JP2002543142A - 虚血および再灌流組織の機能を改善するためのｇｌｐ−１を用いた代謝介入 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 虚血および再灌流組織の機能を改善する方法を提供する。 【解決手段】 治療を必要とするヒトに対し、グルカゴン様ペプチド−１用レセプターに結合する化合物を含む組成物の有効量を薬理学的担体と共に投与する方法およびその組成物。

Description

【発明の詳細な説明】

本願は、１９９８年１０月８日に出願された仮出願第６０／１０３，４９８
号の一部継続出願である。

【０００１】 （発明の技術分野） 本発明は、虚血および再灌流組織の機能を治療により改善するため、GLP-1を
用いた代謝介入に関する。

【０００２】 （発明の背景） 好気性器官組織の細胞障害が虚血の結果、生じることが良く知られており、その
場合の虚血は、自発的冠状動脈閉塞のような内因性であったり、医原性のもの、
例えば、心臓、冠状動脈バイパス手術などに伴う場合、あるいは移植手術、例えば
心臓又は肺、肝臓、腎臓、すい臓、胃腸などの器官に対する手術に伴う場合がある。
これら疾患を生じさせる虚血の程度および期間は、細胞の死および/又は可逆的
細胞機能不全の量に関係する。更に、この組織損傷の多くは実際に再灌流時（す
なわち、血流の継続時）および先に無酸素の組織が再酸素添加された際に発生す
る。再灌流障害は、特に心筋梗塞又は他の心筋治療処置、例えば冠状動脈バイパ
ス、他の心臓開口手術、器官移植などの後の再灌流障害の治療に関する医学の進歩
に促され、最近の研究の注目すべき課題となっている。

【０００３】 正常な好気的呼吸の副産物として、電子が、ミトコンドリア電子輸送チェーン
から日常的に失われる。このような電子は酸素分子と反応して反応性遊離ラジカ
ル超酸化物を発生させ、これが過酸化水素および鉄の存在下で他の反応工程を経
て異常に反応性で、毒性のヒドロキシルラジカルを生じさせる。代謝的に活性な
好気性組織は防御機構を備え、事前に、この毒性遊離ラジカルを劣化させるよう
働く。すなわち、このような保護機構がない場合には、上記反応性酸素種が細胞
小器官、酵素又はDNAと相互作用して、細胞を死滅させることになる。これらの
防御機構には、超酸化物を不均化する超酸化物不均化酵素（SOD）、過酸化水素
を分解するキャタラ-ゼ、および非特異的遊離ラジカル除去剤であるペプチドグ
ルタチオンが含まれる。 十分に判明してはいないが、代謝性組織の虚血およびその後の再灌流の結果、
複雑化した症状が発生する。虚血の初期において、細胞内抗酸化酵素活性が減少
し、これにはSOD、キャタラ-ゼおよびペプチドグルタチオンの活性も含まれる。
更に、キサンチンオキシダーゼ活性のレベルが虚血の際に管脈内皮組織に付随的
に増加する傾向を示す。酸素遊離ラジカルを生産する能力の増大（キサンチンオ
キシダーゼ活性の増大を介して）と、この酸素遊離ラジカルを除去する能力の減
少（SOD、キャタラ-ゼおよびペプチドグルタチオンの活性の減少を介して）との
組合せにより、虚血細胞が酸化バースト（突発）に対し著しく過敏となり、これ
ら細胞が後に血液、従って酸素で再灌流されたときに、損傷され易くなる。再灌流
の数秒ないし数分内に発生する酸化バーストは、可逆的又は非可逆的損傷を虚血-
再灌流器官マトリックスを構成する内皮細胞および他の細胞に与えることになる
。もし、その器官が心臓であるとすると、可逆的酸化損傷は、心筋停止を生じさ
せ、非可逆的損傷は心筋梗塞となる。この初期の酸化バーストに付随するものは
細胞膜への酸化損傷である。細胞膜における脂質の酸化は、後虚血領域に対する
好中球化学走性に大きな役割を生じさせるものと思われる。このように活性化さ
れた好中球は、管脈内皮に付着し、上記内皮細胞内にてキサンチンデヒドロゲナ
ーゼのキサンチンオキシダーゼへの変換を誘起し、内皮の一体性の損失を更に悪
化させる。活性化された好中球は管脈から心筋間質空間へ移行し、そこで炎症細
胞が筋細胞を直接、死滅させる。更に、虚血-再灌流の結果として、筋小胞体から
の正常カルシウム移動性の混乱が心筋停止と呼ばれる可逆性心筋機能不全を招く
。 虚血-再灌流の症状の結果は、可逆的又は非可逆的脳細胞障害、細胞の死、器
官機能効率の劣化を生じさせる。より具体的に述べると、心筋再灌流障害の場合
、心筋停止、不整脈、梗塞を含む結果を生じさせ、その結果、カリエスショック
、潜在的充血性心臓麻痺を生じさせる。

【０００４】 虚血無酸素の限られた期間およびそれに続く再灌流と関係する細胞損傷を逆説
的に述べると、細胞の損傷および死は酸素欠乏の期間から直接もたらされるだけ
でなく、虚血期間の間の酸素障害に非常に敏感になった組織の再酸素化の結果と
してもたらされるものである。再灌流損傷は還流直後の最初の酸化衝撃から始ま
り、同じ後虚血組織における炎症プロセスが発展する数時間に亘って悪化し続け
る。後無酸素細胞の酸化損傷に対する敏感性を減少させるための努力および更に
これらの同じ組織における炎症的応答を減少させる努力により、後無酸素再灌流
器官に対する可逆的および非可逆的損傷が減少されることが示されている。最初
の酸化衝撃障害および後の炎症的障害の双方を減少させる方法の組合せは再灌流
障害に対する相乗効果的保護を提供する。

【０００５】 MI患者と符合する虚血の治療に関し、現在採用されている一般的治療には、血
栓溶解物質、例えばストレプトキナーゼおよびｔ−PAおよび管脈成形術が使用さ
れる。米国特許No.4,976,959には再灌流および/又は経皮経腔冠状動脈形成術の
間において組織損傷を抑制するため、ｔ−PAおよびSODを投与することが記載さ
れている。このように、ますます多くの患者が、特に心臓病患者が再灌流障害お
よびその作用に曝されることになる。

【０００６】 心臓以外の器官に対する再灌流障害は機能の実質的な劣化として現われ、その
結果、器官の変性又は単に機能停止が生じることになる。更に移植された器官は
、可成りの再灌流障害がある場合は拒絶反応の割合が高くなる。 上述のように、再灌流障害についての正確な機構について明確には解明されて
いないが、種々の心臓疾患モデルについての研究から集積されたデータから、酸
素誘導遊離ラジカル（超酸化物アニオン（O₂）、ヒドロキシル遊離ラジカル（.O
H）およびH₂O₂を含む）の発生が再灌流に伴う酸素分子の再導入の結果としても
たらされ、組織の壊死に重要な役割を果たすことが示唆されている。これらの酸
素誘起遊離ラジカルの生産を減少させる薬剤（アロプリノール）又はこれらの物
質（例えば、超酸化物ジスムターゼ、キャタラ-ゼ、グルタチオンおよび銅錯体
）の劣化を増大するための薬剤は梗塞の大きさを制限し、心筋停止からの左心室
機能の回復を向上させることができると思われる。

【０００７】 特に急性心筋梗塞の間の治療として代謝介入の使用は、問題がないわけではな
いが、よく確立されている。グルコース-インシュリン-カリウム（GIK）注入（
代謝介入の第一次形）の急性MI後の使用について、これを支持する多くの実験的
および臨床上の証明がなされており、特に、スウェーデンDIGAMI試験の成功後に
おいてそのことが認められている（Malmberg,K, and DIGAMI Study Group（
1997）、Prospective randomized study of intensive insulin treatmen
t on long term survival after acute myocardial infarction in p
atients with diabetes mellitus． Brit．Med．J．314，1512-1515）。DIG
AMI試験端、糖尿病患者における急性MIに対するグルコース-インシュリン注入の
効能について強調しているが、この治療法を再灌流について使用することについ
ては提案も、又、実際の使用もなされていない。

【０００８】 従って、虚血および再灌流の組織全般、特に器官組織、更に限定されるもので
ないが心筋に対する悪影響を防止し、改善することに対する安全出、効果的な組
成物についての必要性が理解できるであろう。本発明の第1の目的は、この必要
性を満たすことである。 本発明の他の目的は、従来、利用可能な治療法で通常伴っていた副作用を生じ
させることなく、虚血又は再灌流障害を治療するための方法を提供することであ
る。 本発明の更に他の目的は、本発明の組成物の静脈投与するのに適した薬理学的
に許容できる担体組成物であって、好ましくない副作用を実質的に生じさせるこ
とがなく、更に抗原性又は免疫刺激特性に悪影響を与えることのない組成物を提
供である。 本発明の上記および他の目的および利益については、以下の記載および付記し
た特許請求の範囲から当業者にとってあきらかになるであろう。

【０００９】 （発明の概要） 虚血および／又は再灌流障害の治療を必要とするヒトに対して、好ましくは静
脈注射により、グルカゴン様ペプチド-１についてのレセプタに結合する化合物
を含む組成物を用いて治療するものである。従って、本発明は、そのような治療
のための方法および組成物に関する。

【００１０】 （発明の具体的説明） GLP-1はグルコース依存性向インシュリン性ホルモンであり、危険な低血糖症
を誘起することなく、周辺グルコース摂取を効果的に向上させる。更に、GLP-1
は、その向インシュリン作用とは独立して、グルカゴン分泌を著しく抑制し、そ
れにより、インシュリンで達成されるよりも、血漿遊離脂肪酸（FFA）レベルを
実質的に著しく減少させる。高いFFAレベルは心筋梗塞の間における主たる毒性
機構を暗示するものである。 我々は虚血-再灌流障害のための代謝治療としてGLP-1の概念を開発したもので
ある。この開発は、虚血-再灌流障害が日常的であり、潜在的に危険な事象であ
る２つの臨床状態があるという認識に基づくものである。つまり、急性MIについ
ての血栓溶解手法、および心臓手術における虚血性心臓麻痺に続く心臓再灌流で
ある。更に、最近の実験的および臨床データにより、虚血-再灌流障害の現象が
、再灌流なしの孤立した虚血の場合よりも、GIKを用いた代謝治療に特に応答を
示すこと判明された（Apstein，CS（1998） Glucose-insulin-potassium for
acute myocardial infarction．Remarkable results from ａ new pro
spective，randomized trial． Circulation98，2223-2226）。

【００１１】 MIと符合する急性虚血の治療において、過去10年において2つの最も重要な治
療上の前進があり、これは血栓溶解と、β-遮断である。しかし、この全体的成功
にも拘らず、血栓溶解についての或る研究においては、初期の過剰の死亡率が示
され、これが再灌流誘起障害および心筋停止に起因するものであった。この心筋
停止に横たわる機構は、複雑であるが、それが異常サルコレマCa²⁺ポンプおよび
サイトソルCa²⁺オーバロードにつながる細胞内アシドーシスに関係すると思われ
るということで一致しつつある。この最終的結果は心筋収縮機能障害であり、機
械的効率の悪化と、再灌流血管不整脈とにつながる。更に最近の研究で、この細
胞内アシドーシスが、逆に、グリコース分解と完全なグルコース酸化との間の不
均衡、つまり、TCAサイクルにおいて、グリコース分解の速度が、ピルビン酸塩
（グリコース分解の最終生産物）の酸化と結びついていないことによるものであ
ることが示された。この不釣合いは、ピルビン酸塩の乳酸塩への変換によるH⁺の
生産を生じさせる。この不均衡の最もあり得る原因は、大量の血漿遊離脂肪酸（
FFA）レベルの存在であり、これが優先的にミトコンドリアに入り込み、ピルビ
ン酸塩の酸化を抑制する。この機構は、以下の確立された考えにより説明するこ
とができる。つまり、FFAを注入された心臓は、グルコースを注入された心臓と
比較して再灌流段階での回復が小さい。本発明の治療法のベースの１つは、GLP-
1がインシュリンでの50％レベルのFFAの抑制率を超えて、90％もの高いFFA抑制
率を示すことにある。

【００１２】 このような考察は虚血-再灌流障害をグルカゴン様ペプチドで治療するという
我々の確信を高める物である。正常な灌流と、適当な酸素添加の間、心臓は好気性
代謝に依存し、FFAを好ましい燃料として使用することがよく知られている。こ
れとは対照的に、虚血（血量の減少）又は低酸素症（O₂）の間、脂肪酸のβ-酸
化が阻害され（厳密な好気性）、ATPの継続提供は、ますます嫌気性グリコース
分解に依存することになる。虚血期間において、グルコース-インシュリンは有
益である。なぜならば、それがグルコース摂取を向上させ、グリコース分解を刺
激し、それにより基本的膜機能の維持のための、特にイオン輸送のためのATPが
提供される。更に、グルコース-インシュリンが脂肪質組織の脂肪分解を抑制し
、それにより血漿FFAレベルを減少させ、FFAの心筋への摂取を減少させる。FFA
の高いレベルは、膜に対しての直接的洗浄作用およびｃAMPの増大と、Ca²⁺ポン
プを抑制するアシルカミチンの蓄積により、虚血心筋に対し毒性を示す。その作
用により、イオン交換の混乱、サイトソルCa²⁺オーバロードおよびその結果とし
ての収縮性不全および不整脈を生じさせる。

【００１３】 再灌流再灌流期間において、グルコース-インシュリンは有益である。なぜな
らば、上述のように、この治療が心筋停止を生じさせる代謝不均衡を軽減させる
からである。これは、PDHの直接的刺激、それによるピルビン酸塩の酸化により
、更に間接的には、FFAの摂取の減少により達成され、それにより、ピルビン酸
塩のFFA酸化に対する割合が改善される。 上記説明から明らかなように、グルコース-インシュリンの二重の作用（すな
わち、グルコース摂取と代謝の向上と、FFAレベルの減少）は、再灌流において
実質的な治療能力を有する。実質的に無血流の虚血の間に糖分解製品、即ち乳酸
塩が不適当な“ウォシュアウト”のため蓄積すると言うことに関心が示されてい
る。乳酸塩の蓄積は高い細胞内プロトン濃度につながり、NADHを再酸化すること
ができない。即ち、高い［H⁺］とNADH/NAD⁺比が糖分解を抑制する。このような
状況下で、グルコースは細胞にとって毒性となる。なぜならば、ATPは、ブラク
トース-１，6-ビスホスフェートの生産で消費され、高い［H⁺］は筋細胞壊死を
悪化させる（Neely，JR，およびMorgan,HE(1974) Relationship between car
bohydrate and lipid metabolism and the energy balance of heart
muscle．Ann．Rev．Physiol．36，413-459）。しかし、これらの関心は実験的
および臨床データの重みで支持されておらず、グルコース-インシュリンが有益
であることを示唆している。理論的に拘束されるものでないが、この現象は以下
のように説明し得る。すなわち、ヒトにおいて、急性自発的虚血は無血流虚血の
状態ではなく、低血流虚血の領域を表しており、その場合、残留灌流が基材移送
および乳酸塩ウォシュアウトを行うのに適当である。この認識は、虚血-再灌流
における代謝治療の使用についての強力な生理学的理論を提供するものである。 現代の心臓手術は、それが心臓弁置換又は冠状動脈バイパスグラフティング（
CABG）に関するか否かを問わず、通常、低体温心臓麻痺停止、大動脈締付け、心
肺バイパスが手術の間に必要となる。従って、通常の心臓手術では、選択的総括
的虚血の状態を誘導し、ついで再灌流を行う。これにより、心臓が心筋虚血-再
灌流に特有の全ての合併症および障害に曝されることになる。従って、心臓手術
の間、その後における心筋障害の防止は多くの注目を集めることになる。選択的
総括的虚血およびその後の再灌流は、再管脈形成化を伴う急性MIの間に遭遇する
虚血-再灌流と明らかに類似するもので、前述の病態生理学的原則の多くが心臓
手術に適用される。しかし、外科心臓麻痺虚血-再灌流と、MI関連虚血-再灌流と
の間に注目すべき差異がある。手術の間において、心臓は停止され（心臓麻痺）
、ついで心筋保全を最適化するための冷(低温)溶液で灌流される。手術の完了後
、心臓が再活性化され、体温で酸素添加された血液で再灌流される。これにより
、低体温虚血および正常体温再灌流の一連の経過が形成され、これにより、H⁺と
乳酸塩の高い組織レベルの蓄積を防止することができる。更に、急性MIとは異な
り、低温心臓麻痺は総括的な無血流虚血の状態と、それに続く総括的再灌流とに
表される。 本出願人による先の出願(出願番号:60/103，498)(本願の親出願)では、グルコ
ース-インシュリン灌流の欠点と、これに代わるGLP-1灌流の利点(インシュリン
よりも安全)が言及された。要約すると、GIK灌流は、高血糖症と低血糖症の双方
において有意な危険性があり、更に高度の技術、人材が要求される。また、低血糖
症の危険性も明らかである。

【００１４】 対照的に、GLP-1灌流では、これらの危険性はない。グルカゴン様ペプチド-１
（7-36）アミド（GLP-1）は、天然の内臓から得られる内インシュリン性ペプチ
ドであり、いわゆるインクレチン作用の主な成分である。GLP-1はすい臓内分泌
細胞で主たる作用を奏し、そこで（１）インシュリン発現を規制し、グルコース
依存的な方式でβ-細胞からの分泌も規制する；（２）ソマトスタチンの分泌を
刺激する；（３）α細胞からのグルカゴンの分泌を抑制する。形式的に解決され
ていないが、強力なグルカゴンスタティック作用が以下の１つ又は全てから生じ
るものと推定されている。すなわち、(1)刺激によるα細胞におけるGLP-1レセプ
ターの直接的抑制（ほとんどないと思われるが）；（２）ソマトスタチンの島内
解放によるグルカゴン分泌のパラクリン(paracrine)抑制； （３）インシュリン
の島内解放によるパラクリン抑制である。細胞機構がどうであれ、GLP-1はイン
シュリン分泌とグルカゴン解放抑制を同時に行うという特異な能力を有する。イ
ンシュリンの治療灌流もグルカゴン解放抑制を行うが、その作用は、直接、グル
カゴン分泌の島内パラクリン抑制を行うGLP-1ほど強力でない。

【００１５】 GLP-1の二重の能力、すなわち、インシュリン解放を強力に刺激し、グルカゴ
ン解放を抑制する能力は、その内インシュリン性作用の厳密なグルコース依存性
と共に、虚血-再灌流の管理において、特異な治療能力を有するものとさせる。第
1に、GLP-1は内因性インシュリンの分泌を強力に刺激し、それにより虚血-再灌流
の代謝治療においてインシュリン灌流に寄与するのに有利な作用を全て達成させ
るために使用することができる。高投与量GIK灌流では、一般に25-33％のグルコ
ースと、50-100Uインシュリン／Ｌを含有するが、その量は、高血糖症自体に対し、
治療効果を達成するために必要な量について、インシュリンの安全な高投与のた
めの代謝環境を与えることのみとの関係において、 はっきりしてない。適当な血糖値レベルは、基材輸送を可能にするために必要と
思われるが、これは高血糖症のために必要であることを必ずしも意味するもので
なく、グルコース摂取以外にも重要な作用をインシュリンが奏するという事実を
考慮すべきである。従って、治療のためのGLP-1灌流は、僅かの(例えば、５％)のグ
ルコース共灌流でも、血糖を生理学的レベルより若干上のレベルに維持させ、イ
ンシュリンの解放を促すことができる。グルコース端、安全対策としては必要は
ない。なぜならば、3．5mM未満の血液レベルでも、GLP-1のインシュリン-刺激活
性を排除させ、低血糖症の危険性に対し完全に保護をなしうるからである。

【００１６】 第2に、GLP-1は強力なカルカゴスティック作用を奏する。これはその内インシュ
リン性作用とともに、FFAの強力な抑制作用につながるものである。グルコース-
インシュリン灌流の主な利益の１つは循環FFAレベルの減少と、FFA摂取の抑制で
ある。FFAと、その代謝物は虚血性心筋梗塞および再灌流期間において直接的毒
性作用を奏し、心筋停止を生じさせる。従って、FFAレベルの減少が虚血-再灌流
における代謝介入の主な治療目標である。グルカゴンが脂肪組織の分解およびFFA
生産に対し、強力な刺激を与えるから、GLP-1媒介グルカゴン抑制は、更に循環FFA
のインシュリン誘起的減少を促進させる。即ち、GLP-1治療は、グルコース-インシ
ュリン灌流よりも、この点で優れている。事実、ボランテアを用いた予備実験で
は、静脈内GLP-1灌流は、耐性血漿FFAレベルを、対照のものの10％未満まで減少
させることができた。 GLP-1は殆どの患者に対し有効であり、グルコースの同時投与を要しない。しか
し、或る場合に置いては、グルコース/GLP-1の投与が適当なインシュリン応答を
促す上で求められる。更に、グルコースをGLP-1と共に投与した場合、細胞内コンパ
ートメントでのカリウムの過剰なシフトを修正するためにカリウムを投与する必
要がある場合がある。 GLP-1およびその生物学的活性類似体に加え、ラジカル除去剤、例えばグルタチ
オン、メラトニン、ビタミンE、超酸化物ジスミターゼ(dismutage)を、治療に含
めてもよい。このような組合せにおいては、再灌流損傷の危険性をより少なくす
ることができる。

【００１７】 ここで、“GLP-1”、又はグルカゴン様ペプチド(擬似体を含む)の用語は、本
発明において、GLP-1擬似体およびその生物学的活性類似体をも包含するもので
あり、グルカゴン様ペプチド、関連するペプチド、グルカゴン様ペプチド-１の類
似体であって、グルカゴン様ペプチド-１（GLP-1）レセプターたんぱく質、例え
ばGLP-1（7-36）アミドレセプターたんぱく質に結合し得るグルカゴン様ペプチ
ド、これに関連するペプチド、およびグルカゴン様ペプチド-１の類似体を含むも
のであってもよく、GLP-1の天然の生物学的活性型であるGLP-1（7-36）アミドと
同様のインシュリン分泌に対する生物学的作用を奏する（Goke，BおよびByrn、M
、Diabetic Medicine． 1996、13:854-860参照）。GLP-1レセプターは例えば
インシュリン生産性すい臓β-細胞に見られる細胞表面たんぱく質である。グル
カゴン様ペプチドおよび類似体はインシュリノトロピー活性を有し、GLP-1レセ
プター分子の作動物質、即ち、活性化させる種を含み、更に、とりわけ、インシュ
リン生産性β-細胞に対し第2のメッセンジャー活性を有する。

【００１８】 レセプターを介して活性を示すグルカゴン様ペプチドの作動物質については、
EP0708179A2; Hjorth,S.A.ら，J.Biol.Chem. 269（48）:30121-30124(1994);
Siegel,E.G.ら、Amer.Diabetes Assoc.57th Scientific Sessions，Boston
(1997)； Hareter,A.ら、Amer.Diabetes Assoc.57th Scientific Sessions
，Boston(1997)； Adelhorst,K.ら，J.Biol.Chem. 269（9）:6275-6278(1
994); Deacon C.F.ら、16th International Diabetes Federation Congr
ess Abstracts， Diabetologia Supplement (1997)； Irwin,D．M.ら，Proc
.Natl.Acad.Sci．USA．94:7915-7920(1997); Mosjov、S．Int．J．Peptide Pr
otein ;Res．40:333-343(1992)に記載されている。グルカゴン様分子には、GLP
-1の作動物質を表現するポリヌクレオチド、即ち、GLP-1レセプター分子のアクチ
ベータおよびその二次的メッセンジャー活性（特に、インシュリン生産性β-細
胞に見られる）が含まれる。β-細胞の作動物質でもあるGLP-1擬似体はGLP-1レセ
プターを特に活性化させるようにした化学物質が含まれる。 グルカゴン様ペプチド-１作動物質も公知であり（例えば、Watanabe,Y.ら，J
．Endocrinol．140(1):45-52(1994)）、イクスエンジン（９−３９）アミン（イ
クスエンジン類似体で、GLP-1レセプターの潜在的作動物質（WO97/46584参照）
）を含む。最近の文献には、Black Widow GLP-1類似体およびSer^２GLP-1が開
示されている（G.G.Holz,J.F.Hakner、Comparative Biochemistry and Physi
ology、Part B 121（1998）177-184およびRitzel、ら、A Synthetic glucag
on-like peptide-1 analog with improved plasma stability、J．Endocri
nol 1998 Oct;159(1):93-102参照）．

【００１９】 他の例として、化学的に合成されたグルカゴン様ペプチドおよび任意のポリペプ
チド又はそのフラグメント（これらは実質的に異種同形）を含むことができる。
核酸およびアミノ酸配列の双方を対象とする“実質的に異種同形”とは，例えば
変異体配列などの特定の対象配列が、参照配列から1又はそれ以上の置換物、削
除，追加などにより変化するが、その最終的作用は参照配列と、対象配列との間
に悪影響の機能的非類似性を何ら生じさせないものを意味する。本発明の目的に
おいて、50％以上の異種同形、好ましくは90％以上の異種同形、血漿グルコース
レベルに対するβ-細胞応答の向上に関し同等の生物学的活性，および同等の発
現特性を有する配列は実質的に異種同形であると解される。異種同形を判断する
目的において、マチュア配列の先端切断（truncation）は無視されるべきである
。異種同形の程度の低く、同程度の生物学的活性および等価の発現特性を有する
配列は等価と解される。

【００２０】 哺乳類GLPペプチドおよびグルカゴンは同一の遺伝子でエンコードされる。回腸
において，表現型はGLPペプチドホルモンの２つの主分類、GLP-１およびGLP-２
に処理することができる。４つのGLP-1レセプター関連ペプチドが知られており
、これらは表現型ペプチドから処理される。すなわち、GLP-１(１-３７)は配列
：His Asp Glu Phe Glu Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser
Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe
Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Ary Gly（SEQ．ID NO：１）を有する。
GLP-１(１-３７)は翻訳後処理によりアミド化され、GLP-１(１-３６) （NH_２）
を生産し、これは配列：His Asp Glu Phe Glu Arg His Ala Glu Gly
Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gin Ala
Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg（NH_２）（SEQ
．ID NO：２）を有するか、あるいは酵素処理によりGLP-１(７-３７)を生産し
、これは配列： His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser
Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu
Val Lys Gly Arg Gly（SEQ．ID NO：３）を有する。GLP-１(７-３７)もア
ミド化され、GLP-１(７-３６)アミドを生産し、これはGLP-１分子の天然型であ
り、配列： His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser T
yr Leu Glu Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val
Lys Gly Ary（NH_２）（SEQ．ID NO：４）を有する。

【００２１】 腸L細胞はGLP-１(７-３７)（SEQ．ID NO：３）およびGLP-１(７-３６)（NH_２ ）（SEQ．ID NO：４）を1対５の割合で分泌する。GLP-１のこれらのトランケー
テッド型は、そのままで短い半分の寿命、すなわち10分未満の寿命を有するが、
アミノジペプチダーゼIVにより、不活性化され、配列： Glu Gly Thr Phe T
hr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu
Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Ary Gly（SEQ．ID NO：５）；
および配列： Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu
Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys
Gly Arg（NH_２）（SEQ．ID NO：６）をそれぞれ生産する。ペプチド：Glu Gly
Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala
Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly（SEQ．ID
NO：５）；およびGlu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr
Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val
Lys Gly Arg（NH_２）（SEQ．ID NO：６）は肝臓グルコース生産に影響を与え
るものと思われるが、すい臓からのインシュリンの生産又は開放を刺激しない。

【００２２】 アメリカドクトカゲの毒液中には6個のペプチドがあり、これらはGLP-１に対
し異種同形である。これらのものの配列が表１にてGLP-１のものと比較されてい
る。

【００２３】 表 １ ａ．ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＮＨ_２ ｂ．ＨＳＤＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳ
ＧＡＰＰＰＳＮＨ_２ ｃ． ＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰ
ＰＳＳＮＨ_２ ｄ．ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳ
ＧＡＰＰＰＳＮＨ_２ ｅ．ＨＳＤＡＴＦＴＡＥＹＳＫＬＬＡＫＬＡＬＱＫＹＬＥＳＩＬＧＳＳＴＳＰ
ＲＰＰＳＳ ｆ．ＨＳＤＡＴＦＴＡＥＹＳＫＬＬＡＫＬＡＬＱＫＹＬＥＳＩＬＧＳＳＴＳＰ
ＲＰＰＳ ｇ．ＨＳＤＡＩＦＴＥＥＹＳＫＬＬＡＫＬＡＬＱＫＹＬＡＳＩＬＧＳＲＴＳＰ
ＰＰＮＨ_２ ｈ．ＨＳＤＡＩＦＴＱＱＹＳＫＬＬＡＫＬＡＬＱＫＹＬＡＳＩＬＧＳＲＴＳＰ
ＰＰＮＨ_２ ａ＝ＧＬＰ−１（ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ：４） ｂ＝Exendin 3（ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ：７） ｃ＝Exendin ４（９−３９（ＮＨ_２（ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ：８） ｄ＝Exendin ４（ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ：９） ｅ＝Helospectin Ｉ（ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ：１０） ｆ＝Helospectin II（ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ：１１） ｇ＝Helodermin（ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ：１２） ｈ＝Ｑ^８Ｑ^９Helodermin（ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ：１３）

【００２４】 表1に記載した主な異種同形体は、ｂおよびｇから得られるペプチドｃおよびhで
ある。天然で発生するこれら6個のペプチド（ａ，ｂ，ｄ，ｅ，ｆ，ｇ）の全て
は、位置1、7、11、18で異種同形である。ＧＬＰ−１およびExendin 3，4（ａ
，ｂ，ｄ）は、更に位置４，５，６，８，９，１５，２２，２３，２５，２６，
２９で異種同形である。位置２において、Ａ，ＳおよびＧは構造的に類似してい
る。位置３において、残基ＤおよびＥ(AspおよびGlu)は構造的に類似している。
位置22および23において、Ｆ(Phe)およびI(Ile)はそれぞれ、構造的にＹ(Tyr)お
よびＬ(Leu)に類似している。同様に、位置２６において、ＬおよびＩは構造的に
等価である。 すなわち、ＧＬＰ−１の30個の残基のうち、イクスエンジン（Exendin）３およ
び４は15個の位置で同一であり、更に５つの位置において等価である。ラジカル
構造変化が明らかな唯一の位置は残基１６，１７，１９，２１，２４，２７，２
８，３０の位置である。イクスエンジンは更に9個の余分の残基をカルボキシル
基末端に有する。

【００２５】 ＧＬＰ−１様ペプチドはソリッドステート化学的ペプチド合成により作成する
ことができる。ＧＬＰ−１も、例えばSambrookおよびManiaitisに記載されてい
る標準的手法を用いた従来の組換え技術により作成することができる。ここで用
いられる“組換え”とは、GLP-1およびその生物学的活性類似体のための発現型
遺伝子を含むように遺伝子的に変性された組換え型(例えば、微生物又は哺乳類の
)発現システムからたんぱく質が得られるということを意味している。 ＧＬＰ−１様ペプチドは、組換え細胞培養基から回収され、精製される。その
際に用いられる方法は、必ずしも限定されないが、硫酸アンモニウム又はエタノ
ールによる析出、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィ、ホスホ
セルロース・クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、アッフィニ
ティークロマトグラフィ、ヒドロキシルアパタイト・クロマトグラフィ、レクチ
ン・クロマトグラフィなどを用いることができる。高性能液体クロマトグラフィ
(HPLC)は最終の精製工程で使用することができる。

【００２６】 本発明のポリペプチドは天然の精製製品、化学的合成手法の製品、あるいは原
核生物又は真核生物宿主から組換え技法で生産された製品(例えば、培地又はin
vivoにて、バクテリア、酵母、植物、昆虫、哺乳類の細胞を用いて)などのい
ずれであってもよい。組換え技法で使用される宿主によるが、本発明のポリペプ
チドは一般にグリコシル化されないが、グリコシル化されたものであってもよい
。 ＧＬＰ−１活性は標準的方法、一般にレセプター結合活性スクリーニング法に
より判定され、これは表面にＧＬＰ−１レセプターを発現する適当な細胞、例え
ばRINmSF細胞又はINS-1細胞などのインシュリノーマ細胞ラインを提供すること
が含まれる(Mosjov、S．(1992);およびEP0708170A2参照)。ラジオイムノアッセイ
法を用いたトレーサーのメンブラン（膜）に対する特異的結合を測定することに
加えて、cAMP活性又はグルコース依存性インシュリン生産も測定される。1つの
方法として、本発明のレセプターを符号化するポリヌクレオチドを使用して細胞
をトランスフェクトし、それによりＧＬＰ−１レセプターたんぱく質を発現させ
る。このようにして、これらの方法を使用し、このような細胞をスクリーニング
すべき化合物と接触させることによりレセプター作動物質のスクリーニングを行
い、これらの化合物が信号を発生するか否か、すなわち、レセプターを活性化す
るか否かを判定する。

【００２７】 ポリクローンおよびモノクローン抗体を利用して、ここに記載の方法に使用す
るＧＬＰ−１様ペプチドを検出し、識別することができる。ABGA1178のような抗
体は、完全な継ぎ合わせのないＧＬＰ−１（1-37）又はN-末端トランケーテッド
ＧＬＰ−１（7-37）又は（7-3６）アミドを検出する。他の抗体は先駆体分子のC
-末端の先端にて検知し、生物学的活性トランケーテッドペプチド、すなわち、
ＧＬＰ−１（7-37）又は（7-3６）アミドの量を減法により計算することを可能
にする（Orskovら．Diabetes、1993、42:658-661; Orskovら．J．Clin．Invest
．1991、87:415-423）。 他のスクリーニング法としては、GLP-1レセプターを発現する細胞、例えばト
ランスフェクトされたCHO細胞を、レセプター活性化により生じた細胞外ｐH又は
イオン変化を測定するシステムにおいて使用する方法がある。例えば、潜在的作
動体をGLP-1レセプターを発現する細胞と接触させ、第2のメッセンジャー応答、
例えば信号変換又はイオン又はｐH変化を測定し、潜在的作動物質が有効か否か
を判定する。

【００２８】 本発明のグルカゴン様ペプチド-１レセプター結合たんぱく質を適当な薬剤担
体との組合せで用いることができる。この組成物はポリペプチドの治療有効量と
、薬理学的に許容し得る担体又は賦形剤とを具備してなる。この場合の担体とし
て、限定的ではないが、塩水、緩衝化塩水、デキストロース、水、グリセロール
、エタノール、ラクトース、ホスフェート、マンニトール、アルギニン、トレハ
ロース、これらの組合せを用いることができる。なお、調合は投与形態に適合さ
せて作成することができ、それについては当業者にとって容易に判断することが
できよう。GLP-1ペプチドを、ペプチドのin vivoにおける半寿命を向上させる公
知の薬剤との組合せで使用し、ペプチドの生物学的活性を向上又は延長させても
よい。例えば、投与前に、分子又は化学的分画を共有結合により、本発明の組成物
と結合させることができる。その他、寿命向上剤を上記組成物と同時に投与して
もよい。更に、寿命向上剤にGLP-1様ペプチドの酵素分解を抑制する分子をふくめ
、これをGLP-1ペプチド組成物と同時又は後に投与してもよい。このような分子
は、例えば経口又は注射により投与することができる。

【００２９】 GLP-1又はその生物学的活性類似体を上記の担体システムと共に投与された患
者は特に、決められた症状の前、又は最初の4時間以内に投与された患者は、不整脈
が少なく、組織の損傷も少なく、副作用もなく不快感に曝されることもなかった。 この事実から、GLP-1の注入は心筋灌流に著しい治療効果を奏することが予想さ
れる。GLP-1はI.V.、皮下注入、静脈による連続的注入、すなわち（I.V.）では、0
．1pmol/kg/分ないし10pmol/kg/分、皮下注入（ｓ.ｃ.）では、0．1pmol/kg/分
ないし75pmol/kg/分であり、単一注射（ボーラス）の場合、I.V.では、0．005nm
ol/kg/分ないし20nmol/kg/分、ｓ.ｃ.では、0．1nmol/kg/分ないし100nmol/kg/
分で投与することができる。

【００３０】 GLP-1注入を、必要に応じて、グルコース（５％）と同時に行い、血糖値を５ｍM
未満に維持させることができる(有効なインシュリン分泌)。同様に、カリウム（K ^＋ ）も、膜Na^＋／Ｋ^＋ATPaseの活性がＫ^＋の間質細胞へのシフトにつながる程度
を考慮して投与することができる。 GLP-1による治療は、虚血後にできるだけ早い段階で、例えば急性虚血の場合は
家庭でも、救急車においても行うことが好ましい。これは再灌流の前に行い、その
後、継続する。心臓手術の場合、GLP-1による治療を手術の12-24時間前、麻酔の開始
から手術の間にかけて、動脈を締付けて閉じるまで行う。更に、動脈を開いてから
、少なくとも72時間、更に継続する。上述のように遊離ラジカル除去剤の投与は再
灌流回復を促す。 上記実施例から明らかなように、本発明によれば、上記目的の全てを達成するこ
とができる。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年４月２５日（２００１．４．２５）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 47/06 Ａ６１Ｋ 47/10 47/10 47/18 47/18 47/36 47/36 Ａ６１Ｐ 9/10 Ａ６１Ｐ 9/10 39/06 39/06 Ａ６１Ｋ 37/28 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 エイラーズ，マリオ，アール．，ダブリュ ー． アメリカ合衆国 ネブラスカ州 68524， リンカーン，エヌ．ダブリュー． フォー ティーシックスス ストリート 3820 Ｆターム(参考） 4C076 AA11 AA72 BB01 BB11 BB21 BB31 CC11 DD22Z DD26Z DD37A DD38A DD51A DD67A EE30A FF02 4C084 AA02 DB35 MA17 MA32 MA63 MA66 NA14 ZA361 ZC021

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 虚血期間に続く血流再灌流によりもたらされる器官組織障害
   を改善する方法であって、治療を必要とするヒトに対し、グルカゴン様ペプチド
   −１用レセプターに結合する化合物を含む組成物の有効量を薬理学的担体と共に
   投与することを特徴とする方法。
2. 【請求項２】 該グルカゴン様ペプチド−１がGLP−１又はその生物学的活
   性類似体である請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 該薬理学的担体が、塩水、緩衝塩水、デキストロース、水、
   グリセロース、エタノール、ラクト−ス、ホスフェート、マンニトール、アルギニ
   ン、トレホロース又はこれらの組合せから選ばれるものである請求項１記載の方
   法。
4. 【請求項４】 治療を必要とするヒトへの投与量が静脈内投与で０．１ｐｍ
   ｏｌ／ｋｇ／分ないし１０ｐｍｏｌ／ｋｇ／分の範囲である請求項1記載の方法
   。
5. 【請求項５】 グルコースを同時に投与する請求項４記載の方法。
6. 【請求項６】 カリウムを同時に投与する請求項５記載の方法。
7. 【請求項７】 遊離ラジカル除去剤を同時に投与する請求項４記載の方法。
8. 【請求項８】 虚血の発生から4時間以内に投与を開始する請求項１記載の
   方法。
9. 【請求項９】 虚血の発生から4時間以内に投与を開始すると共に、その後、
   投与を継続する請求項８記載の方法。
10. 【請求項１０】 投与が静脈投与によるものである請求項１記載の方法。
11. 【請求項１１】 投与を皮下注射、マイクロ圧注射、深肺吹送法、外部又は
    埋め込みポンプ、デポー注射、他の持効性機構、経口、パッチ（貼布）、頬、その
    他の経皮、経膜機構により行う請求項1記載の方法。
12. 【請求項１２】 器官組織が心筋層である請求項１記載の方法。
13. 【請求項１３】 症状の発生を感知したとき、直ちに投与を開始する請求項
    ８記載の方法。
14. 【請求項１４】 虚血および血流再灌流組織の機能を改善するため、GLP-1
    により代謝介入する方法であって、治療を必要とするヒトに対し、GLP-1を含む
    組成物の有効量を薬理学的担体と共に投与することを特徴とする方法。
15. 【請求項１５】 該グルカゴン様ペプチド−１がGLP−１又はその生物学的
    活性類似体である請求項１４記載の方法。
16. 【請求項１６】 該薬理学的担体が、塩水、緩衝塩水、デキストロース、水
    、グリセロース、エタノール、ラクト−ス、ホスフェート、マンニトール、アルギ
    ニン、トレホロース又はこれらの組合せから選ばれるものである請求項１４記載
    の方法。
17. 【請求項１７】 治療を必要とするヒトへの投与量が０．１ｐｍｏｌ／ｋｇ
    ／分ないし１０ｐｍｏｌ／ｋｇ／分の範囲である請求項1４記載の方法。
18. 【請求項１８】 グルコースを同時に投与する請求項１７記載の方法。
19. 【請求項１９】 虚血の発生から4時間以内に投与を開始する請求項１４記
    載の方法。
20. 【請求項２０】 虚血の発生から4時間以内に投与を開始すると共に、その
    後、投与を継続する請求項１９記載の方法。
21. 【請求項２１】 代謝介入による組織損傷の改善の必要が、心臓外科手術、
    器官移植、外傷手足切断および再接合から選択される外科手術による医学的処置
    から生じたものである請求項1４記載の方法。
22. 【請求項２２】 医学的処置が虚血性再灌流を含み、これが内臓梗塞および
    心筋梗塞を同時に伴うものである請求項1４記載の方法。
23. 【請求項２３】 虚血および再灌流された組織の機能を、GLP-1により代謝
    介入するのに用いられる組成物であって、有効量のGLP-1と、薬理学的担体との
    組合せを含有してなることを特徴とする組成物。