MXPA01010859A - Intervencion metabolica con glp-1 para mejorar la funcion del tejido reperfluido e isquemico.. - Google Patents

Abstract

Individuos con necesidad de tratamiento de reperfusion relacionado a isquemia son tratados, preferiblemente intravenosamente, con una composicion que incluye un compuesto que enlaza a un receptor para el peptido-1 tipo glucagon. La invencion se relaciona al metodo y composiciones para tal tratamiento.

Description

INTERVENCIÓN METABOLICA CON GLP-1 PARA MEJORAR LA FUNCIÓN DEL TEJIDO REPERFUIDO E ISQUÉMICO DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN • Esta solicitud es una continuación en parte de la 5 solicitud provisional 60/103,498 presentada el 8 de octubre de 1998. Esta invención se refiere a la intervención metabólica con GLP-1 para mejorar terapéuticamente la función del tejido reperfluido e isquémico. 10 El daño celular a los tejidos de órganos aeróbicos • está bien reconocido como una consecuencia de isquemia, ya sea endógena como en el caso de una oclusión de arteria coronaria espontánea, o iatrogénica tal como con cirugía de corazón abierto, derivación coronaria, o procedimiento de 15 transplante con el corazón u otros órganos tales como el pulmón, hígado, riñon, páncreas y tracto gastrointestinal. El grado y duración de los eventos que causan isquemia son relevantes a la cantidad de muerte celular y/o disfunción" celular reversible. También se conoce que mucho del daño al 20 tejido de hecho ocurre durante la reperfusión (es decir la reanudación de flujo sanguíneo) y la re-oxigenación del tejido previamente anóxico. La herida de reperfusión ha sido el objeto de considerable estudio reciente impulsado por avances médicos particularmente en el tratamiento de la 25 herida de reperfusión después del infarto del miocardio y otros procedimientos reparadores del miocardio tales como derivación de coronaria, otras cirugías de corazón abierto, así como transplantes de órganos. Como un producto secundario de la respiración aeróbica normal, se pierden rutinariamente electrones a partir de la cadena transportadora de electrones de la mitocondria. Dichos electrones pueden reaccionar con oxígeno molecular para generar el radical libre reactivo superóxido el cual a través de otros pasos de reacción en la presencia de peróxido de hidrógeno y fierro produce el radical hidroxilo extraordinariamente reactivo y tóxico. Los tejidos aeróbicos metabólicamente activos poseen mecanismos de defensa dedicados a degradar los radicales libres tóxicos antes que estas especies de oxígeno reactivas puedan interactuar con organelos celulares, enzimas, o ADN, las consecuencias de lo cual podría ser, sin dichos mecanismos protectores, la muerte celular. Estos mecanismos de defensa incluyen las enzimas superóxidos dismutasa (SOD) que desproporciona el superóxido, la catalasa que degrada el peróxido de hidrógeno y el glutation peptídico que es un depurador de radicales libres no específico. Si bien no está completamente entendido, se cree que en la isquemia de los tejidos metabólicos y la reperfusión subsecuente, ocurre un grupo complejo de eventos. Inicialmente, durante el periodo isquémico, la actividad enzimática antioxidante intracelular parece disminuir, incluyendo la de SOD, catalasa y glutation. Existe también un indicio de que el nivel de actividad de xantin oxidasa se aumenta concomitantemente en el tejido del endotelio bascular durante el evento isquémico. La combinación de habilidad mejorada para producir radicales libres oxígeno (por medio de la mejorada actividad de xantin oxidasa) y la habilidad reducida para depurar los mismos radicales oxígeno (por medio de la actividad reducida de SOD, catalasa y glutation) sensibiliza grandemente la célula isquémica a una incremento repentino oxidativo y en consecuencia al daño, si estas células se reperfusionan subsecuentemente con sangre y por lo tanto oxígeno. Este incremento repentino oxidativo que ocurre dentro de segundos a minutos de reperfusión podría resultar en el daño reversible e irreversible a las células del endotelio y a otras células que constituyen la matriz del órgano isquémico reperfusionado. Si, por ejemplo, el corazón es el órgano bajo consideración, el daño oxidativo reversible puede contribuir al aturdimiento del miocardio, mientras que el daño irreversible se presenta así mismo como un infarto al miocardio. Concurrente con este incremento repentino oxidativo inicial está el daño por oxidación a las membranas de las células. La oxidación de lípidos en las membranas de la célula parece jugar un papel en la quimiotaxis de neutrófilos en las áreas post-isquémicas. Dichos neutrófilos ^^JUÉI^^^M^^^^^ ll ll l - - ?iggaaÉü J activados se adhieren al endotelio bascular, induce la conversión de xantin deshidrogenasa en xantin oxidasa dentro de las células del endotelio, y empeoran adicionalmente en la pérdida de integridad del endotelio. Los neutrófilos activados también miran fuera de la basculatura dentro de los espacios intersticiales del miocardio en donde las células inflamatorias pueden matar directamente miocitos. Adicionalmente, las perturbaciones en la mobilización normal del calcio a partir del retículo sarcoplásmico como una consecuencia de isquemia-reperfusión contribuye a la disfunción reversible del miocardio referida como aturdimiento del miocardio. Las consecuencias de los eventos de isquemia-reperfusión son el daño celular reversible e irreversible, muerte celular, disminuida eficiencia funcional del órgano. Más específicamente, en el caso de la herida de reperfusión del miocardio, las consecuencias incluyen aturdimiento del miocardio, arritmias, e infarto, y como un resultado, choque cariogénico e insuficiencia cardiaca potencialmente congestiva. La paradoja del daño celular asociado con un periodo limitado de anoxia isquémica seguido por reperfusión es que el daño y muerte celular parece no sólo y probablemente resultar ' directamente del periodo de deprivación de oxígeno, sino, adicionalmente, como una •—*» » -••— --*- - -* • ——*M?a consecuencia de la reoxigenación de tejidos vueltos altamente sensibles al daño oxidativo durante el periodo isquémico. El daño por reperfusión comienza con el incremento repentino oxidativo inicial inmediatamente durante el reflujo y continua empeorando durante un número de horas conforme se desarrollan los procesos inflamatorios en los mismos tejidos post-isquémicos. Los esfuerzos dedicados a disminuir la sensibilidad de las células post-anóxicas al daño oxidativo y, adicionalmente, los esfuerzos para reducir las respuestas inflamatorias en estos mismos tejidos han mostrado reducir el daño reversible e irreversible a los órganos reperfusionados post-anóxicos. Una combinación de métodos para reducir el incremento repentino oxidativo inicial y el daño asociado con la inflamación subsecuente podría proporcionar protección sinergística en contra de la herida de reperfusión. Con respecto al tratamiento de la isquemia coincidente con pacientes MI, las terapias comunes ahora usadas son emplear trombolíticos tales como estreptocinasa y t-PA y angioplastía. La Patente Norteamericana No. 4,976,959 describe la administración de t-PA y SOD para inhibir daño del tejido durante la reperfusión y/o la angioplastia coronaria transluminal percutánea coincidente con la esquemia para restablecer el flujo sanguíneo regional. Así, un número creciente de pacientes está siendo expuesto a la probabilidad de la herida de reperfusión y sus efectos, particularmente -? * - t rw -f •• — - <<7»~~ . > . - . . .-..y*... .x.ytz. - x . j-T Tij=ftj i pacientes cardiacos. La herida de reperfusión a otros órganos distintos ^ al corazón se manifestará generalmente así misma en la eficiencia considerablemente reducida de la función, una 5 consecuencia de la cual puede ser la degeneración prematura del órgano, o simplemente el paro. Adicionalmente, los órganos transplantados experimentan proporciones de rechazo mejoradas si existe herida de reperfusión subyacente significativa . 10 Como se discutió breve y anteriormente, si bien el • mecanismo preciso de la herida de reperfusión no ha sido definido claramente, los datos ascendentes, la mayoría de los cuales han sido reunidos en diversos estudios de modelos cardiacos, indican que la generación de radicales libres 15 derivados del oxígeno, que incluyen el anión superóxido (02) , el radical libre hidroxilo (.OH) y H202, resultan como una consecuencia de la reintroducción de oxígeno molecular en la reperfusión y juega un papel importante en la necrosis de • tejido. Los agentes que aumentan la producción de estos 20 radicales libres derivados de oxígeno (que incluyen alopurinol y deferroxamina) o aumenta la degradación de estos materiales tales como superóxido dismutasa, catalasa, glutation, y complejos de cobre, parecen limitar el tamaño del infarto y también pueden mejorar la recuperación de la 25 función ventricular izquierda del aturdimiento cardiaco.

El uso de la intervención metabólica como una terapia específicamente durante el infarto agudo del miocardio está bien establecida, aunque no sin controversias.

• Existe abundante evidencia experimental y clínica para 5 soportar el uso de una infusión de glucosa-insulina-potasio (GIK) - la forma primaria de intervención metabólica - después de MI agudo, particularmente después del éxito del estudio sueco DIGAMI (Malmberg, K, and DIGAMI Study Group (1997) Prospective randomized study of intensive insulin 10 treatment on long term survival after acute myocardial • infarction in patients with diabetes mellitus. Brit . Med. J. 314, 1512-1515) . El estudio DIGAMI acentuó la eficiencia de una infusión de glucosa-insulina para MI agudo en pacientes diabéticos, pero este tipo de terapia nunca ha sido sugerido 15 o usado para reperfusión. Por lo tanto puede verse que existe una necesidad de una composición efectiva segura que tenga amplia aplicabilidad para prevenir o mejorar los efectos • perjudiciales de la isquemia y reperfusión para tejidos en 20 general, especialmente tejido de órgano e incluyendo pero no limitado al miocardio. Es un objeto principal de la presente invención satisfacer esta necesidad. Otro objeto de la presente invención es proporcionar un método para tratar isquemia y reperfusión sin 25 los efectos secundarios normalmente concurrentes con las terapias actualmente disponibles. Aún otro objeto de la presente invención es ^fc proporcionar una composición portadora farmacéuticamente aceptable que pueda usarse para administración intravenosa de 5 las composiciones de la presente invención sin ningún efecto secundario significativamente indeseable y sin aceptar adversamente las propiedades estimulantes antigénicas o inmunes . Estos y otros objetos y beneficios de la presente 10 invención serán aparentes a aquellos expertos en la técnica • de la descripción adicional y las reivindicaciones anexas. Individuos con necesidad de tratamiento de isquemia y/o reperfusión se tratan, preferentemente intravenosamente con una composición que incluye un compuesto que se enlaza a 15 un receptor para el péptido-1 tipo glucagon. La invención se refiere al método y las composiciones para dicho tratamiento. La GLP-1 es una hormona insulinotrópica dependiente de glucosa que mejora efectivamente la captación periférica • de glucosa sin inducir la peligrosa hipoglicemia. 20 Adicionalmente, la GLP-1 suprime fuertemente la secreción de glucagon, independiente de su acción insulinotrópica, y reduce poderosamente con eso los niveles de ácidos grasos libres en plasma (FFA) más considerablemente que lo que puede lograrse con la insulina." Los altos niveles de FFA se han 25 implicado como un mecanismo tóxico principal durante la ? ., isquemia del miocardio. Se han desarrollado ahora el concepto de GLP-1 como fA una terapia metabólica para la herida de isquemia- reperfusión. Este desarrollo se basó en la realización de que 5 existen dos situaciones clínicas en las cuales la isquemia- reperfusión es un evento de rutina, y potencialmente peligroso: procedimientos trombolíticos en MI agudo, y reperfusión cardiaca después de cardioplegia isquémica durante cirugía del corazón. Además, datos experimentales y 10 clínicos recientes han establecido que el fenómeno de • isquemia-reperfusión responde particularmente a la terapia metabólica con infusión de GIK, aún más así que la isquemia aislada sin reperfusión (Apstein, CS (1998) Glucose-insulin- potassium for acute myocardial infarction. Remarkable results 15 from a new prospective, randomized trial. Circula tion 98, 2223-2226) . Los dos avances terapéuticos más importantes en el tratamiento de isquemia aguda coincidente con MIP en la década pasada han sido la introducción de trombolisis y ß- 20 bloqueo. Sin embargo, a pesar de este éxito general, algunos estudios de trombolisis han revelado un exceso temprano de mortalidad, que ha sido atribuido a la herida inducida por reperfusión y aturdimiento del miocardio. Los mecanismos que subyacen el aturdimiento son complejos, pero un consenso que 25 emerge es que esto está probablemente relacionado a la acidosis intracelular que conduce a bombas de Ca2+ de sarcolema disfuncionales y sobrecarga de Ca2+ citosólica. El resultado neto es la función contráctil del miocardio • deteriorada que conduce a la eficiencia mecánica disminuida, 5 así como arritmias ventriculares por reperfusión. Además, investigación reciente ha establecido que la acidosis intracelular, a su vez, se debe a un desequilibrio entre la glicólisis y la completa oxidación de glucosa, en el sentido de que la proporción de glicólisis se desacopla de la 10 oxidación de piruvato (el producto final de la glicolisis) en • el ciclo de TCA. Este desacoplamiento resulta en la producción neta de H+ debido a la conversión del piruvato en lactato. La causa más probable para este desequilibrio es la presencia de altos niveles de ácidos grasos libres (FFA) , que 15 preferentemente entran a la itocondrea e inhiben la oxidación de piruvato, un mecanismo que esmeradamente cuenta por la bien establecida observación de que los corazones perfusionados con FFA son menos capaces de recuperarse en la • fase de reperfusión que los corazones perfusionados con 20 glucosa. Se ha descubierto aquí y es una de las bases de esta invención terapéutica que la GLP-1 suprime los FFA más allá de lo que se espera con la insulina que está al 50% del nivel de suspensión, y GLP-1 puede ser tan alto como 90% de supresión de FFA. 25 Estas consideraciones han reforzado nuestra ^^^Mfej^ convicción de tratar isquemia-reperfusión con péptidos tipo glucagon. Esta bien establecido que durante la perfusión ?áfc normal y la oxigenación adecuada, el corazón depende del metabolismo aeróbico y usa los FFA como su combustible 5 preferido. En contraste, durante la isquemia (flujo sanguíneo reducido) o hipóxica (tensión de 02 reducida) , la ß-oxidación de ácidos grasos se deteriora (debido a que es estrictamente aeróbica) y la provisión continuada de ATP es crecientemente dependiente de la glicolisis anaeróbica. Durante el periodo 10 isquémico, la glucosa-insulina es de beneficio debido a que • mejora la captación de glucosa y estimula la glicólisis, proporcionado con eso ATP para el mantenimiento de las funciones esenciales de la membrana, especialmente el transporte de iones. Además la glucosa-insulina suprime la 15 lipólisis del tejido adiposo, reduciendo con eso los niveles de FFA en plasma y la captación de los FFA dentro del miocardio. Altos niveles de los FFA son tóxicos debido al miocardio isquémico, por efectos detergentes directos sobre las membranas y aumentos en AMPc, y por acumulación de 20 acilcamitina, que inhibe las bombas de Ca2+. El efecto neto es la perturbación del intercambio iónico, sobrecarga de Ca2+ citosólico, y disfunción contráctil resultante y arritmias. Durante el periodo de reperfusión, la glucosa- insulina es de beneficio, debido a que, como se explicó 25 anteriormente, esta terapia puede aliviar el desequilibrio trt?M?aß Btomirwm **+ * * +.... - ^J . .. -. .. . . .. .. -. . .^- * metabólico que produce aturdimiento. Esto se logra por la estimulación directa de PDH y en consecuencia la oxidación de /jflfc piruvato, e indirectamente por la captación de FFA reducida y en consecuencia la relación mejorada de piruvato a oxidación 5 de FFA. De la discusión anterior es evidente que la acción dual de la glucosa-insulina-captación de glucosa y metabolismo mejorado, y niveles de FFA reducidos tienen considerable potencial terapéutico en la reperfusión. Algunos 10 han expresado una preocupación que durante la isquemia • profunda, esencialmente flujo cero, los productos finales glicolíticos, principalmente lactato, se acumularán debido al "lavado inadecuado". La acumulación de lactato, a su vez, conduce a concentraciones altas de protones intracelulares, y 15 la falla en reoxidar NADH; altas relaciones de NADH/NAD+ y [H+] inhiben la glicolisis productiva. Bajo estas circunstancias, la glucosa puede ser tóxica a las células, debido a que el ATP se consume actualmente en la producción de 1, 6-bifosfato de fructuosa, y la alta [H+] puede agravar 20 la necrosis de miocitos [H+] (Neely, JR, and Morgan, HE (1974) Relationship between carbohydrate and lipid metabolism and the energy balance of heart muscle. Ann. Jev. Physiol . 36, 413-459) . Sin embargo, estas preocupaciones sustentadas por el peso de los datos experimentales y clínicos, lo que 25 indica que la glucosa-insolina produce resultados de ^^g¡H beneficio. Si bien no se desea limitar por la teoría, la explicación probable para esto es que en humanos, la isquemia espontánea aguda no es una condición de isquemia de flujo cero, pero en su lugar representa una región de isquemia de 5 bajo flujo, en la cual la perfusión residual es adecuada para el suministro de sustrato y el lavado de lactato. Esta realización ha proporcionado ahora una lógica fisiológica poderosa para el uso de la terapia metabólica en isquemia- reperfusión. 10 La cirugía cardiaca moderna, ya sea que involucre • la reposición de la válvula cardiaca o el injerto de derivación de la arteria coronaria (CABG) , requiere rutinariamente la interrupción cardioplégica hipotérmica, la sujeción cruzada aórtica, y derivación cardiopulmonar durante 15 la cirugía. Efectivamente, por lo tanto, la cirugía cardiaca de rutina induce a un estado de isquemia global electiva seguida por reperfusión, lo cual expone potencialmente al corazón a todos los riesgos y heridas concurrentes peculiares • a la isquemia-reperfusión del miocardio. En consecuencia, la 20 prevención del daño al miocardio durante y después de las operaciones cardiacas permanece una preocupación principal. La isquemia cardioplégica electiva seguida por reperfusión tiene paralelos obvios con la isquemia-reperfusión encontrada durante el MI agudo seguido por revascularización, y así 25 muchos de los principios patofisiológicos considerados en las MIIiMiMiaÉlMBMMfafcaBaMit.. Xz., . ... ....... XLz „ .J.. .. .. . ... _ .,..._ .___ z ._. z. -, y y yy . z . . . . ..yX^zff^fx gf secciones previas también aplican durante la cirugía cardiaca. Sin embargo, existen algunas diferencias notables entre la isquemia-reperfusión cardioplégica quirúrgica y la isquemia-reperfusión asociada con MI. Durante la cirugía, el corazón se interrumpe (cardioplegia) y se infunde con una solución fría (hipotérmica) diseñada para optimizar la preservación del miocardio. Después de completar la cirugía, el corazón se reactiva y reperfusiona con sangre oxigenada a temperatura corporal. Esto produce una secuencia de isquemia hipotérmica y reperfusión normotérmica, que puede prevenir la acumulación de altos niveles en tejido de H+ y lactato. Además, a diferencia del MI agudo, la cardioplegia hipotérmica representa un estado de isquemia global de flujo cero, seguido por reperfusión global. En la solicitud previa (No. de Serie 60/103,498), de la cual esto es una continuación en parte, revisamos las desventajas de las infusiones de glucosa insulina y las ventajas de sustituir estas con una infusión de GLP-1 que es más segura que la insulina. En resumen, las infusiones de GIK llevan riesgos significativos de hipoglicemia e hiperglicemia, son técnicamente demandantes y ocupan mucho personal. Los peligros de la hipoglicemia son obvios. En contraste, estos riesgos no existen con una infusión de GLP-1. La amida (7-36) peptídica tipo glucagon (GLP-1) es un péptido insulinotrópico derivado del intestino, ¡^ Ü^----».. - . - ._-.__*_! - _ . . . • < ,#-* * y- ?. * . ^t-^^asití?y^ití^ natural, que constituye un componente principal del así llamado efecto incretina. El GLP-1 ejerce su efecto principal en las células endocrinas pancreáticas, en donde (1) regula la expresión y secreción de la insulina de las células ß en 5 una forma dependiente de glucosa; (2) estimula la secreción de somatoestatina; y (3) suprime la secreción de glucagon de las células a. Aunque no formalmente resuelto, se presume que el efecto glucagonestático fuerte resulta de una o todas de las siguientes: (1) supresión directa por estimulación de 10 receptores de GLP-1 sobre células a, aunque esto no es • probable, (2) supresión de paracrina de la secreción de glucagon por liberación intraislotes de somatostatina; o (3) supresión de paracrina por liberación intraislotes de insulina. Cualquiera que sea el mecanismo celular, el GLP-1 15 es único en su capacidad para estimular simultáneamente la secreción de insulina e inhibir la liberación de glucagón. Aunque una infusión terapéutica de insulina también inhibe la liberación de glucagon, este efecto no es tan potente como el GLP-1 que ejerce una inhibición directa, intraislote de 20 paracrina de la secreción de glucagon. La capacidad dual de GLP-1 para estimular poderosamente la liberación de insulina e inhibir la secreción de glucagon, junto con la estricta dependencia de glucosa de su acción insulinotrópica, dota a esta molécula 25 con un potencial terapéutico único en el manejo de la ^^^^^^ ^ ?j g gi^l isquemia- reperfusión. Primero, el GLP-1 estimula fuertemente la secreción de insulina endógena y por lo tanto puede usarse para lograr todas las acciones de beneficio atribuidas a una infusión de insulina en el tratamiento metabólico de isquemia-reperfusión. Aunque altas dosis de infusiones de GIK contienen típicamente 25-33% de glucosa y 50-100 U de insulina/L, no está claro el requerimiento de la introducción de hiperglicemia per se para lograr eficiencia terapéutica, versus proporcionar solamente un medio ambiente metabólico para la administración segura de altas dosis de insulina. Es probable que se requieran niveles de glucosa en sangre adecuados para permitir el suministro del sustrato, pero esto no implica necesariamente una necesidad de hiperglicemia y no debe desmerecer del hecho de que la insulina ejerce efectos importantes distintos a la captación de glucosa. Por lo tanto, una infusión terapéutica de GLP-1 requerirá solamente probablemente una confusión modesta de glucosa (por ejemplo 5%) para mantener la glucosa en sangre a niveles fisiológicos ligeramente arriba para disparar la liberación de insulina. No se requiere glucosa como una medida de seguridad, puesto que los niveles en sangre de < 3.5 mM anulan la actividad que estimula insulina de GLP-1, protegiendo completamente con eso en contra de los peligros de hipoglicemia. Segundo, el GLP-1 ejerce un efecto glucagonestático poderoso, que junto con su acción insulinotrópica conducirá a una supresión fuerte de los FFA. Uno de los beneficios principales de las infusiones de glucosa-insulina es la reducción en los niveles de FFA circulante y la supresión de la captación de FFA. Los FFA y sus metabolitos tienen efectos 5 tóxicos directos en el miocardio isquémico así como durante el periodo de reperfusión, cuando contribuyen al aturdimiento, y en consecuencia la reducción de los niveles de FFA es una objetivoterapéutica principal de la intervención metabólica en la isquemia-reperfusión, objetivo 10 de la intervención metabólica en la isquemia-reperfusión.

• Puesto que el glucagon es un estímulo poderoso para la lipólisis de tejido adiposo y producción de FFA, la supresión de glucagon mediada por GLP-1 aumenta adicionalmente la reducción inducida de insulina en los FFA circulantes. Así, 15 la terapia de GLP-1 es superior a una infusión de glucosa- insulina a este respecto. Verdaderamente, los datos preliminares en voluntarios saludables indican que una infusión intravenosa de GLP-1 reducirá los niveles de FFA en plasma en ayuno a <10% de los valores control. 20 El GLP-1 debe ser efectivo en la mayoría de los pacientes sin requerir la administración concomitante de glucosa. Sin embargo, una pequeña proporción de sujetos puede requerir glucosa/GLP-1 para producir una adecuada respuesta de insulina. Además, también puede ser necesario administrar 25 potasio para corregir cambios excesivos de potasio en el compartimento intracelular cuando se coadministra glucosa con GLP-1. ^fc Además de GLP-1 o sus análogos biológicos, la terapia puede incluir el uso de depuradores de radicales 5 libres tales como glutation, melatonina, vitamina E, y superóxido dismutasa (SOD) . En dichas combinaciones se disminuye el riesgo de daño por reperfusión aún adicionalmente . El término "GLP-1", o péptido tipo glucagon, 10 incluyen miméticos, y como se usa en el contexto de la presente invención puede estar comprendido de péptidos tipo glucagon y péptidos y análogos relacionados de péptido tipo glucagon-1 que se enlazan a una proteína receptora de péptido tipo glucagon-1 (GLP-1) tal como la proteína receptora de 15 amida (7-36) GLP-1 y tiene un efecto biológico correspondiente sobre la secreción de insulina como amida de (7-36) GLP-1 que es una forma biológicamente activa, nativa de GLP-1. Véase Goke, B and Byrne, M, Diabetic Medicine, 1996, 13:854-860. Los receptores de GLP-1 son proteínas de la 20 superficie celular encontradas, por ejemplo, en células ß pancreáticas que producen insulina. Los péptidos y análogos tipo glucagon incluirán especies que tienen actividad insulinotrópica y que son agonistas de, es decir activan la molécula receptora de GLP-1 y su segunda actividad mensajera 25 sobre, inter alia, células ß que producen insulina. Los agonistas del péptido tipo glucagon que presentan actividad a través de este receptor han sido descritos: EP0708179A2; f Hjorth, S.A. et al . , J. Biol . Chem. 269 (48) : 30121-30124 (1994); Siegel, E.G. et al. Amer. Diabetes Assoc. 57th 5 Scientific Sessions, Boston (1997); Hareter, A. et al. Amer. Diabetes Assoc. 57th Scientific Sessions, Boston (1997) ; Adelhorst, K. et al. J. Biol . Chem. 269 (9) : 6275-6278 (1994); Deacon C.F. et al 16th International Diabetes Federation Congress 7Abstracts, Diabetologia Suppl ement (1997); Irwin, 10 D.M. et al., Proc. Natl . Acad. Sci . USA. 94:7915-7920 (1997); Mosjov, S., Int. J. Peptide Protein Res . 40:333-343 (1992). Las moléculas tipo glucagon incluyen polinucleótidos que expresan agonistas de GLP-1, es decir activadores de la molécula receptora de GLP-1 y su actividad mensajera 15 secundaria encontrada en, inter alia, células ß que producen insulina. Los miméticos de GLP-1 que también son agonistas, incluyen, por ejemplo, compuestos químicos específicamente diseñados para activar el receptor de GLP-1. Los antagonistas del péptido tipo glucagon-1 también son conocidos, por 20 ejemplo, véase por ejemplo Watanabe, Y et al., J. Endocrinol . 140(1) :45-52 (1994), e incluye exendina (9-39) amina, un análogo exendina, que es un antagonista potente de receptores GLP-1 (véase, por ejemplo W097/46584) . Publicaciones recientes describen Black Widow GLP-1 y Ser2 GLP-1, véase 25 G.G. Holz, J.F. Hakner/ Compara ti ve Biochemistry and Physiology, Part B 121(1998)177-184 y Ritzel, et al., A synthetic glucagon-like peptide-1 analog with improved plasma stabili ty, J. Endocrinol 1998 Oct. 159 (1) : 93-102. Modalidades adicionales incluyen polipéptidos tipo glucagon químicamente sintetizados así como cualquier polipéptido o fragmentos de los mismos que sean considerablemente homólogos. "Considerablemente homólogos", lo cual puede referirse a las secuencias de ácido nucleico y aminoácido, significa que una secuencia objeto particular, por ejemplo, una secuencia mutante, varía de una secuencia de referencia en una o más sustituciones de lesiones o adiciones, el efecto neto de lo cual no resulta en una diferencia funcional adversa entre las secuencias de referencia y del sujeto. Para propósitos de la presente invención, las secuencias que tienen más del 50% de homología, y preferentemente más del 90% de homología, actividad biológica equivalente para mejorar las respuestas de células ß a los niveles de glucosa en plasma, y las características de expresión equivalentes se consideran considerablemente homologas. Para propósitos de determinar homología debe desecharse la interrupción de la secuencia madura. Las secuencias que tienen grados menores de homología, bioactividad comparable, y características de expresión equivalentes se consideran equivalentes. Los péptidos, GLP de mamífero y glucagon se -*-***»«£. „ . •-- . - & - í -X^^ Müi i codifican por el mismo gen. En el íleon el genotipo se procesa en dos clases principales de hormonas peptídicas GLP, principalmente GLP-1 y GLP-2. Existen cuatro péptidos relacionados con GLP-1 conocidos que se procesan desde los péptidos fenotípicos. El GLP-1 (1-37) tiene la secuencia His Asp Glu Phe Glu Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly (SEC. DE IDENT. N0.:1) GLP-1 (1-37) se amida por procesamiento post-translacional para producir GLP-1 (1-36) NH que tiene la secuencia His Asp Glu Phe Glu Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg (NH2) (SEC. DE IDENT. NO.:2); o se procesa enzimáticamente para producir GLP-1 (7-37) que tiene la secuencia His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe He Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly (SEC. DE IDENT. NO.:3). GLP-1 (7-37) también puede amidarse para producir amida (7-36) de GLP-1 que es la forma natural de la molécula de GLP-1, y que tiene la secuencia His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe He Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg (NH2) (SEC. DE IDENT. NO.:4) y en la forma natural de la molécula de GLP-1. Las células L intestinales secretan GLP-1 (7-37) (SEC. DE IDENT. NO.:3) y GLP-1 (7-36) NH2 (SEC. DE IDENT. l NO.: 4) en una proporción de 1 a 5 respectivamente. Estas formas interrumpidas de GLP-1 tienen vidas medias cortas in situ, es decir menos de 10 minutos y se inactivan por una • aminodipeptidasa IV para producir Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp 5 Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe He Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly (SEC. DE IDENT. NO.: 5) y Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe He Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg (NH2) (SEC. DE IDENT. NO.: 6), respectivamente. Se ha especulado que los 10 péptidos Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe He Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly (SEC. DE IDENT. NO.:5) y Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe He Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg (NH2) (SEC. DE IDENT. NO.: 6) afecta la 15 producción de glucosa epática, pero no estimulan la producción o liberación de insulina desde el páncreas. Existen seis péptidos en el veneno del monstruo de Gila que son homólogos a GLP-1. Sus secuencias se comparan a • la secuencia de GLP-1 en la Tabla 1. **m -<yy?tt'«f? tiSÍHaL > < - «. .-* ?lz ^fa,^ .. Jfa». . . . . . 4^»^»HÜJ TABLA 1 a.HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRNH2 b.HSDGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSNH2 • c. DLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSNHj d.HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSNH2 e.HSDATFTAEYSKLLAKLALQKYLESILGSSTSPRPPSS f.HSDATFTAEYSKLLAKLALQKYLESILGSSTSPRPPS g.HSDAIFTEEYSKLLAKLALQKYLASILGSRTSPPPNH2 .HSDAIFTQQYSKLLAKLALQKYLASILGSRTSPPPNH2 a=GLP-l(SEC. DE IDENT. NO.4). b=Exendina 3(SEC. DE IDENT. NO.7). c=Exendina 4(9-39(NH2(SEC. DE IDENT. NO.8). d=Exepdina 4 (SEC. DE IDENT. NO.9). e=Helospectina I(SEC. DE IDENT. NO.10). fHrlelospectin II(SEC. DE IDENT. NO.l 1). g=Helodermina(SEC. DE IDENT. NO.12). h=Q8, Q9 Helodepnina (SEC. DE IDENT. NO.13).

Las homologías principales como se indica por las área delineadas en la Tabla 1 son: los péptidos c y h se derivan de b y g, respectivamente. Todos los seis péptidos que ocurren naturalmente (a, b, d, e, f y g) son homólogos en las posiciones 1, 7, 11 y 18. El GLP-1 y exendinas 3 y 4 (a, b y d) son homólogos adicionalmente en las posiciones 4, 5, 6, 8, 9, 15, 22, 23, 25, 26 y 29. En la posición 2, A, S y G son estructuralmente similares. En la posición 3, los residuos D y E (Asp y Glu) son estructuralmente similares. En las posiciones 22 y 23 (Phe) y I (He) son estructuralmente similares a Y (Tyr) y L (Leu), respectivamente. Igualmente, fc en la posición 26 L e I son estructuralmente equivalentes. Así, de los 30 residuos GLP-1, las exendinas 3 y 4 5 son idénticas en 15 posiciones y equivalentes en 5 posiciones adicionales. Las únicas posiciones en donde son evidentes los cambios estructurales radicales son en los residuos 16, 17, 19, 21, 24, 27, 28 y 30. Las exendinas también tienen 9 residuos extra en el carboxilo terminal. 10 Los péptidos tipo GLP-1 pueden hacerse por síntesis peptídica química de estado sólido. El GLP-1 también puede hacerse por técnicas recombinantes convencionales usando procedimientos estándar descritos en, por ejemplo, Sambrook y Maniaitis. "Recombinante", como se usa en la presente, 15 significa que una proteína se deriva de sistemas de expresión recombinantes (por ejemplo de microbio o mamífero) que pueden modificarse genéticamente para contener un gen de expresión para GLP-1 o sus análogos biológicamente activos. Los péptidos tipo GLP-1 pueden recuperarse y purificarse de 20 cultivos de célula recombinantes por métodos que incluyen, pero no se limitan a, precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción acida, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de 25 afinidad, cromatografía de hidroxilapatita y cromatografía de i - -y1 electina. Puede emplearse cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para los pasos de purificación final. jtffc Los polipéptidos de la presente invención pueden ser un producto naturalmente purificado, o un producto de 5 procedimientos de química sintética, o producidos por técnicas recombinantes de huéspedes procarióticos o eucarióticos (por ejemplo por bacterias, levaduras, plantas superiores, insectos y células de mamíferos en cultivo o in vivo) . Dependiendo del huésped empleado en un procedimiento 10 de producción recombinante, los polipéptidos de la presente invención son generalmente no glicosilados, pero pueden glicosilarse. La actividad de GLP-1 puede determinarse por métodos estándar, en general, por procedimientos de selección 15 de actividad de enlace a receptor que involucra proporcionar células apropiadas que expresan el receptor de GLP-1 sobre su superficie, por ejemplo, líneas de células de insulinoma tales como células RINmSF o células INS-1. Véase también Mosjov, S. (1992) y EP0708170A2. Además de medir el enlace 20 específico del trazador a la membrana usando métodos de radio inmunoensayo, la actividad de AMPc o la producción de insulina dependiente de glucosa también pueden medirse. En un método, un polinucleótido que codifica el receptor de la presente invención se emplea para transfectar células para 25 expresar con eso la proteína receptora de GLP-1. Así, por ejemplo, estos métodos pueden emplearse para seleccionar un agonista de receptor poniendo en contacto dichas células con fc compuestos a ser seleccionados y determinar si dichos compuestos generan una señal, es decir activan el receptor. 5 Pueden utilizarse anticuerpos policlonales y monoclonales para detectar, purificar e identificar péptidos tipos GLP-1 para uso en los métodos descritos en la presente. Los anticuerpos tales como ABGA1178 detectan GLP-1 no empalmado intacto o (7-36) amida N-terminalmente 10 interrumpido. Otros anticuerpos detectan muy al extremo del término C de la molécula precursora, un procedimiento que permite calcular por sustracción la cantidad de péptido interrumpido biológicamente activo, es decir GLP-1 (7-37) o (7-36) amida (Orskov et al. Diabetes, 1993, 42:658-661; 15 Orskov et al. J. Clin. Invest. 1991 87:415-423). Otras técnicas de selección incluyen el uso de células que expresan el receptor de GLP-1, por ejemplo, células CHO transectadas, en un sistema que mide el pH extracelular o los cambios iónicos causados por la activación 20 del receptor. Por ejemplo, los agonistas potenciales pueden ponerse en contacto con una célula que expresa el receptor de la proteína GLP-1 y una segunda respuesta mensajera, por ejemplo la transducción de señales o cambios iónicos o de pH, pueden medirse para determinar si el agonista potencial es 25 efectivo.

Las proteínas de enlace al receptor péptido tipo glucagon-1 de la presente invención pueden usarse en combinación con un portador farmacéutico adecuado. Dichas composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente 5 efectiva del polipéptido, y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. Dicho portador incluye, pero no se limita a, solución salina, solución salina regulada, dextrosa, agua, glicerol, etanol, lactosa, fosfato, manitol, arginina, trealosa y combinaciones de los mismos. Las 10 formulaciones deben adecuar el modo de administración y se determinan fácilmente por aquellos de experiencia en la técnica. El péptido GLP-1 también puede usarse en combinación con agentes conocidos en la técnica que mejoran la vida media in situ del péptido para mejorar o prolongar la actividad 15 biológica del péptido. Por ejemplo, una molécula o porción química puede unirse covalentemente a la composición de la presente invención antes de la administración de la misma. Alternativamente, el agente mejorador puede administrarse concomitantemente con la composición. Aún adicionalmente, el 20 agente puede comprender una molécula que se conoce que inhibe la degradación enzimática de los péptidos tipo GLP-1 puede administrarse concomitantemente con o después de la administración de la composición peptídica GLP-1. Dicha molécula puede administrarse, por ejemplo, oralmente o por 25 inyección.

Mühi ^a«? Se observa que los pacientes administrados con GLP-1 o sus análogos en combinaciones con los sistemas portadores aquí enumerados, especialmente aquellos tratados antes de un evento planeado o dentro de las primeras cuatro horas después de un evento isquémico, tienen menos arritmia, menos daño de tejido, y menos incomodidad sin efectos secundarios. De estas consideraciones es evidente que puede esperarse que una infusión de GLP-1 ejerza un efecto terapéutico principal en la reperfusión del miocardio. Se espera que el GLP-1 pueda administrarse ya sea por administración I.V. o subcutánea para infusión continua por intravenosa (I.V.) de 0. lpmol/kg/min a 10 pmol/kg/min y por subcutánea (S.C.) de 0.1 pmol/kg/min a 75 pmol/kg/min, y por inyección individual (bolo) por I.V. de 0.005 nmol/kg a 20 nmol/kg y S.C. de 0.1 nmol/kg a 100 nmol/kg la infusión de GLP-1 puede coadministrarse con glucosa (5%) si se requiere para mantener niveles de glucosa en sangre de > 5 mM (para mantener la eficiente secreción de insulina) . Igualmente, la coadministración de potasio (K+) también se considerará, dependiendo del grado al cual la activación de la ATPasa Na+/K+ de membrana conduzca un cambio de K+ dentro del espacio intracelular. El tratamiento de GLP-1 comenzará tan temprano en el periodo postisquémico como sea posible después, de isquemia espontánea aguda en el contexto del hogar o la ambulancia y antes de las terapias de reperfusión, y a-MM . .-- ^^ba-.-f-.. continuado después de eso. En el caso de cirugía cardiaca, la infusión de GLP-1 debe comenzar 12-24 horas antes de la cirugía, durante la cirugía desde el comienzo de la anestesia hasta la sujeción aórtica cruzada, e inmediatamente después de la des-sujeción durante un periodo de al menos 72 horas post-operativamente. Como se explicó anteriormente, la coadministración de un depurador de radicales libres auxiliará adicionalmente en la recuperación de la reperfusión. De lo anterior puede verse que la invención logra todos sus objetivos establecidos. ^*

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES 1. Uso de una composición que incluye un compuesto que activa un receptor para el péptido tipo glucagon-1 y un portador farmacéuticamente aceptable para la fabricación de un medicamento para tratar individuos con necesidad de mejorar la herida de tejido de órgano causada por la reperfusión de flujo sanguíneo después de un periodo de isquemia.
2. 2. Uso de una composición de conformidad con la reivindicación 1, en donde el péptido tipo glucagon-1 es GLP- 1 o un análogo biológicamente activo del mismo.
3. 3. Uso de una composición de conformidad con la reivindicación 1, en donde el portador farmacéutico se selecciona a partir del grupo que consiste de solución salina, solución salina regulada, dextrosa, agua, glicerol, etanol, lactosa, fosfato, manitol, arginina, trialosa y combinaciones de los mismos.
4. 4. Uso de una composición de conformidad con la reivindicación 1, en donde la administración a un individuo en necesidad del tratamiento es a un nivel de dosis de 0.1 pmol/kg/min hasta 10 pmol/kg/min.
5. 5. Uso de una composición de conformidad con la reivindicación 4, en donde existe administración concomitante de glucosa.
6. 6. Uso de una composición de conformidad con la reivindicación 5, en donde existe administración concomitante de potasio. ^fc
7. 7. Uso de una composición de conformidad con la reivindicación 4, en donde existe administración concurrente 5 de un depurador de radicales libres.
8. 8. Uso de una composición de conformidad con la reivindicación 1, en donde la administración comienza dentro de cuatro horas de un evento isquémico.
9. 9. Uso de una composición de conformidad con la 10 reivindicación 8, en donde la administración ocurre dentro de • cuatro horas de un evento isquémico y continúa después de eso.
10. 10. Uso de una composición de conformidad con la reivindicación 1, en donde la administración es 15 intravenosamente.
11. 11. Uso de una composición de conformidad con la reivindicación 1, en donde la administración es por inyección subcutánea o de micropresión, insuflación pulmonar profunda, bomba externa o de implante, inyección de depósito, y otros 20 mecanismos de liberación sostenida, suministro oral y mecanismos de parche, de boca y otros que atraviesan la piel y membrana.
12. 12. Uso de una composición de conformidad con la reivindicación 1, en donde el tejido de órgano es el 25 miocardio.
13. 13. Uso de una composición de conformidad con la reivindicación 1, en donde la necesidad de mejora del tejido ^fc dañado por la intervención metabólica surge de un procedimiento médico que es un evento quirúrgico seleccionado 5 a partir del grupo que consiste de procedimientos quirúrgicos cardiacos, transplantes de órganos, amputación y recolocación traumática de miembros.
14. 14. Uso de una composición de conformidad con la reivindicación 13, en donde el procedimiento médico involucra 10 un evento de reperfusión isquémico, siendo el evento concomitante con infarto del intestino e infarto del miocardio.