CN1997397A - 卡奇霉素结合物 - Google Patents

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Abstract

本发明描述抗Lewis Y抗体。本发明描述用于制备单体细胞毒性药物/载体结合物的方法，所述结合物具有显著高于先前所报导程序中的药物负载量且具有降低的聚集和低结合部分(LCF)。本发明也描述细胞毒性药物衍生物/抗体结合物、包含所述结合物的组合物以及所述结合物的用途。特定而言，本发明也描述单体卡奇霉素(calicheamicin)衍生物/抗Lewis Y抗体结合物、包含所述结合物的组合物以及所述结合物的用途。

Description

卡奇霉素结合物
技术领域
本发明是关于用于生产结合于具有较高药物负载量和大体上减少的低结合部分(LCF)的IgG1抗体的单体卡奇霉素细胞毒性药物的方法。特定而言，本发明是关于结合于卡奇霉素的抗Lewis Y抗体。本发明也是关于所述结合物的用途。
背景技术
细胞毒性化学疗法的使用提高了患有各种类型的癌症的患者的生存率。对于诸如年轻人中急性淋巴性白血病(Kalwinsky，D.K.(1991)3：39-43，1991)和霍奇金(Hodgkin)淋巴瘤(Dusenbery，K.E等人(1988)American Journal of Hematology，28：246-251)的选定赘生性疾病使用，细胞毒性药物的鸡尾酒疗法可产生完全治愈。不幸的是，当前所应用的化学疗法并不能在大多数癌症中产生完全缓解。多种原因可解释这一相关功效不足(对于回顾，请参见：Gottesman，M.M.(2002)Ann.Rev.of Med.53，615-62；Mashima，T.等人(1998)Biotherapy：12(6)，947-952；Mareel，M.M.等人(1986)Radiotherapy andOncology：6，135-142)。其中，多数化学治疗剂的低治疗指数是药物改良的一个可能对象。低治疗指数反映药物的有效和毒性剂量之间的狭窄边界，其可防止投予根除所需要的足够高的剂量而且获得治愈效果。
绕过这一问题的一种策略是使用所谓的魔弹。魔弹的概念由Ehrlich提出(Ehrlich，P.(Collected Studies on Immunity 2，442-447))并且魔弹由化学连接于抗体的细胞毒性化合物组成。将细胞毒性抗癌药物结合于识别肿瘤相关抗原的抗体可提高所述药物的治疗指数。这一抗体应理想地识别专门表达于肿瘤细胞表面的肿瘤相关抗原(TAA)。此策略允许将细胞毒性剂递送至肿瘤位点同时使得正常组织的暴露最少。所述抗体可将细胞毒性剂特别递送至肿瘤并藉此降低全身毒性。
针对全身药物疗法所开发的药物是靶点特异性细胞毒性剂。所述概念涉及将治疗剂偶合于对确定的靶点细胞群具有特异性的载体分子。对抗原具有高亲和力的抗体是作为靶向部分的天然选择。一种所述抗原是Lewis Y抗原，其表达于正常组织，但表达水平在某些肿瘤类型中更高。所述Lewis Y(Ley)抗原见于一些乳癌、结肠癌、胃癌、食道癌、胰腺癌、十二指肠癌、肺癌、膀胱癌和肾癌以及岛细胞神经内分泌肿瘤的细胞。其在一些肿瘤细胞上的存在并不伴随其血清水平的增加，因此所投予的Lewis Y特异性抗体并不显著结合可溶性抗原。
由于高亲和力单克隆抗体的可用性，所以抗体靶向治疗剂的前景变得更有希望。结合于单克隆抗体的毒性物质包括毒素、低分子量细胞毒性药物、生物反应调节剂和放射性核素。抗体-毒素结合物常被称为免疫毒素，而由抗体和诸如氨甲喋呤和阿霉素的低分子量药物组成的免疫结合物被称为化学免疫结合物。免疫调节剂含有已知具有调节功能的生物反应调节剂，诸如淋巴因子、生长因子和补体激活眼镜蛇毒因子(CVF)。放射性免疫结合物由放射性同位素组成，其可用作治疗剂以由其射线杀死细胞或者用于成像。期望将细胞毒性药物递送至肿瘤细胞的抗体介导的特异性递送不仅增强其抗肿瘤功效，也防止正常组织的非靶向性吸收，因而增加其治疗指数。
开发了使用抗菌剂和抗肿瘤剂的有效家族的成员的免疫结合物(总体称为卡奇霉素或LL-E33288复合物)用来治疗癌症。最有效的卡奇霉素称为γ1 1，其在本文中简称为γ。所述化合物含有可与适当硫醇反应形成二硫化物并同时引入诸如酰肼或其他适用于将卡奇霉素衍生物连接于载体的官能基的官能基的甲基三硫化物。所述卡奇霉素含有可通过将-S-S-键还原而激活并使双链DNA断裂的烯二炔弹头(图1)。
也称为CMA-676或CMA的MYLOTARG(Sievers，E.L.等人(1999)Blood：93，3678-3684)是仅有的根据此原理起作用的的市售药物。MYLOTARG(吉妥珠单抗(gemtuzumab)奥唑米星(ozogamicin))当前已批准用于治疗老年患者中的急性骨髓白血病。所述药物由借助于可酸性水解的连接子结合于卡奇霉素的抗CD33抗体组成。将半合成N乙酰基γ卡奇霉素的二硫化物类似物用于结合(美国专利第5,606,040、5,770,710号)。后文将这一分子N乙酰基γ卡奇霉素二甲基酰肼简写为CM。
多种实验证据加强以下思想，意即使用识别不同于CD33的TAA的抗体可扩展魔弹方法的应用范围。多种抗体和化疗剂的结合物(免疫结合物)具有治愈异种移植肿瘤的宿主的已经证明了的能力。一些靶向TAA的实例是：HER2/neu(Starling，J.J，等人(1992)Bioconjugate Chemistry：3(4)，315-322；DiJoseph，J.F等人(2002)European Journal ofCancer：38(suppl.7)，S150)、PSCA(Sjogren，H.O，等人(1997)Cancer Res.：57,4530-4536)、粘蛋白型糖蛋白(MIRACL-26457)(Zhang，S.等人(1997)Int.J.Cancer，73：50-56；Wahl，A.F.等人(2000)Int.J.Cancer，93：590-600)、EGFR(Furokawa，K.，等人(1990)Mol.Immunol.，27：723-732)、CEA(Kitamura，K.，等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，91：12957-12961)、CD22(Clarke，K.，等人(2000)Cancer Res.，60：4804-4811)和Lewisy-抗原(Ley)(Morgan，A.，等人(1995)Immunology，86：319-324)。为实现细胞毒性效应，将抗所述表面抗原的抗体结合于假单胞菌外毒素(DiJoseph，J.F等人，S150)、美登素碱(maytansinoid)(Sjogren，H.O，等人4530-4536；Zhang，S.等人50-56)、卡奇霉素(Wahl，A.F.等人590-600；Clarke，K.，等人4804-4811)、RNase(Furokawa，K.，等人723-732)、长春碱(Kitamura，K.，等人，12957-12961)或阿霉素(Morgan，A.，等人319-324)。
在开发用于多种癌症的疗法中使用单体卡奇霉素衍生物/载体结合物受到特定靶向剂(载体)以及使得在结合于所述载体的卡奇霉素衍生物的量(意即药物负载)增加时形成蛋白聚集体的结合方法限制。因为较高药物负载增加结合物的固有效能，所以希望在载体上负载有符合保持与载体蛋白的亲和力的要求的尽可能多的药物。
包括卡奇霉素的多种细胞毒性药物的天然疏水特性使得在制备具有良好药物负载和合理产量的单体药物结合物中产生困难。键联的疏水性增加以及将治疗剂与载体(抗体)分开的共价距离的增加看来加剧了这一问题。因此，可能具有非特异性毒性和免疫原性且因而必须去除以用于治疗应用的聚集蛋白的存在使得生产所述结合物的规模化扩大方法更加困难并降低所述产物的产率。
加载于载体蛋白上的卡奇霉素的量(药物负载)、形成于结合反应中的聚集体的量以及可获得的最终纯化单体结合物的产率均为相关的。在一些情况下，由于过量聚集，通常难以使用公开于美国专利第5,053,394号的反应条件以适用产率和适用于治疗应用的负载量制备结合物。所述反应条件在结合反应中将DMF用作共溶剂。因此需要允许更高药物负载量/产率而无聚集和固有材料损失的方法。减少聚集的改良描述于美国专利第5,712,374和5,714,586号以及美国专利申请案第2004/0082764 A1和2004/0192900 A1号中，其均以全文引用的方式并入本文中。
当与美国专利第5,877,296和5,773,001号(其均以引用的方式并入本文中)中描述的连接子进行结合反应时，卡奇霉素结合物聚集的倾向尤其成问题。在这一情况下，大百分比的所产生的结合物为聚集形式，且通过这些方法(例如使用描述于美国专利第5,877,296号中的方法)制备的结合物非常难以纯化以用于治疗用途。对于一些载体蛋白，实际上除了小规模以外不可能制备具有适当负载量的结合物。对于其中抗体同型和差异糖基化模式影响结合过程的抗体尤其如此。因此，需要设计用于将卡奇霉素结合于特定抗体的新颖的和改良的方法，由此将聚集量最小化并以合理产物产率产生尽可能高的药物负载量。
发明内容
本发明提供用于制备卡奇霉素结合物的方法以及由这一方法制备的结合物，所述方法包含在约7至约9之pH下(优选约8.2)使(i)经活化的卡奇霉素—可水解连接子衍生物和(ii)IgG1抗体在脱氧胆酸家族成员或其盐存在下反应。本发明也提供包含共价连接于抗Lewis Y抗体的卡奇霉素—可水解连接子衍生物的结合物的组合物。
在一个实施例中，所述脱氧胆酸家族成员具有以下结构之一：
(A)
Figure A20058000842900131
其中：
X1至X5中的两个是H或OH且其他三个独立地为O或H；
R1为其中n为0-4的(CH2)n，且
R2为OH、NH(CH2)mCOOH、NH(CH2)mSO3H或NH(CH2)mPO3H2，其中m为1-4。
或者
(B)
Figure A20058000842900132
其中：
X1至X4中的一个是H或OH且其他三个独立地为O或H；
R1为其中n为0-2的(CH2)n，且
R2为OH、NH(CH2)mCOOH或NH(CH2)mSO3H，且其中m为2。
或者
(C)
Figure A20058000842900141
其中：
X1至X4中的一个为OH且其他三个为H；
R1为其中n为0-2的(CH2)n，且
R2为OH、NH(CH2)2SO3H。
脱氧胆酸家族成员也可为鹅脱氧胆酸、猪脱氧胆酸、熊脱氧胆酸、甘油脱氧胆酸、牛磺脱氧胆酸、牛磺熊脱氧胆酸或牛磺鹅脱氧胆酸。所述脱氧胆酸家族成员优选地为约10mM浓度的脱氧胆酸。
在另一实施例中，卡奇霉素衍生物为IgG1抗体的约3至约9重量％，优选地为IgG1抗体的约7重量％。
在一个实施例中，所述IgG1抗体为抗Lewis Y抗体，其中抗Lewis Y抗体优选地为G193或Hu3S193。
在另一实施例中，所述卡奇霉素衍生物为卡奇霉素的N-酰基衍生物或卡奇霉素的二硫化物类似物。优选地，所述卡奇霉素衍生物为N乙酰基γ卡奇霉素二甲基酰肼(N乙酰基卡奇霉素DMH)。
在另一实施例中，所述可水解连接子为4-(4-乙酰基苯氧基)丁酸(AcBut)。
所述方法可视情况进一步包含将所述卡奇霉素结合物纯化。所述纯化可包含色谱分离和超滤/透滤。
优选地，所述色谱分离为尺寸排除色谱(SEC)或疏水相互作用色谱(HIC)。在色谱步骤之后，结合物的平均负载量优选地为每摩尔IgG1抗体约5至约7摩尔卡奇霉素，且所述结合物的低结合部分(LCF)低于约10％。
本发明的卡奇霉素结合物优选地具有约1×10-7M至约4×10-7M的KD，且更优选地具有约3.4×10-7M的KD。所述结合物结合Lewis Y抗原并且不结合Lewis X和H-2血型抗原，具有细胞毒性活性且具有抗肿瘤活性。优选地，所述结合物在组合物中以治疗有效量存在。
因此，本发明提供包含共价连接于G193的N乙酰基γ卡奇霉素二甲基酰肼—4-(4-乙酰基苯氧基)丁酸(N乙酰基卡奇霉素DMH—AcBut)的结合物的组合物，其中平均负载量为每摩尔G193约5至约7摩尔N乙酰基卡奇霉素DMH且所述结合物的低结合部分(LCF)低于约10％。
本发明也提供用于保存所述组合物的生物学活性的方法，其包含：使所述组合物在溶液中与防冻剂、表面活性剂、缓冲剂和电解质接触；并使所述溶液冻干。
在一个实施例中，所述结合物是在约0.5mg/mL至约2mg/mL的浓度下。优选地，所述结合物是在1mg/mL的浓度下。
在另一实施例中，所述防冻剂是在约1.5％至约6重量％的浓度下。所述防冻剂可为糖醇或碳水化合物；优选地，所述防冻剂为海藻糖、甘露醇或山梨糖醇，且更优选地所述防冻剂为约5％浓度的蔗糖。
在一个实施例中，表面活性剂是在约0.005％至约0.05％的浓度下。优选地，所述表面活性剂是0.01重量％浓度的聚山梨醇酯80(Polysorbate 80)或约0.01％浓度的吐温80(Tween80)。
在另一实施例中，缓冲剂是在约5mM至约50mM的浓度下。优选地，所述缓冲剂为约20mM浓度的Tris。
在另一实施例中，电解质是在约5mM至约100mM的浓度下。优选地，所述电解质为钠盐或钾盐，且更优选地，所述电解质为约10mM浓度的NaCl。
在一个实施例中，在冻干之前，pH为约7.8至约8.2，且优选地，pH为约8.0。
在一个实施例中，冻干包含：在约-35℃至约-50℃的温度下冷冻溶液；最初在约20至约80微米汞柱(micron)的初步干燥压力在约-10℃至约-40℃的存放温度下干燥所冷冻的溶液24至78小时；和继而在约20至约80微米汞柱的第二干燥压力在约+10℃至约+30℃的存放温度下干燥所经冷冻干燥的产物15至30小时。优选地，冷冻是在约-45℃下进行，最初的冷冻干燥是在约60微米汞柱的初始干燥压力和约-30℃的存放温度下进行60小时，且第二干燥步骤是在约60微米汞柱的干燥压力和约+25℃的存放温度下进行约24小时。
所述方法可视情况进一步包含在冻干前添加膨化剂。优选地，膨化剂浓度为约0.5至约1.5重量％，且更优选地，膨化剂为约0.9重量％浓度的葡聚糖40(Dextran 40)或约0.9重量％浓度的羟乙基淀粉40。
本发明进一步提供包含上述卡奇霉素—抗Lewis Y抗体结合物组合物、防冻剂、表面活性剂、缓冲剂和电解质的调配物。
本发明也提供治疗癌症或另一增生性病症的方法，其包含投予治疗有效量的也可用于制造用于治疗癌症的药物的本文所述的组合物。
所述组合物可作为第二线单独疗法或作为第一线组合疗法投予。
优选地，癌症为Lewis Y抗原阳性的且更优选地，所述癌症为恶性肿瘤。同样，所述癌症优选地为非小细胞肺癌(NSCLC)、乳癌、前列腺癌或结肠直肠癌。
本发明的方法可与诸如抗癌剂的生物活性剂组合实施。
本发明也提供包含下列各物的试剂盒：(i)容纳本发明的任何调配物的容器；和(ii)用于将所述调配物与稀释剂重构为所述重构调配物中的结合物浓度在约0.5mg/mL至约5mg/mL范围内的说明书。
附图说明
图1展示结合于卡奇霉素的抗Lewis Y抗体(hu3S193)(hu3S193-AcBut-CM)的结构。
图2A和2B展示结合于卡奇霉素的抗Lewis Y抗体(hu3S193-AcBut-CM)对Ley+和-细胞的效应，如发生频率对ED50(ng/ml)之图所示；图2A展示Ley+细胞株AGS且图2B展示Ley-细胞株PC3MM2。图2C展示hu3S193-AcBut-CM对Ley+和-细胞的效应，如CMA倍数对细胞(意即Ley+细胞株LOVO、N87、HCT8/S11-R1、AGS、LNCaP、NCI-H358和Ley-细胞株PC3-MM2、A431和PANC-1)表面上的Lewis Y表达之图所示，其中n表示独立ED50测定的数值。
图3展示结合于卡奇霉素的抗Lewis Y抗体(hu3S193-AcBut-CM)抗N87胃癌异种移植物的活体内活性，如肿瘤体积(cm3)对肿瘤生长时期(天)之图所示；图3A展示对照结合物CMA和RITUXAN-AcBut-CM且图3B展示hu3S193和hu3S193-AcBut-CM。
图4展示结合于卡奇霉素的抗Lewis Y抗体(hu3S193-AcBut-CM)抗LNCaP前列腺癌异种移植物的活体内活性，如肿瘤体积(cm3)对肿瘤生长时期(天)之图所示。
图5展示结合于卡奇霉素的抗Lewis Y抗体(hu3S193-AcBut-CM)抗LOVO结肠癌异种移植物的活体内活性，如肿瘤体积(cm3)对肿瘤生长时期(天)之图所示；图5A展示对照结合物RITUXAN-AcBut-CM且图5B展示hu3S193和hu3S193-AcBut-CM。
图6展示结合于卡奇霉素的抗Lewis Y抗体(hu3S193-AcBut-CM)抗LOVO结肠癌异种移植物的活体内活性，如肿瘤体积(cm3)对肿瘤生长时期(天)之图所示；图6A展示对照结合物CMA和RITUXAN-AcBut-CM且图6B展示以4μg Q4Dx3或Q4Dx4投予的hu3S193和hu3S193-AcBut-CM。
图7展示成熟分泌型抗Lewis Y抗体hu3S193(wt)和G193(mt)IgGl重链的氨基酸序列的比较，其中突变位点为黑体并突出显示且CDR为黑体并加阴影。
图8展示hu3S193(Wyeth wt)和hu3S193(路德维格癌症研究院(Ludwig Institutefor Cancer Research)，后文称作LICR wt)IgGl重链的氨基酸序列的比较，其中CDR为黑体并加阴影且异型差异突出显示并为黑体。
图9展示结合于卡奇霉素的抗Lewis Y抗体(CMD-193)对A431(图9A)和A431/Ley(图9B)表皮样癌细胞的活体外生长抑制，如控制百分比(CMA)对卡奇霉素浓度(cal.eq.，ng/ml)之图所示。
图10展示结合于卡奇霉素的抗Lewis Y抗体(hu3S193-AcBut-CM和CMD-193)对N87胃癌异种移植物的活体内生长抑制，如肿瘤体积(cm3)对肿瘤生长时期(天)之图所示；图10A展示对照结合物CMA，图10B展示CMD-193和hu3S193-AcBut-CM，且图10C展示游离抗体。
图11展示结合于卡奇霉素的抗Lewis Y抗体(hu3S193-AcBut-CM和CMD-193)对L2987肺癌异种移植物的活体内生长抑制，如肿瘤体积(em3)对肿瘤生长时期(天)之图所示；图11A展示对照结合物CMA且图11B展示CMD-193。
图12展示结合于卡奇霉素的抗Lewis Y抗体(hu3S193-AcBut-CM和CMD-193)对L2987肺癌异种移植物的活体内生长抑制，如各群体中肿瘤体积小于起始平均体积的小鼠数量(％)对肿瘤生长时期(天)之图所示；图12A展示对照结合物CMA且图12B展示CMD-193。
图13展示结合于卡奇霉素的抗Lewis Y抗体(CMD-193)对L2987肺癌异种移植物的活体内生长抑制，如肿瘤体积(cm3)对肿瘤生长时期(天)之图所示。
图14展示结合于卡奇霉素的抗Lewis Y抗体(CMD-193)对A431/Ley表皮样癌异种移植物的活体内生长抑制，如肿瘤体积(cm3)对肿瘤生长时期(天)之图所示。
图15展示结合于卡奇霉素的抗Lewis Y抗体(hu3S193-AcBut-CM和CMD-193)对A431/Ley表皮样癌异种移植物的活体内生长抑制，如肿瘤体积(cm3)对肿瘤生长时期(天)之图所示；图15A展示对照结合物CMA且图15B展示CMD的功效。
图16展示结合于卡奇霉素的抗Lewis Y抗体(CMD-193)对A431/Ley表皮样癌异种移植物的活体内生长抑制，如各群体中肿瘤体积小于起始平均体积的小鼠数量(％)对肿瘤生长时期(天)之图所示；图16A展示对照结合物CMA的功效且图16B展示CMD的功效。
图17展示结合于卡奇霉素的抗Lewis Y抗体(CMD-193)对LS174T结肠癌异种移植物的活体内生长抑制，如肿瘤体积(cm3)对肿瘤生长时期(天)之图所示；图17A展示对照结合物CMA的功效且图17B展示CMD的功效。
图18展示结合于卡奇霉素的抗Lewis Y抗体(CMD-193和hu3S193-AcBut-CM)对LOVO结肠癌异种移植物的活体内生长抑制，如肿瘤体积(cm3)对肿瘤生长时期(天)之图所示；图18A展示对照结合物CMA和G193的功效，图18B和18C展示CMD分别于Z4DX3和Q4DX4下的功效，且图18D和18E展示CMD在各种时间间隔下的功效。
图19展示接受各种剂量的结合于卡奇霉素的抗Lewis Y抗体(CMD-193)注射的裸鼠的存活率，如存活率百分比对观察时期(天)之图所示。
图20展示结合于卡奇霉素的抗Lewis Y抗体(CMD-193)对Lewis Y抗原的结合特异性，如Lewis Y和结构上相关的抗原对BIAcore共振单位之图所示。
图21展示结合于卡奇霉素的抗Lewis Y抗体(hu3S193-AcBut-CM)抗HCT8S11结肠癌异种移植物的活体内活性，如肿瘤质量(g)对肿瘤生长时期(天)之图所示；图21A展示小肿瘤且图21B展示大肿瘤。
图22展示结合于卡奇霉素的抗Lewis Y抗体(CMD-193)抗MX1乳癌异种移植物的活体内活性，如相对肿瘤生长对肿瘤生长时期(天)之图所示。
图23展示结合于卡奇霉素的抗Lewis Y抗体(CMD-193)抗N87胃癌异种移植物的基于不同药物负载量的活体内活性，如肿瘤质量(g)对肿瘤生长时期(天)之图所示。
图24展示抗Lewis Y抗体(G193)和其卡奇霉素结合物(CMD-193)对N87胃癌细胞的活体外补体依赖性细胞毒性(CDC)活性，如细胞毒性百分比对抗体浓度(μg/ml)之图所示。
图25展示抗Lewis Y抗体(G193)和其卡奇霉素结合物(CMD-193)对A431/Ley表皮样癌细胞的活体外抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性；图25A展示对Lewis Y+++A431表皮样癌细胞的活性且图25B展示对Lewis Y阴性A431表皮样癌的活性。
具体实施方式
本发明提供制备卡奇霉素结合物的方法。所述方法包括在约7至约9的pH下使(i)经激活的卡奇霉素—可水解连接子衍生物和(ii)例如抗Lewis Y抗体的IgG1抗体在脱氧胆酸家族成员或其盐存在下反应以及由此产生的结合物。本发明也提供具有共价连接于抗Lewis Y抗体的卡奇霉素—可水解连接子的结合物的组合物。也提供用于保存所述组合物的生物活性的方法，其包括使所述组合物在溶液中与防冻剂、表面活性剂、缓冲剂和电解质接触并冻干所述溶液。进一步提供卡奇霉素—抗Lewis Y抗体结合物、防冻剂、表面活性剂、缓冲剂和电解质的调配物以及制造的物品。最后，本发明提供通过投予治疗有效量的所述组合物/调配物治疗癌症或其他增生性病症的方法，包括所述组合物/调配物在制造用于治疗癌症或其他增生性疾病的药物中的用途。以下描述本发明的各种实施例。
已经应用所建立的结合条件形成MYLOTARG(也称为CMA-676或CMA)和CMC-544(一种人源化抗CD22抗体G5/44卡奇霉素结合物)。所述两者均为IgG4抗体。由于引入MYLOTARG，所以已经通过使用离子交换色谱知道卡奇霉素并不以均一或均质的方式分布于所述类型的抗体上。尽管所述结合物的平均负载量为每摩尔抗体0.1至10或15摩尔的卡奇霉素，但所述卡奇霉素约为抗体的一半，而另一半以仅含有少量卡奇霉素的低结合部分(LCF)存在。
用于将诸如卡奇霉素的细胞毒性药物结合于载体并由此使聚集最小化且使得药物负载更高度均一而结合产物的产率显著提高的改良方法在开发CMC-544期间完成。特定实例为G5/44-人源化抗CD22抗体-NAc-γ卡奇霉素DMH AcBut结合物的方法。对于CMC-544的开发，希望将LCF的量降低为少于总抗体的10％，且考虑了各种用于降低LCF水平的选择。诸如抗原结合和细胞毒性的免疫结合物的其他属性必须不受最终溶液的影响。所考虑的选择包括抗体分子的遗传或物理修饰、色谱分离技术或反应条件的更改。
使用老的反应条件(CMA-676方法条件)使G5/44抗体与NAc-γ卡奇霉素-DMH-AcBut-OSu反应产生具有类似于CMA-676的物理特性(药物负载量，LCF)和聚集作用的产物。然而，认为并不希望在结合后存在高水平(50-60％)的LCF。最佳反应条件是通过其中评估诸如温度、pH、卡奇霉素衍生物输入和添加剂浓度的关键反应变量的统计实验设计方法来确定。为将LCF降低至小于10％，将卡奇霉素衍生物输入相对于反应中的抗体量从3％增加至8.5％(w/w)。添加剂是从200mM浓度的辛酸或其盐(CMA方法)改变至37.5mM浓度的辛酸或其盐。包括所述改变的反应条件将LCF降至10％以下同时增加卡奇霉素负载量，且在后文称为CMC-544方法条件。
卡奇霉素输入增加使药物负载量从2.5-3.0重量％增加至5.0-9.0(最通常为5.5-8.5)重量％，且并不导致反应中蛋白聚集增加。由于聚集体和LCF的减少，CMC-544方法条件产生更均质的产物。
因为氨基酸序列和同型的变化，所以并非所有抗体展示相同的物理特征且对于各特定抗体必须定制反应条件。当使用CMA-676结合反应条件同时使用例如抗Lewis Y抗体的IgG1抗体时，所得结合物具有与CMA-676类似的物理特性(药物负载量、LCF和聚集作用)，且认为并不希望在结合后存在高水平(50-60％)的LCF。使用为CMC-544开发的经过修改的条件和IgG1产生具有低LCF的产物，但认为在反应中产生的聚集体的量并不太高。经确定特定胆酸、脱氧胆酸家族或其盐在此情况下起到降低LCF和聚集体的最佳添加剂的作用。在表1中展示一种按照CMA-676、CMC-544两者和新颖优化方法与添加剂一起制备的IgG1抗体结合物的比较(辛酸、癸酸和脱氧胆酸)。
表1
 条件/结果  辛酸  癸酸  脱氧胆酸
 卡奇霉素衍生物输入  7.0％(w/w)  7.0％(w/w)  7.0％(w/w)
 添加剂浓度  200mM  37.5mM  10mM
 温度  32(±2)℃  32(±2)℃  32(±2)℃
 PH  8.2(±0.2) 8.2(±0.2)  8.2(±0.2)
 负载量(ug卡奇霉素/mg抗体)  65-75  65-75  65-75
 低结合部分  13.5％  5.3％  3.8％
 聚集(反应最后)  25.4％  14.6％  3.2％
因此本发明提供用于制备卡奇霉素结合物的方法。在这一方法中，使经激活的卡奇霉素—可水解连接子衍生物与IgG1抗体在脱氧胆酸家族成员或其盐的存在下反应。这一方法使得聚集量最少且显著增加IgG1抗体结合物的药物负载量。
在本发明的方法中可使用胆酸的脱氧胆酸家族的任何适当成员或其盐。在一个实施例中，所述脱氧胆酸家族成员具有以下结构：
其中：
X1至X5中的两个是H或OH且其他三个独立地为O或H；
R1为其中n为0-4的(CH2)n，且
R2为OH、NH(CH2)mCOOH、NH(CH2)mSO3H或NH(CH2)mPO3H2，其中m为1-4。
或者，所述脱氧胆酸家族成员可具有以下结构：
其中：
X1至X4中的一个是H或OH且其他三个独立地为O或H；
R1为其中n为0-2的(CH2)n，且
R2为OH、NH(CH2)mCOOH或NH(CH2)mSO3H，其中m为2。
同样或者，所述脱氧胆酸盐家族成员可具有以下结构：
其中：
X1至X4中的一个为OH且其他三个为H；
R1为其中n为0-2的(CH2)n，且
R2为OH、NH(CH2)2SO3H。
优选地，脱氧胆酸家族成员也可为脱氧胆酸鹅脱氧胆酸、猪脱氧胆酸、熊脱氧胆酸、甘油脱氧胆酸、牛磺脱氧胆酸、牛磺熊脱氧胆酸或牛磺鹅脱氧胆酸。更优选地，所述脱氧胆酸家族成员为脱氧胆酸，其优选地以约10mM的浓度存在。
如先前所讨论，卡奇霉素是指如美国专利第4,970,198号(也参见美国专利第5,108,912号)所述的抗菌和抗肿瘤剂家族。在本发明的方法的一个优选实施例中，所述卡奇霉素为卡奇霉素的N-酰基衍生物或卡奇霉素的二硫化物类似物。所述化合物的二氢衍生物描述于美国专利第5,037,651号中且N-酰基化衍生物描述于美国专利第5,079,233号中。也适用于本发明的相关化合物包括描述于美国专利第4,675,187、4,539,203、4,554,162和4,837,206号中的埃拉霉素(esperamicin)。所有所述化合物含有可与适当硫醇反应形成二硫化物并在同时引入诸如酰肼或类似亲核基团的甲基三硫化物。上述专利引文中的所有信息是以引用的方式并入本文中。使用本发明的两种化合物γ二甲基酰肼和N乙酰基γ二甲基酰肼公开于美国专利第5,053,394号中且展示于美国专利第5,877,296号中的表1中。
优选地，在本发明的内容中，所述卡奇霉素衍生物为N乙酰基γ卡奇霉素二甲基酰肼(N乙酰基卡奇霉素DMH)。N乙酰基卡奇霉素DMH比当前使用的大多数细胞毒性化疗剂至少有效10至100倍。其高效能使其成为用于抗体靶向疗法的理想候选物，由此使抗肿瘤活性最大化同时降低正常器官和组织的非特异性暴露。
因此，在一个实施例中，本发明的结合物具有下式的结构：
Pr(—X—W)m
其中：
Pr为IgG1抗体；
X为包含可与所述IgG1抗体反应的任何反应基团的产物的连接子；
W为来自卡奇霉素家族的细胞毒性药物；
m为经纯化结合产物的平均负载量从而卡奇霉素构成结合物的3-9重量％；且
(-X-W)m为细胞毒性药物衍生物。
优选地，X具有下式的结构：
(CO-Alk1-Sp1-Ar-Sp2-Alk2-C(Z1)＝Q-Sp)，
其中：
Alk1和Alk2独立地为键或分枝或未分枝的(C1-C10)亚烷基链；
Sp1为键、-S-、-O-、-CONH-、-NHCO-、-NR-、-N(CH2CH2)2N-或-X-Ar-Y-(CH2)n-Z，其中X、Y和Z独立地为键、-NR-、-S-或-O-，其限制条件为当n＝0时，则Y和Z中的至少一个必须为键且Ar为视情况经(C1-C5)烷基、(C1-C4)烷氧基、(C1-C4)硫代烷氧基、卤素、硝基、-COOR、-CONHR、-(CH2)nCOOR、-S(CH2)nCOOR、-O(CH2)nCONHR或-S(CH2)nCONHR中的至少一个、两个或三个基团取代的1，2-、1，3-或1，4-亚苯基，其限制条件为当Alk1为键时，Sp1为键；
n为0至5的整数；
R为视情况经-OH、(C1-C4)烷氧基、(C1-C4)硫代烷氧基、卤素、硝基、(C1-C3)二烷基氨基或(C1-C3)三烷基铵-A中的一个或两个基团取代的分枝或未分枝的(C1-C5)链，其中A是完成盐的医药上可接受的阴离子；
Ar为视情况经(C1-C6)烷基、(C1-C5)烷氧基、(C1-C4)硫代烷氧基、卤素、硝基、-COOR、-CONHR、-(CH2)nCOOR、-S(CH2)nCOOR、-O(CH2)nCONHR或-S(CH2)nCONHR中的一个、两个或三个基团取代的1，2-、1，3-或1，4-亚苯基，其中n和R如上文所定义或为1，2-、1，3-、1，4-、1，5-、1，6-、1，7-、1，8-、2,3-、2,6-或2,7-亚萘基或
其中各亚萘基或吩噻嗪视情况经(C1-C6)烷基、(C1-C5)烷氧基、(C1-C4)硫代烷氧基、卤素、硝基、-COOR、-CONHR、-(CH2)nCOOR、-S(CH2)nCOOR或-S(CH2)nCONHR中的一个、两个、三个或四个基团取代，其中n和R如以上定义，其限制条件为当Ar为吩噻嗪时，Sp1为仅连接于氮的键；
Sp2为键、-S-或-O-，其限制条件为当Alk2为键时，Sp2为键；
Z1为H、(C1-C5)烷基或视情况经(C1-C5)烷基、(C1-C5)烷氧基、(C1-C4)硫代烷氧基、卤素、硝基、-COOR、-ONHR、-O(CH2)nCOOR、-S(CH2)nCOOR、-O(CH2)nCONHR或-S(CH2)nCONHR中的一个、两个或三个基团取代的苯基，其中n和R如以上所定义；
Sp为直链或支链二价或三价(C1-C18)基团、二价或三价芳基或杂芳基、二价或三价(C3-C18)环烷基或杂环烷基、二价或三价芳基-或杂芳基-芳基(C1-C18)基团、二价或三价环烷基-或杂环烷基-烷基(C1-C18)基团或者二价或三价(C2-C18)不饱和烷基，其中杂芳基优选地为呋喃基、噻吩基、N-甲基吡咯基、吡啶基、N-甲基咪唑基、噁唑基、嘧啶基、喹啉基、异喹啉基、N-甲基肼甲酰基、氨基香豆素基或吩嗪基，且其中如果Sp为三价基团，则Sp可另外经低碳数(C1-C5)二烷基氨基、低碳数(C1-C5)烷氧基、羟基或低碳数(C1-C5)烷硫基取代；且
Q为＝NHNCO-、＝NHNCS-、＝NHNCONH-、＝NHNCSNH-或＝NHO-。
优选地，为分枝或未分枝(C1-C10)亚烷基链；Sp为键、-S-、-O-、-CONH-、-NHCO-或-NR，其中R如上文所定义，其限制条件为当Alk1为键时，Sp1为键；
Ar为视情况经(C1-C6)烷基、(C1-C5)烷氧基、(C1-C4)硫代烷氧基、卤素、硝基、-COOR、-CONHR、-(CH2)nCOOR、-S(CH2)nCOOR、-O(CH2)nCONHR或-S(CH2)nCONHR中的一个、两个或三个基团取代的1，2-、1，3-或1，4-亚苯基，其中n和R如上文所定义，或者Ar为各自视情况经(C1-C6)烷基、(C1-C5)烷氧基、(C1-C4)硫代烷氧基、卤素、硝基、-COOR、-CONHR、-(CH2)nCOOR、-S(CH2)nCOOR、-O(CH2)nCONHR或-S(CH2)nCONHR中的一个、两个、三个或四个基团取代的1，2-、1，3-、1，4-、1，5-、1，6-、1，7-、1，8-、2,3-、2,6-或2,7-亚萘基。
Z1为(C1-C5)烷基或视情况经(C1-C5)烷基、(C1-C5)烷氧基、(C1-C4)硫代烷氧基、卤素、硝基、-COOR、-CONHR、-O(CH2)nCOOR、-S(CH2)nCOOR、-O(CH2)nCONHR或-S(CH2)nCONHR中的一个、两个或三个基团取代的苯基。
Alk2和Sp2一起为键。
Sp和Q如以上所直接定义。
在本发明的方法中，将卡奇霉素优选地以IgG1抗体的约3至约9重量％且更优选地为IgG1抗体的约7重量％添加至反应中。
本发明的结合物利用与包括与IgG1抗体反应的任何反应基团的连接子衍生的细胞毒性药物卡奇霉素，将其用作形成细胞毒性药物衍生物-抗体结合物的蛋白载体靶向剂。以其全文并入本文中的美国专利第5,773,001、5,739,116和5,877,296号公开可与由卡奇霉素制备的尤其为酰肼的亲核性衍生物和相关亲核试剂一起使用的连接子。所述连接子尤其适用于其中当形成于药物和连接子之间的键联为可水解的时获得更佳活性的情形。所述连接子含有两个官能基。一个基团通常为用于与载体反应的羧酸。当适当激活时，所述酸性官能基可与载体的游离氨基形成酰胺键，所述游离氨基诸如抗体或其他蛋白载体的赖氨酸的侧链中的胺。另一官能基通常为将与经适当修饰的治疗剂反应的羰基，意即醛或酮。所述羰基可与药物上的酰肼基反应形成腙键。这一键联为可水解的，允许在结合于靶细胞后从结合物释放治疗剂。优选地，所述可水解连接子为4-(4-乙酰基苯氧基)丁酸(AcBut)。
可使用N-羟基丁二酰亚胺(OSu)酯或其他经同等激活的酯产生经激活的卡奇霉素—可水解连接子衍生物。其他合适活化酯的实例包括NHS(N-羟基丁二酰亚胺)、磺基-NHS(磺化NHS)、PFP(五氟苯基)、TFP(三氟苯基)和DNP(二硝基苯基)。
可用于本发明的抗体的实例包括例如嵌合抗体、人源化抗体、灵长源化抗体、再表面化抗体、人类抗体和其生物活性片段的单克隆抗体(mAb)。除非另外说明，否则如本文所用的术语抗体广泛用于提及抗体分子和多种抗体衍生分子。所述抗体衍生分子包含至少一个可变区(重链或轻链可变区)且包括诸如Fab片段、F(ab′)2片段、Fd片段、Fabc片段、Sc抗体(单链抗体)、双功能抗体、个别抗体轻单链、个别抗体重链、抗体链和其他分子之间的嵌合融合体等等的分子。
优选地，本发明的IgG1抗体是针对表达于靶细胞及/或诸如癌症的增生性病症中的组织上的细胞表面抗原。在一个实施例中，所述IgG1抗体是抗Lewis Y抗体。Lewis Y是具有结构Fucαl→2Galβ1→4[Fucαl→3]GIcNacβ1→3R的碳水化合物抗原(Abe等人(1983)J.Biol.Chem.，258 11793-11797)。Lewis Y抗原表达于60％至90％的人类上皮肿瘤(包括乳腺、结肠、肺和前列腺的上皮肿瘤)表面上(其至少40％过量表达这一抗原)且在正常组织中表达有限。
为靶向Ley且有效靶向肿瘤，理想地需要对所述抗原具有独占特异性的抗体。因此，本发明的抗Lewis Y抗体优选地不与1型结构(意即血型的乳糖系列(Lea和Leb))交叉反应且优选地不结合如Lex的其他2型抗原决定部位(意即新乳糖结构)和H-2型结构。
在过去数十年中，已经产生若干种识别Ley的抗体。但是其大多数展示与Lex和2型H抗原结构的交叉反应性(Furokawa，K.，等人723-732)。优选抗Lewis Y抗体的实例特指hu3S193(参见美国专利第6,310,185、6,518,415、5,874,060号，以其全文并入本文中)。抗Lewis Y抗体的其他实例(例如欧洲专利第0 285 059号、美国专利第4,971,792和5,182,192号)包括当前评估为SGN-15中的阿霉素结合物的单克隆抗体BR96(例如美国专利第5,980,896号)、为含有源自绿脓杆菌(Pseudomonas Aeruginosa)外毒素A(PE)的38 kD毒性元件的重组的经二硫键稳定的抗Lewis Y IgGK免疫毒素的LMB-9的单克隆抗体(B3(dsFv)PE38)(例如美国专利第5,980,895号)和IGN311人源化抗体(例如欧洲专利第0 528 767号和美国专利第5,562,903号)。
人源化抗体hu3S193(Attia，M.A.，等人1787-1800)是通过CDR接枝从3S193产生，其为对抗腺癌细胞而产生的对具有特别特异性的鼠类单克隆抗体(Kitamura，K.，12957-12961)。Hu3S193不仅保持3S193对Ley的特异性，而且也获得介导补体依赖性细胞毒性(后文称为CDC)和抗体依赖性细胞毒性(后文称为ADCC)的能力(Attia，M.A.，等人1787-1800)。这一抗体在裸鼠中以Ley表达异种移植物为靶点，如由用以125I、111In或18F或诸如111In、99mTc或90Y的其他需要螯合剂的放射性标记物标记的hu3S193进行的生物分布研究所证明(Clark,等人4804-4811)。
本发明基于鼠类单克隆抗体的CDR区可被剪接为人类受体框架从而产生对Lewis Y抗原具有特异性的人源化重组抗体的发现而提供众多对Lewis Y抗原具有特异性的人源化抗体。CDR可使用所属领域中已知的任何惯用术语定义，诸如Kabat编号系统、Chothia编号系统或者AbM定义，其为由牛津分子AbM抗体模型软件(Oxford Molecular′s AbMantibody modeling software)使用的Kabat和Chothia之间的折衷。特对而言，本发明的优选实施例为具有优良抗原结合特性的例示性人源化抗体分子。用于产生对Lewis Y抗原具有特异性的人源化重组抗体的方案陈述于以其全文并入本文中的美国专利第6,518,415号中。如先前所讨论，在本发明的优选实施例中，人源化Lewis Y特异性抗体的CDR是来源于鼠类抗体3S193。
当将CDR接枝时，可考虑所述CDR来源的供体抗体的类别/类型使用任何适当受体可变区框架序列，包括小鼠、灵长类动物和人类框架区。可用于本发明的人类框架的实例为KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY和POM(Kabat等人Seq.of Proteins ofImmunol.Interest，1：310-334(1994))。举例而言，KOL和NEWM可用于重链，REL可用于轻链且EU、LAY和POM可用于重链和轻链。
在实践中，为产生保持原始鼠类抗体的特异性的有效人源化抗体，通常简单替换CDR并不足够。需要在人类可变区框架中包括少量关键鼠类抗体残基。这些残基的一致性取决于原始鼠类抗体和受体人类抗体的结构。因此，本文所述的人源化抗体含有一些为保持供体单克隆抗体的结合特异性而需要的受体抗体(意即人类)重链及/或轻链可变域框架区的改变。换句话说，本文所述的人源化抗体的一些实施例的框架区并不必需由天然产生的人类抗体可变区的框架区的精确氨基酸序列组成，但含有提高对相同靶点与鼠类抗体一样具有特异性的人源化抗体区的结合特性的各种取代。对框架区进行最少数量的取代以避免大规模引入非人类框架区并确保人源化抗体的最小免疫原性。因此在本发明的内容中，优选抗Lewis Y抗体为hu3S193和G193。
在一个实施例中，本发明的抗体分子的变异体是针对Lewis Y且展示对Lewis Y的提高的亲和力。所述变异体可通过多种亲和力成熟方案获得，包括突变CDR(Yang等人，J.Mol.Biol.， 254，392-403，1995)、使用大肠杆菌(E.coli)的突变株(Marks等人，Bio/Technology， 10，779-783，1992)、DNA改组(Patten等人，Curr.Opin.Biotechnol.，8，724-733，1997)、噬菌体呈现(Thompson等人，J.Mol.Biol.， 256，77-88，1996)和PCR(Crameri等人，Nature， 391，288-291，1998)。
本发明的人源化抗体可通过多种适用于产生多肽的方法产生，例如活体外合成、重组DNA生产等等。优选地。人源化抗体通过重组DNA技术产生。因此本发明的人源化Lewis Y特异性抗体通过使用DNA技术的重组蛋白表达方法产生。操作DNA(例如多核苷酸)的技术对于分子生物学领域的一般技术人员是熟知的。所述熟知技术的实例可见于Molecular Cloning：A Laboratory Manual第二版，Sambrook等人，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)。用于重组表达免疫球蛋白(包括人源化免疫球蛋白)的技术也可另外见于Goeddel等人，Gene Expression Technology Methods in Enzymology,第185卷，AcademicPress(1991)和Borreback，Antibody Engineering，W.H.Freeman(1992)。其他关于重组抗体的产生、设计和表达的信息可见于Mayforth，Designing Antibodies，Academic Press，SanDiego(1993)。常规分子生物学技术的实例包括但不限于活体外连接、限制内切酶消化、PCR、细胞转化、杂交、电泳、DNA测序等等。
用于构造本发明的载体的一般方法、产生本发明的宿主细胞的细胞转染、产生本发明的抗体的细胞培养均为常规分子生物学方法。同样，一旦产生，本发明的重组抗体可通过所属领域的标准程序纯化，包括横流过滤、硫酸铵沉淀、亲和柱色谱、凝胶电泳、透滤等等。用于表达重组抗体的宿主细胞可为诸如大肠杆菌的细菌细胞或者优选地为真核细胞。优选地使用诸如PER.C.6细胞或中华仓鼠卵巢细胞(CHO)的哺乳动物细胞。表达载体的选择依赖于宿主细胞的选择，且表达载体经选择以在选定宿主细胞中具有所需表达和调控特征。
使用特定共溶剂、添加剂和特定反应条件连同分离方法使得形成LCF显著降低的单体细胞毒性药物衍生物抗体结合物。不同于聚集形式的结合物的单体形式具有重要的治疗价值，且使LCF最小和大体上降低聚集使得可通过防止LCF与更高结合部分(HCF)竞争而以治疗上有意义的方式利用抗体起始材料。
在本发明的内容中，单体细胞毒性药物结合物是指共价连接于任何数量的卡奇霉素分子而无显著抗体聚集的单个抗体。共价连接于抗体的卡奇霉素部分的数量也指药物负载量。举例而言，根据本发明，平均药物负载量可为每抗体0.1至10或15之间任何值的卡奇霉素部分。就药物负载量而言结合物的给定群体(例如在组合物或调配物中)可为异质或均质的。在已知群体中，由于平均负载量表示结合于抗体的药物分子(或摩尔)的平均数，所以每抗体中药物部分的实际数量可大体上变化。在给定群体中具有未结合或显著不足结合抗体的抗体百分比被称为低结合部分或LCF。
发现与非亲核性、蛋白相容性的缓冲溶液一起使用脱氧胆酸通常产生具有优良活性的具有较高药物负载量/产率和降低的聚集作用的单体细胞毒性药物衍生物/载体结合物。用于由N-羟基丁二酰亚胺(OSu)酯或其他同等激活的酯制备的结合物的优选缓冲溶液为磷酸盐缓冲盐水(PBS)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N-(4-丁磺酸)(HEPBS)或N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸(HEPES缓冲液)。用于所述结合反应中的缓冲溶液不能含有游离胺或亲核试剂。所属领域的技术人员易于确定用于其他类型的结合物的可接受的缓冲剂。
有效形成单体结合物所需要的添加剂的量也根据抗体与抗体的不同而变化。此量也可由所属领域的一般技术人员确定而无需过度实验。在本反应中，抗体的浓度可在1至15mg/ml的范围内且卡奇霉素衍生物(例如N-乙酰基γ卡奇霉素DMH AcBut OSu酯)的浓度以抗体的重量计在约3-9％的范围内。
或者共溶剂可为乙醇，其中可在6至11.4％(以体积计)范围内的浓度下证明良好结果。所述反应可在PBS、HEPES、N-(2-羟乙基)哌嗪-N-(4-丁磺酸)(HEPBS)或其他相容缓冲剂中在约7至约9(优选8至9)的pH下在约25℃至约40℃(优选约30℃至约35℃)范围内的温度下进行并进行15分钟至24小时范围内的时间。更优选地，所述反应在约8.2的pH下进行。所属领域的技术人员易于确定用于其他类型的结合物的可接受的pH。对于各种抗体，发现前述添加剂组合中的轻微改变提高药物负载量和单体结合物产率，且应了解任何特定抗体可需要精确条件或者添加剂选择中的一些较小更改以实现最佳结果。
结合后，可将单体结合物从未结合反应物(诸如蛋白载体分子/抗体和游离细胞毒性药物/卡奇霉素)及/或结合物的聚集形式中纯化出来。可使用用于纯化的常规方法，例如尺寸排除色谱(SEC)、疏水相互作用色谱(HIC)、离子交换色谱(IEC)、色谱聚焦(CF)。在例如色谱分离后，可将结合物超滤及/或透滤。
经纯化的结合物为单体且通常含有3至9重量％的细胞毒性药物/卡奇霉素。在优选实施例中，使用HIC纯化结合物。当细胞毒性药物具有高疏水特性(诸如卡奇霉素衍生物)且用于结合物中时，HIC为提供结合和未结合抗体的有效分离的优选候选方法。HIC相对于SEC呈现三个关键优势：(1)其具有有效降低LCF含量以及聚集体的能力；(2)HIC的柱加载容量相当高；和(3)HIC避免产物的过分稀释。适于生产规模用途的诸如丁基、苯基和辛基琼脂糖凝胶4 Fast Flow(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)的多种高容量HIC介质可在结合过程后将未结合和结合物聚集体与单体结合组份有效分离。
优选地，使用具有加载的丁基琼脂糖凝胶FF树脂和0.60M磷酸钾的洗涤缓冲液以及20mM/25mM NaCl的洗提缓冲液进行HIC。同样优选地，使用再生纤维素膜进行超滤且使用10透滤体积的20mM Tris/10mM NaCl缓冲液在pH8.0下进行透滤。
因此，根据本发明的方法，在纯化步骤后，结合物的平均负载量为每摩尔IgG1抗体约5至约7摩尔卡奇霉素。此外，在纯化步骤后，结合物的低结合部分(LCF)小于约10％。
本发明也提供由所述方法制备的结合物。所述结合物优选地保持裸抗体的结合动力学和特异性。因而，本发明的结合物优选地具有如由BIAcore分析所测定的约100至400nM，优选地3.4×10-7M的KD，结合Lewis Y抗原且并不结合Lewis X和H-2血型抗原，具有细胞毒性活性及/或具有抗肿瘤活性。举例而言，可使用诸如FACS或BIAcore分析的任何已知方法测定结合物的结合动力学和特异性。
由本发明的方法制备的优选卡奇霉素结合物为共价连接于可水解连接子4-(4-乙酰基苯氧基)丁酸(AcBut)、共价连接于抗-Lewis Y抗体G193(另外被称为CMD-193或CMD)的N-乙酰基γ卡奇霉素二甲基酰肼(N-乙酰基卡奇霉素DMH)，其中卡奇霉素结合物的平均负载量为每摩尔抗体约5至约7摩尔卡奇霉素且所述结合物的低结合部分(LCF)小于约10％。
本发明也提供包含共价连接于抗-Lewis Y抗体的卡奇霉素—可水解连接子连同医药上可接受的赋形剂、稀释剂或载体的组合物。因此，根据本发明的优选组合物包含共价连接于G193的N-乙酰基γ卡奇霉素二甲基酰肼—4-(4-乙酰基苯氧基)丁酸(N-乙酰基卡奇霉素DMH—AcBut)的结合物，其中平均负载量为每摩尔G193约5至约7摩尔N-乙酰基卡奇霉素DMH且所述结合物的低结合部分(LCF)小于约10％。
可使用人源化Lewis Y特异性抗体联接或连接于诸如人类或人源化单克隆抗体的其他抗体(或其部分)。所述其他抗体可与用于本发明的抗体所针对或对其具有不同选定特异性的疾病的其他标记(抗原决定部位)特征反应以将人类免疫系统的分子或细胞招募至患病细胞。可将本发明的抗体(或其部分)与所述抗体(或其部分)一起作为分别投予的组合物或作为与两种所连接的药剂的单一组合物由常规化学或分子生物学方法投予。此外，本发明的抗体的诊断和治疗价值可通过将所述人源化抗体以产生可检测信号(活体外或活体内)的标记物或以具有治疗特性的标记物标记而增加。例如放射性核素的一些标记物可产生可检测信号且具有治疗特性。放射性核素标记物的实例包括125I、131I、14C。其他可检测标记物的实例包括用于荧光显微法的诸如荧光素、藻胆蛋白或四乙基罗丹明(rhodamine)的荧光发色团、产生用于由荧光检测的荧光或有色产物的酶、产生用于由电子显微镜术证明的高电子密度产物的吸光可见颜色或凝集物；或者用于直接或间接电子显微镜观察的诸如铁蛋白、过氧化物酶或金珠的高电子密度分子。具有治疗特性的标记物包括用于治疗癌症的诸如氨甲喋呤等等的药物。
单体细胞毒性药物衍生物载体/结合物可为治疗或诊断组合物/调配物中的单一活性成份或者可伴随其他活性成份(例如化疗剂、激素治疗剂或如下所述的生物治疗剂)，其包括例如抗CD19、抗CD20、抗CD33、抗T细胞、抗IFN γ或抗LPS抗体的其他抗体成份或者诸如细胞激素、生长因子、激素、抗激素、细胞毒性药物和黄嘌呤的非抗体成份。
可向患者投予所述组合物/调配物以治疗癌症。根据本发明，向需要其的患者投予治疗有效量的卡奇霉素—抗Lewis Y抗体结合物、防冻剂、表面活性剂、缓冲剂和电解质的组合物或调配物。或者，使用所述组合物或调配物制造用于治疗癌症的药物。应了解，这一方法或药物可用于治疗具有以在细胞表面表达Lewis Y抗原为特征的增生性病症的任何患者。因此，在一个实施例中，所治疗的癌症为Lewis Y抗原阳性的。所述癌症优选地为表达大量Lewis Y抗原的癌症(意即高Lewis Y抗原表达肿瘤)。所治疗的癌症可为恶性肿瘤，且优选地为非小细胞肺癌(NSCLC)或乳癌或者为前列腺癌或结肠直肠癌。
优选地，可在任何其中希望降低细胞表达存在于用本文所公开的组合物或药物治疗的患者中的Lewis Y水平的疗法中应用hu3S193-AcBut-CM或CMD-193。特对而言，使用所述组合物或药物治疗具有在细胞表面上表达Lewis Y抗原的增生性病症(意即癌症)的人类或动物。这些表达Lewis Y的细胞可在体内循环或以不希望的大的数量定位于体内特定位点而存在。
本发明的治疗方法可与包括手术、放射、化疗、激素疗法、生物疗法、骨髓移植(对于白血病或其中需要高剂量化疗的其他癌症)的其他癌症治疗组合使用。新的治疗当前也正在开发且基于对癌症生物学了解的增加而得到认可。
存在两种一般类别的放射疗法且可用于本方法。在一种方法(短程治疗)中，将放射性同位素的直接移植物植入肿瘤以向所述区域递送浓缩剂量。在另一种方法(远距离疗法)中，使用射线束以将放射线递送至身体的较大区域或者以总体照射(TBI)递送至整个身体。
在本方法中可使用任何合适的化疗剂。所述化疗剂通常属于以下类别(各以实例例示)：抗代谢物(例如诸如氨甲喋呤的叶酸拮抗剂、诸如6-巯基嘌呤(6-MP)的嘌呤拮抗剂和诸如5-氟尿嘧啶(5-FU)的嘧啶拮抗剂)；烷基化剂(环磷酰胺)；DNA结合剂(顺铂或奥克赛铂(oxaliplatin))；抗肿瘤抗生素(阿霉素或米托蒽醌(mitoxantrone))；有丝分裂抑制剂(例如紫杉烷或诸如长春新碱的微管抑制剂)或拓扑异构酶抑制剂(喜树碱衍生物或紫杉酚)。以下描述更多特定实例。
与本方法相关的激素疗法包括例如用于白血病和骨髓瘤的皮质内固醇、用于乳癌的雌激素和抗雌激素和用于前列腺癌的雄激素和抗雄激素。
生物疗法使用来源于身体的物质。本方法中合适疗法的实例包括抗体(例如诸如西妥昔单抗(cetuximab)或曲妥珠单抗(trastuzumab)的抗EGFR抗体或者诸如贝伐单抗(bevacizumab)的抗VEGF抗体)、T细胞疗法、干扰素、白细胞介素和造血生长因子。
可使用骨髓移植治疗一些癌症，尤其为白血病。为治疗白血病，通过化学疗法或射线治疗破坏患者的骨髓细胞。随后将在细胞表面具有匹配或近似匹配HLA抗原的来自供体的骨髓引入患者。也使用骨髓移植替换需要极高剂量的射线或化学疗法以杀死肿瘤细胞的患者中的骨髓。基于供体源将移植物分类。在异源移植物中，骨髓供体通常并不在遗传上相关但在为由免疫系统识别的主要蛋白的六个细胞表面抗原中(HLA抗原)至少五个匹配。在自体移植中，患者在化学疗法或射线治疗后重新接受其自身的骨髓。这一类型的骨髓移植物可用于常规治疗剂量对其并不完全有效的非骨髓相关癌症。
此外，可用于本方法的新出现的方法(一些已认可或正在临床试验中)正基于对癌症和疾病进程的分子和细胞基础的了解增加而开发。可使用抑制磷酸化级联的蛋白激酶抑制剂(小分子和抗体)(例如埃罗替尼(erlotinib)或甲磺酸伊马替尼(imatinibmesylate))。可使用阻断癌细胞传播和新组织侵入的任何抗转移剂。可使用阻断为肿瘤提供营养的血管发育的抗血管生成剂(例如沙立度胺(thalidomide))。可使用的其他药剂为阻断引起肿瘤细胞增生的异常蛋白产生的反义寡核苷酸。也可使用基因疗法以将基因引入注射进患者并经设计以杀死特定肿瘤细胞的T细胞。同样，p53也可通过将正常p53基因引入突变癌细胞而成为靶点，例如重新建立对化疗药物的敏感性。
在一个实施例中，将本发明的组合物/调配物与生物活性剂组合使用。常用生物活性剂包括抗体、生长因子、激素、细胞激素、抗激素、黄嘌呤、白细胞介素、干扰素、细胞毒性药物和抗血管生成蛋白。
通常用以治疗诸如癌症的增生性病症并可与卡奇霉素—抗Lewis Y抗体结合物一起使用的生物活性细胞毒性药物包括：使用高达三天的诸如阿霉素、柔红霉素、黄胆素、阿克拉霉素、佐柔比星、米托蒽醌、表柔比星、卡鲁比星(carubicin)、诺加霉素、美诺利尔(menogaril)、皮鲁比星(pitarubicin)和伐鲁比星(valrubicin)的蒽环抗生素类；诸如阿糖胞苷、吉西他宾(gemcitabine)、三氟尿苷、环胞苷、伊诺他宾(enocitabine)、阿扎胞苷、去氧氟尿苷、戊糖苷、溴尿苷、卡西他宾(capecitabine)、克拉曲宾(cladribine)、地西他宾(decitabine)、氟尿苷、氟达拉宾(fludarabine)、谷氏菌素、嘌呤霉素、喃氟啶、噻唑呋啉(tiazofurin)的嘧啶或嘌呤核苷；诸如环磷酰胺、美法仑(melphalan)、硫替派(thiotepa)、异环磷酰胺(ifosfamide)、卡氮芥(carmustine)、顺铂(cisplatin)、CKD-602、左多黄酮(ledoxantrone)、鲁比特康(rubitecan)、拓朴替康盐酸盐(topotecanhydrochloride)、LE-SN38、阿非替康盐酸盐(afeletecan hydrochloride)、XR-11576和XR-11612的烷基化剂；诸如氨甲喋呤、5氟尿嘧啶、喃氟啶/尿嘧啶(UFT)、雷替曲噻(ralititrexed)、卡西他宾、甲酰四氢叶酸(leucovorin)/UFT、S-1、培美曲噻钠(pemetrexeddisodium)、特西他宾(tezacitabine)、三甲曲沙葡糖醛酸盐(trimetrexate glucuronate)、胸甲他新(thymectacin)、地西他宾的抗代谢物；诸如依决洛单抗(edrecolomab)、丝裂霉素、丝裂霉素C和奥克赛铂的抗肿瘤抗体；诸如长春新碱、长春碱、长春瑞宾(vinorelbine)、脱水长春瑞宾(anhydrovinblastine)的长春花碱；诸如丁二酸凡塔籃尼(vatalanib succinate)、奥鲁凡尼(oglufanide)、RPI-4610的血管生成抑制剂；诸如吉非替尼(gefitinib)、317615.2 HCL、因地苏拉(indisulam)、拉帕替尼(lapatinib)、索拉芬尼(sorafenib)、WHI-P131的信号转导抑制剂；诸如阿伐西地盐酸盐(alvocidibhydrochloride)、伊洛福芬(irofulven)、苯基丁酸钠、硼替佐米(bortezomib)、伊西苏林(exisulind)、MS-2167的细胞凋亡诱发剂；诸如足叶乙甙的表鬼臼脂素；和诸如紫杉醇、doceltaxel、DHA-紫杉醇、ixabepilone、聚谷氨酸紫杉醇或艾普塞隆的紫杉烷。
可与hu3S193-AcBut-CM或CMD-193或AG G193-AcBut-CM组合投予的其他化疗/抗赘生剂包括阿霉素、顺铂、卡波铂、环磷酰胺、氮烯唑胺(dacarbazine)、异环磷酰胺、去乙酰长春酰胺、吉西他宾、伊达曲沙(edatrexate)、硫替派、氟鲁利定(fluxuridine)(FUDR)、MeCCNU、长春碱、长春新碱、米托蒽醌、博莱霉素、氮芥、泼尼松、甲基苄肼氨甲喋呤、氟尿嘧啶、足叶乙甙、紫杉酚和其各种类似物、丝裂霉素、沙立度胺和其各种类似物、GBC-590、曲沙他宾、ZYC-300、TAU、(R)氟比洛芬(flurbiprofen)、组胺盐酸盐、tariquidar、davanat-1、ONT-093。可与所述治疗剂中的一种或一种以上同时投予或者与所述治疗剂中的一种或一种以上按顺序投予。
可与本发明的抗体结合物一起投予的生物活性抗体包括但不限于赫赛汀(Herceptin)、泽伐林(Zevalin)、Bexxar、坎帕斯(Campath)、西妥昔单抗、贝伐单抗、ABX-EGF、MDX-210、帕妥珠单抗(pertuzumab)、曲妥珠单抗、I-131 ch-TNT-1/b、hLM609、6H9、CEA-Cide Y90、IMC-1C11、ING-1、斯洛珠单抗(sibrotuzumab)、TRAIL-R1 Mab、YMB-1003、2C5、givarex和MH-1。
也可单独投予所述卡奇霉素—抗Lewis Y抗体结合物或者与作为疗法部分的诸如生长因子、细胞激素、类固醇、诸如抗Lewis Y抗体、利妥昔单抗的抗体的其他生物活性剂和化疗剂的组合同时或连续投予。也可单独投予卡奇霉素—抗Lewis Y抗体结合物或者与以上鉴别的作为引导治疗期、巩固治疗期和维持治疗期的部分的疗法同时或连续投予。
本发明的结合物也可与作为用于治疗复发的侵入性癌症的组合化学疗法的部分的其他生物活性剂和化疗剂一起投予。所述疗法包括：CAP(环磷酰胺、阿霉素、顺铂)、PV(顺铂、长春碱或去乙酰长春酰胺)、CE(卡波铂、足叶乙甙)、EP(足叶乙甙、顺铂)、MVP(丝裂霉素、长春碱或去乙酰长春酰胺、顺铂)、PFL(顺铂、5-氟尿嘧啶、甲酰四氢叶酸)、IM(异环磷酰胺、丝裂霉素)、IE(异环磷酰胺、足叶乙甙)；IP(异环磷酰胺、顺铂)；MIP(丝裂霉素、异环磷酰胺、顺铂)、ICE(异环磷酰胺、卡波铂、足叶乙甙)；PIE(顺铂、异环磷酰胺、足叶乙甙)；Viorelbine和顺铂；卡波铂和紫杉醇；CAV(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱)、CAE(环磷酰胺、阿霉素、足叶乙甙)；CAVE(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、足叶乙甙)；EP(足叶乙甙、顺铂)；CMCcV(环磷酰胺、氨甲喋呤、Lomustine、长春新碱)；CMF(环磷酰胺、氨甲喋呤、5-氟尿嘧啶)；CAF(环磷酰胺、阿霉素、5-氟尿嘧啶)；CEF(环磷酰胺、表柔比星、5-氟尿嘧啶)；CMFVP(环磷酰胺、氨甲喋呤、5-氟尿嘧啶、长春新碱、泼尼松)；AC(阿霉素、环磷酰胺)；VAT(长春碱、阿霉素、硫替派)；VATH(长春碱  阿霉素、硫替派、Fluosymesterone)；CDDP+VP-16(顺铂、足叶乙甙、丝裂霉素C+长春碱)。
本发明也提供治疗患有增生性病症或者有增生性病症风险的人类或动物患者的方法，所述病症特征为细胞表达Lewis Y，所述方法包含向患者投予有效量的本发明的卡奇霉素—抗Lewis Y抗体结合物。应了解，就治疗而言，其意谓抑制、预防或减缓癌症生长，其包括延缓肿瘤生长且抑制转移。
本发明的组合物/调配物可作为第二线单独疗法投予。就第二线而言，其意谓在以不同抗癌疗法治疗后使用本发明的组合物/调配物，所述不同抗癌疗法的实例在以上描述。或者，所述组合物或调配物可作为与另一上述抗癌疗法的第一线组合物疗法投予。
可以多种方式向患者投予本发明的人源化抗体组合物。所述组合物的直接递送通常通过皮下、腹膜内、静脉内或肌肉内注射完成或递送至组织间隙空间。医药组合物可优选地非经肠投予，意即皮下、肌肉内或静脉内。也可将组合物投予至病变内。剂量治疗可为单剂量疗程或多剂量疗程。
因此，本发明提供用于非经肠投予的组合物/调配物，其包含人类抗体或其鸡尾酒疗法溶解于可接受载剂(优选地为水性载剂)中的溶液。举例而言，卡奇霉素—抗Lewis Y抗体结合物、防冻剂、表面活性剂、缓冲剂和电解质的调配物。
可使用多种水性载剂，例如水、经缓冲的水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸等等。所述溶液为无菌的且通常不含微粒物质。所述组合物可通过常规的熟知杀菌技术杀菌。当需要时所述组合物可含有医药上可接受的辅助物质以接近生理条件，诸如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠。在所述调配物中抗体的浓度可广泛变化，例如从小于约0.5％，通常在约0.1％或至少约0.1％至高达15或20重量％，且所述浓度最初会基于液体体积和黏度而选择，例如根据所选特定投予模式。
应了解，所述组合物中的活性成份为抗Lewis Y抗体—卡奇霉素结合物。因此，其易于在胃肠道中降解。因此，如果将通过使用胃肠道的途径投予所述组合物，则所述组合物需要含有保护蛋白载体不受降解但在结合物从胃肠道吸收后将其释放的药剂。
用于制备可非经肠投予的组合的实际方法和投予至患者所需的调节对于所属领域的技术人员而言是已知和显而易见的，且更详细描述于例如Remingtons PharmaceuticalScience，第15th版，Mack Publishing Company，Easton，Pa.(1980)(其以引用的方式并入本文中)中。医药上可接受载体的全面讨论可见于Remingtons Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company，N.J.1991)中。
组合物可个别投予至患者或可与其他药剂、药物或激素组合投予。可用于治疗诸如癌症的增生性病症且可与本发明的细胞毒性药物衍生物/载体结合物一起使用的细胞激素和生长因子包括干扰素、诸如白细胞介素2的白细胞介素、TNF、CSF、GM-CSF和G-CSF。通常用于治疗诸如癌症的增生性病症且可与本发明的细胞毒性药物衍生物/载体结合物一起使用的激素包括雌激素(乙烯雌酚、雌二醇)、雄激素(睾酮、氟羟甲睾酮)、孕激素(美可治(Megace)、甲孕酮)和皮质内固醇(泼尼松、地塞米松、氢化可的松)。诸如抗雌激素(他莫西芬(tamoxifen))、抗雄激素(氟他米特(flutamide))和抗肾上腺剂的抗激素通常用于治疗诸如癌症的增生性病症且可与本发明的细胞毒性药物衍生物/载体结合物一起使用。
此外，通常用于治疗诸如癌症的增生性病症且可与本发明的细胞毒性药物衍生物/载体结合物一起使用的化疗剂/抗赘生剂包括但不限于阿霉素(Adriamycin)、顺铂、卡波铂、长春碱、博莱霉素、氨甲喋呤、阿霉素(doxorubicin)、氟尿嘧啶、足叶乙甙、紫杉酚和其各种类似物、丝裂霉素、沙立度胺和其各种类似物。
所述医药组合物/调配物应优选地包含治疗有效量的本发明的结合物。如本文所用的术语治疗有效量是指治疗、改善或预防目标疾病或病状或者展现可检测的治疗或预防效应所需的治疗剂的量。对于任何结合物而言，最初可在细胞培养检定或在动物模型中，通常在啮齿动物、兔、犬、猪或灵长类动物中估算治疗有效剂量。也可使用动物模型确定适当浓度范围和投药途径。接着可使用所述信息确定人类中的适用剂量和投药途径。
用于人类患者中的精确有效量也取决于疾病状态的性质和严重性、患者的一般健康状况、患者的年龄、体重和性别、饮食、投药时间和频率、药物组合、反应敏感性和对疗法的耐受性/反应。如果正预防性使用所述结合物治疗现有病状，则其也将影响有效量。此量可由常规实验确定并由临床医师判断。通常，以蛋白载体计，有效量为0.01mg/m2至50mg/m2，优选地为0.1mg/m2至20mg/m2，更优选地为约10-15mg/m2。
给药频率将取决于结合物的半衰期和其效应的持续时间。如果所述结合物具有短的半衰期(例如2至10小时)，则可需要每天给药一次或一次以上。或者，如果所述结合物分子具有长的半衰期(例如2至15天)，则可仅需要每天给药一次，每周一次或者甚至每1或2月一次。
组合物也可含有用于投予所述抗体结合物的医药上可接受的载剂。医药载剂可为任何适于将单克隆抗体递送至患者的相容性非毒性物质。无菌水、醇、脂肪、蜡和惰性固体可包括于所述载剂中。所述载剂本身应不诱导产生对接受所述组合物的个体有害的抗体且不应具有毒性。合适载剂可为大的代谢缓慢的大分子，诸如蛋白质、多肽、脂质体、多醣、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和非活性病毒颗粒。医药上可接受的佐剂(缓冲剂、分散剂)也可并入所述医药组合物中。
也可使用医药上可接受的盐，例如诸如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐和硫酸盐的无机酸盐或者诸如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐和苯甲酸盐的有机酸盐。
在治疗组合物/调配物中的医药上可接受的载剂可另外含有诸如水、盐水、甘油和乙醇的液体。诸如湿润剂或乳化剂或者pH调节物质的辅助物质也可存在于所述组合物中。所述载剂使得所述组合物能够被调配为用于由患者摄取的锭剂、药丸、糖衣药丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液和悬浮液。
用于投药的优选形式包括适于例如通过注射或灌输(例如通过快速注射或连续灌输)而非经肠投药的形式。当将产物用于注射或灌输时，其可采用于油性或水性媒剂中的悬浮液、溶液或乳液的形式，且其可含有调配剂，诸如悬浮剂、防腐剂、稳定剂及/或分散剂。
尽管经缓冲的结合物溶液具有足够的短期稳定性，但其长期稳定性不良。为增强所述结合物的稳定性且增加其储存期，可将抗体-药物结合物冻干为干燥形式，在使用前用适当无菌液体重构。与冻干蛋白溶液相关的问题已经充分记录。在冷冻和干燥过程期间可出现二级、三级和四级结构的丢失。使其在溶液中与防冻剂、表面活性剂、缓冲剂和电解质接触并随后将所述溶液冻干可保持所述组合物/调配物的生物活性。也可将低温保护剂添加至所述溶液中。
稳定调配物为其中在储存后其中的抗体基本上保持其物理和化学稳定性以及完整性的调配物。用于测量抗体稳定性的各种分析技术可用于所属领域且在Peptide andProtein Drug Delivery，247-301，Vincent Lee Ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y，Pubs.(1991)和Jones，A.Adv.Drug Delivery Rev.10：29-90(1993)中回顾。稳定性可在选定温度下历时选定时期测量。对于快速筛检，可将调配物保持于40℃下历时2周至1月，在其时测量稳定性。若将调配物储存于2-8℃，通常所述调配物应在30℃至40℃下稳定至少1月及/或在2-8℃下稳定至少2年。若将调配物储存于30℃，通常所述调配物应在30℃下稳定至少2年及/或在40℃下稳定至少6月。冻干和储存后的聚集程度可用作抗体稳定性的指示。举例而言，稳定调配物可为其中少于约10％且优选地少于约5％的抗体在所述调配物中作为聚集体存在。在其他实施例中，可测定冻干和储存所述冻干调配物后聚集体形成的任何增加。举例而言，稳定冻干调配物可为其中当将冻干调配物在2-8℃下储存至少一年时冻干调配物中聚集体的增加少于约5％且优选地少于约3％的调配物。此外，抗体调配物的稳定性可使用生物活性检定来测量。
可必须包括防冻剂以充当结合物的非晶形稳定剂且在冻干过程期间保持蛋白的结构完整性。在一个实施例中，适用于本发明的防冻剂为诸如醛醇、甘露醇、山梨糖醇、肌醇、聚乙二醇和其组合的糖醇。在另一实施例中，所述防冻剂为糖酸，包括醛糖酸、糖醛酸、糖二酸和其组合。
本发明的防冻剂也可为碳水化合物。合适的碳水化合物为含有两个或两个以上羟基的醛或酮化合物。所述碳水化合物可为环状或线性的且包括例如醛糖、酮糖、氨基糖、醛醇、肌醇、醛糖酸、糖醛酸或糖二酸或其组合。所述碳水化合物也可为单、二或多聚碳水化合物，诸如二糖或多糖。合适的碳水化合物包括例如甘油醛、阿拉伯糖、来苏糖、戊糖、核糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、己糖、艾杜糖、甘露糖、塔罗糖、庚糖、葡萄糖、果糖、葡糖酸、山梨糖醇、乳糖、甘露醇、甲基α-葡萄哌喃糖苷、麦芽糖、异抗坏血酸、抗坏血酸、内酯、山梨糖、葡糖二酸、赤藓糖、苏阿糖、阿拉伯糖、阿洛糖、阿卓糖、古洛糖、艾杜糖、塔罗糖、赤藓酮糖、核酮糖、木酮糖、阿洛酮糖、塔格糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖酸、葡糖二酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸、葡糖胺、半乳糖胺、蔗糖、海藻糖或神经胺糖酸或其衍生物。合适的多聚碳水化合物包括例如阿拉伯聚糖、果聚糖、脱氧半乳聚糖、半乳聚糖、聚半乳糖醛酸、葡聚糖、甘露聚糖、木聚糖(诸如菊糖)、左聚糖、岩藻依聚糖、角叉藻聚糖、galactocarolose、果胶、果胶酸、直链淀粉、支链淀粉、糖原、胶淀粉、纤维素、右旋糖、石脐素、几丁质、琼脂糖、角质素、软骨素、皮肤素、透明质酸、褐藻酸、三仙胶或淀粉。其中尤其适用的碳水化合物是蔗糖、葡萄糖、乳糖、海藻糖和其组合。蔗糖为尤其适用的防冻剂。
优选地，本发明的防冻剂为碳水化合物或糖醇，其可为多羟基醇。多羟基化合物为含有多于一个羟基的化合物。所述多羟基化合物优选地为线性的。合适的多羟基化合物包括例如诸如乙二醇、聚乙二醇和聚丙二醇的二醇、甘油或季戊四醇或其组合。在一些优选实施例中，防冻剂为蔗糖、海藻糖、甘露醇或山梨糖醇。在另一实施例中，所述防冻剂是在约1.5％至约6重量％的浓度下。优选地，所述防冻剂是约5％浓度的蔗糖。
已发现需要向预冻干调配物添加表面活性剂。或者或此外，可将表面活性剂添加至经冻干的调配物及/或重构调配物中。例示性表面活性剂包括非离子性表面活性剂，诸如聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20或80)；帕洛沙姆(例如帕洛沙姆188)；Triton；十二烷基磺酸钠(SDS)；月桂基磺酸钠；辛基糖苷钠；月桂基-、肉豆蔻基-、亚油基-或硬脂基-磺基甜菜碱；月桂基-、肉豆蔻基-、亚油基-或硬脂基-肌氨酸；亚油基-、肉豆蔻基-或鲸蜡基-甜菜碱；月桂酰胺丙基-、可可酰胺丙基-、亚油酰胺丙基-、肉豆蔻酰胺丙基-、棕榈酰胺丙基-或异硬脂酰胺丙基-甜菜碱(例如月桂酰胺丙基)；肉豆蔻酰胺丙基-、棕榈酰胺丙基-或异硬脂酰胺丙基-二甲胺；甲基可可基牛磺酸钠或甲基油基牛磺酸二钠；和MONAQUATTM系列(Mona Industries，Inc.，Paterson，N.J.)、聚乙二醇、聚丙二醇和乙二醇与丙二醇的共聚物(例如Pluronics或PF68)以及吐温80。在一个实施例中，表面活性剂是在约0.005％至约0.05重量％的浓度下。在优选实施例中，所述表面活性剂是0.01重量％浓度的聚山梨醇酯80或约0.01重量％浓度的吐温80。
重构调配物为已经通过将冻干抗体调配物溶解于稀释剂中而制备从而所述抗体分散于重构调配物中的调配物。在本发明的某些实施例中，适于投予(例如非经肠投予)至欲用所关注的抗体治疗的患者的重构调配物可为适于皮下投予的调配物。
就等渗而言，其意谓所关注的调配物具有与人类血液基本上相同的渗透压力。等渗调配物通常具有约250至350mOsm的渗透压力。等渗性可例如使用蒸气压力或冰冻型渗压计测量。
也可将低温保护剂添加至预冻干调配物中。低温保护剂为当与所关注的抗体组合时在冻干和随后的储存后显著防止或降低所述抗体的化学及/或物理不稳定性的分子。例示性低温保护剂包括诸如蔗糖或海藻糖的糖；诸如谷氨酸单钠或组氨酸的氨基酸；诸如甜菜碱的甲基胺；诸如硫酸镁的易溶盐；诸如三羟基或高级糖醇的多元醇，例如甘油(glycerin)、赤藻糖醇、甘油(glycerol)、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露醇；聚丙二醇；聚乙二醇；Pluronic；和其组合。优选低温保护剂为非还原性糖，诸如海藻糖或蔗糖。
在优选实施例中，低温保护剂为诸如蔗糖或海藻糖的非还原性糖。预冻干调配物中低温保护剂的量通常为在重构后所得调配物为等渗的。但是高渗重构调配物也可为合适的。此外，低温保护剂的量不必太低从而在冻干后出现不可接受的量的抗体降解/聚集。如果低温保护剂为糖(诸如蔗糖或海藻糖)，预冻干调配物中的例示性低温保护剂浓度为约10mM至约400mM，且优选地为约30mM至约300mM，且最优选地为约50mM至约100mM。对于各抗体和低温保护剂组合，选择抗体与低温保护剂的比率。在糖(例如蔗糖或海藻糖)作为用于产生具有高抗体浓度的等渗重构调配物的低温保护剂的情况下，低温保护剂与抗体的摩尔比为约100至约1500摩尔低温保护剂比1摩尔抗体，且优选地为约200至约1000摩尔低温保护剂比1摩尔抗体，且更优选地为约200至约600摩尔低温保护剂比1摩尔抗体。
将低温保护剂以低温保护的量添加至预冻干调配物中，其意谓在低温保护量的低温保护剂存在下将抗体冻干后，抗体在冻干和储存后基本上保留其物理和化学稳定性和完整性。
本文所关注的稀释剂为医药上可接受(用于投予至人类安全且无毒)且适用于制备重构调配物的稀释剂。例示性稀释剂包括无菌水、用于注射的抑菌水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水溶液、林格氏溶液(Ringers solution)或右旋糖溶液。
防腐剂为可添加至稀释剂以减少重构调配物中的细菌活动从而例如有利于生产多用途重构调配物的化合物。潜在防腐剂的实例包括氯化十八烷基二甲基苄基铵、氯化六甲铵、氯化苄烷铵(其中烷基为长链化合物的氯化烷基苄基二甲基铵的混合物)和氯化苯甲乙氧铵。其他类型的防腐剂包括诸如苯酚、丁基和苄基醇、诸如对氧苯甲酸甲酯或对氧苯甲酸丙酯的烯丙基对氧苯甲酸酯、邻苯二酚、间苯二酚、环已醇、3-戊醇和间甲酚的芳族醇。本文最优选的防腐剂为苄基醇。
膨化剂为大量添加至冻干混合物中并帮助形成冻干块的物理结构(例如利于产生保持开放孔结构的基本上均一的冻干块)的化合物。例示性膨化剂包括甘露醇、甘氨酸、聚乙二醇和xorbitol。
在一些情形下，在制备预冻干调配物中使用低温保护剂(诸如蔗糖或海藻糖)和膨化剂(例如甘露醇或甘氨酸)的混合物。膨化剂可允许产生其中无过量孔穴的均一冻干块。因此，也可在冻干之前田间膨化剂。合适的膨化剂可具有约0.5至约1.5重量％的浓度。优选地，所述膨化剂为0.9重量％浓度的葡聚糖40或0.9重量％浓度的羟乙基淀粉40。
如果其他诸如描述于Remingtons Pharmaceutical Sciences第16th版，Osol，A.Ed.(1980)中的医药上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂并不对调配物的所要特征产生不利影响，则其可包括于预冻干调配物(及/或冻干调配物及/或重构调配物)中。可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在所应用的剂量和浓度下对接受者无毒性且包括另外的缓冲剂、防腐剂、共溶剂、包括抗坏血酸和甲硫氨酸在内的抗氧化剂、诸如EDTA的螯合剂、金属复合物(例如Zn-抗体复合物)、诸如聚酯的可生物降解聚合物及/或诸如钠的成盐抗衡离子。
欲用于活体内投药的调配物必须无菌。此易于在冻干和重构之前或之后通过滤过无菌过滤膜完成。或者，整体混合物的灭菌可通过例如将除了抗体之外的成份在约120℃下高压灭菌30分钟而完成。
在制备所述抗体之后，制造预冻干调配物。考虑所要给药量、投药模式来确定存在于预冻干调配物中的抗体的量。抗体通常存在于溶液中。例如，抗体可存在于pH缓冲溶液中。例示性缓冲剂包括组氨酸、磷酸盐、Tris、柠檬酸盐、丁二酸盐和其他有机酸。在一个实施例中，所述结合物之浓度为约0.5mg/mL至约2mg/mL，且优选地浓度为1mg/mL。在一个实施例中，缓冲剂之浓度为约5mM至约50mM。在优选实施例中，所述缓冲剂为约20mM浓度的Tris。在冻干之前，pH可为任何适当pH值，例如约7.8至约8.2且优选地约8.0。
在本发明的调配物的另一实施例中，电解质浓度为约5mM至约100mM。举例而言，可使用任何适当电解质，诸如钠、钾、钙、镁、氯化物、磷酸盐和碳酸氢盐。优选地，所述电解质为钠盐或钾盐，且更优选地，所述电解质为约10mM浓度的NaCl。
在将抗体、低温保护剂和其他可选组份一起混合后，将调配物冻干。多种冷冻干燥剂可用于此目的，诸如Hull50.TM(Hull，USA)或GT20.TM.(Leybold-Heraeus，Germany)冷冻干燥剂。冷冻干燥是通过将调配物冷冻并随后在适于初步干燥的温度下使冰从冷冻的内容物中升华而完成。在此条件下，产物温度低于调配物的共熔点或坍塌温度。通常，在范围通常为约50至250毫巴的合适压力下，用于初步干燥的存放温度在约-30至25℃范围内(假设产物在初步干燥期间仍保持冷冻)。干燥所需要的时间主要受制于调配物、容纳样品的容器(例如玻璃小瓶)的尺寸和类型以及液体的体积，所述时间可在数小时至数天的范围内变化(例如40-60小时)。二次干燥阶段可主要根据容器的类型和尺寸以及所用抗体的类型在约0-40℃下进行。但是在本文中发现可不需要二次干燥步骤。举例而言，在冻干的整个水去除期的存放温度可为约15-30℃(例如约20℃)。二次干燥所需要的时间和压力会为根据例如温度和其他参数产生合适冻干块的时间和压力。二次干燥时间受制于产物中的所要残余水分水平且通常为至少约5小时(例如10-15小时)。压力可与初步干燥步骤期间所用的压力相同。冷冻干燥条件可根据调配物和小瓶尺寸而变化。
根据本发明的冻干可包含在约-35℃至约-50℃的温度下冷冻溶液；最初在约20至80微米汞柱的初步干燥压力在约-10℃至-40℃的存放温度下干燥所冷冻的溶液24至78小时；和继而在约20至80微米汞柱的第二干燥压力在约+10℃至+30℃的存放温度下干燥所经冷冻干燥的产物15至30小时。冷冻可在-45℃下进行，其中最初的冷冻干燥是在60微米汞柱的初始干燥压力和-30℃的存放温度下进行60小时，且第二干燥步骤是在60微米汞柱的干燥压力和+25℃的存放温度下进行24小时。
希望在为避免转移步骤而在其中进行抗体重构的容器中冻干抗体调配物。在此情形下，容器可为例如3、5、10、20、50或100cc小瓶。
一般建议，冻干会产生其中其水分含量少于约5％且优选地少于约3％的冻干调配物。
在所要阶段，通常当将抗体投予至患者时，可用稀释剂将冻干调配物重构从而在重构调配物中的抗体浓度为至少50mg/mL，例如约50mg/mL至约400mg/mL，更优选地为约80mg/mL至约300mg/mL，且最优选地为约90mg/mL至约150mg/mL。当希望皮下递送重构调配物时，认为重构调配物中的所述高抗体浓度尤其适用。但是，对于诸如静脉内投药的其他投药途径，重构调配物中低浓度的抗体可为合乎需要的(例如在重构调配物中为约5-50mg/mL或约10-40mg/mL抗体)。在某些实施例中，重构调配物中抗体浓度显著高于预冻干调配物中的抗体浓度。距离而言，重构调配物中的抗体浓度可为预冻干调配物中抗体浓度的约2-40倍，优选地为3-10倍且最优选地为3-6倍(例如至少三倍或至少四倍)。
重构通常在约25℃的温度下进行以确保完全水合，尽管必要时可应用其他温度。重构所需要的时间取决于例如稀释剂的类型、赋形剂的量和抗体。例示性稀释剂包括无菌水、用于注射的抑菌水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水溶液、林格氏溶液或右旋糖溶液。所述稀释剂视情况含有防腐剂。例示性防腐剂已在以上描述，其中诸如苄基或苯酚醇的芳族醇为优选防腐剂。所用防腐剂的量是通过评估为与抗体相容的不同防腐剂浓度和防腐剂功效测试而确定。举例而言，若防腐剂为芳族醇(诸如苄基醇)，则其可以约0.1-2.0％且优选地约0.5-1.5％但最优选地约1.0-1.2％的量存在。优选地，所述重构调配物在每瓶具有的大于10微米尺寸的颗粒少于6000个。
根据已知方法将所述重构调配物投予至需要用所述抗体治疗的人类中，所述方法诸如作为大丸剂静脉内投予或者经一段时期连续灌输、肌肉内、腹膜内、脑脊内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、经口、局部或吸入途径。
提供含有本发明的冻干调配物的制造物品并提供用于重构及/或使用的说明书。所述制造物品或试剂盒具有(i)容纳本发明的组合物/调配物的容器；和(ii)用于将冻干调配物与稀释剂重构至所述重构调配物中的结合物浓度在0.5mg/mL至5mg/mL范围内的说明书。合适的容器包括例如瓶、小瓶(例如双腔小瓶)、注射器(诸如双腔注射器)和试管。所述容器可由诸如玻璃或塑料的多种材料形成。所述容器容纳冻干调配物且容器上的或者与容器联接的标签可指示重构及/或使用的指导。举例而言，所述标签可指示将冻干调配物重构为如以上所述的抗体浓度。所述标签可进一步指示所述调配物适用于或者希望用于皮下注射。含有所述调配物的容器可为多用小瓶，其允许重复投予(例如投予2-6次)所重构的调配物。制造的物品可进一步包含包含合适稀释剂(例如BWFI)的第二容器。在将稀释剂与冻干调配物混合后，在重构调配物中的最终抗体浓度通常为至少50mg/mL。制造的物品可进一步包括其他合乎商业和使用者观点需要的材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头、注射器和包装衬垫以及使用说明书。
调配后，可直接将本发明的组合物投予至患者。欲治疗的和患者可为动物。但是，可优选地将组合物调适以投予至人类患者。
本发明的组合物可通过包括但不限于经口、静脉内、肌肉内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、经皮(transdermal)、经皮(transcutaneous)(参见PCT公开案第WO98/20734号)、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下、阴道内或直肠途径的多种途径的任一种投予。也可使用无针注射器投予本发明的组合物。通常，所述组合物可制备为可注射液体溶液或悬浮液。也可在注射前制备适于液体媒剂中的溶液或悬浮液的固体形式。
实例
一般材料和方法
癌细胞
选择在表面表达不同水平的Lewis Y抗原的人类癌细胞株。其包括具有Lewis Y抗原高表达的细胞株(L2987肺癌、N87胃癌、A431/LeY表皮样癌、AGS结肠癌和LS174T结肠癌)、具有Lewis Y抗原低表达的细胞株(LOVO结肠癌和LNCaP前列腺癌)和具有Lewis Y抗原极低表达或无表达的细胞株(PC3MM2前列腺癌和A431表皮样癌)。所用癌细胞株的Lewis Y表达状态可通过流式细胞仪确认。以下为所用细胞株的实例。
DLD-1(CCL-221)、HCT8S11、HCT8S11/R1和LOVO(CCL-229)为在细胞膜上呈现Ley抗原的结肠癌细胞株。
NCI-H157(CRL-5802)、NCI-H358(CRL-5807)和A549(CCL-159)为肺癌细胞株。在所述三种细胞株中，NC1-H358在细胞表面上呈现可检测水平的Ley。
胃癌N87(CRL-5822)和AGS(CRL-1739)均表达Ley。
A431(CRL-1555)和A431/Ley为表皮样(子宫颈)癌细胞。仅后一种变异体表达Ley。
MDA-MB435(Ley-)和MDA-MB-36 1(Ley+)用作乳癌细胞的模型。
PC3-MM2(Ley-)和LNCaP(Ley+，CRL-1740)来源于前列腺癌。
除HCT8S11、HCT8S11/R1、MDA-MB435、PC3-MM2和A431/Ley之外的所有细胞株是购自American Type Culture Collection(ATCC)。将获自ATCC的细胞株按照ATCC目录中的说明维持于培养基中。HCT8S11和HCT8S11/R1是由M.Mareel博士(UniversityHospital，Ghent，Belgium)赠予。所述细胞在补充有10％v/v胎牛血清(FBS)、1mM丙酮酸钠、100ng/ml链霉素和100U/ml青霉素(后文称为pen/strep)的RPMI 1640中生长。MDA-MB435和PC3-MM2是获自I.Fidler博士(MD Anderson，TX)。将所述细胞培养于补充有10％v/v FBS、2mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、0.2mM非必需氨基酸、2％MEM维生素溶液和pen/strep的最低基本培养基中。A431/Ley由路德维格癌症研究院(Melbourne，Australia)提供。将其培养于补充有10％FBS、2mM谷氨酰胺和pen/strep的DMEM/F12中。
抗体
RITUXAN(利妥昔单抗；IDEC Pharmaceuticals Corporation and Genentech，SanDiego and San Francisco，CA)是将鼠类重链和轻链可变区与人类IgG1k恒定区组合的嵌合抗体。所述抗体识别B淋巴细胞标记CD20。为进行FACS分析，分别将人类IgG(hulgGZymed，San Francisco，CA)和经FITC标记的羊抗huIgG(FITC/ct-hulgG，Zymed，SanFrancisco，CA)用作对照抗体和二级抗体。因为FACS展示由RITUXAN识别的抗原(CD20)以痕量存在于用于所描述的实验的细胞的表面上，所以将RITUXAN用作阴性对照。RITUXAN的卡奇霉素结合物控制免疫球蛋白的载体功能和卡奇霉素的水解释放。
MYLOTARG(吉妥珠单抗奥唑米星，也称为CMA-676或简称为CMA)为卡奇霉素结合物(Wyeth，Madison，NJ)。使用平均量为35ug卡奇霉素结合于1mg抗体的批次。CMA或CMA-676的抗体部分对CD33具有特异性，CD33为由多能造血干细胞和急性骨髓白血病细胞表达的白细胞分化抗原。用于所述实验的任一个中的细胞均不表达有效水平的CD33。实际上，FACS分析展示结合于所述细胞株的CMA的量类似于证明缺乏CD33表达的对照hulgGI的量。CMA的最高结合在PC3MM2细胞中测定(re MCF＝2.3)。
因此，CMA也控制所释放的无结合物靶向的抗原的CM的功效。
等离子共振分析(BIACORE)
Lewis-BSA结合物(意即H I型-、H II型-、唾液酸基Lea-、唾液酸基Lex-、磺基Lea-、磺基Lex-、Lea-、Leb-、Lex-和Ley-BSA)是购自Alberta Research Council(Edmonton，Alberta，Canada)。抗原/BSA负载量在每摩尔BSA 20至42摩尔抗原之间。将各抗原以4,000至9,000 RU的密度固定于CM5生物感应器芯片的表面。所述芯片由偶合试剂EDC/NHS(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二酰亚胺-HCl)/(N-羟基丁二酰亚胺)以5微升/分钟的流速活化6分钟，随后以5微升/分钟历时6分钟添加于10mM乙酸钠缓冲液pH4.5中的浓度为50微克/毫升的Lewis-BSA抗原。在pH4.0下将磺基-Lewis和唾液酸基-Lewis-BSA结合物偶合。过剩的结合位点用1M乙醇胺-HCl pH8.5以5微升/分钟阻断6分钟。结合特异性分析在缓冲液(10mM HEPES、150mM NaCl、3mMEDTA、50ppm聚山梨醇酯20)中以20微升/分钟的流速进行。历时3分钟以6.67nM或50nM注射Hu3S193。测量在用HBS-EP缓冲液洗涤30秒后仍保持结合的抗体的量。抗原表面由10mM NaOH、200mM NaCl以20微升/分钟再生1分钟以重新建立基线。
为进行动力学分析，以1至16nM的浓度使用抗体。Ley-BSA的密度为9,000。在HBS-EP缓冲液中在3与15分钟期间以30微升/分钟测量结合和解离。
FACS分析
由FACS分析评估Ley在一系列人类肿瘤细胞株上的存在。将105细胞的试样悬浮于100微升补充有1％v/v牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲盐水(PBS/BSA)中。随后将所述细胞在4℃下在各种浓度的初级抗体、hu3S193或G193、hu3S193或CM-结合物中培养30分钟。初级抗体与细胞的结合由标记FITC/α-hulgG显示。
MCF(平均通道荧光)值为与初级抗体(hulgG和hu3S193)结合并用荧光标记的二级抗体连续染色后细胞群体的平均荧光密度。
HulgG为阴性对照。MCF直接和结合初级抗体分子的数量成比例。大部分(13株中有8株)所研究的细胞株表达Ley，可见在hu3S193结合后MCF比阴性对照的MCF增加至少10倍(相对MCF，reMCF)。具有高Ley表达的细胞株的实例见于各组织型的肿瘤类别中。所有结肠直肠和胃部来源的肿瘤细胞均为Ley阳性的。
结合于卡奇霉素的抗LEWIS Y抗体的ED50
使用活体染料(MTS)测定暴露于各种处理后存活细胞的数量。MTS(非放射性细胞增殖检定试剂盒)是购自Promega(Madison，W1)并根据制造商的说明书使用。对于各细胞株，建立校准曲线(2小时后细胞数对光密度)以估算适当起始接种密度。接着将细胞以每孔750至5,000个细胞的密度接种于96孔多孔盘中。在接种后，立即将所述细胞暴露于各种浓度(0、0.01、0.05、0.1、1、10、100和500纳克卡奇霉素当量/毫升)的CMA、hu3S193-AcBut-CM或CM或暴露于PBS。各孔接受10微升的100X药物溶液。在测定了暴露于药物96小时后存活的细胞数后，基于来源剂量反应曲线的对数回归参数计算ED50。ED50定义为使细胞数在暴露于药物96小时后减少50％的药物摩尔浓度(CM)。应注意，卡奇霉素当量为作为纯物质或作为结合物给出的CM的浓度。根据结合于抗体的CM的量(抗体药物负载量)，不同结合物的卡奇霉素当量可表示不同蛋白浓度。
实例1.产生抗LEWIS Y抗体
产生野生型(hu3S193)和突变型(G193)抗Lewis Y抗体。通过将BALB/c小鼠用Lewis Y抗原阳性的人类腺癌细胞免疫产生鼠类3S193单抗。随后产生3S193抗体的人源化型式(hu3S193)。详细特异性分析证明hu3S193对Ley具有高度特异性(未结合H 2型或1型抗原)且与Lex三糖仅显示最小交叉反应性。hu3S193的突变IgG1型式(G193)不同于hu3S193，因为其在其CH2域具有两个氨基酸取代，意即：亮氨酸(234)取代为丙氨酸且甘氨酸(237)取代为丙氨酸。除以上两个突变外，还存在两个相应于IgG1的CH3域的Gmz异型的额外保守性突变(358位的天冬氨酸突变为谷氨酸和360位的甲硫氨酸突变为亮氨酸)。因此，人源化突变型IgG1抗Lewis Y抗体在Fc区内的4个残基处不同于hu3S193：L236A、G239A、D358E和M360L。抗Lewis Y抗体的所述突变型IgG1形式被称为G193，表达于中华仓鼠卵巢细胞中，且用于产生CMD-193。图7提供所述两种抗体的成熟分泌重链的氨基酸序列的比较。在这一图中，突变残基为黑体且突出显示且CDR为黑体并加以阴影。
细胞和培养条件
表达hu3S193抗体的杂交瘤细胞是获自路德维格癌症研究院。Hu3S193是来源于小鼠单克隆抗体MuS193的人源化抗Ley抗体(IgG1)，其已经工程化从而仅互补决定区是来源于鼠类。
所述细胞株是胆固醇依赖型细胞株且需要在Hyclone HyQ-CCM1生长培养基(Hyclone Labs，Logan，Utah)中添加胆固醇。因为胆固醇为非水溶性的，所以所述培养基补充有0.2％ExCyte VLE(Miles Pentex，Kankake，IL)。将细胞在37℃下在5％CO2中维持。细胞是购自ATCC(Rockville，Maryland)且维持于补充有10％胎牛血清(FBS)和2mM谷氨酰胺、100单位/毫升青霉素、100微克/毫升链霉素(后文称为pen/strep)的杜贝卡氏改良依格培养基(Dulbeccos Modified Eagle Medium)(DMEM)中。
PA-DUKX 153.8细胞不能产生二氢叶酸还原酶(dhfr)。所述细胞维持于补充有10微克/毫升腺苷、脱氧腺苷和胸苷(Sigma，St.Louis，MO)、10％FBS、20mM HEPES、0.1％碳酸氢钠、2mM谷氨酰胺和pen/strep的最低基本培养基(MEM-α，Gibco BRL，GrandIsland，NY)中。转染后，使细胞在不存在核苷酸的情形下生长且维持，其中用1毫克/毫升G418(Gibco)和250nM氨甲喋呤(Sigma)作为选择标记。
载体
为产生野生型(hu3S193)和突变型(G193)抗Lewis Y抗体的重链和轻链构造物，使用以下载体：PED6_HCJgG1、PED6_HC_mlgG1和pED6_LCK载体。PED6_HC_mlgG1载体含有突变型CH2域的模板(所述载体在234位编码丙氨酸置换亮氨酸且在237位编码丙氨酸置换甘氨酸)。将hu3S193的轻链的可变区的DNA连接于pED6_LCκ表达载体的BssH II和Pad限制位点之间。将hu3S193的重链的可变区的DNA连接于pED6_HCIgG1表达载体的BssH II和Sal I限制位点之间。使用载体pED6_Hc_mlgG1产生G193的重链。所述载体在其域的序列中不同于pED6_HC_lgG1。pED6_HC_mlgG1的表达产生其中丙氨酸取代亮氨酸(234)和甘氨酸(237)的重链。
将编码G193或hu3S193的轻链的可变区和恒定区的DNA从pED6_LCk质粒中剪切出来并连接于pMEN2载体的PpUM和EcoR I限制位点之间。将编码G193或hu3S193的重链的可变区和恒定区的DNA从pED6 HC_lgG1或pED6_HC_mlgG1载体中剪切出来并插入于pTDMEDL载体的BglII和XbaI限制位点之间。
提取和克隆
借助于RNAzolB试剂盒(RNAzol B，TEL-TEST，Inc.，Friendswood，TX)根据制造商的说明书从产生hu3S193的细胞中提取RNA。使用试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)，将所提取的RNA转录为单链cDNA。将10微克总RNA与寡dT引物混合。将此反应混合物加热至65℃历时5分钟且缓慢冷却至22℃。在50微升总体积中含有5微升10倍浓度的第一链缓冲液、5微升DTT、1微升RNAse阻断剂、2微升DNTPs(1.25mM)和1微升MMLV逆转录酶(10单位/微升)的混合物中合成第一链cDNA。将所述组份轻柔混合并在37℃下培养1小时。使用所述cDNA扩增hu3S193的VH和VK。使用以下引物用于聚合酶链式反应(PCR)：
Hu3S193 VH UP(BssH II)
GCTTG GCGCGCACTCC GAG GTC CAA CTG GTG GAG AGC GGT GGA GGTGTT(SEQ.ID.NO.1)
Hu3S193 VH DN(Sall)
GCGA CGTCGACAGGACTCACC TGA GGA GAC GGT GAG CGG GGT CCC TTGGCC CCA GTA AGC AAA(SEQ.ID.NO.2)
Hu3S193 VK UP(BssH II)
GCTTG GCGCGCACTCC GAC ATC CAG ATG ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTGA(SEQ.ID.NO.3)
Hu3S193 VK DN(Pacl)
GCC CTTAATTAAGTTATTCTACTCACG TGT GAT TTG CAG CTT GGT CCC TTGGCC GAA CGT GAA(SEQ.ID.NO.4)
PCR反应是在50微升的总体积中5微升第一链cDNA、100纳克有义和反义引物、5微升10X PFU聚合酶缓冲液、500微摩尔浓度MgCI2、1.25mM DNTP和1微升酶(2单位/微升)的混合物中进行。反应由35个交互的变性(95℃-1min)和合成(72℃-4min)循环以及1个终止循环(72℃-7min)组成。在1％琼脂糖中通过电泳分析反应产物。纯化PCR产物，并将重链PCR产物用BssH II和SalI消化并连接入经BssH ll/Sal1消化的pED6_HC_mlg1或pED6_HC_Ig1表达载体中以分别产生G193和hu3S193重链构造物。类似地，将轻链PCR产物用BssH II/Pac I消化并连接入经BssH II/Pac I消化的pED6J_CK表达载体中以产生G193轻链构造物。在瞬时转染实验中使用pED载体测定抗体的表达。
进一步将含有G193或hu3S193的重链和轻链的pED载体亚克隆入pTDMEDL-DHFR/VH和pMEN2-NeoA/K。为制备所述构造物，将hu3S193pED6_HC_mlgG1 VH(hu3S193 VH+CH1+mtCH2+CH3)和hu3S193 pED6_HC_lgG1 VH(hu3S193 VH+CHI+CH2+CH3)用Bgl II和Xba I消化并连接入经Bgl II/Xba I消化的pTDMEDL载体中以产生G193 VH/pTDMEDL-DHFR或hu3S193 VH/pTDMEDL-DHFR。类似地，将pED6_LCκhu3S193 VK用PpUM和EcoR I消化(hu3S193 VK+CK)并连接入经PpUM和EcoR I消化的pMEN2载体中以产生Hu3S193 VK/pMEN2-Neo。G193单抗的序列为SEQ ID NO：13。
连接、转化和质粒纯化
将消化产物用T4 DNA连接酶(Gibco)在12℃下连接过夜并转化进DH5a细胞。将单菌落在50微克/毫升青霉素存在下接种进2毫升LB培养基中并在37℃生长过夜。对少量制备的DNA进行的限制定位证实插入物的适当长度。在证实后，使用Qiagen试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)根据制造商说明书制备大量制备DNA。
VH和VK DNA的测序
将大量制备的DNA送去DNA核心设施以将hu3S193的可变重链和轻链测序。如下确定DNA序列。Qiagen 9600自动仪(Qiagen)根据由制造商提供的涡式制备方法制备少量制备物。在13微升水中将500微克所述少量制备的DNA与20pM引物DNA混合物。接着将所述DNA通过加热(98℃，5分钟)和冷却(4℃，5分钟)变性。将8微升Big染料终止子(ABI，Foster City，CA)添加至经变性的DNA中。将混合物加热至98℃且经受一系列的25个热循环(96℃，20s；55℃、20s；62℃，120s)和20个热循环(96℃，20s；60℃，120s)。将反应混合物经Biosystems 96孔过滤板(Edge，Gaithersburg，MD)过滤以去除过量染料终止子。随后在3700毛细管阵列测序仪(ABI)上分析DNA片段。G193和hu3S193的重链和轻链的序列呈现于图7和8中。
COS-7细胞的瞬时转染
在COS-7细胞中瞬时转染后确认抗体表达。将一百万个COS-7细胞涂在一个6孔盘上。第二天，将等摩尔浓度(各1微克的混合物)的hu3S193 pED6_HC_mlgG1 VH和hu3S193 pED6_HC mlgG1 VH或hu3S193 pED6_HC_IgG1 VH和hu3S193pED6_HC_lgG1 VH在250微升无血清DMEM中稀释。同样，也将6微升1毫克/毫升转脂胺(Invitrogen)在250微升无血清DMEM中稀释。将DNA和转脂胺混合并在室温下培养15分钟。将所述混合物添加至细胞中(细胞在暴露于DNA-转脂胺复合物之前用无血清培养基洗涤)。在37℃下培养8小时后，向所述细胞中添加新鲜培养基。通过FACS和BIAcore分析来分析暴露于细胞48小时的培养基中抗体的存在。
稳定细胞株
在确认抗体表达后，如下在PA-DUKX 153.8细胞中产生表达突变型(G193)和野生型(hu3S193)抗Lewis Y IgG1抗体的稳定株。将五百万个细胞涂于直径为10厘米的盘中。16小时后，将等摩尔(各10微克)的G193 VH/pTDMEDL(克隆18)和VK/pMEN2(克隆1)的混合物或者hu3S193的等效构造物用1.5毫升无血清MEM-α稀释。将60微升转脂胺也用1.5毫升无血清MEM稀释。将DNA和转脂胺混合并在室温下培养15分钟。将所述混合物添加至细胞中并接着置于37℃历时8小时。在此时期后，将混合物用15毫升新鲜生长培养基替换。24小时后，以1∶10稀释度将细胞培养物传代至含有1毫克/毫升G418且新鲜氨甲喋呤浓度逐步增加(20、40、80、100、120、160、200和250nM/ml)的生长培养基(不含核糖核苷和脱氧核糖核苷)中。挑选并扩展菌落。将来自所述克隆的条件培养基通过FACS、BIAcore和ELISA分析。接着使用表达G193或hu3S193的稳定细胞株大量生产和纯化抗体。
G193的效应器功能
为测定G193和其结合物CMD-193的效应器功能能力，将两者均使用表达Lewis Y抗原的N87胃癌细胞和具有极低和无Lewis Y抗原表达的A431表皮样癌细胞检测。将野生型人源化IgG1抗Lewis Y抗体hu3S193用作阳性对照。已证明这一抗体介导ADCC和CDC活性。在ADCC检定期间使用新分离的人类外周血液单核细胞(PBMNC)作为效应器细胞来源并在CDC检定中使用新鲜制备的人类血清作为补体来源。
使用与不同浓度的抗Lewis Y抗体一起在作为补体源的新鲜人类血清的1∶100稀释液存在下培养4小时的固定数量的肿瘤细胞评估G193和CMD-193的CDC活性。测量作为肿瘤细胞溶解的结果而释放的乳酸脱氢酶活性。测量由非离子性去污剂释放的LDH活性作为总溶解的表示。类似评估用表达高水平的Lewis Y(Lewis Y+++)(意即高LewisY)的A431细胞进行。
使用与不同浓度的抗Lewis Y抗体一起在以50的效应器细胞：靶细胞比率下用作效应器细胞的外周血液单核细胞的存在或不存在下培养4小时的固定数量的肿瘤细胞测定G193和CMD-193的ADCC活性。测量作为肿瘤细胞溶解的结果而释放的乳酸脱氢酶活性。测量由非离子性去污剂释放的LDH活性作为总溶解的表示。类似评估用Lewis Y+++N87细胞进行。
如图24和25所示，野生型IgG1和突变型IgG1抗Lewis Y抗体同样能够介导抗具有高Lewis Y抗原表达的N87癌细胞的ADCC和CDC活性。各抗体的抗具有极低或无Lewis Y抗原表达的A431细胞的类似活性未观察到。相反，具有与hu3S193和G193的序列相同的VH和VK序列的抗Lewis Y抗体的IgG4型式不能促进ADCC和CDC活性。已知人类IgG4同型缺少介导ADCC和CDC的能力，且与此观点一致，抗Lewis Y IgG4抗体在ADCC和CDC检定中无活性。
所述结果暗示在G193的Fc中引入L236A和G239A突变并不使G193的效应器功能能力缺失。在介导抗具有Lewis Y抗原高表达的N87癌细胞的CDC活性中CMD-193也与G193一样有效。所述结果进一步说明将G193与卡奇霉素结合并不改变G193介导CDC活性的能力。因此，G193和CMD-193均能够介导效应器功能活性，且CMD-193为有效应器功能能力的抗体结合物。
实例2.将抗LEWIS Y抗体与卡奇霉素结合
最初如下使抗体结合于卡奇霉素(CM)。将蛋白浓度为约10毫克/毫升的抗体调节为pH 8-8.5且具有高摩尔浓度非亲核缓冲剂(1M HEPES)。接下来将防止蛋白聚集的赋形剂(辛酸钠)以0.1-0.2M的终浓度添加。最终，将5％蛋白质量的激活的卡奇霉素衍生物作为于有机溶剂(乙醇或二甲基甲酰胺)中的浓溶液(10-20毫克/毫升)添加。接着将所述反应混合物在25-35℃下培养1至2小时。反应进程由SEC-HPLC监控。反应完成后，在制备性SEC柱上使结合物与聚集抗体和游离卡奇霉素分离。用于本实验中的结合物制剂的每抗体的CM的量对于hu3S193-AcBut-CM和RITUXAN-AcBut-CM分别在22与47微克/毫克之间和17与30微克/毫克之间变化。
优化结合条件
在典型结合反应中，将人源化抗Lewis Y抗体(hu3S193)结合于NAc-γ-卡奇霉素-DMH-AcBut-OSu(卡奇霉素衍生物)，其中目标蛋白浓度为10毫克/毫升且目标卡奇霉素衍生物负载量为蛋白的7.0重量％。目标反应pH为8.0±0.2且如下为其他反应组份的目标浓度：50mM HEPBS、10mM脱氧胆酸钠和9％v/v乙醇。所述反应在33±2℃下进行1小时。如下为在纯化前此典型反应的分析结果：蛋白：9.92mg/ml；卡奇霉素负载量：70mcg/mg；聚集体：1.9％未结合蛋白：(LCF)：0.81％。
测试各种表面活性剂添加剂和其浓度对产物产率和纯度的影响以确定其对生产hu3S193的结合单体的影响。结果展示于下表2。进行反应，其中除了添加剂和其浓度之外所有变量保持恒定。分析从这些反应产生的结合物的聚集、LCF和蛋白回收率。尽管一些添加剂以低聚集或低LCF产生结合物，但仅脱氧胆酸以低聚集、低LCF和高蛋白回收率产生结合物。
表2
 去污剂(浓度)  聚集(％)  未结合单抗(％)  产率(％)
 乙二醇(10％)  16.7  16.3  36
 吐温-80  18.5  19.5  38
 梭链孢酸(10mM)  9.9  25.2  47
 梭链孢酸(20mM)  13.7  10.5  49
 梭链孢酸(50mM)  25.6  5.2  46
 辛酸(180mM)  9.8  26.4  37
 辛酸(200mM)  24.2  10.1  38
 辛酸(220mM)  36.8  8.4  33
 癸酸(20mM)  24.9  64.3  23
 癸酸(50mM)  71.9  0  9
 辛基硫酸盐(75mM)  5  24  78
 辛基硫酸盐(100mM)  42  6  38
 辛基硫酸盐(150mM)  74  1  ND
 癸基硫酸盐(20mM)  47  6  35
 癸基硫酸盐(30mM)  69  6  13
 癸基硫酸盐(40mM)  68  7  7
 氯化第三丁基铵(150mM)  1  58  85
 氯化第三丁基铵(250mM)  5  35  74
 去氧皮质固酮-hemis(4mM)  1  100  99
 去氧皮质固酮-hemis(10mM)  0  100  94
 去氧皮质固酮-hemis(20mM)  0  59  41
 氢化可的松-hemis(20mM)  1  57  88
 氢化可的松-hemis(40mM)  1  26  85
 氢化可的松-hemis(80mM)  2  13  81
 苯甲酸盐(100mM)  0  72  100
 苯甲酸盐(200mM)  0  66  92
 苯甲酸盐(400mM)  1  50  82
 苯甲酸盐(1M)  11  31  83
 Napthoic Acid(40mM)  4  52  98
 Napthoic Acid(100mM)  5  ND  64
 4-苯基丁酸(167mM)  2  52  100
 二羟基苯基乙酸(175mM)  0  67  100
 脱氧胆酸(15mM)  3.4(1-6.2)  2.3(0.7-3.3)  73(63-80)
 甘油脱氧胆酸  4.1  3.12  72.8
 牛磺脱氧胆酸  4.6  4.5  71.7
 胆酸  9.8  28.4  67.9
 甘油胆酸  13.3  33.9  60.7
 牛磺胆酸  15  35.1  64.3
辛酸为用于CMA-676结合反应中的标准催化剂，而癸酸为用于CMC-544结合反应中的标准催化剂。脱氧胆酸结果为括号中范围的5个反应的平均值。测试去污剂的胆酸家族的其他成员并给出类似结果。
对于各种IgG1和IgG4抗体使用辛酸、癸酸和脱氧胆酸测定结合反应结束时聚集百分比和游离蛋白百分比。所测试的IgG1抗体为G193且对照抗体为mAb 01，而所测试的IgG4抗体为带有IgG4恒定区的G193(G193-lgG4)、来自CMA-676结合物的mAb 676、来自CMC-544结合物的mAb G544且对照抗体为。如下表3所示，在脱氧胆酸存在下IgG1抗体的结合产生低聚集百分比和低未结合蛋白(或LCF)百分比，而在辛酸或癸酸存在下的结合产生高聚集百分比或高未结合蛋白百分比。其与IgG4抗体相反，当在癸酸或脱氧胆酸存在下结合时IgG4抗体具有低聚集百分比和低未结合蛋白百分比。
表3
 辛酸  癸酸  脱氧胆酸
 mAb  聚集(％)未结合蛋白(％)  聚集(％)未结合蛋白(％)  聚集(％)未结合蛋白(％)
 G193*G193-lgG46760102G544  5.68    39.74.48    38.79.22    48.86.03    36.55.47    41.163.75    37.55  15.0    2.2528.03   0.135.29    34.46.92    14.925.03    0.072.34    3.29  2.91    1.084.33    33.36    29.46.55    2.33.44    3.443.57    3.34
 IgG1 AvgIgG4 Avg  5.86    38.15.73    41.55  10.96   8.5910.17   9.47  4.73    1.693.68    9.80
*三次运作的平均值
CMD-193的不同药物负载量
评估每抗Lewis Y抗体(G193)上卡奇霉素的不同药物负载量。产生每毫克G193抗体蛋白上药物负载量为30、60或90毫克NAc-γ卡奇霉素DMH的CMD-193制剂且在N87异种移植小鼠中以每千克160毫克卡奇霉素当量的剂量IP Q4Dx3投予。CMD-193的抗肿瘤功效并不受药物负载量不同的影响。
如图23所示，具有不同卡奇霉素负载量的CMD-193的抗肿瘤功效基本上相同。因为未结合靶向抗体G193在介导抗肿瘤活性中无效，所以CMD-193的全部抗肿瘤功效可归因于将卡奇霉素靶向递送至肿瘤细胞。所述结果也暗示30至90微克/毫克CMD-193的卡奇霉素结合程度(负载量)并不影响其治疗结果。
色谱纯化
用于纯化的起始物质是含有卡奇霉素衍生物负载量为70微克/毫克、聚集体含量为1.9％(HPLC面积百分比)且LCF含量为0.82％(HPLC面积百分比)的9.92毫克/毫升蛋白的结合反应混合物。在结合反应完成后，通过添加磷酸钾溶液至磷酸盐终浓度为0.6M(pH8.2)将反应混合物稀释10倍。混合后，使所述溶液通过0.45微米过滤器过滤。将经稀释的溶液加载于丁基琼脂糖凝胶4 Fast Flow柱上。加载于柱上的蛋白总量为每毫升床体积20毫克。在用0.6M磷酸钾洗涤后，使用0.6M至4mM磷酸钾pH8.2的分级梯度洗提所述柱(或者，所述柱可用20mM Tris/25mM NaCl洗提)。汇集来自分级梯度的溶离份且储池含有：蛋白8.3mg/mL；卡奇霉素69.3mcg/mg；聚集体0.42％；LCF：0.31％。
使用超滤/透滤用再生纤维素膜完成缓冲液交换。用20mM Tris/10mM NaCl，pH8.0(10透滤体积)透滤结合物。可使用尺寸排除色谱或超滤/透滤处理储池为适于调配的缓冲液。
实例3.抗LEWIS Y抗体卡奇霉素结合物的特异性和动力学
为确认将卡奇霉素结合于野生型(hu3S193)和突变型(G193)抗Lewis Y不会阻断与Ley的结合，使所述抗体和其各自的结合物经受等离子共振分析(BIAcore)及/或FACS分析。Hu3S193以及hu3S193-AcBut-CM仅识别Ley-BSA且其均不能识别以下寡糖抗原：H I型、H II型、唾液酸基-Lea、唾液酸基-Lex、磺基-Lea、磺基-Lex、Lea、Leb或Lex。hu3S193-AcBut-CM的结合动力学不同于hu3S193的结合动力学。所述抗体的Ka和Kd也因结合CM而改变。
综上所述，来自BIAcore和FACS分析的结果说明将CM结合于hu3S193或G193并不影响对Ley-BSA或对Ley阳性细胞(数据未展示)的特异性。hu3S193-AcBut-CM与hu3S193相比改变的动力学参数并不必转换为可结合N87细胞的结合物或抗体的不同量。
BIACORE分析
为确认G193、hu3S193、hu3S193-AcBut-CM和CMD对Ley的特异性，通过使用表面等离子共振分析(使用BIAcore 3000)检测所述抗体和其CM结合物对各种Ley相关抗原的亲和力。将Lewis Y-BSA(30摩尔Lewis Y/每摩尔BSA)固定于生物感应器芯片上并暴露于各种浓度的各种Lewis Y反应抗原(2、4、8、12和16nM)。G193、hu3S193、hu3S193-AcBut-CM和CMD-193以与hu3S193相同的亲和力和特异性结合于Ley-BSA。由BIAcore测定的所述动力学参数是依赖于所述抗体或结合物与人工Ley-BSA底物的结合。
所述三种抗体具有相同的动力学常数。所述评估说明未结合抗Lewis Y抗体、G193和hu3S193以适当亲和力(KD范围100-300nM)结合Lewis Y-BSA。如下表4所示，结合于卡奇霉素使得所述抗体在此人工系统中的Lewis Y结合强度轻微降低。CMD-193以低亲和力和高纳摩尔浓度KD结合Lewis Y抗原。
表4
 抗体  KD(M)  KA(1/M)  KD(1/s)  Ka(1/Ms)
 Hu3S193  1.3×10-7  7.7×106  4.9×10-3  3.9×104
 G193  1.5×10-7  6.6×106  4.9×10-3  3.3×104
 CMD-193  3.4×10-7  2.9×106  2.5×10-3  7.4×104
所述抗体和结合物仅识别Ley且不识别相关寡糖中的任一者。也使用生物感应器分析研究G193、hu3S193和其卡奇霉素结合物与各种与Lewis Y结构上相关的碳水化合物抗原的结合。将各种结合于BSA的Lewis Y相关抗原固定于生物感应器芯片上并暴露于抗Lewis Y抗体和其卡奇霉素结合物。展示于图20的所述结果说明G193和CMD-193对Lewis Y抗原具有特异性且并不展现甚至与结构上与Lewis Y接近的抗原(Lewis X和H-2血型抗原)的结合。所述结果也进一步暗示与卡奇霉素的结合并不改变抗Lewis Y抗体的抗原特异性。
FACS分析
为检验结合是否影响hu3S193与Ley+细胞的结合，用流式细胞仪(FACS)比较结合N87细胞的hu3S193和hu3S193-AcBut-CM的量。在将N87暴露于各种浓度的hu3S193或hu3S193-AcBut-CM后获得的平均通道荧光(MCF)相似。将N87细胞与各种浓度的hu3S193和hu3S193-AcBut-CM一起培养。所结合的结合物或抗体的量表示为MCF。下表5展示hu3S193与各种癌细胞株结合的流式细胞仪检测(将人类IgG1用作对照抗体)。基于MCF与抗Lewis Y抗体/MCF与对照抗体的比率将表达状态任意赋值。3-10范围内的比率表示+Lewis Y表达水平，10与100之间的比率表示++Lewis Y表达水平，100与300之间的比率表示+++Lewis Y表达水平，且大于300的比率表示++++Lewis Y表达水平。基于此起始的估算值，在其他研究中使用Lewis Y高表达和低表达的癌细胞株。
表5
 癌症类型  肿瘤细胞株             平均通道荧光  表达水平
 对照单抗  人源化IgG1抗LewisY单抗
 乳腺  MDA-MB-361  9  298  ++
 MDA-MB-435  3  3  -
 MXl  25  381  ++
 结肠  LOVO  5  62  ++
 HCT8S11  4  2221  ++++
 HCT8S11/R1  3  1162  +++
 DLD-1  3  1167  +++
 LS174T  29  712  +++
 HT-29  12  271  ++
 表皮样  A431/LeY  16  912  +++
 A431  19  37  ±
 KB  9  106  ++
 胃  AGS  3  1063  ++++
 N87  4  771  +++
 肺  L2987  4  894  +++
 A549  3  5  -
 H157  2  3  -
 前列腺  LNCaP  5  50  +
 PC3  5  41  +
 PC-MM2  3  19  +
G193和hu3S193结合物在培养物中与hu3S193类似结合于Ley+胃癌细胞株(N87)。在将N87单层暴露于各种浓度的hu3S193或G193后测定的MCF(平均通道荧光)值也相同。因此，除了用BIAcore证明的与Ley-BSA的结合相等外，hu3S193、G193和hu3S193-CM与天然呈现的Ley的结合也相同。
药物动力学
利用CMD-193的药物动力学研究由以下步骤组成：确认酶联免疫吸收检定(enzyme-linked immunosorbent assay)(ELISA)以测定CMD 193(大鼠)、G193抗体(大鼠、犬)、未结合卡奇霉素衍生物(大鼠、犬)、总卡奇霉素衍生物(大鼠、犬)和在大鼠血清中存在的对CMD-193具有特异性的抗体以及犬血清中的对G193抗体具有特异性的抗体的浓度；在雌性裸鼠中投予单腹膜内(IP)剂量的CMD-193后对G193抗体进行药物动力学评估；在人类肝脏微粒体和细胞溶质中活体外代谢NAc-γ-卡奇霉素二甲基酰肼(CM)和NAc-γ-卡奇霉素DMH AcBut并在HL 60成髓细胞白血病细胞中活体外代谢NAc-γ-卡奇霉素DMH。对于裸鼠中的活体内药物动力学研究，以含有5％蔗糖、0.01％聚山梨醇酯80、2.92毫克/毫升(50mM)氯化钠、2.42毫克/毫升(20mM)Tris和无菌注射用水并将pH调节为8.0的载剂腹膜内投予CMD-193。在这一研究中，负载量约为75毫克卡奇霉素衍生物/每毫克抗体，其相当于约6摩尔卡奇霉素/每摩尔抗体。
在雌性裸鼠中以15毫克卡奇霉素当量/千克的剂量(最低有效剂量(MED))单剂量IP投予CMD193后G193的药物动力学特征为中等吸收率和长的表观终半衰期(t1/2)。G193抗体的浓度对时间曲线下的平均面积(AUCO-)为222mg-h/mL。
在人类肝脏微粒体和细胞溶质中活体外检测NAc-γ-卡奇霉素DMH和NAc-γ-卡奇霉素DMH AcBut的代谢率，且在HL-60成髓细胞白血病细胞中检测NAc-γ-卡奇霉素DMH的代谢率。在人类肝脏微粒体和细胞溶质中培养后发现多种代谢物。在微粒体中的生物转化途径为羟基化和去甲基化，而在细胞溶质中似乎NAc-ε卡奇霉素和其衍生物的形成为主要途径。包括NAc-ε卡奇霉素和其异构体的一些代谢物在与HL-60白血病细胞一起培养期间产生。在肝脏和白血病细胞制备物中观察到常见代谢物，暗示卡奇霉素衍生物的代谢可能并不为细胞特异性的。在细胞中的NAc-ε卡奇霉素和其衍生物的检测支持以下假说，即NAc-ε卡奇霉素的反应性双基物质可能是经由细胞内的NAc-γ-卡奇霉素的二硫键的谷胱甘肽依赖性还原而形成。
实例4.抗LEWIS Y抗体卡奇霉素结合物对人类癌细胞株的活体外生长的功效
利用人类癌细胞株评估结合于hu3S193(hu3S193-CM)和G193(CMD-193)的卡奇霉素对人类癌细胞株的活体外生长的效应。所评估的细胞株包括具有高Lewis Y抗原表达和低Lewis Y抗原表达的癌和来自乳腺、结肠、肺和前列腺的癌。hu3S193-AcBut-CM和CMD-193的功效均在活体外与CM(游离药物)及/或各种对照结合物比较。
如下表6和7所示，对于抗Lewis Y表达癌细胞而言，hu3S193和CMD-193总是比对照结合物(例如CMA-676)更有效。相反，对于抗具有低或少量Lewis Y抗原表达的细胞而言，hu3S193和CMD-193与对照结合物一样有效或者有效性降低。
HU3S193—CM
Hu3S193-AcBut-CM尤其在活体外抑制Ley表达癌细胞的生长。当以1×10-4至6.9微克蛋白/毫升范围内的浓度使用时，游离hu3S193抗体不影响LOVO、L2987、N87或AGS的生长。所述蛋白浓度范围相当于作为结合物给予的抗体的量。ED50指示在暴露于CM或结合物96小时后50％细胞存活的剂量(ng/ml)。在Ley阳性细胞中(re MCF＞10)hu3S193-AcBut-CM的ED50总是低于CMA的ED50。在Ley阳性细胞中(re MCF＞10)hu3S193-AcBut-CM的ED50总是低于CMA的ED50。
观察到两种结合物的ED50在实验之间的变化。但是当测试结合物对Ley+AGS细胞的功效时，hu3S193-AcBut-CM的ED50范围总是低于CMA。相反，当对Ley-PC3MM2细胞测定两种结合物的功效时，所述范围重叠。此结果不可能由两种细胞株的选择引起。在使用Ley+细胞的平行实验中比较CMA和hu3S193-AcBut-CM的ED50展示平均而言hu3S193-AcBut-CM的ED50比CMA低(倍数CMA＜1)。此发现与细胞株来源、其对卡奇霉素的敏感性和其与Ley的相对量无关。当使用各种Ley-细胞时，参数倍数CMA大于等于1。对于所述实验使用各种hu3S193-AcBut-CM结合物制备物(每毫克蛋白22和47微克卡奇霉素)，说明观察结果与此变量无关。综上所述，所述结果说明由于卡奇霉素以Ley为靶的hu3S193-AcBut-CM的选择性细胞毒性。
此发现结果由一系列利用不同批次的hu3S193-AcBut-CM的实验证实。用于所述实验的结合物制备物具有每毫克蛋白22与47微克之间的CM。从9个实验中汇总hu3S193-AcBut-CM和MYLOTARG(CMA)的ED50值并作图为其发生频率的函数(参见图2A和2B)。将对Ley+细胞的功效(AGS，图2A)与对Ley-细胞的功效(PC3MM2，图2B)比较。对于10个细胞株的群体，也相对于CMA(在各实验中用作内部对照(倍数CMA))的ED50值评估hu3S193-AcBut-CM的ED50值，其中n为独立测定的数值(参见图2C)。虽然ED50在实验间具有一些变化，但hu3S193-AcBut-CM仍总是比CMA对Ley阳性细胞更有效(倍数-AcBut-CMA＜1)。所述结果说明由于CM以Ley为靶的选择性细胞毒性。
表6
 癌细胞株  Lewis Y表达  ED50(nM)卡奇霉素当量  倍数选择性比率
 CM  Hu3S193-CM  CMA-676
 N87  +++  9.0  60  148  2.5
 AGS  +++  0.01  0.24  3.50  14
 HCT8S11  ++++  20  16  ＞348  ＞22
 HCTS11R1  +++  21  16.5  ＞340  ＞21
 LOVO  ++  1.46  21  45  2.1
 LNCaP  ++  2.1  ＜0.007  2.80  ＞400
 NCI-H358  +  2.0  60  90  1.5
 PC3MM2  ±  4.0  38  16  0.42
在此实验中，在递增浓度的未结合或结合卡奇霉素(CMA-676或CMD-193)存在下培养人类癌细胞96小时，随后将各培养物中的存活细胞使用MTS检定试剂盒计数。在上表6中，CM是指NAc-Calich DMH，CMA-676和CMD-193的浓度以卡奇霉素当量(nM)表示，且倍数选择性比率表示为CMA的ED50与CMD的ED50比率。6.7mg/mL(所测试的最高浓度)的未结合抗Lewis Y抗体对所检测的任何肿瘤细胞株无效。
CMD-193
当以5,700至6,900纳克蛋白/毫升范围内的浓度使用时，游离G193抗体并不影响任何所研究的细胞类型的生长。如hu3S193的情形，在Ley阳性细胞中CMD的ED50总是比CMA的ED50低。用于所述实验的结合物制备物具有每毫克蛋白56与88微克之间的CM。虽然ED50在实验间具有一些变化，但CMD仍总是比CMA对Ley阳性细胞更有效(倍数-AcBut-CMA＜1)。所述结果说明由于CM以Ley为靶的选择性细胞毒性。
CMD-193的选择性通过在用CMA和CMD处理后比较A431和A431/Ley的衰减曲线图得以最佳说明(图9)。在这一实验中，A431和A431/Ley细胞单层在CMD或CMA存在下培养96小时。处理后剩余的细胞数通过活体染料方法测定并表示为对照的百分比。两种类型的A431细胞对CM具有类似的敏感性。如图9B所示，在处理Ley阳性细胞株(A431/Ley)后观察到CMD衰减曲线相对于CMA明显左移；如图9A所示，在处理Ley阴性细胞(A431)后未观察到CMD衰减曲线相对于CMA明显左移。
表7
癌细胞株 Lewis Y表达  ED50(nM)卡奇霉素当量  倍数选择性比率
 CM  CMD-193  CMA-676
 A431/LeY  +++  0.05  0.33  7.83  24
 AGS  +++  0.03  0.1  0.68  6.9
 N87  +++  4.86  50.83  109.00  2.1
 L2987  +++  0.30  6.00  18.60  3.0
 LS174T  +++  0.28  15.33  22.66  1.5
 LOVO  ++  1.16  66.66  66.66  1.0
 LNCaP  ++  0.13  0.40  0.66  1.7
 A431  ±  0.05  7.9  5.72  0.7
 PC3MM2  ±  2.60  19.00  6.15  0.3
在这些实验中，在递增浓度的未结合或结合卡奇霉素(CMA-676或CMD-193)存在下培养人类癌细胞96小时，随后将各培养物中的存活细胞使用MTS检定试剂盒计数。在上表7中，CM是指NAc-Calich DMH，CMA-676和CMD-193的浓度以卡奇霉素当量(nM)表示，且倍数选择性比率表示为CMA的ED50与CMD的ED50比率。6.7微克/毫升(所测试的最高浓度)的未结合抗Lewis Y抗体对所检测的任何肿瘤细胞株无效。
实例5.抗LEWIS Y抗体卡奇霉素结合物对人类癌细胞异种移植物的活体内生长的功效
评估结合于抗Lewis Y抗体的卡奇霉素对皮下(SC)建立于裸鼠中的人类癌异种移植物的抗肿瘤功效。所评估的异种移植物包括具有高Lewis Y抗原表达和低Lewis Y抗原表达的癌和来自乳腺、结肠、肺和前列腺的癌。随机将带有平均质量为150至300毫克的实体肿瘤的小鼠分为各种治疗群。
HU3S193-CM
测试hu3S193-AcBut-CM对来自胃癌(N87，图3)、前列腺癌(LNCaP，图4)和结肠癌(LOVO，图5和6)的皮下异种移植物的活体内功效。使N87、LOVO和LNCaP的皮下肿瘤在无胸腺裸鼠(Charles River，Wilmington，MA)中生长。将1.5至3月龄的雌性小鼠每只小鼠分别注射5×106个N87细胞或107个LOVO细胞。在3月龄的雄性裸鼠中注射LNCaP细胞。为生长肿瘤，在注射前N87和LNCaP细胞必需与MATRIGEL(Collaborative Biomedical Products，Belford，MA)混合(1∶1，体积/体积)。借助于测径器每周至少一次测量肿瘤的两个垂直直径。根据Attia和Weiss的公式：A2×B×0.4计算肿瘤体积。
除非另外说明，否则以4天的时间间隔腹膜内给予3次剂量的各结合物和对照(Q4D×3)。在活体内，hu3S193-AcBut-CM在其三个单独模型中抑制肿瘤生长。Hu3S193-AcBut-CM治愈了具有高Lewis Y抗原表达的胃癌异种移植物(N87)的小鼠(图3)。在投予hu3S193-AcBut-CM后前列腺癌异种移植物(LNCaP)停止生长，且用结肠癌异种移植物(LOVO)获得肿瘤生长抑制(分别为图5和6)。在LOVO模型中，hu3S193-AcBut-CM的功效通过增加结合物的量而得以提高(图5)。
N87胃癌异种移植物
将带有100mm3N87(Ley+，CD33-和CD20-)异种移植物的小鼠用对照结合物(CMA，RITUXAN-AcBut-CM)、PBS、hu3S193或hu3S193-AcBut-CM处理。在各群组中的小鼠接受三次腹膜内给药。在第1、5和9天注射结合物和对照。图3A展示对照结合物的功效且图3B说明hu3S 193和其卡奇霉素结合物的效应。误差条表示在各时间点平均肿瘤体积的标准偏差。在带有肿瘤的小鼠的治疗群组中肿瘤尺寸的差异通过双尾Students t检验探查，第28天的p值展示于C中，其n等于每群的小鼠数量。以1、2和4微克卡奇霉素当量/剂量/小鼠，hu3S193-AcBut-CM显著抑制N87异种移植物的肿瘤生长(图3)。在4、2和1微克卡奇霉素当量/剂量/小鼠下也分别观察到100、60和10％的治愈率，说明在治疗后100天期间异种移植物的尺寸降低且从未超过初始平均肿瘤体积。
LNCAP前列腺癌异种移植物
将具有LNCaP前列腺肿瘤的小鼠用hu3S193-AcBut-CM、PBS或对照结合物CMA处理治疗。图例中括号之间的数字指示每只小鼠每剂量的卡奇霉素的量。由双尾Studentst检验探查所处理群组中肿瘤尺寸的差异。报导第30天的p值且n等于小鼠数。如图4所示，在相等或更低剂量下对照结合物对肿瘤生长的抑制程度比等量或更低剂量的hu3S193-AcBut-CM要低。此外，在用对照结合物处理后观察到0％治愈率。当以相当于给予有4微克卡奇霉素当量Hu3S193-AcBut-CM的蛋白量(120微克)的剂量和方案投予时，Hu3S193无效。先前实验展示以与hu3S193-AcBut-CM相等的剂量投予卡奇霉素并不抑制目前为止的任何所测试的肿瘤模型。因此在当前的研究中已略去投予卡奇霉素作为对照。
LOVO结肠癌异种移植物
hu3S193-AcBut-CM抑制肿瘤生长的能力也在结肠癌(LOVO)模型中证明。将具有100mm3的LOVO异种移植物的小鼠用对照结合物(RITUXAN-AcBut-CM，图5A)、PBS(图5A和5B)、hu3S193(图5B)或hu3S193-AcBut-CM(图5B)处理。除了用4微克/剂量的Hu3S193-AcBut-CM处理的组外，各组中的小鼠均接受三次腹膜内给药。在图例中指出以卡奇霉素当量表示的每次给药的量。在第1、5和9天注射结合物和对照。如下命名各组：hu3S193-AcBut-CM组在第43、47和51天接受三次额外给药。每组中小鼠的数量(n)报导于C中。由双尾Students t检验探查在第30天肿瘤尺寸差异的统计显著性。
Hu3S193抑制LOVO异种移植物的生长的程度比所观察到的对N87异种移植物的抑制程度低。对照结合物(RITUXAN-AcBut-CM或CMA)产生的肿瘤抑制可忽略。由hu3S193-AcBut-CM引起的抑制比对照结合物持续时间更长。因此，一方面用每小鼠4和2微克卡奇霉素当量的剂量(Q4D×3)的RITUXAN-AcBut-CM处理后的肿瘤尺寸与另一方面用PBS处理后的肿瘤尺寸之间的差异仅在16天内显著(p＜0.05)。
相反，用每小鼠4、2和1微克卡奇霉素当量剂量(Q4D×3)的hu3S193-AcBut-CM处理产生与PBS处理在统计学上的差异性分别历时43、22和16天。将带有100mm3的LOVO异种移植物的小鼠用对照结合物处理：RITUXAN-AcBut-CM和CMA(图6A)、PBS或hu3S193-AcBut-CM(图6B)。在各组中的小鼠接受四次腹膜内给药。在图例中以卡奇霉素当量说明了每次给药的量。在第1、5和9天注射结合物和对照。命名为：hu3S193-AcBut-CM*的群组在第13天接受额外剂量。每组中小鼠的数量等于n且测定双尾Students t检验的p值。
HCT8S11结肠癌异种移植物
测试带有HCT8S11结肠癌异种移植物的小鼠以测定hu3S193-AcBut-CM的活体内活性。将靶向CD20的结合卡奇霉素的利妥昔单抗用作非结合对照。以80或160毫克/千克IP Q4Dx3投予结合物。图21展示结合卡奇霉素的hu3S193能够在小的和大的肿瘤中产生对HCT8S11结肠癌异种移植物生长的强烈抑制。靶向Lewis Y的结合物的抗肿瘤活性总是大于靶向CD20或CD33的非特异性非结合结合物的活性。
CMD-193
对来自胃癌(N87)、肺癌(L2987)、子宫颈癌/表皮样癌(A431/Ley)和结肠癌(LS174T和LOVO)的皮下异种移植物测试CMD-193的活体内功效。除非另外说明，否则所有结合物和对照均根据Q4DX3进程腹膜内注射。为监测由于免疫球蛋白的载体功能的肿瘤靶向性，将CMA用作阴性对照。基于以下所述的研究，认为15毫克/千克的CMD-193的剂量(相当于562至803mg/m2范围内的结合抗体蛋白剂量)为最低有效剂量(MED)。
N87胃癌异种移植物
将带有150mm3的N87异种移植物的小鼠用对照结合物(CMA)、PBS、G193-AcBut-CM、hu3S193-AcBut-CM、G193或hu3S193处理。在各组中的小鼠接受三次腹膜内给药。在图例中以卡奇霉素当量说明了每次给药的量。在第1、5和9天注射结合物和对照。图10A展示对照结合物的功效。图10B说明CMD-193和hu3S193-AcBut-CM的效应，而图10C证明游离抗体缺乏功效。误差条表示在各时间点平均肿瘤体积的标准偏差。
在相等剂量下，CMA抑制生长明显比hu3S193-AcBut-CM或CMD低。在4微克卡奇霉素当量/剂量/小鼠的剂量下，hu3S193-AcBut-CM以及G193-AcBut-CM(CMD)治愈小鼠的N87异种移植物(图10)。特定而言，在分别投予4微克卡奇霉素当量的hu3S193-AcBut-CM或CMD后，40％和60％的小鼠的肿瘤得到治愈。术语治愈指示在治疗后100天期间内异种移植物的尺寸降低且从未超过初始平均肿瘤体积。此外，在2微克卡奇霉素当量/剂量/小鼠的剂量下由hu3S193-AcBut-CM或CMD引起的肿瘤生长抑制也相等(图10)。早期实验展示以相当于hu3S193-AcBut-CM的剂量投予CM从未抑制任何当前所描述的肿瘤模型(数据未展示)。因而略去投予CM作为对照。
G193以及hu3S193并不抑制N87异种移植物的生长。
L2987肺癌异种移植物
将带有100mm3的L2987异种移植物的小鼠用对照结合物(CMA)、PBS或CMD处理。在各组中的小鼠接受三次腹膜内给药。在图例中以卡奇霉素当量说明了每次给药的量。在第1、5和9天注射结合物和对照。图11A展示对照结合物的功效且图11B说明CMD的效应。误差条表示在各时间点平均肿瘤体积的标准偏差。在图12中将各组中肿瘤尺寸小于初始肿瘤平均值的小鼠的数量(表示为百分比)作图为观察时期的函数。将CMA处理(图12A)或CMD处理(图12B)与媒剂对照(PBS)处理比较。
图12展示在0.375至3微克/剂量/小鼠的剂量范围内CMD抑制L2987生长。此抑制的选择性的解释受制于两个因素。首先，CMA在此肿瘤模型中发挥明显的生长抑制效应(图12)。在较低剂量下，此抑制低于由CMD产生的抑制。其次，对照组中10只小鼠中有两只出现肿瘤的自发退化(图12)。然而，在用CMD处理的群组中每组中退化肿瘤的数量明显高于用CMA处理的群组。CMD也抑制所建立的L2987异种移植物的生长。
对于图13中所示的实验，10只小鼠接受L2987异种移植物。生长所述肿瘤直至其达到1.25cm3的平均体积。将其中肿瘤体积大于0.5cm3(意即0.66、1.97和1.11cm3)的三只小鼠用三次剂量的4微克卡奇霉素当量CMD(Q4DX3)处理。在30天的时期内所述肿瘤首次给药后缩小。但是足够的残余疾病残留使得所述肿瘤会重新生长。一只具有2.31cm3的肿瘤的小鼠也接受4微克卡奇霉素当量CMD(Q4DX3)。这一较大肿瘤不对所述疗法反应且所述小鼠因伦理原因在第三次注射前必须被杀死。因此，三次剂量的4微克卡奇霉素当量CMD(Q4DX3)足以抑制体积在0.66和1.97cm3之间的L2987肿瘤的肿瘤生长但不足以治愈。误差条表示在各时间点平均肿瘤体积的标准偏差。
A431/LEY表皮样癌异种移植物
也评估A431/Ley表皮样癌的CMD-193生长抑制。将带有约300mm3的A431/Ley异种移植物的小鼠用PBS或CMD处理。在各组中的小鼠接受三次腹膜内给药。在图例中以卡奇霉素当量说明了每次给药的量。在第1、5和9天注射结合物和对照。误差条表示在各时间点平均肿瘤体积的标准偏差。结果展示于图14。将带有约100mm3的A431/Ley异种移植物的小鼠也用对照结合物(CMA)、PBS或CMD处理。在各组中的小鼠接受三次腹膜内给药。在图例中以卡奇霉素当量说明了每次给药的量。在第1、5和9天注射结合物和对照。结果展示于图15；图15A展示对照结合物的功效且图15B说明CMD的效应。误差条表示在各时间点平均肿瘤体积的标准偏差。
如图14和15所示，A431/Ley的CMD肿瘤抑制的特异性的解释也因肿瘤的自发退化和CMA引起的生长抑制而变得复杂。用相当剂量的CMD或CMA处理后所治愈的小鼠的数量的比较(图16)说明CMD治疗的选择性优势。
LS174T结肠癌异种移植物
用CMD处理后LS174T异种移植物的生长抑制并不如前述肿瘤明显；但其比对照结合物更有效(图17)。将带有150mm3的LS174T异种移植物的小鼠用对照结合物(CMA)、PBS或CMD处理。在各组中的小鼠接受三次腹膜内给药。在图例中以卡奇霉素当量说明了每次给药的量。在第1、5和9天注射结合物和对照。LS174T肿瘤增殖得如此之快以至于在对照组中由于大的肿瘤负担(＞2.5cm3)所有小鼠在51天的时期内必须被杀死。在用4微克卡奇霉素当量CMD(Q4DX3)处理的组中，5只小鼠中有3只由于大的肿瘤负担(1/3)或由于肿瘤坏死(2/3)在44天内被杀死。在另外两只小鼠中一只历时125天仍无肿瘤而另一只产生了一个小的肿瘤。在用2微克卡奇霉素当量CMD(Q4DX3)或4微克卡奇霉素当量CMD(Q4DX3)处理的组中未观察到治愈。相反，在用2微克卡奇霉素当量CMA(Q4DX3)处理的五只小鼠中有一只被治愈。图17A展示对照结合物的功效且图17B说明CMD的效应。误差条表示在各时间点平均肿瘤体积的标准偏差。
LOVO结肠癌异种移植物
测试带有LOVO异种移植物的小鼠以研究不同于Q4DX3的4微克卡奇霉素当量/剂量/小鼠的疗法的潜在益处。将带有约100mm3的LOVO异种移植物的小鼠用PBS、G193或对照结合物CMA或CMD的各种疗法处理。在图例中以卡奇霉素当量说明了每次给药的量。由于利用Q4DX3的4微克卡奇霉素当量所见的边缘功效，所以选择LOVO模型用于这一类型的实验。
图18A展示CMA和G193功效缺失。图18B和18C分别说明Q4DX3和Q4DX4的CMD的效应。图18D和18E展示当以各种时间间隔给予时CMD的功效。误差条表示在各时间点平均肿瘤体积的标准偏差。在用CMD处理后LOVO异种移植物的生长抑制并不如前述肿瘤明显。但是，其暗示添加第四次给药、降低注射时间间隔以及以更高频率投予较低剂量增强CMD的功效。
MX1乳癌异种移植物
也在MX1乳癌中检测CMD-193对所建立的具有低Lewis Y抗原表达的癌的异种移植物的生长的效应。将CMA-676用作非结合对照结合物。将移植有MX1乳癌的裸鼠用各种剂量的CMD-193(40至240mg/kg)或CMA-676(阴性对照)处理。记录肿瘤生长至少35天。如图22所示，低至80mg/kg的剂量的CMD-193引起MX1异种移植物生长的明显生长抑制。相反，CMA-676仅在所测试的最高剂量(160mg/kg)有效。
CMD-193的最大非致死剂量
对于说明于图19的实验，使用10只小鼠的八个群组。每4天总投药三次(Q4DX3)以0至9.9微克卡奇霉素当量(0至396微克/千克)范围内的递增剂量向各组投予CMD并监控其存活率历时高达105天。在整个观察期间用媒剂处理的对照组具有一例致死。产生类似致死率的最高剂量为5.7微克卡奇霉素当量CMD。由于此例致死出现得比对照组早，因此人们会认为其是因为药物相关的毒性。在所处理的小鼠中高于或等于284微克/千克的剂量产生显著更高的致死率而用7.1、8.5和9.9微克卡奇霉素当量处理不仅产生明显更高的致死率，也产生比用媒剂对照处理更早的致死发作。用低于或等于228微克/千克的剂量的CDM-193处理的小鼠的存活率类似于媒剂对照小鼠中的存活率。综上所述，所述数据说明CMD的最大非致死剂量(MND)为5.7微克卡奇霉素当量(228微克/千克，其相当于8.5至12.2mg/m2范围内的结合抗体蛋白剂量)Q4DX3。在大多数肿瘤模型中所述MND比有效剂量(MED)高出很多，例如假设在L2987模型中其MED为15微克/千克，CMD-193展现其中治疗指数(MND/MED)为19的强抗肿瘤活性。
实例6.毒理学
在小鼠和大鼠中以单剂量静脉内(IV)毒性研究且在大鼠和犬中以剂量范围和重复剂量、4循环(循环为1剂量/2周)静脉内毒性研究来评估结合物CMD 193的毒性。也进行毒性动力学和免疫原性评估作为在大鼠和犬中的4循环毒性研究的部分。
以细菌反向突变和小鼠微核检定评估的CMD-193基因毒性潜能。
在大鼠和犬(经选择用于表达Lewis Y抗原)中单剂量或重复剂量投予CMD-193通常产生类似的活体效应(指示骨髓和淋巴器官毒性的体重和食物消耗降低以及血液学改变)和靶器官毒性。总体而言，CMD-193的毒性在大鼠和犬中相当。在雄性和雌性中观察到相当的化合物相关结果。在两种物种中毒性的靶器官均为骨髓、胸腺和雄性生殖器官。肝脏(大鼠中)和胃肠(GI)道(犬中)也为靶器官。在大鼠和犬中的多个靶器官中的CMD-193相关效应的观察结果符合归因于CMD-193中的未结合卡奇霉素衍生物的非特异性细胞毒性；但是经CMD-193处理的犬中的GI改变也可反映如在组织交叉反应性研究中所观察到的G193抗体与胃肠道上皮细胞的结合和随后细胞毒性未结合卡奇霉素衍生物的释放。
单剂量静脉内研究
在大鼠中的单剂量静脉内(IV)安全性药理学研究中，1.18、3.54或10.69毫克蛋白/平方米的剂量的CMD-193并不对中枢神经系统(CNS)或呼吸系统产生任何不利效应。在犬中的单剂量心血管安全性药理学研究中，1.3或6.7毫克蛋白/平方米的剂量的CMD-193并不产生心率或动脉血压的不利改变。在6.7毫克蛋白/平方米剂量下检测的任何心电图(ECG)中并无形态异常、异常动脉或静脉节律不齐或化合物相关QTc延长的迹象(ECG未在1.3毫克蛋白/平方米下检测)。
当作为单剂量静脉内投予时，CMD-193的最高非致死剂量在小鼠中为15.30毫克蛋白/平方米且在大鼠中为30.09毫克蛋白/平方米；其为基于76毫克/毫升(卡奇霉素当量)的最大浓度和5毫升/千克的最大给药量的最大可行剂量。不产生不利效应的剂量对于小鼠为15.30毫克蛋白/平方米且对于大鼠为15.81毫克蛋白/平方米。
剂量范围研究
在利用CMD-193的剂量范围研究中，在12毫克蛋白/平方米的最高测试单剂量下一只犬中出现必需实行安乐死的垂死性；垂死性是因为轻度到中度的粘膜退化和坏死的CMD-193相关胃肠改变。在任何测试剂量(高达30.09毫克蛋白/平方米)下未发现死亡或选择进行安乐死的大鼠。
4循环研究
在4循环毒性研究中，所投予的CMD-193的剂量在大鼠中为0.55、1.98或5.55毫克蛋白/平方米/循环且在犬中为0.36、1.2或3.59毫克蛋白/平方米/循环。在所述研究中，在大鼠中以5.55毫克蛋白/平方米/循环的剂量且在犬中以3.59毫克蛋白/平方米/循环的剂量单独投予G193抗体。CMD-193的最大耐受剂量(MTD)在大鼠中为5.55毫克蛋白/平方米/循环且在犬中为3.59毫克蛋白/平方米/循环(所投予的最高剂量)；所述剂量并不引起剂量限制或生命威胁性毒性。在大鼠中的4循环研究中，CMD-193的未观察到不利效应的水平(NOAEL)并未在雄性中基于在0.55毫克蛋白/平方米/循环的剂量下观察到的微观观察结果(睾丸管萎缩)建立。基于5.55毫克蛋白/平方米/循环剂量下在雄性和雌性中的肝细胞巨核/巨细胞，在大鼠中的4循环研究中雌性中的NOAEL为0.98毫克蛋白/平方米/循环。在犬中的4循环研究中，雄性中CMD-193的NOAEL并未基于0.36毫克蛋白/平方米/循环的剂量下的微观观察结果(睾丸管退化，其中二级附睾精子过少且附睾上皮轻微退化)建立。基于在雄性和雌性中在3.59毫克蛋白/平方米/循环的剂量下在胃肠道中粘膜上皮退化的微观观察结果，在犬中的4循环研究中在雌性中CMD-193的NOAEL为1.2毫克蛋白/平方米/循环。
在大鼠的4循环毒性研究中，5.55毫克蛋白/平方米/循环的单独的G193抗体的测试剂量并不产生任何G193抗体相关毒性。在犬的4循环毒性研究中，3.59毫克蛋白/平方米/循环的单独的G193抗体的测试剂量并不产生任何剂量限制或生命威胁性毒性。在犬中的所述研究中的G193抗体相关毒性包括轻微的睾丸管退化和轻微的胃粘膜退化。
进行G193抗体、未结合(游离)卡奇霉素衍生物和总卡奇霉素衍生物(仅在大鼠中)的毒性动力学评估以及在大鼠中对CMD-193具有特异性和在犬中对G193抗体具有特异性的抗体的存在的测定以作为4循环重复剂量静脉内毒性研究的部分。
基因毒性研究
CMD-193在细菌反向突变检定中为诱变阴性但在活体内小鼠微核检定中为致染色体断裂性的。在这一检定中的阳性反应为预期的且符合由卡奇霉素和其他烯二炔抗肿瘤抗生素诱发的DNA断裂。
交叉反应性研究
在交叉反应性研究中，未结合的G193抗体在大鼠和犬的唾液腺和胃肠道中和仅仅犬的胰腺和肝脏(胆上皮)中展示特异性染色。在其他研究中，在大鼠、犬和人类中利用G193抗体的最突出和一致的染色是在胃肠道(大肠和胃的上皮)、泌尿膀胱(上皮)、阴道(上皮)和垂体(腺垂体的内分泌细胞)中。由于在大鼠、犬和人类中CMD-193的G193抗体组份与Lewis Y抗原表达相关组织交叉反应，所以此等结果证明大鼠和犬为用于利用CMD-193进行的非临床研究的适当物种。
实例7.抗LEWIS Y抗体卡奇霉素的稳定调配物
制备用于活体内投药的抗Lewis Y抗体卡奇霉素的稳定调配物(hu3S193-AcBut-CM和CMD-193)。如下根据表8或9调配于20mM TRIS(pH8.0)中的约19毫克CMD-193以及100mM氯化钠。
表8
 成份  含量
 CMD-193  1mg/mL
 蔗糖  5％
 TRIS  20mM
 氯化钠  50mM
 盐酸1N  将pH调节为7.5和8.0
 注射用水  补足
表9
 活性成份  非活性成份
 CMD-193(5毫克)满体积mL  5％蔗糖0.01％吐温8010mM氯化钠20mM TRIS将pH用HCl调节至8.0
冻干两批CMD-193。调配物的差异为pH，其中一个在pH7.5下缓冲，且另一个是杂pH8.0下缓冲。将四瓶pH8.0调配物与注射用水重构且在聚丙烯管中合并。测量pH且接着将溶液分为四份并放置于25℃。类似地使用四瓶以在pH7.5下建立类似研究。当将溶液合并时，pH必须用0.1N盐酸重新调节至7.5。另外四瓶也用以产生pH7.0的溶液。将溶液用于初始分析且将剩余在25℃保存于稳定腔室中。接着在2天和7天后分析溶液并将结果展示于下表10中(25℃下历时1周pH7.0、7.5和8.0的CMD-193本体溶液的稳定性)。25℃下1周后在pH7.0和pH7.5溶液中观察到溶液混浊并观察到透明沉淀。基于所述结果，在三种情形下在pH8.0下缓冲的溶液产生最佳稳定性且将TRIS选为缓冲剂。
表10
 天数              pH  未结合卡奇霉素(微克/毫克蛋白)          聚集(％)
 pH  7.0  7.5  8.0  7.0  7.5  8.0  7.0  7.5  8.0
 0  7.056  7.432  8.039  0.50  0.41  0.61  3.25  3.38  3.33
 2  2.09  1.83  1.69  2.47  3.06  3.25
 7  6.919  7.321  7.933  6.24  5.52  4.63  1.87  2.60  3.34
在另一实例中，使用于20mM TRIS(pH8.0)中的约35毫克CMD-193以及100mM氯化钠。因此，制备另外两种CMD-193调配物。第一种调配物含有5％蔗糖并用TRIS在pH8.0下缓冲。最终调配物描述于下表11中。
表11
 成份  含量
 CMD-193  1mg/mL
 蔗糖  5％
 TRIS  20mM
 氯化钠  50mM
 盐酸1N  将pH调节为8.0
 注射用水  补足
为制备第二种调配物，将所用CMD-193的浓缩物(总蛋白2.23mg/mL)用注射用水稀释从而蛋白浓度为1mg/mL。随后将所述溶液使用可渗透小于30,000道尔顿(Dalton)的分子的centricon过滤器单元离心。当溶液体积减半时，接着将其用5mMK2HPO4、50mM NaCl、10％蔗糖溶液稀释。最终调配物描述于下表12中。
表12
 成份  含量
 CMD-193  1mg/mL
 蔗糖  5％
 K2HPO4(缓冲剂交换)  5mM
 氯化钠  50mM
 盐酸1N  将pH调节至7.5
 注射用水  补足
将在pH7.5和pH8.0下制备的CMD-193的小瓶用表13中列出的各种溶液重构(第二调配物)，表3展示用不同溶液重构的CMD-193的视觉检查，且观察小瓶的可见颗粒。在所有情形下，在pH8.0缓冲的溶液比在pH7.5下缓冲的溶液清澈。在所有情形下添加表面活性剂有利。将在所述用注射用水(wfi)重构的小瓶中的沉淀过滤并收集用于显微镜检测。
表13
 pH  重构溶液   观察
 7.5  wfi  沉淀
 7.5  0.01％吐温80  清澈
 7.5  0.1％吐温80  清澈
 7.5  0.1％帕洛沙姆188  轻微混浊
 7.5  10％丙二醇  沉淀
 8.0  wfi  沉淀
 8.0  0.01％吐温80  清澈
 8.0  0.1％吐温80  清澈
 8.0  0.1％帕洛沙姆188  清澈
 8.0  10％丙二醇  清澈
根据以上，发现向溶液添加表面活性剂为确保可溶性所必需。选择吐温80(0.01％)以维持1mg/ml的溶解度。最终调配物含有5％蔗糖、0.01％吐温80、20mM TRIS(pH8.0)和50mM氯化钠。
使用另外两批CMD-193。第一批使用HIC接着超滤纯化，且第二批直接在结合后通过超滤。如下表13和14调配所述两种调配物。
表14
 成份  含量
 CMD-193  1mg/mL
 蔗糖  5％
 TRIS  20mM
 氯化钠  50mM
 盐酸1N  将pH调节为8.0
 注射用水  补足
如下进行并概述在5℃下本体溶液(表15)和在25℃下冻干产物(表16)的稳定性。
表15
 初始  1周  2周
 LIMS#  200272733   200273196  200273639
 App和Desc；块  一致   一致  一致
 App和Desc；重构  一致   一致  一致
 蛋白含量(mg/mL)  1.05   1.06  1.06
 总卡奇霉素(微克/毫克蛋白)  66
 未结合卡奇霉素(％总卡奇霉素)  1.13    2.31   2.64
 聚集体(％)  3.02    3.39   3.32
 pH重构  7.83    7.79   7.71
 SDS-PAGE还原(％)  100   100
 抗原结合ELISA  108
 未结合抗体(％)  1.77
表16
 初始  2周  4周
 LIMS#  200273198200273204  200274024  200274713200274715
 App和Desc；块  一致  一致  一致
 App和Desc；重构  一致  一致  一致
 蛋白含量(毫克/小瓶)   0.99  0.99  0.98
 总卡奇霉素(微克/毫克蛋白)   67  67
 未结合卡奇霉素(％总卡奇霉素)   1.11  1.59  1.56
 聚集体(％)   3.32  3.17  3.18
 pH重构   7.76  7.78  7.75
 水分   0.95  1.19
 SDS-PAGE还原(％)  100
 抗原结合ELISA(％)  99
稀释和投药
用于注射的CMD-193作为20毫升琥珀色玻璃瓶中的无菌白色、无防腐剂、冻干粉末供应。各单瓶包装含有5毫克CMD193冻干粉末。用于注射的CMD-193也可为冷冻的(2至8℃/36至46)并避光。
所述药物产物为光敏感性的且在制备和投予期间可避免直接和键结日光照射并无需屏蔽荧光。所有制备优选地在生物安全柜内进行。冻干药物无需将小瓶平衡至室温即可重构。使用无菌注射器用5毫升无菌注射用水USP重构各小瓶的内容物。可使用轻柔涡旋以有助于此过程。在重构后和在投药前，视觉检查各小瓶药物的颗粒物质和变色。重构溶液的最终浓度为1毫克/毫升。
不推荐含有苄基醇或任何其他防腐剂的无菌注射用水USP用于重构用于注射的CMD-193。
重构后，将药物溶液进一步稀释于注射用0.9％氯化钠USP中并在重构小瓶后4小时内投予。用于注射的CMD-193的重构小瓶应决不允许冷冻。
为产生用于投药的最终剂量，将适当量的重构药物注射入足够的注射用0.9％氯化钠USP中以产生50毫升的最终体积。混合物包或容器由聚烯烃组成或含有聚乙烯衬里的接触表面和紫外UV光保护剂。
用于注射的CMD-193不应作为静脉内推注或快速注射投予。
患者通过静脉内灌输以恒定速率经1小时(±15分钟)时期经由程序控制灌输泵接受混合物溶液(总剂量)。尽管灌输容器应避光，但灌输管不必避光。灌输管可为聚烯烃或聚乙烯衬里的。投予CMD-193时应使用嵌入式过滤器。
所有以上引用的参考文献和专利均以引用的方式并入本文中。本发明的多种修改和改变包括于以上确定的说明书中并预期对于所属领域的技术人员是显而易见的。认为对结合方法、由所述方法制备的结合物以及对包含结合物的组合物/调配物的修改和改变涵盖于权利要求书的范畴中。
序列表
<110>惠氏公司
<120>卡奇霉素结合物
<130>AM101462.
<160>12
<170>PatentIn version3.2
<210>1
<211>49
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>引物序列
<400>1
Gly Cys Thr Thr Gly Gly Cys Gly Cys Gly Cys Ala Cys Thr Cys Cys
1               5                   10                  15
Gly Ala Gly Gly Thr Cys Cys Ala Ala Cys Thr Gly Gly Thr Gly Gly
            20                  25                  30
Ala Gly Ala Gly Cys Gly Gly Thr Gly Gly Ala Gly Gly Thr Gly Thr
        35                  40                  45
Thr
<210> 2
<211> 63
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>引物序列
<400>2
Gly Cys Gly Ala Cys Gly Thr Cys Gly Ala Cys Ala Gly Gly Ala Cys
1               5                   10                  15
Thr Cys Ala Cys Cys Thr Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Cys Gly Gly
            20                  25                  30
Thr Gly Ala Cys Cys Gly Gly Gly Gly Thr Cys Cys Cys Thr Thr Gly
        35                  40                  45
Gly Cys  Cys  Cys  Cys Ala Gly Thr Ala Ala Gly Cys Ala Ala Ala
    50                 55                  60
<210>3
<211>50
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>引物序列
<400>3
Gly Cys Thr Thr Gly Gly Cys Gly Cys Gly Cys Ala Cys Thr Cys Cys
1               5                   10                  15
Gly Ala Cys Ala Thr Cys Cys Ala Gly Ala Thr Gly Ala Cys Cys Cys
            20                  25                  30
Ala Gly Ala Gly Cys Cys Cys Ala Ala Gly Cys Ala Gly Cys Cys Thr
        35                  40                  45
Gly Ala
    50
<210>4
<211>63
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>引物序列
<400>4
Gly Cys Cys Cys Thr Thr Ala Ala Thr Thr Ala Ala Gly Thr Thr Ala
1               5                   10                  15
Thr Thr Cys Thr Ala Cys Thr Cys Ala Cys Gly Thr Gly Thr Gly Ala
            20                  25                  30
Thr Thr Thr Gly Cys Ala Gly Cys Thr Thr Gly Gly Thr Cys Cys Cys
        35                  40                  45
Thr Thr Gly Gly Cys Cys Gly Ala Ala Cys Gly Thr Gly Ala Ala
    50                  55                  60
<210>5
<211>60
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>引物序列
<400>5
Ala Ala Gly Ala Cys Ala Ala Ala Gly Cys Cys Gly Cys Gly Gly Gly
1               5                   10                  15
Ala Gly Gly Ala Gly Cys Ala Gly Thr Ala Cys Ala Gly Cys Ala Gly
            20                  25                  30
Cys Ala Cys Gly Thr Ala Cys Cys Gly Thr Gly Thr Gly Gly Thr Cys
        35                  40                  45
Ala Gly Cys Gly Thr Cys Cys Thr Cys Ala Cys Cys
    50                  55                  60
<210>6
<211>60
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>引物序列
<400>6
Gly Gly Thr Gly Ala Gly Gly Ala Cys Gly Cys Thr Gly Ala Cys Cys
1               5                   10                  15
Ala Cys Ala Cys Gly Gly Thr Ala Cys Gly Thr Gly Cys Thr Gly Cys
            20                  25                  30
Thr Gly Thr Ala Cys Thr Gly Cys Thr Cys Cys Thr Cys Cys Cys Gly
        35                  40                  45
Cys Gly Gly Cys Thr Thr Thr Gly Thr Cys Thr Thr
    50                  55                  60
<210>7
<211>60
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>引物序列
<400>7
Ala Ala Gly Ala Cys Ala Ala Ala Gly Cys Cys Gly Cys Gly Gly Gly
1               5                   10                  15
Ala Gly Gly Ala Gly Cys Ala Gly Thr Ala Cys Ala Ala Ala Ala Gly
            20                  25                  30
Cys Ala Cys Gly Thr Ala Cys Cys Gly Thr Gly Thr Gly Gly Thr Cys
        35                  40                  45
Ala Gly Cys Gly Thr Cys Cys Thr Cys Ala Cys Cys
    50                  55                  60
<210>8
<211>60
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>引物序列
<400>8
Gly Gly Thr Gly Ala Gly Gly Ala Cys Gly Cys Thr Gly Ala Cys Cys
1               5                   10                  15
Ala Cys Ala Cys Gly Gly Thr Ala Cys Gly Thr Gly Cys Thr Thr Thr
            20                  25                  30
Thr Gly Thr Ala Cys Thr Gly Cys Thr Cys Cys Thr Cys Cys Cys Gly
        35                  40                  45
Cys Gly Gly Cys Thr Thr Thr Gly Thr Cys Thr Thr
    50                  55                  60
<210>9
<211>60
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>引物序列
<400>9
Ala Ala Gly Ala Cys Ala Ala Ala Gly Cys Cys Gly Cys Gly Gly Gly
1               5                   10                  15
Ala Gly Gly Ala Gly Cys Ala Gly Thr Ala Cys Gly Ala Cys Ala Gly
            20                  25                  30
Cys Ala Cys Gly Thr Ala Cys Cys Gly Thr Gly Thr Gly Gly Thr Cys
        35                  40                  45
Ala Gly Cys Gly Thr Cys Cys Thr Cys Ala Cys Cys
    50                  55                  60
<210>10
<211>60
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>引物序列
<400>10
Gly Gly Thr Gly Ala Gly Gly Ala Cys Gly Cys Thr Gly Ala Cys Cys
1               5                   10                  15
Ala Cys Ala Cys Gly Gly Thr Ala Cys Gly Thr Gly Cys Thr Gly Thr
            20                  25                  30
Cys Gly Thr Ala Cys Thr Gly Cys Thr Cys Cys Thr Cys Cys Cys Gly
        35                  40                  45
Cys Gly Gly Cys Thr Thr Thr Gly Thr Cys Thr Thr
    50                  55                  60
<210>11
<211>60
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>引物序列
<400>11
Ala Ala Gly Ala Cys Ala Ala Ala Gly Cys Cys Gly Cys Gly Gly Gly
1               5                   10                  15
Ala Gly Gly Ala Gly Cys Ala Gly Thr Ala Cys Cys Ala Ala Ala Gly
            20                  25                  30
Cys Ala Cys Gly Thr Ala Cys Cys Gly Thr Gly Thr Gly Gly Thr Cys
        35                  40                  45
Ala Gly Cys  Gly Thr Cys Cys Thr Cys Ala Cys Cys
    50                   55                  60
<210>12
<211>60
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>引物序列
<400>12
Gly Gly Thr Gly Ala Gly Gly Ala Cys Gly Cys Thr Gly Ala Cys Cys
1               5                   10                  15
Ala Cys Ala Cys Gly Gly Thr Ala Cys Gly Thr Gly Cys Thr Thr Thr
            20                  25                  30
Gly Gly Thr Ala Cys Thr Gly Cys Thr Cys Cys Thr Cys Cys Cys Gly
        35                  40                  45
Cys Gly Gly Cys Thr Thr Thr Gly Thr Cys Thr Thr
    50                  55                  60
Seq.Id.No.13：
抗Lewis Y mAb(人源化  Hu3S193lgG1mut)pTDMLEYmutG1
    TATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGTACTGAGT
  1  ---------+---------+---------+---------+---------+---------+
60  ATACGCCACACTTTATGGCGTGTCTACGCATTCCTCTTTTATGGCGTAGTCCATGACTCA
a   Y  A  V     N  T  A  Q  M  R  K′E  K  I  P  H  Q  V  L  S
-
b    M  R  C  E  I  P  H  R  C  V  R  R  K  Y  R  I  R  Y     V
-
c     C  G  V  K  Y  R  T  D  A     G  E  N  T  A  S  G  T  E  S
-
      CATTAGGGACTTTCCAATGGGTTTTGCCCAGTACATAAGGTCAATAGGGGTGAATCAACA
  61  ---------+---------+---------+---------+---------+---------+120    GTAATCCCTGAAAGGTTACCCAAAACGGGTCATGTATTCCAGTTATCCCCACTTAGTTGT
a     H      G  L  S  N  G  F  C  P  V  H  K  V  N  R  G  E  S  T
-
b      I  R   D  F  P  M  G  F  A  Q  Y  I  R  S  I  G  V  N  Q  Q
-
c       L  G   T  F  Q  W  V  L  P  S  T     G  Q     G     I  N  R
-
       GGAAAGTCCCATTGGAGCCAAGTACACTGAGTCAATAGGGACTTTCCATTGGGTTTTGCC
  121  ---------+---------+---------+---------+---------+---------+
       CCTTTCAGGGTAACCTCGGTTCATGTGACTCAGTTATCCCTGAAAGGTAACCCAAAACGG
a      G  K  S  H  W  S  Q  V  H     V  N  R   D  F  P  L  G  F  A
-
b       E  S  P  I  G  A  K  Y  T  E  S  I  G   T  F  H  W  V  L  P
-
c        K  V  P  L  E  P  S  T  L  S  Q  *  G  L   S  I  G  F  C  P
-
       CAGTACAAAAGGTCAATAGGGGGTGAGTCAATGGGTTTTTCCCATTATTGGCACGTACAT
  181  ------------+---------+---------+---------+---------+---------+
240
       GTCATGTTTTCCAGTTATCCCCCACTCAGTTACCCAAAAAGGGTAATAACCGTGCATGTA
a      Q  Y  K  R  S  I  G  G  E  S  M  G  F  S  H  Y  W  H  V  H
-
b       S  T  K  G  Q     G  V  S  Q  W  V  F  P  I  I  G  T  Y  I
-
c        V  Q  K  V  N  R  G     V  N  G  F  F  P  L  L  A  R  T
-
       AAGGTCAATAGGGGTGAGTCATTGGGTTTTTCCAGCCAATTTAATTAAAACGCCATGTAC
    241  --------+---------+---------+---------+---------+---------+
300
         TTCCAGTTATCCCCACTCAGTAACCCAAAAAGGTCGGTTAAATTAATTTTGCGGTACATG
a        K  V  N  R  G  E  S  L  G  F  S  S  Q  F  N    N  A  M  Y
-
b         R  S  I  G  V  S  H  W  V  F  P  A  N  L  I  K  T  P  C  T
-
c          G  Q     G     V  I  G  F  F  Q  P  I     L  K  R  H  V  L
-
         TTTCCCACCATTGACGTCAATGGGCTATTGAAACTAATGCAACGTGACCTTTAAACGGTA
    301  ----------+---------+---------+---------+---------+---------+
360
         AAAGGGTGGTAACTGCAGTTACCCGATAACTTTGATTACGTTGCACTGGAAATTTGCCAT
a        F  P  T  I  D  V  N  G  L  L  K  L  M  Q  R  D  L    T  V
-
b         F  P  P  L  T  S  M  G  Y     N     C  N  V  T  F  K  R  Y
-
c          S  H  H     R  Q  W  A  I  E  T  N  A  T     P  L  N  G  T
-
         CTTTCCCATAGCTGATTAATGGGAAAGTACCGTTCTCGAGCCAATACACGTCAATGGGAA
    361  ---------+---------+---------+---------+---------+---------+
420      GAAAGGGTATCGACTAATTACCCTTTCATGGCAAGAGCTCGGTTATGTGCAGTTACCCTT
a        L  S  H  S  *  L  M  G  K  Y  R  S  R  A  N  T  R  Q  W  E
-
b         F  P  I  A  D  *  W  E  S  T  V  L  E  P  I  H  V  N  G  K
-
c          F  P     L  I  N  G  K  V  P  F  S  S  Q  Y  T  S  M  G  S
-
     GTGAAAGGGCAGCCAAAACGTAACACCGCCCCGGTTTTCCCCTGGAAATTCCATATTGGC
421  ---------+---------+---------+------------+---------+---------+
     CACTTTCCCGTCGGTTTTGCATTGTGGCGGGGCCAAAAGGGGACCTTTAAGGTATAACCG
a    V  K  G  Q  P  K  R  N  T  A  P  V  F  P  W  K  F  H  I  G
-
b     *  K  G  S  Q  N  V  T  P  P  R  F  S  P  G  N  S  I  L  A
-
c      E  R  A  A  K  T     H  R  P  G  F  P  L  E  I  P  Y  W  H
-
        ACGCATTCTATTGGCTGATACTGAGTCATTAGGGACTTTCCAATGGGTTTTGCCCAGTAC
   481  ---------+---------+---------+---------+---------+---------+
540     TGCGTAAGATAACCGACTATGACTCAGTAATCCCTGAAAGGTTACCCAAAACGGGTCATG
a       T  H  S  I  G    Y    V  I  R  D  F  P  M  G  F  A  Q  Y
-
b    R  I  L  L  A  D  T  E  S  L  G  T  F  Q  W  V  L  P  S  T
-
c     A  F  Y  W  L  I  L  S  H     G  L  S  N  G  F  C  P  V  H
-
       ATAAGGTCAATAGGGGTGAATCAACAGGAAAGTCCCATTGGAGCCAAGTACACTGAGTCA
   541 ---------+---------+---------+------------+---------+---------+
600
       TATTCCAGTTATCCCCACTTAGTTGTCCTTTCAGGGTAACCTCGGTTCATGTGACTCAGT
a      I  R  S  I  G  V  N  Q  Q  E  S  P  I  G  A  K  Y  T  E  S
-
b          G  Q     G     I  N  R  K  V  P  L  E  P  S  T  L  S  Q
-
c        K  V  N  R  G  E  S  T  G  K  S  H  W  S  Q  V  H     V  N
-
        ATAGGGACTTTCCATTGGGTTTTGCCCAGTACAAAAGGTCAATAGGGGGTGAGTCAATGG
   601  ---------+---------+---------+---------+---------+---------+
        TATCCCTGAAAGGTAACCCAAAACGGGTCATGTTTTCCAGTTATCCCCCACTCAGTTACC
a       I  G  T  F  H  W  V  L  P  S  T  K  G  Q    G  V  S  Q  W
-
b           G  L  S  I  G  F  C  P  V  Q  K  V  N  R  G  *  V  N  G
-
c         R  D  F  P  L  G  F  A  Q  Y  K  R  S  I  G  G  E  S  M  G
-
        GTTTTTCCCATTATTGGCACGTACATAAGGTCAATAGGGGTGAGTCATTGGGTTTTTCCA
   661  ---------+---------+-------------+---------+---------+-----------+
        CAAAAAGGGTAATAACCGTGCATGTATTCCAGTTATCCCCACTCAGTAACCCAAAAAGGT
a       V  F  P  I  I  G  T  Y  I  R  S  I  G  V  S  H  W  V  F  P
-
b        F  F  P  L  L  A  R  T      G  Q  *  G    V  I  G  F  F  Q
-
c         F  S  H  Y  W  H  V  H  K  V  N  R  G  E  S  L  G  F  S  S
-
        GCCAATTTAATTAAAACGCCATGTACTTTCCCACCATTGACGTCAATGGGCTATTGAAAC
    721 -----------+---------+---------+---------+---------+---------+
780
        CGGTTAAATTAATTTTGCGGTACATGAAAGGGTGGTAACTGCAGTTACCCGATAACTTTG
a       A  N  L  I  K  T  P  C  T  F  P  P  L  T  S  M  G  Y    N
-
b        P  I     L  K  R  H  V  L  S  H  H     R  Q  W  A  I  E  T
-
c         Q  F  N      N  A  M  Y  F  P  T  I  D  V  N  G  L  L  K  L
-
        TAATGCAACGTGACCTTTAAACGGTACTTTCCCATAGCTGATTAATGGGAAAGTACCGTT
   781  ---------+---------+---------+---------+---------+---------+
840
        ATTACGTTGCACTGGAAATTTGCCATGAAAGGGTATCGACTAATTACCCTTTCATGGCAA
a          C  N  V  T  F  K  R  Y  F  P  I  A  D    W  E  S  T  V
-
b        N  A  T     P  L  N  G  T  F  P      L  I  N  G  K  V  P  F
-
c         M  Q  R  D  L      T  V  L  S  H  S      L  M  G  K  Y  R  S
-
        CTCGAGCCAATACACGTCAATGGGAAGTGAAAGGGCAGCCAAAACGTAACACCGCCCCGG
        ---------+---------+---------+---------+---------+---------+
900
        GAGCTCGGTTATGTGCAGTTACCCTTCACTTTCCCGTCGGTTTTGCATTGTGGCGGGGCC
a       L  E  P  I  H  V  N  G  K    K  G  S  Q  N  V  T  P  P  R
-
b        S  S  Q  Y  T  S  M  G  S  E  R  A  A  K  T    H  R  P  G
-
c         R  A  N  T  R  Q  W  E  V  K  G  Q  P  K  R  N  T  A  P  V
-
        TTTTCCCCTGGAAATTCCATATTGGCACGCATTCTATTGGCTGAGCTGCGTTCTACGTGG
   901  ---------+---------+---------+---------+---------+-------+
960
        AAAAGGGGACCTTTAAGGTATAACCGTGCGTAAGATAACCGACTCGACGCAAGATGCACC
a       F  S  P  G  N  S  I  L  A  R  I  L  L  A  E  L  R  S  T  W
-
b        F  P  L  E  I  P  Y  W  H  A  F  Y  W  L  S  C  V  L  R  G
-
c         F  P  W  K  F  H  I  G  T  H  S  I  G     A  A  F  Y  V  G
-
        GTATAAGAGGCGCGACCAGCGTCGGTACCGTCGCAGTCTTCGGTCTGACCACCGTAGAAC
        ---------+---------+---------+---------+---------+---------+
1020
        CATATTCTCCGCGCTGGTCGCAGCCATGGCAGCGTCAGAAGCCAGACTGGTGGCATCTTG
a       V    E  A  R  P  A  S  V  P  S  Q  S  S  V  *  P  P  *  N
-
b        Y  K  R  R  D  Q  R  R  Y  R  R  S  L  R  S  D  H  R  R  T
-
c         I  R  G  A  T  S  V  G  T  V  A  V  F  G  L  T  T  V  E  R
-
          GCAGAGCTCCTCGCTGCAGCCCAAGCTCTGTTGGGCTCGCGGTTGAGGACAAACTCTTCG
    1021  ---------+---------+---------+---------+---------+---------+
1080
          CGTCTCGAGGAGCGACGTCGGGTTCGAGACAACCCGAGCGCCAACTCCTGTTTGAGAAGC
a         A  E  L  L  A  A  A  Q  A  L  L  G  S  R  L  R  T  N  S  S
b    Q  S  S  S  L  Q  P  K  L  C  W  A  R  G    G  Q  T  L  R
-
c     R  A  P  R  C  S  P  S  S  V  G  L  A  V  E  D  K  L  F  A
-
        CGGTCTTTCCAGTACTCTTGGATCGGAAACCCGTCGGCCTCCGAACGGTACTCCGCCACC
    1081---------+---------+---------+---------+---------+---------+
1140
        GCCAGAAAGGTCATGAGAACCTAGCCTTTGGGCAGCCGGAGGCTTGCCATGAGGCGGTGG
a       R  S  F  Q  Y  S  W  I  G  N  P  S  A  S  E  R  Y  S  A  T
-
b        G  L  S  S  T  L  G  S  E  T  R  R  P  P  N   G  T  P  P  P
-
c         V  F  P  V  L  L  D  R  K  P  V  G  L  R  T   V  L  R  H  R
-
          GAGGGACCTGAGCGAGTCCGCATCGACCGGATCGGAAAACCTCTCGACTGTTGGGGTGAG
    1141  ---------+---------+---------+---------+---------+---------+
1200      CTCCCTGGACTCGCTCAGGCGTAGCTGGCCTAGCCTTTTGGAGAGCTGACAACCCCACTC
a         E  G  P  E  R  V  R  I  D  R  I  G  K  P  L  D  C  W  G  E
-
b          R  D  L  S  E  S  A  S  T  G  S  E  N  L  S  T  V  G  V  S
-
c           G  T      A  S  P  H  R  P  D  R  K  T  S  R  L  L  G    V
-
       TACTCCCTCTCAAAAGCGGGCATGACTTCTGCGCTAAGATTGTCAGTTTCCAAAAACGAG
    1201---------+---------+---------+---------+---------+----------+
1260
        ATGAGGGAGAGTTTTCGCCCGTACTGAAGACGCGATTCTAACAGTCAAAGGTTTTTGCTC
a       Y  S  L  S  K  A  G  M  T  S  A  L  R  L  S  V  S  K  N  E
-
b        T  P  S  Q  K  R  A      L  L  R    D  C  Q  F  P  K  T  R
-
c         L  P  L  K  S  G  H  D   F  C  A  K  I  V  S  F  Q  K  R  G
-
          GAGGATTTGATATTCACCTGGCCCGCGGTGATGCCTTTGAGGGTGGCCGCGTCCATCTGG
    1261  ---------+---------+---------+---------+---------+---------+
1320      CTCCTAAACTATAAGTGGACCGGGCGCCACTACGGAACCCACCGGCGCAGGTAGACC
a         E  D  L  I  F  T  W  P  A  V  M  P  L  R  V  A  A  S  I  W
-
b          R  I     Y  S  P  G  P  R     C  L     G  W  P  R  P  S  G
-
c           G  F  D  I  H  L  A  R  G  D  A  F  E  G  G  R  V  H  L  V
-
                                                       BglII   MScI
         TCAGAAAAGACAATCTTTTTGTTGTCAAGCTTGAGGTGTGGCAGGCTTGAGATCTGGCCA
    1321 ---------+---------+---------+---------+---------+----------+
1380
         AGTCTTTTCTGTTAGAAAAACAACAGTTCGAACTCCACACCGTCCGAACTCTAGACCGGT
a        S  E  K  T  I  F  L  L  S  S  L  R  C  G  R  L  E  I  W  P
-
b         Q  K  R  Q  S  F  C  C  Q  A  *  G  V  A  G  L  R  S  G  H
-
c          R  K  D  N  L  F  V  V  K  L  E  V  W  Q  A  *  D  L  A  I
-
         TACACTTGAGTGACAATGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAGG
         ---------+---------+---------+---------+---------+---------+
1440
         ATGTGAACTCACTGTTACTGTAGGTGAAACGGAAAGAGAGGTGTCCACAGGTGAGGGTCC
a        Y  T    V  T  M  T  S  T  L  P  F  S  P  Q  V  S  T  P  R
-
b         T  L  E  *  Q    H  P  L  C  L  S  L  H  R  C  P  L  P  G
-
c          H  L  S  D  N  D  I  H  F  A  F  L  S  T  G  V  H  S  Q
-
          TCCAACTGCAgccaccATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTAC
    1441  ---------+---------+---------+---------+---------+---------+
1500      AGGTTGACGTcggtggTACCCTACCTCGACATAGTAGGAGAAGAACCATCGTTGTCGATG
a         S  N  C  S  H  H  G  M  E  L  Y  H  P  L  L  G  S  N  S  V
Figure A20058000842900801
c          Q  L  Q  P  P  W  D  G  A  V  S  S  S  S  W      Q  Q  L  Q
-
          AGGTAAGGGGTTAACAGTAGCAGGCTTGAGGTCTGGACATATATATGGGTGACAATGACA
    1501  ---------+---------+---------+---------+--------+---------+
1560
          TCCATTCCCCAATTGTCATCGTCCGAACTCCAGACCTGTATATATACCCACTGTTACTGT
a         R  *  G  V  N  S  S  R  L  E  V  W  T  Y  I  W  V  T  M  T
-
b          G  K  G  L  T  V  A  G  L  R  S  G  H  I  Y  G  *  Q     H
-
c           V  R  G     Q     Q  A      G  L  D  I  Y  M  G  D  N  D  I
-
                           BSSHII
        TCCACTTTGgCTTTCTCTCCACAGGCGCGCACTCCGAGGTCCAACTGGTGGAGAGCGGTG
        ---------+---------+---------+---------+---------+---------+
1620    AGGTGAAACcGAAAGAGAGGTGTCCGCGCGTGAGGCTCCAGGTTGACCACCTCTGGCCAC
a       S  T  L  A  F  S  P  Q  A  R  T  P  R  S  N  W  W  R  A  V
-
b        P  L  W  L  S  L  H  R  R  A  L  R  G  P  T  G  G  E  R  W
-
c         H  F  G  F  L  S  T
Figure A20058000842900811
        GAGGTGTTGTGCAACCTGGCCGGTCCCTGCGCCTGTCCTGCTCCACGTCTGGCTTCACTT
    1621---------+---------+---------+---------+---------+---------+
1680
        CTCCACAACACGTTGGACCGGCCAGGGACGCGGACAGGACGAGGTGCAGACCGAAGTGAA
a       E  V  L  c  N  L  A  G  P  c  A  c  P  A  P  R  L  A  s  L
-
b        R  C  C  A  T  W  P  V  P  A  P  V  L  L  H  V  W  L  H  F
Figure A20058000842900812
          TCAGTGACTATTACATGTATTGGGTGAGACAGGCACCTGGAAAAGGTCTTGAGTGGGTTG
    1681  ---------+---------+---------+---------+---------+---------+
1740
          AGTCACTGATAATGTACATAACCCACTCTGTCCGTGGACCTTTTCCAGAACTCACCCAAC
a         S  V  T  i  T  C  I  G    D  R  H  L  E  K  V  L  S  G  L
-
b          Q    L  L  H  V  L  G  E  T  G  T  W  K  R  S     V  G  C
          CATACATGAGTAATGTTGGTGCTATCACCGACTATCCAGACACTGTGAAGGGGAGATTTA
    1741  ---------+---------+---------+---------+---------+---------+
1800
          GTATGTACTCATTACAACCACGATAGTGGCTGATAGGTCTGTGACACTTCCCCTCTAAAT
a         H  T    V  M  L  V  L  S  P  T  I  Q  T  L    R  G  D  L
-
b          I  H  E    C  W  C  Y  H  R  L  S  R  H  C  E  G  E  I  Y
Figure A20058000842900814
          CAAITATCGAGAGACAACAGCAAGAACACATTGTTCCTGCAAATGGACAGCCTGAGACCCG
    1801  ---------+---------+---------+---------+---------+---------+
1860      GTTATAGCTCTCTGTTGTCGTTCTTGTGTAACAAGGACGTTTACCTGTCGGACTCTGGGC
a         Q  Y  R  E  T  T  A  R  T  H  C  S  C  K  W  T  A  *  D  P
-
b          N  I  E  R  Q  Q  Q  E  H  I  V  P  A  N  G  Q  P  E  T  R
Figure A20058000842900815
AAGACACCGGGGTCTATTTTTGTGCAAGAGGCACCCGTGATGGCTCGTGGTTTGCTTACT
    1861  ---------+---------+---------+---------+----------+---------+
1920
    TTCTGTGGCCCCAGATAAAAACACGTTCTCCGTGGGCACTACCGAGCACCAAACGAATGA
a   K  T  P  G  S  I  F  V  Q  E  A  P  V  M  A  R  G  L  L  T
-
b    R  H  R  G  L  F  L  C  K  R  H  P     W  L  V  V  C  L  L
Figure A20058000842900821
                                            SalI
          GGGGCCAAGGGACCCCGGTCACCGTCTCCTCAGGTGAGTCCTGTCGACggatcCACCCAA
    1921  ---------+---------+---------+-------+---------+---------+
          CCCCGGTTCCCTGGGGCCAGTGGCAGAGGAGTCCACTCAGGACAGCTGCCTAGGTGGGTT
a         G  A  K  G  P  R  S  P  S  P  Q  V  S  P  V  D  G  S  T  Q
-
b          G  P  R  D  P  G  H  R  L  L  R     V  L  S  T  D  P  P  N
Figure A20058000842900822
                                        G  E  S  C  R  R  I  H  P  M
          TGCCCATGAGCCCAGACACTGGACGCTGAACCTCGCGGACAGTTAAGAACCCAGGGGCCT
    1981  ---------+---------+---------+---------+---------+--------+
          ACGGGTACTCGGGTCTGTGACCTGCGACTTGGAGCGCCTGTCAATTCTTGGGTCCCCGGA
a         C  P    A  Q  T  L  D  A  E  P  R  G  Q  L  R  T  Q  G  D
-
b          A  H  E  P  R  H  W  T  L  N  L  A  D  S  *  E  P  R  G  L
-
c           P  M  S  P  D  T  G  R  *  T  S  R  T  V  K  N  P  G  A  S
-
          CTGCGCCCTGGGCCCAGCTCTGTCCCACACCGCGGTCACATGGCACCACCTCTCTTGCAG
    2041  ---------+---------+---------+---------+---------+---------+
2100
          GACGCGGGACCCGGGTCGAGACAGGGTGTGGCGCCAGTGTACCGTGGTGGAGAGAACGTC
a         L  R  P  G  P  S  S  V  P  H  R  G  H  M  A  P  P  L  L  Q
-
b          C  A  L  G  P  A  L  S  H  T  A  V  T  W  H  H  L  S  C  S
-
c           A  P  W  A  Q  IL  C  P  T  P  R  S  H  G  T  T  S  L  A
      CCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAAGCACCTCTGGGG
2101  ---------+---------+---------+---------+---------+---------+
      GGAGGTGGTTCCCGGGTAGCCAGAAGGGGGACCGTGGGAGGAGGTTCTCGTGGAGACCCC
a    P  P  P  R  A  H  R  S  S  P  W  H  P  P  P  R  A  P  L  G
-
b     L  H  Q  G  P  I  G  L  P  P  G  T  L  L  Q  E  H  L  W  G
Figure A20058000842900831
                                                  AgeI  TthlllI
          GCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGT
    2161  ---------+--------+---------+---------+----------+---------+
2220
          CGTGTCGCCGGGACCCGACGGACCAGTTCCTGATGAAGGGGCTTGGCCACTGCCACAGCA
a         A  Q  R  P  W  A  A  W  S  R  T  T  S  P  N  R  *  R  C  R
-
b          H  S  G  P  G  L  P  G  Q  G  L  L  P  R  T  G  D  G  V  V
Figure A20058000842900832
                    BbeI
                  SfoI ｜
                NarI｜ ｜
               KasI｜｜｜
                 ｜｜｜｜
          GGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAG
    2221  ----------+---------+---------+---------+---------+---------+
2280
          CCTTGAGTCCGCGGGACTGGTCGCCGCACGTGTGGAAGGGCCGACAGGATGTCAGGAGTC
a         G  T  Q  A  P    P  A  A  C  T  P  S  R  L  S  Y  S  P  Q
-
b          E  L  R  R  P  D  Q  R  R  A  H  L  P  G  C  P  T  V  L  R
          GACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAAGACCT
    2281  ---------+---------+---------+---------+---------+----------+
2340
    CTGAGATGAGGGAGTCGTCGCACCACTGGCACGGGAGGTCGTCGAACCCGTGGGTCTGGA
a   D  S  T  P  S  A  A  W    P  C  P  P  A  A  W  A  P  R  P
-
b    T  L  L  P  Q  Q  R  G  D  R  A  L  Q  Q  L  G  H  P  D  L
Figure A20058000842900834
          ACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAaAGTTGGTGAGA
    2341  ---------+---------+---------+---------+----------+---------+
2400
    TGTAGACGTTGCACTTAGTGTTCGGGTCGTTGTGGTTCCACCTGTTCTtTCAACCACTCT
a       T  S  A  T    I  T  S  P  A  T  P  R  W  T  R  K  L  V  R
-
b        H  L  Q  R  E  S  Q  A  Q  Q  H  Q  G  G  Q  E  S  W    E
-
c         I  C  N  V  N  H  K  P  S  N  T  K  V  D  K  K  V  G  E  R
-
        GGCCAGCACAGGGAGGGAGGGTGTCTGCTGGAAGCCAGGCTCAGCGCTCCTGCCTGGACG
    2401---------+---------+---------+---------+----+-----+---------+
2460    CCGGTCGTGTCCCTCCCTCCCACAGACGACCTTCGGTCCGAGTCGCGAGGACGGACCTGC
a       G  Q  H  R  E  G  G  C  L  L  E  A  R  L  S  A  P  A  W  T
-
b        A  S  T  G  R  E  G  V  C  W  K  P  G  S  A  L  L  P  G  R
-
c         P  A  Q  G  G  R  V  S  A  G  S  Q  A  Q  R  S  C  L  D  A
-
          CATCCCGGCTATGCAGTCCCAGTCCAGGGCAGCAAGGCAGGCCCCGTCTGCCTCTTCACC
    2461  ---------+---------+---------+---------+---------+--------+
2520      GTAGGGCCGATACGTCAGGGTCAGGTCCCGTCGTTCCGTCCGGGGCAGACGGAGAAGTGG
a         H  P  G  Y  A  V  P  V  Q  G  S  K  A  G  P  V  C  L  F  T
-
b          I  P  A  M  Q  S  Q  S  R  A  A  R  Q  A  P  S  A  S  S  P
-
c           S  R  L  C  S  P  S  P  G  Q  Q  G  R  P  R  L  P  L  H  P
-
          CGGAGGCCTCTGCCCGCCCCACTCATGCTCAGGGAGAGGGTCTTCTGGCTTTTTCCCCAG
    2521  ---------+---------+---------+---------+---------+---------+
2580
    GCCTCCGGAGACGGGGGGGGTGAGTACGAGTCCCTCTCCCAGAAGACCGAAAAAGGGGTC
a   R  R  P  L  P  A  P  L  M  L  R  E  R  V  F  W  L  F  P  Q
-
b    G  G  L  C  P  P  H  S  C  S  G  R  G  S  S  G  F  F  P  R
-
c     E  A  S  A  R  P  T  H  A  Q  G  E  G  L  L  A  F  S  P  G
-
          GCTCTGGGCAGGCACAGGCTAGGTGCCCCTAACCCAGGCCCTGCACACAAAGGGGCAGGT
    2581  ----------+---------+---------+---------+---------+---------+
2640      CGAGACCGGTCCGTGTCCGATCCACGGGGATTGGGTCCGGGACGTGTGTTTCCCCGTCCA
a         A  L  G  R  H  R  L  G  A  P  N  P  G  P  A  H  K  G  A  G
-
b          L  W  A  G  T  G  *  V  P  L  T  Q  A  L  H  T  K  G  Q  V
-
c           S  G  Q  A  Q  A  R  C  P     P  R  P  C  T  Q  R  G  R  C
-
          GCTGGGCTCAGACCTGCCAAGAGCCATATCCGGGAGGACCCTGCCCCTGACCTAAGCCCA
    2641  ---------+---------+---------+---------+---------+---------+
          CGACCCGAGTCTGGACGGTTCTCGGTATAGGCCCTCCTGGGACGGGGACTGGATTCGGGT
          A  G  L  R  P  A  K  S  H  I  R  E  D  P  A  P  D  L  S  P
b          L  G  S  D  L  P  R  A  I  S  G  R  T  L  P  L  T     A  H
-
c           W  A  Q  T  C  Q  E  P  Y  P  G  G  P  C  P     P  K  P  T
-
          CCCCAAAGGCCAAACTCTCCACTCCCTCAGCTCGGACACCTTCTCTCCTCCCAGATTCCA
    2701  ---------+---------+---------+----------+---------+---------+
          GGGGTTTCCGGTTTGAGAGGTGAGGGAGTCGAGCCTGTGGAAGAGAGGGAGGGTCTAAGGT
a         P  Q  R  P  N  S  P  L  P  Q  L  G  H  L  L  S  S  Q  I  P
-
b          P  K  G  Q  T  L  H  S  L  S  S  D  T  F  S  P  P  R  F  Q
-
c           P  K  A  K  L  S  T  P  S  A  R  T  P  S  L  L  P  D  S  S
-
          GTAACTCCCAATCTTCTCTCTGCAGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCA
    2761  ---------+---------+---------+---------+---------+---------+
2820      CATTGAGGGTTAGAAGAGAGACGTCTCGGGTTTAGAACACTGTTTTGAGTTGTGTACGGGT
a         V  T  P  N  L  L  S  A  E  P  K  S  E  D  F  F  H  D  C  F
-
b          *  L  P  I  F  S  L  Q  S  P  N  L  V  T  K  L  T  H  A  H
-
c           N  S  Q  S  S  L  C  R  A  Q  I  L     Q  N  S  H  M  P  T
-
          CCGTGCCCAGGTAAGCCAGCCCAGGCCTCGCCCTCCAGCTCAAGGCGGGACAGGTGCCCT
    2821  ---------+----------+---------+---------+---------+---------+
2880      GGCACGGGTCCATTCGGTCGGGTCCGGAGCGGGAGGTCGAGTTCCGCCCTGTCCACGGGA
a         E  C  P  G  K  P  A  Q  A  S  P  S  S  S  R  R  D  R  C  P
-
b          R  A  Q  V  S  Q  P  R  P  R  P  P  A  Q  G  G  T  G  A  L
-
c           V  P  R  *  A  S  P  G  L  A  L  Q  L  K  A  G  Q  V  P
-
          AGAGTAGCCTGCATCCAGGGACAGGCCCCAGCCGGGTGCTGACACGTCCACCTCCATCTC
    2881  ---------+---------+-----------+---------+---------+---------+
2940      TCTCATCGGACGTAGGTCCCTGTCCGGGGTCGGCCCACGACTGTGCAGGTGGAGGTAGAG
a         R  V  A  C  I  Q  G  Q  A  P  A  G  C    H  V  H  L  H  L
b    E    P  A  S  R  D  R  P  Q  P  G  A  D  T  S  T  S  I  S
-
c     S  S  L  H  P  G  T  G  P  S  R  V  L  T  R  P  P  P  S  L
-
          TTCCTCAGCACCTGAAgcCCTGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAA
    2941  ---------+---------+---------+---------+----------+----------+
3000      AAGGAGTCGTGGACTTcgGGACCCCCgTGGCAGTCAGAAGGAGAAGGGGGGTTTTGGGTT
a         F  L  S  T    S  P  G  G  T  V  S  L  P  L  P  P  K  T  Q
c          P  Q  H  L  K  P  W  G  H  R  Q  S  S  S  S  P  Q  N  P  R
-
        GGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCA
    3001---------+---------+---------+----------+---------+---------+
3060    CCTGTGGGAGTACTAGAGGGCCTGGGGACTCCAGTGTACGCACCACCACCTGCACTCGGT
a       G  H  P  H  D  L  P  D  P  *  G  H  M  R  G  G  G  R  E  P
Figure A20058000842900862
c         T  P  S  *  S  P  G  P  L  R  S  H  A  W  W  W  T    A  T
-
          CGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAA
    3061  ---------+---------+---------+---------+---------+---------+
3120      GCTTCTGGGACTCCAGTTCAAGTTGACCATGCACCTGCCGCACCTCCACGTATTACGGTT
a         R  R  P    G  Q  V  Q  L  V  R  G  R  R  G  G  A    C  Q
c           K  T  L  R  S  S  S  T  G  T  W  T  A  W  R  C  I  M  P  R
-
          GACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGT
    3121  ---------+---------+---------+---------+---------+---------+
3180      CTGTTTCGGCGCCCTCCTCGTCATGTTGTCGTGCATGGCACACCAGTCGCAGGAGTGGCA
a         D  K  A  A  G  G  A  V  Q  Q  H  V  P  C  G  Q  R  P  H  R
Figure A20058000842900864
c           Q  S  R  G  R  S  S  T  T  A  R  T  V  W  S  A  S  S  P  S
-
          CCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCT
    3181 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+
3240
         GGACGTGGTCCTGACCGACTTACCGTTCCTCATGTTCACGTTCCAGAGGTTGTTTCGGGA
a        P  A  P  G  L  A  E  W  Q  G  V  Q  V  Q  G  L  Q  Q  S  P
c          C  T  R  T  G  *  M  A  R  S  T  S  A  R  S  P  T  K  P  S
-
          CCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGTGGGACCCGTGGGGTGCGAGG
    3241  ----------+---------+---------+---------+---------+---------+
3300
          GGGTCGGGGGTAGCTCTTTTGGTAGAGGTTTCGGTTTCCACCCTGGGCACCCCACGCTCC
a         P  S  P  H  R  E  N  H  L  Q  S  Q  R  W  D  P  W  G  A  R
G  G  T  R  G  V  R  G
c           Q  P  P  S  R  K  P  S  P  K  P  K  V  G  P  V  G  C  E  G
-
                       NaeI               BaeI
                    NgoMIV ｜SfiI        BplI｜
          GCCACATGGACAGAGGCCGGCTCGGCCCACCCTCTGCCCTGAGAGTGACCGCTGTACCAA
    3301  ---------+---------+---------+---------+---------+---------+
3360
          CGGTGTACCTGTCTCCGGCCGAGCCGGGTGGGAGACGGGACTCTCACTGGCGACATGGTT
a         A  T  W  T  E  A  G  S  A  H  P L  P  *  E  *  P  L  Y  Q
-
b          P  H  G  Q  R  P  A  R  P  T  L  C  P  E  S  D  R  C  T  N
-
c           H  M  D  R  G  R  L  G  P  P  S  A  L  R  V  T  A  V  P  T
-
                                           BsrGI
          CCTCTGTCCCTACAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGG
    3361  ---------+---------+---------+----------+---------+---------+
          GGAGACAGGGATGTCCCGTCGGGGCTCTTGGTGTCCACATGTGGGACGGGGGTAGGGCCC
a         P  L  S  L  Q  G  S  P  E  N  H  R  C  T  P  C  P  H  P  G
-
b          L  C  P  Y  R  A  A  P  R  T  T  G  V  H  P  A  P  I  P  G
-
c            S  V  P  T
-
      AGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCG
3421  ---------+---------+---------+---------+----------+----------+
    TCCTCTACTGGTTCTTGGTCCAGTCGGACTGAACGGACCAGTTTCCGAAGATAGGGTCGC
a   R  R    P  R  T  R  S  A    P  A  W  S  K  A  S  I  P  A
-
b    G  D  D  Q  E  P  G  Q  P  D  L  P  G  Q  R  L  L  S  Q  R
          ACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTC
    3481  ---------+---------+---------+---------+---------+---------+
3540
          TGTAGCGGCACCTCACCCTCTCGTTACCCGTCGGCCTCTTGTTGATGTTCTGGTGCGGAG
a         T  S  P  W  S  G  R  A  M  G  S  R  R  T  T  T  R  P  R  L
-
b          H  R  R  G  V  G  E  Q  W  A  A  G  E  Q  L  Q  D  H  A  S
Figure A20058000842900882
          CCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCA
    3541  ---------+---------+---------+----------+---------+---------+
3600      GGCACGACCTGAGGCTGCCGAGGAAGAAGGAGATATCGTTCGAGTGGCACCTGTTCTCGT
a         P  C  W  T  P  T  A  P  S  S  S  I  A  S  S  P  W  T  R  A
-
b          R  A  G  L  R  R  L  L  L  P  L     Q  A  H  R  G  Q  E  Q
          GGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACT
    3601  ---------+---------+---------+---------+---------+---------+
3660      CCACCGTCGTCCCCTTGCAGAAGAGTACGAGGCACTACGTACTCCGAGACGTGTTGGTGA
a         G  G  S  R  G  T  S  S  H  A  P    C  M  R  L  C  T  T  T
-
b          V  A  A  G  E  R  L  L  M  L  R  D  A  *  G  S  A  Q  P  L
                                                           XbaI
          ACACGCAGGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAATGAGTGCGACGGggccgtctagaCCCG
    3661  ---------+---------+---------+---------+---------+-----------+
3720      TGTGCGTCTTCTCGGAGAGGGACAGGGGCCCATTTACTCACGCTGccggcagatctGGGC
a         T  R  R  R  A  S  P  C  P  R  V  N  E  C  D  G  R  L  D  P
-
b          H  A  E  E  P  L  P  V  P  G  *  M  S  A  T  A  V    T  R
V  R  R  P  S  R  P  G
        EcoRI
          GGGAATTCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTAT
    3721  ---------+---------+---------+---------+----+----+---------+
3780      CCCTTAAGATTGCAATGACCGGCTTCGGCGAACCTTATTCCGGCCACACGCAAACAGATA
a         G  N  S  N  V  T  G  R  S  R  L  E    G  R  C  A  F  V  Y
-
b          G  I  L  T  L  L  A  E  A  A  W  N  K  A  G  V  R  L  S  I
-
c           E  F  *  R  Y  W  P  K  P  L  G  I  R  P  V  C  V  C  L  Y
-
    ATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCT
        ----------+---------+---------+---------+---------+---------+
3840    TACAATAAAAGGTGGTATAACGGCAGAAAACCGTTACACTCCCGGGCCTTTGGACCGGGA
a       M  L  F  S  T  I  L  P  S  F  G  N  V  R  A  R  K  P  G  P
-
b        C  Y  F  P  P  Y  C  R  L  L  A  M     G  P  G  N  L  A  L
-
c         V  I  F  H  H  I  A  V  F  W  Q  C  E  G  P  E  T  W  P  C
                        AvrII
          GTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTG
    3841  ----------+---------+--------+---------+---------+---------+
3900
          CAGAAGAACTGCTCGTAAGGATCCCCAGAAAGGGGAGAGCGGTTTCCTTACGTTCCAGAC
a         V  F  L  T  S  I  P  R  G  L  S  P  L  A  K  G  M  Q  G  L
-
b          S  S     R  A  F  L  G  V  F  P  L  S  P  K  E  C  K  V  C
-
c           L  L  D  E  H  S     G  S  F  P  S  R  Q  R  N  A  R  S  V
-
        TTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTA
        ---------+---------+---------+---------+----------+---------+
3960    AACTTACAGCACTTCCTTCGTCAAGGAGACCTTCGAAGAACTTCTGTTTGTTGCAGACAT
a       L  N  V  V  K  E  A  V  P  L  E  A  S  *  R  Q  T  T  S  V
-
b        *  M  S    R  K  Q  F  L  W  K  L  L  E  D  K  Q  R  L
-
c           E  C  R  E  G  S  S  S  S  G  S  F  L  K  T  N  N  V  C  S
-
          GCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAG
    3961  ---------+---------+---------+---------+---------+---------+
4020
          CGCTGGGAAACGTCCGTCGCCTTGGGGGGTGGACCGCTGTCCACGGAGACGCCGGTTTTC
a         A  T  L  C  R  Q  R  N  P  P  P  G  D  R  C  L  C  G  Q  K
-
b          R  P  F  A  G  S  G  T  P  H  L  A  T  G  A  S  A  A  K  S
-
c           D  P  L  Q  A  A  E  P  P  T  W  R  Q  V  P  L  R  P  K  A
-
          PmlI                                         DraIII
          CCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGG
    4021  ---------+---------+---------+---------+---------+---------+
          GGTGCACATATTCTATGTGGACGTTTCCGCCGTGTTGGGGTCACGGTGCAACACTCAACC
a         P  R  V    D  T  P  A  K  A  A  Q  P  Q  C  H  V  V  S  W
-
b          H  V  Y  K  I  H  L  Q  R  R  H  N  P  S  A  T  L  *  V  G
-
c           T  C  I  R  Y  T  C  K  G  G  T  T  P  V  P  R  C  E  L  D
-
          ATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGAT
    4081  ---------+---------+---------+---------+---------+---------+
          TATCAACACCTTTCTCAGTTTACCGAGAGGAGTTCGCATAAGTTGTTCCCCGACTTCCTA
a         I  V  V  E  R  V  K  W  L  S  S  S  V  F  N  K  G  L  K  D
-
b             L  W  K  E  S  N  G  S  P  Q  A  Y  S  T  R  G  *  R  M
-
c           S  C  G  K  S  Q  M  A  L  L  K  R  I  Q  Q  G  A  E  G  C
-
          GCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACA
    4141  ---------+---------+---------+---------+---------+---------+
4200
          CGGGTCTTCCATGGGGTAACATACCCTAGACTAGACCCCGGAGCCACGTGTACGAAATGT
a         A  Q  K  V  P  H  C  M  G  S  D  L  G  P  R  C  T  C  F  T
-
b          P  R  R  Y  P  I  V  W  D  L  I  W  G  L  G  A  H  A  L  H
-
c           P  E  G  T  P  L  Y  G  I  *  S  G  A  S  V  H  M  L  Y  M
-
          TGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCC
    4201  ---------+---------+---------+---------+----------+---------+
4260
          ACACAAATCAGCCTCCAATTTTTGCAGATCCGGGGGGCTTGGTGCCCCTGCACCAAAAGG
a         C  V    S  R  L  K  N  V    A  P  R  T  T  G  T  W  F  S
-
b          V  F  S  R  G    K  T  S  R  P  P  E  P  R  G  R  G  F  P
-
c           C  L  V  E  V  K  K  R  L  G  P  P  N  H  G  D  V  V  F
-
    TTTGAAAAACACGATTGCTCGAGCCATCATGGTTCGACCATTGAACTGCATCGTCGCCGT
    ---------+---------+---------+---------+---------+---------+
4320
    AAACTTTTTGTGCTAACGAGCTCGGTAGTACCAAGCTGGTAACTTGACGTAGCAGCGGCA
a    F  E  K  H  D  C  S  S  H  H  G  S  T  I  E  L  H  R  R  R
-
b     L  K  N  T  I  A  R  A  I  M  V  R  P  L  N  C  I  V  A  V
-
c          K  T  R  L  L  E  P  S  W  F  D  H  *  T  A  S  S  P  C
-             GTCCCAAAATATGGGGATTGGCAAGAACGGAGACCTACCCTGGCCTCCGCTCAGGAACGA
    4321  ---------+---------+---------+---------+---------+--------------+
4380
    CAGGGTTTTATACCCCTAACCGTTCTTGCCTCTGGATGGGACCGGAGGCGAGTCCTTGCT
a   V  P  K  Y  G  D  W  Q  E  R  R  P  T  L  A  S  A  Q  E  R
-
b    S  Q  N  M  G  I  G  K  N  G  D  L  P  W  P  P  L  R  N  E
-
c     P  K  I  W  G  L  A  R  T  E  T  Y  P  G  L  R  S  G  T  S
-
       GTTCAAGTACTTCCAAAGAATGACCACAACCTCTTCAGTGGAAGGTACAGAATCTGGT
       ---------+----------+---------+---------+----------+---------+
4440
       CAAGTTCATGAAGGTTTCTTACTGGTGTTGGAGAAGTCACCTTCCATTTGTCTTAGACCA
a      V  Q  V  L  P  K  N  D  H  N  L  F  S  G  R    T  E  S  G
-
b       F   K  Y  F  Q  R  M  T  T  T  S  S  V  E  G  K  Q  N  L  V
-
c        S   S  T  S  K  E     P  Q  P  L  Q  W  K  V  N  R  I  W
-
          GATTTATGGGTAGGAAAACCTGGTTCTCCATTCCTGAGAAGAATCGACCTTTAAAGGACAG
    4441  ---------+---------+---------+---------+---------+---------+
4500      CTAATACCCATCCTTTTGGACCAAGAGGTAAGGACTCTTCTTAGCTGGAAATTTCCTGTC
a         D  Y  G    E  N  L  V  L  H  S    E  E  S  T  F  K  G  Q
-
b       I  M  G  R  K  T  W  F  S  I  P  E  K  N  R  P  LK  D  R
-
c        L  W  V  G  K  P  G  S  P  F  L  R  R  I  D  L  *  R  T  E
-
         AATTAATATAGTTCTCAGTAGAGAACTCAAAGAACCACCACGAGGAGCTCATTTTCTTGC
    4501 -----------+---------+---------+---------+---------+---------+
4560
        TTAATTATATCAAGAGTCATCTCTTGAGTTTCTTGGTGGTGCTCCTCGAGTAAAAGAACG
a       N  *  Y  S  S  Q  *  R  T  Q  R  T  T  T  R  S  S  F  S  C
-
b        I  N  I  V  L  S  R  E  L  K  E  P  P  R  G  A  H  F  L  A
-
c          L  I    F  S  V  E  N  S  K  N  H  H  E  E   L  I  F  L  P
-
                      AflII
          CAAAAGTTTGGATGATGCCTTAAGACTTATTGAACAACCGGAATTGGCAAGTAAAGTAGA
    4561  ---------+---------+---------+----+------+---------+------------+
4620
          GTTTTCAAACCTACTACGGAATTCTGAATAACTTGTTGGCCTTAACCGTTCATTTCATCT
a         Q  K  F  G    C  L  K  T  Y    T  T  G  I  G  K    S  R
-
b         K  S  L  D  D  A  L  R  L  I  E  Q  P  E  L  A  S  K  V  D
-
c         K  V  W   M  M  P  *  D  L  L  N  N  R  N  W  Q  V  K    T
          CATGGTTTGGATAGTCGGAGGCAGTTCTGTTTACCAGGAAGCCATGAATCAACCAGGCCA
    4621  ------------+---------+---------+---------+---------+---------+
4680
          GTACCAAACCTATCAGCCTCCGTCAAGACAAATGGTCCTTCGGTACTTAGTTGGTCCGGT
a         H  G  L  D  S  R  R  Q  F  C  L  P  G  S  H  E  S  T  R  P
-
b         M  V  W  I  V  G  G  S  S  V  Y  Q  E  A  M  N  Q  P  G  H
-
c         W   F  G    S  E  A  V  L  F  T  R  K  P  *  I  N  Q  A  T
-
          CCTCAGACTCTTTGTGACAAGGATCATGCAGGAATTTGAAAGTGACACGTTTTTCCCAGA
    4681---------+---------+---------+---------+-----------+--------+
4740
          GGAGTCTGAGAAACACTGTTCCTAGTACGTCCTTAAACTTTCACTGTGCAAAAAGGGTCT
a         P  Q  T  L  C  D  K  D  H  A  G  I    K  *  H  V  F  P  R
-
b          L  R  L  F  V  T  R  I  M  Q  E  F  E  S  D  T  F  F  P  E
-
c           S  D  S  L    Q  G  S  C  R  N  L  K  V  T  R  F  S  Q  K
-
          AATTGATTTGGGGAAATATAAACTTCTCCCAGAATACCCAGGCGTCCTCTCTGAGGTCCA
    4741  ---------+---------+---------+---------+---------+---------+
4800
          TTAACTAAACCCCTTTATATTTGAAGAGGGTCTTATGGGTCCGCAGGAGAGACTCCAGGT
a         N    F  G  E  I    T  S  P  R  I  P  R  R  P  L  *  G  P
-
b          I  D  L  G  K  Y  K  L  L  P  E  Y  P  G  V  L  S  E  V  Q
-
c           L  I  W  G  N  I  N  F  S  Q  N  T  Q  A  S  S  L  R  S  R
-
         GGAGGAAAAAGGCATCAAGTATAAGTTTGAAGTCTACGAGAAGAAAGACTAACAGGAAGA
    4801 ---------+---------+----------+--------+-----------+--------+
4860
        CCTCCTTTTTCCGTAGTTCATATTCAAACTTCAGATGCTCTTCTTTCTGATTGTCCTTCT
a         G  G  K  R  H  Q  V    V    S  L  R  E  E  R  L  T  G  R
-
b          E  E  K  G  I  K  Y  K  F  E  V  Y  E  K  K  D    Q  E  D
-
c           R  K  K  A  S  S  I  S  L  K  S  T  R  R  K  T  N  R  K  M
-
          TGCTTTCAAGTTCTCTGCTCCCCTCCTAAAGCTATGCATTTTTATAAGACCATGGATCCA
     4861  ---------+---------+---------+---------+------------+---------+
4920
          ACGAAAGTTCAAGAGACGAGGGGAGGATTTCGATACGTAAAAATATTCTGGTACCTAGGT
a          C  F  Q  V  L  C  S  P  P  K  A  M  H  F  Y  K  T  M  D  P
-
b           A  F  K  F  S  A  P  L  L  K  L  C  I  F  I  R  P  W  I  Q
-
c            L  S  S  S  L  L  P  S    S  Y  A  F  L    D  H  G  S  R
-
          GACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAA
    4921  ---------+---------+---------+---------+---------+---------+
4980
         CTGTACTATTCTATGTAACTACTCAAACCTGTTTGGTGTTGATCTTACGTCACTTTTTTT
a          D  M  I  R  Y  I  D  E  F  G  Q  T  T  T  R  M  Q    K  K
-
b           T    D  TL  M  S  L  D  K  P  Q  L  E  C  S  E  K  N
-
c            H  D  K  I  H    V  W  T  N  H  N    N  A  V  K  K  M
-
     TGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAAT
   4981  ---------+--------+---------+---------+---------+---------+
5040
     ACGAAATAAACACTTTAAACACTACGATAACGAAATAAACATTGGTAATATTCGACGTTA
a      C  F  I  C  E  I  C  D  A  I  A  L  F  V  T  I  I  S  C  N
-
b    A  L  F  V  K  F  V  M  L  L  L  Y  L    P  L  *  A  A  I
-
c     L  Y  L    N  L    C  Y  C  F  I  C  N  H  Y  K  L  Q
-
                  MfeI
          AAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGG
    5041  ----------+---------+---------+---------+----+----+---------+
5100
          TTTGTTCAATTGTTGTTGTTAACGTAAGTAAAATACAAAGTCCAAGTCCCCCTCCACACC
a         K  Q  V  N  N  N  N  C  I  H  F  M  F  Q  V  Q  G  E  V  W
-
b          N  K  L  T  T  T  I  A  F  I  L  C  F  R  FF  R  G  R  C  G
-
c           T  S    Q  Q  Q  L  H  S  F  Y  V  S  G  S  G  G  G  V  G
-
                                                     BsaBI
        GAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTATGGCTGATTATGATCTAAAG
        ---------+---------+---------+---------+---------+---------+
5160
        CTCCAAAAAATTTCGTTCATTTTGGAGATGTTTACACCATACCGACTAATACTAGATTTC
a       E  V  F    S  K    N  L  Y  K  C  G  M  A  D  Y  D  L  K
-
b        R  F  F  K  A  S  K  T  S  T  N  V  V  W  L  I  M  I    S
-
c         G  F  L  K  Q  V  K  P  L  Q  M  W  Y  G    L  *  S  K  A
-
         CCAGCAAAAGTCCCATGGATCCGGCCGTCCGCCGTGATCCATGCGGTTACCGCCCGCGTG
    5161 ---------+---------+---------+---------+---------+----------+
5220
         GGTCGTTTTCAGGGTACCTAGGCCGGCAGGCGGCACTAGGTACGCCAATGGCGGGCGCAC
a        P  A  KV  P  W  I  R  P  S  A  V  I  H  A  V  T  A  R  V
-
b         Q  Q  K  S  H  G  S  G  R  P  P    S  M  R  L  P  P  A  C
-
c          S  K  S  P  M  D  P  A  V  R  R  D  P  C  G  Y  R  P  R  V
-
        TCGAACCCAGGTGTGCGACGTCAGACAACGGGGGAGCGCTCCTTTTGGCTTCCTTCCAGG
    5221 ---------+---------+---------+---------+------------+---------+
5280    AGCTTGGGTCCACACGCTGCAGTCTGTTGCCCCCTCGCGAGGAAACCGAAGGAAGGTCC
a       S  N  P  G  V  R  R  Q  T  T  G  E  R  S  F  W  L  P  S  R
-
b        R  T  Q  V  C  D  V  R  Q  R  G  S  A  P  F  G  F  L  P  G
-
c    E  P  R  C  A  T  S  D  N  G  G  A  L  L  L  A  S  F  Q  A
-
                NheI
          CGCGGCGGCTGCTGCGCTAGCTTTTTTGGCGAGCTCGAATTAATTCTGCATTAATGAATC
    5281  ---------+---------+---------+---------+---------+---------+
5340
         GCGCCGCCGACGACGCGATCGAAAAAACCGCTCGAGCTTAATTAAGACGTAATTACTTAG
a        R  G  G  C  C  A  S  F  F  G  E  L  E  L  I  L  H    I
-
b         A  A  A  A  A  L  A  F  L  A  S  S  N    F  C  I  N  E  S
-
c          R  R  L  L  R    L  F  W  R  A  R  I  N  S  A  L  M  N  R
-
          GGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACT
    5341  ---------+---------+---------+---------+---------+---------+
5400
          CCGGTTGCGCGCCCCTCTCCGCCAAACGCATAACCCGCGAGAAGGCGAAGGAGCGAGTGA
a         G  Q  R  A  G  R  G  G  L  R  I  G  R  S  S  A  S  S  L  T
-
b          A  N  A  R  G  E  A  V  C  V  L  G  A  L  P  L  P  R  S  L
-
c            P  T  R  G  E  R  R  F  A  Y  W  A  L  F  R  F  L  A  H
-
          GACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTA
    5401  ---------+---------+---------+----------+---------+---------+
5460      CTGAGCGACGCGAGGCCAGCAAGCCGACGCCGCTCGCCATAGTCGAGTGAGTTCCCGCCAT
a       D  S  L  R  S  V  V  R  L  R  R  A  V  S  A  H  S  K  A  V
-
b        T  R  C  A  R  S  F  G  C  G  E  R  Y  Q  L  T  Q  R  R  *
-
c         L  A  A  L  G  R  S  A  A  A  S  G  I  S  S  L  K  G  G  N
-
        ATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAG
    5461---------+---------+----------+---------+---------+----------+
5520    TATGCCAATAGGTGTCTTAGTCCCCTATTGCGTCCTTTCTTGTACACTCGTTTTCCGGTC
a       I  R  L  S  T  E  S  G  D  N  A  G  K  N  M  *  A  K  G  Q
-
b        Y  G  Y  P  Q  N  Q  G  I  T  Q  E  R  T  C  E  Q  K  A  S
-
c         T  V  I  H  R  I  R  G    R  R  K  E  H  V  S  K  R  P  A
-
        CAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCC
    5521  ---------+---------+---------+---------+---------+---------+
5580
          GTTTTCCGGTCCTTGGCATTTTTCCGGCGCAACGACCGCAAAAAGGTATCCGAGGCGGGG
a         Q  K  A  R  N  R  K  K  A  AL  L  A  F  F  H  R  L  R  P
-
b          K  R  P  G  T  V  K  R  P  R  C  W  R  F  S  I  G  S  A  P
-
c            K  G  Q  E  P    K  G  R  V  A  G  V  F  P     A  P  P  P
-
          CCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTA
    5581  ---------+---------+---------+---------+---------+---------+
5640      GGACTGCTCGTAGTGTTTTTAGCTGCGAGTTCAGTCTCCACCGCTTTGGGCTGTCCTGAT
a         P  D  E  H  H  K  N  R  R  S  S  Q  R  W  R  N  P  T  G  L
-
b          L  T  S  I  T  K  I  D  A  Q  V  R  G  G  E  T  R  Q  D  Y
-
c               R  A  S  Q  K  S  T  L  K  S  E  V  A  K  P  D  R  T  I
-
          TAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTG
    5641  ---------+---------+---------+---------+----------+---------+
57000     ATTTCTATGGTCCGCAAAGGGGGACCTTCGAGGGAGCACGCGAGAGGACAAGGCTGGGAC
a            R  Y  Q  A  F  P  P  G  S  S  L  V  R  s  P  V  P  T  L
-
b         K  D  T  R  R  F  P  L  E  A  P  S  C  A  L  L  F  R  P  C
-
c           K  I  P  G  V  S  P  W  K  L  P  R  A  L  S  C  S  D  P  A
-
         CCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGC
    5701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+
5760     GGCGAATGGCCTATGGACAGGCGGAAAGAGGGAAGCCCTTCGCACCGCGAAAGAGTTACG
a        P  L  T  G  Y  L  S  A  F  L  P  S  G  S  V  A  L  S  Q  C
-
b         R  L  P  D  T  C  P  P  F  S  L  R  E  A  W  R  F  L  N  A
-
c          A  Y  R  I  P  V  R  L  S  P  F  G  K  R  G  A  F  S  M
-
         TCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCAC
    5761 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+
5820     AGTGCGACATCCATAGAGTCAAGCCACATCCAGCAAGCGAGGTTCGACCCGACACACGTG
a        S  R  C  R  Y  L  S  S  V    V  V  R  S  K  L  G  C  V  H
-
b        H  A  V  G  I  S  V  R  C  R  S  F  A  P  S  W  A  V  C  T
-
c          T  L     V  S  Q  F  G  V  G  R  S  L  Q  A  G  L  C  A  R
-
         GAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAAC
    5821 ----------+----------+---------+---------+---------+---------+
5880
         CTTGGGGGGCAAGTCGGGCTGGCGACGCGGAATAGGCCATTGATAGCAGAACTCAGGTTG
a        E  P  P  V  Q  P  D  R  C  A  L  S  G  N  Y  R  L  E  S  N
-
b         N  P  P  F  S  P  T  A  A  P  Y  P  V  T  I  V  L  S  P  T
-
c          T   P  R  S  A  R  P  L  R  L  I  R    L  S  S     V  Q  P
-
        CCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCG
    5881---------+----------+---------+---------+---------+---------+
5940
        GGCCATTCTGTGCTGAATAGCGGTGACCGTCGTCGGTGACCATTGTCCTAATCGTCTCGC
a       P  V  R  H  D  L  S  P  L  A  A  A  T  G  N  R  I  S  R  A
-
b         R    D  T  T  Y  R  H  W  Q  Q  P  L  V  T  G  L  A  E  R
-
c          G  K  T  R  L  I  A  T  G  S  S  H  W    Q  D  *  Q  S  E
-
          AGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGA
    5941  ---------+---------+---------+---------+---------+---------+
6000
    TCCATACATCCGCCACGATGTCTCAAGAACTTCACCACCGGATTGATGCCGATGTGATCT
a   R  Y  V  G  G  A  T  E  F  L  K  W  W  P  N  Y  G  Y  T  R
-
b    G  M    A  V  L  Q  S  S      S  G  G  L  T  T  A  T  L  E
-
c      V  C  R  R  C  Y  R  V  L  E  V  VA       L  R  L  H    K
-
    AGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGCAGAAAAAGAGTTGGT
    6001---------+--------+---------+---------+---------+---------+
6060
    TCCTGTCATAAACCATAGACGCGAGACGACTTCGGTCAATGGAAGCCTTTTTCTCAACCA
a   R  T  V  F  G  I  C  A  L  L  K  P  V  T  F  G  K  R  V  G
-
b    G  Q  Y  L  V  S  A  L  C     S  Q  L  P  S  E  K  E  L  V
-
c      D  S  I  W  Y  L  R  S  A  E  A  S  Y  L  R  K  K  S  W
-
     AGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAG
    6061  ---------+---------+---------+---------+---------+----------+
          TCGAGAACTAGGCCGTTTGTTTGTGGCGACCATCGCCACCAAAAAAACAAACGTTCGTC
a         S  S    S  G  K  Q  T  T  A  G  S  G  G  F  F  V  C K  Q
-
b          A  L  D  P  A  N  K  P  P  L  V  A  V  V  F  L  F  A  S  S
-
c            L  L  I  R  Q  T  N  H  R  W  *  R  W  F  F  C  L  Q  A  A
-
         CAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCT
    6121 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+
6180
         GTCTAATGCGCGTCTTTTTTTCCTAGAGTTCTTCTAGGAAACTAGAAAAGATGCCCCAGA
a        Q  I  T  R  R  K  K  G  S  Q  E  D  P  L  I  F  S  T  G  S
-
b         R  L  R  A  E  K  K  D  L  K  K  I  L  *  S  F  L  R  G  L
-
c          D  Y  A  Q  K  K  R  I  S  R  R  S  F  D  L  F  Y  G  V
-
          GACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGG
    6181  ---------+---------+---------+---------+---------+---------+
6240      CTGCGAGTCACCTTGCTTTTGAGTGCAATTCCCTAAAACCAGTACTCTAATAGTTTTTCC
a         D  A  Q  W  N  E  N  S  R    G  I  L  V  M  R  L  S  K  R
-
b          T  L  S  G  T  K  T  H  V  K  G  F  W  S    D  Y  Q  K  G
-
c           R  S  V  E  R  K  L  T  L  R  D  F  G  H  E  I  I  K  K  D
-
          ATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATAT
    6241  ---------+---------+---------+---------+---------+---------+
          TAGAAGTGGATCTAGGAAAATTTAATTTTTACTTCAAAATTTAGTTAGATTTCATATATA
a         I  F  T    I  L  L  N    K    S  F  K  S  I  *  S  I  Y
-
b          S  S  P  R  S  F    I  K  N  E  V  L  N  Q  S  K  V  Y  M
-
c           L  H  L  D  P  F  K  L  K  M  K  F  *  I  N  L  K  Y  I
-
          GAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATC
    6301  ---------+---------+---------+---------+---------+---------+
6360      CTCATTTGAACCAGACTGTCAATGGTTACGAATTAGTCACTCCGTGGATAGAGTCGCTAG
a         E    T  W  S  D  S  Y  Q  C  L  I  S  E  A  P  I  S  A  I
-
b    S  K  L  G  L  T  V  T  N  A    S  V  R  H  L  S  Q  R  S
-
c    V  N  L  V    Q  L  P  M  L  N  Q    G  T  Y  L  S  D  L
-
                               AhdI
         TGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGG
    6361 ---------+---------+---------+---------+----------+---------+
6420
         ACAGATAAAGCAAGTAGGTATCAACGGACTGAGGGGCAGCACATCTATTGATGCTATGCC
a        C  L  F  R  S  S  I  V  A    L  P  V  V    I  T  T  I  R
-
b         V  Y  F  V  H  P    L  P  D  S  P  S  C  R    L  R  Y  G
-
c          S  I  S  F  I  H  S  C  L  T  P  R  R  V  D  N  Y  D  T  G
-
          GAGGGCTTACCATCTGGGGCCCCCCAGTTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCT
    6421  ---------+---------+---------+---------+---------+---------+
          CTCCCGAATGGTAGACCGGGGTCACGACGTTACTATGGCGCTCTGGGTGCGAGTGGCCGA
a         E  G  L  P  S  G  P  S  A  A  M  I  P  R  D  P R  S  P  A
-
b          R  A  Y  H  L  A  P  V  L  Q  *  Y  R  E  T  H  A  H  R  L
-
c           G  L  T  I  W  P  Q  C  C  N  D  T  A  R  P  T  L  T  G  S
-
          CCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCA
    6481  ---------+---------+----------+---------+---------+---------+
6540     GGTCTAAATAGTCGTTATTTGGTCGGTCGGCCTTCCCGGCTCGCGTCTTCACCAGGACGT
a        P  D  L  S  A  I  N  Q  P  A  G  R  A  E  R  R  S  G  P  A
-
b         Q  I  Y  Q  Q     T  S  Q  P  E  G  P  S  A  E  V  V  L  Q
-
c          R  F  I  S  N  K  P  A  S  R  K  G  R  A  Q  K  W  S  C  N
-
          ACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCG
    6541  ---------+---------+---------+--------+---------+----------+
6600      TGAAATAGGCGGAGGTAGGTCAGATAATTAACAACGGCCCTTCGATCTCATTCATCAAGC
a         T  L  S  A  S  I  Q  S  I  N  C  C  R  E  A  R  V  S  S  S
-
b         L  Y  P  P  P  S  S  L  L  I  V  A  G  K  L  E     V  V  R
-
c          F  I  R  L  H  P  V  Y     L  L  P  G  S     S  K     F  A
-
                        pI
          CCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCG
    6601  ---------+---------+---------+---------+---------+---------+
6660
         GGTCAATTATCAAACGCGTTGCAACAACGGTAACGATGTCCGTAGCACCACAGTGCGAGC
a        P  V  N  S  L  R  N  V  V  A  I  A  T  G  I  V  V  S  R  S
-
b         Q  L  I  V  C  A  T  L  L  P  L  L  Q  A  S  W  C  H  A  R
-
c          S     *  F  A  Q  R  C  C  H  C  Y  R  H  R  G  V  T  L  V
-
          TCGTTTGGTATGGCTTCATTCAAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCC
    6661  ----------+---------+---------+---------+-------+----------+
6720      AGCAAACCATACCGAAGTAAGTCGAGGCCAAGGGTTGCTAGTTCCGCTCAATGTACTAGG
a         S  F  G  M  A  S  F  S  S  G  S  Q  R  S  R  R  V  T  *  S
-
b          R  L  V  W  L  H  S  A  P  V  P  N  D  Q  G  E  L  H  D  P
-
c           V  W  Y  G  F  I  Q  L  R  F  P  T  I  K  A  S  Y  M  I  P
-
                                                  PVuI
          CCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAG
    6721  ---------+---------+---------+---------+---------+----------+
6780      GGGTACAACACGTTTTTTCGCCAATCGAGGAAGCCAGGAGGCTAGCAACAGTCTTCATTC
a         P  M  L  C  K  K  A  V  S  S  F  G  P  P  I  V  V  R  S  K
-
b          P  C  C  A  K  K  R  L  A  P  S  V  L  R  S  L  S  E  V  S
-
c           H  V  V  Q  K  S  G     L  L  R  S  S  D  R  C  Q  K  *  V
-
          TTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATG
    6781  ---------+---------+----------+---------+---------+---------+
6840      AACCGGCGTCACAATAGTGAGTACCAATACCGTCGTGACGTATTAAGAGAATGACAGTAC
a        L  A  A  V  L  S  L  M  V  M  A  A  L  H  N  S  L  T  V  M
-
b          W  P  Q  C  Y  H  S  W  L  W  Q  H  C  I  I  L  L  L  S  C
-
c          G  R  S  V  I  T  H  G  Y  G  S  T  A  *  F  S  Y  C  H  A
-
                                                                  BcgI
           CCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAG
    6841  ---------+---------+---------+---------+---------+---------+
6900
          GGTAGGCATTCTACGAAAAGACACTGACCACTCATGAGTTGGTTCAGTAAGACTCTTATC
a         P  S  V  R  C  F  S  V  T  G  E  Y  S  T  K  S  F    E  *
-
b         H  P     D  A  F  L     L  V  S  T  Q  P  S  H  S  E  N  S
-
c          I  R  K  M  L  F  C  D  W     V  L  N  Q  V  I  L  R  I  V
-
         TGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACAT
    6901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+
6960     ACATACGCCGCTGGCTCAACGAGAACGGGCCGCAGTTATGCCCTATTATGGCGCGGTGTA
a        C  M  R  R  P  S  C  S  C  P  A  S  I  R  D  N  T  A  P  H
-
b         V  C  G  D  R  V  A  L  A  R  R  Q  Y  G  I  I  P  R  H
-
c          Y  A  A  T  E  L  L  L  P  G  V  N  T  G  *  Y  R  A  T
-
          AGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGG
    6961  ---------+---------+---------+---------+---------+---------+
7020      TCGTCTTGAAATTTTCACGAGTAGTAACCTTTTGCAAGAAGCCCCGCTTTTGAGAGTTCC
a         S  R  T  L  K  V  L  I  I  G  K  R  S  S  G  R  K  L  S  R
-
b          A  E  L     K  C  S  S  L  E  N  V  L  R  G  E  N  S  Q  G
-
c           Q  N  F  K  S  A  H  H  W  K  T  F  F  G  A  K  T  L  K  D
-
         ATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCA
    7021 ---------+----------+---------+---------+---------+---------+
7080
         TAGAATGGCGACAACTCTAGGTCAAGCTACATTGGGTGAGCACGTGGGTTGACTAGAAGT
a        I  L  P  L  L  R  S  S  S  M    P  T  R  A  P  N     S  S
-
b         S  Y  R  C     D  P  V  R  C  N  P  L  V  H  P  T  D  L  Q
-
c           L  T  A  V  E  I  Q  F  D  V  T  H  S  C  T  Q  L  I  F  S
-
          GCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCA
    7081  ---------+---------+----------+---------+----------+---------+
7140      CGTAGAAAATGAAAGTGGTCGCAAAGACCCACTCGTTTTTGTCCTTCCGTTTTACGGCGT
 a        A  S  F  T  F  T  S  V  S  G     A  K  T  G  R  Q  N  A  A
-
b        H  L  L  L  S  P  A  F  L  G  E  Q  K  Q  E  G  K  M  P  Q
-
c         I  F  Y  F  H  Q  R  F  W  V  S  K  N  R  K  A  K  C  R  K
-
                                                              SspI
        AAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATAT
    7141---------+---------+---------+---------+---------+----------+
7200
    TTTTTCCCTTATTCCCGCTGTGCCTTTACAACTTATGAGTATGAGAAGGAAAAAGTTATA
a   K  K  G  I  R  A  T  R  K  C    I  L  I  L  F  L  F  Q  Y
-
b    K  R  E    G  R  H  G  N  V  E  Y  S  Y  S  S  F  F  N  I
-
c     K  G  N  K  G  D  T  E  M  L  N  T  H  T  L  P  F  S  I  L
-
          TATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAG
    7201  ---------+---------+---------+---------+---------+---------+
7260
          ATAACTTCGTAAATAGTCCCAATAACAGAGTACTCGCCTATGTATAAACTTACATAAATC
a         Y  *  S  I  Y  Q  G  Y  C  L  M  S  G  Y  I  F  E  C  I
-
b          I  E  A  F  I  R  V  I  V  S  *  A  D  T  Y  L  N  V  F  R
-
c           L  K  H  L  S  G  L  L  S  H  E  R  I  H  I     M  Y  L  E
-
        AAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAGTGCCACCTGACGTCTAA
    7261---------+---------+---------+---------+---------+---------+
7320    TTTTTATTTGTTTATCCCCAAGGCGCGTGTAAAGGGGCTTTTCACGGTGGACTGCAGATT
a       K  N  K  Q  I  G  V  P  R  T  F  P  R  K  V  P  P  D  V
-
b        K  I  N  K     G  F  R  A  H  F  P  E  K  C  H  L  T  S  K
-
c         K     T  N  R  G  S  A  H  I  S  P  K  S  A  T  *  R  L  R
-
        GAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGT
    7321---------+---------+---------+---------+---------+----------+
7380
        CTTTGGTAATAATAGTACTGTAATTGGATATTTTTATCCGCATAGTGCTCCGGGAAAGCA
a       E  T  I  I  I  M  T  L  T  Y  K  N  R  R  I  T  R  P  F  R
-
b        K  P  L  L  S  *  H  *  P  I  K  I  G  V  S  R  G  P  F
-
c         N  H  Y  Y  H  D  I  N  L    K    A  Y  H  E  A  L  S  S
-
          CTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTC
    7381  ---------+---------+---------+----------+---------+---------+
7440      GAGCGCGCAAAGCCACTACTGCCACTTTTGGAGACTGTGTACGTCGAGGGCCTCTGCCAG
a         L  A  R  F  G  D  D  G  E  N  L    H  M  Q  L  P  E  T  V
-
b          S  R  V  S  V  M  T  V  K  T  S  D  T  C  S  S  R  R  R  S
-
c           R  A  F  R        R     K  P  L  T  H  A  A  P  G  D  G  H
-
          ACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGT
    7441  ---------+---------+---------+---------+---------+----------+
7500
          TGTCGAACAGACATTCGCCTACGGCCCTCGTCTGTTCGGGCAGTCCCGCGCAGTCGCCCA
a         T  A  C  L    A  D  A  G  S  R  Q  A  R  Q  G  A  S  A  G
-
b          Q  L  V  C  K  R  M  P  G  A  D  K  P  V  R  A  R  Q  R  V
-
c           S  L  S  V  S  G  C  R  E  Q  T  S  P  S  G  R  V  S  G  C
-
        GTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTG
    7501---------+---------+---------+-----------+-----------+---------+
        CAACCGCCCACAGCCCCGACCGAATTGATACGCCGTAGTCTCGTCTAACATGACTCTCAC
a       V  G  G  C  R  G  W  L  N  Y  A  A  S  E  Q  I  V  L  R  V
-
b        L  A  G  V  G  A  G  L  T  M  R  H  Q  S  R  L  Y     E  C
-
c         W  R  V  S  G  L  A  *  L  C  G  I  R  A  D  C  T  E  S  A
-
      CACCA
  7561-----7565
      GTGGT
a    H
b     T
c      P

Claims (100)

1.一种用于制备卡奇霉素(calicheamicin)结合物的方法，其包含在约7至约9的pH下使(i)经活化的卡奇霉素-可水解连接子衍生物与(ii)IgG1抗体在脱氧胆酸家族的成员或其盐存在下反应。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述脱氧胆酸家族成员具有以下结构之一：
(A)
其中：
X1至X5中的两个为H或OH且其他三个独立地为O或H；
R1为其中n为0-4的(CH2)n，且
R2为OH、NH(CH2)mCOOH、NH(CH2)mSO3H或NH(CH2)mPO3H2，其中m为1-4；或者
(B)
Figure A2005800084290002C2
其中：
X1至X4中的一个为H或OH且其他三个独立地为O或H；
R1为其中n为0-2的(CH2)n，且
R2为OH、NH(CH2)mCOOH或NH(CH2)mSO3H，且其中m为2；或者
(C)
其中：
X1至X4中的一个为OH且其他三个为H；
R1为其中n为0-2的(CH2)n，且
R2为OH、NH(CH2)2SO3H。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述脱氧胆酸家族成员为鹅脱氧胆酸、猪脱氧胆酸、熊脱氧胆酸、甘油脱氧胆酸、牛磺脱氧胆酸、牛磺熊脱氧胆酸或牛磺鹅脱氧胆酸。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述脱氧胆酸家族成员为约10mM浓度的脱氧胆酸。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述卡奇霉素衍生物为IgG1抗体的约3至约9重量％。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述卡奇霉素衍生物为所述IgG1抗体的约7重量％。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述IgG1抗体为抗Lewis Y抗体。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述抗Lewis Y抗体为G193或Hu3S193。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述卡奇霉素衍生物为卡奇霉素的N-酰基衍生物或卡奇霉素的二硫化物类似物。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述卡奇霉素衍生物为N-乙酰基γ卡奇霉素二甲基酰肼(N-乙酰基卡奇霉素DMH)。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述可水解连接子为4-(4-乙酰基苯氧基)丁酸(AcBut)。
12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述pH为约8.2。
13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包含纯化所述卡奇霉素结合物。
14.如权利要求13所述的方法，其中纯化包含色谱分离和超滤/透滤。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述色谱分离为尺寸排除色谱(SEC)或疏水相互作用色谱(HIC)。
16.如权利要求13至15中任一项所述的方法，其中在所述纯化步骤后，所述结合物的平均负载量为每摩尔IgG1抗体约5至约7摩尔卡奇霉素。
17.如权利要求13至16中任一项所述的方法，其中在所述纯化步骤后，所述结合物的低结合部分(LCF)少于约10％。
18.一种通过如权利要求1至17中任一项所述的方法制备的卡奇霉素结合物。
19.一种通过如权利要求13所述的方法制备的卡奇霉素结合物。
20.一种通过如权利要求13所述的方法制备的卡奇霉素结合物，其中所述卡奇霉素衍生物为N-乙酰基γ卡奇霉素二甲基酰肼(N-乙酰基卡奇霉素DMH)，所述可水解连接子为4-(4-乙酰基苯氧基)丁酸(AcBut)，所述脱氧胆酸家族成员为约10mM浓度的脱氧胆酸，pH为约8.2，且其中在所述纯化步骤后，所述卡奇霉素结合物的平均负载量为每摩尔IgG1抗体约5至约7摩尔卡奇霉素且所述结合物的低结合部分(LCF)少于约10％。
21.一种组合物，其包含卡奇霉素-可水解连接子衍生物共价连接于抗Lewis Y抗体构成的结合物。
22.如权利要求21所述的组合物，其中所述卡奇霉素衍生物为卡奇霉素的N-酰基衍生物或卡奇霉素的二硫化物类似物。
23.如权利要求22所述的组合物，其中所述卡奇霉素衍生物为N-乙酰基γ卡奇霉素二甲基酰肼(N-乙酰基卡奇霉素DMH)。
24.如权利要求21至23中任一项所述的组合物，其中所述可水解连接子为4-(4-乙酰基苯氧基)丁酸(AcBut)。
25.如权利要求21至24中任一项所述的组合物，其中所述抗Lewis Y抗体为G193或Hu3S193。
26.如权利要求21至25中任一项所述的组合物，其中所述平均负载量为每摩尔抗LewisY抗体约5至约7摩尔卡奇霉素。
27.如权利要求21至26中任一项所述的组合物，其中所述结合物具有约1×10-7M至约4×10-7M的KD。
28.如权利要求21至26中任一项所述的组合物，其中所述结合物具有约3.4×10-7M的KD。
29.如权利要求21至28中任一项所述的组合物，其中所述结合物结合所述Lewis Y抗原且并不结合Lewis X和H-2血型抗原。
30.如权利要求21至29中任一项所述的组合物，其中所述结合物具有细胞毒性活性。
31.如权利要求21至29中任一项所述的组合物，其中所述结合物具有抗肿瘤活性。
32.如权利要求21至31中任一项所述的组合物，其中所述结合物以治疗有效量存在。
33.一种组合物，其包含由N-乙酰基γ卡奇霉素二甲基酰肼-4-(4-乙酰基苯氧基)丁酸(N-乙酰基卡奇霉素DMH-AcBut)共价连接于G193构成的结合物，其中所述平均负载量为每摩尔G193约5至约7摩尔N-乙酰基卡奇霉素DMH且所述结合物的低结合部分(LCF)少于约10％。
34.一种用于保留如权利要求21至33中任一项所述的组合物的生物活性的方法，其包含
使所述组合物在溶液中与防冻剂、表面活性剂、缓冲剂和电解质接触；且冻干所述溶液。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述结合物的浓度为约0.5毫克/毫升至约2毫克/毫升。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述结合物的浓度为1毫克/毫升。
37.如权利要求34至36中任一项所述的方法，其中所述防冻剂的浓度为约1.5重量％至约6重量％。
38.如权利要求34至37中任一项所述的方法，其中所述防冻剂为糖醇或碳水化合物。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述防冻剂为海藻糖、甘露醇或山梨糖醇。
40.如权利要求38所述的方法，其中所述防冻剂为约5％浓度的蔗糖。
41.如权利要求34至40中任一项所述的方法，其中所述表面活性剂的浓度为约0.005％至约0.05％。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述表面活性剂为0.01重量％浓度的聚山梨醇酯80(Polysorbate 80)或约0.01％浓度的吐温80(Tween 80)。
43.如权利要求34至42中任一项所述的方法，其中所述缓冲剂的浓度为约5mM至约50mM。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述缓冲剂为约20mM浓度的Tris。
45.如权利要求34至44中任一项所述的方法，其中所述电解质的浓度为约5mM至约100mM。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述电解质为钠盐或钾盐。
47.如权利要求45所述的方法，其中所述电解质为约10mM浓度的NaCl。
48.如权利要求34至47中任一项所述的方法，其中在冻干前所述pH为约7.8至约8.2。
49.如权利要求48所述的方法，其中在冻干前所述pH为约8.0。
50.如权利要求34至49中任一项所述的方法，其中冻干包含：
在约-35℃至约-50℃的温度下冷冻所述溶液；
最初在约20至约80微米汞柱(micron)的初始干燥压力及约-10℃至约-40℃的存放温度下干燥所述经冷冻的溶液24至78小时；和
继而在约20至约80微米汞柱的第二干燥压力及约+10℃至约+30℃的存放温度下干燥所述经冷冻-干燥的产物15至30小时。
51.如权利要求50所述的方法，其中冷冻是在约-45℃下进行；所述最初的冷冻干燥是在约60微米汞柱的初始干燥压力和约-30℃的存放温度下进行60小时；且所述第二干燥步骤是在约60微米汞柱的干燥压力和约+25℃的存放温度下进行约24小时。
52.如权利要求34至51中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包含在冻干前添加膨化剂。
53.如权利要求52所述的方法，其中所述膨化剂的浓度为约0.5至约1.5重量％。
54.如权利要求52所述的方法，其中所述膨化剂为约0.9重量％浓度的葡聚糖40或约0.9重量％浓度的羟乙基淀粉40。
55.如权利要求34至54中任一项所述的方法，其中所述结合物具有细胞毒性活性。
56.如权利要求34至54中任一项所述的方法，其中所述结合物具有抗肿瘤活性。
57.如权利要求34至56中任一项所述的方法，其中所述结合物以治疗有效量存在。
58.如权利要求34所述的方法，其中所述结合物为共价连接于G193的N-乙酰基γ卡奇霉素二甲基酰肼-4-(4-乙酰基苯氧基)丁酸(N-乙酰基卡奇霉素DMH-AcBut)，其中所述平均负载量为每摩尔G193约5至约7摩尔N-乙酰基卡奇霉素DMH且所述结合物的低结合部分(LCF)少于约10％。
59.一种调配物，其包含卡奇霉素-抗Lewis Y抗体结合物、防冻剂、表面活性剂、缓冲剂和电解质。
60.如权利要求59所述的调配物，其中所述结合物的浓度为约0.5毫克/毫升至约2毫克/毫升。
61.如权利要求60所述的调配物，其中所述结合物的浓度为约1毫克/毫升。
62.如权利要求59至61中任一项所述的调配物，其中所述防冻剂的浓度为约1.5重量％至约6重量％。
63.如权利要求62所述的调配物，其中所述防冻剂为一糖醇或一碳水化合物。
64.如权利要求63所述的调配物，其中所述防冻剂为海藻糖、甘露醇或山梨糖醇。
65.如权利要求63所述的调配物，其中所述防冻剂为约5％浓度的蔗糖。
66.如权利要求59至65中任一项所述的调配物，其中所述表面活性剂的浓度为约0.005％至约0.05％。
67.如权利要求66所述的调配物，其中所述表面活性剂为约0.01重量％浓度的吐温80。
68.如权利要求59至67中任一项所述的调配物，其中所述缓冲剂的浓度为约5mM至约50mM。
69.如权利要求59至68中任一项所述的调配物，其中所述缓冲剂为约20mM浓度的Tris。
70.如权利要求59至69中任一项所述的调配物，其中所述电解质的浓度为约5mM至约100mM。
71.如权利要求59至70中任一项所述的调配物，其中所述电解质为钠盐或钾盐。
72.如权利要求59至71中任一项所述的调配物，其中所述电解质为约10mM浓度的NaCl。
73.如权利要求59至72中任一项所述的调配物，其中所述pH为约7.8至约8.2。
74.如权利要求73所述的调配物，其中所述pH为约8.0。
75.如权利要求59至74中任一项所述的调配物，其中所述卡奇霉素为卡奇霉素的N-酰基衍生物或卡奇霉素的二硫化物类似物。
76.如权利要求75所述的调配物，其中所述卡奇霉素为N-乙酰基γ卡奇霉素二甲基酰肼(N-乙酰基卡奇霉素DMH)。
77.如权利要求59至76中任一项所述的调配物，其中所述可水解连接子为4-(4-乙酰基苯氧基)丁酸(AcBut)。
78.如权利要求59至77中任一项所述的调配物，其中所述抗Lewis Y抗体为G193或Hu3S193。
79.如权利要求59至78中任一项所述的调配物，其中所述平均负载量为每摩尔抗LewisY抗体约5至约7摩尔卡奇霉素。
80.如权利要求59至79中任一项所述的调配物，其中所述结合物具有约1×10-7M至约4×10-7M的KD。
81.如权利要求59至79中任一项所述的调配物，其中所述结合物具有约3.4x10-7M的KD。
82.如权利要求59至81中任一项所述的调配物，其中所述结合物结合所述Lewis Y抗原且不结合Lewis X和H-2血型抗原。
83.如权利要求59至82中任一项所述的调配物，其中所述结合物具有细胞毒性活性。
84.如权利要求59至82中任一项所述的调配物，其中所述结合物具有抗肿瘤活性。
85.如权利要求59至84中任一项所述的调配物，其中所述结合物以治疗有效量存在。
86.如权利要求59所述的调配物，其中所述结合物为共价连接于G193的N-乙酰基γ卡奇霉素二甲基酰肼-4-(4-乙酰基苯氧基)丁酸(N-乙酰基卡奇霉素DMH-AcBut)，其中所述平均负载量为每摩尔G193约5至约7摩尔N-乙酰基卡奇霉素DMH且所述结合物的低结合部分(LCF)少于约10％。
87.如权利要求86所述的调配物，其中所述结合物的浓度为1毫克/毫升，所述防冻剂为约5％浓度的蔗糖，所述表面活性剂为约0.01重量％浓度的吐温80，所述缓冲剂为约20mM浓度的Tris，且所述电解质为约10mM浓度的NaCl，其中pH为约8.0。
88.一种治疗癌症的方法，其包含投予治疗有效量的如权利要求21至32中任一项所述的组合物。
89.如权利要求88所述的方法，其中所述癌症呈Lewis Y抗原阳性。
90.如权利要求88或89所述的方法，其中所述癌症为恶性肿瘤。
91.如权利要求88至90中任一项所述的方法，其中将所述组合物作为第二线单独疗法投予。
92.如权利要求88至90中任一项所述的方法，其中将所述组合物作为第一线组合疗法投予。
93.如权利要求88至92中任一项所述的方法，其中所述癌症为非小细胞肺癌(NSCLC)或乳癌。
94.如权利要求88至92中任一项所述的方法，其中所述癌症为前列腺癌或结肠直肠癌。
95.如权利要求88至94中任一项所述的方法，其中将所述组合物与生物活性剂组合投予。
96.如权利要求95所述的方法，其中所述生物活性剂为抗癌剂。
97.一种治疗NSCLC的方法，其包含投予如权利要求21至32中任一项所述的组合物。
98.一种治疗乳癌的方法，其包含投予如权利要求21至32中任一项所述的组合物。
99.一种治疗患有增生性病症的患者的方法，所述方法包含投予治疗有效量的如权利要求21至32中任一项所述的组合物。
100.一种试剂盒，其包含(i)容纳有如权利要求59至86中任一项所述的调配物的容器；和(ii)关于使用稀释剂将所述调配物重构至在重构后的调配物中结合物浓度在约0.5毫克/毫升至约5毫克/毫升范围内的说明书。
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