KR20210088745A - 항-her2 항체-약물 접합체 - Google Patents

항-her2 항체-약물 접합체 Download PDF

Info

Publication number
KR20210088745A
KR20210088745A KR1020217021044A KR20217021044A KR20210088745A KR 20210088745 A KR20210088745 A KR 20210088745A KR 1020217021044 A KR1020217021044 A KR 1020217021044A KR 20217021044 A KR20217021044 A KR 20217021044A KR 20210088745 A KR20210088745 A KR 20210088745A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antibody
compound
drug
her2
ggfg
Prior art date
Application number
KR1020217021044A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102314913B1 (ko
Inventor
히로유키 나이토
유스케 오기타니
다케시 마스다
다카시 나카다
마사오 요시다
신지 아시다
고지 모리타
히데키 미야자키
유지 가스야
이치로 하야카와
유키 아베
Original Assignee
다이이찌 산쿄 가부시키가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=53756672&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR20210088745(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 filed Critical 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤
Priority to KR1020217032820A priority Critical patent/KR102362920B1/ko
Publication of KR20210088745A publication Critical patent/KR20210088745A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102314913B1 publication Critical patent/KR102314913B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4738—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/4745—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems condensed with ring systems having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. phenantrolines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68037—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a camptothecin [CPT] or derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6855—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from breast cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6857—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from lung cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6859—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from liver or pancreas cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6869—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from a cell of the reproductive system: ovaria, uterus, testes, prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D491/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00
    • C07D491/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D491/04—Ortho-condensed systems
    • C07D491/044—Ortho-condensed systems with only one oxygen atom as ring hetero atom in the oxygen-containing ring
    • C07D491/052—Ortho-condensed systems with only one oxygen atom as ring hetero atom in the oxygen-containing ring the oxygen-containing ring being six-membered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D491/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00
    • C07D491/22—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00 in which the condensed system contains four or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3015—Breast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3023—Lung
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/303—Liver or Pancreas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3046—Stomach, Intestines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation

Abstract

항종양 효과와 안전성이 우수하며 또한 우수한 치료 효과를 갖는 항종양 약물로서, 하기 식 (1) 로 나타내는 항종양 화합물과 항-HER2 항체를 식: -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- 로 나타내는 구조의 링커를 통해 연결시킨 것을 특징으로 하는 항체-약물 접합체 (여기서, 항-HER2 항체는 L1 의 말단에서 연결되고, 항종양 화합물은 항종양 화합물에서의 위치 1 에 위치한 아미노기의 질소 원자가 연결 위치로서 역할하는 -(CH2)n2-C(=O)- 부분에서 카르보닐기에 연결됨) 를 제공한다.

Description

항-HER2 항체-약물 접합체 {ANTI-HER2 ANTIBODY-DRUG CONJUGATE}
본 발명은, 항-HER2 항체와 항종양 약물을 링커 구조 부분을 통해 접합시킨, 항종양 약물로서 유용한 항체-약물 접합체에 관한 것이다.
암 세포 표면에서 발현되고 또한 세포에 내재화할 수 있는 항원에 대한 항체에 세포독성을 갖는 약물을 접합시킨 항체-약물 접합체 (ADC) 는, 따라서 암 세포에 약물을 선택적으로 전달할 수 있으며, 그에 따라 암 세포 내에 약물을 축적시키고 암 세포를 사멸시키는 것이 예상된다 (비특허문헌 1~3 참조). ADC 로서, 항-CD33 항체에 칼리키아미신을 접합시킨 마일로타그 (Mylotarg) (등록상표; 겜투주마브 오조가미신 (Gemtuzumab ozogamicin)) 가 급성 골수성 백혈병의 치료제로서 인가되어 있다. 또한, 항-CD30 항체에 오리스타틴 E 를 접합시킨 애드세트리스 (Adcetris) (등록상표; 브랜툭시마브 베도틴 (Brentuximab vedotin)) 가 호지킨 림프종과 미분화 대세포 림프종의 치료제로서 최근 인가되었다 (비특허문헌 4 참조). 지금까지 인가된 ADC 에 함유된 약물은 DNA 또는 튜불린을 표적으로 하고 있다.
항종양제와 관련하여, 토포이소머라아제 I 를 저해하여 항종양 효과를 발현하는 저분자량 화합물인 캄토테신 유도체가 알려져 있다. 그 중, 하기 식:
[식 1]
Figure pat00001
으로 나타내는 항종양 화합물 (엑사테칸, 화학명: (1S,9S)-1-아미노-9-에틸-5-플루오로-2,3-디히드로-9-히드록시-4-메틸-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-10,13(9H,15H)-디온) 은, 수용성의 캄토테신 유도체이다 (특허문헌 1 및 2). 현재 임상 환경에서 사용되는 이리노테칸과 달리, 상기 화합물은 항종양 효과를 나타내기 위한 효소에 의한 활성화를 필요로 하지 않는다. 또한, 이리노테칸의 주요 약학적 활성 물질인 SN-38 및 임상 환경에서 또한 사용되는 토포테칸보다 높은 토포이소머라아제 I 에 대한 저해 활성이 관찰되었으며, 여러가지 암 세포에 대해 높은 시험관내 살세포 활성이 확인되었다. 특히, P-당단백질의 발현으로 인해 SN-38 등에 내성을 갖는 암 세포에 대해서도 효과가 확인되었다. 추가로, 마우스의 인간 종양 피하 이식 모델에서도 강한 항종양 효과가 확인되었으며, 그에 따라 임상 시험을 거쳤으나 아직 출시에는 이르지 않았다 (비특허문헌 5~10 참조). 엑사테칸이 ADC 로서 유효하게 작용할지 여부에 대해서는 분명하지 않다.
DE-310 은, 생분해성의 카르복시메틸덱스트란 폴리알코올 중합체에 엑사테칸을 GGFG 펩티드 스페이서를 통해 접합시킨 복합체이다 (특허문헌 3). 엑사테칸을 중합체 전구약물의 형태로 변환시켜, 높은 혈중 체류성을 유지시킬 수 있으며, 또한 종양 내 신생 혈관의 투과성 증가 및 종양 조직 중 체류성을 이용하여 종양 부위에 대한 높은 지향성을 수동적으로 증가시킨다. DE-310 은, 효소에 의한 펩티드 스페이서의 절단을 통해, 주요 활성 물질로서 엑사테칸, 및 글리신이 아미노기에 결합하는 엑사테칸이 지속적으로 유리되며 그 결과 약물 동태가 개선된다. 비임상 연구에 있어서의 여러가지 종양 평가 모델에 따라서, DE-310 은 D310 에 함유된 엑사테칸의 총량이 엑사테칸 단일 투여의 경우보다 낮음에도 불구하고, 단일 투여된 엑사테칸보다 높은 유효성을 갖는 것으로 발견되었다. DE-310 에 관해서는 임상 연구가 실시되었고, 주요 활성 물질이 정상 조직보다 종양에 축적되는 것을 제시하는 보고를 포함하는 유효예도 확인되었다. 그러나, 종양에서의 DE-310 및 주요 활성 물질의 축적이 인간에서의 정상 조직에서의 축적과 큰 차이가 없고, 따라서 인간에서는 수동적인 표적화는 관찰되지 않았다는 보고가 또한 존재한다 (비특허문헌 11~14 참조). 결과적으로, DE-310 도 출시에는 이르지 않았으며, 엑사테칸이 이러한 표적화를 지향한 약물로서 유효하게 기능하는지 여부는 분명하지 않다.
DE-310 의 관련 화합물로서, -NH-(CH2)4-C(=O)- 로 나타내는 구조 부분을 -GGFG- 스페이서와 엑사테칸 사이에 삽입하여, 스페이서 구조로서 사용되는 -GGFG-NH-(CH2)4-C(=O)- 를 형성시키는 복합체도 알려져 있다 (특허문헌 4). 그러나, 상기 복합체의 항종양 효과에 대해서는 전혀 알려져 있지 않다.
HER2 는 인간 표피 세포 증식 인자 수용체 2-관련 암 유전자로서 동정된 통상적인 증식 인자 수용체형의 암 유전자 산물 중 하나이며, 분자량 185 kDa 이며 티로신 키나아제 도메인을 갖는 막관통형 수용체 단백질이다 (비특허문헌 15). HER2 의 DNA 서열 및 아미노산 서열은 공적 데이터베이스에 공개되어 있고, 예를 들어 M11730 (Genbank), NP_004439.2 (NCBI) 등의 접근 번호로 참조 가능하다.
HER2 (neu, ErbB-2) 는 EGFR (epidermal growth factor receptor: 표피 증식 인자 수용체) 패밀리 일원 중 하나이며, 동종이량체 형성 또는 또 다른 EGFR 수용체 HER1 (EGFR, ErbB-1), HER3 (ErbB-3) 또는 HER4 (ErbB-4) 와의 이종이량체 형성 (비특허문헌 16-18) 에 의해 세포내 티로신 잔기에서 자기인산화됨으로써 활성화되어, 그로써 정상 세포 및 암 세포에 있어서 세포 증식, 분화 및 생존에 중요한 역할을 한다 (비특허문헌 19 및 20). HER2 는 유방암, 위암 및 난소암과 같은 여러가지 암종에 있어서 과발현하며 (비특허문헌 21~26), 유방암에 있어서는 부정적 예후 인자인 것이 보고되고 있다 (비특허문헌 27 및 28).
트라스트주마브 (trastuzumab) 는, 재조합 인간화 항-HER2 단일클론 항체 (huMAb4D5-8, rhuMAb HER2, Herceptin (R)) 로 지칭되는 마우스 항-HER2 항체 4D5 (비특허문헌 29 및 특허문헌 5) 의 인간화 항체 (특허문헌 6) 이다. 트라스트주마브는 HER2 의 세포외 도메인 IV 에 특이적으로 결합하며, 항체 의존성 세포독성 (ADCC) 을 유도하거나 HER2 로부터의 신호 전달 저해를 통해 항암 효과를 발휘한다 (비특허문헌 30 및 31). 트라스트주마브는 HER2 를 과발현하는 종양에 대해 높은 효과를 나타내며 (비특허문헌 32), 그로 인해 HER2 를 과발현하는 전이성 유방암 환자에서의 치료제로서 미국에서 1999 년, 일본에서 2001 년에 출시되었다.
유방암에 있어서의 트라스트주마브의 치료 효과가 충분히 증명되고 있으나 (비특허문헌 33), 광범위한 종래의 항암 치료를 받은 HER2 를 과발현하는 유방암 환자의 이른바 약 15% 가 트라스트주마브에 대한 응답자이다. 이 집단의 약 85% 의 환자는 트라스트주마브 치료에 대해 반응하지 않거나, 반응이 약하다.
따라서, 트라스트주마브에 대해 반응하지 않거나 반응이 약한 HER2 를 과발현하는 종양 또는 HER2-관련 장애를 앓고 있는 환자에 대하여, HER2 발현-관련 질환을 표적으로 하는 치료제의 필요성이 인식되어 있다. 링커 구조를 통해 트라스트주마브에 접합된 항종양 약물을 갖는 T-DM1 (트라스트주마브 엠탄신, Kadcyla (R); 비특허문헌 34), 및 HER2 의 세포외 도메인 II 를 표적으로 하며 이종이량체 형성을 저해하도록 설계된 퍼투주마브 (Perjeta (R); 비특허문헌 35 및 특허문헌 7) 가 개발되었다. 그러나, 그의 반응성, 활성 강도 및 적응 범위는 여전히 불충분하며 HER2 를 표적으로 하는 미충족 요구가 존재하고 있다.
일본 공개특허공보 평 5-59061 호 일본 공개특허공보 평 8-337584 호 국제 공개 WO 1997/46260 호 국제 공개 WO 2000/25825 호 미국 특허 제 5677171 호 미국 특허 제 5821337 호 국제 공개 WO 01/00244 호
Ducry, L., et al., Bioconjugate Chem. (2010) 21, 5-13. Alley, S. C., et al., Current Opinion in Chemical Biology (2010) 14, 529-537. Damle N.K. Expert Opin. Biol. Ther. (2004) 4, 1445-1452. Senter P. D., et al., Nature Biotechnology (2012) 30, 631-637. Kumazawa, E., Tohgo, A., Exp. Opin. Invest. Drugs (1998) 7, 625-632. Mitsui, I., et al., Jpn J. Cancer Res. (1995) 86, 776-782. Takiguchi, S., et al., Jpn J. Cancer Res. (1997) 88, 760-769. Joto, N. et al. Int J Cancer (1997) 72, 680-686. Kumazawa, E. et al., Cancer Chemother. Pharmacol. (1998) 42, 210-220. De Jager, R., et al., Ann N Y Acad Sci (2000) 922, 260-273. Inoue, K. et al., Polymer Drugs in the Clinical Stage, Edited by Maeda et al. (2003) 145-153. Kumazawa, E. et al., Cancer Sci (2004) 95, 168-175. Soepenberg, O. et al., Clinical Cancer Research, (2005) 11, 703-711. Wente M. N. et al., Investigational New Drugs (2005) 23, 339-347. Coussens L, et al., Science. 1985;230(4730):1132-1139. Graus-Porta G, et al., EMBO J. 1997;16;1647-1655. Karnagaran D, et al., EMBO J. 1996;15:254-264. Sliwkowski MX, et al., J. Biol. Chem. 1994;269:14661-14665. Di Fore PP, et al., Science. 1987;237:178-182. Hudziak RM, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1987;84:7159-7163. Hardwick R, et al., Eur. J Surg Oncol. 1997 (23):30-35. Korkaya H, et al., Oncogene. 2008;27(47):6120-6130. Yano T, et al., Oncol Rep. 2006;15(1):65-71. Slamon DJ, et al., Science. 1987;235:177-182. Gravalos C, et al., Ann Oncol 19: 1523-1529, 2008. Fukushige S et al., Mol Cell Biol 6: 955-958, 1986. Slamon DJ, et al. Science. 1989;244:707-712. Kaptain S et al., Diagn Mol Pathol 10:139-152, 2001. Fendly. et al., Cancer Research 1990(50):1550-1558. Sliwkowski MX, et al., Semin Oncol. 1999;26(4,Suppl 12):60-70. Hudis CA, et al., N Engl J Med. 357: 39-51, 2007. Vogel CL, et al., J Clin Oncol. 2002;20(3):719-726. Baselga et al., J. Clin. Oncol. 14:737-744 (1996). Howard A. et al., J Clin Oncol 2011;29:398-405. Adams CW, et al., Cancer Immunol Immunother. 2006;6:717-727.
항체에 의한 종양의 치료에 있어서는, 항체가 항원을 인식하여 종양 세포에 결합하는 경우에도 항종양 효과가 불충분한 것이 관찰될 수 있으며, 보다 효과적인 항종양 항체가 필요한 경우가 있다. 또한, 많은 항종양 저분자량 화합물은 상기 화합물이 항종양 효과가 우수한 경우에도 부작용 및 독성과 같은 안전성에 있어서의 문제점을 갖는다. 안전성을 보다 증강시켜 우수한 치료 효과를 획득하는 것이 과제로 남아 있다. 따라서 본 발명은 항종양 효과 및 안전성에 있어서 우수한, 우수한 치료 효과를 갖는 항종양 약물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 항-HER2 항체가 종양 세포를 표적으로 할 수 있는 항체인 것, 즉 종양 세포를 인식할 수 있는 특성, 종양 세포에 결합할 수 있는 특성, 종양 세포 내에서 내재화할 수 있는 특성, 종양 세포에 대한 세포독성 활성, 종양 세포에 대한 살세포 활성 등을 가지며; 따라서 항종양 화합물 엑사테칸을 링커 구조 부분을 통해, 상기 항체에 대한 접합에 의해 항체-약물 접합체로 변환시키는 경우, 항종양 화합물을 종양 세포로 확실하게 이동시켜 당해 화합물의 항종양 효과를 종양 세포에서 특이적으로 나타낼 수 있고, 따라서 항종양 효과를 확실히 나타낼 수 있으며 또한 항-HER2 항체의 살세포 효과의 증강을 기대할 수 있고, 항종양 화합물의 투여량을 당해 화합물의 단독 투여 경우에 비해 감소시킬 수 있으며 따라서 정상 세포에 대한 항종양 화합물의 영향을 완화시켜 보다 높은 안전성을 달성할 수 있다는 것을 고려하고 있다.
이와 관련하여, 본 발명자들은 특정 구조의 링커를 창출하고 상기 링커를 통해 항-HER2 항체 및 엑사테칸을 접합시킨 항체-약물 접합체를 획득하는 것에 성공하였으며, 상기 접합체가 우수한 항종양 효과를 나타내는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
구체적으로, 본 발명은 하기에 관한 것이다.
[1] 하기 식으로 나타내는 항종양 화합물을:
[식 2]
Figure pat00002
하기 식:
-L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-
으로 나타내는 구조의 링커를 통해, 항-HER2 항체의 힌지 부분에 존재하는 디술피드 결합 부분에서 형성되는 티오에테르 결합에 의해 항-HER2 항체에 접합시키는 항체-약물 접합체로서,
여기서, 항-HER2 항체는 L1 의 말단에 연결되고,
항종양 화합물은 연결 위치로서 위치 1 에서 아미노기의 질소 원자를 갖는 -(CH2)n2-C(=O)- 부분의 카르보닐기에 연결되고,
식 중,
n1 은 0 내지 6 의 정수를 나타내고,
n2 는 0 내지 5 의 정수를 나타내고,
L1 는 -(숙신이미드-3-일-N)-(CH2)n3-C(=O)- 를 나타내고, 여기서, n3 은 2 내지 8 의 정수를 나타내고,
L2 는 -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)- 또는 단결합을 나타내고, 여기서, n4 는 1 내지 6 의 정수를 나타내고,
LP 는 2 내지 7 개의 아미노산으로 구성되는 펩티드 잔기를 나타내고,
La 는 -O- 또는 단결합을 나타내고,
-(숙신이미드-3-일-N)- 은 하기 식:
[식 3]
Figure pat00003
으로 나타내는 구조이며, 이는 그의 위치 3 에서 항-HER2 항체와 연결되고 위치 1 에서 질소 원자 상에서 이 구조를 함유하는 링커 구조 내의 메틸렌기와 연결되는, 항체-약물 접합체.
본 발명은 또한 하기의 각각에 관한 것이다.
[2] [1] 에 있어서, 펩티드 잔기 LP 가 페닐알라닌, 글리신, 발린, 리신, 시트룰린, 세린, 글루탐산 및 아스파르트산에서 선택되는 아미노산을 포함하는 펩티드 잔기인 항체-약물 접합체.
[3] [1] 또는 [2] 에 있어서, LP 가 하기의 군에서 선택되는 펩티드 잔기인 항체-약물 접합체:
-GGF-,
-DGGF-,
-(D-)D-GGF-,
-EGGF-,
-GGFG-,
-SGGF-,
-KGGF-,
-DGGFG-,
-GGFGG-,
-DDGGFG-,
-KDGGFG-, 및
-GGFGGGF-;
여기서 "(D-)D" 는 D-아스파르트산을 나타냄.
[4] [1] 또는 [2] 에 있어서, LP 가 4 개의 아미노산으로 구성되는 펩티드 잔기인 항체-약물 접합체.
[5] [1]~[4] 중 어느 하나에 있어서, LP 가 테트라펩티드 잔기 -GGFG- 인 항체-약물 접합체.
[6] [1]~[5] 중 어느 하나에 있어서, n3 이 2 내지 5 의 정수이고 L2 가 단결합인 항체-약물 접합체.
[7] [1]~[5] 중 어느 하나에 있어서, n3 이 2 내지 5 의 정수이고 L2 가 -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)- 이며 n4 가 2 또는 4 인 항체-약물 접합체.
[8] [1]~[7] 중 어느 하나에 있어서, -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- 가 4 내지 7 개 원자의 사슬 길이를 갖는 부분 구조인 항체-약물 접합체.
[9] [1]~[7] 중 어느 하나에 있어서, -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- 가 5 또는 6 개 원자의 사슬 길이를 갖는 부분 구조인 항체-약물 접합체.
[10] [1]~[9] 중 어느 하나에 있어서, -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- 가
-NH-CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-, 또는
-NH-CH2CH2-O-C(=O)-
인 항체-약물 접합체.
[11] [1]~[9] 중 어느 하나에 있어서, -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- 가
-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-, 또는
-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-
인 항체-약물 접합체.
[12] [1]~[9] 중 어느 하나에 있어서, -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- 에 약물을 연결시킨 약물-링커 구조 부분이 하기의 군에서 선택되는 1 종의 약물-링커 구조인 항체-약물 접합체:
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-C(=O)-(NH-DX),
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
여기서, -(숙신이미드-3-일-N)- 은 하기 식:
[식 4]
Figure pat00004
으로 나타내는 구조이며, 이는 그의 위치 3 에서 항-HER2 항체와 연결되고, 위치 1 에서 질소 원자 상에서 이 구조를 함유하는 링커 구조 내의 메틸렌기와 연결되고,
-(NH-DX) 는 하기 식:
[식 5]
Figure pat00005
으로 나타내는 기를 표시하며, 여기서 위치 1 에서 아미노기의 질소 원자는 결합 위치이고,
-GGFG- 는 테트라펩티드 잔기 -Gly-Gly-Phe-Gly- 를 나타냄.
[13] [1]~[9] 중 어느 하나에 있어서, -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- 에 약물을 연결시킨 약물-링커 구조 부분이 하기의 군에서 선택되는 1 종의 약물-링커 구조인 항체-약물 접합체:
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
여기서, -(숙신이미드-3-일-N)-, -(NH-DX), 및 -GGFG- 는 상기 정의한 바와 같음.
[14] 하기 식:
[식 6]
Figure pat00006
으로 나타내는 항종양 화합물을 하기 식:
-L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-
으로 나타내는 구조의 링커를 통해, 항-HER2 항체의 힌지 부분에 존재하는 디술피드 결합 부분에서 형성되는 티오에테르 결합에 의해 항-HER2 항체에 접합시키는 항체-약물 접합체로서,
여기서, 항-HER2 항체는 L1 의 말단에 연결되고, 항종양 화합물은 -(CH2)n2-C(=O)- 부분의 카르보닐기에 연결되고,
식 중, n1 은 0 내지 6 의 정수를 나타내고,
n2 는 0 내지 5 의 정수를 나타내고,
L1 은 -(숙신이미드-3-일-N)-(CH2)n3-C(=O)- 를 나타내고, 여기서, n3 은 2 내지 8 의 정수를 나타내고,
L2 는 -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)- 또는 단결합을 나타내고, 여기서, n4 는 1 내지 6 의 정수를 나타내고,
LP 는 테트라펩티드 잔기 -GGFG- 를 나타내고,
La 는 -O- 또는 단결합을 나타내고,
-(숙신이미드-3-일-N)- 은 하기 식:
[식 7]
Figure pat00007
으로 나타내는 구조이며, 이는 그의 위치 3 에서 항-HER2 항체에 연결되고, 위치 1 에서 질소 원자 상에서 이 구조를 함유하는 링커 구조 내의 메틸렌기에 연결되는, 항체-약물 접합체.
[15] [14] 에 있어서,
n1 이 3 이고, n2 가 0 이고, n3 이 2 이고, L2 가 -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)- 이고, n4 가 2 이고, La 가 단결합이고,
n1 이 1 이고, n2 가 1 이고, n3 이 5 이고, L2 가 단결합이고, La 가 -O- 이거나,
n1 이 2 이고, n2 가 1 이고, n3 이 5 이고, L2 가 단결합이고, La 가 -O- 인, 항체-약물 접합체.
[16] [14] 또는 [15] 에 있어서, n3 이 2 또는 5 이고, L2 가 단결합인 항체-약물 접합체.
[17] [14] 또는 [15] 에 있어서, n3 이 2 또는 5 이고, L2 가 -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)- 이고, n4 가 2 또는 4 인 항체-약물 접합체.
[18] [14] 내지 [17] 중 어느 하나에 있어서, -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- 가
-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-, 또는
-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-
인 항체-약물 접합체.
[19] [14]~[18] 중 어느 하나에 있어서, -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- 에 약물을 연결시킨 약물-링커 구조 부분이 하기의 군에서 선택되는 1 종의 약물-링커 구조인 항체-약물 접합체:
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-C(=O)-(NH-DX),
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
여기서, -(숙신이미드-3-일-N)- 은 하기 식:
[식 8]
Figure pat00008
으로 나타내는 구조이며, 이는 그의 위치 3 에서 항-HER2 항체와 연결되고, 위치 1 에서 질소 원자 상에서 이 구조를 함유하는 링커 구조 내의 메틸렌기에 연결되고,
-(NH-DX) 는 하기 식:
[식 9]
Figure pat00009
으로 나타내는 기를 표시하며, 여기서 위치 1 에서 아미노기의 질소 원자는 결합 위치이고,
-GGFG- 는 테트라펩티드 잔기 -Gly-Gly-Phe-Gly- 를 나타냄.
[20] [14]~[18] 중 어느 하나에 있어서, -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- 에 약물을 연결시킨 약물-링커 구조 부분이 하기의 군에서 선택되는 1 종의 약물-링커 구조인 항체-약물 접합체:
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), 및
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
여기서, -(숙신이미드-3-일-N)-, -(NH-DX), 및 -GGFG- 는 상기 정의한 바와 같음.
[21] [1]~[20] 중 어느 하나에 있어서, 항체 분자 당 선택된 1 종의 약물-링커 구조의 평균 접합 단위 수가 1 내지 10 의 범위인 항체-약물 접합체.
[22] [1]~[20] 중 어느 하나에 있어서, 항체 분자 당 선택된 1 종의 약물-링커 구조의 평균 접합 단위 수가 2 내지 8 의 범위인 항체-약물 접합체.
[23] [1]~[20] 중 어느 하나에 있어서, 항체 분자 당 선택된 1 종의 약물-링커 구조의 평균 접합 단위 수가 3 내지 8 의 범위인 항체-약물 접합체.
[24] [1]~[23] 중 어느 하나에 따른 항체-약물 접합체, 이의 염 또는 이의 수화물을 함유하는 약물.
[25] [1]~[23] 중 어느 하나에 따른 항체-약물 접합체, 이의 염 또는 이의 수화물을 함유하는 항종양 약물 및/또는 항암 약물.
[26] [25] 에 있어서, 폐암, 요로 상피암, 대장암, 전립선암, 난소암, 췌장암, 유방암, 방광암, 위암, 위장간질 종양, 자궁경부암, 식도암, 편평상피암, 복막암, 간암, 간세포암, 결장암, 직장암, 결장 직장암, 자궁 내막암, 자궁암, 침샘암, 신장암, 외음부암, 갑상선암, 음경암, 백혈병, 악성 림프종, 형질세포종, 골수종 또는 육종에 대하여 사용하기 위한 항종양 약물 및/또는 항암 약물.
[27] [1]~[23] 중 어느 하나에 따른 항체-약물 접합체, 이의 염 또는 이의 수화물을 활성 성분으로서, 및 약학적으로 허용되는 제형 성분을 함유하는 약학 조성물.
[28] [27] 에 있어서, 폐암, 요로 상피암, 대장암, 전립선암, 난소암, 췌장암, 유방암, 방광암, 위암, 위장간질 종양, 자궁경부암, 식도암, 편평상피암, 복막암, 간암, 간세포암, 결장암, 직장암, 결장 직장암, 자궁 내막암, 자궁암, 침샘암, 신장암, 외음부암, 갑상선암, 음경암, 백혈병, 악성 림프종, 형질세포종, 골수종 또는 육종에 대하여 사용하기 위한 약학 조성물.
[29] [1]~[23] 중 어느 하나에 따른 항체-약물 접합체, 이의 염 또는 이의 수화물을 투여하는 것을 포함하는 종양 및/또는 암의 치료 방법.
[30] 하기 식으로 나타내는 화합물을:
(말레이미드-N-일)-(CH2)n3-C(=O)-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-(NH-DX)
항-HER2 항체 또는 이의 반응성 유도체와 반응시키고, 그 항체의 힌지 부분에 존재하는 디술피드 결합 부분에서 티오에테르 결합을 형성시키는 방법에 의해 약물-링커 부분을 그 항체에 접합시키는 것을 포함하는 항체-약물 접합체의 제조 방법.
식 중에서, n3 은 2 내지 8 의 정수를 나타내고,
L2 는 -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)- 또는 단결합을 나타내고, 여기서, n4 는 1 내지 6 의 정수를 나타내고,
LP 는 페닐알라닌, 글리신, 발린, 리신, 시트룰린, 세린, 글루탐산 및 아스파르트산에서 선택되는 2 내지 7 개의 아미노산으로 구성되는 펩티드 잔기를 나타내고,
n1 은 0 내지 6 의 정수를 나타내고,
n2 는 0 내지 5 의 정수를 나타내고,
La 는 -O- 또는 단결합을 나타내고,
(말레이미드-N-일)- 은 하기 식:
[식 10]
Figure pat00010
으로 나타내는 기이며, 여기서 질소 원자는 결합 위치이고,
-(NH-DX) 는 하기 식:
[식 11]
Figure pat00011
으로 나타내는 기이며, 여기서 위치 1 에서의 아미노기의 질소 원자는 결합 위치임.
[31] [30] 에 있어서, 약물-링커 부분을 항-HER2 항체에 접합시키는 방법이, 그 항체를 환원시켜 반응성 유도체로 변환하는 방법인 제조 방법.
[32] [30] 또는 [31] 에 있어서, 항체 분자 당 선택된 1 종의 약물-링커 구조의 평균 접합 단위 수가 1 내지 10 의 범위인 제조 방법.
[33] [30] 또는 [31] 에 있어서, 항체 분자 당 선택된 1 종의 약물-링커 구조의 평균 접합 단위 수가 2 내지 8 의 범위인 제조 방법.
[34] [30] 또는 [31] 에 있어서, 항체 분자 당 선택된 1 종의 약물-링커 구조의 평균 접합 단위 수가 3 내지 8 의 범위인 제조 방법.
[35] [30]~[34] 중 어느 하나에 따른 제조 방법에 의해 수득되는 항체-약물 접합체.
[36] 항-HER2 항체를 환원 조건에서 처리한 후에 하기의 군에서 선택되는 화합물과 반응시키는, 항체의 힌지 부분의 술피드 결합 부분에서 티오에테르 결합을 형성시켜 수득되는 항체-약물 접합체:
(말레이미드-N-일)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), 및
(말레이미드-N-일)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX).
상기에서, (말레이미드-N-일)- 은 하기 식:
[식 12]
Figure pat00012
으로 나타내는 기이며, 여기서 질소 원자는 결합 위치이고,
-(NH-DX) 는 하기 식:
[식 13]
Figure pat00013
으로 나타내는 기이며, 여기서 위치 1 에서의 아미노기의 질소 원자는 결합 위치이고,
-GGFG- 는 테트라펩티드 잔기 -Gly-Gly-Phe-Gly- 를 나타냄.
[37] 항-HER2 항체를 환원 조건에서 처리한 후에 하기의 군에서 선택되는 화합물과 반응시키는, 항체의 힌지 부분에 존재하는 술피드 결합 부분에서 티오에테르 결합을 형성시켜 수득되는 항체-약물 접합체:
(말레이미드-N-일)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), 및
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX).
여기서, (말레이미드-N-일)-, -(NH-DX), 및 -GGFG- 는 상기 정의한 바와 같음.
[38] [36] 또는 [37] 에 있어서, 항체 분자 당 선택된 1 종의 약물-링커 구조의 평균 접합 단위 수가 1 내지 10 의 범위인 항체-약물 접합체.
[39] [36] 또는 [37] 에 있어서, 항체 분자 당 선택된 1 종의 약물-링커 구조의 평균 접합 단위 수가 2 내지 8 의 범위인 항체-약물 접합체.
[40] [36] 또는 [37] 에 있어서, 항체 분자 당 선택된 1 종의 약물-링커 구조의 평균 접합 단위 수가 3 내지 8 의 범위인 항체-약물 접합체.
특정 구조의 링커를 통해 항종양 화합물 엑사테칸을 접합시킨 항-HER2 항체-약물 접합체에 의해, 우수한 항종양 효과 및 안전성을 달성할 수 있다.
[도 1] 도 1 은 인간화 항-HER2 단일클론 항체의 중쇄의 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 1) 을 나타낸다.
[도 2] 도 2 는 인간화 항-HER2 단일클론 항체의 경쇄의 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 2) 을 나타낸다.
[도 3] 도 3 은 인간 유방암주 KPL-4 세포 피하 이식 누드 마우스에 대한 항체-약물 접합체 (27) 또는 트라스트주마브의 항종양 효과를 나타내는 도면이다. 도면에서, 가로축은 종양 접종 후의 일수를 나타내고 세로축은 종양 부피를 나타낸다.
[도 4] 도 4 는 인간 위암주 NCI-N87 세포 피하 이식 누드 마우스에 대한 항체-약물 접합체 (8), (28), 또는 트라스트주마브 엠탄신의 항종양 효과를 나타내는 도면이다. 도면에서, 가로축은 종양 접종 후의 일수를 나타내고, 세로축은 종양 부피를 나타낸다.
[도 5] 도 5 는 인간 유방암주 JIMT-1 세포 피하 이식 누드 마우스에 대한 항체-약물 접합체 (8), (29), (30), 트라스트주마브, 또는 트라스트주마브 엠탄신의 항종양 효과를 나타내는 도면이다. 도면에서, 가로축은 종양 접종 후의 일수를 나타내고, 세로축은 종양 부피를 나타낸다.
[도 6] 도 6 은 인간 췌장암주 Capan-1 세포 피하 이식 누드 마우스에 대한 항체-약물 접합체 (31), 트라스트주마브, 또는 트라스트주마브 엠탄신의 항종양 효과를 나타내는 도면이다. 도면에서, 가로축은 종양 접종 후의 일수를 나타내고, 세로축은 종양 부피를 나타낸다.
[도 7] 도 7 은 인간 위암주 NCI-N87 세포 피하 이식 누드 마우스에 대한 항체-약물 접합체 (50) 의 항종양 효과를 나타내는 도면이다. 도면에서, 가로축은 종양 접종 후의 일수를 나타내고, 세로축은 종양 부피를 나타낸다.
[도 8] 도 8 은 인간 유방암주 ST225 세포 피하 이식 누드 마우스에 대한 항체-약물 접합체 (50), 트라스트주마브, 또는 트라스트주마브 엠탄신의 항종양 효과를 나타내는 도면이다. 도면에서, 가로축은 종양 접종 후의 일수를 나타내고, 세로축은 종양 부피를 나타낸다.
[도 9] 도 9 는 인간 유방암주 ST910 세포 피하 이식 누드 마우스에 대한 항체-약물 접합체 (50), 트라스트주마브, 또는 트라스트주마브 엠탄신의 항종양 효과를 나타내는 도면이다. 도면에서, 가로축은 종양 접종 후의 일수를 나타내고, 세로축은 종양 부피를 나타낸다.
[도 10] 도 10 은 인간 대장암주 CTG-0401 세포 피하 이식 누드 마우스에 대한 항체-약물 접합체 (50), 트라스트주마브, 또는 트라스트주마브 엠탄신의 항종양 효과를 나타내는 도면이다. 도면에서, 가로축은 종양 접종 후의 일수를 나타내고, 세로축은 종양 부피를 나타낸다.
[도 11] 도 11 은 인간 비소세포 폐암주 CTG-0860 세포 피하 이식 누드 마우스에 대한 항체-약물 접합체 (50), 트라스트주마브, 또는 트라스트주마브 엠탄신의 항종양 효과를 나타내는 도면이다. 도면에서, 가로축은 종양 접종 후의 일수를 나타내고, 세로축은 종양 부피를 나타낸다.
[도 12] 도 12 는 인간 담관암주 CTG-0927 세포 피하 이식 누드 마우스에 대한 항체-약물 접합체 (50), 트라스트주마브, 또는 트라스트주마브 엠탄신의 항종양 효과를 나타내는 도면이다. 도면에서, 가로축은 종양 접종 후의 일수를 나타내고, 세로축은 종양 부피를 나타낸다.
[도 13] 도 13 은 인간 식도암주 CTG-0137 세포 피하 이식 누드 마우스에 대한 항체-약물 접합체 (50), 트라스트주마브, 또는 트라스트주마브 엠탄신의 항종양 효과를 나타내는 도면이다. 도면에서, 가로축은 종양 접종 후의 일수를 나타내고, 세로축은 종양 부피를 나타낸다.
[도 14] 도 14 는 인간 난소암주 SK-OV-3 세포 피하 이식 누드 마우스에 대한 항체-약물 접합체 (50), 트라스트주마브, 또는 트라스트주마브 엠탄신의 항종양 효과를 나타내는 도면이다. 도면에서, 가로축은 종양 접종 후의 일수를 나타내고, 세로축은 종양 부피를 나타낸다.
구현예의 설명
이하, 본 발명을 실시하기 위한 바람직한 형태를 도면을 참조하면서 설명한다. 하기에 설명하는 구현예는, 본 발명의 대표적인 구현예의 일례를 나타낸 것이며, 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
본 발명의 항-HER2 항체-약물 접합체는, 항-HER2 항체를 링커 구조 부분을 통해 항종양 화합물에 접합시킨 항종양 약물이며, 이하에 상세하게 설명한다.
[항체]
본 발명의 항-HER2 항체-약물 접합체에 사용되는 항-HER2 항체는 임의 종에서 유래할 수 있으며, 바람직한 종의 예는 인간, 래트, 마우스 및 토끼를 포함할 수 있다. 항체가 인간 이외의 종에서 유래하는 경우에는, 주지된 기법을 사용하여 키메라화 또는 인간화하는 것이 바람직하다. 본 발명의 항체는, 다클론 항체 또는 단일클론 항체일 수 있으며, 단일클론 항체가 바람직하다.
항-HER2 항체는 종양 세포를 표적으로 할 수 있는 항체이며, 즉 종양 세포를 인식하는 특성, 종양 세포에 결합하는 특성, 종양 세포 내에서 내재화하는 특성, 종양 세포에 대한 살세포 활성 등을 갖고, 항종양 활성을 갖는 약물과 링커를 통해 접합되어 항체-약물 접합체를 형성할 수 있다.
항체의 종양 세포에 대한 결합 활성은, 유세포분석을 사용하여 확인할 수 있다. 종양 세포 내로의 항체의 내재화는, (1) 치료 항체에 결합하는 2 차 항체 (형광 표지됨) 를 사용하여 세포 내에 혼입된 항체를 형광 현미경으로 가시화하는 검정 (Cell Death and Differentiation (2008) 15, 751-761), (2) 치료 항체에 결합하는 2 차 항체 (형광 표지됨) 를 사용하여 세포 내에 혼입된 형광 강도를 측정하는 검정 (Molecular Biology of the Cell Vol. 15, 5268-5282, December 2004), 또는 (3) 치료 항체에 결합하는 면역독소를 사용하여, 세포 내에 혼입시 독소가 방출되어 세포 증식이 억제되는 Mab-ZAP 검정 (Bio Techniques 28: 162-165, January 2000) 을 사용하여 확인할 수 있다. 면역독소로서는, 디프테리아 독소 촉매 도메인과 단백질 G 의 재조합 복합 단백질을 사용할 수 있다.
항체의 항종양 활성은, 세포 증식의 억제 활성을 측정함으로써 시험관내 확인할 수 있다. 예를 들어, 항체의 표적 단백질을 과발현하는 암 세포주를 배양하고, 배양계에 여러 농도로 항체를 첨가하여 병소 형성, 콜로니 형성 및 스페로이드 증식에 대한 억제 활성을 측정한다. 예를 들어, 표적 단백질을 고발현하는 종양 세포주를 이식한 누드 마우스에 항체를 투여하고 암 세포의 변화를 측정함으로써, 생체내 항종양 활성을 확인할 수 있다.
항체-약물 접합체에 접합된 화합물이 항종양 효과를 발휘하므로, 항체 자체가 항종양 효과를 갖는 것이 바람직하지만, 필수는 아니다. 종양 세포에 대한 항종양 화합물의 세포독성 활성을 특이적이고 선택적으로 발휘시키기 위해, 항체가 내재화되어 종양 세포 내로 이동하는 특성을 갖는 것이 중요하고, 또한 바람직하다.
항-HER2 항체는, 공지된 절차에 의해 수득할 수 있다. 예를 들어, 당업계에서 통상 실시되는 방법을 사용하여, 항원성 폴리펩티드로 동물을 면역화하고 생체내 생성된 항체를 수집 및 정제함으로써 본 발명의 항체를 수득할 수 있다. 항원의 기원은 인간으로 한정되지 않으며, 마우스, 래트 등과 같은 비-인간 동물에서 유래하는 항원으로 동물을 면역화할 수 있다. 이러한 경우, 수득한 이종 항원에 결합하는 항체와 인간 항원과의 교차 반응성을 시험하여, 인간 질환에 적용 가능한 항체를 선별할 수 있다.
대안적으로, 당업계에 공지된 방법 (예를 들어, Kohler and Milstein, Nature (1975) 256, p.495-497; and Kennet, R.ed., Monoclonal Antibodies, p.365-367, Plenum Press, N.Y.(1980)) 에 따라 항원에 대한 항체를 생성하는 항체 생성 세포와 골수종 세포를 융합시켜 하이브리도마를 확립하고, 이로부터 단일클론 항체를 수득할 수 있다.
항원은 숙주 세포를 유전자 조작하여 항원성 단백질을 코딩하는 유전자를 생성시킴으로써 수득할 수 있다. 구체적으로는, 항원 유전자를 발현 가능한 벡터를 제작하고, 이를 숙주 세포에 도입하여 상기 유전자를 발현시킨다. 이에 따라 발현된 항원은 정제할 수 있다. 상기 유전자 조작한 항원 발현 세포 또는 항원을 발현하는 세포주로 동물을 면역화하는 방법에 의해서도 항체를 수득할 수 있다.
본 발명에서 사용할 수 있는 항-HER2 항체는 특별히 제한은 없지만, 예를 들어 하기의 특성을 갖는 것들이 바람직하다.
(1) 하기의 특성을 갖는 항-HER2 항체:
(a) HER2 에 특이적으로 결합하고,
(b) HER2 와 결합함으로써 HER2 발현 세포에서 내재화하는 활성을 가짐.
(2) (1) 에 있어서, HER2 의 세포외 도메인에 결합하는 항체.
(3) (1) 또는 (2) 에 있어서, 단일클론 항체인 항체.
(4) (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 있어서, 항체 의존성 세포독성 (ADCC) 활성 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC) 활성을 갖는 항체.
(5) (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 있어서, 마우스 단일클론 항체, 키메라 단일클론 항체 또는 인간화 단일클론 항체인 항체.
(6) (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 있어서, SEQ ID NO: 1 로 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 SEQ ID NO: 2 로 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 인간화 단일클론 항체인 항체.
(7) (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 있어서, 중쇄 카르복실 말단의 리신 잔기가 결여되어 있는 항체.
(8) (7) 에 있어서, SEQ ID NO: 1 의 아미노산 잔기 1 내지 449 로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 SEQ ID NO: 2 의 아미노산 잔기 1 내지 214 로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 항체.
(9) (1) 내지 (8) 중 어느 하나에 따른 항체를 생성하는 방법에 의해 수득하는 항체로서, 상기 방법이, 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 공정; 및 전술한 공정으로 수득한 배양물로부터 관심 항체를 수집하는 공정을 포함하는 것인, 항체.
이하, 본 발명에서 사용되는 항-HER2 항체에 대해 설명한다.
본원에서, 용어 "암" 및 "종양" 은 동일한 의미로 사용된다.
본원에서, 용어 "유전자" 는 DNA 뿐 아니라 이의 mRNA, 이의 cDNA 및 이의 cRNA 도 포함한다.
본원에서, 용어 "폴리뉴클레오티드" 는 핵산과 동일한 의미로 사용되며, 또한 DNA, RNA, 프로브, 올리고뉴클레오티드 및 프라이머를 포함한다.
본원에서, 용어 "폴리펩티드", "단백질" 및 "단백" 은 구별하지 않고 사용된다.
본원에서, 용어 "세포" 는 또한 동물 개체 내의 세포 및 배양 세포를 포함한다.
본원에서, 용어 "HER2" 는 HER2 단백질과 동일한 의미로 사용된다.
본원에서, 항-HER2 항체의 예는 특별히 제한은 없지만, 퍼투주마브 (국제 공개 특허 WO 01/00245 호) 및 트라스트주마브 (미국 특허 제 5821337 호) 를 포함할 수 있다. 트라스트주마브가 바람직하다. 그러나 본 발명의 항-HER2 항체는, HER2 에 특이적으로 결합하는, 보다 바람직하게는 HER2 와 결합함으로써 HER2 발현 세포에 내재화 활성을 갖는 항-HER2 항체이면 이것에 한정되지 않는다.
본원에서, 용어 "트라스트주마브" 는 HERCEPTIN(R), huMAb4D5-8 또는 rhuMAb4D5-8 로도 지칭되며, SEQ ID NO: 1 (도 1) 의 아미노산 잔기 1 내지 449 로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 SEQ ID NO: 2 (도 2) 의 아미노산 잔기 1 내지 214 로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 인간화 항체이다.
본원에서, 용어 "특이적으로 결합" 은 비특이적 흡착이 아닌 결합을 의미한다. 결합이 특이적인지 여부의 판정 기준의 예는, 해리 상수 (이하, "KD" 로 지칭함) 를 포함할 수 있다. 항체의 HER2 단백질에 대한 KD 값은 바람직하게는 1 x 10-5 M 이하, 5 x 10-6 M 이하, 2 x 10-6 M 이하, 또는 1 x 10-6 M 이하; 보다 바람직하게는 5 x 10-7 M 이하, 2 x 10-7 M 이하, 또는 1 x 10-7 M 이하; 보다 더 바람직하게는 5 x 10-8 M 이하, 2 x 10-8 M 이하, 또는 1 x 10-8 M 이하; 가장 바람직하게는 5 x 10-9 M 이하, 2 x 10-9 M 이하, 또는 1 x 10-9 M 이하이다. HER2 단백질과 항체 사이의 결합은 표면 플라스몬 공명, ELISA 또는 RIA 와 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 측정할 수 있다.
본원에서 용어 "CDR" 은 상보성 결정 부위 (CDR: complementarity determining region) 을 의미한다. 항체 분자의 중쇄 및 경쇄에는 각각 3 개의 상보성 결정 부위 (CDR) 가 있는 것이 알려져 있다. CDR 은 초가변 도메인 (hypervariable domain) 으로도 불리며, 항체의 각 중쇄 및 경쇄의 가변부 내에 존재한다. 이는 일차 구조의 변이성이 특히 높은 부위이며, 각 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 사슬의 일차 구조에서 3 개의 분리된 CDR 이 존재한다. 본 명세서에서는, 항체의 CDR 에 대해, 중쇄의 CDR 을 중쇄 아미노산 서열의 아미노 말단측으로부터 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 으로 표기하고, 경쇄의 CDR 을 경쇄 아미노산 서열의 아미노 말단측으로부터 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 으로 표기한다. 이들 부위는 삼차 구조에서 서로 근접하고, 항체가 결합하는 항원에 대한 특이성을 결정한다.
본원에서, 어구 "엄격한 조건 하에 하이브리드화를 수행한다" 는 시판 하이브리드화 용액 ExpressHybHybridization Solution (Clontech, Inc.사제) 중 68℃ 에서 하이브리드화를 실시하거나, DNA 를 고정한 필터를 사용하여 0.7 내지 1.0 M NaCl 의 존재 하, 68℃ 에서 하이브리드화를 실시한 후, 0.1 내지 2 x SSC 용액 (1 x SSC 용액은 150 mM NaCl 및 15 mM 시트르산 나트륨으로 이루어짐) 을 이용해 68℃ 에서 세척함으로써 동정할 수 있는 조건, 또는 그와 동등한 조건으로 하이브리드화하는 것을 나타낸다.
1. HER2
HER2 는 인간 표피 세포 증식 인자 수용체 2-관련 암 유전자로서 동정된 통상의 증식 인자 수용체 암 유전자의 암 유전자 산물 중 하나이며, 분자량 185 kDa 이며 티로신 키나아제 도메인을 갖는 막관통형 수용체 단백질이다. HER2 는 HER1 (EGFR, ErbB-1), HER2 (neu, ErbB-2), HER3 (ErbB-3) 및 HER4 (ErbB-4) 로 이루어지는 EGFR 패밀리의 일원이며, 그의 동종단량체 형성 또는 또 다른 EGFR 수용체 HER1, HER3 또는 HER4 와의 이종이량체 형성에 의해 세포내 티로신 잔기에서 자기 인산화되며 그 자체가 이러한 방식으로 활성화됨으로써, 정상 세포 및 종양 세포에 있어서 세포 증식, 분화 및 생존에 중요한 역할을 완수하는 것이 알려져 있다.
본 발명에서 사용되는 HER2 단백질에 대해서는, 인간 또는 비인간 포유 동물 (래트 또는 마우스 등) 의 HER2 발현 세포로부터 직접 정제하고 사용할 수 있거나, 상기 세포의 세포막 분획물을 제조하고 사용할 수 있다. 또한 HER2 를, 이의 시험관내 합성 또는 유전자 조작을 통한 숙주 세포에서의 생성에 의해 수득할 수 있다. 유전자 조작에서는, 구체적으로는, HER2 cDNA 를 발현할 수 있는 벡터에 HER2 cDNA 를 혼입한 후, 전사와 번역에 필요한 효소, 기질 및 에너지 물질을 함유하는 용액 중에서 합성하거나, 또 다른 원핵생물 또는 진핵생물 형질전환 숙주 세포에서 HER2 를 발현시킴으로써 HER2 단백질을 수득할 수 있다. 대안적으로, 상기 유전자 조작된 HER2 발현 세포 또는 HER2 발현 세포주를 HER2 단백질로서 사용할 수도 있다.
HER2 의 DNA 서열 및 아미노산 서열은 공적 데이터베이스에 공개되어 있고, 예를 들어 접근 번호 M11730 (Genbank), NP_004439.2 (NCBI) 등에 의해 참조 가능하다.
또한, 상기 임의의 HER2 의 아미노산 서열에서 1 개 또는 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며 상기 단백질과 동등한 생물학적 활성을 갖는 단백질이 또한 HER2 에 포함된다.
인간 HER2 단백질은 N-말단 22 개 아미노산 잔기로 이루어지는 신호 서열, 630 개 아미노산 잔기로 이루어지는 세포외 도메인, 23 개 아미노산 잔기로 이루어지는 세포막 관통 도메인, 및 580 개 아미노산 잔기로 이루어지는 세포내 도메인으로 구성되어 있다.
2. 항-HER2 항체의 생성
본 발명의 HER2 에 대한 항체는 예를 들어, HER2 또는 HER2 의 아미노산 서열에서 선택되는 임의의 폴리펩티드로 동물을 면역화시키고 생체내에 생성되는 항체를 수집하고 정제하는 것을 포함하는 당업계에서 통상 실시되는 방법에 따라 수득할 수 있다. 항원으로서 사용되는 HER2 의 생물종은 인간으로 한정되지 않으며, 마우스 또는 래트와 같은 인간 이외의 동물에서 유래하는 HER2, 또는 래트 p185neu 로 동물을 면역화할 수 있다. 이러한 경우에는, 수득한 이종 HER2 에 결합하는 항체와 인간 HER2 사이의 교차 반응성을 시험함으로써, 인간 질환에 적용 가능한 항체를 선별할 수 있다.
또한, 공지된 방법 (예를 들어, Kohler and Milstein, Nature (1975) 256, pp. 495-497; Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, pp. 365-367, Plenum Press, N.Y. (1980)) 에 따라, HER2 에 대한 항체를 생성하는 항체 생성 세포와 골수종 세포를 융합시켜 하이브리도마를 확립하여, 단일클론 항체를 수득할 수 있다.
항원으로서 사용되는 HER2 는 HER2 유전자를 유전자 조작을 사용하여 숙주 세포에서 발현시킴으로써 수득할 수 있다.
구체적으로는, HER2 유전자를 발현할 수 있는 벡터를 제작하고, 생성된 벡터를 숙주 세포에 트랜스펙션하여 상기 유전자를 발현시킨 후, 발현된 HER2 를 정제한다.
대안적으로, 상기 유전자 조작된 HER2 발현 세포, 또는 HER2 를 발현하는 세포주를 HER2 단백질로서 사용할 수 있다. 항-HER2 항체는 당업계에 공지된 절차에 의해 수득할 수 있다. 이하, 구체적으로 HER2 에 대한 항체의 수득 방법을 설명한다.
(1) 항원의 제조
항-HER2 항체를 생성하는데 사용되는 항원의 예는 HER2, 또는 HER2 의 6 개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 부분 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드, 또는 이에 소정의 아미노산 서열이나 담체가 부가된 유도체를 포함한다.
HER2 는 인간의 종양 조직 또는 종양 세포로부터 직접 정제하고 사용할 수 있다. 또한, HER2 를 시험관내에서 합성하거나, 유전자 조작에 의해 숙주 세포에서 생성시킴으로써 수득할 수 있다.
유전자 조작에 있어서, 구체적으로는, HER2 cDNA 를 발현할 수 있는 벡터에 HER2 cDNA 를 혼입한 후, 전사와 번역에 필요한 효소, 기질 및 에너지 물질을 함유하는 용액 중에서 이를 합성하거나, 또 다른 원핵생물 또는 진핵생물 형질전환 숙주 세포에서 HER2 를 발현시킴으로써 HER2 를 수득할 수 있다.
또한, 막 단백질인 HER2 의 세포외 도메인과 항체의 불변부를 연결하여 수득한 융합 단백질을 적절한 숙주-벡터계에서 발현시켜, 분비 단백질로서 항원을 수득할 수도 있다.
HER2 cDNA 는, 예를 들어 HER2 cDNA 를 발현하는 cDNA 라이브러리를 주형으로서 사용하고 HER2 cDNA 를 특이적에 증폭시키는 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄 반응인, 이른바 PCR 법에 의해 수득할 수 있다 (PCR; Saiki, R. K., et al., Science (1988) 239, pp. 487-489).
폴리펩티드의 시험관내 합성으로서, 예를 들어 Roche Diagnostics, Inc.사제 신속 번역 시스템 (Rapid Translation System) (RTS) 을 예시로 들 수 있지만, 이것으로 한정되지 않는다.
원핵생물 숙주 세포의 예는 대장균 (Escherichia coli) 및 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 를 포함한다. 숙주 세포를 표적 유전자로 형질전환시키기 위해, 숙주와 적합할 수 있는 종 유래의 레플리콘, 즉 복제 기원, 및 조절 서열을 포함하는 플라스미드 벡터에 의해 숙주 세포를 형질전환시킨다. 또한 벡터는 형질전환 세포에 표현형 선택성을 부여할 수 있는 서열을 갖는다.
진핵생물 숙주 세포의 예는 척추동물 세포, 곤충 세포 및 효모 세포를 포함한다. 척추동물 세포로서는, 예를 들어 원숭이 COS 세포 (Gluzman, Y. Cell (1981) 23, pp. 175-182, ATCC CRL-1650; ATCC: American Type Culture Collection), 쥐과 섬유아세포 NIH3T3 (ATCC 번호 CRL-1658), 및 중국 햄스터 난소 세포 (CHO 세포; ATCC: CCL-61) 의 디히드로폴레이트 환원효소-결손주 (Urlaub, G. and Chasin, L. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, pp. 4126-4220); 등이 종종 사용되고 있으나, 세포가 이들로 한정되지는 않는다.
이에 따라 수득한 형질전환체는 당업계에서 통상 실시되는 방법에 따라 배양할 수 있고, 상기 형질전환체를 배양함으로써 세포내 또는 세포외에서 표적 폴리펩티드가 생성된다.
배양에 사용되는 적합한 배지는, 이용한 숙주 세포에 따라 각종 흔히 사용되는 배양 배지로부터 선택될 수 있다. 대장균이 이용되는 경우, 예를 들어 LB 배지에 필요에 따라 암피실린 등의 항생제 또는 IPMG 를 보충하여 사용할 수 있다.
상기 배양을 통해 형질전환체에 의해 세포내 또는 세포외에서 생성되는 재조합 단백질은, 상기 단백질의 물리적 또는 화학적 특성을 이용한 임의의 각종 공지된 분리법에 의해 분리하고 정제할 수 있다.
그 방법의 구체예는, 통상적인 단백질 침전제로의 처리, 한외여과, 분자체 크로마토그래피 (겔 여과), 흡착 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 및 친화성 크로마토그래피와 같은 각종 액체 크로마토그래피, 투석법 및 이의 조합을 포함한다.
또한, 발현시키는 재조합 단백질에 6 개 히스티딘 잔기의 태그를 부착시켜, 상기 단백질을 니켈 친화성 컬럼으로 효율적으로 정제할 수 있다. 대안적으로, 발현시키는 재조합 단백질에 IgG Fc 부위를 부착시켜, 상기 단백질을 단백질 A 컬럼으로 효율적으로 정제할 수 있다.
상기 방법을 조합하여, 대량의 표적 폴리펩티드를 고수율 및 고순도로 용이하게 생성시킬 수 있다.
상기 기재한 형질전환체 자체를 항원으로서 사용할 수 있다. HER2 를 발현하는 세포주를 항원으로서 사용할 수도 있다. 이러한 세포주의 예는, 인간 유방암주 SK-BR-3, BT-474, KPL-4 및 JIMT-1, 인간 위암주 NCI-N87, 및 인간 난소암주 SK-OV-3 을 포함할 수 있다. HER2 를 발현하는 한, 본 발명의 세포주는 이들 세포주로 한정되지 않는다.
(2) 항-HER2 단일클론 항체 생성
HER2 와 특이적으로 결합하는 항체의 예는 HER2 와 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 포함하며, 이러한 항체의 수득 방법은 하기 기재한 바와 같다.
단일클론 항체 생성에는 일반적으로 하기의 작업 공정이 필요하다:
(a) 항원으로서 사용하는 생체중합체의 정제, 또는 항원 발현 세포의 제조 공정;
(b) 항원을 동물에 주사함으로써 면역화하고, 혈액을 채취하고, 이의 항체 역가를 검정하여 비장 적출 시기를 결정함에 의한 항체 생성 세포 제조 공정;
(c) 골수종 세포 (이하 "골수종" 으로 지칭함) 의 제조 공정;
(d) 항체 생성 세포와 골수종의 융합 공정;
(e) 필요로 하는 항체를 생성하는 하이브리도마 군의 선별 공정;
(f) 단일 세포 클론으로의 하이브리도마 분할 (클로닝) 공정;
(g) 임의로는, 단일클론 항체를 대량으로 생성하기 위한 하이브리도마의 배양, 또는 하이브리도마를 이식한 동물의 사육 공정;
(h) 이에 따라 생성된 단일클론 항체의 생물학적 활성 및 결합 특이성 검사, 또는 표지 시약으로서의 특성의 검정 공정; 등.
이하, 단일클론 항체의 생성 방법을 상기 공정에 따라 상세히 설명하지만, 그 방법이 이에 한정되는 것은 아니며, 예를 들어 비장 세포 이외의 항체 생성 세포 및 골수종을 사용할 수 있다.
(a) 항원의 정제
항원으로서는, 상기 기재한 바와 같은 방법으로 제조한 HER2 또는 그 일부를 사용할 수 있다.
또한, HER2 발현 재조합 세포로부터 제조된 막 분획물, 또는 HER2 발현 재조합 세포 자체, 및 또한 당업자에게 공지된 방법에 의해 화학적으로 합성된 본 발명의 단백질의 부분 펩티드를 항원으로서 사용할 수도 있다.
게다가, HER2 발현 세포주를 항원으로서 사용할 수도 있다.
(b) 항체 생성 세포의 제조
공정 (a) 에서 수득한 항원을 프로인드 완전 또는 불완전 아쥬반트, 또는 칼륨명반과 같은 보조제와 혼합하고, 생성된 혼합물을 면역원으로서 사용하여 실험 동물을 면역화시킨다. 또 다른 방법에는, 항원 발현 세포를 면역원으로서 사용하여 실험 동물을 면역화하는 것도 포함된다. 실험 동물로서는, 공지된 하이브리도마 생성법에서 사용되는 임의의 동물을 지장없이 사용할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어 마우스, 래트, 염소, 양, 소, 말 등을 사용할 수 있다. 그러나, 추출한 항체 생성 세포와 융합되는 골수종 세포의 입수 용이성의 관점에서, 마우스 또는 래트를 면역화되는 동물로서 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 사용하는 마우스 및 래트의 계통에는 특별히 제한은 없고, 마우스의 경우 예를 들어 각종 계통 A, AKR, BALB/c, BDP, BA, CE, C3H, 57BL, C57BL, C57L, DBA, FL, HTH, HT1, LP, NZB, NZW, RF, R III, SJL, SWR, WB, 129 등, 및 래트의 경우 예를 들어 Wistar, Low, Lewis, Sprague, Dawley, ACI, BN, Fischer 등을 사용할 수 있다.
이들 마우스 및 래트는, 예를 들어 CLEA Japan, Inc. 및 Charles River Laboratories Japan Inc. 의 실험 동물 사육/판매업자로부터 입수할 수 있다.
피면역 동물로서는, 후술한 골수종 세포와의 융합 적합성을 감안하면, 마우스의 경우 BALB/c 계통, 래트의 경우 Wistar 및 Low 계통이 특히 바람직하다.
또한, 인간과 마우스 사이의 항원 상동성을 고려하여, 자기 항체를 제거하는 생물학적 기능이 감소된 마우스, 즉 자가면역 질환 마우스를 사용하는 것이 또한 바람직하다.
이러한 마우스 또는 래트의 면역화시 주령은, 바람직하게는 5 내지 12 주령, 보다 바람직하게는 6 내지 8 주령이다.
HER2 또는 이의 재조합체로 동물을 면역화하기 위해, 예를 들어 [Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987); Kabat, E. A. and Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Springfield, Illinois (1964)] 등에 상세하게 기재되어 있는 공지된 방법을 사용할 수 있다.
이러한 면역화 방법 중에서, 본 발명에 있어서 바람직한 방법은 예를 들어 하기와 같다.
즉, 먼저, 항원으로서 역할하는 막 단백질 분획물, 또는 항원을 발현하는 세포를 동물의 피내 또는 복강내에 투여한다. 그러나, 면역 효율을 증가시키기 위해서는 두 투여 경로 모두의 병용이 바람직하며, 전반부에는 피내 투여를 실시하고 후반부 또는 최종 투여에서만 복강내 투여를 실시하면, 특히 면역 효율을 증가시킬 수 있다.
항원의 투여 스케줄은 피면역 동물의 종류, 개체차 등에 의해 상이하다. 그러나 일반적으로는, 항원 투여 횟수 3 내지 6 회 및 투여 간격 2 내지 6 주인 투여 스케줄이 바람직하고, 항원 투여 횟수 3 내지 4 회 및 투여 간격 2 내지 4 주인 투여 스케줄이 보다 바람직하다.
또한 항원의 투여량은 동물의 종류, 개체차 등에 의해 상이하지만, 일반적으로는 0.05 내지 5 mg, 바람직하게는 약 0.1 내지 0.5 mg 로 설정된다.
추가 면역 (booster immunization) 은 상기 기재한 항원 투여의 1 내지 6 주 후, 바람직하게는 1 내지 4 주 후, 보다 바람직하게는 1 내지 3 주 후에 실시된다. 면역원이 세포인 경우, 1x106 내지 1x107 개의 세포를 사용한다.
추가 면역을 실시할 때의 항원 투여량은 동물의 종류 또는 크기 등에 의해 상이하지만, 예를 들어 마우스의 경우에는 투여량을 일반적으로 0.05 내지 5 mg, 바람직하게는 0.1 내지 0.5 mg, 보다 바람직하게는 약 0.1 내지 0.2 mg 로 설정한다. 면역원이 세포인 경우, 1x106 내지 1x107 개의 세포를 사용한다.
상기 추가 면역으로부터 1 내지 10 일 후, 바람직하게는 2 내지 5 일 후, 보다 바람직하게는 2 내지 3 일 후에 피면역 동물로부터 항체 생성 세포를 포함하는 비장 세포 또는 림프구를 무균적으로 제거한다. 그 때 항체 역가를 측정하고, 항체 역가가 충분히 증가한 동물을 항체 생성 세포의 공급원으로서 이용하면, 이후 절차를 보다 효율적으로 실시할 수 있다.
여기서 사용되는 항체 역가의 측정법의 예는, RIA 법 및 ELISA 법을 포함하지만, 이들의 방법으로 제한되지 않는다. 예를 들어 ELISA 법을 이용하는 경우, 본 발명에 있어서의 항체 역가의 측정은 하기에 기재하는 바와 같은 절차에 따라 실시할 수 있다.
먼저, 정제 또는 부분 정제한 항원을 ELISA 용 96 웰 플레이트와 같은 고체상 표면에 흡착시키고, 항원이 흡착하고 있지 않는 고체상 표면을 항원과 무관한 단백질, 예컨대 소 혈청 알부민 (BSA) 으로 커버한다. 표면을 세정한 후, 제 1 항체로서 연속 희석한 샘플 (예를 들어 마우스 혈청) 과 접촉시켜, 상기 항원에 샘플 중의 항체를 결합시킨다.
추가로, 제 2 항체로서 마우스 항체에 대한 효소 표지된 항체를 첨가하고 마우스 항체에 결합시킨다. 세정 후 상기 효소의 기질을 첨가하고 기질 분해에 의해 유도된 발색에 의한 흡광도 변화 등을 측정하고, 항체 역가를 계산한다.
피면역 동물의 비장 세포 또는 림프구로부터의 항체 생성 세포의 분리는 공지된 방법 (예를 들어, Kohler et al., Nature (1975), 256, p. 495; Kohler et al., Eur. J. Immunol. (1977), 6, p. 511; Milstein et al., Nature (1977), 266, p. 550; Walsh, Nature, (1977), 266, p. 495) 에 따라 실시할 수 있다. 예를 들어 비장 세포의 경우, 비장을 균질화에 의해 분리하여 스테인레스 메쉬로 여과함으로써 세포를 수득하고 이글 최소 필수 배지 (MEM) 에 세포를 현탁함으로써 항체 생성 세포를 분리하는 일반적 방법을 이용할 수 있다.
(c) 골수종 세포 (이하, "골수종" 으로 지칭함) 의 제조
세포 융합에 사용하는 골수종 세포에는 특별한 제한은 없고, 공지된 세포주로부터 적절히 선택할 수 있다. 그러나, 융합 세포로부터 하이브리도마를 선택할 때의 편리성을 고려하여, 선택 절차가 확립되어 있는 HGPRT (히폭산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라아제 (hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase)) 결손주를 사용하는 것이 바람직하다.
보다 구체적으로, HGPRT-결손주는 마우스 유래의 X63-Ag8 (X63), NS1-ANS/1 (NS1), P3X63-Ag8.U1 (P3U1), X63-Ag8.653 (X63.653), SP2/0-Ag14 (SP2/0), MPC11-45.6TG1.7 (45.6 TG), FO, S149/5XXO 및 BU.1; 래트 유래의 210.RSY3.Ag.1.2.3 (Y3); 및 인간 유래의 U266AR (SKO-007), GM1500ㆍGTG-A12 (GM1500), UC729-6, LICR-LOW-HMy2 (HMy2) 및 8226AR/NIP4-1 (NP41) 을 포함한다. 이들 HGPRT 결손주는 예를 들어 ATCC 등으로부터 입수할 수 있다.
이들 세포주는 적당한 배지, 예컨대 8-아자구아닌 배지 [RPMI 1640 배지에 글루타민, 2-메르캅토에탄올, 겐타마이신 및 소 태아 혈청 (이하 "FCS" 로 지칭함) 을 보충한 배지에 8-아자구아닌을 첨가한 배지], 이스코브 개질 둘베코 배지 (Iscove's Modified Dulbecco's Medium) (이하, "IMDM" 으로 지칭함) 또는 둘베코 개질 배지 (Dulbecco's Modified Eagle Medium) (이하, "DMEM" 으로 지칭함) 중에서 계대배양한다. 이러한 경우, 세포 융합 수행 3 내지 4 일 전에 세포를 정상 배지 (예를 들어, 10% FCS 를 함유하는 ASF104 배지 (Ajinomoto Co., Ltd.사제)) 중 계대배양하여, 세포 융합 당일에 2x107 개 이상의 세포를 확보해 둔다.
(d) 세포 융합
항체 생성 세포와 골수종 세포 사이의 융합은, 공지된 방법 (Weir, D. M., Handbookof Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987); Kabat, E. A. and Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Springfield, Illinois (1964) 등) 에 따라, 세포의 생존률을 극도로 저하시키지 않는 조건 하에서 적절히 실시할 수 있다.
이러한 방법으로서 예를 들어, 고농도에서의 폴리에틸렌 글리콜과 같은 중합체 함유 용액 중에서 항체 생성 세포와 골수종 세포를 혼합하는 화학적 방법, 전기적 자극을 이용하는 물리적 방법 등을 사용할 수 있다. 이 중, 상기 화학적 방법의 구체예는 하기에서 설명한 바와 같다.
즉, 고농도에서의 중합체 함유 용액에서 폴리에틸렌 글리콜을 사용하는 경우, 분자량 1500 내지 6000, 보다 바람직하게는 2000 내지 4000 의 폴리에틸렌 글리콜 용액 중에서, 30 내지 40℃, 바람직하게는 35 내지 38℃ 의 온도에서 항체 생성 세포와 골수종 세포를 1 내지 10 분, 바람직하게는 5 내지 8 분 동안 혼합한다.
(e) 하이브리도마 군의 선택
상기 세포 융합에 의해 수득되는 하이브리도마의 선택 방법은 특별히 제한은 없다. 통상, HAT (히폭산틴, 아미노프테린, 티미딘) 선택법 (Kohler et al., Nature (1975), 256, p. 495; Milstein et al., Nature (1977), 266, p. 550) 이 사용된다.
이 방법은, 아미노프테린의 존재 하 생존할 수 없는 HGPRT-결손주의 골수종 세포를 사용하여 하이브리도마를 수득하는 경우에 유효하다. 즉, 미융합 세포 및 하이브리도마를 HAT 배지 중 배양함으로써, 아미노프테린에 대한 내성을 갖는 하이브리도마만을 선택적으로 잔존시키고 증식시킬 수 있다.
(f) 단일 세포 클론으로의 분화 (클로닝)
하이브리도마의 클로닝법으로서는, 예를 들어 메틸셀룰로오스법, 연질 아가로오스법 또는 한계 희석법과 같은 공지된 방법을 사용할 수 있다 (예를 들어 Barbara, B. M. and Stanley, M. S.: Selected Methods in Cellular Immunology, W.H. Freeman and Company, San Francisco (1980) 참조). 이들 방법 중에서, 특히 메틸셀룰로오스법과 같은 삼차원 배양법이 바람직하다. 예를 들어, 세포 융합에 의해 형성된 하이브리도마 군을 ClonaCell-HY 선택 배지 D (StemCell Technologies, Inc.사제 ＃03804) 등의 메틸 셀룰로오스 배지에 현탁하고 배양한다. 그런 다음, 형성된 하이브리도마 콜로니를 수집함으로써 모노클론 하이브리도마를 수득할 수 있다. 수집된 각 하이브리도마 콜로니를 배양하고, 수득한 하이브리도마 배양 상청액 중 안정적으로 항체 역가를 갖는 것으로 확인된 하이브리도마를 HER2 단일클론 항체 생성 하이브리도마 주로서 선택한다.
(g) 하이브리도마의 배양에 의한 단일클론 항체의 제조
이에 따라 선택된 하이브리도마를 배양함으로써, 단일클론 항체를 효율적으로 수득할 수 있다. 그러나 배양 전에, 표적 단일클론 항체를 생성하는 하이브리도마를 스크리닝하는 것이 바람직하다.
이 스크리닝에는 공지된 방법을 이용할 수 있다.
본 발명에 있어서의 항체 역가의 측정은, 예를 들어 상기 항목 (b) 에서 설명한 ELISA 법에 의해 실시할 수 있다.
상기 방법에 의해 수득한 하이브리도마는, 액체 질소 중 또는 -80℃ 이하의 냉동고 안에 동결 상태로 보존할 수 있다.
클로닝 완료 후, 배지를 HT 배지로부터 정상 배지로 바꾸고, 하이브리도마를 배양한다.
대량 배양은, 대형 배양 병을 사용한 회전 배양, 또는 스피너-배양에 의해 수행된다. 상기 대량 배양에 의해 수득한 상청액으로부터, 겔 여과와 같은 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 정제함으로써, 본 발명의 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 수득할 수 있다.
또한, 동일 계통의 마우스 (예를 들어, 상기 BALB/c) 또는 Nu/Nu 마우스의 복강내에 하이브리도마를 주사하여 상기 하이브리도마를 증식시킴으로써, 본 발명의 단일클론 항체를 대량으로 함유하는 복수를 수득할 수 있다.
복강내에 투여하는 경우, 그로부터 3 내지 7 일 전에 2,6,10,14-테트라메틸 펜타데칸 (프리스탄) 등의 광물유를 투여하는 경우, 보다 다량의 복수를 수득할 수 있다.
예를 들어, 하이브리도마와 동일 계통의 마우스의 복강내에 미리 면역억제제를 주사하여 T 세포를 불활성화시킨다. 20 일 후, 106 내지 107 개의 하이브리도마 클론 세포를 혈청-불포함 배지 중 현탁하고 (0.5 ml), 현탁액을 마우스의 복강내에 투여한다. 일반적으로, 복부가 팽만해지고 복수가 고였을 때, 마우스로부터 복수를 수집한다. 이 방법에 의해, 배양액 중에 비해 약 100 배 이상인 농도로 단일클론 항체를 수득할 수 있다.
상기 방법에 의해 수득한 단일클론 항체는, 예를 들어 [Weir, D. M.: Handbook of Experimental Immunology, Vol. I, II, III, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1978)] 에 기재되어 있는 방법에 의해 정제할 수 있다.
이에 따라 수득한 단일클론 항체는 HER2 에 대해 높은 항원 특이성을 갖는다. 본 발명의 단일클론 항체의 예는, 특별히 제한은 없지만, 마우스 단일클론 항체 4D5 (ATCC CRL 10463) 를 포함할 수 있다.
(h) 단일클론 항체의 검정
이에 따라 수득한 단일클론 항체의 동형 및 하위부류는 하기와 같이 결정할 수 있다.
먼저, 동정법의 예는 오크테를로니 (Ouchterlony) 법, ELISA 법 및 RIA 법을 포함한다.
오크테를로니법은 간단하지만, 단일클론 항체의 농도가 낮은 경우에는 농축 작업이 필요하다.
한편, ELISA 법 또는 RIA 법을 사용한 경우에는, 배양 상청액을 직접 항원 흡착 고체상과 반응시키고 제 2 차 항체로서 각종 면역글로불린 동형 및 하위부류에 대응하는 항체를 사용하여, 단일클론 항체의 동형 및 하위부류를 동정하는 것이 가능하다.
추가로, 간단한 방법으로서, 시판되는 동정 키트 (예를 들어, Bio-Rad Laboratories, Inc.사제 Mouse Typer 키트) 등을 이용할 수도 있다.
또한, 단백질의 정량 측정은 폴린 로우리 (Folin Lowry) 법 및 280 nm 에서의 흡광도 (1.4 (OD 280) = 면역글로불린 1 mg/ml) 를 기반으로 한 계산 방법에 의해 실시할 수 있다.
또한, (2) 에서의 (a)~(h) 의 공정을 다시 실시하여 별도로 및 독립적으로 단일클론 항체를 수득하는 경우에도, (g) 의 공정으로 수득한 항-HER2 항체와 동등의 세포독성 활성을 갖는 항체를 수득하는 것이 가능하다. 이러한 항체의 일례로서, (g) 의 공정으로 수득한 항-HER2 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 들 수 있다. 새롭게 생성된 단일클론 항체가, 상기 항-HER2 항체가 결합하는 부분적 펩티드 또는 부분적 입체 구조에 결합하는 경우, 이는 그 단일클론 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 것으로 판정할 수 있다. 또한, HER2 에 대한 결합에 대해 항-HER2 항체와 단일클론 항체가 경합하는 (즉, 상기 단일클론 항체가 상기 항-HER2 항체와 HER2 사이의 결합을 저해함) 것을 확인함으로써, 구체적인 에피토프 서열 또는 구조가 결정되어 있지 않아도 그 단일클론 항체가 항-HER2 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 것으로 판정할 수 있다. 단일클론 항체가 항-HER2 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 것이 확인되는 경우, 단일클론 항체는 항-HER2 항체와 동등한 항원 결합 친화성 또는 생물학적 활성을 갖는 것이 강하게 예측된다.
(3) 그 밖의 항체
본 발명의 항체에는, 상기 HER2 에 대한 단일클론 항체 뿐 아니라 인간에 대한 이종 항원성을 감소시키는 것을 목적으로 인위적으로 변형한 재조합 항체 예컨대 키메라 항체, 인간화 항체 및 인간 항체도 포함된다. 이들 항체는 공지된 방법을 사용하여 생성될 수 있다.
키메라 항체로서는, 항체의 가변부와 불변부가 상이한 종에서 유래한 항체, 예를 들어 마우스 또는 래트 유래 항체의 가변부를 인간 유래 항체의 불변부에 연결한 키메라 항체를 예로 들 수 있다 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6851-6855, (1984) 참조). 본 발명의 키메라 항체의 예는 특별히 제한은 없지만, 인간 IgG1 또는 IgG2 의 중쇄 불변부를 포함하는 키메라 항체 4D5 를 포함할 수 있다.
인간화 항체로서는, 상보성 결정 부위 (CDR) 만을 인간 유래 항체에 혼입하여 수득한 항체 (Nature (1986) 321, p. 522-525 참조), 및 CDR 이식법에 의해 인간 항체에 CDR 서열 뿐 아니라 일부의 골격의 아미노산 잔기를 이식하여 수득한 항체 (WO 90/07861), 및 유전자 변환 돌연변이유발 (gene conversion mutagenesis) 전략을 사용하여 인간화된 항체 (미국 특허 제 5821337 호) 를 예로 들 수 있다.
본 명세서에 있어서의 용어 "여러 개" 는 1 내지 10 개, 1 내지 9 개, 1 내지 8 개, 1 내지 7 개, 1 내지 6 개, 1 내지 5 개, 1 내지 4 개, 1 내지 3 개, 또는 1 또는 2 개를 의미한다.
본 명세서에서의 아미노산 치환으로서는 보존적 아미노산 치환이 바람직하다. 보존적 아미노산 치환이란, 아미노산 측쇄에 관련이 있는 아미노산 기 내에서 발생하는 치환을 나타낸다. 바람직한 아미노산 기는 하기와 같다: 산성 기 (아스파르트산 및 글루탐산); 염기성 기 (리신, 아르기닌 및 히스티딘); 비극성 기 (알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌 및 트립토판); 및 비대전 극성 부류 (글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌 및 티로신). 보다 바람직한 아미노산 기는 하기와 같다: 지방족 히드록시기 (세린 및 트레오닌); 아미드-함유기 (아스파라긴 및 글루타민); 지방족 기 (알라닌, 발린, 류신 및 이소류신); 및 방향족 기 (페닐알라닌, 트립토판 및 티로신). 이러한 아미노산 치환은 원래의 아미노산 서열을 갖는 물질의 특성을 손상시키지 않는 범위에서 수행하는 것이 바람직하다.
상기 기재한 중쇄 아미노산 서열과 높은 상동성을 갖는 서열과 상기 기재한 경쇄 아미노산 서열과 높은 상동성을 갖는 서열을 조합함으로써, 상기의 각 항체와 동등한 생물학적 활성을 갖는 항체를 선택하는 것이 가능하다. 이러한 상동성은, 일반적으로는 80% 이상의 상동성이며, 바람직하게는 90% 이상의 상동성이며, 보다 바람직하게는 95% 이상의 상동성이며, 가장 바람직하게는 99% 이상의 상동성이다. 또한, 중쇄 또는 경쇄 아미노산 서열에 1 내지 여러 개의 아미노산 잔기가 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 서열을 조합함으로써, 상기 기재한 각 항체와 동등한 생물학적 활성을 갖는 항체를 선택하는 것도 가능하다. 본 명세서에 있어서의 용어 "상동성" 은 "동일성" 과 같은 의미로 사용된다.
2 가지 아미노산 서열간의 상동성은, Blast algorithm version 2.2.2 (Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaeffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402) 의 디폴트 매개변수를 사용함으로써 결정할 수 있다. Blast algorithm 은 인터넷 주소 www.ncbi.nlm.nih.gov/blast 에 접근함으로써도 사용할 수 있다.
또한 본 발명의 항체는, HER2 에 결합하는 인간 항체를 포함한다. 항-HER2 인간 항체란, 인간 염색체 유래 항체의 유전자 서열만을 갖는 인간 항체를 의미한다. 항-HER2 인간 항체는, 인간 항체의 중쇄 및 경쇄 유전자를 포함하는 인간 염색체 단편을 갖는 인간 항체 생성 마우스를 사용하는 방법 (Tomizuka, K. et al., Nature Genetics (1997) 16, pp. 133-143; Kuroiwa, Y. et. al., Nucl. Acids Res. (1998) 26, pp. 3447-3448; Yoshida, H. et. al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects vol. 10, pp. 69-73 (Kitagawa, Y., Matsuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999; Tomizuka, K. et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97, pp. 722-727 등을 참조) 에 의해 수득할 수 있다.
이러한 인간 항체 생성 마우스는 구체적으로 하기와 같이 제작될 수 있다. 내재성 면역글로블린 중쇄 및 경쇄의 유전자자리가 파괴되고 대신에 효모 인공 염색체 (YAC) 벡터 등을 통해 인간 면역글로블린 중쇄 및 경쇄의 유전자자리가 도입된 유전자 조작 동물이, 녹아웃 동물 및 트랜스제닉 동물의 제작 및 이들 동물의 교배에 의해 만들어진다.
또한, 재조합 DNA 기법에 따라, 이러한 인간 항체의 중쇄 및 경쇄 각각을 인코딩하는 cDNA, 바람직하게는 이러한 cDNA 를 포함하는 벡터를 사용하여, 진핵세포를 형질전환하고, 재조합 인간 단일클론 항체를 생성하는 형질전환체 세포를 배양함으로써, 상기 항체를 배양 상청액으로부터 수득할 수도 있다.
여기서, 숙주로서는 예를 들어 진핵세포, 바람직하게는 CHO 세포, 림프구나 골수종과 같은 포유동물 세포를 사용할 수 있다.
또한, 인간 항체 라이브러리에서 선별한 파지 디스플레이-유래 인간 항체를 수득하는 방법 (Wormstone, I. M. et. al, Investigative Ophthalmology ＆ Visual Science. (2002) 43 (7), pp. 2301-2308; Carmen, S. et. al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1 (2), pp. 189-203; Siriwardena, D. et. al., Ophthalmology (2002) 109 (3), pp. 427-431 등 참조) 이 또한 알려져 있다.
예를 들어, 인간 항체의 가변부를 단쇄 항체 (scFv) 로서 파지 표면 상에 발현시키고, 항원에 결합하는 파지를 선택하는 파지 디스플레이법 (Nature Biotechnology (2005), 23, (9), pp. 1105-1116) 을 사용할 수 있다.
항원에 대한 결합을 기반으로 선택된 파지의 유전자를 분석함으로써, 항원에 결합하는 인간 항체의 가변부를 인코딩하는 DNA 서열을 결정할 수 있다.
항원에 결합하는 scFv 의 DNA 서열이 결정되는 경우, 당해 서열을 포함하는 발현 벡터를 제작하고, 적당한 숙주에 도입하여 이를 발현시킴으로써 인간 항체를 수득할 수 있다 (WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388; Annu. Rev. Immunol (1994) 12, pp. 433-455; Nature Biotechnology (2005) 23 (9), pp. 1105-1116).
항체의 특성 비교에 있어서 사용되는 또 다른 지표의 일례로서는, 항체의 안정성을 예로 들 수 있다. 시차 주사 열량계 (DSC) 는, 단백질의 상대적 구조 안정성이 바람직한 지표로서 사용되는 열 변성 중점 온도 (Tm) 를 신속하고 정확하게 측정할 수 있는 장치이다. DSC 를 사용하여 Tm 값을 측정하고 그 값을 비교함으로써, 열 안정성의 차이를 비교할 수 있다. 항체의 보존 안정성은, 항체의 열 안정성과 어느 정도의 상관 관계를 나타내는 것으로 알려져 있으며 (Lori Burton, et. al., Pharmaceutical Development and Technology (2007) 12, pp. 265-273), 열 안정성을 지표로서 사용하여 바람직한 항체를 선택할 수 있다. 항체 선택을 위한 다른 지표의 예는 하기의 것을 포함한다: 적절한 숙주 세포에서의 수율이 높은 것; 및 수용액 중의 응집성이 낮은 것. 예를 들어 최고 수율을 나타내는 항체가 항상 최고 열 안정성을 나타내지는 않으며, 따라서 상기 기재한 지표를 기반으로 종합적으로 평가하여, 인간에 대한 투여에 가장 적합한 항체를 선택할 필요가 있다.
본 발명에서, 항체의 개질된 변이체가 또한 포함된다. 개질된 변이체란, 본 발명의 항체를 화학적 또는 생물학적 개질 처리하여 수득한 변이체를 의미한다. 화학적 개질 변이체의 예에는, 아미노산 골격에 화학적 부분을 연결시켜 화학적 개질된 변이체, N-연결 또는 O-연결 탄수화물 사슬로 화학적 개질된 변이체 등이 포함된다. 생물학적인 개질 변이체의 예에는, 번역 후 개질 (예컨대 N-연결 또는 O-연결 글리코실화, N- 또는 C-말단 프로세싱, 탈아미드화, 아스파르트산의 이성질체화, 또는 메티오닌의 산화) 에 의해 수득한 변이체, 및 원핵생물 숙주 세포에서 발현시켜 N-말단에 메티오닌 잔기가 부가한 변이체가 포함된다. 또한, 본 발명의 항체 또는 항원의 검출 또는 단리가 가능해지도록 표지된 항체, 예를 들어, 효소 표지 항체, 형광 표지 항체 및 친화성 표지 항체도 이러한 개질된 변이체의 의미에 포함된다. 이러한 본 발명의 항체의 개질된 변이체는, 항체의 안정성 및 혈중 체류성의 개선, 항원성의 저감, 항체 또는 항원의 검출 또는 단리 등에 유용하다.
또한, 본 발명의 항체에 연결되는 글리칸의 개질을 조절함 (글리코실화, 탈푸코실화 등) 으로써, 항체 의존성 세포독성 활성을 증강하는 것이 가능하다. 항체의 글리칸의 개질을 조절하는 기법로서는, WO 99/54342, WO 00/61739호, WO 02/31140 등이 알려져 있다. 그러나, 기법이 이들로 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 항체에는 글리칸 개질이 조절되는 항체도 포함된다.
항체 유전자를 일단 단리한 후, 적당한 숙주에게 유전자를 도입하여 항체를 생성시키는 경우에는, 적당한 숙주와 적절한 발현 벡터의 조합을 사용할 수 있다. 항체 유전자의 구체예로서는, 본 명세서에 기재된 항체의 중쇄 서열을 인코딩하는 유전자 및 이의 경쇄 서열을 인코딩하는 유전자의 조합이 포함된다. 숙주 세포를 형질전환하는 경우, 중쇄 서열 유전자 및 경쇄 서열 유전자를 동일한 발현 벡터에 삽입할 수 있으며, 또한 상이한 발현 벡터에 별도로 삽입할 수 있다.
진핵세포를 숙주로서 사용하는 경우, 동물 세포, 식물 세포 및 진핵 미생물을 사용할 수 있다. 동물 세포로서는, 포유류 세포, 예를 들어 원숭이 COS 세포 (Gluzman, Y. Cell, (1981) 23, pp. 175-182, ATCC CRL-1650), 마우스 섬유아세포 NIH3T3 (ATCC 번호 CRL-1658) 및 중국 햄스터 난소 세포 (CHO 세포; ATCC: CCL-61) 의 디히드로폴레이트 환원효소 결손주 (Urlaub, G. and Chasin, L. A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, pp. 4126-4220) 를 예로 들 수 있다.
원핵세포를 사용하는 경우에는, 예를 들어 대장균 및 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 를 예로 들 수 있다.
이들의 세포에 원하는 항체 유전자를 형질전환을 통해 도입하고, 형질전환된 세포를 시험관내 배양함으로써 항체를 수득할 수 있다. 상기 기재한 배양법에 있어서, 항체의 서열에 따라 수율이 때때로 가변적일 수 있으며, 따라서 동등한 결합 활성을 갖는 항체 중에서 수율을 지표로서 사용하여 의약으로서 용이하게 생성되는 항체를 선별할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체에서는, 상기 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 공정, 및 배양 공정에서 수득한 배양물로부터 원하는 항체를 수집하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체 생성 방법에 의해 수득한 항체가 또한 포함된다.
또한, 배양된 포유류 세포에서 생성되는 항체의 중쇄의 카르복실 말단의 리신 잔기가 결실되어 있음이 알려져 있으며 (Journal of Chromatography A, 705: 129-134 (1995)), 또한 배양된 포유류 세포에서 생성된 항체의 중쇄 카르복실 말단에서 2 개 아미노산 잔기 (글리신 및 리신) 이 결실되어 있고 카르복실 말단에서 새로이 위치하는 프롤린 잔기가 아미드화되는 것이 알려져 있다 (Analytical Biochemistry, 360: 75-83 (2007)). 그러나, 이들의 중쇄 서열의 결실 및 개질은 항체의 항원-결합 친화성 및 효과기 기능 (보체의 활성화, 항체 의존성 세포독성 등) 에는 영향을 미치지 않는다. 따라서, 본 발명에 따른 항체에서는, 항체의 이러한 개질 처리된 항체 및 항체의 기능적 단편도 포함되고, 중쇄 카르복실 말단에서 1 또는 2 개의 아미노산이 결실되는 결실 변이체, 결실 변이체의 아미드화에 의해 수득된 변이체 (예를 들어, 카르복실 말단 프롤린 잔기가 아미드화된 중쇄) 등도 포함된다. 항원 결합 친화성 및 효과기 기능이 유지되고 있는 한, 본 발명에 따른 항체의 중쇄의 카르복실 말단에서 결실을 갖는 결실 변이체는 상기의 종류로 한정되지 않는다. 본 발명에 따른 항체를 구성하는 2 개 중쇄는, 전체 길이 중쇄 및 상기 결실 변이체로 이루어지는 군에서 선택되는 유형 중 하나일 수 있거나, 그로부터 선택되는 조합 중 2 개 유형일 수 있다. 각 결실 변이체 양의 비는 본 발명에 따른 항체를 생성하는 배양된 포유류 세포의 유형 및 배양 조건에 영향을 받을 수 있지만, 본 발명에 따른 항체의 주성분으로서 함유된 2 개의 중쇄의 쌍방에서 카르복실 말단에서 하나의 아미노산 잔기가 결실되는 경우를 예로 들 수 있다.
본 발명의 항체의 동형으로서는, 예를 들어 IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) 를 예로 들 수 있지만, 바람직하게는 IgG1 또는 IgG2 를 예로 들 수 있다.
항체의 생물학적 활성으로서는, 일반적으로는 항원 결합 활성, 항원과 결합함으로써 그 항원을 발현하는 세포에 내재화하는 활성, 항원의 활성을 중화하는 활성, 항원의 활성을 증강하는 활성, 항체 의존성 세포독성 (ADCC) 활성, 보체 의존성 세포독성 (CDC) 활성 및 항체 의존성 세포 매개 식균작용 (ADCP) 을 예로 들 수 있다. 본 발명의 항체의 생물학적 활성은 HER2 에 대한 결합 활성이며, 바람직하게는 HER2 와 결합함으로써 HER2 발현 세포에 내재화하는 활성이다. 게다가 본 발명의 항체는 세포 내재화 활성에 추가로, ADCC 활성, CDC 활성 및/또는 ADCP 활성을 가질 수 있다.
수득한 항체는 균일하게 정제할 수 있다. 항체의 분리 및 정제는 통상적인 단백질 분리 및 정제 방법을 이용하여 실시될 수 있다. 예를 들어 컬럼 크로마토그래피, 필터 여과, 한외여과, 염 침전, 투석, 분취용 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 등전점 전기영동 등을 적절히 선택 및 조합하여 항체를 분리하고 정제할 수 있으나 (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak et al. eds., Cold SpringHarbor Laboratory Press (1996); Antibodies: A Laboratory Manual. EdHarlow and David Lane, Cold SpringHarbor Laboratory (1988)), 상기 방법이 이들로 한정되는 것은 아니다.
크로마토그래피의 예로서는, 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피 및 흡착 크로마토그래피를 포함한다.
이러한 크로마토그래피는, HPLC 또는 FPLC 와 같은 액체 크로마토그래피를 사용하여 실시할 수 있다.
친화성 크로마토그래피에 사용하는 컬럼으로서는, 단백질 A 컬럼 및 단백질 G 컬럼을 예로 들 수 있다. 예를 들어, 단백질 A 컬럼을 사용한 컬럼으로서 Hyper D, POROS, Sepharose FF (Pharmacia Corporation) 등을 예로 들 수 있다.
또한, 항원을 고정화한 담체를 사용하여, 항원에 대한 결합성을 이용해 항체를 정제할 수도 있다.
[항종양 화합물]
본 발명의 항-HER2 항체-약물 접합체에 접합될 항종양 화합물을 설명한다. 본 발명에서 사용하는 항종양 화합물은 항종양 효과를 갖는 화합물이며 링커 구조에 연결될 수 있는 치환기 또는 부분 구조를 갖는 것이면 특별히 제한은 없다. 링커의 일부 또는 전부가 종양 세포 내에서 절단되는 경우, 항종양 화합물 부분이 방출되어 항종양 화합물의 항종양 효과가 발현된다. 링커가 약물과의 연결 부위에서 절단되므로, 항종양 화합물이 미개질 구조로 방출되어 고유의 항종양 효과가 발휘된다.
본 발명에서 사용되는 항종양 화합물로서, 캄토테신 유도체 중 하나인 엑사테칸 ((1S,9S)-1-아미노-9-에틸-5-플루오로-2,3-디히드로-9-히드록시-4-메틸-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-10,13(9H,15H)-디온; 하기 식으로 나타냄) 을 바람직하게 사용할 수 있다.
[식 14]
Figure pat00014
엑사테칸은 우수한 항종양 활성을 가지고 있지만, 항종양 약물로서 시판되고 있지는 않다. 상기 화합물은 공지된 방법으로 용이하게 수득할 수 있으며 위치 1 에서의 아미노기를 링커 구조에 대한 연결 위치로서 바람직하게 사용할 수 있다. 또한, 엑사테칸은 링커의 일부가 결합한 상태로 종양 세포 내에서 방출될 수 있으나, 이러한 구조로도 우수한 항종양 효과가 발휘되는 우수한 화합물이다.
엑사테칸은 캄토테신 구조를 갖기 때문에, 수성 산성 매질 (예를 들어 pH 3 정도) 에서는 폐쇄된 락톤 고리 (폐환) 를 갖는 구조로 평형이 이동하나, 수성 염기성 매질 (예를 들어 pH 10 정도) 에서는 개방된 락톤 고리 (개환) 를 갖는 구조로 평형이 이동하는 것으로 알려져 있다. 폐환 구조 및 개환 구조에 대응하는 엑사테칸 잔기가 도입된 약물 접합체가 또한 동일한 항종양 효과를 갖는 것으로 예측되며 이러한 구조 중 임의의 것도 본 발명의 범주 내에 포함된다는 것은 말할 필요도 없다.
항종양 화합물의 추가예는 독소루비신, 다우노루비신, 미토마이신 C, 블레오마이신, 시클로시스티딘, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 메토트렉세이트, 백금계 항종양제 (시스플라틴 또는 이의 유도체), 탁솔 또는 이의 유도체, 및 기타 캄토테신 또는 이의 유도체 (일본 공개특허공보 평 6-87746 호에 기재된 항종양제) 를 포함한다.
항체-약물 접합체와 관련하여, 항체 분자 당 약물의 접합수는, 유효성 및 안전성에 영향을 갖는 중요 인자이다. 항체-약물 접합체의 생성은, 약물의 접합수가 일정 수가 되도록 하는, 반응에 대한 원재료 및 시약의 사용량을 포함하는 반응 조건을 규정하여 실시된다. 저분자량 화합물의 화학 반응과는 달리, 상이한 수의 약물이 접합된 약물 분자를 함유하는 혼합물이 일반적으로 수득된다. 항체 분자 당 약물의 접합수는 평균치, 즉 약물 분자 평균 접합수라고 표현되거나 명시된다. 원칙으로서 달리 특히 기재되지 않는 한, 약물 분자 접합수는 상이한 약물 분자 접합수를 갖는 항체-약물 접합체 혼합물에 포함되는 특정 약물 분자 접합수를 갖는 항체-약물 접합체를 나타내는 경우를 제외하고는, 평균치를 의미한다.
항체 분자에 대한 엑사테칸 분자의 접합수는 제어가능하고, 항체 분자 당 약물 분자 평균 접합수로서, 약 1 내지 10 개의 엑사테칸을 연결시킬 수 있다. 바람직하게는 이는 2 내지 8 개이며, 보다 바람직하게는 3 내지 8 개이다. 또한, 당업자는 본원의 실시예의 기재를 기반으로 항체 분자에 대해 필요한 수의 약물 분자를 접합시키기 위한 반응을 설계할 수 있으며, 엑사테칸 분자의 제어된 수와 접합된 항체-약물 접합체를 수득할 수 있다.
[링커 구조]
본 발명의 항-HER2 항체-약물 접합체에 있어서, 항종양 화합물을 항-HER2 항체에 접합시키는 링커 구조를 설명한다. 상기 링커는 하기 식의 구조를 갖는다:
-L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-.
항체는 말단 L1 (L2 가 결합하는 것과 반대측의 말단) 에서 연결되며, 항종양 화합물은 -La-(CH2)n2-C(=O)- 부분의 카르보닐기에 연결된다.
n1 은 0 내지 6 의 정수를 나타내며, 바람직하게는 1 내지 5 의 정수이며, 보다 바람직하게는 1 내지 3 의 정수이다.
1. L1
L1 을 하기 구조로 나타낸다:
-(숙신이미드-3-일-N)-(CH2)n3-C(=O)-.
여기서, n3 은 2 내지 8 의 정수이며, "-(숙신이미드-3-일-N)-" 는 하기 식으로 나타내는 구조를 갖는다:
[식 15]
Figure pat00015
상기 부분 구조의 위치 3 은 항-HER2 항체에 대한 연결 위치이다. 위치 3 에서의 상기 항체에 대한 결합은, 티오에테르를 형성하여 결합하는 것을 특징으로 한다. 이 구조 부분의 위치 1 에서의 질소 원자는, 상기 구조를 포함하는 링커 내에 존재하는 메틸렌의 탄소 원자와 연결된다. 구체적으로, "-(숙신이미드-3-일-N)-(CH2)n3-C(=0)-L2-" 는 하기 식으로 나타내는 구조이다 (여기서, "항체-S-" 는 항체 유래임).
[식 16]
Figure pat00016
식 중에서, n3 은 2 내지 8 의 정수이며, 바람직하게는 2 내지 5 의 정수이다.
L1 의 구체예로서는,
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-,
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-, 및
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-
이 포함될 수 있다.
2. L2
L2 는 -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)- 으로 나타내는 구조이며, L2 는 존재하지 않을 수 있고, 이러한 경우 L2 는 단결합이 된다. n4 는 1 내지 6 의 정수이며, 바람직하게는 2 내지 4 의 정수이다. L2 는 그의 말단 아미노기에서 L1 에 연결되고, 그의 반대 말단에서 카르보닐기에서 LP 와 연결된다.
L2 의 구체예로서는,
-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-
이 포함될 수 있다.
3. LP
LP 는 2 내지 7 개의 아미노산으로 구성되는 펩티드 잔기이다. 구체적으로, 2 내지 7 개의 아미노산이 펩티드 결합에 의해 연결되는 올리고펩티드 잔기로 구성된다. LP 는 그의 N 말단에서 L2 에 연결되고, 그의 C 말단에서 링커의 -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- 부분의 아미노기에 연결된다. 여기서, 용어 "펩티드 잔기" 또는 "올리고펩티드 잔기" 란, 2 개 이상의 아미노산 잔기로 이루어지는 펩티드로부터 유도되는 기이며, 그의 N 말단과 C 말단을 연결 위치로 하는 2 가기를 나타낸다.
LP 를 구성하는 아미노산은 특별히 한정되지 않지만, 이의 예는 L- 또는 D-아미노산, 바람직하게는 L-아미노산을 포함한다. 그리고, 이는 α-아미노산에 추가로, β-알라닌, ε-아미노카프로산 또는 γ-아미노부티르산과 같은 구조를 갖는 아미노산일 수 있으며, 또한 N-메틸화 아미노산과 같은 비천연형 아미노산일 수 있다.
LP 의 아미노산 서열은 특별히 한정되지 않지만, 구성하는 아미노산의 예는 페닐알라닌 (Phe; F), 티로신 (Tyr; Y), 류신 (Leu; L), 글리신 (Gly; G), 알라닌 (Ala; A), 발린 (Val; V), 리신 (Lys; K), 시트룰린 (Cit), 세린 (Ser; S), 글루탐산 (Glu; E) 및 아스파르트산 (Asp; D) 을 포함한다. 이들 중 바람직한 예는 페닐알라닌, 글리신, 발린, 리신, 시트룰린, 세린, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 이러한 아미노산으로부터, 중복의 존재 또는 부재 하, 임의로 선택된 아미노산의 서열을 갖는 LP 를 구축할 수 있다. 아미노산 유형에 따라, 약물 방출 패턴을 제어할 수 있다. 아미노산 수는 2 내지 7 개일 수 있다.
LP 의 구체예는 하기를 포함할 수 있다:
-GGF-,
-DGGF-,
-(D-)D-GGF-,
-EGGF-,
-GGFG-,
-SGGF-,
-KGGF-,
-DGGFG-,
-GGFGG-,
-DDGGFG-,
-KDGGFG-, 및
-GGFGGGF-.
상기에서, "(D-)D" 는 D-아스파르트산을 의미한다. 본 발명의 항체-약물 접합체에 대해 특히 바람직한 LP 의 예는 테트라펩티드 잔기 -GGFG- 를 포함할 수 있다.
4. La-(CH2)n2-C(=O)-
La-(CH2)n2-C(=O)-에 있어서의 La 는 -O- 의 구조이거나 단결합이다. n2 는 0 내지 5 의 정수이고, 바람직하게는 0 내지 3 의 정수이고, 보다 바람직하게는 0 또는 1 의 정수이다.
La-(CH2)n2-C(=O)- 의 예는 하기 구조를 포함할 수 있다:
-O-CH2-C(=O)-,
-O-CH2CH2-C(=O)-,
-O-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-O-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
-O-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
-CH2-C(=O)-,
-CH2CH2-C(=O)-,
-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
-O-C(=O)-.
이들 중에서는,
-O-CH2-C(=O)-,
-O-CH2CH2-C(=O)-,
-O-C(=O)-
또는 La 가 단결합이고 n2 가 0 인 경우가 바람직하다.
링커의 -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- 로 나타내는 구조의 구체예는 하기를 포함할 수 있다:
-NH-CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2-O-C(=O)-,
-NH-CH2CH2-O-C(=O)-,
-NH-CH2CH2CH2-O-C(=O)-,
-NH-CH2CH2CH2CH2-O-C(=O)-.
이들 중,
-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-
가 보다 바람직하다.
링커에서, -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- 는 바람직하게는 4 내지 7 개 원자의 사슬 길이이고, 보다 바람직하게는 5 또는 6 개 원자의 사슬 길이이다.
본 발명의 항-HER2 항체-약물 접합체에 대하여, 이것이 종양 세포 내로 이동하는 경우, 이는 링커 부분이 절단되고 NH2-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-(NH-DX) 로 나타내는 구조의 약물 유도체가 방출되어 항종양 작용을 발현하는 것으로 제안된다. 본 발명의 항체-약물 접합체로부터 방출되어 항종양 효과를 발현하는 항종양 유도체의 예는, 링커의 -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- 로 나타내는 구조의 말단이 아미노기를 갖는 구조 부분을 갖는 항종양 유도체를 포함하며, 특히 바람직한 것은 하기의 것이다.
NH2-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
NH2-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
NH2-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
NH2-CHCH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX).
또한 NH2-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) 의 경우에는, 분자 내에 있는 아미날 구조가 불안정하므로, 추가로 자기 분해하여 하기의:
HO-CH2-C(=O)-(NH-DX)
를 방출하는 것이 확인되었다. 이들 화합물은 본 발명의 항체-약물 접합체의 생성 중간체로서 바람직하게 사용할 수 있다.
엑사테칸을 약물로서 사용하는 본 발명의 항체-약물 접합체에 있어서는, 하기 구조를 갖는 약물-링커 구조 부분 [-L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-(NH-DX)] 을 항체에 연결시키는 것이 바람직하다. 항체 분자 당 상기 약물-링커 구조 부분의 평균 접합수는 1 내지 10 일 수 있다. 이는 바람직하게는 2 내지 8 이고, 보다 바람직하게는 3 내지 8 이다.
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-C(=O)-(NH-DX),
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
이들 중, 보다 바람직한 것은 하기의 것이다.
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-C(=O)-(NH-DX),
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
특히 바람직한 것은 하기의 것이다.
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
본 발명의 항체-약물 접합체에서 항-HER2 항체와 약물을 접합시키기 위한 링커 구조에 대하여, 상기 설명한 링커 각 부분에 있어서 나타낸 바람직한 구조를 연결시킴으로써 바람직한 링커를 구축할 수 있다. 링커 구조에 대한 것으로서, 하기 구조를 갖는 것을 바람직하게 사용할 수 있다. 또한, 이러한 구조의 좌측 말단이 항체와의 연결 위치이며, 우측 말단이 약물과의 연결 위치이다.
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-,
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-,
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-C(=O)-,
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-,
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-,
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.
이들 중에서, 보다 바람직한 것은 하기의 것이다.
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-C(=O)-,
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.
특히 바람직한 것은 하기의 것을 포함한다.
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.
[제조 방법]
다음으로, 본 발명의 항체-약물 접합체 또는 이의 생성 중간체의 대표적 생성 방법에 대해 설명한다. 또한, 각 반응식 중에 화합물 번호를 나타내어, 하기에 화합물을 설명한다. 구체적으로, "식 (1) 의 화합물", "화합물 (1)" 등으로 지칭한다. 또한, 이들 이외의 번호를 갖는 화합물에 대해도 유사하게 기재한다.
1. 생성 방법 1
티오에테르를 통해 항체와 약물-링커 구조가 연결되는, 식 (1) 으로 나타내는 항체-약물 접합체는, 예를 들어 하기 방법에 의해 생성될 수 있다.
[식 17]
Figure pat00017
[식 중, AB 는 술프히드릴기를 갖는 항체를 나타내고, L1' 는 링커 말단이 말레이미딜기 (하기 식으로 나타냄) 인 L1 링커 구조를 나타내고:
[식 18]
Figure pat00018
(여기서, 질소 원자는 결합 위치임), 구체적으로는 L1 의 -(숙신이미드-3-일-N)-(CH2)n3-C(=O)- 에서의 -(숙신이미드-3-일-N)- 부분이 말레이미딜기인 기를 나타냄. 또한, -(NH-DX) 는 하기 식으로 나타내는 구조를 나타내고:
[식 19]
Figure pat00019
이는 엑사테칸의 위치 1 에서의 아미노기의 수소 원자 1 개를 제거함으로써 유도되는 기를 나타냄].
또한, 상기 반응식에서의 식 (1) 의 화합물은, 약물로부터 링커 말단까지 상응하는 1 개의 구조 부분이 1 개의 항체에 대해 연결되는 구조로서 해석될 수 있다. 그러나, 이는 단지 편리를 위해 제공된 설명이며, 실제로는 다수의 이러한 구조 부분이 항체 분자 1 개에 연결되는 경우가 많다. 하기 생성 방법의 설명에 있어서도 동일하게 적용된다.
후술한 방법에 의해 입수할 수 있는 화합물 (2) 와, 술프히드릴기를 갖는 항체 (3a) 를 반응시켜, 항체-약물 접합체 (1) 를 생성할 수 있다.
술프히드릴기를 갖는 항체 (3a) 는 당업계에 널리 공지된 방법으로 수득할 수 있다 (Hermanson, G.T, Bioconjugate Techniques, pp.56-136, pp.456-493, Academic Press (1996)). 예를 들어, 트라우트 (Traut) 시약을 항체의 아미노기와 반응시키는 것; N-숙신이미딜 S-아세틸티오알카노에이트류를 항체의 아미노기와 반응시킨 후, 히드록실아민과 반응시키는 것; N-숙신이미딜 3-(피리딜디티오)프로피오네이트와 반응시킨 후, 항체를 환원제와 반응시키는 것; 항체를 디티오트레이톨, 2-메르캅토에탄올 및 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 히드로클로라이드 (TCEP) 와 같은 환원제와 반응시켜 항체 내 힌지 부분의 디술피드 결합을 환원시킴으로써 술프히드릴기를 형성시키는 것을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
구체적으로는, 항체 내 힌지 부분에서의 디술피드 당 환원제로서 0.3 내지 3 몰 당량의 TCEP 를 사용하고 킬레이트제를 함유하는 완충액 중에서 항체와 반응시킴으로써, 항체 내 힌지 부분에서의 디술피드가 부분적으로 또는 완전히 환원된 항체를 수득할 수 있다. 킬레이트제의 예는 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA) 및 디에틸렌트리아민 펜타아세트산 (DTPA) 을 포함한다. 이는 1 mM 내지 20 mM 의 농도로 사용될 수 있다. 사용할 수 있는 완충액의 예는 인산나트륨, 붕산나트륨 또는 아세트산나트륨 용액을 포함한다. 구체적으로는, 항체를 4℃ 내지 37℃ 에서 1 내지 4 시간 동안 TCEP 와 반응시킴으로써 부분적으로 또는 완전히 환원된 술프히드릴기를 갖는 항체 (3a) 를 수득할 수 있다.
한편, 술프히드릴기를 약물-링커 부분에 첨가하는 반응을 실시하여, 티오에테르 결합에 의해 약물-링커 부분을 접합시킬 수 있다.
술프히드릴기를 갖는 항체 (3a) 당 2 내지 20 몰 당량의 화합물 (2) 를 사용하여, 항체 분자 당 2 내지 8 개의 약물 분자가 접합되는 항체-약물 접합체 (1) 을 생성할 수 있다. 구체적으로는, 반응을 위해, 술프히드릴기를 갖는 항체 (3a) 를 함유하는 완충액에, 화합물 (2) 를 용해시킨 용액을 첨가하는 것이면 충분하다. 여기서, 사용할 수 있는 완충액의 예는 아세트산나트륨 용액, 인산나트륨 및 붕산나트륨을 포함한다. 반응에 대한 pH 는 5 내지 9 이며, 보다 바람직하게는 반응은 pH 7 부근에서 수행된다. 화합물 (2) 를 용해시키기 위한 용매의 예는 디메틸 술폭시드 (DMSO), 디메틸포름아미드 (DMF), 디메틸 아세트아미드 (DMA), N-메틸-2-피리돈 (NMP) 등의 유기 용매를 포함한다.
반응을 위해, 화합물 (2) 를 용해시킨 유기 용매 용액을, 술프히드릴기를 갖는 항체 (3a) 를 함유하는 완충액에 1 내지 20% v/v 에서 첨가하는 것이면 충분하다. 반응 온도는 0 내지 37℃, 보다 바람직하게는 10 내지 25℃ 이며, 반응 시간은 0.5 내지 2 시간이다. 반응은, 미반응 화합물 (2) 의 반응성을 티올-함유 시약에 의해 불활성화시킴으로써 종료될 수 있다. 티올-함유 시약의 예는 시스테인 또는 N-아세틸-L-시스테인 (NAC) 을 포함한다. 보다 구체적으로는, 사용한 화합물 (2) 에 1 내지 2 몰 당량의 NAC 를 첨가하고, 실온에서 10 내지 30 분 동안 인큐베이션함으로써 반응을 종료시킬 수 있다.
생성된 항체-약물 접합체 (1) 은 하기 기재한 공통 절차에 따라 농축, 완충액 교환, 정제, 및 항체 농도 및 항체 분자 당 약물 분자 평균 접합수의 측정 후, 항체-약물 접합체 (1) 의 동정을 실시할 수 있다.
공통 절차 A: 항체 또는 항체-약물 접합체 수용액의 농축
Amicon Ultra (50,000 MWCO, Millipore Co.) 용기 내에 항체 또는 항체-약물 접합체의 용액을 첨가하고, 원심분리기 (Allegra X-15R, Beckman Coulter, Inc.) 를 사용하여 원심분리 (2000 G 내지 3800 G 에서 5 내지 20 분 동안 원심부분리) 하여, 항체 또는 항체-약물 접합체의 용액을 농축하였다.
공통 절차 B: 항체 농도 측정
UV 측정기 (Nanodrop 1000, Thermo Fisher Scientific Inc.) 를 사용하여, 제조사 규정의 방법에 따라 항체 농도 측정을 실시하였다. 그 때, 각 항체에 대해 상이한 280 nm 흡광 계수 (1.3 mLmg-1cm-1 내지 1.8 mLmg-1cm-1) 를 사용하였다.
공통 절차 C-1: 항체에 대한 완충액 교환
Sephadex G-25 담체를 사용한 NAP-25 컬럼 (카탈로그 번호 17-0852-02, GE Healthcare Japan Corporation) 을, 제조사 규정의 방법에 따라 염화나트륨 (137 mM) 및 에틸렌 디아민 테트라아세트산 (EDTA, 5 mM) 을 함유하는 인산 완충액 (10 mM, pH 6.0; 본 명세서에서 PBS6.0/EDTA 로 지칭함) 으로 평형화시켰다. 단일 NAP-25 컬럼에 항체 수용액을 2.5 mL 의 양으로 적용한 후, PBS6.0/EDTA 3.5 mL 로 용리한 분획물 (3.5 mL) 을 수집하였다. 이 분획물을 공통 절차 A 에 의해 농축하였다. 공통 절차 B 를 사용하여 항체 농도를 측정한 후, PBS6.0/EDTA 를 사용하여 10 mg/mL 로 항체 농도를 조정하였다.
공통 절차 C-2: 항체에 대한 완충액 교환
Sephadex G-25 담체를 사용한 NAP-25 컬럼 (카탈로그 번호 17-0852-02, GE Healthcare Japan Corporation) 을, 제조사 규정의 방법에 따라 염화나트륨 (50 mM) 및 EDTA (2 mM) 를 함유하는 인산 완충액 (50 mM, pH6.5; 본 명세서에서 PBS6.5/EDTA 로 지칭함) 으로 평형화시켰다. 단일 NAP-25 컬럼에 항체 수용액을 2.5 mL 의 양으로 적용한 후, PBS6.5/EDTA 3.5 mL 로 용리한 분획물 (3.5 mL) 을 수집하였다. 이 분획물을 공통 절차 A 에 의해 농축하였다. 공통 절차 B 를 사용하여 항체 농도를 측정한 후, PBS6.5/EDTA 를 사용하여 20 mg/mL 로 항체 농도를 조정하였다.
공통 절차 D: 항체-약물 접합체의 정제
시판되는 인산 완충액 (PBS7.4, 카탈로그 번호 10010-023, Invitrogen), 염화나트륨 (137 mM) 을 함유하는 인산나트륨 완충액 (10 mM, pH 6.0; 본 명세서에서 PBS6.0 으로 지칭함) 또는 소르비톨 (5%) 을 함유하는 아세테이트 완충액 (10 mM, pH 5.5; 본 명세서에서 ABS 로 지칭함) 에서 선택된 임의의 완충액으로 NAP-25 컬럼을 평형화시켰다. 상기 NAP-25 컬럼에, 항체-약물 접합체 반응 수용액을 약 1.5 mL 의 양으로 적용한 후, 제조사에 의한 규정량의 완충액으로 용리함으로써 항체 분획물을 수집하였다. 수집 분획물을 다시 NAP-25 컬럼에 적용하고, 완충액으로 용리하는 겔 여과 정제 과정을 총 2 내지 3 회 반복함으로써, 미접합 약물 링커 및 저분자량 화합물 (트리스(2-카르복시에틸)포스핀 히드로클로라이드 (TCEP), N-아세틸-L-시스테인 (NAC) 및 디메틸 술폭시드) 을 제외한 항체-약물 접합체를 수득하였다.
공통 절차 E: 항체-약물 접합체에 있어서의 항체 농도 및 항체 분자 당 약물 분자 평균 접합수의 측정 (1)
항체-약물 접합체에 있어서의 접합 약물 농도는, 항체-약물 접합체 수용액의 280 nm 및 370 nm 의 두 파장에 있어서의 UV 흡광도를 측정한 후에 하기 나타낸 계산을 수행함으로써 산출할 수 있다.
임의 파장에서의 전체 흡광도가 시스템 내에 존재하는 모든 광-흡수 화학 종의 흡광도 합계와 동일하기 때문에 (흡광도의 가성성), 항체와 약물 사이의 접합 전후에 항체 및 약물의 몰 흡광 계수가 동일한 경우, 항체-약물 접합체에 있어서의 항체 농도 및 약물 농도를 하기의 등식으로 나타낸다.
Figure pat00020
상기에서, A280 은 280 nm 에서의 항체-약물 접합체 수용액의 흡광도를 나타내고, A370 은 370 nm 에서의 항체-약물 접합체 수용액의 흡광도를 나타내고, AA, 280 은 280 nm 에서의 항체의 흡광도를 나타내고, AA, 370 은 370 nm 에서의 항체의 흡광도를 나타내고, AD, 280 은 280 nm 에 있어서의 접합체 전구체의 흡광도를 나타내고, AD, 370 은 370 nm 에 있어서의 접합체 전구체의 흡광도를 나타내고, εA, 280 은 280 nm 에서의 항체의 몰 흡광 계수를 나타내고, εA, 370 은 370 nm 에서의 항체의 몰 흡광 계수를 나타내고, εD, 280 은 280 nm 에서의 접합체 전구체의 몰 흡광 계수를 나타내고, εD, 370 은 370 nm 에서의 접합체 전구체의 몰 흡광 계수를 나타내고, CA 는 항체-약물 접합체에 있어서의 항체 농도를 나타내고, CD 는 항체-약물 접합체에 있어서의 약물 농도를 나타낸다.
상기 εA, 280, εA, 370, εD, 280 및 εD, 370 에 대하여, 사전에 준비한 값 (계산 추정치 또는 화합물의 UV 측정에 의해 수득한 실측치) 이 사용된다. 예를 들어, εA, 280 은 항체의 아미노산 서열로부터 이미 알려진 계산 방법 (Protein Science, 1995, vol.4, 2411-2423) 에 의해 추정할 수 있다. εA, 370 은 일반적으로 제로이다. 실시예에서, 트라스트주마브의 몰 흡광 계수에 대해서는, εA, 280 = 215400 (계산 추정치) 및 εA, 370 = 0 을 사용하였다. εD, 280 및 εD, 370 은, 사용하는 접합체 전구체를 특정 몰 농도에서 용해시킨 용액의 흡광도를 측정함으로써, 램버트-비어 법칙 (Lambert-Beer's law) (흡광도 = 몰 농도 x 몰 흡광 계수 x 세포 경로 길이) 을 기반으로 수득할 수 있다. 실시예에서 약물 링커의 몰 흡광 계수에 대하여, 달리 명시되지 않는 한, εD, 280 = 5000 (실측 평균치) 및 εD, 370 = 19000 (실측 평균치) 을 사용하였다. 항체-약물 접합체 수용액의 A280 및 A370 을 측정하고 상기 값을 사용하여 연립 방정식 (I) 및 (II) 를 풀음으로써, CA 및 CD 를 수득할 수 있다. 추가로, CD 를 CA 로 나누어, 항체 분자 당 약물 분자 평균 접합수를 수득할 수 있다.
공통 절차 F: 항체-약물 접합체에 있어서의 항체 분자 당 약물 분자 평균 접합수의 측정 (2)
항체-약물 접합체에 있어서의 항체 분자 당 약물 분자 평균 접합수는, 전술한 공통 절차 E 에 추가로 하기의 방법을 사용하는 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 분석에 의해서도 측정될 수 있다.
[F-1. HPLC 분석용 샘플의 제조 (항체-약물 접합체의 환원)]
항체-약물 접합체 용액 (약 1 mg/mL, 60 μL) 을 디티오트레이톨 (DTT) 수용액 (100 mM, 15 μL) 과 혼합한다. 혼합물을 37℃ 에서 30 분 동안 인큐베이션하여, 항체-약물 접합체의 L 사슬 및 H 사슬 사이의 디술피드 결합을 절단한 샘플을 HPLC 분석에 사용한다.
[F-2. HPLC 분석]
HPLC 분석을 하기의 측정 조건 하에 실시한다.
HPLC 시스템: Agilent 1290 HPLC 시스템 (Agilent Technologies Inc.)
검출기: 자외선 흡광도계 (측정 파장: 280 nm)
컬럼: PLRP-S (2.1 x 50 mm, 8 ㎛, 1000 옹스트롬; Agilent Technologies Inc., P/N PL1912-1802)
컬럼 온도: 80℃
이동상 A: 0.04% 트리플루오로아세트산 (TFA) 함유 수용액
이동상 B: 0.04% TFA 함유 아세토니트릴 용액
구배 프로그램: 29%-36% (0-12.5 분), 36%-42% (12.5-15 분), 42%-29% (15-15.1 분) 및 29%-29% (15.1-25 분)
샘플 주입량: 15 μL
[F-3. 데이터 분석]
[F-3-1] 미접합 항체 L (L0) 및 H (H0) 사슬과 비교하여, 약물-접합 L (하나의 약물 분자에 연결된 L 사슬: L1) 및 H (하나의 약물 분자에 연결된 H 사슬: H1, 2 개의 약물 분자에 연결된 H 사슬: H2, 3 개의 약물 분자에 연결된 H 사슬: H3) 사슬은, 접합된 약물 분자의 수에 비례하여 더 높은 소수성을 나타내며, 따라서 더 긴 유지 시간을 갖는다. 따라서 이들 사슬은 L0 및 L1 또는 H0, H1, H2 및 H3 의 순서로 용리된다. L0 및 H0 와의 유지 시간 비교에 의해 검출 피크를 L0, L1, H0, H1, H2 및 H3 중 임의의 것에 할당할 수 있다.
[F-3-2] 약물 링커가 UV 흡수를 갖기 때문에, 약물 링커 분자의 접합수에 따라 L 또는 H 사슬 및 약물 링커의 몰 흡광 계수를 사용하여 하기 식에 따라 피크 면적 값을 수정한다.
[수식 1]
Figure pat00021
[수식 2]
Figure pat00022
여기서, 각 항체의 L 또는 H 사슬의 몰 흡광 계수 (280 nm) 에 대하여, 공지된 계산 방법 (Protein Science, 1995, vol.4, 2411-2423) 에 의해 각 항체의 L 또는 H 사슬의 아미노산 서열로부터 추정된 값을 사용할 수 있다. 트라스트주마브의 경우, 그의 아미노산 서열에 따라, L 및 H 사슬에 대한 추정치로서 각각 26150 의 몰 흡광 계수 및 81290 의 몰 흡광 계수를 사용하였다. 약물 링커의 몰 흡광 계수 (280 nm) 에 대하여, 각 약물 링커를 메르캅토에탄올 또는 N-아세틸시스테인과 반응시켜 말레이미드기를 숙신이미드 티오에테르로 변환시킨 화합물의 실측 몰 흡광 계수 (280 nm) 를 사용하였다.
[F-3-3] 각 사슬의 피크 면적비 (%) 를 하기 식에 따라 피크 면적의 총 수정된 값에 대해 계산한다.
[수식 3]
Figure pat00023
[F-3-4] 항체-약물 접합체에 있어서의 항체 분자 당 약물 분자 평균 접합수를 하기 식에 따라 계산한다.
약물 분자 평균 접합수 = (L0 피크 면적비 x 0 ＋ L0 피크 면적비 x 1 ＋ H0 피크 면적비 x 0 ＋ H1 피크 면적비 x 1 ＋ H2 피크 면적비 x 2 ＋H3 피크 면적비 x 3) / 100 x 2
생성 방법 1 에서 사용한 생성 중간체 화합물을 하기에서 설명한다. 생성 방법 1 에서 식 (2) 로 나타내는 화합물은 하기 식으로 나타내는 화합물이다:
(말레이미드-N-일)-(CH2)n3-C(=O)-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-(NH-DX).
식 중에서,
n3 은 2 내지 8 의 정수를 나타내고,
L2 는 -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)- 또는 단결합을 나타내고, 여기서 n4 는 1 내지 6 의 정수를 나타내고,
LP 는 페닐알라닌, 글리신, 발린, 리신, 시트룰린, 세린, 글루탐산 및 아스파르트산에서 선택되는 2 내지 7 개의 아미노산으로 구성되는 펩티드 잔기를 나타내고,
n1 은 0 내지 6 의 정수를 나타내고,
n2 는 0 내지 5 의 정수를 나타내고,
La 는 -O- 또는 단결합을 나타내고,
(말레이미드-N-일)- 은 하기 식으로 나타내는 말레이미딜기 (2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일기) 를 나타내고:
[식 20]
Figure pat00024
여기서, 질소 원자는 연결 위치이고,
-(NH-DX) 는 하기 식으로 나타내는 기이고:
[식 21]
Figure pat00025
여기서, 위치 1 에서의 아미노기의 질소 원자는 결합 위치이다.
L2 가 단결합이거나 -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)- 인 경우, n4 가 2 내지 4 의 정수인 것이 생성 중간체로서 바람직하다.
LP 의 펩티드 잔기에 대해서, 페닐알라닌, 글리신, 발린, 리신, 시트룰린, 세린, 글루탐산 및 아스파르트산에서 선택되는 아미노산으로 이루어지는 펩티드 잔기를 갖는 화합물이 생성 중간체로서 바람직하다. 이러한 펩티드 잔기 중에서, LP 가 4 개의 아미노산으로 구성되는 펩티드 잔기인 화합물이 생성 중간체로서 바람직하다. 보다 구체적으로는, LP 가 테트라펩티드 잔기 -GGFG- 인 화합물이 생성 중간체로서 바람직하다.
또한, -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2- 에 대해서, -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2- 또는 -NH-CH2CH2-O-CH2- 를 갖는 화합물이 생성 중간체로서 바람직하다. -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2- 또는 -NH-CH2CH2-O-CH2 를 갖는 화합물이 보다 바람직하다.
n3 이 2 내지 5 정수이고, L2 이 단결합이고, -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2- 이 -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2- 또는 -NH-CH2CH2-O-CH2- 인, 식 (2) 로 나타내는 화합물이 생성 중간체로서 바람직하다. -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2- 가 -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2- 또는 -NH-CH2CH2-O-CH2- 인 화합물이 보다 바람직하다. n3 이 2 또는 5 인 화합물이 추가로 바람직하다.
n3 이 2 내지 5 의 정수이고, L2 가 -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)- 이고, n4 가 2 내지 4 의 정수이고, -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2- 가 -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2- 또는 -NH-CH2CH2-O-CH2- 인, 식 (2) 로 나타내는 화합물이 생성 중간체로서 바람직하다. n4 가 2 또는 4 의 정수인 화합물이 보다 바람직하다. -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2- 가 -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2- 또는 -NH-CH2CH2-O-CH2- 인 화합물이 추가로 바람직하다.
이러한 본 발명의 화합물 생성에 유용한 중간체의 바람직한 예는 하기를 포함할 수 있다.
(말레이미드-N-일)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
상기 언급된 생성 중간체 화합물의 군에서 선택되는 약물-링커 화합물을 항-HER2 항체 또는 이의 반응성 유도체와 반응시켜 항-HER2 항체의 힌지 부분에 존재하는 디술피드 결합 부분에서 티오에테르 결합을 형성시킴으로써 본 발명의 항-HER2 항체-약물 접합체를 생성시킬 수 있다. 이러한 경우, 항-HER2 항체의 반응성 유도체를 사용하는 것이 바람직하고, 항-HER2 항체를 환원시켜 수득한 반응성 유도체가 특히 바람직하다.
하기는 생성 중간체로서 보다 바람직한 화합물이다.
(말레이미드-N-일)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2-CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
상기 언급한 중간체 화합물 군 중에서, 하기 식으로 나타내는 화합물:
(말레이미드-N-일)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), 또는
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
이 추가로 바람직한 화합물이다.
접합체의 양을 확보하기 위해서, 동일한 수의 약물 (예를 들어 약 ±1) 을 갖도록 유사한 조건 하에 수득한 다수의 접합체를 혼합하여 새로운 로트를 제조할 수 있다. 이러한 경우, 평균 약물수는 혼합 전의 접합체 중 평균 약물수 사이에 해당된다.
2. 생성 방법 2
상기 생성 방법에서 사용한 중간체로서 식 (2) 로 나타내는 화합물 및 이의 약리학적으로 허용가능한 염은, 예를 들어 하기 방법에 의해 생성될 수 있다.
[식 22]
Figure pat00026
식 중에서, L1' 는 말단 말레이미딜기를 나타내고, P1, P2 및 P3 은 각각 보호기를 나타낸다.
카르복실산 (5) 을 활성 에스테르, 혼합 산 무수물, 산 할라이드 등으로 유도체화하고 이를 NH2-DX (4) 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염과 반응시킴으로써 화합물 (6) 을 생성할 수 있다. NH2-DX (4) 는, 엑사테칸 (화학명: (1S,9S)-1-아미노-9-에틸-5-플루오로-2,3-디히드로-9-히드록시-4-메틸-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-10,13(9H,15H)-디온) 을 나타낸다.
이 반응에 대해, 펩티드 합성에 통상 사용하는 반응 시약 및 조건을 이용할 수 있다. 활성 에스테르에는 다양한 종류가 존재한다. 예를 들어 p-니트로페놀 등의 페놀류, N-히드록시 벤조트리아졸 또는 N-히드록시 숙신이미드 등과 카르복실산 (5) 를 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 또는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드 등의 축합제를 사용하여 반응시킴으로써 생성시킬 수 있다. 또한, 활성 에스테르는 카르복실산 (5) 와 펜타플루오로페닐 트리플루오로아세테이트 등과의 반응; 카르복실산 (5) 와 1-벤조트리아졸릴 옥시트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스파이트와의 반응; 카르복실산 (5) 와 디에틸 시아노포스포네이트와의 반응 (염해법 (salting-in method)); 카르복실산 (5) 와 트리페닐포스핀 및 2,2'-디피리딜 디술피드와의 반응 (무카이야마법 (Mukaiyama's method)); 카르복실산 (5) 와 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 클로라이드 (DMTMM) 와 같은 트리아진 유도체와의 반응; 등에 의해서도 생성시킬 수 있다. 또한, 예를 들어 카르복실산 (5) 를 염기 존재 하에 염화티오닐 및 옥살릴클로라이드와 같은 산 할라이드로 처리하는 산 할라이드법에 의해서도 반응을 실시할 수 있다.
상기와 같이 수득한 카르복실산 (5) 의 활성 에스테르, 혼합 산 무수물 또는 산 할라이드를 불활성 용매 중에서 -78℃ 내지 150℃ 에서, 적절한 염기의 존재 하에 화합물 (4) 와 반응시킴으로써, 화합물 (6) 을 생성시킬 수 있다. (또한 "불활성 용매" 란, 그 용매를 사용하는 반응을 저해하지 않는 용매를 나타냄.)
상기 각 공정에 사용하는 염기의 구체예는 탄산나트륨, 탄산칼륨, 나트륨 에톡시드, 칼륨 부톡시드, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수소화나트륨 및 수소화칼륨과 같은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속의 탄산염, 알콕시드, 수산화물 또는 수소화물; n-부틸 리튬과 같은 알킬 리튬, 또는 리튬 디이소프로필아미드와 같은 디알킬아미노 리튬으로 대표되는 유기금속 염기; 리튬 비스(트리메틸실릴)아미드와 같은 비스실릴아민의 유기금속 염기; 및 피리딘, 2,6-루티딘, 콜리딘, 4-디메틸아미노피리딘, 트리에틸아민, N-메틸모르폴린, 디이소프로필에틸아민 및 디아자비시클로[5.4.0]운데크-7-엔 (DBU) 과 같은 3 급 아민 또는 질소 함유 헤테로시클릭 화합물과 같은 유기 염기를 포함한다.
본 발명의 반응에 사용하는 불활성 용매의 예는 디클로로메탄, 클로로포름 및 사염화탄소와 같은 할로겐화 탄화수소계 용매; 테트라히드로푸란, 1,2-디메톡시에탄 및 디옥산과 같은 에테르계 용매; 벤젠 및 톨루엔과 같은 방향족 탄화수소계 용매; 및 N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드 및 N-메틸피롤리딘-2-온과 같은 아미드계 용매를 포함한다. 이에 추가로, 디메틸 술폭시드 및 술포란과 같은 술폭시드계 용매; 및 아세톤 및 메틸 에틸 케톤과 같은 케톤계 용매; 메탄올 및 에탄올과 같은 알코올계 용매를 일부 경우에 사용할 수 있다. 추가로, 이의 혼합 용매를 또한 사용할 수 있다.
화합물 (6) 의 말단 아미노기에 대한 보호기 P1 에 대해서, tert-부틸옥시 카르보닐기, 9-플루오레닐메틸옥시 카르보닐기 또는 벤질옥시 카르보닐기와 같은, 펩티드 합성에 통상 이용되고 있는 아미노기에 대한 보호기를 사용할 수 있다. 다른 아미노기에 대한 보호기의 예는 아세틸기와 같은 알카노일기; 메톡시카르보닐기 및 에톡시카르보닐기와 같은 알콕시카르보닐기; 파라메톡시벤질옥시 카르보닐기 및 파라 (또는 오르토) 니트로벤질옥시 카르보닐기와 같은 아릴메톡시 카르보닐기; 벤질기 및 트리페닐 메틸기와 같은 아릴 메틸기; 벤조일기와 같은 아로일기; 및 2,4-디니트로벤젠 술포닐기 및 오르토니트로벤젠 술포닐기와 같은 아릴 술포닐기를 포함한다. 보호기 P1 은 예를 들어, 보호될 아미노기를 갖는 화합물의 성질에 따라 선택될 수 있다.
수득된 화합물 (6) 의 말단 아미노기에 대한 보호기 P1 를 탈보호함으로써, 화합물 (7) 을 제조할 수 있다. 탈보호에 있어서, 시약 및 조건은 보호기에 따라 선택될 수 있다.
N 말단을 P2 로 보호한 펩티드 카르복실산 (8) 을 활성 에스테르, 혼합 산 무수물 등으로 유도체화하고, 수득한 화합물 (7) 과 반응시켜, 화합물 (9) 를 제조할 수 있다. 펩티드 카르복실산 (8) 과 화합물 (7) 사이의 펩티드 결합을 형성하는데 사용한 반응 조건, 시약, 염기 및 불활성 용매는, 화합물 (6) 의 합성에 대해 기재한 것들에서 적절히 선택될 수 있다. 보호기 P2 는 화합물 (6)의 보호기에 대해 기재한 것들에서 적절히 선택될 수 있으며, 선택은 예를 들어 보호될 아미노기를 갖는 화합물의 성질에 따라 이루어질 수 있다. 이것이 펩티드 합성에 통상 이용되고 있는 것처럼, 펩티드 카르복실산 (8) 을 구성하는 아미노산 또는 펩티드의 순차 반응 및 탈보호를 반복하여 신장시켜, 화합물 (9) 를 또한 제조할 수 있다.
수득한 화합물 (9) 의 아미노기에 대한 보호기 P2 를 탈보호시켜, 화합물 (10) 을 제조할 수 있다. 탈보호에 있어서, 시약 및 조건은 보호기에 따라 선택될 수 있다.
카르복실산 (11) 을 활성 에스테르, 혼합 산 무수물, 산 할라이드 등으로 유도체화하고, 수득한 화합물 (10) 과 반응시켜, 화합물 (2) 를 제조할 수 있다. 카르복실산 (11) 과 화합물 (10) 사이의 펩티드 결합을 형성하는데 사용한 반응 조건, 시약, 염기 및 불활성 용매는 화합물 (6) 의 합성에 대해 기재한 것들에서 적절히 선택될 수 있다.
화합물 (9) 는 예를 들어 하기 방법에 의해서도 제조할 수 있다.
N 말단을 P2 로 보호한 펩티드 카르복실산 (8) 을 활성 에스테르, 혼합 산 무수물 등으로 유도체화하고, 염기 존재 하에 카르복시기를 P3 으로 보호한 아민 화합물 (12) 와 반응시켜, 화합물 (13) 을 제조할 수 있다. 펩티드 카르복실산 (8) 과 화합물 (12) 사이의 펩티드 결합을 형성하는데 사용한 반응 조건, 시약, 염기 및 불활성 용매는, 화합물 (6) 의 합성에 대해 기재한 것들에서 적절히 선택될 수 있다. 화합물 (13) 의 아미노기에 대한 보호기 P2 는 통상 사용되는 보호기이면 특별한 제한은 없다.
구체적으로는 히드록실기에 대한 보호기의 예는 메톡시메틸기와 같은 알콕시메틸기; 벤질기, 4-메톡시벤질기 및 트리페닐메틸기와 같은 아릴메틸기; 아세틸기와 같은 알카노일기; 벤조일기와 같은 아로일기; 및 tert-부틸 디페닐실릴기와 같은 실릴기를 포함할 수 있다. 카르복시기는 예를 들어 메틸기, 에틸기 및 tert-부틸기와 같은 알킬기, 알릴기, 또는 벤질기와 같은 아릴메틸기와의 에스테르로서 보호될 수 있다. 아미노기에 대한 보호기의 예는 tert-부틸옥시 카르보닐기, 메톡시카르보닐기 및 에톡시카르보닐기와 같은 알킬옥시 카르보닐기; 알릴옥시카르보닐기, 또는 9-플루오레닐메틸옥시 카르보닐기, 벤질옥시 카르보닐기, 파라메톡시벤질옥시 카르보닐기 및 파라 (또는 오르토) 니트로벤질옥시 카르보닐기와 같은 아릴메톡시 카르보닐기; 아세틸기와 같은 알카노일기; 벤질기 및 트리페닐 메틸기와 같은 아릴메틸기; 벤조일기와 같은 아로일기; 및 2,4-디니트로벤젠 술포닐기 또는 오르토니트로벤젠 술포닐기와 같은 아릴 술포닐기를 포함할 수 있다.
카르복시기에 대한 보호기 P3 에 대해서, 유기 합성 화학, 특히 펩티드 합성에 있어서 카르복시기에 대한 보호기로서 통상 이용되고 있는 보호기를 사용할 수 있다. 구체적으로는 상기 보호기, 예를 들어 메틸기, 에틸기 또는 tert-부틸과 같은 알킬기와의 에스테르, 알릴 에스테르 및 벤질 에스테르에서 적절히 선택될 수 있다.
이러한 경우, 아미노기에 대한 보호기와 카르복시기에 대한 보호기는 상이한 방법 또는 상이한 조건에 의해 제거될 수 있는 것들이 바람직하다. 예를 들어, 대표예는 P2 가 tert-부틸옥시 카르보닐기이고 P3 이 벤질기인 조합을 포함한다. 보호기는 예를 들어 보호될 아미노기와 카르복시기를 갖는 화합물의 성질에 따라 상기 서술한 것들에서 선택될 수 있다. 보호기의 제거를 위해, 보호기에 따라 시약 및 조건을 선택할 수 있다.
수득한 화합물 (13) 의 카르복시기에 대한 보호기 P3 을 탈보호시켜 화합물 (14) 를 제조할 수 있다. 탈보호에 있어서, 시약 및 조건은 보호기에 따라 선택될 수 있다.
수득한 화합물 (14) 를 활성 에스테르, 혼합 산 무수물, 산 할라이드 등으로 유도체화하고, 염기의 존재 하에, 화합물 (4) 와 반응시켜 화합물 (9) 를 제조할 수 있다. 반응에 대해, 펩티드 합성에 통상 사용하는 반응 시약 및 조건을 또한 사용할 수 있고, 반응에 사용한 반응 조건, 시약, 염기 및 불활성 용매는 화합물 (6) 의 합성에 대해 기재한 것들에서 적절히 선택될 수 있다.
화합물 (2) 는 또한 예를 들어 하기 방법에 의해 제조할 수 있다.
화합물 (13) 의 아미노기에 대한 보호기 P2 를 탈보호시켜, 화합물 (15) 를 제조할 수 있다. 탈보호에 있어서, 시약 및 조건은 보호기에 따라 선택될 수 있다.
카르복실산 유도체 (11) 을 활성 에스테르, 혼합 산 무수물, 산 할라이드 등으로 유도체화하고, 염기의 존재 하에, 수득한 화합물 (15) 와 반응시켜 화합물 (16) 을 제조할 수 있다. 펩티드 카르복실산 (11) 과 화합물 (15) 사이의 아미드 결합을 형성하는데 사용한 반응 조건, 시약, 염기 및 불활성 용매는 화합물 (6) 의 합성에 대해 기재한 것들에서 적절히 선택될 수 있다.
수득한 화합물 (16) 의 카르복시기에 대한 보호기를 탈보호하여, 화합물 (17) 을 제조할 수 있다. 화합물 (14) 제조에 있어서의 카르복시기의 탈보호와 유사하게 탈보호를 실시할 수 있다.
화합물 (17) 을 활성 에스테르, 혼합 산 무수물, 산 할라이드 등으로 유도체화하고, 염기의 존재 하에, 화합물 (4) 와 반응시켜 화합물 (2) 를 제조할 수 있다. 반응에 대해, 펩티드 합성에 통상 사용하는 반응 시약 및 조건을 또한 사용할 수 있으며, 반응에 사용한 반응 조건, 시약, 염기 및 불활성 용매는 화합물 (6) 의 합성에 대해 기재한 것들에서 적절히 선택될 수 있다.
3. 제조 방법 3
중간체의 식 (2) 으로 나타내는 화합물은 하기 방법에 의해서도 제조할 수 있다.
[식 23]
Figure pat00027
식 중에서, L1' 는 말단이 말레이미딜기로 변환된 구조를 갖는 L1 이고, P4 는 보호기를 나타낸다.
화합물 (11) 을 활성 에스테르, 혼합 산 무수물 등으로 유도체화하고, 염기의 존재 하에, C 말단을 P4 로 보호한 펩티드 카르복실산 (18) 과 반응시켜, 화합물 (19) 를 제조할 수 있다. 펩티드 카르복실산 (18) 과 화합물 (11) 사이의 펩티드 결합을 형성하는데 사용한 반응 조건, 시약, 염기 및 불활성 용매는, 화합물 (6) 의 합성에 대해 기재한 것들에서 적절히 선택될 수 있다. 화합물 (18) 의 카르복시기에 대한 보호기 P4 는 상기 기재한 보호기에서 적절히 선택될 수 있다.
수득한 화합물 (19) 의 카르복시기에 대한 보호기를 탈보호시켜, 화합물 (20) 을 제조할 수 있다. 화합물 (14) 의 제조에 있어서의 카르복시기의 탈보호와 유사하게 탈보호를 실시할 수 있다.
수득한 화합물 (20) 을 활성 에스테르, 혼합 산 무수물 등으로 유도체화하고, 화합물 (7) 과 반응시켜 화합물 (2) 를 제조할 수 있다. 반응에 대해, 펩티드 합성에 통상 사용하는 반응 시약 및 조건을 또한 사용할 수 있으며, 반응에 사용한 반응 조건, 시약, 염기 및 불활성 용매는 화합물 (6) 의 합성에 대해 기재한 것들에서 적절히 선택될 수 있다.
4. 제조 방법 4
이하, 제조 방법 2 에 기재된 생성 중간체 (10) 에 있어서, n1 = 1, La = O 인 화합물 (10b) 의 제조 방법을 상세히 기재한다. 식 (10b) 으로 나타내는 화합물, 이의 염 또는 용매화물은 예를 들어 하기 방법으로 제조할 수 있다.
[식 24]
Figure pat00028
식 중에서, LP 는 상기와 같은 것을 나타내고, L 은 아세틸기와 같은 알카노일기 또는 벤조일기와 같은 아로일기인 아실기, 또는 수소 원자를 나타내고, X 및 Y 는 각각 1 내지 3 개의 아미노산으로 이루어지는 올리고펩티드를 나타내고, P5 및 P7 은 각각 아미노기에 대한 보호기를 나타내고, P6 은 카르복시기에 대한 보호기를 나타낸다.
식 (21) 으로 나타내는 화합물은 일본 공개특허공보 2002-60351 호에 기재되는 방법 또는 문헌 (J. Org. Chem., Vol. 51, 3196 페이지, 1986) 에 기재된 방법을 사용하거나 응용하여, 그리고 필요에 따라 보호기의 제거나 관능기의 변환을 실시하여 제조할 수 있다. 추가로, 이는 말단 아미노기가 보호된 아미노산 또는 아미노기가 보호된 올리고펩티드의 산 아미드를 알데히드 또는 케톤으로 처리함으로써 수득할 수 있다.
화합물 (21) 을 불활성 용매 중, 산 또는 염기 존재 하에서 냉각으로부터 실온의 온도 조건 하 온도 범위에서 히드록실기를 갖는 화합물 (22) 와 반응시켜, 화합물 (23) 을 제조할 수 있다.
여기서, 사용할 수 있는 산의 예는 불화수소산, 염산, 황산, 질산, 인산 및 붕산과 같은 무기산; 아세트산, 시트르산, 파라톨루엔 술폰산 및 메탄술폰산과 같은 유기산; 및 테트라플루오로보레이트, 염화아연, 염화주석, 염화알루미늄 및 염화철과 같은 루이스 산을 포함한다. 이들 중에서, 술폰산, 특히 파라톨루엔 술폰산이 바람직하다. 염기로서는, 이미 언급된 염기 중 임의 하나를 적절히 선택해 사용할 수 있다. 이의 바람직한 예는 칼륨 tert-부톡시드와 같은 알칼리 금속 알콕시드; 수산화나트륨 및 수산화칼륨과 같은 알칼리 금속 수산화물; 수소화나트륨 및 수소화칼륨과 같은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 수소화물; 리튬 디이소프로필아미드와 같은 디알킬 아미노리튬으로 대표되는 유기금속 염기; 및 리튬 비스(트리메틸실릴)아미드와 같은 비스실릴아민의 유기금속 염기를 포함한다.
반응에 사용하는 용매의 예는 테트라히드로푸란 및 1,4-디옥산과 같은 에테르계 용매; 및 벤젠 및 톨루엔와 같은 방향족 탄화수소계 용매를 포함한다. 이들 용매는 물과의 혼합물로서 제조될 수 있다.
또한, P5 로 예시되는 아미노기에 대한 보호기는, 아미노기의 보호에 통상 사용되는 기이면 특별히 제한은 없다. 대표예는 제조 방법 2 에서 기재한 아미노기의 보호기를 포함한다. 그러나 본 발명에서, P5 로 예시되는 아미노기에 대한 보호기가 절단되는 경우가 있을 수 있다. 이러한 경우에는, 필요에 따라 적당한 아미노기 보호용 시약과 적절히 반응시켜 보호기를 다시금 도입할 수 있다.
화합물 (24) 는, 화합물 (23) 의 보호기 P6 을 제거하여 제조할 수 있다. 여기서, P6 으로 예시되는 카르복시기에 대한 보호기의 대표예는, 제조 방법 2 에서 기재되어 있으며, 이는 이들로부터 적절히 선택될 수 있다. 화합물 (23) 에 있어서, 이러한 경우 아미노기에 대한 보호기 P5 와 카르복시기에 대한 보호기 P6 이 상이한 방법 또는 상이한 조건에 의해 제거될 수 있는 보호기인 것이 바람직하다. 예를 들어, 대표예는 P5 가 9-플루오레닐메틸옥시 카르보닐기이고, P6 이 벤질기인 조합을 포함한다. 보호기는, 예를 들어 보호될 아미노기 및 카르복시기를 갖는 화합물의 성질에 따라 선택될 수 있다. 보호기 제거를 위해, 시약 및 조건은 보호기에 따라 선택된다.
카르복실산 (24) 를 활성 에스테르, 혼합 산 무수물, 산 할라이드 등으로 유도체화하고, 염기의 존재 하에, 화합물 (4) 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염과 반응시켜 화합물 (25) 를 제조한 후, 수득한 화합물 (25) 의 보호기 P5 를 제거함으로써 화합물 (26) 을 제조할 수 있다. 화합물 (4) 와 카르복실산 (24) 사이의 반응 및 보호기 P6 을 제거하는 반응에 대해서는, 제조 방법 2 에 대해 기재한 것들과 동일한 시약 및 반응 조건을 사용할 수 있다.
화합물 (26) 과 말단 아미노기가 보호된 아미노산 또는 아미노기가 보호된 올리고펩티드 (27) 를 반응시켜 화합물 (9b) 를 제조하고, 수득한 화합물 (9b) 의 보호기 P7 을 제거함으로써 화합물 (10b) 를 제조할 수 있다. P7 로 나타내는 아미노기에 대한 보호기는 통상 아미노기의 보호에 사용되는 기이면 특별히 제한되지는 않는다. 이의 대표예는 제조 방법 2 에 대해 기재한 아미노기에 대한 보호기를 포함한다. 보호기의 제거를 위해서는, 보호기에 따라 시약 및 조건을 선택한다. 화합물 (26) 과 화합물 (27) 사이의 반응에 대해서는, 펩티드 합성에 통상 사용되는 반응 시약 및 조건을 이용할 수 있다. 상기의 방법에 의해 제조한 화합물 (10b) 는 상기 기재한 방법에 따라 본 발명의 화합물 (1) 로 유도체화될 수 있다.
5. 제조 방법 5
이하, 제조 방법 2 에 기재된 생성 중간체 (2) 에 있어서 n1 = 1, n2 = 1, La = O 인 화합물 (2) 의 제조 방법을 상세히 기재한다. 식 (2) 으로 나타내는 화합물, 이의 염 또는 용매화물은 예를 들어 하기 방법으로 제조할 수 있다.
[식 25]
Figure pat00029
식 중에서, L1', L2, LP 는 상기와 같이 정의되고, Z 는 1 내지 3 개의 아미노산으로 이루어지는 올리고펩티드를 나타내고, P8 은 아미노기에 대한 보호기를 나타내고, P9 는 카르복시기에 대한 보호기를 나타낸다.
말단 아미노기 및 카르복시기가 보호된 아미노산 또는 올리고펩티드 (28) 의 보호기 P8 을 제거하여 화합물 (29) 를 제조하고, 수득한 아민 형태 (29) 와 화합물 (11) 을 반응시킴으로써, 화합물 (30) 을 제조할 수 있다. P8 로 나타내는 아미노기에 대한 보호기로서는, 통상 아미노기의 보호에 사용되는 기이면 특별히 제한되지 않는다. 대표예는 제조 방법 2 에 대해 기재한 아미노기에 대한 보호기를 포함한다. 또한, 보호기 P8 의 제거를 위해서는, 보호기에 따라 시약 및 조건을 선택할 수 있다. 화합물 (29) 과 카르복실산 (11) 사이의 반응에 대해서는, 제조 방법 2 에 대해 기재한 것들과 동일한 시약 및 반응 조건을 사용할 수 있다.
화합물 (30) 의 보호기 P9 를 제거하여 화합물 (31) 을 제조하고, 수득한 카르복실산 (31) 과 화합물 (26) 을 반응시킴으로써 생성 중간체 (2b) 를 제조할 수 있다. P8 로서 나타내는 카르복시기에 대한 보호기의 대표예를 제조 방법 2 에서 기재한다. 그의 탈보호 반응에 대해서는, 제조 방법 2 에서 기재된 것들과 동일한 시약 및 반응 조건을 사용할 수 있다. 화합물 (26) 과 카르복실산 (31) 사이의 반응에서는, 펩티드 합성에 통상 사용되는 반응 시약 및 조건을 또한 사용할 수 있다. 상기 방법에 의해 제조한 화합물 (2b) 는, 상기 기재한 방법에 따라 본 발명의 화합물 (1) 로 유도체화될 수 있다.
6. 제조 방법 6
이하, 제조 방법 2 에 기재된 생성 중간체 (17) 에 있어서 n1 = 1, n2 = 1, La = O 인 화합물 (17b) 의 제조 방법을 상세히 기재한다. 식 (17b) 으로 나타내는 화합물, 이의 염 또는 용매화물은 예를 들어 하기 방법에 따라서 또한 제조할 수 있다.
[식 26]
Figure pat00030
식 중에서, L1', L2, LP, X, Y, P5, P6 및 P7 은 상기 정의한 바와 같다.
말단 아미노기 및 말단 카르복시기가 보호된 화합물 (23) 의 아미노기에 대한 보호기 P5 를 탈보호하여 화합물 (32) 를 제조하고, 수득한 아민 형태 (32) 와 말단 아미노기 또는 아미노기가 보호된 올리고펩티드 (27) 를 반응시킴으로써, 화합물 (33) 을 제조할 수 있다. P5 로서 나타내는 아미노기에 대한 보호기는, 통상 아미노기의 보호에 사용되는 기이면 특별히 제한되지 않는다. 대표예는 제조 방법 2 에서 기재한 아미노기에 대한 보호기를 포함한다. 또한, 보호기 P5 의 제거에 대해서는, 보호기에 따라 시약 및 조건을 선택할 수 있다. 여기서, P6 으로서 나타내는 카르복시기에 대한 보호기 및 P7 로서 나타내는 아미노기에 대한 보호기의 대표예는 제조 방법 2 에서 기재한 카르복시기 및 아미노기에 대한 보호기를 포함한다. 화합물 (33) 에서는, 카르복시기에 대한 보호기 P6 과 아미노기에 대한 보호기 P7 은 동일한 방법 또는 동일한 조건에 의해 제거될 수 있는 보호기인 것이 바람직하다. 예를 들어, 대표예는 P6 이 벤질 에스테르기이고, P7 이 벤질옥시 카르보닐기인 조합을 포함한다.
화합물 (34) 는, 화합물 (33) 의 카르복시기에 대한 보호기 P6 과 아미노기에 대한 보호기 P7 을 제거함으로써 제조할 수 있다. 카르복시기에 대한 보호기 P6 과 아미노기에 대한 보호기 P7 을 순차적으로 제거함으로써 화합물 (37) 을 또한 제조할 수 있으며, 추가로, 동일한 방법 또는 동일한 조건에 의해 제거될 수 있는 보호기 P6 과 P7 둘 모두를 한번에 제거함으로써 화합물 (34) 를 간단하게 제조할 수 있다.
수득한 화합물 (34) 와 화합물 (11) 을 반응시켜, 화합물 (17b) 를 제조할 수 있다. 화합물 (34) 와 화합물 (11) 사이의 반응에 대해서는, 제조 방법 2 에서 기재된 것들과 동일한 시약 및 반응 조건을 사용할 수 있다.
본 발명의 항-HER2 항체-약물 접합체는 대기 중에 방치하거나 재결정화 또는 정제되는 경우, 수분을 흡수하거나 흡착수를 갖거나 수화물로 변화할 수 있으며, 이러한 수-함유 화합물 또는 염이 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명에는 또한, 여러 방사성 또는 비방사성 동위원소로 표지된 화합물도 포함된다. 본 발명의 항체-약물 접합체를 구성하는 하나 이상의 원자는 원자 동위원소를 비천연 비율로 함유할 수 있다. 원자 동위원소의 예는, 중수소 (2H), 삼중수소 (3H), 요오드-125 (125I) 및 탄소-14 (14C) 를 포함한다. 또한 본 발명의 화합물은, 삼중수소 (3H), 요오드-125 (125I), 탄소-14 (14C), 구리-64 (64Cu), 지르코늄-89 (89Zr), 요오드-124 (124I), 불소-18 (18F), 인듐-111 (111I), 탄소-11 (11C) 및 요오드-131 (131I) 과 같은 방사성 동위원소로 방사성 표지될 수 있다. 방사성 표지된 화합물은 치료 또는 예방제, 연구용 시약, 예를 들어 검정 시약, 및 진단제, 예를 들어 생체내 화상 진단제로서 유용하다. 방사성에 관련됨이 없이, 본 발명의 항체-약물 접합체 중 임의의 동위원소 변이체 유형은 본 발명의 범주 내에 있다.
[약물]
본 발명의 항-HER2 항체-약물 접합체는 암 세포에 대한 세포독성 활성을 나타내며, 따라서 약물로서, 특히 암에 대한 치료제 및/또는 예방제로서 사용할 수 있다.
즉, 본 발명의 항-HER2 항체-약물 접합체는 암 치료를 위한 주요 방법인 화학요법용 약물로서 선택적으로 사용될 수 있고, 그 결과, 암 세포의 성장을 지연시키고, 이의 증식을 억제하고, 더 나아가 암 세포를 사멸시킬 수 있다. 이로 인해, 암 환자가 암에 의한 증상으로부터 자유로워지거나 암 환자의 QOL 에 있어서 개선을 달성할 수 있고 암 환자의 생명을 유지하여 치료 효과를 얻을 수 있다. 본 발명의 항-HER2 항체-약물 접합체가 암 세포의 사멸을 달성하지 못하는 경우에도, 이는 암 세포의 증식의 억제 또는 제어에 의해 암 환자의 더 높은 QOL 을 달성하면서 장기간 생존을 달성시킬 수 있다.
이러한 약물 요법에 있어서, 이는 약물 단독으로 사용될 수 있으며 추가로, 아쥬반트 치료요법에 있어서 다른 치료요법과 조합된 약물로서 사용될 수 있고, 외과 수술, 방사선요법, 호르몬 요법 등과 조합될 수 있다. 추가로, 네오아쥬반트 치료요법에 있어서 약물 치료요법의 약물로서 사용할 수도 있다.
상기 기재한 바와 같은 치료적 사용에 추가로, 미세 전이 암 세포의 증식을 억제하며 나아가서는 이를 사멸시키는 효과가 또한 예상가능하다. 특히 원발성의 암 세포에 있어서 HER2 의 발현이 확인되었을 경우, 본 발명의 항-HER2 항체-약물 접합체를 투여함으로써 암 전이 억제 또는 예방 효과를 예상할 수 있다. 예를 들어, 전이 과정에서 체액 중의 암 세포를 억제하고 사멸시키는 효과 또는 임의 조직에 착상 직후 미세 암 세포를 억제 및 사멸시키는 효과를 예상할 수 있다. 따라서, 특히 암의 외과적 제거 후, 암 전이의 억제 또는 예방 효과를 예상할 수 있다.
본 발명의 항-HER2 항체-약물 접합체는, 환자에 대한 전신 치료요법으로서의 투여, 및 추가적으로, 암 조직에 대한 국소 투여에 의해 치료 효과를 발휘하는 것으로 예상할 수 있다.
본 발명의 항-HER2 항체-약물 접합체가 적용되는 암 유형의 예는 폐암, 요로 상피암, 대장암, 전립선암, 난소암, 췌장암, 유방암, 방광암, 위암, 위장간질 종양, 자궁경부암, 식도암, 편평상피암, 복막암, 간암, 간세포암, 결장암, 직장암, 결장 직장암, 자궁 내막암, 자궁암, 침샘암, 신장암, 외음부암, 갑상선암, 또는 음경암을 포함할 수 있다. 본 발명의 항-HER2 항체-약물 접합체의 치료 대상은, 치료 대상으로서 암 세포에서, 항체-약물 접합체 내의 항체가 인식할 수 있는 HER2 단백질을 발현하는 암 세포이다. 본원에서 용어 "HER2 단백질을 발현하는 암" 이란, 그 세포 표면에 HER2 단백질을 갖는 세포를 함유하는 암이다. HER2 단백질은 다양한 인간 종양에 있어서 과발현하며, HER2 단백질의 과발현을 평가하기 위한 면역조직화학 염색법 (IHC) 이나 HER2 유전자의 증폭을 평가하기 위한 형광 제자리 (in situ) 하이브리드화법 (FISH) 과 같은 당업계에서 일반적으로 실시되는 방법을 사용하여 평가할 수 있다.
또한, 본 발명의 항-HER2 항체-약물 접합체는 이의 항-HER2 항체를 통해, 암 세포 표면에서 발현하는 HER2 단백질을 인식하고, 암 세포 내에서 내재화함으로써 항종양 효과를 나타낸다. 따라서, 본 발명의 항-HER2 항체-약물 접합체의 치료 대상은 "HER2 단백질을 발현하는 암" 으로 한정되지 않으며, 예를 들어 백혈병, 악성 림프종, 형질세포종, 골수종, 또는 육종일 수도 있다.
본 발명의 항-HER2 항체-약물 접합체는, 포유 동물에 대해 바람직하게 투여될 수 있으나, 보다 바람직하게는 인간에게 투여된다.
본 발명의 항-HER2 항체-약물 접합체가 함유되는 약학 조성물에서 사용되는 물질은, 투여량이나 투여 농도 측면에서, 당업계에서 일반적으로 사용되는 제형 첨가물 등으로부터 적절히 선택하고 적용할 수 있다.
본 발명의 항-HER2 항체-약물 접합체는 하나 이상의 약학적으로 적합한 성분을 함유하는 약학 조성물로서 투여될 수 있다. 예를 들어, 상기 약학 조성물은, 통상 하나 이상의 약학적 담체 (예를 들어, 멸균한 액체) 를 함유한다. 여기서 액체에는, 예를 들어, 물 및 오일 (석유 및 동물 기원, 식물 기원 또는 합성 기원의 오일) 이 포함된다. 오일은 예를 들어, 땅콩유, 대두유, 광유 또는 참기름일 수 있다. 물은, 상기 약학 조성물이 정맥내 투여되는 경우에 보다 통상적 담체이다. 식염수 용액, 덱스트로오스 수용액 및 글리세롤 수용액이 또한 액체 담체로서, 특히, 주사용 용액을 위해 사용될 수 있다. 적절한 약학적 부형제는 당업계에서 공지된 것들에서 선택될 수 있다. 필요시, 상기 조성물은 또한 미량의 습윤제, 유화제 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 적절한 약학적 담체의 예는 E. W. Martin 에 의한 "Remington's Pharmaceutical Sciences" 에 기재된다. 제형은 투여 양태에 상응한다.
여러 전달 시스템이 공지되어 있으며, 본 발명의 항-HER2 항체-약물 접합체를 투여하기 위해 사용될 수 있다. 투여 경로의 예는 피내, 근육내, 복강내, 정맥내 및 피하 경로를 포함할 수 있지만, 이들로 한정되지는 않는다. 투여는 예를 들어 주입 또는 볼루스 주사에 의해 이루어질 수 있다. 특정 바람직한 구현예에 따라서, 항체-약물 접합체의 투여는 주입에 의해 실시된다. 비경구 투여는 바람직한 투여 경로이다.
대표적 구현예에 따라서, 약학 조성물은 인간에 대한 정맥내 투여에 적합한 약학 조성물로서 종래 절차에 따라 처방된다. 정맥내 투여를 위한 조성물은 통상, 멸균 및 등장성 수성 완충액 중의 용액이다. 필요한 경우, 약물은 가용화제 및 주사 부위에서의 통증을 완화시키기 위한 국소 마취제 (예를 들어, 리그노카인) 를 함유할 수 있다. 일반적으로, 상기 성분은 활성제의 양을 갖는 앰플 또는 사케에 밀봉하여 수득한 용기 중의 동결건조 분말 또는 무수 농축물 중 임의 하나로서 개별적으로, 또는 단위 투약 형태로 혼합물로서 제공된다. 상기 약물이 주입에 의해 투여되는 형태의 경우, 이는 멸균 약학 등급의 수 또는 식염수를 함유하는 주입 병으로부터 투여될 수 있다. 상기 약물이 주사에 의해 투여되는 경우, 주사용 멸균수 또는 식염수의 앰플은 상기 성분이 투여 전 서로 혼합되도록 제공될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 본 발명의 항-HER2 항체-약물 접합체만을 함유하는 약학 조성물 또는 항-HER2 항체-약물 접합체 및 접합체 이외에 하나 이상의 암 치료제를 함유하는 약학 조성물일 수 있다. 본 발명의 항-HER2 항체-약물 접합체는 다른 암 치료제와 함께 투여할 수도 있다. 이에 따라 항암 효과를 증강시킬 수 있다. 이러한 목적으로 사용되는 다른 항암제는, 항체-약물 접합체와 동시에, 이와 별개로, 또는 연속하여 개체에 투여될 수 있으며, 각각의 투여 간격을 가변적으로 하면서 투여될 수 있다. 암 치료제의 예는 5-FU, 퍼투주마브, 파클리탁셀, 카르보플라틴, 시스플라틴, 겜시타빈, 카페시타빈, 이리노테칸 (CPT-11), 파클리탁셀, 도세탁셀, 페메트렉세드, 소라페니브, 빈블라스틴, 비노렐빈, 에버롤리무스, 타네스피마이신, 베바시주마브, 옥살리플라틴, 라파티니브, 아도-트라스트주마브 엠탄신 (T-DM1) 또는 국제 공개 WO 2003/038043 호에 기재된 약물, LH-RH 유사체 (류프로렌린, 고세렐린 등), 에스트라무스틴 포스페이트, 에스트로겐 안타고니스트 (타목시펜, 랄록시펜 등) 및 아로마타아제 저해제 (아나스트로졸, 레트로졸, 엑세메스탄 등) 를 포함하지만, 항종양 활성을 갖는 약물이면 한정되지 않는다.
약학 조성물은, 원하는 조성과 필요한 순도를 갖는 제형으로서 동결건조 제형 또는 액체 제형으로 제형화될 수 있다. 동결건조 제형으로서 제형화하는 경우, 이는 당업계에서 사용되는 적합한 제형 첨가물을 함유하는 제형일 수 있다. 또한 액체 제형에 대해서도, 이는 당업계에 있어서 사용되는 각종 제형 첨가물을 함유하는 액체 제형으로서 제형화될 수 있다.
약학 조성물의 조성 및 농도는 투여 방법에 따라 가변적일 수 있다. 그러나, 본 발명의 약학 조성물에 함유되는 항-HER2 항체-약물 접합체는 항체-약물 접합체가 항원에 대해 높은 친화성, 즉 항원에 대한 해리 정수 (즉, Kd 값) 의 점에 있어서 높은 친화성을 갖는 (= 낮은 Kd 값) 경우, 소량의 투여량으로도 약효를 나타낼 수 있다. 따라서, 항체-약물 접합체의 투여량 결정을 위해, 항체-약물 접합체와 항원 사이의 친화성에 관련된 상황의 관점에서 투여량을 결정할 수 있다. 본 발명의 항체-약물 접합체를 인간에게 투여하는 경우, 예를 들어 약 0.001 내지 100 mg/kg 를 1 회 투여하거나 1 내지 180 일의 간격으로 수 회 투여할 수 있다.
실시예
본 발명을 하기의 실시예를 통해 구체적으로 설명한다. 그러나, 본 발명은 그에 한정되지 않는다. 또한, 달리 기재되지 않는 한, 본원 기재의 시약, 용매, 및 출발 물질은 상업적 공급자로부터 용이하게 입수 가능하다.
참고예 1 트라스트주마브의 제조
440 mg/바이알 Herceptin(Genentech, Inc.)의 14 개 바이알을 양이온 교환 크로마토그래피 완충액 A(25 mM 시트레이트 완충액, 30 mM NaCl, pH 5.0)의 2 L에 용해하여, 0.2 μm 필터 (Millipore Corp.: Stericup 0.22 μm, GVPVDF Membrane)에서 여과를 실시하였다. 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼(SP SepharoseHP 240 ml, XK50 컬럼)에 샘플을 제공한 후, 양이온 교환 크로마토그래피 완충액 B(25 mM 시트레이트 완충액, 500 mM NaCl, pH 5.0)를 사용하여 NaCl 농도 30 mM~500 mM의 직선 구배에 의해 용리시켜, IgG 모노머 분획물을 분리하였다. 크기 배제 크로마토그래피 분석에 의해, 98% 이상의 고순도 모노머 샘플을 수합하여 UF30K (Millipore Corp.: PELLICON XL Filter, BIOMAX 30 K, PXB030A50)에 의해 농축하고 CBS 완충액(10 mM 시트레이트/140 mM NaCl, pH 6.0)으로 교체하였다. CBS 완충액으로 교체한 샘플은 0.2 μm 필터(Sartorius: Minisart-Plus 0.2 μm, 17823 K)를 통해 여과를 실시하였다.
참고예 2 트라스트주마브 엠탄신 T-DM1의 제조
항체의 SMCC 유도체화: 참고예 1에서 제조한 트라스트주마브를 제조 방법 1에 기재한 공통 절차 C-2(완충액으로서 PBS6.5/EDTA를 사용), 공통 절차 A 및 공통 절차 B(280 nm 흡광 계수로서 1.37 mLmg-1cm-1을 사용)를 사용하여, PBS6.5/EDTA로 완충액을 교체하여, 트라스트주마브(160.0 mg)가 PBS6.5/EDTA(7.60 mL)에 용해된 용액을 15 mL 폴리프로필렌제 튜브에서 제조하였다. 이어서 SMCC(1.84 mg)의 DMSO 용액(0.40 mL; 항체 1 분자에 대해 약 5.1 당량 상당)을 실온에서 첨가하였다. 반응 용액의 항체 농도를 20 mg/mL로 조정하고 튜브 회전기(MTR-103, AS One Corporation)를 사용하여 실온에서 2시간 반응시켰다. 이 반응액을 공통 절차 D-2(완충액으로서 PBS6.5/EDTA를 사용)에 따른 정제를 실시하여, SMCC 유도체화된 항체를 154.9 mg 포함하는 용액을 12 mL 수득하였다.
항체와 약물 링커 사이의 접합: 50 mL 폴리프로필렌제 튜브에 넣은 상기 용액에 PBS6.5/EDTA(2.56 mL) 및 N2-디아세틸-N2-(3-메르캅토-1-옥소프로필)-메이탄신(4.67 mg; DM1, Journal of Medicinal Chemistry, 2006년, 49권, 14호, 4392)의 DMA(디메틸아세트아미드) 용액 (0.93 mL; SMCC 유도체화된 항체 1 분자에 대해 약 5.8 당량 상당)을 실온에서 첨가하여, 반응 용액의 항체 농도를 10 mg/mL로 조정하고 튜브 회전기를 사용하여 실온에서 16.5시간 반응시켰다.
정제 절차: 상기 용액을, 염화나트륨(137 mM)을 포함하는 인산나트륨 완충액(10 mM, pH 6.5)을 사용한 공통 절차 D-1에 의한 정제를 실시하여, 목적의 참고예 화합물을 함유하는 용액을 35 mL 수득하였다.
물리화학적 특성 평가: 252 nm 및 280 nm의 2 파장에 있어서의 UV 흡광도를 사용한 공통 절차 E를 사용하여 하기의 특성치를 수득하였다.
항체 농도: 4.14 mg/mL, 항체 수율: 144.9 mg (91%), 항체 분자 당 약물 분자 평균 접합수 (n): 3.0.
실시예 1 중간체 (1)
[식 27]
Figure pat00031
공정 1: tert-부틸 (4-{[(1S, \9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]아미노}-4-옥소부틸)카르바메이트
4-(tert-부톡시카르보닐아미노)부탄산(0.237 g, 1.13 mmoL)을 디클로로메탄(10 mL)에 용해하여, N-히드록시숙신이미드(0.130 g, 1.13 mmoL) 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드(0.216 g, 1.13 mmoL)을 첨가하고 1시간 교반하였다. 그 반응 용액을, 엑사테칸의 메탄술폰산 염(0.500 g, 0.94 mmoL) 및 트리에틸아민 (0.157 mL, 1.13 mmoL)를 가한 N,N-디메틸포름아미드 용액(10 mL)에 적하하고, 실온에서 1일 교반하였다. 용매를 감압 하 제거하고, 수득한 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 [클로로포름~클로로포름:메탄올 = 8:2 (v/v)]에 의해 정제하여, 표제 화합물(0.595 g, 정량적)을 수득하였다.
Figure pat00032
MS (APCI)m/z: 621 (M+H)+
공정 2: 4-아미노-N-[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]부탄아미드
상기 공정 1로 수득한 화합물(0.388 g, 0.61 mmoL)을 디클로로메탄(9 mL)에 용해하였다. 트리플루오로아세트산(9 mL)을 첨가해 4시간 교반하였다. 용매를 감압 하 제거하고, 수득한 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 [클로로포름~클로로포름:메탄올:물 = 7:3:1 (v/v/v)의 분배 유기층]에 의해 정제하여, 표제 화합물의 트리플루오로아세테이트(0.343 g, 정량적)를 수득하였다.
Figure pat00033
MS (APCI)m/z: 521 (M+H)+
실시예 2 항체-약물 접합체 (2)
[식 28]
Figure pat00034
공정 1: N-(tert-부톡시카르보닐)글리실글리실-L-페닐알라닐-N-(4-{[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]아미노}-4-옥소부틸)글리신아미드
N-(tert-부톡시카르보닐)글리실글리실-L-페닐알라닐글리신(0.081g, 0.19 mmoL)을 디클로로메탄(3 mL)에 용해하여, N-히드록시숙신이미드(0.021g, 0.19 mmoL) 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드(0.036 g, 0.19 mmoL)를 첨가한 후 3.5시간 교반하였다. 이 반응 용액을 실시예 1의 공정 2로 수득한 화합물(0.080 g, 0.15 mmoL)을 가한 N,N-디메틸포름아미드 용액(1.5 mL)에 적하하고, 실온에서 4시간 교반하였다. 용매를 감압 하 제거하고, 수득한 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 [클로로포름~클로로포름:메탄올 = 8:2 (v/v)]에 의해 정제하여, 표제 화합물(0.106 g, 73%)를 수득하였다.
Figure pat00035
MS (APCI)m/z: 939 (M+H)+
공정 2: 글리실글리실-L-페닐알라닐-N-(4-{[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]아미노}-4-옥소부틸)글리신아미드
상기 공정 1로 수득한 화합물(1.97 g, 2.10 mmoL)을 디클로로메탄(7 mL)에 용해하였다. 트리플루오로아세트산(7 mL)을 첨가한 후, 1시간 교반하였다. 용매를 감압 하 제거하고, 잔류물에 톨루엔을 첨가해 공비 증류시켰다. 수득한 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 [클로로포름~클로로포름:메탄올:물 = 7:3:1 (v/v/v)의 분배 유기층]에 의해 정제하여, 표제 화합물의 트리플루오로아세테이트(1.97 g, 99%)를 수득하였다.
Figure pat00036
MS (APCI)m/z: 839 (M+H)+
공정 3: N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]글리실글리실-L-페닐알라닐-N-(4-{[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]아미노}-4-옥소부틸)글리신아미드
상기 공정 2로 수득한 화합물(337 mg, 0.353 mmoL)의 N,N-디메틸포름아미드(1.2 mL) 용액에, 트리에틸아민(44.3 mL, 0.318 mmoL) 및 N-숙신이미딜 6-말레이미드 헥사노에이트(119.7 mg, 0.388 mmoL)를 첨가하고 실온에서 1시간 교반하였다. 용매를 감압 하 제거하고, 수득한 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 [클로로포름~클로로포름:메탄올 = 5:1 (v/v)]에 의해 정제하여, 표제 화합물(278.0 mg, 76%)을 담황색 고체로서 수득하였다.
Figure pat00037
MS (APCI)m/z: 1032 (M+H)+
공정 4: 항체-약물 접합체 (2)
항체의 환원: 참고예 1에서 제조한 트라스트주마브를, 제조 방법 1에 기재한 공통 절차 C-1 및 공통 절차 B(280 nm 흡광 계수로서 1.37 mLmg-1cm-1을 사용)를 사용하여, PBS6.0/EDTA로 항체 농도 10 mg/mL를 가지도록 제조하였다. 용액(3.0 mL)을 15 mL 폴리프로필렌제 튜브에 넣어 여기에 10 mM 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 히드로클로라이드 (TCEP, Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) 수용액(0.0934 mL; 항체 1 분자에 대해 4.6 당량) 및 1M 인산 수소 2칼륨 수용액(Nacalai Tesque, Inc.; 0.150 mL)을 가하였다. 용액의 pH가 7.4±0.1인 것을 확인한 후에, 37℃에서 1시간 인큐베이션함으로써, 항체 내 힌지 부분의 디술피드 결합을 환원시켰다.
항체와 약물 링커 사이의 접합: 상기 용액을 22℃에서 10분간 인큐베이션한 후에 상기 공정 3으로 수득한 화합물을 10 mM 포함하는 DMSO 용액(0.187 mL; 항체 1 분자에 대해 9.2 당량)을 첨가하고 22℃에서 40분간 인큐베이션하여, 약물 링커를 항체에 접합시켰다. 다음으로, N-아세틸시스테인(NAC, Sigma-Aldrich Co. LLC) 수용액(0.0374 mL; 항체 1 분자에 대해 18.4 당량)을 첨가하고 추가로 22℃에서 20분간 인큐베이션하여, 약물 링커의 반응을 정지시켰다.
정제: 상기 용액을, 제조 방법 1에서 기재한 공통 절차 D-1(완충액으로서 PBS6.0을 사용)을 사용한 정제를 실시하여, 표제 항체-약물 접합체를 함유하는 용액을 6 mL 수득하였다. 이후, 공통 절차 A를 사용하여 용액을 농축하였다.
물리화학적 특성 평가: 제조 방법 1에서 기재한 공통 절차 E를 사용하여 하기의 특성치를 수득하였다.
항체 농도: 3.21 mg/mL, 항체 수율: 22.5 mg (75%), 항체 분자 당 약물 분자 평균 접합수 (n): 2.6.
실시예 3 항체-약물 접합체 (3)
[식 29]
Figure pat00038
공정 1: 항체-약물 접합체 (3)
항체의 환원: 참고예 1에서 제조한 트라스트주마브를, 공통 절차 C-1 및 B(280 nm 흡광 계수로서 1.487 mLmg-1cm-1을 사용)을 사용하여, 매질을 PBS6.0/EDTA 로 교체하여 항체 농도 10 mg/mL를 가지도록 제조하였다. 용액(1.25 mL)를 1.5 mL 폴리프로필렌제 튜브에 넣어 여기에 10 mM TCEP 수용액(0.039mL; 항체 1 분자에 대해 4.6 당량) 및 1M 인산 수소 2칼륨 수용액(0.0625 mL)를 가하였다. 용액의 pH가 7.4±0.1인 것을 확인한 후에, 37℃에서 1시간 인큐베이션함으로써, 항체 내 힌지 부분의 디술피드 결합을 환원시켰다.
항체와 약물 링커 사이의 접합: 상기 용액에 DMSO(0.072 mL)와 실시예 2의 공정 3의 화합물을 10 mM 포함하는 DMSO 용액(0.078 mL; 항체 1 분자에 대해 9.2 당량)을 실온에서 첨가한 후, 튜브 회전기를 사용하여 실온에서 40분 교반하여, 약물 링커를 항체에 접합시켰다. 다음으로, 100 mM NAC 수용액(0.0155 mL; 항체 1 분자에 대해 18.4 당량)을 첨가하고 추가로 실온에서 20분간 교반하여, 약물 링커의 반응을 정지시켰다.
정제: 상기 용액을, 공통 절차 D(완충액으로서 ABS를 사용)를 사용한 정제를 실시하여, 목적의 화합물을 함유하는 용액을 6 mL 수득하였다. 추가로 공통 절차 A에 의해 용액을 농축하였다. 이후, 공통 절차 E를 사용하여 하기의 특성치를 수득하였다.
항체 농도: 9.85 mg/mL, 항체 수율: 6.9 mg (55%), 항체 분자 당 약물 분자 평균 접합수 (n): 7.3.
실시예 4 항체-약물 접합체 (4)
[식 30]
Figure pat00039
공정 1: N-[3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)프로파노일]글리실글리실-L-페닐알라닐-N-(4-{[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]아미노}-4-옥소부틸)글리신아미드
실시예 1의 화합물 (80 mg, 0.084 mmoL)를, N-숙신이미딜 6-말레이미드 헥사노에이트 대신에 N-숙신이미딜 3-말레이미드 프로피오네이트(24.6 mg, 0.0924 mmoL)를 사용하여, 실시예 2의 공정 3과 동일한 방식으로 반응시켜, 표제 화합물(60.0 mg, 73%)를 담황색 고체로서 수득하였다.
Figure pat00040
MS (APCI)m/z: 990 (M+H)+
공정 2: 항체-약물 접합체 (4)
항체의 환원: 참고예 1에서 제조한 트라스트주마브를, 공통 절차 C-1 및 B(280 nm 흡광 계수로서 1.48 mLmg-1cm-1을 사용)을 사용하여, 매질을 PBS6.0/EDTA 로 교체하여, 항체 농도 10 mg/mL를 가지도록 제조하였다. 용액(1mL)을 1.5 mL 폴리프로필렌제 튜브에 넣어 여기에 10 mM TCEP 수용액(0.0155 mL; 항체 1 분자에 대해 2.3 당량) 및 1M 인산 수소 2칼륨 수용액(0.050 mL)를 가하였다. 용액의 pH가 7.4±0.1인 것을 확인한 후에, 37℃에서 1시간 인큐베이션함으로써, 항체 내 힌지 부분의 디술피드 결합을 환원시켰다.
항체와 약물 링커 사이의 접합: 상기 용액에, DMSO(0.072 mL)와 실시예 2의 공정 3의 화합물을 10 mM 포함하는 DMSO 용액(0.031mL; 항체 1 분자에 대해 4.6 당량)을 실온에서 첨가해 튜브 회전기를 사용하여 실온에서 40분간 교반하여, 약물 링커를 항체에 접합시켰다. 다음으로, 100 mM NAC 수용액(0.0078 mL; 항체 1 분자에 대해 9.2 당량)을 첨가하고 추가로 실온에서 20분간 교반하여, 약물 링커의 반응을 정지시켰다.
정제: 상기 용액을, 공통 절차 D(완충액으로서 ABS를 사용)를 사용한 정제를 실시하여, 목적의 화합물을 함유하는 용액을 6 mL 수득하였다. 공통 절차 E를 사용하여 하기의 특성치를 수득하였다.
항체 농도: 1.32 mg/mL, 항체 수율: 7.9 mg (79%), 항체 분자 당 약물 분자 평균 접합수 (n): 3.1.
실시예 5 항체-약물 접합체 (5)
[식 31]
Figure pat00041
공정 1: 항체-약물 접합체 (5)
항체 환원시의 항체에 대한 TCEP의 몰비가 4.6이 되도록 10 mM TCEP 수용액의 첨가량을 조절하였다. 그리고 약물 링커 접합시의 항체에 대한 실시예 4의 공정 1의 화합물의 몰비가 9.2가 되도록 10 mM 약물 링커 용액의 첨가량을 조절하였다. 그런 다음, 반응 정지시의 항체에 대한 NAC의 몰비가 18.4가 되도록 100 mM NAC 수용액의 첨가량을 조절하였다. 실시예 4의 공정 2와 동일한 절차에 의해, 표제 항체-약물 접합체를 함유하는 용액을 6 mL 수득하고, 하기의 특성치를 수득하였다.
항체 농도: 1.23 mg/mL, 항체 수율: 7.4 mg (74%), 항체 분자 당 약물 분자 평균 접합수 (n): 6.1.
실시예 6 항체-약물 접합체 (6)
[식 32]
Figure pat00042
공정 1: N-{3-[2-(2-{[3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)프로파노일]아미노}에톡시)에톡시]프로파노일}글리실글리실-L-페닐알라닐-N-(4-{[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]아미노}-4-옥소부틸)글리신아미드
실시예 2의 공정 2로 수득한 화합물(100 mg, 0.119 mmoL)를, 트리에틸아민 대신에 디이소프로필에틸아민(20.8μL, 0.119 mmoL)를, N-숙신이미딜 6-말레이미드 헥사노에이트 대신에 N-숙신이미딜 3-(2-(2-(3-말레인이미드프로판아미드)에톡시)에톡시)프로파노에이트(50.7 mg, 0.119 mmoL)를 사용하여, 실시예 2의 공정 3과 동일한 방식으로 반응시켜, 표제 화합물(66.5 mg, 48%)를 담황색 고체로서 수득하였다.
Figure pat00043
MS (APCI)m/z: 1149 (M+H)+
공정 2: 항체-약물 접합체 (6)
항체의 환원: 참고예 1에서 제조한 트라스트주마브를, 공통 절차 C-1 및 B(280 nm 흡광 계수로서 1.48 mLmg-1cm-1을 사용)을 사용하여, 매질을 PBS6.0/EDTA 로 교체하여, 항체 농도 10 mg/mL를 가지도록 제조하였다. 용액(1.25 mL)를 1.5 mL 폴리프로필렌제 튜브에 넣어 여기에 10 mM TCEP 수용액(0.019mL; 항체 1 분자에 대해 2.3 당량) 및 1M 인산 수소 2칼륨 수용액(0.0625 mL)를 가하였다. 용액의 pH가 7.4±0.1인 것을 확인한 후에, 37℃에서 1시간 인큐베이션함으로써, 항체 내 힌지 부분의 디술피드 결합을 환원시켰다.
항체와 약물 링커 사이의 접합: 상기 용액에, DMSO(Sigma-Aldrich Co. LLC; 0.109mL)와 상기 공정 1의 화합물을 10 mM 포함하는 DMSO 용액(0.039mL; 항체 1 분자에 대해 4.6 당량)을 실온에서 첨가해 튜브 회전기를 사용하여 실온에서 40분간 교반해, 약물 링커를 항체에 접합시켰다. 다음으로, 100 mM NAC 수용액(0.008 mL)를 첨가하고 추가로 실온에서 20분간 교반하여, 약물 링커의 반응을 정지시켰다.
정제: 상기 용액을, 제조 방법 1에서 기재한 공통 절차 D(완충액으로서 ABS를 사용)를 사용한 정제를 실시하여, 목적의 화합물을 함유하는 용액을 6 mL 수득하였다.
물리화학적 특성 평가: 공통 절차 E를 사용하여 하기의 특성치를 수득하였다.
항체 농도: 1.76 mg/mL, 항체 수율: 10.6 mg (85%), 항체 분자 당 약물 분자 평균 접합수 (n): 3.6.
실시예 7 항체-약물 접합체 (7)
[식 33]
Figure pat00044
공정 1: 항체-약물 접합체 (7)
항체의 환원: 참고예 1에서 제조한 트라스트주마브를, 공통 절차 C-1 및 B(280 nm 흡광 계수로서 1.48 mLmg-1cm-1을 사용)을 사용하여, 매질을 PBS6.0/EDTA 로 교체하여, 항체 농도 10 mg/mL를 가지도록 제조하였다. 용액(1.25 mL)를 1.5 mL 폴리프로필렌제 튜브에 넣어 여기에 10 mM TCEP 수용액(0.039mL; 항체 1 분자에 대해 4.6 당량) 및 1M 인산 수소 2칼륨 수용액(0.0625 mL)를 가하였다. 용액의 pH가 7.4±0.1인 것을 확인한 후에, 37℃에서 1시간 인큐베이션함으로써, 항체 내 힌지 부분의 디술피드 결합을 환원시켰다.
항체와 약물 링커 사이의 접합: 상기 용액에, DMSO (0.072 mL)와 실시예 6의 공정 1의 화합물을 10 mM 포함하는 DMSO 용액(0.078 mL; 항체 1 분자에 대해 9.2 당량)을 실온에서 첨가해 튜브 회전기를 사용하여 실온에서 40분간 교반하여, 약물 링커를 항체에 접합시켰다. 다음으로, 100 mM NAC 수용액(0.0155 mL)를 첨가하고 추가로 실온에서 20분간 교반하여, 약물 링커의 반응을 정지시켰다.
정제: 상기 용액을, 공통 절차 D(완충액으로서 ABS를 사용)를 사용한 정제를 실시하여, 목적의 화합물을 함유하는 용액을 6 mL 수득하였다.
물리화학적 특성 평가: 공통 절차 E를 사용하여 하기의 특성치를 수득하였다.
항체 농도: 1.93 mg/mL, 항체 수율: 11.6 mg (93%), 항체 분자 당 약물 분자 평균 접합수 (n): 6.9.
실시예 8 항체-약물 접합체 (8)
[식 34]
Figure pat00045
공정 1: 항체-약물 접합체 (8)
항체의 환원: 참고예 1에서 제조한 트라스트주마브를, 공통 절차 C-1 및 B(280 nm 흡광 계수로서 1.48 mLmg-1cm-1을 사용)을 사용하여, 매질을 PBS6.0/EDTA 로 교체하여, 항체 농도 10 mg/mL를 가지도록 제조하였다. 용액(1.25 mL)를 1.5 mL 폴리프로필렌제 튜브에 넣어 여기에 10 mM TCEP 수용액(0.039mL; 항체 1 분자에 대해 4.6 당량) 및 1M 인산 수소 2칼륨 수용액(0.0625 mL)를 가하였다. 용액의 pH가 7.4±0.1인 것을 확인한 후에, 37℃에서 1시간 인큐베이션함으로써, 항체 내 힌지 부분의 디술피드 결합을 환원시켰다.
항체와 약물 링커 사이의 접합: 상기 용액에, DMSO(0.072 mL)와 실시예 6의 공정 1의 화합물을 10 mM 포함하는 DMSO 용액(0.078 mL; 항체 1 분자에 대해 9.2 당량)을 실온에서 첨가해 튜브 회전기를 사용하여 실온에서 40분간 교반하여, 약물 링커를 항체에 접합시켰다. 다음으로, 100 mM NAC 수용액(0.0155 mL)를 첨가하고 추가로 실온에서 20분간 교반하여, 약물 링커의 반응을 정지시켰다.
정제: 상기 용액을, 공통 절차 D-1(완충액으로서 ABS를 사용)을 사용한 정제를 실시하여, 목적의 화합물을 함유하는 용액을 5.7 mL 수득하였다.
물리화학적 특성 평가: 공통 절차 E를 사용하여 하기의 특성치를 수득하였다.
항체 농도: 1.50 mg/mL, 항체 수율: 8.55 mg (86%), 항체 분자 당 약물 분자 평균 접합수 (n): 6.2.
실시예 9 항체-약물 접합체 (9)
[식 35]
Figure pat00046
공정 1: N-[19-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-17-옥소-4,7,10,13-테트라옥소-16-아자노나데칸-1-오일]글리실글리실-L-페닐알라닐-N-(4-{[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]아미노}-4-옥소부틸)글리신아미드
실시예 2의 공정 2로 수득한 화합물(90 mg, 0.107 mmoL)를, 트리에틸아민 대신에 디이소프로필에틸아민(18.7μL, 0.107 mmoL)를, N-숙신이미딜 6-말레이미드 헥사노에이트 대신에 N-숙신이미딜 1-말레인이미드-3-옥소-7,10,13,16-테트라옥사-4-아자노나데칸-19-오에이트(55.1 mg, 0.107 mmoL)를 사용하여, 실시예 2의 공정 3과 동일한 방식으로 반응시켜, 표제 화합물(50 mg, 37%)을 담황색 고체로서 수득하였다.
Figure pat00047
MS (APCI)m/z: 1237 (M+H)+
공정 2: 항체-약물 접합체 (9)
참고예 1에서 제조한 트라스트주마브 및 상기 공정 1로 수득한 화합물을 사용하여, 실시예 6의 공정 2와 동일한 방식으로, 표제 항체-약물 접합체를 수득하였다.
항체 농도: 1.75 mg/mL, 항체 수율: 10.5 mg (84%), 항체 분자 당 약물 분자 평균 접합수 (n): 3.4.
실시예 10 항체-약물 접합체 (10)
[식 36]
Figure pat00048
공정 1: 항체-약물 접합체 (10)
참고예 1에서 제조한 트라스트주마브 및 실시예 9의 공정 1로 수득한 화합물을 사용하여, 실시예 7의 공정 1과 동일한 방식으로, 표제 항체-약물 접합체를 수득하였다.
항체 농도: 1.79 mg/mL, 항체 수율: 10.7 mg (86%), 항체 분자 당 약물 분자 평균 접합수 (n): 6.0.
실시예 11 중간체 (11)
[식 37]
Figure pat00049
공정 1: tert-부틸 [2-(2-{[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]아미노}-2-옥소에톡시)에틸]카르바메이트
엑사테칸의 메탄술폰산 염(3.10 g, 5.47 moL)를, 4-(tert-부톡시카르보닐아미노)부탄산 대신에 {2-[(tert-부톡시카르보닐)아미노]에톡시}아세트산(J. Med. Chem., 1992년, 35권, 2928페이지; 1.55 g, 6.01 mmol)를 사용하여, 실시예 1의 공정 1과 동일한 방식으로 반응시켜, 표제 화합물(2.56 g, 73%)를 담황색 고체로서 수득하였다.
Figure pat00050
MS (APCI)m/z: 637 (M+H)+
공정 2: 2-(2-아미노에톡시)-N-[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]아세트아미드
상기 공정 1로 수득한 화합물(1.50 g, 2.36 mol)를, 실시예 1의 공정 2와 동일한 방식으로 반응시켜, 표제 화합물의 트리플루오로아세트산 염(1.50 g, 정량적)을 담황색 고체로서 수득하였다.
Figure pat00051
MS (APCI)m/z: 537 (M+H)+
실시예 12 항체-약물 접합체 (12)
[식 38]
Figure pat00052
공정 1: N-(tert-부톡시카르보닐)글리실글리실-L-페닐알라닐-N-[2-(2-{[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]아미노}-2-옥소에톡시)에틸]글리신아미드
실시예 11의 공정 2의 화합물(554 mg, 0.85 mmol)를, 실시예 2의 공정 1과 동일한 방식으로 반응시켜, 표제 화합물(775 mg, 95%)을 수득하였다.
Figure pat00053
MS (APCI)m/z: 955 (M+H)+
공정 2: 글리실글리실-L-페닐알라닐-N-[2-(2-{[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]아미노}-2-옥소에톡시)에틸]글리신아미드
상기 공정 1로 수득한 화합물(630 mg, 0.659 mmol)를, 실시예 2의 공정 2와 동일한 방식으로 반응시켜, 표제 화합물의 트리플루오로아세트산 염(588 mg, 92%)을 수득하였다.
Figure pat00054
MS (APCI)m/z: 855 (M+H)+
공정 3: N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]글리실글리실-L-페닐알라닐-N-[2-(2-{[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]아미노}-2-옥소에톡시)에틸]글리신아미드
상기 공정 2로 수득한 화합물(240 mg, 0.247 mmol)를, 실시예 2의 공정 3과 동일한 방식으로 반응시켜, 표제 화합물(162 mg, 62%)을 수득하였다.
Figure pat00055
MS (APCI)m/z: 1048 (M+H)+
공정 4: 항체-약물 접합체 (12)
참고예 1에서 제조한 트라스트주마브 및 상기 공정 3으로 수득한 화합물을 사용하여, 실시예 6의 공정 2와 동일한 방법에 의해, 표제 항체-약물 접합체를 수득하였다. 추가로 공통 절차 A를 사용하여 용액을 농축하였다. 이후, 공통 절차 E를 사용하여 하기의 특성치를 수득하였다.
항체 농도: 10.77 mg/mL, 항체 수율: 7.5 mg (60%), 항체 분자 당 약물 분자의 평균 접합수 (n): 3.7.
실시예 13 항체-약물 접합체 (13)
[식 39]
Figure pat00056
공정 1: 항체-약물 접합체 (13)
참고예 1에서 제조한 트라스트주마브 및 실시예 12의 공정 3으로 수득한 화합물을 사용하여, 실시예 7의 공정 1과 동일한 방식에 의해, 표제 항체-약물 접합체를 수득하였다. 추가로 공통 절차 A를 사용하여 용액을 농축하였다. 이후, 공통 절차 E를 사용하여 하기의 특성치를 수득하였다.
항체 농도: 10.69 mg/mL, 항체 수율: 7.5 mg (60%), 항체 분자 당 약물 분자의 평균 접합수 (n): 6.9.
실시예 14 중간체 (14)
[식 40]
Figure pat00057
공정 1: tert-부틸 (3-{[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]아미노}-3-옥소프로필)카르바메이트
엑사테칸의 메탄술폰산 염(500 mg, 0.941 mmoL)를, 4-(tert-부톡시카르보닐아미노)부탄산 대신에 N-(tert-부톡시카르보닐)-β-알라닌을 사용하여, 실시예 1의 공정 1과 동일한 방식으로 반응시켜, 표제 화합물(616 mg, 정량적)을 황갈색 고체로서 수득하였다.
Figure pat00058
MS (ESI) m/z: 607 (M+H)+
공정 2: N-[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]-β-알라닌아미드
상기 공정 1로 수득한 화합물을, 실시예 1의 공정 2와 동일한 방식으로 반응시켜, 표제 화합물의 트리플루오로아세트산 염(499 mg, 86%)을 황색 고체로서 수득하였다.
Figure pat00059
MS (ESI) m/z: 507 (M+H)+
실시예 15 항체-약물 접합체 (15)
[식 41]
Figure pat00060
공정 1: N-(tert-부톡시카르보닐)글리실글리실-L-페닐알라닐글리실-N-[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]-β-알라닌아미드
실시예 14의 공정 2로 수득한 화합물(484 mg, 0.780 mmoL)를, 실시예 2의 공정 1과 동일한 방식으로 반응시켜, 표제 화합물(626 mg, 87%)을 담황색 고체로서 수득하였다.
Figure pat00061
공정 2: 글리실글리실-L-페닐알라닐글리실-N-[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]-β-알라닌아미드 트리플루오로아세테이트
상기 공정 1로 수득한 화합물(624 mg, 0.675 mmoL)를, 실시예 2의 공정 2와 동일한 방식으로 반응시켜, 표제 화합물(626 mg, 92%)을 황색 고체로서 수득하였다.
Figure pat00062
MS (ESI) m/z: 825 (M+H)+
공정 3: N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]글리실글리실-L-페닐알라닐글리실-N-[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]-β-알라닌아미드
상기 공정 2로 수득한 화합물(60.0 mg, 0.0646 mmoL)를, 실시예 2의 공정 3과 동일한 방식으로 반응시켜, 표제 화합물(14.0 mg, 21%)를 고체로서 수득하였다.
Figure pat00063
MS (ESI) m/z: 1018 (M+H)+
공정 4: 항체-약물 접합체 (15)
항체의 환원: 참고예 1에서 제조한 트라스트주마브를, 공통 절차 C-1 및 공통 절차 B(280 nm 흡광 계수로서 1.37 mLmg-1cm-1을 사용)을 사용하여, PBS6.0/EDTA로 항체 농도 10 mg/mL를 가지도록 제조하였다. 용액(1.0 mL)를 2 mL 튜브에 수집하고, 10 mM TCEP 수용액(0.0155 mL; 항체 1 분자에 대해 2.3 당량) 및 1M 인산 수소 2칼륨 수용액(0.050 mL)를 가하였다. 용액의 pH가 7.4±0.1인 것을 확인한 후에, 37℃에서 1시간 인큐베이션함으로써, 항체 내 힌지 부분의 디술피드 결합을 환원시켰다.
항체와 약물 링커 사이의 접합: 상기 용액을 22℃에서 10분간 인큐베이션한 후에 상기 공정 3으로 수득한 화합물을 10 mM 포함하는 DMSO 용액(0.0311mL; 항체 1 분자에 대해 4.6 당량)을 첨가해 22℃에서 40분간 인큐베이션하여, 약물 링커를 항체에 접합시켰다. 다음으로, 100 mM NAC 수용액(0.00622 mL; 항체 1 분자에 대해 9.2 당량)을 첨가하고 추가로 22℃에서 20분간 인큐베이션하여, 약물 링커의 반응을 정지시켰다.
정제: 상기 용액을, 공통 절차 D-1(완충액으로서 PBS6.0을 사용)을 사용한 정제를 실시하여, 표제 항체-약물 접합체를 함유하는 용액을 6 mL 수득하였다.
물리화학적 특성 평가: 공통 절차 E를 사용하여 하기의 특성치를 수득하였다.
항체 농도: 1.18 mg/mL, 항체 수율: 7.08 mg (71%), 항체 분자 당 약물 분자의 평균 접합수 (n): 2.0.
실시예 16 항체-약물 접합체 (16)
[식 42]
Figure pat00064
공정 1: 항체-약물 접합체 (16)
항체의 환원: 참고예 1에서 제조한 트라스트주마브를, 공통 절차 C-1 및 공통 절차 B(280 nm 흡광 계수로서 1.37 mLmg-1cm-1을 사용)을 사용하여, PBS6.0/EDTA로 항체 농도 10 mg/mL를 가지도록 제조하였다. 용액(1.0 mL)를 2 mL 튜브에 수집해, 10 mM TCEP 수용액(0.0311mL; 항체 1 분자에 대해 4.6 당량) 및 1M 인산 수소 2칼륨 수용액(0.050 mL)를 가하였다. 용액의 pH가 7.4±0.1인 것을 확인한 후에, 37℃에서 1시간 인큐베이션함으로써, 항체 내 힌지 부분의 디술피드 결합을 환원시켰다.
항체와 약물 링커 사이의 접합: 상기 용액을 22℃에서 10분간 인큐베이션한 후에 실시예 15의 공정 3으로 수득한 화합물을 10 mM 포함하는 DMSO 용액(0.0622 mL; 항체 1 분자에 대해 9.2 당량)을 첨가해 22℃에서 40분간 인큐베이션하여, 약물 링커를 항체에 접합시켰다. 다음으로, 100 mM NAC 수용액(0.0124 mL; 항체 1 분자에 대해 18.4 당량)을 첨가하고 추가로 22℃에서 20분간 인큐베이션하여, 약물 링커의 반응을 정지시켰다.
정제: 상기 용액을, 공통 절차 D-1(완충액으로서 PBS6.0을 사용)을 사용한 정제를 실시하여, 표제 항체-약물 접합체를 함유하는 용액을 6 mL 수득하였다.
물리화학적 특성 평가: 공통 절차 E를 사용하여 하기의 특성치를 수득하였다.
항체 농도: 1.03 mg/mL, 항체 수율: 6.18 mg (62%), 항체 분자 당 약물 분자의 평균 접합수 (n): 3.8.
실시예 17 항체-약물 접합체 (17)
[식 43]
Figure pat00065
공정 1: N-[3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)프로파노일]글리실글리실-L-페닐알라닐글리실-N-[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]-β-알라닌아미드
실시예 15의 공정 2로 수득한 화합물(60.0 mg, 0.0646 mmoL)를, N-숙신이미딜 6-말레이미드 헥사노에이트 대신에 N-숙신이미딜 3-말레이미드 프로피오네이트를 사용하여, 실시예 2의 공정 3과 동일한 방식으로 반응시켜, 표제 화합물(36.0 mg, 57%)를 담황색 고체로서 수득하였다.
Figure pat00066
MS (ESI) m/z: 976 (M+H)+
공정 2: 항체-약물 접합체 (17)
참고예 1에서 제조한 트라스트주마브 및 상기 공정 1로 수득한 화합물을 사용하여, 실시예 6의 공정 2와 동일한 방식에 의해, 표제 항체-약물 접합체를 수득하였다.
항체 농도: 1.74 mg/mL, 항체 수율: 10.4 mg (83%), 항체 분자 당 약물 분자의 평균 접합수 (n): 3.7.
실시예 18 항체-약물 접합체 (18)
[식 44]
Figure pat00067
공정 1: 항체-약물 접합체 (18)
참고예 1에서 제조한 트라스트주마브 및 실시예 17의 공정 1로 수득한 화합물을 사용하여, 실시예 7의 공정 1과 동일한 방식에 의해, 표제 항체-약물 접합체를 수득하였다.
항체 농도: 1.98 mg/mL, 항체 수율: 11.9 mg (95%), 항체 분자 당 약물 분자의 평균 접합수 (n): 6.6.
실시예 19 항체-약물 접합체 (19)
[식 45]
Figure pat00068
공정 1: N-{3-[2-(2-{[3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)프로파노일]아미노})에톡시]프로파노일}글리실글리실-L-페닐알라닐글리실-N-[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]-β-알라닌아미드
실시예 15의 공정 2로 수득한 화합물(60.0 mg, 0.0646 mmoL)를, N-숙신이미딜 6-말레이미드 헥사노에이트 대신에 N-숙신이미딜 3-(2-(2-(3-말레인이미드프로판아미드)에톡시)에톡시)프로파노에이트를 사용하여, 실시예 2의 공정 3과 동일한 방식으로 반응시켜, 표제 화합물(23.0 mg, 31%)를 고체로서 수득하였다.
Figure pat00069
MS (ESI) m/z: 1135 (M+H)+
공정 2: 항체-약물 접합체 (19)
참고예 1에서 제조한 트라스트주마브 및 상기 공정 1로 수득한 화합물을 사용하여, 실시예 6의 공정 2와 동일한 방식에 의해, 표제 항체-약물 접합체를 수득하였다.
항체 농도: 1.60 mg/mL, 항체 수율: 9.6 mg (77%), 항체 분자 당 약물 분자의 평균 접합수 (n): 1.9.
실시예 20 항체-약물 접합체 (20)
[식 46]
Figure pat00070
공정 1: 항체-약물 접합체 (20)
참고예 1에서 제조한 트라스트주마브 및 실시예 19의 공정 1로 수득한 화합물을 사용하여, 실시예 7의 공정 1과 동일한 방식에 의해, 표제 항체-약물 접합체를 수득하였다.
항체 농도: 1.69 mg/mL, 항체 수율: 10.1 mg (81%), 항체 분자 당 약물 분자의 평균 접합수 (n): 3.0.
실시예 21 항체-약물 접합체 (21)
[식 47]
Figure pat00071
공정 1: N-[19-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-17-옥소-4,7,10,13-테트라옥사-16-아자노난데칸-1-오일]글리실글리실-L-페닐알라닐글리실-N-[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]-β-알라닌아미드
실시예 15의 공정 2로 수득한 화합물(60.0 mg, 0.0646 mmoL)를, N-숙신이미딜 6-말레이미드 헥사노에이트 대신에 N-숙신이미딜 1-말레인이미드-3-옥소-7,10,13,16-테트라옥사-4-아자노나데카노에이트를 사용하여, 실시예 2의 공정 3과 동일한 방식으로 반응시켜, 표제 화합물(23.0 mg, 29%)를 고체로서 수득하였다.
Figure pat00072
MS (ESI) m/z: 1224 (M+H)+
공정 2: 항체-약물 접합체 (21)
참고예 1에서 제조한 트라스트주마브 및 상기 공정 1로 수득한 화합물을 사용하여, 실시예 6의 공정 2와 동일한 방법에 의해, 표제 항체-약물 접합체를 수득하였다.
항체 농도: 1.77 mg/mL, 항체 수율: 10.6 mg (85%), 항체 분자 당 약물 분자의 평균 접합수 (n): 3.2.
실시예 22 항체-약물 접합체 (22)
[식 48]
Figure pat00073
공정 1: 항체-약물 접합체 (22)
참고예 1에서 제조한 트라스트주마브 및 실시예 21의 공정 1로 수득한 화합물을 사용하여, 실시예 7의 공정 1과 동일한 방법에 의해, 표제 항체-약물 접합체를 수득하였다.
항체 농도: 1.89 mg/mL, 항체 수율: 11.3 mg (90%), 항체 분자 당 약물 분자의 평균 접합수 (n): 6.2.
실시예 23 중간체 (23)
[식 49]
Figure pat00074
공정 1: tert-부틸 (6-{[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]아미노}-6-옥소헥실)카르바메이트
엑사테칸의 메탄술폰산 염(0.500 g, 0.882 mmoL)를, 4-(tert-부톡시카르보닐아미노)부탄산 대신에 6-(tert-부톡시카르보닐아미노)헥산산을 사용하여, 실시예 1의 공정 1과 동일한 방식으로 반응시켜, 표제 화합물(0.620 g, 정량적)을 수득하였다.
Figure pat00075
공정 2: 6-아미노-N-[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]헥산아미드
상기 공정 1로 수득한 화합물(0.397 g, 0.611 mmoL)를, 실시예 1의 공정 2와 동일한 방식으로 반응시켜, 표제 화합물의 트리플루오로아세트산 염(0.342 g, 84%)를 수득하였다.
Figure pat00076
실시예 24 항체-약물 접합체 (24)
[식 50]
Figure pat00077
공정 1: N-(tert-부톡시카르보닐)글리실글리실-L-페닐알라닐-N-(6-{[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]아미노}-6-옥소헥실)글리신아미드
실시예 23의 공정 2로 수득한 화합물(0.170 g, 0.516 mmoL)를, 실시예 2의 공정 1과 동일한 방식으로 반응시켜, 표제 화합물(0.225 g, 91%)를 수득하였다.
Figure pat00078
공정 2: 글리실글리실-L-페닐알라닐-N-(6-{[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]아미노}-6-옥소헥실)글리신아미드
상기 공정 1로 수득한 화합물(0.105 g, 0.108 mmoL)를, 실시예 2의 공정 2와 동일한 방식으로 반응시켜, 표제 화합물(0.068 mg, 65%)를 수득하였다.
Figure pat00079
공정 3: N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]글리실글리실-L-페닐알라닐-N-(6-{[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]아미노}-6-옥소헥실)글리신아미드
상기 공정 2로 수득한 화합물(58 mg, 0.060 mmoL)를, 실시예 2의 공정 3과 동일한 방식으로 반응시켜, 표제 화합물(39 mg, 62%)을 수득하였다.
Figure pat00080
MS (ESI) m/z: 1060 (M+H)+
공정 4: 항체-약물 접합체 (24)
항체의 환원: 참고예 1에서 제조한 트라스트주마브를, 공통 절차 C-1 및 공통 절차 B(280 nm 흡광 계수로서 1.37 mLmg-1cm-1을 사용)을 사용하여, PBS6.0/EDTA로 항체 농도 10 mg/mL를 가지도록 제조하였다. 용액(9.0 mL)를 50 mL 튜브에 수집하고, 10 mM TCEP 수용액(0.140 mL; 항체 1 분자에 대해 2.3 당량) 및 1M 인산 수소 2칼륨 수용액(0.450 mL)를 가하였다. 용액의 pH가 7.4±0.1인 것을 확인한 후에, 37℃에서 1시간 인큐베이션함으로써, 항체 내 힌지 부분의 디술피드 결합을 환원시켰다.
항체와 약물 링커 사이의 접합: 상기 용액을 22℃에서 10분간 인큐베이션한 후에 상기 공정 3의 화합물을 10 mM 포함하는 DMSO 용액(0.280 mL; 항체 1 분자에 대해 4.6 당량)을 첨가하고 22℃에서 40분간 인큐베이션하여, 약물 링커를 항체에 접합시켰다. 다음으로, 100 mM NAC 수용액(0.0559 mL; 항체 1 분자에 대해 9.2 당량)을 첨가하고 추가로 22℃에서 20분간 인큐베이션하여, 약물 링커의 반응을 정지시켰다.
정제: 상기 용액을, 공통 절차 D-1(완충액으로서 PBS7.4를 사용)을 사용한 정제를 실시하여, 표제 항체-약물 접합체를 함유하는 용액을 수득하였다.
물리화학적 특성 평가: 공통 절차 E를 사용하여 하기의 특성치를 수득하였다.
항체 농도: 3.30 mg/mL, 항체 수율: 53.5 mg (59%), 항체 분자 당 약물 분자의 평균 접합수 (n): 1.7.
실시예 25 항체-약물 접합체 (25)
[식 51]
Figure pat00081
공정 1: 항체-약물 접합체 (25)
항체의 환원: 참고예 1에서 제조한 트라스트주마브를, 공통 절차 C-1 및 공통 절차 B(280 nm 흡광 계수로서 1.37 mLmg-1cm-1을 사용)을 사용하여, PBS6.0/EDTA로 항체 농도 10 mg/mL를 가지도록 제조하였다. 용액(9.0 mL)를 50 mL 튜브에 수집하고, 10 mM TCEP 수용액(0.280 mL; 항체 1 분자에 대해 4.6 당량) 및 1M 인산 수소 2칼륨 수용액(0.450 mL)를 가하였다. 용액의 pH가 7.4±0.1인 것을 확인한 후에, 37℃에서 1시간 인큐베이션함으로써, 항체 내 힌지 부분의 디술피드 결합을 환원시켰다.
항체와 약물 링커 사이의 접합: 상기 용액을 22℃에서 10분간 인큐베이션한 후에 실시예 24의 공정 3의 화합물을 10 mM 포함하는 DMSO 용액(0.559 mL; 항체 1 분자에 대해 9.2 당량)을 첨가하고 22℃에서 40분간 인큐베이션하여, 약물 링커를 항체에 접합시켰다. 다음으로, 100 mM NAC 수용액(0.112 mL; 항체 1 분자에 대해 18.4 당량)을 첨가하고 추가로 22℃에서 20분간 인큐베이션하여, 약물 링커의 반응을 정지시켰다.
정제: 상기 용액을, 공통 절차 D-1(완충액으로서 PBS6.0을 사용)을 사용한 정제를 실시하여, 표제 항체-약물 접합체를 함유하는 용액을 수득하였다.
물리화학적 특성 평가: 공통 절차 E를 사용하여 하기의 특성치를 수득하였다.
항체 농도: 10.65 mg/mL, 항체 수율: 55.1 mg (61%), 항체 분자 당 약물 분자의 평균 접합수 (n): 2.5.
실시예 26 항체-약물 접합체 (26)
[식 52]
Figure pat00082
공정 1: ({N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]글리실}아미노)메틸 아세테이트
N-9-플루오레닐메톡시카보닐글리실글리신(4.33 g, 12.2 mmol), 테트라히드로푸란(THF; 120 ml), 및 톨루엔(40.0 ml)을 함유하는 혼합물에, 피리딘(1.16 ml, 14.7 mmol) 및 테트라아세트산 납(6.84 g, 14.7 mmol)를 첨가하고 5시간 가열 환류하였다. 반응액을 실온까지 냉각한 후, 불용물을 셀라이트 여과에 의해 제거하고, 감압 하 응축하였다. 수득한 잔류물을 에틸 아세테이트에 용해하고, 물 및 포화 식염수로 세정 후, 유기층을 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 용매를 감압 하 제거한 후, 수득한 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 [헥산:에틸 아세테이트 = 9:1 (v/v)~에틸 아세테이트]에 의해 정제하여, 표제 화합물(3.00 g, 67%)를 무색 고체로서 수득하였다.
Figure pat00083
공정 2: 벤질 [({N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]글리실}아미노)메톡시]아세테이트
상기 공정 1로 수득한 화합물(3.68 g, 10.0 mmoL) 및 벤질 글리콜레이트(4.99g, 30.0 mmoL)의 THF(40.0 mL) 용액에, 칼륨 tert-부톡시드(2.24 g, 20.0 mmoL)를 0℃에서 더해 실온에서 15분간 교반하였다. 반응 용액에 에틸 아세테이트 및 물을 0℃에서 더해 에틸 아세테이트 및 클로로포름으로 추출하였다. 수득한 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하였다. 용매를 감압 하 제거하였다. 수득한 잔류물을 디옥산(40.0 mL) 및 물(10.0 mL)에 용해하여, 탄산수소나트륨(1.01 g, 12.0 mmoL) 및 9-플루오레닐메틸 클로로포르메이트(2.59 g, 10.0 mmoL)를 첨가하고 실온에서 2시간 교반하였다. 반응 용액에 물을 가하고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 수득한 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고 여과하였다. 용매를 감압 하 제거하고, 수득한 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 [헥산:에틸 아세테이트 = 100:0 (v/v)~0:100]에 의해 정제하여, 무색 유상의 표제 화합물(1.88 g, 40%)를 수득하였다.
Figure pat00084
공정 3: [({N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]글리실}아미노)메톡시]아세트산
상기 공정 2로 수득한 화합물(1.88 g, 3.96 mmoL)를 에탄올(40.0 mL) 및 에틸 아세테이트(20.0 ml)에 용해하였다. 팔라듐 탄소 촉매(376 mg)를 첨가한 후, 수소 분위기 하, 실온에서 2시간 교반하였다. 불용물을 셀라이트 여과에 의해 제거하고, 용매를 감압 하 제거하여, 표제 화합물(1.52 g, 정량적)을 무색 고체로서 수득하였다.
Figure pat00085
공정 4: 9H-플루오렌-9-일메틸(2-{[(2-{[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]아미노}-2-옥소에톡시)메틸]아미노}-2-옥소에틸)카르바메이트
빙랭 하, 엑사테칸의 메탄술폰산 염(0.283 g, 0.533 mmoL), N-히드록시숙신이미드(61.4 mg, 0.533 mmoL), 및 상기 공정 3으로 수득한 화합물(0.205 g, 0.533 mmoL)의 N,N-디메틸포름아미드(10.0 mL) 용액에, N,N-디이소프로필에틸아민(92.9μL, 0.533 mmoL) 및 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 (0.143 g, 0.693 mmoL)를 첨가하고 실온에서 3일간 교반하였다. 용매를 감압 하 제거하고, 수득한 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 [클로로포름~클로로포름:메탄올:물 = 7:3:1 (v/v/v)의 분배 유기층]에 의해 정제하여, 표제 화합물(0.352 g, 82%)를 담갈색 고체로서 수득하였다.
Figure pat00086
MS (ESI) m/z: 802 (M+H)+
공정 5: N-[(2-{[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]아미노}-2-옥소에톡시)메틸]글리신아미드
상기 공정 4로 수득한 화합물(0.881g, 1.10 mmoL)의 N,N-디메틸포름아미드(11.0 mL) 용액에, 피페리딘(1.1 mL)를 첨가하고 실온에서 2시간 교반하였다. 용매를 감압 하 제거하여, 표제 화합물을 포함하는 혼합물을 수득하였다. 혼합물은, 더 이상의 정제는 실시하지 않고 다음의 반응에 사용하였다
공정 6: N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]글리실글리실-L-페닐알라닐-N-[(2-{[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]아미노}-2-옥소에톡시)메틸]글리신아미드
빙랭 하, 상기 공정 5로 수득한 혼합물(0.439 mmoL), N-히드록시숙신이미드(0.101 g, 0.878 mmoL), 및 N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]글리실글리실-L-페닐알라닌(일본 공개특허공보 2002-60351호; 0.440 g, 0.878 mmoL)의 N,N-디메틸포름아미드(50.0 mL) 용액에, N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 (0.181 g, 0.878 mmoL)를 첨가하고 실온에서 4일간 교반하였다. 용매를 감압 하 제거하고, 수득한 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 [클로로포름~클로로포름:메탄올 = 9:1 (v/v)]에 의해 정제하여, 표제 화합물(0.269 g, 58%)를 옅은 오렌지색 고체로서 수득하였다.
MS (ESI) m/z: 1063 (M+H)+
공정 7: 글리실글리실-L-페닐알라닐-N-[(2-{[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]아미노}-2-옥소에톡시)메틸]글리신아미드
상기 공정 6으로 수득한 화합물(0.269 g, 0.253 mmoL)의 N,N-디메틸포름아미드(4.00 mL) 용액에, 피페리딘(0.251 mL, 2.53 mmoL)를 첨가하고 실온에서 2시간 교반하였다. 용매를 감압 하 제거하여, 표제 화합물을 포함하는 혼합물을 수득하였다. 혼합물은, 더 이상의 정제는 실시하지 않고 다음의 반응에 사용하였다.
공정 8: N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]글리실글리실-L-페닐알라닐-N-[(2-{[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]아미노}-2-옥소에톡시)메틸]글리신아미드
상기 공정 7로 수득한 화합물(0.253 mmoL)의 N,N-디메틸포름아미드(10.0 mL) 용액에, N-숙신이미딜 6-말레이미드 헥사노에이트(0.156 g, 0.506 mmoL)를 첨가하고 실온에서 3일간 교반하였다. 용매를 감압 하 제거하고, 수득한 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 [클로로포름~클로로포름:메탄올 = 9:1 (v/v)]에 의해 정제하여, 표제 화합물(0.100 g, 38%)를 담황색 고체로서 수득하였다.
Figure pat00087
MS (ESI) m/z: 1034 (M+H)+
공정 9: 항체-약물 접합체 (26)
참고예 1에서 제조한 트라스트주마브 및 상기 공정 8로 수득한 화합물을 사용하여, 실시예 6의 공정 2와 동일한 방식에 의해, 표제 항체-약물 접합체를 수득하였다.
항체 농도: 1.61 mg/mL, 항체 수율: 9.7 mg (77%), 항체 분자 당 약물 분자의 평균 접합수 (n): 2.9.
실시예 27 항체-약물 접합체 (27)
[식 53]
Figure pat00088
공정 1: 항체-약물 접합체 (27)
참고예 1에서 제조한 트라스트주마브 및 실시예 26의 공정 8로 수득한 화합물을 사용하여, 실시예 7의 공정 1과 동일한 방식에 의해, 표제 항체-약물 접합체를 수득하였다.
항체 농도: 1.58 mg/mL, 항체 수율: 9.5 mg (76%), 항체 분자 당 약물 분자의 평균 접합수 (n): 5.6.
실시예 28 항체-약물 접합체 (28)
[식 54]
Figure pat00089
공정 1: 항체-약물 접합체 (28)
항체의 환원: 참고예 1에서 제조한 트라스트주마브를, 공통 절차 C-1 및 B(280 nm 흡광 계수로서 1.48 mLmg-1cm-1을 사용)을 사용하여, 매질을 PBS6.0/EDTA 로 교체하여, 항체 농도 10 mg/mL를 가지도록 제조하였다. 용액(1.25 mL)를 1.5 mL 폴리프로필렌제 튜브 2개에 넣어 여기에 10 mM TCEP 수용액(0.039 mL; 항체 1 분자에 대해 4.6 당량) 및 1M 인산 수소 2칼륨 수용액(0.0625 mL)를 가하였다. 용액의 pH가 7.4±0.1인 것을 확인한 후에, 37℃에서 1시간 인큐베이션함으로써, 항체 내 힌지 부분의 디술피드 결합을 환원시켰다.
항체와 약물 링커 사이의 접합: 상기 용액에, DMSO(0.072 mL)와 실시예 26의 공정 8의 화합물을 10 mM 포함하는 DMSO 용액(0.078 mL; 항체 1 분자에 대해 9.2 당량)을 실온에서 첨가하고, 튜브 회전기를 사용하여 실온에서 40분간 교반하여 약물 링커를 항체에 접합시켰다. 다음으로, 100 mM NAC 수용액(0.0155 mL)를 첨가하고 추가로 실온에서 20분간 교반하여, 약물 링커의 반응을 정지시켰다.
정제: 상기 용액을, 공통 절차 D-1(완충액으로서 ABS를 사용)을 사용한 정제를 실시하여, 목적의 화합물을 함유하는 용액을 총 11.7 mL 수득하였다.
물리화학적 특성 평가: 공통 절차 E를 사용하여 하기의 특성치를 수득하였다.
항체 농도: 1.60 mg/mL, 항체 수율: 18.7 mg (94%), 항체 분자 당 약물 분자의 평균 접합수 (n): 5.2.
실시예 29 항체-약물 접합체 (29)
[식 55]
Figure pat00090
공정 1: 항체-약물 접합체 (29)
항체의 환원: 참고예 1에서 제조한 트라스트주마브를, 공통 절차 C-1 및 B(280 nm 흡광 계수로서 1.48 mLmg-1cm-1을 사용)을 사용하여, 매질을 PBS6.0/EDTA 로 교체하여, 항체 농도 10 mg/mL를 가지도록 제조하였다. 용액(6 mL)을 폴리프로필렌제 튜브에 넣어 여기에 10 mM TCEP 수용액(0.108 mL; 항체 1 분자에 대해 2.5 당량) 및 1M 인산 수소 2칼륨 수용액(0.091mL)를 가하였다. 용액의 pH가 7.0±0.1인 것을 확인한 후에, 37℃에서 1시간 인큐베이션함으로써, 항체 내 힌지 부분의 디술피드 결합을 환원시켰다.
항체와 약물 링커 사이의 접합: 상기 용액에, DMSO(0.146 mL)와 실시예 26의 공정 8의 화합물을 10 mM 포함하는 DMSO 용액(0.193 mL; 항체 1 분자에 대해 4.5 당량)을 실온에서 첨가하고 15℃에서 1시간 인큐베이션하여, 약물 링커를 항체에 접합시켰다. 다음으로, 100 mM NAC 수용액(0.029 mL)를 첨가하고 추가로 실온에서 20분간 교반하여, 약물 링커의 반응을 정지시켰다.
정제: 상기 용액을, 공통 절차 D(완충액으로서 ABS를 사용)를 사용한 정제를 실시하여, 목적의 화합물을 함유하는 용액을 24 mL 수득하였다.
물리화학적 특성 평가: 공통 절차 E 및 F(εD,280 = 5178(실측치), εD,370 = 20217(실측치)을 사용)을 사용하여 하기의 특성치를 수득하였다.
항체 농도: 1.77 mg/mL, 항체 수율: 42 mg (85%), 공통 절차 E에서 측정된 항체 분자 당 약물 분자의 평균 접합수 (n): 3.0; 공통 절차 F에서 측정된 항체 분자 당 약물 분자의 평균 접합수 (n): 3.4.
실시예 30 항체-약물 접합체 (30)
[식 56]
Figure pat00091
공정 1: 항체-약물 접합체 (30)
항체의 환원: 참고예 1에서 제조한 트라스트주마브를, 공통 절차 C-1 및 B(280 nm 흡광 계수로서 1.48 mLmg-1cm-1을 사용)을 사용하여, 매질을 PBS6.0/EDTA 로 교체하여, 항체 농도 10 mg/mL를 가지도록 제조하였다. 용액(6 mL)을 폴리프로필렌제 튜브에 넣어 여기에 10 mM TCEP 수용액(0.215 mL; 항체 1 분자에 대해 5 당량) 및 1M 인산 수소 2칼륨 수용액(0.094 mL)를 가하였다. 용액의 pH가 7.0±0.1인 것을 확인한 후에, 37℃에서 1시간 인큐베이션함으로써, 항체 내 힌지 부분의 디술피드 결합을 환원시켰다.
항체와 약물 링커 사이의 접합: 상기 용액에, 실시예 26의 공정 8의 화합물을 10 mM 포함하는 DMSO 용액(0.370 mL; 항체 1 분자에 대해 8.6 당량)을 실온에서 첨가하고 15℃에서 1시간 인큐베이션하여, 약물 링커를 항체에 접합시켰다. 다음으로, 100 mM NAC 수용액(0.056 mL)를 첨가하고 추가로 실온에서 20분간 교반하여, 약물 링커의 반응을 정지시켰다.
정제: 상기 용액을, 공통 절차 D(완충액으로서 ABS를 사용)를 사용한 정제를 실시하여, 목적의 화합물을 함유하는 용액을 24 mL 수득하였다.
물리화학적 특성 평가: 공통 절차 E 및 F(εD,280 = 5178(실측치), εD,370 = 20217(실측치)을 사용)을 사용하여 하기의 특성치를 수득하였다.
항체 농도: 1.92 mg/mL, 항체 수율: 46 mg (92%), 공통 절차 E에서 측정된 항체 분자 당 약물 분자의 평균 접합수 (n): 6.2; 공통 절차 F에서 측정된 항체 분자 당 약물 분자의 평균 접합수 (n): 7.1.
실시예 31 항체-약물 접합체 (31)
[식 57]
Figure pat00092
공정 1: 항체-약물 접합체 (31)
항체의 환원: 참고예 1에서 제조한 트라스트주마브를, 공통 절차 C-1 및 B(280 nm 흡광 계수로서 1.48 mLmg-1cm-1을 사용)을 사용하여, 매질을 PBS6.0/EDTA 로 교체하여, 항체 농도 10 mg/mL를 가지도록 제조하였다. 용액(50.00 mL)를 폴리프로필렌제 용기에 넣어 교반 하, 실온에서 1M 인산 수소 2칼륨 수용액(0.745 mL)를 가한 후, 10 mM TCEP 수용액(1.868 mL; 항체 1 분자에 대해 5.4 당량)을 가하였다. 용액의 pH가 7.0±0.1인 것을 확인한 후에, 교반을 정지하고, 37℃에서 1시간 인큐베이션함으로써, 항체 내 힌지 부분의 디술피드 결합을 환원하였다.
항체와 약물 링커 사이의 접합: 상기 용액을 15℃로 냉각 후, 교반 하에, 실시예 26의 공정 8의 화합물을 10 mM 포함하는 DMSO 용액(2.958 mL; 항체 1 분자에 대해 8.6 당량)을 천천히 적하하였다. 15℃에서 온도를 유지시키면서, 반응 용액을 최초 30분간 교반하고, 다음 1시간은 교반 없이 인큐베이션하여, 약물 링커를 항체에 접합시켰다. 다음으로, 교반 하에, 100 mM NAC 수용액(0.444 mL)를 첨가하고 추가로 실온에서 20분간 교반하여, 약물 링커의 반응을 정지시켰다.
정제: 교반 하, 상기 용액에 20% 아세트산 수용액(약 0.25 mL)와 ABS(50 mL)를 천천히 첨가하여 용액의 pH를 5.5±0.1로 조정하였다. 이 용액을 정밀 여과(Millipore Corp. Millex-HV 필터, 0.45 μm, PVDF 막)하여 백탁물을 제거하였다. 이 용액에 대해, 한외여과막(Merck Japan, Pellicon XL Cassette, Biomax 50 KDa), 튜브 펌프(Cole-Parmer International, MasterFlex Pump model 77521-40, Pump Head model 7518-00) 및 튜브(Cole-Parmer International, MasterFlex Tube L/S16)로 구성된 한외여과 장치를 이용하여 한외여과 정제를 실시하였다. 구체적으로, 반응액에 정제 완충액으로서 ABS(합계 800 mL)를 적하하면서, 한외여과 정제를 실시하는 것으로, 미접합 약물 링커 및 다른 저분자량 시약을 제거함과 함께 완충액을 ABS로 교체하고, 용액을 추가로 농축하였다. 수득한 정제 용액에 대해, 정밀 여과(0.22 μm(Millipore Corp. Millex-GV 필터, PVDF 막) 및 0.10 μm(Millipore Corp. Millex-VV 필터, PVDF 막))를 실시하여, 표제 항체-약물 접합체를 함유하는 용액을 수득하였다.
물리화학적 특성 평가: 공통 절차 E 및 F(εD,280= 5178(실측치), εD,370 = 20217(실측치)을 사용)을 사용하여 하기의 특성치를 수득하였다.
항체 농도: 11.28 mg/mL, 항체 수율: 451 mg (90%), 공통 절차 E에서 측정된 항체 분자 당 약물 분자의 평균 접합수 (n): 6.6; 공통 절차 F에서 측정된 항체 분자 당 약물 분자의 평균 접합수 (n): 7.7.
실시예 32 (실시예 26의 공정 8의 화합물의 대안 합성법)
[식 58]
Figure pat00093
공정 1: tert-부틸 N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]글리실글리실-L-페닐 알라니네이트
빙랭 하, tert-부틸 N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]글리실글리실-L-페닐 알라니네이트(J. Pept. Res., 1999년, 53권, 393; 0.400 g, 0.717 mmol)의 THF(12.0 ml) 용액에, 1,8-디아자비시클로[5.4.0]-7-운데센(0.400 ml)를 첨가하고 실온에서 4일간 교반한 후, 나아가 N-숙신이미딜 6-말레이미드 헥사노에이트(0.221g, 0.717 mmoL)를 첨가하고 3시간 교반하였다. 반응액을 에틸 아세테이트로 희석하고, 10% 시트르산 수용액, 포화 탄산수소나트륨 수용액, 및 포화 식염수로 세정 후, 유기층을 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 용매를 감압 하 제거한 후, 수득한 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 [클로로포름~클로로포름:메탄올 = 9:1 (v/v)]에 의해 정제하여, 표제 화합물(0.295 g, 78%)를 담황색 고체로서 수득하였다.
Figure pat00094
MS (ESI) m/z: 529 (M+H)+
공정 2: N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]글리실글리실-L-페닐알라닌
상기 공정 1로 수득한 화합물(0.295 g, 0.558 mmoL)의 디클로로메탄(8.00 ml) 용액에, 트리플루오로아세트산(4.00 mL)를 첨가하고 실온에서 18시간 교반하였다. 용매를 감압 하 제거하여, 표제 화합물(0.240 g, 91%)를 담황색 고체로서 수득하였다.
Figure pat00095
공정 3: N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]글리실글리실-L-페닐알라닐-N-[(2-{[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]아미노}-2-옥소에톡시)메틸]글리신아미드
상기 공정 2로 수득한 화합물(0.572 g, 1.21 mmoL)를 디클로로메탄(12.0 mL)에 용해하여, N-히드록시숙신이미드(0.152 g, 1.32 mmoL), 및 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드(0.253 g, 1.32 mmoL)를 가하고 1시간 교반하였다. 반응 용액을 실시예 26의 공정 5로 수득한 혼합물(1.10 mmoL)의 N,N-디메틸포름아미드(22.0 mL) 용액에 첨가하고 실온에서 3시간 교반하였다. 반응 용액에 10% 시트르산 수용액을 첨가하고 클로로포름으로 추출하였다. 수득한 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하였다. 용매를 감압 하 제거하고, 수득한 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 [클로로포름~클로로포름:메탄올 = 8:2 (v/v)]에 의해 정제하여, 표제 화합물(0.351 g, 31%)를 담황색 고체로서 수득하였다. 화합물의 기기 데이터는, 실시예 26의 공정 8의 화합물과 동일하였다.
실시예 33 (실시예 26의 공정 8의 화합물의 대안 합성법)
[식 59]
Figure pat00096
공정 1: 벤질 [({N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]글리실}아미노)메톡시]아세테이트
실시예 26의 공정 1로 수득한 화합물(7.37 g, 20.0 mmoL)의 THF(200 ml) 용액에, 벤질 글리콜레이트(6.65 g, 40.0 mmoL), 및 p-톨루엔 술폰산 일수화물(0.381g, 2.00 mmoL)를 0℃에서 첨가하고 실온에서 2시간 30분간 교반하였다. 반응 용액에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 가하고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 수득한 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하였다. 용매를 감압 하 제거하고, 수득한 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 [헥산: 에틸 아세테이트 = 100:0 (v/v)~0:100]에 의해 정제하여, 표제 화합물(6.75 g, 71%)를 무색 고체로서 수득하였다. 화합물의 기기 데이터는, 실시예 26의 공정 2의 화합물과 동일하였다.
공정 2: N-[(벤질옥시)카르보닐]글리실글리실-L-페닐알라닌-N-{[(2-(벤질옥시)-2-옥소에톡시]메틸}글리신아미드
상기 공정 1로 수득한 화합물(6.60 g, 13.9 mmoL)의 N,N-디메틸포름아미드 (140 mL) 용액에, 1,8-디아자비시클로[5.4.0]운데크-7-엔(2.22 g, 14.6 mmoL)를 0℃에서 첨가하고 실온에서 15분간 교반하였다. 반응 용액에, N-[(벤질옥시)카르보닐]글리실글리실-L-페닐알라닌(6.33 g, 15.3 mmoL), N-히드록시숙신이미드(1.92 g, 16.7 mmoL), 및 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드(3.20 g, 16.7 mmoL)의 N,N-디메틸포름아미드(140 mL) 용액을, 미리 실온에서 1시간 교반한 후에 첨가하고, 실온에서 4시간 교반하였다. 반응 용액에 0.1N 염산을 첨가하고 클로로포름으로 추출하였다. 수득한 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하였다. 용매를 감압 하 제거하고, 수득한 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 [클로로포름~클로로포름:메탄올 = 8:2 (v/v)]에 의해 정제하여, 표제 화합물(7.10 g, 79%)를 무색 고체로서 수득하였다.
Figure pat00097
공정 3: 글리실글리실-L-페닐알라닐-N-[(카르복시메톡시)메틸]글리신아미드
상기 공정 2로 수득한 화합물(7.00 g, 10.8 mmoL)의 N,N-디메틸포름아미드(216 mL) 용액에, 팔라듐 탄소 촉매(7.00 g)를 첨가하고, 수소 분위기 하 실온에서 24시간 교반하였다. 불용물을 셀라이트 여과에 의해 제거하고, 용매를 감압 하 제거하였다. 수득한 잔류물을 물에 용해하여, 불용물을 셀라이트 여과에 의해 제거하고, 용매를 감압 하 제거하였다. 상기 절차를 2회 반복하여, 표제 화합물(3.77 g, 82%)를 무색 고체로서 수득하였다.
Figure pat00098
공정 4: N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]글리실글리실-L-페닐알라닐-N-[(카르복시메톡시)메틸]글리신아미드
상기 공정 3으로 수득한 화합물(3.59 g, 8.48 mmoL)의 N,N-디메틸포름아미드(85.0 mL) 용액에, N-숙신이미딜 6-말레이미드 헥사노에이트(2.88 g, 9.33 mmoL), 및 트리에틸아민(0.858 g, 8.48 mmoL)를 첨가하고 실온에서 1시간 교반하였다. 반응 용액에 0.1N 염산을 첨가하고 클로로포름, 클로로포름과 메탄올의 혼합 용매[클로로포름:메탄올 = 4:1 (v/v)]로 추출하였다. 수득한 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하였다. 용매를 감압 하 제거하고, 수득한 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 [클로로포름~클로로포름:메탄올:물 = 7:3:1 (v/v/v)의 분배 유기층]에 의해 정제하여, 표제 화합물(3.70 g, 71%)를 무색 고체로서 수득하였다.
Figure pat00099
공정 5: N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]글리실글리실-L-페닐알라닐-N-[(2-{[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]아미노}-2-옥소에톡시)메틸]글리신아미드
엑사테칸의 메탄술폰산 염(1.14 g, 2.00 mmoL)의 N,N-디메틸포름아미드(40.0 mL) 용액에, 트리에틸아민(0.202 g, 2.00 mmoL), 상기 공정 4로 수득한 화합물(1.48 g, 2.40 mmoL), 및 16.4% 물 함유의 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 클로라이드(0.993 g, 3.00 mmoL)를 0℃에서 첨가하고 실온에서 1시간 교반하였다. 용매를 감압 하 제거하고, 수득한 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 [클로로포름~클로로포름:메탄올 = 8:2 (v/v)]에 의해 정제하여, 표제 화합물(1.69 g, 82%)를 담황색 고체로서 수득하였다. 화합물의 스펙트럼 데이터는, 실시예 26의 공정 8의 화합물과 동일하였다.
실시예 34 중간체 (34)
[식 60]
Figure pat00100
공정 1: 2-{[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]아미노}-2-옥소에틸아세테이트
빙랭 하, 엑사테칸의 메탄술폰산 염(0.500 g, 0.941 mmoL)의 N,N-디메틸포름아미드(20.0 mL) 현탁액에, N,N-디이소프로필에틸아민(0.492 mL, 2.82 mmoL) 및 아세톡시아세틸 클로라이드(0.121 ml, 1.13 mmoL)를 첨가하고 실온에서 1시간 교반하였다. 용매를 감압 하 제거하고, 수득한 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 [클로로포름~클로로포름:메탄올:물 = 7:3:1 (v/v/v)의 분배 유기층]에 의해 정제하여, 표제 화합물(0.505 g, 정량적)을 담황색 고체로서 수득하였다.
Figure pat00101
MS (ESI) m/z: 536 (M+H)+
공정 2: N-[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]-2-히드록시아세트아미드
상기 공정 1로 수득한 화합물(0.504 g, 0.941 mmoL)의 메탄올(50.0 mL) 현탁액에, THF(20.0 ml) 및 1N 수산화나트륨 수용액(4.00 ml, 4.00 mmoL)를 첨가하고 실온에서 1시간 교반하였다. 1N 염산(5.00 ml, 5.00 mmoL)를 첨가해 반응을 정지시키고, 용매를 감압 하 제거하였다. 수득한 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 [클로로포름~클로로포름:메탄올:물 = 7:3:1 (v/v/v)의 분배 유기층]에 의해 정제하여, 표제 화합물(0.412 g, 89%)를 담황색 고체로서 수득하였다. 항체-약물 접합체 (45) 또는 (46)을 투여한 마우스의 종양 내에서 상기 화합물을 확인하였다.
Figure pat00102
실시예 35 (실시예 34의 화합물의 대안 합성법)
[식 61]
Figure pat00103
공정 1: N-[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]-2-히드록시아세트아미드
글리콜 산(0.0201 g, 0.27 mmoL)를 N,N-디메틸포름아미드(1.0 mL)에 용해하여, N-히드록시숙신이미드(0.0302 g, 0.27 mmoL), 및 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드(0.0508 g, 0.27 mmoL)를 첨가하고 1시간 교반하였다. 반응 용액을 엑사테칸의 메탄술폰산 염(0.1 g, 0.176 mmoL) 및 트리에틸아민(0.025 mL, 0.18 mmoL) 을 가한 N,N-디메틸포름아미드 현탁액(1.0 mL)에 첨가하고 실온에서 24시간 교반하였다. 용매를 감압 하 제거하고, 수득한 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 [클로로포름~클로로포름:메탄올 = 10:1 (v/v)]에 의해 정제하여, 표제 화합물(0.080 g, 92%)를 담황색 고체로서 수득하였다. 화합물의 스펙트럼 데이터는, 실시예 34의 공정 2로 수득한 화합물과 동일하였다.
실시예 36 항체-약물 접합체 (36)
[식 62]
Figure pat00104
공정 1: N-[4-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)부타노일]글리실글리실-L-페닐알라닐글리실-N-[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]-β-알라닌아미드
실시예 15의 공정 2로 수득한 화합물(60.0 mg, 0.0646 mmoL)를, N-숙신이미딜 6-말레이미드 헥사노에이트 대신에 N-숙신이미딜 4-말레이미드 부티레이트를 사용하여, 실시예 2의 공정 3과 동일한 방식으로 반응시켜, 표제 화합물(24.0 mg, 38%)를 담백색 고체로서 수득하였다.
Figure pat00105
MS (ESI) m/z: 990 (M+H)+
공정 2: 항체-약물 접합체 (33)
참고예 1에서 제조한 트라스트주마브 및 상기 공정 1로 수득한 화합물을 사용하여, 실시예 6 의 공정 2와 동일한 방식에 의해, 표제 항체-약물 접합체를 수득하였다.
항체 농도: 1.75 mg/mL, 항체 수율: 10.5 mg (84%), 항체 분자 당 약물 분자의 평균 접합수 (n): 4.7.
실시예 37 항체-약물 접합체 (37)
[식 63]
Figure pat00106
공정 1: 항체-약물 접합체 (37)
참고예 1에서 제조한 트라스트주마브 및 실시예 36의 공정 1로 수득한 화합물을 사용하여, 실시예 7의 공정 1과 동일한 방식에 의해, 표제 항체-약물 접합체를 수득하였다.
항체 농도: 1.89 mg/mL, 항체 수율: 11.3 mg (90%), 항체 분자 당 약물 분자의 평균 접합수 (n): 8.5.
실시예 38 중간체 (38)
[식 64]
Figure pat00107
공정 1: tert-부틸 (5-{[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]아미노}-5-옥소펜틸)카르바메이트
엑사테칸의 메탄술폰산 염(500 mg, 0.941 mmoL)를, 4-(tert-부톡시카르보닐아미노)부탄산 대신에 5-(tert-부톡시카르보닐아미노)발레르산을 사용하여, 실시예 1의 공정 1과 동일한 방식으로 반응시켜, 표제 화합물(571 mg, 96%)을 황갈색 고체로서 수득하였다. 화합물을 더 이상의 정제 없이 다음의 반응에 사용하였다.
MS (ESI) m/z: 635 (M+H)+
공정 2: 5-아미노-N-[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]펜탄아미드
상기 공정 1로 수득한 화합물(558 mg, 0.879 mmoL)를, 실시예 1의 공정 2와 동일한 방식으로 반응시켜, 표제 화합물의 트리플루오로아세테이트(363 mg, 64%)을 황색 고체로서 수득하였다.
Figure pat00108
MS (ESI) m/z: 535 (M+H)+
실시예 39 항체-약물 접합체 (39)
[식 65]
Figure pat00109
공정 1: N-(tert-부톡시카르보닐)글리실글리실-L-페닐알라닐-N-(5-{[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]아미노}-5-옥소펜틸)글리신아미드
실시예 38의 공정 2로 수득한 화합물(348 mg, 0.537 mmoL)를, 실시예 2의 공정 1과 동일한 방식으로 반응시켜, 표제 화합물(429 mg, 84%)을 담황색 고체로서 수득하였다. 화합물을 더 이상의 정제 없이 다음의 반응에 사용하였다
공정 2: 글리실글리실-L-페닐알라닐-N-(5-{[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]아미노}-5-옥소펜틸)글리신아미드
상기 공정 1로 수득한 화합물(427 mg, 0.448 mmoL)를, 실시예 2의 공정 2와 동일한 방식으로 반응시켜, 표제 화합물의 트리플루오로아세테이트(430 mg, 99%)를 황색 고체로서 수득하였다.
Figure pat00110
MS (ESI) m/z: 853 (M+H)+
공정 3: N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]글리실글리실-L-페닐알라닐-N-(5-{[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]아미노}-5-옥소펜틸)글리신아미드
상기 공정 2로 수득한 화합물(60.0 mg, 0.0621 mmoL)를, 실시예 2의 공정 3과 동일한 방식으로 반응시켜, 표제 화합물(16.0 mg, 25%)를 고체로서 수득하였다.
Figure pat00111
MS (ESI) m/z: 1046 (M+H)+
공정 4: 항체-약물 접합체 (39)
항체의 환원: 참고예 1에서 제조한 트라스트주마브를, 공통 절차 C-1 및 공통 절차 B(280 nm 흡광 계수로서 1.37 mLmg-1cm-1을 사용)을 사용하여, PBS6.0/EDTA로 항체 농도 10 mg/mL를 가지도록 제조하였다. 용액(1.0 mL)를 2 mL 튜브에 수집하고, 10 mM TCEP 수용액(0.0155 mL; 항체 1 분자에 대해 2.3 당량) 및 1M 인산 수소 2칼륨 수용액(0.050 mL)를 가하였다. 용액의 pH가 7.4±0.1인 것을 확인한 후에, 37℃에서 1시간 인큐베이션함으로써, 항체 내 힌지 부분의 디술피드 결합을 환원시켰다.
항체와 약물 링커 사이의 접합: 상기 용액을 22℃에서 10분간 인큐베이션한 후에 상기 공정 3으로 수득한 화합물을 10 mM 포함하는 DMSO 용액(0.0311 mL; 항체 1 분자에 대해 4.6 당량)을 첨가하고 22℃에서 40분간 인큐베이션하여, 약물 링커를 항체에 접합시켰다. 다음으로, 100 mM NAC 수용액(0.00622 mL; 항체 1 분자에 대해 9.2 당량)을 첨가하고 추가로 22℃에서 20분간 인큐베이션하여, 약물 링커의 반응을 정지시켰다.
정제: 상기 용액을, 공통 절차 D-1(완충액으로서 PBS6.0을 사용)을 사용한 정제를 실시하여, 표제 항체-약물 접합체를 함유하는 용액을 6 mL 수득하였다.
물리화학적 특성 평가: 공통 절차 E를 사용하여 하기의 특성치를 수득하였다.
항체 농도: 1.12 mg/mL, 항체 수율: 6.72 mg (67%), 항체 분자 당 약물 분자의 평균 접합수 (n): 1.8.
실시예 40 항체-약물 접합체 (40)
[식 66]
Figure pat00112
공정 1: 항체-약물 접합체 (40)
항체의 환원: 참고예 1에서 제조한 트라스트주마브를, 공통 절차 C-1 및 공통 절차 B(280 nm 흡광 계수로서 1.37 mLmg-1cm-1을 사용)을 사용하여, PBS6.0/EDTA로 항체 농도 10 mg/mL를 가지도록 제조하였다. 용액(1.0 mL)를 2 mL 튜브에 수집하고, 10 mM TCEP 수용액(0.0311 mL; 항체 1 분자에 대해 4.6 당량) 및 1M 인산 수소 2칼륨 수용액(0.050 mL)를 가하였다. 용액의 pH가 7.4±0.1인 것을 확인한 후에, 37℃에서 1시간 인큐베이션함으로써, 항체 내 힌지 부분의 디술피드 결합을 환원시켰다.
항체와 약물 링커 사이의 접합: 상기 용액을 22℃에서 10분간 인큐베이션한 후에 실시예 39의 공정 3으로 수득한 화합물을 10 mM 포함하는 DMSO 용액(0.0622 mL; 항체 1 분자에 대해 9.2 당량)을 첨가하고 22℃에서 40분간 인큐베이션하여, 약물 링커를 항체에 접합시켰다. 다음으로, 100 mM NAC 수용액(0.0124 mL; 항체 1 분자에 대해 18.4 당량)을 첨가하고 추가로 22℃에서 20분간 인큐베이션하여, 약물 링커의 반응을 정지시켰다.
정제: 상기 용액을, 공통 절차 D-1(완충액으로서 PBS6.0을 사용)을 사용한 정제를 실시하여, 표제 항체-약물 접합체를 함유하는 용액을 6 mL 수득하였다.
물리화학적 특성 평가: 공통 절차 E를 사용하여 하기의 특성치를 수득하였다.
항체 농도: 0.98 mg/mL, 항체 수율: 5.88 mg (59%), 항체 분자 당 약물 분자의 평균 접합수 (n): 3.4.
실시예 41 항체-약물 접합체 (41)
[식 67]
Figure pat00113
공정 1: tert-부틸 {2-[(2-히드록시에틸)아미노]-2-옥소에틸}카르바메이트
N-(tert-부톡시카르보닐)글리신(4.2 g, 24 mmol)를 디메틸포름아미드(40 mL)에 용해하였다. 아미노에탄올(2.9 g, 48 mmol) 및 1-히드록시벤조트리아졸(3.7 g, 24 mmol)를 첨가하고 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드(6.9 g, 36 mmoL)를 첨가하고, 실온에서 12시간 교반하였다. 용매를 감압 하 제거하고, 잔류물에 톨루엔을 첨가해 공비 증류시켰다. 수득한 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 [에틸 아세테이트~에틸 아세테이트:메탄올 = 10:1 (v/v)]에 의해 정제하여, 무색 유상의 표제 화합물(3.8 g, 72%)를 수득하였다.
Figure pat00114
공정 2: 2-{[N-(tert-부톡시카르보닐)글리실]아미노}에틸4-니트로페닐카르보네이트
상기 공정 1로 수득한 화합물(1.0 g, 4.59 mmoL)의 THF(23 mL) 용액에, 디이소프로필에틸아민(0.80 mL, 4.59 mmol) 및 비스(4-니트로페닐)카르보네이트(1.32 g, 6.88 mmoL)를 첨가하고 실온에서 12시간 교반하였다. 용매를 감압 하 제거하고, 수득한 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 [헥산~헥산:에틸 아세테이트 = 1:3 (v/v)]에 의해 정제하여, 표제 화합물(1.13 g, 64%)를 담황색 고체로서 수득하였다.
Figure pat00115
공정 3: 2-({[(tert-부톡시카르보닐)아미노]아세틸}아미노)에틸[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]카르바메이트
엑사테칸의 메탄술폰산 염(0.70 g, 1.2 mmoL), 상기 공정 2로 수득한 화합물(0.57 g, 1.5 mmoL) 및 1-히드록시벤조트리아졸(3.7 g, 24 mmol)에 디메틸포름아미드(23 mL)를 첨가하고, 디이소프로필에틸아민(0.43 mL, 2.5 mmol)를 첨가하고 실온에서 12시간 교반하였다. 용매를 감압 하 제거하고, 잔류물에 톨루엔을 첨가해 공비 증류시켰다. 수득한 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 [클로로포름~클로로포름:메탄올 = 10:1 (v/v)]에 의해 정제하여, 표제 화합물(0.86 g, 정량적)을 담황색 고체로서 수득하였다.
Figure pat00116
공정 4: 2-(글리실아미노)에틸[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]카르바메이트
상기 공정 3으로 수득한 화합물(0.86 g, 2.1 mmoL)를 디클로로메탄(15 mL)에 용해하였다. 트리플루오로아세트산(15 mL)을 첨가한 후, 1시간 교반하였다. 용매를 감압 하 제거하고, 잔류물에 톨루엔을 첨가해 공비 증류시켰다. 수득한 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 [클로로포름~클로로포름:메탄올:물 = 7:3:1 (v/v/v)의 분배 유기층]에 의해 정제하여, 표제 화합물(0.86 g, 99%)를 담황색 고체로서 수득하였다.
Figure pat00117
MS (APCI)m/z: 939 (M+H)+
공정 5: N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]글리실글리실-L-페닐알라닐-N-[2-({[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]카르바모일}옥시)에틸]글리신아미드
N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]글리실글리실-L-페닐알라닌(일본 공개특허공보 2002-60351호; 0.21 g, 0.41 mmoL)를 N,N-디메틸포름아미드(3 mL)에 용해하였다. N-히드록시숙신이미드(0.052 g, 0.45 mmoL) 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드(0.086 g, 0.45 mmoL)를 첨가하고, 1시간 교반하였다. 반응 용액을 상기 공정 4로 수득한 화합물(0.24 g, 0.35 mmol) 및 트리에틸아민(0.078 mL, 0.45 mmoL)를 가한 N,N-디메틸포름아미드 용액(2 mL)에 적하하고, 실온에서 1시간 교반하였다. 용매를 감압 하 제거하고, 수득한 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 [클로로포름~클로로포름:메탄올 = 8:2 (v/v)]에 의해 정제하여, 표제 화합물(0.24 g, 65%)를 담황색 고체로서 수득하였다.
Figure pat00118
MS (APCI)m/z: 1063 (M+H)+
공정 6: 글리실글리실-L-페닐알라닐-N-[2-({[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]카르바모일}옥시)에틸]글리신아미드
상기 공정 5로 수득한 화합물 (0.24 g, 0.35 mmol)를, 실시예 26의 공정 7과 동일한 방식으로 반응시켜, 표제 화합물(0.12 g, 65%)를 담황색 고체로서 수득하였다.
Figure pat00119
MS (APCI)m/z: 841 (M+H)+
공정 7: N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]글리실글리실-L-페닐알라닐-N-[2-({[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]카르바모일}옥시)에틸]글리신아미드
상기 공정 6으로 수득한 화합물(42.0 mg, 0.0499 mmoL)를, 실시예 2의 공정 3과 동일한 방식으로 반응시켜, 표제 화합물(38.3 mg, 74%)를 담황색 고체로서 수득하였다.
Figure pat00120
MS (ESI) m/z: 1034 (M+H)+
공정 8: 항체-약물 접합체 (41)
참고예 1에서 제조한 트라스트주마브 및 상기 공정 7로 수득한 화합물을 사용하여, 실시예 6의 공정 2와 동일한 방식에 의해, 표제 항체-약물 접합체를 수득하였다.
항체 농도: 1.54 mg/mL, 항체 수율: 9.2 mg (74%), 항체 분자 당 약물 분자의 평균 접합수 (n): 3.7.
실시예 42 항체-약물 접합체 (42)
[식 68]
Figure pat00121
공정 1: 항체-약물 접합체 (42)
참고예 1에서 제조한 트라스트주마브 및 실시예 41의 공정 7로 수득한 화합물을 사용하여, 실시예 7의 공정 1과 동일한 방식에 의해, 표제 항체-약물 접합체를 수득하였다.
항체 농도: 1.47 mg/mL, 항체 수율: 8.8 mg (71%), 항체 분자 당 약물 분자의 평균 접합수 (n): 7.0.
실시예 43 항체-약물 접합체 (43)
[식 69]
Figure pat00122
공정 1: N-{3-[2-(2-{[3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)프로파노일]아미노}에톡시)에톡시]프로파노일}글리실글리실-L-페닐알라닐-N-[(2-{[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]아미노}-2-옥소에톡시)메틸]글리신아미드
실시예 26의 공정 6으로 수득한 화합물(53.7 mg, 50.5 μmoL)를 N,N-디메틸포름아미드(1.50 mL)에 용해하였다. 1,8-디아자비시클로(5.4.0)-7-운데센(7.5 μL, 50.5 μmoL)를 첨가한 후, 실온에서 30분 교반하였다. 반응 용액에 피리디늄 p-톨루엔술포네이트(14.0 mg, 5.56 μmoL)를 가한 후, N-숙신이미딜 3-(2-(2-(3-말레인이미도프로판아미도)에톡시)에톡시)프로파노에이트(32.3 mg, 75.8 μmoL)를 첨가하고 실온에서 2.25시간 교반하였다. 용매를 감압 하 제거하고, 수득한 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 [클로로포름~클로로포름:메탄올:물 = 7:3:1 (v/v/v)의 분배 유기층]에 의해 정제하여, 표제 화합물(27.1 mg, 47%)를 담황색 고체로서 수득하였다.
Figure pat00123
MS (ESI) m/z = 1151 (M+H)+
공정 2: 항체-약물 접합체 (43)
참고예 1에서 제조한 트라스트주마브 및 상기 공정 1로 수득한 화합물을 사용하여, 실시예 7 의 공정 1과 동일한 방식에 의해, 표제 항체-약물 접합체를 수득하였다.
항체 농도: 1.96 mg/mL, 항체 수율: 17.6 mg (88%), 항체 분자 당 약물 분자의 평균 접합수 (n): 5.6.
실시예 44 항체-약물 접합체 (44)
[식 70]
Figure pat00124
공정 1: tert-부틸 N-[(벤질옥시)카르보닐]글리실글리실-D-페닐알라니네이트
N-[(벤질옥시)카르보닐]글리실글리신(3.00 g, 11.3 mmoL)를 N,N-디메틸포름아미드(20.0 mL)에 용해하였다. N-히드록시숙신이미드(1.43 g, 12.4 mmoL) 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드(2.37 g, 12.4 mmoL)를 첨가하고, 1시간 교반하였다. 그 반응 용액에 D-페닐알라닌 tert-부틸(2.74 g, 12.38 mmoL) 및 트리에틸아민(1.73 mL, 12.4 mmoL)를 가한 N,N-디메틸포름아미드 용액(10 mL)을 적하하고, 실온에서 2시간 교반하였다. 반응 용액에 디클로로메탄을 첨가하고 물, 1N 염산 및 포화 탄산수소나트륨 수용액으로 세정 후, 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 감압 하 제거한 후, 수득한 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 [클로로포름~클로로포름:메탄올 = 9:1 (v/v)]에 의해 정제하여, 표제 화합물(4.21 g, 80%)를 무색 고체로서 수득하였다.
Figure pat00125
MS (APCI)m/z: 470 (M+H)+
공정 2: N-[(벤질옥시)카르보닐]글리실글리실-D-페닐알라닌
공정 1로 수득한 화합물(4.21 g, 8.97 mmoL)를 에틸 아세테이트(20 mL)에 용해하였다. 4 N 염화수소의 에틸 아세테이트 용액(20.0 mL)를 첨가한 후, 실온에서 하룻밤 방치하였다. 용매를 감압 하 제거한 후, 톨루엔을 첨가하고, 용매를 감압 하 제거하였다. 수득한 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 [클로로포름~클로로포름:메탄올:물 = 7:3:1 (v/v/v)의 분배 유기층]에 의해 정제하여, 표제 화합물(1.66 g, 45%)를 무색 고체로서 수득하였다.
Figure pat00126
공정 3: N-[(벤질옥시)카르보닐]글리실글리실-D-페닐알라닐-N-{[2-(벤질옥시)-2-옥소에톡시]메틸}글리신아미드
실시예 32의 공정 1로 수득한 화합물(1.25 g, 2.63 mmoL)의 디옥산(25.0 mL) 용액에, 피페리딘(5.00 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(5.00 mL)를 첨가하고 실온에서 30분간 교반하였다. 용매를 감압 하 제거하고, 수득한 잔류물을 N,N-디메틸포름아미드(20.0 mL)에 용해하였다. 상기 공정 2의 화합물(1.20 g, 2.90 mmoL), 및 16.4% 물 함유의 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 클로라이드(1.03 g, 3.16 mmoL)를 첨가한 후, 실온에서 2시간 교반하였다. 반응액에 클로로포름을 첨가해 물로 세정 후, 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 감압 하 제거한 후, 수득한 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 [클로로포름~클로로포름:메탄올 = 9:1 (v/v)]에 의해 정제하여, 표제 화합물(270 mg, 16%)을 무색 고체로서 수득하였다.
Figure pat00127
MS (APCI)m/z: 648 (M+H)+
공정 4: 글리실글리실-D-페닐알라닐-N-[(카르복시메톡시)메틸]글리신아미드
상기 공정 3으로 수득한 화합물(200 mg, 0.31 mmoL)를 N,N-디메틸포름아미드(5.0 mL)에 용해하였다. 5% 팔라듐 탄소 촉매(0.12 g)를 첨가한 후, 수소 분위기 하, 실온에서 9시간 교반하였다. 반응액을 셀라이트 여과하고, 잔류물을 물과 N,N-디메틸포름아미드의 혼합 용매로 세정하였다. 여과물과 세정물을 수합하고, 감압 하 제거하여 표제 화합물(0.15 g, 정량적)을 무색 고체로서 수득하였다.
Figure pat00128
MS (APCI)m/z: 424 (M+H)+
공정 5: N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]글리실글리실-D-페닐알라닐-N-[(카르복시메톡시)메틸]글리신아미드
상기 공정 4로 수득한 화합물(0.15 g, 0.35 mmoL)를 N,N-디메틸포름아미드(10 mL)에 용해하였다. N-숙신이미딜 6-말레이미드 헥사노에이트(0.11 g, 0.35 mmoL)를 첨가한 후, 실온에서 1시간 교반하였다. 반응액에 클로로포름을 첨가하고 물로 세정 후, 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 감압 하 제거한 후, 수득한 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 [클로로포름~클로로포름:메탄올:물 = 7:3:1 (v/v/v)의 분배 유기층]에 의해 정제하여, 표제 화합물(41 mg, 26%)을 무색 고체로서 수득하였다.
Figure pat00129
MS (APCI)m/z: 615(M-H)-
공정 6: N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]글리실글리실-D-페닐알라닐-N-[(2-{[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]아미노}-2-옥소에톡시)메틸]글리신아미드
엑사테칸의 메탄술폰산 염(22 mg, 0.388 mmoL)의 N,N-디메틸포름아미드(10 mL) 용액에, 트리에틸아민(5.42 μL, 0.388 mmoL), 상기 공정 5로 수득한 화합물(29 mg, 0.466 mmoL), 및 16.4% 물 함유의 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 클로라이드(19 mg, 0.686 mmoL)를 0℃에서 첨가하고 실온에서 1시간 교반하였다. 반응액 중 용매를 감압 하 제거한 후, 수득한 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 [클로로포름~클로로포름:메탄올:물 = 7:3:1 (v/v/v)의 분배 유기층]에 의해 정제하여, 표제 화합물(26 mg, 65%)을 담황색 고체로서 수득하였다.
Figure pat00130
MS (APCI)m/z: 1034 (M+H)+
공정 7: 항체-약물 접합체 (44)
참고예 1에서 제조한 트라스트주마브 및 상기 공정 6으로 수득한 화합물을 사용하여, 실시예 7 의 공정 1과 동일한 방식에 의해, 표제 항체-약물 접합체를 수득하였다.
항체 농도: 1.87 mg/mL, 항체 수율: 16.8 mg (84%), 항체 분자 당 약물 분자의 평균 접합수 (n): 6.1.
실시예 45 중간체 (45)
[식 71]
Figure pat00131
공정 1: tert-부틸 (2-{[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]아미노}-2-옥소에틸)카르바메이트
N-(tert-부톡시카르보닐)-글리신(0.395 g, 2.26 mmoL)의 디클로로메탄(3.00 mL) 용액에, N-히드록시숙신이미드(0.260 g, 2.26 mmoL) 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드(0.433 mg, 2.26 mmoL)를 첨가하고 실온에서 1시간 교반하였다. 이 용액을, 엑사테칸의 메탄술폰산 염(1.00 g, 1.88 mmoL), 트리에틸아민(0.315 mL, 2.26 mmoL), 및 N,N-디메틸포름아미드(3.00 mL)로 이루어지는 용액에 첨가하고 실온에서 16.5시간 교반하였다. 반응 용액을 클로로포름으로 희석하고, 10% 시트르산 용액으로 세정 후, 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 감압 하 제거하고, 수득한 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 [클로로포름~클로로포름:메탄올 = 9:1 (v/v)]에 의해 정제하여, 표제 화합물(1.16 g, 99%)를 황색 고체로서 수득하였다.
Figure pat00132
MS (APCI)m/z: 593 (M+H)+
공정 2: N-[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]글리신아미드
상기 공정 1로 수득한 화합물(0.513 g, 1.01 mmoL)를, 실시예 1의 공정 2와 동일한 방식으로 반응시켜, 표제 화합물(0.463 g, 93%)를 황색 고체로서 수득하였다.
Figure pat00133
실시예 46 항체-약물 접합체 (46)
[식 72]
Figure pat00134
공정 1: 항체-약물 접합체 (46)
항체의 환원: 참고예 1에서 제조한 트라스트주마브를, 공통 절차 C-1 및 B(280 nm 흡광 계수로서 1.48 mLmg-1cm-1을 사용)을 사용하여, 매질을 PBS6.0/EDTA 로 교체하여, 항체 농도 10 mg/mL를 가지도록 제조하였다. 용액(50 mL)을 125 mL 폴리카르보네이트 삼각 플라스크에 넣어 마그네틱 교반기를 이용한 교반 하, 실온에서 1M 인산 수소 2칼륨 수용액(0.750 mL)를 가한 후, 10 mM TCEP 수용액(1.857 mL; 항체 1 분자에 대해 5.4 당량)을 가하였다. 용액의 pH가 7.0±0.1인 것을 확인한 후에, 교반을 정지하고, 37℃에서 1시간 인큐베이션함으로써, 항체 내 힌지 부분의 디술피드 결합을 환원하였다.
항체와 약물 링커 사이의 접합: 상기 용액을 15℃로 냉각 후, 교반 하에 실시예 26의 공정 8의 화합물을 10 mM 포함하는 DMSO 용액(2.958 mL; 항체 1 분자에 대해 8.6 당량)을 천천히 적하하였다. 15℃에서, 반응 용액을 최초 30분간은 교반하고, 다음 1시간은 교반 없이 인큐베이션하여, 약물 링커를 항체에 접합시켰다. 다음으로, 교반 하에 100 mM NAC 수용액(0.444 mL; 항체 1 분자에 대해 12.9 당량)을 첨가하고 추가로 실온에서 20분간 교반하여, 미반응 약물 링커의 반응성을 정지시켰다.
정제: 교반 하, 상기 용액에 20% 아세트산 수용액(약 0.25 mL)과 ABS(50 mL)를 천천히 첨가하여 용액의 pH를 5.5±0.1로 조정하였다. 이 용액을 정밀 여과(Millipore Corp. Millex-HV 필터, 0.45 μm, PVDF 막)하여 백탁물을 제거하였다. 이 용액에 대해, 한외여과막 (Merck Japan, Pellicon XL Cassette, Biomax 50 KDa), 튜브 펌프(Cole-Parmer International, MasterFlex Pump model 77521-40, Pump Head model 7518-00) 및 튜브(Cole-Parmer International, MasterFlex Tube L/S16)로 구성된 한외여과 장치를 이용하여 한외여과 정제를 실시하였다. 구체적으로, 반응액에 정제 완충액으로서 ABS를 적하하면서(합계 800 mL), 한외여과 정제를 실시하여, 미접합 약물 링커 및 다른 저분자량 시약을 제거하고, 또한 완충액을 ABS로 교체하고, 추가로 용액을 농축하였다. 수득한 정제 용액에 대해, 정밀 여과(0.22 μm(Millipore Corp. Millex-GV 필터, PVDF 막) 및 0.10 μm(Millipore Corp. Millex-VV 필터, PVDF 막))를 실시하여, 표제 항체-약물 접합체를 함유하는 용액을 42.5 mL 수득하였다.
물리화학적 특성 평가: 공통 절차 E 및 F(εD,280 = 5178(실측치), εD,370 = 20217(실측치)을 사용)을 사용하여 하기의 특성치를 수득하였다.
항체 농도: 10.4 mg/mL, 항체 수율: 442 mg (88.5%), 공통 절차 E에서 측정된 항체 분자 당 약물 분자의 평균 접합수 (n): 6.0; 공통 절차 F에서 측정된 항체 분자 당 약물 분자의 평균 접합수 (n): 7.5.
실시예 47 항체-약물 접합체 (47)
[식 73]
Figure pat00135
공정 1: 항체-약물 접합체 (47)
항체의 환원: 참고예 1에서 제조한 트라스트주마브를, 공통 절차 C-1 및 B(280 nm 흡광 계수로서 1.48 mLmg-1cm-1을 사용)을 사용하여, 매질을 PBS6.0/EDTA 로 교체하여, 항체 농도 10 mg/mL를 가지도록 제조하였다. 용액(15 mL)을 폴리프로필렌제 튜브에 넣고 여기에 10 mM TCEP 수용액(0.567 mL; 항체 1 분자에 대해 5.5 당량) 및 1M 인산 수소 2칼륨 수용액(0.225 mL)를 가하였다. 용액의 pH가 7.0±0.1인 것을 확인한 후에, 37℃에서 2시간 인큐베이션함으로써, 항체 내 힌지 부분의 디술피드 결합을 환원시켰다.
항체와 약물 링커 사이의 접합: 상기 용액에, DMSO(0.146 mL)와 실시예 26의 공정 8의 화합물을 10 mM 포함하는 DMSO 용액(0.928 mL; 항체 1 분자에 대해 9.0 당량)을 실온에서 첨가한 후, 15℃에서 30분간 인큐베이션하여 약물 링커를 항체에 접합시켰다. 다음으로, 100 mM NAC 수용액(0.133 mL; 항체 1 분자에 대해 12.9 당량)을 첨가하고 추가로 실온에서 20분간 교반하여, 미반응 약물 링커의 반응성을 정지시켰다.
정제: 상기 용액을, 공통 절차 D(완충액으로서 ABS를 사용)를 사용한 정제를 실시하여, 목적의 화합물을 함유하는 용액을 49 mL 수득하였다.
물리화학적 특성 평가: 공통 절차 E(εD,280 = 5178, εD,370 = 20217을 사용)를 사용하여 하기의 특성치를 수득하였다.
항체 농도: 2.91 mg/mL, 항체 수율: 143 mg (95%), 항체 분자 당 약물 분자의 평균 접합수 (n): 6.2.
실시예 48 항체-약물 접합체 (48)
[식 74]
Figure pat00136
공정 1: 항체-약물 접합체 (48)
항체의 환원: 참고예 1에서 제조한 트라스트주마브를, 공통 절차 C-1 및 B(280 nm 흡광 계수로서 1.48 mLmg-1cm-1을 사용)을 사용하여, 매질을 PBS6.0/EDTA 로 교체하여, 항체 농도 10 mg/mL를 가지도록 제조하였다. 용액(280 mL)을 1000 mL 폴리카르보네이트 삼각 플라스크에 넣어 마그네틱 교반기를 이용한 교반 하, 실온에서 1M 인산 수소 2칼륨 수용액(4.200 mL)를 가한 후, 10 mM TCEP 수용액(10.594 mL; 항체 1 분자에 대해 5.5 당량)을 가하였다. 용액의 pH가 7.0±0.1인 것을 확인한 후에 교반을 정지하고, 37℃에서 2시간 인큐베이션함으로써, 항체 내 힌지 부분의 디술피드 결합을 환원하였다.
항체와 약물 링커 사이의 접합: 상기 용액을 15℃로 냉각 후, 교반 하에 실시예 26의 공정 8의 화합물을 10 mM 포함하는 DMSO 용액(17.335 mL; 항체 1 분자에 대해 9.0 당량)을 천천히 적하하였다. 반응액을 15℃에서, 30분간 교반하여 약물 링커를 항체에 접합시켰다. 다음으로, 교반 하에 100 mM NAC 수용액(2.485 mL; 항체 1 분자에 대해 12.9 당량)을 첨가하고 추가로 실온에서 20분간 교반하여, 미반응 약물 링커의 반응성을 정지시켰다.
정제: 교반 하, 상기 용액에 20% 아세트산 수용액(약 1.4 mL)과 ABS(280 mL)를 천천히 첨가하여 용액의 pH를 5.5±0.1로 조정하였다. 이 용액을 정밀 여과(0.45 μm, PVDF 막)하여 백탁물을 제거하면서, 여과물을 약 600 mL 수득하였다. 이 용액에 대해, 한외여과막(Merck Japan, Pellicon XL Cassette, Biomax 50 KDa), 튜브 펌프(Cole-Parmer International, MasterFlex Pump model 77521-40, Pump Head model 7518-00) 및 튜브(Cole-Parmer International, MasterFlex Tube L/S16)로 구성된 한외여과 장치를 이용하여 한외여과 정제를 실시하였다. 구체적으로, 반응액에 정제 완충액으로서 ABS(합계 4800 mL)를 적하하면서, 한외여과 정제를 실시하여, 미접합의 약물 링커 및 다른 저분자량 시약을 제거하고, 또한 완충액을 ABS로 교체하고, 용액을 추가로 농축하였다. 수득한 정제 용액에 대해, 정밀 여과(0.22 μm 및 0.10 μm의 2회, PVDF 막)를 실시하여, 표제 항체-약물 접합체를 함유하는 용액을 70 mL 수득하였다.
물리화학적 특성 평가: 공통 절차 E(εD,280 = 5178, εD,370 = 20217을 사용)를 사용하여 하기의 특성치를 수득하였다.
항체 농도: 35.96 mg/mL, 항체 수율: 2517 mg (90%), 항체 분자 당 약물 분자의 평균 접합수 (n): 6.2.
실시예 49 항체-약물 접합체 (49)
[식 75]
Figure pat00137
공정 1: 항체-약물 접합체 (49)
항체의 환원: 참고예 1에서 제조한 트라스트주마브를, 공통 절차 C-1 및 B(280 nm 흡광 계수로서 1.48 mLmg-1cm-1을 사용)을 사용하여, 매질을 PBS6.0/EDTA 로 교체하여, 항체 농도 10 mg/mL를 가지도록 제조하였다. 용액(280 mL)을 1000 mL 폴리카르보네이트 삼각 플라스크에 넣어 마그네틱 교반기를 이용한 교반 하, 실온에서 1M 인산 수소 2칼륨 수용액(4.200 mL)를 가한 후, 10 mM TCEP 수용액(10.594 mL; 항체 1 분자에 대해 5.5 당량)을 가하였다. 용액의 pH가 7.0±0.1인 것을 확인한 후에 교반을 정지하고, 37℃에서 2시간 인큐베이션함으로써 항체 내 힌지 부분의 디술피드 결합을 환원하였다.
항체와 약물 링커 사이의 접합: 상기 용액을 15℃로 냉각 후, 교반 하에 실시예 26의 공정 8의 화합물을 10 mM 포함하는 DMSO 용액(17.335 mL; 항체 1 분자에 대해 9.0 당량)을 천천히 적하하였다. 반응액을 15℃에서, 30분간 교반하여 약물 링커를 항체에 접합시켰다. 다음으로, 교반 하에 100 mM NAC 수용액(2.485 mL; 항체 1 분자에 대해 12.9 당량)을 첨가하고 추가로 실온에서 20분간 교반하여, 미반응 약물 링커의 반응성을 정지시켰다.
정제: 교반 하, 상기 용액에 20% 아세트산 수용액(약 1.4 mL)과 ABS(280 mL)를 천천히 첨가하여 용액의 pH를 5.5±0.1로 조정하였다. 이 용액을 정밀 여과(0.45 μm, PVDF 막)하여 백탁물을 제거하면서, 여과물을 약 600 mL 수득하였다. 이 용액에 대해, 한외여과막(Merck Japan, Pellicon XL Cassette, Ultracell 30 KDa), 튜브 펌프(Cole-Parmer International, MasterFlex Pump model 77521-40, Pump Head model 7518-00) 및 튜브(Cole-Parmer International, MasterFlex Tube L/S16)로 구성된 한외여과 장치를 이용하여 한외여과 정제를 실시하였다. 구체적으로, 반응액에 정제 완충액으로서 ABS(합계 4800 mL)를 적하하면서 한외여과 정제를 실시하여, 미접합의 약물 링커 및 다른 저분자량 시약을 제거하고, 또한 완충액을 ABS로 교체하고, 용액을 추가로 농축하였다. 수득한 정제 용액에 대해, 정밀 여과(0.22 μm 및 0.10 μm의 2회, PVDF 막)을 실시하여, 표제 항체-약물 접합체를 함유하는 용액을 130 mL 수득하였다.
물리화학적 특성 평가: 공통 절차 E(εD,280 = 5178, εD,370= 20217을 사용)를 사용하여 하기의 특성치를 수득하였다.
항체 농도: 21.00 mg/mL, 항체 수율: 2730 mg (97.5%), 항체 분자 당 약물 분자의 평균 접합수 (n): 6.3.
실시예 50 항체-약물 접합체 (50)
공정 1: 항체-약물 접합체 (50)
실시예 47, 48 및 49에서 제조한 항체-약물 접합체 (47), (48) 및 (49)를 혼합하고(243 mL), 추가로 ABS(39.75 mL)를 가하여, 표제 항체-약물 접합체를 함유하는 용액을 283 mL 수득하였다.
물리화학적 특성 평가: 공통 절차 E 및 F(εD,280 = 5178, εD,370 = 20217을 사용)를 사용하여 하기의 특성치를 수득하였다.
항체 농도: 20.0 mg/mL, 항체 수율: 5655 mg, 공통 절차 E에서 측정된 항체 분자 당 약물 분자의 평균 접합수 (n): 6.3; 공통 절차 F에서 측정된 항체 분자 당 약물 분자의 평균 접합수 (n): 7.8.
평가예 1 항체-약물 접합체의 세포 증식 억제 효과 (1)
HER2 항원 양성 세포의 인간 유방암주 KPL-4(Dr. Junichi Kurebayashi, Kawasaki Medical School, British Journal of Cancer, (1999) 79 (5/6). 707-717), 또는 항원 음성 세포의 인간 유방암주 MCF7(European Collection of Cell Cultures; ECACC)를 10%의 소 태아 혈청(MOREGATE)을 포함하는 RPMI1640(GIBCO) (이하, 배지로 지칭함)중에서 배양하였다. KPL-4 또는 MCF7을, 배지를 사용하여 2.5x104 개 세포/mL의 농도가 되도록 각각 제조하고, 세포 배양용 96-웰 마이크로플레이트에 100 μL/웰의 농도로 첨가하고 하룻밤 배양하였다.
다음날, 배지를 사용하여 1000 nM, 200 nM, 40 nM, 8 nM, 1.6 nM, 0.32 nM 및 0.064 nM로 희석한 트라스트주마브 또는 항체-약물 접합체를 마이크로플레이트에 10 μL/웰 농도로 첨가하였다. 항체 비첨가 웰에는 배지를 10μL/웰 농도로 첨가하였다. 세포를 37℃, 5% CO2 하에서 5 내지 7일간 배양하였다. 배양 후, 마이크로플레이트를 인큐베이터에서 꺼내고 실온에서 30분간 정치하였다. 배양액과 등량의 CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega)를 첨가하고 교반하였다. 실온에서 10분간 정치 후 플레이트 판독기(PerkinElmer)로 각 웰의 발광 강도를 계측하였다. IC50 값은 다음의 식으로 계산하였다:
IC50 (nM) = antilog((50-d) x (LOG10(b)-LOG10(a))/ (d-c)+LOG10(b))
a: 샘플 a의 농도
b: 샘플 b의 농도
c: 샘플 a의 세포 생존률 (cell viability)
d: 샘플 b의 세포 생존률
각 농도에 있어서의 세포 생존률은 다음의 식으로 계산하였다:
세포 생존률(%) = a/b x 100
a: 샘플 웰의 평균 발광 강도 (n = 2)
b: 항체 비첨가 웰의 평균 발광 강도 (n = 10)
항체-약물 접합체 (2), (3), (5), (7), (10), (12), (13), (16), (18), (40) 및 (42)는, KPL-4 세포에 대해 IC50<0.1 (nM)의 세포 증식 억제 효과를 나타내었다.
항체-약물 접합체 (4), (6), (9), (15), (17), (21), (22), (25), (36), (37), (39), (41) 및 (43)은, 세포에 대해 0.1<IC50<1 (nM)의 세포 증식 억제 효과를 나타내었다.
항체-약물 접합체 (20), (24) 및 (27)은, 세포에 대해 1<IC50<100 (nM)의 세포 증식 억제 효과를 나타내었다. 항체-약물 접합체 (19) 또는 (26)은 세포에 대해 세포 증식 억제 효과를 나타내지 않았다 (>100 (nM)).
한편, MCF7 세포에 대해서는 (5), (13) 및 (43)이 1<IC50<100 (nM)의 세포 증식 억제 효과를 나타낸 한편, 항체-약물 접합체 (2), (3), (4), (6), (7), (9), (10), (12), (15), (16), (17), (18), (25), (26), (27), (39), (40), (41), (42) 및 (44)는 어느 것도 세포애 대해 세포 증식 억제 효과를 나타내지 않았다 (>100 (nM)).
트라스트주마브는 KPL-4 세포에 대해서도, MCF7 세포에 대해서도 세포 증식 억제 효과를 나타내지 않았다 (>100 (nM)).
평가예 2 항종양 시험 (1)
마우스: 5-6주령의 암컷 누드 마우스(Charles River Laboratories Japan, Inc.) 를 실험 사용 전에 SPF 조건 하에서 4 내지 7일간 순화하였다. 마우스에는 멸균한 고형 사료(FR-2, Funabashi Farms Co., Ltd)를 급식하고, 멸균한 수돗물(5-15 ppm 하이포아염소산 나트륨 용액을 첨가하여 제조)을 공급하였다.
검정 및 계산식: 모든 연구에 있어서, 종양의 장경(major axis) 및 단경(minor axis)을 전자식 디지털 캘리퍼(CD-15CX, Mitutoyo Corp.)로 주 2회 측정하고, 종양 부피(mm3)를 계산하였다. 계산식은 하기에 나타내는 바와 같다.
종양 부피(mm3) = 1/2 x 장경(mm) x [단경(mm)]2
항체-약물 접합체 및 항체는 모두 생리 식염수(Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.)로 희석하고, 10 mL/kg의 부피로 각 마우스 꼬리 정맥에 정맥내 투여하였다.
KPL-4 세포를 생리 식염수에 현탁하고, 1.5x107 개 세포를 암컷 누드 마우스의 오른쪽 몸의 측면부에 피하 이식하고(제0일), 제15일에 무작위로 군을 나누었다. 항체-약물 접합체 (27) 또는 대조군용으로 항HER2 항체 트라스트주마브(참고예 1) 를 제15일 및 제22일에 10 mg/kg의 용량으로 각 마우스 꼬리 정맥에 정맥내 투여하였다. 대조군으로서 무처치군을 설정하였다.
결과를 도 3에 나타낸다. 트라스트주마브의 투여가 종양 증식을 억제한 한편, 항체-약물 접합체 (27)의 투여는 보다 현저한 종양 증식 억제 효과를 나타내었다. 도면에서, 가로축은 종양 접종 후의 일수를 나타내고, 세로축은 종양 부피를 나타낸다. 또한, 트라스트주마브 또는 항체-약물 접합체 (27)가 투여된 마우스에서는 체중 감소와 같은 특별히 눈에 띄는 소견이 없으며, 이는 항체-약물 접합체 (27)가 높은 안전성을 갖는다는 것을 제시한다. 하기 항종양 시험에 관한 평가예에 있어서, 달리 명시되지 않는 한, 본 평가예에서 사용한 절차에 의해 시험을 실시하였다.
평가예 3 항종양 시험 (2)
ATCC(American Type Culture Collection)로부터 구입한 인간 위암주 NCI-N87 세포를 생리 식염수에 현탁하고, 1x107 개 세포를 암컷 누드 마우스의 오른쪽 몸의 측면부에 피하 이식하고(제0일), 제7일에 무작위로 군을 나누었다. 항체-약물 접합체 (8) 또는 (28), 또는 트라스트주마브 엠탄신(참고예 2)을 제7일에 10 mg/kg의 용량으로 각 마우스 꼬리 정맥에 정맥내 투여하였다. 대조군으로서 무처치군을 설정하였다.
결과를 도 4에 나타낸다. 항체-약물 접합체 (8) 및 (28)은, 트라스트주마브 엠탄신과 동등한 종양의 퇴축을 수반하는 강한 항종양 효과를 갖는 것으로 확인되었다. 또한, 항체-약물 접합체 (8) 또는 (28), 또는 트라스트주마브 엠탄신 투여에 의해서는 마우스의 체중 손실이 없는 것으로 발견되었다.
평가예 4 항종양 시험 (3)
DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)로부터 구입한 인간 유방암주 JIMT-1 세포를 생리 식염수에 현탁하고, 3x106 개 세포를 암컷 누드 마우스의 오른쪽 몸의 측면부에 피하 이식하고(제0일), 제12일에 무작위로 군을 나누었다. 항체-약물 접합체 (8), (29) 또는 (30), 또는 트라스트주마브, 또는 트라스트주마브 엠탄신을 제12일 및 제19일에 10 mg/kg의 용량으로 각 마우스 꼬리 정맥에 정맥내 투여하였다. 대조군으로서 생리 식염수 투여군을 설정하였다.
결과를 도 5에 나타낸다. 트라스트주마브 또는 트라스트주마브 엠탄신의 투여는 JIMT-1 종양의 증식을 억제하지 않았다. 한편, 항체-약물 접합체 (8), (29) 또는 (30)의 투여에 의해서는 종양 증식이 억제되었다. 또한, 항체-약물 접합체 (8), (29) 또는 (30), 트라스트주마브, 또는 트라스트주마브 엠탄신 투여에 의해서는 마우스의 체중 손실이 없는 것으로 발견되었다.
평가예 5 항체-약물 접합체의 세포 증식 억제 효과 (2)
인간 비소세포 폐암주 Calu-3(ATCC)을, 10%의 소 태아 혈청(MOREGATE)을 포함하는 이글 최소 필수 배지(Eagle's Minimum Essential Medium) (GIBCO) (이하, MEM 배지로 지칭함)중에서 배양하였다.
인간 위암주 NCI-N87(ATCC) 또는 인간 위암주 MKN-45(Health Science Research Resources Bank)를, 10%의 소 태아 혈청을 포함하는 RPMI1640 배지(GIBCO) (이하, RPMI 배지로 지칭함)중에서 배양하였다.
인간 유방암주 MDA-MB-453(ATCC) 또는 인간 유방암주 MDA-MB-468(ATCC)을, 10%의 소 태아 혈청을 포함하는 레보비츠 (Leibovitz) L-15 배지 (GIBCO) (이하, 레보비츠 배지로 지칭함)중에서 배양하였다.
이들 5 종류의 세포주 중에서, Calu-3, NCI-N87 및 MDA-MB-453은 HER2 양성 세포이고, MKN-45 및 MDA-MB-468은 HER2 음성 세포이다.
Calu-3, NCI-N87 또는 MKN-45를, MEM 배지 또는 RPMI 배지를 사용하여 4x104 개 세포/mL의 농도가 되도록 제조하여, 65 μL/웰의 배지를 넣은 세포 배양용 96-웰 마이크로플레이트에 25 μL/웰 농도로 첨가하고, 37℃, 5% CO2 하에서 하룻밤 배양하였다. 또한 MDA-MB-453 또는 MDA-MB-468을, 레보비츠 배지를 사용하여 4x104 개 세포/mL의 농도가 되도록 제조하여, 65 μL/웰의 배지를 넣은 세포 배양용 96-웰 마이크로플레이트에 25 μL/웰 농도로 첨가하고, 37℃에서, CO2 농도 설정 없이 하룻밤 배양하였다.
다음날, RPMI 배지 또는 레보비츠 배지를 사용하여 검체를 1000 nM, 200 nM, 40 nM, 8 nM, 1.6 nM, 0.32 nM, 및 0.064 nM로 희석하거나, RPMI 배지 또는 레보비츠 배지를 상기 마이크로플레이트에 10 μL/웰 농도로 첨가하였다. 세포를 37℃, 5% CO2 하, 또는 37℃에서 CO2 농도 설정 없이 6일간 배양하였다.
Calu-3, NCI-N87 및 MDA-MB-468에는 항체-약물 접합체 (46)을 검체로서 첨가하였다. 그 밖의 세포에는 항체-약물 접합체 (50)을 검체로서 첨가하였다. 배양 후, 마이크로플레이트를 인큐베이터에서 꺼내고 실온에서 30분간 정치하였다. 배양액에 동량의 CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega)를 첨가하고, 플레이트 믹서로 교반하여 세포를 완전하게 용해하였다. 실온에서 10분간 정치 후에 플레이트 판독기로 발광 강도를 계측하였다.
세포 생존률은 다음의 식으로 계산하였다:
세포 생존률(%) = a/b x 100
a: 검체 첨가 웰의 평균 발광 강도
b: 배지 첨가 웰의 평균 발광 강도
IC50 값은 다음의 식으로 계산하였다:
IC50 (nM) = antilog((50-d) x (LOG10(b)-LOG10(a))/ (d-c)+LOG10(b))
a: 검체 농도 a
b: 검체 농도 b
c: 농도 a의 검체 첨가시 세포 생존률
d: 농도 b의 검체 첨가시 세포 생존률
농도 a 및 b는 세포 생존률 50%를 교차하는 a>b의 관계를 성립시킨다.
항체-약물 접합체 (46)은, HER2 양성 세포 Calu-3 및 NCI-N87에 대해 IC50<1 (nM)의 세포 증식 억제 효과를 나타내었다. 한편, 항체-약물 접합체 (46)은 HER2 음성 세포 MDA-MB-468에 대해서는 세포 증식 억제 효과를 나타내지 않았다 (>100 (nM)).
항체-약물 접합체 (50)은, HER2 양성 세포 MDA-MB-453에 대해 IC50<1 (nM)의 세포 증식 억제 효과를 나타내었다. 한편, 항체-약물 접합체 (50)은 HER2 음성 세포 MKN-45에 대해서는 세포 증식 억제 효과를 나타내지 않았다 (>100 (nM)).
평가예 6 항종양 시험 (4)
HER2 저발현인 인간 췌장암주 Capan-1 세포(ATCC)를 생리 식염수에 현탁하고, 4x107 개 세포를 암컷 누드 마우스의 오른쪽 몸의 측면부에 피하 이식하여 Capan-1 고형 종양을 생성시켰다. 그 후, 이 고형 종양을 암컷 누드 마우스 이식에 의해 수회 계대 유지시키고, 본 시험에 사용하였다. 고형 종양의 종양편을 각 암컷 누드 마우스의 오른쪽 몸의 측면부에 피하 이식하고(제0일), 제20일에 무작위로 군을 나누었다.
항체-약물 접합체 (31), 트라스트주마브, 또는 트라스트주마브 엠탄신을 제20일에 10 mg/kg의 용량으로 각 마우스 꼬리 정맥에 정맥내 투여하였다. 대조군으로서 생리 식염수 투여군을 설정하였다.
결과를 도 6에 나타낸다. 트라스트주마브 또는 트라스트주마브 엠탄신의 투여는 Capan-1 종양의 증식을 억제하지 않았다. 이와 반대로, 항체-약물 접합체 (31)의 투여에 의해 종양 증식이 억제되었으며, 이는 HER2 저발현 종양에 대한 항체-약물 접합체 (31)의 유효성을 입증하는 것이다. 항체-약물 접합체 (31)은 HER2 비발현 위암주 GCIY 종양의 증식을 억제하지 않았다.
종양에서의 HER2의 발현에 관련하여, HER2 시험 가이드라인 제3판(일본 병리학회, 트라스트주마브 병리부회 작성)에 기재된 면역 조직화학 염색의 측정 결과를 기반으로 하여, 스코어가 3+인 것을 고발현으로 하고, 2+를 중간 발현으로 하고, 1+을 저발현으로 하여 분류하였다. 상기 측정법에서 스코어가 0이더라도, 유세포분석기를 사용하는 측정법과 같은 다른 측정법에 의해 HER2 양성인 것으로 발견된 종양은 저발현 종양으로 분류하였다.
평가예 7 항종양 시험 (5)
ATCC로부터 구입한 인간 위암주 NCI-N87 세포를 생리 식염수에 현탁하고, 1x107 개 세포를 암컷 누드 마우스의 오른쪽 몸의 측면부에 피하 이식하고(제0일), 제6일에 무작위로 군을 나누었다. 항체-약물 접합체 (50)를 제6일에 0.3, 1, 3, 또는 10 mg/kg의 용량으로 각 마우스 꼬리 정맥에 정맥내 투여하였다. 대조군으로서 아세테이트 완충액 투여군을 설정하였다.
결과를 도 7에 나타낸다. 항체-약물 접합체 (50)은, 투여량-의존적 항종양 효과를 나타내었다. 또한, 항체-약물 접합체 (50) 투여에 의해서는 마우스의 체중 손실이 없는 것으로 발견되었다.
평가예 8 항종양 시험 (6)
본 시험을 이하의 방법으로 실시하였다.
마우스: 6-12주령의 암컷 누드 마우스(Charles River Laboratories Japan, Inc.)를 실험에 제공하였다.
검정 및 계산식: 종양의 장경 및 단경을 전자식 디지털 캘리퍼로 주 2회 측정하고, 종양 부피(mm3)를 계산하였다. 계산식은 하기에 나타내는 바와 같다.
종양 부피(mm3) = 0.52 x 장경(mm) x [단경(mm)]2
항체-약물 접합체, 트라스트주마브, 및 트라스트주마브 엠탄신을 아세테이트 완충액으로 희석하고, 10 mL/kg의 부피로 각 마우스 꼬리 정맥에 정맥내 투여하였다.
유방암 환자에게서 절제한 종양을 암컷 누드 마우스에 이식함으로써 수회 계대 유지시킨 종양(ST225; South Texas Accelerated Research Therapeutics(START))를 본 시험에 사용하였다. 이 종양은 HER2를 중간 발현하였다(면역 조직화학 염색에서는 스코어가 2+임).
고형 종양의 종양편을 암컷 누드 마우스의 몸의 측면부에 피하 이식하고, 종양 부피가 100 내지 300 mm3에 도달했을 때 마우스를 무작위로 군을 나누었다. 군을 나눈 날짜를 제0일로 정의하였다. 제0일에 항체-약물 접합체 (50), 트라스트주마브, 또는 트라스트주마브 엠탄신을 10 mg/kg의 용량으로 각 마우스 꼬리 정맥에 정맥내 투여하였다. 대조군으로서 아세테이트 완충액 투여군을 설정하였다.
결과를 도 8에 나타낸다. 트라스트주마브의 투여는, HER2 를 중간 발현하는 유방암 ST225 종양의 증식을 억제하지 않았다. 이와 반대로, 트라스트주마브 엠탄신 또는 항체-약물 접합체 (50)의 투여에 의해서 종양의 증식은 현저하게 억제되었다.
평가예 9 항종양 시험 (7)
유방암 환자에게서 절제한 종양을 암컷 누드 마우스에 이식함으로써 수회 계대 유지시킨 종양(ST910; START)을 본 시험에 사용하였다. 이 종양은 HER2 를 저발현하였다(면역 조직화학 염색에서는 스코어가 1+임).
고형 종양의 종양편을 암컷 누드 마우스의 몸의 측면부에 피하 이식하고, 종양 부피가 100 내지 300 mm3에 도달하였을때 마우스를 무작위로 군을 나누었다. 군을 나눈 날짜를 제0일로 정의하였다. 제0일에 항체-약물 접합체 (50), 트라스트주마브, 또는 트라스트주마브 엠탄신을 10 mg/kg의 용량으로 각 마우스 꼬리 정맥에 정맥내 투여하였다. 대조군으로서 아세테이트 완충액 투여군을 설정하였다.
결과를 도 9에 나타낸다. 트라스트주마브 및 트라스트주마브 엠탄신의 투여는 HER2 를 저발현하는 유방암 ST910 종양의 증식을 억제하지 않았다. 이와 반대로, 항체-약물 접합체 (50)의 투여에 의해서는 종양의 증식이 현저하게 억제되었으며, 이는 HER2 저발현 유방암 종양에 대한 항체-약물 접합체 (50)의 유효성을 입증하는 것이다. 이 평가예 9를 평가예 8과 동일한 절차로 실시하였다.
평가예 10 항종양 시험 (8)
본 시험을 하기의 절차로 실시하였다. 평가예 11 내지 13 또한 이 절차에 의해 실시하였다.
마우스: 5-8주령의 암컷 누드 마우스(Harlan Laboratories사)를 실험에 제공하였다.
검정 및 계산식: 종양의 장경 및 단경을 전자식 디지털 캘리퍼로 주 2회 측정하고, 종양 부피(mm3)를 계산하였다. 계산식은 하기에 나타내는 바와 같다.
종양 부피(mm3) = 0.52 x 장경(mm) x [단경(mm)]2
항체-약물 접합체, 트라스트주마브, 및 트라스트주마브 엠탄신을 아세테이트 완충액으로 희석하고, 10 mL/kg의 부피로 각 마우스 꼬리 정맥에 정맥내 투여하였다.
결장 직장암 환자에게서 절제한 종양을 암컷 누드 마우스에 이식함으로써 수회 계대 유지시킨 종양(CTG-0401; Champions Oncology Inc.)을 본 시험에 사용하였다. 이 종양은 HER2를 저발현 또는 중간 발현하였다(면역 조직화학 염색에서는 스코어가 1+ 또는 2+임).
고형 종양의 종양편을 암컷 누드 마우스의 왼쪽 몸의 측면부에 피하 이식하고, 종양 부피가 100 내지 300 mm3에 도달하였을때 마우스를 무작위로 군을 나누었다. 군을 나눈 날짜를 제0일로 정의하였다. 제0일에 항체-약물 접합체 (50), 트라스트주마브, 또는 트라스트주마브 엠탄신을 10 mg/kg의 용량으로 각 마우스 꼬리 정맥에 정맥내 투여하였다. 대조군으로서 아세테이트 완충액 투여군을 설정하였다.
결과를 도 10에 나타낸다. 트라스트주마브 또는 트라스트주마브 엠탄신의 투여는 HER2 를 저발현 내지 중간 발현하는 결장 직장암 CTG-0401 종양의 증식을 억제하지 않았다. 이와 반대로, 항체-약물 접합체 (50)의 투여에 의해서는 종양의 증식이 현저하게 억제되었다.
평가예 11 항종양 시험 (9)
비소세포 폐암 환자에게서 절제한 종양을 암컷 누드 마우스 이식에 의해 수회 계대 유지시킨 종양(CTG-0860; Champions Oncology Inc.)을 본 시험에 사용하였다. 이 종양은 HER2를 중간 발현하였다(면역 조직화학 염색에서는 스코어가 2+임).
고형 종양의 종양편을 암컷 누드 마우스의 왼쪽 몸의 측면부에 피하 이식하고, 종양 부피가 100 내지 300 mm3에 도달하였을때 마우스를 무작위로 군을 나누었다. 군을 나눈 날짜를 제0일로 정의하였다. 제0일에 항체-약물 접합체 (50), 트라스트주마브, 또는 트라스트주마브 엠탄신을 10 mg/kg의 용량으로 각 마우스 꼬리 정맥에 정맥내 투여하였다. 대조군으로서 아세테이트 완충액 투여군을 설정하였다.
결과를 도 11에 나타낸다. 트라스트주마브 또는 트라스트주마브 엠탄신의 투여는 HER2 를 중간 발현하는 비소세포 폐암 CTG-0860 종양의 증식을 억제하지 않았다. 이와 반대로, 항체-약물 접합체 (50)의 투여에 의해서는 종양의 증식이 현저하게 억제되었다.
평가예 12 항종양 시험 (10)
담관암 환자에게서 절제한 종양을 암컷 누드 마우스에 이식함으로써 수회 계대 유지시킨 종양(CTG-0927; Champions Oncology Inc.)을 본 시험에 사용하였다. 이 종양은 HER2 를 고발현하였다(면역 조직화학 염색에서는 스코어가 3+ 임).
고형 종양의 종양편을 암컷 누드 마우스의 왼쪽 몸의 측면부에 피하 이식하고, 종양 부피가 100 내지 300 mm3에 도달하였을때 마우스를 무작위로 군을 나누었다. 군을 나눈 날짜를 제0일로 정의하였다. 제0일에 항체-약물 접합체 (50), 트라스트주마브, 또는 트라스트주마브 엠탄신을 10 mg/kg의 용량으로 각 마우스 꼬리 정맥에 정맥내 투여하였다. 대조군으로서 아세테이트 완충액 투여군을 설정하였다.
결과를 도 12에 나타낸다. 트라스트주마브의 투여는 HER2 를 고발현하는 담관암 CTG-0927 종양의 증식을 억제하지 않았다. 이와 반대로, 트라스트주마브 엠탄신의 투여에 의해서는 종양의 증식이 억제되었다. 추가로 항체-약물 접합체 (50)의 투여는 종양의 퇴축을 유도하였다.
평가예 13 항종양 시험 (11)
식도암 환자에게서 절제한 종양을 암컷 누드 마우스에 이식함으로써 수회 계대 유지시킨 종양(CTG-0137; Champions Oncology Inc.)을 본 시험에 사용하였다. 이 종양은 HER2 를 고발현하였다(면역 조직화학 염색에서는 스코어가 3+ 임).
고형 종양의 종양편을 암컷 누드 마우스의 왼쪽 몸의 측면부에 피하 이식하고, 종양 부피가 100 내지 300 mm3에 도달하였을때 마우스를 무작위로 군을 나누었다. 군을 나눈 날짜를 제0일로 정의하였다. 제0일에 항체-약물 접합체 (50), 트라스트주마브, 또는 트라스트주마브 엠탄신을 10 mg/kg의 용량으로 각 마우스 꼬리 정맥에 정맥내 투여하였다. 대조군으로서 아세테이트 완충액 투여군을 설정하였다.
결과를 도 13에 나타낸다. 트라스트주마브의 투여는 HER2 를 고발현하는 식도암 CTG-0137 종양의 증식을 억제하지 않았다. 이와 반대로, 트라스트주마브 엠탄신 또는 항체-약물 접합체 (50)의 투여에 의해서는 종양의 증식이 현저하게 억제되었다.
평가예 14 항종양 시험 (12)
ATCC로부터 구입한, HER2 고발현인 인간 난소암주 SK-OV-3 세포를 생리 식염수에 현탁하고, 4x107 개 세포를 암컷 누드 마우스의 오른쪽 몸의 측면부에 피하 이식하여, SK-OV-3 고형 종양을 생성시켰다. 그 후, 이 고형 종양을 암컷 누드 마우스에 이식함으로써 수회 계대 유지시키고, 본 시험에 사용하였다
고형 종양의 종양편을 암컷 누드 마우스의 오른쪽 몸의 측면부에 피하 이식하고, 종양 부피가 100 내지 300 mm3에 도달하였을때 마우스를 무작위로 군을 나누었다. 군을 나눈 날짜를 제0일로 정의하였다. 제0일에 항체-약물 접합체 (50), 트라스트주마브, 또는 트라스트주마브 엠탄신을 10 mg/kg의 용량으로 각 마우스 꼬리 정맥에 정맥내 투여하였다. 대조군으로서 생리 식염수 투여군을 설정하였다.
결과를 도 14에 나타낸다. 트라스트주마브의 투여는 SK-OV-3 종양의 증식을 억제하지 않았다. 이와 반대로, 트라스트주마브 엠탄신 또는 항체-약물 접합체 (50)의 투여에 의해서는 종양의 증식이 현저하게 억제되었다.
SEQ ID NO: 1: 인간화 항-HER2 단일클론 항체 중쇄의 아미노산 서열
SEQ ID NO: 2: 인간화 항-HER2 단일클론 항체 경쇄의 아미노산 서열
<110> Daiichi Sankyo Company, Limited <120> ANTI-HER2 ANTIBODY-DRUG CONJUGATE <130> PD20-9008WO <150> JP2014-017777 <151> 2014-01-31 <150> JP2014-168944 <151> 2014-08-22 <150> JP2014-227886 <151> 2014-11-10 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of the heavy chain of Trastuzumab <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 2 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of the light chain of Trastuzumab <400> 2 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210

Claims (5)

  1. 하기 식으로 나타내는 약물-링커 구조가 티오에테르 결합에 의해 항-HER2 항체와 결합하는, 항체-약물 접합체를 생산하는 방법으로서,
    -(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
    항체를 환원 조건에서 처리한 후에 하기 식으로 나타내는 화합물과 항체를 반응시키는 단계를 포함하는 방법:
    (말레이미드-N-일)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
    (식 중,
    (말레이미드-N-일)- 은 하기 식:
    Figure pat00138

    으로 나타내는 기이며, 여기서 질소 원자는 결합 위치이고,
    -(숙신이미드-3-일-N)- 은 하기 식:
    Figure pat00139

    으로 나타내는 구조이며, 그의 위치 3 에서 항체와 결합하고, 위치 1 의 질소 원자 상에서 이 구조를 함유하는 링커 구조 내의 메틸렌기와 결합하고,
    -(NH-DX) 는 다음 식：
    Figure pat00140

    으로 나타내는 기이며, 위치 1 의 아미노기의 질소 원자가 결합 위치임).
  2. 제 1 항에 있어서, 항-HER2 항체가, 서열 번호 1 의 아미노산 잔기 1 내지 449 로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 2 의 아미노산 잔기 1 내지 214 로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 항-HER2 항체가, 서열 번호 1 로 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 2 로 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 약물-링커 구조의 1 항체 당의 평균 접합 수가 2 내지 8 개의 범위인 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 약물-링커 구조의 1 항체 당의 평균 접합 수가 3 내지 8 개의 범위인 방법.
KR1020217021044A 2014-01-31 2015-01-28 항-her2 항체-약물 접합체 KR102314913B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020217032820A KR102362920B1 (ko) 2014-01-31 2015-01-28 항-her2 항체-약물 접합체

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2014017777 2014-01-31
JPJP-P-2014-017777 2014-01-31
JPJP-P-2014-168944 2014-08-22
JP2014168944 2014-08-22
JP2014227886 2014-11-10
JPJP-P-2014-227886 2014-11-10
PCT/JP2015/000355 WO2015115091A1 (ja) 2014-01-31 2015-01-28 抗ｈｅｒ２抗体－薬物コンジュゲート
KR1020217009854A KR102275925B1 (ko) 2014-01-31 2015-01-28 항-her2 항체-약물 접합체

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217009854A Division KR102275925B1 (ko) 2014-01-31 2015-01-28 항-her2 항체-약물 접합체

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217032820A Division KR102362920B1 (ko) 2014-01-31 2015-01-28 항-her2 항체-약물 접합체

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20210088745A true KR20210088745A (ko) 2021-07-14
KR102314913B1 KR102314913B1 (ko) 2021-10-19

Family

ID=53756672

Family Applications (12)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217032820A KR102362920B1 (ko) 2014-01-31 2015-01-28 항-her2 항체-약물 접합체
KR1020207035147A KR102238848B1 (ko) 2014-01-31 2015-01-28 항-her2 항체-약물 접합체
KR1020237008409A KR102557062B1 (ko) 2014-01-31 2015-01-28 항-her2 항체-약물 접합체
KR1020237024073A KR102606930B1 (ko) 2014-01-31 2015-01-28 항-her2 항체-약물 접합체
KR1020167015961A KR101916553B1 (ko) 2014-01-31 2015-01-28 항-her2 항체-약물 접합체
KR1020217021044A KR102314913B1 (ko) 2014-01-31 2015-01-28 항-her2 항체-약물 접합체
KR1020187031594A KR102190548B1 (ko) 2014-01-31 2015-01-28 항-her2 항체-약물 접합체
KR1020217009854A KR102275925B1 (ko) 2014-01-31 2015-01-28 항-her2 항체-약물 접합체
KR1020227022459A KR102465042B1 (ko) 2014-01-31 2015-01-28 항-her2 항체-약물 접합체
KR1020237040108A KR20230162159A (ko) 2014-01-31 2015-01-28 항-her2 항체-약물 접합체
KR1020227004389A KR102417312B1 (ko) 2014-01-31 2015-01-28 항-her2 항체-약물 접합체
KR1020227038845A KR102510128B1 (ko) 2014-01-31 2015-01-28 항-her2 항체-약물 접합체

Family Applications Before (5)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217032820A KR102362920B1 (ko) 2014-01-31 2015-01-28 항-her2 항체-약물 접합체
KR1020207035147A KR102238848B1 (ko) 2014-01-31 2015-01-28 항-her2 항체-약물 접합체
KR1020237008409A KR102557062B1 (ko) 2014-01-31 2015-01-28 항-her2 항체-약물 접합체
KR1020237024073A KR102606930B1 (ko) 2014-01-31 2015-01-28 항-her2 항체-약물 접합체
KR1020167015961A KR101916553B1 (ko) 2014-01-31 2015-01-28 항-her2 항체-약물 접합체

Family Applications After (6)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020187031594A KR102190548B1 (ko) 2014-01-31 2015-01-28 항-her2 항체-약물 접합체
KR1020217009854A KR102275925B1 (ko) 2014-01-31 2015-01-28 항-her2 항체-약물 접합체
KR1020227022459A KR102465042B1 (ko) 2014-01-31 2015-01-28 항-her2 항체-약물 접합체
KR1020237040108A KR20230162159A (ko) 2014-01-31 2015-01-28 항-her2 항체-약물 접합체
KR1020227004389A KR102417312B1 (ko) 2014-01-31 2015-01-28 항-her2 항체-약물 접합체
KR1020227038845A KR102510128B1 (ko) 2014-01-31 2015-01-28 항-her2 항체-약물 접합체

Country Status (29)

Country Link
US (4) US10155821B2 (ko)
EP (4) EP3973995A1 (ko)
JP (8) JP5998289B2 (ko)
KR (12) KR102362920B1 (ko)
CN (2) CN105829346B (ko)
AU (3) AU2015212265B2 (ko)
BR (1) BR112016013482B1 (ko)
CA (1) CA2928794C (ko)
CY (2) CY1121573T1 (ko)
DK (2) DK3101032T3 (ko)
ES (2) ES2727351T3 (ko)
FR (1) FR21C1030I2 (ko)
HR (2) HRP20211848T1 (ko)
HU (3) HUE044389T2 (ko)
IL (4) IL310627A (ko)
LT (3) LT3466976T (ko)
MX (2) MX2016006498A (ko)
NL (1) NL301117I2 (ko)
NO (1) NO2021027I1 (ko)
NZ (1) NZ719202A (ko)
PH (1) PH12016500904B1 (ko)
PL (2) PL3101032T3 (ko)
PT (2) PT3466976T (ko)
RS (2) RS62618B1 (ko)
SG (2) SG10201800210TA (ko)
SI (2) SI3101032T1 (ko)
TW (9) TWI796246B (ko)
WO (1) WO2015115091A1 (ko)
ZA (1) ZA201602802B (ko)

Families Citing this family (74)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ746440A (en) * 2012-10-11 2019-11-29 Daiichi Sankyo Co Ltd Glycinamide derivatives and production methods thereof
AU2014371934B2 (en) * 2013-12-25 2020-01-23 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-TROP2 antibody-drug conjugate
EP3973995A1 (en) * 2014-01-31 2022-03-30 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-her2 antibody-drug conjugate
JP6612738B2 (ja) * 2014-04-10 2019-11-27 第一三共株式会社 抗ｈｅｒ２抗体−薬物コンジュゲート
TWI695011B (zh) 2014-06-18 2020-06-01 美商梅爾莎納醫療公司 抗ｈｅｒ２表位之單株抗體及其使用之方法
WO2015195925A1 (en) 2014-06-18 2015-12-23 Mersana Therapeutics, Inc. Protein-polymer-drug conjugates and methods of using same
KR20180021723A (ko) 2015-06-29 2018-03-05 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항체-약물 콘주게이트의 선택적 제조 방법
WO2018066626A1 (ja) * 2016-10-07 2018-04-12 第一三共株式会社 抗ｈｅｒ２抗体－薬物コンジュゲート投与による耐性癌の治療
WO2018110515A1 (ja) 2016-12-12 2018-06-21 第一三共株式会社 抗体－薬物コンジュゲートと免疫チェックポイント阻害剤の組み合わせ
EP3590534A4 (en) * 2017-02-28 2020-12-23 Kinki University METHOD OF TREATMENT OF EGFR-TKI RESISTANT NON-SMALL CELL LUNG CANCER BY ADMINISTRATION OF ANTI-3-ANTIBODY ACTIVE CONJUGATE
CN108653746B (zh) * 2017-03-29 2021-04-27 北京键凯科技股份有限公司 一种多载药点、高载药配基药物偶联物
US20210128741A1 (en) 2017-08-23 2021-05-06 Daiichi Sankyo Company, Limited Antibody-drug conjugate preparation and lyophilization for same
CN111051330A (zh) 2017-08-31 2020-04-21 第一三共株式会社 抗体-药物缀合物的改进制备方法
US11318212B2 (en) 2017-08-31 2022-05-03 Daiichi Sankyo Company, Limited Method for producing antibody-drug conjugate
EP3794041B1 (en) 2018-05-18 2023-07-12 Glycotope GmbH Anti-muc1 antibody
CN112153989A (zh) * 2018-05-28 2020-12-29 第一三共株式会社 通过施用抗her2抗体-药物缀合物治疗her2突变的癌
AU2019311557A1 (en) * 2018-07-25 2021-02-04 Daiichi Sankyo Company, Limited Effective method for manufacturing antibody-drug conjugate
TW202019973A (zh) 2018-07-27 2020-06-01 日商第一三共股份有限公司 辨識抗體－藥物結合物之藥物部位的蛋白質
CA3108044A1 (en) * 2018-07-31 2020-02-06 Daiichi Sankyo Company, Limited Treatment of metastatic brain tumor by administration of antibody-drug conjugate
CN110790840A (zh) * 2018-08-01 2020-02-14 三生国健药业（上海）股份有限公司 结合人her2的抗体、其制备方法和用途
KR20210042120A (ko) 2018-08-06 2021-04-16 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항체-약물 콘주게이트와 튜불린 저해제의 조합
US20210340628A1 (en) 2018-08-23 2021-11-04 Daiichi Sankyo Company, Limited Sensitivity marker for antibody-drug conjugate
MX2021003382A (es) 2018-09-26 2021-05-27 Jiangsu Hengrui Medicine Co Conjugado de ligando y farmaco analogo de exatecan, metodo de preparacion del mismo y aplicacion del mismo.
AU2019351427A1 (en) 2018-09-30 2021-04-15 Changzhou Hansoh Pharmaceutical Co., Ltd. Anti-B7H3 antibody-exatecan analog conjugate and medicinal use thereof
KR20210102341A (ko) 2018-12-11 2021-08-19 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항체-약물 컨쥬게이트와 parp 저해제의 조합
BR112021011894A2 (pt) 2018-12-21 2021-09-08 Daiichi Sankyo Company, Limited Composição farmacêutica
CN109824759A (zh) * 2019-03-08 2019-05-31 联宁（苏州）生物制药有限公司 一种用于抗体药物偶联物的药物-连接子mc-mmaf的制备方法及其中间体
EP3946464B1 (en) 2019-03-29 2022-08-31 MedImmune Limited Compounds and conjugates thereof
CN111686259B (zh) * 2019-05-26 2023-08-08 成都百利多特生物药业有限责任公司 一种含sn38的抗体药物偶联物
US20220233708A1 (en) * 2019-06-28 2022-07-28 Shanghai Fudan-Zhangjiang Bio-Pharmaceutical Co., Ltd. Antibody-drug conjugate, intermediate thereof, preparation method therefor and application thereof
CN112125915A (zh) * 2019-09-18 2020-12-25 四川百利药业有限责任公司 一种喜树碱衍生物及其偶联物
US20220387618A1 (en) 2019-11-15 2022-12-08 Seagen Inc. Methods of treating her2 positive breast cancer with tucatinib in combination with an anti-her2 antibody-drug conjugate
KR20220113728A (ko) 2019-12-12 2022-08-16 지앙수 헨그루이 파마슈티컬스 컴퍼니 리미티드 항 클라우딘 항체 약물 접합체 및 그 의약 용도
KR20220113747A (ko) 2019-12-16 2022-08-16 지앙수 헨그루이 파마슈티컬스 컴퍼니 리미티드 항 cea 항체-엑사테칸 유사체의 접합체 및 이의 약학적 용도
US20230101735A1 (en) 2020-01-22 2023-03-30 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. Anti-trop-2 antidody-exatecan analog conjugate and medical use thereof
CN115103858A (zh) 2020-03-25 2022-09-23 江苏恒瑞医药股份有限公司 一种抗体药物偶联物的制备方法
BR112022019073A2 (pt) * 2020-03-25 2022-11-08 Jiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co Ltd Composição farmacêutica que compreende conjugado anticorpo-fármaco e uso da mesma
JP2023519261A (ja) 2020-03-25 2023-05-10 江蘇恒瑞医薬股▲ふん▼有限公司 抗ｐｓｍａ抗体－エキサテカン類似体複合体及びその医薬用途
CN115835860A (zh) * 2020-06-12 2023-03-21 树顶分子生技股份有限公司 用于治疗非酒精性脂肪性肝病和非酒精性脂肪性肝炎的带有碳酸酯的紫檀芪氨基酸的新型类似物
WO2021260582A1 (en) * 2020-06-24 2021-12-30 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and aurora b inhibitor
WO2021260578A1 (en) * 2020-06-24 2021-12-30 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and cdk9 inhibitor
WO2021260583A1 (en) * 2020-06-24 2021-12-30 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and dna-pk inhibitor
BR112022026205A2 (pt) * 2020-06-24 2023-03-14 Astrazeneca Uk Ltd Produto farmacêutico, uso de um conjugado anticorpo anti-her2-fármaco ou um inibidor de atr na fabricação de um medicamento, e, método de tratamento do câncer
TW202216209A (zh) 2020-06-24 2022-05-01 英商阿斯特捷利康英國股份有限公司 抗體-藥物結合物及atm抑制劑之組合
CN115515644A (zh) * 2020-06-28 2022-12-23 昆山新蕴达生物科技有限公司 一种抗体-药物偶联物，其制备方法及应用
EP4183420A1 (en) 2020-07-20 2023-05-24 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of (anti-her2 antibody)-drug conjugate and her dimerization inhibitor
AU2021323863A1 (en) * 2020-08-13 2023-03-23 Chia Tai Tianqing Pharmaceutical Group Co., Ltd. Antibody drug conjugate
CA3195062A1 (en) 2020-09-12 2022-03-17 Astrazeneca Uk Limited A scoring method for an anti-her2 antibody-drug conjugate therapy
AU2020442003B2 (en) * 2020-09-15 2023-09-28 Baili-Bio (Chengdu) Pharmaceutical Co., Ltd. A camptothecin drug and its antibody conjugate thereof
CN116239601B (zh) * 2020-09-30 2023-10-13 映恩生物制药（苏州）有限公司 一种抗肿瘤化合物及其制备方法和应用
BR112023006337A2 (pt) 2020-10-09 2023-05-09 Astrazeneca Uk Ltd Produto farmacêutico, uso de um conjugado anticorpo anti-her2-fármaco ou um inibidor seletivo de parp1, e, método de tratamento do câncer
AU2021361938A1 (en) * 2020-10-12 2023-05-25 Baili-Bio (Chengdu) Pharmaceutical Co., Ltd. Deuterated camptothecin derivative and antibody-drug conjugate thereof
EP4227310A1 (en) * 2020-10-12 2023-08-16 Sichuan Baili Pharmaceutical Co. Ltd. Camptothecin derivative and ligand-drug conjugate thereof
AU2021378152A1 (en) 2020-11-11 2023-06-22 Daiichi Sankyo Company, Limited COMBINATION OF AN ANTIBODY-DRUG CONJUGATE WITH ANTI-SIRPα ANTIBODY
EP4245322A1 (en) 2020-11-12 2023-09-20 Daiichi Sankyo Company, Limited Treatment for mesothelioma through administration of anti-b7-h3 antibody-drug conjugate
CN112535738B (zh) * 2020-12-04 2022-09-09 中国科学技术大学 奥沙利铂偶联物及其制备方法和应用
US20240115721A1 (en) * 2021-01-13 2024-04-11 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Anti-dll3 antibody-drug conjugate
CN116888123A (zh) * 2021-02-09 2023-10-13 微境生物医药科技(上海)有限公司 用于adc制备的喜树碱衍生物
CN117015549A (zh) * 2021-03-17 2023-11-07 江苏恒瑞医药股份有限公司 一种喜树碱衍生物的制备方法
CN116867789A (zh) * 2021-03-31 2023-10-10 上海复旦张江生物医药股份有限公司 一种伊喜替康衍生物的制备方法及其中间体
CA3219236A1 (en) * 2021-05-07 2022-11-10 ALX Oncology Inc. Exatecan derivatives and antibody-drug conjugates thereof
CN113402584A (zh) * 2021-07-06 2021-09-17 联宁（苏州）生物制药有限公司 一种抗体偶联药物连接子的中间体lnd1067-l1的合成方法
US11806405B1 (en) 2021-07-19 2023-11-07 Zeno Management, Inc. Immunoconjugates and methods
US11814394B2 (en) 2021-11-16 2023-11-14 Genequantum Healthcare (Suzhou) Co., Ltd. Exatecan derivatives, linker-payloads, and conjugates and thereof
TW202329936A (zh) 2021-11-18 2023-08-01 英商阿斯特捷利康英國股份有限公司 抗體-藥物結合物與parp1選擇性抑制劑之組合
WO2023126823A1 (en) 2021-12-28 2023-07-06 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and atr inhibitor
TW202333800A (zh) * 2021-12-28 2023-09-01 英商阿斯特捷利康英國股份有限公司 抗體-藥物結合物及rasg12c抑制劑之組合
WO2023175483A1 (en) 2022-03-16 2023-09-21 Astrazeneca Uk Limited A scoring method for an anti-trop2 antibody‑drug conjugate therapy
WO2023209591A1 (en) 2022-04-27 2023-11-02 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of antibody-drug conjugate with ezh1 and/or ezh2 inhibitor
TW202400650A (zh) 2022-05-11 2024-01-01 日商第一三共股份有限公司 抗體與cd47抑制劑之組合
WO2024015830A1 (en) 2022-07-12 2024-01-18 Cytomx Therapeutics, Inc. Epcam immunoconjugates and uses thereof
WO2024023750A1 (en) 2022-07-28 2024-02-01 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and bispecific checkpoint inhibitor
CN117024438A (zh) * 2022-07-29 2023-11-10 杭州爱科瑞思生物医药有限公司 依沙替康衍生物及其应用
WO2024049931A1 (en) * 2022-09-02 2024-03-07 Merck Sharp & Dohme Llc Exatecan-derived topoisomerase-1 inhibitors pharmaceutical compositions, and uses thereof

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0559061A (ja) 1991-01-16 1993-03-09 Dai Ichi Seiyaku Co Ltd 六環性化合物
JPH08337584A (ja) 1995-04-10 1996-12-24 Dai Ichi Seiyaku Co Ltd 縮合六環式アミノ化合物、これを含有する医薬及びその製法
US5677171A (en) 1988-01-12 1997-10-14 Genentech, Inc. Monoclonal antibodies directed to the HER2 receptor
WO1997046260A1 (en) 1996-06-06 1997-12-11 Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. Drug complexes
US5821337A (en) 1991-06-14 1998-10-13 Genentech, Inc. Immunoglobulin variants
WO2000025825A1 (fr) 1998-10-30 2000-05-11 Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. Composes dds et procede de dosage de ces composes
WO2001000244A2 (en) 1999-06-25 2001-01-04 Genentech, Inc. METHODS OF TREATMENT USING ANTI-ErbB ANTIBODY-MAYTANSINOID CONJUGATES
KR20010052385A (ko) * 1998-05-22 2001-06-25 스즈키 다다시 약물복합체
KR20110044808A (ko) * 2006-05-30 2011-04-29 제넨테크, 인크. 항체 및 면역접합체 및 이들의 용도

Family Cites Families (76)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
DK0585287T3 (da) 1990-07-10 2000-04-17 Cambridge Antibody Tech Fremgangsmåde til fremstilling af specifikke bindingsparelementer
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5658920A (en) 1991-01-16 1997-08-19 Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. Substituted 1H,12H-benz-[DE]pyrano[3',4':6,7] indolizino[1,2-B]quinoline-10,13(9H,15H)-dione compound
DK0605522T3 (da) 1991-09-23 2000-01-17 Medical Res Council Fremgangsmåde til fremstilling af humaniserede antistoffer
DK1024191T3 (da) 1991-12-02 2008-12-08 Medical Res Council Fremstilling af autoantistoffer fremvist på fag-overflader ud fra antistofsegmentbiblioteker
CA2131151A1 (en) 1992-03-24 1994-09-30 Kevin S. Johnson Methods for producing members of specific binding pairs
JP3359955B2 (ja) 1992-07-16 2002-12-24 第一製薬株式会社 抗腫瘍剤
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
GB9313509D0 (en) 1993-06-30 1993-08-11 Medical Res Council Chemisynthetic libraries
CA2177367A1 (en) 1993-12-03 1995-06-08 Andrew David Griffiths Recombinant binding proteins and peptides
US6504029B1 (en) 1995-04-10 2003-01-07 Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. Condensed-hexacyclic compounds and a process therefor
SG50747A1 (en) 1995-08-02 1998-07-20 Tanabe Seiyaku Co Comptothecin derivatives
JPH1095802A (ja) 1995-12-28 1998-04-14 Tanabe Seiyaku Co Ltd カンプトテシン誘導体
CA2192725C (en) 1995-12-28 2004-04-20 Kenji Tsujihara Camptothecin derivatives
TW409058B (en) 1996-06-06 2000-10-21 Daiichi Seiyaku Co Method for preparation of a drug complex
JPH1171280A (ja) 1997-06-26 1999-03-16 Tanabe Seiyaku Co Ltd 医薬組成物
JPH1192405A (ja) 1997-09-19 1999-04-06 Dai Ichi Seiyaku Co Ltd 薬物複合体
AU3657899A (en) 1998-04-20 1999-11-08 James E. Bailey Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
EP2275540B1 (en) 1999-04-09 2016-03-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
EP1189641B1 (en) 1999-06-25 2009-07-29 Genentech, Inc. HUMANIZED ANTI-ErbB2 ANTIBODIES AND TREATMENT WITH ANTI-ErbB2 ANTIBODIES
JP2002060351A (ja) 2000-03-22 2002-02-26 Dai Ichi Seiyaku Co Ltd 水酸基を有する薬物を含むｄｄｓ化合物
IL153505A0 (en) 2000-06-29 2003-07-06 Daiichi Seiyaku Co Dds compound and process for the preparation thereof
US6815435B2 (en) 2000-07-13 2004-11-09 Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. Pharmaceutical compositions containing DDS compounds
CA2424602C (en) 2000-10-06 2012-09-18 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Antibody composition-producing cell
TWI313609B (en) 2001-08-21 2009-08-21 Mitsubishi Tanabe Pharma Corp Pharmaceutical composition for inhibiting the metastasis or preventing the recurrence of malignant tumor
KR100573565B1 (ko) 2001-08-29 2006-04-25 주식회사 포스코 요철부가 형성된 실린더 링과 이 실린더 링이 결합된 맨드릴
PL216750B1 (pl) 2001-11-01 2014-05-30 Uab Research Foundation Zastosowanie przeciwciał selektywnych dla receptora liganda indukującego apoptozę pokrewnego czynnikowi martwicy nowotworu i innych czynników terapeutycznych do leczenia nowotworu oraz kompozycja zawierająca takie przeciwciała i inne czynniki terapeutyczne
WO2003043583A2 (en) 2001-11-20 2003-05-30 Seattle Genetics, Inc. Treatment of immunological disorders using anti-cd30 antibodies
US8877901B2 (en) 2002-12-13 2014-11-04 Immunomedics, Inc. Camptothecin-binding moiety conjugates
US9745380B2 (en) 2002-03-01 2017-08-29 Immunomedics, Inc. RS7 antibodies
WO2004054622A1 (en) * 2002-12-13 2004-07-01 Immunomedics, Inc. Immunoconjugates with an intracellularly-cleavable linkage
US20040202666A1 (en) 2003-01-24 2004-10-14 Immunomedics, Inc. Anti-cancer anthracycline drug-antibody conjugates
WO2005084390A2 (en) 2004-03-02 2005-09-15 Seattle Genetics, Inc. Partially loaded antibodies and methods of their conjugation
EP1747021B1 (en) 2004-05-19 2015-09-09 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Self-immolative linkers and drug conjugates
NZ551180A (en) 2004-06-01 2009-10-30 Genentech Inc Antibody drug conjugates and methods
KR20160096228A (ko) * 2004-07-22 2016-08-12 제넨테크, 인크. Ｈｅｒ２ 항체 조성물
US8802820B2 (en) 2004-11-12 2014-08-12 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
WO2006065533A2 (en) 2004-11-29 2006-06-22 Seattle Genetics, Inc. Engineered antibodies and immunoconjugates
EP3698807A1 (en) 2005-01-21 2020-08-26 Genentech, Inc. Fixed dosing of her antibodies
DE102005009099A1 (de) 2005-02-28 2006-08-31 Ktb Tumorforschungsgesellschaft Mbh Proteinbindende Camptothecin-Peptid-Derivate und diese enthaltende Arzneimittel
DE102005009084A1 (de) 2005-02-28 2006-08-31 Ktb Tumorforschungsgesellschaft Mbh Proteinbindende Anthrazyklin-Peptid-Derivate und diese enthaltende Arzneimittel
US7833979B2 (en) 2005-04-22 2010-11-16 Amgen Inc. Toxin peptide therapeutic agents
EP1942944A2 (en) 2005-10-31 2008-07-16 Genentech, Inc. Macrocyclic depsipeptide antibody-drug conjugates and methods
US20080131428A1 (en) 2006-02-24 2008-06-05 Arius Research, Inc. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of TROP-2
UA95958C2 (en) 2006-05-30 2011-09-26 Дженентек, Инк. Antibody that binds to cd22, immunoconjugates and uses therefor
ITMI20061473A1 (it) 2006-07-26 2008-01-27 Indena Spa Derivati della camptotecina ad attivita antitumorale
DK2644194T3 (en) 2008-03-18 2017-07-03 Genentech Inc Combinations of an anti-HER2 antibody-drug conjugate and docetaxel
US8236319B2 (en) * 2008-04-30 2012-08-07 Immunogen, Inc. Cross-linkers and their uses
CA2720124C (en) * 2008-05-13 2015-07-21 Genentech, Inc. Analysis of antibody drug conjugates by bead-based affinity capture and mass spectrometry
WO2010059315A1 (en) 2008-11-18 2010-05-27 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Human serum albumin linkers and conjugates thereof
EP3243527B1 (en) 2009-02-13 2019-06-05 Immunomedics, Inc. Immunoconjugates with an intracellularly-cleavable linkage
JP5705836B2 (ja) 2009-05-29 2015-04-22 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｈｅｒ２を発現する胃癌患者のｈｅｒ２シグナル伝達のためのモジュレーター
CN102481364A (zh) * 2009-07-22 2012-05-30 安龙制药公司 用her2受体拮抗剂联合7-乙基-10-羟基喜树碱的多臂聚合缀合物治疗her2阳性癌症的方法
CA2770847A1 (en) 2009-08-18 2011-02-24 Baker Hughes Incorporated Methods of forming polycrystalline diamond elements, polycrystalline diamond elements, and earth-boring tools carrying such polycrystalline diamond elements
CA2775350A1 (en) 2009-09-24 2011-03-31 Seattle Genetics, Inc. Dr5 ligand drug conjugates
EP2506881B1 (en) 2009-12-02 2024-03-06 Immunomedics, Inc. Combining radioimmunotherapy and antibody-drug conjugates for improved cancer therapy
EP2569000B1 (en) 2010-05-13 2017-09-27 Indiana University Research and Technology Corporation Glucagon superfamily peptides exhibiting nuclear hormone receptor activity
ES2664809T3 (es) 2010-05-17 2018-04-23 Chiome Bioscience Inc. Anticuerpo anti-TROP-2 humano que tiene actividad antitumoral in vivo
CA2799202C (en) 2010-05-18 2016-07-05 Cerulean Pharma Inc. Compositions and methods for treatment of autoimmune and other diseases
EP2594589A1 (en) 2010-06-10 2013-05-22 Sapporo Medical University ANTI-Trop-2 ANTIBODY
PE20130643A1 (es) 2010-07-12 2013-06-07 Covx Technologies Ireland Ltd Conjugados de anticuerpos multifuncionales
WO2012019024A2 (en) 2010-08-04 2012-02-09 Immunogen, Inc. Her3-binding molecules and immunoconjugates thereof
JP6014596B2 (ja) 2010-11-09 2016-10-25 メディミューン，エルエルシー 均一コンジュゲーションのための抗体足場
US20120121615A1 (en) 2010-11-17 2012-05-17 Flygare John A Alaninyl maytansinol antibody conjugates
EP2776470A2 (en) 2011-11-11 2014-09-17 Rinat Neuroscience Corporation Antibodies specific for trop-2 and their uses
US9427464B2 (en) 2011-11-22 2016-08-30 Chiome Bioscience Inc. Anti-human TROP-2 antibody having an antitumor activity in vivo
US20150023989A1 (en) 2011-12-14 2015-01-22 Seattle Genetics, Inc. New antibody drug conjugates (adcs) and the use thereof
US20130280282A1 (en) 2012-04-24 2013-10-24 Daiichi Sankyo Co., Ltd. Dr5 ligand drug conjugates
CN104619350A (zh) 2012-06-14 2015-05-13 Ambrx公司 结合到核受体配体多肽的抗psma抗体
NZ746440A (en) 2012-10-11 2019-11-29 Daiichi Sankyo Co Ltd Glycinamide derivatives and production methods thereof
WO2014061277A1 (ja) 2012-10-19 2014-04-24 第一三共株式会社 親水性構造を含むリンカーで結合させた抗体－薬物コンジュゲート
EP2927227A4 (en) * 2013-01-03 2015-12-30 Celltrion Inc ANTIBODY CONCENTRATOR REMEDY CONJUGATE, METHOD OF MANUFACTURING THEREOF, AND ANTIBODY TOGETHER THEREWITH
AU2014371934B2 (en) 2013-12-25 2020-01-23 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-TROP2 antibody-drug conjugate
EP3973995A1 (en) * 2014-01-31 2022-03-30 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-her2 antibody-drug conjugate
NZ722668A (en) 2014-04-10 2024-02-23 Daiichi Sankyo Europe Gmbh Anti-her3 antibody-drug conjugate

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5677171A (en) 1988-01-12 1997-10-14 Genentech, Inc. Monoclonal antibodies directed to the HER2 receptor
JPH0559061A (ja) 1991-01-16 1993-03-09 Dai Ichi Seiyaku Co Ltd 六環性化合物
US5821337A (en) 1991-06-14 1998-10-13 Genentech, Inc. Immunoglobulin variants
JPH08337584A (ja) 1995-04-10 1996-12-24 Dai Ichi Seiyaku Co Ltd 縮合六環式アミノ化合物、これを含有する医薬及びその製法
WO1997046260A1 (en) 1996-06-06 1997-12-11 Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. Drug complexes
KR20010052385A (ko) * 1998-05-22 2001-06-25 스즈키 다다시 약물복합체
WO2000025825A1 (fr) 1998-10-30 2000-05-11 Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. Composes dds et procede de dosage de ces composes
WO2001000244A2 (en) 1999-06-25 2001-01-04 Genentech, Inc. METHODS OF TREATMENT USING ANTI-ErbB ANTIBODY-MAYTANSINOID CONJUGATES
KR20110044808A (ko) * 2006-05-30 2011-04-29 제넨테크, 인크. 항체 및 면역접합체 및 이들의 용도

Non-Patent Citations (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Adams CW, et al., Cancer Immunol Immunother. 2006;6:717-727.
Alley, S. C., et al., Current Opinion in Chemical Biology (2010) 14, 529-537.
Baselga et al., J. Clin. Oncol. 14:737-744 (1996).
Coussens L, et al., Science. 1985;230(4730):1132-1139.
Damle N.K. Expert Opin. Biol. Ther. (2004) 4, 1445-1452.
De Jager, R., et al., Ann N Y Acad Sci (2000) 922, 260-273.
Di Fore PP, et al., Science. 1987;237:178-182.
Ducry, L., et al., Bioconjugate Chem. (2010) 21, 5-13.
Fendly. et al., Cancer Research 1990(50):1550-1558.
Fukushige S et al., Mol Cell Biol 6: 955-958, 1986.
Graus-Porta G, et al., EMBO J. 1997;16;1647-1655.
Gravalos C, et al., Ann Oncol 19: 1523-1529, 2008.
Hardwick R, et al., Eur. J Surg Oncol. 1997 (23):30-35.
Howard A. et al., J Clin Oncol 2011;29:398-405.
Hudis CA, et al., N Engl J Med. 357: 39-51, 2007.
Hudziak RM, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1987;84:7159-7163.
Inoue, K. et al., Polymer Drugs in the Clinical Stage, Edited by Maeda et al. (2003) 145-153.
Joto, N. et al. Int J Cancer (1997) 72, 680-686.
Kaptain S et al., Diagn Mol Pathol 10:139-152, 2001.
Karnagaran D, et al., EMBO J. 1996;15:254-264.
Korkaya H, et al., Oncogene. 2008;27(47):6120-6130.
Kumazawa, E. et al., Cancer Chemother. Pharmacol. (1998) 42, 210-220.
Kumazawa, E. et al., Cancer Sci (2004) 95, 168-175.
Kumazawa, E., Tohgo, A., Exp. Opin. Invest. Drugs (1998) 7, 625-632.
Mitsui, I., et al., Jpn J. Cancer Res. (1995) 86, 776-782.
Senter P. D., et al., Nature Biotechnology (2012) 30, 631-637.
Slamon DJ, et al. Science. 1989;244:707-712.
Slamon DJ, et al., Science. 1987;235:177-182.
Sliwkowski MX, et al., J. Biol. Chem. 1994;269:14661-14665.
Sliwkowski MX, et al., Semin Oncol. 1999;26(4,Suppl 12):60-70.
Soepenberg, O. et al., Clinical Cancer Research, (2005) 11, 703-711.
Takiguchi, S., et al., Jpn J. Cancer Res. (1997) 88, 760-769.
Vogel CL, et al., J Clin Oncol. 2002;20(3):719-726.
Wente M. N. et al., Investigational New Drugs (2005) 23, 339-347.
Yano T, et al., Oncol Rep. 2006;15(1):65-71.

Also Published As

Publication number Publication date
EP3101032A4 (en) 2017-09-06
KR102314913B1 (ko) 2021-10-19
AU2020200596A1 (en) 2020-02-20
JPWO2015115091A1 (ja) 2017-03-23
US10155821B2 (en) 2018-12-18
KR20210040181A (ko) 2021-04-12
JP2022180504A (ja) 2022-12-06
KR102362920B1 (ko) 2022-02-14
TWI627967B (zh) 2018-07-01
KR20200140932A (ko) 2020-12-16
ZA201602802B (en) 2017-09-27
TWI796245B (zh) 2023-03-11
JP2021169493A (ja) 2021-10-28
RU2016123597A (ru) 2018-03-02
JP7146031B2 (ja) 2022-10-03
TWI789700B (zh) 2023-01-11
LTC3101032I2 (ko) 2022-10-25
MX2016006498A (es) 2016-08-04
AU2022203818A1 (en) 2022-06-23
ES2727351T3 (es) 2019-10-15
JP6914380B2 (ja) 2021-08-04
KR102417312B1 (ko) 2022-07-05
SG11201603960XA (en) 2016-07-28
KR20230162159A (ko) 2023-11-28
US20190077880A1 (en) 2019-03-14
PT3466976T (pt) 2021-10-27
RU2019107788A (ru) 2019-05-17
SI3466976T1 (sl) 2021-12-31
JP2020097617A (ja) 2020-06-25
TWI661839B (zh) 2019-06-11
HUE044389T2 (hu) 2019-10-28
RU2016123597A3 (ko) 2018-10-12
TWI796243B (zh) 2023-03-11
CN105829346B (zh) 2019-08-23
EP3466976A1 (en) 2019-04-10
JP6105183B1 (ja) 2017-03-29
CN110464847A (zh) 2019-11-19
KR102238848B1 (ko) 2021-04-09
LT3466976T (lt) 2021-11-10
KR102275925B1 (ko) 2021-07-12
FR21C1030I2 (fr) 2022-04-08
RS62618B1 (sr) 2021-12-31
JP2019112403A (ja) 2019-07-11
JP2017036285A (ja) 2017-02-16
EP3101032A1 (en) 2016-12-07
KR102190548B1 (ko) 2020-12-14
MX2020010682A (es) 2020-11-06
EP3101032B1 (en) 2019-01-16
US20240026030A1 (en) 2024-01-25
TWI796246B (zh) 2023-03-11
KR102557062B1 (ko) 2023-07-18
SI3101032T1 (sl) 2019-02-28
TW202322817A (zh) 2023-06-16
JP2017095457A (ja) 2017-06-01
TWI796244B (zh) 2023-03-11
KR20230113822A (ko) 2023-08-01
NZ719202A (en) 2022-02-25
LTPA2021515I1 (ko) 2021-08-10
KR102465042B1 (ko) 2022-11-09
IL245252B (en) 2019-06-30
CY1121573T1 (el) 2020-05-29
KR20220100994A (ko) 2022-07-18
AU2020200596B2 (en) 2022-03-03
US11795236B2 (en) 2023-10-24
JP5998289B2 (ja) 2016-09-28
NL301117I1 (nl) 2021-07-19
TW202120088A (zh) 2021-06-01
KR102606930B1 (ko) 2023-11-29
WO2015115091A1 (ja) 2015-08-06
US20160333112A1 (en) 2016-11-17
PH12016500904A1 (en) 2016-07-11
ES2895254T3 (es) 2022-02-18
KR102510128B1 (ko) 2023-03-14
HUE057464T2 (hu) 2022-05-28
AU2015212265B2 (en) 2020-01-02
TW202237115A (zh) 2022-10-01
US11584800B2 (en) 2023-02-21
US20200385486A1 (en) 2020-12-10
SG10201800210TA (en) 2018-02-27
BR112016013482A2 (ko) 2017-10-03
HUS2100025I1 (hu) 2021-07-28
CA2928794A1 (en) 2015-08-06
EP3973995A1 (en) 2022-03-30
TW201613649A (en) 2016-04-16
DK3101032T3 (en) 2019-04-29
RU2683780C2 (ru) 2019-04-02
JP6046301B1 (ja) 2016-12-14
PT3101032T (pt) 2019-04-03
EP4212552A1 (en) 2023-07-19
KR20180122038A (ko) 2018-11-09
IL278891B1 (en) 2024-02-01
LT3101032T (lt) 2019-03-25
CY1124774T1 (el) 2022-11-25
PL3466976T3 (pl) 2021-12-20
TWI722422B (zh) 2021-03-21
RS58415B1 (sr) 2019-04-30
JP6665325B2 (ja) 2020-03-13
JP6466895B2 (ja) 2019-02-06
NL301117I2 (nl) 2021-07-29
IL266790A (en) 2019-07-31
KR20230042126A (ko) 2023-03-27
JP2017105789A (ja) 2017-06-15
IL245252A0 (en) 2016-06-30
TW201934145A (zh) 2019-09-01
HRP20190431T1 (hr) 2019-04-19
KR20220025176A (ko) 2022-03-03
TW202237113A (zh) 2022-10-01
IL310627A (en) 2024-04-01
EP3466976B1 (en) 2021-09-08
TW201834692A (zh) 2018-10-01
BR112016013482B1 (pt) 2022-04-19
CN110464847B (zh) 2024-02-09
DK3466976T3 (da) 2021-12-13
HRP20211848T1 (hr) 2022-03-04
TW202237114A (zh) 2022-10-01
KR101916553B1 (ko) 2018-11-07
CN105829346A (zh) 2016-08-03
TW202237191A (zh) 2022-10-01
IL278891A (en) 2021-01-31
PH12016500904B1 (en) 2016-07-11
KR20220154251A (ko) 2022-11-21
KR20160113099A (ko) 2016-09-28
FR21C1030I1 (ko) 2021-08-27
KR20210127803A (ko) 2021-10-22
JP7467557B2 (ja) 2024-04-15
PL3101032T3 (pl) 2019-07-31
NO2021027I1 (no) 2021-07-06
CA2928794C (en) 2019-08-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102275925B1 (ko) 항-her2 항체-약물 접합체
JP6105171B2 (ja) 抗ｈｅｒ３抗体−薬物コンジュゲート
RU2794183C2 (ru) Анти-her2 конъюгат антитела с лекарственным средством

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant