NO325601B1 - Anvendelse av et preparat for fremstilling av et medikament for a behandle organ-vevsskade. - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av et preparat som inkluderer et peptid som aktiverer en reseptor for glukagonlignende peptid-1 (GLP-1) og en farmasøytisk aksepterbar bærer for fremstilling av et medikament for terapeutisk å forbedre funksjonen av iskemisk og reperfundert vev.

Cellulær skade på aerobiske og organiske vev er kjent som en konsekvens av iskemi, enten endogen som i tilfellet med en spontan koronar arterieokklusjon eller iatrogen som med åpent hjerte, koronar bypass-kirurgi eller transplantasjonsprose-dyrer med hjerte eller andre organer som lunger, lever, nyre, pankreas og gastrointestinalkanalen. Grad og varighet av de iskemi-bevirkende hendelser er relevant for omfanget av celledød og/eller reversibel cellulær dysfunksjon. Det er også kjent at mye av vevskaden faktisk skjer ved reperfusjon (dvs. gjenopptagelse av blodstrøm) og re-oksygenering av det tidligere anoksiske vev. Reperfusjonsskade har vært formålet for omfattende nyere studier tilskyndet ved medisinske frem-skritt, særlig i behandlingen av reperfusjonsskade etter hjerteinfarkt eller andre myokardiale hjelpeprosedyrer som koronar bypass, andre åpne hjertekirurgier såvel som organ-transplantasjoner .

Som et biprodukt av normal aerob respirasjon, tapes rutinemessig elektroner fra mitokondrie-elektrontransportkjeden. Slike elektroner kan reagere med molekylært oksygen for å danne det reaktive fri-radikal-superoksyd som gjennom andre reaksjonstrinn i nærvær av hydrogenperoksyd og jern produserer det ekstraordinære reaktive og toksiske hydroksylradikal. Metabolsk aktivt aerobt vev har forsvarsmekanismer for å degradere toksiske frie radikaler før disse reaktive oksygen-arter kan interagere med cellulære organeller, enzymer eller DNA, hvis konsekvens kan, uten slike beskyttelsesmekanismer, være celledød. Disse forsvarsmekanismer inkluderer enzymene superoksyd dismutase (SOD) som disproporsjonerer superoksyd, katalase som degraderer hydrogenperoksyd og peptidet glutation som er en ikke-spesifikk fri-radikal scavenger.

Mens ikke fullt ut forstått mener man at i forbindelse med iskemi av metabolsk vev og påfølgende reperfusjon forekommer en kompleks gruppe av hendelser. Initialt under den iskemiske periode, synes intracellulær anti-oksydant enzymakti-vitet å avta, inkluderende aktiviteten til SOD, katalase og glutation. Der er også en indikasjon på at nivået av xantin-oksydaseaktivitet samtidig øker i vaskulært endotelvev under den iskemiske hendelse. Da kombinasjonen av økt evne til å produsere oksygenfrie radikaler (via økt xantinoksydaseakti-vitet) og redusert evne til å fjerne de samme oksygenradi-kaler (via nedsatt SOD, katalase- og glutationaktivitet) i stor grad sensibiliserer den iskemiske celle for en oksydativ burst, og følgelig skade, bør disse celler senere reperfunderes med blod og derfor oksygen. Denne oksydative burst som forekommer i løpet av sekunder til minutter av reperfusjon kan resultere i reversibel og irreversibel skade på endotelceller og andre celler som utgjør den iskemi-reperfunderte organmatriks. Dersom for eksempel hjertet er det aktuelle organ, kan reversibel oksydativ skade bidra til hjertesvekkelse, mens irreversibel skade fremkommer som et hjerteinfarkt. Sammen med denne initiale oksydative burst følger oksydasjonsskade på cellemembraner. Lipidoksydasjon i cellemembraner synes å spille en rolle i nøytrofil kjemotakse mot post-iskemiområder. Slike aktiverte nøytrofiler adhererer til vaskulært endotel, induserer omdannelsen av xantinde-hydrogenase til xantinoksydase inne i nevnte endotelceller, og aggraverer videre tap av endotelintegritet. Aktiverte nøytrofiler migrerer også ut av vaskulaturen og inn i myo-karde interstitielle rom hvor de inflammatoriske celler direkte kan drepe myocytter. I tillegg vil perturbasjoner i normal kalsiummobilisering fra sarkoplasmatisk retikulum som en konsekvens av iskemi-reperfusjon bidra til reversibel myokard dysfunksjon omtalt som hjertesvekkelse.

Konsekvensene av iskemi-reperfusjonshendelser er reversibel og irreversibel celleskade, celledød og nedsatt organfunk-sjons-effektivitet. Mere spesielt, i tilfellet av myokard reperfusjonsskade, inkluderer konsekvensene hjertesvekkelse, arrytmier og infarkt, og som et resultat, kariogenisk sjokk og eventuelt kongestiv hjertesvikt.

Paradokset med cellulær skade assosiert med en begrenset periode av iskemisk anoksi etterfulgt av reperfusjon er at celleskade og celledød ikke trolig fremkommer bare som et direkte resultat fra perioden med oksygendeprivasjon, men i tillegg som en konsekvens av reoksygenering av vev som er gjort svært sensitivt overfor oksydativ skade under den iskemiske periode. Reperfusjonsskade begynner med det initiale oksydative burst umiddelbart etter re-gjennomstrømming og fortsetter å forverre seg i løpet av flere timer når inflammatoriske prosesser utvikles i de samme post-iskemiske vev. Anstrengelser som er gjort for å nedsette sensitivitet hos post-anoksiske celler for oksydativ skade og i tillegg anstrengelser for å redusere inflammatoriske responser i disse samme vev er blitt vist å redusere den reversible og irreversible skade på post-anoksiske reperfunderte organer. En kombinasjon av metoder for å redusere både det initiale oksydative burst og påfølgende inflammasjonsassosiert skade vil kunne gi synergistisk beskyttelse mot reperfusjonsskade.

WO-A1-9808531 vedrører anvendelse av GLP-1 eller analoger ved behandling av myokardialt infarkt.

Med hensyn til behandlingen av iskemi samtidig med MI pasienter, er vanlige terapier som nå anvendes å benytte trombolytiske midler som streptokinase og t-PA og angioplasti. U.S. patent nr. 4 976 959 omhandler administreringen av t-PA og SOD for å inhibere vevskade under reperfusjon og/eller perkutan transluminal koronar angioplasti samtidig med iskemi for å restaurere regional blodgjennomstrømming. Således er et økende antall pasienter blitt eksponert for sannsynlig-heten for reperfusjonsskade og dens effekter, særlig hjerte-pasienter.

Reperfusjonsskade på organer annet enn hjerte vil generelt manifestere seg i vesentlig redusert funksjonsvirkning, og en følge av dette kan være prematur degenerering av organet, eller simpelthen driftsstans. I tillegg opplever transplan-terte organer en økt grad av avstøtning dersom der er signi-fikant underliggende reperfusjonsskade.

Som omtalt kort i det foregående, mens den nøyaktige mekanis-men til reperfusjonsskade ikke klart er definert, indikerer fremkomne data, hvorav de fleste er blitt samlet i forskjel-lige hjertemodellstudier, at dannelsen av oksygen-avledede frie radikaler, inkluderende superoksydanion (02)", hydroksyl fri-radikalet (.OH) og H202, er resultatet som en følge av reintroduksjonen av molekylært oksygen med reperfusjon og spiller en viktig rolle ved vevsnekroser. Midler som enten nedsetter produksjonen av disse oksygen-avledede frie radikaler (inkluderende allopurinol og deferroksamin) eller øker degraderingen av disse materialer slik som superoksyddismutase, katalase, glutation og kopperkomplekser, synes å begrense infarktstørrelse og kan også øke restituering av venstre ventrikkelfunksjon etter hjertesvekkelse.

Anvendelse av metabolsk intervensjon som en terapi, spesielt under akutt hjerteinfarkt er vel etablert, skjønt ikke uten kontroversitet. Der er rikelig med eksperimentelt og klinisk bevis til å understøtte bruk av en glukose-insulin-kalium (GIK)infusjon, den primære form av metabolsk intervensjon, etter akutt MI, særlig etter suksessen til det Svenske DIGAMI studiet (Malmberg, K, og DIGAMI Study Group (1997) Prospective randomized study of intensive insulin treatment on long term survival after acute myocardial infarction in patients with diabetes mellitus. Brit. Med. J. 314: 1512-1515). DIGAMI studiet fremhever effektiviteten av en glukose-insulin-infusjon for akutt MI i diabetespasienter, men denne type av terapi er aldri blitt foreslått eller anvendt for reperfusjon.

Man vil derfor se at der er et behov for et sikkert og effektivt preparat med en bred anvendelse for å forhindre eller forbedre den skadelige effekten av iskemi og reperfusjon for vev generelt, særlig organvev og som inkluderer, men som ikke er begrenset til, myokardium. Det er et primært formål for den foreliggende oppfinnelse å oppfylle dette behov.

Et formål for den foreliggende oppfinnelse er anvendelse av et preparat for fremstilling av et medikament for å behandle iskemi og reperfusjon uten de bivirkninger som normalt med-følger med de for tiden tilgjengelige terapier.

Et farmasøytisk aksepterbart bærerpreparat som kan anvendes for intravenøs administrering av preparatene uten signifikante uønskede bivirkninger og uten at dette negativt på-virker antigeniske eller immunstimulerende egenskaper er også beskrevet.

Disse og andre formål og fordeler med den foreliggende oppfinnelse vil for de fagkyndige på området klart fremgå fra den etterfølgende beskrivelse og krav.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører således anvendelse av et preparat som inkluderer et peptid som aktiverer en reseptor for glukagonlignende peptid-1 (GLP-1) og en farmasøytisk aksepterbar bærer for fremstilling av et medikament for å behandle individer med behov for en forbedring av organ-vevsskade bevirket ved reperfusjon av blodgjennomstrømming etter en iskemiperiode, hvori peptidet som aktiverer en reseptor for GLP-1 er valgt fra gruppen som består av GLP-1, GLP-1 etterligninger og biologisk aktive analoger derav.

GLP-1 er et glukoseavhengig insulinotropisk hormon som effektivt øker det perifere glukoseopptak uten å indusere farlig hypoglykemi. Videre undertrykker GLP-1 i stor grad glukagonsekresjon, uavhengig av dets insulinotropiske virkning, og reduserer dernest sterkt nivåer av frie fettsyrer (FFA) i plasma vesentlig mere enn det som kan oppnås med insulin. Høye FFA nivåer har vært implisert som en toksisk hovedmeka-nisme under myokard iskemi.

Man har nå utviklet GLP-1 konseptet som en metabolsk terapi for iskemi-reperfusjonsskade. Denne utvikling ble basert på den oppfatning at der er to kliniske situasjoner hvor iskemi-reperfusjon er en rutinehendelse og eventuelt en farlig hendelse: trombolytiske prosedyrer for akutt MI, og kardial reperfusjon etter iskemisk kardioplegi under hjertekirurgi. Dessuten har senere eksperimentelle og kliniske data etablert at fenomenet med iskemi-reperfusjon særlig reagerer på metabolsk terapi med GIK infusjon, og enda mere enn isolert iskemi uten reperfusjon (Apstein, CS (1998) Glucose-insulin-potassium for acute myocardial infarction. Remarkable results from a new prospective, randomized trial. Circulation 98, 2223-2226).

De to viktigste terapeutiske fordeler i behandlingen av akutt iskemi samtidig med MI i løpet av det siste tiår har vært introduksjonen av trombolyse og p-blokkade. Imidlertid, til tross for denne generelle suksess, har enkelte studier av trombolyse vist en tidlig mermortalitet som skyldes reper-fusjons-indusert skade og myokard svekking. Mekanismene som ligger bak svekkelse er komplekse, men en konsensus som viser seg er at dette sannsynligvis er forbundet med intracellulær acidose som fører til dysfunksjonelle sarcolemma Ca<2+> pumper og cytosolisk Ca<2+> overbelastning. Nettoresultatet er svekket myokard kontraktil funksjon som fører til nedsatt mekanisk effektivitet, såvel som reperfusjon-ventrikulære arrytmier. Dessuten har nyere forskning etablert at den intracellulære acidose i sin tur skyldes en ubalanse mellom glykolyse og fullstendig glukoseoksydasjon, i den betydning at graden av glykolyse er avkoblet fra oksydasjonen av pyruvat (sluttpro-duktet fra glykolyse) i TCA syklusen. Denne avkobling resulterer i netto H+ produksjon som skyldes omdannelsen av pyruvat til laktat. Den mest sannsynlige årsak til denne ubalanse er tilstedeværelsen av høye plasmanivåer av frie fettsyrer (FFA), som foretrukket går inn i mitokondriene og inhiberer pyruvatoksydasjon, en mekanisme som elegant forklarer den vel etablerte observasjon at hjerter perfundert med FFA er mindre i stand til å restituere i reperfusjonsfasen enn hjerter perfundert med glukose. Det er nå blitt funnet, og dette er noe av det grunnleggende for denne terapeutiske oppfinnelse, at GLP-1 undertrykker FFA utover det som forventes med insulin som er på 50% suppresjonsnivået, og GLP-1 kan gi en så høy som 90% suppresjon av FFA.

Disse betraktninger har styrket vår overbevisning om å behandle iskemi-reperfusjon med glukagonlignende peptider. Det er vel etablert at under normal perfusjon og adekvat oksygenering, avhenger hjertet av aerob metabolisme og anvender FFA'er som sitt foretrukne brennstoff. I motsetning til dette, under iskemi (redusert blodgjennomstrømming) eller hypoksi (redusert 02 tensjon), svekkes p-oksydasjon av fettsyrer (fordi den er strengt aerob) og fortsatt tilveiebring-else av ATP er i økende grad avhengig av anaerob glykolyse. Under den iskemiske periode, er glukose-insulin fordelaktig fordi den øker glukoseopptak og stimulerer glykolyse, og til-veiebringer derved ATP for opprettholdelse av essensielle membranfunksjoner, særlig ionetransport. Dessuten undertrykker glukose-insulin adiposevevlipolyse, og reduserer derved plasma FFA nivåer og opptak av FFA'er inn i myokardet. Høye nivåer av FFA'er er toksiske for det iskemiske myokard, både ved direkte detergente effekter på membraner og økninger i cAMP, og ved akkumulering av acylkamitin, som inhiberer Ca<2+ >pumper. Nettoeffekten er forstyrrelse av ionebytting, cytosolisk Ca<2+> overbelastning og resulterende kontraktil dysfunksjon og arrytmier.

Under reperfusjonsperioden, er glukose-insulin fordelaktig fordi, som forklart over, kan denne terapi lindre den metabolske ubalanse som produserer svekking. Dette oppnås ved direkte stimulering av PDH og således pyruvatoksydasjon, og indirekte ved redusert FFA opptak og således et forbedret forhold mellom pyruvat- og FFA oksydasjon.

Fra den ovennevnte omtale fremgår det klart at den doble virkning av glukose-insulin-økt glukoseopptak og metabolisme og reduserte FFA nivåer, har vesentlig terapeutisk potensiale ved reperfusjon. Noen har uttrykt en bekymring om at under inngående, i alt vesentlig null-gjennomstrømming iskemi, vil glykolytiske produkter, nemlig laktat, akkumulere på grunn av utilstrekkelig "utvasking". Laktatakkumulering fører i sin tur til høye intracellulære protonkonsentråsjoner, og mang-lende evne til å reoksydere NADH, og høye [H<+>] og NADH/NAD<+ >forhold inhiberer produktiv glykolyse. Under disse omsten-digheter kan glukose være toksisk for celler fordi ATP faktisk konsumeres ved fremstillingen av fruktose-1,6-bisfosfat, og høy [H<+>] kan aggravere myocytt nekrose (Neely, JR, og Morgan, HE (1974) Relationship between carbohydrate and lipid metabolism and the energy balance of heart muscle. Ann. Rev. Physiol. 36, 413-459). Disse bekymringer er imidlertid ikke blitt bekreftet ved betydningen av eksperimentelle data og kliniske data, som indikerer at glukose-insulin gir fordelaktige resultater. Idet man ikke ønsker å være bundet av noen teori, er den sannsynlige forklaring for dette at i mennesker er akutt spontan iskemi ikke en tilstand med null-gjennomstrømming iskemi, men representerer i stedet et område med lav-gjennomstrømming iskemi hvor residualperfusjon er adekvat for substratavlevering og laktat-utvasking. Denne forståelse har nå tilveiebragt en sterk fysiologisk logikk for anvendelse av metabolsk terapi ved iskemi-reperfusjon.

Moderne hjertekirurgi, enten den involverer erstatning av hjerteklaff eller koronararterie-bypass-transplantasjon (CABG), krever rutinemessig hypotermisk kardioplegistans, aorta-kryssklemming og kardiopulmonal bypass under operasjon. Rutinemessig kardial kirurgi induserer effektivt derfor en tilstand av elektiv global iskemi etterfulgt av reperfusjon, som eventuelt eksponerer hjertet for alle de medfølgende risikoer og skader som er spesielle for myokard iskemi-reperfusjon. Følgelig forblir prevensjon av myokard skade under og etter hjerteoperasjoner et viktig anliggende. Elektiv kardioplegi-iskemi etterfulgt av reperfusjon har klare paral-leller til iskemi-reperfusjon som man treffer på under akutt MI etterfulgt av revaskularisering, og således gjelder mange av de patofysiologiske prinsipper som er overveiet i tidligere deler også under hjertekirurgi. Der er imidlertid noen klare forskjeller mellom kirurgisk kardioplegi-iskemi-reperfusjon og MI-assosiert iskemi-reperfusjon. Under kirurgi stanses hjertet (kardioplegi) og infuseres med en.

(hypotermisk) oppløsning som er utformet for å optimalisere myokard preservasjon. Etter endt operasjon, reaktiveres hjertet og reperfunderes med oksygenert blod ved kroppstem-peratur. Dette produserer en sekvens av hypotermisk iskemi og normotermisk reperfusjon, som kan forhindre akkumuleringen av høye vevsnivåer av H+ og laktat. Dessuten, til forskjell fra akutt MI, representerer hypotermisk kardioplegi en tilstand av global, null-strøm iskemi, etterfulgt av global reperfusjon.

I vår tidligere søknad (Nr. 60/103 498)har man gjennomgått ufordelaktighetene med glukose-insulin infusjoner og fordel-ene med å erstatte disse med GLP-1 infusjon som er sikrere enn insulin. Oppsummert, bærer GIK infusjoner signifikante risikoer for både hypoglykemi og hyperglykemi, og er teknisk krevende og personal-intensive. Farene for hypoglykemi er

. åpenbare.

I motsetning eksisterer disse risikoer ikke med en GLP-1 infusjon. Glukagonlignende peptid (7-3 6) amid (GLP-1) er et naturlig, tarmavledet, insulinotropisk peptid som utgjør en hovedkomponent i den såkalte inkretineffekten. GLP-1 utviser sin hovedeffekt i de pankreatiske endokrine celler, mens det (1) regulerer insulinekspresjon og sekresjon fra p-cellene på en glukoseavhengig måte, (2) stimulerer sekresjonen av somatostatin og (3) undertrykker sekresjonen av glukagon fra a-cellene. Skjønt dette ikke er formelt løst, antas den sterke glukagonostatiske effekt å resultere fra en eller alle av de etterfølgende: (1) direkte suppresjon ved stimulering av GLP-1 reseptorer på a-celler, skjønt dette er usannsynlig, (2) parakrin suppresjon av glukagonsekresjon ved intra-øy fri-gjøring av somatostatin eller (3) parakrin suppresjon ved intra-øy frigjøring av insulin. Uansett cellulær mekanisme, er GLP-1 unik i sin kapasitet med hensyn til samtidig å sti-mulere insulinsekresjonen og inhibere glukagonfrigjøring. Skjønt en terapeutisk insulininfusjon også inhiberer gluka-gonf rig j øring, er denne effekten ikke så potent som den til GLP-1, som utviser en direkte intra-øy parakrin inhibering av glukagonsekresj on.

Den doble kapasitet til GLP-1 for kraftig stimulering av insulinfrigjøring og inhibering av glukagonsekresjon, sammen med den strenge glukoseavhengighet av dets insulinotropiske virkning, utstyrer dette molekyl med et unikt terapeutisk potensiale i forbindelse med håndteringen av iskemi-reperfusjon. For det første stimulerer GLP-1 i stor grad sekresjonen av endogent insulin og kan derfor anvendes for å oppnå alle de fordelaktige virkninger som tilskrives en insulininfusjon i den metabolske behandling av iskemi-reperfusjon. Skjønt høy-dose GIK-infusjoner typisk inneholder 2 5-33% glukose og 50-100 U insulin/L, er kravet for introduksjon av hyperglykemi per se for å oppnå terapeutisk effekt i motsetning til kun å tilveiebringe et metabolsk miljø for den sikre administrering av høye doser av insulin, uklart. Det er sannsynlig at adekvate blodglukosenivåer er nødvendig for å muliggjøre substratavlevering, men dette medfører nødvendig-vis ikke et behov for hyperglykemi og bør ikke lede bort fra det faktum at insulin utviser viktige effekter annet enn glukoseopptak. En terapeutisk GLP-1 infusjon vil derfor sannsynligvis kun kreve en beskjeden (for eksempel 5%) glukose-koinfusjon for å opprettholde blodglukose like over fysiologiske nivåer for å utløse insulinfrigjøring. Glukose er ikke nødvendig som et sikkerhetsmål, da blodnivåer på £ 3,5 itiM motvirker den insulinstimulerende aktivitet av GKP-1, og beskytter derved fullstendig mot farene for hypoglykemi.

For det andre utviser GLP-1 en kraftig glukagonostatisk effekt, som sammen med dets insulinotropiske virkning vil føre til en sterk suppresjon av FFA'er. En av de viktigste fordeler med glukose-insulin infusjoner er reduksjonen i sirkulerende FFA nivåer og suppresjonen av FFA opptak. FFA'er og deres metabolitter har direkte toksiske effekter på det iskemiske myokardium så vel som under reperfusjonsperioden, når de bidrar til svekking, og følgelig er reduksjon av FFA nivåer et viktig terapeutisk mål for metabolsk intervensjon ved iskemi-reperfusjon. Da glukagon er et kraftig stimuli for adiposevevlipolyse og FFA produksjon, vil GLP-1 mediert glukagonsuppresjon ytterligere øke den insulininduserte reduksjon i sirkulerende FFA<1>er. Således er GLP-1 terapi overlegen en glukose-insulin infusjon i denne forbindelse. Innledende data i friske frivillige indikerer bestemt at en intravenøs GLP-1 infusjon vil redusere fastende plasma FFA nivåer til < 10% av kontrollverdier.

GLP-1 bør være effektiv i flertallet i pasienter uten å kreve samtidig glukoseadministrering. En liten andel av individer kan imidlertid kreve glukose/GLP-1 for å utløse en adekvat insulinrespons. I tillegg kan det også være nødvendig å administrere kalium for å korrigere omfattende kaliumforan-dringer i det intracellulære rom når glukose ko-administreres med GLP-1.

I tillegg til GLP-1 eller dets biologiske analoger, kan tera-pien inkludere anvendelse av fri-radikal scavengere slik som glutation, melatonin, vitamin E og superoksyddismutase (SOD). I slike kombinasjoner er risiko for reperfusjonsskade ytterligere nedsatt.

Betegnelsen "GLP-1" eller glukagonlignende peptid inkluderer etterligninger og kan, som anvendt i oppfinnelsens sammen-heng, omfatte glukagonlignende peptider og relaterte peptider og analoger av glukagonlignende peptid-1 som binder til et glukagonlignende peptid-1 (GLP-1) reseptorprotein som GLP-1 (7-3 6) amidreseptorproteinet og har en tilsvarende biologisk effekt på insulinsekresjon som GLP-1 (7-36) amid, som er en nativ, biologisk aktiv form av GLP-1. Se Goke, B og Byrne, M, Diabetic Medicine, 1996, 13:854-860. GLP-1 reseptorene er celleoverflateproteiner som for eksempel er funnet på de insulinproduserende pankreatiske p-celler. Glukagonlignende peptider og analoger vil inkludere arter med insulinotropisk aktivitet og som er agonister av, dvs. aktiverer, GLP-1 reseptormolekylet og dets andre budbringeraktivitet på, inter alia, insulinproduserende p-celler. Agonister av glukagonlignende peptid som utviser aktivitet gjennom denne reseptor er blitt beskrevet: EP 07 081 179A2, Hjorth, S.A. et al., J.

Biol Chem. 269 (48) : 30121-30124 (1994), Siegel, E.G. et al. Amer. Diabetes Assoc. 57th Scientific Sessions, Boston

(1997), Adelhorst, K. et al. J. Biol. Chem. 269 (9):6275-6278

(1994), Deacon CF. et al. 16th International Diabetes Federation Congress Abstracts, Diabetologia Supplement

(1997), Irwin, D.M. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 94:7915-7920 (1997), Mosjov, S., Int. J. Peptide Protein Res. 40:333-343 (1992). Glukagonlignende molekyler inkluderer polynukleotider som uttrykker agonister av GLP-1, dvs. aktivatorer av GLP-1 reseptormolekylet og dets sekundære budbringeraktivitet funnet på, inter alia, insulinproduserende p-celler. GLP-1 etterligninger som også er agonister inkluderer for eksempel kjemiske forbindelser som spesifikt er utformet for å aktivere GLP-1 reseptoren. Glukagonlignende peptid-1 antagonister er for eksempel også kjent, se for eksempel Watanabe, Y et al., J. Endocrinol 140 (1):45-52

(1994), og inkluderer eksendin (9-39) amin, en eksendinanalog som er en potent antagonist av GLP-1 reseptorer (se for eksempel WO 97/46584). Nylige publikasjoner omhandler Black Widow GLP-1 og Ser<2> GLP-1, se G.G. Holz, J.F. Hakner/- Comparative Biochemistry and Physiology, part B 121 (1998) 177-184 og Ritzel, et al., A synthetic glucagon- like peptide-1 analog with improved plasma stability, J. Endocrinol 1998 oktober 159(1):93-102.

Videre utførelser inkludere kjemisk syntetiserte glukagonlignende popypeptider såvel som hvilke som helst polypeptider eller fragmenter derav som er i alt vesentlig homologe. "I alt vesentlig homologe" som kan referere både til nuklein-syre- og aminosyresekvenser, betyr at en spesiell sekvens av interesse, for eksempel en mutant sekvens, varierer fra en referansesekvens med en eller flere substitusjoner, delesjo-ner eller addisjoner, hvis nettoeffekt ikke resulterer i en skadelig funksjonell ulikhet mellom referansesekvens og sekvenser av interesse. For formålet med den foreliggende oppfinnelse, vil sekvenser med mere enn 50% homolog og foretrukket mere enn 90% homolog ekvivalent biologisk aktivitet med hensyn til å øke p-celle responser på plasmaglukosenivåer og med ekvivalente ekspresjonsegenskaper betraktes som i alt vesentlig homologe. For å bestemme homologi, bør avkorting av den modne sekvens ignoreres. Sekvenser med mindre grad av homologi, sammenlignbar bioaktivitet og ekvivalente ekspresjonsegenskaper betraktes som ekvivalenter.

Pattedyr GLP peptider og glukagon kodes for av det samme gen. I ileum prosesseres fenotypen til to hovedklasser av GLP pep-tidhormoner, nemlig GLP-1 og GLP-2. Der er fire GLP-1 relaterte peptider som er kjent og som prosesseres fra de feno-typiske peptider. GLP-1 (1-37) har sekvensen His Asp Glu Phe Glu Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly (SEQ. ID. No:l). GLP-1 (1-37) amideres ved post-translasjons-prosessering til å gi GLP-1 (1-36) NH2 som har sekvensen His Asp Glu Phe Glu Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg (NH2) (SEQ. ID N0:2), eller prosesseres enzymatisk til å gi GLP-1 (7-37) som har sekvensen His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly (SEQ. ID N0-.3) , GLP-1 (7-37) kan også amideres til å gi GLP-1 (7-36) amid som er den naturlige form av GLP-1 molekylet, og som har sekvensen His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg (NH2) (SEQ. ID NO:4) og i den naturlig formen av GLP-1 molekylet.

Intestinale L celler utskiller GLP-1 (7-37)(SEQ. ID N0:3) og GLP-1 (7-36) NH2 (SEQ. ID NO:4) i et forhold på henholdsvis 1 til 5. Disse trunkerte former av GLP-1 har korte halverings-tider in situ, dvs. mindre enn 10 minutter, og inaktiveres ved en aminodipeptidase IV til å gi henholdsvis Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly (SEQ. ID NO:5) og Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg (NH2)

(SEQ. ID NO:6). Peptidene Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly (SEQ. ID NO:5) og Glu Gly Thr Phe Thr Ser

Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg (NH2) (SEQ. ID NO:6) er blitt spekulert til å påvirke hepatisk glukoseproduksjon, men stimulerer ikke produksjonen eller frigjøringen av insulin fra pankreas.

Der er seks peptider i Gilaøglegifter som er homologe med GLP-1. Deres sekvenser er sammenlignet med sekvensen til GLP-l i tabell 1.

a= GLP-1 (SEQ. ID NO:4).

b= Exendin 3 (SEQ. ID NO:7).

C= Exendin 4(9-39)NH2(SEQ. ID NO:8).

d= Exendin 4(SEQ. ID NO:9).

e= Helospektin I(SEQ. ID NO:10).

f= Helospektin II(SEQ. ID N0:11).

g= Helodermin(SEQ. ID N0:12).

h=Q<8>, Q<9>Helodermin (SEQ. ID NO:13).

De viktigste homologier som indikert ved de skisserte områder i tabell 1 er: peptider c og h er avledet fra henholdsvis b og g. Alle 6 naturlig forekommende peptider (a,b,d,e,f og g) er homologer i posisjoner 1,7,11 og 18. GLP-1 og exendiner 3 og 4 (a,b og d) er videre homologer i posisjoner 4,5,6,8,9, 15,22,23,25,26 og 29. I posisjon 2 er A, S og G strukturelt tilsvarende. I posisjon 3 er rester D og E (Asp og Glu) strukturelt tilsvarende. I posisjoner 22 og 23 er F(Phe) og I(Ile) strukturelt tilsvarende til henholdsvis Y(Tyr) og L(Leu). Likeledes, i posisjon 26 er L og I strukturelt ekvivalente.

Således, av de 30 rester av GLP-1, er exendiner 3 og 4 iden-tiske i 15 posisjoner og ekvivalente i 5 ytterligere posisjoner. De eneste posisjoner hvor grunnleggende strukturelle forandringer er tydelige er i rester 16,17,19, 21,24,27,28 og 30. Exendiner har også 9 ekstra rester i karboksyltermi-nusen.

De GLP-1 lignende peptider kan fremstilles ved fast-fase kjemisk peptidsyntese. GLP-1 kan også fremstilles ved kon-vensjonelle rekombinante teknikker som ved anvendelse av standardprosedyrer beskrevet i for eksempel Sambrook and Maniatis. "Rekombinant" som anvendt heri betyr at et protein er avledet fra rekombinante (for eksempel mikrobielle eller pattedyr) ekspresjonssystemer som kan modifiseres genetisk til å inneholde et ekspresjonsgen for GLP-1 eller dets biologisk aktive analoger.

De GLP-l lignende peptider kan utvinnes og renses fra rekombinante cellekulturer ved metoder som inkluderer, men som ikke er begrenset til, ammoniumsulfat eller etanolpresipi-tering, syreekstraksjon, anion- eller kationbytterkromato-grafi, fosforcellulosekromatografi, hydrofob interaksjons-kromatografi, affinitetskromatografi, hydroksylapatittkroma-tografi og lektinkromatografi. Høyytelsesvæskekromatografi (HPLC) kan anvendes for avsluttende rensetrinn.

Polypeptidene ifølge oppfinnelsen kan være et naturlig renset produkt eller et produkt av kjemiske synteseprosedyrer, eller produsert ved rekombinante teknikker fra prokaryotiske eller eukaryotiske vertsceller (for eksempel ved bakterier, gjær-celler, høyere planteceller, insektsceller og pattedyrceller i kultur eller in vivo). Avhengig av den vert som anvendes i en rekombinant produksjonsprosedyre, er polypeptidene ifølge oppfinnelsen generelt ikke-glykosylert, men de kan være glykosylert.

GLP-1 aktivitet kan bestemmes ved standard metoder, generelt ved reseptor-bindingsaktivitet screeningprosedyrer som involverer å tilveiebringe passende celler som uttrykker GLP-1 reseptoren på deres overflate, for eksempel insulinoma-celle-linjer som RINmSF celler eller INS-1 celler. Se også Mosjov, S. (1992) og EP 07 081 70A2. I tillegg til å måle spesifikk binding av tracer til membran ved anvendelse av radioimmuno-assaymetoder, kan cAMP aktivitet eller glukoseavhengig insu-linproduksjon også måles. I en metode anvendes et polynukle-otid som koder for reseptoren i forbindelse med oppfinnelsen for å transfektere celler for derved å uttrykke GLP-1 resep-torproteinet. Således kan for eksempel disse metoder anvendes for å screene for en reseptoragonist ved å bringe slike celler i kontakt med forbindelser som skal screenes og. bestemme om slike forbindelser danner et signal, dvs. aktiverer reseptoren.

Polyklonale og monoklonale antistoffer kan anvendes for å detektere, rense og identifisere GLP-1 lignende peptider for anvendelse som beskrevet heri. Antistoffer som ABGA1178 detekterer intakt ikke-spleiset GLP-1 (1-37) eller N-termi-nalt trunkert GLP-1 (7-37) eller (7-3S) amid. Andre antistoffer detekterer på selve enden av C terminusen av prekur-sormolekylet, en prosedyre som ved subtraksjon tillater å beregne mengden av biologisk aktivt trunkert peptid, dvs. GLP-1 (7-37) eller (7-36) amid (Orskov et al. Diabetes, 1993, 42:658-661, Orskovet al. J. Clin. Invest. 1991, 87:415-423).

Andre screeningteknikker inkluderer anvendelse av celler som uttrykker GLP-1 reseptoren, for eksempel transfekterte CHO celler, i et system som måler ekstracellulære pH eller ioniske forandringer bevirket ved reseptoraktivering. Poten-sielle agonister kan for eksempel bringes i kontakt med en celle som uttrykker GLP-1 proteinreseptoren og en andre bud-bringerrespons, for eksempel signaltransduksjon eller ioniske eller pH forandringer, kan måles for å bestemme om den poten-sielle agonist er effektiv.

De glukagonlignende peptid-1 reseptorbindingsproteiner anvendes i kombinasjon med en passende farmasøytisk bærer. Slike preparater omfatter en terapeutisk effektiv mengde av polypeptidet og en farmasøytisk aksepterbar bærer eller eksi-piens. En slik bærer inkluderer, men er ikke begrenset til, saltoppløsning, bufret saltoppløsning, dekstrose, vann, glyserol, etanol, laktose, fosfat, mannitol, arginin, trehalose og kombinasjoner derav. Formuleringene bør passe til administreringsmåten og dette kan lett bestemmes av fagkyndige på området. GLP-1 peptidet kan også anvendes i kombinasjon med midler som er kjent innen teknikken til å øke halv-eringstiden in vivo for peptidet for å øke eller forlenge peptidets biologiske aktivitet. Et molekyl eller en kjemisk enhet kan for eksempel være kovalent bundet til preparatet før administrering derav. Alternativt kan det økende middel administreres samtidig med preparatet. Midlet kan ytterligere omfatte et molekyl som-er kjent til å inhibere den enzymatiske degradering av GLP-1 slik som peptider som kan administreres samtidig med eller etter administrering av GLP-1 peptidpreparatet. Et slikt molekyl kan for eksempel administreres oralt eller ved injeksjon.

Pasienter som har fått administrert GLP-1 eller dets analoger i kombinasjon med bærersystemene som er spesifisert her, særlig dem som er behandlet før en planlagt hendelse eller innen de første 4 timer etter en iskemisk hendelse, obser-veres til å ha mindre arrytmier, mindre vevsskade og mindre ubehag uten bivirkninger.

Ut fra disse betraktninger fremgår det klart at en infusjon av GLP-1 kan forventes til å utvise en omfattende terapeutisk effekt ved myokard reperfusjon. Det forventes at GLP-1 kan administreres enten ved I.V. eller subkutan administrering for kontinuerlig infusjon ved intravenøs (I.V.) 0,1 pmol/kg/- min til 10 pmol/kg/min og ved subkutan (S.C.) 0,1 pmol/kg/min til 75 pmol/kg/min, og for enkel injeksjon (bolus) ved I.V.

0,005 nmol/kg til 20 nraol/kg og S.C. 0,1 nmol/kg til 100 nmol/kg som egnede administreringsnivåer. GLP-1 infusjonen kan koadministreres med glukose (5%) om nødvendig for å opprettholde blodglukosenivåer £ 5 mM (for å opprettholde effektiv insulinsekresjon). Likeledes vil koadministrering av kalium (K<+>) også overveies, avhengig av i hvilken grad aktiveringen av membranen Na<+>/K<+> ATPase fører til en overfør-ing av K<+> inn i det intracellulære rom. GLP-1 behandlingen vil bli igangsatt så tidlig som mulig i post-iskemiperioden etter for eksempel akutt spontan iskemi i hjemmet eller i ambulansen og før reperfusjonsterapier, og fortsettes deretter. I tilfellet av hjertekirurgi, bør GLP-1 infusjonen starte 12 til 24 timer før operasjon, under operasjon fra begynnende anestesi inntil aorta-kryssklemming og umiddelbart etter opphør av kryssklemming i en periode på minst 72 timer postoperativt. Som forklart tidligere vil koadministrering av en fri-radikal scavenger ytterligere understøtte reperfu-sjonsrestituering.

Fra det foregående fremgår det at oppfinnelsen oppfyller alle de angitt formål.

Claims (17)

1. Anvendelse av et preparat som inkluderer et peptid som aktiverer en reseptor for glukagonlignende peptid-1 (GLP-1) og en farmasøytisk aksepterbar bærer for fremstilling av et medikament for å behandle individer med behov for en forbedring av organ-vevsskade bevirket ved reperfusjon av blod-gjennomstrømming etter en iskemiperiode, hvori peptidet som aktiverer en reseptor for GLP-1 er valgt fra gruppen som består av GLP-1, GLP-1 etterligninger og biologisk aktive analoger derav.

2. Anvendelse som angitt i krav 1, hvor peptidet som aktiverer en reseptor for GLP-1 er GLP-1 eller en biologisk aktiv analog derav.

3. Anvendelse som angitt i krav l, hvor peptidet som aktiverer en reseptor for GLP-1 er et exendin.

4. Anvendelse som angitt i krav 1, hvor peptidet som aktiverer en reseptor for GLP-1 er valgt fra gruppen som består av GLP-1(1-36)NH2 (SEQ ID NO: 2), GLP-1(7-37)(SEQ ID NO: 3), GLP-1(7-36)NH2 (SEQ ID NO: 4), GLP-1(9-37)(SEQ ID NO: 5), GLP-1(9-36)NH2 (SEQ ID NO: 6), exendin-3 og exendin-4.

5. Anvendelse som angitt i krav 1, hvor behandlingen ikke inkluderer ko-administreringen av glukose.

6. Anvendelse som anvendt i krav 1, hvor peptidet som aktiverer en reseptor for GLP-1 administreres til et individ med behov for behandling ved et dosenivå på 0,1 pmol/kg/min. opp til 10 pmol/kg/min.

7. Anvendelse av et preparat som angitt i krav 1, hvor den farmasøytiske bærer er valgt fra gruppen bestående av salt-oppløsning, bufret saltoppløsning, dekstrose, vann, glyserol, etanol, laktose, fosfat, mannitol, arginin, trehalose og kombinasjoner derav.

8. Anvendelse av som angitt i krav 6, hvor der er en samtidig administrering av glukose.

9. Anvendelse som angitt i krav 8, hvor der er en samtidig administrering av kalium.

10. Anvendelse som angitt i krav 6, hvor der er en samtidig administrering av en fri-radikal scavenger.

11. Anvendelse som angitt i krav 1, hvor administrering begynner innen 4 timer etter en iskemisk hendelse.

12. Anvendelse som angitt i krav 11, hvor administrering skjer innen 4 timer etter en iskemisk hendelse og fortsetter deretter.

13. Anvendelse som angitt i krav 1, hvor administrering er intravenøs.

14. Anvendelse som angitt i krav 1, hvor administrering er ved en subkutan eller mikrotrykk-injeksjon, dyp lungeinsuf-flasjon, ekstern eller implantat pumpe, depotinjeksjon og andre mekanismer med forsinket frigjøring, oral avlevering og plaster, bukkal og andre mekanismer som krysser hud og membraner .

15. Anvendelse som angitt i krav 1, hvor organvevet er myokardium.

16. Anvendelse som angitt i krav 1, hvor behovet for forbedring av vevsskade ved metabolsk intervensjon stammer fra en medisinsk prosedyre som er en kirurgisk hendelse valgt fra gruppen bestående av hjertekirurgiprosedyrer, organtransplan-tasjoner, traumatisk lem-amputasjon og ny fastgjøring.

17. Anvendelse av et preparat som angitt i krav 16, hvor den medisinske prosedyre involverer en iskemisk reperfusjons-hendelse hvor nevnte hendelse er samtidig med tarminfarkt eller myokard infarkt.