2)mCOOH, 또는 NH(CH2)mSO3H로서 여기서 m은 2이다.
또한 대안으로서, 데옥시콜레이트 족은 하기 화학식을 지닌다.
Figure 112006074065888-PCT00006
상기식에서
X1 내지 X4중 하나는 OH이고, 다른 세 개는 H이며;
R1은 (CH2)n로서, 여기서 n은 0 내지 2이고; 그리고
R2는 OH, NH(CH2)2SO3H이다.
데옥시콜레이트 족의 구성원들로는 데옥시콜린산, 케노데옥시콜린산, 히드록시콜레이트, 우로소데옥시콜린산, 글리코데옥시콜린산, 타우로데옥시콜린산, 타우로우르소데옥시콜린산, 또는 타우로케노콜린산을 들 수 있다. 데옥시콜레이트 족의 구성원은 약 10mM의 농도로 존재하는 데옥시콜린산인 것이 바람직하다.
전술한 바와 같이, 칼리케아미신은 미국 특허 제4,970,198호(또한 미국 특허 제5,108,912호 참조)에 개시된 항균제 또는 항종양제 군을 의미한다. 본 발명의 한 바람직한 실시양태에 있어서, 칼리케아미신은 칼리케아미신의 N-아실 유도체 또는 칼리케아미신의 이황화물 유사체이다. 이들 화합물의 디하이드로 유도체는 미국 특허 제5,037,651호에 개시되었으며, N-아실화 유도체는 미국 특허 제5,079,233호에 개시되어 있다. 본 발명에 유용하게 사용되는 관련된 화합물은 미국 특허 제4,675,187호; 제4,539,203호; 제4,554,162호; 및 제4,837,206호에 개시된 칼리케아미신을 포함한다. 이들 모든 화합물들은 적절한 티올과 반응하여 디설파이드를 형성하는 메틸트리설파이드를 지니고 있으며, 동시에 히드라지드 또는 유사한 친핵체를 도입한다. 상술한 특허 인용문에 있는 모든 정보는 본원에 포함된다. 본 발명에 유용하게 사용되는 두 가지 화합물은 미국 특허 제5,053,394호에 개시되어 있으며, 이는 미국 특허 제5,877,296호의 표 1에 나타난, 감마 디메틸 히드라지드 및 N-아세틸 감사 디메틸 히드라지드이다.
본 발명의 문맥상, 칼리케아미신은 N-아세틸 감마 디메틸 칼리케마이신 디메틸 히드라지드 (N-아세틸 칼리케아미신 DMH)인 것이 바람직하다. N-아세틸 칼리케아미신 DMH는 현재 사용되는 대다수의 세포 독성 화학 치료제보다 적어도 10-배 또는 100-배 강력하다. 이것이 지닌 높은 효능으로 인해 이는 항체 표적 치료 요법에 대한 이상적인 후보가 됨으로써 항 종양 활성을 최대화시키는 한편 정상 기관 및 정상 조직의 비특이적 노출을 감소시킨다.
그러므로, 한 가지 실시양태에 있어서, 본 발명의 컨쥬게이트는 하기 식으로 나타난다:
Pr(-X-W)m
상기 식에서,
Pr은 IgG1 항체이며;
X는 IgG1 항체와 반응할 수 있는 임의의 반응기의 생성물을 포함하는 링커이고;
W는 칼리케아미신 군 유래의 세포 독성 약물이며;
m은 칼리케아미신이 3 중량% 내지 9 중량%의 컨쥬게이트를 구성할 정도로 정제된 컨쥬게이션 생성물에 대한 평균 로딩이며;
(-X-W)m 은 세포 독성 약물 유도체이다.
X는 하기 식을 가진다.
(CO - Alk1 - Sp1 - Ar - Sp2 - Alk2 - C(Z1) = Q - Sp)
상기 식에서,
Alkl 및 Alk2 는 각기 결합이거나 또는 측쇄 또는 측쇄가 아닌 (Cl-C10)알킬렌 사슬이며;
Sp1은 결합, -S-, -O-, -CONH-, -NHCO-, -NR-, -N(CH2CH2)2N-, 또는 -X-Ar-Y-(CH2)n-Z 으로서, 여기서 X, Y, 및 Z는 각기 결합, -NR-, -S-, 또는 -O-이되, n = 0인 경우, Y 및 Z 중 적어도 하나는 결합이며, Ar은 (C1-C5)알킬, (C1-C4)알콕시, (C1-C4)티오알콕시, 할로겐, 니트로, -COOR, -CONHR, -(CH2)nCOOR, -S(CH2)nCOOR, -O(CH2)nCONHR, 또는 -S(CH2)nCONHR 중 하나, 두 개, 또는 세 개의 기에 의해 임의 치환된 1,2-, 1,3-, 또는 1,4-페닐렌으로서, Alk1가 결합인 경우, Sp1은 결합인 것을 조건으로 하며;
n은 0 내지 5의 정수이고;
R은 -OH, (C1-C4) 알콕시, (C1-C4)티오알콕시, 할로겐, 니트로, (C1-C3)디알킬아미노, 또는 (C1-C3)트리알킬암모늄 A-(여기서 A-는 염을 형성하는 약학적으로 허용가능한 음이온이다)로 구성된 하나 또는 두 개의 기에 의해 임의 치환된 측쇄 또는 측쇄가 아닌 (C1-C5)사슬이며;
Ar은 (C1-C6)알킬, (C1-C5)알콕시, (C1-C4)티오알콕시, 할로겐, 니트로, -COOR, -CONHR, -O(CH2)nCOOR, -S(CH2)nCOOR, -O(CH2)nCONHR, 또는 -S(CH2)nCONHR(여기서 n 과 R은 상기 정의된 것과 같다)중에서 하나, 두 개 또는 세 개의 기에 의해 임의 치환된 1,2-, 1,3-, 또는 1,4-페닐렌 이거나, 또는 1,2-, 1,3-, 1,4-, 1,5-, 1,6-, 1,7-, 1,8-, 2,3-, 2,6-, 또는 2,7-나프틸리덴 또는
Figure 112006074065888-PCT00007
로서, 각 나프틸리덴 또는 페노티아진은 (C1-C6)알킬, (C1-C5)알콕시, (C1-C4)티오알콕시, 할로겐, 니트로, -COOR, -CONHR, -O(CH2)nCOOR, -S(CH2)nCOOR, 또는 -S(CH2)nCONHR(여기서 n과 R은 상기 정의한 바와 같음)중에서 하나, 두 개, 또는 세 개의 기에 의해 임의 치환되는데, Ar이 페노티아진인 경우는 Sp1은 질소에만 연결되는 결합인 것을 조건으로 하며;
Sp2 는 결합, -S-, 또는 -O-로서, Alk2 가 결합일때, Sp2 는 결합이고;
Z1은 H, (C1-C5)알킬, (C1-C5)알콕시, (C1-C4)티오알콕시, 할로겐, 니트로, -COOR, -CONHR, -O(CH2)nCOOR, -S(CH2)nCOOR, -O(CH2)nCONHR, 또는 -S(CH2)nCONHR(여기서 n과 R은 상기 정의한 바와 같음)중에서 하나, 두개, 또는 세개의 기에 의해 임의 치환된 H, (C1-C6)알킬, 또는 페닐이며;
Sp는 직쇄, 측쇄의 이가 또는 삼가(C1-C18)라디칼, 이가 또는 삼가 아릴 또는 헤테로아릴 라디칼, 이가 또는 삼가(C3-C18)시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬 라디칼, 이가 또는 삼가 아릴- 또는 헤테로아릴-아릴(C1-C18) 라디칼, 또는 이가 또는 삼가 시클로알킬- 또는 헤테로시클로알킬-알킬(C1-C18) 라디칼 또는 이가 또는 삼가(C2-C18)불포화 알킬 라디칼로서, 여기서 헤테로아릴은 바람직하게는 푸릴, 티에닐, N-메틸피롤릴, 피리디닐, N-메틸이미다졸릴, 옥사졸릴, 피리미디닐, 퀴놀릴, 이소퀴놀릴, N-메틸카르바조일, 아미노쿠르마리닐, 또는 페나지닐이며, Sp가 삼가 라디칼인 경우, Sp는 저급(C1-C5)디알킬아미노, 저급(C1-C5)알콕시, 히드록시, 또는 저급(C1-C5)알킬티오기에 의해 부가적으로 치환될 수 있으며; 그리고
Q 는 =NHNCO-, =NHNCS-, =NHNCONH-, =NHNCSNH-, 또는 =NHO- 이다.
바람직하게는, Alk1는 측쇄 또는 비측쇄(C1-C10) 알킬렌 사슬이며; Sp는 결합, -S-, -O-, -CONH-, -NHCO-, 또는 -NR이고, 여기서 R은 전술한 바와 같으며, Alk1가 결합일 때, Sp1은 결합인 것을 조건으로 하고;
Ar은 (C1-C6)알킬, (C1-C5)알콕시, (C1-C4)티오알콕시, 할로겐, 니트로, -COOR, -CONHR, -O(CH2)nCOOR, -S(CH2)nCOOR, -O(CH2)nCONHR, 또는 -S(CH2)nCONHR(여기서 n 과 R은 상기 정의된 것과 같다)중에서 하나, 두 개, 또는 세 개의 기에 의해 임의 치환된 1,2-, 1,3-, 또는 1,4-페닐렌이거나, 또는 1,2-, 1,3-, 1,4-, 1,5-, 1,6-, 1,7-, 1,8-, 2,3-, 2,6-, 또는 2,7-나프틸리덴으로서, 각 나프틸리덴은 (C1-C6)알킬, (C1-C5)알콕시, (C1-C4)티오알콕시, 할로겐, 니트로, -COOR, -CONHR, -O(CH2)nCOOR, -S(CH2)nCOOR, -O(CH2)nCONHR, 또는 -S(CH2)nCONHR중에서 하나, 두 개, 세 개, 또는 네 개의 기에 의해 임의 치환되고;
Z1은 (C1-C5)알킬, (C1-C5)알콕시, (C1-C4)티오알콕시, 할로겐, 니트로, -COOR, -CONHR, -O(CH2)nCOOR, -S(CH2)nCOOR, -O(CH2)nCONHR, 또는 -S(CH2)nCONHR중에서 하나, 두 개, 또는 세 개의 기에 의해 임의 치환된 (C1-C6)알킬, 또는 페닐이며;
Alk2와 Sp2는 함께 결합을 형성한다.
Sp 및 Q는 상술한 것과 동일하다.
본 발명의 방법에 있어서, 칼리케아미신은 바람직하게는 반응시 약 IgG1 항체의 약 3 중량% 내지 약 9중량% 양으로 가해지며, 더욱 바람직하게는 IgG1 항체의 약 7중량%의 양으로 첨가된다.
본 발명의 컨쥬게이트는 링커에 의해 유도체화된 세포 독성 약물 칼리케아미신을 이용하며, 이때 링커는 IgG1 항체와 반응하고, 이것은 단백질계 캐리어 표적화제로서 사용되어 세포 독성 약물 유도체-항체 컨쥬게이트를 형성한다. 본원에 그 전체 내용이 포함되는 미국 특허 제5,773,001호 및 제5,739,116호 및 제5,877,296호는 칼리케아미신으로부터 제조된, 친핵성 유도체, 특히 히드라지드 및 관련 친핵체 들과 함께 사용될 수 있는 링커에 대해서 개시한다. 이들 링커는 특히 약물과 링커 간에 형성된 결합이 가수분해가능할 때 더 나은 활성을 얻는 경우에 특히 유용하다. 이들 링커는 두 개의 작용기를 함유한다. 일반적으로 한 작용기는 캐리어와 반응하도록 사용되는 카르복실산이다. 이 산 작용기는 적절히 활성화되면 캐리어의 유리 아민기, 예를 들면 항체 또는 단백질계 캐리어의 리신의 측쇄 중의 아민과 아미드 결합을 형성할 수 있다. 다른 작용기는 카르보닐기로서, 즉 알데하이드 또는 케톤이며, 이들은 적절히 변형된 치료제와 반응할 것이다. 카르보닐기는 약물 상에 히드라지드 기와 반응하여 히드라존 결합을 형성할 수 있다. 이 결합은 표적 세포에 결합한 후 컨쥬게이트로부터 치료제를 방출하도록 한다. 가수분해가능한 링커는 4-(4-아세틸에페녹시)부탄산(AcBut)인 것이 바람직하다.
N-히드록시숙신이미드(OSu) 에스테르 또는 다른 대등한 활성화 에스테르를 사용하여 활성화 칼리케아미신 가수분해가능한 링커 유도체를 생성할 수 있다. 기타 적당한 활성화 에스테르의 예로는 NHS(N-히드록시숙신이미드), 설포-NHS(설폰화 NHS), PFP(펜타플루오로페닐), TFP(테트라플루오로페닐), 및 DNP(디니트로페닐)을 포함한다.
본 발명에 사용될 수 있는 항체의 예로는 단일클론 항체(mAbs), 예를 들면, 키메릭 항체, 인간화 항체, 영장류와 항체, 재표면화 항체, 인간 항체 및 이의 생물학적 활성 단편을 포함한다. 본원에서 사용된 항체란 용어는, 특별한 언급이 없는 한, 다양한 항체 유래 분자와 항체 분자 모두를 언급하는 넓은 의미로 사용된다. 이러한 항체 유래의 분자는 적어도 하나의 가변성 영역과(중쇄 가변성 영역 또는 경쇄 가변성 영역)을 포함하며, 이는 Fab 단편, F(ab')2 단편, Fd 단편, Fabc 단편, Sc 항체(단쇄 항체), 디아바디(diabodies), 개개의 항체 경쇄, 개개의 항체 중쇄, 항체 사슬과 다른 분자 간의 키메라 융합체 및 기타 등을 포함한다.
본 발명의 IgG1의 항체는 암과 같은 증식성 질환을 앓고 있는 조직 및/또는 표적 세포 상에 발현된 세포 표면 항원에 대해서 사용된다. 한 실시양태에 있어서, IgG1 항체는 항-루이스 Y 항체이다. 루이스 Y는 Fuca → 2Galß1 → 4[Fuca1 → 3]GlcNacß1→3R 구조를 지닌 탄수화물 항원이다(Abe 등. (1983) J. Biol. Chem., 258 11793-11797). 루이스 Y 항원은 사람의 내피 종양(유방 종양, 대장 종양, 폐 종양 및 전립선 종양을 포함)의 표면 60% 내지 90%상에서 발현되며, 이것의 적어도 40%는 이 항원을 과잉 발현하므로, 정상 조직에서 제한된 발현을 한다.
Ley를 표적화하여 종양을 효과적으로 표적화하기 위해서, 이상적으로는 항원에 대해서 배타적 특이성을 갖는 항체가 필요하다. 그러므로, 본 발명의 항-루이스 Y 항체는 타입 1 구조물(즉, 혈액 군의 락토-시리즈(Lea 및 Leb))와는 가교 반응을 하지 않는 것이 바람직하므로, Lex 및 H-타입 2 구조물처럼 다른 타입 2 에피토프(즉, 네오락토-구조)와도 반응하지 않는 것이 바람직하다.
지난 수십년간, Ley를 인식하는 몇몇 항체가 생성되어 왔다. 하지만, 이들 대부분은 Lex 및 타입 2 H-항원 구조물과 가교 반응을 한다(Furokawa, K., 등. 723-732). 바람직한 항-루이스 Y 항체의 예는 hu3S193 이다(참조: 미국 특허 제6,310,185호; 제6,518,415호; 제5,874,060호, 이 전체가 본원에 포함된다). 항-루이스 Y 항체의 다른 예는(예를 들면, 유럽 특허 제0 285 059호; 미국 특허 미국 특허 제4,971,792호 및 제5,182,192호), 현재 SGN-15인 독소루비신 컨쥬게이트로 평가되고 있는(미국 특허 제5,980,896호) 단일 클론 항체 BR96(예를 들면, 미국 특허 제5,491,088호; 제5,792,456호; 제5,869,045호), 슈도모나스 아우루기노사 외독소A(PE)로부터 유래된 38kD 독성 원을 함유한 재조합 디설파이드 안정화 항-루이스 Y IgGκ 면역 독소(예를 들면, 미국 특허 제5,980,895호)인 LMB-9 (B3(dsFv)PE38)의 단일 클론 항체, 및 IGN311 인간화 항체(예를 들면, 유럽 특허 제 0 528 767호 및 미국 특허 제5,562,903호)를 포함한다.
인간화 항체 hu3S193(Attia, M.A., 등. 1787-1800)는 3S193으로부터 CDR 그래프팅에 의해 생성된 것으로, 이는 Ley에 대해 놀라운 특이성을 지니는 아데노 암종에 대해 생성된 마우스의 단일클론 항체이다(Kitamura, K., 12957-12961). Hu3S193는 Ley에 대한 3S193의 특이성을 보유할 뿐 아니라 보체 의존 세포 독성(후술되는 곳에서 CDC라 간주함) 및 항체 의존 세포성 세포 독성도(후술되는 곳에서 ADCC로 간주)을 조정하는 역량을 지닌다(Attia, M.A., 등. 1787-1800). 이 항체는 125I, 111In, 또는 18F뿐 아니라, 111In, 99mTc, 또는 90Y와 같은 킬레이트제를 요구하는 기타 방사 표지로 표지된 hu3S193에 대한 생물학적 분포의 연구를 통해 입증한 것처럼 누드 마우스에서 이종이식물을 발현하는 Ley를 표적으로 한다(Clark, 등. 4804-4811).
본 발명은 루이스 Y 항원에 특이적인 인간화 재조합 항체를 생산하기 위해 마우스의 단일 클론 항체의 CDR 영역이 인간 수용체 구조 내로 스플라이싱될 수 있다는 발견을 기초로 하여 루이스 Y 항원에 특이적인 다수의 인간화된 항체를 제공한다. CDR은 Kabat 넘버링 시스템, Chothia 넘버 시스템, 또는 AbM 정의법(옥스포드 분자의 AbM 항체 모델 소프트웨어를 사용하는 Kabat과 Chothia의 중간 방법)과 같은 당 분야에 공지된 임의의 통상 명명법을 사용하여 정의될 수 있다. 특히, 본 발명의 바람직한 실시양태는 항원 결합 특성을 소유한 인간화 항체 분자의 예들이다. 루이스 Y 항원에 특이적인 인간화 재조합 항체를 제조하기 위한 프로토콜은 미국 특허 제6,518,415호에 개시되어 있으며, 이 문헌은 그 전체가 본원에 포함된다. 전술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시양태에 있어서, 인간화 루이스 Y 특이적 항체의 CDR은 마우스의 항체 3S193로부터 유래한다.
CDR이 그래프팅 되면, 마우스, 영장류 및 인간 구조 영역을 비롯하여, CDR이 유래 되는 공여 항체의 부류 및/타입에 대해서 임의의 적절한 수용체 가변성 구조의 서열이 사용될 수도 있다. 인간 구조의 예로서 본 발명에 사용될 수 있는 것으로는 KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY 및 POM (Kabat 등. Seq. of Proteins of Immunol. Interest, 1:310-334 (1994))을 들 수 있다. 예를 들면, KOL 및 NEWM은 중쇄에 대해서 사용할 수 있으며, REI는 경쇄에 대해서 사용할 수 있고, EU, LAY 및 POM은 중쇄과 경쇄 모두에 대해서 사용할 수 있다.
실시에 있어서, 원래의 마우스 항체의 특이성을 보유하는 효과적인 인간화 항체를 생산하기 위해 일반적으로 CDR을 간단히 대체하는 것만으로는 충분하지가 않다. 거기에는 인간 가변성 영역 구조에 중요한 마우스의 항체 잔기 소수가 포함되어야 한다는 요구 조건이 따른다. 이들 잔기의 규명은 원래의 마우스의 항체와 수용체 인간 항체 두 가지의 구조에 좌우된다. 그러므로, 본원에 제시된 인간화 항체는 수용체 항체를 일부 변형시키는 것을 포함하는데, 즉, 공여자 단일클론 항체에 특이적인 결합 특이성을 보유하는 데 필요한 인간의 중쇄 및/또는 경쇄 가변성 도메인 구조 영역을 포함한다. 다른 말로 하자면, 어떤 실시양태에 따른 구조 영역, 본원에 설명된 인간화 항체는 자연산 인간 항체 가변성 영역의 구조 영역의 정확한 아미노산 서열로 꼭 구성되는 것은 아니지만, 마우스의 항체 3S193과 동일한 표적에 대해서 특이적인 인간화 항체 영역의 결합 특성을 개선하는 다양한 치환체를 함유한다. 인간의 것이 아닌 구조 잔기가 대량 도입되는 것을 막고 그리고 인간화 항체의 최소 면역원성을 보장하기 위하여 최소 수의 치환이 구조 영역에 대해 일어난다. 그러므로, 본 발명의 범주에 바람직한 항-루이스 Y 항체는 hu3S193 및 G193이다.
한 가지 실시양태에 있어서, 본 발명의 항체 분자의 변형체는 루이스 Y에 대해서 생성되며 루이스 Y에 대한 개선된 친화력을 나타낸다. 이러한 변형체는 CDR을 변이 처리하고(Yang 등., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), 사슬 셔플링을 수행하며(Marks 등., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), 대장균의 변이 유발 균주를 사용하고(Low 등., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996), DNA 셔플링을 수행하고(Patten 등., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), 파지 디스플레이를 수행하며(Thompson 등., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996), 그리고 PCR을 수행하는(Crameri 등., Nature, 391, 288-291, 1998)것을 비롯한, 다수의 변이 프로토콜에 따라 얻어질 수 있다.
본 발명의 인간화 항체는 폴리펩티드 제조에 유용하게 사용되는 다양한 방법, 예를 들면 실험관 내 합성법, 재조합 DNA 생산법 및 기타 다른 방법에 의해 제조될 수도 있다. 인간화 항체는 재조합 DNA 기술에 의해 생산되는 것이 바람직하다. 그러므로 본 발명의 인간화 루이스 Y 특이적 항체는 DNA 기술을 사용하는 재조합 단백질 발현 방법에 의해 생산될 수 있다. DNA(예를 들면, 폴리뉴클레오티드)를 조작하는 기술는 분자 생물학 분야의 당업자에게 잘 알려져 있다. 이러한 잘 알려진 기술의 예로는 Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2 nd Edition, Sambrook 등, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)에서 볼 수 있다. 인간화 면역글로블린을 함유하는, 면역글로블린의 재조합 발현 기술 또한 Goeddel 등, Gene Expression Technology Methods in Enzymology, Vol. 185, Academic Press (1991), 및 Borreback, 항체 Engineering, W.H. Freeman (1992)에서 찾아 볼 수 있다. 재조합 항체의 생성, 디자인 및 발현과 관련한 추가의 정보는 Mayforth의 Designing antibody, Academic Press, San Diego (1993)에서 찾아 볼 수 있다. 통상의 분자 생물 기술의 예로는, 제한하는 것은 아니지만, 실험 관내 결찰법, PCR, 세포성 형질전환법, 하이브리드화 기술, 전기 영동, DNA 서열 규명 및 기타 등을 포함한다.
본 발명의 벡터를 제조하기 위한 일반적인 방법, 세포를 트랜스팩션시켜 본 발명의 숙주 세포를 제조하는 방법, 세포를 배양하여 본 발명의 항체를 생산하는 방법 모두는 통상의 분자 생물학 방법이다. 이와 유사하게, 한번 생산되면, 본 발명의 재조합 항체는 교차 흐름 여과 공정, 암모늄 설페이트 침전, 친화도 칼럼 크로마토그래피, 겔 전기 영동, 정용여과 및 기타를 비롯한 당 분야의 표준 방법에 따라 정제될 수 있다. 재조합 항체를 발현하는 데 사용되는 숙주 세포는 세균 세포, 예를 들면 대장균이거나, 또는 바람직하게는 진핵 세포일 수 있다. PER.C.6 세포 또는 Chinese 햄스터 난소 세포(CHO)와 같은 포유 동물 세포를 사용하는 것이 바람직하다. 발현 벡터의 선택은 숙주 세포의 선택에 좌우되며, 이 발현 벡터가 선택되면 소정의 발현이 이루어지게 되고, 선택된 숙주 세포에서 조절 특성이 나타난다.
분리 공정과 함께 특정 공용매, 첨가제. 및 특이적 반응 조건을 사용하면 LCF가 크게 감소된 단량체 세포 독성 약물 유도체 항체 컨쥬게이트가 형성된다. 응집된 형태와는 반대의 형태인 상기 컨쥬게이트 단량체는 유의적인 치료 가치를 나타내며, 또한 LCF를 최소화시키고 응집을 실질적으로 감소시키면 LCF가 좀더 많은 양의 컨쥬게이션된 분획(HCF)과 경쟁하는 것이 방지하는 치료 면에서 의미 있는 방식으로 항체 출발 재료를 이용할 수 있다.
본 발명의 범주에 있어서. 단량체 세포 독성 약물 컨쥬게이트는 항체의 유의적인 응집 없이 임의 수의 칼리케아미신 분자에 공유결합되는 단일 항체를 말한다. 또한, 항체에 공유결합되는 칼리케아미신의 수는 약물 로딩으로 지칭한다. 예를 들면, 본 발명에 따른 평균 로딩은 항체 하나 당 칼리케아미신 0.1 내지 10 또는 15 부분의 범위로 존재할 수 있다. 제공된 컨쥬게이트 군(예를 들면, 제제 조성물 중에서)은 약물 로딩의 관점에서 볼 때 비균일하거나 또는 균일할 수 있다. 비균일 군의 경우에서, 평균 로딩은 항체에 컨쥬게이션된 약물 분자의 평균 수(또는 몰)를 나타내기 때문에, 항체 하나당 약물 부분의 실질적인 수는 충분히 변화할 수 있다. 컨쥬게이션되지 않은 항체 또는 상당히 컨쥬게이션된 항체를 가진 주어진 군의 항체(%)는 저 컨쥬게이션 분획 또는 LCF로 나타낸다.
비-친핵성, 단백질 상용성, 완충 용액과 함께 데옥시콜레이트를 사용하면 약물 로딩/수득량은 높으면서 활성은 우수한 감소된 응집율의 단량체 세포 독성 약물 유도체/캐리어 컨쥬게이트가 생산되는 것으로 밝혀졌다. N-히드록시숙신이미드(OSu) 에스테르 또는 다른 비교가능한 활성화 에스테르로부터 제조한 컨쥬게이트의 바람직한 완충 용액은 인산염 완충 식염수(PBS), N-(2-히드록시에틸)피페라진-N-(4-부탄설폰산)(HEPBS), 또는 N-2-히드록시에틸 피페라진-N-2-에탄설폰산(HEPES 완충제)이다. 이러한 컨쥬게이션 반응에 사용되는 완충 용액은 유리 아민 또는 친핵체를 지니지 않는다. 당 분야에 숙련된 당업자라면 다른 타입의 컨쥬게이트용의 허용가능한 완충제를 쉽게 결정할 수 있을 것이다.
또한, 단량체 컨쥬게이트를 효과적으로 형성하는데 필요한 첨가제의 양은 항체마다 다르다. 이러한 양은 과도한 실험 없이 당 분야의 기술에 숙련된 사람에 의해 결정될 수 있다. 현재의 반응에 있어서, 항체의 농도는 1 내지 15 mg/㎖ 이며, 칼리케아미신 유도체, 예를 들면 N-아세틸 감마-칼리케아미신의 DMH AcBUt Osu 에스테르는 항체의 약 3-9 중량%의 범위에 있다.
공용매의 대체 용매는 에탄올일 수 있는데, 이것은 6 내지 11.4%(부피 기준)으로 변화하는 농도하에서 양호한 결과가 나타났다. 반응은 PBS, HEPES, N-(2-히드록시에틸)피페라진-N-(4-부탄설폰산)(HEPBS), 또는 다른 상용성 완충제(pH 약 7 내지 약 9, 바람직하게는 8 내지 9)를 약 25℃ 내지 약 40℃에서, 바람직하게는 약 30℃ 내지 약 35℃에서 15분 내지 24시간 동안 수행될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 반응은 약 8.2의 pH에서 수행할 수 있다. 당업자들은 다른 타입의 컨쥬게이트에 대해서도 허용가능한 pH 범위를 쉽게 결정할 수 있다. 다양한 항체의 경우에, 전술한 첨가제 조합물을 약간 변형하여 사용하면 약물 로딩이 개선될 뿐아니라 단량체 컨쥬게이트 수율 또한 개선되는 것으로 밝혀졌으므로, 임의의 특정 항체가 최적 결과를 얻기 위해서는 첨가제의 정확한 조건 또는 선택을 약간 변형할 것을 요구할 수도 있다는 것도 이해해야 한다.
컨쥬게이션 수행후, 단량체 컨쥬게이트는 컨쥬게이션되지 않은 반응물(예를 들면 단백질 캐리어 분자/항체 및 유리 세포 독성 약물 칼리케아미신) 및/또는 응집 형태의 컨쥬게이트로부터 정제될 수 있다. 통상적인 정제 방법으로, 예를 들면 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC), 이온 교환 크로마토그래피(IEC), 크로마토포커싱(CF)이 사용될 수 있다. 예를 들면, 크로마토그래피 분리 후에, 컨쥬게이트는 한외여과처리되거나 및/또는 정용여과될 수 있다.
정제된 컨쥬게이트는 단량체로서 일반적으로 세포 독성 약물/칼리케아미신을 3 중량% 내지 9 중량% 함유한다. 바람직한 실시양태에 있어서, 컨쥬게이트는 HIC를 사용하여 정제된다. 세포 독성 약물이 높은 소수 특성을 갖는 경우에, 예를 들면 칼리케아미신 유도체가 컨쥬게이트에 사용되는 경우에, 컨쥬게이션된 항체 또는 컨쥬게이션되지 않은 항체를 효과적으로 분리하기 위한 바람직한 후보는 HIC이다. HIC는 SEC에 비해서 3가지의 주된 장점을 나타낸다: (1) 이것은 LCR 함량 및 응집체를 효율적으로 감소시키는 역량을 지닌다; (2) HIC에서의 칼럼 부하 역량이 훨씬 높다; 및 (3) HIC는 생성물의 과도한 희석을 피한다. 제조 규모로 사용하기 적합한 다수의 높은 역량 HIC 매질, 예를 들면 부틸, 페닐 및 옥틸 세파로즈 4 급속 흐름(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)은 컨쥬게이션 과정 후에 단량체 컨쥬게이션된 성분으로부터 컨쥬게이트중의 응집체와 컨쥬게이션되지 않은 것을 효과적으로 분리할 수 있을 것이다.
바람직하게는, HIC는 세척 완충제가 0.60 M의 인산칼륨이고 용출 완충제가 20mM 트리스/25mM NaCl로 부하되어 있는 부틸 세파로즈 FF 수지를 사용하여 수행된다. 또한, 바람직하게는, 재생된 셀룰로스 막을 사용하여 한외여과를 수행한다. 20 mM 트리스/10 mM NaCl 완충제(pH 8.0)의 10배 투석 부피를 사용하여 정용여과를 수행한다.
그러므로, 본 발명의 공정에 따르면, 정제 단계 후에, 컨쥬게이트의 평균 로딩은 IgG1 항체 1 몰당 약 5 내지 7 몰의 칼리케아미신인 양이다. 또한, 정제 단계 후에, 컨쥬게이트의 저 컨쥬게이션 분획(LCF)은 약 10% 미만이다.
본 발명은 또한 이들 공정에 따라 제조된 컨쥬게이트를 제공한다. 이 컨쥬게이트는 순(naked) 항체의 결합 동역학적 특성(kinetics)과 특이성을 유지하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 본 발명의 컨쥬게이트는 바람직하게는 BIAcore 분석에 의해 측정한 바와 같이 약 100 내지 400 nM의 kD, 바람직하게는 3.4 x 10-7M의 kD를 가지며, 루이스 Y 항원에는 결합하지만 루이스 X 및 H-2 혈액 군에는 결합하지 않으며, 세포 독성 및/또는 항-종양 활성을 지닌다. 컨쥬게이트의 결합 동역학적 특성과 특이성을 결정하는 데는 임의의 공지된 방법, 예를 들면 FACS 또는 BIAcore 분석을 사용할 수 있다.
본 발명의 공정에 의해 제조되는 바람직한 칼리케아미신 컨쥬게이트는 가수분해가능한 링커 4-(4-아세틸에페녹시)부탄산(AcBut)에 공유결합되거나 또는 항-루이스 Y 항체 G193에 공유결합된 N-아세틸 감마 칼리케아미신 디메틸 히드라지드(N-아세틸 칼리케아미신 DMH)로서, 이 칼리케아미신 컨쥬게이트는 항체 1 몰당 약 5 내지 약 7몰의 칼리케아미신을 지니며, 컨쥬게이트의 저 컨쥬게이션 분획(LCF)은 약 10% 미만으로 나타낸다.
본 발명에 의해 또한 제공되는 것은 약학적 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 항-루이스 Y 항체에 공유결합된 칼리케아미신-가수분해가능한 링커의 컨쥬게이트를 함유하는 조성물이다. 그러므로, 본 발명에 따른 바람직한 조성물은 G193에 공유결합된 N-아세틸 감마 칼리케아미신 디메틸 히드라지드(4-(4-아세틸에페녹시)부탄산(N-아세틸 칼리케아미신 DMH-AcBut)의 컨쥬게이트를 포함하는데, 여기서 평균 로딩은 G193 1 몰당 N-아세틸 칼리케아미신 DMH가 약 5 내지 약 7몰이며, 컨쥬게이트의 저 컨쥬게이션 분획(LCF)은 약 10% 미만으로 존재한다.
인간화 루이스 Y 특이적 항체는 인간 또는 인간화 단일 클론 항체와 같은 다른 항체(또는 이의 일부)와 함께 또는 이들 다른 항체에 결합하여 사용될 수 있다. 이들 다른 항체들은 본 발명의 항체가 지시하는 것에 대한 질환의 마커(에피토프) 특성에 반응할 수 있거나 또는 이들 다른 항체들은, 예를 들면 병든 세포에 인간 면역 시스템의 분자 또는 세포를 채용하도록 선택된 다양한 특이성을 갖는 것일 수 있다. 본 발명의 항체(또는 이의 일부)는 분리 투여된 조성물로서 또는 통상의 화학 또는 분자 생물 방법에 의해 두 가지 제제가 결합된 단일 조성물로서 상기 항체(또는 이의 일부)와 함께 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체의 진단 및 치료적 가치는 검출가능한 신호(시험관 내에서든지 또는 생체 내에서)을 생산하는 표지로 인간화 항체를 표지하거나 또는 치료 특성을 지닌 표지로 인간화 항체를 표지함으로써 높일 수 있다. 어떤 표지, 예를 들면 방사 핵종은 검출가능한 신호를 생산하므로 치료 특성을 가질 수 있다. 방사 핵종 표지의 예로는 125I, 131I, 14C를 들 수 있다. 다른 검출가능한 표지의 예로는 형광 발색단, 가령 형광 현미경용 플루오레신, 피코빌리프로테인 또는 테트라 로다민, 형광, 흡광 가시 색상 또는 응집 반응에 의해 검출되는 형광성 생성물이나 또는 착색 생성물을 생산하는 효소로서 이들은 전자 현미경에 의해 입증된 바와 같이 전자 밀집 생성물을 생산하며; 또는 직접 또는 간접 전자 현미경 가시화를 위한 골드 비드, 페록시다제, 또는 페리틴과 같은 것들을 포함한다. 치료 특성을 지닌 표지는 암 치료용 약물, 예를 들면 메토트렉세이트 및 기타 등을 포함한다.
단량체 세포 독성 약물 유도체/캐리어 컨쥬게이트는 치료용 또는 진단용 조성물/제제 중에 존재하는 유일한 활성 성분일 수 있거나, 또는 다른 항체 성분, 예를 들면 항-CD19, 항-CD20, 항-CD33, 항-T 세포, 항-IFNγ 또는 항-LPS 항체, 또는 비-항체 성분, 예를 들면 시토킨, 성장 인자, 호르몬, 항-호르몬, 세포 독성 약물 및 크산틴을 포함하여, 다른 활성 성분을 수반할 수 있는데, 그러한 다른 성분의 예로는 상술한 화학 치료제, 호르몬 치료제, 또는 생물학적 치료제를 들 수 있다.
이들 조성물/제제는 암 치료 목적으로 환자에게 투여될 수 있다. 본 발명에 따르면, 칼리케아미신 - 항-루이스 Y 항체 컨쥬게이트, 동결보호제, 계면 활성제, 완충제, 및 전해질로 이루어진 조성물 또는 제제의 치료 유효량을 이것이 필요한 환자에게 투여한다. 대안으로서, 상기 조성물 또는 제제를 사용하여 암 치료용 의약을 제조한다. 이 방법 또는 의약을 사용하여 이들 표면상에서 루이스 Y 항원을 세포 발현하는 특징을 보이는 증식성 질환을 지닌 환자를 치료할 수 있음을 주지해야 한다. 따라서, 한 가지 실시양태에 있어서, 치료되는 암은 루이스 Y 항원에 대해서 양성이다. 이 암은 루이스 Y 항원의 많은 수를 발현하는 암(즉, 높은 루이스 Y-발현 종양)인 것이 바람직하다. 치료될 수 있는 암은 암종일 수 있으며, 바람직하게는 비-소세포 폐암(NSCLC) 또는 유방암 또는 대안적으로는 전립선암 또는 결장직장암(colorectal cancer)이다.
바람직하게는, hu3S193-AcBut-CM 또는 CMD-193는 본원에 기술된 의약 또는 조성물로 치료되는 대상체에 존재하는 루이스 Y의 세포 발현 수준을 감소시킬 필요가 있는 임의의 치료에 사용될 수 있다. 특히, 상기 의약 또는 조성물은 세포 표면상에 루이스 Y 항원을 발현하는 증식성 질환, 주로 암종을 앓고 있는 인간이나 동물을 치료하는 데 사용된다. 이들 루이스 Y 발현 세포들은 체내에 돌아다니는 순환성으로 존재하거나 또는 체내의 특정 부위에 바람직하지 않게 다량이 편재하는 방식으로 존재할 수 있다.
본 치료 방법은 다른 암 치료 방법과 조합하여 사용될 수 있는데, 그러한 것으로는 수술, 조사, 화학 치료법, 호르몬 치료법, 생물학적 치료법, 골수 이식법(매우 높은 용량의 화학 치료 요법이 필요한 다른 암 병 및 백혈병)을 포함한다. 암 생물학에 대한 이해가 깊어지면서 현재 개발 및 승인상태에 있는 새로운 치료법도 나타나고 있다.
일반적으로 두 가지 부류의 조사 요법을 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 한 가지 부류는 근접 치료법으로서 방사성 동위원소의 직접 이식물을 종양내에 넣어서 그 부위에 농축된 용량을 전달하는 것이다. 다른 부류는 원격 치료법으로서 빔을 사용해서 체내의 넓은 부위에 조사량을 전달하거나 또는 전체 신체 대상 조사법(TBI)을 통해서 몸 전체에 전달하는 것이다.
임의의 적합한 화학 치료제가 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 이러한 화학 치료제는 다음의 부류에 속하는 것들이다(각 부류당 예가 주어졌다): 항-대사물(예를 들면 메토트렉세이트와 같은 폴린산 길항제, 6-메르캅토퓨린(6-MP)과 같은 퓨린 길항제, 및 5-플루로오우라실(5-FU)과 같은 피리미딘 길항제; 알킬화제(시클로포스파미드); DNA 결합제(시스플라틴 또는 옥살리플라틴); 항-종양 항생제(독소루비신 또는 미토크산트론); 유사 분열 억제제(예를 들면, 빈크리스틴과 같은 미세소관 억제제 또는 타크산류) 또는 국소 이성화 효소 억제제(캄프토테칸 또는 탁솔). 더욱 구체적인 예들은 다음에 후술 된다.
본 발명의 방법에서 사용되는 호르몬 치료법은, 예를 들면 백혈병 및 골수종의 경우에는 코르티코스테로이드, 유방암의 경우에는 에스트로겐 및 항-에스트로겐, 전립선암의 경우에는 안드로겐 및 항-안드로겐을 포함한다.
생물학적 요법은 체내로부터 유래 되는 성분을 사용한다. 본 발명의 방법에 적합한 치료 요법의 예로는 항체(예를 들면, 항-EGFR 항체, 가령 세툭시마브 또는 트라츄주마브, 또는 항-VEGF 항체, 예를 들면 베바시주마브), T-세포 요법, 인터페론, 인터루킨 및 조혈 성장 인자를 포함한다.
골수 이식은 어떤 암들, 특히 백혈병을 치료하는 데 사용될 수 있다. 백혈병을 치료하기 위해서, 환자의 골수 세포를 화학 치료제 또는 방사 치료로 파괴한다. 세포 표면상의 HLA 항원과 일치되거나 거의 일치되는 공여자로부터 얻은 골수를 환자에게 유입한다. 골수 이식은 종양 세포를 죽이기 위해서 매우 높은 용량의 화학 치료 요법 또는 조사량을 필요로 하는 환자의 골수를 대체하는 데도 사용할 수 있다. 이식물은 공여자로부터 얻은 자원을 근거로 분류한다. 동종 이식물(allogeneic transplant)의 경우, 골수는 흔히 유전학적으로 관련되어 있지는 않지만 면역 시스템에 의해 인지되는 주 단백질인 6개의 세포 표면 항원 중 적어도 5개가 일치된다(HLA 항원). 자가 이식의 경우에는, 환자는 화학 치료 또는 조사 치료 직후에 이들의 골수를 수용한다. 골수 이식의 이러한 유형들은 통상의 치료 용량으로는 불완전한 효과를 보이는 비-골수 관련 암을 치료하는 데도 사용될 수 있다.
또한, 승인된 시험 또는 임상 시험의 일부인, 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 새로 등장하는 방법들을 분자 수준 및 세포 수준에서의 암에 대한 증가된 애해 및 상기 질환의 진행에 대한 증가된 이해를 기초로 하여 개발하고 있다. 인산화 캐스캐이드를 억제하는 단백질 키나제 억제제(소분자 및 항체 둘 다)를 사용할 수 있다(예를 들면, 에리오티니브 또는 이마티니브 메실레이트). 임의의 항전이제를 사용하여 암 세포가 퍼지고 새로운 조직을 공격하는 것을 차단할 수 있다. 항혈관신생제를 사용하여 종양을 성장시키는 혈관의 발달을 차단할 수 있다(예를 들면, 탈리도마이드). 사용될 수 있는 다른 제제는 안티센스 올리고뉴클레오티드로서, 이는 종양 세포의 증식을 일으키는 변이 단백질의 생성을 차단할 수 있다. 또한, 유전 치료법은 환자 내에 주입되어 특이적 종양 세포를 사멸하도록 디자인된 T 세포 내로 유전자를 도입하는 데 사용할 수 있다. 또한, 정상 p53 유전자를 변이 암 세포에 유입하여, 예를 들면 화학 치료 약물에 대한 감수성을 재확립함으로써 p53을 표적화할 수 있다.
한 가지 실시양태에 있어서, 본 발명의 조성물/제제는 생체활성제와 함께 사용한다. 통상적으로 사용되는 생체활성제는 항체, 증식 인자. 호르몬, 시토킨, 항-호르몬, 크산틴, 인터루킨, 인터페론, 세포 독성 약물 및 항혈관신생 단백질을 포함한다.
칼리케아미신 - 항-루이스 Y 항체 컨쥬게이트와 함께 사용될 수 있으며, 증식성 질환을 치료하는데 통상적으로 사용되는 생체활성 세포 독성 약물로는 안트라사이클린, 예를 들면 3일 이하로 복용하는 독소루비신, 다우노루비신, 이다루비신, 아다루비신, 조루비신, 미토크산트론, 에피루비신, 카루비신, 노갈락마이신, 메노가릴, 피타루비신, 및 발루비신; 피리미딘, 또는 퓨린 뉴클레오시드, 예를 들면 시타라빈, 겜시타빈, 트리플루리딘, 안시타빈, 에노시타빈, 아자시티딘, 독시플루리딘, 펜토스타틴, 브록스우리딘, 카페시타빈, 클라드리빈, 데시타빈, 플록스우리딘, 플루다라빈, 고게로틴, 퓨로마이신, 테가푸르: 알킬화제, 예를 들면 시클로포스파미드, 멜파란. 티오테파, 이포스파미드, 카무스틴, 시스플라틴, CKD-602, 레도크산트론, 루비테칸, 토포테칸 히드로클로라이드, LE-SN38, 알페레테칸 히드로클로라이드, XR-11576 및 XR-11612; 항 대사물, 예를 들면 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 테카푸르/우라실(UFT), 라리티트렉세드, 카페시타빈, 루코보린/UFT, S-1, 페메트렉세드 이나트륨, 테자시타빈, 트리메트렉세이트, 글루코로네이트, 티멕타신, 데시타빈; 항종양 항체, 예를 들면 에드레콜로마브, 미토마이신, 미토마이신 C 및 옥사리플라틴; 빈카 알카로이드, 예를 들면 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 안히드로빈블라스틴; 혈관신생 억제제, 예를 들면, 바타라니브 숙시네이트, 오글루파니드, RPI-4610; 신호 유도 억제제, 예를 들면 게피티니브, 317615.2 HCL, 인디술람, 라파티니브, 소라페니브, WHI-P131; 세포 괴사 유도제, 예를 들면 알보시디브 히드로클로라이드, 이로풀벤, 나트륨 페닐부티레이트, 보르테조미브, 엑시술린드, MS-2167; 에피포도필로톡신, 예를 들면 에토포시드; 및 타크산류, 예를 들면 파크리탁셀, 도셀타셀, DHA-파클리탁셀, 이크사베피론, 폴리글루타메이트 파클리탁셀, 또는 에포티론을 포함한다.
hu3S193-AcBut-CM 또는 CMD-193 또는 AG G193-AcBut-CM와 조합되어 투여될 수 있는 다른 화학 치료제/항종양신생제로는 아드리아마이신, 시스플라틴, 카르보플라틴, 시클로포스파미드, 다카르바진, 이포스파미드, 빈데신, 겜시타빈, 에다트렉세이트, 이리노테칸, 메클로에타민, 알트레타민, 카보플라틴, 테니포시드, 토포테칸, 겜시타빈, 티오테파. 플룩스우리딘(FUDR), MeCCNU, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 미토크산트론, 블레오마이신, 메클러로에타민, 프레드니손, 프로카르바진 메토트렉세이트, 플루오로우라실, 에토포시드, 탁솔 및 이의 다양한 아날로그, 미토마이신, 탈리도미드, 및 이의 다앙한 아날로그, GBC-590, 트로크사시타빈, ZYC-300, TAU, (R) 플루비프로펜, 히스타민 히드로클로라이드, 타리퀴달, 다바나트-1, ONT-093을 포함한다. 투여는 이들 하나 또는 그 이상의 치료제를 동시에 또는 선택해서 또는, 대안으로서 이들 치료제중 하나 또는 그 이상을 순차적으로 투여할 수 있다.
본 발명의 항체 컨쥬게이트와 함께 투여될 수 있는 생체활성 항체는 헤르셉틴(Herceptin), 제바린(Zevalin), 벡스아르(Bexxar), 캄패스(Campath), 세툭시마브, 베바시주마브, ABX-EGF, MDX-210, 퍼추마브, 트라스츄주마브, I-131 ch-TNT-1/b, hLM609, 6H9, CEA-Cide Y90, IMC-1C11, ING-1, 시브로츄주마브, TRAIL-R1 Mab, YMB-1003, 2C5, 기바렉스 및 MH-1을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
칼리케아미신 - 항-루이스 Y 항체 컨쥬게이트는 단독으로, 동시에, 또는 순차적으로 다른 생체활성 제제와 함께 투여될 수 있는데, 그러한 제제의 예로는 화학 치료 요법의 일부 성분로서 성장 인자, 시토킨, 스테로이드, 항체, 예를 들면 항-루이스 Y 항체, 리툭시마브 및 화학 치료제를 포함한다. 칼리케아미신 - 항-루이스 Y 항체 컨쥬게이트는 단독 투여되거나 또한 유도 치료 단계의 일부로서, 통합 요법 단계로서 및 유지 요법 단계로서 상술한 임의의 요법제와 병행하여, 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
본 발명의 컨쥬게이트는 재발된 공격성 암종을 치료하기 위하여 조합 화학 요법제의 일부로서 다른 생체활성 제제 및 화학 치료제와 함께 투여될 수 있다. 이러한 치료제는 다음을 포함한다: CAP (시클로포스파미드, 독소루비신, 시스플라틴), PV (시스플라틴, 빈블라스틴 또는 빈데신), CE (카르보플라틴, 에토포시드), EP (에토포시드, 시스플라틴), MVP (미토마이신, 빈블라스틴 또는 빈데신, 시스플라틴), PFL (시스플라틴, 5-플루오로우라실, 루코보린), IM (이포스파미드, 미토마이신), IE (이포스파미드, 에토포시드); IP (이포스파미드, 시스플라틴); MIP (미토마이신, 이포스파미드, 시스플라틴), ICE (이포스파미드, 카르보플라틴, 에토포시드); PIE (시스플라틴, 이포스파미드, 에토포시드); 비오렐빈 및 시스플라틴; 카르보플라틴 및 파클리탁셀; CAV (시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴), CAE (시클로포스파미드, 독소루비신, 에토포시드); CAVE (시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴, 에토포시드); EP (에토포시드, 시스플라틴); CMCcV (시클로포스파미드, 메토트렉세이트, 로무스틴, 빈크리스틴); CMF (시클로포스파미드, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실); CAF (시클로포스파미드, 독소루비신, 5-플루오로우라실); CEF (시클로포스파미드, 에피루비신, 5-플루오로우라실); CMFVP (시클로포스파미드, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 빈크리스틴, 프레드니손); AC (독소루비신, 시클로포스파미드); VAT (빈블라스틴, 독소루비신, 티오테파); VATH (빈블라스틴독소루비신, 티오테파, 플루오시메스테론); CDDP + VP-16 (시스플라틴, 에토포시드, 미토마이신 C + 빈블라스틴).
본 발명은 루이스 Y를 발현하는 세포를 특징으로 하는 증식성 질환을 앓거나 상기 증식성 질환을 앓을 위험에 있는 간 또는 동물 대상체를 치료하는 방법으로서, 유효량의 본 발명의 칼리케아미신-항-루이스 Y 항체를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 치료한다는 의미는 종양의 증식을 지연시키고 전이를 억제하는 것을 비롯하여, 억제, 예방, 또는 암이 느리게 성장한다는 것을 의미한다.
본 발명의 조성물/제제는 2차 단일요법으로 투여될 수 있다. 2차라 함은 다양한 항암 치료제로 치료한 후에 사용되는 것을 말한다. 이것의 예는 전술하였다. 대안으로서, 본 발명의 조성물 또는 제제는 전술한 다른 항암 치료제와 병용해서 투여할 수 있다.
본 발명의 인간화 항체 조성물은 다양한 방식으로 환자에게 투여될 수 있다. 조성물의 직접 전달은 주사, 피하내, 복강내, 정맥내, 근육내의 방법으로 수행되거나, 또는 조직의 근접치료 부위에 전달될 수 있다. 바람직하게는, 약학 조성물은 비경구적으로, 즉, 피하내로, 근육내로 또는 정맥내로 투여될 수 있다. 이 조성물은 병소에 투여될 수 있다. 투약 치료는 단회 투약 스케쥴 또는 다회 투약 스케쥴일 수 있다.
그러므로, 본 발명은 허용가능한 캐리어, 바람직하게는 수성 캐리어 중에 용해된 인간 단일클론 항체 또는 이의 칵테일의 용액을 함유한 비경구 투여용 조성물/제제를 제공한다. 예를 들면, 이 제제는 칼리케아미신-항-루이스 Y 항체 컨쥬게이트, 동결보호제, 계면 활성제, 완충제, 및 전해질로 이루어진다.
다양한 수성 캐리어가 사용될 수 있는데, 예를 들면, 물, 완충제수, 0.4% 염수, 0.3% 글리신 및 기타 등을 포함한다. 이들 용액은 멸균성으로 일반적으로 입자 덩어리가 유리된 재료이다. 이들 조성물은 통상의 잘 알려진 멸균 기법으로 멸균 처리될 수 있다. 본 조성물은 적절한 생리적 조건에 필요한 약학적 허용의 보조 성분을 포함하는데, 그러한 것들의 예로는 pH 조정 및 완충제, 독성 조정제 및 기타, 예를 들면, 초산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 젖산나트륨을 들 수 있다. 이들 제제 중에 존재하는 항체의 농도는 광범위하게 변화하는데, 예를 들면, 약 0.5% 미만, 일반적으로는 1%, 또는 적어도 1%로부터 15 또는 20 중량%까지 많은 양으로 변화하며, 이 양은 유체 부피 및 점도, 예를 들면, 선택되는 투여 모드에 따라 선택될 것이다.
조성물 중에 존재하는 활성 성분은 항-루이스 Y 항체-칼리케아미신 컨쥬게이트라는 것을 알 수 있을 것이다. 따라서, 위장관에서의 분해 작용을 겪게 될 것이다. 그러므로, 본 조성물이 위장관의 경로를 통하여 투여되는 경우, 본 조성물은, 분해 작용으로부터 단백질계 캐리어를 보호하지만 이것이 위장관에 일단 흡수된 이후에는 컨쥬게이트를 방출하는 제제를 함유할 것이다.
비경구 투여 조성물을 제조하는 실제적인 방법 및 대상체에게 투여하는 데 필요한 조정 방식들은 당 업계의 당업자에게 잘 알려져 있거나 당업자가 명확히 알 수 있으며, 이는 예를 들면, Remingtons Pharmaceutical Science, 15th Ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1980)에 기술되어 있는데, 이는 본원에 참고로 포함되었다. 약학적 허용 담체에 관한 심도 있는 고찰은 Remingtons Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991)에 개시되어 있다.
본 조성물은 환자에게 개별적으로 투여될 수 있거나 다른 제제, 약물 또는 호르몬과 병용하여 투여될 수 있다. 암과 같은 증식성 질환을 치료하는 데 사용되며 본 발명의 세포 독성 약물 유도체/캐리어 컨쥬게이트와 함께 사용될 수 있는 시토킨 및 성장 인자로는 인터페론, 인터루킨, 예를 들면 인터루킨 2 (IL-2), TNF, CSF, GM-CSF 및 G-CSF을 포함한다. 암과 같은 증식성 질환을 치료하는 데 일반적으로 사용되며, 본 발명의 세포 독성 약물 유도체/캐리어 컨쥬게이트와 함께 사용될 수 있는 호르몬은 에스트로겐(디에틸스틸베스트롤, 에스트라디올), 안드로겐(테스토스테론, 할로테스틴), 프로게스틴(메가스, 프로베라), 및 코르티코스테로이드(프레드니손, 덱사메타손, 히드로코르티손)을 포함한다. 항호르몬, 예를 들면 항에스트로겐(타목시펜), 항안드로겐(플루타미드) 및 항아드레날 제제는 일반적으로 암과 같은 증식성 질환을 치료하는 데 사용되며, 이는 본 발명의 세포 독성 약물 유도체/캐리어 컨쥬게이트와 함께 사용될 수 있다.
또한, 암과 같은 증식성 질환을 치료하는 데 일반적으로 사용되며 본 발명의 세포 독성 약물 유도체/캐리어 컨쥬게이트와 함께 사용될 수 있는 화학요법제/항종양 신생제로는 아드리아마이신, 시스플라틴, 카르보플라틴, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 블레오마이신, 메토트렉세이트, 독소루비신, 플루오로우라실, 에토포시드, 탁솔 및 이의 다양한 아날로그, 미토마이신, 탈리도미드 및 이의 다양한 유사체가 있지만, 이에 한정되지 않는다.
약학적 조성물/제제는 본 발명의 치료 유효량의 컨쥬게이트를 함유하고 있는 것이 바람직하다. 본원에 사용되는 치료 유효량이란 용어는 표적화하는 질환 또는 상태를 치료, 개선, 또는 예방하거나 또는 검출 가능한 치료 또는 예방 효과를 나타내는 데 필요한 치료제의 양을 말한다. 임의의 컨쥬게이트 경우, 치료 유효량은 세포 배양 분석이나 또는 동물 모델에서, 일반적으로는 설취류, 토끼, 개, 돼지 또는 영장류에서 초기에 예상할 수 있다. 동물 모델을 사용하여 투여의 적합한 농도 범위와 투여 경로를 결정할 수 있다. 이후 이러한 정보를 사용하여 유용한 용량 및 인간의 투여 경로를 결정할 수 있다.
인간 대상체에 사용되는 정확한 유효량은 질환 상태의 특성과 심각성, 대상체의 일반적인 건강 상태, 나이, 체중, 및 성별, 식사, 투여 시간 및 투여 횟수, 약물 조합, 반응 민감도, 및 요법에 대한 내성/응답 반응에 따라 다르다. 현재의 상태를 치료하기 위해서 컨쥬게이트를 예방적으로 사용되는 경우, 이것은 유효량에 영향을 미친다. 이 양은 일상적인 실험에 의해 결정될 수 있는데, 이는 임상의의 판단 범위 내에 있다. 일반적으로, 유효량은 단백질계 캐리어를 기준으로 계산할 때 0.01 mg/m2 내지 50 mg/m2, 바람직하게는 0.1 mg/m2 내지 20 mg/m2, 더욱 바람직하게는 약 10-15 mg/m2이다.
투여 용량의 횟수는 컨쥬게이트의 반감기 및 이의 지속 효과에 따라 다르다. 컨쥬게이트의 반감기가 짧은 경우(예를 들면 2 시간 내지 10시간), 하루에 1회 이상의 투여 용량으로 투여하는 것이 필요할 수 있다. 대안으로서, 컨쥬게이트 분자의 반감기가 긴 경우(예를 들면 2일 내지 15일), 이것은 하루에 1 회의 용량을 투여하거나 매 1주일마다 1회 투여하거나 또는 매 1달 또는 2달 마다 심지어 1회 투여하는 것이 필요할 수도 있다.
조성물은 항체 컨쥬게이트를 투여하는데 필요한 약학적 허용가능한 캐리어를 함유한다. 약학적 캐리어는 환자에게 단일 클론 항체를 전달하는데 적합한 상용성의 비-독성 성분일 수 있다. 멸균수, 알코올, 유지, 왁스, 및 불활성 고형분을 캐리어 중에 포함시킬 수도 있다. 캐리어 그 자체는 조성물을 투여받는 개체에게 해로운 항체의 생산 자체를 유도해서는 안 되며 또한 독성이 있어서도 안 된다. 적합한 캐리어는, 서서히 많은 양을 대사하는 거대 분자, 예를 들면 단백질, 폴리펩티드, 리포좀, 폴리사카라이드, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합성 아미노산, 아미노산 공중합체 및 불활성 바이러스 입자일 수 있다. 약학적으로 허용되는 어쥬반트(완충제, 분산제)를 약학 조성물 내로 혼입할 수 있다.
약학적 허용 염은, 예를 들면, 광산 염, 예를 들면 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 포스페이트 및 설페이트, 또는 유기산 염, 예를 들면 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 및 벤조에이트를 사용할 수 있다.
치료 조성물/제제 중의 약학적 허용 담체는 액체, 예를 들면, 물, 염수, 글리콜, 및 에탄올을 부가적으로 포함할 수 있다. 보조 성분, 예를 들면 습윤제, 또는 유화제 또는 pH 완충제 성분들이 상기 조성물 중에 존재할 수 있다. 이러한 캐리어는 환자에게 소화가 잘되도록 하기 위해 정제, 환제, 당의정, 캅셀제, 액제, 겔, 시럽, 슬러리 및 현탁제로 제형화될 수 있다.
투여의 바람직한 형태는 비경구 투여에 적합한 형태, 예를 들면 주사 또는 주입, 예컨대 일시 주사 또는 연속 주입을 포함한다. 생성물이 주사용 또는 주입용인 경우에, 이것은 유성 매질 또는 수성 매질중의 현탁제, 용제, 또는 유화제 형태를 취할 수 있으며, 또한 제형화 제제, 예를 들면 현탁제, 방부제, 안정화제 및/또는 분산화제를 포함할 수도 있다.
완충제가 첨가된 컨쥬게이트 용액의 안정성은 짧은 시간에 적합할 뿐, 장기간의 안정성은 불량하다. 컨쥬게이트의 안정성을 향상시키고 또한 이의 반감기를 증가시키기 위해, 항체-약물 컨쥬게이트를 동결건조하여 건조형으로 만든 후 사용 전에 적당한 멸균 액체로 재구성하도록 한다. 단백질 용액의 동결건조화와 관련된 문제점은 문헌에 잘 나타나 있다. 2차, 3차, 및 4차 구조의 파괴는 동결 및 건조 과정에서 일어날 수 있다. 컨쥬게이트를 동결보호제, 계면 활성제, 완충제 및 전해질과 용액중에서 접촉하고, 이 용액을 동결건조시키면, 이들 조성물/제제중의 생물학적 활성이 보전될 수 있다. 동결보호제(lyoprotectant)를 이 용액에 첨가할 수 있다.
안정한 제제란 보관시에도 제제 내에서 항체가 물리적 및 화학적 안정성과 이의 특성을 그대로 유지하는 제제이다. 항체 안정성을 측정하는 다양한 분석 기술이 당 분야에 사용되고 있으며, 이는 Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) 및 Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993)에서 검토된 바 있다. 안정성은 선택된 시간동안 선택된 온도에서 측정할 수 있다. 빠른 스크리닝을 위해서는, 제제는 2주에서 1개월 동안 40℃로 유지하고 이 시점에서 안정성을 측정한다. 제제가 2-8℃에서 유지되는 경우, 일반적으로 제제는 적어도 1달간은 30℃ 또는 40℃에서 안정해야 하며 및/또는 적어도 2년간은 2-8℃에서 안정하여야 한다. 제제가 30℃에서 보관되는 경우, 일반적으로 제제는 30℃에서 최소한 2년간 및/또는 적어도 6개월간은 40℃에서 안정해야 한다. 동결건조 및 보관 후에 일어나는 응집의 정도는 항체 안정성의 지시 척도로 사용될 수 있다. 예를 들면, 안정한 제제는 약 10% 미만의 항체 및 바람직하게는 약 5% 미만의 항체가 제제중에서 응집 상태로 존재하는 제제이다. 다른 실시양태에 있어서, 동결건조한 제제의 동결건조 및 보관 후에 응집체 형성의 증가가 일어나는 지를 측정할 수 있다. 예를 들면, 안정화 동결건조한 제제는 동결건조 처리된 제제 중에 응집체가 적어도 1년간 2-8℃에 보관시에 약 5% 미만, 바람직하게는 약 3% 미만으로 존재하는 제제이다. 또한, 항체 제형화의 안정도는 생물학적 활성 분석을 사용하여 측정될 수 있다.
동결보호제는 컨쥬게이트의 비결정질 안정화제로서 작용하여 동결건조 과정 동안에 단백질이 구조적 특성을 유지하도록 하기 위해서 포함될 수 있다. 한 실시양태에 있어서, 본 발명의 동결보호제는 당 알코올, 예를 들면, 알디톨, 만니톨, 소르비톨, 이노시톨, 폴리에틸렌 글리콜 및 이의 조합물이다. 다른 실시양태에 있어서, 동결보호제는 당 산으로서 알도닌산, 유론산, 및 이의 조합물을 포함한다.
본 발명의 동결보호제는 탄수화물일 수 있다. 적당한 탄수화물는 알데하이드 또는 케톤 화합물로서 두 개 이상의 히드록실 기를 함유한다. 탄수화물는, 예를 들면, 알도즈, 케톤, 아미노 당, 알디톨, 이노시톨, 알돈산, 유론산, 또는 알다린산, 또는 이의 조합물을 포함한다. 탄수화물는 또한 모노-. 디- 또는 폴리- 탄수화물로서, 예를 들면, 디사카라이드 또는 폴리사카라이드일 수 있다. 적당한 탄수화물은 예를 들면, 글리세르알데하이드, 아라비노즈, 라이코즈, 펜토즈, 리보즈, 자일로즈, 갈락토즈, 글루코즈, 헥소즈, 아이도즈, 만노즈, 탈로즈, 헵토즈, 글루코즈, 푸락토즈, 글루콘산, 소르비톨, 락토즈, 만니톨, 메틸-α 글루코피라노시드, 말토즈, 이소아스코르빈산, 아스코르빈산, 락톤, 소르보즈, 글루카린산, 에리트레오즈, 트레오즈, 아라비노즈, 알로즈, 알트로즈, 글루코즈, 이도오즈, 탈로즈, 에리트루로즈, 리불로즈, 자실루로즈, 피시코즈, 타가토즈, 글루쿠론산, 글루콘산, 글루카린산, 갈락트론산, 만누론산, 글루코자민, 갈락토자민, 슈크로스, 트레할로스, 또는 뉴라민산, 또는 이의 유도체를 포함한다. 적합한 폴리카르보하이트레이트는, 예로서 아라비노즈, 푸락탄즈, 푸칸즈, 갈락탄즈, 갈락투로난즈, 글루칸즈, 자실란스(예를 들면, 이눌린), 레반, 푸코이단, 카라기난, 갈락토카로로즈, 펙틴, 펙틴산, 아밀로즈, 풀루란, 글리코겐, 아밀로펙틴, 셀룰로즈, 덱스트란, 푸수투란, 키틴, 아가로즈, 케라틴, 콘드로이틴, 덜마탄, 히아루론산, 알긴산, 크산틴 검, 또는 전분이다. 특히 유용한 탄수화물는 슈크로스, 글루코즈, 락토즈, 트레할로스, 및 이의 조합물이다. 슈크로스가 특히 유용한 동결보호제가다.
바람직하게는, 본 발명의 동결보호제는 탄수화물 또는 당 알코올로서, 이는 다가 알코올일 수 있다. 다가 화합물은 하나 이상의 히드록실 기를 함유한다. 바람직하게는, 다가 화합물은 직쇄이다. 적합한 다가 화합물은, 예를 들면, 에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 및 폴리프로필렌 글리콜 또는 펜타에리트리톨 또는 이의 조합물이다. 일부 바람직한 실시양태에 있어서, 동결보호제는 슈크로스, 트레할로스, 만니톨, 또는 소르비톨이다. 다른 실시양태에 있어서, 동결보호제는 약 5%의 농도의 슈크로스인 것이 바람직하다.
사전에 동결건조 처리한 제제에 계면 활성화제를 첨가하는 것이 바람직한 것으로 밝혀져 왔다. 대안으로서, 또는 또한, 계면 활성제를 동결건조 제제에 첨가하거나 및/또는 재구성된 제제에 첨가할 수 있다. 이러한 계면 활성제의 예로는 비 이온성 계면 활성제로서, 예를 들면 폴리소르베이트(예컨대, 폴리소르베이트 20 또는 80); 폴록사머 (예컨대, 폴록사머 188); 트리톤; 나트륨 도데실 설페이트(SDS); 나트륨 라우렐 설페이트; 나트륨 옥틸 글리코시드; 라우릴-, 미리스티릴-, 리놀레일-, 또는 스테아릴-설포베타인; 라우릴-, 미리스티릴-, 리놀레일-, 또는 스테아릴-사르코신; 리놀레일-, 미리스틸-, 또는 세틸-베타인; 라우로아미도프로필-, 코카미도프로필-, 리놀레아미도프로필-, 미리스타미도프로필-, 팔미도프로필-, 또는 이소스테아라미도프로필-베타인(예를 들면, 라우로아미도프로필); 미리스트아미도프로필-, 팔미도프로필, 또는 이소스테아라미도프로필-디메틸아민; 나트륨 메틸 코코일-, 또는 이나트륨 메틸 올레일-타우레이트; 및 MONAQUAT™ 시리즈(Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.), 폴리에틸 글리콜, 폴리프로필 글리콜, 및 에틸렌 및 프로필렌 글리콜의 공중합체(예를 들면, Pluronics 또는 PF68), 및 트윈 80을 포함한다. 한 가지 실시양태에 있어서, 계면 활성제는 약 0.005 중량% 내지 약 0.05 중량%의 농도로 존재한다. 바람직한 실시양태에 있어서, 계면 활성제는 0.01 중량% 농도의 폴리소르베이트 80 또는 약 0.01 중량% 농도의 트윈 80이다.
재구성된 제제는 항체가 재구성 제제 중에 분산될 정도로 동결건조 항체 제제를 희석제 중에서 용해시켜 제조한 제제이다. 대상 항체로 치료되는 환자 투여용(예를 들면, 비 경구 투여)으로 적합한 재구성 제제는 본 발명의 한 실시양태에 있어서, 피하 투여용으로 적합한 제제이다.
등장성이란 의미는 대상 제제가 인간의 혈액과 실질적으로 동일한 삼투압을 지닌다는 것을 의미한다. 등장성 제제는 일반적으로 약 250 내지 350 mOsm의 삼투압을 지닌다. 등장성은 예를 들면, 얼음에 의해 동결되는 삼투압기 또는 증기압을 사용하여 측정될 수 있다.
동결보호제를 사전에 동결건조한 제제 중에 첨가할 수 있다. 동결보호제는 대상 항체와 결합 되었을 때, 동결건조 및 이후의 보관시 대상 항체의 화학적 및/또는 물리적 불안정성을 크게 예방하거나 또는 감소시키는 분자이다. 동결보호제는 당, 예를 들면 슈크로스 또는 트레할로스; 아미노산, 예를 들면 글루탐산 일나트륨 또는 히스티딘; 메틸아민, 예를 들면 베타인; 황산 마그네슘과 같은 동결 친화성 염(Iyotropic); 예를 들면 황산 마그네슘; 폴리올, 예를 들면 삼가 또는 이보다 알코올이가 높은 당 알코올, 예를 들면, 글리세린, 에리트리톨, 글리세롤, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨, 및 만니톨; 폴리프로필렌 글리콜; 폴리에틸렌 글리콜; 플루로닉스; 및 이의 조합물이다. 바람직한 동결보호제는 비환원성 당, 예를 들면 트레할로스 또는 슈크로스이다.
바람직한 실시양태에 있어서, 동결보호제는 비환원성 당, 예를 들면 트레할로스 또는 슈크로스이다. 사전에 동결건조한 제제 중에 존재하는 동결보호제의 양은 일반적으로, 재구성시에, 생성된 제제가 등장성일 정도인 양이다. 하지만, 고장성 재구성 제제 또한 적합하게 사용될 수 있다. 또한, 동결보호제의 양이 동결건조시에 허용하지 않는 수준의 항체의 응집과 분해가 일어날 정도로 너무 낮아서는 안 된다. 동결보호제가 당(예를 들면 슈크로스 또는 트레할로스)인 경우에, 예를 들면 제제 중에 존재하는 동결보호제의 농도는 약 10mM 내지 약 400mM이며, 바람직하게는 약 30mM 내지 약 300mM, 가장 바람직하게는 약 50mM 내지 약 100mM이다. 항체:동결보호제의 비는 각 항체 및 동결보호제 조합에 따라 선택된다. 당인 경우에 있어서(예를 들면, 슈크로스 또는 트레할로스), 고농도의 항체를 지닌 등장성 재구성 제제를 생성하기 위해 동결보호제를 사용할 때, 동결보호제:항체의 비는 약 100 내지 약 1500 몰의 동결보호제:1 몰의 항체, 및 바람직하게는 약 200 내지 약 1000 몰의 동결보호제:1 몰의 항체, 더욱 바람직하게는, 약 200 내지 약 600 몰의 동결보호제:1 몰의 항체이다.
동결보호제는 동결을 보호하는 양으로 사전에 동결건조한 제제 중에 첨가되는데, 이는 동결보호제의 동결 보호 양 존재하에 항체를 동결건조한 후 항체가 동결건조 및 보관시에 그의 물리적 및 화학적 안정성과 특성을 보유하는 것을 말한다.
본원에 사용되는 대상 희석제는 약학적으로 허용되는 희석제로서(사람에게 투여시 안정하며 비 독성임) 재구성된 제제를 제조하는 데에 유용하게 사용된다. 희석제의 예로는 멸균수, 주사용 정균 작용수(BWFI), pH 완충 용액(예를 들면, 인산염 완충 식염수), 멸균성 염수 용액, 링거 용액 또는 덱스트로즈 용액을 포함한다.
방부제는 재구성된 제제 중에서의 세균 작용을 실질적으로 감소시키기 위해 첨가될 수 있는 화합물로서, 다수회 사용할 수 있는 재구성 제제의 생산을 용이하게 한다. 방부제로서 사용가능한 예로는 염화 옥타데실디메틸벤질 암모늄, 염화 헥사메토늄, 염화 벤즈알코늄(알킬기가 장쇄 화합물인 경우에 염화 알킬벤질디메틸암모늄) 및 염화벤제토늄을 포함한다. 다른 타입의 방부제로는 방향족 알코올, 예를 들면, 페놀, 부틸, 및 벤질 알코올, 알릴 파라벤, 예를 들면 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레조르시놀, 시클로헥사놀, 3-펜타놀, 및 m-크레졸을 포함한다. 본원에서 가장 바람직한 방부제는 벤질 알코올이다.
증량제는 덩어리를 동결건조한 혼합물에 첨가함으로써 동결건조한 케이크의 물리적 구조에 기여하는 화합물이다(예를 들면, 개방된 세공 구조를 유지하는 실질적으로 균일한 동결건조한 케이크의 생산을 용이하게 한다). 증량제의 예로는 만니톨, 글리신, 폴리에틸렌 및 소르비톨이다.
일부 경우에 있어서. 동결보호제(예를 들면 슈크로스 또는 트레할로스)와 증량제(예를 들면, 만니톨 또는 글리신)와의 혼합물은 사전에 동결건조한 제형의 제조에 사용된다. 이 증량제는 그 안에 과도한 포켓을 형성하지 않고서도 균일하게 동결건조한 케이크의 생산을 가능하게 한다. 그러므로, 증량제는 동결건조 하기 전에 첨가될 수 있다. 적합한 증량제는 약 0.5 중량% 내지 약 1.5 중량%의 농도를 지닐 수 있다. 증량제는 0.9 중량% 농도의 덱스트란 40 또는 0.9 중량% 농도의 히드록시에틸 전분 40이다.
예를 들면 문헌[Remingtons Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 기술된 것과 같은 다른 약학적 허용 담체, 부형제, 또는 안정화제는 제형의 바람직한 특성에 해로운 영향을 미치지 않는 것을 조건으로 하여 사전동결화 제제(및/또는 동결건조한 제형 및/또는 재구성된 제형)중에 포함될 수 있다. 허용가능한 캐리어, 부형제 또는 안정화제는 사용된 복용량과 농도하에서 수혜자에게 비독성이며, 완충제; 방부제; 공용매; 아스코르빈산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 킬레이트제, 예를 들면 EDTA; 금속 착체(예를 들면, Zn-항체 착체); 생분해성 중합체, 예를 들면 폴리에스테르; 및/또는 염 형성 반대이온, 예를 들면 나트륨이다.
생체 투여에 적합하게 사용되는 제제는 멸균성이어야 한다. 이는 동결건조 및 재구성 전, 후에 멸균 여과막을 통과시키는 여과 과정에 의해 쉽게 이루어진다. 대안으로서, 전체 혼합물의 멸균은 예를 들면, 약 120℃에서 약 30분간 항체를 제외한 성분들을 오토클래브 함으로써 이루어질 수 있다.
대상 항체를 제조한 후, 사전 동결건조한 제제를 생산한다. 사전 동결건조한 제제 중에 존재하는 항체의 양은 소정의 용량 부피, 투여 방식을 고려하여 결정된다. 항체는 일반적으로 용액 중에 존재한다. 예를 들면, 항체는 pH-완충 용액 중에 존재할 수 있다. 완충제의 예로는 히스티딘, 포스페이트, 트리스, 시트레이트, 숙시네이트 및 기타 유기산을 포함한다. 한 가지 실시양태에 있어서, 컨쥬게이트는 약 0.5 mg/㎖ 내지 약 2 mg/㎖, 바람직하게는 1 mg/㎖의 농도로 존재한다. 한 가지 실시양태에 있어서, 완충제는 약 5 mM 내지 약50 mM의 농도로 존재한다. 바람직한 실시양태에 있어서, 완충제는 약 20mM의 농도로 존재하는 트리스가다. 동결건조를 수행하기 전에, pH는 임의의 적합한 pH, 예를 들면, 약 7.8 내지 약 8.2일 수 있으며, 바람직하게는 약 8.0일 수 있다.
본 제제의 다른 실시양태에 있어서 전해질은 약 5 mM 내지 약 100 mM의 농도 범위에 있다. 임의의 적합한 전해질이 사용될 수 있는데, 예를 들면 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 클로라이드, 포스페이트, 및 중탄산염이 사용될 수 있다. 전해질은 바람직하게는 나트륨 염 또는 칼륨 염이며, 더욱 바람직하게는 전해질은 약 10mM 농도의 NaCl이다.
대상 항체를 제조한 후에, 동결보호제 및 다른 임의의 성분을 함께 혼합하고, 제제를 동결-건조(freeze-drying)한다. 이러한 목적에 많은 다양한 동결-건조기를 사용할 수 있는데, 예를 들면 Hull50.TM.(Hull, USA) 또는 GT20.TM.(Leybold-Heraeus, Germany) 동결-건조기이다. 동결-건조는 제제를 동결한 후 동결된 성분 으로부터 얼음을 일차 건조에 적합한 온도로 승화시킨다. 이 조건하에서, 생성물 온도는 제제의 공융 온도 또는 붕괴 온도 아래로 유지된다. 일반적으로, 1차 건조의 보관 온도는 약 50 내지 약 250m Torr 범위의 적합한 압력하에서 약 -30℃ 내지 25℃ 이다(1차 건조시에 생성물이 동결되어 있을 것을 조건으로 한다). 제제, 시료를 담는 용기의 크기 및 유형(예를 들면, 유리 바이알) 및 액체의 부피는 건조에 필요한 시간을 주로 따르는데, 이는 수 시간에서 수 일의 범위일 수 있다(예를 들면, 40-60 시간). 2차 건조 단계는 사용된 항체의 타입과, 용기의 크기 및 타입에 따라, 약 0 내지 40℃에서 수행될 수 있다. 하지만, 2차 건조 단계가 꼭 필요하지는 않다는 것이 밝혀졌다. 예를 들면, 동결건조(lyophilization)에서 전체적으로 물이 제거되는 동안의 보관 온도는 약 15 내지 30℃일 수 있다(예를 들면, 약 20°C). 2차 건조에 필요한 시간 및 압력은 온도와 다른 파라미터에 따라 적당한 동결건조 케이크를 생산하는 것이다. 2차 건조 시간은 생성물 중에서 소정의 잔류 수분의 수준에 따르는데 이는 일반적으로 적어도 약 5시간이 걸린다(예를 들면, 10-15 시간). 압력은 1차 건조 단계 중에 사용되는 것과 동일한 압력일 수 있다. 동결-건조 조건은 제제 및 바이알의 크기에 따라 변화할 수 있다.
본 발명의 동결건조는 용액을 -35℃ 내지 약 -50℃의 온도하에서 용액을 동결하고; 보관 온도 약 -10℃ 내지 약 -40℃에서 24 시간 내지 78 시간 동안 1차 건조 압력 20 내지 80 마이크론 하에서 동결 용액을 1차 건조하고; 약 +10° 내지 +30℃의 보관 온도에서 15 시간 내지 30 시간 동안 2차 건조압력 20 내지 80 마이크론하에서 동결-건조된 생성물을 2차로 건조하는 것을 포함한다. 동결은 -45℃에서 수행될 수 있는데, 이때 1차 건조 단계는 건조 압력이 60 마이크론이고 보관 온도는 -30℃이며 60 시간 동안 수행되며, 2차 건조 단계는 건조 압력이 60 마이크론이고 보관 온도가 +25℃에서 24 시간 동안 수행될 수 있다.
항체 제제를 동결건조하는 것이 바람직할 수 있는 것은 이전(移轉) 단계를 회피하기 위해서 항체 재구성을 수행될 것이기 때문이다. 이러한 경우에서 용기는, 예를 들면 3, 5, 10, 20, 50 또는 100cc의 바이알이다.
일반적인 제안으로서, 동결건조 과정은 약 5%^ 미만의 수분 함량, 바람직하게는 약 3% 미만의 수분 함량을 지닌 동결건조 제제를 생산할 것이다.
바람직한 단계에서, 일반적으로 항체를 환자에게 투여하는 시점에서, 재구성된 제제의 항체 농도가 적어도 50 mg/㎖, 예를 들면, 약 50 mg/㎖ 내지 약 400 mg/㎖, 더욱 바람직하게는 약 80 mg/㎖ 내지 약 300 mg/㎖, 및 가장 바람직하게는 약 90 mg/㎖ 내지 약 150 mg/㎖의 범위에 있도록 희석제로 동결건조 제제를 재구성할 수 있다. 이러한 재구성 제제 중에 존재하는 항체의 높은 농도는 재구성된 제제가 피하 전달을 의도하는 경우에 특히 유용한 것으로 생각된다. 그러나, 다른 경로의 투여용 제제인 경우에, 예를 들면, 정맥 내 투여인 경우에는, 재구성된 제제의 항체의 농도는 낮은 것이 바람직하다(예를 들면, 재구성된 제제 중의 약 5 내지 50 mg/㎖, 또는 약 10-40 mg/㎖ 농도의 항체). 어떤 실시양태에 있어서, 재구성된 항체 농도는 사전 동결건조한 제제의 농도보다 훨씬 높다. 예를 들면, 재구성된 제제 중의 항체 농도는 사전 동결건조한 제제의 농도보다 약 2 내지 40배, 바람직하게는 3 내지 10배, 가장 바람직하게는 3 내지 6배(예를 들면, 적어도 3배 또는 적어도 4배)로 존재한다.
일반적으로 재구성 과정은 다른 온도가 사용될 수 있긴 하지만, 약 25℃의 온도에서 재구성이 일어나 완전한 수화 작용이 보장한다. 재구성에 요구되는 시간은, 예를 들면, 희석제의 타입, 부형제 및 항체의 양에 좌우된다. 희석제의 예로는 멸균수, 주사용 정균 작용수(BWFI), pH 완충 용액(예를 들면, 인산염 완충 식염수), 멸균성 염수 용액, 링거 용액 또는 덱스트로즈 용액을 포함한다. 희석제는 임의적으로 방부제를 함유한다. 방부제의 예는 전술한 바와 같은데, 방향족 알코올, 예컨대 벤질 또는 페놀 알코올이 바람직한 방부제이다. 사용된 방부제의 양은 항체와 상용되는 다양한 방부제 농도를 평가하는 것과 방부제의 효능을 테스트하는 것에 의해 결정된다. 예를 들면, 방부제가 방향족 알코올인 경우(예컨대 벤질 알코올), 이는 약 0.1% 내지 2.0%, 바람직하게는 0.5% 내지 1.5%, 가장 바람직하게는 약 1.0% 내지 1.2%의 양으로 존재할 수 있다. 바람직하게는, 재구성된 제제는 바이알 당 6000 미만의 입자를 가지는데, 이는 >10㎛ 인 크기이다.
재구성된 제제는 항체 치료가 필요한 인간에게 투여되는데, 투여는 공지된 방법, 예컨대 일시 주사로서 또는 시간 경과에 따른 연속 주입으로서 정맥 투여, 근육내, 복강내, 내척수내, 피하, 관절내, 윤활막내, 수막 공간내, 경구, 국소 또는 흡입 경로에 따른다.
본 발명의 동결건조한 제제를 포함하는 제품이 제공되며, 이는 재구성 및/또는 사용을 위한 지침서가 제공된다. 이 제품 또는 키트는 (i) 본 발명의 조성물/제제를 담는 용기; 및 (ii) 동결건조한 제제를 희석제로 재구성할 때 컨쥬게이트의 농도가 0.5 mg/㎖ 내지 5 mg/㎖의 범위 내로 제제중에서 유지되도록 지시하는 지침서를 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들면, 병, 바이알(예를 들면, 두 개의 챔버가 있는 바이알), 시린지(예컨대 두 개의 챔버가 있는 시린지) 및 테스트 튜브를 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로부터 성형될 수 있다. 용기는 동결건조한 제제와 그 용기 상에 또는 용기와 관련한 표지를 가지고 있으며, 그 용기는 재구성 및/또는 사용하기 위한 지시서를 지닐 수 있다. 예를 들면, 표지는 동결건조한 제제가 상술한 항체 농도로 재구성되도록 지시한 내용을 담고 있을 수 있다. 표지는 제제가 피하 투여용으로 유용하게 사용하라거나 그러한 목적에 사용하라는 지시를 담고 있을 수 있다. 제제를 담고 있는 용기는 다수회 사용할 수 있는 바이알 일 수 있으며, 이는 재구성된 제제의 반복적인 투여를 가능케 한다(예를 들면, 2-6회의 투여). 제품은 또한 적합한 희석제(예를 들면, BWFI)를 함유하는 제2의 용기를 더 포함할 수 있다. 희석제와 동결건조한 제제를 혼합하는 경우에, 재구성된 제제 중의 최종 항체 농도는 일반적으로 적어도 50mg/㎖일 것이다. 제품은 또한 상업적 관점 및 사용자 관점에서 바람직한 기타 다른 물질들을 포함하는데, 그러한 것으로는 다른 완충제, 희석제, 필터, 니들, 시린지, 및 사용 지침서가 들어있는 포장 삽입물을 포함한다.
일단 제형화한 후에는, 본 발명의 조성물은 대상체 에게 직접 투여될 수 있다. 치료 대상체는 동물 일 수 있다. 하지만, 조성물은 인간 대상체에게 투여되는 것이 적합하다.
본 발명의 조성물은, 제한하는 것은 아니지만, 경구, 정맥내, 근육내. 관절내, 골수강내, 수막 공간내, 심실내, 경피(transdermal), 경피(transcutaneous)(참조: PCT 공개 공보 WO98/20734), 피하, 복강내, 비내, 장피, 국소, 설하, 질내 또는 직장 경로로 투여된다. 괴하 분사기(hypospray) 또한 본 발명의 조성물을 투여하는 데 사용될 수 있다. 일반적으로, 본 조성물은 액체 용제 또는 현탁제와 같이 주사 가능한 형태로 제조될 수 있다. 주사하기 전에 액체 매질 중에, 용액 중에, 현탁제 중에 존재하는 것으로 적합한 고형제를 제조할 수도 있다.
실시예
일반 재료 및 방법
암종 세포
표면상에 루이스 Y 항원의 수준을 가변적으로 발현하는 인간의 암종 세포주가 선택되었다. 이들은 루이스 Y 항원(L2987 폐암종, N87 위암종, A431/LeY 편평세포 (표피) 암종, AGS 결장암종, 및 LS174T 결장암종)의 높은 발현을 지닌 세포주, 루이스 Y 항원(LOVO 결장암종 및 LNCaP 전립선암종)을 낮게 발현하는 세포주, 및 루이스 Y 항원(PC3MM2 전립선암종, 및 A431 표피암종)을 적게 또는 전혀 발현하지 않는 세포주를 포함하였다. 사용된 암종 세포주의 루이스 Y 발현 상태는 유동 세포 계수로 확인하였다. 사용된 세포주의 예는 다음과 같다:
DLD-1 (CCL-221), HCT8S11, HCT8S11/R1 및 LOVO(CCL-229)는 세포 막상의 Ley 항원을 표시하는 결장암종 세포주이다.
NCI-H157(CRL-5802), NCI-H358(CRL-5807) 및 A549(CCL-159)는 폐암종 세포 암종 세포주이다. 이들 세 가지 세포주 중에서, NCI-H358은 세포 표면상에 Ley 의 검출가능한 수준을 나타내었다.
두 가지 위암종 N87(CRL-5822) 및 AGS(CRL-1739)는 Ley을 발현한다
A431(CRL-1555) 및 M31/Ley는 표피(자궁 경부) 암종 세포이다. 후자의 변이체만이 Ley를 발현한다.
MDA-MB435(Ley -) 및 MDA-MB-361(Ley+)를 사용하여 유방 암종 세포의 모델로서 사용하였다.
PC3-MM2(Ley -) 및 LNCaP(Ley +, CRL-1740)는 전립선암종 으로부터 유래되었다.
HCT8S11, HCT8S11/R1, MDA-MB435, PC3-MM2 및 A431/Ley를 제외하고 모든 세포주들은 미국 타입의 배양 수집소(ATCC)에서 얻었다. ATCC에서 얻은 세포주들을 ATCC 카탈로그에서 구체적으로 제시한 것처럼 배양 배지 중에 유지하였다. HCT8S11 및 HCT8S11/R1은 Dr. M. Mareel (University Hospital, Ghent, Belgium)로부터 선물받았다. 이들 세포는 10% v/v 소의 태 혈청(FBS), 1 mM의 피루브산 나트륨, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 100U/㎖ 페니실린(후술되는 곳에서 pen/strep이라 함)으로 보충된 RPMI 1640 에서 증식되었다. MDA-MB435 및 PC3-MM2는 Dr.I. Fidler(MD Anderson, TX)으로부터 얻었다. 10% v/v FBS, 2 mM 글루타민, 1 mM 피루브산 나트륨, 0.2 mM 비필수 아미노산, 2% MEM 비타민 용액, 및 pen/strep으로 보충된 최소 필수 배지에서 이들 세포를 배양하였다. A431/Ley는 루드비그 인수티튜트 포어 캔서 리서치(Melbourne, Australia)에서 얻었다. 10% FBS, 2 mM 글루타민 및 pen/strep로 보충된 DMEM/F12중에서 배양하였다.
항체
RITUXAN ®(리툭시마브; IDEC 파마슈티칼 코오포레이숀 및 제넨텍, San Diego, San Francisco, CA)는 마우스의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 인간 IgG1k 고정 영역과 연결하는 키메릭 항체이다. 이 항체는 B-임파구 마커 CD20을 인식한다. FACS-분석의 경우, 인간 IgG(hulgG, Zymed, San Francisco, CA) 및 FITC-표지된 염소의 항-hulgG(FITC/a-hulgG, Zymed, San Francisco, CA)를 컨트롤 항체 및 2차 항체로서 각기 사용하였다. RITUXAN을 음성 대조구로서 사용하였는데, 그 이유는 FACS 분석 결과 RITUXAN(CD20)에 의해 인식된 항원이 전술된 실험에 사용된 세포 표면상에 미량으로 존재한다는 것을 보여주었기 때문이다. RITUXAN의 칼리케아미신 컨쥬게이트는 면역글로블린의 캐리어 기능 및 칼리케아미신의 가수분해가능한 방출을 통제하였다.
MYLOTARG(겜츄주마브 오조가미신, 또한 CMA-676로도 간주되며, 또는 간단하게는 CMA)는 칼리케아미신 컨쥬게이트이다(Wyeth, Madison, NJ). 1mg의 항체에 컨쥬게이션된 칼리케아미신의 평균량 35㎍을 지닌 배치가 사용되었다. CMA 또는 CMA-676의 항체 일부는 CD33에 특이적인데, 이는 많은 가능성을 가진 조혈 스템 세포 및 급성 골수 백혈병 세포에 의해 발현된 백혈구 분화 반응 항원이다. 전술한 실험에 사용된 세포 어느 것도 CD33의 유의적 수준을 발현하지 않았다. 실제로, FACS 분석은 이들 세포주에 결합된 CMA의 양이 컨트롤 hulgG1의 양과 유사했음을 나타냈는데, 이는 CD33의 발현이 부족했다는 것을 보여준다. CMA의 가장 높은 결합은 PC3MM2 세포(re MCF=2.3)에서 측정되었다. 그러므로, CMA는 컨쥬게이트의 항원을 표적화 하지 않고도 방출된 CM의 효능을 통제한다.
플라스몬 공명 분석( BIACORE )
루이스-BSA 컨쥬게이트들(즉, H 타입 I-, H 타입 II-, 시알릴 Lea-, 시알릴 Lex-, 설포 Lea-, 설포 Lex-, Lea-, Leb-, Lex-및 Ley-BSA)은 알버타 리서치 카운실(Edmonton, Alberta, Canada)에서 구입하였다. 항원/BSA 로딩은 20 내지 42 몰 항원/BSA 몰이었다. 각 항원을 4,000 내지 9,000 RU의 밀도로 CM5 바이오센서 칩 표면에 고정화하였다. 커플링 시약 EDC/NHS[1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드-HCl]/[N-히드록시숙신이미드]을 유속 5㎕/분의 속도로 6분간 첨가하고, 다음에 10 mM의 초산나트륨 완충제(pH 4.5) 중의 루이스-BSA 항원을 50㎕/분의 농도로 유속 5㎕/분의 속도하에 6분간 첨가하여 이 칩을 활성화하였다. 설포-루이스 및 시알릴-루이스-BSA 컨쥬게이트는 pH 4.0에서 커플링되었다. 잉여의 결합 부위는 6분간 5㎕/분의 유속으로 pH 8.5하에 1M 에탄올아민-HCl를 사용하여 차단하였다. 결합 특이성 분석은 20㎕/분의 유속으로 HBS-EP 완충제(10 mM HEPES, 150 mMNaCI, 3 mM EDTA, 50 ppm 폴리솔르베이트 20)중에서 수행되었다. Hu3S193은 6.67 nM 또는 50 nM하에 3분간 주사되었다. HBS-EP 완충제로 30초간 세척한 후 결합 되어 남아 있는 항체의 양을 측정하였다. 기저선을 재구축하기 위해서 항원성 표면을 20㎕/분하에 1분간 10 mMNaOH, 200 mM NaC1 로 재생하였다.
동역학적 특성 분석을 위해, 항체를 1 내지 16 nM의 농도로 사용하였다. Ley-BSA의 밀도는 9,000이었다. 결합 및 해리는 30㎕/분의 속도하에 3 분 내지 15분간 HBS-EP 완충제 중에서 측정되었다.
FACS -분석
인간 종양 세포주 시리즈 상에서 발견되는 LeY의 존재는 FACS 분석에 의해 평가되었다. 105세포의 일정량을 1% v/v 소의 혈청 알부민으로 보충한 100㎕의 포스페이트 완충제 염수(PBS/BSA)에 현탁시켰다. 이후 세포를 다양한 농도의 일차 항체인 hu3S193 또는 G193, hu3S193, 또는 CM-컨쥬게이트 중에서 30분간 4℃의 온도로 항온배양하였다. 이들 세포에 대한 일차 항체의 결합은 FITC 표지된/α-huIgG에 의해 나타났다.
MCF(평균 채널 형광) 값은 일차 항체(huIgG 및 hu3S193)과 결합하고, 이차 항체의 연속적인 염색 처리 후에 나타난 세포군의 평균적 형광 강도를 말한다. HuIgG는 음성 컨트롤이다. MCF는 결합된 일차 항체 분자의 수에 직접적으로 비례한다. 연구된 세포주 대다수가(13중 8 이상), 음성 컨트롤의 MCF에 비해서, hu3S193 결합한 후에 적어도 MCF가 10배(MCF에 비해서, reMCF) 증가로 알 수 있는 바와 같은 LeY를 발현하였다. LeY를 수준 높게 발현하는 세포주의 예가 각 조직 종양 카테고리에서 발견되었다. 직장 결장 및 위 기원의 모든 종양은 LeY-양성이었다.
칼리케아미신에 대하여 컨쥬게이션된 항-루이스 Y 항체의 ED 50
중요한 염료(MTS) 염색을 사용하여 여러 가지 치료를 행한 후 생존하는 세포의 수를 측정하였다. MTS(비-방사성 세포 증식 분석 키트)는 Promega (Madison, WI)에서 구입하여 제조업자의 지시 사항에 따라 사용하였다. 각 세포주의 경우, 구배 곡선(세포 수 대(對) 2시간 후의 광학 밀도)은 초기 시딩(seeding) 밀도를 평가하기 위한 것이었다. 이후 1 개의 웰당 750 내지 5,000 세포의 밀도로 세포를 96-멀티 웰 디쉬에 시드하였다. 시딩 하자마자, 세포를 CMA, hu3S193-AcBut-CM, 또는 CM의 다양한 농도(0, 0.01, 0.05, 0.1, 1,10, 100 및 500 ng의 칼리케아미신 당량/㎖) 또는 PBS에 노출시켰다. 각 웰은 10㎕의 100X 약물 용액을 투여받았다. 약물에 노출된 지 96 시간 동안 생존하는 세포의 수를 측정한 후에, 용량-반응 곡선으로부터 알 수 있는 로지스틱 회귀 파라미터를 근거로 ED50을 계산하였다. ED50은 약물에 노출된 지 96 시간 후에 세포의 수가 50% 감소하는데 필요한 약물(CM) 몰 농도로 정의된다. 칼리케아미신 당량(cal. eq)은 순수한 성분 또는 컨쥬게이트로서 주어지는 CM의 농도라는 점에 주목해야 한다. 항체에 결합하는 CM의 양에 따라(항체 약물 로딩), 다양한 컨쥬게이트의 칼리케아미신 당량은 다른 단백질 농도를 나타낼 수 있다.
실시예 1. 항-루이스 Y 항체의 생성
야생형 (hu3S193)과 돌연변이체 (G193) 항-루이스 Y 항체를 생성시켰다. 쥐과인 3S193 mAb를 루이스 Y 항원에 대해 양성인 인간 선암 세포를 이용하여 BALB/c 마우스를 면역화시킴으로써 생성하였다. 이어서, 3S193 항체의 인간화된 버전을 생성시켰다 (hu3S193). 세부에 걸친 특이성 분석을 통해, hu3S193은 Ley 에 대해 매우 특이적이며(H-타입 2 또는 타입 1 항원에 결합하지 않음), Lex 트리사카라이드와 최소한의 교차 반응성만을 나타내는 것이 증명되었다. hu3S193 (G193)의 돌연변이화된 IgG1 버전은 그의 CH2 도메인에 두 개의 아미노산 치환체, 즉; 알라닌에 대한 루이신 (234) 및 알라닌에 대한 글리신 (237)을 가진다는 점에서 hu3S193과 다르다. 상기 두 돌연변이 이외에, IgG1의 CH3 도메인에 있어서 Gmz 알로타입에 해당하는 두 개의 추가적인 보존적 돌연변이(글루탐산에 대해 358번 위치에서의 아스파르트산, 및 루이신에 대해 360번 위치에서의 메티오닌)가 존재한다. 따라서, 인간화된 돌연변이 IgG1 항-루이스 Y 항체는 Fc 영역 내의 4개의 잔기; L236A, G239A, D358E, 및 M360L에서 hu3S193과 다르다. 항-루이스 Y 항체의 상기 돌연변이 IgG1 형태는 차이니스 햄스터 난소 세포(Chinese hamster ovary cell)에서 발현되는 G193으로서 명명되며, 이는 CMD-193을 생성하는데 사용된다. 도 7은 두 항체의 성숙한 분비되는 중쇄의 아미노산 서열의 비교 정보를 제공한다. 상기 도면에서, 돌연변이 잔기는 진하게 칠하였고, 강조하여 나타냈으며, CDR은 진하게 칠하고 음영처리하였다.
세포 및 배양 조건
hu3S193 항체를 발현하는 하이브리도마 세포를 루드빅 암연구소(Ludwig Institute for Cancer Research)로부터 입수하였다. Hu3S193는 마우스 모노클로날 항체 MuS193로부터 유래된 인간화된 항-Ley 항체 (IgG1)로, 상보성 결정 영역만이 쥐과 기원이 되도록 처리하였다.
세포주는 콜레스테롤 의존성 세포주이며 Hy클론 HyQ- CCM
Figure 112006074065888-PCT00008
성장 배지 (Hyclone Labs, Logan, Utah)에 콜레스테롤의 첨가를 필요로 한다. 콜레스테롤은 수용성이 아니기 때문에, 배지를 0.2% ExCyte VLE (Miles Pentex, Kankake, IL)로 보충하였다. 세포를 5% CO2 중에서 37℃로 유지하였다. COS-7 세포를 ATCC (Rockville, Maryland)로부터 구입하여 10% 소 태아 혈청 (FBS) 및 2 mM 글루타민, 100 U/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신 (이하 pen/strep로 칭함)이 보충된 둘베코스 변형 이글 배지(Dulbeccos Modified Eagle Medium, DMEM)에서 유지시켰다.
PA-DUKX 153.8 세포는 디히드로폴레이트 리덕타아제(dihydrofolate reductase, dhfr)의 생성에 있어서는 불충분하다. 이들 세포를 10 ㎍/ml 아데노신, 데옥시아데노신 및 티미딘 (Sigma, St. Louis, MO), 10% FBS, 20 mM HEPES, 0.1% 중탄산나트륨, 2 mM 글루타민 및 pen/strep가 보충된 최소 성장 배지 (MEM-α Gibco BRL, Grand Island, NY)에서 유지하였다. 감염 후, 세포를 뉴클레오티드의 부재 하에 성장시키고 1 mg/ml의 G418 (Gibco) 및 선별 마커로서 250 nM의 메토트렉세이트 (Sigma)로 유지시켰다.
벡터
야생형 (hu3S193) 및 돌연변이 (G193) 항-루이스 Y 항체의 중쇄 및 경쇄 구조물을 생성하기 위해, 하기 벡터를 사용하였다: PED6_HC_IgG1, PED6_HC_mIgG 1 및 pED6_LC κ 벡터. PED6_HC_mIgG 1 벡터는 돌연변이화된 CH2 도메인을 위한 주형을 포함한다 (벡터는 루이신을 치환하는 234번 위치와 글리신을 치환하는 237번 위치 모두에서 알라닌을 코딩함). hu3S193의 경쇄 가변 영역의 DNA는 pED6_LC κ 발현 벡터의 BssH II와 PacI 제한 부위 사이에 결찰시켰다. hu3S193의 경쇄 가변 영역의 DNA는 pED6_HCIgG1 발현 벡터의 BssH II와 Sal I 제한 부위 사이에 결찰시켰다. 벡터 pED6_Hc_mIgG1은 중쇄의 G193를 생성하는데 사용하였다. 상기 벡터는 그 도메인 서열에 있어서 pED6_HC_IgG1와 다르다. pED6_HC_mIgG1의 발현은 루이신 (234) 및 글리신 (237)을 알라닌으로 대체하는 중쇄를 만들어낸다.
경쇄 G193 또는 hu3S193의 가변 및 불변 영역을 코딩하는 DNA를 pMEN2 벡터의 PpUM와 EcoR I 제한 부위 사이에 결찰된 pED6_LC k 플라스미드로부터 절단하였다. 경쇄 G193 또는 hu3S193의 가변 및 불변 영역을 코딩하는 DNA를 pED6_HC_IgG1 또는 pED6_HC_mIgG1 벡터로부터 절단하였으며, pTDMEDL 벡터의 Bgl II와 Xba I 제한 부위 사이에 삽입시켰다.
추출 및 클로닝
RNA를 제조업자의 사용설명서에 따라 RNAzolB 키트 (RNAzol B, TEL-TEST, Inc., Friendswood, TX)를 이용하여 hu3S193-생성 세포로부터 추출하였다. 키트 (Stratagene, La Jolla, CA)를 사용하여, 추출된 RNA를 단일 가닥 cDNA에 전사시켰다. 10 ㎍의 총 RNA를 올리고 dT 프라이머와 혼합하였다. 상기 반응 혼합물을 65℃까지 5분간 가열하고 서서히 22℃까지 냉각시켰다. 제1 가닥 cDNA를 총 50 ㎕의 부피 중에 5 ㎕의 10배 농축된 제1 가닥 버퍼, 5 ㎕의 DTT, 1 ㎕의 RNAse 블록, 2 ㎕의 DNTP (1.25 mM) 및 1 ㎕의 MMLV 역전사 효소 (20 U/㎕)를 포함하는 혼합물 중에서 합성시켰다. 상기 성분들을 부드럽게 혼합하고 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 상기 cDNA를 hu3S193의 VH 및 VK 모두를 증폭시키기 위해 사용하였다. 하기 프라이머를 중합 연쇄 반응(PCR)에 사용하였다:
Hu3S193 VH UP (BssH II)
GCTTGGCGCGCACTCC GAG GTC CAA CTG GTG GAG AGC GGT GGA GGT GTT (서열번호 1)
Hu3S193 VH DN (Sal I)
GCGACGTCGACAGGACTCACC TGA GGA GAC GGT GAC CGG GGT CCC TTG GCC CCA GTA AGC AAA (서열번호 2)
Hu3S193 VK UP (BssH II)
GCTTGGCGCGCACTCC GAC ATC CAG ATG ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG A (서열번호 3)
Hu3S193 VK DN (Pac I)
GCCCTTAATTAAGTTATTCTACTCACG TGT GAT TTG CAG CTT GGT CCC TTG GCC GAA CGT GAA (서열번호 4)
PCR 반응을 50 ㎕ 총 부피인 5 ㎕의 제1 가닥 cDNA, 100 ng의 센스 및 안티센스 프라이머, 5 ㎕의 10X PFU 폴리머라제 버퍼, 500μM의 MgCl2, 1.25 mM의 DNTPs 및 1 ㎕의 PFU 효소 (2 U/㎕)의 혼합물 중에서 수행하였다. 반응은 변형 (95℃-1분)과 합성 (72℃-4분)의 35 병행 사이클, 및 1 종료 사이클 (72℃-7분)로 이루어진다. 반응 생성물을 1% 아가로스 중의 전기영동으로 분석하였다. PCR 생성물을 정제하고, 중쇄 PCR 생성물을 BssH II 및 Sal I로 분해하여 BssH II/Sal I-분해된 pED6_HC_mIg1 또는 pED6_HC_Ig1 발현 벡터에 결찰시켜 각각 G193 및 hu3S193 중쇄 구조물을 생성시켰다. 유사하게, 경쇄 PCR 생성물을 BssH II/ Pac I로 분해하여 BssH II/Pac I 분해된 pED6_LC κ 발현 벡터에 결찰시켜 G193 경쇄 구조물을 생성시켰다. pED 벡터를 일시적인 형질 감염 실험에서 항체의 발현을 측정하는데 사용하였다.
또한, 중쇄 및 경쇄 G193 또는 hu3S193를 함유하는 pED 벡터를 pTDMEDL-DHFR/VH 및 pMEN2-Neo/VK에 서브클로닝하였다. 이러한 구조물을 제작하기 위해, hu3S193 pED6_HC_mIgG1 VH (hu3S193 VH+ CH1+ mtCH2+CH3) 및 hu3S193 pED6_HC_IgG1 VH (hu3S193 VH+ CHI+CH2+CH3)를 Bgl II 및 Xba I로 분해하고, 이를 Bgl II/ Xba I 분해된 pTDMEDL 벡터에 결찰시켜 G193 VH/pTDMEDL-DHFR 또는 hu3S193 VH/pTDMEDL-DHFR을 만들었다. 유사하게 pED6_LC κ hu3S193 VK를 PpUM 및 EcoR I (hu3S193 VK+CK)로 분해하여 이를 PpUM 및 EcoR I 분해된 pMEN2 벡터에 결찰시켜 Hu3S193 VK/pMEN2-Neo를 생성시켰다. G193 mAb에 대한 서열은 서열번호 13에 해당한다.
결찰 , 형질전환, 및 플라스미드 정제
분해된 생성물을 12℃에서 T4 DNA 리가아제 (Gibco)로 밤새 결찰시켜 DH5α세포로 형질 전환시켰다. 단일 콜로니를 2 ml LB 배양물에 50 ㎍/ml 암피실린의 존재 하에 접종하여 37℃에서 밤새 성장시켰다. 미니프렙 DNA들 상의 제한 지도로 적당한 길이의 인서트를 확인하였다. 확인 후, 맥시프렙 DNA를 제조업자의 사용권고에 따라 Qiagen-키트 (Qiagen, Valencia, CA)를 이용하여 제조하였다.
VH 및 VK DNA 의 시퀀싱
맥시프렙 DNA를 가변 중쇄 및 경쇄 hu3S193의 시퀀싱을 위한 DNA 핵심 설비(core facility)로 보냈다. DNA 서열을 하기와 같이 결정하였다. 제조업자로부터 제공된 터보 프렙 방법에 따라서 Qiagen 9600 robot (Qiagen)로 미니프렙을 제조하였다. 500 ㎍의 미니프렙 DNA를 13 ㎕의 H2O 중에서 20 pM 프라이머 DNA와 혼합하였다. 이후 DNA를 가열 (98℃, 5분) 및 냉각 (4℃, 5분)에 의해 변성시켰다. 8 ㎕의 Big Dye Terminator (ABI, Foster City, CA)를 변성된 DNA에 첨가하였다. 혼합물을 98℃로 가열하고 25 열화학 사이클 (96℃, 20 s; 55℃, 20 s; 62℃, 120 s) 및 20 열화학 사이클 (96℃, 20 s; 60℃, 120 s) 일련을 거치게 하였다. 반응 혼합물을 Biosystems 96-웰 여과 플레이트 (Edge, Gaithersburg, MD)를 통해 여과시켜 초과량의 dye terminator를 제거하였다. 이후 DNA 단편을 3700 모세관 어레이 시퀀서 (ABI) 상에서 분석하였다. G193 및 hu3S193의 중쇄 및 경쇄 모두의 서열을 도 7과 8에 나타내었다.
COS -7 세포의 일시적 형질 감염
항체 발현을 COS-7 세포에서 일시적 형질 감염에 따라 확인하였다. 백만 개의 COS-7 세포를 6 웰 디쉬에 플레이팅하였다. 다음 날, 같은 몰 농도 (각 1 ㎍의 혼합물)의 hu3S193 pED6_HC_mIgG1 VH 및 hu3S193 pED6_HC_mIgG1 VH 또는 hu3S193 pED6_HC_IgG1 VH 및 hu3S193 pED6_HC_IgG1 VH를 250 ㎕의 무혈청 DMEM에 희석하였다. 또한, 6 ㎕의 1 mg/ml Lipofectamine (Invitrogen)도 250 ㎕의 무혈청 DMEM에 희석하였다. DNA 및 Lipofectamine을 혼합하고 실온에서 15분간 배양하였다. 상기 혼합물을 상기 세포들에 첨가하였다 (세포들은 DNA-Lipofectamine 복합체의 노출 전에 무혈청 배지로 세척함). 37℃에서 8시간 동안 배양 후, 신선한 배지를 세포에 첨가하였다. 48시간 동안 세포에 노출되는 배양 배지를 FACS 및 BIAcore 분석을 통해 항체의 존재에 대해 검사하였다.
안정한 세포주
항체 발현의 확인에 이어서, 돌연변이 (G193) 및 야생형 (hu3S193) 항-루이스 Y IgG1 항체를 발현하는 안정한 세포주를 하기와 같이 PA-DUKX 153.8 세포에서 생성시켰다. 5백만 개의 세포를 직경 10 cm의 디쉬에 플레이팅하였다. 16시간 후, G193 VH/pTDMEDL (클론 #18) 및 VK/pMEN2 (클론 #1) 또는 hu3S193에 대한 등가의 구조물의 동몰의 혼합물(각 10㎍)을 1.5 ml의 무혈청 MEM-α로 희석하였다. 60 ㎕의 Lipofectamine도 1.5 ml의 무혈청 MEM로 희석하였다. DNA 및 Lipofectamine을 혼합하고 실온에서 15분간 배양하였다. 상기 혼합물을 이후 37℃에서 8시간 동안 방치된 세포에 첨가하였다. 이후, 혼합물을 15 ml의 신선한 성장 배지로 대체시켰다. 24시간 후, 세포 배양물을 1 mg/ml의 G418 및 순차적으로 증가하는 농도를 갖는 신선한 메토트렉세이트 (20, 40, 80, 100, 120, 160, 200 및 250 nM/ml)를 함유하는 성장 배지 (리보뉴클레오시드 및 데옥시리보뉴클레오시드 무함유)에 1:10 희석액으로 통과시켰다. 콜로니를 선별하여 확장시켰다. 상기 클론으로부터 조건화된 배양 배지를 FACS, BIAcore 및 ELISA로 분석하였다. G193 또는 hu3S193를 발현하는 안정한 세포주를 이후 항체의 대량 생산 및 정제에 사용하였다.
G193 의 이펙터 ( Effector ) 작용
G193 및 이의 콘쥬게이트, CMD-193의 이펙터 작용 능력을 측정하기 위해, 이들을 루이스 Y 항원의 발현이 있는 N87 위암종(gastric carcinoma) 세포와 루이스 Y 항원의 발현이 아주 낮거나 전무한 A431 유표피 암종(epidermoid carcinoma) 세포 모두를 이용하여 시험하였다. 야생형 인간화된 IgG1 항-루이스 Y 항체, hu3S193을 양성 대조군으로서 사용하였다. 상기 항체는 ADCC 및 CDC 활성 모두를 중재하는 것으로 나타났다. 갓 단리된 인간 말초혈액의 단핵구 세포 (PBMNC)를 ADCC 분석 동안 이펙터 세포의 공급원으로서 사용하였고 CDC 분석에서는 보체의 공급원으로서 갓 준비한 인간 혈청을 사용하였다.
G193 및 CMD-193의 CDC 활성을 보체의 공급원으로서 신선한 인간 혈청의 1:100 희석액의 존재 하에 다른 농도를 갖는 루이스 Y 항체로 4시간 동안 배양된 고정수의 종양 세포를 이용하여 평가하였다. 종양 세포의 용해의 결과로 표출된 락테이트 데히드로게나아제의 활성을 측정하였다. 비이온성 세정제에 의해 표출된 LDH 활성을 총체적인 용해로서 측정하였다. 매우 높은 농도의 루이스 Y (루이스 Y+++), 즉, 높은 루이스 Y를 발현하는 A431 세포를 이용하여 유사한 평가를 수행하였다.
G193 및 CMD-193의 ADCC 활성을 이펙터 세포로서 사용되는 말초혈액 단핵구 세포의 존재 또는 부재 하에 (50:50의 비율의 이펙터 세포:표적 세포) 다른 농도를 갖는 루이스 Y 항체로 4시간 동안 배양된 고정수의 종양 세포를 이용하여 측정하였다. 종양 세포의 용해의 결과로 표출된 락테이트 데히드로게나아제의 활성을 측정하였다. 비이온성 세정제에 의해 표출된 LDH 활성을 총체적인 용해로서 측정하였다. 루이스 Y+++ N87 세포를 이용하여 유사한 평가를 수행하였다.
야생형 IgG1과 돌연변이 IgG1 항 루이스 Y 항체 모두 도 24 및 25에 나타난 바와 같이, 루이스 Y 항원의 높은 발현을 갖는 N87 암종 세포에 대해 ADCC 및 CDC 활성 모두를 공히 중재할 수 있었다. 유사한 활성을 갖는 항체는 루이스 Y 항원의 발현이 매우 낮거나 없는 A431 세포에 대해서는 관찰되지 않았다. 반대로, hu3S193 및 G193의 것과 동일한 VH 및 VK 서열을 갖는 항-루이스 Y 항체의 IgG4 버전은 ADCC 및 CDC 활성 모두를 촉진시킬 수는 없었다. 인간 IgG4 이소타입은 ADCC 및 CDC를 매개하는 이의 능력에 있어 부족한 것으로 공지되어 있으며, 이러한 사실과 일치하는 것은 항-루이스 Y IgG4 항체가 ADCC 및 CDC 분석에서는 불활성이라는 점이다.
상기 결과들은 G193의 Fc에서 L236A 및 G239A 돌연변이의 도입이 G193에게 이펙터 작용 능력을 주기에는 부족하다는 것을 시사한다. CMD-193도 고발현의 루이스 Y 항원을 갖는 N87 암종 세포에 대해 CDC 활성을 매개하는 데 있어 G193과 같이 효과적이었다. 이러한 결과는 칼리치마이신(calicheamicin)에 대한 G193의 콘쥬게이션도 CDC 활성을 매개하는 G193의 능력을 변화시키지 않는다는 것을 의미한다. 따라서, G193 및 CMD-193 모두는 이펙터 작용 활성을 매개할 수 있으며, CMD 193은 이펙터 작용 가능한 항체 콘쥬게이트이다.
실시예 2. 항-루이스 Y 항체의 칼리치마이신으로의 콘쥬게이션
항체를 하기와 같이 칼리치마이신 (CM)에 초기에 콘쥬게이션하였다. 약 10 mg/ml의 단백질 농도에서의 항체를 고몰농도 비친핵성 버퍼 (1 M HEPES)를 이용하여 pH 8-8.5로 조절하였다. 다음으로, 단백질 응집을 방해하는 부형제 (나트륨 옥타노에이트)를 최종 농도 0.1-0.2 M로 첨가하였다. 마지막으로, 5% 단백질 질량의 활성화된 칼리치마이신 유도체를 유기 용매 (에탄올 또는 디메틸포름아미드) 중에 농축액(10-20 mg/ml)으로서 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 이후 25-35℃에서 1 내지 2시간 동안 배양하였다. 반응의 진행 상황을 SEC-HPLC로 모니터링하였다. 반응 완료 후, 콘쥬게이트를 응집된 항체로부터 분리하고 분취 SEC 칼럼 상에서 칼리치마이신을 제거하였다. 본 실험에서 사용된 콘쥬게이트물의 항체 당 CM의 양은 hu3S193-AcBut-CM 및 RITUXAN-AcBut-CM에 대해 각각 22 내지 47 ㎍/mg, 17 내지 30 ㎍/mg 범위이다.
콘쥬게이션 조건의 최적화
전형적인 콘쥬게이션 반응에서, 인간화된 항-루이스 Y 항체 (hu3S193)는 표적 단백질 농도가 10 mg/ml이고 표적 칼리치마이신 유도체 로딩이 단백질의 7.0 중량%인 NAc-γ-칼리치마이신-DMH-AcBut-OSu (칼리치마이신 유도체)에 콘쥬게이션시켰다. 목적하는 반응 pH는 8.2±0.2이고 다른 반응 성분들의 목적하는 농도는 하기와 같다: 50 mM HEPBS, 10 mM 나트륨 데옥시콜레이트, 및 9% v/v 에탄올. 반응을 33±2℃에서 1시간 동안 수행하였다. 정제 전의 상기 전형적인 반응의 분석 결과는 하기와 같다: 단백질: 9.92 mg/ml; 칼리치마이신 로딩: 70 mcg/mg; 응집률: 1.9%; 비콘쥬게이트된 단백질 (LCF): 0.81%.
생성물 수율 및 순도에 대한 다양한 계면활성제 첨가제 및 이들의 농도의 효과를 시험하여 hu3S193의 콘쥬게이트된 단량체의 생성에 대한 이들의 효과를 측정하였다. 결과를 하기 표 2에 나타내었다. 반응은 첨가제 및 이의 농도를 제외하고는 모든 변수들을 일정하게 유지하면서 수행하였다. 이러한 반응으로부터 제조된 콘쥬게이트를 응집률, LCF 및 단백질 회수율에 대해 분석하였다. 일부 첨가제들이 낮은 응집률 또는 낮은 LCF를 갖는 콘쥬케이트를 생산하지만, 데옥시콜레이트만은 낮은 응집률, 낮은 LCF 및 높은 단백질 회수율을 갖는 콘쥬게이트를 생성한다.
세정제 (농도) 응집률(%) 비콘쥬게이트된 mAb (%) 수율(%)
에틸렌 글리콜 (10%) 16.7 16.3 36
Tween-80 18.5 19.5 38
푸시딘산 (10 mM) 9.9 25.2 47
푸시딘산 (20 mM) 13.7 10.5 49
푸시딘산 (50 mM) 25.6 5.2 46
옥타노에이트 (180 mM) 9.8 26.4 37
옥타노에이트 (200 mM) 24.2 10.1 38
옥타노에이트 (220 mM) 36.8 8.4 33
데카노에이트 (20 mM) 24.9 64.3 23
데카노에이트 (50 mM) 71.9 0 9
옥틸 설페이트 (75 mM) 5 24 78
옥틸 설페이트 (100 mM) 42 6 38
옥틸 설페이트 (150 mM) 74 1 ND
데실 설페이트 (20 mM) 47 6 35
데실 설페이트 (30 mM) 69 6 13
데실 설페이트 (40 mM) 68 7 7
t-부틸 염화암모늄 (150 mM) 1 58 85
t-부틸 염화암모늄 (250 mM) 5 35 74
데옥시코르티코스테론-헤미스(4mM) 1 100 99
데옥시코르티코스테론-헤미스 (10 mM) 0 100 94
데옥시코르티코스테론-헤미스 (20 mM) 0 59 41
히드로코르티손-헤미스(20 mM) 1 57 88
히드로코르티손-헤미스(40 mM) 1 26 85
히드로코르티손-헤미스(80 mM) 2 13 81
벤조에이트 (100 mM) 0 72 100
벤조에이트 (200 mM) 0 66 92
벤조에이트 (400 mM) 1 50 82
벤조에이트 (1M) 11 31 83
나프토산 (40 mM) 4 52 98
나프토산 (100 mM) 5 ND 64
4-페닐 부티르산 (167mM) 2 52 100
디히드록실 페닐 아세트산(175 mM) 0 67 100
데옥시콜레이트 (15 mM) 3.4 (1-6.2) 2.3 (0.7-3.3) 73 (63-80)
글리코데옥시콜린산 4.1 3.12 72.8
타우로데옥시콜린산 4.6 4.5 71.7
콜린산 9.8 28.4 67.9
글리코콜린산 13.3 33.9 60.7
타우로콜린산 15 35.1 64.3
옥타노에이트는 CMA-676 콘쥬게이션 반응에서 사용되는 표준 촉매인 반면, 데카노에이트는 CMC-544 콘쥬게이션 반응에서 사용되는 표준 촉매이다. 데옥시콜레이트 결과는 괄호의 범위를 갖는 5개 반응의 평균값이다. 담즙산 부류의 세정제의 기타 성분들을 시험하여도 유사한 결과를 수득하였다.
콘쥬게이션 반응 종료시 응집률(%) 및 유리 단백질(%)을 옥타노에이트, 데카노에이트, 및 데옥시콜레이트를 이용하여 다양한 IgG1 및 IgG4 항체에 대해 측정하였다. 시험된 IgG1 항체는 G193이고 이는 대조군 항체, mAb 01이며, 시험된 IgG4 항체는 IgG4 불변 영역 (G193-IgG4), mAb 676(CMA-676 콘쥬게이트 유래), mAb G544(CMC-544 콘쥬게이트 유래)를 갖는 G193이고 이는 대조군 항체, mAb 02이다. 하기 표 3에 보여진 바와 같이, 데옥시콜레이트의 존재 하에 IgG1 항체의 콘쥬게이션은 낮은 % 응집률 및 낮은 % 비콘쥬게이트된 단백질 (또는 LCF)을 유도하는 반면, 옥타노에이트 또는 데카노에이트의 존재 하의 콘쥬게이션은 높은 % 응집률 또는 높은 % 비콘쥬게이트된 단백질을 유도한다. 이는 데카노에이트 또는 데옥시콜레이트의 존재 하에 콘쥬게이트 되는 경우 낮은 % 응집률 및 낮은 % 비콘쥬게이트된 단백질을 갖는 IgG4 항체와는 대조적이다.
표 3
옥타노에이트 데카노에이트 데옥시콜레이트
mAb 응집률(%) 비콘쥬게이트 단백질(%) 응집률(%) 비콘쥬게이트 단백질(%) 응집률(%) 비콘쥬게이트 단백질(%)
G193* 5.68 39.7 15.0 2.25 2.91 1.08
G193-lgG4 4.48 38.7 28.03 0.13 4.33 3
676 9.22 48.8 5.29 34.4 3.36 29.4
01 6.03 36.5 6.92 14.92 6.55 2.3
02 5.47 41.16 5.03 0.07 3.44 3.44
G544 3.75 37.55 2.34 3.29 3.57 3.34
lgG1 평균 5.86 38.1 10.96 8.59 4.73 1.69
lgG4 평균 8.73 41.55 10.17 9.47 3.68 9.80
* 3번 시행의 평균
CMD -193의 다른 약물 로딩
항-루이스 Y 항체 (G193)에 대한 칼리치마이신의 다른 약물 로딩을 평가하였다. 밀리그램의 G193 항체 단백질 당 30, 60 또는 90 mg의 NAc-γ 칼리치마이신 DMH의 약물 로딩을 갖는 CMD-193 제제를 만들고 N87 이종이식 마우스에 kg당 160 mg의 칼리치마이신 당량의 용량으로 IP Q4Dx3를 투여하였다. CMD-193의 항종양 효능은 약물 로딩의 차이에 의해 영향받지는 않았다.
도 23에서 보여진 바와 같이, 다른 칼리치마이신 로딩을 갖는 CMD-193 항종양 효능은 본질적으로 동일하였다. 비콘쥬게이트된 표적 항체 G193가 항종양 활성을 매개하는데 있어서 비효율적이기 때문에, CMD-193의 전체적인 항종양 효능은 종양 세포로의 칼리치마이신의 표적화된 전달에 기인할 수 있다. 이러한 결과도 30 내지 90 ㎍/mg의 CMD-193 범위에서 칼리치마이신 콘쥬게이션 (로딩) 정도는 그 치료적 결과에 영향을 주지 않는다는 것을 시사한다.
크로마토그래피 정제
정제를 위한 출발 물질은 70 ㎍/mg의 칼리치마이신 유도체 로딩에서 9.92 mg/mL 단백질을 1.9% (HPLC에서의 면적%) 함량의 응집체, 및 0.82% (HPLC에서의 면적%) 함량의 LCF와 함께 포함하는 콘쥬게이션 반응 혼합물이다. 콘쥬게이션 반응이 완료된 후, 반응 혼합물을 인산칼륨 용액을 첨가하여 10배 희석하여 0.6 M의 최종 포스페이트 농도로 하였다 (pH 8.2). 혼합 후, 상기 용액을 0.45 미크론 필터를 통해 여과시켰다. 희석된 용액을 부틸 Sepharose 4 Fast Flow 칼럼 상에 로딩하였다. 칼럼 상에 로딩된 단백질의 총량은 ml 층 부피당 20 mg이었다. 0.6 M 인산칼륨으로 세척 후, 칼럼을 0.6M 내지 4 mM 인산칼륨(pH 8.2)의 단계적 구배를 사용하여 용출시켰다 (대안적으로, 칼럼을 20 mM Tris/25 mM NaCl로 용출시킬 수 있음). 단계적 구배로부터 얻어진 분획들을 모았으며 이들은 하기를 포함한다: 단백질 8.3 mg/mL; 칼리치마이신 69.3 mcg/mg; 응집률 0.42%; LCF: 0.31%.
버퍼 교환을 재생 셀룰로스 막을 갖춘 초여과/정용여과를 이용하여 수행하였다. 콘쥬게이트를 20 mM Tris/10 mM NaCl(pH 8.0, 10 직경부피)에 대해 정용여과하였다. 크기별 배제 크로마토그래피 또는 초여과/정용여과가 상기 풀의 제형화에 적절한 버퍼로 처리하는데 사용될 수 있다.
실시예 3. 항 루이스 Y 항체 칼리치마이신 콘쥬게이트의 특이성 및 동역학
야생형(hu3S193) 및 돌연변이형 (G193) 항 루이스 Y로의 칼리치마이신의 콘쥬게이션이 Ley에의 결합을 없애지 않는다는 것을 확인하기 위해, 상기 항체 및 이들 각각의 콘쥬게이트를 플라즈몬 공명 분석 (BIAcore) 및/또는 FACS 분석을 실시하였다. Hu3S193 뿐만 아니라 hu3S193-AcBut-CM은, Ley-BSA만을 인식하며 하기 올리고사카라이드 항원 모두를 인식하지 못한다: H 타입 I, H 타입 II, 시알릴-Lea, 시알릴-Lex, 설포-Lea, 설포-Lex, Lea, Leb 또는 Lex. hu3S193-AcBut-CM 결합의 동역학은 hu3S193의 것과는 다르다. 항체의 Ka 및 Kd도 CM으로의 콘쥬게이션에 의해 변화되었다.
BIAcore 및 FACS 분석 결과를 함께 취합한 결과는 hu3S193 또는 G193으로의 CM의 콘쥬게이션이 Ley-BSA 또는 Ley 양성 세포에 대한 특이성에 영향을 주지 않는다는 것을 의미한다 (데이터로 나타내지 않았음). hu3S193과 비교하여 hu3S193-AcBut-CM의 변화된 동역학 매개변수는 N87 세포에 결합할 수 있는 다른 양의 콘쥬게이트 또는 항체로 반드시 번역될 필요는 없다.
BIACORE 분석
Ley에 대한 G193, hu3S193, hu3S193-AcBut-CM 및 CMD의 특이성을 확인하기 위해, 다양한 Ley 관련 항원에 대한 항체 및 이들의 CM 콘쥬게이트의 친화도를 BIAcore 3000을 사용한 표면 플라즈몬 공명 분석을 이용하여 검사하였다. 루이스 Y-BSA (30몰의 루이스 Y/1몰의 BSA)를 바이오센서 칩에 고정화시키고 다양한 농도의 다양한 루이스 Y-반응성 제제 (2, 4, 8, 12 및 16 nM)에 노출시켰다. G193, hu3S193, hu3S193-AcBut-CM 및 CMD-193를 hu3S193과 동일한 친화도 및 특이성을 갖는 Ley-BSA에 결합시켰다. BIAcore에 의해 측정된 동역학 매개변수는 인공 Ley-BSA 기질로의 항체 또는 콘쥬게이트의 결합에 의존한다.
3개의 항체는 동일한 동역학 상수를 가진다. 3개의 평가로 비콘쥬게이트된 항-루이스 Y 항체, G193 및 hu3S193은, 중간 정도의 친화도(KD 범위 100-300 nM)로 루이스 Y-BSA에 결합하는 것을 알 수 있다. 하기 표 4에 나타난 바와 같이, 칼리치마이신으로의 콘쥬게이션은 상기 인공적인 시스템에서 이러한 항체들의 루이스 Y 결합 강도를 약간 감소시킨다. CMD-193은 낮은 친화도와 높은 나노몰 KD로 루이스 Y 항원에 결합한다.
표 4
항체 KD (M) KA (1/M) KD (1/s) Ka (1/Ms)
Hu3S193 1.3 x 10-7 7.7 x 106 4.9 x 10-3 3.9 x 104
G193 1.5 x 10-7 6.6 x 106 4.9 x 10-3 3.3 x 104
CMD-193 3.4 x 10-7 2.9 x 106 2.5 x 10-3 7.4 x 104
항체 및 콘쥬게이트는 Ley만을 인식하며 관련 올리고사카라이드는 인식하지 못하였다. 루이스 Y에 구조적으로 관련이 있는 다양한 탄수화물 항원으로의 G193, hu3S193 및 이들의 칼리치마이신 콘쥬게이트의 결합도 바이오센서 분석을 이용하여 조사하였다. BSA에 콘쥬게이트된 다양한 루이스 Y-관련 항원을 바이오센서 칩 ㅅ사상에 고정화시키고 항-루이스 Y 항체 및 이들의 칼리치마이신 콘쥬게이트에 노출시켰다. 도 20에 보여진 바와 같은 이들 결과는, G193 및 CMD-193이 루이스 Y 항원에 대해 특이적이며 루이스 Y, 루이스 X 및 H-2 혈액군 항원에 구조적으로 보다 근접한 항원들에 대한 임의적 결합을 나타내지 않는다는 것을 보여준다. 이들 결과는 또한 칼리치마이신에 대한 콘쥬게이션이 항-루이스 Y 항체의 항원 특이성을 변화시키지 않는다는 것을 시사한다.
FACS 분석
콘쥬게이션이 hu3S193의 Ley + 세포에의 결합에 영향을 미치는지를 확인하기 위해, N87 세포에 결합한 hu3S193 및 hu3S193-AcBut-CM의 양을 유세포 분석기(flow cytometry)로 비교하였다 (FACS). 다양한 농도의 hu3S193 또는 hu3S193-AcBut-CM을 N87에 노출시킨 후에 수득된 평균 채널 형광(Mean Channel Fluorescence, MCF)은 비슷하였다. N87 세포를 다양한 농도의 hu3S193 및 hu3S193-AcBut-CM으로 배양하였다. 결합된 콘쥬게이트 또는 항체의 양을 MCF로 나타내었다. 하기 표 5는 다양한 암종 세포주에의 hu3S193 결합의 유세포 분석 검출을 나타낸다 (인간 IgG1을 대조군 항체로 사용하였다). 루이스 Y 발현 상태는 항-루이스 Y 항체의 MCF/대조군 항체의 MCF의 비에 기초하여 자체적으로 지정되었다. 3-10 범위의 비는 루이스 Y 발현의 + 레벨, 10 내지 100 범위는 ++ 레벨, 100 내지 300 범위는 +++ 레벨을 나타내고, >300 은 ++++ 레벨을 나타낸다. 상기 초기 평가에 기초하여, 루이스 Y-고발현 및 저발현 암종 세포주를 추가의 연구에서 사용하였다.
표 5
Figure 112006074065888-PCT00009
G193 및 hu3S193 콘쥬게이트는 배양물 내에서 hu3S193과 유사하게 Ley + 위 암종 세포 (N87)에 결합한다. 다양한 농도의 hu3S193 또는 G193에 N87 단층을 노출시킨 후의 MCF (평균 채널 형광) 수치도 동일하였다. 따라서, BIAcore로 증명된 Ley-BSA로의 동등한 결합 이외에, hu3S193, G193, 및 hu3S193-M의 자연적으로 나타나는 Ley 로의 결합도 동일하다.
약동학
CMD-193의 약동학적 연구는 하기로 이루어진다: CMD 193 (랫트), G193 항체 (랫트, 개), 비콘쥬게이트된 칼리치마이신 유도체 (랫트, 개), 총 칼리치마이신 유도체 (랫트, 개)의 농도, 및 랫트 혈청 중의 CMD-193 및 개 혈청 중의 G193 항체에 대해 특이적인 항체의 존재를 측정하기 위한 효소-결합 면역 분석법 (ELISA)의 유효성 평가; 암컷 누드 마우스의 CMD-193의 단일 복강내 투여(IP) 용량을 투여 후 G193 항체의 약동학적 평가; 인간 간장 마이크로좀 및 시토졸에서의 NAc γ 칼리치마이신 디메틸 히드라지드 (CM) 및 NAc γ 칼리치마이신 DMH AcBut의 시험관내 대사, 및 HL 60 전골수성 백혈병 세포에서의 NAc γ 칼리치마이신 DMH의 시험관내 대사.
누드 마우스에서의 생체내 약동학적 연구에 있어서, CMD-193은 5% 수크로스, 0.01% 폴리소르베이트 80, 2.92 mg/mL (50 mM)의 염화나트륨, 2.42 mg/mL (20 mM)의 Tris, 및 pH 8.0으로 조절된 주사용 멸균수를 포함하는 비히클로 IP 투여하였다. 본 연구에서, 로딩은 약 75 mg의 칼리치마이신 유도체/항체 1 mg으로서, 이는 약 6몰의 칼리치마이신/항체 1몰에 해당한다.
암컷 누드 마우스에서 15 mg 칼리치마이신 당량/kg (최소 효능 투약량 (MED))의 용량으로 CMD 193을 단일 용량 IP 투여 후 G193 항체의 약동학을 중간 정도의 흡수 속도 및 긴 겉보기 말기 반감기 (t1/2)를 이용하여 특성화하였다. G193 항체의 농도 대 시간 곡선(AUC0-￥) 아래의 평균 면적은 222 mg·h/mL이었다.
NAc γ 칼리치마이신 DMH 및 NAc γ 칼리치마이신 DMH AcBut의 대사경로를 인간 간장 마이크로좀 및 시토졸에서 생체내 검사하였고, NAc-γ 칼리치마이신 DMH의 대사경로는 HL-60 전골수성 백혈병 세포에서 검사하였다. 인간 간장 마이크로좀 및 시토졸에서의 배양 후 많은 대사물질들이 발견되었다. 마이크로좀에서의 생체 형질전환 경로는 히드록실화 및 탈메틸화인 반면, NAc-ε 칼리치마이신 및 이의 유도체의 형성은 시토졸에서의 주된 경로로 보인다. NAc-ε 칼리치마이신 및 이의 이성질체를 포함하는 일부 대사물질들은 HL-60 백혈병 세포의 배양 동안 생성되었다. 흔한 대사물질들이 간장과 백혈병 세포물 모두에서 관찰된다는 것은 칼리치마이신 유 도체의 대사가 세포 특이적이지 않을 수 있다는 것을 시사한다. 세포에서의 NAc-ε 칼리치마이신 및 이의 유도체의 검출은, NAc-ε 칼리치마이신의 반응성 이중 라디칼 종은 아마도 세포 내에서 NAc-γ 칼리치마이신 DMH의 이황화 결합의 글루타티온 의존성 환원을 통해 형성될 것이라는 가설을 뒷받침하는 것이다.
실시예 4. 인간 암종 세포주의 시험관내 성장에 대한 항 루이스 Y 항체 칼리치마이신 콘쥬게이트의 효과
hu3S193 (hu3S193-CM) 및 G193 (CMD-193) 모두에 콘쥬게이트된 칼리치마이신의 인간 암종 세포주에 대한 효과를 인간 암종 세포주에 대해 평가하였다. 평가된 세포주는 높거나 낮은 발현의 루이스 Y 항원을 갖는 암종 및 유방, 결장, 폐, 및 전립선 암종을 포함한다. hu3S193-AcBut-CM 및 CMD-193의 모두의 효능을 CM (프리 드러그, free drug) 및/또는 다양한 대조군 콘쥬게이트의 효능과 시험관내에서 비교하였다.
하기 표 6과 7에서 나타난 바와 같이, hu3S193 및 CMD-193 모두는 루이스 Y-발현 암종 세포에 대해서 대조군 콘쥬게이트 (예를 들어, CMA-676) 보다 일정하게 더 효과적이다. 반대로, hu3S193 및 CMD-193은 발현이 낮거나 거의 없는 루이스 Y 항원을 갖는 세포에 대해서는 대조군 콘쥬게이트와 같은 효능을 갖거나 덜 효과적이다.
HU3S193 - CM
Hu3S193-AcBut-CM은 시험관 내에서 Ley 발현 암종 세포의 성장을 특이적으로 억제한다. 유리된 hu3S193 항체는 1x10-4 내지 6.9 ㎍ 단백질/ml 범위의 농도로 사용되는 경우 LOVO, L2987, N87 또는 AGS의 성장에 영향을 주지는 않는다. 상기 범위의 단백질 농도는 콘쥬게이트로서 항체의 양과 같았다. ED50 은 96시간 동안 CM 또는 콘쥬게이트에 노출 후 세포 배양물의 50%가 살아남는 용량 (ng/ml)을 가리킨다. hu3S193-AcBut-CM의 ED50 은 Ley 양성 세포 (re MCF > 10)에서 CMA의 ED50 보다 일관되게 더 낮았다.
두 콘쥬게이트 모두 ED50의 실험간 변화가 관찰되었다. 그러나, hu3S193-AcBut-CM의 ED50 범위는 Ley + AGS 세포 상에서 콘쥬게이트의 효용성을 시험하였을 경우 CMA 보다 일관되게 더 낮았다. 반대로, 상기 범위는 Ley - PC3MM2 세포 상에서 두 콘쥬게이트 모두 효용성을 시험하였을 경우에 중첩된다. 상기 결과는 두 세포주의 선별에 의해 야기된 것으로 보이지는 않았다. Ley + 세포를 이용한 병렬적 실험에서의 CMA 및 hu3S193-AcBut-CM의 ED50 비교는 평균적으로 CMA에서보다 hu3S193-AcBut-CM의 ED50 값이 더 낮다는 것을 보여준다 (폴드(fold) CMA<1). 이러한 발견은 세포주의 기원, 이의 칼리치마이신에 대한 민감성 및 이의 상대적인 Ley 양과는 독립적이다. 매개변수인 폴드 CMA는 다양한 Ley - 세포가 사용되는 경우 ≥ 1이었다. 다양한 hu3S193-AcBut-CM 콘쥬게이트물을 상기 관찰들이 이러한 변수들과는 독립적임을 나타내는 상기 실험(22 내지 47 ㎍의 칼리치마이신/단백질 1 mg)을 위해 사용하였다. 종합하면, 상기 결과들은 Ley으로의 칼리치마이신의 표적화에 기인한 hu3S193-AcBut-CM의 선택적 세포 독성을 보여주는 것이다.
상기 발견은 hu3S193-AcBut-CM의 다른 뱃치들을 이용한 일련의 실험에 의해 확인되었다. 상기 실험들에 사용된 콘쥬게이트물은 단백질 1 mg 당 22 내지 47 ㎍의 CM을 가졌다. hu3S193-AcBut-CM 및 MYLOTARG (CMA)의 ED50-수치는 9개의 실험으로부터 모은 것이며 이들의 발생빈도의 함수로서 플롯팅하였다(도 2A 및 2B 참조). Ley+ 세포에 대한 효능 (AGS, 도 2A)을 Ley - 세포에 대한 효능 (PC3MM2, 도 2B)과 비교하였다. 10개의 세포주 그룹에 대해, hu3S193-AcBut-CM의 ED50 수치도 각 실험(폴드 CMA)에서 내부 대조군으로서 사용된 CMA의 수치에 대해 평가하였다(여기서, n은 독립적인 ED50 측정수이다)(도 2C 참조). 일부 실험간 ED50의 변화가 있었지만, hu3S193-AcBut-CM은 일관되게 Ley 양성 세포에 대해 CMA보다 더 효능이 있는 것으로 유지되었다. 이 결과는 Ley으로의 CM의 표적화에 기인한 선택적 세포 독성을 보여주는 것이다.
표 6
Figure 112006074065888-PCT00010
상기 실험에서, 인간 암종 세포를 증가하는 농도의 비콘쥬게이트된 또는 콘쥬게이트된 칼리치마이신 (CMA-676 또는 CMD-193)의 존재 하에 96시간 동안 배양한 후 각 배양물에 살아있는 세포들을 MTS 분석 키트를 이용하여 세수하였다. 상기 표 6에서, CM은 NAc-Calich DMH를 지칭하며, CMA-676 및 CMD-193 모두 농도를 칼리치마이신 당량 (nM)의 관점으로 표현하였으며, 폴드 선택비(fold selectivity ratio)는 CMD의 ED50 에 대한 CMA의 ED50 비로서 표현된다. 6.7 mg/mL(가장 높은 시험 농도)에서 비콘쥬게이트된 항-루이스 Y 항체는 검사된 임의의 종양 세포주의 성장에 아무런 영향을 주지 못했다.
CMD -193
유리된 G193 항체는 5,700 내지 6,900 ng 단백질/ml 범위의 농도로 사용되는 경우, 임의의 조사된 세포 타입의 성장에 아무런 영향을 주지 못했다. hu3S193의 경우에서와 같이, CMD의 ED50은 CMA의 ED50 보다 Ley 양성 세포에서 일관되게 더 낮았다. 상기 실험에 사용된 콘쥬게이트물은 단백질 1 mg 당 56 내지 88 ㎍의 CM을 가졌다. 일부 실험간 ED50의 변화가 있었지만, CMD는 일관되게 Ley 양성 세포에 대해 CMA보다 더 효능이 있는 것(폴드-AcBut-CMA<1)으로 유지되었다. 이 결과는 Ley으로의 CM의 표적화에 기인한 선택적 세포 독성을 보여주는 것이다.
CMD-193의 선택성은 CMA 및 CMD로 처리 후의 A431 및 A431/Ley 의 감쇠 플롯의 비교로 가장 잘 예시된다(도 9). 이 실험에서, A431 및 A431/Ley 세포의 단층을 CMD 또는 CMA의 존재 하에 96시간 동안 배양하였다. 처리 후 잔존하는 세포수를 생체 염료법으로 측정하였고 대조군 %로 표현하였다. A431 세포의 두 타입은 CM에 대해 유사한 민감도를 가졌다. CMD 감쇠 곡선의, CMA에 대한 현저한 좌측 이동은 도 9B에서 보여진 바와 같이, Ley 양성 세포주 (A431/Ley)의 처리 후 관찰되었으나, 도 9A에서 보여진 바와 같이 Ley 음성 세포주 (A431)의 처리 후에는 관찰되지 않았다.
표 7
Figure 112006074065888-PCT00011
상기 실험에서, 인간 암종 세포를 증가하는 농도의 비콘쥬게이트된 또는 콘쥬게이트된 칼리치마이신 ( CMA -676 또는 CMD -193)의 존재 하에 96시간 동안 배양한 후 각 배양물에 살아있는 세포들을 MTS 분석 키트를 이용하여 세수하였다. 상기 표 7에서, CM 은 NAc - Calich DMH 를 지칭하며, CMA -676 및 CMD -193 모두 농도를 칼리치마이신 당량 ( nM )의 관점으로 표현하였으며, 폴드 선택비( fold selectivity ratio )는 CMD 의 ED 50 에 대한 CMA 의 ED 50 비로서 표현된다. 6.7 mg/ mL (가장 높은 시험 농도)에서 비콘쥬게이트된 항-루이스 Y 항체는 검사된 임의의 종양 세포주의 성장에 아무런 영향을 주지 못했다.
실시예 5. 인간 암종 세포 이종이식물의 생체내 성장에 대한 항 루이스 Y 항체 칼리치마이신 콘쥬게이트의 효과
항-루이스 Y 항체에 콘쥬게이트된 칼리치마이신의 항종양 효능을 누드 마우스에서 피하(SC) 이종이식된 인간 암종에 대해 평가하였다. 평가된 이종이식물은 높거나 낮은 정도의 발현의 루이스 Y 항원을 갖는 암종 및 유방, 결장, 폐, 및 전립선 암종을 포함한다. 150 내지 300 mg의 평균 질량의 고형 종양을 가진 마우스를 다양한 처리군에 무작위 배치하였다.
HU3S193 - CM
위 (N87, 도 3), 전립선 (LNCaP, 도 4) 및 결장 (LOVO, 도 5 및 6)의 피하 암종의 이종이식물에 대해 hu3S193-AcBut-CM의 생체내 효능에 대해 시험하였다. N87, LOVO 및 LNCaP의 피하 암종을 무갑상선 누드 마우스에서 성장시켰다 (Charles River, Wilmington, MA). 1.5 내지 3달된 암컷 마우스를 마우스 한 마리당 각각 5x106 N87 또는 107 LOVO 세포를 주사하였다. LNCaP 세포를 3달된 수컷 누드 마우스에게 주사하였다. 종양을 성장시키기 위해, 주사 전 N87 및 LNCaP 세포를 MATRIGEL
Figure 112006074065888-PCT00012
(Collaborative Biomedical Products, Belford, MA)와 혼합하여야 한다 (1:1, vol/vol). 종양의 두 수직 직경을 캘리퍼를 이용하여 1주에 한번 이상 측정하였다. 종양 부피는 Attia & Weiss 식: A2xBx0.4에 따라 계산하였다.
달리 언급되지 않는 한, 각 콘쥬게이트와 대조군의 3회 투약량을 4일 간격으로 복강내 주사하였다 (Q4Dx3). 생체내에서, hu3S193-AcBut-CM은 상기 3개의 별개의 모델에서 종양 성장을 억제하였다. Hu3S193-AcBut-CM은 높은 발현의 루이스 Y 항원을 갖는 위 암종 이종이식물 (N87)로부터 마우스를 치유하였다 (도 3). 전립선 암종 이종이식물 (LNCaP)은 hu3S193-AcBut-CM의 투여후 성장을 멈췄으며 종양 성장의 억제는 결장 암종 이종이식물 (LOVO)로 이루어졌다 (각각 도 5 및 6). LOVO 모델에서, hu3S193-AcBut-CM의 효능은 콘쥬게이트 양의 증대로 향상되었다 (도 5).
N87 위 암종 이종이식물
100 mm3의 N87 (Ley +, CD33- 및 CD20-) 이종이식물을 갖는 마우스를 대조군 콘쥬게이트 (CMA, RITUXAN-AcBut-CM), PBS, hu3S193 또는 hu3S193-AcBut-CM으로 처리하였다. 각 군의 마우스는 3회 용량으로 i.p 투여하였다. 콘쥬게이트 및 대조군을 1일, 5일 및 9일에 주사하였다. 도 3A는 대조군 콘쥬게이트의 효능을 보여주며 도 3B는 hu3S193 및 이의 칼리치마이신 콘쥬게이트의 효과를 보여준다. 에러 바는 각 시점에서의 평균 종양 부피의 표준 편차를 나타낸다. 종양을 갖는 마우스의 처리군 사이의 종양 크기 차이는 2-tailed Students t-test로 규명하였으며, 28일째 p-값은 C에 나타나 있고, n은 군당 마우스 수와 같다. 1, 2, 및 4 ㎍의 cal.eq/용량/마우스에서 hu3S193-AcBut-CM는 N87 이종이식물의 종양 성장을 현저히 억제시켰다(도 3). 100, 60 및 10%의 치유율도 1, 2, 및 4 ㎍의 cal.eq/용량/마우스 각각에서 관찰되었는데, 이는 이종이식물의 크기가 감소되어 치료후 100일 동안 초기 평균 종양 부피를 초과하지 않는다는 것을 가리킨다.
LNCAP 전립선 암종 이종이식물
전립선 종양-함유 마우스를 hu3S193-AcBut-CM, PBS 또는 대조군 콘쥬게이트 CMA로 처리하였다. 범례의 괄호 안의 수는 칼리치마이신/용량/마우스의 양을 나타낸다. 처리군 사이의 종양 크기의 차이는 2-tailed Students t-test로 규명하였다. 30일 째의 p 값은 보고되었으며 n은 마우스 수와 같다. 도 4에 보여진 바와 같이, 대조군 콘쥬게이트는 동등하거나 낮은 용량에서 hu3S193-AcBut-CM 보다 덜한 정도로 종양 성장을 억제하였다. 또한, 대조군 콘쥬게이트 처리 후 0% 치유율이 관찰되었다. hu3S193은, 4 ㎍의 cal.eq의 hu3S193-AcBut-CM로 주어진 단백질 양(120 ㎍)과 같은 용량 및 처방량으로 투여되었을 경우 아무런 효과가 없었다. 이전 실험은 hu3S193-AcBut-CM과 같은 용량으로 칼리치마이신의 투여가 지금까지 시험된 임의의 종양 모델을 억제하지 않는다는 것을 보여주었다.
LOVO 결장 암종 이종이식물
종양 성장을 억제하는 hu3S193-AcBut-CM의 능력은 결장 암종(LOVO) 모델에서도 증명되었다. 100 mm3 의 LOVO 이종이식물을 갖는 마우스를 대조군 콘쥬게이트 (RITUXAN-AcBut-CM, 도 5A), PBS (도 5A 및 5B), hu3S193 (도 5B) 또는 hu3S193-AcBut-CM (도 5B)로 처리하였다. 4 mg/용량에서 Hu3S193-AcBut-CM로 처리된 군을 제외하고, 각 군의 마우스를 3회분 용량의 i.p 주사하였다. 칼리치마이신 당량의 각 투약량은 범례 안에 특정되었다. 콘쥬게이트 및 대조군을 1일, 5일 및 9일에 주사하였다. 군들을 하기와 같이 지정하였다: hu3S193-AcBut-CM은 43일, 47일 및 51일째에 추가로 3회분의 처방량을 투약하였다. 군당 마우스 수(n)는 C에 보고되었다. 30일째 종양 크기의 차이는 2-tailed Students t-test로 그 통계적 유의성에 대해 규명하였다.
Hu3S193는 N87 이종이식물에서 관찰된 것보다는 덜한 정도로 LOVO-이종이식물의 성장을 억제하였다. 대조군 콘쥬게이트 (RITUXAN-AcBut-CM 또는 CMA)의 종양 억제는 무시할 정도로 미미하였다. hu3S193-AcBut-CM에 의해 발생한 억제는 대조군 콘쥬게이트에 의한 것보다 더 오래 지속되었다. 따라서, 한편으로는, 4 및 2 mg의 cal.eq./마우스 (Q4Dx3)의 용량으로 RITUXAN-AcBut-CM 처리 후 종양 크기와, 다른 한편으로는, PBS로 처리 후 종양 크기의 차이는 16일 동안 단지 현저하였다 (p<0.05).
반대로, 4, 2 및 1 mg의 cal.eq./마우스 (Q4Dx3)의 용량에서 hu3S193-AcBut-CM으로 치료는 각각 43일, 22일, 및 16일째에 대해 PBS 처리에서와 통계적인 차이를 초래하였다. 100 mm3 의 LOVO 이종이식물을 갖는 마우스를 대조군 콘쥬게이트로 처리하였다: RITUXAN-AcBut-CM 및 CMA (도 6A), PBS 또는 hu3S193-AcBut-CM (도 6B). 각 군의 마우스를 3회분 또는 4회분 용량으로 i.p 주사하였다. 칼리치마이신 당량의 각 투약량은 범례에 특정되어 있다. 콘쥬게이트 및 대조군을 1일, 5일 및 9일째에 주사하였다. 군을 지정하였다: hu3S193-AcBut-CM*은 13일째 추가 용량을 주사하였다. 군당 마우스 수는 n 이며 2-tailed Students t-test의 p값을 측정하였다.
HCT8S11 결장 암종 이종이식물
HCT8S11 결장 암종 이종이식물을 갖는 마우스를 hu3S193-AcBut-CM의 생체내 활성을 측정하기 위해 시험하였다. CD20-표적화 칼리치마이신-콘쥬게이트된 리툭시맙을 비결합 대조군으로서 사용하였다. 콘쥬게이트를 80 또는 160 mg/kg에서 IP Q4Dx3 투여하였다. 도 21은 칼리치마이신-콘쥬게이트된 hu3S193은 소종양 및 대종양 모두에서 HCT8S11 결장 암종 이종이식물의 성장을 강하게 억제할 수 있다는 것을 보여준다. 루이스 Y-표적화된 콘쥬게이트의 항종양 활성은 항상 CD20 또는 CD33에 표적화된 비특이적 비결합 콘쥬게이트의 활성보다 항상 더 컸다.
CMD -193
CMD-193의 생체내 효능을 위 (N87), 폐 (L2987), 경부/상피 (A431/Ley) 및 결장 (LS174T 및 LOVO) 암종의 피하 이종이식물에 대해 시험하였다. 달리 언급하지 않는 한, 모든 콘쥬게이트 및 대조군을 Q4DX3 스케쥴에 따라 복강내 투여하였다. 면역글로불린의 담체 작용에 기인한 종양 표적화를 모니터하기 위해, CMA를 음성 대조군으로서 사용하였다. 하기 기술된 연구에 기초하여, 15 mg/kg의 CMD-193 용량 (562 내지 803 mg/m2 범위의 콘쥬게이트된 항체 단백질 용량과 같음)을 최소 효능 용량 (MED)으로 하였다.
N87 위 암종 이종이식물
150 mm3의 N87 이종이식물을 갖는 마우스를 대조군 콘쥬게이트 (CMA), PBS, G193-AcBut-CM, hu3S193-AcBut-CM, G193 또는 hu3S193으로 처리하였다. 각 군의 마우스를 3회분의 용량으로 i.p 주사하였다. 칼리치마이신 당량의 각 투약량은 범례에 특정되어 있다. 콘쥬게이트 및 대조군을 1일, 5일 및 9일째에 주사하였다. 도 10A은 대조군 콘쥬게이트의 효능을 보여준다. 도 10B은 CMD-193 및 hu3S193-AcBut-CM의 효과를 예시하는 반면, 도 10C는 유리된 항체의 효능의 결핍을 증명한다. 에러 바는 각 시점에서 평균 종양 부피의 표준 편차를 나타낸다.
CMA는 동일한 용량에서 hu3S193-AcBut-CM 또는 CMD 보다 덜 현저하게 성장을 억제하였다. 4 ㎍의 cal.eq./용량/마우스에서, hu3S193-AcBut-CM 뿐만 아니라 G193-AcBut-CM (CMD)은 N87 이종이식물로부터 마우스를 치유하였다 (도 10). 특이적으로, 40 % 및 60 %의 마우스가 4 ㎍의 cal.eq.의 hu3S193-AcBut-CM 또는 CMD의 투여 후 이들 종양으로부터 치유되었다. 치유라는 용어는 이종이식물의 크기가 감소하고 치료 후 100일 동안 초기 평균 종양 부피를 초과하지 않는다는 것을 의미한다. 또한, hu3S193-AcBut-CM 또는 CMD에 의해 야기된 종양 성장 억제도 2 ㎍의 cal.eq./용량/마우스에서 같았다 (도 10). 이전의 실험들은 hu3S193-AcBut-CM과 동일한 용량의 CM 투여가 임의의 현재 기술된 종양 모델을 억제하지 않는다는 것을 보여준다(데이터로 나타내지 않았음). CM의 투여는 따라서 대조군으로서 생략하였다. G193 뿐만 아니라 hu3S193도 N87 이종이식물의 성장을 억제하지 않았다.
L2987 폐 암종 이종이식물
100 mm3의 L2987 이종이식물을 갖는 마우스를 대조군 콘쥬게이트 (CMA), PBS 또는 CMD로 처리하였다. 각 군의 마우스를 3회분의 용량으로 i.p 주사하였다. 칼리치마이신 당량의 각 투약량은 범례에 특정되어 있다. 콘쥬게이트 및 대조군을 1일, 5일 및 9일째에 주사하였다. 도 11A는 대조군 콘쥬게이트의 효능을 보여주며 도 11B는 CMD의 효과를 예시한다. 에러 바는 각 시점에서 평균 종양 부피의 표준 편차를 나타낸다. 각 군의 초기 종양의 평균보다 작은 종양 크기를 갖는 마우스의 수(%로 표현)를 도 12에 관찰 기간의 함수로서 플롯팅하였다. CMA (도 12A) 또는 CMD (도 12B)로의 처리와 비히클 대조군 (PBS)으로의 처리와 비교하였다.
도 12는 CMD가 0.375 내지 3 ㎍/용량/마우스으로 L2987 성장을 억제한다는 것을 보여준다. 상기 억제의 선택성의 해석은 두 요인에 의해 구속된다. 그 첫번째로서, CMA가 상기 종양 모델에서 현저한 성장 억제 효과를 가진다는 것이다 (도 12). 보다 낮은 용량에서, 상기 억제는 CMD에 의해 발생한 억제보다 덜하다. 두번째로서, 대조군 그룹의 10마리 마우스 중 2마리에서 종양의 자연적 퇴행이 발생하였다는 것이다. 그럼에도 불구하고, 군당 퇴보한 종양의 수는 CMA로 처리된 것들보다 CMD로 처리된 군에서 현저히 높았다. CMD도 발달된 L2987 이종이식물의 성장을 억제하였다.
도 13에 보여진 실험에서, 10마리의 마우스를 L2987 이종이식하였다. 이들 종양들을 1.25 cm3의 평균 부피가 될 때까지 성장시켰다. 0.5 cm3 (즉, 0.66, 1.97 및 1.11 cm3) 보다 큰 부피의 종양을 갖는 3마리의 마우스를 3회분의 4 ㎍ cal.eq.의 CMD (Q4DX3)로 처리하였다. 이들 종양은 첫번째 투약 이후 30일 동안 주춤하였다. 그러나, 충분한 잔존 질병으로 종양이 다시 재발하게 된다. 2.31 cm3 의 종양을 갖는 한마리 마우스도 4 ㎍ cal.eq.의 CMD (Q4DX3)를 투여하였다.상기 대종양은 치료에 반응하지 않아 마우스는 3차 주사 전에 윤리적 이유로 사멸시켜야 한다. 따라서, 3회분의 4 ㎍ cal.eq.의 CMD (Q4DX3)은 0.66 내지 1.97 cm3 의 부피를 갖는 L2987의 종양 성장 억제에는 충분하나 치유에는 부적합하다. 에러 바는 각 시점에서 평균 종양 부피의 표준 편차를 나타낸다.
A431/ LE Y 상피 암종 이종이식물
A431/Ley 상피 암종의 CMD-193 성장 억제도 평가하였다. 약 300 mm3의 A431/Ley 이종이식물을 갖는 마우스를 PBS 또는 CMD로 처리하였다. 각 군의 마우스를 3회분의 용량으로 i.p 주사하였다. 칼리치마이신 당량의 각 투약량은 범례에 특정되어 있다. 콘쥬게이트 및 대조군을 1일, 5일, 및 9일째에 주사하였다. 에러 바는 각 시점에서 평균 종양 부피의 표준 편차를 나타낸다. 결과를 도 14에 나타내었다. 약 100 mm3의 A431/Ley 이종이식물을 갖는 마우스도 대조군 콘쥬게이트 (CMA), PBS, 또는 CMD로 처리하였다. 각 군의 마우스를 3회분의 용량으로 i.p 주사하였다. 칼리치마이신 당량의 각 투약량은 범례에 특정되어 있다. 콘쥬게이트 및 대조군을 1일, 5일, 및 9일째에 주사하였다. 결과를 도 15에 나타냈다; 도 15A는 대조군 콘쥬게이트의 효능을 보여주며 도 15B는 CMD의 효과를 예시한다. 에러 바는 각 시점에서 평균 종양 부피의 표준 편차를 나타낸다.
도 14 및 15에서 보여진 바와 같이, A431/Ley의 CMD 종양 억제의 특이성도 종양의 자연적 퇴보 및 CMA에 의해 야기되는 성장 억제에 의해 얽혀있다. CMD 또는 CMA의 동일한 용량으로 처리 후의 치유된 마우스의 수 비교(도 16)는 CMD 처리의 선택적 장점을 보여준다.
LS174T 결장 암종 이종이식물
CMD로 처리 후 LS174T 이종이식물의 성장 억제는 이전의 종양들과 같이 현저하지는 않지만, 대조군 콘쥬게이트보다는 보다 효과적이다 (도 17). 150 mm3의 LS174T 이종이식물을 대조군 콘쥬게이트 (CMA), PBS 또는 CMD으로 처리하였다. 각 군의 마우스를 3회분의 용량으로 i.p 주사하였다. 칼리치마이신 당량의 각 투약량은 범례에 특정되어 있다. 콘쥬게이트 및 대조군을 1일, 5일 및 9일째에 주사하였다. LS174T 종양은 빠르게 증식하여 대조군 그룹 내에서 모든 마우스를 대종양의 부피 때문에(> 2.5 cm3) 51일의 기간 내에 사멸시켜야 했다. 4 ㎍의 cal.eq. CMD (Q4DX3)로 처리된 군에서, 5마리의 마우스 중 3마리를 대종양 부피 (1/3) 또는 종양의 괴사 (2/3) 때문에 44일 내에 사멸하였다. 다른 두마리 마우스 중 한마리가 125일 동안 무종양으로 유지하였던 반면 다른 한 마리는 소종양이 발달하였다. 2 ㎍의 cal.eq. CMD (Q4DX3) 또는 4 ㎍의 cal.eq CMA (Q4DX3)로 처리된 군에서는 치유가 관찰되지 않았다.
반대로, 2 ㎍의 cal.eq. CMD (Q4DX3)로 처리된 마우스 5마리 중 한마리는 치유되었다. 도 17A은 대조군 콘쥬게이트의 효능을 보여주며 도 17B는 CMD의 효과를 예시한다. 에러 바는 각 시점에서 평균 종양 부피의 표준 편차를 나타낸다.
LOVO 결장 암종 이종이식물
LOVO 이종이식물을 갖는 마우스를 Q4DX3에서 4 ㎍의 cal.eq./용량/마우스와는 다른 처방량의 잠재적인 이익을 연구하기 위해 시험하였다. 약 100 mm3의 LOVO 이종이식물을 갖는 마우스를 PBS, G193 또는 다양한 처방량의 대조군 콘쥬게이트 CMA 또는 CMD로 처리하였다. 칼리치마이신 당량의 각 투약량은 범례에 특정되어 있다. LOVO-모델을 상기 실험 형태를 위해 선택하였는데, 이는 Q4DX3에서 4 ㎍의 cal.eq으로 나타나는 최저 효과 때문이다.
도 18A는 CMA 및 G193의 효능이 부족함을 보여준다. 도 18B 및 18C는 각각 Q4DX3 및 Q4DX4에서 CMD의 효과를 예시한다. 도 18D 및 18E는 다양한 시간차가 주어진 경우의 CMD의 효능을 보여준다. 에러 바는 각 시점에서 평균 종양 부피의 표준 편차를 나타낸다. CMD로의 처리 후 LOVO 이종이식물의 성장 억제는 상기 종양들과 같이 현저하지는 않다. 그러나, 4회차 용량의 첨가는 보다 적은 양을 투여하게 될 뿐 아니라 주사 시간 간격을 줄이면서 CMD의 효능을 보다 빈번히 향상시키는 것으로 보여진다.
MX1 유방 암종 이종이식물
낮은 발현의 루이스 Y 항원을 갖는 암종의 발달된 이종이식물의 성장에 대한 CMD-193의 효과도 MX1 유방 암종에서 검사하였다. CMA-676을 비결합 대조군 콘쥬게이트로서 사용하였다. MX1 유방 암종이 외식된 누드 마우스를 다양한 용량의 CMD-193 (40 내지 240 mg/kg) 또는 CMA-676 (음성 대조군)으로 처리하였다. 종양 성장을 35일 이상 동안 기록하였다. 80 mg/kg와 같이 낮은 용량에서 CMD-193는 도 22에 보여진 바와 같이 MX1 이종이식물 성장에 현저한 성장 억제를 야기시켰다. 반대로, CMA-676은 시험된 가장 높은 용량에서만 효과적이었다(160 mg/kg).
CMD -193의 최대 비치사 용량
도 19에 예시된 실험에서, 10마리 마우스 여덟 군을 사용하였다. 각 군을 총 3회분 투여 (Q4DX3)에 대해 4일 간격 마다 0 내지 9.9 ㎍ cal.eq. (0 내지 396 ㎍/kg) 범위에서 증가하는 용량에서 CMD 투여하고 이들의 생존을 105일 되는 날까지 모니터링하였다. 비히클로 처리된 대조군 그룹은 전체 관찰 기간 동안 한마리의 치사가 있었다. 비슷한 치사로 초래되는 가장 높은 용량은 5.7 ㎍ cal.eq CMD 였다. 대조군 그룹에서보다 더 먼저 이러한 치사가 발생되기 때문에, 당업자라면 이것이 약물 관련 독성 때문이라는 것을 언급할 수 있다. 284 ㎍/kg 이상의 용량은 처리된 마우스의 현저히 더 높은 치사율을 초래하며, 7.1, 8.5 및 9.9 ㎍ cal.eq.으로의 처리는 현저히 높은 치사율 뿐만 아니라, 비히클 대조군으로의 처리보다 더 이른 치사 개시를 초래하였다. 228 ㎍/kg 이하의 용량에서 CDM-193으로 처리된 마우스의 생존은 비히클 대조군 마우스와 유사하였다. 이러한 데이터를 종합해 보면, CMD의 최대 비치사 용량 (MND)은 5.7 ㎍ cal.eq. (228 ㎍/kg, 이는 8.5 내지 12.2 mg/m2 범위의 콘쥬게이트된 항체 단백질과 같음) Q4DX3 이었다. 상기 MND는 예를 들어, L2987 모델에서 15 ㎍/kg의 MED로 주어진 것과 같이, 대두분의 종양 모델에서 효율적인 용량 (MED) 보다 상당히 높으며, CMD-193은 19의 치료 지수(MND/MED)를 갖는 강한 항종양 활성을 나타낸다.
실시예 6. 독성학
콘쥬게이트 CMD 193의 독성을 마우스 및 랫트에서의 단일 용량 정맥내(IV) 독성 연구와, 랫트 및 개에서의 용량 범위, 반복 용량, 4-사이클(사이클은 1 용량/2주) IV 독성 연구에서 평가하였다. 독성동태 및 면역원성 평가도 랫트 및 개에서 4-사이클 독성 연구의 일부로서 수행하였다. CMD-193의 유전독성 잠재력을 박테리아 역 돌연변이 및 마우스 소핵 분석에서 평가하였다.
랫트 및 개(루이스 Y 항원의 발현을 위해 선택됨)에서 CMD-193의 단일- 또는 반복-용량 투여는 일반적으로 유사한 생체내 효과(감소된 체중 및 음식 소비 및 골수 및 림프 기관 독성을 나타내는 혈액 변화)와 표적 기관 독성을 나타낸다. 전체적으로, CMD-193의 독성은 랫트 및 개에서 거의 비슷하다. 비슷한 화합물 관련 연구 결과가 암컷 및 수컷에서 관찰되었다. 두 종 모두에서 독성의 표적 기관은 골수, 흉선, 및 수컷 생식기였다. 간장(랫트) 및 위장 (GI)관(개)도 표적 기관이었다. 랫트 및 개의 다중 표적 기관에서의 CMD-193-관련 효과는 CMD 193에서 비콘쥬게이트된 칼리치마이신 유도체에 기인하는 비특이적 세포독성과 일치하지만, CMD-193-처리된 개의 GI 변화도 조직 교차반응 연구에서 관찰된 바와 같은 GI관 상피에의 G193 항체의 결합 및 비콘쥬게이트된 칼리치마이신 유도체의 후속 방출을 반영하는 것일 수 있다.
단일-용량 IV 연구
랫트의 단일-용량 정맥내 주사 (IV) 안전성 약리시험 연구에서, 1.18, 3.54, 또는 10.69 mg 단백질/m2의 용량에서 CMD-193은 중추신경계 또는 호흡기계에 어떠한 불리한 영향도 주지 않았다. 개의 단일 용량 심혈관 안전성 약리시험 연구에서, 1.3 또는 6.7 mg 단백질/m2의 IV 용량에서 CMD 193은 심박률 또는 동맥 혈압에 있어서 불리한 변화를 주지 못하였다. 6.7 mg 단백질/m2(ECG는 1.3 mg 단백질/m2에서는 검사하지 않음)에서 검사된 임의의 심전도(ECG) 검사에서 형태학적 이상성, 비정상적인 심방 또는 심실 부정맥, 또는 화합물 관련 QT 연장선의 정황은 없었다.
단일 용량으로서 IV 투여되는 경우, 가장 높은 비치사성 용량의 CMD-193은 마우스에서 15.30 mg 단백질/m2이었고, 랫트에서 30.09 mg 단백질/m2이었고; 이들은 76 mg/mL (칼리치마이신 당량)의 최대 농도 및 5 mL/kg의 최대 용량 부피에 기초하여 최대로 적합한 용량들이다. 불리한 영향을 주지 않는 용량은 마우스에서 15.30 mg 단백질/m2이었고, 랫트에서 15.81 mg 단백질/m2이었다.
용량-범위 연구
CMD-193을 이용한 용량-범위 연구에서, 12 mg 단백질/m2의 가장 높은 시험된 단일 용량에서 1마리의 개에서 안락사가 필요한 빈사 상태가 발생하였고; 이러한 빈사 상태는 점액질 변성 및 괴사의 CMD-193 관련 위장의 약한 변화 내지 중간 정도의 변화에 기인하였다. 시험된 임의의 용량(30.09 mg 단백질/m2 이하)에서 죽거나 전기적으로 안락사된 랫트는 없었다.
4-사이클 연구
4-사이클 독성 연구에서, 투여된 CMD-193의 용량은 랫트에서 0.55, 1.98, 또는 5.55 mg 단백질/m2/사이클이었고, 개에서는 0.36, 1.2, 또는 3.59 mg 단백질/m2/사이클이었다. 상기 연구에서, G193 항체 단독으로 랫트에서 5.55 mg 단백질/m2/사이클이, 개에서는 3.59 mg 단백질/m2/사이클이 투여되었다. CMD-193의 최대 허용 용량 (MTD)은 랫트에서 5.55 mg 단백질/m2/사이클이었고, 개에서는 3.59 mg 단백질/m2/사이클이었으며(투여된 가장 높은 용량); 이들 용량은 용량-제한 또는 생명을 위협할 정도의 독성을 유도하지는 않았다. 랫트에서의 4-사이클 연구에서, CMD-193에 대한 무독성량(NOAEL)은 0.55 mg 단백질/m2/사이클에서 관찰된 현미경 관찰 결과(고환성 관상 위축)에 기초할때 성립되지 않았다. 5.55 mg 단백질/m2/사이클에서의 암수 모두의 간세포 비정상적 거대화(karyomegaly/cytomegaly)에 기초할때, 랫트의 4-사이클 연구의 암컷의 NOAEL은 1.98 mg 단백질/m2/사이클이었다. 개의 4-사이클 연구에서, 수컷의 CMD-193에 대한 NOAEL은 0.36 mg 단백질/m2/사이클에서 현미경 관찰 결과(2차 부고환 정액과소증(secondary epididymal hypospermia)을 갖는 고환성 관상 퇴행 및 약한 부고환 상피 퇴행(slight epididymal epithelial degeneration))에 기초할 때 성립되지 않았다. 암수 모두 3.59 mg 단백질/m2/사이클에서 GI관의 점액성 상피 퇴행의 현미경 관찰 결과에 기초할 때, 개의 4-사이클 연구에서 암컷의 CMD-193에 대한 NOAEL은 1.2 mg 단백질/m2/사이클이었다.
랫트의 4-사이클 독성 연구에서, 5.55 mg 단백질/m2/사이클의 G193 항체 단독 시험 용량은 임의의 G193 항체-관련 독성을 초래하지는 않았다. 개의 4 사이클 독성 연구에서, 3.59 mg 단백질/m2/사이클의 G193 항체 단독 시험 용량은 용량 제한 또는 생명을 위협할 정도의 독성을 초래하지는 않았다. 개에 대한 본 연구의 G193 항체-관련 독성은 약한 고환성 관상 퇴행 및 약한 위장관 점액성 퇴행을 포함한다.
G193 항체, 비콘쥬게이트된 (유리된) 칼리치마이신 유도체, 및 총 칼리치마이신 유도체(랫트만)의 독성동태 평가 뿐만 아니라, 랫트 혈청에서 CMD-193에 특이적인 항체 및 개 혈청에서 G193에 대해 특이적인 항체의 존재의 측정도 4 사이클 반복-용량 IV 독성 연구의 일부로서 수행하였다.
유전독성 연구
CMD-193은 박테리아 역 돌연변이 분석에서 돌연변이성에 대해 음성이었지만, 생체내 마우스 소핵 분석에서는 유발성(clastogenic)이었다. 상기 분석에서 양성 반응이 예측되었고 이는 칼리치마이신과 다른 엔다인(enediyne) 항종양 항생제에 의한 DNA 파괴(유발성, clastogenicity)의 유도로서 일치하였다.
교차 반응 연구
교차 반응 연구에서, 비콘쥬게이트된 G193 항체는 랫트 및 개의 침샘 및 GI관에서, 그리고 개에서만은 췌장 및 간장(담 상피)에서 특이적 염색을 보여주었다. 추가의 연구에서, 가장 현저하고 G193 항체와 일치하는 염색은 랫트, 개, 및 인간의 GI관 (대장 및 위의 상피), 방광 (상피), 질 (상피), 및 뇌하수체 (샘뇌하수체의 내분비 세포)에서였다. 랫트, 개, 및 인간에서 CMD-193의 G193 항체 성분이 루이스 Y 항원의 발현과 관련된 조직과 교차 반응하기 때문에, 이들 결과는 랫트와 개가 CMD 193로 수행된 비임상적 연구에 적합한 종임을 증명하는 것이다.
실시예 7. 항-루이스 Y 항체 칼리치마이신 콘쥬게이트의 안정한 제형
생체내 투여를 위한 항-루이스 Y 항체 칼리치마이신 콘쥬게이트 (hu3S193-AcBut-CM 및 CMD-193)의 안정한 제형을 제조하였다. 20 mM TRIS (pH 8.0) 중 약 19 mg의 CMD-193, 및 100 mM의 염화나트륨을 표 8 또는 9에 따라 하기와 같이 제형화하였다.
표 8
성분 함량
CMD-193 1 mg/mL
수크로스 5%
TRIS 20 mM
염화나트륨 50 mM
염산, 1 N pH를 7.5 및 8.0으로 조정
멸균수 q.s
표 9
활성 성분 불활성 성분
CMD-193 (5 mg) 부피 5 mL 채움 5% 수크로스 0.01% Tween 80 10 mM 염화나트륨 20 mM TRIS HCl로 pH를 8.0로 조절
CMD-193의 두 뱃치를 동결건조하였다. 제형의 차이는 pH이었는데, 하나는 pH 7.5에서, 다른 하나는 pH 8.0에서 완충되었다. pH 8.0 제형의 4개의 바이알을 멸균수로 다시 채우고 폴리프로필렌 튜브에서 혼합하였다. pH를 측정한 후 용액을 4 분할하여 25℃에 놓았다. 유사하게 4개의 바이알을 사용하여 pH 7.5에서의 유사 연구를 설정하였다. 용액을 혼합하는 경우, pH를 0.1 N 염산을 이용하여 7.5로 재조정하였다. 4개의 바이알을 더 사용하여 pH 7.0 용액을 제조하였다. 용액들을 초기 분석하였고 나머지들은 25℃에서 안정성 챔버에 보관하였다. 이후 용액들을 2일 및 7일 후 분석하여 그 결과들을 하기 표 10에 나타내었다(25℃에서 1주 동안 pH 7.0, 7.5, 및 8.0에서 CMD-193 벌크 용액의 안정성). 용액들은 흐릿하게 되는 것이 관찰되었으며 맑은 침전물이 pH 7.0 및 pH 7.5 용액에서 25℃에서 1주 후에 관찰되었다. 상기 결과에 기초하여, pH 8.0에서 완충된 용액은 3가지 경우 중에서 최적의 안정성을 유도하였으며 TRIS가 버퍼로서 선택되었다.
표 10
날짜 pH 비콘쥬게이트된 칼리치마이신 (mg/mg의 단백질) 응집률 (%)
pH 7.0 7.5 8.0 7.0 7.5 8.0 7.0 7.5 8.0
0 7.056 7.432 8.039 0.50 0.41 0.61 3.25 3.38 3.33
2 2.09 1.83 1.69 2.47 3.06 3.25
7 6.919 7.321 7.933 6.24 5.52 4.63 1.87 2.60 3.34
다른 실시예에서, 20 mM TRIS (pH 8.0) 중 약 35 mg의 CMD-193 및 100 mM 염화나트륨를 사용하였다. 이로부터, CMD-193의 두 추가적 제형을 제조하였다. 첫번째 제형은 5% 수크로스를 포함하였으며 pH 8.0에서 TRIS로 완충하였다. 최종 제형을 하기 표 11에 기술하였다.
표 11
성분 함량
CMD-193 1 mg/mL
수크로스 5%
TRIS 20 mM
염화나트륨 50 mM
염산, 1 N pH를 8.0으로 조정
멸균수 q.s
두번째 제형을 제조하기 위해, 사용된 CMD-193의 농도 (총 단백질 2.23 mg/mL)을 멸균수로 희석하여 단백질의 농도가 1 mg/mL이 되도록 하였다. 이후 상기 용액을 30,000 돌턴 미만의 분자에 대해 투과성인 센트리콘 필터 유닛을 사용하여 원심분리하였다. 용액 부피를 이등분하는 경우, 이는 5 mM K2HPO4, 50 mM NaCl, 10% 수크로스 용액으로 희석하였다. 최종 제형을 하기 표 12에 기술하였다.
표 12
성분 함량
CMD-193 1 mg/mL
수크로스 5%
K2HPO4 (버퍼 교환됨) 5 mM
염화나트륨 50 mM
염산, 1 N pH를 7.5로 조정
멸균수 q.s
pH 7.5 및 pH 8.0에서 제조된 CMD-193의 바이알을 표 13 (두번째 제형, 다른 용액들로 재구성된 CMD-193의 시각적 관찰을 보여줌)에 열거된 다양한 용액으로 재구성하고, 바이알들을 시각적인 입자 상태에 대해 관찰하였다. 모든 경우에 있어서, pH 8.0에서 완충된 용액들은 pH 7.5에서 완충된 용액들 보다 더 청명하였다. 계면활성제의 첨가는 모든 경우에 있어서 유익하였다. 멸균수 (wfi)로 혼합된 바이알에서의 침전물을 여과하여 현미경 검사를 위해 수집하였다.
표 13
pH 재구성 용액 관찰
7.5 wfi 침전
7.5 0.01% Tween 80 맑음
7.5 0.1% Tween 80 맑음
7.5 0.1% Poloxamer 188 약간 흐림
7.5 10% 프로필렌 글리콜 침전
8.0 wfi 침전
8.0 0.01% Tween 80 맑음
8.0 0.1% Tween 80 맑음
8.0 0.1% Poloxamer 188 맑음
8.0 10% 프로필렌 글리콜 맑음
상기에 기초하여, 용액에 계면활성제의 첨가는 가용성을 위해 필요한 것으로 보였다. Tween 80 (0.01%)은 1 mg/ml의 가용성을 위해 선택하여 사용하였다. 최종 제형은 5% 수크로스, 0.01% Tween 80, 20 mM TRIS (pH 8.0), 및 50 mM 염화나트륨을 포함하였다.
CMD-193의 두 뱃치를 더 사용하였다. 첫번째 뱃치를 초여과를 수반하는 HIC를 이용하여 정제하고, 두번째 뱃치는 콘쥬게이션 후 직접 초여과를 이용하였다. 두 제형들을 하기 표 13 및 14와 같이 제형화하였다.
표 14
성분 함량
CMD-193 1 mg/mL
수크로스 5%
TRIS 20 mM
염화나트륨 50 mM
염산, 1 N pH를 8.0로 조정
멸균수 q.s
5℃에서 벌크 용액의 안정성 (표 15) 및 25℃에서 동결건조 생성물의 안정성 (표 16) 검사를 수행하여 하기에 요약하였다.
표 15
개시 1주 2주
LIMS # 200272733 200273196 200273639
App & Desc ; 케이크 합치 합치 합치
App & Desc; 재구성 합치 합치 합치
단백질 함량 (mg/mL) 1.05 1.06 1.06
총 칼리치마이신 (mg/mg의 단백질) 66
비콘쥬게이트된 칼리치마이신(총 칼리치마이신%) 1.13 2.31 2.64
응집률 (%) 3.02 3.39 3.32
pH 재구성 7.83 7.79 7.71
SDS-PAGE 환원 (%) 100 100
항원 결합 ELISA 108
비콘쥬게이트된 항체 (%) 1.77
표 16
개시 2주 4주
LIMS # 200273198 200273204 200274024 200274713 200274715
App & Desc; 케이크 합치 합치 합치
App & Desc; 재구성 합치 합치 합치
단백질 함량 (mg/바이알) 0.99 0.99 0.98
총 칼리치마이신(mg/mg의 단백질) 67 67
비콘쥬게이트된 칼리치마이신(총 칼리치마이신%) 1.11 1.59 1.56
응집률 (%) 3.32 3.17 3.18
pH 재구성 7.76 7.78 7.75
수분 0.95 1.19
SDS-PAGE 환원 (%) 100
항원 결합 ELISA (%) 99
희석 및 투여
주사를 위한 CMD-193을 20-mL 앰버 유리 바이알 중에 멸균된 백색의, 보존제 무함유된, 동결건조된 분말로서 제공하였다. 각 단일 바이알 패키지는 5 mg의 CMD 193 동결건조된 분말을 포함한다. 주사용 CMD-193은 냉장 보관 (2 내지 8℃/36 내지 46℉) 될 수 있고 빛으로부터 차단하였다.
약물 제품은 광민감성이며, 제조 및 투여 동안 직접 및 간접적인 일광 및 비차폐된 형광으로부터 보호될 수 있다. 모든 제조는 바람직하게는 생물학적으로 안전한 후드 내에서 수행한다. 동결건조된 약물은 바이알의 실온으로의 평형없이 재구성될 수 있다. 멸균된 주사기를 사용하여 5 mL의 주사용 멸균수(USP)로 각 바이알의 함량을 재구성하였다. 상기 공정을 돕기 위해 약하게 흔들어 주었다. 재구성 후 투여 전에, 각 바이알의 약물을 그 입자 상태 및 변색에 대해 시각적으로 검사하였다. 재구성된 용액의 최종 농도는 1 mg/mL이었다.
벤질 알콜 또는 임의의 다른 보존제를 포함하는 멸균수(USP)는 주사용 CMD-193의 재구성을 위해 추천할 만하지는 않다.
일단 재구성되면, 약물 용액을 0.9% 염화나트륨 주사액(USP)으로 추가로 희석시키고 바이알 재구성 후 4시간 이내에 투여한다. 주사용 CMD-193의 재구성된 바이알은 동결시켜서는 안된다.
투여를 위한 최종 용량을 제조하기 위해, 재구성된 약물의 적절한 양을 충분한 0.9% 염화나트륨 주사액(USP)에 주입하여 50 mL의 최종 부피를 제조하였다. 혼합 백 또는 용기는 폴리올레핀으로 이루어지거나 폴리에틸렌 재질의 접촉 표면을 포함하며, 자외선 광 보호기를 구비한다.
주사용 CMD-193은 IV 푸쉬(push) 또는 볼루스로서 투여되어서는 안된다.
프로그램된 주입 펌프를 통해 1시간(±15분)에 걸쳐 일정한 속도로 IV 주입으로 혼합 용액(총 용량)을 환자들에게 투여하였다. 주입 용기를 빛으로부터 차단시켜야 하지만, 주입관을 빛으로부터 차단시킬 필요는 없다. 주입관은 폴리올레핀 또는 폴리에틸렌 재질일 수 있다. 인라인 필터를 CMD-193 투여에서 사용해서는 안된다.
상기 인용된 모든 참조 문헌 및 특허는 본원에 참조로서 포함된다. 본 발명의 다양한 변화 및 변경이 상기 명세서에 포함되며 이는 당업자에게 명백할 것이다. 콘쥬게이션 공정, 상기 공정에 의해 제조된 콘쥬게이트, 및 콘쥬게이트를 포함하는 조성물/제형에 대한 이러한 변화 및 변경은 청구항의 범위 내에 포함된다.
[서열목록]
Figure 112006074065888-PCT00013
Figure 112006074065888-PCT00014
Figure 112006074065888-PCT00015
Figure 112006074065888-PCT00016
Figure 112006074065888-PCT00017
Figure 112006074065888-PCT00018
Figure 112006074065888-PCT00019
Figure 112006074065888-PCT00020
Figure 112006074065888-PCT00021
Figure 112006074065888-PCT00022
Figure 112006074065888-PCT00023
Figure 112006074065888-PCT00024
Figure 112006074065888-PCT00025
Figure 112006074065888-PCT00026
Figure 112006074065888-PCT00027
Figure 112006074065888-PCT00028
Figure 112006074065888-PCT00029
Figure 112006074065888-PCT00030
Figure 112006074065888-PCT00031
Figure 112006074065888-PCT00032
Figure 112006074065888-PCT00033
Figure 112006074065888-PCT00034
Figure 112006074065888-PCT00035
Figure 112006074065888-PCT00036
Figure 112006074065888-PCT00037
Figure 112006074065888-PCT00038
Figure 112006074065888-PCT00039
Figure 112006074065888-PCT00040
Figure 112006074065888-PCT00041
Figure 112006074065888-PCT00042
Figure 112006074065888-PCT00043
Figure 112006074065888-PCT00044
Figure 112006074065888-PCT00045
Figure 112006074065888-PCT00046
Figure 112006074065888-PCT00047

Claims (100)

  1. 데옥시콜레이트 족(family)의 구성원 또는 이의 염의 존재 하에 약 7 내지 약 9의 pH에서 (i) 활성화된 칼리케아미신―가수분해가능한 링커 유도체와 (ii) IgG1 항체를 반응시키는 단계를 포함하는, 칼리케아미신 컨쥬게이트의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 데옥시콜레이트 족 구성원은 하기 화학식 (A) 내지 (C) 중 하나를 가지는 것인 방법:
    화학식 (A)
    Figure 112006074065888-PCT00048
    (상기 식에서,
    X1 내지 X5 중 둘은 H 또는 OH이고, 나머지 셋은 독립적으로 O 또는 H이고;
    R1은 (CH2)n이고, 여기서 n은 0-4이며;
    R2는 OH, NH(CH2)mCOOH, NH(CH2)mSO3H, 또는 NH(CH2)mPO3H2이고, 여기서 m은 1-4임);
    화학식 (B)
    Figure 112006074065888-PCT00049
    (상기 식에서,
    X1 내지 X4 중 하나는 H 또는 OH이고, 나머지 셋은 독립적으로 O 또는 H이며;
    R1은 (CH2)n이고, 여기서 n은 0-2이며;
    R2는 OH, NH(CH2)mCOOH, 또는 NH(CH2)mSO3H이고, m은 2임); 및
    화학식 (C)
    Figure 112006074065888-PCT00050
    (상기 식에서,
    X1 내지 X4 중 하나는 OH이고, 나머지 셋은 H이며;
    R1은 (CH2)n이고, 여기서 n은 0-2이며;
    R2는 OH 또는 NH(CH2)2SO3H임).
  3. 제1항에 있어서, 데옥시콜레이트 족 구성원은 케노데옥시콜산, 히오데옥시콜레이트 산, 우로소데옥시콜산, 글리코데옥시콜산, 타우로데옥시콜산, 타우로우르소데옥시콜산 또는 타우로케노데옥시콜산인 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 데옥시콜레이트 족 구성원은 약 10 mM 농도의 데옥시콜산인 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 칼리케아미신 유도체는 IgG1 항체의 약 3 내지 약 9 중량%인 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 칼리케아미신 유도체는 IgG1 항체의 약 7 중량%인 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, IgG1 항체는 항-루이스(Lewis) Y 항체인 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 항-루이스 Y 항체는 G193 또는 Hu3S193인 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 칼리케아미신 유도체는 칼리케아미신의 N-아실 유도체 또는 칼리케아미신의 이황화물 유사체인 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 칼리케아미신 유도체는 N-아세틸 감마 칼리케아미신 디메틸 히드라지드(N-아세틸 칼리케아미신 DMH)인 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 가수분해가능한 링커는 4-(4-아세틸에페녹시) 부탄산(AcBut)인 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, pH는 약 8.2인 것인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 칼리케아미신 컨쥬게이트를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 정제는 크로마토그래피 분리 및 한외여과/정용여과를 포함하는 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 크로마토그래피 분리는 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)인 것인 방법.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 정제 단계 후, 컨쥬게이트의 평균 로딩(loading)은 IgG1 항체 1 몰 당 약 5 내지 약 7 몰의 칼리케아미신인 것인 방법.
  17. 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 정제 단계 후, 컨쥬게이트 중 저 컨쥬게이션 분획(low conjugated fraction; LCF)은 약 10% 미만인 것인 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 칼리케아미신 컨쥬게이트.
  19. 제13항의 방법에 의해 제조된 칼리케아미신 컨쥬게이트.
  20. 제13항의 방법에 의해 제조된 칼리케아미신 컨쥬게이트로서, 칼리케아미신 유도체가 N-아세틸 감마 칼리케아미신 디메틸 히드라지드(N-아세틸 칼리케아미신 DMH)이고, 가수분해가능한 링커가 4-(4-아세틸에페녹시) 부탄산(AcBut)이며, 데옥시콜레이트 족 구성원이 약 10 mM 농도의 데옥시콜산이고, pH가 약 8.2이며, 정제 단계 후, 칼리케아미신 컨쥬게이트의 평균 로딩이 IgG1 항체 1 몰 당 약 5 내지 약 7 몰의 칼리케아미신이고, 컨쥬게이트 중 저 컨쥬게이션 분획(LCF)이 약 10% 미만이 것인 칼리케아미신 컨쥬게이트.
  21. 항-루이스 Y 항체에 공유 결합된 칼리케아미신―가수분해가능한 링커 유도체로 된 컨쥬게이트를 포함하는 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 칼리케아미신 유도체는 칼리케아미신의 N-아실 유도체 또는 칼리케아미신의 이황화물 유사체인 것인 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 칼리케아미신 유도체는 N-아세틸 감마 칼리케아미신 디메틸 히드라지드(N-아세틸 칼리케아미신 DMH)인 것인 조성물.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 가수분해가능한 링커는 4-(4-아세틸에페녹시) 부탄산(AcBut)인 것인 조성물.
  25. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 항-루이스 Y 항체는 G193 또는 Hu3S193인 것인 조성물.
  26. 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 평균 로딩은 항-루이스 Y 항체 1 몰 당 약 5 내지 약 7 몰의 칼리케아미신인 것인 조성물.
  27. 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 컨쥬게이트는 약 1 × 10-7 M 내지 약 4 × 10-7 M의 KD를 가지는 것인 조성물.
  28. 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 컨쥬게이트는 약 3.4 × 10-7 M의 KD를 가지는 것인 조성물.
  29. 제21항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 컨쥬게이트는 루이스 Y 항원에 결합하고, 루이스 X 및 H-2 혈액군 항원에는 결합하지 않는 것인 조성물.
  30. 제21항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 컨쥬게이트는 세포독성 활성을 가지는 것인 조성물.
  31. 제21항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 컨쥬게이트는 항-종양 활성을 가지는 것인 조성물.
  32. 제21항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 컨쥬게이트는 치료 유효량으로 존재하는 것인 조성물.
  33. G193에 공유 결합된 N-아세틸 감마 칼리케아미신 디메틸 히드라지드―4-(4-아세틸에페녹시) 부탄산(N-아세틸 칼리케아미신 DMH―AcBut)로 된 컨쥬게이트를 포함하는 조성물로서, 평균 로딩이 G193 1 몰 당 약 5 내지 약 7 몰의 N-아세틸 칼리케아미신 DMH이고, 컨쥬게이트 중 저 컨쥬게이션 분획(LCF)이 약 10% 미만인 조성물.
  34. 제21항 내지 제33항 중 어느 한 항의 조성물의 생물학적 활성을 보존하는 방법으로서,
    상기 조성물을 용액 중의 동결보호제(cryoprotectant), 계면활성제, 완충제 및 전해질과 접촉시키는 단계; 및
    상기 용액을 동결건조하는 단계
    를 포함하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 컨쥬게이트는 약 0.5 ㎎/㎖ 내지 약 2 ㎎/㎖의 농도로 존재하는 것인 방법.
  36. 제35항에 있어서, 컨쥬게이트는 1 ㎎/㎖의 농도로 존재하는 것인 방법.
  37. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 동결보호제는 약 1.5 중량% 내 지 약 6 중량%의 농도로 존재하는 것인 방법.
  38. 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 동결보호제는 당 알코올 또는 탄수화물인 것인 방법.
  39. 제38항에 있어서, 동결보호제는 트레할로스, 만니톨 또는 소르비톨인 것인 방법.
  40. 제38항에 있어서, 동결보호제는 약 5% 농도의 슈크로스인 것인 방법.
  41. 제34항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 계면활성제는 약 0.005% 내지 약 0.05%의 농도로 존재하는 것인 방법.
  42. 제41항에 있어서, 계면활성제는 0.01 중량% 농도의 폴리소르베이트(Polysorbate) 80 또는 약 0.01% 농도의 트윈(Tween) 80인 것인 방법.
  43. 제34항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 완충제는 약 5 mM 내지 약 50 mM의 농도로 존재하는 것인 방법.
  44. 제43항에 있어서, 완충제는 약 20 mM 농도의 트리스(Tris)인 것인 방법.
  45. 제34항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 전해질은 약 5 mM 내지 약 100 mM의 농도로 존재하는 것인 방법.
  46. 제45항에 있어서, 전해질은 나트륨 또는 칼륨 염인 것인 방법.
  47. 제45항에 있어서, 전해질은 약 10 mM 농도의 NaCl인 것인 방법.
  48. 제34항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 동결건조 전의 pH는 약 7.8 내지 약 8.2인 것인 방법.
  49. 제48항에 있어서, 동결건조 전의 pH는 약 8.0인 것인 방법.
  50. 제34항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 동결건조는
    약 -35℃ 내지 약 -50℃의 온도에서 용액을 동결시키는 단계;
    동결된 용액을 약 20 내지 약 80 마이크론의 제1 건조 압력 및 약 -10℃ 내지 약 -40℃의 저장 온도에서 24 내지 78 시간 동안 초기 건조하는 단계; 및
    동결-건조된 생성물을 약 20 내지 약 80 마이크론의 제2 건조 압력 및 약 +10℃ 내지 약 +30℃의 저장 온도에서 15 내지 30 시간 동안 2차적으로 건조하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  51. 제50항에 있어서, 동결 단계는 약 -45℃에서 수행하고; 초기 동결 건조 단계는 약 60 마이크론의 제1 건조 압력 및 약 -30℃의 저장 온도에서 60시간 동안 수행하고; 2차 건조 단계는 약 60 마이크론의 건조 압력 및 약 +25℃의 저장 온도에서 약 24 시간 동안 수행하는 것인 방법.
  52. 제34항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 동결건조 전에 증량제(bulking agent)를 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  53. 제52항에 있어서, 증량제는 약 0.5 중량% 내지 약 1.5 중량%의 농도로 첨가하는 것인 방법.
  54. 제52항에 있어서, 증량제는 약 0.9 중량% 농도의 덱스트란(Dextran) 40 또는 약 0.9 중량% 농도의 히드록시에틸 전분 40인 것인 방법.
  55. 제34항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 컨쥬게이트는 세포독성 활성을 가지는 것인 방법.
  56. 제34항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 컨쥬게이트는 항-종양 활성을 가지는 것인 방법.
  57. 제34항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 컨쥬게이트는 치료 유효량으로 존재하는 것인 방법.
  58. 제34항에 있어서, 컨쥬게이트는 G193에 공유 결합된 N-아세틸 감마 칼리케아미신 디메틸 히드라지드―4-(4-아세틸에페녹시) 부탄산(N-아세틸 칼리케아미신 DMH―AcBut)이고, 평균 로딩은 G193 1 몰 당 약 5 내지 약 7 몰의 N-아세틸 칼리케아미신 DMH이고, 컨쥬게이트 중 저 컨쥬게이션 분획(LCF)은 약 10% 미만인 것인 방법.
  59. 칼리케아미신―항-루이스 Y 항체 컨쥬게이트, 동결보호제, 계면활성제, 완충제 및 전해질을 포함하는 제제.
  60. 제59항에 있어서, 컨쥬게이트는 약 0.5 ㎎/㎖ 내지 약 2 ㎎/㎖의 농도로 존재하는 것인 제제.
  61. 제60항에 있어서, 컨쥬게이트는 약 1 ㎎/㎖의 농도로 존재하는 것인 제제.
  62. 제59항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 동결보호제는 약 1.5 중량% 내 지 약 6 중량%의 농도로 존재하는 것인 제제.
  63. 제62항에 있어서, 동결보호제는 당 알코올 또는 탄수화물인 것인 제제.
  64. 제63항에 있어서, 동결보호제는 트레할로스, 만니톨 또는 소르비톨인 것인 제제.
  65. 제63항에 있어서, 동결보호제는 약 5% 농도의 슈크로스인 것인 제제.
  66. 제59항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 계면활성제는 약 0.005% 내지 약 0.05%의 농도로 존재하는 것인 제제.
  67. 제66항에 있어서, 계면활성제는 약 0.01 중량% 농도의 트윈 80인 것인 제제.
  68. 제59항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 완충제는 약 5 mM 내지 약 50 mM의 농도로 존재하는 것인 제제.
  69. 제59항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 완충제는 약 20 mM 농도의 트리스인 것인 제제.
  70. 제59항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 전해질은 약 5 mM 내지 약 100 mM의 농도로 존재하는 것인 제제.
  71. 제59항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 전해질은 나트륨 또는 칼륨 염인 것인 제제.
  72. 제59항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 전해질은 약 10 mM 농도의 NaCl인 것인 제제.
  73. 제59항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, pH는 약 7.8 내지 약 8.2인 것인 제제.
  74. 제73항에 있어서, pH는 약 8.0인 것인 제제.
  75. 제59항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 칼리케아미신은 칼리케아미신의 N-아실 유도체 또는 칼리케아미신의 이황화물 유사체인 것인 제제.
  76. 제75항에 있어서, 칼리케아미신은 N-아세틸 감마 칼리케아미신 디메틸 히드라지드(N-아세틸 칼리케아미신 DMH)인 것인 제제.
  77. 제59항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 가수분해가능한 링커는 4-(4-아세틸에페녹시) 부탄산(AcBut)인 것인 제제.
  78. 제59항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 항-루이스 Y 항체는 G193 또는 Hu3S193인 것인 제제.
  79. 제59항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 평균 로딩은 항-루이스 Y 항체 1 몰 당 약 5 내지 약 7 몰의 칼리케아미신인 것인 제제.
  80. 제59항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 컨쥬게이트는 약 1 × 10-7 M 내지 약 4 × 10-7 M의 KD를 가지는 것인 제제.
  81. 제59항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 컨쥬게이트는 약 3.4 × 10-7 M의 KD를 가지는 것인 제제.
  82. 제59항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 컨쥬게이트는 루이스 Y 항원에 결합하고 루이스 X 및 H-2 혈액군 항원에는 결합하지 않는 것인 제제.
  83. 제59항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 컨쥬게이트는 세포독성 활성을 가지는 것인 제제.
  84. 제59항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 컨쥬게이트는 항-종양 활성을 가지는 것인 제제.
  85. 제59항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 컨쥬게이트는 치료 유효량으로 존재하는 것인 제제.
  86. 제59항에 있어서, 컨쥬게이트는 G193에 공유 결합된 N-아세틸 감마 칼리케아미신 디메틸 히드라지드―4-(4-아세틸에페녹시) 부탄산(N-아세틸 칼리케아미신 DMH―AcBut)이고, 평균 로딩은 G193 1 몰 당 약 5 내지 약 7 몰의 N-아세틸 칼리케아미신 DMH이고, 컨쥬게이트 중 저 컨쥬게이션 분획(LCF)은 약 10% 미만인 것인 제제.
  87. 제86항에 있어서, 컨쥬게이트는 1 ㎎/㎖의 농도로 존재하고, 동결보호제는 약 5% 농도의 슈크로스이며, 계면활성제는 약 0.01 중량% 농도의 트윈 80이고, 완충제는 약 20 mM 농도의 트리스이며, 전해질은 약 10 mM 농도의 NaCl이고, pH는 약 8.0인 것인 제제.
  88. 치료 유효량의 제21항 내지 제32항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  89. 제88항에 있어서, 암은 루이스 Y 항원에 대해 양성인 것인 방법.
  90. 제88항 또는 제89항에 있어서, 암은 암종인 것인 방법.
  91. 제88항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 2차 단일요법(second-line monotherapy)으로서 투여하는 것인 방법.
  92. 제88항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 1차 조합 요법(first-line combination therapy)으로서 투여하는 것인 방법.
  93. 제88항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 암은 비-소세포 폐암(NSCLC) 또는 유방암인 것인 방법.
  94. 제88항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 암은 전립선암 또는 결장직장암인 것인 방법.
  95. 제88항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 생체활성제와 함께 투여하는 것인 방법.
  96. 제95항에 있어서, 생체활성제는 항암제인 것인 방법.
  97. 제21항 내지 제32항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, NSCLC를 치료하는 방법.
  98. 제21항 내지 제32항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 유방암을 치료하는 방법.
  99. 치료 유효량의 제21항 내지 제32항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 증식성 질환을 가진 환자를 치료하는 방법.
  100. (i) 제59항 내지 제86항 중 어느 한 항의 제제를 보유하는 용기; 및 (ii) 약 0.5 ㎎/㎖ 내지 약 5 ㎎/㎖ 범위 내의, 재구성된 제제 중의 컨쥬게이트 농도까지 상기 제제를 희석제로 재구성할 것을 지시하는 설명서를 포함하는 키트.
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