TW200539855A - Calicheamicin conjugates - Google Patents

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TW200539855A TW094107641A TW94107641A TW200539855A TW 200539855 A TW200539855 A TW 200539855A TW 094107641 A TW094107641 A TW 094107641A TW 94107641 A TW94107641 A TW 94107641A TW 200539855 A TW200539855 A TW 200539855A
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Justin Keith Moran
Joseph Thomas Rubino
Neera Jain
Erwin Raymond Arsene Boghaert
Philip Ross Hamann
Mark Edward Ruppen
Nitin Krishnaji Damle
Eugene Vidunas
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Wyeth Corp
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Description

200539855 • ⑩ 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種共軛至I g G 1抗體之單體性卡奇黴 素（c a 1 i c h e a m i c i η )細胞毒性藥物的製造方法，該藥物具 有較高藥物負荷量及實質上降低之低共軛物分量（LCF )。 本發明特別係關於共軛至卡奇黴素之抗路易斯 Υ (anti-Lewis Υ )抗體。本發明亦關於這些共軛物之用途。 【先前技術】 > 細胞毒性化學治療的使用已經改善了罹患各種癌症之 病患的存活率，並用來對抗所選出之贅瘤疾病，如年輕人 的急性淋巴性白血病（Kalwinsky, D. K. ( 1 99 1 ) 3: 3 9-43, 1991)和霍奇金氏淋巴瘤（Dusenbery，K. E，" α/· (1988) American Journal of Hematology, 28: 246-251 )，細胞毒性 藥物的混合雞尾酒可引發完全治癒的效果，不幸的是，近 來所用之化學治療在大多數的癌症中都不會達到完全的緩 解。有許多原因可以解釋這種效率上的相對缺乏（可回顧： Gottesman，Μ.Μ. (2002) Ann. Rev，of Med. 53，615-62; Mashima, T. et al. ( 1 99 8) Biotherapy: 1 2(6), 947-952; Mar eel, M.M. et al. ( 1 9 8 6) Radiotherapy and Oncology: 6, 135-142)。在這之中，多數化學治療的低治療指數是醫藥 改良上的一個合適標的。低治療指數反映出在藥物之有效 劑量和毒性劑量之間的界限很狹窄，而妨礙爲了撲滅腫瘤 並得到治療效果所需之足夠高劑量的給入。 一個用來規避這個問題的策略是使用所謂的魔術子 200539855 # · 彈。魔術子彈是 Ehrlich 的構想（Ehrlich, P. Collected Studies on Immunity 2，442-447)，它是由經化學結合至抗 體上之細胞毒性化合物所組成。將細胞毒性抗癌藥物結合 到能夠辨識腫瘤相關抗原的抗體上可以改善該藥物的治療 指數，這種抗體應可完美地辨識出在腫瘤細胞表面具有獨 占性表現的腫瘤相關抗原（TAA )。這個策略可使正常組織 對細胞毒劑之暴露降到最低的同時，將細胞毒劑遞送至腫 瘤位置，而抗體能夠特異地將細胞毒劑送到腫瘤，而降低 φ 系統毒性。 已發展用作系統性藥物治療的藥物共軛物是標的特異 性細胞毒劑，這個觀念涉及將治療劑偶合至限定之標的細 胞族群具有特異性的載劑分子。對抗原有高親和力的抗體 是作爲標的部分的自然選擇。這類抗原的一種是路易斯Y (Lewis Y )抗原，它會表現在正常組織中，但在某些腫瘤 類型中的表現程度較高。路易斯Y ( Ley)抗原可見於某些 乳房、直腸、胃、食道、胰臟、十二指腸、肺、膀胱和直 •腸癌瘤、以及胃和胰島細胞神經內泌腫瘤的細胞。它會在 某些腫瘤細胞出現，而其血清含量並不會隨之增加，因此， 給入的路易斯Y特異抗體不會明顯地被可溶性抗原結合。 藉由高親和力單株抗體的可利用性，抗體-標的治療的 前景變得十分可期。已共軛至單株抗體之毒性物質包括毒 素、低分子量細胞毒性藥物、生物反應改質劑、和放射核 種。抗體-毒素共軛物常被稱爲免疫毒素，但由抗體和低分 子量藥物（如甲氨喋呤（methotrexate)和阿黴素 200539855 • · (A dri am yci η))所組成的免疫共軛物則被稱爲化學免疫共軛 物。免疫調節劑包含已知具有特定功能之生物反應改質 劑，如淋巴激素、生長因子、和補體活化眼鏡蛇毒因子 (CVF )。由放射活性同位素所組成之放射免疫共軛物可藉 由其放射來殺死細胞而用作治療物，或用於形成影像。吾 人預期，將細胞毒性藥物經由抗體中介之特異性遞送送至 腫瘤細胞不僅可增強其抗腫瘤效率，亦可預防正常組織之 非標的性吸收，從而提高其治療指數。 使用有力的抗細菌劑和抗腫瘤劑（其共同地已知爲卡 奇黴素或LL-E 3 3 2 8 8複合物）家族成員之免疫共軛物是爲 了用於癌症治療而發展的。在卡奇黴素當中最有力者被稱 爲7! 1，其在此簡單地以7表示。這些化合物包含甲基三硫 化物，其可與合適之硫醇反應而形成二硫化物、同時能夠 引入功能基，如醯肼或其他可用於將卡奇黴素衍生物連接 至載劑之功能基。該等卡奇黴素包含一個烯二炔彈頭（第 1圖）可藉由-S-S-鍵還原所致之雙股DNA斷裂而活化。 吉妥單抗® ( Sievers，E.L. d a/· (1999) Blood: 93, 3 6 7 8 - 3 6 8 4 )也稱爲CMA-676或CMA，是唯一根據此一原 則來作用的商業可購得之藥物。吉妥單抗® ( My lot arg® ’ g e m t u z u m a b ο z o g a m i c i η )近來被核准用於老年病患之急性 骨髓性白血病的治療，這種藥物是由一藉由酸可水解之鍵 結劑結合至卡奇黴素之抗CD33的抗體所組成。半合成性 N-乙醯基γ卡奇黴素的二硫化物類似物係用作共軛之用 (美國專利案第5,606,040、5,770,710號）。Ν-乙醯基γ卡
200539855 奇黴素二甲基醯肼這個分子以下縮寫爲CM。 數個實驗性證據鞏固了使用會辨識異於CD3 3之TAA 的抗體能夠擴大神奇子彈策略應用範圍的構想。現已證 明，多個抗體和化療劑之共軛物（免疫共軛物）有能力治 癒具有經異種移植之腫瘤的宿主。標的 TAA的一些實例 爲·· HER2/neu ( Starling, J.J，et a l. (1992) Bioconjugates
Chemistry: 3 (4), 3 1 5 -3 22; DiJoseph, J.F et al. (2002)
European Journal of Cancer: 38 (s up p 1. 7)，S150)、PSCA
(Sjogren， H.O， et al. ( 1 997) Cancer Res. : 57, 4530-4536)、黏液型醣蛋白（MIRACL-26457) ( Zhang, S· ei al. (1997) Int. J. Cancer, 73: 50-56; Wahl, A.F. et al.
(2 000) Int. J. Cancer，93: 5 9 0- 6 00 )、EGFR ( Furokawa，K·， et al. ( 1 990) Mol. Immunol·， 27: 723 -73 2 ) 、 CE A (Kitamura， K·， et a l,， ( 1 9 9 4) P r o c. Natl. Acad. Sci. USA., 9 1 : 1 295 7- 1 296 1 )、CD22 ( Clarke, K.5 et al. (2000) Cancer Res.， 60: 4804- 48 1 1 )和 Lewisy 抗原(Ley ) (Morgan，A.，et al, ( 1 9 9 5 ) Immunology, 8 6: 3 1 9-3 24 )。爲 了達到細胞毒性的效果，將對抗這些表面抗原的抗體共軛 至假單胞菌屬外毒素（DiJoseph，J.F d a/.，S150)、美坦西 諾得(m a y t an s i η 〇 i d ) ( Sjogren, H.O，e t a l · 4530-4536;
Zhang, S . et al. 50-56)、卡奇黴素（Wahl，A.F. et al. 5 9 0- 6 00; Clarke, K., et al. 4 8 0 4 - 4 8 1 1 )、RN A 酶（F u r o k a w a， K·，a/. 723-732)、長舂花生物驗（Kitamura，K·，ei a/.， 12957-12961 )或多柔比星（doxorubicin) ( Morgan，A.，er 200539855 • · al. 3 1 9 - 3 24 )上 ° 單體性卡奇黴素衍生物/載劑共軛物於多種癌症發展 療法的使用已受到兩種限制：特異標的劑（載劑）之可用 性、以及在共軛至載劑上之卡奇黴素衍生物量（即藥物負 荷量）增加時會引起蛋白凝集物形成之共軛方法學。由於較 高的藥物負荷量會增加共軛物天生的功效，因此較佳爲在 保有對載劑蛋白之親和力的同時，將藥物儘可能地負載在 載劑上。 許多細胞毒性藥物（包括卡奇黴素在內）的自然疏水 性質會在具有良好藥物負荷量和合理產率之單體性藥物共 軛物的製備中造成困難，而鍵結的疏水性增加，以及分離 治療劑與載劑（抗體）之共價距離增加，會使這個問題更 加惡化。凝集的蛋白可能具有非特異之毒性和免疫產生 性，因此，爲了治療上的應用，一旦出現就必須將之移除， 從而使得這些共軛物生產方法規模的提高更加困難、並使 這些產物的產率降低。 負載在載劑蛋白上之卡奇黴素量（藥物負荷量）、在共 軛反應中形成之凝集量、以及所得之最終經純化單體性共 軛物產率彼此都是相關的。在某些例子當中，要使用美國 專利案第5,05 3,3 94號所揭露之反應條件來使共軛物具有 可用之產率以及治療應用上可用之負荷量常常是很困難 的，原因就是過量的凝集。這些反應條件係在共軛反應中 利用DMF作爲共溶劑。因此，我們需要可在無凝集及無材 料固有損失的情況下得到較高藥物負荷量/產率的方法。降 200539855 • · 低凝集的改良法係描述於美國專利案第5，7 1 2，3 7 4和 5，714,586號、以及美國專利申請案第2004/0082764 A1和 2 004/0 1 92 9 00 A1號中，以上各案係以其完整內容合倂於此 處。 當共軛反應以美國專利案第5,877,296和5,773,001號 (以上各案係以其完整內容合倂於此處）所描述之鍵結劑 進行時，卡奇黴素共軛性凝集的傾向問題特別大。在這個 例子當中，所產生之共軛物會有較高比例的是凝集的形 φ 式，而以這些以美國專利案第5,8 77,2 96號所描述之製法所 得出的共軛物要用於治療用途，是相當難以純化的。對某 些載劑蛋白來說，除非規模很小，否則事實上不可能製造 出具有適度負荷量之共軛物。對於那些共軛方法會受到抗 體異構型和分化性糖基化作用模式影響的抗體來說，這一 點格外地確切。因此，需要想出新的改良方法將卡奇黴素 共軛至特定抗體上，從而將凝集之量降到最低，並使產物 之藥物負荷量盡可能地提高，並有合理的產率。 φ 【發明內容】 發明槪述 本發明提供一種用於製備卡奇黴素（calicheamicin) 共軛物之製法，其包含於pH値爲約7至約9時（較佳爲 約8.2時）將（i)經活化之卡奇黴素-可水解之鍵結劑衍生物 和（ii)IgGl抗體在去氧膽酸酯家族之成員或其鹽存在的情 況下進行反應；以及藉由此方法所製備之共軛物。本發明 亦提供一種組成物，其包含共價地連結至抗路易斯Y抗體 -10-
200539855 的卡奇黴素-可水解之鍵結劑衍生物之共軛物。 在一具體實施例中，該去氧膽酸酯家族成員具有下列 結構之一： (A)
其中 Χι至X5中之二爲Η或OH，而其他三個係獨立爲〇 或Η ;
Ri爲（CH2)n，其中η爲0-4 ;且 R2 爲 OH、NH(CH2)mCOOH、N H ( C H 2) m S Ο 3 Η、或 NH(CH2)mp〇3H2，其中 m 爲 1-4; _或者 (B)
-11-
200539855 其中 Χι至X4中之一爲Η或OH，而其他三個係獨立爲Ο 或Η ; R!爲（CH2)n，其中η爲0-2 ;且 R2 爲 OH、NH(CH2)mCOOH、或 NH(CH2)mS03H，其中 m爲2 ; 或者 (C)
其中 乂！至X4中之一爲OH，而其他三個爲H;
Ri爲（CH2)n，其中η爲0-2 ;且 R2 爲 OH、NH(CH2)2S03H。 去氧膽酸酯家族成員亦可爲鵝去氧膽酸、豬去氧膽酸 酯、熊去氧膽酸、甘胺去氧膽酸、牛磺去氧膽酸、牛磺熊 去氧膽酸、或牛磺鵝去氧膽酸。較佳者，去氧膽酸酯家族 成員係濃度爲約1 0 mM之去氧膽酸。 在另一具體實施例中，卡奇黴素衍生物爲約3至約9 重量％之I g G 1抗體，較佳者爲約7重量％之〗g 〇 1抗體。 -12- 200539855 • · 在一具體實施例中，IgGl抗體爲抗路易斯Y抗體，其 較佳者，抗路易斯Υ抗體爲G193或Hu3S193。 在另一具體實施例中，卡奇黴素衍生物爲卡奇黴素之 Ν -醯基衍生物、或卡奇黴素中之二硫化物類似物。較佳者， 卡奇黴素衍生物爲Ν -乙酿基γ卡奇黴素二甲基醯肼（Ν -乙 醯基卡奇黴素DMH )。 在又一具體實施例中，可水解之鍵結劑爲4 _ (4 _乙醯基 苯氧基）丁酸（AcBut)。 | 該方法可選擇性進一步包含將該卡奇黴素共軛物純 化。這類純化可包含層析分離、和超過濾/透析過濾 (diafiltration )。較佳者，該層析分離爲尺寸排除層析法 (SEC )或疏水性交互作用層析法（HIC )。於純化步驟之 後，較佳之共軛物之平均負荷量爲每莫耳IgGl抗體有從約 5至約7莫耳之卡奇黴素，且共軛物之低共軛分量（LCF ) 少於約1 0 %。 本發明之卡奇黴素共軛物，較佳者之KD爲約1x10_7M 鲁至約4χ1(Γ7Μ，且更佳者之KD爲約3·4χ1(Γ7Μ。這類共轭 物會連結路易斯Υ抗原而不會連結路易斯X和Η - 2血型抗 原，具有細胞毒性之活性，且具有抗腫瘤活性。較佳者， 該共軛物係以治療有效量存在於組成物中。 因此’本發明提供一種組成物，其包含共價地結合至 G193的Ν-乙醯基γ卡奇黴素二甲基醯肼—4-(4-乙醯基苯氧 基）丁酸之共軛物（Ν-乙醯基卡奇黴素DMH-AcBut)，其中 該平均負荷量爲每莫耳之G193有從約5至約7莫耳之N- -13- 200539855 • · 乙醯基卡奇黴素dmh，且共軛物之低共軛分量（LCF)少 於約1 0 %。 本發明亦提供一種用以保存這些組成物之生物活性的 方法，其包含：將組成物與低溫保護劑、界面活性劑、緩 衝劑、和電解質在溶液中接觸，並將該溶液冷凍乾燥。 在一具體實施例中，共軛物之濃度爲約0.5 mg/mL至 約2 mg/mL ;較佳者，共軛物之濃度爲約丨mg/mL。 在另一具體實施例中，低溫保護劑之濃度爲約1 . 5重 φ 量％至約6重量％。該低溫保護劑爲糖醇或碳水化合物；較 佳者’該低溫保護劑爲繭糖、甘露糖醇、或山梨糖醇；且 更佳者，該低溫保護劑係濃度爲約5 %之蔗糖。 在一具體實施例中，界面活性劑之濃度爲約0.0 0 5 % 至約0.05 % ;較佳者，界面活性劑係濃度爲〇.〇1重量％之 聚山梨酯80( Polysorbate 80 )、或濃度爲約0.01 %之Tween 80 ° 在另一具體實施例中，緩衝劑之濃度爲約5 mM至約 φ 50 mM ;較佳者，緩衝劑係濃度爲約20 mM之Tris。 在另一具體實施例中，電解質之濃度爲約5 mM至約 100mM;較佳者，電解質爲鈉鹽或鉀鹽；更佳者，電解質 係濃度爲約10 mM之NaCl。 在一具體實施例中，該pH値在冷凍乾燥之前爲約7.8 至約8.2 ;較佳者，pH値爲約8.0。 在一具體實施例中，冷凍乾燥包含：將溶液於約-35 °C 至約-5 0 °C之溫度冷凍；將該經冷凍之溶液在約2 0至約8 0 -14- 200539855 鲁 微米之第一乾燥壓力於約-1 〇至約-4 0 °C之層架溫度進行初 始乾燥2 4至7 8小時；且將經冷凍乾燥之產物在約2 0至約 80微米之第二乾燥壓力於約+10至約+30°C之層架溫度進 行第二乾燥15至30小時。較佳者，冷凍係於約-45 °C進行； 初始冷凍乾燥係於約6 0微米之第一乾燥壓力和約-3 0 °C之 ' 層架溫度進行60小時；而第二乾燥步驟係於約60微米之 乾燥壓力和約+25 °C之層架溫度進行約24小時。 該方法可選擇性進一步包含在冷凍乾燥之前加入結塊 φ 劑。較佳者，結塊劑之濃度爲約〇. 5至約1 . 5重量％ :且更 佳者，結塊劑爲濃度爲約0.9重量％之右旋糖酐40( Dextran 40 )、或濃度爲約0.9重量％之羥乙基澱粉40。 本發明進一步提供一種包含上述卡奇黴素-抗路易斯 Y抗體共軛物組成物、低溫保護劑、界面活性劑、緩衝劑、 和電解質之配方。 本發明亦提供一種治療癌症或另一增生性疾病之方 法，其包含給予此處所描述之組成物的治療有效量，其可 @用於大量製造用以治療癌症之醫藥。 可給予這些組成物而作爲第二線單一治療、或作爲第 一線合倂治療。 較佳者，該癌症爲路易斯Y抗原陽性；且更佳者，該 癌症爲癌瘤（carcinoma)。又’較佳者’該癌症爲非小細 胞肺癌（N S C L C )、乳癌、前列腺癌、或結直腸癌。 本發明之方法可與生物活性劑（如舉例來說，抗癌劑） 合倂而加以實施。 -15· 200539855 · 本發明亦提供一種套組，其包含（i)裝有本發明之任一 配方的容器；以及（ii)以稀釋劑對該配方進行再組成、直至 再組成配方中的共軛物濃度在從約 0.5 mg/mL至約5 mg/mL之範圍內的使用說明書。 發明之詳細敘述 本發明提供一種用於製備卡奇黴素（calicheamicin) 共軛物之製法，其包含於p Η値爲約7至約9時將（i)經活 化之卡奇黴素-可水解之鍵結劑衍生物和（ii)IgGl抗體（如 φ 抗路易斯Y抗體）在去氧膽酸酯家族之成員或其鹽存在的 情況下進行反應；以及藉由此方法所製備之共軛物。本發 明亦提供一種組成物，其包含共價地連結至抗路易斯Y抗 體的卡奇黴素-可水解之鍵結劑衍生物之共軛物。亦提供一 種用以保存這些組成物之生物活性的方法，其包含：將組 成物與低溫保護劑、界面活性劑、緩衝劑、和電解質在溶 液中接觸，並將該溶液冷凍乾燥。進一步提供一包含上述 卡奇黴素-抗路易斯γ抗體共軛物、低溫保護劑、界面活性 Φ劑、緩衝劑、和電解質之配方，以及大量製造之物件。最 後’本發明提供一種治療癌症或其他增生性疾病之方法， 其係藉由給予這類組成物/配方之治療有效量，包括將這些 組成物/配方用於大量製造用於治療癌症或其他增生性疾 '病之醫藥。以下所描述的是本發明之各個具體實施例。 已經將所建立之共軛條件施用至吉妥單抗（亦稱爲 CMA-6 7 6 或 CMA)和 CMC-544(人類化抗 CD22 抗體 G5/44 卡奇黴素共軛物）的形成，這兩種都是IgG4抗體。由於吉 -16- 200539855 • · 妥單抗的引入，已透過離子交換層析法的使用而了解到： 卡奇黴素在這些類型抗體上分布的方式並不固定，也不均 勻。雖然這些共軛物的平均負荷量爲每莫耳抗體有從0.1 至10或15莫耳之卡奇黴素，大多數的卡奇黴素是位於大 約一半的抗體上，而另一半的抗體是以低共軛物分量 ~ ( LCF )存在，僅包含小量的卡奇黴素。 將細胞毒性藥物（如卡奇黴素）共軛至載劑之改良方 法，係於CMC-5 44發展之時，達成將凝集之量降到最低， 0 並使之具有較高的均一藥物負荷量，且共軛物產物之產率 有顯著的改善。其一特定實例爲G5/44-人類化抗CD 22抗 體-NAc-γ卡奇黴素DMHAcBut共軛物（即CMC-544)。對 CMC-5 44的發展而言，LCF之量理想上要降低至總抗體之 10 %以下（<10 % )，並將各種用來降低LCF之量的選擇列 入考量。免疫共軛物的其他貢獻（如抗原結合和細胞毒性） 必須不受最終溶液影響。列入考量的選擇包括抗體分子的 基因性或物理性改質、層析分離技術、或反應條件的修正。 _ G5/44抗體與NAc-γ卡奇黴素-DMH-AcBut-OSu的反 應係使用舊有的反應條件（C Μ A - 6 7 6方法條件），其會使產 物具有與C Μ A - 6 7 6類似的物理性質（藥物負荷量、l C F ) 和凝集。然而，LCF在共軛之後所呈現的高量値（50 _ 6〇 % ) 並不理想，合適的反應條件係透過統計上的實驗設計方法 學來決定，其中對主要反應變因（如溫度、pH値、卡奇 黴素衍生物投入量、和添加物濃度）進行了評估。爲了將 LCF降至10 %以下（<1〇 % )，需將卡奇黴素衍生物投入量 -17-
200539855 從相對於反應中抗體量的3 %增加至8·5 % ( w/w )。 從濃度爲200 mM之辛酸或其鹽（CMA方法）變成 3 7 . 5 m Μ之癸酸或其鹽。倂有這些改變的反應條件 奇黴素負荷量增加的同時將LCF降低至1 0百分比 而在後文中稱爲CMC-5 44方法條件。 卡奇黴素投入量的增加，會使藥物負荷量從 重量％增加至5.0-9.0(最典型者爲5.5-8.5)重量％ 得反應中的蛋白凝集沒有增加。由於凝集和LCF | C M C - 5 4 4方法條件會產生更均勻的產物。 由於胺基酸序列和同型物的變動，不是所有的 會顯示出相同的物理特徵，且反應條件須對各特異 身訂做。當CMA-676共軛反應條件與igGl抗體（ 易斯Y抗體）一起使用時，所得共軛物具有與CM A 似之物理性質（藥物負荷量、LC F、和凝集），而其 共軛之後所呈現的高量値（5 0 - 6 0 % )並不理想。 C M C - 5 4 4而發展的修正條件和〗g g 1抗體會使產物 •低的L C F，但是在反應中所產生的凝集量被認爲過 這個例子當中’爲了降低L C F和凝集，認爲特定的膽 氧膽酸酯家族）或其鹽類會作爲最佳的添加物。 CMA-676、CMC-544兩者和新穎合適方法之添加物 備的IgGl抗體共軛物比較係顯示於表1(辛酸酯、癸 和去氧膽酸酯之比較）。 添加物 濃度爲 會在卡 以下， 2.5-3.0 ，而使 降低， 抗體都 抗體量 如抗路 -676 類 LCF在 使用爲 具有較 高。在 〖酸（去 與來自 一起製 $酸酯、 表1 條件/結果 癸酸酯 去氧膽酸酯 -18- 200539855 m · — —-==°°°°°] 卡奇黴素衍生物投入量 7.0 % (w/w) 7.0 % (w/w) 7.0 % (w/w) 添加物濃度 200 mM 37.5 mM lOmM 溫度 32 (士2)°C 32 (士2)°C 32 (±2)°C PH _ 8.2 (±0.2) 8.2 (±0.2) 8.2 (±0.2) 負荷量（Mg卡奇黴素/mg抗體） 65-75 65-75 65-75 低共軛物分量 13.5 % 5.3 % 3.8 % 凝集（反應終點） 25.4% 14.6 % 3.2 % 因此本發明提供了 一種卡奇黴素共轭物之製法。在這 φ 個製法中，經活化之卡奇黴素·可水解之鍵結劑衍生物和 IgGl抗體係在去氧膽酸酯家族之成員或其鹽存在的情況下 反應。該製法會將凝集量降至最低，並顯著地增加1gGl抗 體共軛物之藥物負荷量。 任一合適的膽酸之去氧膽酸酯家族成員或其鹽均可用 於本發明之製法。在一具體實施例中，去氧膽酸酯家族成 員具有下列結構：
其中 Χι至X5中之二爲Η或OH，而其他三個係獨立爲〇 或Η ; -19-
200539855 R】爲（CH2)n，其中η爲0-4 ;且 R2 爲 OH、NH(CH2)mCOOH、NH ( C Η 2)爪 S Ο 3 Η、或 NH(CH2)mP03H2，其中 m 爲 1-4; 或者，該去氧膽酸酯家族成員可具有下列結構：
其中 乂！至X4中之一爲Η或OH，而其他三個係獨立爲Ο 或Η ; R!爲（CH2)n，其中η爲0-2 ;且 R2 爲 OH、NH(CH2)mCOOH、或 NH(CH2)mS03H，其中
其中 -20- 200539855 Χι至Χ4中之一爲〇H，而其他三個爲Η;
Ri爲（CH2)n，其中η爲0-2;且 R2 爲 OH、NH(CH2)2S03H。 較佳者，該去氧膽酸酯家族成員爲去氧膽酸、鵝去氧 膽酸、豬去氧膽酸酯、熊去氧膽酸、甘胺去氧膽酸、牛磺 去氧膽酸、牛磺熊去氧膽酸、或牛磺鵝去氧膽酸。更佳者， 該去氧膽酸酯家族成員爲去氧膽酸，其較佳者所呈現之濃 度爲約1 0 m Μ。 | 如先前的討論，卡奇黴素係一種抗細菌及抗腫瘤劑家 族，如美國專利案第4,9 70,1 98號所描述者（亦見於美國專 利案第5，108,912號）。在本製法之一較佳具體實施例中， 卡奇黴素爲卡奇黴素之Ν_醯基衍生物、或卡奇黴素中之二 硫化物類似物。這些化合物之二氫衍生物係描述於美國專 利案第5,〇3 7,65 1號中，而其Ν-醯化之衍生物則描述於美 國專利案第5,079,2 3 3號中。亦可用於本發明之相關化合物 包括描述於美國專利案第4,675,187、4,539,203、4,554,162 φ和4,8 3 7,206號中的艾斯帕拉黴素（esperamicin )。這些化 合物都包含甲基三硫化物，其可與合適之硫醇反應而形成 二硫化物，同時能夠引入功能基，如醯肼或或類似的親核 劑。上述專利引證案中的所有資訊係以參考文獻合倂於此 處。兩個可用於本發明之化合物γ二甲基醯肼和N-乙醯基 7二甲基醯肼係揭露於美國專利案第5,05 3, 3 94號及顯示於 美國專利案第5, 877,296號之表1。 在本發明之上下文中，卡奇黴素較佳爲Ν-乙醯基γ卡 -21-
200539855 奇黴素二甲基醯肼（N -乙醯基卡奇黴素DMH)°N. 卡奇黴素DMH至少比大多數現用的細胞毒性化療 10至100倍，其高藥效使它成爲抗體標的療法的 擇，因而在降低正常器官及組織之非特異性暴露的 能將抗腫瘤活性放到最大。 因此，在一具體實施例中，本發明之共軛物具巧
Pr( —X — W)m 其中
Pr爲IgGl抗體； X爲鍵結劑，其包含任一可與IgG 1抗體反應之 的產物； W爲來自卡奇黴素家族之細胞毒性藥物； m爲經純化之共軛產物的平均負荷量，因此卡 帶有3 - 9重量％共軛物；且 (一X — W)m爲細胞毒性藥物衍生物； 較佳者，X具有下式： (CO-Alk1-Sp1-Ar-Sp2-Alk2-C(Z1) = Q-Sp) 其中
Aik1和 Aik2係獨立爲一化學鍵、或分支或不 (C^-Cio)伸烷基鏈；
Sp1 爲一化學鍵、-S-、-0-、-CONH-、-NHCO-、 -N(CH2CH2)2N-、或-X-Ar-Y-(CH2)n-Z，其中 X、Y 獨立爲一化學鍵、-NR-、-S-、或-0-;惟當n = 0時， 之至少一個必須爲一化學鍵，且 Ar爲選擇性經一 乙釀基 劑有效 理想選 同時， '下式： 反應基 奇黴素 分支之 -NR-、 和Z係 Y和Z 個、兩 -22- 200539855 · · 個、或三個下列基所取代之i,2-、丨，3-、或i,4-伸苯基： (Ci-C5)院基、（C1-C4)院氧基、（C1-C4)硫院氧基、鹵素、硝 基、-COOR、-CONHR、-(CH2)nCOOR、-S(CH2)nC00R、 -0(CH2)nC0NHR、或-S(CH2)nCONHR;惟當 Aik1 爲一化學 鍵時，Sp1爲一化學鍵； η爲由0到5之整數； R爲選擇性經一個或兩個下列基所取代之分支或不分 支之（Ci-C5)鏈：-OH、（Ci-C4)烷氧基、（Ci-C4)硫烷氧基、 φ 鹵素、硝基、（C丨-C3)二烷基胺基、或（C^CO三烷基銨-A·， 其中A_爲一可作成一鹽的醫藥可接受陰離子；
Ar爲選擇性經一個、兩個、或三個下列基所取代之 1，2-、1，3·、或 1，4-伸苯基：（CrCe)烷基、（CrCs)烷氧基、 (CrCd硫烷氧基、鹵素、硝基、-C00R、-C0NHR、 -0(CH2)nC00R、-S(CH2)nC00R、- Ο ( C Η 2) n C Ο N H R、或 -S(CH2)nCONHR，其中n和R係如上文定義或爲l，2-、l，3-、 1，4_、 1，5-、 1，6-、 1，7_、 1，8_、 2,3-、 2,6_、或 2,7-亞萘基 •或
其中亞萘基或苯并噻阱係選擇性經一個、兩個、三個、 或四個下列基所取代：（Cl-C6)烷基、（Cl-C5)烷氧基、（d-CJ 硫烷氧基、鹵素、硝基、-COOR、-CONHR、-〇(CH2)nCO〇R、 -S(CH2)nCOOR、或-S(CH2)nCONHR，其中 η 和 R 係如上文 定義；惟當Ar爲啡噻畊時，Sp 1爲一僅與氮連接之化學鍵； -23- 200539855
Sp2爲一化學鍵、-S-、或-Ο-;惟當Aik2爲一化學鍵 時，Sp2爲一化學鍵； Z1爲Η、（Ci-Cs)烷基、或選擇性經一個、兩個、或三 個下列基所取代之苯基：（Cl-C5)烷基、（Ci-Cs)烷氧基、 (Κ4)硫烷氧基、鹵素、硝基、-COOR、-ONHR、 -0(CH2)nC00R、-S(CH2)nCOOR、- 〇 (C Η 2) n C ONH R、或 eS(CH2)nCONHR，其中n和R係如上文定義；
Sp爲直鏈或支鏈二價或三價（Ci-CH)殘基、二價或三 鲁價芳基或雜芳基殘基、二價或三價（C3-C18)環烷基或雜環烷 基殘基、二價或三價芳基-或雜芳基-芳基（CrC^)殘基、二 價或三價環烷基-或雜環烷基-烷基（Ci-C^)殘基、或二價或 三價（C 2 - C ! 8)不飽和烷基殘基，其中雜芳基較佳爲呋喃基、 噻吩基、N-甲基吡咯基、吡啶基、N-甲基咪唑基、噚唑基、 哌啶基、喹啉基、異喹啉基、N-甲基咔唑基、胺基香豆素 基、或啡阱基；且其中若Sp爲三價殘基，Sp可另由下列基 所取代：低級（Ci-Cs)二烷基胺基、低級（Ci-Cs)烷氧基、羥 ¥基' 或低級（Ci-Cs)烷基硫基；且 Q 爲=NHNCO- 、 =NHNCS- 、 =NHNCONH-、 ^NHNCSNH- > 或=NH〇-。 較佳者，Aik1爲分支或不分支之（Ci-Cio)伸烷基鏈； SP 爲一化學鍵、-S-、-0-、-CONH·、-NHCO-、或-NR，其 中R係如上文定義；惟當Aik1爲一化學鍵時，Sp1爲一化 學鍵。
Ar爲選擇性經一個、兩個、或三個下列基所取代之 -24- 200539855 • · 1，2-、1，3-、或1，4-伸苯基··（C〗-C6)烷基、（C〗-C5)院氧基、 (Ci-C4)硫烷氧基、鹵素、硝基、-COOR、-C〇NHr、 -0(CH2)nC00R、 -S(CH2)nCOOR、 · 〇 ( C Η 2) n C Ο N H R、或 -S(CH2)nCONHR，其中n和R係如上文定義；或Ar爲各選 擇性經一個、兩個、三個、或四個下列基所取代之1，2-、 1，3-、 1，4_、 1，5-、 1，6-、 1，7-、 1，8-、 2,3-、 2,6-、或 2,7_ 亞萘基··（Ci-CJ烷基、（Ci-C5)烷氧基、（Ci-C4)硫烷氧基、 鹵素、硝基、-COOR、-CONHR、 -0(CH2)nC00R、 .-S(CH2)nCOOR、-0(CH2)nC0NHR、或-S(CH2)nCONHR。 Z1爲（C1-C5)院基、或選擇性經一個、兩個、或三個下 列基所取代之苯基：（G-C5)烷基、（CKC4)烷氧基、（Cl-C4) 硫烷氧基、鹵素、硝基、-COOR、-CONHR、-0(CH2)nC00R、 -S(CH2)nCOOR、-0(CH2)nC0NHR、或-S(CH2)nCONHR。 Aik2和Sp2係合爲一化學鍵。
Sp和Q係直接如上文定義。 在本方法中，較佳爲將卡奇黴素在IgGl抗體爲約3 φ至約9重量％時加入反應中，更佳爲在I g G 1抗體爲約7重 量％時。 本發明之共軛物係利用與包括任一可與IgGl抗體反 應之反應基的鍵結劑一起衍生出來的細胞毒性藥物卡奇黴 素，其可用作蛋白載劑標的藥劑，而形成細胞毒性藥物衍 生物-抗體共軛物。以其整體合倂於此處之美國專利案第 5,7 7 3,00 1、5,7 3 9，116和5,877,296號揭露了可與親核性衍 生物一起使用的鍵結劑，特別是由卡奇黴素所製備的醯肼 -25- 200539855 • · 和相關親核劑。當在藥物和鍵結劑之間所形成的鍵結可水 解的時候，這些鍵結劑在那些得到較佳活性的例子當中特 別有用。這些鍵結劑包含兩個功能基，一個基係典型爲羧 酸，用來與載劑作用。酸功能基在適度活化的時候，可與 載劑的自由胺基形成醯胺鍵結，舉例來說，在抗體或其他 蛋白載劑之離胺酸側鏈上的胺。其他功能基一般爲羰基， 即醛或酮，其會與經合適地改質的治療劑作用。羰基可與 藥物之醯肼基作用，而形成一腙鍵結。此鍵結可水解，在 | 鍵結至標的細胞後可使治療劑從共軛物中釋出。較佳者， 該可水解之鍵結劑爲4-(4-乙醯基苯氧基）丁酸（人〇：61^)。 可使用N -羥基琥珀醯二亞胺（〇 S u )酯類或其他經等 同程度活化之酯類來得出經活化之卡奇黴素-可水解之鍵 結劑衍生物。其他合適的活化酯類實例包括NHS ( N-羥基 琥珀醯二亞胺）、磺酸基-NHS (磺酸化NHS )、PFP (五氟 苯基）、TFP (四氟苯基）和DNP (二硝基苯基）。 可用於本發明之抗體的實例包括單株抗體（mAb )，舉 春例來說，嵌合抗體、人類化抗體、靈長類化抗體、再表面 化之抗體、人類抗體、和其等之生物活性片段。詞語「抗 體」用於此處時，除非另有所指，係廣泛用於指稱抗體分 子和各種由抗體所衍生之分子。這類由抗體所衍生之分子 包含至少一可變區（重鏈或輕鏈可變區），並包括以下分 子：如Fab片段、F(ab，）2片段、Fd片段、Fabc片段、Sc 抗體（單鏈抗體）、二聚抗體（diabodies)、個別抗體輕單 鏈、個別抗體重鏈、在抗體鏈與其他分子之間的嵌合性融 -26- 200539855 · · 合等。 本發明之較佳IgGl抗體爲對抗表現在增生性疾病（如 癌症）之標的細胞及/或組織上的細胞表面抗原者。在一具 體實施例中，IgGl抗體爲抗路易斯Y抗體。路易斯Y爲一 具有結構 Fuc^l — 2Galfll — 4[Fuc^l — 3]GlcNacBl — 3R 之碳 水化合物抗原（Abe d α/. ( 1 983 ) J· Biol· Chem·，258 1 1 7 9 3 - 1 1 7 9 7 )。路易斯Y抗原係表現在60 %至90 %之人類 上皮腫瘤（包括乳房、直腸、肺和前列腺之腫瘤）表面， φ 其中至少40 %過度表現此抗原，而其在正常組織中則爲有 限制地的表現。 爲了找出Ley標的並有效地找出腫瘤標的，理想上需 要一種對抗原具有獨占特異性的抗體。因此，本發明之抗 路易斯Y抗體較佳爲不與第1型結構（即乳糖系列血型（Lea 和Leb))產生交互作用，較佳爲不與其他第2型抗原決定 部位（即新乳糖結構，如Lex和H-2型結構）結合。 在過去數十年間，已產出了數種會辨識Ley的抗體， 馨然而，其中大多數均與Lex和第2型H-抗原結構產生交互-反應（Fur okawa，K·，d α/. 723-732)。較佳抗路易斯Y抗 體之實例被稱爲hu3S193(見美國專利案第6,310，185、 6,5 18,415、5,8 74,060號，係以其整體合倂於此處）。其他 抗路易斯Y抗體之實例（如歐洲專利案第0 2 8 5 0 5 9號、 美國專利案第4,971，792和5，182，192號）包括單株抗體 61196(如美國專利案第5,491，088、5,792,456、5,869,045 號），其於近年來被評估爲 SGN-15中的多柔比星 -27- 200539855 # # (doxorubicin)共轭物（如美國專利案第5,980,896號）； 單株抗體LMB-9 ( B3(dsFv)PE38 )，其爲一重組經二硫化物 安定化的抗路易斯Y之IgGK免疫毒素，該免疫毒素係包 含從綠膿桿菌外毒素A(PE) 所衍稱得出之38kD毒性要素（如美國專利案第5,9 8 0,8 9 5 號）；以及IGN3 11人類化抗體（如歐洲專利案第〇 5 2 8 7 6 7 號和美國專利案第5, 5 62,903號）。 人類化抗體 hu3S 193 ( Attia，Μ·Α·，Μ β/. 1 7 8 7- 1 800 ) φ 係藉由從3S 193(對抗腺癌瘤細胞且對Ley具有優異之特異 性的鼠類單株抗體）進行C D R移植而產出的（K i t a m u r a，K .， 1 295 7- 1 2 96 1 )。Hu3S193 不僅保有 3S193 對 Ley2 特佳特 異性，且亦獲得了中介補體依存性之細胞毒性（在後文中 稱爲CDC )和抗體依存性之細胞的細胞毒性（在後文中稱 爲 ADCC)的能力（Attia，M.A., α/. 1787-1800)。這種 以在裸鼠中表現爲異種移植物的Ley爲標的的抗體係藉由 以125Ι、ιηΙη或18F或其他需要螯合劑的放射標示如ηιΙη、 φ 99mTc或9()Y加以標示之hu3S193的生物分布硏究來加以說 明(Clark, et al. 4804-48 1 1 )。 本發明基於可將鼠類單株抗體之CDR區切成人類接 受器骨架之的發現，而提供多種對路易斯Y抗原具有特異 性的人類化抗體，而製造對路易斯Y抗原具有特異性的人 類化重組抗體。CDR可使用任一該項技藝中已知之習知命 名法加以定義，如Kabat編碼系統、Chothia數目系統、或 AbM定義，其係藉由Oxford Molecular’s AbM抗體模型軟 -28- 200539855 體來使用在Kabat和Chothia系統之間的折衷方法。本發 明之特佳具體實施例係例示具有優異抗原結合性質的人類 化抗體分子。製造對路易斯Y抗原具有特異性的人類化重 組抗體的方法程序係載於以其整體合倂於此處的美國專利 案第6，5 1 8，4 1 5號。如前述討論，在本發明之較佳具體實施 例中，人類化路易斯Y特異抗體之CDR係衍生自鼠類抗體 3 S 1 93 ° 當移植CDR時，任一可用的合適接受器可變區骨架序 φ 列在考慮到CDR來源（包括小鼠、靈長類和人類骨架區） 之捐贈者抗體種類/類型下來使用。可用於本發明之人類骨 架的實例爲 KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY 和 POM ( Kabat e t a l. Seq. of proteins of Immunol. Interest， 1:310-334 (1994))。舉例來說，KOL和NEWM可用作重鏈， REI可用作輕鏈，而EU、LAY和POM可用作重鏈和輕鏈 兩者。 實務上，爲了生產保有鼠類抗體來源之特異性的有效 • 率人類化抗體，通常不會簡單地足量取代CDR。有在人類 可變區骨架中包含少數重要鼠類抗體殘基的需求，這些殘 基的性質係取決於鼠類抗體來源和接受器人類抗體的結 構。因此，此處所描述之人類化抗體包含一些接受器抗體 的變化，即，人類對保有捐贈者單株抗體之結合特異性爲 必要的重鏈及/或輕鏈可變結構域（domain )骨架區的變 化。換句話說，一些具體實施例之骨架區（即此處所描述 之人類化抗體）不必由自然發生之人類抗體可變區的骨架 -29-
200539855 區精確胺基酸序列所組成，但其包含各種取代情形，其中 取代係能夠改善對相同標的（如鼠類抗體3 S 1 93 )具有特 異性之人類化抗體區的結合性質。爲了避免大規模引入非 人類骨架殘基並確保人類化抗體的免疫生成性爲最小，要 使骨架區的取代數目達到最小。因此在本發明之上下文 中，較佳抗路易斯Y抗體爲hu3S193和G193。 在一具體實施例中，係使本發明之抗體分子的變異株 對抗路易斯Y，並對路易斯Y顯示出改善的親和力。這類 φ 變異株可藉由許多親和力成熟程序步驟而得出，其包括 CDR 的變異（Yang ei β/·，J. Mol. Biol·，254，3 92-403, 1995 )、鏈改組（chain shuffling ) ( Marks e，α/·， Bio/Technology，10，779-783，1 992 )、使用 E.coli 變異株 (Low et al.9 J. Mol. Biol., 2 5 0, 3 5 9 -3 6 8, 1996)、DNA 改 組（DNA shuffling ) ( Patten e t a l ·， Curr. O p i n.
Biotechnol.，8，724- 733，1997)、噬菌體顯示（Thompson ei al., J. Mol. Biol ., 2 5 6, 7 7- 8 8, 1996)、和 PCR( Crameri d φ al. , Nature, 391，2 8 8 -2 9 1，1 99 8 )°
本發明之人類化抗體可藉由各種可用於生產多肽的方 法來產出，如生物體外合成、重組DNA生產等。較佳者， 人類化抗體係藉由重組DNA技術來產出。因此本發明之人 類化路易斯Y特異抗體可藉由使用DNA技術之重組蛋白表 現方法來產出。操作DNA (如多核苷酸）的技術係對於在 分子生物學領域中具有通常知識者爲眾所周知。這類眾所 周知之技術的實例可見於 Molecular Cloning: A -30-
200539855
Laboratoty Manual 2nd Edition, Sambrook et a L， Cold Spring Harbor, N.Y· (1989)，用於免疫球蛋白（包括人類化 免疫球蛋白）之重組表現的技術也可見於其他地方： Goeddel e t a l. , Gene Expression Technology Methods in Enzymology， Vo 1. 185， Academic Press (1991)和
Borreback，Antibody Engineering, W. H. Freeman ( 1 992)。 此外有關重組抗體之生成、設計和表現可見於Mayforth， Designing Antibodies, Academic Press, San Diego I ( 1 993 )。習知分子生物學技術之實例包括（但不限於）：生 物體外連接、限制酶作用、PCR、細胞轉型、雜交、電泳、 DNA定序等。 一般用於本發明之載體構築的方法爲：轉染細胞，以 產生本發明之宿主細胞；培養細胞，以產生本發明之抗體； 均爲習知分子生物學方法。同樣地，本發明之重組抗體一 旦產生，則可依照該項技藝之標準程序來純化，包括交叉 流動過濾、硫酸銨沉澱、親和力管柱層析法、凝膠電泳、 φ透析過濾（diafiltration)等。用來表現重組抗體之宿主細 胞可爲細菌細胞（如E. coil)，或較佳者爲真核細胞。較佳 者，係使用哺乳類細胞如PER. C.6細胞、或中國倉鼠卵巢 細胞（CHO )。表現載體的挑選係取決於宿主細胞的挑選， 並經由挑選而使之在所選出之宿主細胞中具有理想表現和 正常特徵。 特定共溶劑、添加物、和特定反應條件係與分離方法 一起使用會導致單體性細胞毒性藥物衍生物抗體共軛物形 -31- 200539855 成與LCF顯著降低。相對於凝集形式的共軛物單體形式具 有顯著治療價値，並藉由預防 LCF與更高的高共軛分量 (H C F )競爭使L C F降到最低並實質上減少凝集，而使抗 體起始材料以具治療意義的方法來加以利用。 在本發明之上下文中’單體性細胞毒性藥物共軛物係 指共價地連結至任一數目之卡奇黴素分子且抗體無顯著凝 集的單一抗體。共價地連結至抗體之卡奇黴素部分的數目 亦稱爲藥物負荷量。舉例來說，根據本發明，其平均負荷 φ 量可爲每抗體有從0·1至10或15當中任一處之卡奇黴素 部分。一特定共軛物族群（如在組成物或配方中者）的藥 物負荷量可爲不均勻或均勻。在不均勻的族群中，由於平 均負荷量係表示共軛至抗體之藥物分子的平均數目（或莫 耳），每抗體上之藥物部分的確實數目實質上可能各自不 同。在非共軛或顯著經共軛之抗體特定族群中的抗體百分 比係稱爲低共軛物分量或LCF。 發現與非親核性、蛋白可相容的緩衝溶液一起使用的 •去氧膽酸一般係用以製造具備較高藥物負荷量/產率且凝 集降低、並具有優良活性之單體性細胞毒性藥物衍生物衍 生物/載劑共軛物。用於共軛物且製自Ν-羥基琥珀醯二亞胺 (Ο S u )酯類或其他經等同程度活化之酯類之較佳緩衝溶液 爲磷酸鹽緩衝鹽水（P B S )、Ν - ( 2 -羥基乙基）哌阱-Ν - ( 4 · 丁院 磺酸）（HEPBS )、或Ν-2-羥基乙基哌畊_Ν_2_乙烷擴酸 (HEPES緩衝液）。在這類共軛反應中所用之緩衝溶液不能 包含自由胺或親核劑。熟習該項技藝者可簡單地決定出用 -32- 200539855 # _ 於其他類型共軛物之可接受緩衝液。 爲有效形成單體性共軛物所必須的添加物之 個抗體而不同。這個用量亦可由對技藝具有通常 未進行不當實驗的情況下來決定。在本反應中， 度可在從1至15 mg/mL之範圍內，且卡奇黴素行: N·乙醯基γ-卡奇黴素DMHAcButOSu酯）之濃度 之從約3 - 9重量％的範圍內。 共溶劑可換成乙醇，已測出其濃度在從6至： φ 體積計）之範圍可達良好結果。反應可在PBS、 N-(2-羥基乙基）哌阱-Ν-(4·丁烷磺酸）（HEPBS )、 相容緩衝液中，在pH値爲約7至約9時（較佳 於從約25°C至約40°C (較佳者約30°C至約35°C 範圍進行1 5分鐘至24小時範圍的時間。更佳者 在pH約8.2進行。熟習該項技藝者可簡單地測 型之共軛物可接受的pH範圍。對各種抗體來說 以輕微變化來合倂使用前述添加物可以改善藥物 φ 單體性共軛物產率，且可了解，爲了達到最合適 任一特定抗體可要求在確實的條件及添加物的挑 一些小改變。 在共軛之後，單體性共軛物可由共軛物之非 物（如蛋白載劑分子/抗體、和自由細胞毒性藥1 素）及/或凝集形式來加以純化。舉例來說，用於 知方法可使用尺寸排除層析法（SEC )、疏水性交 析丨去（HIC )、離子交換層析法（IEC )、色f 量亦因各 知識者在 抗體之濃 生物（如 爲在抗體 1 · 4 %(以 HEPES、 或其他可 爲8至9 ) )之溫度 ，反應係 出其他類 ，已發現 負荷量和 的結果， 選上作出 共軛反應 3 /卡奇黴 純化之習 互作用層 i焦集法 -33- 200539855 # # (chromatofocusing’CF)。舉例來說，在下列層析分離中， 共軛物可被超過濾及/或透析過濾。 純化的共軛物爲單體性，且通常包含從3至9重量％ 之細胞毒性藥物/卡奇黴素。在一較佳具體實施例中，該共 軛物係使用HIC來純化。當細胞毒性藥物具有高疏水性質 (如卡奇黴素衍生物）且用於共軛物中時，爲有效分離經 共軛和非共軛之抗體，HIC是較佳的選擇。較之SEC，HIC 有三個主要的優點：（1)它具有有效減少L C F含量以及凝集 φ 的能力、（2)HIC之管柱負荷量高很多、以及（3)HIC可避免 產物過量稀釋。許多高容量的HIC媒介都適用於生產規 模’如 Butyl、Phenyl、和 Octyl Sepharose 4 Fast Flow (Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)都能在共軛方法 之後從單體性經共軛之組份中有效分離非共軛物和共軛物 的凝集。 車父佳者’HIC係在具有一負荷量之Butyl Sepharose FE 樹脂上以0·60 Μ磷酸鉀清洗緩衝液、和2〇 mM Tris / 25 鲁mM NaCl的沖提緩衝液來進行。亦較佳者，超過濾係使用 再生纖維素膜來進行，而透析過濾（diafiltration)則是使 用10透析體積之pH 8.0的20 mM Tris / 10 mM NaCl緩衝 液來進行。 因此’根據本發明方法，在純化步驟之後，共軛物之 平均負荷量爲每莫耳IgG1抗體有從約5至約7莫耳之卡奇 徽素。此外’在純化步驟之後，共軛物之低共軛分量（lcf ) 少於約1 〇 %。 -34- 200539855 # · 本發明亦提供藉由這些製法來製備的共軛物 軛物較佳爲維持裸抗體之結合動力學和特異性者 本發明之共軛物較佳爲經B I A c 〇 r e分析測定之Κ E 至400 nM(較佳爲3·4χ10·7Μ)、與路易斯Y抗原 與路易斯X和Η-2血型抗原結合、具有細胞毒性； 或具有抗腫瘤活性者。可用任一已知方法來測定 結合動力學和其特異性，舉例來說，如FACS或 分析。 φ 以本發明之方法所製備的卡奇黴素共軛物較 地連結至可水解之鍵結劑 4-(4-乙醯基苯氧 (AcBut)之N -乙醯基γ卡奇黴素二甲基醯肼（ 卡奇黴素DMH )，其係共價地連結至抗路易斯υ j (稱爲CMD-193或CMD)，是平均負荷量爲每莫 有從約5至約7莫耳之卡奇黴素的卡奇黴素共軛 軛物之低共軛分量（LCF )少於約1〇 %。 本發明亦提供包含共價地連結至抗路易斯γ 0奇黴素-可水解之鍵結劑的共轭物與醫藥可接受顚 釋劑、或載劑的組成物。因此，如本發明之較佳 包含共價地結合至G193之N-乙醯基γ卡奇黴素 肼-4-(4-乙醯基苯氧基）丁酸乙醯基4 DMH-AcBut)的共轭物，其中該平均負荷量爲每] 有從約5至約7莫耳之N-乙醯基卡奇黴素DMH， 之低共軛分量（LCF )少於約10 %。 人類化路易斯Y特異抗體可與其他抗體（或 。這類共 。是以， >是約1 0 0 結合而不 之活性及/ 共軛物的 B IA c 〇 r e 佳爲共價 基）丁酸 N-乙醯基 ΐ 體 G193 耳之抗體 物，且共 抗體之卡 :形劑、稀 組成物係 二甲基醯 ?奇黴素 I 耳 G193 且共軛物 其部分） -35- 200539855 • · 結合或連結來使用，其如人類或人類化單株抗體。這些其 他抗體可與其他的疾病特徵之標記（抗原決定部位）反應， 其標記係與本發明之抗體相對抗、或可具有經選擇之不同 特異性，舉例來說，將人類免疫系統之分子或細胞徵集到 有病的細胞上。本發明之抗體（或其部分）可與這類抗體 (或其部分）一起給藥，如分別給予多個組成物，或將單 個組成物與藉由習知化學或分子生物方法鍵結在一起的兩 種藥劑一起給藥。此外，可藉由使用會產生可偵測訊號（生 | 物體外或生物體內）之標記、或具有治療性質之標記來標 記之人類化抗體來增加本發明之抗體的診斷値和治療値。 一些標記如放射核種，可產生可偵測訊號且具有治療性 質。放射核種標記之實例包括1251、1311、14c。其他可偵 測標記之實例包括螢光發光團（如用於螢光顯微鏡之螢光 素、藻膽蛋白、或四乙基若丹明（r hod amine))，會產生可藉 由螢光、有色光吸收或凝集加以偵測之螢光或有色產物的 酶，以及會產生可藉由電子顯微鏡加以證明之電子密集產 φ物的酶，或直接或間接用於電子顯微鏡具像化的電子密集 分子，如鐵蛋白、過氧化酶、或金質珠粒。具有治療性質 的標記包括用於癌症治療的藥物，如甲氨喋呤等。 單體性細胞毒性藥物衍生物/載劑共軛物可爲治療性 或診斷性組成物/配方中的單獨活性成分、或可伴隨其他活 性成分（如下述化學治療劑、激素治療劑、或生物性治療 劑），其包括其他抗體成分，舉例來說爲抗CD19、抗CD20、 抗CD33、抗T細胞、抗IFN7、或抗LPS抗體；或非抗體 -36- 200539855 · · 成分，如細胞激素、生長因子、激素、抗激素、細胞毒性 藥物、和黄嘌呤素。 可將這些組成物/配方給予病患來做癌症的治療。根據 本發明，係將卡奇黴素-抗路易斯Y抗體共軛物之組成物或 配方的治療有效量、低溫保護劑、界面活性劑、緩衝劑、 和電解質給予有其需要之病患。或者，該組成物或配方可 用於大量製造治療癌症用的醫藥。當可察知，本方法或醫 藥可用以治療其特徵爲細胞表面表現出路易斯Υ抗原之增 Φ 生性疾病的任一病患。因此，在一具體實施例中，其所治 療的癌症爲路易斯Υ抗原陽性，該癌症較佳爲表現出大量 路易斯Υ抗原者（即路易斯Υ表現高之腫瘤）。其所治療 之癌症可爲癌瘤（carcinoma )，較佳爲非小細胞肺癌 (NSCLC )或乳癌，或爲前列腺癌或結直腸癌。 較佳者，hu3S193-AcBut-CM 或 CMD-193 可用於任一 療法，其中理想的是要以此處所揭露之組成物或醫藥來治 療，以降低患者身上有路易斯Y表現的細胞數目。特別是， φ將組成物或醫藥用於治療患有其細胞表面有路易斯Y抗原 表現之增生性疾病（亦即癌瘤）的人類或動物。這些有路 易斯Y表現的細胞可能是在體內循環、或以不理想的數目 大量出現，位於體內特定位置上。 本治療方法可與其他癌症治療合倂使用，其他癌症治 療包括手術、放射、化學治療、激素治療、生物治療、骨 髓移植（用於需要非常高劑量之化學治療的白血症和其他 癌症）°基於吾人對癌症生物學了解的增加，新型治療也已 -37- 200539855 # · 發展並獲得核准。 現有兩種一般放射療法可用於本方法。其中一種爲近 接療法（brae hy therapy )，係直接將放射性同位素移植到腫 瘤中，以將一濃縮劑量遞送到該區域內；另一種則爲體外 照射（teletherapy )，係使用光束來將放射遞送至身體的大 區域，或以全身體照射（total body irradiation，TBI)送至 全身。 任一合適的化療劑均可用於本方法中。這些化療劑一 φ 般係落在下列分類中（各有實例）：抗代謝產物（例如，葉 酸拮抗劑如甲氨喋呤，嘌呤拮抗劑如6-锍基嘌呤（6-MP)， 和嘧啶拮抗劑如 5-氟尿嘧啶（5-EU))、烷基化劑（環磷醯 胺）、D N A 結合劑（順鉑（c i s ρ 1 a t i η)或草酸鉑（ο X a 1 i p 1 a t i η))、 抗腫瘤抗生素（多柔比星（doxorubicin)或米托蔥醌 (mitoxantrone))、有絲分裂抑制劑（如紫杉類藥物 (taxanes))或微管抑制劑（如長春新鹼（vincristine))、或 拓樸異構酶抑制劑（喜樹鹼（camptothecan)或紫杉醇 φ (taxol))。更多特定實例敘述如下。 舉例來說，與本方法有關的激素療法包括用於白血病 和骨髓細胞癌的皮質類固醇、用於乳癌的雌激素和抗雌激 素、以及用於前列腺癌瘤之雄激素和抗雄激素。 生物療法係使用從生物體所取得的物質。在本方法中 合適療法的實例包括抗體（例如抗EGFR抗體，如西妥昔 單抗（cetuximab)或曲妥珠單抗（trastuzumab);或抗 VEGF 抗體，如貝伐單抗（bevacizumab) )、T細胞療法、干擾素、 •38- 200539855 · · 介白素、和造血生長因子。 骨髓移植可用以治療某些癌症，尤其是白血病。爲了 治療白血病，病患的骨髓細胞係以化學治療或放射治療加 以摧毀，之後將來自捐贈者、細胞表面HLA抗原相合或幾 乎相合的骨髓送入病患體內。骨髓移植也用來取代那些需 要極高劑量之放射或化學治療來殺死腫瘤細胞之病患的骨 髓。移植係根據捐贈者來源加以分類，在同種異體移植中， 骨髓捐贈者通常不是遺傳上相關者，但至少有五或六個細 φ 胞表面抗原相合，這些表面抗原是會被免疫系統（HLA抗 原）辨識的主要蛋白。而在自體移植中，病患是在接受化 學治療或放射治療後接受他們自己的骨髓移植，這種骨髓 移植可用於習知治療劑量不完全有效之非骨髓相關性癌 症。 此外，亦可在本方法中使用新硏發的策略，其中有些 是已核准或在臨床實驗階段，這些策略是基於吾人對於癌 症之分子與細胞基礎與疾病進程更加了解而發展出來的。 鲁可使用能抑制磷酸化級聯（p h 〇 s p h 〇 r y 1 a t i ο n c a s c a d e )的蛋 白激酶抑制劑（小分子和抗體兩者）（如埃羅替尼 (erlotinib)或甲磺酸伊馬替尼（imatinib mesylate))。任一抗 轉移劑可用於阻斷癌症細胞擴散與侵入新組織。可使用抗 血管生成劑來阻斷對腫瘤給養的血管發展（如沙利竇邁 (thalidomide))。其他可使用之藥劑爲反義（antiSense)寡 核苷酸，其可阻斷會導致腫瘤細胞增生之畸形蛋白的產 生。亦可使用基因療法來將基因引入要注射到病患身上、 -39-
200539855 且設計用來殺死特定的腫瘤細胞的T細胞。又，舉例來說， 可藉由將正常ρ 5 3基因引入變異型癌症細胞來把ρ 5 3當作 標的，以重建其對化學治療性藥物之敏感性。 在一具體實施例中，本發明之組成物/配方係與生物活 性劑合倂使用。常用的生物活性劑包括抗體、生長因子、 激素、細胞激素、抗激素、黄嘌呤素、介白素、干擾素、 細胞毒性藥物、和抗血管生成之蛋白。 生物活化的細胞毒性藥物一般用於治療增生性疾病 (如癌症），其可與卡奇黴素-抗路易斯Υ抗體共軛物一起 使用，且其包括：蒽環黴素類（anthracyclines)，如多柔比 星、柔紅黴素（daunorubicin)、伊達比星（idarubicin)、 阿柔比星（aclarubicin)、佐柔比星（zorubicin)、米托蒽 11、表柔比星（epirubicin)、卡柔比星（carubicin)、諾加 黴素（nogalamycin)、美諾立爾（menogaril)、達柔比星 (pitarubicin)和凡柔比星（valrubicin)，高達三天；&密π定
或嘌哈核音類，如阿糖胞苷（cytarabine )、吉西他濱 (gemcitabine)、三氟尿苷（trifluridine)、安西他濱 (ancitabine)、伊諾他濱（enocitabine)、阿扎胞苷 (azacitidine)、去氧氟尿苷（doxifl uridine)、噴司他汀 (pentostatin )、溴尿苷（broxuridine )、卡培他濱 (capecitabine)、克拉屈濱（cladribine)、地西他濱 (decitabine )、尿苷（floxuridine )、贏達拉濱 (fludarabine)、谷氏菌素（gougerotin)、嘿呤黴素 (puromycin)、替加氟（tegafur)、噻唑呋啉（tiazofurin); -40- 200539855 φ
烷基化劑類，如環磷醯胺、威克瘤（melphalan )、塞替派 (thiotepa)、異環碟醯胺 （ifosfamide)、卡莫斯汀 (carmustine)、川員鉑、CKD-602、雷多沙同（ledoxantrone)、 魯比替康（rubitecan)、拓樸替康（topotecan)氫氯酸鹽、 LE-SN38、阿凡內替康（afeletecan)氫氯酸鹽、XR-11576、 和XR-11 612 ;抗代謝產物類，如甲氨喋呤、5-氟尿嘧啶、 替加氟/尿嘧啶（UFT)、雷替曲塞（ralititrexed)、卡培他濱、 爾可福（leucovorin)/UFT、S-1、培美曲塞二鈉（pemetrexed disodium )、特拉西他濱 （tezacitabine )、三甲曲沙 (trimetrexate)葡萄糖醛酸酯、塞美他辛（thymectacin)、 地西他濱；抗腫瘤抗體類，如伊決洛單抗（edrecolomab )、 絲裂黴素（Mitomycin)、絲裂黴素C、和草酸鉑；長春花 生物鹼類，如長春新鹼 （vincristine )、長春鹼 (vinblastine)、長春瑞賓（vinorelbine)、脫水長春鹼；血 管生成作用抑制劑類，如伐塔拉尼（vatalanib )琥珀酸鹽、 歐谷法奈（oglufanide )、RP1-4610 ;訊息傳遞抑制劑類， •如吉非替尼（gefitinib)、317615.2 HCL、因地蘇蘭 (indisulam )、拉帕替尼 （lapatinib )、索拉分尼 (sorafenib )、WHI-P 1 3 1 ;細胞凋亡引發劑類，如艾佛西 第（alvocidib)氫氯酸鹽、伊諾夫文（irofulven)、苯基丁 酸鈉、波替所密（bortezomib)、伊昔舒林（exisulind)、 MS-2167;表鬼臼毒素類（epipodophyllotoxins)，如依託 泊苷（etoposide );和紫杉類藥物，如紫杉醇（paclitaxel )、 多西紫杉醇（doceltaxel )、DHA紫杉醇、伊沙貝皮隆 -41- 200539855 · (ixabepilone )、聚麩胺酸酯紫杉醇、或埃坡黴素 (epothilones) 〇 其他可與 hu3S 1 93-AcBut-CM 或 CMD-193 或 AG G 193-Ac But-CM合倂給予的化學治療劑/抗贅瘤劑包括阿 黴素、順鉑、卡鉑（carboplatin )、環磷醯胺、達卡巴阱 (dacarbazine)、異環磷醯胺、長春地辛（vindesine)、吉 西他濱、伊達曲沙（edatrexate)、伊立替康（irinotecan)、 氮芥（mechlorethamine)、六甲蜜胺（altretamine)、卡鉑 • (carboplatine)、替尼泊苷（teniposide)、拓樸替康、吉 西他濱、塞替派、氟尿苷（fluxuridine，FUDR)、MeCCNU、 長春鹼、長春新鹼、米托蒽醌、平陽黴素（bleomycin)、 氮芥、潑尼松（prednisone)、丙卡巴哄（procarbazine)、 甲氨喋呤、氟尿嘧啶、依託泊苷、紫杉醇和其各種類似物、 絲裂黴素、沙利竇邁和其各種類似物、GBC-5 90、曲沙他 濱（troxacitabine )、 ZYC-300、 TAU、 （R)氟比洛芬 ((R)fUrbipr〇fen )、 組胺氫氯酸鹽、塔立奎達 φ ( tariquidar)、達伐奈-1 ( davanat-1)、ONT-093。給藥可 與一種或多種這些治療劑同時給予，或者，與一種或多種 這些治療劑先後給予。 可與本發明之抗體共軛物一起給予的生物活化抗體包 括（但不限於）·· Herceptin、Zevalin、Bexxar、Campath、 西妥昔單抗、貝伐單抗、ABX-EGF、MDX-210、培妥單抗 (pertuzurmab)、曲妥珠單抗、1-131 ch-TNT-l/b、hLM609、 6H9、CEA-Cide Y90、IMC-1C11、ING-1、西伯妥單抗 -42- 200539855 φ (sibrotuzumab)、TRAIL-Rl Mab、YMB-1003、2C5、GivaRex 和 Μ Η - 1。 卡奇黴素-抗路易斯Υ抗體共軛物亦可單獨給藥、或 與其他作爲治療計畫之一部分的生物活性劑（如生長因 子、細胞激素、類固醇）、抗體（如抗路易斯Υ抗體、利昔 妥單抗（rituximab))和化療劑同時或先後給藥。卡奇黴素-抗路易斯Y抗體共軛物亦可單獨給藥、或與任一上述定義 之治療計畫如誘發療法階段、強化療法階段、和維持療法 φ 階段之一部分同時或先後給藥。
本發明之共軛物亦可與作爲合倂化學治療計畫之一部 分的其他生物活性劑和化療劑一起給予，用來治療復發的 惡性癌瘤。這類治療計畫包括：CAP (環磷醯胺、多柔比 星、順鉑）、PV (順鉑、長春鹼或長春地辛）、CE (卡鉑、 依託泊苷）、EP (依託泊苷、順鉑）、MVP (絲裂黴素、長 春鹼或長春地辛、順鉑）、PFL (順鉑、5 -氟尿嘧啶、爾可 福）、IM (異環磷醯胺、絲裂黴素）、ΐΕ (異環磷醯胺、依 φ託泊苷）、iP (異環磷醯胺、順鉑）、MIP (絲裂黴素、異環 磷醯胺、順鉑）、IC E (異環磷醯胺、卡鈾、依託泊苷）、p IE (順鈾、異環磷醯胺、依託泊苷）、長春瑞賓和順鉑、卡鉑 和紫杉醇、CAV (環磷醯胺、多柔比星、長春新鹼）、CAE (環磷醯胺、多柔比星、依託泊苷）、C A V E (環磷醯胺、 多茱比星、長舂新鹼、依託泊苷）、EP (依託泊苷、順鉑）、 CMCcV (環磷醯胺、甲氨喋呤、洛莫斯汀（1〇mustine)、長 春新鹼）、CMF (環磷醯胺、甲氨喋呤、5_氟尿嘧啶）、CAF -43- 200539855 φ (環磷醯胺、多柔比星、5-氟尿嘧啶）、CEF (環磷醯胺、 表柔比星、5 -氟尿嘧啶）、CMFVP (環磷醯胺、甲氨喋呤、 5 -氟尿嘧啶、長春新鹼、潑尼松）、AC (多柔比星、環磷醯 胺）、VAT (長春鹼、多柔比星、塞替派）、VATH (長春鹼 多柔比星、塞替派、氧甲睪酮（fluosymesterone))、 CDDP-VP-16 (順鉑、依託泊苷、絲裂黴素C +長春鹼）。 本發明亦提供一種治療罹患其細胞有路易斯Y表現之 增生性疾病或具有罹患該疾病之風險的人類或動物患者之 φ 方法，該方法包含給予患者本發明之卡奇黴素-抗路易斯Y 抗體共軛物的有效量。其應察知，藉由治療，可抑制、預 防或延緩癌症的生長，包括延緩腫瘤生長和抑制轉移。 可給予本發明之組成物/配方而作爲第二線單一治 療。第二線係指將本組成物/配方係在不同之抗癌治療之治 療後來使用，其實例如上所述。或者，可將該組成物或配 方作爲第一線合倂治療而與上述另一抗癌治療一同給予。 可用各種方法將本發明之人類化抗體組成物給予病 #患。該組成物之直接遞送一般會伴隨皮下、腹膜內、靜脈 內、或肌肉內注射，或遞送至組織間隙。較佳者，該醫藥 組成物可爲由非經口給藥，即，皮下給藥、肌肉內給藥、 或靜脈內給藥。該組成物亦可給入患處。劑量治療可爲單 劑量療程或多劑量療程。 因此’本發明提供用於非經口給藥之組成物/配方，其 包含溶解於可接受之載劑（較佳爲水性載劑）之人類單株 抗體或其混合雞尾酒的溶液。舉例來說，爲卡奇黴素-抗路 -44- 200539855 _ 易斯γ抗體共軛物、低溫保護劑、界面活性劑、緩衝液、 和電解質之配方。 可使用多種水性載劑，如水、緩衝之水、〇.4 %鹽水、 0.3 %甘胺酸等。這些溶液爲滅菌的溶液，且一般而言沒有 顆粒物。這些組成物可藉由習知、眾所周知之滅菌技術來 滅菌。該組成物可依照接近生理學條件（如pH之調整和 緩衝劑、毒性調整劑等）之需求而包含醫藥可接受之輔助 性物質，舉例來說，乙酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、 φ 乳酸鈉。在這些配方中的抗體濃度變化可能很大，如從少 於約0.5重量％、通常爲1重量％或至少約1重量％至15或 2 0重量％之多，且主要係基於流體體積和黏度來加以選 擇，舉例來說，係根據所選擇之特定給藥模式來加以選擇。 當可察知，組成物中的活性成分爲抗路易斯Y抗體-卡奇黴素共軛物。當其如此，會容易在胃腸道中降解。因 此，若將組成物藉由胃腸道途徑來給予，組成物會需要包 含能保護蛋白載劑免於降解、但只要共軛物釋出便會被胃 φ腸道吸收的藥劑。 製備可非經口給予之組成物的確實方法和對患者給藥 來說爲必須之調整劑對熟習該項技藝者爲已知或至爲顯 明，舉例來說，其於下列合倂於此處作爲參考之文獻中有 更詳盡的描述：Remingtons Pharmaceutical Science，15th Ed·，Mack Publishing Company，Easton，Pa. ( 1 9 8 0) 0 醫藥 可接受載劑之完整討論可見於Remingtons Pharmaceutical Sciences ( Mack Publishing Company，N . J . 1991)。 -45- 200539855 · 可將組成物個別給予病患、或可與其他藥劑、藥物、 或激素合倂給予病患。細胞激素和生長因子可用於治療增 生性疾病（如癌症），且可與本發明之細胞毒性藥物衍生物 /載劑共軛物（包括干擾素、介白素如介白素2(lL-2)、TNF、 CSF、GM-CSF和G-CSF) —起使用。激素一般係用於治療 增生性疾病（如癌症），且可與本發明之細胞毒性藥物衍生 物/載劑共軛物一起使用，其包括雌激素（己烯雌酚 (diethylstilbestrol)、雌二醇）、雄激素（睪酮、氟甲睪酮 .(Halotestin))、黄體酮（滅惡速（Megace)、普羅弗 (Provera))、和皮質類固醇（潑尼松、地塞米松 (dexamethasone)、皮質酮）。抗激素劑，如抗雌激素（泰莫 西芬（tamoxifen))、抗雄激素（氟硝丁醯胺（flutamide))和 抗腎上腺劑一般係用於治療增生性疾病（如癌症），且可與 本發明之細胞毒性藥物衍生物/載劑共軛物一起使用。 此外，化學治療劑/抗贅瘤劑一般係用於治療增生性疾 病（如癌症），且其可用與本發明之細胞毒性藥物衍生物/ φ載劑共軛物一起使用；其包括（但不限於）：阿黴素、順鉑、 卡鉑、長春鹼、長春新鹼、平陽黴素、甲氨喋呤、多柔比 星、氟尿嘧啶、依託泊苷、紫杉醇和其各種類似物、絲裂 黴素、沙利竇邁和其各種類似物。 醫藥組成物/配方較佳應包含本發明之共軛物之治療 有效量。詞語「治療有效量」用於此處時，係指爲治療、 緩和或預防標的疾病或適應症、或爲了展示出可偵測之治 療或預防效果所需之治療劑的量。對任一共軛物來說，治 -46- 200539855 · # 療有效量一開始可用細胞培養測試法或動物模型（通常是 在嚅齒類、兔子、狗、豬或靈長類身上）來推估。動物模 型亦可用來測定合適的濃度範圍和給藥途徑。之後，這類 資訊可用以測定用於人類之給藥劑量和途徑。 人類患者之精確有效量亦取決於疾病狀態的性質和嚴 重程度、患者的一般健康狀況、患者的年齡、體重和性別、 飲食、給藥的時間和頻率、藥物合倂物（可爲多種）、反應 敏感度、以及治療的耐受性/和反應。若將該共軛物預防性 φ 地用在既有的條件中，也會影響到有效量。這個量可藉由 例行實驗來加以決定，並在臨床醫師的判斷範圍之內。一 般而言，有效劑量以蛋白載劑之基準計，爲從0.01 mg/m2 至 50mg/m2，較佳爲 O.lmg/m2至 20mg/m2，更佳者約 10-15mg/m2 〇 劑量之頻率係取決於共軛物之半生期和其有效期。若 該共軛物的半生期短（如2至1 0小時），其劑量的給予就 可能必須每天一次或多次；或者，若該共軛物分子半生期 Φ長（如2至1 5天），其劑量的給予就可能必須每天一次、 每週一次、或甚至每1或2個月一次。 組成物亦可包含用於抗體共軛物之給藥的醫藥可接受 載劑。醫藥上的載劑可爲任一適用於將單株抗體遞送到病 患身上之相容且非毒性之物質。載劑中可包含滅菌水、醇、 脂肪、蠟、和惰性固體。載劑本身應不會引發對接受該組 成物之個體有害的抗體產生，也應爲無毒。合適的載劑可 爲大型、慢慢代謝的大分子，如蛋白、多肽、脂質體、多 -47- 200539855 · # 糖、聚乳酸、聚乙醇酸、高分子胺基酸、胺基酸共聚物、 和非活化之病毒顆粒。醫藥上可接受之佐劑（緩衝劑、分 散劑）亦可合倂於醫藥組成物中。 可以使用的醫藥可接受鹽，舉例來說，爲礦物酸鹽， 如氫氯酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、和硫酸鹽；或爲有機酸 之鹽，如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、和苯甲酸鹽。 在治療性組成物/配方中之醫藥可接受載劑可另含有 液體，如水、鹽水、甘油、和乙醇。這類組成物中可存有 % 輔佐性物質（如濕潤劑或乳化劑）或pH緩衝物質。這類 載劑會使組成物可以配製成錠劑、九劑、糖衣錠、膠囊、 液劑、凝膠劑、糖漿劑、漿劑和懸浮劑，供給病患消化之 用。 用於給藥之較佳形式包括適用於非經口給藥之形式， 如注射或輸注，舉例來說，藥團（bolus )注射或連續輸注。 在產物用於注射或輸注的時候，可採用在油性或水性賦形 劑中之懸浮液、溶液或乳液的形式，且其可包含配方劑， • 如懸浮劑、保存劑、安定劑及/或分散劑。 雖然緩衝之共軛物溶液的安定性在短時間內不錯，但 長期的安定性不佳。爲了增強共軛物之安定性、加長保存 期限，該抗體-藥物共軛物可爲經冷凍乾燥之乾燥形式，在 使用前以合適的滅菌的液體來進行再組成。有關蛋白溶液 之冷凍乾燥的問題已有詳盡記載，二級、三級和四級結構 的喪失可以是在冷凍和乾燥製法期間發生。將之與低溫保 護劑、界面活性劑、緩衝劑、和電解質在溶液中接觸，之 -48- 200539855 • · 後將該溶液冷凍乾燥可保存這些組成物/配方之生物活 性。亦可將低溫保護劑加至該溶液中。 安定配方爲一內含在儲存期間基本上保有其物理和化 學安定性以及整體性之抗體的配方。在該項技藝中，有各 種用於測量抗體安定性之分析技術可用，可見於Peptide and Protein Drug Delivery, 247-3 0 1, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker，Inc.，New York，Ν·Υ·，Pubs. (1991)和 Jones，A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993)。可在 φ 所選擇的溫度經過一段所選擇的時間來測量安定性。爲了 快速篩檢，該配方可於40 °C保持2週至1個月，其中並測 量其時間安定性。當將該配方儲存於2-8 °C時，該配方一般 應於30°C或40°C安定至少1個月及/或於2-8°C安定至少2 年。當將該配方儲存於3 0 °C時，該配方一般應於3 0 °C安定 至少2年及/或於40 °C安定至少6個月。在冷凍乾燥和儲存 之後的凝集程度可用作抗體安定性的指標。舉例來說，安 定的配方可爲在配方中以凝集方式出現之抗體少於約1 〇 % 鲁者，較佳爲少於約5 %者。在其他具體實施例中’可測定 經冷凍乾燥之配方在冷凍乾燥和儲存之後任一凝集程度的 增加。舉例來說，當經冷凍乾燥之配方於2-8 °C儲存至少一 年時，安定的經冷凍乾燥之配方可爲在經冷凍乾燥之配方 中凝集之增加少於約5 %者’且較佳爲凝集之增加少於約3 %者。此外，抗體配方之安定性可使用生物活性測定法來 加以測量。 低溫保護劑可能必須包括於內’而作爲共軛物之無水 -49-
200539855 安定劑’以便在冷凍乾燥方法中維持蛋白之結構完整性。 在一具體實施例中，可用於本發明之低溫保護劑爲糖醇， 如糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、聚乙二醇、和其等 之合倂物。在另一具體實施例中，低溫保護劑爲糖酸，包 括醛糖糖酸、糖醛酸、醛糖二酸、和其等之合倂物。 本發明之低溫保護劑亦可爲碳水化合物。合適的碳水 化合物爲包含二個以上羥基的醛或酮化合物。該碳水化合 物可爲環形或線性，且包括，舉例來說，醛糖、酮糖、胺 φ 基糖、糖醇、肌醇、醛糖糖酸、糖醛酸、或醛糖二酸、或 此等之合倂物。該碳水化合物亦可爲單-、二-、或多-碳水 化合物，如舉例來說，雙糖類或多糖類。舉例來說，合適 的碳水化合物包括甘油糖、阿拉伯糖、來蘇糖、戊糖、核 糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、己糖、艾杜糖、甘露糖、太 洛糖、庚糖、葡萄糖、果糖、葡萄糖酸、山梨糖醇、乳糖、 甘露糖醇、甲基α-葡萄峨喃糖苷、麥芽糖、異抗壞血酸、 抗壞血酸、內酯、山梨糖、葡萄糖二酸、赤藻糖、蘇糖、 馨阿拉伯糖、阿洛糖、阿卓糖、古洛糖、艾杜糖、太洛糖、 赤藻酮糖、核酮糖、木酮糖、假果糖、塔格糖、葡萄糖醛 酸、葡萄糖酸、葡萄糖二酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸、 葡萄胺糖、半乳胺糖、蔗糖、繭糖或神經胺糖酸、或其衍 生物。舉例來說，合適的多碳水化合物包括阿拉伯糖膠、 果聚糖、藻聚糖、半乳聚糖、聚半乳糖酸、葡聚糖、甘露 聚糖、木聚糖（舉例來說，如菊糖）、左聚糖、墨角藻聚糖、 角叉聚糖、半乳卡羅聚糖、果膠、果膠酸、直鏈澱粉、支 -50- 200539855 · · 鏈澱粉、糖原、支鏈澱粉、纖維素、右旋糖酐、石臍素、 幾丁質、瓊脂糖、角質素、軟骨素、皮膚素（dermatan)、 透明質酸、藻酸、黃原膠、或澱粉。其中特別有用的碳水 化合物爲蔗糖、葡萄糖、乳糖、海藻糖、和此等之合倂物。 蔗糖爲一種特別有用的低溫保護劑。 較佳者，本發明之低溫保護劑爲碳水化合物或糖醇， 其可爲多元醇。多元化合物爲包含一個以上之羥基的化合 物。該多元化合物較佳爲線性者。舉例來說，合適的多元 0 化合物包括二醇類，如乙二醇、聚乙二醇、和聚丙二醇、 甘油、或新戊四醇、或其等之合倂物。在某些較佳具體實 施例中，該低溫保護劑爲蔗糖、繭糖、甘露糖醇、或山梨 糖醇。在另一具體實施例中，該低溫保護劑之濃度爲約1 . 5 重量％至約6重量％。較佳者，該低溫保護劑爲濃度爲約5 % 之蔗糖。 現已發現，將界面活性劑加至經預先冷凍乾燥之配方 中是較爲理想的。或者，或說此外，可將界面活性劑加至 φ經冷凍乾燥之配方及/或再組成配方中。界面活性劑之範例 包括非離子性界面活性劑，如聚山梨酯系（如聚山梨酯20 或 8 0)； poloxamer 系（如 poloxamer 188)； Triton ；硫酸 十二鈉（SDS );硫酸月桂鈉；葡萄糖苷辛基鈉；月桂基-、 肉宣蔻基-、亞麻油基-、或硬脂基-磺甜菜鹼；月桂基-、肉 宣蔻基-、亞麻油基-、或硬脂基-肌胺酸；亞麻油基-、肉宣 蔻基-、或鯨蠟基-甜菜鹼；月桂醯胺基丙基·、椰子醯胺基 丙基-、亞麻油醯胺基丙基-、肉萱蔻醯胺基丙基-、棕櫚醯 -51- 200539855 · · 胺基丙基-、或異硬脂醯胺基丙基-甜菜鹼（如月桂醯胺基 丙基）；肉宣蔻醯胺基丙基-、棕櫚醯胺基丙基-、或異硬脂 醯胺基丙基-二甲基胺；牛磺酸-椰子基甲基鈉、或-油基甲 基二鈉；和 MONAQUATtm 系（Mona Industries, Inc·， Paterson，N.J.);聚乙二醇、聚丙二醇、與乙烯和丙二醇之 共聚物（如Pluronics或PF68);以及Tween 80。在一具體 實施例中，界面活性劑之濃度爲約〇 · 〇 〇 5重量％至約0 · 0 5 重量％，在一較佳具體實施例中，界面活性劑係濃度爲〇. 〇 1 φ 重量％之聚山梨酯80,或濃度爲約0.01重量％之Tween 80。 再組成配方係可藉由將經冷凍乾燥之抗體配方溶解於 稀釋劑中，而使抗體分散在再組成配方內。再組成配方適 用於對要用重要抗體來治療之病患的給藥（如非經口給 藥），且在本發明之一些具體實施例中，其可爲適用於皮下 給藥者。 等張意爲該重要配方具有本質上與人類血液相同的滲 透壓。等張配方一般會具有從約250至350 mOsm之滲透 φ壓。等張度可使用蒸氣壓型或冰凍型滲透儀來加以測量。 亦可將低溫保護劑加入經預先冷凍乾燥之配方中。低 溫保護劑爲一種在與重要之抗體合倂時能顯著地預防或降 低在冷凍乾燥及後續儲存時抗體的化學及/或物理不安定 性的分子。低溫保護劑之範例包括糖（如蔗糖或繭糖）、胺 基酸（如麩胺酸單鈉、或組胺酸）、甲基胺（如甜菜鹼）、 親液性鹽（如硫酸鎂）、多元醇（如三元或更高級之糖醇， 如甘油、赤藻糖醇、丙三醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨 -52-
200539855 · 糖醇、和甘露糖醇）、聚丙二醇、聚乙二醇、Pluron 及此等之合倂物。較佳之低溫保護劑爲非還原糖， 或蔗糖。 在較佳具體實施例中，低溫保護劑爲非還原糖 糖或繭糖。在經預先冷凍乾燥之配方中，低溫保護 一般係使所得配方於再組成中爲等張者。然而，低 組成配方也是合適的。此外，低溫保護劑之量不可 以免在冷凍乾燥中發生不可接受之抗體降解/凝集量 φ 溫保護劑爲糖（如蔗糖或繭糖）時，在經預先冷凍 配方中的低溫保護劑濃度範例爲從約1 0 mM至 m Μ，較佳爲從約3 0 m Μ至約3 0 0 m Μ，且最佳者爲 mM至約1 00 mM。抗體對低溫保護劑之比率係依各 和低溫保護劑之合倂物來加以選擇。在以糖（如蔗 糖）作爲用來生產具高抗體濃度之等張再組成配方 保護劑的例子當中，低溫保護劑對抗體之莫耳比率 約100至約1 5 00莫耳之低溫保護劑對1莫耳抗體， •爲從約2 0 0至約1 000莫耳之低溫保護劑對1莫耳拧 更佳爲從約2 0 0至約6 0 0莫耳之低溫保護劑對1莫] 以低溫保護量加入經預先冷凍乾燥之配方之低 劑意爲：在低溫保護量之低溫保護劑存在的情況下 冷凍乾燥之後，該抗體在冷凍乾燥和儲存中本質上 物理和化學安定性、以及其整體性。 此處重要的稀釋劑爲一種醫藥可接受（對人類 說爲安全且非毒性）且可用於製備再組成配方者。 ics、以 如繭糖 ，如蔗 劑之量 張的再 過低， 。在低 乾燥之 約 4 0 0 從約5 0 個抗體 糖或繭 的低溫 可爲從 且較佳 〔體，且 ί抗體。 溫保護 將抗體 保有其 給藥來 稀釋劑 -53- 200539855 · 之範例包括滅菌水、抑菌之注射用水（B W F I )、ρ Η緩衝溶 液（如磷酸鹽緩衝鹽水）、滅菌之鹽水溶液、林格氏液 (Ringers solution)、或葡萄糖溶液。 保存劑是一種可加入稀釋劑中而本質上會降低再組成 配方中之細菌作用的化合物，從而促進多用途再組成配方 實例的生產。有潛力的保存劑實例包括氯化十八基二甲基 苄基銨、氯化六甲銨、氯化苄烷銨（氯化烷基苄基二甲基 銨之混合物，其中烷基爲長鏈化合物）、和氯化苄乙銨。其 φ 他類型之保存劑包括芳族醇（如酚、丁基醇和苄基醇）、對 羥基苯甲酸烯丙酯（如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸 丙酯）、兒茶酚、間苯二酚、環己醇、3-戊醇、和m-甲醇。 此處最佳保存劑爲苄基醇。 結塊劑爲一種會對增加冷凍乾燥之混合物之質量、且 對經冷凍乾燥之餅狀物的物理結構有所貢獻的化合物（如 促進一種本質上均一、且維持一開孔結構的經冷凍乾燥之 餅狀物的生產）。結塊劑之範例包括甘露糖醇、甘胺酸、聚 鲁乙二醇和山梨糖醇。 在一些例子當中，係將低溫保護劑（如蔗糖或繭糖）和 結塊劑（如甘露糖醇或甘胺酸）的混合物用於預冷凍乾燥 配方之製備中。該結塊劑可使經冷凍乾燥之均一餅狀物的 生產不會有過量的氣袋（Pocket )在餅狀物中。因此，亦 可將結塊劑在冷凍乾燥之前加入。合適的結塊劑可具有約 〇 . 5至約1 · 5重量％之濃度。結塊劑較佳爲濃度爲〇 . 9重量％ 之右旋糖酐40、或濃度爲0.9重量％之羥乙基澱粉40。 -54- 200539855 • · 其他醫藥可接受載劑、賦形劑或安定劑係如那些 Remingtons Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A· Ed· ( 1 9 8 0)所描述者，其可被包括在所提供之經預先冷 凍乾燥之配方（及/或經冷凍乾燥之配方及/或再組成配方） 中，而不會對該配方之理想特徵造成不良影響。可接受之 載劑、賦形劑或安定劑在所用之劑量和濃度時對接受者來 說是無毒的，且其另外包括緩衝液、保存劑、共溶劑、抗 氧化劑（包括抗壞血酸和甲硫胺酸）、螯合劑（如EDTA )、 φ 金屬複合物（如Zn-抗體複合物）、生物可分解之聚合物（如 聚酯）、及/或鹽形成平衡離子（如鈉）。 要用於生物體內給藥的配方必須滅菌，這可在冷凍乾 燥和再組成之前或之後藉由通過滅菌過濾膜之過濾而快速 達成。或者，舉例來說，整體混合物的滅菌可藉由將抗體 以外之成分於約1 2 0 °C高溫高壓滅菌約3 0分鐘來達成。 在製備出重要的抗體之後，產出經預先冷凍乾燥之配 方。在經預先冷凍乾燥之配方中的抗體量係以理想給藥劑 鲁量體積、態樣來決定。抗體通常是存在於溶液中，舉例來 說，抗體可存在於pH緩衝溶液中。緩衝液之範例包括組 胺酸、磷酸鹽、Tris、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽、和其他有機 酸。在一具體實施例中，共軛物之濃度爲約0.5 mg/mL至 約2 mg/mL，且較佳者之濃度爲1 mg/mL。在一具體實施 例中，緩衝劑之濃度爲約5 mM至約5 0 mM。在一較佳具 體實施例中，緩衝劑係濃度爲約20 mM之Tris。在冷凍乾 燥之前，pH可爲任一合適的PH ，舉例來說，從約7.8 -55· 200539855 # · 至約8.2，且較佳者爲約8.0。 在本配方之另一具體實施例中，電解質之濃度爲約5 m Μ至約1 0 0 m Μ。任一合適的電解質均可使用，如鈉、鉀、 鈣、鎂、氯化物、磷酸鹽、和碳酸氫鹽之實例。較佳者’ 其電解質爲鈉鹽或鉀鹽；且更佳者，其電解質係濃度爲約 10 mM 之 NaClo 在抗體、低溫保護劑和其他選擇性組份混合之後，將 該配方冷凍乾燥。爲達成此目的，可使用多種不同之冷凍 _ 乾燥機，如 Hull50.TM. ( Hull， USA )或 GT20.TM. (Leybold-Heraeus，Germany)冷凍乾燥機。冷凍乾燥係藉 由將該配方冷凍、之後使經冷凍之內容物於合適的溫度讓 冰昇華，而作爲第一乾燥。在此條件之下，產物溫度會低 於配方的共熔點或坍塌溫度。一般來說，第一乾燥之層架 溫度範圍係在合適的壓力下從約-30至25°C (係提供而使 該產物在第一乾燥期間維持冷凍），其合適的壓力範圍一般 爲從約50至25 0 mTorr。配方、盛放樣本之容器（如玻璃 鲁管）的大小和種類、和液體之體積主要是由乾燥所需之時 間來決定，範圍可從數小時至數天（如4 0 - 6 0小時）。第二 乾燥階段可於約0-40 °C進行，主要取決於容器的種類和大 小、以及所用之抗體的種類。然而，在此發現，第二乾燥 步驟並非必要。舉例來說，在冷凍乾燥之所有水分移除階 段之層架溫度可爲從約15-30°C (如約20°C )。第二乾燥所 需之時間和壓力則會是能夠產生合適的經冷凍乾燥之餅狀 物者’其取決於如溫度和其他參數。第二乾燥時間係由產 -56- 200539855 _ 物中之理想殘餘水分含量來決定，一般需要至少約5小時 (如1 0- 1 5小時）。該壓力可與在第一乾燥步驟當中所使用 者相同。冷凍乾燥條件可根據配方和管的大小作出改變。 根據本發明之冷凍乾燥可包含於約-35至約-5 0°C之溫 度冷凍該溶液；將經冷凍之溶液於約2 0至約8 0微米之第 一乾燥壓力和約-10°C至約-4 (TC之層架溫度進行初始乾燥 24至78小時·，而後將經冷凍乾燥之產物於約20至約80 微米之第二乾燥壓力和約+ 1 〇 °C至約+ 3 0 °C之層架溫度進行 φ 第二乾燥15至30小時。冷凍係於約-45°C完成；初始冷凍 乾燥係於約60微米之第一乾燥壓力和約-30°C之層架溫度 進行60小時；而第二乾燥步驟係於約60微米之乾燥壓力 和約+2 5 °C之層架溫度進行約24小時。 爲了避免轉移的步驟，將抗體配方於進行抗體之再組 成的容器中冷凍乾燥可能是理想的。舉例來說，在這個實 例中之容器可爲3、5、10、20、50或100毫升管。 作爲一般提案者，冷凍乾燥會導致在經冷凍乾燥之配 φ方中的水分含量少於約5 %，且較佳爲少於約3 %。 在理想的階段中，一般係於將抗體給予病患時，經冷 凍乾燥之配方可與稀釋劑進行再組成，如此則再組成配方 中的抗體濃度至少爲50 mg/mL，舉例來說，爲從約50 mg/mL至約400 mg/mL，更佳爲從約80 mg/mL至約300 m g / m L，且最佳爲從約9 0 m g / m L至約1 5 0 m g / m L。在想要 以皮下方式來遞送再組成配方時，認爲這類再組成配方中 的高抗體濃度格外地有用。然而，對其他給藥途徑（如靜 -57- 200539855 · · 脈給藥）來說，再組成配方內的抗體濃度較低可能是理想 的。（舉例來說，其於在再組成配方中爲從約5 - 5 0 m g/m L， 或爲從約10-40 mg/mL抗體）。在一些具體實施例中，再組 成配方中的抗體濃度顯著高於經預先冷凍乾燥之配方中的 抗體濃度。舉例來說，再組成配方中的抗體濃度可爲經預 先冷凍乾燥之配方的抗體濃度之約2-40倍，較佳者爲3-10 倍，且最佳者爲3-6倍（如至少三倍或至少四倍）。 雖然也可使用其他的理想溫度，但是再組成通常是在 0 約25 °C之溫度進行，以確保完全水合。再組成所需的時間 係取決於如稀釋劑的類型、以及賦形劑（可爲多種）和抗 體的量。稀釋劑之範例包括滅菌水、抑菌之注射用水 (BWFI)、pH緩衝溶液（如磷酸鹽緩衝鹽水）、滅菌之鹽 水溶液、林格氏液、或葡萄糖溶液。稀釋劑選擇性地含有 保存劑。保存劑之範例已如上所述，其中芳族醇（如苄基 醇或酚醇）爲較佳之保存劑。保存劑之用量係藉由估算不 同之保存劑濃度與抗體之相容性和保存劑效率測試來決 φ定；舉例來說，若保存劑爲芳族醇（如苄基醇），其量可爲 從約 0 · 1 - 2 · 0 %，且較佳爲從約 0 · 5 -1 · 5 %，但最佳爲約 1.0-1 .2 %。較佳者，再組成配方每管具有少於6000個〉10 μΜ顆粒。 再組成配方係以已知方法給予有需要以抗體來治療的 人類，其方法如作爲藥團進行靜脈內給藥、或在一段時間 內進行連續輸注、或藉由肌肉內、腹膜內、腦脊髓內、皮 下、關節內、關節滑液內、椎管內、口服、局部、或吸入 -58-
200539855 · 途徑來給藥。 提供一種大量製造之物品，其包含本發明之經冷凍乾 燥之配方，並提供其再組成及/或其用途之使用說明書。此 大量製造之物品或套組具有（i)裝有本發明之組成物/配方 的容器、以及（Π)以稀釋劑對經冷凍乾燥之配方進行再組成 而使再組成配方中之共軛物濃度在從 0.5 mg/mL至5 mg/mL之範圍內的使用說明書。舉例來說，合適的容器包 括瓶子、管（如雙腔室管）、針筒（如雙腔室針筒）、和測 φ 試管。容器可由各種材料（如玻璃或塑膠）形成。該容器 盛有經冷凍乾燥之配方，該容器上並黏有或倂有標籤，而 可標示再組成及/或用途之指示。舉例來說，該標籤可標示 出要對經冷凍乾燥之配方進行再組成，直到如上所述之抗 體濃度爲止。該標籤可進一步標示出該配方可用於或意圖 用於皮下給藥。盛有該配方之容器可爲多用途管，其可使 再組成配方進行重複給藥（如2 - 6次給藥）。該大量製造之 物品可進一步包含內有合適的稀釋劑（如BWFI)之第二個 #容器。在混合稀釋劑和經冷凍乾燥之配方時，再組成配方 中的最終抗體濃度一般至少是50 mg/mL。該大量製造之物 品可進一步包括其他以商業或使用者觀點來說爲理想之材 料，包括其他緩衝液、稀釋劑、過濾器、針頭、針筒、和 帶有使用說明的包裝。 一旦經過配製，便可將本發明之組成物直接給予患 者。要接受治療的患者可爲動物，然而，較佳之組成物係 適用於人類患者之給藥。 -59- 200539855 • · 本發明之組成物可藉由多種途徑來給藥，其途徑包括 但不限於：口服、靜脈內、肌肉內、動脈內、脊髓內、椎 管內、靜脈內、經皮、經皮下（見P C T公開案第W Ο 9 8 / 2 0 7 3 4 號）、皮下、腹膜內、鼻內、腸內、局部、舌下、陰道內、 或直腸途徑。亦可使用無針注射器（hypo spray )來給予本 發明之組成物。一般來說，該組成物可製備爲可注射劑， 爲液體溶液或懸浮液，亦可製備爲在注射之前可在液體賦 形劑中形成合適的溶液或懸浮液之固體。 φ 【實施方式】 實施例 《一般材料及方法》 〈癌瘤細胞〉 挑選在表面上表現出不同程度之路易斯Y抗原的人類 癌瘤細胞株。這包括了具有高度表現之路易斯Y抗原的細 胞株（L2 987肺癌瘤、N87胃癌瘤、A431LeY表皮樣癌瘤、 A GS直腸癌瘤、和LSI 7 4T直腸癌瘤）、低度表現之路易斯 φ Y抗原的細胞株（L0V0直腸癌瘤、和LNCaP前列腺癌瘤）、 以及具有極低表現或不表現之路易斯 Y抗原的細胞株 (PC 3 MM2前列腺癌瘤、和A431表皮樣癌瘤）。所用之癌 瘤細胞株的路易斯Y表現狀態係以流式細胞儀加以確認。 所用之細胞株的實例如下： DLD-1 ( CCL-221)、HCT8S11、HCT8S11/R1 和 L0V0 (CCL-2 29 )爲在細胞膜上顯示出Ley抗原的直腸癌瘤細胞 株0 -60· 200539855 · · NCI-H157 ( CRL-5802 )、NCI-H358 ( CRL-5807 )和 A 5 49 ( C CL-159 )爲肺癌瘤細胞株。在這三個細胞株中， NCI-H 3 5 8在細胞表面上顯示出可偵測程度的Ley。 胃癌瘤 N87( CRL-5822)和 AGS( CRL-1739)均表現 出 Ley。 A431 ( CRL- 1 5 5 5 )和 A4 31/Ley爲表皮樣（子宮頸） 癌瘤細胞，只有後者變異株表現出Ley。 MDA-MB43 5 ( Le”）和 M D A - Μ B - 3 6 1 ( L e y + )是作爲 φ 乳癌瘤細胞的模型。 PC3-MM2 ( Ley_ )和 LNCaP ( Ley+，CRL- 1 740 )係自 前列腺癌瘤取得。 除 HCT8S11、HCT8S11/RI、MDA-MB43 5、PC3-MM2 和 A431/Ley以外的所有細胞株均購自 American Type Culture Collection ( ATCC )。得自 ATCC 的細胞株係維持 在如ATCC目錄中特定的培養基中。HCT8S11和HCT8S11/R1 是 Dr· M. Mareel ( University Hospital，Ghent，Belgium) •的贈禮，這些細胞是在補充了 10 % v/v胎牛血清（FBS )、 1 mM丙酮酸鈉、100 g/ml鏈黴素和100 U/ml青黴素（以 下稱爲 pen/strep)的 RPMI 1640 中培養。MDA-MB435 和 PC3-MM2 係得自 Dr. I. Fidler(MD Anderson，TX)，這些 細胞是在補充了 10 % v/v FBS、2 mM麩醯胺酸、1 mM丙 酮酸鈉、0.2 mM非必須胺基酸、2 % MEM維生素溶液和 pen/strep的最小必須培養基中培養。A431/Ley是由Ludwig Institute for Cancer Research ( Melbourne, Australia )提 -61· 200539855 · 供，是在補充了 10 % FBS、2 mM鍵醯胺酸和pen/strep的 DMEM/F12中培養。 〈抗體〉
利昔妥單抗 ® ( Rituxan® ， rituximab ; IDEC
Pharmaceuticals Corporation and Genentech， San Diego and San Francisco，CA )爲一合倂了鼠類重鏈和輕鏈可變區 與人類IgGlk恆定區的嵌合抗體。該抗體能辨識B-淋巴球 標記CD20。在FACS分析中，係以人類IgG( huIgG, Zymed, I San Francisco，CA )和經 FITC 標示之山羊抗 huIgG (FITC/a-huIgG，Zymed, San Francisco，C A )分別用作對 照抗體及第二抗體。利昔妥單抗係用作陰性對照物，因爲 FACS分析顯示爲利昔妥單抗所辨識之抗原（CD20)係在 所描述之實驗中以微量存在於細胞表面上。利昔妥單抗之 卡奇黴素-共軛物能控制免疫球蛋白之載劑功能、以及卡奇 黴素之水解釋出。 吉妥單抗 ® ( Mylotarg®，gemtuzumab ozogamicin ;亦 φ稱爲CMA-676或簡稱爲CMA)爲卡奇黴素共軛物（Wyeth， Madison，NJ)。使用一批平均有35 /xg卡奇黴素之量共軛至 1 mg抗體者。CMA或CMA-676之抗體部份對CD33有特 異性，其中CD33爲藉由多形性造血幹細胞和急性骨髓性 白血球細胞來表現之白血球分化抗原。這些細胞都不會用 在任一經描述有顯著CD33量表現的實驗。確實，FACS分 析顯示：結合至這些細胞株之CMA的量與缺乏CD33表現 之對照huIgGl的量是類似的。CMA之最高結合量是以 -62- 200539855 · · P C 3 Μ Μ 2細胞（r e M C F = 2.3 )來加以測定。 因此，CMA亦能在沒有共軛物之抗原標的的情況下控 制經釋出C Μ的效率。 〈質體共振分析（BIACORE)〉 路易斯-B S Α共軛物（即Η第I型-、Η第11型-、唾液 酸基Lea-、唾液酸基Lex-、磺基Lea-、磺基Lex-、Lea-、 Leb-、Lex -和 Ley-BSA)係購自 Alberta Research Council (Edmonton, Alberta，Canada)。抗原 /BSA 負荷量係在 20 φ 至42莫耳抗原/莫耳之BSA之間。將各個抗原以4,000至 9,000 RU之密度固定在CM5生物感測晶片表面，該晶片經 偶合劑EDC/NHS[l-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基）-碳化二亞 胺-HC1]/[N-羥基琥珀醯二亞胺]於5 /iL/miii之流動速率活 化6分鐘，之後以5 /xL/m in加入在10 mM乙酸鈉緩衝液 pH 4.5中濃度爲50 /xg/mL的路易斯-BSA抗原6分鐘。磺 基-路易斯和唾液酸基-路易斯-B S A共輛物於p Η 4.0偶合’ 多餘的結合位置以5 gL/min之1Μ乙醇胺-HC1 pH 8.5阻斷 φ 6 分鐘。在 HBS-EP 緩衝液（10 mM HEPES、150 mM NaCl、 3 mM EDTA、50 ppm 聚山梨酯 20)中以 20 /xL/min 之流 動速率進行結合特異性分析。將Hu3 SI 93於6.67 nM或50 nM注射3分鐘，在以HBS-EP緩衝液清洗30秒後，測量 保持在結合狀態的抗體量。抗原表面以1 〇 mM NaOH、200 mM NaCl於20 /xL/min進行再生成1分鐘，以重建基準線。 爲了進行動力學分析，所用之抗體濃度爲1至1 6 nM， Ley-BSA之密度爲9,000。其結合與解離係在HBS-EP緩衝 -63- 200539855 · 液中於30 ML/m in在3分鐘和15分鐘期間進行測量。 〈FACS分析〉
Ley在一系列人類腫瘤細胞株上的表現係以FACS分析 加以評估。將1 〇5個細胞的分裝懸浮於補充有1 % v/v牛 血清白蛋白之100 /iL磷酸鹽緩衝鹽水（PBS/BSA)。之後 將細胞在各種濃度之第一抗體（hu3S193或 G193、 hu3S193、或CM-共軛物）中於4°C培養30分鐘。第一抗 體對細胞之結合是藉由FITC標記/a-huIgG來顯示。 . MCF (平均頻道螢光値，mean channel fluorescence) 値爲細胞族群在與第一抗體（huIgG和hu3S193 )結合再以 有螢光標示之第二抗體加以染色之後的平均螢光強度。 HuIgG爲一陰性對照物。MCF會直接與結合的第一抗體分 子數目成正比。在hix3S193與陰性對照物的MCF結合之 後，所硏究之有Ley表現的細胞株大多（1 3株中有8株） 都可看到至少10倍的MCF增加（相對性MCF，reMCF )。 可在各種組織型的腫瘤分類中發現有高度Ley表現的細胞 φ株實例。所有來自結直腸和胃的腫瘤細胞都是Ley陽性。 〈共軛至卡奇黴素之抗路易斯Y抗體的ED50〉 使用一種致命的染料（MTS )染色來測定在各種處理 的暴露之後存活細胞的數目。MTS (非放射活性細胞增生 測定法套組）係購自P r 〇 m e g a ( M a d i s ο η，WI )，並根據製造 商的說明書來使用。對各個細胞株建立一條校正曲線（兩 小時後之細胞數目對光學密度），以估算合適的初始細胞密 度，之後將細胞以每孔7 5 0至5，0 0 0個細胞之密度種在96- -64- 200539855 多孔盤中。在種入細胞之後，細胞馬上暴露在各種濃 0.01、0.05、0.1、1、10、100 和 500 ng 卡奇黴素當 的 CMA、hu3S193-AcBut-CM、或 CM 或 PBS 之下。 接受10 μί之100X藥物溶液。在測定了 96小時藥 之存活細胞數目之後，根據得自劑量-反應曲線之對 參數算出ED5G。ED5G係定義爲：暴露於藥物下96 造成細胞數目減少5 0 %的藥物莫耳濃度（CM )。應 卡奇黴素當量（c a 1. e q )是以純物質或共軛物來給 φ 濃度。依照CM結合到抗體上的量（抗體藥物負荷| 同共軛物的卡奇黴素當量意味著不同之蛋白濃度。 《實施例1》抗路易斯Y抗體的產生
產生野生型（hu3S193)和變異型（G193)抗路 抗體。鼠類3S 193mAb係藉由路易斯Y抗原陽性的 癌瘤細胞對BALB/c小鼠進行免疫作用而產生，之 3S193抗體的人類化版本（hu3S193 )。詳細的特異 說明了 hu3S193對Ley有高度特異性（不會結合到 φ型或第1型抗原），並顯示出其與Lex三糖之間僅有 交互反應性。hu3S193之變異IgGl版本（G193)與h 不同的地方在於，有兩個胺基酸取代了它的 CH2 (domain )，亦即白胺酸（2 3 4 )變爲丙胺酸，且甘胺酸 變爲丙胺酸。除了上述兩個突變之外，還有與IgGl 結構域的Gmz同種異型對應的兩個保守突變（位置 天冬胺酸變爲麩胺酸，於位置3 6 0之甲硫胺酸變 酸）。因此，該人類化變異型I g G1抗路易斯 Y 度（〇、 量 /mL ) 各孔會 物暴露 數迴歸 小時後 注意， >之CM I )，不 易斯Y 人類腺 後產生 性分析 Η第2 最小的 u3S 1 93 結構域 K 23 7 ) 之CH3 3 5 8之 爲白胺 抗體與 -65-
200539855 hu3S193 在 Fc 區有四個殘基不同：L236A、G239A、D358E、 和M3 6 0L。這個抗路易斯Y抗體的變異型IgGl形式被命 名爲 G193，其表現在中國倉鼠卵巢細胞中，並用於產生 CMD-193。第7圖提供了這兩個抗體之成熟分泌重鏈的胺 基酸序列的比較。在這個圖中，變異型殘基爲粗體並加亮 標示，而CDR爲粗體並加陰影標示。 〈細胞和培養條件〉 表現 hu3S193 抗體之融合瘤細胞係得自 Ludwig | Institute for Cancer Research。Hu3S193 爲取自小鼠單株抗 體MuS193之人類化抗Ley抗體（IgGl)，其已經過基因工 程，因此只有補體決定區是來自鼠類來源。 該細胞株爲膽固醇依存性之細胞株，且需要在Hyc lone HyQ-CCM® 1 生長培養基（Hyclone Labs，Logan，Utah )中 加入膽固醇，因爲膽固醇不是水溶性，所以要在培養基中 補充 0.2 % ExCyte VLE ( Miles Pentex, Kankake，IL)，並 將細胞維持於37°C的5 % C02中。COS-7細胞係購自ATCC • (Rockville，Maryland)，並維持在補充了 10 %胎牛血清 (FBS)和 2mM 麩醯胺酸、100 U/mL 青黴素、1〇〇 gg/ml 鏈黴素（以下稱爲 pen/strep)的 Dulbeccos Modified Eagle 培養基（DMEM)中。 PA-DUKX 153·8細胞不會生產二氫葉酸鹽還原酶 (dhfr )。這些細胞係維持在補充了 10 /xg/mL腺苷、去氧 腺苷、和胸苷（Sigma，St· Louis，MO)、10 % FBS、20 mM HEPES、0·1 %碳酸氫鈉、2 mM麩醯胺酸、和pen/strep的 -66-
Minimal Necessary Medium ( MEM-α, Gibco BRL, Grand Island，NY )中。在轉染後，細胞係在核苷酸不存在、並維 持有 1 mg/mL 之 G418( Gibco)和 250 nM 甲氨喋呤（Sigma) 200539855 作爲選擇標記的情形下生長。 〈載體〉 爲了作出野生型（hu3S193)和變異型（G193)抗路 易斯Y抗體之重鏈和輕鏈的構築基因（construct )，使用下 歹 IJ 載體：PED6_HC —IgGl、P E D 6 — H C — m I g G 1 和 pED6 —LC I kappa載體。PED6_HC_mIgGl載體包含用於變異之CH2結 構域的模板（該載體密碼丙胺酸在位置 2 3 4取代了白胺 酸，且在位置23 7取代了甘胺酸）。hu3S 193輕鏈之可變區 的DNA係連接在pED6_LC κ表現載體上BssH II和Pac I 限制酶位置之間。hu3S193重鏈之可變區的DNA則連接在 pED6_HCIgGl表現載體上B s s Η 11和S a 1 I限制酶位置之 間。載體pED6_Hc_mIgGl係用於生成G193之重鏈，此載 體與 pED6 —HC_IgGl在其結構域之序列有所不同。 φ PED6_HC_mIgGl之表現產出遊由丙胺酸取代了白胺酸 (2 3 4 )和甘胺酸（2 3 7 )之重鏈。 編有G1 93或hu3S 193之輕鏈可變區與恆定區密碼的 DNA係從pED6_LC,質體切出而連接在PMEN2載體之 PpUM和EcoR I限制酶位置之間。編有G193或hu3S193 之重鏈可變區與恆定區密碼的DNA係從pED6_HC_IgGl或 pED6 —HC — mlgGl載體切出，而嵌進pTDMEDL載體之Bgl II 和Xba I限制酶位置之間。 -67-
200539855 〈萃取和選殖〉 RNA係根據製造商的使用說明書以 RNAzoIB套組 (RNAzoIB，TEL-TEST, I n c ·，F r i e n d s w ο o d，T X )從生產 hu3S193之細胞中萃取出來。使用一套組（Stratagene, La Jolla，CA)將萃取出來的RNA轉錄成單股cDNA。將10 /xg 之總RNA與寡dT引子混合，將此反應混合物加熱至65 °C 5 分鐘，並慢慢地冷卻至22°C。第一股cDNA係於總體積爲 5 0 /xL且包含5 /xL之10倍濃縮之第一股緩衝液、5 /xL之 _ DTT、1 /xL 之 RNA 酶阻斷劑（RNaseblock)' 2 pLDNTPs (1.25 mM)和1 ML之MMLV反轉錄酶（20U//X1)的混合 物中合成。將該組份和緩地混合，並於3 71培養1小時。 此cDNA係用以放大hu3S193之VH和VK。下列引子係用 於聚合酶連鎖反應（PCR):
Hu3S193 VH UP (BssH II) GCTTGGCGCGCACTCC GAG GTC CAA CTG GTG GAG AGC GGT GGA GGT GTT (SEQ.ID. NO.l) • Hu3S193 VH DN (Sal I) GCGACGTCGACAGGACTCACC TGA GGA GAC GGT GAC CGG GGT CCC TTG GCC CCA GTA AGC AAA (SEQ.ID. NO.2)
Hu3 S 1 93 VK UP (BssH II) GCTTGGCGCGCACTCC GAC ATC CAG ATG ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG A (SEQ.ID. NO.3)
Hu3S193 VK DN (Pac I) -68-
200539855 · GCCCTTAATTAAGTTATTCTACTCACG TGT GAT TTG CAG CTT GGT CCC TTG GCC GAA CGT GAA (SEQ.ID. NO.4) PCR反應係於總體積爲 50 /xL的 5 之第一股 cDNA、100 ng 之有義（sense)和反義（antisense)弓I 子、 5 μί lOxPFU 聚合酶緩衝液、5 00 μΜ MgCl2、1.25 mM DNTPs和1 /xL PFU酶（2U/ /xL)之混合物中進行。該反應 係由3 5個變性（9 5 °C -1 m i η )和合成（7 2 °C - 4 m i η )交替 φ 循環與1個終止循環（72°C -7 min )所組成，反應產物在1 %瓊脂糖中以電泳加以分析。PCR產物經過純化，且重鏈 PCR產物以BssH II和Sal I加以消化（digest )並連接至 經 BssH II/Sal I 消化的 pED6 —HC_mIgl 或 pED6 —HC —Igl 表 現載體中，以分別作出G1 93和hu3 SI 93重鏈構築基因。同 樣地，輕鏈PCR產物係以BssH II/Pac I加以消化，並連接 至經BssH II/Pac I消化的pED6_LC kappa表現載體中，以 作出G 1 9 3輕鏈構築基因。PED載體係在暫時性轉染實驗中 •用於決定抗體之表現。 進一步言之，將包含G1 93或hu3S 193之重鏈和輕鏈 的 pED 載體次選殖（subclone)到 pTDMEDL-DHFR/VH 和 pMEN2-Neo/VK中。爲了作出這些構築基因，將 h u 3 S 1 9 3 pED6 —HC_mIgGl VH ( hu3S193 VH - CHI - mtCH2 - CH3) 和 hu3S193 pED6_HC_IGl VH ( hu3S193 VH - CHI - CH2 -CH3 )以Bgl II和Xba I加以消化，並連接至經Bgl II / Xba I 消化的 pTDMEDL 載體，以作出 G193 VH / -69- 200539855 · pTDMEDL-DHFR 或 hu3S193 VH / pTDMEDL-DHFR。同樣 地，p E D 6 _ L C kappa hu 3 S 1 9 3 V K 係以 PpUM 和 EcoR I (hu3S193 VK + CK)加以消化，並連接至經PpUM和EcoR I 消化的 pMEN2 載體中，以作出 Hu3S193 VK / pMEN2-Neo。G193 mAb 之序歹ij 爲 SEQ ID NO:13。 〈連接、轉型、和質體純化〉 將經消化之產物以T4 DNA連接酶（Gibco )於12°C進 行連接隔夜，並轉型至DH5a細胞。將單個菌落種入有50 ^ /xg/mL安比西林（ampicillin)存在的2毫升LB培養物並 於37T：生長隔夜。在小量製備之DNA ( miniprep DNA)進 行限制酶圖譜（restriction mapping )，確認嵌入物的合適 長度。在確認後，使用Qiagen套組（Qiagen，Valencia，CA)， 根據製造商的建議來作出大量製備之 DNA ( maxiprep DNA ) 〇 〈VH和VKDNA之定序〉 將大量製備之DNA送到DNA核心儀器，對hn3S193 φ之各個重鏈和輕鏈進行定序。DNA序列係以下述方法來測 定。在Qiagen 9600機器人（Qiagen)上根據以製造商所提 供之渦輪製備方法來進行小量製備。將500 此小量製備 之DNA與20 pM引子DNA在1 3 μΐ^ H20中混合，之後DNA 藉由加熱（9 8 °C，5 m i η )和冷卻（4 °C，5 m i η )來變性。 在變性之 DNA中加入 8 ML大終止染料（Big Dye Terminators，ABI，Foster City，CA)，將混合物加熱至 9 8 °C，且使之接受一系列2 5個熱循環（9 6 °C，2 0秒；5 5 °C， -70- 200539855 · 2 0 秒；6 2 °C，1 2 0 秒）和 2 0 個熱循環（9 6 °C，2 0 秒；6 Ot：， 1 2 0秒）。將該反應混合物通過B i 〇 S y s t e m s 9 6孔過濾盤 (Edge，Gaithersburg，MD)過濾，而移除過量的終止染 料。之後將DNA片段在3 7 00毛細管陣列序列儀（ABI )上 進行分析。G1 93和hu3S 193之重鏈和輕鏈的序列係顯示於 第7和8圖。 〈C Ο S - 7細胞之暫時性轉染〉 在COS-7細胞之暫時性轉染之後確認抗體表現。將一 φ 百萬個 COS-7細胞種入 6孔盤中，隔天，將 hu3S193 pED6_HC_mIgGl VH 和 hu3S193 p E D 6 _ H C _ m I g G1 VH 或 hu3S193 pED6_HC_IgGl VH 和 hu3S 1 93 pED6_HC_IgGl VH之當量莫耳濃度（各1 /xg之混合物）稀釋在2 5 0 /xL無 血清之 DMEM 中。並且，也將 6 fih 之 1 mg/mL Lipofectamine(Invitrogen)稀釋在 250 μι 無血清之 DMEM 中。將DNA和Lipofectamine混合並於室溫培養15分鐘。 將此混合物加至細胞（細胞在暴露於DNA-Lipofectamine 鲁複合物之前先以無血清之培養基清洗）中，於3 7 t培養8 小時後，將新鮮培養基加入細胞中。暴露於細胞4 8小時的 培養基以FACS和BIAc ore分析來測定抗體的存在。 〈安定細胞株〉 在確定抗體表現之後，生產出在PA-DUKX 1 53.8細胞 中表現出變異型（G193 )和野生型（hu3S193 )抗路易斯Y IgGl抗體的安定株如下。將五百萬個細胞種入直徑10 cm 的培養盤，16小時後，以1.5 mL無血清MEMw稀釋G193 -71- 200539855 · φ VH / pTDMEDL (純種株 #1 8 )和 V K / p Μ E N 2 (純種株 # 1 ) 中任一者的當量莫耳混合物（各10/xg)或hu3S193之等量 構築基因，亦以1 .5 mL無血清之MEM來稀釋60 /xL之 Lipofectamine。將 DNA 和 Lipofectamine 混合並於室溫培 養1 5分鐘，將此混合物加入細胞中，之後置於3 7 °C 8小時。 在這段時間過後，以1 5 mL新鮮生長培養基來取代該混合 物。24小時後，將細胞培養物以1: 10稀釋通入含有1 mg/mL 之G418以及逐步增加濃度之新鮮甲氨喋呤（20、40、80、 • 100、120、160、200和250nM/mL)的生長培養基（無核 苷和去氧核苷）。挑出菌落並使之擴充。得自這些純化株的 條件化培養基藉由FACS、BIAcore和ELISA加以分析。表 現出G193或hu3S193之安定細胞株之後用於抗體的大量生 產及純化。 〈G1 93之效應物（effector)功能〉 爲了測定G1 93和其共軛物CMD-193之效應物功能， 兩者都使用具有路易斯Y抗原之表現的N8 7胃癌瘤細胞、 φ和具有非常低或無路易斯Y抗原之表現的A431表皮樣癌 瘤細胞兩者來加以檢驗。野生型人類化I g G1抗路易斯Y抗 體（即hu3 S 1 93 )係用作陽性對照物。此抗體已顯示出能 夠中介ADCC和CDC活性。新鮮分離出來的人類週邊血液 單核細胞（PBMNC )係在ADCC測試法中用作效應細胞來 源，而新鮮分離出來的人類血清係在CDC測試法中用作補 體來源。 G193和CMD-193之CDC活性係將固定數目之腫瘤細 -72- 200539855 • · 胞與不同濃度之抗路易斯Y抗體在1 : 1 0 0稀釋之作爲補體 來源的新鮮人類血清存在的情況下培養 4小時來加以評 估。乳酸脫氫酶活性係經測量而作爲腫瘤細胞溶解之結果 釋出。藉由非離子性清潔劑而釋出之LDH活性係經測量而 作爲總溶解的表示。類似的評估係以表現出高含量路易斯 Υ (路易斯Υ + + +，即高路易斯Υ)的Α431細胞來進行。 G193和CMD-193之ADCC活性係以固定數目之腫瘤 細胞與不同濃度之抗路易斯Υ抗體在作爲效應細胞之週邊 φ 血液單核細胞存在或不存在的情況下培養4小時來加以測 定，其中效應細胞：標的細胞之比率爲5 0。測量所釋出之 乳酸脫氫酶活性而作爲腫瘤細胞溶解之結果。藉由非離子 性清潔劑而釋出之LDH活性係經測量而作爲總溶解的表 示。類似的評估係以路易斯Υ + + +的Ν87細胞來進行。 野生型IgGl和變異型IgGl抗路易斯Υ抗體兩者在中 介對抗具有高路易斯Y抗原表現之N87癌瘤細胞的ADCC 和CDC活性上，其能力是相等的，如第24和25圖所示。 φ且未觀察到這兩種抗體在對抗具有非常低或無路易斯Y抗 原表現之A43 1細胞上有類似的活性。相對來說，具有VH 和VK序列之抗路易斯Y抗體的IgG4版本與hu3S193和 G 1 9 3的版本相同，都不能促進AD C C和C D C活性。已知 人類IgG4異構型缺乏中介ADCC和CDC的能力，且抗路 易斯Y IgG4抗體在ADCC和CDC測試法中無活性，亦與 此槪念一致。
這些結果暗示：在G193之Fc引入L236A和G239A -73- 200539855 · 突變不會使得G1 93缺少其效應物（effect〇r )之功能， CMD-193也有G193在中介對抗具有高路易斯γ抗原表現 之N 8 7癌瘤細胞之C D C活性的效果。這些結果進一步指 稱，將G 1 9 3共轭至卡奇黴素不會改變g 1 9 3中介c D C活性 的能力。因此，G1 93和CMD-193兩者均可中介效應物之 功能活性，且CMD 1 93爲效應物功能-補體抗體共轭物。 《實施例2》抗路易斯Y抗體對卡奇黴素之共轭 一開始，將抗體共轭至卡奇黴素（CM)如下。將蛋白 φ 濃度爲大約1 〇 Hig/mL之抗體以高莫耳濃度非親核性緩衝 液（1 M HEPES)調整至pH 8-8.5。之後，將可預防蛋白 凝集之賦形劑（辛酸鈉）加入，使其最終濃度爲0.1-0.2 Μ。 最後，加入經活化之卡奇黴素衍生物之5 °/。蛋白質量，其 爲有機溶劑（乙醇或二甲基甲醯胺）中之濃縮溶液（10-20 m g / m L )。之後將此反應混合物於2 5 - 3 5 °C培養1至2小時， 反應過程以SEC-HPLC監控。在反應完成後，在製備性SEC 管柱將共軛物自經凝集之抗體和自由卡奇黴素中分離出 •來。對hu3S193-AcBut-CM和利昔妥單抗- AcBut-CM而言， 用於本實驗共軛物製備之每抗體的CM量分別爲在22和47 μ g / m g範圍之間、以及在1 7和3 0 μ g / m g範圍之間。 〈最適共軛條件〉 在典型共軛反應中，將人類化抗路易斯 Y抗體 (hu3S193)共 _尼至 N A c - γ -卡奇徽素-DMH-AcBut-OSu (卡 奇黴素衍生物），其中標的蛋白濃度爲1 0 m g / m L，且標的 卡奇黴素衍生物負荷量爲蛋白之7.0重量％。標的反應Ρ Η -74- 200539855 • · 爲8.2=t〇.2，且其他反應組份之標的濃度如下：50 mM HEPBS、1 0 mM去氧膽酸鈉、和9 % v/v 乙醇。反應係於 3 3 士 2 °C進行一小時。此典型反應在純化之前之分析結果如 下：蛋白：9.92 mg/mL;卡奇黴素負荷量：70 mcg/mg;凝 集：1.9 % ;非共軛之蛋白（LCF ) : 0.81 %。 測試各種界面活性劑添加物和其濃度對產物產率和純 度之效應，以決定其在hu3S 193之經共軛的單體生產上的 效應。結果顯示於下表2。反應係於除了添加物和其濃度 φ 以外之所有變因都保持一定的狀況下來進行。分析從這些 反應所產出之共軛物的凝集、LCF和蛋白回收率。雖然有 數種添加物會產生具有低凝集、或具有低L C F的共軛物， 但僅有去氧膽酸酯會產生具有低凝集、低LCF和高蛋白回 收率的共軛物。 表2 清潔劑 凝集 未共軛之mAb (%) 產率 (濃度） (%) (%) 乙二醇（10%) 16.7 16.3 36 Tween-80 18.5 19.5 38 褐黴酸（l〇mM) 9.9 25.2 47 褐黴酸（20mM) 13.7 10.5 49 褐黴酸（50mM) 25.6 5.2 46 辛酸酯（180 mM) 9.8 26.4 37 辛酸酯（200 mM) 24.2 10.1 38 辛酸酯（220mM) 36.8 8.4 33 -75- 200539855
癸酸酯（20mM) 24.9 64.3 23 癸酸酯（50mM) 71.9 0 9 硫酸辛酯（75 mM) 5 24 78 硫酸辛酯（100 mM) 42 6 38 硫酸辛酯（l5〇mM) 74 1 ND 硫酸癸酯（20mM) 47 6 35 硫酸癸酯（30 mM) 69 6 13 硫酸癸酯（40 mM) 68 7 7 氯化三級丁基銨（150 mM) 1 58 85 氯化三級丁基銨（250 mM ) 5 35 74 去氧皮質固酮-hemis (4mM) 1 100 99 去氧皮質固酮-hemis (10mM) 0 100 94 去氧皮質固酮I-hemis (20mM) 0 59 41 皮質酮-hemis (20 mM) 1 57 88 皮質酮-hemis (4〇mM) 1 26 85 皮質酮-hemis (80mM) 2 13 81 苯甲酸酯（100mM) 0 72 100 苯甲酸酯（200mM) 0 66 92 苯甲酸酯（400mM) 1 50 82 苯甲酸酯（1 Μ) 11 31 83 萘甲酸（40mM) 4 52 98 萘甲酸（100 mM) 5 ND 64 4-苯基丁酸（167 mM) 2 52 100 二羥基苯基乙酸（175 mM) 0 67 100 -76-
200539855 去氧膽酸酯（15 mM) 3.4(1-6.2) 2.3(0.7-3.3) 73 (63-80) 甘胺去氧膽酸 4.1 3.12 72.8 牛磺去氧膽酸 4.6 4.5 71.7 膽酸 9.8 28.4 67.9 甘胺膽酸 13.3 33.9 60.7 牛磺膽酸 15 35.1 64.3 辛酸酯爲用於CMA-676共軛反應之標準觸媒，而癸酸 酯爲用於CMC-5 44共軛反應之標準觸媒。去氧膽酸酯結果 φ 爲在括號內範圍的五反應之平均値。清潔劑之膽酸家族其 他成員經過測試也得到類似的結果。 在共軛反應終點之凝集百分比和自由蛋白百分比係使 用辛酸酯、癸酸酯、和去氧膽酸酯，以各種IgGl和IgG4 抗體來決定。所測試之I g G 1抗體爲G 1 9 3，而對照抗體爲 mAb 01 ;同時所測試之IgG4抗體爲具有IgG4恆定區 (G193-IgG4 )的 G193，、來自 CMA-676 共軛物之 mAb 6 76、來自 CMC-5 44共軛物之mAb G544，而對照抗體爲 鲁mAb 02。如下表3所示，IgGl抗體在去氧膽酸酯存在的情 況下進行共軛會導致低百分比凝集和低百分比非共軛之蛋 白（或LCF )，同時在辛酸酯或癸酸酯存在的情況下進行共 軛則會導致高百分比凝集或高百分比非共軛之蛋白。這與 IgG4抗體是一個對比，其在癸酸酯或去氧膽酸酯存在的情 況下進行共軛時，IgG4抗體會具有低百分比凝集和低百分 比非共軛之蛋白。 表3 -77- 200539855 • · 辛酸酯 癸酸酯 去氧膽酸酯 mAb 非共軛 凝集（％) 之蛋白（％) 非共軛 凝集（％) __之蛋白（％) 凝集（％) 非共軛 之蛋白（％) G193* 5.68 39.7 15.0 2.25 2.91 1.08 G193-IgG4 4.48 38.7 28.03 0.13 4.33 3 676 9.22 48.8 5.29 34.4 3.36 29.4 01 6.03 36.5 6.92 14.92 6.55 2.3 02 5.47 41.16 5.03 0.07 3.44 3.44 G544 3.75 37.55 2.34 3.29 3.57 3.34 IgGl Avg 5.86 38.1 10.96 8.59 4.73 1.69 IgG4 Avg 5.73 41.55 10.17 9.47 3.68 9.80 *三次測試的平均値 〈CMD-193之不同藥物負荷量〉 評估每抗路易斯Y抗體（G193)之卡奇黴素的不同藥 物負荷量。生成藥物負荷量爲每毫克之G193抗體蛋白有 30、60或90mg之NAc-γ卡奇黴素DMH的CMD-193製劑， 鲁並對經N87異種移植之小鼠給予IP Q4DX3每仟克爲160mg 之卡奇黴素當量的劑量。CMD-193之抗腫瘤效率不會受到 在藥物負荷量上之差異的影響。 如第23圖所示，帶有不同卡奇黴素負荷量之CMD-193 的抗腫瘤效率本質上是相同的。由於非共軛之標的抗體 G 193無法有效地中介抗腫瘤活性，CMD-193的整個抗腫瘤 效率可能是被貢獻給將卡奇黴素標的遞送至腫瘤細胞。這 些結果亦暗示：在30至90 /xg/mg之CMD-193範圍內的卡 -78-
200539855 奇黴素共軛度（負荷量）不會影響其治療效果。 〈層析純化〉 在卡奇黴素衍生物負荷量爲70 Mg/mg時，用於純化之 起始材料爲包含9 · 9 2 m g / m L蛋白之共軛反應混合物，其凝 集含量爲1 .9 % (藉由HPLC測定之面積百分比），且LCF 含量爲0.82 % (藉由HPLC測定之面積百分比）。在共軛反 應完成後，藉由加入磷酸鉀溶液來將反應混合物稀釋1〇 倍，使最終磷酸鹽濃度爲〇·6 M ( pH 8.2)。在混合之後， | 將此溶液通過0.4 5-微米之過濾器過濾。將經稀釋之溶液載 入Butyl Sepharose 4 Fast Flow管柱，載入管柱的蛋白總 量爲每ml床體積20mg。以0.6M磷酸鉀清洗過後，該管 柱以0.6 Μ至4 mM逐步梯度之pH 8.2磷酸鉀加以沖提（或 者，管柱可以20 mM Tris / 25 mM NaCl加以沖提）。將得 自該逐步梯度的分量管集合起來，且該集合包含：蛋白8.3 mg/mL、卡奇黴素 69.3 mcg/mg、凝集 0·42 %、LCF 0·31 %。 緩衝液之交換係使用具有再生性纖維素膜之超過濾/ 0透析過濾（diafiltration)來達成。該共轭物係以 pH 8.0 之20 mM Tris / 10 mM NaCl ( 10透析體積）加以透析過 濾。可使用尺寸排除層析法或超過濾/透析過濾將該集合物 送入適合該配方之緩衝液。 《實施例3》抗路易斯Y抗體卡奇黴素共軛物之特異性和 動力學 爲了確認卡奇黴素對野生型（hu3S 193 )和變異型 (G 1 9 3 )抗路易斯γ的共軛不會消除其對Ley的結合，對 •79- 200539855 · · 這些抗體及其各自的共軛物進行質粒基因組（Plasmon)共 振分析（BIAcore)及/或 FACS 分析。Hu3S193和 hu3S193-AcBut-CM僅能辨識Ley-BSA，而不會辨認出下列 寡糖抗原：Η第I型、Η第II型、唾液酸基Lea、唾液酸基 Lex、磺基-Lea、磺基 Lex、Lea、Leb 或 Le、hu3S193-AcBut-CM 之結合的動力學與hu3S193有所不同。抗體之Ka和Kd會 因爲共軛至CM而改變。 綜而言之，得自BIAcore和FACS分析的結果顯示CM φ 對hu3S193或G193之共軛不會影響其對Ley-BSA或對Ley 陽性之細胞的特異性（數據未顯示）。與hu3S 193比較之下， hu3S193-AcBut-CM改變的動力學參數不必換算成可與N87 細胞結合的共軛物或抗體的不同量。 〈BIACORE 分析〉
爲 了確定 G193、hu3S193、hu3S193-AcBut-CM 和 CMD 對Ley之特異性，藉由BIAcore 3 000之表面質粒基因組共 振分析來檢驗該抗體和其CM共軛物對各種Ley相關抗原 春之親和力。路易斯Y-BSA ( 30莫耳之路易斯Y / BSA之莫 耳數）係固定在生物感測晶片上’並暴露於各種濃度之各 種路易斯丫-反應劑（2、4、8、12和16 111^)。0193、111133193、 hu3S193-AcBut-CM 和 CMD-193 以與 hu3S193 相同的親和 力和特異性結合至Ley-BSA。藉由BIAcore所測定的動力 學參數係取決於抗體或共軛物對人工的Ley_BSA受質的結 合。 這三個抗體具有相同的動力學常數。這些評估指出： -80- 200539855 · · 非共軛之抗路易斯Y抗體、G1 93和hu3 SI 93以適度的親和 力（KD範圍1 00-3 00 nM )結合至路易斯Y-BSA。如下表4 所示，共軛至卡奇黴素會使這些抗體的路易斯Y結合強度 在此人工系統中輕微下降。C M D -1 9 3會以低親和力和高奈 莫耳濃度KD來與路易斯Υ抗原結合。 表4 抗體 KD (Μ) ΚΑ (1/Μ) KD (1/s) Ka (1/Ms) Hu3S193 1.3 χ ΙΟ-7 7.7 χ ΙΟ6 4.9 χ ΙΟ'3 3.9 χ 104 G193 1.5 χ ισ7 6.6 χ ΙΟ6 4.9 χ ΙΟ'3 3.3 χ ΙΟ4 CMD-193 3.4 χ 10-7 2.9 χ ΙΟ6 2.5 χ ΙΟ-3 7.4 χ ΙΟ4 抗體和共軛物僅能辨識Ley而無法辨識相關的寡糖。 G193、hu3S193和其卡奇黴素共軛物對與路易斯γ結構相 關之各種碳水化合物抗原的結合也使用生物感測分析來進 行硏究。各種共軛至BSA之路易斯Y相關抗原係固定在生 物感測晶片上，並暴露至抗路易斯Y抗體和其卡奇黴素共 軛物下。這些顯示於第2 0圖的結果指出，G 1 9 3和C M D - 1 9 3 鲁對路易斯Υ抗原有特異性，且不會顯示出任何結合，甚至 是對那些結構與路易斯Υ、路易斯X和Η - 2血型抗原相近 的抗原亦然。這些結果亦進一步暗示：共軛至卡奇黴素不 會改變抗路易斯Υ抗體之抗原特異性。 〈FACS分析〉 爲了釐清共軛是否會影響hu3S193對Ley +細胞之結 合’與N87細胞結合之hu3S193和hu3S193-AcBut-CM量 係藉由流式細胞儀（FA C S )測定。在N 8 7暴露在各種濃度 -81- 200539855 · 之hu3S193或hu3S193-AcBut-CM之後所得之平均頻道螢 光値（MCF)很類似。N87細胞係以各種濃度之hu3S193 和hu3S193-AcBut-CM來培養。經結合之共軛物或抗體的 量係以MCF來表示。下表5顯示了 hu3S 193對各種癌瘤細 胞株之結合（用人類IgGl作對照抗體）的流式細胞偵測。 路易斯Y表現狀態可基於抗路易斯Y抗體之MCF/對照抗 體之M C F的比率來加以指定。比率在3 - 1 0之範圍內表示 路易斯Υ表現程度爲-，在1 〇和1 〇〇之間表示其表現程度 φ 爲…，在100和300之間表示其表現程度爲…-，且>3 00表 示其表現程度爲----。基於此一初始評估，會將有路易斯γ 高表現與低表現之癌瘤細胞株用於進一步的硏究中。 表5 平均頻道螢光値 癌瘤種類 腫瘤細胞株 對照mAb 人類化IgGl 表現程度 抗路易斯YmAb 乳房 MDA-MB-361 9 298 •細 MDA-MB-435 3 3 • ΜΧ1 25 381 -- 直腸 LOVO 5 62 __ HCT8S11 4 2221 ____ HCT8S11/R1 3 1162 ___ DLD-1 3 1167 ___ LS174T 29 712 ΗΤ-29 12 271 -82-
200539855 表皮樣 A431/LeY 16 912 ___ A431 19 37 士 KB 9 106 •垂 胃 AGS 3 1063 ____ N87 4 771 編·— 肺 L2987 4 894 ___ A549 3 5 - H157 2 3 • 前列腺 LNCaP 5 50 • PC3 5 41 - PC-MM2 3 19 - G193和hu3S193共軛物在培養物中與Ley+胃癌瘤細胞 (N87 )之結合與hu3S193類似，在將N87單層細胞暴露 於各種濃度之hu3S193或G193後測定的MCF (平均頻道 螢光値）値也是相同的。是以，除了以BI Ac ore說明其對 Ley-BSA 之結合相等之外，hu3S193、G193、和 hu3S193-CM ®對自然顯示的Ley之結合也是相同的。 〈藥物動力學〉 以CMD-193進行的藥物動力學硏究包括下列者：以酶 標記免疫結合測定法（E LIS A )確認來測定C M D 1 9 3 (大 鼠）、G 1 9 3抗體（大鼠、狗）、非共軛之卡奇黴素衍生物（大 鼠、狗）、總卡奇黴素衍生物（大鼠、狗）、和出現在大鼠 血清中對CMD-193有特異性之抗體、與出現在狗血清中對 G 1 9 3有特異性之抗體的濃度；在雌性裸鼠中給予單腹膜內 -83- 200539855 # · (IP )劑量CMD-193後之G1 93抗體藥物動力學的評估； NAc γ卡奇黴素二甲基醯肼（CM)和NAc γ卡奇黴素DMH AcBut在人類肝臟微粒體和胞液中的生物體外代謝作用； 以及NAc γ卡奇黴素DMH在HL60前骨髓白血球細胞的生 物體外代謝作用。 對於在裸鼠身上進行的生物體內藥物動力學之硏究， 係將CMD-193在包含5 %蔗糖、〇.〇1 %聚山梨酯80、2.92 mg/mL(50 mM)氯化鈉、2.42 mg/mL(20 mM) Tris、和 φ 滅菌注射用水、並將ρ Η調整至8.0之賦形劑中以IP方式 給藥。在此硏究中，負荷量爲大約7 5毫克之卡奇黴素衍生 物/毫克抗體，其等同於大約6莫耳之卡奇黴素/莫耳抗體。 在雌性裸鼠中單劑IP給予劑量爲1 5 mg卡奇黴素當量 /公斤（最小有效劑量（Μ E D))之C M D 1 9 3後，G 1 9 3抗體 的藥物動力學特徵爲：適度的吸收速率、和明顯的長終止 半生期（tl/2 )。在G193抗體之濃度-對-時間曲線（AUC0-¥) 下的平均面積爲222 mg· h/mL。 φ NAc Ύ卡奇黴素DMH和NAc γ卡奇黴素DMH AcBut 的代謝命運係於人類肝臟微粒體和胞液中進行生物體外的 檢驗’而NAc-γ卡奇黴素DMH的代謝命運係於HL-60前 骨髓白血球細胞進行檢驗。已發現許多在人類肝臟微粒體 和胞 '液中培養後的代謝產物。在微粒體中的生物轉型路徑 爲羥基化和去甲基化，其中NA c - e卡奇黴素和其衍生物的 形成是胞液中的主要路徑。有數種代謝產物（包括NAc^ 卡奇黴素和其異構物）都是在與H L_60白血病細胞培養期 -84· 200539855 · 間所產出的。一般代謝產物可在肝臟和白血球細胞製備觀 察到，暗示卡奇黴素衍生物之代謝作用可不具細胞特異 性。在細胞中，NAc-€卡奇黴素和其衍生物之偵測支持下 列假設：NAc-e卡奇黴素之反應性二殘基種類可能是透過 來自細胞中與NAc-γ卡奇黴素DMH結合之二硫化物的麩胱 甘肽-依存性還原而形成。 《實施例4》抗路易斯Y抗體卡奇黴素共軛物對人類癌瘤 細胞株之生物體外生長的效率 , 共軛至 hu3S193 ( hu3S193-CM)與 G193 ( CMD-193 ) 兩者之卡奇黴素在人類癌瘤細胞株之生物體外生長的效率 係以人類癌瘤細胞株來加以評估。經評估的細胞株包括具 有高或低路易斯Y抗原表現的癌瘤、以及來自乳房、直腸、 肺、和前歹IJ腺之癌瘤。hu3S 1 93-AcBut-CM和CMD-193之 效率均與CM (自由藥物）及/或各種對照共軛物進行生物 體外之比較。 如下表6和表7所示，hu3S193和CMD-193兩者的有 @效度均較抗路易斯 Y表現癌瘤細胞之對照共軛物（如 C Μ A-6 76 )高。相對來說，hu3S 193和CMD-193的有效度 係與抗具有低或極低路易斯γ抗原表現之細胞的對照共軛 物相同或較低。 〈HU3S 1 93-CM〉
Hu3S193-AcBut-CM特別能抑制有Ley表現之癌瘤細 胞在生物體外的生長。當自由hu3S193抗體以從1χ10_4至 6.9 /ig蛋白/mL範圍之濃度來使用時，不會影響LOVO、 -85- 200539855 · · L2987、N87或AGS的生長。這個範圍的蛋白濃度係等同 於作爲共軛物來給予的抗體量。ED 5G指出在暴露至CM或 共軛物96小時後有50 %之細胞培養存活的劑量（ng/mL )。 在 Ley 陽性細胞中，hu3S193-AcBut-CM 之 ED50(reMCF>10) 也一樣低於 C Μ A 之 E D 5 〇。在 L ey陽性細胞中， hu3S193-AcBut-CM 之 E D 5 〇 ( r e M C F > 1 0 )也一樣低於 CMA 之 E D 5 〇。 可觀察到兩種共軛物之ED5〇在實驗之間的變化，然 φ 而，當在 Ley + AGS 細胞上測試共軛物之效率時， hu3S193-AcBut-CM之ED5〇範圍係同樣地低於CMA之ED50 範圍。相對來說，當兩種共軛物之效率是在 Le〃PC3MM2 細胞上測試時，這些範圍會重疊。這個結果不像是由於這 兩個細胞株的選擇所造成的。在平行實驗中，用Ley +細胞 進行 CMA和 hu3S193-AcBut-CM之 ED5〇的比較顯示 hu3S193-AcBut-CM會有平均較CMA爲低的ED5〇(倍數 C Μ A< 1 )。這項發現係獨立於細胞株的來源之外，它對卡奇 #黴素的敏感度，以及它的Ley相對量。當使用各種1^〃細 胞時，參數倍數 CMA爲 1。用於這些實驗的各種 hu3S193-AcBut-CM共軛物製備（每毫克蛋白22和47 /xg 卡奇黴素）指出，觀察結果係獨立於這項變因之外。綜而 言之，這個結果說明了標的卡奇黴素對 Ley所產生的 hu3S193-AcBut-CM之選擇性細胞毒性。 這項發現經由不同批的h u 3 S 1 9 3 - A c B u t - C Μ進行一系 列實驗而確認。用於這些實驗之共軛物製備的濃度在每毫 •86·
200539855 · 克蛋白22和47 /xgCM之間。hu3S193-AcBut-CM和吉妥單 抗（CMA)之ED 5〇値是集自九次實驗並製作成其發生頻率 的函數（見第2A和2B圖）。在Ley +細胞（AGS ’第2A圖） 上的效率係與在L e y ·細胞（P C 3 Μ Μ 2，第2 B圖）上的效率 進行比較。對1〇個細胞株的組群來說，hu3S193-AcBut-CM 之ED 5G値亦經評估而對抗CM A之ED5〇値，而用作各實驗 (倍數CMA )之內對照組。其中η爲獨立ED5q測定的數 目（見第2C圖）。除了有些ED5G實驗之間的變因以外’ hu3S193-AcBut-CM在Ley陽性細胞上同樣地保持在較CMA 更有效率的情形（倍數AcBut-CMA<l )。此結果說明了將 C Μ標的至L e y所產生之選擇性細胞毒性。 表6
癌瘤細胞株 路易斯Y表現 ed5 〇 (nM)卡奇黴素當量 倍數選擇性比率 CM Hu3S193- CM CMA-676 N87 麵— 9.0 60 148 2.5 AGS ___ 0.01 0.24 3.50 14 HCT8S11 ____ 20 16 >348 >22 HCTS11R1 ___ 21 16.5 >340 >21 LOVO ―― 1.46 21 45 2.1 LNCaP — 2.1 <0.007 2.80 >400 NCI-H358 • 2.0 60 90 1.5 PC3MM2 土 4.0 38 16 0.42 在本實驗中，人類癌瘤細胞係在非共軛之或經共軛之 -87- 200539855 · φ 卡奇黴素（C Μ A - 6 7 6或C Μ D - 1 9 3 )濃度漸增的情況下培養 9 6小時，之後使用Μ T S測定法套組列出各個培養中的多種 細胞。在上表6中，CM係指NAc -卡奇黴素DMH，CMA-676 和CMD-193兩者之濃度係以卡奇黴素當量（nM)單位來表 示，且倍數選擇性比率係表現爲C Μ A之E D 5 〇對C M D之 ED 5〇的比率。6.7 mg/mL (最高測試濃度）之非共軛抗路易 斯Y抗體對任一檢驗的腫瘤細胞株生長均不具效應。 〈CMD- 1 93〉 φ 當自由G193抗體以從5,700至6,900ng蛋白/mL之濃 度範圍來使用時，不會影響任一所硏究之細胞類型的生 長。在hu3S 1 93的例子當中，在Ley陽性細胞中，CMD之 ED 5G —致地較CM A之ED5Q爲低。用於這些實驗之共軛物 製備的辰度在每毫克蛋白56和88 /xg CM之間。在L ey陽 性細胞中，除了一些ED5Q在實驗之間的變因之外，CMD 也一致地保持在較CMA有效（倍數- AcBut-CMA<l )的情 形。這個結果說明了將CM標的至Ley所造成之選擇性細 U胞毒性。 CMD-193之選擇性最佳係藉由在CMA和CMD處理後 之A43 1和A4 3 1/Ley的衰變圖比較來加以說明（第9圖）。 在此實驗中，AG 1和 A43 1/Ley單層細胞係於在 CMD或 CMA存在的情況下培養96小時。在處理過後，殘留的細 胞數目係以致死性染料方法來測定，並以對照組之百分比 來表示。這兩型A431細胞對CM具有類似的敏感度，在對 Ley陽性細胞株（A43 1/Ley )進行處理過後，可觀察到一相 -88-
200539855 對於CMA顯著向左偏移的CMD衰變曲線，如第9B圖所 示；而在對Ley陰性細胞株（A4 3 1 )進行處理過後的情況 則否，如第9 A圖所示。 表7 癌瘤細胞株 A431/LeY 路易斯Y表現 EDso CM 0.05 ,(nM)卡夸 CMD-193 0.33 ί黴素當量 CMA-676 7.83 倍數選擇性比率 24 AGS — 0.03 0.1 0.68 6.9 N87 — 4.86 50.83 109.00 2.1 L2987 — 0.30 6.00 18.60 3.0 LS174T --- 0.28 15.33 22.66 1.5 LOVO —— 1.16 66.66 66.66 1.0 LNCaP —— 0.13 0.40 0.66 1.7 A431 土 0.05 7.9 5.72 0.7 PC3MM2 土 2.60 19.00 6.15 0.3
在這些實驗中，將人類癌瘤細胞在非共軛或經共軛之 鲁卡奇黴素（CMA-676或CMD-193 )濃度持續上升的情況下 培養9 6小時，之後將各培養物中的存活細胞以MT S測定 套組加以計數。在上表7中，CM係指NAc-卡奇黴素DMH ’ CMA-676和CMD-193兩者的濃度均以卡奇黴素當量（nM) 來表現，而倍數選擇性比率係表現爲CMA之ED5G對CMD 之ED 5()的比率。在6.7 Mg/mL (最高測試濃度）之非共扼 抗路易斯Y抗體對任一檢驗的腫瘤細胞株之生長都沒有效 果。 -89- 200539855 · 《實施例5》抗路易斯Y抗體卡奇黴素共軛物在人類癌瘤 細胞異種移植物之生物體內生長上的效率 共軛至抗路易斯Υ抗體之卡奇黴素的抗腫瘤效率係在 裸鼠中於皮下（S C )建立之人類癌瘤異種移植物來加以評 估。該經評估之異種移植物包括具有高或低路易斯Υ抗原 之表現的癌瘤、以及來自乳房、直腸、肺、和前列腺之癌 瘤。將帶有平均質量爲150至300 mg之固體腫瘤的小鼠隨 機分配到各種處理組中。 _ 〈 HU3S193-CM〉 hu3S193-AcBut-CM 之生物體內效率係在來自胃 (N87，第3圖）、前列腺（LNCaP，第4圖）和直腸（LOVO， 第5和6圖）癌瘤之皮下異種移植物上進行測試。N8 7、 LOVO和 LNCaP之皮下腫瘤係於無胸腺裸鼠（C h ar 1 e s River, Wilmington，MA)生長，分別對1.5至3個月大的 雌性小鼠注射每小鼠5x1 0ό個Ν87或107個LOVO細胞。 對3個月大的雄性裸鼠注射LNCaP細胞。爲使腫瘤生長， •必須將 N87 和 LNCaP 細胞與 MATRIGEL® ( Collaborative Biomedical Products，Bel ford，ΜΑ)在注射之前混合（1: 1， 體積/體積）。腫瘤之兩個垂直直徑一週至少以測徑器測定 一次。腫瘤體積係根據公式A11 i a & W e i s s : A2 χΒ χ0.4來計 算。 除非另有所指，將3個劑量的各共軛物和對照物在4 天的時間間隔內以腹膜內方式給藥（Q4DX3 )。在生物體 內，hu3S193-AcBut-CM在這些三個個別模型中能抑制腫瘤 -90- 200539855 · 生長。Hu3S193-AcBut-CM治癒的小鼠係得自具有高表現之 路易斯Y抗原的胃癌瘤異種移植物（N 8 7 )(第3圖）。前 列腺癌瘤異種移植物（LNCaP )在hu3S193-AcBut-CM給藥 後停止生長，且以直腸癌異種移植物（LOVO )得到腫瘤生 長之抑制作用（分別在第5和6圖）。在LOVO模型中， h u 3 S 1 9 3 - A c B u t - C Μ之效率可藉由加共軛物之量來加以改 善（第5圖）。 〈Ν 8 7胃癌瘤異種移植物〉 • 以對照共軛物（CMA、利昔妥單抗- AcBut-CM )、PBS、 hu3 S 1 93 或 hu3S193-AcBut-CM 處理帶有 100 mm3 之 N87 (Ley+、CD33·和CD20·)異種移植物的小鼠。在各組中的 小鼠接受三個劑量的i. p .。在第1、5和9天注射共軛物和 對照物。第3A圖顯示的是對照共軛物之效率，而第3B圖 說明了 hn3S 193和其卡奇黴素共軛物之效應。誤差棒（error b at* )顯示在各時間點上平均腫瘤體積之標準差。在這些經 過處理之帶有腫瘤的小鼠組別中，腫瘤尺寸之差異係經雙 籲尾學生t檢定（2-tailed Students t-test)查明，第28天之 p値顯示爲C，且η等於每組之小鼠數目。在1、2和4 /xg 卡奇黴素當量/劑/小鼠中，hu3S193-AcBut-CM會顯著地抑 制N 8 7異種移植物之腫瘤生長（第3圖）。在4、2和1 /xg 卡奇黴素當量/劑/小鼠觀察到的治癒速率分別爲100、60 和1 0 %，其意指在處理後一百天內異種移植物的尺寸會縮 小，且不會超出初始平均腫瘤體積。 〈LN CAP前列腺癌瘤異種移植物〉 -91- 200539855 · 以hu3S193-AcBut-CM、PBS或對照共軛物CMA處理 帶有LNCaP前列腺腫瘤之小鼠。在此方法中，括號中的數 目意指每劑量每小鼠之卡奇黴素量。在這些經過處理的組 別中，腫瘤尺寸之差異係經雙尾學生t檢定查明。報告第 3 〇天之P値，且η等於每組之小鼠數目。如第4圖所示， 對照共軛物會抑制腫瘤生長的程度到會低於等量或更低劑 量之hu3S193-AcBut-CM。再者，在以對照共軛物加以處理 後所觀察到的治癒率是〇%。當所給予之Hu3S 1 93的劑量和 φ 計畫（regimen)等同於給予 4 /xg卡奇黴素當量 Hu3S193-AcBut-CM之蛋白量（120 /xg)時，是沒有效果的。 先前實驗顯示：當卡奇黴素給藥之劑量等同於 hu3S193-AcBut-CM時，其不會抑制任一目前所測試之腫瘤 模型。因此在近來的硏究中，卡奇黴素之給藥可予以忽略 而作爲對照。 〈LOVO直腸癌瘤異種移植物〉 hn3S 193-Ac But-CM抑制腫瘤生長的能力也在直腸癌 φ瘤（LOVO )模型中加以測定。以對照共軛物（利昔妥單抗 -AcBut-CM，第 5A 圖）、PBS (第 5A 和 5B 圖）、hu3S193 (第5B圖）或hu3S193-AcBut-CM (第5B圖）處理帶有 1 00mm3之LOVO異種移植物的小鼠。除了以4 /xg/劑量之 Hu3S 193-Ac But-CM處理的組別外，在各組中的小鼠接受三 個劑量的i.P.。將在此方法中各個以卡奇黴素當量表示之 劑量的量加以特定。在第1、5和9天注射共軛物和對照物。 其組別設計爲·· hu3S193-AcBut-CM，在第43、47和51天 -92- 200539855 · 接受另外三個劑量的計畫。每組的小鼠數目（η )報告爲C。 第3 0天之腫瘤尺寸差異係以雙尾學生t檢定來查明其統計 上的意義。 HU3S193對LOVO-異種移植物生長的抑制程度少於在 N87-異種移植物所觀察到的程度。對照共軛物（利昔妥單 抗-AcBut-CM或CMA)則會引起可忽略的腫瘤抑制作用。 hu3S 1 93-AcBut-CM所造成的抑制作用較對照共軛物來得 持久。因此，一方面，以每小鼠4和2 /xg卡奇黴素當量之 φ 劑量（Q4DX3 )的利昔妥單抗-AcBut-CM處理後的腫瘤尺 寸與另一方面以PBS處理後之腫瘤尺寸的差異僅在16天 (ρ < 0.0 5 )爲顯著。 相對來說，以每小鼠4、2和1 /xg卡奇黴素當量之劑 量（Q4DX3)的 hu3S193-AcBut-CM處理會分別與以PBS 處理在4 3、2 2和1 6天有統計上的差異。以對照共軛物利 昔妥單抗- AcBut-CM和 CMA (第 6A圖）、或以 PBS或 hu3S193-AcBut-CM(第 6B 圖）處理帶有 100 mm3 之 LOVO 馨異種移植物的小鼠。在各組中的小鼠接受三或四劑量i. ρ.。 將在此方法中各個以卡奇黴素當量表示之劑量的量加以特 定，在第1、5和9天注射共軛物和對照物。其組別設計爲： hu3S 1 93-AcBut-CM*在第1 3天接受另一劑量。每組的小鼠 數目等於η，且ρ値係由雙尾學生t檢定加以決定。 〈H C T 8 S 1 1直腸癌瘤異種移植物〉 對帶有HCT8S11直腸癌瘤異種移植物的小鼠進行測 試，以測定hu3S193-AcBut-CM之生物體內活性。以CD20- -93- 200539855 · 標的之經卡奇黴素共軛之利昔妥單抗作爲非結合對照。共 軛物係以80或160mg/kg之IPQ4DX3來給藥。第21圖顯 示的是經卡奇黴素共軛之hu3S193可引起強烈的HCT8S11 直腸癌瘤異種移植物生長抑制作用，對小及大腫瘤都是。 路易斯Y-標的共軛物之抗腫瘤活性恆大於以C D 2 0或C D 3 3 爲標的之非特異性非結合共軛物的抗腫瘤活性。 〈CMD- 1 93〉 CMD-193之生物體內效率係於來自胃（N87)、肺 鲁 （L2987)、子宮頸/表皮樣（A431/Ley)和直腸（LS174T 和LOVO )癌瘤之皮下異種移植物來進行測試。除非另有 所指，所有的共軛物和對照物係根據Q 4 D X 3程序注射至腹 膜內。爲了監測由於免疫球蛋白之載劑功能所引起的腫瘤 標的，係以C Μ A作爲陰性對照物。基於下述硏究，劑量爲 15 mg/kg之CMD-193 (等同於在562至803 mg/m2之範圍 內的經共軛之抗體蛋白劑量）被視爲最小有效劑量 (MED )。 φ 〈 N 8 7胃癌瘤異種移植物〉 以對照共軛物（CMA)、PBS、G193-AcBut-CM、 hu3S193-AcBut-CM、G193 或 hu3S193 處理帶有 150 mm3 之N 8 7異種移植物的小鼠。在各組中的小鼠接受三個劑量 的i.P.。將在此方法中各個以卡奇黴素當量表示之劑量的 量加以特定’在第1、5和9天注射共轭物和對照物。第 1 〇 A圖顯示了對照共軛物之效率，第丨〇 b圖說明了 c M D -1 9 3 和hu3S193-AcBut-CM之效應，而第l〇C圖說明了自由抗 -94- 200539855 · 體的效率缺乏。誤差棒顯示在各時間點上平均腫瘤體積之 標準差。 CMA 對生長的抑制明顯少於當量劑量之 hu3S193-AcBut-CM或CMD。在4 /xg卡奇黴素當量/劑/小 鼠時，hu3S193-AcBut-CM 以及 G193-AcBut_CM( CMD)都 可治癒小鼠的N87異種移植物（第10圖）。尤其是在4/xg 卡奇黴素當量之hu3S193-AcBut-CM或CMD給藥後，分別 有40 %和6 0 %小鼠的腫瘤被治癒。詞語「治癒」意爲異種 φ 移植物的尺寸在處理後一百天內會減小，且不會超過初始 平均腫瘤體積。再者，hu3S193-AcBut-CM或CMD所引起 的腫瘤生長抑制作用亦等同於2 Mg卡奇黴素當量/劑/小鼠 之劑量（第 1〇圖）。早先的實驗顯示，以等同於 hu3S 1 93-AcBut-CM之劑量給予的CM不會抑制任一種近來 描述之腫瘤模型（數據未顯示）。因此CM之給藥可忽略而 作爲對照。 G193以及hu3S193不會抑制N87異種移植之生長。 φ 〈 L 2 9 8 7肺癌瘤異種移植物〉 以對照共軛物（CMA)、PBS或CMD處理帶有1〇〇 mm3 之L2 9 8 7異種移植物的小鼠。在各組中的小鼠接受三個劑 量的i .p .。將在此方法中各個以卡奇黴素當量表示之劑量 的量加以特定，將在第1、5和9天注射共軛物和對照物。 第1 1 A圖顯示了對照共軛物之效率，而第1 1 B圖說明了 CMD之效應。誤差棒顯示在各時間點上平均腫瘤體積之標 準差。將腫瘤尺寸小於各組初始腫瘤平均之小鼠數目（以 -95- 200539855 · 鲁 百分比表示）在第12圖中作成觀察期之函數。以CMA(第 12A圖）或CMD(第12B圖）處理係與以賦形劑對照組（PBS ) 處理進行比較。 第12圖顯示了 CMD在從0.375至3 /xg/劑/小鼠之劑 量範圍內會抑制L2 9 8 7生長。此抑制作用之選擇性的說明 會受到兩個因子的阻礙。首先，CMA在此腫瘤模型中發揮 了顯著的生長抑制效應（第1 2圖）；在較低的劑量時，此 抑制作用會低於CMD所引起的抑制作用。第二，對照組 φ 1 〇隻小鼠中有2隻發生腫瘤之自發性退化（第1 2圖）；雖 然在以 CMD處理之組中每組之退化腫瘤數目明顯高於以 CMA處理之組，CMD也會抑制已建立之L2 9 8 7異種移植物 的生長。 爲了進行顯示於第1 3圖的實驗，使1 〇隻小鼠接受 L298 7異種移植。這些腫瘤會生長到平均體積達到1.25 cm3 爲止，以三劑4 Mg卡奇黴素當量之CMD ( Q4DX3 )處理三 隻腫瘤體積大於0.5 cm3 (即0.66、1.97和1.11 cm3 )的小 φ鼠。這些腫瘤在第一劑後3 0天的時間當中縮小，然而，仍 有足量的病灶殘留，可使腫瘤復發。一隻帶有2.31cm3之 腫瘤的小鼠也接受了 4 Mg卡奇黴素當量之 CMD (Q4DX3 )。這個大腫瘤對治療沒有反應，且具有該腫瘤的 小鼠在第三次注射之前便因倫理問題予以犧牲。是以，三 劑4/xg卡奇黴素當量之CMD(Q4DX3)可抑制體積在0.66 和1.97cm3之間之L2 9 8 7腫瘤的腫瘤生長，但不足以達到 治癒。誤差棒顯示在各時間點上平均腫瘤體積之標準差。 -96- 200539855 # · 〈A4 3 1/Ley表皮樣癌瘤異種移植物〉 亦可評估A431/Ley表皮樣癌瘤之CMD-193生長抑制 作用。以PBS或CMD處理帶有大約300 mm3之A431/Ley 異種移植物的小鼠。在各組中的小鼠接受三個劑量的i. p.。 將在此方法中各個以卡奇黴素當量表示之劑量的量加以特 定，將在第1、5和9天注射共軛物和對照物，誤差棒顯示 在各時間點上平均腫瘤體積之標準差。結果顯示於第14 圖。亦以對照共軛物（CMA)、PBS或CMD處理帶有大約 g 100mm3之A4 3 1/Ley異種移植物之小鼠。在各組中的小鼠 接受三個劑量的i · P ·。將在此方法中各個以卡奇黴素當量 表示之劑量的量加以特定，將在第1、5和9天注射共軛物 和對照物，結果顯示於第1 5圖；第1 5 A圖顯示的是對照共 軛物之效率，而第15B圖說明CMD之效應。誤差棒顯示在 各時間點上平均腫瘤體積之標準差。 如第14和15圖所示，A431/Ley之CMD腫瘤抑制作 用的特異性說明也會因腫瘤之自發性退化和 CMA所引起 φ的生長抑制作用變得更加複雜。在以CMD或CMA之當量 劑量處理後，治癒之小鼠數目的比較（第1 6圖）指出CMD 處理的選擇性優點。 〈LSI 7 4T直腸癌瘤異種移植物〉 在C M D處理過後，L S 1 7 4 T異種移植物之生長抑制作 用不如先前腫瘤來得明顯，但仍較對照共軛物更有效率（第 17圖）。以對照共軛物（CMA)、PBS或CMD處理帶有150 mm3之LSI 7 4Τ異種移植物的小鼠，各組內的小鼠接受三個 - 97- 200539855 · · 劑量的i . P .。各個以卡奇黴素當量表示之劑量的量在說明 中予以特定。將共軛物和對照物於第1、5、9天注射’ LSI 74T 腫瘤增生得非常迅速，以致對照組中所有的小鼠都因帶有 大腫瘤（>2.5cm3)而在51天內死亡。在以4/xg卡奇黴素 當量之CMD處理（Q4DX3 )的組別中，五隻小鼠中有三隻 在44天內因帶有大腫瘤（1/3)或因腫瘤壞死（2/3)而死 亡；在其他二隻小鼠中，一隻維持在無腫瘤狀態1 2 5天， 而另一隻則已發展出小腫瘤。在以2 /xg卡奇黴素當量之 φ CMD處理（Q4DX3)或以4/xg卡奇黴素當量之CMA處理 (Q4DX3 )的組別中未觀察到治癒的情形。相對來說，以2 Mg卡奇黴素當量之CMA處理（Q4DX3 )者，在五隻小鼠 中有一隻被治癒。第1 7 A圖顯示了對照共軛物的效率，而 第17B圖說明了 CMD的效應。誤差棒表示在各時間點上平 均腫瘤體積之標準差。 〈LOVO直腸癌瘤異種移植物〉 對帶有LOVO異種移植物之小鼠進行測試，來硏究不 φ同於Q4DX3之4 /xg卡奇黴素當量/劑/小鼠的計畫的優點。 以PBS、G193或對照共軛物CMA或CMD之各種計畫處理 帶有大約1 〇 〇 m m3之L Ο V Ο異種移植物的小鼠。各個以卡 奇黴素當量表示之劑量的量在說明中予以特定。之所以選 擇LOVO-模型來做這類型實驗，是因爲在Q4DX3之4 /xg 卡奇黴素當量可以看到其邊際效率。 第1 8A圖顯示的是CMA和G193之效率缺乏情形。第 1 8B和1 8C圖分別說明了 CMD在Q4DX3和Q4DX4的效 -98- 200539855 · 應。第1 8D和1 8E圖顯示了 CMD在各個時間間隔的效率。 誤差棒表示在各時間點上平均腫瘤體積之標準差。在以 CMD治療後，LOVO異種移植物的生長抑制作用不如其與 先前腫瘤來得明顯。然而，吾人建議加入第四劑量、縮短 注射時間間隔、以及以較頻繁的次數給予較低劑量會增加 C M D的效率。 〈ΜΧ1乳癌瘤異種移植物〉 CMD-193對於已建立在路易斯Υ抗原之表現低之癌瘤 0 上的異種移植物生長的效應亦在MX 1乳癌瘤中進行檢驗。 C Μ A-6 76係用作結合對照共軛物。植入MX1乳癌瘤的裸鼠 以各種劑量之CMD-193( 40至240 mg/kg)或CMA-676C陰 性對照物）加以處理，記錄至少3 5天的腫瘤生長。如第 22圖所示，劑量低至80 mg/kg的CMD-193會對MXI異種 移植生長引起顯著的生長抑制作用。相對而言，CM A-67 6 僅在測試之最高劑量（160 mg/kg)有效果。 〈C M D - 1 9 3之最大非致死劑量〉 φ 就第1 9圖的實驗說明來說，使用了八組小鼠，每組 1 〇隻。對各組每4天給予劑量範圍從0至9.9 /xg卡奇黴素 當量（0至 3 96 /xg/kg )漸增的 CMD，總共有 3次給藥 (Q4DX3 )，且監測其存活高達105天。以賦形劑處理的對 照組在整個觀察期中有一隻致死。會導致類似致死情形的 最高劑量爲5.7 /ig卡奇黴素當量之CMD。因爲這項致死情 形的發生較對照組爲早，會受到其是否肇因於藥物相關毒 性的質疑。大於或等於2 8 4 /xg/kg之劑量會在經處理之小 -99- 200539855 · 鼠身上導致顯著較高的致死發生率，且以7 . 1、8 . 5和9.9 Mg 卡奇黴素當量處理不僅會導致確實較高致死發生率，也會 導致較賦形劑對照組爲早的致死情形。以少於或等於22 8 /xg/kg之劑量的CDM- 1 93處理的小鼠，其存活與賦形劑對 照小鼠類似。將這些數據統合後顯示，CMD之最大非致死 劑量（MND)爲5.7 /xg卡奇黴素當量（228 /ig/kg，其等同 於在8.5至12.2mg/m2之範圍內的經共軛之抗體蛋白劑量） Q4DX3。這個 MND明顯高於多數腫瘤模型的有效劑量 φ ( MED)，舉例來說，在L2987模型中，其MED爲15 /xg/kg。 CMD-193具有很強的抗腫瘤活性，其治療指數（MND/MED ) 爲19。 《實施例6》毒理學 共軛物CMD 1 93的毒性係以在小鼠和大鼠進行單劑靜 脈內（IV)毒性硏究、且以劑量範圍和重複劑量在大鼠和狗 進行四循環（一循環爲1劑量/2週）IV毒性硏究來加以評 估。毒物動力學和免疫原性（i ni m u η 〇 g e n i c i t y )評估也作 φ爲在大鼠和狗之四循環毒性硏究的一部分來進行。 CMD-193之潛在基因毒性係於細菌逆突變和小鼠小核測試 法來加以評估。 在大鼠和狗（以路易斯Υ抗原之表現而選擇）身上， CMD-193之單次或重複劑量給藥一般會產生相似的生前效 應（體重和食物消耗量降低’且血液學改變顯示骨髓和淋 巴樣器官之毒性）與標的器官毒性。整體來說’ CMD-193 在大鼠和狗身上的毒性是可以比較的。在雄性和雌性身上 -100- 200539855 · φ 也觀察到可以比較的化合物相關發現。在兩個物種身上’ 其毒性的標的器官爲骨髓、胸腺、和雄性生殖器官。肝臟 (大鼠）和消化道（GI )(狗）也是標的器官。在大鼠和狗 之多個標的器官的CMD-193相關效應觀察與在CMD 193 中由非共軛之卡奇黴素衍生物引起之非特異細胞毒性是一 致的；然而，在經C M D -1 9 3處理的狗身上的G I變化亦可 反映出G 1 9 3抗體結合至消化道上皮（如同其在組織交互反 應性硏究所觀察到的情形）、以及具細胞毒性的非共軛之卡 φ 奇黴素衍生物後續的釋出。 〈單劑IV硏究〉 在大鼠之單劑靜脈內（IV)安全藥理硏究中，1.18、 3.54、或10.69 mg蛋白/m2劑量之CMD-193不會在中樞神 經系統（CNS )或呼吸系統造成任何不良效應。在狗之單 劑心血管安全藥理硏究中，1 . 3或6.7 m g蛋白/ m2 IV劑量 之CMD 193不會在心跳速率或動脈血壓造成不良變化。在 任何於6.7 mg蛋白/m2進行檢驗的心電圖（ECG ) ( ECG 鲁不在1 .3 mg蛋白/m2下進行檢驗）中，均沒有形態學上的 異常、異常動脈或靜脈心律不整、或化合物相關之QTc延 長的證據。 當I V是以單劑量來給予，c M D - 1 9 3之最高非致死劑 量對小鼠爲15.30 mg蛋白/m2，且對大鼠爲30.09 mg蛋白 /m2 ;這些劑量是基於最大濃度76 mg/mL (卡奇黴素當量） 和最大劑量體積5 mL/kg計的最大可實行劑量。不會產生 不良效應之劑量對小鼠爲1 5·30 mg蛋白/m2，且對大鼠爲 -101-
200539855 · 15.81 mg 蛋白 /m2。 〈劑量範圍硏究〉 在CMD-193之劑量範圍硏究中，必須失去活力 (moribundity )的安樂死在狗身上是在最高單一測試劑量 爲l2mg蛋白/m2時發生，其中失去活力會引起CMD 193 相關之胃腸道變化，有輕微至中度的黏膜變性及壞死。在 任一測試劑量（高達3 0.09 mg蛋白/m2 )下，未發現大鼠 有死亡或選擇性安樂死的情形。 | 〈四循環硏究〉 在四循環毒性硏究中，所給予之C M D -1 9 3劑量對大鼠 爲0.55、1.98、或5.55 mg蛋白/m2/循環，而對狗爲〇.36、 1.2、或3.59 mg蛋白/m /循ί哀。在這些硏究中，單給之G193 抗體量對大鼠爲5.55 mg蛋白/m2/循環，而對狗爲359 mg 蛋白/m/循環。CMD-193之最大耐受劑量（Maximium Tolerance Dosage，MTD )對大鼠爲 5·55 mg 蛋白 /m2/循環， 而對狗爲3.59 mg蛋白/m 2 /循環（所給予之最高劑量）；這 •些劑量不會引起對劑量造成限制或危及生命之毒性。在大 鼠的四循環硏究中，基於在〇·5 5mg蛋白/m2/循環所觀察到 的顯微鏡發現（睪九的管狀萎縮），雄性之C M D · 1 9 3的 Ν Ο AE L ( 未觀察到不良效應之劑量 ， no-observed-advefse-effect level)還未建立。而基於在 5 .5 5mg蛋白/m2/循環於雄性和雌性兩者肝細胞細胞核/細 胞質的情形’大鼠的四循環硏究中之雌性的Ν Ο A E L爲1 . 9 8 mg蛋白/m2/循環。在狗的四循環硏究中，基於在ο.% mg -102- 200539855 · · 蛋白/m2/循環所觀察到的顯微鏡發現（睪九的管狀萎縮與 第二副睾低精子症、以及輕微的副睾變性），雄性之 CMD-193的NOAEL還未建立。而基於3.59 mg蛋白/m2/ 循環於雄性和雌性兩者消化道在顯微鏡下發現黏膜上皮變 性的情形，狗的四循環硏究中之雌性的CMD-193的NOAEL 爲1.2 mg蛋白/m2/循環。 在大鼠的四循環硏究中，5.55 mg蛋白/m2 /循環之單用 G 193抗體測試劑量不會導致任一 G1 93抗體相關毒性。在 φ 狗的四循環毒性硏究中，3.59 mg蛋白/m2/循環之單用G1 93 抗體測試劑量不會導致對劑量造成限制或危及生命的毒 性。在此項狗的硏究中，G1 93抗體相關之毒性包括輕微的 睾九管狀變性、以及輕微的胃黏膜變性。 G 1 9 3抗體、非共軛（自由）之卡奇黴素衍生物、和總 卡奇黴素衍生物（僅有大鼠）之毒物動力學的評估，以及 對大鼠血清中的CMD-193及對在狗血清中的G1 93抗體具 有特異性之抗體的測量，係作爲四循環重複-劑量IV毒性 φ硏究的一部分來進行。 〈基因毒性硏究〉 CMD-193在細菌逆突變測定法中的致變異性結果爲陰 性，但在生物體內小鼠小核測定法中的致DNA斷裂性結果 爲陽性。在此測定法中的陽性結果爲吾人所預期者，且與 卡奇黴素和其他儲二炔（enediyne)抗腫瘤抗生素所引發 之 DNA 斷裂（致 DNA 斷裂性（clastogenicity)) —•致。 〈交叉反應性硏究〉 -103-
200539855 φ 在交叉反應性硏究中，非共軛之G 1 9 3抗體僅會在大 鼠和狗的唾腺和消化道、以及狗的胰臟和肝臟（膽之上皮） 顯示出特異的染色。在其他硏究中，大多數明顯而一致的 G 1 93抗體染色會出現在大鼠、狗和人類的消化道（大腸和 胃部上皮）、泌尿膀胱（上皮）、陰道（上皮）、和腦下垂體 (腺垂體葉（adenohypophysis)之內分泌細胞）。由於 CMD-193之G1 93抗體組份會與大鼠、狗和人類身上有路 易斯Y抗原之表現之相關組織產生交叉反應，這些結果證 φ 明了大鼠和狗對於以CMD 193來進行的非臨床硏究來說是 合適的物種。 《實施例7》抗路易斯Y抗體卡奇黴素共軛物之安定配方 製備用於生物體內給藥的抗路易斯Y抗體卡奇黴素共 軛物（hu3S193-AcBut-CM和CMD-193)之安定配方。根據 下表8或表9，在20 mM TRIS(pH 8.0)和1〇〇 mM氯化 鈉中配製大約1 9 m g之C M D -1 9 3。 表8 成分 含量 CMD-193 1 mg/mL 蔗糖 5% TRIS 20 mM 氯化鈉 50 mM 氫氯酸，1Ν 將pH調整至7.5和8.0 注射用水 q.s 表9 •104- 200539855 · 活性成分 非活性成分 CMD-193 5 %蔗糖 (5 mg) 0.01 % Tween 80 滿注體積5mL 10mM氯化鈉 20 mM TRIS 將pH以HC1調整至8.0 將兩批CMD-193冷凍乾燥。配方之差異在於pH値， 其中一個緩衝値爲pH 7.5，另一個則爲pH 8.0。將與注射 φ 用水再組成之pH 8.0配方當中的四管在聚丙烯管中合倂， 測量pH値，之後將溶液分成四份，置於25 °C。使用類似 的四管配方來進行pH 7.5的硏究。將溶液合倂的時候，pH 値必須以0 · 1 N氫氯酸再調整至7.5。也用另外四管配方來 製作pH 7.0之溶液。這些溶液係用作初始分析，其他的則 放在2 5 °C的安定室內，之後在2天及7天後對這些溶液進 行分析，結果如下表 10所示（CMD-193外圍溶液（bulk solution)在 pH 7.0、7.5、和 8.0 時，於 25°C — 週之安定性）。 鲁這些溶液的觀察結果爲渾濁，而在pH 7.0和pH 7.5於25 °C 一週後之溶液的觀察結果則爲澄清沉澱。根據這些結果， 在三個例子當中能夠得出最佳安定性的溶液緩衝値爲pH 8.0，且選用TRIS作爲緩衝液。 表10 天數 pH 非共軛之卡奇黴素 (Mg/mg 蛋白） 凝集 (%) pH 7.0 7.5 8.0 7.0 7.5 8.0 7.0 7.5 8.0 -105- 200539855 · 0 7.056 7.432 8.039 0.50 0.41 0.61 3.25 3.38 3.33 2 2.09 1.83 1.69 2.47 3.06 3.25 7 6.919 7.321 7.933 6.24 5.52 4.63 1.87 2.60 3.34 在另一實施例中，使用在20 mM TRIS( pH 8.0)和100 mM氯化鈉中大約35 mg之CMD-193。由此，大量製造另 外兩個CMD-193之配方。第一配方包含5 %蔗糖，且以pH 8.0之TRIS加以緩衝。最終配方係如下表11所述。 表11 成分 含量 CMD-193 1 mg/mL 蔗糖 5% TRIS 20 mM 氯化鈉 50 mM 氫氯酸，1N 將pH調整至8.0 注射用水 q.s 爲了大量製造第二配方，將所用之CMD-193濃縮物 β (總蛋白2.2 3 m g / m L )以注射用水稀釋’使蛋白之濃度爲 1 mg/mL。之後將該溶液以少於30,000 Daltons之分子可滲 透之Centric on過濾器單位加以離心。當該溶液體積變爲一 半之後，以5 mM K2HP〇4、50 mM NaCl、10 %蔗糖溶液加 以稀釋。最終配方係如下表1 2所述。 表12
成分 含量 CMD-193 1 mg/mL -106- 200539855 蔗糖 5% K2HP〇4 (緩衝液互換） 5mM 氯化鈉 50 mM 氫氯酸，1N 將pH調整至7.5 注射用水 q.s 將於pH 7.5和pH 8.0大量製造的CMD-193管以表13 中所列出的各種溶液進行再組成（第二配方），該表顯示了 φ 與不同之溶液再組成的CMD-193目視檢查結果，且這些管 觀察到目視可見顆粒。在所有的例子當中，緩衝於pH 8.0 的溶液較那些緩衝於pH 7.5者來得澄清。界面活性劑的加 入對所有的例子都有所助益。將管中與注射用水（w fi )再 組成之沉澱加以過濾並收集’以進行顯微鏡的檢驗。 表13 pH 再組成用之溶液 觀察結果 7.5 wfi 沉澱 7.5 0.01 % Tween 80 澄清 7.5 0.1 % Tween 80 澄清 7.5 0.1 % Poloxamer 188 輕微混濁 7.5 10%聚丙二醇 沉澱 8.0 wfi 沉澱 8.0 0.01 % Tween 80 澄清 8.0 0.1 % Tween 80 澄清 8.0 0.1 % Poloxamer 188 澄清 -107-
200539855 8.0丨10%聚丙二醇 澄清 根據前文發現，爲了要確保溶解度，必須將界面活性 劑加入溶液中。挑選Tween 80 ( 〇.〇1 % )來用於將溶解度 維持在1 ni g / m L，最終配方包含5 %薦糖、〇 . 〇 1 % T w e e η 80、20 mM TRIS (pH 8.0)、和 50 mM 氯化鈉。 成分 含量 CMD-193 1 mg/mL 蔗糖 5% TRIS 20 mM 氯化鈉 50 mM 氫氯酸，1N 將pH調整至8.0 注射用水 q.s 另外使用了兩批CMD-193。第一批是以先以HIC後以 超過濾來純化，第二批則在共軛後直接通過超過濾方法來 純化。這兩個配方係如下表1 3和1 4來配製。 φ 表 14 _ 5 °C之外圍溶液（表1 5 )和2 5 °C之經冷凍乾燥之產物 (表1 6 )的安定性係表列並簡述於下。 表15 初始 2週 4週 LIMS# 200272733 200273196 200273639 Αρρ & Desc ;餅狀物 同 同 同 App & Desc ;再組成 同 同 同 蛋白含量（mg/mL) 1.05 1.06 1.06 -108- 200539855 · 總卡奇黴素（Mg/mg蛋白） 66 非共軛之卡奇黴素（總卡奇黴素之％) 1.13 2.31 2.64 凝集（％) 3.02 3.39 3.32 再組成之pH 7.83 7.79 7.71 SDS-PAGE 還原（％) 100 100 抗原結合ELISA 108 非共軛之抗體（％) 1.77 表16 初始 2週 4週 LIMS# 200273198 200274024 200274713 200273204 200274715 App & Desc ;餅狀物 同 同 同 App & Desc ;再組成 同 同 同 蛋白含量（mg/管） 0.99 0.99 0.98 總卡奇黴素（/xg/mg蛋白） 67 67 非共軛之卡奇黴素（總卡奇黴素之％) 1.11 1.59 1.56 凝集（％) 3.32 3.17 3.18 再組成之pH 7.76 7.78 7.75 水分 0.95 1.19 SDS-PAGE 還原（％) 100 抗原結合ELISA (%) 99 〈稀釋與給藥〉 注射用之CMD-193係以滅菌、白色、無保存劑、且經 冷凍乾燥之粉末在20-mL棕色玻璃管中來供應。各單管包 •109- 93 200539855 · # 裝包含5mg之CMD 193冷凍乾燥粉末。注射用之CMD-l 可以冷藏（2至8 °C /36至46 °F)並避光保護之。 該藥物產物爲光敏性，且在製備和給藥時，均可避 直接和間接的陽光與無屏蔽的螢光。所有的製備較佳係 生物安全通風櫥內完成。經冷凍乾燥之藥物可在管子未 衡至室溫的情況下進行再組成。用滅菌的針筒來對含 5 m L滅菌注射用水（u S P )之各管的內容物進行再組成 可使用溫和的轉動來輔助這個方法的進行。在再組成後 φ 給藥之前，目視檢查各藥物管有無顆粒物和變色情形。 組成溶液之終濃度爲1 mg/mL。 不建議將包含苄基醇或任一其他保存劑之滅菌注射 水（U S P )用於注射用之C MD - 1 9 3的再組成。 一旦進行再組成之後，將藥物溶液進一步稀釋至0.9 氯化鈉注射液USP，並在管之再組成後4小時內投藥。 組成之注射用之CMD-193管絕對不可冷凍。 爲了生產給藥用之最終劑量，將再組成之藥物的合 馨之量注射到足夠0.9 %氯化鈉注射液USP，以產生50mL 最終體積。混合的袋子或容器係由聚烯烴或包含聚乙烯 裡的接觸表面、以及紫外線UV光保護物所組成。 注射用之CMD-193不應以IV推劑或藥團來給藥。 病患係藉由程式輸注幫浦於恆定速率用IV輸注接 混合溶液（總劑量）1小時（土 1 5分鐘）的時間。雖然輸 容器應予避光保護，輸注管線仍無避光保護的必要。輸 管線可爲聚烯烴或以聚乙烯襯裡。管線中的過濾器不應 開 於 平 有 5 和 再 用 % 再 適 之 襯 受 注 注 與 -110- 200539855 • · CMD-193給藥一同使用。 以上所引用之所有參考文獻和專利係合倂於此處而作 爲參考文獻。本發明之多種改質和變化均包括在上述定義 之說明書中，且對熟習該項技藝者來說當至爲顯明。咸信， 這些對於共軛方法的改質和變更、由此方法所製得的共軛 物、以及包含該共軛物之組成物/配方均包括在申請專利範 圍內。 【圖式簡單說明】 I 第1圖顯示的是共軛至卡奇黴素之抗路易斯Y抗體 hu3S193 ( hu3S 1 93-AcBut-CM )之結構。 第2A和2B圖顯示的是共軛至卡奇黴素之抗路易斯Y 抗體（hu3S193-AcBut-CM)在Ley + S_細胞的效應，爲發生 頻率對ED5G ( ng/ml )之圖表；第2A圖顯示的是Ley +細胞 株AGS，第2B圖顯示的是Le y·細胞株PC3MM2，而第2C 圖顯示的是hu3S193-AcBut-CM在Ley + &_細胞的效應，爲 CMA倍數對路易斯Y在細胞（gp Ley +細胞株LOVO、N87、 鲁 HCT8/S11-R1、AGS、LNCaP、NCI-H358、和 Ley·細胞株 PC3-MM2、A431、PANC-1)表面之表現的圖表，其中η代 表獨立ED5G測定的次數。 第3圖顯示的是共軛至卡奇黴素之抗路易斯Y抗體 (hu3S193-AcBut-CM)對抗N87胃癌瘤異種移植物之生物 體內活性，爲腫瘤體積（cm3 )對腫瘤生長期（天）之圖表； 第3A圖顯示的是對照共軛物 CMA和利昔妥單抗 ®-AcBut-CM ，而第 3B 圖顯示的是 hu3S193 和 -111-
200539855 hu3 S 1 93 - AcBut-CM。 第4圖顯示的是共軛至卡奇黴素之抗路易斯Y抗體 (hu3S 1 93-AcBut-CM )對抗LNCaP前列腺癌瘤異種移植物 之生物體內活性，爲腫瘤體積（c m3 )對腫瘤生長期（天） 之圖表。 第5圖顯示的是共軛至卡奇黴素之抗路易斯Y抗體 (hu3S193-AcBut-CM)對抗LOVO直腸癌瘤異種移植物之 生物體內活性，爲腫瘤體積（cm3 )對腫瘤生長期（天）之 φ 圖表；第 5A 圖顯示的是對照共軛物利昔妥單抗 -AcBut-CM ，而第 5B 圖顯示的是 hu3S193 和 hu3S193-AcBut-CM。 第 6圖顯示的是共軛至卡奇黴素之抗路易斯 Y抗體 (hu3S193-AcBut-CM)對抗LOVO直腸癌瘤異種移植物之 生物體內活性，爲腫瘤體積（cm3 )對腫瘤生長期（天）之 圖表；第 6A圖顯示的是對照共軛物CMA和利昔妥單抗 -AcBut-CM，而第6B圖顯示的是在Q4DX3或Q4Dx4給予 • 4 pg 的 hu3S193 和 hu3S193 - AcBut - CΜ 〇 第7圖顯示的是成熟分泌之抗路易斯Y抗體hu3 SI 93 (wt )和G193 ( mt)之IgGl重鏈的胺基酸序列比較，其 中變異位置爲粗體並加亮標示，而CDR爲粗體並加陰影標 示0 第 8 圖顯示的是 hu3S193 ( Wyeth wt)和 hu3S193 (Ludwig Institute for Cancer Research，在後文中稱爲 LICR wt )之IgGl重鏈的胺基酸序列比較，其中CDRs爲 -112- 200539855 φ 粗體並加陰影標示，而同種異型性的差異爲粗體並加亮標 示0 第9圖顯示的是共軛至卡奇黴素之抗路易斯γ抗體 (CMD-193)對 Α431 (第 9Α 圖）和 A431/Ley (第 9Β 圖） 表皮樣癌瘤細胞之生物體外生長抑制作用，爲對照組 (CMA)百分比對卡奇黴素（卡奇黴素當量，；ng/ml)濃度 之圖表。 第10圖顯示的是共軛至卡奇黴素之抗路易斯Y抗體 | (hu3S193-AcBut-CM 和 CMD-193)對抗 N87 胃癌瘤異種 移植物之生物體內生長抑制作用，爲腫瘤體積（cm3 )對腫 瘤生長期（天）之圖表；第10 A圖顯示的是對照共軛物 CMA，第 10B 圖顯示的是 CMD-193 和 hu3S193-AcBut-CM， 而第10C圖顯示的是自由抗體。 第11圖顯示的是共軛至卡奇黴素之抗路易斯Y抗體 (hu3S193-AcBut-CM 和 CMD-193)對抗 L2987 肺癌瘤異 種移植物之生物體內生長抑制作用，爲腫瘤體積（cm3 )對 魯腫瘤生長期（天）之圖表；第1 1 A圖顯示的是對照共軛物 CMA，而第11B圖顯示的是CMD-193。 第12圖顯示的是共軛至卡奇黴素之抗路易斯γ抗體 (hu3S193-AcBut-CM 和 CMD-193)對抗 L2987 肺癌瘤異 種移植物之生物體內生長抑制作用，爲各組腫瘤體積少於 初始平均體積之小鼠數目（％ )對腫瘤生長期（天）之圖 表；第12A圖顯示的是對照共軛物CMA，而第12B圖顯示 的是 C M D -1 9 3。 •113- 200539855 • · 第1 3圖顯示的是共軛至卡奇黴素之抗路易斯γ (CMD-193 )對抗L2 9 8 7肺癌瘤異種移植物之生物體 長抑制作用，爲腫瘤體積（cm3 )對腫瘤生長期（天） 表。 第14圖顯示的是共軛至卡奇黴素之抗路易斯γ (CMD-193)對抗A431/Ley表皮樣癌瘤異種移植物之 體內生長抑制作用，爲腫瘤體積（cm3 )對腫瘤生長期 之圖表。
> 第15圖顯示的是共軛至卡奇黴素之抗路易斯Y (CMD-193 )對抗A43 1/Ley表皮樣癌瘤異種移植物之 體內生長抑制作用，爲腫瘤體積（cm3 )對腫瘤生長期 之圖表；第15A圖顯示對照共軛物CMA的效率，而第 圖顯示的是CMD的效率。 第16圖顯示的是共軛至卡奇黴素之抗路易斯Y (CMD-193)對抗A431/Ley表皮樣癌瘤異種移植物之 體內生長抑制作用，爲各組腫瘤體積少於初始平均體 φ小鼠數目（％ )對腫瘤生長期（天）之圖表；第1 6 A 示的是對照共軛物CMA的效率，而第16B圖顯示的是 的效率。 第17圖顯示的是共軛至卡奇黴素之抗路易斯Y (C M D -1 9 3 )對抗L S 1 7 4 T直腸癌瘤細胞異種移植物之 體內生長抑制作用，爲腫瘤體積（cm3 )對腫瘤生長期 之圖表；第17A圖顯示的是對照共軛物CMA的效率， 1 7B圖顯示的是CMD的效率。 抗體 內生 之圖 抗體 生物 (天） 抗體 生物 (天） ；1 5B 抗體 生物 積之 圖顯 CMD 抗體 生物 (天） 而第 -114- 200539855 · 第18圖顯示的是共軛至卡奇黴素之抗路易斯Y抗體 (CMD-193 和 hu3S193-AcBut-CM)對抗 LOVO 直腸癌瘤異 種移植物之生物體內生長抑制作用，爲腫瘤體積（cm3 )對 腫瘤生長期（天）之圖表；第1 8 A圖顯示的是對照共軛物 CMA和G193的效率，第18B和18C圖顯示的是CMD分別 在Z4DX3和Q4DX4的效率，而第18D和18E圖顯示的是 CMD在各個時間間隔的效率。 第1 9圖顯示的是裸鼠在注射各種劑量共軛至卡奇黴 φ 素之抗路易斯Y抗體（CMD-193)後的存活率，爲存活百 分比對觀察期（天）之圖表。 第20圖顯示的是共軛至卡奇黴素之抗路易斯Y抗體 (CMD-193 )對於路易斯Y抗原之結合特異性，爲路易斯 Y和結構相關之抗原對BI Ac ore共振單位之圖表。 第21圖顯示的是共軛至卡奇黴素之抗路易斯Y抗體 (hu3S193-AcBnt-CM)對抗HCT8S11直腸癌瘤異種移植物 之生物體內活性，爲腫瘤質量（克）對腫瘤生長期（天） 鲁之圖表；第2 1 A圖顯示的是小腫瘤，而第2 1 B圖顯示的是 大腫瘤。 第22圖顯示的是共軛至卡奇黴素之抗路易斯γ抗體 (CMD-193 )對抗MX1乳癌瘤異種移植物之生物體內活 性，爲相對腫瘤生長對腫瘤生長期（天）之圖表。 第23圖顯示的是基於共軛至卡奇黴素之抗路易斯γ 抗體（CMD-193)的不同藥物負荷量對抗N87胃癌瘤異種 移植物之生物體內活性，爲腫瘤質量（克）對腫瘤生長期 -115- 200539855 · (天）之圖表。 第24圖顯示的是抗路易斯Y抗彳 黴素共軛物（CMD-193)對抗N87胃 補體依存性之細胞毒性（CDC )的活> 比對抗體濃度（/xg/ml)之圖表。 第25圖顯示了抗路易斯Y抗體 素共軛物（CMD-193)對抗A431/Ley 物體外抗體依存性之細胞的細胞毒性 φ 25A圖顯示的是對抗路易斯Y + + + A43l 第2 5 B圖顯示的是對抗路易斯Y陰性 活性。 體（G 1 9 3 )和其卡奇 癌瘤細胞之生物體外 性，爲細胞毒性百分 (G193 )和其卡奇黴 表皮樣癌瘤細胞之生 (ADCC )的活性；第 癌瘤細胞的活性，而 之A431癌瘤細胞的
-116- 200539855
I 序列表 <110> Wyeth
Kunz, Arthur Jain, Neera Boghaert, Erwin Hamann, Philip Ruppen, Mark Damle, Nitin Rubino, Joseph T Moran, Justin K. <120> Calicheamicin conjugates <130> AM1014 62. <160> 12
<?170> Patentln 3.2 版 <210> 1 <211> 49 .
<212> PRT <2i3卜人爲合成 <22〇> <223>引子序列 <400> 1
Gly Cys Thr Thr Gly Gly Cys Gly Cys Gly Cys Ala Cys Thr Cys Cys 1 ' 5 · 10 15
Gly Ala Gly Gly Thr Cys Cys Ala Ala Cys Thr Gly Gly Thr Gly Gly 20 25 30
Ala Gly Ala Gly Cys Gly Gly Thr Gly Gly Ala Gly Gly Thr Gly Thr 35 40 45 ·
Thr <210> 2 . <211> 63
<212> PRT <213>人崑合成 <220> <223>引子序列 <400> 2
Gly Cys Gly Ala Cys Gly Thr Cys Gly Ala Cys AXa Gly C31y Ala Cys 200539855 r r 5 10 15
Thr Cys Ala Cys.Cys Thr Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Cys G^y Gly 20 25 .30
Thr Gly Ala Cys Cys Gly Gly Gly. Gly Thr Cys Cys Cys Thr TJir Gly 35 40 . 45 .
Gly Cys Cys Cys.Cys Ala Gly Thr Ala Ala Gly Cys Ala Ala ^ula 50 55 * 60 <210> 3 <211> 50 # <212> PRT <213>人爲合成
<220> <223>引子序列 <400> 3
Gly Cys Thr Thr Gly Gly Cys Gly Cys Gly Cys Ala Cys Thr Cys Cyis 1 5 10 IV
Gly Ala Cys Al,a fhr Cys Cys Ala Gly Ala Thr Gly Ala Cys’ Cys Cys 20 25 · · 30
Ala Gly Ala Gly Cys Cys Cys Ala Ala Gly Cys Ala Gly Cys Cys Thr 35 40 45
Gly Ala 50 <210> 4 <211〉 63 <212> PRT <213>人爲合成 <220> <223>引子序列 <400> 4
Gly Cys Cys Cys Thr Thr Ala Ala Thr Thr Ala Ala Gly Thl^Thr Ala 1 5 10 ； 15
200539855
Thr Thr Thr Gly Cys Ala Gly Cys Thr Thr Gly Gly Thr Cys . Cys Cys 35 40 45 .
Thr Thr Gly Gly Cys Cys Gly Ala Ala Cys Gly Thr.Gly Ala Ala 50 55 60 <210> 5 <211> 60 <212> PRT . <213>人爲合成 <220> <223>引子序列 <400> 5
Ala Ala Gly Ala Cys Ala. Ala Ala Gly Cys Cys Gly Cys Gly Gly Gly 1 · 5 10 . 15
Ala Gly Gly Ala Gly Cy3 Ala Gly Thr Ala Cys Ala Gly Cys Ala Gly , 20 25 30 |Cys Ala Cys Gly Thr· Ala Cys Cys Gly Thr Giy Thr Gly Gly . Thr Cys • 35 . 40 · . . 45-
Ala Gly Cys Gly Thr Cys Cys Thr Cys Ala Cys Cys 50 55 60 <210> 6 <211> 60 <212> PRT <213>人爲合成 <220> <223>引子序列 <400> 6
Gly Gly Thr Gly Ala Gly Gly Ala Cys Gly Cys Thr GJLy Ala Cys Cys 1 5 10 15
Ala Cys Ala Cys Gly Gly Thr Ala Cys Gly Thr Gly Cys Thr Gly Cys 20 25 30
Thr Gly Thr Ala Cys Thr Gly Cys Thr Cys Cys Thr. Cys Cys Cys Gly 35 40 45 3 200539855
Cys Gly Gly Cys Thr Thr Thr Gly Thr Cys Thr Th^ 50 、 55 60 <210> 7 <211> 60 <212> PRT ♦ <213>人爲合成 <220> <2巧> 引子序列 <400> 7
Ala Ala Gly Ala .Cys Ala Ala Ala Gly Cys Cys Gly Cys Gly Gly Gly 1 * 5 10 . 15
Ala Gly Gly Ala Gly Cys Ala Gly Thr Ala. Cys Ala Ala Ala ^la Gly 20 .25 , . 30' . ·
Cys Ala Cys Gly Thr Ala Cys Cys Gly Thr Gly Thr Gly Gly Thr Cys 35 40 45
Ala Gly Cys Gly Thr Cys Cys Thr Cys Ala Cys Cys 50 55 .60 <210> 8, <211> 60 <212> PRT <ή3>人爲合成 <220> <223>引子序列 <400> 8
Gly Gly Thr Gly Ala Gly Gly Ala Cys Gly Cys Thr Gly Ala Cys Cys 1 5 10 15
Ala Cys Ala Cys Gly Gly Thr Ala Cys Gly Thr Gly Cys Thr Thr Thr 20 25 30
Thr Gly Thr Ala Cys Thr Gly Cys Thr Cys Cys Thr Cys C^s Cys Gly 35. 40 45 !
Cys Gly Gly Cys Thr Thr Thr Gly Thr Cys Thr Thr 50 55 60
200539855 <2l〇> 9 . <211> 60 <212> PRT <213>人爲合成 <220> <2匕> 引子序列 <400> 9
Ala Ala Gly Ala Cys Ala Ala Ala Gly Cys Cys Gly Cys *Gly Gly Gly 1 5 10 15
Ala Gly Gly Ala Gly Cys Ala Gly Thr Ala Cys Gly .Ala Cys Ala Gly 20 25 30 .. *
Cys Ala Cys Gly. Thr Ala Cys Cys Gly Thr Gly Thr Gly Gly Thr Cys 35 40 45
Ala Gly Cy^ Gly Thr Cys Cys Thr Cys Ala. Cys Cys 50 55 .60 <2,10> 10 <211> 60 <2I2> PRT <213>人爲合成 <220> <223>引子序列 <400> 10
Gly Gly.Thr Giy Ala Gly Gly Ala Cys Gly Cys Thr Gly Ala Cys Cys 1 5 10 15
Ala Cys Ala Cys Gly Gly Thr Ala Cys Gly Thr Gly. Cys Thr Gly Thr 20 25. 30
Cys Gly Thr Ala Cys Thr Gly Cys Thr Cys Cys Thr Cys Cys Cys Gly 35 40 45
Cys Gly Gly Cys Thr Thr Thr Gly Thr Cys Thr Thr 50 55 60 <210> 11 <211> 60 <212> PRT <213>人爲合成 5 200,539855 <220> <223>引子序列 <400> 11
Ala Ala Gly Ala Cys Ala Ala Ala Gly Cys Cys Gly Cys Gly Gly Gly 1· 5 10 If
Ala Gly Gly Ala Gly Cys Ala Gly Thr Ala Cys Cys Ala Ala Aka Gly 20 25 30
Cys Ala Cys Gly Thr Ala Cys Cys Gly Thr Gly Thr Gly Gly ihr Cys 35 40 45 · ;
Ala Gly Cys Gly Thr Cys Cys* Thr Cys Ala Cys Cys 50 55 · 60
<210> 12 <211> 60 <212> PRT <213>人窵合成 <220> <223>引子序列 <400> 12
Gly Gly Thr Gly Ala Gly Gly Ala Cys Gly Cys Th'r'Gly Ala Cys Cys 1 ' 5 , l〇 15
Ala Cys Ala Cys Gly Gly Thr Ala Cys Gly Thr Gly Cys Thr Thr Thr 20 25 · 30
Gly Gly Thr Ala Cys Thr 'Gly Cys Thr Cys Cys Thr Cys Cys Cys,Gly 35 40 45
Cys Gly Gly Cys Thr Thr Thr Gly Thr Cys Thr Thr 50 55 60 6 .200539855
Seq. Id. No. 13:
抗路易斯 Y mAb (人類化 Hu3S193lgG1mut) pTDMLEYmutGI 5 TATGQ(?GTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACcdcATCAGGTACTGAGT 1---------+----：——+---------+—*-------+-------------- + 60 10 ATACGCCACACTTTATGGCGTGTCTACGCATTCCTCTTTTATGGfiGTAGtCCATGACTCA·
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GTAATCCCTGAAAGGTTACCCAAAACGGGTCATGTATTCCAGT1<ATCCCCACTTAGTTGT a H GLSNGFCPVHKVNR GE· S T 25 -
b IRDFPMGFAQY IR SI GVNQQ
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4〇 c KVPLEPSTLSQ*G LSIGFeP
45 240
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a QYKRSI GG ESMGFSHYWHV H
5〇 b STKGQ GVSQWVFPII GTYI
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55 AAGGTCAATAGGGG^GAGTCATTGGGTTTTTCCAGCCAATTTAATTAAAACGCCATGTAC 7 24120Q539855
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15 AAAGGGTGGTAACTGCAGTTACCCGATAACTTTGATTACGTTGCACTGGAAATTTGCCAT
a FPTIDVNGL LKLMQ RDL T V
b FPPLT SMGY N C N V T F K K Y 20
c S Η H RQWAXETNA T P L N G T CTTTCCCATAGCTGATTAATGGGAAAGTACCGT.TCTCGAGCCAATACACGTCAATGGGAA 25 361 一一細__一一—雌—+一一一-一一一一一肇一一+· 420
GAAAGGGTATCGACTAATTACCCTTTCATGGCAAGAGCTCGGTTATGTGCAGTTACCCTT a LSHS*LMGKYR SR ANT RQWE 30 -
b FPIAD *WESTVLEPIHVNG K
C F P LING. KVPFSSQY .TS MGS 35 GTGAAAGGGCAGCCAAAACGTAACACCGCCCCGGTTTTCCCCTGGAAATTCCATATTGGC 421---------+---------+----------+---------+-----；----+------------+
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300 a b
a VKG. Q PKRNT APVF PWKFHIG
b *KGSQNVTPPRFSPGNSIL A
45 c ERAAKT H R P G F P L E I P Y W H ACGCATTCTATTGGCTGATACTGAGTCATTAGGGACTTTCCAATGGGTTTTGCCCAGTAC 481---------+---------+---------+------------+---------+---+ 50 540
TGCGTAAGATAACCGACTATGACTCAGTAATCeCTGAAAGGTTACCCAAAACGGGTCATG a THSIG Y VIKDFP MG FAQ Y 8 .200539855
b RILLADTESLG .TFQWVLP S T c AFYWLILSH G L S N G F CJ； P V H 5 ataaggtcaataggggtgaatcaacaggaaagtcccatt6gagccaagtacactgagtca 600 TATTCCAGTTATCCCCACTTAGTTGTCCTTTCAGGGTAACCTCGqTTGATGTGACTCAGT 10 a IRSIGVNQQESPIGAKYTE S b G Q 6 INRKVPLEpj' STLS Q 15 c KVNRGES.TGKSHWS 'Q VH V N 20 ATAGGGACTTTCCATTGGGTTTTGCCCAGTACAAAAGGTCAATAGGGGGTGAGTCAATGG TATCCCTGAAAGGTAACCCAAAACiGGGTCATGTTTTCCAGTTAajcCCCCACTCAGTTACC a IGTFHWVL PSTKGQ GVS. QW 25 b G LSIGFCPVQKVNRG*VNG c RDFPLGF AQYKRSI .GGBS M G 30 GTTTTTCCCATTATTGGCACGTACATAAGGTCAATAGGGGTGAGTCATTGGGTTTTTCCA CAAAAAGGGTMTAACCGTGCATiSTATTCCAGTTATCCCCACTCAGTAACCCAAAAAGGT 35 a V^FPIIGTYIRSIGVSHWVF P b; FFPLLART G Q * G yi GFFQ c 40 FSHYW HVHKVN RGESLGFSS 780 45 • GCCAATTTAATTAAAACGCCATGTACTTTCCCACCATTGACGTCAATGGGCTATTGAAAC CGGTTAAATTAATTTTGCGGTACATGAAAGGGTGGTAACTGCAGTTACCCGATAACTTTG a ANLI KTPC T FPPL TSMGY W b 50 -c PI L KRHVLSHH R Q W A I E T QFN NAMYFPTIDVNGLLKL TAATGCAACGTGACCTTTAAACGGTACTTTCCCATAGCTGAT7AATGGGAAAGTACCGTT 9 .20Q539855
781 840
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AATTAATATAGTTCTCAGTAGAGAACTCAAAGAACCACCACGAGGAGCTCATTTTCTTGC 4501 -----r一一·一一+------r~+---------+-----；----+--------------+ 4560 ' TTAATTATATCAAGAGTCATCTCTTGAGTTTCTTGGTGGTGCTCCTCGAGTAAAAGAACG a N*YSSQ*RTQRTTTR .S SF SC b INIVLSRELKEPPRG A HF LA c L I F S V E N S K N Η Η E E. L .1 F L P
Aflll
20 CAAAAGTTTGGATGATGCCTTAAGACTTATTGAACAACCGGAATTGGCAAGTAAAGTAGA 4561 ---------+--------二+--------+---------+---------+一一-:------+ 4620
GTTTTCAAACCTACTACGGAATTCTGAATAACTTGTTGGCCTTAACCGTTCATTTCATCT 25 a QKFG CLKTY TTGIGK SR
b KSLDDALRLIEQPEL A SK V D
c KVWM MP*DLLNNRNWQVK T 30 CATGGTTTGGATAGTCGGAGGCAGTTCTGTTTACCAGGAAGCCATGAATCAACCAGGCCA 4 621 ---------+---------+~-------+--4-------+------—+---------+ 4680
35 GTACCAAACCTATCAGCCTCCGTCAAGACAAATGGTCCTTCGGTACTTAGTTGGTCGGGT
a HGLDSRRQFCLPGSH E5 TRP
b MVWIVGGSSVYQEAMNQPGH 40 -
C W F G SEAVLFTRKP*INQ.AT
CCTCAGACTCTTTGTGACAAGGATCATGCAGGAATTTGAAAGTGACACGTTTTTCCCAGA 45 4681 ---------十---------+一麵了------+ ：------+-----------+ -------+ 4740
GGAGTCTGAGAAACACTGTTCCTAGTACGTCCTTAAACTTTCACTGTGCAAAAAGGGTCT a PQTLCDKDHAGI K * Η V F P R 50 -
b LR .LFVT RIM QEFESDTFFPE
c SD SL QG SCRNLKyTRFSQK 24 55 200539855 f 5
AATTGATTTGGGGAAATATAAACTTCTCCCAGAATACCCAGGCGTCCTC.TCTGAGGTCCA 4741 ---------+---------+----:：—+------+--------------+ 4800 .TTAACTAT^ACCCCTTTATWTTGAAGAGGGTCTTATGGGTCGGCAGGAGAGACTCCAGGiT a N FGEI T S P R I P R R P L * G P b I DLG KYKLLPEYPG VL S E V Q
10 t LIW GNI NFSQNTQ' ASS LRS R GGAGGAAAAAGGCATCAAGTATAAGTTTGAAGTCTACGAGAAGAAAGACTAACAGGAAGA --------T+---------+-·--------+ —r---+---— ------：+
4801 15 4860 CCTCCTTTTTCCGTAGTTCAfATTCAAACTTCAGATGCTGTTCTTTCTGATTGTCCTTCT a G G K R H Q V V S L R E E R L T G R 20 b E EKGIK YK FEVYEKK D Q E. D c RKK ASSISLKSTRRKTNK KM 25 , 4920 30 a 4861
TGCTTTCAAGTTCTCTGCTCCCCTCCTAAAGCTATGCATTTTTATAAGACCATGGATCCA ---------+------>---+---------+----------+---~------- ACGAAAGTTCAAGAGACGAGGGGAGGATTTCGATACGTAAAAATATTCTGGTACCTAGGT* CFQVLCSPPKAMHF.YK T MPP
b A F K F S A P L L K L C I F I R P W I Q c L S S S L L P S S Y A F .L D H G S R
.GACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAJUVAAA 4921 ---------+------—+---------十----------+-----------+ 4980 4〇 CTGTACTATTCTATGTAACTACTCAAACCTGTTTGGTGTTGATCTTAGGTCACTTTT.TTT
DM IRYIDEFGQTTTRMQ K .K b 45 - c
T DT LMSLD KPQL ECSEKN H D K I Η V W T N Η. N N A V K K M
TGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAAT 50 4981 ---------十-------τ^+---------+---------+--------.一+_------~+ 5040 ACG7VAATAAACACTTTAAACACTACGATAACGAAATAAACATTGGTAATATTCGACGTTA
CF ICEICDAIALFV TIISCN 25 55 200539855 r b
ALFVKFVMLL LYL PL* AAI LY L N L CYCFICNHY ^LQ
Mfel AAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGG 5041 ------·---十：-----------·-----+--'-------+----4-----+---·------+ 10 5100
TTTGTTCAATTGTTGTTGTTAACGTAAGTAAAATACAAAGTCCA^GTCGCCCTCCACACC a K QV N N N N C I H f'm FQ V Q G EV W
15 b NKLTTTI AFILCFR^RGKC G
c T S QQQLHS FYVSGS GG GVG
20
BsaBI gaggttttttaaagcaagtaaaacctctacaaatgtggtatg<bctgattatgatctaaag ---------+------—+---------+—:------+----------+---------+ 5160 25 a
CTCCAAAAAATTTCGTTCATTTTGGAGATGTTTACACCATACCGACTAATACTAGATTTC E VF SK N L Y K C G M' A D Y D L K
b ^FFKASKTSTNVVWLIMI S
c GFLKQVKPL Q MWYG L * S K A
CCAGCAAAAGTCCCATGGATCCGGCCGTCCGCCGTGATCCATGCGGTTACCGCCCGCGTG 35 5161 ----T----+---------+----------+—-------+---------+---------+ 5220
GGTCGTTTTCAGGGTACCTAGGCCGGCAGGCGGCACTAGGT^CGCCAATGGCGGGCGCAC 40
45 b c 5280 a b
PAK-VP WIR PSAVIHAVTARV QQKS H GSGRPP SMRLPPAC SKSPMDPAVRRDPCGY RPRV TCGAACCCAGGTGTGCGACGTCAGACAACGGGGGAGCGCTC|：TTT.TGGCTTCCTTCCAGG 5221 --------_+---------+---------+--------------------r+ AGCTTGGGTCCACACGCTGCAGTCTGTTGCCCCCTCGCGAGbAAAACCGAAGGAAGGTCC SNPGVRR QTTGERSFWLPSR R^TQVCDVR QRGSAPFGFLP G 26 50 200539855 Γ c e prcatsdngga lll a s fqa
Nhel 5
CGCGGCGGCTGCTGCiSCTAGCTTTTTTGGCGAGCTCGAATTAATTCTGCATTAATGAATC 5281 一一-：-7----+------,一一賺+·一一—---------+~----- 二十·-----------+ 5340 ·
GCGCCGCCGACGACGCGATGGAAAAAACCGCTCGAGCTTAATTAAGACGTAATTACTTAG 10
a R G G _C C A S F F G E L E L I L Η I
b AAAAALAFLASSN F C I N E S
15 c RRLLR LFWRARIN SALMN R .GGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACT 534.1 一一齡麵_+一一 十 r--二 —+-r.一一一一一 20 5400
CCGGTTGCGCGCCCCTCTCCGCCAAACGCATAACCCGCGAGAAGGCG^GGAGCGAGTGA a GQR AGRGGL RI6RSSAS S .LT
25 b ANARGEAVCVLGAL PLP RS L
C PTRGERRFAYWALF R .FLA H 30 GACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGGGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTA 54.01---------十---------+---------+----:-----+------------一---+ 5460
CTGAGCGACGCGAGCCAGCAAGCCGACGCCGCTCGCCATAGTCGAGTGAGTTTCCGCCAT
35 a DSLRSVVRLRRAVSAHSK'AV b TRCARSFGCGER YQL .TQRR*
c L AALGRSAAASGI S.SLK GGN 40
45 ATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAG 5461 ------:---+-------+------™+---------------^一-------+ 5520
TATGCCAATAGGTGTCTTAGTCC.CCTATTGCGTCCTTTCTTGTACACTCGTTTTCCGGTC
IRL STESGDNA .GKNM*AKG Q b 50 -
YGYPQNQGITQERTCE QKAS TVIHRIRG RRKEHVSKR P A
CAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCC 27 200539855 r r 5521 5580
GTTTTCCGGTCCTTGGCATTTTTCCGGCGCAACGACCGCAAAAAGGTATC€GAGGCGGGG q'karnrkkaallaff^rlrp
b KRP, GTVKRPR .CWRFS IGSAP
c K G Q E P KG RVAGVF^ A P P P 10 CCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAQTCAGAGGTGGCGkAACCCGACAGGACTA. 5581 ---------+---------+-----------+---------+----f-----+---------+ 5640 15 GGACTGCTCGTAGTGTTTTTAGC^TGCGAGTTCAGTCTCCACCGOTTTGGGCTGTCCTGAT.
a PDEHHKNRR SSQRWRNPTGL
b LTSITKI DAQVRGGEiTRQDY 20 -
c E. ASQKSTLKSEV AKPDKT I
TAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTG 25 5641 ---------+---------+-----------+-----；----+-------<---+---------+ 5700 *
AiTTCTATGGTCCGCAAAGGGGGACCTTCGAGGGAGCACGCGAGAGGACAAGGCTGGGAC
a RYQAFPP GSS LVRSP VPTL 30 -
b KDTRRFPLEAPSCAL. L. FRPC
KIPGVSPWKLP RALSCSDPA 35 40 CCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGC 5701 ---------+—----------+---------+---------+---—-----+---------+ 5760
GGCGAATGGCCTATGGACAGGCGGAAAGAGGGAAGCCCTTCGCACCGCGAAAGAGTTACG a PL TGYL SAFLP SGSVALSQC
RLPDTCPPF .S LREAWRFLNA
45 c AYRIPVRLSPFGKRGAFSM TCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTC<tAAGCTGGGCTGTGTGCAC 5761 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 50 5820
AGTGCGACATCCATAGAGTCAAGCCACATCCAGCAAGCGAG(^TTCGACCCGACACACGTG a SR CRY LSSV VVRSKL GC VH 28 200539855 r e
b HAVGISVRCRSFAPSWA VC T
c TL VSQFGVGRSLQAGL CA R 5 GAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAAC 5821 -------------------------+------------+------------+ 5880
CTTGGGGGGCAAGTCGGGCTGGCGACGCGGAATAGGCCATTGATAGCAGAACTCAGGTTG 10
a EPPVQPDRCALSGN YR L E S N
b N. PPFSPTAAPYPVTI 'VLSP T
15 c TPRSAR PLRLIR _LSS VQP CCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCG 5881 ---------+ ，-----+---------+-------··-一+---··------·+------ 20 5940
GGCCATTCTGTGCTGAATAGCGGTGACCGTCGTCGGTGACCATTGTCCTAATCGTCTCGC
^ PVRHDLSPLAAATGNRI S .RA 一·
25 b R DTTYRHWQ QPLVTGLAE K
c GKTRLI AT GSSHW Q D * Q S E
30 AGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGA 5941 ---------+---------+---------+---------+-r--------+------:---+ 6000
TCCATACATCCGCCACGATGTCTCAAGAACTTCACCACCGGATTGATGCCGATGT.GATCT 35 a ryvggateflkwwpnygy.tr
b G Μ Ά V L Q S S S G G L T T A T L E
c V CRRCYR VLEVV A L R L Η K 40 一 AGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGT 6001 ---------+--------+---------------+-一一:-----+-------.--=+ 6060
45 TCCTGTCATAAA.CCATAGACGCGAGACGACTTCGGTCAATGGAAGCCTTTTTCTCAACCA
a RTV FGICALLK PVT FGKRVG
b GQYLVSALC SQLP SEK ELV 50 -
c DSIWYL RSAEASY LRKKSW
AGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAG 29 200539855 r 6061 ---------+---------+ ------+- .__： +---------+一- -----+
TCGAGAACTAGGCCGTTTGTTTGGTGGCGACCATCGCCACGAAAAAAACAj^CGTTCGTC s S SGKQTTAGSG 'GFIFVCKQ
b ALDPANKPPLVAVV FLFAS S
C LL. IR ：QTNHRWwRWF ff CLQAA 10績 CAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAG^AGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCT 6121 —------+---------+-------—+——·------+----「·———：-------+ 6180 15 GTCTAATGCGCGTCTTTTTTTCCTAGAGTTCTTCTAGGAAACTApAAAAGATGCCCCAGA-
a QI TRRKKGSQEDP LI FST GS b RLRAEKK DL1 KK IL* S' FLRGli
20辞
c DYAQKK RlSRRSF DlLFY GV
• GACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGG 25 6181 ---------+---------+-----------+---------+---------+----------+ 6240
CTGCGAGTCACCTTGCTTTTGAGTGCAATTCCCTAAAACCAGTACTCTAATAGTTTTTCC a DAQW NENSR GI LVMRLSK H 30 ·
b TLSGTKTHVKG FWS DYQKG
c RSV ERKLTLRD .FGHEI I KKD 35 ATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAkGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATAT 6241---------+--：-------+---------------+---------+-7-T-----+---------+
TAGAAGTGGATCTAGGAAAATTTAATTTTTACTTCAAAATTTAGTTAGATTTCATATATA 40
a I F T I L L N K SFKSI*SIY
b 3 SPRSF IKNEVL NQSKVY M
45 c LHL DPFKLKMKF*!： NLK YI GAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGA(jGCACCTATCTCAGCGATC 6301 ---------+---------+-----：----+---------+--1-------+------- 50 6360
CTCATTTGAACCAGACTGTCAATGGTTACGAATTAGTCACTdlCGTGGATAGAGTCGCTAG a E TWSDSYQ CLISEAP ISAI 30
200539855 f b c
SKLGLTVTNA SVRHLSQRS VNL V Q L P M L N Q G T Y L S D L
Ahdl
TGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAfeATAACTACGATACGG 6361 ~~一1一 酿麵十------~r+---------+--1-------+-----·----+ 10 6420
ACAG^TAAAGCAAGTAGGTATCAACGGACTGAGGGGCAGCACATfcTATTGATGCTATGCG a CLFRSSI .VA L* P V V ϊ T T I R
15 b V Y F V Η P LPDSPSC 糸 LRYG
c SISFIHSCL TP KRV .DNYDTG
. , · · · .: . · · 20 GAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCG5CT
6421 __一一一 ^---r·———一—一+—_—一~一——+
CTCCCGAATGGTAGACCGGGGTCACGACGTTACTATGGCGCTfcTGGGTGCGAGTGGCCGA
25 a E G L P S G P St A A Μ I P R D P R S PA
b RAYHLAPVL Q* YR ETHAH RL
c GLTIWPQCCNDTA RPTL TG S 30 ccagatttatcagcaataaaccagccaggcggaagggccgagcgcagaagtggtcctgca 6481 ---------+Γ--------十一--------+---------.+---·----r-----+ 6540
35 GGTCTAAATAGTCGTTATTTCGTCGGTCGGCCTTCCCGGCTCGCGTCTTCACCAGGACGT
a PDLSA JNQPAG. RAERRSGPA
b Q I Y Q Q TSQPEGP SAEVVLQ 40 -
c R FI^NKPASRK GRAQK WSC N ACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTA71GTAGTTCX3 45 6541 ---------+----------r-+---------+---------+---------+------- ~+ 6600
TGAAATAGGCGGAGGTAGGTCAGATAATTAACAACGGCCCTjrCGATCTCATTCATCAAGC a TLS .AS IQSINCCREARVS S S 50 -
b LYPPPS SLLIVAGKlLE V V R
c FIRLH PVY X L P G S S K FA 31 55 200539855 pi CCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCG 6601 ---------+：---------+---------+--------+------------+---------+. 5 6660
GGTCAATTATCAAACGCGTTGCAACAACGGTAACGATGTCCGTAGCACCACAGTGCGAGC a PVNSLRNVVAIAT GIVVS RS
10 t) QLIVCATLLPLLQ'ASWCHAR
•c S ^ FAQRCCHCYRHRGV TLV 15 , TCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCC 666i----—‘一+----------------+---------+---------+----------+ 6720
AGCAAACCATACCGAAGTAAGTCGAGGCCAAGGGTTGCTAGTTCCGCT.CAATGTACTAGG
20 a b
SFGMAS.FSSGSQ RSKRVT^ S RLVW. LHSAPVPNDQGEL HDP
c VWYG .FIQLRFPTIKA SYM I P 25 一
Pvul
CCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAG 30 6721 ------*一—+---------+~----:―一------+---------+------—+ 6780 "
GGGTACAACACGTTTTTTCGCCAATCGAGGAAGCCAGGAGGCTAGCAACAGTCTTCATTC 35 a b
P MLCKKAVSSFGPPI VVRSK P CCAKKRLAPSVLRSLSEVS
c Η V V Q K S G LLRSSDRCQK*V 40
TTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATG 6781 --------------+-------:~+---------+---------+---------+---------+ 6840
AACCGGCGTCACAATAGTGAGTACCAATACCGTCGTGACGTATTAAGAGAATGACAGTAC 45
a LAAVLSLMVMAAL HNSLTVM
b WPQCYHSW LWQHCIILLLS. C
5〇 c GRSVITHGYGSTA*FSY CHA
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55 CCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTX^ACCAAGTCATTCTGAGAATAG 32 200539855 ( 6841 ---------+---------+-----------+---------+.--------—+ 6900 ggtaggcattctacgaaaagacactgaccactca!tgagttggttcagtaa〇actcttatc ft 5 a PSVRCF SVTGEYSXKfe F E *
b HP DAFL LVSTQPSH SEN S
c IRKML FCDW V L N Q Vl I L R I V 10 - 6901. 15 6960
TGTATGCGGCGACCGAGTTGqTCTTGCCCGGGGTCAATACGGGAtAATACCGCGCCACAT ---- -----r_+；---------+--------·—I----------4*---------+----------+ ACATACGCCGCTGGCTCAACGAGAACGGGCCGCAGTTATGCCCTkTTATGGCGCGGTGTA
a CMRRPSCSCPASIRD NTAPH
b vcg drvalarrqygi!i pr h 20 -
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AGCAGAACTTTAAT^AGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGG 25 6961 ---------+—-------+---------1---------+-:---··—+---------十 7020
TCGTCTTGAAATTTTCACGAGTAGTAACCTTTTGCAAGAAGCCCCGCTTTT'GAGAGTTCC a SRTLKVLIIGK RS SGRKLS R 30 -
b AEl KCS SLENVLRGE.NSQG
c QNFKSAHHWKTFT. GAKTLKD 35 ATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCA 7021 ---------+-T---------+---------+麵二了------+-τ-------+---------+ 7080
TAGAATGGCGACAACTCTAGGTCAAGCTACATTGGGTGAGCACGTGGGTTGACtAGAAGT 40
a ILPLL R SSSM P T B： A P N S S
b SYR C D PVR .C N P LV H P T D L Q
45 c LTAVEI QFDVTHS CTQLI FS GCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCA 7081 ---------r+----二----+-----·----+---------+·中-------+-------+ 7140
CGTAGAAAATGAAAGTGGTCGCAAAGACCCACTCGTTTTtG^CCTTCCGTtTTACGGCGT a ASFTFTSVSG AKT GRQNA A 33 50 200539855 C ^
b HLLLSPAFLGEQKQEG KMPQ c 工 fyfhqrfwvsknrka?c cr k 5 gspl AAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCrTCCTTTTTCAATAT 7141---------+---------+---------+---------+---------+r---+ 10 7200
TTTTTCCCTTATTCCCGCTGTGCCTTTACAACTTATGAGTATGAGAAGGAAAAAGTTATA a KKGIRATRKC ILIL?LF. QY
15 b KRE GRHGNVEJYSYS .S FFN I
c K G N K G. D T E M L N T Η T L P F S I L
20 TATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAG 7201 —:-------+---------+--------+---------+---------+-~--------+ 7260
ATAACTTCGTAAATAGTCCCAATAACAGAGTACTCGCCTATGTATAAACTTACATAAATC 25 a Y *SIYQGYCLM SGYIF ECI
b IEAFIRVIVS ^AD TYL NV F R
c LKH LSGLLS HERIHI MYLE •30 AAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAA 7261 ---------+-------:一鑛+----!-----+---------+ ---------+---------+ 7320
35 TTTTTATTTGTTTATGCCCAAGGCGCGTGTAAAGGGGCTTTTCACGGTGGACTGCAGATT
a KNKQIGVPRTFPRKVPPDV
b KINK G FRAHFPEKCHLTS K 40 -
c K TNHGSAHISPKSAT*RLR GAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGT. 45 7321 -----™+---------十纖 ------+---------:+---------十·，----—+ 7380
CTTTGGTAATAATAGTACTGTAATTGGATATTT.TTATCCGCATAGTGCTCCGGGAAAGCA
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b KPLLS*H*PIKIGVSRGPF
c NH YYHDINL K AYHEALSS 34 55 ,200539855 r ^ 5
CTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTC 7381 ~~———————·1------— 7440 ^ GAGCQCGCAAAGCCACTACTGCCACTTTTGGAGACTGTGTACGTCGAGGGCCTCTGCCAG « *· I · . a LARFG D'DGENL Η M Q L P E T V 10
b SR. V SVMTVKTSDTC S S RR R S c R X F R R KPLT HA/^PGD G H 15
ACAGCTTGTCTGTAAGCGGA+GCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCjiGGGCGCGTCAGCGGGT 7441 --------+---------+---------+---------十----i r~+一二•一·-----+ 7500 · · TGTCGAACAGACATTCGCCTACGGCCCTCGTCTGTTCGGGCAGTCCCGCGCAiSTCGCCCA a T A C ' L ADAGSRQAR Q GAS A G
20
b QLVCKRMPGADKPV^ARQRV c S L' SVSGCREQTSP S；GRV SG C
25 GTT.GGCGGGTGiCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAiSATTGTACTGAGAGTG 7501 ---------+------一·+---------+------•十一---•一•細一 ---------+
CAACCGCCCACAGCCCCGACCGAATTGATACGCCGTAGTCTCGTCTAACATGACTCTCAC
3〇 a VGG CRGWLNYAASEQIV LRV
b LAGVGAG LTM’RHQSRfi Y E C
c WRVSGLA*LCG IRADCTB SA 35
• CACCA 7561 ----- 7565
GTGGT 40 a b c
H
T
P 35 45

Claims (1)

  1. 200539855 • · 十、申請專利範圍·· 1· 一種用於製備卡奇黴素（calicheamicin)共軛物之製 法，其包含於p Η値爲約7至約9時將（i)經活化之卡 可黴素-可水解之鍵結劑衍生物和（i i ) I g G 1抗體在去氧 膽酸酯家族之成員或其鹽存在的情況下進行反應。 2 · 如申請專利範圍第1項之製法，其中該去氧膽酸酯家 族成員具有下列結構之一： (A)
    其中 Χι至X5中之二爲Η或OH，而其他三個係獨立爲〇或 Η ； 其中η爲0-4;且 r2 爲 0H、NH(CH2)mCOOH、NH(CH2)mS03H、或 NH(CH2)mP03H2，其中 m 爲 1-4 ; 或者 -117-
    200539855 (B)
    其中
    乂1至X4中之一爲H或OH，而其他三個係獨立爲O或 Η ; R!爲（CH2)n，其中η爲0-2 ;且 R2 爲 OH、NH(CH2)mCOOH、或 NH ( C H 2) m S Ο 3 Η，其中 m爲2 ; 或者 (C)
    其中 又！至X4中之一爲OH，而其他三個爲H; R〗爲（CH2)n，其中η爲0-2 ;且 -118- 200539855 · · R2 爲 OH、NH(CH2)2S03H。 3. 如申請專利範圍第1項之製法，其中該去氧膽酸酯家 族成員爲鵝去氧膽酸、豬去氧膽酸酯、熊去氧膽酸、 甘胺去氧膽酸、牛磺去氧膽酸、牛磺熊去氧膽酸、或 牛磺鵝去氧膽酸。 4. 如申請專利範圍第1項之製法，其中該去氧膽酸酯家 族成員係濃度爲約1 〇 mM之去氧膽酸。 5 . 如申請專利範圍第1項之製法，其中該卡奇黴素衍生 φ 物爲約3至約9重量％之IgGl抗體。 6. 如申請專利範圍第5項之製法，其中該卡奇黴素衍生 物爲約7重量％之IgGl抗體。 7. 如申請專利範圍第1項之製法，其中該IgG 1抗體爲抗 路易斯Y抗體。 8 . 如申請專利範圍第7項之製法，其中該抗路易斯Y抗 體爲 G193 或 Hu3S193 。 9 · 如申請專利範圍第1項之製法，其中該卡奇黴素衍生 φ 物爲卡奇黴素之N-醯基衍生物或卡奇黴素中之二硫化 物類似物。 1 0 .如申請專利範圍第9項之製法，其中該卡奇黴素衍生 物爲N-乙醯基γ卡奇黴素二甲基醯肼（N-乙醯基卡奇 黴素D Μ Η )。 1 1 ·如申請專利範圍第1項之製法，其中該可水解之鍵結 劑爲4-(4-乙醯基苯氧基）丁酸（AcBut)。 I2.如申請專利範圍第1項之製法，其中該pH値爲約8.2。 -119- 200539855 · 1 3 .如申請專利範圍第1項之製法，其中該製法進一步包 含將該卡奇黴素共軛物純化。 1 4 .如申請專利範圍第1 3項之製法，其中純化包含層析分 離、和超過濾/透析過濾（diafiltration)。 i 5.如申請專利範圍第14項之製法，其中該層析分離爲尺 寸排除層析法（SEC )或疏水性交互作用層析法 (HIC )。 1 6 ·如申請專利範圍第1 3項之製法，其中於純化步驟之 • 後，共軛物之平均負荷量爲每莫耳IgG1抗體有從約5 至約7莫耳之卡奇黴素。 17•如申請專利範圍第13項之製法，其中於純化步驟之 後’共軛物之低共軛分量（L C F )少於約1 〇 %。 1 8 · —種以如申請專利範圍第1項之製法製備的卡奇黴素 共軛物。 1 9 . 一種以如申請專利範圍第1 3項之製法製備的卡奇黴素 共軛物。 鲁2 0 · —種以如申請專利範圍第丨3項之製法製備的卡奇黴素 共軛物，其中該卡奇黴素衍生物爲N_乙醯基γ卡奇黴 素二甲基醯肼（Ν-乙醯基卡奇黴素DMH)，該可水解 之鍵結劑爲4-(4 -乙醯基苯氧基）丁酸（AcBut)，去氧 膽酸酯家族成員係濃度爲約1 〇 m Μ之去氧膽酸，ρ η値 爲約8.2，且於純化步驟之後，卡奇黴素共轭物之平均 負何量爲每莫耳之IgGl抗體有從約5至約7莫耳之卡 奇黴素，且共軛物之低共軛分量（LCF )少於約〗〇 %。 -120- 200539855 · _ 2 1. —種組成物，其包含共價地連結至抗路易斯γ抗體的 卡奇黴素-可水解之鍵結劑衍生物之共軛物。 22 .如申請專利範圍第2 1項之組成物，其中該卡奇黴素衍 生物爲卡奇黴素之Ν-醯基衍生物、或卡奇黴素中之二 硫化物類似物。 23 ·如申請專利範圍第22項之組成物，其中該卡奇黴素衍 生物爲Ν-乙醯基γ卡奇黴素二甲基醯胼（Ν-乙醯基卡 奇黴素D Μ Η )。 φ 24 ·如申請專利範圍第2 1項之組成物，其中該可水解之鍵 結劑爲4-(4-乙醯基苯氧基）丁酸（AcBut)。 2 5 .如申請專利範圍第2 1項之組成物，其中該抗路易斯γ 抗體爲G193或Hu3S193 。 26 ·如申請專利範圍第2 1項之組成物，其中該平均負荷量 爲每莫耳抗路易斯Y抗體有從約5至約7莫耳之卡奇 黴素。 2 7 ·如申請專利範圍第2 1項之組成物，其中該共軛物之 _ κ d 爲約 1 X 1 0 · 7 Μ 至約 4 X 1 (Γ7 Μ。 2 8 ·如申請專利範圍第2 1項之組成物，其中該共軛物之 Kd 爲約 3·4χ1(Γ7μ。 2 9 ·如申請專利範圍第2 1項之組成物，其中該共軛物會連 結路易斯Υ抗原，而不會連結路易斯X和Η_2血型抗 原。 3 0.如申請專利範圍第2 1項之組成物，其中該共軛物具有 細胞毒性之活性。 -121-
    200539855 3 1 ·如申請專利範圍第2 1項之組成物，其中該共 抗腫瘤活性。 3 2 .如申請專利範圍第2 1項之組成物，其中該共 治療有效量存在。 3 3 . —種組成物，其包含共價地結合至g 1 9 3的N 卡奇黴素二甲基醯肼-4-(4-乙醯基苯氧基）丁 醯基卡奇黴素DMH-AcBut)之共範物，其中 荷量爲每莫耳之G1 93有從約5至約7莫耳；： 基卡奇黴素DMH，且共軛物之低共軛分量（ 於約1 0 %。 3 4 . —種用於保存如申請專利範圍第2 1或3 3項 的生物活性之方法，其包含： 將組成物與低溫保護劑、界面活性劑、緩衝 解質在溶液中接觸，並 將該溶液冷凍乾燥。 3 5 ·如申請專利範圍第3 4項之製法，其中該共軛 度爲約〇·5 mg/mL至約2 mg/mL。 3 6 ·如申請專利範圍第3 5項之製法，其中該共軛 爲 1 mg/mL。 3 7 ·如申請專利範圍第3 4項之製法，其中該低溫 濃度爲約1 · 5重量％至約6重量❶/。。 3 8 ·如申請專利範圍第3 4項之製法，其中該低溫 糖醇或碳水化合物。 3 9 ·如申請專利範圍第3 8項之製法，其中該低溫 軛物具有 軛物係以 -乙醯基γ 酸（Ν-乙 該平均負 匕Ν-乙醯 LCF )少 之組成物 劑、和電 物爲之濃 物之濃度 保護劑之 保護劑爲 保護劑爲 -122·
    200539855 繭糖、甘露糖醇、或山梨糖醇。 40·如申請專利範圍第38項之製法，其中該低溫保護劑係 濃度爲約5 %之蔗糖。 4 1 .如申請專利範圍第3 4項之製法，其中該界面活性劑之 濃度爲約0 · 0 0 5 %至約〇 · 〇 5 %。 4 2 ·如申請專利範圍第4 1項之製法，其中該界面活性劑係 濃度爲0.0 1重量％之聚山梨酯8 0、或濃度爲約0.0 1 % 之 Tween 80。 φ 43 ·如申請專利範圍第34項之製法，其中該緩衝劑之濃度 爲約5 m Μ至約5 0 m Μ。 44.如申請專利範圍第43項之製法，其中該緩衝劑係濃度 爲約20mM之Tris。 4 5 ·如申請專利範圍第3 4項之製法，其中該電解質之濃度 爲約5 m Μ至約1 〇 〇 m Μ。 4 6 ·如申請專利範圍第4 5項之製法，其中該電解質爲鈉鹽 或鉀鹽。 鲁4 7 .如申請專利範圍第4 5項之製法，其中該電解質係濃度 爲約10mM之NaCl。 48.如申請專利範圍第34項之製法，其中該pH値在冷凍 乾燥之前爲約7.8至約8 · 2 ° 4 9.如申請專利範圍第48項之製法，其中該PH値在冷凍 乾燥之前爲約8.0。 5 〇 ·如申請專利範圍第3 4項之製法，其中冷凍乾燥包含： 將溶液於約-35t至約-5〇°C之溫度冷凍； -123- 200539855 · 將該經冷凍之溶液在約2 0至約8 〇微米之第一乾燥壓 力於約-10至約-4 0°C之層架溫度進行初始乾燥24至78 小時；且 將經冷凍乾燥之產物在約2 0至約8 0微米之第二乾燥 壓力於約+ 1 0至約+ 3 0 °C之層架溫度進行第二乾燥i 5 至3 0小時。 5 1 ·如申請專利範圍第5 0項之製法，其中冷凍係於約_ 4 5 進行；初始冷凍乾燥係於約6 0微米之第一乾燥壓力和 約-3 0 °C之層架溫度進行6 0小時；而第二乾燥步驟係 於約6 0微米之乾燥壓力和約+ 2 5 °C之層架溫度進行約 24小時。 5 2 .如申請專利範圍第3 4項之製法，其中該製法進一步包 含在冷凍乾燥之前加入結塊劑。 53.如申請專利範圍第52項之製法，其中該結塊劑之濃度 爲約〇. 5至約1 . 5重量％。 54·如申請專利範圍第52項之製法，其中該結塊劑係濃度 爲約0 · 9重量％之右旋糖醉4 0、或濃度爲約〇 · 9重量％ 之羥乙基澱粉40。 5 5 ·如申請專利範圍第3 4項之製法，其中該共轭物亘有細 胞毒性之活性。 5 6 ·如申請專利範圍第3 4項之製法，其中該共轭物具有抗 腫瘤活性。 5 7 ·如申請專利範圍第3 4項之製法，其中該共轭物係以治 療有效量存在。 -124- 200539855 5 8 ·如申請專利範圍第3 4項之製法，其中該共轭物爲共價 地結合至G193的N -乙醯基γ卡奇黴素二甲基醯 肼-4-(4 -乙醯基苯氧基）丁酸（Ν -乙醯基卡奇黴素 DMH-AcBut)，其中該平均負荷量爲每莫耳gi93有從 約5至約7莫耳之N-乙醯基卡奇黴素DMH，且共軛物 之低共軛分量（LCF )少於約1 0 %。 59· —種含有卡奇黴素—抗路易斯Y抗體共軛物、低溫保護 劑、界面活性劑、緩衝劑、和電解質之配方。 φ 6 0 ·如申請專利範圍第5 9項之配方，其中該共軛物之濃度 爲約 0.5 mg/mL 至約 2 mg/mL。 6 1 ·如申請專利範圍第60項之配方，其中該共軛物之濃度 爲約 1 m g / m L。 62.如申請專利範圍第59項之配方，其中該低溫保護劑之 濃度爲約1 . 5重量％至約6重量％。 63 .如申請專利範圍第62項之配方，其中該低溫保護劑爲 糖醇或碳水化合物。 鲁6 4 .如申請專利範圍第6 3項之配方，其中該低溫保護劑爲 繭糖、甘露糖醇、或山梨糖醇。 6 5 .如申請專利範圍第6 3項之配方，其中該低溫保護劑係 濃度爲約5 %之蔗糖。 6 6 .如申請專利範圍第5 9項之配方，其中該界面活性劑之 濃度爲約0.00 5 %至約〇.〇5 %。 6 7 .如申請專利範圍第6 6項之配方，其中該界面活性劑係 濃度爲約0.01重量％之Tween 80。 -125- 200539855 68 . 69. 70. • 72. 73 . 74. 75.
    76. 77. 如申請專利範圍第5 9項之配方，其中緩衝劑之濃度爲 約5 m Μ至約5 0 m Μ。 如申請專利範圍第6 9項之配方，其中緩衝劑係濃度爲 約 20mM 之 Tris。 如申請專利範圍第5 9項之配方，其中該電解質之濃度 爲約5 m Μ至約1 〇 〇 m Μ。 如申請專利範圍第70項之配方，其中該電解質爲鈉鹽 或鉀鹽。 如申請專利範圍第7 1項之配方，其中該電解質係濃度 爲約10mM之NaCl。 如申請專利範圍第5 9項之配方，其中該pH値爲約 7 · 8 至約 8 · 2。 如申請專利範圍第7 3項之配方，其中該pH値爲約 8.0° 如申請專利範圍第59項之配方，其中該卡奇黴素爲卡 奇黴素之N -醯基衍生物、或卡奇黴素中之二硫化物類 似物。 如申請專利範圍第7 5項之配方，其中該卡奇黴素爲 N-乙醯基γ卡奇黴素二甲基醯肼（N_乙醯基卡奇黴素 DMH )。 如申請專利範圍第5 9項之配方，其中該可水解之鍵結 劑爲4-(4-乙醯基苯氧基）丁酸（AcBut)。 如申請專利範圍第5 9項之配方，其中該抗路易斯y抗 體爲 G193 或 Hu3S193 。 -126- 78 .
    200539855 79·如申請專利範圍第59項之配方，其中該平均負荷量爲 每莫耳抗路易斯γ抗體有從約5至約7莫耳之卡奇徽 素。 ” 8 〇 ·如申請專利範圍第5 9項之配方，其中該共軛物之Kc 爲約 1 X 1 (Γ7 Μ 至約 4 X 1 0 ·7 Μ。 8 1 ·如申請專利範圍第5 9項之配方，其中該共軛物之Kc 爲約 3.4 X 1 (Γ7 μ。 8 2 ·如申請專利範圍第5 9項之配方，其中該共軛物會連結 路易斯Υ抗原，而不會連結路易斯X和Η-2血型抗原。 8 3 ·如申請專利範圍第5 9項之配方，其中該共軛物具有細 胞毒性之活性。 8 4 ·如申請專利範圍第5 9項之配方，其中該共軛物具有抗 腫瘤活性。 8 5 ·如申請專利範圍第5 9項之配方，其中該共軛物係以治 療有效量存在。 8 6 ·如申請專利範圍第5 9項之配方，其中該共軛物爲共價 地結合至G193的 Ν -乙醯基7卡奇黴素二甲基醯 肼-4-(4-乙醯基苯氧基）丁酸（Ν-乙醯基卡奇黴素 DMH-AcBut)，其中該平均負荷量爲每莫耳G193有從 約5至約7莫耳之N-乙醯基卡奇黴素DMH，且共軛物 之低共軛分量（LCF)少於約1〇 %。 8 7 ·如申請專利範圍第86項之配方，其中該共軛物之濃度 爲1 mg/mL，該低溫保護劑係濃度爲約5 %之蔗糖，該 界面活性劑係濃度爲約〇·〇1重量％之Tween 80，緩衝 -127- 200539855 · 劑係濃度爲約20 mM之Tris，且該電解質係濃度爲約 10mM之NaCl’其中該pH値爲約8.0。 8 8 · —種治療癌症之方法，包含給予如申請專利範圍第 2 1、2 5或3 2項中任一項之組成物的治療有效量。 8 9 ·如申請專利範圍第8 8項之方法，其中該癌症爲路易斯 Y抗原陽性。 9 0.如申請專利範圍第8 9項之方法，其中該癌症爲癌瘤 (carcinoma ) 〇 φ 9 1 ·如申請專利範圍第8 8項之方法，其中該組成物係作爲 第二線單一治療來給藥。 9 2 .如申請專利範圍第8 8項之方法，其中該組成物係作爲 第一線合倂治療來給藥。 93 ·如申請專利範圍第88項之方法，其中該癌症爲非小細 胞肺癌（NSCLC )或乳癌。 94·如申請專利範圍第88項之方法，其中該癌症爲前列腺 癌或結直腸癌。 鲁9 5 ·如申請專利範圍第8 8項之方法，其中該組成物係與生 物活性劑合倂而給藥。 96. 如申請專利範圍第95項之方法，其中該生物活性劑爲 抗癌劑。 97. —種治療NSCLC之方法，其包含給予如申請專利範圍 第2 1、2 5或3 2項中任一項之組成物。 9 8. —種治療乳癌之方法，其包含給予如申請專利範圍第 2 1、2 5或3 2項中任一項之組成物。 -128· 200539855 9 9 · 一種治療患有增生性疾病之病患的方法，該方法包含 給予如申請專利範圍第2 1、2 5或3 2項中任一項之組 成物之治療有效量。 10 0.—種套組，其包含⑴裝有如申請專利範圍第59、85或 8 6項中任一項之配方的容器；以及（i i)以稀釋劑對該配 方進行再組成、直至再組成配方中的共軛物濃度在從 約0· 5 mg/mL至約5 mg/mL之範圍內的使用說明書。
    -129-
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