DE102020103987A1 - Agens zur Behandlung und Prophylaxe einer postischämischen Gewebeschädigung - Google Patents

Agens zur Behandlung und Prophylaxe einer postischämischen Gewebeschädigung Download PDF

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Peter Rosenberger
Bernhard Nieswandt
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EBERHARD KARLS UNIVERSITAET TUEBINGEN, MEDIZIN, DE
Julius-Maximilians-Universitaet Wuerzburg De
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Eberhard Karls Universitaet Tuebingen
Julius Maximilians Universitaet Wuerzburg
Universitaetsklinikum Tuebingen
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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Agens zur Verwendung bei der Behandlung und/oder Prophylaxe einer postischämischen Gewebeschädigung, eine pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend dieses Agens, ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe einer postischämischen Gewebeschädigung, sowie ein Verfahren zur Behandlung und/oder Prophylaxe einer postischämischen Gewebeschädigung.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Agens zur Verwendung bei der Behandlung und/oder Prophylaxe einer postischämischen Gewebeschädigung, eine pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend dieses Agens, ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe einer postischämischen Gewebeschädigung, sowie ein Verfahren zur Behandlung und/oder Prophylaxe einer postischämischen Gewebeschädigung.
  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung betrifft das Gebiet der molekularen Medizin, insbesondere den Bereich der Prophylaxe und Therapie der postischämischen Gewebeschädigung.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Der Myokardinfarkt (MI) ist nach wie vor eine der bedeutendsten Gesundheitsprobleme weltweit. Bei der Behandlung des MI ist die frühe Reperfusion des Myokards die derzeit wirksamste Therapie zur Verbesserung des klinischen Ergebnisses. Die Reperfusion des zuvor ischämischen Myokards kann jedoch auch die Schädigung des Gewebes induzieren. Dieses als „Reperfusionsschaden“ (englisch: reperfusion injury, RI) bezeichnete Phänomen reduziert die positiven Effekte der frühen Reperfusion und ist durch die Infiltration von Immunzellen, hauptsächlich Neutrophilen, in zuvor ischämische Bereiche gekennzeichnet, wo diese durch Gewebeentzündung zu einer Schädigung beitragen. Thrombozyten werden zunehmend als zentrale Orchestratoren von Entzündungsprozessen erkannt, hauptsächlich durch die Verstärkung der Immunzellrekrutierung und die Modulation der endothelialen Barrierenfunktion. Dieses Phänomen wird Thrombo-Inflammation bezeichnet. Im Verlauf des myokardialen IR verschlimmert die Bildung von Komplexen aus Thrombozyten und Neutrophilen (englisch: platelet-neutrophil complexes; PNCs). Die entzündliche Gewebeschädigung und ist somit ein Marker für die Gewebeentzündung.
  • Klinisch kommt es bei einem Reperfusionsschaden zu einer allgemeinen Gewebsschädigung im betroffenen Körperabschnitt sowie zu einer Übersäuerung bzw. Azidose des Gesamtorganismus. Dies führt örtlich zu Überwärmung, Rötung und Schwellung des betroffenen Abschnitts, z.B. am Bein oder Arm bis hin zur Entwicklung eines Kompartmentsyndroms mit ausgedehnter Rhabdomyolyse. Generalisiert können die Symptome von leichter Beschleunigung der Spontanatmung bis hin zu Blutdruckabfall, Herzrhythmusstörungen infolge Hyperkaliämie, Gerinnungsstörungen, Nierenversagen oder gar Herz-Kreislaufstillstand reichen.
  • Der Entstehung eines Reperfusionsschadens kann derzeit nur wenig zufriedenstellend entgegengewirkt werden. So wird durch das Herunterkühlen des betroffenen Gewebes vor der Reperfusion die Aktivität der Enzyme verringert. Ferner wird durch den Anästhesisten während eines operativen Eingriffs unmittelbar durch Hyperventilation der metabolischen Azidose entgegengewirkt. In schwereren Fällen wird die Azidose zusätzlich mit Natriumbicarbonat gepuffert. Außerdem kommen gegebenenfalls kreislaufstützende Medikamente wie Katecholamine und Diuretika zur Anwendung. Eine zielgerichtete und spezifische Behandlung der postischämischen Gewebeschädigung und insbesondere des Reperfusionsschades ist derzeit jedoch nicht möglich.
  • Vor diesem Hintergrund liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, einen neuen Prophylaxe- bzw. Therapieansatz zu entwickeln, mit dem zielgerichtet der postischämischen Gewebeschädigung entgegengewirkt bzw. diese behandelt werden kann. Vorzugsweise soll ein pharmazeutisch wirksames Agens bereitgestellt werden, mit dem in die pathologischen Mechanismen der postischämischen Gewebeschädigung regulierend eingegriffen werden kann.
  • ZUSAMMENFASSENDE DARSTELLUNG DER ERFINDUNG
  • Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung eines Inhibitors von Semaphorin 7A (SEMA7A) zur Verwendung bei der Behandlung und/oder Prophylaxe einer postischämischen Gewebeschädigung gelöst.
  • Die Erfinder haben überraschenderweise festgestellt, dass die Inhibition von SEMA7A einer postischämischen Gewebeschädigung deutlich entgegenwirken, diese ggf. sogar verhindern kann. Diese Erkenntnis war überraschend, da SEMA7A bislang in einem anderen Zusammenhang beschrieben wurde.
  • Semaphorin 7A (SEMA7A für die menschliche Variante, oder Sema7a für die Mausvariante, hier synonym gebraucht), GPI-Membrananker (John Milton Hagen-Blutgruppe), auch bekannt als CD108 (Cluster of Differentiation 108), ist ein membrangebundenes Semaphorin, das über eine Glycosylphosphatidylinositol (GPI) Bindung mit Zelloberflächen assoziiert ist [Entrez: 8482 (Mensch); 20361 (Maus)]. SEMA7A ist auch als das John-Milton-Hagen (JMH) Blutgruppenantigen bekannt, ein 80-kD-Glykoprotein, das auf aktivierten Lymphozyten und Erythrozyten exprimiert wird. Es ist bekannt, dass SEMA7A einen Rezeptor für den Malaria-Parasiten Plasmodium falciparum darstellt.
  • SEMA7A wurde ursprünglich im Zusammenhang mit dem axonalen Wachstum als ein Botenprotein beschrieben, das an der Steuerung der Synapsenbildung für den neuronalen Schaltkreis beteiligt ist. Spätere Arbeiten haben gezeigt, dass es die Autoimmun-Enzephalitis durch T-Zell-abhängige Zytokinproduktion verstärkt und die Infiltration von Neutrophilen in Stellen mit Gewebehypoxie erhöhen kann. Eine Rolle für SEMA7A im kardiovaskulären System wurde kürzlich in der Atherogenese beschrieben. Außerdem wurde gezeigt, dass ein gestörter Blutfluss zu einer Induktion von SEMA7A auf dem vaskulären Endothel führt und dass dies eine erhöhte Expression von Leukozyten-Adhäsionsmolekülen auf der Endotheloberfläche zur Folge hat.
  • Die Rolle von SEMA7A bei der Thrombozytenfunktion ist bislang unbekannt.
  • In der WO 2008/024300 , WO 2009/133984 , WO 2013/052631 und der EP 3 220 447 wird die Inhibition von SEMA7A zur Behandlung der pulmonalen Fibrose vorgeschlagen.
  • Die Erfinder konnten in einem experimentellen System zeigen, dass lösliches SEMA7A im Plasma von Patienten mit akutem Myokardinfarkt erhöht ist und dass SEMA7A einen signifikanten Einfluss auf das Ausmaß einer postischämischen Gewebeschädigung bzw. eines Reperfusionsschadens hat. Sie konnten außerdem zeigen, dass SEMA7A die myokardiale Thrombo-Inflammation und Gewebeschädigung fördert, indem es die thrombotische Aktivität der Thrombozyten und die Bildung von PNCs durch einen GPIbabhängigen Mechanismus der Thrombozyten verstärkt. Umgekehrt, so konnten die Erfinder insbesondere feststellen, führt die Hemmung von SEMA7A zu einem verringerten Reperfusionsschaden.
  • Erfindungsgemäß wird unter „Inhibition“ jede Maßnahme verstanden, die zur einer Verminderung der Funktionalität von SEMA7A führt. Dies kann bspw. durch eine Reduzierung der Aktivität von SEMA7A, der Menge und/oder Konzentration von SEMA7A in der zellulären Membran, der Transkription oder Translation oder weiteren Maßnahmen erreicht werden, die in einer Abnahme der SEMA7A-Funktionalität resultieren.
  • Erfindungsgemäß wird unter einer „postischämischen Gewebeschädigung“ allgemein ein Krankheitsprozess verstanden, der nach einer Minderdurchblutung bzw. Ischämie eines zellulären Gewebes ausgelöst wird.
  • Das der Erfindung zugrundeliegende Problem wird hiermit vollkommen gelöst.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei der postischämischen Gewebeschädigung um einen Reperfusionsschaden.
  • Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass ein therapeutisches und/oder prophylaktisches Agens für eine besonders wichtige postischämische Gewebeschädigung bereitgestellt wird, für die bislang im Stand der Technik keine zufriedenstellenden spezifischen therapeutischen oder prophylaktischen Ansätze existieren.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei dem Reperfusionsschaden um einen myokardialen Reperfusionsschaden.
  • Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass einer der klinisch besonders relevanten Reperfusionsschäden wirksam therapiert bzw. diesem vorgebeugt werden kann.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist der Inhibitor derart ausgestaltet ist, dass er die Wechselwirkung von SEMA7A mit der Thrombozytenoberfläche modifiziert, und vorzugsweise die Wechselwirkung von SEMA7A mit GPIb modifiziert.
  • Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass die Erfindung unmittelbar in die molekularen Mechanismen eingreift, die nach Erkenntnissen der Erfinder bei der Entstehung postischämischen Gewebeschädigung, wie bspw. einem myokardialen Reperfusionsschaden, eine entscheidende Rolle spielen.
  • Erfindungsgemäß wird unter „GPIb“ das Glykoprotein Ib verstanden, bei dem es sich um ein Oberflächenprotein auf Thrombozyten ähnelt, das an der Blutgerinnung beteiligt ist.
  • Erfindungsgemäß kann „modifiziert“ in einer ersten Ausführungsform „inhibiert“ bedeuten. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann „modifiziert“ „aktiviert“ und/oder „stimuliert“ bedeuten.
  • In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung ist der Inhibitor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Antikörper, Antikörperfragment, löslicher SEMA7A-Rezeptor, Antisense-Nukleinsäure, siRNA, niedermolekulare Verbindung, und Kombinationen davon.
  • Die Maßnahme hat den Vorteil, dass solche Strukturen als Inhibitoren zum Einsatz kommen, die zur zielgerichteten Inhibition von SEMA7A besonders geeignet sind.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei dem α-SEMA7A-Antikörper um einen funktionsinhibierenden Antikörper.
  • Mit dieser Maßnahme kommt ein solcher Antikörper zum Einsatz, der selektiv und zielgerichtet SEMA7A in seiner Funktionalität inhibiert und somit unspezifische Effekte weitgehend oder vollständig vermieden werden können.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung, die den erfindungsgemäßen Inhibitor aufweist.
  • Die Merkmale, Vorteile, Weiterentwicklungen and Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Inhibitors gelten für die pharmazeutische Zusammensetzung gleichermaßen.
  • Pharmazeutisch akzeptable Träger sind dem Fachmann gut bekannt. Sie ermöglichen eine ordnungsgemäße Formulierung des Inhibitors und dienen dazu, die Selektivität, Wirksamkeit und/oder Sicherheit der Arzneimittelverabreichung zu verbessern. Pharmazeutisch akzeptable Träger umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Lösungsmittel, Füllstoffe, Bindemittel, Gleitmittel, Stabilisatoren, Tenside, Suspensionen, Verdickungsmittel, Emulgatoren, Konservierungsmittel, Liposomen, Micellen, Mikrosphären, Nanopartikel usw., die für die bestimmte Dosierungsform geeignet sind. Materialien, die als pharmazeutisch akzeptable Träger dienen können, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Monosaccharide und Oligosaccharide sowie Derivate davon; Malz, Gelatine; Talk; Hilfsstoffe wie: Kakaobutter und Zäpfchenwachse; Öle wie Erdnussöl, Baumwollsamenöl, Safloröl, Sesamöl, Olivenöl, Maisöl und Sojaöl; Glykole wie Propylenglykol; Ester wie Ethyloleat und Ethyllaurat; Agar; Puffersubstanzen wie Magnesiumhydroxid und Aluminiumhydroxid; Alginsäure; pyrogenfreies Wasser; isotonische Kochsalzlösung, Ringer-Lösung; Ethylalkohol- und Phosphatpufferlösungen. Darüber hinaus kann die Zusammensetzung andere nicht toxisch verträgliche Schmiermittel enthalten, beispielsweise Natriumlaurylsulfat und Magnesiumstearat, sowie Farbstoffe, Trennflüssigkeiten, Filmbildner, Süßstoffe, Geschmackszusätze und Geschmacksstoffe, Konservierungsmittel und Antioxidationsmittel.
  • Erfindungsgemäß kann die pharmazeutisch Zusammensetzung den SEMA7A-Inhibitor als einzigen Wirkstoff aufweisen, oder aber in Kombination mit weiteren Wirkstoffen zur Behandlung und/oder Prophylaxe einer postischämischen Gewebeschädigung vorliegen.
  • Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung des erfindungsgemäßen Inhibitors zur Behandlung und/oder Prophylaxe einer postischämischen Gewebeschädigung.
  • Die Merkmale, Vorteile, Weiterentwicklungen und Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Inhibitors gelten für die erfindungsgemäße Verwendung gleichermaßen.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe einer postischämischen Gewebeschädigung, das die Formulierung eines Inhibitors von SEMA7A in einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst.
  • Die Merkmale, Vorteile, Weiterentwicklungen und Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Inhibitors gelten für das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren gleichermaßen.
  • Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung und/oder Prophylaxe einer postischämischen Gewebeschädigung, das die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Inhibitors von SEMA7A in ein bedürftiges Säugetier, vorzugsweise einen Menschen, weiter vorzugsweise einen Myokardinfarktpatienten oder einen myokardinfarktgefährdeten Patienten, umfasst.
  • Die Merkmale, Vorteile, Weiterentwicklungen und Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Inhibitors gelten für das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren gleichermaßen.
  • In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird durch die Verabreichung des Inhibitors die Wechselwirkung von SEMA7A mit der Thrombozytenoberfläche modifiziert, und vorzugsweise wird durch die Verabreichung des Inhibitors die Wechselwirkung von SEMA7A mit GPIb modifiziert.
  • Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass die Erfindung unmittelbar in die molekularen Mechanismen eingreift, die nach Erkenntnissen der Erfinder bei der Entstehung postischämischen Gewebeschädigung, wie bspw. einem myokardialen Reperfusionsschaden, eine entscheidende Rolle spielen.
  • Erfindungsgemäß kann „modifiziert“ in einer ersten Ausführungsform „inhibiert“ bedeuten. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann „modifiziert“ „aktiviert“ und/oder „stimuliert“ bedeuten.
  • Weitere Vorteile und Merkmale ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen und den beigefügten Zeichnungen.
  • Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
  • Figurenliste
    • 1: Patienten mit akutem Myokardinfarkt zeigen eine erhöhte Aktivierung von PNCs und eine erhöhte Plasma-SEMA7A-Konzentration. Die Proben wurden von Patienten mit akutem Myokardinfarkt, Patienten, die sich herzchirurgischen Operationen unter Einsatz einer Herzlungenmaschine (HLM) oder Bypass-Operationen ohne Einsatz einer Herzlungenmaschine (Off-Pump) unterziehen, sowie von gesunden Kontrollen entnommen. a) Durchflusszytometrische Auswertung der Expression von GPIb (CD42b) der PNCs in den gezeigten Patientengruppen. b) Durchflusszytometrische Auswertung von PNCs zur CD62P-Expression auf Neutrophilen. c) PAC-1-Bindung an PNCs. d) Repräsentative durchflusszytometrische Histogramme der gemessenen Gruppen, und e) Sema7a im Plasma von Patienten mit akutem MI, Patienten, die sich kardiopulmonalen Operationen mit (HLM) oder kardiopulmonalen Bypass-Operationen ohne Herzlungenmaschinen (Off-Pump) unterziehen, und gesunden Kontrollen. Zum Vergleich führten die Erfinder Einweg-Varianzanalysen durch, gefolgt von Dunnett-Tests zur Gruppe Myokardinfarkt (Daten sind Mittelwerte ± SA; *p < 0,05, **p < 0,01 und ***p < 0,001 wie angegeben; n ≥ 4/Gruppe).
    • 2: Demographische und Standard-Laborwerte von Patienten mit Myokardinfarkt, Herzoperationen ohne kardiopulmonalen Bypass (Off-Pump), kardiopulmonalen Herzoperationen (HLM) und von gesunden Personen.
    • 3: Expression von SEMA7A (%) auf menschlichen Erythrozyten im Relation zum Alter in Jahren. Die Erythrozyten wurden in verschiedenen Altersgruppen analysiert, um den Grad der SEMA7A-Expression auf ihrer Oberfläche zu bestimmen. Der Vergleich von SEMA7A (%) auf menschlichen Erythrozyten mit den Jahren der Spender mittels ANOVA zeigte keine signifikanten Unterschiede in der Veränderung über das Alter, p = 0,1194.
    • 4: Plasmawerte von Sema7a in WT-Mäusen, die eine Myokardischämie und eine Reperfusion von 1 Minute aufweisen. WT-Mäuse wurden 60 Minuten lang einer Ischämie ausgesetzt. Die Proben wurden nach 1 Minute Reperfusion entnommen. Die Vergleiche in der 4 wurden durch Student's t-Tests analysiert (Daten sind Mittelwerte ± SA; n ≥ 3/Gruppe (*p < 0,05 wie angegeben).
    • 5: SEMA7A-Spaltung aus menschlichen Erythrozyten. Menschliche Erythrozyten wurden entweder Scherstress, Hypoxie (2%O2) oder Normoxie (21% O2) für die angegebenen Zeitpunkte ausgesetzt und die SEMA7A-Konzentrationen wurden im Überstand bestimmt. Für Vergleiche in der 5 führten die Erfinder Einweg-Varianzanalysen, gefolgt von Dunnett's Tests zur Gruppe „5min unstimulated“, durch (Daten sind Mittelwerte ± SA; n = 4/Gruppe; *p < 0,05, ***p < 0,01 wie angegeben).
    • 6 Die Injektion von Sema7a führt zu einer erhöhten myokardialen RI-Schädigung und PNC-Bildung. Mäusen wurden entweder rekombinantes Semaphorin 7a (rmSema7a) oder Fc-Kontrolle (rmlgG2A Fc) injiziert und dann für 1 h einer Ischämie gefolgt von 2 h Reperfusion unterzogen. Die Proben wurden nach 1 min oder 120 min Reperfusion entnommen. a) Repräsentative TTC-gefärbte Schnitte von Myokardgewebe mit Infarktbereich (blau/dunkel = retrograde Evans-Blau-Färbung; rot und weiß = AAR, weiß = Infarktgewebe; 120 min) mit b) systematische Auswertung der Infarktgrößen und der entsprechenden Troponin I-Plasmaspiegel (120 min). c) Repräsentative histologische Schnitte von WT-Tieren, denen entweder IgG Fc-Kontrolle oder rmSema7a injiziert wurden (120 min) und d) Anzahl der PNCs, die in myokardialen Gewebeschnitten der AAR bei Tieren gezählt wurden (120 min). e) Repräsentative durchflusszytometrische PNC-Plots im Blut von Scheintieren, rmSema7a- oder IgG Fc-Kontroll-Mäusen, die nach 1 min und 120 min Reperfusion GPIb (CD42b) und P-Selektin (CD62P) präsentierten. Systematische Auswertung der durchflusszytometrischen Expression der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) für f) GPIb (CD42b) und g) P-Selektin (CD62P) Expression. h) Systematische Auswertung der PNCs in % durchflusszytometrisch im Blut von Tieren, denen eine rmSema7a- oder Fc-Kontrolle injiziert wurde, nach 1 min und 120 min. i) Repräsentative durchflusszytometrische Diagramme von PNCs in der AAR, die das Vorhandensein von GPIb (CD42b) und P-Selektin (CD62P) nach 1 min und 120 min Reperfusion zeigen. Systematische Auswertung der durchflusszytometrischen Expression von MFI für j) GPIb (CD42b) und k) P-Selektin (CD62P) und I) systematische Auswertung von PNCs in % durchflusszytometrisch im AAR von Tieren, denen rmSema7a oder Fc-Kontrolle injiziert wurde, und zwar nach 1 min und 120 min. Die Vergleiche in 6 b und d wurden durch Student's t-Tests analysiert (Daten sind Mittelwert±SD; n≥5/Gruppe; Histologie n=9/Gruppe). Für 6 f, g, h, j, k und I verwendeten die Erfinder die Log-Transformation der Daten zur Übereinstimmung mit der Normalität. Für log-transformierte Daten wurden Tests mit den Log-Werten durchgeführt, und die Ergebnisse werden als geometrische Mittelwerte und ihre 95%-Konfidenzintervalle angezeigt (*p < 0.05, **p < 0.01 und ***p< 0.001 wie angegeben).
    • 7: SEMA7A induziert keine Caspase 3 in menschlichen Herzmuskelzellen (HMCs). a) HMCs wurden für die angegebenen Zeiten an rekombinantem menschlichen SEMA7A (rhSEMA7A), einer geeigneten Fc-Kontrolle (rhlgG1 Fc), nur BSA oder Staurosporin exponiert und die Expression der Caspase 3 wurde mittels ELISA gemessen. b) HMCs wurden für 6 h an SEMA7A, der Fc-Kontrolle oder BSA exponiert und auf Caspase 3 angefärbt. Die Behandlung mit Staurosporin diente als Positivekontrolle. Die Daten sind Mittelwerte ± SA; n ≥ 4 /Gruppe, Histologie n = 3.
    • 8: Die Injektion von Sema7a führt zu einer verstärkten αllbβ3-Aktivierung von PNCs. Den Tieren wurden entweder rekombinantes Semaphorin 7a (rmSema7a) oder Fc-Kontrolle (rmlgG2A Fc) injiziert und diese dann für 1 h einer Ischämie gefolgt von 2 h Reperfusion unterzogen. Blut und myokardiale Gewebeschnitte (AAR) wurden nach 1 min oder 120 min Reperfusion entnommen. Repräsentative durchflusszytometrische PNC-Plots im Blut und Gewebe von Schein-, rmSema7a- oder IgG Fc-Kontrollinjektionen von Mäusen, die eine αllbβ3 (JON/A)-Aktivierung zeigten. Systematische Auswertung der durchflusszytometrischen mittleren Fluoreszenzintensitäten (MFI) von αllbβ3 (JON/A) an PNCs von rmSema7a-injizierten, IgG Fc-Kontroll- oder Scheinmäusen. Für die 8 verwendeten die Erfinder die Log-Transformation der Daten zur Anpassung an die Normalität. Für log-transformierte Daten wurden Tests an den Log-Werten durchgeführt, und die Ergebnisse werden als geometrische Mittelwerte und deren 95%-Vertrauensintervalle dargestellt. (**p < 0,01 und ***p < 0,001 wie unter n ≥ 5 angegeben).
    • 9: SEMA7A beeinflusst die Migration von Neutrophilen im Fluss. Vollblutneutrophile, die mit rhSEMA7A behandelt und mit Rhodamin markiert wurden, haften an Glaskapillaren, beschichtet mit E-Selektin oder E-Selektin mit ICAM1. a) Repräsentativer Rahmen von neutrophilen (magentafarbenen) Spuren (Cyan) auf beschichteten Kapillaren mit Durchflusskammerexperimenten, die mit ganzen Proben von 4 unabhängigen gesunden Spendern durchgeführt wurden, und in jeder Versuchsgruppe wurden zumindest 150 Zellen verfolgt. b) Neutrophilen-Geschwindigkeit (µm / sec) auf beschichteten Kapillaren unter dem Einfluss von rhSEMA7A. c) Neutrophile (Magenta) und Thrombozyten (Cyan), die im Fluss auf Kremastergewebe vor und 15min nach i.v.-Impfung von rmSema7a abgebildet wurden, d) Aus gewonnenen Videos zur Intra-Vital-Mikroskopie wurde die Neutrophilen-Geschwindigkeit (µm / sec) aus den verfolgten Zellen berechnet; die stationären Neutrophilen wurden gezählt (Zellzahl / mm2); die Thrombozytensedimentation an der Gefäßwand wurde gemessen (normalisierter MFI % / mm); die durchwanderten Zellen aus dem Gefäßsystem nach 15min Exposition mit rmSema7a wurden gezählt (Zellzahl / mm2); der Abstand der durchwanderten Zellen wird in µm gemessen. e) Repräsentative Optosplit-Bildanalyse von Thrombozyten (Cyan) und Neutrophilen (Magenta), die sich auf der Mikrovaskulatur des Maus-Kremasters (≤40 µm) bewegen, mit Hinweisen, wie die Daten von jedem 10-Sekunden-Bild-Slot erfasst werden; das weiße Kreuz stellt stationäre Zellen dar; weiße Linien verbinden (µm) durchwanderte Neutrophile mit den Austrittspunkten aus dem Gefäßsystem; rote Linien beschreiben das Intensitätsprofil der Anheftung der Thrombozyten an das Gefäßsystem als mittlere Fluoreszenzintensität (MFI); grüne Kreise verfolgen die sich bewegenden Neutrophilen über eine definierte Region, die in die Geschwindigkeit der Zellbahn (µm / Sek.) übersetzt wird. Intravitalmikroskopie-Experimente wurden an n ≥ 4 Mäusen mit n ≥ 10 Videos pro Bedingung mit 20 Sekunden Intervall von rmSema7a-Gruppen durchgeführt, die 15 Minuten nach der Basislinienkontrolle aufgenommen wurden. Die Daten werden als geometrischer Mittelwert mit Cl dargestellt, wobei die P-Werte mit *<0,05, **<0,01, ***<0,001 bezeichnet werden; Intravitalmikroskopie-Experimente wurden an n = 5 Mäusen mit Videos von 10 Sekunden (n ≥ 10 Videos pro Bedingung mit 20 Sekunden Intervall) von rmSema7a-Gruppen durchgeführt, die 15 Minuten nach der Basislinienkontrolle aufgenommen wurden. Die Daten werden als geometrischer Mittelwert mit Cl mit P-Werten, die mit *<0,05, **<0,01, ***<0,001 bezeichnet wurden, dargestellt.
    • 10: Sema7a-/- Tiere zeigen reduzierte Anzeichen einer myokardialen RI-Schädigung und eine abgeschwächte PNC-Bildung. a) Sema7a-/- Tiere und Wurfgeschwisterkontrollen wurden mittels Magnetresonanztomographie (MRT) ausgewertet, um anatomische und funktionelle Veränderungen bei Sema7a-/- Tieren auszuschließen. b) Die links- und rechtsventrikuläre Ejektionsfraktion (LVEF oder RVEF in %) wurde mittels MRT bestimmt. c) Se-ma7a-/- Mäuse und Wurfgeschwisterkontrollen wurden 60 Minuten lang einer Ischämie und 120 Minuten lang einer Reperfusion ausgesetzt, wobei die Proben nach 1 Minute oder 120 Minuten Reperfusion entnommen wurden. Repräsentative TTC-gefärbte Schnitte des Myokardgewebes mit Darstellung des Infarktgebietes (blau/dunkel = retrograde Evans-Blau-Färbung; rot und weiß = AAR, weiß = Infarktgewebe, 120 min) mit d) systematischer Auswertung der Infarktgrößen und der entsprechenden Troponin I-Plasmaspiegel (120 min). e) Repräsentative histologische Schnitte von Sema7a-/- und Wurfgeschwisterkontrollherzen (120 min). f) Anzahl der PNCs in myokardialen Gewebeschnitten im AAR von Sema7a-/- Mäusen und Wurfgeschwisterkontrollen (120 min). g) Repräsentative durchflusszytometrische PNC-Plots im Blut von Sema7a-/- und Wurfgeschwisterkontrollen, die GPIb (CD42b) und P-Selektin (CD62P) nach 1 min und 120 min Reperfusion zeigen. Mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) für h) GPIb (CD42b) und i) P-Selektin (CD62P) in PNCs und j) systematische Auswertung von PNCs in % durch Durchflusszytometrie im Blut von Sema7a-/- Tieren und Wurfgeschwisterkontrollen. k) Repräsentative durchflusszytometrische Darstellungen von PNCs in der AAR und MFI für I) GPIb (CD42b) und m) P-Selektin (CD62P) und n) systematische Auswertung von PNCs durch Durchflusszytometrie in % in der AAR von WTs und Sema7a-/- Tieren bei 1 min und 120 min. Die Vergleiche in 10 b, d und f wurden durch Student's t-Tests analysiert (Daten sind Mittelwerte ± SA; n≥5/Gruppe; Histologie n=9/Gruppe). Für 10 h, i, j, I, m und n verwendeten die Erfinder eine Log-Transformation der Daten zur Anpassung an die Normalität. Für log-transformierte Daten wurden Tests mit den Log-Werten durchgeführt, und die Ergebnisse werden als geometrische Mittelwerte und ihre 95%-Konfidenzintervalle angezeigt (*p < 0.05, **p < 0.01 und *** p < 0.001 wie angegeben).
    • 11: Sema7a-/- Tiere zeigen im Vergleich zu WT-Geschwistern keine veränderte Herzleistung. Kurz-Achsen-Herz-MRT-Bilder wurden auf einem 70/39 7T BioSpec-Scanner mit der IntraGateFLASH-Messmethode mit folgenden Parametern aufgenommen: Echozeit = 2,112 ms, 100 Wiederholungen von 74,352 ms, 128-fach quadratische Matrix, räumliche Auflösung von 176 µm. Es wurden zehn axiale Schnitte von 1 mm Dicke und 10 kardiale Rahmen zur Rekonstruktion entnommen, um RV und LV abzudecken. a) Beurteilung des linksventrikulären enddiastolischen Volumens (LVEDV), b) linksventrikulären endsystolisches Volumens (LVESV), c) linksventrikuläre Masse (LV-Masse) und d) linksventrikulären Schlaganfallvolumens (LV-Hub). e) Bewertung des rechtsventrikulären enddiastolischen Volumens (RVEDV), f) rechtsventrikulären endsystolischen Volumens (RVESV), g) rechtsventrikulären Masse (RV-Masse) und h) rechtsventrikulären Schlaganfallvolumens (RV-Hub). Die Vergleiche wurden durch Student's t-Tests analysiert (Daten sind Mittelwerte ± SA; n=6/Gruppe (*p < 0,05 wie angegeben).
    • 12: Sema7a-/- Tiere zeigen bei PNCs reduzierte Anzeichen einer αllbβ3 (JON/A) Aktivierung. Sema7a-/- und Wurfgeschwisterkontrollen wurden für 1 h einer Ischämie und für 2 h der Reperfusion ausgesetzt. Blut- und Myokardgewebeproben (AAR) wurden nach 1 Minute oder 120 Minuten Reperfusion entnommen. Repräsentative durchflusszytometrische Plots von PNCs im Blut und Gewebe von Scheintieren, Sema7a-/- und Wurfgeschwisterkontrollen zeigten eine aktivierte αllbβ3 (JON/A) Aktivierung bei PNCs. Systematische Auswertung der mittleren Fluoreszenzintensitäten von αllbβ3 (JON/A) an PNCs von Sema7a-/- und Wurfgeschwisterkontrollen. Für die 12 haben die Erfinder die Log-Transformation der Daten zur Übereinstimmung mit der Normalität verwendet. Für log-transformierte Daten wurden Tests an den log-Werten durchgeführt, und die Ergebnisse werden als geometrische Mittelwerte und deren 95%-Vertrauensintervalle angezeigt. (*p < 0,05 und **p < 0,01 wie unter n ≥ 5/Gruppe angegeben).
    • 13: Sema7a-Expression in Gewebe von Mäusen und hämatopoetischen menschlichen Zellen. a) Relative Sema7a-mRNA-Expression in Mäusegewebe im Vergleich zum Gehirn. b) Densitometrie der Sema7a-Proteinexpression in Mäusegewebe mit einer repräsentativen Western-Blot-Abbildung. c) Densitometrie der Sema7a-Proteinexpression auf menschlichen hämatopoetischen Zellen mit einer repräsentativen Western-Blot-Abbildung. RBC=Rote Blutzellen, Mono=Monozyten, Plt=Plättchen und PMNs=Polymorphkernige Zellen. (alle Daten sind Mittelwerte ± SA; n≥4/Gruppe).
    • 14: Das von RBC abgeleitete Semaphorin 7A treibt die PNC-Bildung an und verschlechtert die myokardiale RI-Schädigung. Sema7aloxP/loxPHBBCre+, Sema7aloxP/loxPMyh6Cre+, Sema7aloxP/loxPTie2Cre+ und Se-ma7aloxP/loxPLysMCre+ Tiere oder Wurfgeschwisterkontrollen wurden 60 Minuten lang einer Ischämie und 120 Minuten lang einer Reperfusion ausgesetzt. a) Repräsentative TTC-gefärbte Schnitte von Myokardgewebe mit Infarktbereich (blau/dunkel = retrograde Evans-Blau-Färbung; rot und weiß = AAR, weiß = infarktes Gewebe) in Sema7aloxP/loxPHBBCre+ oder Wurfgeschwisterkontrollen mit b) systematischer Auswertung der Infarktgrößen und korrelierenden Troponin I-Plasmaspiegeln. c) Repräsentative histologische Schnitte von Sema7aloxP/loxPHBBCre+ Tieren oder Wurfgeschwisterkontrollen, und d) Anzahl der PNCs, die aus myokardialen AAR-Schnitten bei Sema7aloxP/loxPHBBCre+ Tieren oder Wurfgeschwisterkontrollen gezählt wurden, e) Repräsentative TTC-gefärbte Schnitte von Myokardgewebe, die das Infarktgebiet bei Sema7aloxP/loxPMyh6Cre+ oder Wurfgeschwisterkontrollen zeigen, mit f) systematischer Auswertung der Infarktgrößen und der korrelierenden Troponin I-Plasmaspiegel. g) Repräsentative histologische Schnitte von Sema7aloxP/loxPMyh6Cre+ Tieren oder Wurfgeschwisterkontrollen. h) Die Anzahl der PNCs, die in myokardialen AAR-Schnitten bei Sema7aloxP/loxPMyh6Cre+ -Tieren oder Wurfgeschwisterkontrollen gezählt wurden. i) Repräsentative TTC-gefärbte Herzschnitte, die Myokardinfarkte in Sema7aloxP/loxPTie2Cre+ oder Wurfgeschwisterkontrollen zeigen, mit j) systematischer Auswertung der Infarktgrößen und der korrelierenden Troponin I-Plasmaspiegel. k) Repräsentative histologische Schnitte von Sema7alox/loxPTie2Cre+ Tieren oder Wurfgeschwisterkontrollen und I) Anzahl der PNCs, die in Myokardgewebeschnitten von Sema7aloxP/loxPTie2Cre+ oder Wurfgeschwisterkontrollen gezählt wurden. m) Repräsentative TTC-gefärbte Schnitte von Myokardgewebe, die das Infarktgebiet in Sema7aloxP/loxPLysMCre+ oder Wurfgeschwisterkontrollen zeigen, mit n) systematischer Auswertung der Infarktgrößen und korrelierender Troponin I-Plasmaspiegel. o) Repräsentative histologische Schnitte von Sema7aloxP/loxPLysMCre+ Tieren oder Wurfgeschwisterkontrollen und p) Anzahl der PNCs, die aus myokardialen Gewebeschnitten von Sema7aloxP/loxPLysMCre+ oder Wurfgeschwisterkontrollen gezählt wurden. Alle Vergleiche in der 14 wurden durch Student's t-Tests analysiert (Daten sind Mittelwerte ± SA; n ≥ 5/Gruppe; Histologie n = 9/Gruppe). (*p < 0,05, **p < 0,01 und *** p < 0,001 wie angegeben).
    • 15: Die Rekonstitution von Sema7aloxP/loxPHBBCre+ führt zu einem erhöhten MIRI. Sema7aloxP/loxPHBBCre+ -Tiere oder Wurfgeschwisterkontrollen wurden entweder rekombinantes Semaphorin 7a (rmSema7a) oder Fc-Kontrolle (rmlgG2A Fc) injiziert und dann für 1 h einer Ischämie, gefolgt von 2 h einer Reperfusion unterzogen. a) Repräsentative TTC-gefärbte Schnitte von Myokardgewebe, die das Infarktgebiet zeigen (blau/dunkel = retrograde Evans-Blau-Färbung; rot und weiß = AAR, weiß = infarziertes Gewebe). b) Systematische Auswertung von Infarktgrößen und korrelierenden Troponin I-Plasmaspiegeln. c) Repräsentative histologische Schnitte, die auf das Vorhandensein von PNCs gefärbt wurden, und d) Anzahl der PNCs, die aus myokardialen AAR-Schnitten in Sema7aloxP/loxPHBBCre+ Tieren gezählt wurden, denen entweder rekombinantes Semaphorin 7a (rmSema7a) oder Fc-Kontrolle (rmlgG2A Fc) injiziert wurden. Alle Vergleiche in 15 wurden durch Student's t-Tests analysiert (Daten sind Mittelwerte ± SA; n ≥ 5/Gruppe; Histologie n = 9/Gruppe). (*p < 0,05 und *** p < 0,001 wie angegeben).
    • 16: Sema7a übt seine Funktion über das Thrombozytenglykoprotein Ib (GPIb) aus. a) rmSema7a verstärkt deutlich die Adhäsion und Thrombusbildung von WT-Thrombozyten auf Kollagen im Fluss bei einer Scherrate von 1000 s-1. Eine Blockade der Ligandenbindungsstelle des Thrombozytenglykoproteins GPIb (p0p/B) hebt diesen thrombusfördernden Effekt von rmSema7a auf. b) Repräsentative IF-Bilder des Experiments in (a). c) rmSema7a beeinträchtigt weder die Adhäsion noch die Thrombusbildung von GPIb-IL-4-tg-Thrombozyten auf Kollagen im Fluss bei einer Scherrate von 1000 s-1. d) Repräsentative IF-Bilder des Experiments aus (c). Die repräsentativen Fluoreszenzbilder sowie die mittlere Oberflächenbedeckung und das relative Thrombusvolumen sind gezeigt, gemessen durch die integrierte Fluoreszenzintensität (IFI) pro mm2 ± SEM (n ≥ 3/Gruppe)). e) GP-lb-IL4-tg Tiere wurden 60 Minuten lang einer Ischämie und 120 Minuten lang einer Reperfusion ausgesetzt. Ihnen wurde unmittelbar vor der Ischämie rmSema7a oder rmlgG2A Fc-Kontrolle injiziert. f) Die Infarktgrößen und die korrelierenden Troponin I Plasmaspiegel wurden bestimmt. g) Repräsentative histologische Schnitte und h) Anzahl der PNCs, die aus Myokardgewebeschnitten von GP-lb-IL4-tg gezählt wurden, denen entweder rmSema7a oder rmlgG2A Fc (Kontrolle) injiziert wurden, i) Es wurde eine Coimmunpräzipitationsanalyse zwischen Sema7a und GPIb in Blut und Herz (AAR) durchgeführt. Sema7a wurde mit Hilfe eines Anti-GPIb-Antikörpers affinitätspräzipitiert, und GPIb wurde mit Hilfe eines Sema7a-Antikörpers affinitätspräzipitiert. Als negative Kontrolle wurde Ratten- oder Maus-IgG verwendet. Gebundene Proteine wurden mittels Immunblotting analysiert. Die gleiche Proteinmenge wurde in allen Eingangsbeladungen von Blut- oder Herzlysaten eingesetzt. j) Zur Quantifizierung der Immunoblots wurde eine densitometrische Analyse durchgeführt. Für Vergleiche in der 16 a und 16 c führten die Erfinder Einweg-Varianzanalysen durch, gefolgt von Dunnett-Tests zur Gruppe WT +rmSema7a (Daten sind Mittelwerte ± SA; n=4/Gruppe). Die Vergleiche in der 16 f, h, i und j wurden mit Hilfe von Student's t-Tests analysiert (Daten sind Mittelwerte ± SA; n ≥ 7/Gruppe; Histologie n = 9/Gruppe; densitometrische Analyse n≥7/Gruppe). (*p < 0,05, **p < 0,01 und *** p < 0,001 wie angegeben).
    • 17: Rekombinantes Semaphorin 7A (rmSema7a) verbessert deutlich die Adhäsion und Thrombusbildung von WT-Thrombozyten auf Kollagen im Fluss bei einer Scherrate von 400 s-1. Eine Blockade der Ligandenbindungsstelle von Thrombozyten-GPIb (p0p/B) hebt die thrombusfördernde Wirkung von rmSema7a auf. Es werden repräsentative Fluoreszenzbilder sowie die mittlere Oberflächenbedeckung und das relative Thrombusvolumen, gemessen durch die integrierte Fluoreszenzintensität (IFI) pro mm2, gezeigt. Für Vergleiche in der Figure 17 führten die Erfinder Einweg-Varianzanalysen durch, gefolgt von Dunnett's Tests zur Gruppe WT + rmSema7a. (Daten sind Mittelwerte ± SA; n ≥ 3/Gruppe; *p < 0,05, **p < 0,01 und *** p < 0,001 wie angegeben).
    • 18: Anti-Sema7a reduziert die myokardiale RI-Schädigung, die Thrombozytenaktivierung und die PNC-Bildung. Den Tieren wurde 5 Minuten vor Beginn der 120-minütigen Reperfusion nach 60-minütiger Ischämie entweder Anti-Semaphorin-7A-Antikörper (Anti-Sema7a) oder IgG-Kontrolle injiziert, wobei die Proben nach 1 Minute oder 120 Minuten Reperfusion entnommen wurden. a) Repräsentative TTC-gefärbte Herzschnitte von Myokardinfarkten (blau/dunkel = retrograde Evans-Blau-Färbung; rot und weiß = AAR, weiß = Infarktgewebe) mit b) systematischer Auswertung der Infarktgrößen und korrelierender Troponin I-Plasmaspiegel. c) Repräsentative histologische Schnitte von WT-Tieren, denen entweder IgG-Kontrolle oder Anti-Sema7a injiziert wurde, und d) Anzahl der PNCs, die in Myokardgewebeschnitten gezählt wurden, e) Repräsentative Durchflusszytometrie-Blots von PNCs im Blut von Tieren, denen eine Schein-, Anti-Sema7a- oder IgG-Kontrolle injiziert wurde, die GPIb (CD42b) und P-Selektin (CD62P) exprimieren. Systematische Auswertung der durchflusszytometrischen Expression der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) für f) GPIb (CD42b) und g) P-Selektin (CD62P) und h) systematische Auswertung der PNCs in % durchflusszytometrisch im Blut von Tieren, denen Anti-Sema7a oder IgG-Kontrolle injiziert wurde, und zwar nach 1 min und 120 min. i) Systematische Auswertung der durchflusszytometrischen Expression von MFI für j) GPIb (CD42b) k) P-Selektin (CD62P) und I) systematische Auswertung von PNCs in % durchflusszytometrisch im AAR von Tieren, denen Anti-Sema7a- oder IgG-Kontrolle injiziert wurde, und zwar nach 1 min und 120 min. Die Vergleiche in 18 b und d wurden durch Student's t-Tests analysiert (Daten sind Mittelwerte ± SA; n ≥ 6/Gruppe; Histologie n = 9/Gruppe). Für die 18 f, g, h, j, k und I verwendeten die Erfinder die Log-Transformation der Daten zur Anpassung an die Normalität. Für log-transformierte Daten wurden Tests mit den log-Werten durchgeführt, und die Ergebnisse werden als geometrische Mittelwerte und deren 95%-Konfidenzintervalle angezeigt. (*p < 0,05, **p < 0,01 und *** p< 0,001 wie angegeben).
    • 19: Anti-Sema7a dämpft die Aktivierung des Integrins αllbβ3 (JON/A). Die Tiere wurden für 1 h einer Myokardischämie und anschließend für 2 h einer Reperfusion unterzogen und 5 Minuten vor der Reperfusionsphase wurden entweder ein Anti-Semaphorin-7A-Antikörper (Anti-Sema7a) oder eine IgG-Kontrolle injiziert. Nach 1 Minute oder 120 Minuten der Reperfusion wurden Blut- und Myokardgewebeschnitte (AAR) entnommen. Repräsentative durchflusszytometrische PNC-Plots im Blut und Gewebe von WT-Tieren, die entweder mit IgG-Kontrolle oder Anti-Sema7a injiziert wurden, zeigten eine Integrin αllbβ3 (JON/A) Aktivierung bei PNCs nach 1 Minute und 120 Minuten der Reperfusion. Systematische Auswertung der durchflusszytometrischen mittleren Fluoreszenzintensitäten der aktivierten αllbβ3 (JON/A) an PNCs von Mäusen, denen entweder Anti-Sema7a oder eine IgG-Kontrolle injiziert wurde, nach 1 min und 120 min. Für die 19 verwendeten die Erfinder die Log-Transformation der Daten zur Anpassung an die Normalität. Für log-transformierte Daten wurden Tests mit den Log-Werten durchgeführt, und die Ergebnisse werden als geometrische Mittelwerte und deren 95%-Konfidenzintervalle angezeigt (*p < 0,05 und ***p < 0,001 wie angegeben, n ≥ 5/Gruppe).
    • 20: Schematische Darstellung der Rolle von Sema7a während der myokardialen Ischämie-Reperfusion. 1) Während der myokardialen Ischämie führen Scherstress und Hypoxie zur Abspaltung von Sema7a von der Oberfläche der Erythrozyten (1a) als Hauptquelle von Sema7a innerhalb des Gefässbettes. 2) Das freigesetzte Sema7a greift dann in den Glykoprotein-Ib-Rezeptor (2a) und aktiviert die Thrombozyten, der dann die Integrinrezeptoren (2b) freilegt, was zu einer Thrombozyten- und Blutplättchenbildung führt. 3) Aktivierte Thrombozyten und PNCs wandern aus dem Gefäßsystem in das ischämische Gewebe, was zu einer Schädigung und Zerstörung des Gewebes führt.
  • BEISPIELE
  • Material und Methoden
  • Erklärung zur Ethik
  • Die Tierprotokolle entsprachen den deutschen Richtlinien für die Verwendung lebender Tiere und wurden von dem Institutional Animal Care und dem Regierungspräsidium Tübingen und Würzburg sowie dem Landesamt für Verbraucherschutz Niedersachsen genehmigt. Die Genehmigung für die Verarbeitung von Humanproben wurde von der Ethikkommission (Institutional Review Board) der Universität Tübingen eingeholt. Proben von Patienten mit Myokardinfarkt wurden bei der Präsentation im Katheterlabor gewonnen und aufbereitet (Biobank: 266/2018BO1; Sema7a-Subanalyse: 266/2018BO2; Clinicaltrial.gov: NCT01417884). Im Rahmen der TüSep-Studie (NCT02692118) wurden Patientenproben vor und nach der Herzoperation gesammelt. Vor der Probenentnahme wurde von jedem Patienten eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt.
  • Verarbeitung von menschlichen Blutproben
  • Menschliche Blutproben wurden während einer Koronarintervention, am Ende eines kardiopulmonalen Bypasses oder während des Verschlusses der Koronararterien während einer Herzoperation ohne Herzlungenmaschine entnommen und für die Durchflusszytometrie aufbereitet. Darüber hinaus wurde Blut zentrifugiert, um Plasmaproben zu erhalten, die dann gelagert und gemessen wurden. Das Blut wurde auch zur Isolierung von Erythrozyten verwendet, die auf die SEMA7A-Expression analysiert oder in weiteren Experimenten verwendet wurden (Ethik-Zulassung 507/2017BO1).
  • Mäuse
  • Sema7a-/- Mäuse wurden, wie im Stand der Technik beschrieben, generiert, validiert und charakterisiert. Die entsprechenden WT-Kontrollen wurden als Wurfgeschwister der Sema7a-/- Mäuse gezüchtet. In einer Untergruppe von Experimenten wurde eine neu generierte Sema7a-Floxmauslinie (Sema7aloxP/loxP/Ozgene) auf einem C57BL/6-Hintergrund mit den folgenden Cre-Rekombinase-positiven Mauslinien gekreuzt, um eine gewebsspezifische Gendeletion zu erhalten: Erythrozyten-spezifisches HbbCre+, Myokardzell-spezifisches Myh6Cre+; Endothelzell-spezifisches Tie2Cre+ und Immunzellspezifisches LysMCre+. In den Experimenten wurden gewebsspezifische Gen-Deletionen von Sema7a-Mauslinien (Sema7aloxP/loxPHbbCre+; Sema7aloxP/loxPMyh6Cre+, Sema7aloxP/loxPTie2Cre+ und Sema7aloxP/loxPLysMCre+) verwendet. Als Kontrollen wurden Sema7aloxP/loxPCre-negative (-) Wurfgeschwister verwendet. In einer Untergruppe von Experimenten verwendeten die Erfinder eine funktionelle GPIb-Knockout-Mauslinie (GPIb-IL4tg), um die Interferenz von Sema7a mit dem GPIb-Rezeptor zu testen. In einer Untergruppe von Experimenten wurden Sema7aloxP/loxPHbbCre+-Tiere mit rekombinantem Maus-Sema7a (rmSema7a; R&D SYSTEMS, Minneapolis, USA) oder rekombinantem Maus-lgG2A Fc (rmIgG2A Fc; Kontrolle) rekonstituiert.
  • Murine Myokardischämie und Reperfusionsmodell
  • Dieses Tiermodell wurde im Stand der Technik ausführlich beschrieben. Untergruppen von Tieren erhielten entweder rekombinantes Maus-Sema7a (rmSema7a) oder rekombinantes Maus-lgG2A Fc (rmIgG2A Fc; Kontrolle) vor Versuchsbeginn oder Sema7a-Antikörper (abcam ab23578, Cambridge, UK; Anti-Sema7a) oder als Kontrolle Kaninchen-IgG sc-2027 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA) 5 Minuten vor Beginn der Reperfusion intravenös.
  • Immunhistochemischer Nachweis von Neutrophilen, Thrombozyten und PNCs in myokardialem Gewebe der Maus
  • Für die immunhistochemische Färbung wurde das Vectastain-ABC-Kit (Linaris, Wertheim, Deutschland) verwendet. Nach Inhibierung der unspezifischen Bindungsstellen mit Avidin-Blockierungslösung (Vector) wurden die Schnitte mit primären Antikörpern (Kaninchen-anti-Maus-CD41, abcam, Cambridge, UK) über Nacht bei 4 °C inkubiert. Die Gewebeschnitte wurden dann mit biotinyliertem Kaninchen-anti-IgG für 1 Stunde inkubiert, gefolgt von Vectastain-ABC-Reagenz für 30 Minuten, dann über DAB-Substrat entwickelt. Für die PMN-Färbung wurde das Verfahren unter Verwendung von Ratten-anti-Mausneutrophilen Antikörpern (BioRad, Serotec, Puchheim, Deutschland) und HistoGreen als Substrat (Linaris, Wertheim, Deutschland) wiederholt. Die Gegenfärbung wurde mit Nuclear Fast Red durchgeführt (Linaris, Wertheim, Deutschland). Histologische Schnitte wurden durch manuelle Zählung innerhalb von 3 unabhängigen Gewebeschnitten jedes Tieres bei einer Vergrößerung von 400 × 400 auf das Vorhandensein von PNCs analysiert.
  • Troponin I Messung
  • Die Troponin-Blutplasmaspiegel von Proben, die durch zentralvenöse Punktion nach 120 Minuten Reperfusion entnommen wurden, wurden mit dem ELISA-Kit SEA478Mu (Cloud-Clone Corp., Houston, USA) auf murines Troponin I Typ 3 (TNNI3) gemessen.
  • Caspase 3-Färbung und Caspase 3-ELISA
  • Humane kardiale Myozyten (HMC-c; PromoCell, Heidelberg, Deutschland) wurden bis zur Konfluenz auf Kammerobjektträgern gezüchtet, gefolgt von einer 6-stündigen Stimulation mit rhSEMA7A, rhlgG1 Fc, BSA oder Staurosporin (Sigma-Aldrich, München, Deutschland), jeweils 1 µg/ml. Nach der Fixierung wurden die Zellen mit polyklonaler Kaninchen-Antikaspase3 (abcam, Cambridge, UK) gefärbt.
  • Sema7a-ELISA
  • Sema7a-ELISAs wurden gemäß den Herstelleranweisungen unter Verwendung des ELISA-Kits SEB448Hu für humanes und SEB448Mu für murines Sema7a durchgeführt (Cloud-Clone Corp., Houston, USA).
  • RT-qPCR
  • Für die RNA-Extraktion haben die Erfinder das peqGOLD TriFast™ (Peqlab; Deutschland; Erlangen) nach den Anweisungen des Herstellers verwendet. Für die cDNA-Synthese wurde der iScript-Kit von Bio-Rad (Bio-Rad; Deutschland; München) verwendet. Die semiquantitative Analyse von murinem Sema7a wurde mittels Echtzeit-PCR unter Verwendung des Sense-Primers 5'-GTG GGT ATG GGC TGC TTT TT-3' (SEQ ID Nr. 1) und des Antisense-Primers 5'-CGT GTA TTC GCT TGG TGA CAT-3' (SEQ ID Nr. 2) durchgeführt. Das Referenzgen war das murine 18S rRNA-Gen mit dem folgenden Satz von Primern: Sense 5'-GTA ACC CGT TGA ACC CCA TT-3' (SEQ ID Nr. 3) und Antisense-Primer 5'-CCA TCC AAT CGG TAG TAG CG-3' (SEQ ID Nr. 4).
  • Protein-Analyse
  • Murines Gewebe wurde homogenisiert und in RIPA-Puffer resuspendiert. Die Proben wurden über SDS-Polyacrylamid-Gele getrennt und auf PVDF-Membranen geblottet. Die folgenden Antikörper wurden in murinen Proben verwendet: Anti-Sema7a-Antikörper (ab23578; abcam, Cambridge, UK) und, zur Kontrolle der Beladungsbedingungen, GAPDH-Antikörper (sc-25778; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA). Für menschliche Proben verwendeten die Erfinder einen polyklonalen Ziegen-Anti-Sema7a-Antikörper (AF2068; R&D SYSTEMS, Minneapolis, USA) und β-Aktin-Antikörper (sc-130656; Santa Cruz Biotechnology). Die Banden wurden durch Chemilumineszenzreaktion von HRP-konjugierten Antikörpern nachgewiesen und mit dem Luminol-Reagenz (sc-2048; Santa Cruz Biotechnology) entwickelt.
  • Coimmunpräzipitation und Immunblotting
  • Die Coimmunpräzipitation (Co-IP) wurde nach den Anweisungen des Herstellers mit dem Pierce Co-IP-Kit (Kat. Nr. 261498, Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) durchgeführt. Kurz gesagt, wurden die Mausproben nach einer 60-minütigen Ischämie entnommen, gefolgt von einer 1-minütigen (Blut) oder 15-minütigen (Herzgewebe, AAR) Reperfusion. Dann wurden 250 µl Citrat+Blut in 1 ml IP-Lyse/Waschpuffer lysiert und auf Eis aufbewahrt. Die AAR wurde in 1 ml IP-Lyse-/Waschpuffer inkubiert und in einem Precellys 24 (VWR/Peqlab, Erlangen, Deutschland) homogenisiert und für 60 Minuten bei 4 °C aufbewahrt. Alle Proben wurden bei 13.000 × g für 10 Minuten zentrifugiert. Das Gesamtprotein der Lysate wurde mit dem Pierce™ BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific; Kat. Nr. 23225) gemessen und in einem Infinite® M200 Pro Plate Reader (Tecan, Männedorf, Schweiz) analysiert. Zehn Mikrogramm monoklonaler Maus-Antikörper gegen Sema7a (sc374432; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA) oder 10 µg monoklonaler Ratten-Antikörper gegen GPIb (p0p4) wurden auf dem Amino Link Plus-Kopplungsharz immobilisiert. Als IgG-Kontrolle wurden 10 µg Ratten-IgG (sc2016; Santa Cruz Biotechnology) oder Maus-IgG (X0943; Dako, Glostrup, Dänemark) verwendet. Für die Proteinanalyse wurden 30 µl pro Co-IP-Eluat auf die SDS-PAGE aufgetragen. Für die Immunodetektion wurden ein polyklonaler Kaninchen-Antikörper gegen Sema7a (sc135263; Santa Cruz Biotechnology) und der beschriebene monoklonale Antikörper (p0p5) gegen GPIb verwendet. Spezies-angepasste alkalische Phosphatase-konjugierte Sekundärantikörper wurden verwendet (Ziege gegen Kaninchen-IgG-AP; sc-2007; Santa Cruz Biotechnology; und Ziege gegen Ratte-lgG-AP; A18868; Thermo Fisher Scientific). Der Proteinnachweis wurde mit einem BCIP/NBT-Substrat durchgeführt.
  • Kardiale Magnetresonanztomographie (MRT) und Beurteilung von RV und LV -EDV, - ESV, -EF und Masse mittels MRT
  • Die Tiere wurden im Alter von 22 Wochen einer kardialen MRT unterzogen. Die Analyse wurde auf einer klinischen Workstation mit halbautomatischer Konturverfolgungssoftware durchgeführt (CVI42, Release 4.1.8 (201), Circle Cardiovascular Imaging Inc., Calgary, Kanada).
  • Durchflusskammer-Experimente
  • Die Thrombozytenadhäsion im Fluss wurde durch Perfusion von murinem Vollblut auf kollagenbeschichteten Deckgläsern (200 µg/ml fibrilläres Typ-I-Kollagen) bei 1000 s-1 oder 400 s-1, wie angegeben, gemessen. Die Thrombozyten wurden mit einem DyLight 488-konjugierten Anti-GPIX-Ig-Derivat (0,2 (µg/ml) markiert und vor der Perfusion 5 Minuten lang bei 37°C mit rmSema7a oder IgG2A Fc behandelt. Im Falle der Behandlung mit GPIb-blockierenden Antikörpern wurden 20 Minuten vor der Blutentnahme für das Experiment 100 µg/Maus p0p/B Fab intravenös injiziert. In weiteren Experimenten wurde Blut von Tieren mit funktionellem GPIb (GPIb-IL4tg) verwendet.
  • Durchflusszytometrische Analyse
  • Für die durchflusszytometrische Analyse wurden die folgenden Antikörper verwendet und vor dem Experiment frisch präpariert: Ratten-Anti-Maus Ly6G (Biolegend, Klon 1A8), markiert mit BV421 (Biolegend 127628), Ratten-Anti-Maus CD42b-FITC (Emfret, Klon Xia.G5), Ratten-Anti-Maus CD62P (BD Pharmingen, Klon RB40.34), markiert mit Alexa Fluor 647 (BD 563674), Ratten-Anti-Maus aktiviertes GPIIb/IIIa-PE (Emfret, Klon JON/A).
  • Gating-Strategie
  • Nach der Färbung fokussierte die Probennahme periphere Granulozyten durch ihre Granularität und Oberflächenexpression des Lymphozyten-Antigen-6-Komplexes, Locus G (Ly-6G), der als SSC/Ly-6G+ bezeichnet wird. Das Vorhandensein des Thrombozyten-Oberflächenmarkers CD42b auf der Oberfläche von SSC/Ly-6G+-Ereignissen unterschied die Thrombozyten-Neutrophilen-Komplexe SSC/Ly-6G+/CD42b+ (PNCs) von den frei zirkulierenden PMNs SSC/Ly-6G+/CD42b-. Diese beiden Populationen wurden auf ihre Darstellung des Oberflächen-Transmembranglykoproteins P-Selektin (CD62P) und des aktivierten GPIIb/llla (Klon JON/A) getestet (nicht gezeigt).
  • SEMA7A-Abspaltung von Erythrozyten
  • Die Erythrozyten wurden mit MACS-Beads (MicroBeads Kit, Milenyi Biotec, Deutschland) aus menschlichen Blutproben abgetrennt. Die Zellen wurden in einer Neubauer-Kammer quantifiziert. Pro Probe wurden 8×108 Erythrozyten eingesetzt. Die Scherbeanspruchung wurde durch Ziehen und Drücken der Erythrozyten durch eine 27-Gauge-Nadel induziert. Für die Hypoxie-Exposition wurden Zellen in hypoxisches PBS-Medium, das einer Hypoxie (8% O2) ausgesetzt war, in einer Invivo2 400 Hypoxie-Arbeitsstation (Ruskin Technology Ltd; Leeds) platziert. Am Ende jedes Experiments wurden die Proben bei RT mit 1200 U/min für 10 Minuten zentrifugiert, und die SEMA7A-Konzentration wurde im Überstand mit dem ELISA-Kit SEB448Hu gemessen.
  • Intravitale Mikroskopie
  • Die Mäuse wurden betäubt und das kremastische Gewebe unter einer Nikon 20x Wassertauchlinse (NA=0,32) präpariert. Die Neutrophilen wurden mit 20 µl anti-Ly6G (Biolegend 127608) und die Thrombozyten mit 20 µl des Thrombozyten-spezifischen FITC-markierten X488-Antikörpers (emfret, Eibelstadt, Deutschland) in 200 µl resuspendiert und i.v. verabreicht. Videos von postkapillären Kremastervenolen mit einem Durchmesser von 20-40 µm wurden mit einer Hamamatsu Orca Flash 4.0-Kamera aufgenommen, die auf einem Dual-Emissions-Bildteiler (optoSplit II, Cairn Research; UK) mit einer Rate von 16 Bildern/s (bei Videos von insgesamt 10 Sekunden) und mit einer Auflösung von 2048 × 1024 Pixel montiert war, der auf einem Nikon Eclipse Ci-L-Mikroskop (Nikon, Düsseldorf; Deutschland) montiert war, das von der NIS elements Ar-Software betrieben wird. Die Videos wurden vor der Verabreichung von rmSema7a i.v. aufgezeichnet und die Videos nach einer Inkubation von 15 Minuten für 5 Minuten in Intervallen von 20 Sekunden aufgenommen. Die Neutrophilen-Geschwindigkeit (µm / sec) wurde aus manuell verfolgten Zellen berechnet, die stationären Neutrophilen wurden gezählt (Zellzahl / mm2), die Thrombozytensedimentation an der Gefäßwand wurde gemessen (normalisierte MFI % / mm), die durchwanderten Zellen aus dem Gefäßsystem nach 15min Exposition mit rmSema7a wurden gezählt (Zellzahl / mm2), der in allen Videos in µm gemessene Abstand der durchwanderten Zellen wurde mit der NIS elements Ar-Software 4.20 - 64bit verarbeitet (Nikon, Düsseldorf, Deutschland).
  • Analyse der Daten
  • Die gesamte Datenanalyse wurde in Zusammenarbeit mit dem Institut für Klinische Epidemiologie und Angewandte Biometrie der Universität Tübingen durchgeführt. Die Daten werden in der Regel als Balkendiagramme mit Mittelwerten ± SA dargestellt. Die Normalverteilung wurde anhand der Schiefe überprüft. Da die Prüfung auf Normalität bei kleinen Stichprobengrößen leicht zu statistisch nicht signifikanten, aber bedeutungslosen Ergebnissen führen kann, wie es in dieser Studie der Fall war, führten die Erfinder auch eine visuelle Inspektion der Datenverteilungen mit Hilfe von Histogrammen durch und versuchten eine Log-Transformation der Daten in Übereinstimmung mit der Normalität, wenn diese Inspektion schiefe Verteilungen ergab. Für log-transformierte Daten wurden Tests der Log-Werte durchgeführt; die Daten werden auf einer logarithmischen Skala angezeigt, die geometrische Mittelwerte und ihre 95%-Vertrauensintervalle zeigt. Insgesamt wurden beim Vergleich zweier Gruppen statistische Tests unter Verwendung von Student's t-Tests durchgeführt; für den Vergleich mehrerer Gruppen führten die Erfinder Einweg-Varianzanalysen durch, gefolgt von Dunnett's Tests. Für die Figure 3: Der SEMA7A% auf menschliche Erythrozyten und das Alter als Inputvariablen wurde durch lineare Regressionsanalyse analysiert und punktweise mit 95% Konfidenzbändern angezeigt, wobei gesunde Menschen als Spender und das Alter als Inputvariablen verwendet wurden. Für alle durchgeführten Vergleiche werden p-Werte angezeigt und p-Werte unter p < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen, angezeigt als p < 0,05 (*); p < 0,01 (**) und p < 0,001 (***).
  • Ergebnisse
  • Patienten mit Myokardischämie zeigen eine erhöhte PNC-Bildung und Plasma SEMA7A
  • Die Anzahl der PNCs nimmt im Myokardgewebe während MIRI zu. Die schädlichen Auswirkungen von PNCs wurden in anderen Organen, wie z.B. der Lunge, nachgewiesen, wo sie die entzündliche Gewebeschädigung verstärken, was zu einer Beeinträchtigung der Organfunktion führt. In einem Versuch, die Interaktion von Thrombozyten und Neutrophilen und die Bildung von PNCs bei entzündlichen Myokardschäden besser zu verstehen, haben die Erfinder Blutproben von Patienten mit aktiver Myokardischämie entnommen und mittels FACS-Analyse auf das Vorhandensein von PNCs untersucht. Die Erfinder verglichen diese Proben mit Patienten, die sich einer herzchirurgischen Operation unterziehen, die auch einer Reperfusion nach extrakorporaler Zirkulation (HLM) ausgesetzt sind. Diese Patienten zeigten keine Anzeichen für eine aktive Ischämie. Darüber hinaus erhielten die Erfinder Blut aus herzchirurgischen Operationen ohne Reperfusionsverletzung sowie gesunde Kontrollen. Die Erfinder fanden heraus, dass die Patienten mit akutem MI im Vergleich zu gesunden Kontrollen und Patienten, die sich herzchirurgischen Eingriffen mit oder ohne extrakorporale Zirkulation unterzogen, signifikant mehr CD42b-positive Neutrophile (d.h. PNCs) aufwiesen. Bemerkenswert ist, dass die Thrombozyten in den Konjugaten vollständig aktiviert waren, wie die deutliche Aktivierung von Integrin IIb3 (PAC-1-Bindung) und die CD62P-Exposition zeigten (1 a-d). Angesichts der Tatsache, dass die Reperfusion ischämischen Gewebes eine Entzündung auslöst, und der früheren Feststellung der Erfinder, dass SEMA7A eine signifikante pro-inflammatorische Kapazität aufweist, haben die Erfinder auch lösliches SEMA7A im Blut dieser Patienten gemessen. Tatsächlich stieg SEMA7A im Plasma von MI-Patienten an, aber nicht in einer der anderen getesteten Patientengruppen (1 e, 2). Die Erfinder fanden auch heraus, dass die SEMA7A-Expression auf Erythrozyten nicht altersabhängig ist (3). Experimente an Mäusen ergaben, dass Plasma Sema7a während einer kardialen Ischämie sehr schnell zunahm, wobei bereits nach 1 Minute Reperfusion eine signifikante Erhöhung festgestellt wurde (4). SEMA7A wurde aus Erythrozyten als Reaktion auf Scherstress oder Gewebehypoxie freigesetzt, die beide während der Myokardischämie-Reperfusion in den betroffenen Bereichen vorhanden sind (5).
  • Die Injektion von Sema7a verschlechtert die myokardiale IR-Schädigung
  • Der starke Anstieg von Sema7a im Plasma von Patienten und Mäusen mit Myokardischämie hat die Möglichkeit aufgeworfen, dass Sema7a eine funktionelle Rolle bei der Progression der myokardialen IR-Verletzung spielt. Um dies direkt zu testen, injizierten die Erfinder rekombinantes Sema7a (rmSema7a-Fusionsprotein, 1 µg/Maus vor der Reperfusion) in WT-Tiere und stellten fest, dass dies zu einer deutlich erhöhten Infarktgröße im Vergleich zu den entsprechenden IgG Fc-Kontrolltieren (rmlgG2A Fc) führte (6 a,b). Dieser Befund korrelierte mit einem erhöhten Troponin I, einem Marker für eine Schädigung des Myokardgewebes. Histologische Schnitte zeigten eine erhöhte Gewebeschädigung bei den Sema7a-injizierten Tieren im Vergleich zu den Fc-Kontrollen und eine geringere Anzahl von PNCs in den gefährdeten Gewebebereichen (6 c,d). In Zellkulturexperimenten fanden die Erfinder keine direkte pro-apoptotische Wirkung von humanem Sema7a (rhSEMA7A) auf Kardiomyozyten, wie durch die Aktivierung von Caspase 3 beurteilt wurde (7 a,b). Nachdem die Erfinder mehr PNCs im Myokardgewebe beobachtet hatten und die schädlichen Auswirkungen, die diese PNCs haben können kennen, haben die Erfinder als nächstes die Durchflusszytometrie verwendet, um das Vorhandensein von PNCs zu testen. Die Erfinder fanden deutlich erhöhte Zahlen von PNCs im Blut von Mäusen, denen rmSema7a injiziert wurde, und die Konjugate (6 h) zeigten auch stärkere Signale für die Thrombozytenmarker GPIb, CD62P und aktiviertes Integrin αllbβ3 (JON/A) (6 e-g, 8). Um zu prüfen, ob sich dies durch PNCs, die in das Risikogebiet (AAR) eindringen, widerspiegelt, extrahierten die Erfinder dieses Gebiet und bestimmten die Anzahl der PNCs im Myokardgewebe. Mit Hilfe der Durchflusszytometrie stellten die Erfinder fest, dass bei den Tieren, denen rmSema7a injiziert wurde, mehr PNCs in das Myokard in der AAR extravasiert waren und dass die Konjugate bei Neutrophilen signifikant erhöhte Signale für GPIb, P-Selektin und aktiviertes Integrin αllbβ3 (JON/A) zeigten (6 i-I, 8). Die Erfinder testeten auch den Einfluss von rmSema7a auf das Rollen von Neutrophilen und stellten fest, dass rmSema7a die Adhäsion von Neutrophilen in vitro und in vivo beeinflusste (9). Dies stimmt mit früheren Ergebnissen der Erfinder überein, wonach Sema7a, das auf der Oberfläche von Endothelzellen exprimiert wird, die Transmigration von Neutrophilen in entzündete Gewebe erhöht.
  • Deutlich reduzierte myokardiale IR-Schädigung bei Sema7a-/- Mäusen
  • Zur weiteren Untersuchung der Rolle von Sema7a bei myokardialen IR-Verletzungen haben die Erfinder Sema7a-/- Tiere und ihre Wurfgeschwisterkontrollen eingesetzt. Da Sema7a an der fibrotischen Transformation von Gewebe beteiligt ist, untersuchten die Erfinder zunächst die Herzfunktion bei unbehandelten WT- und Sema7a-/- Tieren mittels dynamischer Magnetresonanztomographie. Die Erfinder konnten keine Unterschiede in der Anatomie oder den kardialen Leistungsparametern von Sema7a-/- Mäusen gegenüber Wurfgeschisterkontrollen feststellen (10 a, b, 11). Als nächstes exponierten die Erfinder die Sema7a-/- Mäuse an MIR und stellten fest, dass sie dramatisch kleinere Infarkte entwickelten und im Vergleich zu den Wurfgeschwisterkontrollen ein vermindertes Plasmatroponin I aufwiesen (10 c, d). Histologische Schnitte zeigten eine geringere Gewebeschädigung bei Sema7a-/- Tieren im Vergleich zu den Wurfgeschwisterkontrollen und eine geringere Anzahl von PNCs in den gefährdeten Gewebebereichen (10 e, f). Die durchflusscytometrische Analyse zeigte eine geringere Anzahl von PNCs (10 j) im Blut von Sema7a-/- Tieren im Vergleich zu den Kontrollen, und die Konjugate zeigten geringere Werte von Thrombozytenaktivierungsmarkern (Oberflächen-P-Selectin und aktiviertes Integrin αllbβ3 (JON/A)) in der frühen Phase nach der IR (10 g-i, 12). Die Erfinder testeten erneut, ob sich dies innerhalb der PNCs in der AAR widerspiegelt. Die Erfinder extrahierten diesen Bereich und zählten die PNCs innerhalb des Myokardgewebes. Mit Hilfe der Durchflusszytometrie fanden die Erfinder eine reduzierte Anzahl von PNCs innerhalb der AAR und die Konjugate zeigten verminderte Signale für GPIb, aktiviertes Integrin αllbβ3 und P-Selektin auf Neutrophilen in der AAR von Sema7a-/- Tieren (10 k-n, 12).
  • Das aus roten Blutkörperchen gewonnene Semaphorin 7a ist von zentraler Bedeutung für myokardiale RI-Schädigung
  • Als nächstes versuchten die Erfinder, die zelluläre Quelle des löslichen Sema7a zu identifizieren, die die beobachtete pathogene Wirkung vermittelt. Sema7a wird in verschiedenen Organen und Geweben exprimiert, wobei es auf den Erythrozyten (RBCs) in großer Menge vorhanden ist und im Myokardgewebe nur eine geringe Expression aufweist (13). Deshalb haben die Erfinder Tiere mit genetischer Deletion von Sema7a in Endothelzellen (Sema7aloxP/loxPTie2Cre+), Kardiomyozyten (Sema7aloxP/loxPMyh6Cre+), Erythrozyten (Sema7aloxP/loxPHbbCre+) und immunkompetenten Zellen (Sema7aloxP/loxPLysMCre+) generiert und sie dem MIRI-Modell zugeführt. Bei den Sema7aloxP/loxPHbbCre+-Tieren fanden die Erfinder eine signifikante Verringerung der Infarktgröße, die gut mit reduziertem Plasma-Tnl korrelierte (14 a,b). Die immunhistologische Analyse zeigte eine reduzierte Anzahl von PNCs im Myokardgewebe dieser Tiere im Vergleich zur WT-Kontrolle (14 c,d). Die Injektion von rmSema7a zeigte, dass diese Ergebnisse bei den Sema7aloxP/loxPHbbCre+-Tieren umgekehrt werden konnten, obwohl die Injektion von Sema7a bei diesen Tieren zu höheren Troponinwerten führte (15). Bei den Sema7aloxP/loxPMyh6Cre+ -Tieren fanden die Erfinder keine signifikante Veränderung der myokardialen IR-Schädigung (14 e,f) und keine Veränderungen im Vergleich zu den Wurfgeschwisterkontrollen, wenn man die PNCs im Myokardgewebe betrachtet (14 g,h). Bei der Exposition der Sema7aloxP/loxPTie2Cre+-Tiere mit demselben Modell fanden die Erfinder im Vergleich zu den Kontrollen signifikant kleinere Infarkte (14 i,j). Dieser Schutz spiegelte sich auch in einer reduzierten Anzahl von PNCs wider, während die Reduktion von Troponin I keine statistische Signifikanz erreichte (14 k,l). Im Gegensatz dazu blieb die Infarktgröße bei Sema7aloxP/loxPLysMCre-Mäusen im Vergleich zu den Kontrollen unverändert (14 m,n), ebenso wie die Troponin I Konzentration und die Anzahl der PNCs im Myokardgewebe (14 o,p). Dieser Ansatz zeigte, dass die Expression von Sema7a auf RBCs entscheidend für die Induktion der PNC-Bildung und der Verletzung des Myokardgewebes ist.
  • Sema7a interagiert mit dem Thrombozytenglykoprotein Ib
  • Die obigen Experimente haben gezeigt, dass Sema7a die Thrombozytenaktivierung und PNC-Bildung in der Umgebung des myokardialen IR verstärkt. Um zu testen, ob Sema7a direkt auf die Thrombozyten wirkt, haben die Erfinder zunächst dessen Auswirkungen auf die Thrombozytenfunktion in der Standardaggregometrie untersucht. Unerwarteterweise induzierte Sema7a bei der Konzentration von 1 µg/ml keine nachweisbare Thrombozytenaktivierung oder -aggregation. Dies wurde auch durch die durchflusszytometrische Analyse der Thrombozytenaktivierung bestätigt. Steigende Konzentrationen von Sema7a hatten keinen Einfluss auf die Integrin-αllbβ3-Aktivierung (JON/A-PE) oder die P-Selektin-Exposition unter statischen Bedingungen. In starkem Kontrast dazu wurde eine profunde prothrombotische Aktivität von Sema7a beobachtet, wenn die Thrombusbildung auf Kollagen im Fluss mit einem Vollblut-Perfusionssystem untersucht wurde. Bei einer mittleren bis hohen Scherrate (1000 s-1), die den arteriellen Blutfluss widerspiegelt, vergrößerte Sema7a deutlich sowohl die von Thrombozyten bedeckte Oberfläche als auch das Thrombusvolumen (16 a,b), und die gleiche Wirkung wurde bei einer niedrigen Scherrate (400 s-1, 17 a,b) beobachtet. Die Fliessabhängigkeit des prothrombotischen Sema7a-Effekts deutete auf eine mögliche Beteiligung des vWF-Rezeptors GPIb-IX an diesem Prozess hin, der besonders wichtig für die Thrombusbildung unter Bedingungen hoher Scherung ist. Um dies direkt zu testen, hemmten die Erfinder GPIb-IX durch Zugabe von Fab-Fragmenten des Antikörpers p0p/B, der die Liganden-Bindungsstelle auf der GPIb-Untereinheit des Rezeptorkomplexes vollständig blockiert. Unter diesen Bedingungen ging die thrombusfördernde Wirkung von Sema7a sowohl bei niedrigen als auch bei hohen Schergeschwindigkeiten vollständig verloren, was zeigt, dass sie GPIb-abhängig war (16 a,b). Dieses Ergebnis wurde auch bei Mäusen bestätigt, bei denen die Ektodomäne von GPlbα durch den menschlichen IL-4-Rezeptor (GPIb-II-4tg) ersetzt wurde (16 c,d), wobei Sema7a keine Zunahme der Oberflächenbedeckung oder des Thrombusvolumens im Vollblut-Perfusionssystem induzierte.
  • Um zu testen, ob die thrombo-inflammatorische Wirkung der Sema7a myokardialen RI-Schädigung auch von der Thrombozyten-GPIb abhängt, haben die Erfinder zunächst GP/b-IL-4tg-Tiere dem MIRI-Modell zugeführt. Auffallend war, dass diese Tiere im Vergleich zu den WT-Kontrollen eine deutlich reduzierte Infarktgröße aufwiesen, was sich auch in den Troponin I Messungen widerspiegelte. Darüber hinaus führte die Behandlung dieser mutierten Tiere mit Sema7a nicht zu einer Erhöhung des MIRI, was zeigt, dass diese pathogene Aktivität von Sema7a vollständig GPIb-abhängig war (16 e,f). Bei der Auswertung der Gewebeschnitte der AAR dieser Tiere fanden die Erfinder eine geringe Anzahl von PNCs innerhalb der myokardialen Gewebeschnitte (16 g,h). Um eine mögliche Interaktion von Sema7a mit GPIb zu testen, führten die Erfinder Coimmunpräzipitationsexperimente durch. In einem ersten Schritt haben die Erfinder Sema7a aus Blut- und Herzmuskelgewebeproben immunpräzipitiert und auf das Vorhandensein von GPIb geblottet. Tatsächlich coimmunpräzipitierte GPIb mit Sema7a im Blut und insbesondere der myokardialen AAR als Reaktion auf MIR. Die Erfinder haben dann diesen Ansatz mit der Immunpräzipitation von GPIb und dem Blotting für Sema7a umgekehrt. Auch hier stellten die Erfinder eine Interaktion von Sema7a mit GPIb im Blut und der AAR als Reaktion auf MIR fest (16 i,j).
  • Die Anti-Sema7a-Behandlung reduziert die PNC-Bildung und die myokardiale IR-Verletzung
  • Um zu prüfen, ob die Hemmung des endogenen Sema7a die MIRI beeinflusst, haben die Erfinder vor Beginn der Reperfusion einen funktionsblockierenden Anti-Sema7a-Antikörper oder eine IgG-Kontrolle (1µg/Maus) injiziert. Tatsächlich führte die Anti-Sema7a-Behandlung zu einer Verringerung der Infarktgröße und einer Verringerung von Troponin I im Vergleich zu den Tieren, denen eine IgG-Kontrolle injiziert wurde (18 a,b). Die histologischen Schnitte der AAR zeigten eine geringere Gewebeschädigung bei den anti-Sema7a-injizierten Tieren im Vergleich zu den IgG-Kontrolltieren, mit einer geringeren Anzahl von PNCs in den gefährdeten Gewebebereichen (18 c,d). Die Durchflusszytometrie zeigte eine erhöhte Anzahl CD42b-positiver und P-Selektin-positiver Neutrophiler im Blut der IgG-injizierten Tiere zu Beginn des Prozesses nach der IR, die bei den anti-Sem7a-injizierten Tieren nicht beobachtet wurde (18 e-g, 19). Darüber hinaus fanden die Erfinder eine signifikant reduzierte Anzahl von PNCs im Blut dieser anti-Sema7a-injizierten Tiere (18 h). Die Analyse der AAR ergab eine deutliche Zunahme der PNCs mit vollständig aktivierten Thrombozyten (erkennbar an hohen Signalen für GPIb, aktiviertes Integrin αllbβ3 und P-Selektin) zum späteren Zeitpunkt (120 min) bei den Tieren mit IgG-Kontrolle, die bei den Tieren mit Anti-Sema7a-Injektion praktisch nicht auftrat (18j-k, 19), und eine geringere Anzahl von PNCs innerhalb der AAR (18 I). Diese Daten zeigen, dass die PNC-Bildung nahteilige Auswirkungen auf die Schädigung des Myokardgewebes im experimentellen myokardialen IR hat und durch die Hemmung des endogenen Sema7a wirksam verhindert werden kann.
  • Diskussion
  • Die Myokardischämie, gefolgt von der Reperfusion, bleibt eines der bedeutendsten Gesundheitsprobleme weltweit. Eine Intervention zur Rekanalisation der verschlossenen Koronararterie ist ein entscheidender Teil der Ersttherapie dieser Erkrankung und verbessert das Gesamtergebnis des Patienten erheblich. Nach dem Verschluss ist die nachfolgende Reperfusionsschädigung des Myokards das Ergebnis einer Entzündungsreaktion, die einen großen Teil der Patienten mit MI betrifft und dann zu einer schweren myokardialen Dysfunktion führen kann. Die Erfinder konnten zeigen, dass das aus der Membran der roten Blutkörperchen freigesetzte neuronale Leitprotein Semaphorin 7a ein Mediator der entzündlichen Myokardschädigung ist. Die Erfinder liefern ferner Hinweise darauf, dass Sema7a mit dem Thrombozyten-GPIb interagiert und dadurch die Bildung von Plättchen-Neutrophilen-Komplexen und deren Translokation in das betroffene Myokard fördert und dadurch die Myokardverletzung verstärkt. Um die Rolle von Sema7a auf die Thrombozyten und die Wirkung von Sema7a auf MIRI zu veranschaulichen, haben die Erfinder in der 20 eine Skizze bereitgestellt. Die Ergebnisse zeigen, dass eine Strategie zur Beeinflussung der Sema7a-GPIb-Interaktion zu einer verringerten Herzschädigung und einem verbesserten Myokardergebnis nach MI führen kann und daher in Zukunft als therapeutische Strategie verfolgt werden sollte.
  • Fazit
  • Die Erfinder konnten aufgrund ihrer Erkenntnisse zu den molekularen Grundlagen der postischämischen Gewebeschädigung, insbesondere in Form des Reperfusionsschadens, erstmals einen Wirkstoff entwickeln, der eine zielgerichtete Prophylaxe und Therapie ermöglicht.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
  • Zitierte Patentliteratur
    • WO 2008/024300 [0012]
    • WO 2009/133984 [0012]
    • WO 2013/052631 [0012]
    • EP 3220447 [0012]
  • Zitierte Nicht-Patentliteratur
    • Kat. Nr. 261498, Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA [0054]

Claims (15)

  1. Inhibitor von Semaphorin 7A (SEMA7A) zur Verwendung bei der Behandlung und/oder Prophylaxe einer postischämischen Gewebeschädigung.
  2. Inhibitor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der postischämischen Gewebeschädigung um einen Reperfusionsschaden handelt.
  3. Inhibitor nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Reperfusionsschaden um einen myokardialen Reperfusionsschaden handelt.
  4. Inhibitor nach einem der vorherigen Ansprüche, der derart ausgestaltet ist, dass er die Wechselwirkung von SEMA7A mit der Thrombozytenoberfläche modifiziert.
  5. Inhibitor nach einem der vorherigen Ansprüche, der derart ausgestaltet ist, dass er die Wechselwirkung von SEMA7A mit GPIb modifiziert.
  6. Inhibitor nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei der Inhibitor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Antikörper, Antikörperfragment, löslicher SEMA7A-Rezeptor, Antisense-Nukleinsäure, siRNA, niedermolekulare Verbindung, und Kombinationen davon.
  7. Inhibitor nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Antikörper um einen funktionsinhibierenden Antikörper handelt.
  8. Pharmazeutische Zusammensetzung, die den Inhibitor nach einem der Ansprüche 1-7 sowie einen pharmazeutisch akzeptablen Träger aufweist.
  9. Verwendung eines Inhibitors von SEMA7A zur Behandlung und/oder Prophylaxe einer postischämischen Gewebeschädigung.
  10. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe einer postischämischen Gewebeschädigung, das die Formulierung eines Inhibitors von SEMA7A in einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst.
  11. Verfahren zur Behandlung und/oder Prophylaxe einer postischämischen Gewebeschädigung, das die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Inhibitors von SEMA7A in ein bedürftiges Säugetier umfasst.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Säugetier um einen Menschen handelt.
  13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Verabreichung des Inhibitors in einen Myokardinfarktpatienten oder einen myokardinfarktgefährdeten Patienten erfolgt.
  14. Verfahren nach einem der Ansprüche 11-13, dadurch gekennzeichnet, dass durch die Verabreichung des Inhibitors die Wechselwirkung von SEMA7A mit der Thrombozytenoberfläche modifiziert wird.
  15. Verfahren nach einem der Ansprüche 11-14, dadurch gekennzeichnet, dass durch die Verabreichung des Inhibitors die Wechselwirkung von SEMA7A mit GPIb modifiziert wird.
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