ES2233366T5

ES2233366T5 - Intervención metabólica con glp-1 para mejorar la función de tejido isquémico y reperfundido.

Info

Publication number: ES2233366T5
Application number: ES00926404T
Authority: ES
Inventors: Thomas R. Coolidge; Mario R. W. Ehlers
Original assignee: Amylin Pharmaceuticals LLC
Current assignee: Amylin Pharmaceuticals LLC
Priority date: 1999-04-30
Filing date: 2000-04-27
Publication date: 2012-01-27
Anticipated expiration: 2020-04-27
Also published as: NZ514610A; WO2000066138A3; ES2233366T3; AU2004240247B2; AU777019B2; EP1173197B2; NO20015294L; HK1046640A1; AU2004240247A1; NO325601B1; US20020147131A1; JP2002543142A; NO20015294D0; WO2000066138A2; DE60016393T3; CA2372947C; AU4493500A; IL145830A0; MXPA01010859A; IL145830A

Abstract

Uso de una composición que incluye GLP - 1, o un análogo biológicamente activo del mismo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable, para la fabricación de un medicamento para tratar individuos en necesidad de mejora de lesión del tejido orgánico producida por reperfusión de flujo sanguíneo después de un período de isquemia, dicho tratamiento no incluye la co - administración de glucosa.

Description

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la intervención metabólica con GLP-1 para mejorar terapéuticamente la función de tejido isquémico y reperfundido.

Antecedentes de la invención

El daño celular a tejidos orgánicos aerobios se reconoce bien como una consecuencia de isquemia, tanto si es endógeno como en el caso de una oclusión de arteria coronaria espontánea, o iatrogénica tal como con corazón abierto, cirugía de desviación coronaria, o procedimientos de transplante con el corazón u otros órganos tal como el pulmón, hígado, riñón, páncreas y tracto gastrointestinal. El grado y duración de los procesos que producen isquemia están relacionados la cantidad de muerte celular y/o alteración reversible de la función celular. También se sabe que mucho del daño de tejidos de hecho se produce tras reperfusión (es decir, reanudación del flujo sanguíneo) y reoxigenación del tejido anóxico previo. La lesión por reperfusión ha sido el sujeto de estudio reciente considerable impulsado por los avances médicos particularmente en el tratamiento de lesión por reperfusión después de infarto de miocardio y otros procedimientos de remedio miocárdico tal como desviación coronaria, otras cirugías a corazón abierto, así como transplantes de órganos.

Como producto secundario de la respiración aeróbica normal, rutinariamente se pierden electrones de la cadena de transporte de electrones mitocondrial. Tales electrones pueden reaccionar con oxígeno molecular para generar el radical libre reactivo superóxido, que a través de otras etapas de reacción en presencia de peróxido de hidrógeno y hierro produce el radical hidroxilo tóxico extraordinariamente reactivo. Los tejidos aerobios metabólicamente activos poseen mecanismos de defensa dedicados a degradar radicales libres tóxicos antes de que estas especies de oxígeno reactivo puedan interaccionar con orgánulos celulares, enzimas o ADN, cuyas consecuencias podrían ser, sin tales mecanismos protectores, mortales. Los mecanismos de defensa incluyen las enzimas superóxido dismutasa (SOD), que proporciona superóxido, catalasa que degrada el peróxido de hidrógeno, y péptido glutatión que es un secuestrante de radicales libres no específico.

Aunque todavía no se conoce del todo, se cree que con la isquemia de tejidos metabólicos y la reperfusión posterior, se produce un grupo complejo de procesos. Inicialmente durante el período isquémico, la actividad de enzimas antioxidantes intracelulares parece disminuir, incluyendo la de la SOD, la catalasa y el glutatión. También existe una indicación de que el nivel de la actividad de la xantina oxidasa aumenta concomitantemente en el tejido endotelial vascular durante el proceso isquémico. La combinación de capacidad potenciada para producir radicales libres de oxígeno (mediante actividad potenciada de la xantina oxidasa) y capacidad reducida para depurar los mismos radicales de oxígeno (mediante actividad reducida de la SOD, la catalasa y el glutatión) sensibiliza considerablemente la célula isquémica hasta que se produce una descarga oxidativa y por lo tanto daño, si estas células se reperfunden después con sangre y, por lo tanto, oxígeno. Esta descarga oxidativa que se produce en segundos a minutos desde la reperfusión podría producir daños reversibles e irreversibles a las células endoteliales y a otras células que constituyen la matriz del órgano isquémico - reperfundido. Si, por ejemplo, el corazón es el órgano que se está considerando, el daño oxidivo reversible puede contribuir al aturdimiento miocárdico, mientras que el daño irreversible se presenta él mismo como un infarto de miocardio. Junt con esta descarga oxidativa se producen los daños por oxidación en las membranas celulares. La oxidación de los lípidos en las membranas celulares parece desempeñar un papel en al quimiotaxis de los neutrófilos hacia áreas postisquémicas. Tales neutrófilos activados se adhieren al endotelio vascular, inducen la conversión de la xantina deshidrogenasa en xantina oxidasa en el interior de dichas células endoteliales, y posteriormente, agrava la pérdida de la integridad endotelial. Los neutrófilos activados también migran fuera de la vasculatura hacia los espacios intersticiales miocárdicos donde las células inflamatorias pueden destruir directamente los miocitos. Adicionalmente, las perturbaciones en la movilización normal de calcio desde el retículo sarcoplásmico como consecuencia de la isquemia - reperfusión contribuyen a la alteración de la función miocárdica reversible denominada aturdimiento miocárdico.

Las consecuencias de los procesos de isquemia - reperfusión son daños celulares reversibles e irreversiblee, muerte celular y disminución de la eficacia funcional de los órganos. Más específicamente, en el caso de lesión por reperfusión miocárdica, las consecuencias incluyen aturdimiento miocárdico, arritmias, e infarto, y como resultado, choque cariogénico y, potencialmente, insuficiencia cardiaca congestiva.

La paradoja del daño celular asociado con un período limitado de anoxia isquémica, seguido de reperfusión es que el daño y la muerte celular parece que no solo sprobable que sea el resultado del período de privación de oxígeno sino que, adicionalmente, como consecuencia de la reoxigenación de los tejidos se harán altamente sensibles a los daños oxidativos durante el período isquémico. El daño por reperfusión comienza con la descarga oxidativa inicial inmediatamente después de que comience de nuevo el flujo y continua empeornado durante una serie de horas a medida que los procesos inflamatorios se desarrollan en los mismos tejidos postisquémicos. Se ha mostrado que los esfuerzos dedicados a disminuir la sensibilidad de las células postanóxicas al daño oxidativo y, adicionalmente, los esfuerzos para reducir respuestas inflamatorias en estos mismos tejidos reducen el daño reversible e irreversible a órganos reperfundidos postanóxicos. Una combinación de procedimientos para reducir tanto la descarga oxidativa inicial como la inflamación posterior asociada con el daño puede proporcionar protección sinérgica contra la lesión por reperfusión.

Con respecto al tratamiento de la isquemia coincidente con pacientes de IM, los tratamientos que se usan actualmente son la administración de trombolíticos, tales como estreptoquinasa y t – PA, y la angioplastia. La patente de Estados Unidos nº 4.976.959 divulga la administración de t - PA y SOD para inhibir el daño tisular durante la reperfusión y/o la angioplastia coronaria transluminal percutánea coincidente con isquemia para restablecer el flujo sanguíneo regional. Así pues, se extá exponiendo a un número creciente de pacientes a la probabilidad de lesión por reperfusión y a sus efectos, particularmente pacientes cardiacos.

La lesión por reperfusión en órganos distintos al corazón generalmente se manifiesta como una reducción considerable de la de eficacia de la función, una consecuencia de la cual puede ser la prematura degeneración del órgano, o simplemente deja de funcionar. Adicionalmente, los órganos transplantados experimentan un aumento de los índices de rechazo si existe una lesión por reperfusión subyacente significativa.

Como se ha descrito brevemente anteriormente, aunque el mecanismo preciso de la lesión por reperfusión no se ha definido claramente, una gran cantidad de datos, la mayoría de los cuales se han acumulado en diversos estudios de modelos cardiacos, indican que la generación de radicales libres derivados de oxígeno, incluyendo el anión superóxido (O2)-, el radical libre hidroxilo (.OH) y H2O2, se produce como consecuencia de la reintroducción de oxígeno molecular con reperfusión y desempeña un papel importante en la necrosis de tejidos. Los agentes que disminuyen la producción de estos radicales libres derivados de oxígeno (incluidos alopurinol y deferroxamina) o incrementan la degradación de estos materiales, tales como superóxido dismutasa, catalasa, glutatión, y complejos de cobre, parecen limitar el tamaño del infarto y también pueden potenciar la recuperación de la función ventricular izquierda del aturdimiento cardiaco.

El uso de la intervención metabólica como terapia específicamente durante el infarto de miocardio agudo está bien establecido, aunque no sin controversia. Existen abundantes pruebas experimentales y clínicas que avalan el uso de una infusión de glucosa-insulina-potasio (GIK), principal forma de intervención metabólica, después de un IM agudo, particularmente después del éxito del estudio sueco de DIGAMI (MaZmberg, K, y DIGAMI Study Group (1997) Prospective randomized study of intensive insulin treatment on long term survival alter acute myocardial infarction in patients with diabetes mellitus. Brit. Med. J. 314, 1512 - 1515). El estudio de DIGAMI enfatizó la eficacia de una infusión de glucosa - insulina para el IM agudo en pacientes diabéticos, pero este tipo de terapia no se ha sugerido ni usado nunca para reperfusión.

Por lo tanto se puede observar que existe la necesidad de una composición segura y eficaz que tenga amplia aplicabilidad para prevenir o mejorar los efectos perjudiciales de la isquemia y la reperfusión para tejidos en general, especialmente tejidos orgánicos e, incluidos, entre otros, el miocardio. Un objeto principal de la presente invención es satisfacer esta necesidad.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento para tratarla isquemia y la reperfusión sin los efectos secundarios que normalmente acompañan a las terapias disponibles actualmente,

Otro objeto más de la presente invención es proporcionar una composición de vehículo farmacéuticamente aceptable que se puede usar para administración intravenosa de las composiciones de la presente invención sin que se produzca ningún efecto secundario indeseable y sin que afecte adversamente a las propiedades estimulantes antigénicas o inmunitarias.

Estos y otros objetos y beneficios de la presente invención serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción posterior y de las reivindicaciones adjuntas.

En la publicación “Circulation vol. 98, 1998, pp. 2223 - 2226” se divulga el tratamiento del infarto de miocardio con GIK (glucosa-insulina-potasio) en forma de una terapia de reperfusión aguda. La solicitud de patente internacional nº WO 9808531 divulga la posibilidad de sustituir la GIK por GLP-1 en el tratamiento de los infartos de miocardio agudos (IAM), sin embargo tal tratamiento todavía requiere la administración de glucosa e incluso potasio en algunos casos.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona el uso de una composición que incluye GLP-1, o un análogo biológicamente activo del mismo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de individuos que necesiten una mejora de lesión tisular orgánica producida por la reperfusión de flujo sanguíneo después de un período de isquemia, dicho tratamiento no incluye la coadministración de glucosa.

Descripción detallada de la invención

El GLP-1 es una hormona insulinotrópica dependiente de glucosa que potencia eficazmente la captación de glucosa periférica sin inducir hipoglucemia peligrosa. Además, el GLP-1 suprime considerablemente la secreción de glucagón, independiente de su acción insulinotrópica, y, por lo tanto, produce una potente reducción de los niveles de ácidos grasos libres en plasma (AGL) sustancialmente más de lo que se puede conseguir con insulina. Se ha indicado que los niveles altos de AGL son un mecanismo tóxico importante durante la isquemia miocárdica.

Actualmente, los inventores han desarrollado el concepto de GLP-1 como terapia metabólica para la lesión por isquemia reperfusión. Este desarrollo se basó en la existencia de dos situaciones clínicas en las que la isquemia-reperfusión es un proceso rutinario, y potencialmente peligroso: los procedimientos trombolíticos para el IM agudo y la reperfusión cardiaca después de cardioplejia isquémica durante la cirugía cardiaca. Además, los datos recientes experimentales y clínicos han establecido que el fenómeno de isquemia - reperfusión responde particularmente a la terapia metabólica con infusión de GIK, incluso más que la isquemia aislada sin reperfusión (Apstein, CS (1988) Glucose-insulin-potassium for acute myocardial infarction. Remarkable results from a new prospective, randomized trial. Circulation 98, 2223 - 2226).

Los dos avances terapéuticos más importantes en el tratamiento de la isquemia aguda coincidente con IM en la pasa década han sido la introducción de trombólisis y el β - bloqueo. Sin embargo, a pesar de este éxito global, los estudios de trombólisis han revelado un exceso de mortalidad temprana que se ha atribuido a la lesión inducida por la reperfusión y el aturdimiento miocárdico. Los mecanismos que subyacen al aturdimiento son complejos, pero un consenso emergente es que probablemente estén relacionados con la acidosis intracelular que altera la función de las bombas de Ca2+ sarcolemales y la sobrecarga de Ca2+citosólico. El resultado neto es la alteración de la función contráctil miocárdica que conduce a un descenso de la eficacia mecánica, así como arritmias ventriculares por reperfusión. Además, investigaciones recientes han establecido que la acidosis intracelular, a su vez, se debe a un desequilibrio entre glucólisis y oxidación de glucosa completa, en el sentido de que la velocidad de la glucólisis no está acoplada a la oxidación del piruvato (el producto final de la glicólisis) en el ciclo de TCA. Esta falta de acoplamiento da como resultado la producción de H+ neto debido a la conversión de piruvato en lactato. La causa más probable de este desequilibrio es la presencia de niveles altos de ácidos grasos libres (AGL) en plasma, que preferentemente entran en la mitocondria e inhiben la oxidación del piruvato, un mecanismo que de manera esmerada es responsable de la observación bien establecida de que los corazones perfundidos con AGL son menos capaces de recuperarse en la fase de reperfusión que los corazones perfundidos con glucosa. Se ha descubierto, y es una de las bases de esta invención terapéutica que el GLP-1 suprime los AGL más allá de lo esperado con insulina, que está al nivel de 50% de supresión, y la supresión de AGL producida por GLP-1 puede hasta del 90%.

Estas consideraciones han fortalecido la convicción de los inventores para tratar la isquemia-reperfusión con péptidos de tipo glucagón. Se estableció bien que durante la perfusión normal y oxigenación adecuada, el corazón depende del metabolismo aerobio y usa los AGL como su combustible preferido. En contraste, durante la isquemia (flujo sanguíneo reducido) o hipoxia (tensión de O2 reducida), la β-oxidación de los ácidos grasos se altera debido a que son aerobios estrictos) y la provisión continuada de ATP depende de manera creciente de la glucólisis anaerobia. Durante el período isquémico, la glucosa - insulina es beneficiosa debido a que potencia la captación de glucosa y estimula la glucólisis, de modo que proporciona ATP para el mantenimiento de funciones de membrana esenciales, especialmente transporte de iones. Además, la glucosa - insulina suprime la lipólisis en el tejido adiposo, tantote modo que se reducen los niveles de AGL y la captación de los AGL en el miocardio. Los altos niveles de AGL son tóxicos para el miocardio isquémico, tanto mediante efectos detergentes directos sobre la membrana e incrementos en APMc, y mediante la acumulación de acilcamitina, que inhibe las bombas de Ca2+. El efecto neto es la alteración del intercambio iónico, sobrecarga de Ca2+ citosólico, y alteración de la función y arritmias contráctiles resultantes.

Durante el periodo de reperfusión, la glucosa-insulina es beneficiosa debido a que, como se ha explicado anteriormente, esta terapia puede aliviar el desequilibrio metabólico que produce aturdimiento. Esto se logra mediante la estimulación directa de PHD y, por lo tanto, oxidación de piruvato, e indirectamente mediante captación reducida de AGL y, por lo tanto, relación mejorada entre piruvato y oxidación de AGL.

A partir de la descripción anterior es evidente la acción doble de captación y metabolismo de glucosa potenciada por la glucosa - insulina, y niveles reducidos de AGL tiene un potencial terapéutico sustancial en la reperfusión. Algunos autores han expresado la preocupación de que durante la isquemia profunda, esencialmente de flujo cero, se acumulen productos finales de la glicólsis, es decir lactato, debido a un ” lavado” inadecuado. La acumulación de lactato, a su vez, conduce a altas concentraciones intracelulares de protones y el fracaso de la reoxidación de NADH; niveles altos de [H+] y de las relaciones NADH/NAD+ inhiben la glicólisis productiva. En estas circunstancias, la glucosa puede ser tóxica para la células, debido a que el ATP se consume realmente en la producción de fructosa-1,6-bisfosfato, y las [H+] altas puede agravar la necrosis de los miocitos (Neely, JR, y Morgan, HE (1974) Relationship betwenn carbohydrate and lipid metabolism and the energy balance of heart muscle. Ann. Rev. Physiol. 36, 413-459). Sin embargo, estas ideas no se han confirmado con datos experimentales y clínicos, lo que indica que la glucosa - insulina produce resultados beneficiosos.

Sin querer estar sujeto a teoría alguna, la explicación probable para esto es que en los seres humanos, la isquemia espontánea aguda no es una condición de isquemia de flujo cero, sino que representa una región de isquemia de bajo flujo en la que la perfusión residual es adecuada para la distribución de sustrato y lavado de lactato. Esta idea ha proporcionado una potente lógica fisiológica para el uso de la terapia metabólica en isquemia-reperfusión.

La cirugía cardiaca moderna, si implica reemplazo de válvula cardiaca o injerto de derivación de arteria coronaria (CABG), normalmente requiere la detención cardiopléjica hipodérmica, pinzamiento de aorta, y derivación cardiopulmonar durante la cirugía. Por lo tanto, de manera eficaz, la cirugía cardiaca rutinaria induce un estado de isquemia global electiva después de reperfusión, que expone potencialmente el corazón a todos los riesgos acompañantes y lesiones peculiares a isquemia - reperfusión miocárdica. Por lo tanto, la prevención de la lesión miocárdica durante y después de operaciones cardiacas es un asunto importante. La isquemia cardiopléjica electiva que sigue a la reperfusión tiene paralelismos obvios con la isquemia - reperfusión encontrada durante IM agudo después de revascularización, y así pues muchos de los principios patofisiológicos considerados en las secciones previas también se aplican durante la cirugía cardiaca. Sin embargo, existen diferencias notables entre la isquemia - reperfusión cardiopléjica quirúrgica y la isquemia - reperfusión asociada con IM. Durante la cirugía, el corazón se detiene (cardioplejia) y se infunde con una solución fría (hipodérmica) diseñada para optimizar la preservación del miocardio. Después de la finalización de la cirugía, el corazón se reactiva y se reperfunde con sangre oxigenada a temperatura corporal. Esto produce una secuencia de isquemia hipodérmica y reperfusión normotérmica, que puede prevenir la acumulación de altos niveles en tejidos de H+ y lactato. Además, a diferencia de IM agudo, la cardioplejia hipodérmica representa un estado de isquemia global, de flujo cero, seguido de reperfusión global.

En la solicitud previa de los inventores (nº de serie 60/103.498), de la que ésta es una continuación en parte, los autores han revisado las desventajas de infusiones de glucosa - insulina y las desventajas de sustitución de éstas con infusión de GLP-1, que es más segura que la insulina. En resumen, las infusiones de GIK llevan riesgos significativos de tanto hipoglucemia como hiperglucemia, y son técnicamente exigentes y atención intensiva. Los peligros de hipoglucemia son obvios.

En contraste, estos riesgos no existen con una infusión de GLP-1. La amida de péptido de tipo glucagón (7 - 36) (GLP-1) es un péptido insulinotrópico, natural, derivado del intestino que constituye un componente principal del llamado efecto incretina. El GLP-1 ejerce su efecto principal en las células endocrinas pancreáticas, donde (1) regula la expresión y secreción de insulina por las células β de una manera dependiente de glucosa; (2) estimula la secreción de somatostatina; y (3) suprime la secreción de glucagón por las células α. Aunque no resuelto formalmente, el fuerte efecto glucagonestático se presume que se produce de uno o todos de los siguiente: (1) supresión directa mediante estimulación de receptores de GLP-1 sobre una célula, aunque esto es improbable; (2) supresión paracrina de la secreción de glucagón por liberación dentro de los islotes de somatostatina; o (3) supresión paracrina por liberación dentro de los islotes de insulina. Cualquier que sea el mecanismo celular, el GLP-1 es único en su capacidad de estimular simultáneamente la secreción de insulina e inhibir la liberación de glucagón. Aunque una infusión de insulina terapéutica también inhibe la liberación de glucagón, este efecto no es tan potente como el del GLP-1, que ejerce una inhibición, directa, paracrina dentro de los islotes de secreción de glucagón.

La capacidad doble de GLP-1 para estimular enérgicamente la liberación de insulina e inhibir la secreción de glucagón, junto con la dependencia estricta de glucosa de su acción insulinotrópica, dotan a esta molécula de un potencial terapéutico único en la dirección de isquemia - reperfusión. En primer lugar, el GLP-1 estimula de manera firme la secreción de insulina endógena y por lo tanto se puede usar para lograr todas las acciones beneficiosas atribuidas a una infusión de insulina en el tratamiento metabólico de isquemia reperfusión. Aunque las infusiones de altas dosis de GIK típicamente contienen 25 - 33% de glucosa y 50 - 100 U de insulina/l, el requerimiento para la introducción de hiperglucemia per se para lograr eficacia terapéutica, frente a solamente proporcionando un medio metabólico para la administración segura de altas dosis de insulina, no está clara. Es probable que se requieran niveles adecuados de glucosa en sangre para permitir la distribución de sustratos, pero no necesariamente implica una necesidad de hiperglucemia y no se debe menospreciar por el hecho de que la insulina ejerza efectos importantes distintos de la captación de glucosa.

La glucosa no se requiere como medida de seguridad, ya que niveles en sangre ≤ 3,5 mM invalidan la actividad de GLP-1 estimulante de la insulina, por lo tanto protegiendo contra los peligros de la hipoglucemia.

En segundo lugar, el GLP-1 ejerce un potente efecto glucagonestático, que junto a su acción insulinotrópica conducirá a una fuerte supresión de los AGL. Uno de los beneficios principales de las infusiones de glucosa-insulina es la reducción de los niveles de AGL circulantes y la supresión de la captación de AGL. Los AGL y sus metabolitos tienen efectos tóxicos directos sobre el miocardio isquémico así como durante el periodo de reperfusión, cuando contribuyen al aturdimiento, y por lo tanto la reducción de los niveles de AGL es un objetivo terapéutico principal de intervención metabólica en isquemia-reperfusión, objetivo de intervención metabólica en isquemia - reperfusión. Ya que el glucagón es un potente estímulo de lipólisis de tejido adiposo y producción de AGL, la supresión de glucagón mediada por GLP-1 además aumenta la reducción inducida por insulina en los AGL circulantes. Así pues, la terapia por GLP-1 es superior a la infusión de glucosa - insulina a este respecto. De hecho, los datos preliminares con voluntarios sanos indican que una infusión intravenosa de GLP-1 reducirá los niveles de AGL en plasma en ayunas hasta < 10% de los valores control.

El GLP-1 debe ser eficaz en al mayoría de los pacientes sin requerir administración simultánea de glucosa.

Además, puede ser necesario administrar potasio para corregir las desviaciones de exceso de potasio en el compartimento celular.

Además del GLP-1 o de sus análogos biológicos, la terapia puede incluir el uso de secuestrantes de radicales libres tales como glutatión, melatonina, vitamina E, y superóxido dismutasa (SOD). En tales combinaciones el riesgo de daño por reperfusión se reduce incluso más.

El término “GLP-1”, o péptido de tipo glucagón, incluye miméticos, y, como se usa en el contexto de la presente invención, puede comprender péptidos de tipo glucagón y péptidos relacionados y análogos de péptido - 1 de tipo glucagón que se unen a una proteína receptora de péptido de tipo glucagón (GLP-1) tal como la proteína receptora de amida de GLP-1 (7 - 36) y tiene un efecto biológico correspondiente sobre la secreción de insulina como amida de GLP-1 (7 - 36), que es una forma nativa, biológicamente activa de GLP-1, véase Goke, B y Byrne, M, Diabetic Medicine, 1996, 13: 854 - 860. Los receptores de GLP-1 son proteínas de la superficie celular encontradas, por ejemplo, en las células β pancreáticas productoras de insulina. Los péptidos de tipo glucagón y análogos incluirán especies que tienen actividad insulinotrópica y que son agonistas, es decir, activan, de la molécula receptora de GLP-1 y su actividad de segundo mensajero sobre, entre otras, las células β pancreáticas productoras de insulina. Se han descrito agonistas de péptido de tipo glucagón que muestran actividad a través de este receptor: documento EP 0708179A2; Hjorth, S. A. y col., J. Biol. Chem. 269 (4B): 30121 - 30124 (1994); Siegel, E. G. y col., Amer. Diabetes Assoc. edición 57ª Scientific Sessions, Boston (1997); Hareter,

A. y col., Amer. Diabetes Assoc. edición 57ª Scientific Sessions, Boston (1997); Adelhorst, K. y col., J. Biol. Chem. 269 (9): 6275 - 6278 (1994); Deacon C. F. y col., 16ª Internacional Diabetes Federation Congress Abstracts, Diabetologia Supplement (1997); Irwin, D. M. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 7915 - 7920 (1997); Mosjov, S., Int. J. Peptide Protein Res. 40: 333 - 343 (1992). Las moléculas de tipo glucagón incluyen polinucleótidos que expresan agonistas de GLP-1, es decir, activadores de la molécula receptora de GLP-1 y de su actividad de segundo mensajero que se encuentra, entre otras, en las células β pancreáticas productoras de insulina. Los miméticos de GLP-1 que son también agonistas incluyen, por ejemplo, compuestos químicos diseñados específicamente para activar el receptor de GLP-1. También se conocen antagonistas de péptido 1 de tipo glucagón, véase, por ejemplo, Watanabe, Y y col., J. Endocrinol. 140 (1): 45 - 52 (1994), e incluyen exendin (9 - 39) amina, un análogo de la exendina, que es un potente antagonista de los receptores de GLP-1 (véase, por ejemplo, el documento WO 97/46584). En recientes publicaciones se divulgan el GLP-1 Black Widow y el GLP-1 Ser2, véase G. G. Holz, J. F. Hakner/Comparative Biochemistry and Physiology, parte B 121 (1998) 177 - 184 y Ritzel, y col., A synthetic glucagón - like peptide-1 analog with improved plasma stability, J. Endocrinol octubre de 1998 159 (1): 93 - 102.

Realizaciones adicionales incluyen polipéptidos de tipo glucagón sintetizados químicamente, así como cualquier polipéptido o fragmentos de los mismos que son sustancialmente homólogos. “Sustancialmente homólogo”, que puede hacer referencia a secuencias tanto de ácidos nucleicos como de aminoácidos, significa que una secuencia objeto concreta, por ejemplo, una secuencia mutante, varía con respecto a una secuencia de referencia en una o más sustituciones, deleciones o adiciones, cuyo efecto neto no da como resultado una diferencia funcional adversa entre las secuencia de referencia y objeto. Para los fines de la presente invención, en las secuencias que tienen más de un 50% de homología, y preferentemente más de 90% de homología, la actividad biológica equivalente en lo que respecta a la potenciación de las respuestas de las células β a los niveles de glucosa en plasma y las características de expresión equivalente se consideran sustancialmente homólogas. Para los fines de determinación de la homología, se debe descartar el truncamiento de la secuencia madura. Las secuencias que tienen menores grados de homología, una bioactividad comparable y características de expresión equivalentes se consideran equivalentes.

Los péptidos de GLP y glucagón de mamíferos están codificados por el mismo gen. En el íleo el fenotipo se procesa en dos clases principales de hormonas de péptidos de GLP, denominadas GLP-1 y GLP - 2. Se conocen cuatro péptidos relacionados con el GLP-1 que se procesan a partir de los péptidos fenotípicos. El GLP-1 (1 - 37) tiene la secuencia His Asp Glu Phe Glu Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly (SEC ID Nº: 1). El GLP-1 (1 - 37) se amida mediante procesamiento postraduccional para producir GLP-1 (1 - 36) NH2 que tiene la secuencia His Asp Glu Phe Glu Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg (NH2) (SEC ID Nº: 2); o se procesa enzimáticamente para producir GLP-1 (7 - 37) que tiene la secuencia His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly (SEC ID Nº: 3). El GLP-1 (7 - 37) también se puede amidar para producir amida de GLP-1 (7 - 36) que es la forma natural de la molécula de GLP-1, y que tiene la secuencia His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg (NH2) (SEC ID Nº: 4) y en la misma forma natural de la molécula de GLP-1.

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Las células L intestinales secretan GLP-1 (7 - 37) (SEC ID Nº: 3) y GLP-1 (7 - 36) NH2 (SEC ID Nº: 4) y una relación de 1 a 5, respectivamente. Estas formas truncadas de GLP-1 tienen cortas semividas in situ, es decir menor de 10 minutos, y se inactivan mediante una aminodipeptidasa IV para producir Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly (SEC ID Nº: 5); y Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg (NH2) (SECID Nº: 6), respectivamente. Los péptidos Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly (SEC ID Nº: 5) y Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg (NH2) (SEC ID Nº: 6), se ha especulado que afectan a la producción de glucosa hepática, pero no estimulan la producción o liberación de insulina por el páncreas.

En los venenos de monstruo de Gila existen seis péptidos que son homólogos al GLP-1. Sus secuencias se comparan a las secuencias del GLP-1 en la tabla 1.

TABLA 1

a.: H A E G T F T S D V S S Y L E G Q A A K E F I A W L V K G R NH2

b.: H S D G T F T S D L S K Q M E E E A V R L F I E W L K N G G P S S G A P P P S N H2

c.: D L S K Q M E E E A V R L F I E W L K N G G P S S G A P P P S NH2

d.: H G E G T F T S D L S K Q M E E E A V R L F I E W L K N G G P S S G A P P P S NH2

e.: H S D A T F T A E Y S K L L A K L A L Q K Y L E S I L G S S T S P R P P S S

f.: H S D A T F T A E Y S K L L A K L A L Q K Y L E S I L G S S T S P R P P S

g.: H S D A 1FT E E Y S K L L A K L A L Q K Y LAS 1 L G S R T S P P P NH2

h.: H S D A 1FT Q Q Y S K L L A K L A L Q K Y LAS I L G S R T S P P P NH2

a= GLP-1(SEC ID Nº 4). b= Exendina 3(SEC ID Nº 7). c= Exendina 4 (9-39(NH2(SEC ID Nº 8). d= Exendina 4(SEC ID Nº 9). e= Helospectina I (SEC ID Nº10). f= Helospectina II (SEC ID Nº 11). g= Helodermina (SEC IDN º12). h= Q8, Q9 Helodermina (SEC ID Nº 13)

Las homologías principales tal como se indica en las áreas resumids en la tabla 1 son: los péptidos c y h derivan de b y g, respectivamente. Los 6 péptidos de origen natural (a, b, d, e, f y g) son homólogos en las posiciones 1, 7, 11 y 18. El GLP1 y las exendinas 3 y 4 (a, b y d) son además homólogos en las posiciones 4, 5, 6, 8, 9, 15, 22, 23, 25, 26 y 29. En la posición 2, A, S y G son estructuralmente similares. En la posición 3, los residuos D y E (Asp y Glu) son estructuralmente similares. En las posiciones 22 y 23 F (Phe) e I (Ile) son estructuralmente similares a Y (Tyr) y L (Leu), respectivamente. Del mismo modo, en la posición 26 L e I son estructuralmente equivalentes.

Así pues, de los 30 residuos de GLP-1, las exendinas 3 y 4 son idénticas en 15 posiciones y equivalentes en 5 posiciones adicionales. Las únicas posiciones en las que son evidentes los cambios estructurales radicales son en los residuos 16, 17, 19, 21, 24, 27, 28 y 30. Las exendinas también tienen 9 residuos extra en el extremo carboxilo.

Los péptidos de tipo GLP-1 se pueden preparar mediante síntesis química de péptidos en fase sólida. El GLP-1 también se puede preparar mediante técnicas recombinantes convencionales usando procedimientos habituales descritos, en por ejemplo, Sambrook y Maniatis. “Recombinante”, como se usa en el presente documento, significa que una proteína deriva se sistemas de expresión recombinantes (por ejemplo, microbianos o de mamíferos) que se pueden modificar genéticamente para que contengan un gen de expresión para el GLP-1 o sus análogos biológicamente activos.

Los péptidos de tipo GLP-1 se pueden recuperar y purificar a partir de cultivos celulares recombinantes mediante procedimientos que incluyen, entre otros, precipitación por sulfato amónico o etanol, extracción ácida, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía sobre fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía sobre hidroxilapatita y cromatografía sobre lectina. La cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) se puede emplear para etapas de purificación final.

Los polipéptidos de la presente invención pueden ser un producto purificado naturalmente, o un producto de procedimientos de síntesis química, o se pueden producir mediante técnicas recombinantes a partir de huéspedes procariotas o eucariotas (por ejemplo, mediante células de bacterias, de levaduras, de plantas superiores, de insectos y de mamíferos en cultivo o in vivo). Dependiendo del huésped empleado en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos de la presente invención están generalmente no glicosilados, pero pueden estar glicosilados.

La actividad del GLP-1 se puede determinar mediante procedimientos habituales, en general mediante procedimientos de selección de actividad unida a receptores que implican proporcionar células apropiadas que expresan el receptor de GLP1 sobre su superficie, por ejemplo, líneas celulares de insulinoma tales como células RINmSF o o células INS 1. Véase también Mosjov, S. (1992) y el documento EP708170A2. Además para medir la unión específica del trazador a la membrana usando procedimientos de radioinmunoensayos, también se puede usar actividad de AMPc o producción de insulina dependiente de glucosa. En un procedimiento, un polinucleótido que codifica el receptor de la presente invención se emplea para transfeccionar células, que por lo tanto, expresan la proteína receptora del GLP-1. Así pues, por ejemplo, estos procedimientos se pueden emplear para seleccionar un agonista del receptor poniendo en contacto tales células con los compuestos que se van a someter a selección y determinar si tales compuestos generan una señal, es decir activan el receptor.

Los anticuerpos policlonales y monoclonales se pueden utilizar para detectar, purificar e identificar los péptidos de tipo GLP-1 para uso en los procedimientos descritos en esta memoria descriptiva. Los anticuerpos tales como ABGA1178 detectan GLP-1 intacto no ayustado (1 - 37) o GLP-1 N - terminalmente truncado (7 - 37) o (7 - 38) amida. Otros anticuerpos se detectan en el mismo extremo del terminal C de la molécula precursora, un procedimiento que permite mediante sustracción calcular la cantidad de péptido truncado biológicamente activo, es decir, GLP-1 (7 - 37) o (7 - 36) amida (Orskov y col., Diabetes, 1993, 42: 658 - 661; Orskov y col., J. Clin. Invest. 1991, 87: 415 - 423).

Otras técnicas de selección incluyen el uso de células que expresan el receptor del GLP-1, por ejemplo, células CHO transfectadas, en un sistema que mide el pH extracelular o cambios iónicos producidos por activación receptora. Por ejemplo, se pueden poner en contacto agonistas potenciales con una célula que expresa el receptor proteico del GLP-1 y una segunda respuesta mensajera, por ejemplo, traducción de señal o los cambios iónicos o de pH, se pueden medir para determinar si es o no eficaz el agonista potencial.

Las proteínas de unión a los receptores del péptido-1 de tipo glucagón de la presente invención se pueden usar en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido, y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Tal vehículo incluye, pero no se limita a, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol, lactosa, fosfato, manitol, arginina, trehalosa, y las combinaciones de los mismos. Las formulaciones deben seguir la forma de administración y las determinan fácilmente los expertos en la técnica. El péptido de tipo GLP-1 también se puede usar en combinación con agentes conocidos en la técnica que potencian la semivida in vivo del péptido con el fin de potenciar o prolongar la actividad biológica del péptido. Por ejemplo, una molécula o resto químico se puede unir covalentemente a la composición de la presente invención antes de la administración de la misma. Como alternativa, el agente potenciador se puede administrar simultáneamente con la composición. Todavía además, el agente puede comprender una molécula que se sabe que inhibe la degradación enzimática de los péptidos de tipo GLP-1 se puede administrar simultáneamente con o después de la administración de la composición de péptido de GLP-1. Tal molécula se puede administrar, por ejemplo, por vía oral o mediante inyección.

Los pacientes a los que se les administra GLP-1 o sus análogos en combinación con los sistemas vehículo aquí enumerados, especialmente aquellos tratados antes de un proceso planeado o dentro de las primeras 4 horas después de un proceso isquémico, se observa que tienen menos arritmias, menos daño tisular y menos malestar sin efectos secundarios.

A partir de estas consideraciones es evidente que cabe esperar que una infusión de GLP-1 ejerza un efecto terapéutico principal en reperfusión miocárdica. Se espera que el GLP-1 se pueda administrar mediante administración I. V. o subcutánea para infusión continua mediante inyección intravenosa (I. V.) 0,1 pmol/kg/min a 10 pmol/kg/min y subcutánea

(S. C.) 0,1 pmol/kg/min a 75 pmol/kg/min, e inyección única (bolo) mediante I. V. 0,005 nmol/kg a 20 nmoles/kg y S. C. 0,1 nmol/kg a 100 nmol/kg son niveles adecuados de administración. La infusión de GLP-1 se puede coadministrar con glucosa (5%) si se requiere mantener los niveles de glucosa en sangre ≥ 5 mM (para mantener una secreción insulina eficaz). De manera similar, también se considerará la co - administración de potasio (K+), dependiendo del grado al que la 5 activación de la N+/K+ ATPasa de membrana conduce a un desplazamiento de K+ en el espacio intracelular. El tratamiento con GLP-1 comenzará tan pronto en el período post - isquémico como sea posible después de, por ejemplo, la isquemia espontánea aguda en el contexto doméstico o ambulancia y antes de las terapias de reperfusión, y se continúan después. En el caso de cirugía cardiaca, la infusión de GLP-1 debe comenzar 12 - 24 horas antes de la cirugía, durante la cirugía desde el comienzo de la anestesia hasta el pinzamiento de aorta, e inmediatamente después de pinzamiento durante un

10 período de al menos 72 horas después de la operación. Como se ha explicación antes, la co - administración de un depurador de radica libre ayudará adicionalmente a la recuperación de reperfusión.

A partir de lo anterior se puede observar que la invención logra todos sus objetivos establecidos.

Claims

REIVINDICACIONES

1.- Uso de una composición que incluye GLP-1, o un análogo biológicamente activo del mismo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable, para la fabricación de un medicamento para tratar individuos que necesiten una mejora de lesión del tejido orgánico producida por reperfusión de flujo sanguíneo después de un período de isquemia, dicho tratamiento no incluye la coadministración de glucosa.
2.- Uso de una composición de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el vehículo farmacéutico se selecciona entre el grupo que consiste en solución salina, solución salina tamponada, agua, glicerol, etanol, lactosa, fosfato, manitol, arginina, trehalosa, y las combinaciones de los mismos.
3.- Uso de una composición de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que la composición es para administrar a un nivel de dosis de GLP-1 de 0,1 pmol/kg/min a 10 pmol/min.
4.- Uso de una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que se ha de efectuar la administración simultánea de un secuestrante de radicales libres.
5.- Uso de una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la administración comenzará en un plazo de 4 horas desde un acontecimiento isquémico.
6.- Uso de una composición de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la administración se va a realizar en un plazo de 4 horas desde un acontecimiento y continúa después.
7.- Uso de una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la administración se va a efectuar por vía intravenosa.
8.- Uso de una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la administración se efectúa mediante inyección subcutánea o por micropresión, insuflación pulmonar profunda, bomba externa o implantada, inyección por liberación prolongada, y otros mecanismos de liberación sostenida, distribución oral y parche, y mecanismos de membrana, intradérmicos y bucales.
9.- Uso de una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el tejido orgánico es el miocardio.
10.- Uso de una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la necesidad de mejora de daño de tejidos por intervención metabólica surge de un procedimiento médico que es una intervención quirúrgica seleccionado entre el grupo constituido por procedimientos quirúrgicos cardiacos, transplantes de órganos, amputación traumática de miembros e injerto.
11.- Uso de una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el procedimiento médico implica un acontecimiento de reperfusión isquémica, siendo dicho acontecimiento simultáneo a infarto de intestino e infarto de miocardio.