KR20190126205A - 인터류킨-2 융합 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

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파블로 우마나
에케하르트 뫼스너
랄프 호세
로렌스 버나드 피터슨
린다 윅커
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에프. 호프만-라 로슈 아게
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Abstract

본 발명은 일반적으로 면역글로불린 및 인터류킨-2(IL-2)의 융합 단백질에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 예를 들면, 자가면역 질환 및 면역-매개된 염증성 질환의 치료시 치료제로서 사용하기 위해 개선된 특성을 나타내는 면역글로불린 및 돌연변이체 IL-2의 융합 단백질에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 융합 단백질을 생성하는 방법 및 질환의 치료시 상기 융합 단백질을 이용하는 방법에 관한 것이다.

Description

인터류킨-2 융합 단백질 및 이의 용도{INTERLEUKIN-2 FUSION PROTEINS AND USES THEREOF}
본 발명은 일반적으로 면역글로불린 및 인터류킨-2(IL-2)의 융합 단백질에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 예를 들면, 자가면역 질환 및 면역-매개된 염증성 질환의 치료시 치료제로서 사용하기 위한 개선된 특성을 나타내는 면역글로불린 및 돌연변이체 IL-2의 융합 단백질에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 융합 단백질을 생성하는 방법 및 질환의 치료시 상기 융합 단백질을 이용하는 방법에 관한 것이다.
조절 T 세포(Treg)는 자가-관용(self-tolerance)을 유지하는데 중요한 T 림프구의 특정한 아형이다. 억제인자(suppressor) 기능을 갖는 이들 CD4+CD25hi 세포는 전사 인자 FOXP3 뿐만 아니라, CD127low, CTLA-4+, LAP, CD39+, PD-1+, GARP 등과 같은 다른 세포 마커의 세포내 발현에 의해 효과기(effector) T 세포와 구별될 수 있다. FOXP3은 Treg 분화 및 기능에 결정적이며, 면역 조절부전, 다발성내분비병증, 장병증, X-염색체 연관 증후군(IPEX)을 갖는 scurfy 마우스 및 환자 둘 다에서 FOXP3 유전자 결핍 및 돌연변이는 Treg 결핍 또는 기능 결여로 인해 자가-관용의 파괴 및 자가면역 질환의 발생을 야기한다.
제 1형 당뇨병, 전신 홍반성 루푸스(SLE), 다발성 경화증 및 기타 다수에서 자가면역 반응은 Treg 또는 Treg 기능의 결핍과 상관된다. 동물 모델로부터의 데이터는 자가면역 반응이 Treg가 자가반응성 CD4+ 기억 T 효과기 세포의 영향으로 인해 대부분에서 자신에 대한 파괴적 면역 반응을 제어하는 것을 실패함으로써 촉진된다는 가설을 뒷받침한다. 제 1형 당뇨병은 췌장에서 대부분의 인슐린 생성 β 세포의 파괴 후에 발생하는 자가면역 질환이다. 제 1형 당뇨병의 발생빈도는 미국에서 인구의 약 0.3%이고, 미국, 유럽 및 특히 스칸디나비아에서 그 발생이 계속 증가하고 있으며(거의 1%), 다음 20년 내에 2배가 될 것으로 예상된다.
사이토카인 IL-2는 Treg 및 효과기 T 세포(Teff) 둘 다의 활성화 및 기능에서 주요한 역할을 한다. IL-2 생성의 결핍 또는 반응성의 결여는 우선적으로 Treg 기능의 손실 및 자가면역 확률의 증가를 야기한다. Treg는 Teff보다 높은 수준으로 고-친화도 IL-2 수용체를 구성적으로 발현시키므로, 저-용량의 IL-2는 우선적으로 Teff 세포에 비해 Treg의 유지를 지원한다.
시험관내 및 생체내 Treg를 활성화시키기 위한 IL-2의 우선적 효과에 의해, 저-용량의 장기지속(long-lived) IL-2 치료에 대한 가능성이 자가면역 질환에서의 성공에 대해 높은 전망을 갖는 것으로 보일 수 있다. IL-2(프로류킨(Proleukin: 등록상표), 재조합 인간 IL-2)를 사용하여 200명 환자의 이중 맹검 위약 조절 제 1형 당뇨병 임상 시험이 2013년 말에 개시되도록 설정되었다. 매일 저-용량 프로류킨을 사용한 최근의 임상 시험은 만성 이식편-대-숙주 질환(GVHD) 및 C형 간염 바이러스-유도된 혈관염의 징후 및 증상 일부를 개선시켰다(문헌[Koreth et al., New Engl J Med 365, 2055-2066(2011)], [Saadoun et al., New Engl J Med 365, 2067-2077(2011)]). 두 연구 모두에서, 저-용량 프로류킨(등록상표)은 Treg를 유도하고 Treg:Teff 비를 증가시켰다. 그러나, 프로류킨(등록상표)의 불량한 PK 특성은 인간에서 낮은 일정한 수준의 IL-2를 유지하는데 차선이 되게 한다. 임상 시험시 시험되는 다른 방법은 생체외에서 Treg의 개인별 증식 후 재주입이지만, 이 접근방법은 덜 이상적이며 쉽지않은 일련의 품질 제어 문제를 나타낸다.
따라서, 천연 조절 T 세포(Treg) 매개된 우세한 면역 관용을 회복시키고 CD4+ 기억 T 효과기 세포에서 임의의 잠재적인 자극 영향을 매우 최소화하는 새로운 치료적 접근방법은, 제 1형 당뇨병, 다발성 경화증, 전신 홍반성 루푸스, 크론병(Crohn's disease)과 같은 자가면역 질환뿐만 아니라, 만성 이식편 대 숙주 질환, 천식, 폐섬유증, 만성 폐쇄성 폐질환, 심혈관 질환, 예를 들어, 아테롬성경화증, 및 급성 관동맥 증후군, 및 고형 장기 및 골수 둘 다의 이식 거부와 같은 다른 자가면역 질환 및 면역계 전염증성 질환을 갖는 환자를 치료하는 능력을 크게 강화할 수 있다.
WO 2009/135615는 자가면역 질환의 치료 또는 예방을 위한 이전에 공지된 IL-2 뮤테인(WO 1999/60128에 기재된 IL-2 N88R, BAY50-4798)의 용도를 기재한다. 상기 특허는 IL-2 뮤테인이 야생형 Il-2에 비해 Treg 세포에서 증가된 활성을 갖지만, CD8+ T 세포 및 NK 세포에서 이의 영향이 작다는 것을 언급하고 있다. IL-2 뮤테인의 융합 단백질은 전혀 기재되지 않았다.
WO 2010/85495는 비-조절 T 세포에 비해 Treg 세포에서 활성을 선택적으로 촉진하는, 염증성 질환의 치료를 위한 IL-2 변이체를 기재한다. 기재된 IL-2 변이체는 IL-2 수용체의 상이한 서브유닛에 대한 결합에 영향을 미치는 8개 이상의 아미노산 치환의 조합을 포함한다.
본 발명의 IL-2 융합 단백질은 우선적으로 인간 CD4+ 기억 T 효과기 세포에서 영향이 거의 없거나 전혀 없는 인간 및 비인간 Treg를 활성화시켜 균형을 더 높은 Treg:Teff 비 쪽으로 기울어지게 하며, 자가면역 반응을 감소시킨다. 이들은 장기 지속성이어서 편리한 투여 일정을 가능하게 하며, 효과기 기능이 배제되어 가능한 부작용 및 효능 손상을 줄인다.
일 양상에서, 본 발명은 (i) 면역글로불린 분자, 및 (ii) 야생형 IL-2 분자에 비해 중간 친화도 IL-2 수용체에 대한 돌연변이체 IL-2 분자의 친화도를 감소시키는 아미노산 돌연변이를 포함하는 2개의 돌연변이체 인터류킨-2(IL-2) 분자를 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
일 실시양태에서, 상기 면역글로불린 분자는 IgG-클래스 면역글로불린 분자, 특히 IgG1-서브클래스 면역글로불린 분자이다. 일 실시양태에서, 상기 면역글로불린 분자는 인간 면역글로불린 분자이다. 일 실시양태에서, 상기 면역글로불린 분자는 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 일 실시양태에서, 상기 면역글로불린 분자는 단클론성 항체이다. 일 실시양태에서, 상기 면역글로불린 분자는 항원에 특이적으로 결합할 수 없다. 일 실시양태에서, 상기 면역글로불린 분자는 인간 Vh3-23 생식세포 서열을 기반으로 하는 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 면역글로불린 분자는 서열번호 9의 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 면역글로불린 분자는 인간 Vk3-20 생식세포 서열을 기반으로 하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 면역글로불린 분자는 서열번호 11의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 보다 더 특정한 실시양태에서, 상기 면역글로불린 분자는 서열번호 9의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 11의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 면역글로불린 분자는 항원에 특이적으로 결합할 수 없으며, 인간 Vh3-23 생식세포 서열을 기반으로 하는 중쇄 가변 영역 서열 및 인간 Vk3-20 생식세포 서열을 기반으로 하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일 실시양태에서, 상기 면역글로불린 분자는 변형이 없는 상응하는 면역글루불린 분자와 비교하여 Fc 수용체에 대한 면역글로불린 분자의 결합 친화도를 감소시키는 변형을 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 Fc 수용체는 Fcγ 수용체, 특히 인간 Fcγ 수용체이다. 일 실시양태에서, 상기 Fc 수용체는 활성화 Fc 수용체이다. 일 실시양태에서, 상기 Fc 수용체는 FcγRIIIa(CD16a), FcγRI(CD64), FcγRIIa(CD32) 및 FcαRI(CD89)의 군에서 선택된다. 특정한 실시양태에서, 상기 Fc 수용체는 FcγIIIa, 특히 인간 FcγIIIa이다. 일 실시양태에서, 상기 변형은 면역글로불린 분자의 효과기 기능을 감소시킨다. 특정 실시양태에서, 상기 효과기 기능은 항체 의존적 세포-매개 세포독성(ADCC)이다. 일 실시양태에서, 상기 변형은 상기 면역글로불린 분자의 Fc 영역, 특히 CH2 영역에 존재한다. 일 실시양태에서, 상기 면역글로불린 분자는 면역글로불린 중쇄의 위치 329(EU 넘버링)에 아미노산 치환을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 아미노산 치환은 P329G이다. 일 실시양태에서, 상기 면역글로불린 분자는 면역글로불린 중쇄의 위치 234 및 235(EU 넘버링)에 아미노산 치환을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 아미노산 치환은 L234A 및 L235A(LALA)이다. 일 실시양태에서, 상기 면역글로불린 분자는 면역글로불린 중쇄의 위치 234, 235 및 329(EU 넘버링)에 아미노산 치환을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 면역글로불린 분자는 면역글로불린 중쇄에 아미노산 치환 L234A, L235A 및 P329G(EU 넘버링)를 포함한다.
일 실시양태에서, 상기 돌연변이체 IL-2 분자는 인간 IL-2의 잔기 88에 상응하는 위치(서열번호 1)에서 아미노산 돌연변이를 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이다. 특정한 실시양태에서, 상기 아미노산 치환은 N88D이다. 일 실시양태에서, 상기 IL-2 분자는 천연 그대로의 IL-2에 비해 IL-2 수용체에 대한 상기 IL-2 분자의 결합 친화도를 변경하지 않는 아미노산 돌연변이를 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 IL-2 분자는 인간 IL-2의 잔기 125에 상응하는 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함한다. 보다 특정한 실시양태에서, 상기 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환 C125A이다. 일 실시양태에서, 상기 돌연변이체 IL-2 분자는 인간 IL-2의 잔기 3에 상응하는 위치에서 IL-2의 O-글리코실화 부위를 제거하는 아미노산 돌연변이를 포함한다. 일 실시양태에서, 인간 IL-2의 잔기 3에 상응하는 위치에서 IL-2의 O-글리코실화 부위를 제거하는 아미노산 돌연변이는 T3A, T3G, T3Q, T3E, T3N, T3D, T3R, T3L 및 T3P로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 치환이다. 특정한 실시양태에서, 인간 IL-2의 잔기 3에 상응하는 위치에서 IL-2의 O-글리코실화 부위를 제거하는 상기 아미노산 돌연변이는 T3A이다. 일 실시양태에서, 상기 돌연변이체 IL-2 분자는 인간 IL-2 분자이다. 특정 실시양태에서, 상기 돌연변이체 IL-2 분자는 서열번호 58, 서열번호 60, 서열번호 62 및 서열번호 64의 군에서 선택된 서열, 특히 서열번호 58의 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 돌연변이체 IL-2 분자는 서열번호 58, 서열번호 60, 서열번호 62 및 서열번호 64의 군에서 선택된 서열, 특히 서열번호 58의 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 돌연변이체 IL-2 분자는 각각 그의 N-말단 아미노산에서, 임의적으로 펩티드 연결기를 통해, 상기 면역글로불린 분자의 면역글로불린 중쇄 중 하나의 C-말단 아미노산에 융합된다. 일 실시양태에서, 상기 돌연변이체 IL-2 분자는 각각 펩티드 연결기를 통해 상기 면역글로불린 분자에 융합된다. 일 실시양태에서, 상기 펩티드 연결기는 10개 이상, 특히 15개 이상의 아미노산을 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 펩티드 연결기는 아미노산 서열(G4S)3(서열번호 66)을 포함한다.
특정 실시양태에서, 상기 융합 단백질은 서열번호 19 및 서열번호 50의 폴리펩티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 융합 단백질은 서열번호 19의 면역글로불린 경쇄 및 서열번호 50의 면역글로불린 중쇄-IL-2 융합 폴리펩티드를 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 융합 단백질은 본질적으로 면역글로불린 분자, 야생형 IL-2 분자에 비해 중간 친화도 IL-2 수용체에 대한 돌연변이체 IL-2 분자의 친화도를 감소시키는 아미노산 돌연변이를 포함하는 2개의 돌연변이체 인터류킨-2(IL-2) 분자, 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 연결기로 이루어진다. 일 실시양태에서, 상기 융합 단백질은 본질적으로 서열번호 19의 2개의 면역글로불린 경쇄 및 서열번호 50의 2개의 면역글로불린 중쇄-IL-2 융합 폴리펩티드로 이루어진다.
일 실시양태에서, 상기 융합 단백질은 선택적으로 조절 T 세포를 활성화시킨다. 일 실시양태에서, 상기 융합 단백질은 선택적으로 효과기 T 세포 상에서, 특히 통상의 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포 상에서 조절 T 세포를 활성화시킨다. 일 실시양태에서, 상기 융합 단백질은 선택적으로 통상의 CD4+ 기억 T 세포 상에서 조절 T 세포를 활성화시킨다. 일 실시양태에서, 상기 융합 단백질은 통상의 CD4+ 기억 T 세포보다 10배 이상, 100배 이상, 또는 1000배 이상 조절 T 세포를 활성화시킨다. 일 실시양태에서, 상기 활성화는 세포내 STAT, 특히 STAT5, 인산화 수준을 측정하여 결정된다. 일 실시양태에서, 상기 세포내 STAT 인산화 수준의 측정은 유동 세포측정 분석에 의해 수행된다.
본 발명은 또한 본 발명의 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 특히 발현 벡터가 제공된다. 또 다른 양상에서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 본 발명은 또한, (i) 본 발명의 숙주 세포를 융합 단백질의 발현에 적합한 조건하에서 배양하는 단계, 및 (ii) 융합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명의 융합 단백질의 생성 방법을 제공한다. 또한, 상기 방법에 의해 생성된, (i) 면역글로불린 분자, 및 (ii) 야생형 IL-2 분자에 비해 중간 친화도 IL-2 수용체에 대한 돌연변이체 IL-분자의 친화도를 감소시키는 아미노산 돌연변이를 포함하는 2개의 인터류킨-2(IL-2) 분자를 포함하는 융합 단백질이 제공된다.
일 양상에서, 본 발명은 본 발명의 융합 단백질 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 약제로 사용하고, 자가면역 질환, 특히 제 1형 당뇨병, 다발성 경화증(MS), 전신 홍반성 루푸스(SLE), 염증성 장 질환, 크론병 또는 궤양성 대장염, 가장 특히 제 1형 당뇨병, 또는 이식편-대-숙주 질환 또는 이식 거부의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 본 발명의 융합 단백질 또는 약학 조성물이 또한 제공된다. 질환의 치료를 필요로 하는 개체에서 질환의 치료용 약제를 제조하기 위한 본 발명의 융합 단백질의 용도, 및 약학적으로 허용되는 형태의 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 조성물을 치료 효과량으로 상기 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 질환을 치료하는 방법이 또한 제공된다. 일 실시양태에서, 상기 질환은 자가면역 질환이다. 보다 특정한 실시양태에서, 상기 자가면역 질환은 제 1형 당뇨병, 다발성 경화증(MS), 전신 홍반성 루푸스(SLE), 염증성 장 질환, 크론병 또는 궤양성 대장염이다. 보다 더 특정한 실시양태에서, 상기 자가면역 질환은 제 1형 당뇨병이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 질환은 이식 거부 또는 이식편-대-숙주 질환이다. 일 실시양태에서, 상기 개체는 포유동물, 특히 인간이다.
시험관내 또는 생체내 조절 T 세포의 선택적 활성화에 사용하기 위한 본 발명의 융합 단백질이 추가로 제공된다. 일 실시양태에서, 상기 활성화는 조절 T 세포의 증식 유도 및/또는 조절 T 세포에서 IL-2 수용체 신호전달의 유도, 특히 STAT5의 인산화를 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 용도는 시험관내 용도이며, 상기 융합 단백질은 약 10 ng/ml 이하, 특히 약 1 ng/ml 이하의 농도에서 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 상기 용도는 생체내 용도이며, 상기 융합 단백질은 약 100 ㎍/kg 체중 이하, 특히 약 25 ㎍/kg 체중 이하, 보다 특히 약 10 ㎍/kg 체중 이하의 용량으로 사용된다.
본 발명은 또한 조절 T 세포를 본 발명의 융합 단백질과 접촉시키는 것을 포함하는, 시험관내 또는 생체내 조절 T 세포의 선택적 활성화 방법을 제공한다. 일 실시양태에서, 상기 활성화는 조절 T 세포의 증식 유도 및/또는 조절 T 세포에서 IL-2 수용체 신호전달, 특히 STAT5의 인산화의 유도를 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 방법은 시험관내 방법이며, 상기 융합 단백질은 약 10 ng/ml 이하, 특히 약 1 ng/ml 이하의 농도에서 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 상기 방법은 생체내 방법이며, 상기 융합 단백질은 약 100 ㎍/kg 체중 이하, 특히 약 25 ㎍/kg 체중 이하, 보다 특히 약 10 ㎍/kg 체중 이하의 용량으로 사용된다.
도 1. DP47GS IgG-IL-2 융합 단백질(서열번호 13, 15, 19 참조)의 정제. (A) 단백질 A 친화 크로마토그래피 단계의 용출 프로필. (B) 크기 배제 크로마토그래피 단계의 용출 프로필. 수율 4 mg/L. (C) 최종 생성물의 분석용 모세관 전기영동 SDS(칼리퍼(Caliper)). 하기의 밴드가 관찰되었다: 비환원 - 111 kDa에서 7.5% 면적, 174 kDa에서 92.5% 면적; 환원 - 29 kDa에서 23.6% 면적, 67 kDa에서 23.5% 면적, 82 kDa에서 52.9% 면적. 생성물은 약 7.5%의 "반(half) IgG"를 함유한다. (D) TSK겔 G3000 SW XL 컬럼 상에서 최종 생성물의 분석용 크기 배제 크로마토그래피(91% 단량체 함량).
도 2. DP47GS IgG-(IL-2)2 융합 단백질(서열번호 17, 19 참조)의 정제. (A) 단백질 A 친화 크로마토그래피 단계의 용출 프로필. (B) 크기 배제 크로마토그래피 단계의 용출 프로필. 수율 13 mg/L. (C) 최종 생성물의 분석용 모세관 전기영동 SDS(칼리퍼). 하기의 밴드가 관찰되었다: 비환원 - 172.5 kDa에서 2.3% 면적, 185 kDa에서 97.7% 면적; 환원 - 27.3 kDa에서 18.3% 면적, 29.2 kDa에서 0.6% 면적, 78.3 kDa에서 81.1% 면적. (D) 슈퍼덱스(Superdex) 200 컬럼 상에서 최종 생성물의 분석용 크기 배제 크로마토그래피(100% 단량체 함량).
도 3. DP47GS IgG-IL-2 N88D 융합 단백질(서열번호 15, 19, 48 참조)의 정제. (A) 단백질 A 친화 크로마토그래피 단계의 용출 프로필. (B) 크기 배제 크로마토그래피 단계의 용출 프로필. 수율 23.7 mg/L. 수집된 분획을 구획하였다. (C) 최종 생성물의 분석용 모세관 전기영동 SDS(칼리퍼). 하기의 주요 밴드가 관찰되었다: 비환원 - 167.0 kDa에서 100% 면적; 환원 - 28.6 kDa에서 31.5% 면적, 63.5 kDa에서 31.7% 면적, 77.5 kDa에서 35.3% 면적. (D) TSK겔 G3000 SW XL 컬럼 상에서 최종 생성물의 분석용 크기 배제 크로마토그래피(97.3% 단량체 함량).
도 4. DP47GS IgG-(IL-2 N88D)2 융합 단백질(서열번호 19 및 50 참조)의 정제. (A) 단백질 A 친화 크로마토그래피 단계의 용출 프로필. (B) 크기 배제 크로마토그래피 단계의 용출 프로필. 수율 32.9 mg/L. 수집된 분획을 구획하였다. (C) 최종 생성물의 분석용 모세관 전기영동 SDS(칼리퍼). 하기의 주요 밴드가 관찰되었다: 비환원 - 180.4 kDa에서 20.7% 면적, 184.0 kDa에서 78.0% 면적; 환원 - 27.3 kDa에서 16.2% 면적, 76.0 kDa에서 82.7% 면적. (D) TSK겔 G3000 SW XL 컬럼 상에서 최종 생성물의 분석용 크기 배제 크로마토그래피(98.3% 단량체 함량).
도 5. DP47GS IgG-(IL-2 E95A)2 융합 단백질(서열번호 19 및 52 참조)의 정제. (A) 단백질 A 친화 크로마토그래피 단계의 용출 프로필. (B) 크기 배제 크로마토그래피 단계의 용출 프로필. 수율 8.0 mg/L. 수집된 분획을 구획하였다. (C) 최종 생성물의 분석용 모세관 전기영동 SDS(칼리퍼). 하기의 주요 밴드가 관찰되었다: 비환원 - 166.0 kDa에서 10.3% 면적, 175.5 kDa에서 61.4% 면적, 181.2 kDa에서 28.2% 면적; 환원 - 26.1 kDa에서 16.0% 면적, 75.0 kDa에서 83.1% 면적. (D) TSK겔 G3000 SW XL 컬럼 상에서 최종 생성물의 분석용 크기 배제 크로마토그래피(100% 단량체 함량).
도 6. CD4+ Treg 아형, NK 세포 아형 및 NKT 세포에서의 CD25(IL-2RA) 및 CD122(IL-2RB) 발현. CD4+ Treg 아형, NKT 세포 및 NK 세포를 규정하기 위해 세포 표면 마커를 사용하였다. CD25 및 CD122에 대한 염색을 최적화하기 위해, 세포내 FOXP3 염색을 수행하지 않았다. (A,B) 3개의 조절 CD4+ T 세포(Treg) 집단: 미접촉(naive)(CD45RA+, CD25+; 점선), 기억(CD45RA_, CD25+; 실선) 및 활성화(CD45RA_, CD25hi; 파선). (C,D) NKT(점선), CD56bright NK 세포(파선), CD56intermediate NK 세포(실선). 회색: 이소타입(isotype) 대조군(IC).
도 7. 통상의 CD4+ 및 CD8+ T 세포 아형에서의 CD25(IL-2RA) 및 CD122(IL-2RB) 발현. 통상의 미접촉(CD45RA+; 점선) 및 기억(CD45RA_: 실선) CD4+ T 세포(A,B), 통상의 기억 CD8+ T 세포(CD45RA_; 실선) 및 CD45RA+ CD8 T 세포(미접촉 및 TEMRA 아형의 조합; TEMRA는 CD45RA를 발현하도록 복귀된 효과기 기억 세포를 말한다; 점선)(C,D)를 규정하기 위해 세포 표면 마커를 사용하였다. 회색: 이소타입 대조군(IC).
도 8. 인간 말초혈 세포 아형에서 DP47GS IgG-IL-2에 반응하여 pSTAT5a의 유도. 3명의 상이한 인간 기증자(C4 내지 C6)를 STAT5a 인산화의 유도시 다양한 용량의 DP47GS IgG-IL-2의 효과에 대해 별개 시점에서 평가하였다. 결과는 CD4+ Treg 아형: 활성화, 기억 및 미접촉 Treg; 통상의 CD4+ 기억 T 효과기 세포; CD56bright NK 세포; CD8+ 기억 T 효과기 세포; CD4+ 미접촉 T 효과기 세포; NK 세포; NKT 세포; 및 CD8+ 미접촉 T 효과기 + CD45RA+ 기억 세포에 대해 나타내었다.
도 9. 인간 말초혈 세포 아형에서 DP47GS IgG-(IL-2)2에 반응하여 pSTAT5a의 유도. 5명의 상이한 인간 기증자(N1, N2, C4 내지 C6)를 STAT5a 인산화의 유도시 다양한 용량의 DP47GS IgG-(IL-2)2 면역접합물의 효과에 대해 별개 시점에서 평가하였다. 결과는 CD4+ Treg 아형: 활성화, 기억 및 미접촉 Treg; 통상의 CD4+ 기억 T 효과기 세포; CD56bright NK 세포; CD8+ 기억 T 효과기 세포; CD4+ 미접촉 T 효과기 세포; NK 세포; NKT 세포; 및 CD8+ 미접촉 T 효과기 + CD45RA+ 기억 세포에 대해 나타내었다.
도 10. 인간 말초혈 세포 아형에서 pSTAT5a의 유도: DP47GS IgG-IL-2 및 DP47GS IgG-(IL-2)2의 비교. 각각의 세포 아형에 대한 결과는 각각의 아형으로부터 관찰된 최대 효과로 표준화되고, Treg에 대한 적절한 EC50을 표 2에 나타내었다. (A) DP47GS IgG-IL-2에 대해 표준화된 결과, (B) DP47GS IgG-(IL-2)2에 대해 표준화된 결과.
도 11. 3명의 기증자에서 DP47GS IgG-IL-2와 DP47GS IgG-(IL-2)2를 비교하는, Treg 아형 민감성의 상세한 시험. 그래프는 3명의 기증자에 대한 pSTAT5a MFI의 평균±SD를 나타낸다. (A) 총 CD3+CD4+FoxP3+ Treg. (B) 활성화 Treg. (C) 기억 Treg. (D) 미접촉 Treg.
도 12. 인간 말초혈 세포 아형에서 DP47GS IgG-(IL-2E95A)2에 반응하여 pSTAT5a의 유도. 3명의 상이한 인간 기증자(C4 내지 C6)를 STAT5a 인산화 유도시 다양한 용량의 DP47GS IgG-(IL-2E95A)2의 효과에 대해 별개 시점에서 평가하였다. 결과는 CD4+ Treg 아형: 활성화, 기억 및 미접촉 Treg; 통상의 CD4+ 기억 T 효과기 세포; CD56bright NK 세포; CD8+ 기억 T 효과기 세포; CD4+ 미접촉 T 효과기 세포; NK 세포; NKT 세포; 및 CD8+CD45RA+ 미접촉 T 효과기 세포에 대해 나타내었다.
도 13. 인간 말초혈 세포 아형에서 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2에 반응하여 pSTAT5a의 유도. 5명의 상이한 인간 기증자(C4, C5, C6, N1, N2)를 STAT5a 인산화의 유도시 다양한 용량의 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2의 효과에 대해 별개 시점에서 평가하였다. 결과는 CD4+ Treg 아형: 활성화, 기억 및 미접촉 Treg; 통상의 CD4+ 기억 T 효과기 세포; CD56bright NK 세포; CD8+ 기억 T 효과기 세포; CD4+ 미접촉 T 효과기 세포; NK 세포; NKT 세포; 및 CD8+CD45RA+ 미접촉 T 효과기 세포에 대해 나타내었다.
도 14. 인간 말초혈 세포 아형에서 pSTAT5a의 유도: DP47GS IgG-IL-2, DP47GS IgG-(IL-2)2, DP47GS IgG-(IL-2E95A)2, DP47GS IgG-(IL-2 N88D)2, 및 DP47GS IgG-IL-2N88D의 비교. 결과는 CD4+ Treg 아형(A 내지 C): 활성화(A), 기억(C) 및 미접촉(B) Treg; 통상의 CD4+ 기억 T 효과기 세포(D); CD56bright NK 세포(E)에 대해 나타내었다.
도 15. 인간 말초혈 세포 아형에서 P47GS IgG-(IL-2N88D)2 및 DP47GS IgG-(IL-2)2 둘 다에 반응하여 pSTAT5a의 유도. 10명의 상이한 인간 기증자를 STAT5a 인산화의 유도시 넓은 용량 범위(≥ 6 로그)의 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 및 DP47GS IgG-(IL-2)2의 효과에 대해 별도의 일에 평가하였다. 결과는 하기 세포 아형에 대해 나타내었다: (A) 기억 Treg, (B) 미접촉 Treg, (C) CD56bright NK 세포, (D) 총 NK 세포, (E) 중추 기억 CD4+ T 세포, (F) 효과기 기억 CD4+ T 세포, (G) 미접촉 CD4+ T 세포, (H) 중추 기억 CD8+ T 세포, (I) 효과기 기억 CD8+ T 세포, (J) 미접촉 CD8+ T 세포, (K) Temra[Teff 기억 RA+] CD8+ T 세포, (L) NKT 세포, 및 (M) CD3+CD4-CD8-CD56- T 세포. 모든 결과는 평균±SEM으로 나타내었다(n = 10명의 기증자).
도 16. 인간 NK 세포 및 CD8+ T 세포에서 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 및 DP47GS IgG-(IL-2)2의 시험관내 효과의 비교. 정상 인간 기증자(n=10)의 PBMC를 50 ng/ml의 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2(개방 원) 또는 DP47GS IgG-(IL-2)2(회색 원)와 함께 5 x 106 세포/U-바닥 웰로 6일(이는 세포 수가 유동 세포측정기에 의해 정량화되는 시간) 동안 배양하였다. NK 세포의 효과를 CD56dim 및 CD56bright NK 세포 상에서 정량화하였다(A). CD8+ T 세포의 효과를 (B)에 나타내었다. 결과는 중간값±사분위수 범위로 나타내었고, 통계적 차이는 만-휘트니(Mann-Whitney) U 검정을 사용하여 측정하였다.
도 17. CD34+ 줄기 세포 인간화된 마우스에서 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 및 DP47GS IgG-(IL-2)2의 생체내 효과의 비교. CD34+ 줄기 세포를 이식하고 10 내지 12주 후, 마우스를 비히클(DP47GS IgG, IL-2 없음), DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 또는 DP47GS IgG-(IL-2)2로 1주에 2회 처리하였다. 혈액에서 인간 Treg 및 NK 세포의 최대 증가는 3회 처리 후 보여졌고, 결과는 (A) Treg, 및 (B) NK 세포에 대하여 나타내었다. 결과는 중간값±사분위수 범위로 나타내었다; 비히클(n=21), IgG-(IL-2N88D)2(n=22) 및 IgG-(IL-2)2(n=24).
도 18. CD34+ 줄기 세포 인간화된 마우스의 생존에 대한 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 및 DP47GS IgG-(IL-2)2의 생체내 효과의 비교. CD34+ 줄기 세포를 이식하고 10 내지 12주 후, 마우스를 인간 이종이식 대 숙주 반응의 심각도가 연구시 이의 제거를 필요로 하는 소정된 단계(≥ 15% 중량 손실)에 도달할 때까지 비히클(DP47GS IgG, IL-2 없음), DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 또는 DP47GS IgG-(IL-2)2로 1주에 2회 처리하였다. 결과는 비히클(n=7), DP47GS IgG-(IL-2N88D)2(n=12) 및 DP47GS IgG-(IL-2)2(n=13)에 대하여 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism)으로부터의 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존 곡선으로 플로팅하였다.
도 19. CD34+ 줄기 세포 인간화된 마우스의 Treg, NK 세포 및 CD8+ T 세포에서 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 및 DP47GS IgG-(IL-2)2 생체내 효과의 비교. CD34+ 줄기 세포를 이식하고 10 내지 12주 후, 마우스를 인간 이종 이식 대 숙주 반응이 개별 인간 세포 아형에 대하여 혈액을 평가하는 시점에서 연구로부터 이의 제거를 필요로 하는 소정된 단계(≥ 15% 중량 손질)에 도달할 때까지 비히클(DP47GS IgG, IL-2 없음), DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 또는 DP47GS IgG-(IL-2)2로 1주에 2회 처리하였다. 혈액 중 인간 Treg, NK 세포 및 CD8+ 세포는 인간 CD45+ 세포의 %로서 나타내었다. 결과는 평균±SEM으로 나타내었다: 비히클(n=6), DP47GS IgG-(IL-2N88D)2(n=9) 또는 DP47GS IgG-(IL-2)2(n=9).
도 20. 시노몰구스 원숭이 혈액에서 P47GS IgG-(IL-2)2 및 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2에 반응하여 Treg pSTAT5a의 유도. 3명의 정상적인 건강한 기증자(C1 내지 C3)를 Treg에서 STAT5a 인산화의 유도시 최대 용량(20 ng/mL)의 DP47GS IgG-(IL-2)2 및 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2의 효과에 대하여 동시에 평가하였다. (A) CD4+CD25+ Treg 아형을 확인하기 위해 사용된 FOXP3(y-축) 및 CD45RA(x-축)의 유동 세포계측 게이팅 전략: 미접촉 Treg(CD45RA+ FOXP3+), 기억 Treg(CD45RA-FOXP3+), 및 활성화(CD45RA-FOXP3hi). (B) 자극 전 Treg 아형에서 CD25+ 세포 표면 염색의 발현. (C) CD4+CD25+ Treg 아형에 대한 pSTAT5a 반응: 3 마리 시노몰구스 원숭이(C1 내지 C3) 각각에 대한 활성화, 기억 및 미접촉.
도 21. 시노몰구스 혈액에서 DP47GS IgG-(IL-2)2 또는 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2에 대한 통상의 CD4+ 기억 T 효과기 세포 pSTAT5a의 활성화. 도 11에 예시된 3 마리 원숭이 기증자로부터의 동일한 20 ng/mL 자극된 혈액 샘플을 사용하여, 통상의 CD4+ 기억 T 효과기 세포에서 pSTAT5a의 유도를 입증하였다. (A) y-축에서 CD45RA 및 x-축에서 CD25를 갖는 통상의 CD4+FOXP3-CD45RA- 기억 T 효과기 세포를 확인하기 위해 사용된 유동 세포계측 게이팅 전략. (B) 총 CD4+FOXP3-CD45RA- 기억 T 효과기 세포에 대한 pSTAT5a 반응. (C) 또한 CD25-인 기억 T 효과기 세포에 대한 pSTAT5a 반응. (D) 또한 CD25+인 기억 T 효과기 세포에 대한 pSTAT5a 반응.
도 22. 시노몰구스 말초혈 T 세포 아형에서 DP47GS IgG-(IL-2)2 및 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2에 반응하여 pSTAT5a의 유도. 2명의 건강한 성인 기증자를 STAT5a 인산화의 유도시 DP47GS IgG-(IL-2)2 및 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2의 용량 변화(0.03 내지 300 ng/mL)의 효과를 평가하였다. 결과는 CD4+ Treg 아형(A 내지 C)에 대하여 나타내었다: 활성화(A), 기억(C), 및 미접촉(B) Treg 및 통상의 CD4+ 기억 T 효과기 세포(D). 유사한 결과를 원숭이, 및 DP47GS IgG-(IL-2)2 및 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2의 효과를 예시하기 위해 나타낸 1명의 기증자로부터의 결과 둘 다에 대하여 수득하였다.
도 23. 마우스에서, DP47GS IgG-IL-2는 DP47GS IgG-(IL-2)2와 비교하여 뛰어난 약동학(PK) 특성을 갖는 반면, DP47GS IgG-(IL-2N88D)2는 중간이다. (A) NOD 및 NOD.scid 마우스에 0.3 mg/kg의 DP47GS IgG-IL-2 또는 0.3 mg/kg의 DP47GS IgG-(IL-2)2를 정맥내(i.v.) 주사하였다. (B) NOD.scid.IL2Rγ - /- 마우스에 0.1 mg/kg의 DP47GS IgG-IL-2, 0.3 mg/kg의 DP47GS IgG-(IL-2)2 또는 0.1 mg/kg의 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2를 i.v. 주사하였다. 인간 IL-2를 혈청 샘플 중에서 mAb-기재 포획 분석에 의해 나타낸 시간에 평가하였다.
도 24. CD25 및 FoxP3 둘 다는 뮤린 Treg에서 프로류킨(등록상표), DP47GS IgG-IL-2, DP47GS IgG-(IL-2)2 및 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2로 처리 후 증가한다. BALB/c 마우스를 프로류킨(등록상표)(20,000 및 100,000 IU/마우스, n=3), DP47GS IgG-IL-2, DP47GS IgG-(IL-2)2, 또는 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2(60, 300 또는 1,500 IU/마우스, n=3)로 처리하고, 비히클 처리된 마우스를 자극되지 않은 대조군(n=4)으로서 포함하였다. 처리 24 시간 후, 비장 Treg를 CD25 및 FOXP3 수준에 대하여 평가하였다. (A) 세포 표면 CD25에서 약물 의존적 변화, 및 (B) 세포내 FoxP3에서 약물 의존적 변화를 모든 4개의 IL-2 분자에서 관찰하였다. 데이타는 평균±SD로서 나타내고, 흑색 막대는 사용된 최고 용량을 나타내고 연회색 막대는 최저 용량을 나타낸다.
도 25. DP47GS IgG-IL-2 및 DP47GS IgG-(IL-2)2의 PK 특성을 정상적인 건강한 성인 생물학-미접촉 시노몰구스 원숭이에서 평가하였다. (A) DP47GS IgG-IL-2를 10, 25 및 100 ㎍/kg(용량당 n=2)의 용량으로 짧은 볼루스로서 정맥내(i.v.) 주사하였다. (B) DP47GS IgG-(IL-2)2를 10 및 25 ㎍/kg(용량당 n=2)의 용량으로 짧은 볼루스로서 i.v. 주사하였다. 인간 IL-2를 혈청 샘플 중에서 mAb-기재 포획 분석에 의해 나타낸 시간에 평가하였다.
도 26. DP47GS IgG-IL2는 시노몰구스 원숭이에서 조절 T 세포를 증가시키는 용량 의존적 효과를 갖는다. 처리 7일후 전혈 CD4+ CD25+ FOXP3+ 조절 T 세포(Treg)의 변화를 (A) 전혈 mm3 당 Treg의 절대 세포수, 및 (B) Treg의 배수 변화로 나타내었다. 모든 데이터는 평균±SD로 나타낸다. 개방된 막대: DP47GS IgG-IL-2(n=6); 짙은색 막대: 비히클(n=3).
도 27. 시노몰구스 원숭이에서 Treg에 대한 DP47GS IgG-IL-2의 시간 및 저-용량 효과. (A) 2 또는 6 ㎍/kg DP47GS IgG-IL-2(각각 n=4 및 6)의 투여 후 Treg 배수 증가에서의 시간 의존적 변화. (B) 2 또는 6 ㎍/kg DP47GS IgG-IL-2(각각 n=4 및 6)의 투여 후 혈중 Treg 절대 수에서의 시간 의존적 변화. 모든 데이터는 평균±SD로 나타낸다.
도 28. 단일 용량 프로류킨은 시노몰구스 원숭이에서 일시적인 용량 의존적 Treg 반응을 자극한다. (A) 3 x 104 내지 3 x 105 IU/kg 프로류킨으로 단일 용량 처리 후 말초혈 Treg 수의 변화. (B) 3 x 104 내지 3 x 105 IU/kg 프로류킨으로 단일 용량 처리 후 Treg pSTAT5a의 변화. 데이터는 평균±SD로 나타낸다.
도 29. 저-용량 DP47GS IgG-IL-2는 시노몰구스 원숭이에서 Treg 유도에 있어 고-용량 프로류킨보다 더 효과적이다. 정상적인 건강한 시노몰구스 원숭이(n=5의 군)를 저-용량 DP47GS IgG-IL-2 또는 고-용량 프로류킨으로 처리하고, 조절 T 세포에서의 변화를 10일에 시험하였다. 0일 및 7일에, DP47GS IgG-IL-2를 16,800 IU/kg(12 ㎍/kg)의 용량으로 SC 투여하였다. 프로류킨 처리(200,000 IU/kg)를 총 5개 용량에 대해 매주 3회 SC 투여하였다(MWF). 결과는 (A) 혈액 mm3당 총 Treg의 변화, (B) Treg의 배수 증가, 및 (C) Treg 대 통상의 CD4+ FOXP3- 세포 비의 변화에 대해 평균±SD로 나타내었다. 개방된 막대는 IL-2 처리를 나타내고, 짙은색 막대는 비히클 대조군을 나타낸다.
도 30. 생체내 DP47GS IgG-IL-2 Treg 활성화에 대한 민감성 바이오마커로서 생체외 전혈 인산화된 STAT5. 건강한 시노몰구스 원숭이(n=5)에게 단일 저-용량의 DP47GS IgG-IL-2(12 ㎍/kg)를 생체내 투여하고 1일 및 3일 후, 전혈을 수집하고, 자극없이 인산화 STAT5(pSTAT5a)에 대해 즉시 시험하였다. 각각의 원숭이들을 처리 전 0일에 채혈하고, pSTAT5a의 양을 측정하고(짙은색 막대) 처리 후 배수 변화(개방된 막대)를 평가하기 위해 개별적으로 사용하였다. (A) 1일 및 3일에 Treg pSTAT5a의 배수 변화, (B) 통상의 CD4+ CD45- 기억 T 세포에서 pSTAT5a의 배수변화, 및 (C) 미접촉 T 세포 pSTAT5a의 배수 변화를 나타내었다. 데이터는 평균±SD로 나타낸다.
도 31. 생체내 저-용량 DP47GS IgG-IL-2 Treg 활성화에 대한 민감성 바이오마커로서 생체외 전혈 pSTAT5a. 건강한 시노몰구스 원숭이에게 단일 저-용량의 DP47GS IgG-IL-2를 생체내 투여 1일 내지 7일 후, 전혈을 수집하고, 자극없이 pSTAT5a에 대해 즉시 시험하였다. 각각의 원숭이들을 비자극 수준의 pSTAT5a에 대한 처리 전 0일에 채혈하고, 처리 후 pSTAT5a의 변화를 비교하였다. (A) 2 ㎍/kg의 DP47GS IgG-IL-2로 처리 전 및 처리 후 Treg pSTAT5a(n=4). (B) 6 ㎍/kg의 DP47GS IgG-IL-2로 처리 전 및 처리 후 Treg pSTAT5a(n=6). 데이터는 평균±SD로 나타낸다.
도 32. 생체외 시노몰구스 전혈 Ki-67은 생체내 DP47GS IgG-IL-2 유도된 T 세포 증식에 대한 마커로 제공된다. 도 14에서 기술된 바와 같이 2 및 6 ㎍/kg의 DP47GS IgG-IL-2로 처리된 시노몰구스 원숭이는 또한 생체내 증식 정도를 평가하기 위해 세포내 마커 Ki-67의 변화에 대해 생체외 모니터링하였다. 세포 주기중 세포(Ki-67+)의 정상적인 정지 상태 %를 처리 전 0일에 정량화한 후, 다음 7일 내지 11일 동안 매일 모니터링하였다. (A) Treg에 대한 % Ki-67+, (B) 통상의 CD4+CD45- 기억/효과기 T 세포에 대한 % Ki-67+, 및 (C) 미접촉 CD4+CD45RA+ T 세포에 대한 % Ki-67+를 나타내었다. 데이터는 평균±SD로 나타낸다.
도 33. 미접촉 건강한 시노몰구스 원숭이에서 Treg에 대한 DP47GS IgG-(IL-2)2의 시간 및 저-용량 효과. (A) 6 ㎍/kg DP47 IgG-(IL-2)2 투여 후 Treg 절대 수에서의 시간 의존적 변화, (B) 처리 후 Treg pSTAT5a에서의 시간 의존적 변화, (C) Treg의 배수 증가에서의 시간 의존적 변화, 및 (D) DP47Gs IgG-IL-2 처리된 원숭이(개방된 막대, 2 내지 36 ㎍/kg) 대 DP47GS IgG-(IL-2)2 처리된 원숭이(짙은색 막대, 6 ㎍/kg)로부터의 Treg에서의 배수 변화의 비교. 모든 데이터는 평균±SD로 나타낸다(n=4 내지 6).
도 34. 건강한 미접촉 시노몰구스 원숭이에서 Treg에 대한 매우 저-용량 DP47GS IgG-(IL-2)2의 시간 및 용량 의존적 효과. (A) 0.7 및 2 ㎍/kg DP47GS IgG-(IL-2)2의 투여 후 Treg 배수 증가에서의 시간 의존적 변화, (B) 처리 전 0일 및 처리 후 1일 내지 4일에 측정된 Treg pSTAT5a에서의 시간 의존적 변화, (C) Teff/mem 세포 pSTAT5a에서의 시간 의존적 변화. 모든 데이터는 평균±SD로 나타낸다(0.7 ㎍/kg에서 n=3 및 2 ㎍/kg에서 n=8).
도 35. DP47GS IgG-IL-2 대 DP47GS IgG-(IL-2)2의 용량 의존적 비교 및 전혈 시노몰구스 Treg를 증가시키는 그의 능력. 모든 데이터는 평균±SD로 나타낸다(n=3 내지 6).
도 36. 차세대 시퀀싱(NGS)을 사용하여 전사 인자 FOXP3 및 면역억제 분자 CTLA-4에 대한 T 세포 아형-특이적 DNA 탈메틸화를 분석하였다. 성인 생물학 미접촉 시노몰구스 원숭이로부터의 혈액을 최적 용량의 DP47GS IgG-IL-2(25 ㎍/kg, n=4) 및 DP47GS IgG-(IL-2)2(6 ㎍/kg, n=4)로 처리 전 및 처리 후 분석하였다. CD4+ T 세포 아형을 전혈 PBMC로부터 BD FACSAria로 분류하고, 아형당 100,000 개 세포를 유전자 특이적 DNA 탈메틸화를 위해 사용하였다. 유사한 결과를 두 처리에서 확인하였고, DP47GS IgG-(IL-2)2 처리된 원숭이로부터 데이타는 상부 패널에서 FOXP3에 대하여 및 하부 패널에서 CTLA-4에 대하여 나타내었다(n=4, 평균±SD).
도 37. DP47GS IgG-(IL-2N88D)2의 PK 특성을 정상적인 건강한 생물 미접촉 시노몰구스 원숭이에서 평가하였다. (A) DP47GS IgG-(IL-2N88D)2를 30 및 100 ㎍/kg(용량당 n=2)의 용량으로 짧은 볼루스로 정맥내(i.v.) 주사하였다. (B) DP47GS IgG-(IL-2N88D)2를 30 및 100 ㎍/kg(용량당 n=2)의 용량으로 측면 등에 0.2 ml 피하(s.c.) 주사하였다. 인간 IL-2를 혈장 샘플에서 단클론 항체-기재 포획 분석으로 나타낸 시간에 평가하였다. (C) IL-2 노출의 바이오마커로서, 가용성 CD25를 30 및 100 ㎍/kg의 용량의 IgG-(IL-2N88D)2로 주사 후 혈장에서 측정하고; 시노몰구스 sCD25를 시노몰구스 sCD25와 교차 반응하는 것으로 공지된 인간 sCD25 mAb-기재 포획 분석으로 측정하였다. 결과는 평균±SEM으로 나타내었다(n=4).
도 38. 미접촉 건강한 시노몰구스 원숭이의 Treg에서 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2의 생체내 시간 및 용량 의존적 효과. (A) 100 ㎍/kg DP47 IgG-(IL-2N88D)2 또는 (B) 30 ㎍/kg DP47 IgG-(IL-2N88D)2로 주사 후 총 Treg, CD4+ 기억 Treg, CD4+ 미접촉 Treg 및 CD8+FOXP3+ Treg의 절대 수(x 106/ml 혈액)의 시간 의존적 변화. (C) 100 ㎍/kg DP47 IgG-(IL-2N88D)2 또는 (D) 30 ㎍/kg DP47 IgG-(IL-2N88D)2로 주사 후 총 Treg, CD4+ 기억 Treg, CD4+ 미접촉 Treg 및 CD8+FOXP3+ Treg에 대한 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 %의 Treg에서 시간 의존적 변화. 결과는 평균±SEM으로 나타내었다(n=4).
도 39. 건강한 미접촉 시노몰구스 원숭이의 림프구에서 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2의 생체내 시간 및 용량 의존적 효과. CD4+ 기억 T 효과기의 시간 의존적 변화를 100 ㎍/kg DP47 IgG-(IL-2N88D)2 또는 30 ㎍/kg DP47 IgG-(IL-2N88D)2로 주사 후 총 CD4+ T 세포의 %로 나타내었다(A). CD4+CD25hi 기억 T 효과기에서 시간 의존적 변화를 100 ㎍/kg DP47 IgG-(IL-2N88D)2 또는 30 ㎍/kg DP47 IgG-(IL-2N88D)2로 주사 후 CD4+ 기억 T 효과기의 %로 나타내었다(B). 결과는 평균±SEM으로 나타내었다(n=4).
도 40. 생체외 전혈 pSTAT5a는 생체내 IL-2 활성화에 대한 민감한 바이오마커이다. 단일 용량의 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2를 시노몰구스 원숭이에 생체내 투여하고 1일 내지 11일 후, 전혈을 수집하고 pSTAT5a에 대한 자극 없이 즉시 시험하였다. 각각의 원숭이를 pSTAT5a의 자극되지 않은 수준에 대하여 처리 전 0일에 채혈하고 pSTAT5a 처리 후 변화를 비교하였다. (A) 100 ㎍/kg의 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2(n=4)로 처리 전 및 처리 후 pSTAT5a(MFI, 최대 평균 형광 강도). (B) 30 ㎍/kg의 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2(n=4)로 처리 전 및 처리 후 pSTAT5a. 데이타는 나타낸 세포 아형에 대한 평균±SEM으로서 나타내었다.
도 41. 생체외 전혈 세포 표면 CD25 염색은 생체내 IL-2 활성화에 대하여 민감한 바이오마커이다. 단일 용량의 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2를 시노몰구스 원숭이에 생체내 투여하고 1일 내지 14일 후, 전혈을 수집하고 나타낸 세포 유형에서 표면 CD25에 대한 자극 없이 즉시 시험하였다. 각각의 원숭이를 CD25의 자극되지 않은 수준에 대하여 처리 전 0일에 채혈하고 CD25 처리 후 변화를 비교하였다. (A) 100 ㎍/kg의 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2(n=4)로 처리 전 및 처리 후 CD25 염색(최대 MFI, 평균 형광 강도). (B) 30 ㎍/kg의 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2(n=4)로 처리 전 및 처리 후 CD25 염색. 데이타는 나타낸 세포 아형에 대한 평균±SEM으로 나타낸다.
도 42. 생체외 전혈 세포내 Ki-67 염색은 생체내 IL-2 활성화 후 세포 증식에 대한 민감한 바이오마커이다. 단일 용량의 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2를 시노몰구스 원숭이에 생체내 투여하고 1일 내지 14일 후, 전혈을 수집하고 나타낸 세포 유형에서 세포내 Ki-67에 대한 자극 없이 즉시 시험하였다. 각각의 원숭이를 Ki-67+ 세포의 자극되지 않은 수준에 대한 처리 전 0일에 채혈하고, 처리 후 %Ki-67+ 세포에서 변화를 비교하였다. (A) 100 ㎍/kg의 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2(n=4)로 처리 전 및 처리 후 Ki-67 염색(%세포 Ki-67+). (B) 30 ㎍/kg의 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2(n=4)로 처리 전 및 처리 후 Ki-67(%세포 Ki-67+) 염색. 결과는 나타낸 세포 아형에 대하여 평균±SEM으로 나타내었다.
도 43. 시노몰구스 Treg에서 IL-2의 생체내 효과의 비교 요약. CD4+ T 세포의 %로서 총 Treg에서 최대 증가는 프로류킨, IgG-IL-2, IgG-(IL-2)2 및 IgG-(IL-2N88D)2에 대하여 나타내었고, 비교를 위해, 모든 생체내 용량을 pmole/kg으로 전환하였다. 프로류킨을 2주 동안 주당 3회(MWF) 제공하고, IL-2 융합 단백질을 단일 주사로서 투여하였다. 결과는 평균±SEM으로 나타내었다; 프로류킨(n=5), IgG-IL-2(n=6), IgG-(IL-2)2(n=6) 및 IgG-(IL-2N88D)2(n=4).
도 44. 고-용량 IL-2는 시노몰구스 원숭이에서 호산구증가증을 유도한다. 프로류킨 또는 IL-2의 면역접합물을 사용한 모든 시험에서 혈중 호산구 수의 변화를 모니터링하였다. 호산구증가증은 고-용량 프로류킨(2 x 105 IU/kg, 2주 동안 주당 3회) 또는 더 고-용량의 DP47GS IgG-IL-2로 처리하고 7일 내지 14일 후 검출되었지만 DP47GS IgG-(IL-2)2 또는 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2로 처리에서는 검출되지 않았다. 기준치 호산구 수는 IL-2의 용량에 대하여 "0"으로서 나타낸 개방 원이고, 야생형 IL-2 분자 시험을 위해 1회 및 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 시험을 위해 1회, 총 2회 수행하였다. 데이터는 평균±SD로 나타낸다.
도 45. DP47GS IgG-IL-2로 생체내 처리는 뮤린 양 적혈구 세포 지연형 과민증(DTH)을 억제한다. 모든 데이터는 비히클(100% 반응), IgG-IL-2(4,000 IU/마우스) 또는 양성 대조군으로서 마우스 CTLA-4-Ig(200 ㎍/마우스)로 처리된 개별 마우스에 대해 나타내었다. (A) NOD 마우스, 및 (B) C57BL/6 마우스로부터의 결과. 제 4일 DTH 반응의 크기는 비-면역접종 마우스와 비교한 발 중량에서의 변화(Δ 발 중량)로 나타낸다. 데이터는 평균±SD로 나타낸다.
도 46. DP47GS IgG-IL-2(4,000 IU/마우스)로 생체내 처리는 (A) 면역접종 21일후 C57BL/6 마우스, 및 (B) 면역접종 7일후 NOD 마우스에서 KLH에 대한 뮤린 IgG 항체 반응을 억제한다. 데이터는 평균±SD로 나타낸다.
정의
하기에서 달리 정의되지 않는 한, 용어들은 본원에서 당해 분야에서 일반적으로 사용되는 바와 같이 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "융합 단백질"은 면역글로불린 분자 및 IL-2 분자를 포함하는 융합 폴리펩티드 분자를 말하며, 이때 상기 융합 단백질의 성분들은 펩티드-결합에 의해, 직접적으로 또는 펩티드 연결기를 통해 서로 연결된다. 명확하게 하기 위해, 융합 단백질의 면역글로불린 성분의 개별 펩티드 쇄는, 예를 들면, 다이설파이드 결합에 의해 비-공유적으로 연결될 수 있다.
"융합된"은 펩티드 결합에 의해, 직접적으로 또는 하나 이상의 펩티드 연결기를 통해 연결된 성분들을 말한다.
"특이적 결합"은 결합이 항원에 대해 선택적이며 원치않거나 비-특이적인 상호작용과 구별될 수 있음을 의미한다. 특이적 항원에 결합하는 면역글로불린의 능력은 효소-결합 면역흡착 분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 또는 당해 분야에 기술을 가진 자에게 익숙한 다른 기술, 예를 들면, 표면 플라즈몬 공명(SPR) 기술(비아코어(BIAcore) 기기 상에서 분석됨)(문헌[Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329(2000)]), 및 통상적인 결합 분석법(문헌[Heeley, Endocr Res 28, 217-229(2002)])을 통해 측정될 수 있다. 일 실시양태에서, 관련되지 않은 단백질에 대한 면역글로불린의 결합 정도는, 예를 들면, SPR로 측정할 때 항원에 대한 면역글로불린의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 실시양태에서, 항원에 결합하는 면역글로불린은 ≤1μM, ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0.1 nM, ≤0.01 nM 또는 ≤0.001 nM(예를 들면, 10-8 M 이하, 예를 들면, 10-8 내지 10-13 M, 예를 들면, 10-9 내지 10-13 M)의 해리 상수(KD)를 갖는다.
"친화도"는 또는 "결합 친화도"는 분자의 단일 결합 부위(예를 들면, 항체)와 그의 결합 상대(예를 들면, 항원) 사이의 비-공유적 상호작용의 총합의 강도를 말한다. 달리 언급하지 않는 한, 본원에서 사용된 바와 같이, "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원들(예를 들면, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 말한다. 분자 X의 그 상대 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 및 결합 속도 상수(각각 koff 및 kon)의 비인 해리 상수(KD)로 나타낼 수 있다. 따라서, 등가의 친화도는 속도 상수들의 비가 동일하게 유지되는 한, 상이한 속도 상수들을 포함할 수 있다. 친화도는 본원에 기술된 것을 포함하여 당해 분야에 공지된 통상적인 방법들에 의해 측정될 수 있다. 친화도를 측정하기 위한 특정 방법은 표면 플라즈몬 공명(SPR)이다.
"감소된 결합", 예를 들어, Fc 수용체 또는 IL-2 수용체에 대해 감소된 결합은, 예를 들면, SPR로 측정할 때, 각각의 상호작용에 대한 친화도의 감소를 말한다. 명확하게 하기 위해, 상기 용어는 또한 영(0)(또는 분석 방법의 검출 한계 미만)까지의 친화도의 감소, 즉, 상호작용의 완전한 제거를 포함한다. 반대로, "증가된 결합"은 각각의 상호작용에 대한 결합 친화도의 증가를 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항원 결정인자"는 "항원"과 동의어이며, 항체가 결합되어 항체-항원 복합체를 형성하는 폴리펩티드 거대분자 상의 부위(예를 들면, 아미노산의 연속 신장부 또는 비-연속 아미노산의 상이한 영역들로 구성된 입체형태 구조)를 말한다. 유용한 항원 결정인자는, 예를 들면, 세포의 표면 상에서, 혈청내 유리하고/하거나 세포외 기질(extracellular matrix, ECM) 중에서 발견할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단일쇄"는 펩티드 결합에 의해 선형으로 연결된 아미노산 단량체들을 포함하는 분자를 말한다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 광의로 사용되며, 단클론성 항체, 다클론성 항체, 다중특이성 항체(예를 들면, 이중특이성 항체), 및 목적하는 항원-결합 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함하여(이로 한정되지는 않는다), 다양한 항체 구축물을 포함한다.
"항체 단편"은 비손상 항체가 결합하는 항원과 결합하는 비손상 항체의 일부를 포함하는 비손상 항체 이외의 다른 분자를 말한다. 항체 단편의 예로는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, 디아바디(diabody), 선형 항체, 단일쇄 항체 분자(예를 들면, scFv), 및 단일-도메인 항체가 포함되나 이로 한정되지는 않는다.
용어 "면역글로불린 분자"는 천연 항체의 구조를 갖는 단백질을 말한다. 예를 들면, IgG 클래스의 면역글로불린은 다이설파이드-결합된 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄로 이루어진, 약 150,000 달톤의 이종사량체성 당단백질이다. N-말단으로부터 C-말단까지, 각각의 면역글로불린 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 영역(VH)에 이어, 중쇄 불변 영역으로도 불리는 3개의 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N-말단으로부터 C-말단까지, 각각의 면역글로불린 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 영역(VL)에 이어, 경쇄 불변 영역으로도 불리는 불변 경쇄(CL) 도메인을 갖는다. 면역글로불린의 중쇄는, α(IgA), δ(IgD), ε(IgE), γ(IgG) 또는 μ(IgM)으로 불리는 5가지 클래스 중 하나로 지정될 수 있으며, 이들 중 일부는 서브클래스, 예를 들면, γ1(IgG1), γ2(IgG2), γ3(IgG3), γ4(IgG4), α1(IgA1) 및 α2(IgA2)로 추가 분류될 수 있다. 면역글로불린의 경쇄는, 그 불변 도메인의 아미노산 서열을 기준으로, 카파(κ) 및 람다(λ)로 불리는 2개 유형 중 하나로 지정될 수 있다. 면역글로불린은 본질적으로, 면역글로불린 힌지(hinge) 영역에 의해 연결된, 2개의 Fab 분자 및 Fc 도메인으로 이루어진다.
본원에서 사용된 바와 같이, "Fab 단편"은 경쇄의 VL 도메인 및 불변 도메인(CL), 및 중쇄의 VH 도메인 및 제 1 불변 도메인(CH1)을 포함하는 면역글로불린 단편을 말한다.
항체 또는 면역글로불린의 "클래스"는 그 중쇄가 갖는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 말한다. 면역글로불린의 5개 주요 클래스: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하며, 이들 중 여러개가 서브클래스(이소타입), 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 더 분류될 수 있다. 면역글로불린의 상이한 클래스에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 읽반적으로 면역글로불린 또는 항체를 항원에 결합시키는데 수반되는 면역글로불린 또는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 말한다. 그러나, 본 발명의 융합 단백질에 포함되는 면역글로불린은 항원-결합 특이성을 제공하지 않는 가변 영역을 포함할 수 있다. 면역글로불린 또는 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 이때 각각의 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역(framework region, FR) 및 3개의 초가변 영역(hypervariable region, HVR)을 포함한다(예를 들면, 문헌[Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91(2007)] 참조). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원 결합 특이성을 제공하기에 충분할 수 있다.
용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은, 본원에서 사용된 바와 같이, 서열에 있어서 초가변성이고/이거나 구조적으로 한정된 루프("초가변 루프")를 형성하는 면역글로불린 또는 항체 가변 도메인의 영역들 각각을 말한다. 일반적으로, 천연 4-쇄 항체는 6개의 HVR: VH에 3개(H1, H2, H3) 및 VL에 3개(L1, L2, L3)를 포함한다. HVR은 일반적으로 초가변 루프로부터 및/또는 상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR)으로부터의 아미노산 잔기를 포함하며, 상기 상보성 결정 영역은 최고 서열 가변성을 가지고/가지거나 항원 인식에 수반된다. 대표적인 초가변 루프는 아미노산 잔기 26-32(L1), 50-52(L2), 91-96(L3), 26-32(H1), 53-55(H2) 및 96-101(H3)에 존재한다(문헌[Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196, 901-917(1987)]). 대표적인 CDR(CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3)은 L1의 아미노산 잔기 24-34, L2의 아미노산 잔기 50-56, L3의 아미노산 잔기 89-97, H1의 아미노산 잔기 31-35B, H2의 아미노산 잔기 50-65, 및 H3의 아미노산 잔기 95-102에 존재한다(문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991)]). VH 중 CDR1을 제외하고, CDR은 일반적으로 초가변 루프를 형성하는 아미노산 잔기를 포함한다. CDR은 또한 항원과 접촉하는 잔기인 "특이성 결정 잔기" 또는 "SDR"을 포함한다. SDR은 단축된-CDR로 불리는 CDR 또는 a-CDR의 영역들 내에 함유된다. 대표적인 a-CDR(a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 및 a-CDR-H3)은 L1의 아미노산 잔기 31-34, L2의 아미노산 잔기 50-55, L3의 아미노산 잔기 89-96, H1의 아미노산 잔기 31-35B, H2의 아미노산 잔기 50-58, 및 H3의 아미노산 잔기 95-102에 존재한다(문헌[Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13, 1619-1633(2008)] 참조). 달리 언급되지 않는 한, HVR 잔기 및 가변 도메인중의 다른 잔기(예를 들면, FR 잔기)는 본원에서 카밧(Kabat) 등의 상기 문헌에 따라 번호가 붙여진다("카밧 넘버링"으로 언급됨).
"프레임워크" 또는 "FR"은 초가변 영역(HVR) 잔기 이외의 다른 가변 도메인 잔기를 말한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인: FR1, FR2, FR3 및 FR4로 이루어진다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH(또는 VL)에서 하기 순서로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
"인간 면역글로불린"은 인간 또는 인간 세포에 의해 생성되거나 인간 면역글로불린 레퍼토리(repertory) 또는 다른 인간 면역글로불린-암호화 서열을 이용하는 비인간 공급원으로부터 유도된 면역글로불린의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 것이다. 인간 면역글로불린의 상기 정의는 구체적으로 비인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화된 면역글로불린은 제외한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "단클론성 항체"는 실질적으로 동종 항체의 집단로부터 수득된 항체를 말하는바, 상기 집단을 이루는 개별 항체들은, 천연 돌연변이를 함유하거나 단클론성 항체 제제의 제조시 발생하는 가능한 변이체 항체(상기 변이체는 일반적으로 미량으로 존재한다)를 제외하고, 동일하고/하거나 동일 에피토프에 결합한다. 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대해 유도된 상이한 항체들을 포함하는 다클론성 항체 제제와 대조적으로, 단클론성 항체 제제의 각각의 단클론성 항체는 항원상의 단일 결정인자에 대해 유도된다. 따라서, 수식어 "단클론성"은 항체의 실질적으로 동종 집단으로부터 수득된 것으로서의 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 제조를 필요로 하는 것으로 이해하지 않아야 한다. 예를 들면, 본 발명에 따라 사용될 단클론성 항체는, 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 인간 면역글로불린 유전자좌 전체 또는 일부를 함유하는 유전자전이 동물을 이용하는 방법을 포함하여(이로 한정되지는 않는다) 다양한 기술에 의해 제조될 수 있으며, 단클론성 항체를 제조하기 위한 상기 방법 및 다른 대표적인 방법들이 본원에 기술되어 있다.
용어 "Fc 도메인" 또는 "Fc 영역"은 본원에서 불변 영역의 적어도 일부분을 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. 상기 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. IgG Fc 영역은 IgG CH2 및 IgG CH3 도메인을 포함한다. 인간 IgG Fc 영역의 "CH2 도메인"은 통상적으로 대략 위치 231에서의 아미노산 잔기로부터 대략 위치 340에서의 아미노산 잔기까지 이어진다. 일 실시양태에서, 탄수화물 쇄는 CH2 도메인에 부착된다. 본원에서 CH2 도메인은 천연 서열 CH2 도메인 또는 변이체 CH2 도메인일 수 있다. "CH3 도메인"은 Fc 영역에서 CH2 도메인까지 C-말단 잔기들의 연장부(즉, IgG의 대략적 위치 341에서의 아미노산 잔기로부터 대략적 위치 447에서의 아미노산 잔기까지)를 포함한다. 본원에서 CH3 영역은 천연 서열 CH3 도메인 또는 변이체 CH3 도메인(예를 들면, 그의 한 쇄에 도입된 "돌출부"(놉(knob)) 및 그의 다른 쇄에 상응하는 도입된 "공동(cavity)"(홀(hole))을 갖는 CH3 도메인; 특별히 본원에 참고로 인용된 미국 특허 제 5,821,333 호 참조)일 수 있다. 상기 변이체 CH3 도메인은 본원에 기술된 바와 같은 2개의 동일하지 않은 면역글로불린 중쇄의 이종이량체화를 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 일 실시양태에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys 226으로부터, 또는 Pro230으로부터 중쇄의 카복실-말단까지 이어진다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 라이신(Lys447)은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 본원에서 달리 언급되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변 영역에서 아미노산 잔기의 번호는 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기술된 바와 같은, EU 인덱스(EU index)로도 불리는 EU 번호 체계에 따른다.
용어 "효과기 기능"은 면역글로불린 이소타입에 따라 달라지는, 면역글로불린의 Fc 영역에 기인하는 생물 활성을 말한다. 면역글로불린 효과기 기능의 예로는 다음이 포함된다: C1q 결합 및 보체 의존적 세포독성(CDC), Fc 수용체 결합, 항체 의존적 세포-매개 세포독성(ADCC), 항체 의존적 세포 식균작용(ADCP), 사이토카인 분비, 항원 제공 세포에 의한 면역 복합체-매개 항원 흡수, 세포 표면 수용체(예를 들면, B 세포 수용체)의 하향 조절, 및 B 세포 활성화.
"활성화 Fc 수용체"는 면역글로불린의 Fc 영역에 의한 후속 결합이 효과기 기능을 수행하도록 수용체-함유 세포를 자극하는 신호전달 결과를 유도하는 Fc 수용체이다. 활성화 Fc 수용체로는 FcγRIIIa(CD16a), FcγRI(CD64), FcγRIIa(CD32) 및 FcαRI(CD89)가 포함된다. 특정한 활성화 Fc 수용체는 인간 FcγRIIIa(유니프롯(Uniprot) 등록번호 P08637(버전 141) 참조)이다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "인터류킨-2" 또는 "IL-2"는, 달리 언급되지 않는 한, 포유동물, 예를 들어, 영장류(예를 들면, 인간) 및 설치류(예를 들면, 마우스 및 래트)를 포함하여 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 IL-2를 말한다. 상기 용어는 미처리된 IL-2, 및 세포에서의 처리로부터 야기된 IL-2의 임의의 형태를 포함한다. 상기 용어는 또한 IL-2의 천연 변이체, 예를 들면, 스플라이스 변이체 또는 대립형질 변이체를 포함한다. 예시적인 인간 IL-2의 아미노산 서열을 서열번호 1에 나타내었다. 미처리된 인간 IL-2는 또한 성숙한 IL-2 분자에는 존재하지 않는, N-말단 20개 아미노산 신호 펩티드를 포함한다.
"야생형 IL-2"로도 지칭되는 "천연 IL-2"는 천연에 존재하는 IL-2를 의미한다. 천연 인간 IL-2 분자의 서열은 서열번호 1에 나타나 있다. 본 발명에 있어서, 용어 야생형은 또한 천연 IL-2에 비해 IL-2 수용체 결합을 변화시키지 않는 하나 이상의 아미노산 돌연변이, 예를 들면, 인간 IL-2의 잔기 125에 상응하는 위치에서 시스테인의 알라닌으로의 치환을 포함하는 IL-2의 형태를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 있어서 야생형 IL-2는 아미노산 치환 C125A를 포함한다(서열번호 3 참조).
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "CD25" 또는 "IL-2 수용체 α"는 달리 언급하지 않는 한, 영장류(예를 들면, 인간) 및 설치류(예를 들면, 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 포함하여, 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 CD25를 말한다. 상기 용어는 "전장" 미처리 CD25 뿐 아니라, 세포에서의 처리로부터 생성된 CD25의 임의의 형태를 포함한다. 상기 용어는 또한 CD25의 천연 변이체, 예를 들면, 스플라이스 변이체 또는 형질대립 변이체를 포함한다. 특정 실시양태에서, CD25는 인간 CD25이다. 예시적인 인간 CD25의 아미노산 서열(신호 서열, Avi-표지 및 His-표지를 갖는)은 서열번호 25에 나타나 있다.
용어 "고-친화도 IL-2 수용체"는 본원에서 사용된 바와 같이, 수용체 γ-서브유닛(공통 사이토카인 수용체 γ-서브유닛, γC 또는 CD132로도 알려져 있음), 수용체 β-서브유닛(CD122 또는 p70으로도 알려져 있음) 및 수용체 α-서브유닛(CD25 또는 p55로도 알려져 있음)로 이루어진, IL-2 수용체의 이종삼량체 형태를 말한다. 용어 "중간-친화도 IL-2 수용체" 또는 "IL-2 수용체 βγ"는 대조적으로 α-서브유닛 없이 γ-서브유닛 및 β-서브유닛 만을 포함하는 IL-2 수용체를 말한다(검토를 위해, 예를 들면, 문헌[Olejniczak and Kasprzak, Med Sci Monit 14, RA179-189(2008)] 참조). 대표적인 인간 CD122 및 CD132(His-태그를 갖는 Fc 영역에 융합된)의 아미노산 서열은 각각 서열번호 21 및 23에 나타나 있다.
"조절 T 세포" 또는 "Treg 세포"는 다른 T 세포의 반응을 억제할 수 있는 CD4+ T 세포의 분화된 유형을 의미한다(효과기 T 세포). Treg 세포는 CD4, IL-2 수용체의 α-서브유닛(CD25) 및 전사 인자 포크헤드 박스 P3(forkheag box P3, FOXP3)[Sakaguchi, Annu Rev Immunol 22, 531-562(2004)]의 발현을 특징으로 하며, 종양에 의해 발현된 것들을 포함하여, 항원에 대한 말초 자가-관용의 유도 및 유지에 중요한 역할을 한다.
"통상의 CD4+ T 세포"는 조절 T 세포 이외의 CD4+ T 세포를 의미한다. 통상의 CD4+ 기억 T 세포는 CD4, CD3의 발현을 특징으로 하지만, FOXP3의 발현을 특징으로 하지 않는다. "통상의 CD4+ 기억 T 세포"는 CD45RA를 발현하는 "통상의 CD4+ 미접촉 T 세포"와 대조적으로 CD45RA의 발현의 결핍을 추가 특징으로 하는 통상의 CD4+ T 세포의 아형이다.
"Treg 세포의 선택적 활성화"는 본질적으로 다른 T 세포 아형(예를 들면, CD4+ T 헬퍼 세포, CD8+ 세포독성 T 세포, NKT 세포) 또는 자연 살해(natural killer, NK) 세포의 동반 활성화없이 Treg 세포의 활성화를 의미한다. 이들 세포 유형을 확인하고 구별하는 방법은 실시예에 기술되어 있다. 활성화는 IL-2 수용체 신호전달의 유도(예를 들면, 인산화된 STAT5a의 검출에 의해 측정될 때), 증식의 유도(예를 들면, Ki-67의 검출에 의해 측정될 때) 및/또는 활성화 마커(예를 들면, CD25와 같은) 발현의 상향조절을 포함할 수 있다.
용어 "펩티드 연결기"는 하나 이상의 아미노산, 전형적으로 약 2 내지 20개 아미노산을 포함하는 펩티드를 말한다. 펩티드 연결기는 당해 분야에 공지되어 있거나, 본원에 기술되어 있다. 적합한 비-면역원성 연결기 펩티드로는, 예를 들면, (G4S)n, (SG4)n 또는 G4(SG4)n 펩티드 연결기가 포함된다. "n"은 일반적으로 1 내지 10, 전형적으로 2 내지 4의 수이다.
용어 "변형"은 펩티드 주쇄(예를 들면, 아미노산 서열)의 임의의 조작 또는 폴리펩티드의 번역후 변형(예를 들면, 글리코실화)을 말한다.
"놉-인투-홀 변형(knob-into-hole modification)"은, CH3 도메인에서 2개의 면역글로불린 중쇄 사이 계면 내에서의 변형을 말하는 것으로, 이때 i) 한 중쇄의 CH3 도메인에서, 아미노산 잔기가 더 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 치환되어, 다른 중쇄의 CH3 도메인의 계면내 공동(홀)에 위치할 수 있는 한 중쇄의 CH3 도메인의 계면내에 돌출부(놉)를 생성하고, ii) 다른 중쇄의 CH3 도메인에서, 아미노산 잔기가 더 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 치환되어, 첫번째 CH3 도메인의 계면내 돌출부(놉)가 위치할 수 있는 두번째 CH3 도메인의 계면내에 공동(홀)을 생성한다. 일 실시양태에서, "놉-인투-홀 변형"은 항체 중쇄들 중 하나에 아미노산 치환 T366W 및 임의적으로 아미노산 치환 S354C, 및 항체 중쇄 중 다른 하나에 아미노산 치환 T366S, L368A, Y407V 및 임의적으로 Y349C를 포함한다. 놉-인투-홀 기술은, 예를 들면, US 5,731,168; US 7,695,936; 문헌[Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621(1996)]; 및 문헌[Carter, J Immunol Meth 248, 7-15(2001)]에 기술되어 있다. 일반적으로, 상기 방법은 이종이량체 생성을 촉진하고 동종이량체 생성을 저해하기 위해 돌출부가 공동에 위치할 수 있도록, 제 1 폴리펩티드의 계면에 돌출부(놉) 및 제 2 폴리펩티드의 계면에 상응하는 공동(홀)을 도입하는 것을 포함한다. 돌출부는 제 1 폴리펩티드의 계면으로부터 작은 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄(예를 들면, 티로신 또는 트립토판)으로 치환시킴으로써 구성된다. 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 측쇄(예를 들면, 알라닌 또는 트레오닌)로 치환시킴으로써, 돌출부와 동일하거나 유사한 크기의 상호보완적 공동이 제 2 폴리펩티드의 계면에 생성된다. 위치 S354 및 Y349 각각에 2개의 시스테인 잔기의 도입은 Fc 영역의 2개 항체 중쇄 사이에 다이설파이드 가교의 형성을 야기하여 이량체를 더 안정화시킨다[Carter, J Immonol Methods 248, 7-15(2001)].
아미노산 "치환"은 폴리펩티드에서 한 아미노산의 또 다른 아미노산으로의 치환을 말한다. 일 실시양태에서, 아미노산은 유사한 구조 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산, 예를 들면, 보존적 아미노산 치환으로 치환된다. "보존적" 아미노산 치환은 수반되는 잔기들의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성 성질을 기준으로 이루어질 수 있다. 예를 들면, 비극성(소수성) 아미노산으로는 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌이 포함되고; 극성 중성 아미노산으로는 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민이 포함되고; 양으로 하전된(염기성) 아미노산으로는 아르기닌, 라이신 및 히스티딘이 포함되고; 음으로 하전된(산성) 아미노산으로는 아스파트산 및 글루탐산이 포함된다. 비-보존적 치환은 상기 부류들 중 하나의 구성원을 또 다른 부류로 교환하는 것을 수반한다. 예를 들면, 아미노산 치환은 또한 한 아미노산을 상이한 구조 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것, 예를 들면, 한 군(예를 들면, 극성)으로부터의 아미노산을 상이한 군(예를 들면, 염기성)으로부터의 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 야기할 수 있다. 아미노산 치환은 당해 분야에 공지된 유전자 또는 화학적 방법을 이용하여 달성될 수 있다. 유전자 방법은 부위-지향 돌연변이유발, PCR, 유전자 합성 등을 포함할 수 있다. 유전자 조작 이외의 다른 방법, 예를 들면, 화학적 변형에 의해 아미노산의 측쇄 기를 변화시키는 방법도 또한 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 본원에서 동일한 아미노산 치환을 나타내기 위해 다양한 표시가 사용될 수 있다. 예를 들면, 면역글로불린 중쇄의 위치 329에서 프롤린으로부터 글리신으로의 치환은 329G, G329, G329, P329G 또는 Pro329Gly로 나타낼 수 있다.
참조 폴리펩티드 서열과 관련하여 "아미노산 서열 동일성 퍼센트(%)"는, 필요한 경우, 최대 서열 동일성 퍼센트를 달성하기 위해, 서열을 정렬하고 갭(gap)을 도입한 후, 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로 간주하지 않고, 기준 폴리펩티드 서열중의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열내 아미노산 잔기의 %로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 정렬은, 예를 들면, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메갈린(Megalign)(디엔에이스타(DNASTAR)) 소프트웨어와 같은 대중적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 이용하여, 당해 분야의 기술에 속하는 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 당해 분야에 숙련된 자라면 비교되는 서열의 전장에 대한 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 경우, 아미노산 서열 동일성 % 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 산출된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크 인코포레이티드(Genentech, Inc.)에 의해 창시되었으며, 소스 코드는 미국 워싱턴 D.C., 20559 소재의 미국 저작권청(U.S. Copyright Office)에 사용자 문서와 함께 제출되었으며, 여기에 미국 저작권 등록 번호(U.S. Copyright Registration No.) TXU510087로 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코 소재의 제넨테크 인코포레이티드로부터 대중적으로 이용가능하거나, 소스 코드로부터 컴파일링될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 포함하여, UNIX 작업 시스템 상에서 사용하기 위해 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되며 변하지 않는다. ALIGN-2가 아미노산 서열 비교에 사용되는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 B에 대해, 그와 비교해 또는 그에 대비해, 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 %(양자택일적으로, 주어진 아미노산 서열 B에 대해, 그와 비교해 또는 그에 대비해 특정 아미노산 서열 동일성 %를 가지거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로서 표현될 수 있다)는 다음과 같이 산출된다:
100 x 분수 X/Y
상기에서, X는 A와 B의 상기 프로그램의 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일한 매치로 기록된 아미노산 잔기의 수이며, Y는 B 중의 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 %는 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 %와 같지 않을 것임을 인지할 것이다. 특별히 달리 언급하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 아미노산 서열 동일성 % 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 앞 단락에서 기술한 바와 같이 수득된다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 바와 같은 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오티드들의 중합체를 말하며, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기 및/또는 그의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 또는 합성 반응에 의해 중합체에 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예를 들면, 메틸화된 뉴클레오티드 및 그의 유사체를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 성분들에 의해 단속될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 합성후에 이루어진 변형(들), 예를 들면, 표지에 대한 접합을 포함할 수 있다.
본 발명의 참조 뉴클레오티드 서열과 적어도, 예를 들면, 95% "동일한" 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 또는 폴리뉴클레오티드란, 폴리뉴클레오티드 서열이 참조 뉴클레오티드 서열의 각각의 100개 뉴클레오티드 당 5개 이하의 점 돌연변이를 포함할 수 있는 것을 제외하고 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 참조 서열과 동일한 것을 의미하는 것이다. 즉, 참조 뉴클레오티드 서열과 95% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 수득하기 위해, 참조 서열 중 뉴클레오티드의 5% 이하가 결실되거나 또 다른 뉴클레오티드로 치환될 수 있거나, 참조 서열중 총 뉴클레오티드의 5% 이하의 일부의 뉴클레오티드가 참조 서열중에 삽입될 수 있다. 참조 서열의 상기 변이는, 참조 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치에서, 또는 참조 서열중 또는 참조 서열내 하나 이상의 인접 기들중의 잔기들 사이에 개별적으로 배치된, 상기 말단 위치들 사이 어디에서나 일어날 수 있다. 실제적인 문제로서, 임의의 특정 폴리뉴클레오티드 서열이 본 발명의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한지 여부는 통상적으로, 폴리펩티드에 대해 상기 논의한 것(예를 들면, ALIGN-2)과 같은 공지된 컴퓨터 프로그램을 이용하여 결정될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "벡터"는 결합되는 또 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 말한다. 상기 용어는 자가-복제 핵산 구축물로서의 벡터, 및 그것이 도입된 숙주 세포의 게놈내에 혼입되는 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 그들이 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 유도할 수 있다. 상기 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되며, 그 세포의 자손을 포함하여, 외인성 핵산이 도입된 세포를 말한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환 세포"를 포함하며, 이들은 1차 형질전환된 세포, 및 계대 수에 관계없이 그로부터 유도된 자손을 포함한다. 자손은 핵산 함량에 있어서 모 세포와 완전히 동일하지 않을 수 있으며, 돌연변이를 함유할 수 있다. 원래 형질전환된 세포에서 선별 또는 선택된 바와 동일한 기능 또는 생물 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 본 발명에 포함된다. 숙주 세포는 본 발명의 융합 단백질을 생성하기 위해 사용될 수 있는 임의의 유형의 세포 시스템이다. 숙주 세포는 배양 세포, 예를 들면, 배양된 포유동물 세포, 예를 들어, 몇가지만 들자면, CHO 세포, BHK 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, YO 골수종 세포, P3X63 마우스 골수종 세포, PER 세포, PER.C6 세포 또는 하이브리도마 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 및 식물 세포 뿐 아니라, 유전자전이 동물, 유전자전이 식물 또는 배양된 식물 또는 동물 조직 내에 포함된 세포를 포함한다.
약제의 "효과량"은 약제가 투여되는 세포 또는 조직에서 생리적 변화를 야기하기 위해 필요한 양을 말한다.
약제, 예를 들면, 약학 조성물의 "치료 효과량"은 목적하는 치료 또는 예방 결과를 달성하기 위한 투여량에서 필요한 시간 동안 효과적인 양을 말한다. 약제의 치료 효과량은, 예를 들면, 질환의 부작용을 제거하거나, 감소시키거나, 지연시키거나, 최소화시키거나, 방지한다.
"개체" 또는 "대상체"는 포유동물이다. 포유동물로는 가축(예를 들면, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류(예를 들면, 인간 및 비인간 영장류, 예를 들어, 원숭이), 토끼 및 설치류(예를 들면, 마우스 및 래트)가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 특히, 개체 또는 대상체는 인간이다.
용어 "약학 조성물"은, 그중에 함유된 활성 성분의 생물 활성이 효과적이 되게 하는 그런 형태이며, 제형이 투여될 대상체에게 허용될 수 없을 정도로 독성인 추가의 성분을 함유하지 않는 제제를 말한다.
"약학적으로 허용되는 담체"는 대상체에게 무독성인, 활성 성분 이외의 다른, 약학 조성물내 성분을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 완충제, 부형제, 안정화제 또는 방부제가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "치료"(및 그의 문법적 변형, 예를 들면, "치료하다" 또는 "치료하는")는 치료되는 개체에서 질환의 자연적 과정을 변화시키기 위한 시도에서의 임상적 개입을 말하며, 예방을 위해 또는 임상 병리 과정동안 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과로는 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 경감, 질환의 임의의 직접 또는 간접적 병리학적 결과의 감소, 전이 방지, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 차도 또는 개선된 예후가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 질환의 진전을 지연시키거나 질환의 진행을 지체시키기 위해 사용된다.
"자가면역 질환"은 개체 자신의 조직으로부터 야기되고 그에 대해 유도되는 비-악성 질환 또는 질병을 말한다. 자가면역 질환 또는 질병의 예로는 염증 반응, 예를 들면, 건선 및 피부염(예를 들면, 아토피성 피부염)을 포함한 염증성 피부 질환; 염증성 장 질환(예를 들면, 크론병 및 궤양성 대장염)과 관련된 반응; 피부염; 습진 및 천식과 같은 알레르기 상태; 류마티스성 관절염; 전신 홍반성 루푸스(SLE)(루푸스 신염, 피부 루푸스를 포함하나 이로 한정되지 않음); 당뇨병(예를 들면, 제 1형 당뇨병 또는 인슐린 의존적 당뇨병); 다발성 경화증 및 소아 당뇨가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다.
본 발명의 융합 단백질
본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 치료 방법에 사용하기에 특히 유리한 성질들을 갖는 신규 면역글로불린-IL-2 융합 단백질을 제공한다.
첫번째 양상에서, 본 발명은 (i) 면역글로불린 분자, 및 (ii) 야생형 IL-2 분자에 비해 중간 친화도 IL-2 수용체에 대한 돌연변이체 IL-2 분자의 친화도를 감소시키는 아미노산 돌연변이를 포함하는 2개의 돌연변이체 인터류킨-2(IL-2) 분자를 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
일 실시양태에서, 상기 융합 단백질은 면역글로불린 분자, 야생형 IL-2 분자에 비해 중간 친화도 IL-2 수용체에 대한 돌연변이체 IL-2 분자의 친화도를 감소시키는 아미노산 돌연변이를 포함하는 2개의 돌연변이체 인터류킨-2(IL-2) 분자, 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 연결기로 본질적으로 이루어진다.
실시예에 나타낸 바와 같이, 2개의 IL-2 분자를 포함하는 융합 단백질은 놀랍게도 단일 IL-2 분자를 포함하는 상응하는 융합 단백질에 비해, 조절 T 세포의 활성화에 있어 매우 개선된 효능 및 선택성을 제공한다. 또한, 중간 친화도 IL-2 수용체에 대해 감소된 결합을 갖는 (오직 1개보다) 2개의 돌연변이체 IL-2 분자를 포함하는 융합 단백질만이 조절 T 세포에서 유의한 자극 활성을 보유한다.
일 실시양태에서, 상기 면역글로불린 분자는 IgG-클래스 면역글로불린 분자, 특히 IgG1-서브클래스 면역글로불린 분자이다. 일 실시양태에서, 상기 면역글로불린 분자는 인간 면역글로불린 분자인바, 상기 면역글로불린 분자는 완전 인간 가변 및 불변 영역을 포함한다. 예시적인 인간 IgG1 불변 영역의 서열이 서열번호 8에 나타나 있다. IgG-클래스 면역글로불린 분자는 (i) 각각 N-말단으로부터 C-말단까지 경쇄 가변 도메인(VL) 및 경쇄 불변 도메인(CL)을 포함하는 2개의 면역글로불린 경쇄, 및 (ii) 각각 N-말단으로부터 C-말단까지 중쇄 가변 도메인(VH), 중쇄 불변 도메인(CH)1, 면역글로불린 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 2개의 면역글로불린 중쇄를 포함한다. 뒤의 2개 도메인은 면역글로불린 분자의 Fc 영역의 일부를 형성한다. 2개의 중쇄는 Fc 영역에서 이량체화된다.
본 발명에 따른 융합 단백질의 일 실시양태에서, 상기 2개의 돌연변이체 IL-2 분자는 각각 그의 N-말단 아미노산에서, 임의적으로 펩티드 연결기를 통해, 상기 면역글로불린 분자의 면역글로불린 중쇄 중 하나의 C-말단 아미노산에 융합된다. 2개의 (동일한) IL-2 분자의 면역글로불린 중쇄에 대한 융합은 융합 단백질의 간단한 생성을 가능하게 하여, 바람직하지 않은 부산물의 생성을 배제하고, 놉-인투-홀 변형과 같은 동일하지 않은 중쇄의 이종이량체화를 촉진하는 변형에 대한 필요를 배제한다.
본 발명에 따른 융합 단백질의 특정 실시양태에서, 2개의 돌연변이체 IL-2 분자는 펩티드 연결기를 통해 상기 면역글로불린 분자에 융합된다. 일 실시양태에서, 상기 2개의 돌연변이체 IL-2 분자는 각각 펩티드 연결기를 통해 상기 면역글로불린 분자에 융합된다. 일 실시양태에서, 상기 2개의 돌연변이체 IL-2 분자는 각각 그들의 N-말단 아미노산에서, 펩티드 연결기를 통해 상기 면역글로불린 분자의 면역글로불린 중쇄 중 하나의 C-말단 아미노산에 융합된다. 일 실시양태에서, 상기 돌연변이체 IL-2 분자는 각각 동일한 아미노산 서열을 갖는 펩티드 연결기를 통해 상기 면역글로불린 분자에 융한된다. 일 실시양태에서, 상기 펩티드 연결기는 10개 이상의 아미노산을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 상기 펩티드 연결기는 15개 이상의 아미노산을 포함한다. 이론에 의해 제한되는 것은 아니지만, 이 길이의 펩티드 연결기는 IL-2 수용체, 특히 고-친화(이종삼량체) IL-2 수용체에 대한 돌연변이체 IL-2 분자의 최적 결합을 위한 유연성을 제공할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 상기 펩티드 연결기는 15개 아미노산을 포함한다. 보다 더 특정한 실시양태에서, 상기 펩티드 연결기는 아미노산 서열(G4S)3(서열번호 66)을 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 펩티드 연결기는 15개 아미노산 길이이다. 일 실시양태에서, 상기 펩티드 연결기는 아미노산 서열(G4S)3(서열번호 66)을 갖는다. 일 실시양태에서, 상기 펩티드 연결기는 15개 아미노산으로 이루어진다. 일 실시양태에서, 상기 펩티드 연결기는 아미노산 서열(G4S)3(서열번호 66)으로 이루어진다.
면역글로불린 분자에 대한 IL-2 분자의 융합은, 유리(비융합된) IL-2에 비해, 긴 혈청 반감기(FcRn에 대한 결합을 통한 재순환, 및 신장 여과를 위한 임계치보다 훨씬 높은 분자 크기로 인함)를 포함하여 유리한 약동학적 성질을 제공한다. 더욱이, 면역글로불린 분자의 존재는 또한, 예를 들면, 단백질 A 친화 크로마토그래피에 의한 융합 단백질의 간단한 정제를 가능하게 한다. 흥미롭게도, 실시예에 나타낸 바와 같이, 중간 친화도 IL-2 수용체에 대한 감소된 결합을 갖는 2개의 돌연변이체 IL-2 분자를 포함하는 융합 단백질은 2개의 야생형 IL-2 분자를 포함하는 상응하는 융합 단백질보다 더 긴 혈청 반감기를 갖는다. 면역글로불린 분자, 즉, 자연적으로 발생하는 유형의 분자에 대한 융합은 또한 항-약물 항체의 형성을 통해 융합 단백질의 독성을 최소화할 수 있다.
그러나, 면역글로불린 분자, 특히 면역글로불린 분자의 Fc 영역의 존재는 융합 단백질의 약동학 특성에 긍정적이고, 이는 동시에 바람직한 IL-2 수용체 함유 세포보다 Fc 수용체를 발현하는 세포로의 융합 단백질의 바람직하지 않은 표적화를 유도할 수 있다. 또한, Fc 수용체의 개입은 (전-염증) 사이토카인의 방출 및 조절 T 세포 이외의 다른 다양한 면역 세포의 바람직하지 않은 활성화를 유도할 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명의 융합 단백질에 포함된 상기 면역글로불린 분자는 변형을 갖지 않는 상응하는 면역글로불린 분자에 비해, Fc 수용체에 대한 면역글로불린 분자의 결합 친화도를 감소시키는 변형을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 Fc 수용체는 Fcγ 수용체, 특히 인간 Fcγ 수용체이다. Fc 수용체에 대한 결합 친화도는, 예를 들면, ELISA에 의해, 또는 비아코어 기기(지이 헬쓰케어(GE Healthcare))와 같은 표준 기기를 사용하여 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 용이하게 측정될 수 있으며, Fc 수용체는 예를 들어 재조합 발현에 의해 수득될 수 있다. 결합 친화도를 측정하기 위한 특정한 예시적이고 대표적인 실시양태를 하기에 기술한다. 일 실시양태에 따르면, Fc 수용체에 대한 결합 친화도는 CM5 칩상에 고정화된 리간드(Fc 수용체)를 사용하여 25℃에서 비아코어(BIACORE: 등록상표) T100 기계(지이 헬쓰케어)를 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정한다. 간략하게, 카복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩(CM5, 지이 헬쓰케어)을 공급자의 지시에 따라 N-에틸-N'-(3-다이메틸아미노프로필)-카보다이이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드(NHS)로 활성화시킨다. 재조합 리간드를 10 mM 나트륨 아세테이트(pH 5.5)를 사용하여 0.5 내지 30 ㎍/ml로 희석한 후 10 ㎕/분의 유량으로 주사하여 약 100 내지 5000 반응 단위(response unit, RU)의 커플링된 단백질을 수득한다. 리간드의 주사 후에, 1 M 에탄올아민을 주사하여 미반응 기를 차단한다. 동역학 측정을 위해, 항체의 3- 내지 5배 연속 희석물(약 0.01 내지 300 nM의 범위)을 25℃에서 HBS-EP+(지이 헬쓰케어, 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% 서펙턴트(Surfactant) P20, pH 7.4) 중에 약 30 내지 50 ㎕/분의 유량으로 주사한다. 결합 속도(kon) 및 해리 속도(koff)는 단순한 1-대-1 랑뮤어(Langmuir) 결합 모델(비아코어(등록상표) T100 평가 소프트웨어 버전 1.1.1)을 사용하여 결합 및 해리 센서그램을 동시에 적합화(fitting)시킴으로써 계산된다. 평형 해리 상수(KD)는 비 koff/kon으로서 계산된다(예를 들면, 문헌[Chen et al., J Mol Biol 293, 865-881(1999)] 참조). 다르게는, Fc 수용체에 대한 항체의 결합 친화도는 FcγIIIa 수용체를 발현하는 NK 세포와 같은 특정 Fc 수용체를 발현하는 것으로 알려진 세포주를 사용하여 평가할 수 있다.
일 실시양태에서, 변형은 Fc 수용체에 대한 면역글로불린의 결합 친화도를 감소시키는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 일 실시양태에서, 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이다. 전형적으로, 동일한 하나 이상의 아미노산 돌연변이가 2개의 면역글로불린 중쇄 각각에 존재한다. 일 실시양태에서, 상기 아미노산 돌연변이는 Fc 수용체에 대한 면역글로불린의 결합 친화도를 2배 이상, 5배 이상 또는 10배 이상 감소시킨다. Fc 수용체에 대한 면역글로불린의 결합 친화도를 감소시키는 아미노산 돌연변이가 하나보다 많이 존재하는 실시양태에서, 이들 아미노산 돌연변이의 조합은 Fc 수용체에 대한 면역글로불린의 결합 친화도를 10배 이상, 20배 이상 또는 심지어 50배 이상 감소시킬 수 있다. 일 실시양태에서, 상기 면역글로불린 분자는, 상기 변형을 갖지 않는 상응하는 면역글로불린 분자에 비해, 20% 미만, 특히 10% 미만, 보다 특히 5% 미만의 Fc 수용체에 대한 결합 친화도를 나타낸다.
일 실시양태에서, 상기 Fc 수용체는 활성화 Fc 수용체이다. 특정 실시양태에서, 상기 Fc 수용체는 FcγRIIIa(CD16a), FcγRI(CD64), FcγRIIa(CD32) 및 FcγRI(CD89)의 군에서 선택된다. 특정 실시양태에서, Fc 수용체는 Fcγ 수용체, 보다 특히 FcγRIIIa, FcγRI 또는 FcγRIIa 수용체이다. 바람직하게, 상기 수용체들 각각에 대한 결합 친화도는 감소된다. 보다 더 특정한 실시양태에서, 상기 Fc 수용체는 FcγIIIa, 특히 인간 FcγIIIa이다. 일부 실시양태에서, 보체 성분에 대한 결합 친화도, 특히 C1q에 대한 결합 친화도가 또한 감소된다. 일 실시양태에서, 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 결합 친화도는 감소되지 않는다. FcRn에 대한 실질적으로 유사한 결합, 즉 상기 수용체에 대한 면역글로불린 분자의 결합 친화도의 보존은, 면역글로불린 분자가 FcRn에 대한 면역글로불린 분자의 비변형된 형태의 결합 친화도의 약 70% 이상을 나타낼 때 달성된다. 본 발명의 융합 단백질에 포함된 면역글로불린 분자는 상기 친화도의 약 80% 이상, 심지어 약 90% 이상을 나타낼 수 있다.
일 실시양태에서, Fc 수용체에 대한 면역글로불린 분자의 결합 친화도를 감소시키는 상기 변형은 면역글로불린 분자의 Fc 영역, 특히 CH2 영역에 존재한다. 일 실시양태에서, 상기 면역글로불린 분자는 면역글로불린 중쇄의 위치 329(EU 넘버링)에 아미노산 치환을 포함한다. 보다 특정한 실시양태에서, 상기 아미노산 치환은 P329A 또는 P329G, 특히 P329G이다. 일 실시양태에서, 상기 면역글로불린 분자는 면역글로불린 중쇄의 위치 234 및 235(EU 넘버링)에 아미노산 치환을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 아미노산 치환은 L234A 및 L235A(LALA)이다. 일 실시양태에서, 상기 면역글로불린 분자는 항체 중쇄의 위치 329(EU 넘버링)에 아미노산 치환 및 면역글로불린 중쇄의 위치 228, 233, 234, 235, 297 및 331(EU 넘버링)로부터 선택된 위치에 추가의 아미노산 치환을 포함한다. 보다 특정한 실시양태에서, 상기 추가의 아미노산 치환은 S228P, E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D 또는 P331S이다. 특정 실시양태에서, 상기 면역글로불린 분자는 면역글로불린 중쇄의 위치 P329, L234 및 L235(EU 넘버링)에 아미노산 치환을 포함한다. 보다 특정 실시양태에서, 상기 면역글로불린 분자는 면역글로불린 중쇄에 아미노산 치환 L234A, L235A 및 P329G(LALA P329G; EU 넘버링)를 포함한다. 아미노산 치환의 상기 조합은, 본원에 전체가 참고로 인용된 PCT 공개공보 WO 2012/130831에 기술된 바와 같이, 인간 IgG-클래스 면역글로불린의 Fcγ 수용체 결합을 특히 효과적으로 제거한다. PCT 공개공보 WO 2012/130831은 또한 상기 변형된 면역글로불린을 제조하는 방법, 및 Fc 수용체 결합 또는 효과기 기능과 같은 그의 특성을 측정하는 방법을 기술하고 있다.
면역글로불린 중쇄에 변형을 포함하는 면역글로불린은 당해 분야에 공지된 유전적 또는 화학적 방법을 이용하여 아미노산 결실, 치환, 삽입 또는 변형에 의해 제조될 수 있다. 유전적 방법은 암호화 DNA 서열의 부위-특이적 돌연변이유발, PCR, 유전자 합성 등을 포함할 수 있다. 정확한 뉴클레오티드 변화는, 예를 들면, 서열분석에 의해 확인할 수 있다.
Fc 수용체 결합을 감소시키는 변형을 포함하는 면역글로불린 또는 항체는 일반적으로 상응하는 비변형 면역글로불린 또는 항체에 비해 감소된 효과기 기능, 특히 감소된 ADCC를 갖는다. 따라서, 일 실시양태에서, Fc 수용체에 대한 면역글로불린 분자의 결합 친화도를 감소시키는 상기 변형은 면역글로불린 분자의 효과기 기능을 감소시킨다. 특정 실시양태에서, 상기 효과기 기능은 항체 의존적 세포-매개 세포독성(ADCC)이다. 일 실시양태에서, ADCC는 상기 변형을 갖지 않는 상응하는 면역글로불린 분자에 의해 유도된 ADCC의 20% 미만으로 감소된다. 면역글로불린 또는 항체의 효과기 기능은 당해 분야에 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다. 당해 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 분석법의 예는 미국 특허 제 5,500,362 호; 문헌[Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063(1986)]; 및 문헌[Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502(1985)]; 미국 특허 제 5,821,337 호; 문헌[Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361(1987)]에 기술되어 있다. 다르게는, 비-방사성 분석 방법을 사용할 수 있다[예를 들면, 유동 세포분석을 위한 ACTI(등록상표) 비-방사성 세포독성 분석법(셀테크놀로지 인코포레이티드(CellTechnology, Inc.), 미국 캘리포니아주 마운틴뷰 소재); 및 사이토톡스(CytoTox) 96(등록상표) 비-방사성 세포독성 분석법(프로메가(Promega), 미국 위스콘신주 매디슨 소재) 참조]. 상기 분석에 유용한 효과기 세포로는 말초혈 단핵 세포(PBMC) 및 자연 살해(NK) 세포가 포함된다. 대안적으로 또는 추가로, 당해 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들면, 문헌[Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656(1998)]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 보체 성분, 특히 C1q에 대한 면역글로불린 분자의 결합이 또한 감소된다. 따라서, 보체-의존적 세포독성(CDC)이 또한 감소될 수 있다. C1q 결합 분석은 면역글로불린이 C1q에 결합할 수 있으며 따라서 CDC 활성을 갖는지 여부를 측정하기 위해 수행될 수 있다(예를 들면, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402에서의 C1q 및 C3c 결합 ELISA 참조). 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 분석을 수행할 수 있다(예를 들면, 문헌[Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods 202, 163(1996)]; [Cragg et al., Blood 101, 1045-1052(2003)]; 및 [Cragg and Glennie, Blood 103, 2738-2743(2004)] 참조).
상기에서 및 PCT 공개공보 WO 2012/130831에 기술된 면역글로불린 분자 이외에, 감소된 Fc 수용체 결합 및/또는 효과기 기능을 갖는 면역글로불린은 또한 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 것들을 포함한다(미국 특허 제 6,737,056 호). 상기 Fc 돌연변이체는, 잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 갖는 소위 "DANA" Fc 돌연변이체(미국 특허 제 7,332,581 호)를 포함하여, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상에 치환을 갖는 Fc 돌연변이체를 포함한다.
IgG4-서브클래스 면역글로불린은 IgG1 면역글로불린에 비해, Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화도 및 감소된 효과기 기능을 나타낸다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 융합 단백질에 포함된 상기 면역글로불린 분자는 IgG4-서브클래스 면역글로불린, 특히 인간 IgG4-서브클래스 면역글로불린이다. 일 실시양태에서, 상기 IgG4-서브클래스 면역글로불린은 위치 S228(EU 넘버링)에서 Fc 영역에 아미노산 치환, 특히 아미노산 치환 S228P를 포함한다. Fc 수용체에 대한 그의 결합 친화도 및/또는 그의 효과기 기능을 추가로 감소시키기 위해, 일 실시양태에서, 상기 IgG4-서브클래스 면역글로불린은 위치 L235에 아미노산 치환, 특히 아미노산 치환 L235E(EU 넘버링)를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 IgG4-서브클래스 면역글로불린은 위치 P329에 아미노산 치환, 특히 아미노산 치환 P329G(EU 넘버링)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 IgG4-서브클래스 면역글로불린은 위치 S228, L235 및 P329에 아미노산 치환, 특히 아미노산 치환 S228P, L235E 및 P329G(EU 넘버링)를 포함한다. 상기 변형된 IgG4-서브클래스 면역글로불린 및 그의 Fcγ 수용체 결합 성질은 본원에 전체가 참고로 인용된 PCT 공개공보 WO 2012/130831에 기술되어 있다.
일 실시양태에서, 상기 면역글로불린 분자는 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 일 실시양태에서, 상기 면역글로불린 분자는 단클론성 항체이다. 일 실시양태에서, 상기 면역글로불린 분자는 항원에 특이적으로 결합할 수 없고, 특히 인간 항원에 특이적으로 결합할 수 없다. 항원에 대한 상기 면역글로불린 분자의 특이적 결합의 부재(즉, 비-특이적 상호작용과 구별될 수 있는 임의의 결합의 부재)는, 예를 들면, ELISA 또는 본원에 기술된 바와 같은 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정할 수 있다. 상기와 같은 면역글로불린 분자는, 예를 들면, 특정한 조직으로의 표적화가 바람직하지 않은 경우, 융합 단백질의 혈청 반감기를 증대시키기에 특히 유용하다.
일 실시양태에서, 상기 면역글로불린 분자는 인간 Vh3-23 생식세포 서열을 기반으로 하는 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 면역글로불린 분자는 서열번호 9의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 면역글로불린 분자는 인간 Vk3-20 생식세포 서열을 기반으로 하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 면역글로불린 분자는 서열번호 11의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 보다 더 특정한 실시양태에서, 상기 면역글로불린 분자는 서열번호 9의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 11의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 상기 가변 영역 서열들을 포함하는 면역글로불린 분자는 항원, 특히 인간 항원에 특이적으로 결합할 수 없다. 이들은 정상 조직뿐 아니라 PBMC에 대한 결합이 결여되고, 다중반응성을 갖지 않으며, 영상화에 의해 생체내 비-특이적 축적을 보이지 않는다(데이터 나타내지 않음). 가변 영역 서열들은, GSG 서열이 도입되어 비-결합 면역글로불린을 생성한 중쇄 CDR3을 제외하고, 전적으로 인간 생식세포 서열을 기반으로 한다.
일 실시양태에서, 상기 돌연변이체 IL-2 분자는 인간 IL-2의 잔기 88(서열번호 1)에 상응하는 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이다. 더욱 특정한 실시양태에서, 상기 아미노산 치환은 N88D, N88R, N88I 및 N88G의 군에서 선택된다. 특정 실시양태에서, 상기 아미노산 치환은 N88D이다. 일 실시양태에서, 상기 돌연변이체 IL-2 분자는 인간 IL-2 분자이다. 특정한 실시양태에서, 상기 돌연변이체 IL-2 분자는 서열번호 60의 서열(IL-2 N88D)을 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 돌연변이체 IL-2 분자는 야생형 IL-2 분자에 비해 중간 친화도 IL-2 수용체에 대한 돌연변이체 IL-2 분자의 친화도를 감소시키는 오직 하나의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 돌연변이체 IL-2 분자는 야생형 IL-2 분자에 비해, 고-친화도 IL-2 수용체에 대한 돌연변이체 IL-2 분자의 친화도를 변경시키는 아미노산 돌연변이를 포함하지 않는다. 일 실시양태에서, 상기 돌연변이체 IL-2 분자는 야생형 IL-2 분자에 비해, IL-2 수용체에 대한 돌연변이체 IL-2 분자의 친화도를 변경시키는 오직 하나의 아미노산 돌연변이를 포함한다.
일 실시양태에서, 상기 돌연변이체 IL-2 분자는 인간 IL-2의 잔기 125에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 아미노산 치환은 C125A이다. 특정 실시양태에서, 상기 돌연변이체 IL-2 분자는 서열번호 62(아미노산 치환 C125A를 갖는 IL-2 N88D)의 서열을 포함한다. 다르게는, 위치 125에서 시스테인은, 미국 특허 제 4,518,584 호에 기술된 바와 같이, 세린, 트레오닌 또는 발린과 같은 또 다른 중성 아미노산으로 대체되어 각각 C125S IL-2, C125T IL-2 또는 C125V IL-2를 생성한다. 상기 특허에 기술된 바와 같이, 또한 IL-2의 N-말단 알라닌 잔기를 결실시켜 des-A1 C125S 또는 des-A1 C125A와 같은 돌연변이체를 수득할 수도 있다. 대안적으로 또는 추가로, IL-2 분자는 야생형 인간 IL-2의 위치 104에서 자연적으로 발생하는 메티오닌이 알라닌과 같은 중성 아미노산으로 대체된 돌연변이를 포함할 수 있다(미국 특허 제 5,206,344 호 참조). 인간 IL-2에서의 상기 변형은 증가된 발현 또는 안정성과 같은 추가의 이점을 제공할 수 있다.
본 발명의 융합 단백질에 포함된 돌연변이체 IL-2 분자는 또한 비글리코실화 IL-2 분자일 수 있다. 예를 들면, 융합 단백질이 CHO 또는 HEK 세포와 같은 포유동물 세포에서 발현될 때, IL-2 분자의 O-글리코실화 부위의 제거는 보다 동종인 생성물을 제공한다. 따라서, 특정 실시양태에서, 돌연변이체 IL-2 분자는 인간 IL-2의 잔기 3에 상응하는 위치에서 IL-2의 O-글리코실화 부위를 제거하는 변형을 추가로 포함한다. 일 실시양태에서, 인간 IL-2의 잔기 3에 상응하는 위치에서 IL-2의 O-글리코실화 부위를 제거하는 상기 변형은 아미노산 치환이다. 대표적인 아미노산 치환으로는 T3A, T3G, T3Q, T3E, T3N, T3D, T3R, T3K 및 T3P가 포함된다. 특정 실시양태에서, 상기 변형은 아미노산 치환 T3A이다. 특정 실시양태에서, 상기 돌연변이체 IL-2 분자는 서열번호 64(IL-2 T3A N88D)의 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 돌연변이체 IL-2 분자는 아미노산 치환 T3A, N88D 및 C125A를 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 돌연변이체 IL-2 분자는 서열번호 58(IL-2 T3A N88D C125A)의 서열을 포함한다.
일 실시양태에서, IL-2 βγ 수용체에 대한 본 발명의 융합 단백질의 결합은, IL-2 βγ 수용체에 대한 2개의 야생형 IL-2 분자를 포함하는 상응하는 융합 단백질의 결합에 비해 1.5배 이상, 바람직하게는 2배 이상 또는 3배 이상 감소된다. 일 실시양태에서, 상기 IL-2 βγ 수용체에 결합하는 본 발명의 융합 단백질의 친화도 상수(KD)는, 25℃에서 SPR에 의해 측정될 때, 2개의 야생형 IL-2 분자를 포함하는 상응하는 융합 단백질의 KD보다 2배 이상 더 높다. 특정 실시양태에서, 상기 IL-2 βγ 수용체는 인간 IL-2 βγ 수용체이다. 일 실시양태에서, IL-2 α 수용체에 대한 본 발명의 융합 단백질의 결합은 IL-2 α 수용체에 대한 2개의 야생형 IL-2 분자를 포함하는 상응하는 융합 단백질의 결합과 거의 동일하다. 일 실시양태에서, 상기 IL-2 α 수용체에 결합하는 본 발명의 융합 단백질의 친화도 상수(KD)는, 25℃에서 SPR에 의해 측정될 때, 2개의 야생형 IL-2 분자를 포함하는 상응하는 융합 단백질의 KD와 거의 동일하다. 특정 실시양태에서, 상기 IL-2 α 수용체는 인간 IL-2 α 수용체이다. SPR에 의해 IL-2 βγ 또는 IL-2 α 수용체에 대한 결합 친화도를 측정하는 방법은 본원에 기술되어 있다. 일 실시양태에 따르면, 결합 친화도(KD)는 CM5 또는 스트렙타비딘 칩상에 고정화된 IL-2 수용체를 사용하여 25℃에서 비아코어(등록상표) T100 기계(지이 헬쓰케어)를 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된다. 친화도 상수(KD)는 비 koff/kon으로서 계산된다(예를 들면, 문헌[Chen et al., J Mol Biol 293, 865-881(1999)] 참조).
특정 양상에서, 본 발명은 (i) 면역글로불린 중쇄에 아미노산 치환 L234A, L235A 및 P329G(EU 넘버링)를 포함하는 IgG1-서브클래스 면역글로불린 분자, 및 (ii) 각각 그의 N-말단 아미노산에서, 펩티드 연결기를 통해 면역글로불린 중쇄 중 하나의 C-말단 아미노산에 융합된, 아미노산 치환 N88D를 포함하는 2개의 돌연변이체 인터류킨-2(IL-2) 분자를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 일 실시양태에서, 상기 면역글로불린 분자 및 상기 IL-2 분자는 인간 분자들이다. 특정 실시양태에서, 상기 면역글로불린 분자는 서열번호 9의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 11의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 다른 특정 실시양태에서, 상기 IL-2 분자는 각각 서열번호 58의 아미노산 서열을 포함한다. 추가 실시양태에서, 상기 펩티드 연결기는 아미노산 서열(G4S)3(서열번호 66)을 포함한다. 보다 더 특정한 실시양태에서, 상기 융합 단백질은 서열번호 50의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 및 서열번호 19의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함한다.
실시예에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 융합 단백질은 조절 T 세포를 선택적으로 활성화시킨다(즉, 본질적으로, 다른 T 세포 아형 및/또는 NK 세포의 동반 활성화 없음). 따라서, 일 양상에서, 본 발명은 면역글로불린 분자 및 2개의 돌연변이체 IL-2 분자를 포함하는 융합 단백질을 제공하고, 이때 상기 융합 단백질은 효과기 T 세포 및 NK 세포, 특히 통상의 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 및 NK 세포 상에서 조절 T 세포를 선택적으로 활성화시킨다. 일 실시양태에서, 상기 융합 단백질은 조절 T 세포를 효과기 T 세포 및 NK 세포보다 10배 이상, 100배 이상, 또는 1000배 이상 활성화시킨다. 일 실시양태에서, 상기 융합 단백질은 통상의 CD4+ 기억 T 세포 상에서 조절 T 세포를 선택적으로 활성화시킨다. 일 실시양태에서, 상기 융합 단백질은 조절 T 세포를 통상의 CD4+ 기억 T 세포보다 10배 이상, 100배 이상 또는 1000배 이상 활성화시킨다. 일 실시양태에서, 상기 활성화는 세포내 STAT, 특히 STAT5 인산화 수준의 측정에 의해 결정된다. 일 실시양태에서, 상기 세포내 STAT 인산화 수준의 측정은 유동 세포측정 분석에 의해 수행된다. 일 실시양태에서, 조절 T 세포에서 IL-2 수용체 신호전달의 유도를 위한 상기 융합 단백질의 EC50 값은 효과기 T 세포 및 NK 세포에서 IL-2 수용체 신호전달의 유도를 위한 이의 EC50 값보다 10배 이상, 100배 이상 또는 1000배 이상 적다. 일 실시양태에서, 상기 IL-2 수용체 신호전달의 유도는 STAT 인산화의 유도이다. 일 실시양태에서, 조절 T 세포에서 IL-2 수용체 신호전달의 유도를 위한 상기 융합 단백질의 EC50 값은 통상의 CD4+ 기억 T 세포에서 IL-2 수용체 신호전달의 유도를 위한 이의 EC50 값보다 10배 이상, 100배 이상 또는 1000배 이상 적다. 일 실시양태에서, 상기 IL-2 수용체 신호전달의 유도는 STAT 인산화의 유도이다.
추가 양상에서, 본 발명은 특히 시험관내 또는 생체내 조절 T 세포의 선택적 활성화에 사용하기 위한 융합 단백질을 제공한다. 일 실시양태에서, 상기 사용은 조절 T 세포를 시험관내 또는 생체내 상기 융합 단백질과 접촉시키는 것을 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 사용은 또한 다른(비-조절) T 세포를 상기 융합 단백질과 접촉시키는 것을 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 사용은 시험관내 사용이고, 상기 융합 단백질은 약 10 ng/ml 이하, 특히 약 1 ng/ml 이하의 농도로 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 상기 사용은 생체내 사용이고, 상기 융합 단백질은 약 100 ㎍/kg 체중 이하, 특히 약 25 ㎍/kg 체중 이하, 보다 특히 약 10 ㎍/kg 체중 이하(여기서, "체중"은 융합 단백질이 투여되는 개체의 체중을 말한다)의 용량으로 사용된다.
본 발명은 또한, 상기 조절 T 세포를 본 발명의 융합 단백질과 접촉시키는 것을 포함하는, 시험관내 또는 생체내 조절 T 세포의 선택적 활성화를 위한 방법을 제공한다. 일 실시양태에서, 상기 방법은 또한 다른(비-조절) T 세포를 상기 융합 단백질과 접촉시키는 것을 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 활성화는 증식의 유도 및/또는 IL-2 수용체 신호전달의 유도를 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 방법은 시험관내 방법이고, 상기 융합 단백질은 약 10 ng/ml 이하, 특히 약 1 ng/ml 이하의 농도로 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 상기 방법은 생체내 방법이고, 상기 융합 단백질은 약 100 ㎍/kg 체중 이하, 특히 약 25 ㎍/kg 체중 이하, 보다 특히 약 10 ㎍/kg 체중 이하(여기서, "체중"은 융합 단백질이 투여되는 개체의 체중을 말한다)의 용량으로 사용된다.
앞 단락에 기술된 융합 단백질, 용도 또는 방법의 특정 실시양태에 따르면, 상기 활성화는 조절 T 세포의 증식 유도 및/또는 조절 T 세포에서 IL-2 수용체 신호전달의 유도를 포함한다. 증식의 유도는, 예를 들면, 실시예에 기술된 바와 같이, 세포내 증식 마커 Ki-67의 검출에 의해 측정될 수 있다. 일 실시양태에서, 본 발명의 융합 단백질에 의해 활성화된 조절 T 세포의 증식은, 비-활성화된 조절 T 세포의 증식에 비해, 약 1.5배 이상, 약 2배 이상 또는 약 3배 이상 증가된다. 일 실시양태에서, 본 발명의 융합 단백질과 접촉된 다른(비-조절) T 세포 및/또는 NK 세포의 증식은, 상기 융합 단백질과 접촉되지 않은 상응하는 세포의 증식에 비해, 약 1.5배 미만, 약 1.2배 미만 또는 약 1.1배 미만 증가된다. IL-2 수용체 신호전달의 유도는, 예를 들면, 실시예에 기술된 바와 같이, 인산화된 STAT5의 검출에 의해 측정될 수 있다. 일 실시양태에서, 본 발명의 융합 단백질에 의해 활성화된 조절 T 세포에서의 IL-2 수용체 신호전달은, 비-활성화된 조절 T 세포에서의 IL-2 수용체 신호전달에 비해, 약 1.5배 이상, 약 2배 이상, 약 3배 이상 또는 약 5배 이상 증가된다. 일 실시양태에서, 본 발명의 융합 단백질과 접촉된 다른(비-조절) T 세포 및/또는 NK 세포에서의 IL-2 수용체 신호전달은, 상기 융합 단백질과 접촉되지 않은 상응하는 세포에서의 IL-2 수용체 신호전달에 비해, 약 1.5배 미만, 약 1.2배 미만 또는 약 1.1배 미만 증가된다.
폴리뉴클레오티드
본 발명은 또한 본원에 기술된 바와 같은 융합물 또는 그의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 그의 기능성 단편 또는 변이체를 포함하여, 서열번호 10, 12, 20, 51, 59, 61, 63 및 65에 나타낸 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 것들을 포함한다.
본 발명의 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 전체 융합 단백질을 암호화하는 단일 폴리뉴클레오티드로서, 또는 동시-발현되는 다중(예를 들면, 2개 이상) 폴리뉴클레오티드로서 발현될 수 있다. 동시-발현되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드는, 예를 들면, 다이설파이드 결합 또는 다른 수단을 통해 결합되어 기능성 융합 단백질을 생성할 수 있다. 예를 들면, 면역글로불린의 경쇄 부분은 면역글로불린의 중쇄 부분과 별개의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 수 있다. 동시-발현될 때, 중쇄 폴리펩티드는 경쇄 폴리펩티드와 결합되어 면역글로불린을 형성할 것이다.
일 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 9 또는 11에 나타낸 바와 같은 가변 영역 서열을 암호화하는 서열을 포함하는, 면역글로불린 분자 및 2개의 IL-2 분자의 융합 단백질 또는 그의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 19 또는 50에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 암호화하는 서열을 포함하는, 면역글로불린 분자 및 2개의 IL-2 분자의 융합 단백질, 또는 그의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 또한 서열번호 10, 12, 20, 51, 59, 61, 63 또는 65에 나타낸 핵산 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열을 포함하는, 면역글로불린 분자 및 2개의 IL-2 분자의 융합 단백질 또는 그의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 10, 12, 20, 51, 59, 61, 63 또는 65에 나타낸 핵산 서열을 포함하는, 면역글로불린 분자 및 2개의 IL-2 분자의 융합 단백질, 또는 그의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 9 또는 11의 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 가변 영역 서열을 암호화하는 서열을 포함하는, 면역글로불린 분자 및 2개의 IL-2 분자의 융합 단백질, 또는 그의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 19 또는 50의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드 서열을 암호화하는 서열을 포함하는, 면역글로불린 분자 및 2개의 IL-2 분자의 융합 단백질, 또는 그의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열번호 9 또는 11의 가변 영역 서열을 암호화하는 서열을 포함하는, 면역글로불린 분자 및 2개의 IL-2 분자의 융합 단백질, 또는 그의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명은 또한, 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열번호 19 또는 50의 폴리펩티드 서열을 암호화하는 서열을 포함하는, 면역글로불린 분자 및 2개의 IL-2 분자의 융합 단백질, 또는 그의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 DNA이다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 RNA, 예를 들면, 메신저 RNA(mRNA) 형태의 RNA이다. 본 발명의 RNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
재조합 방법
본 발명의 융합 단백질은, 예를 들면, 고체-상태 펩티드 합성(예를 들면, 메리필드(Merrifield) 고상 합성) 또는 재조합 생성에 의해 수득될 수 있다. 재조합 생성의 경우, 예를 들어, 전술한 바와 같은 상기 융합 단백질(단편)을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 단리하고, 숙주 세포에서 추가의 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터에 삽입시킨다. 상기 폴리뉴클레오티드는 통상적인 절차를 이용하여 용이하게 단리되고 서열화될 수 있다. 일 실시양태에서, 본 발명의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 바람직하게는 발현 벡터가 제공된다. 당해 분야에 숙련된 자에게 널리 공지되어 있는 방법을 이용하여 적절한 전사/번역 조절 신호와 함께 융합 단백질(단편)의 암호화 서열을 함유하는 발현 벡터를 구축할 수 있다. 이러한 방법들로는 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체내 재조합/유전자 재조합이 포함된다. 예를 들면, 문헌[Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989); and Ausubel at al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)]에 기재된 기술 참조한다. 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스의 일부일 수 있거나, 핵산 단편일 수 있다. 발현 벡터는, 융합 단백질(단편)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(즉, 암호화 영역)가 프로모터 및/또는 다른 전사 또는 번역 조절 요소와 작동가능하게 결합되어 클로닝되는 발현 카세트를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "암호화 영역"은 아미노산으로 번역되는 코돈으로 이루어지는 핵산의 일부이다. "정지 코돈"(TAG, TGA 또는 TAA)은 아미노산으로 번역되지는 않지만, 존재하는 경우, 암호화 영역의 일부인 것으로 간주될 수 있으나, 임의의 인접(flanking) 서열, 예를 들면, 프로모터, 리보솜 결합 부위, 전사 종결인자, 인트론, 5' 및 3' 미번역 영역 등은 암호화 영역의 일부가 아니다. 2개 이상의 암호화 영역이 단일 폴리뉴클레오티드 구축물에, 예를 들면, 단일 벡터 상에, 또는 별개의 폴리뉴클레오티드 구축물들에, 예를 들면, 별개의(상이한) 벡터 상에 존재할 수 있다. 또한, 임의의 벡터는 단일 암호화 영역을 함유할 수 있거나, 2개 이상의 암호화 영역을 포함할 수 있고, 예를 들면, 본 발명의 벡터는 번역 후 또는 번역과 동시에 단백질분해성 절단에 의해 최종 단백질로 분리되는 하나 이상의 폴리펩티드를 암호화할 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 본 발명의 융합 단백질(단편) 또는 그의 변이체 또는 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 융합되거나 비융합된 이종 암호화 영역을 암호화할 수 있다. 이종 암호화 영역은 제한하지 않고 분화된(specialized) 요소 또는 모티프, 예를 들면, 분비 신호 펩티드 또는 이종 기능성 도메인을 포함한다. 작동가능한 결합은 유전자 산물, 예를 들면, 폴리펩티드에 대한 암호화 영역이 조절 서열(들)의 영향 또는 조절하에 유전자 산물의 발현이 일어나게 하는 방식으로 하나 이상의 조절 서열과 결합되는 경우이다. 2개의 DNA 단편(예를 들면, 폴리펩티드 암호화 영역 및 그와 결합된 프로모터)은, 프로모터 기능의 유도가 목적하는 유전자 산물을 암호화하는 mRNA의 전사를 야기하는 경우, 및 2개의 DNA 단편 사이의 연결기의 특징이 유전자 산물의 발현을 유도하는 발현 조절 서열의 능력을 방해하지 않거나 전사될 DNA 주형의 능력을 방해하지 않는 경우 "작동가능하게 결합"된다. 따라서, 프로모터 영역은, 프로모터가 핵산의 전사를 수행할 수 있는 경우 폴리펩티드를 암호화하는 핵산과 작동가능하게 결합될 수 있다. 프로모터는, 예정된 세포에서만 DNA의 실질적인 전사를 유도하는 세포-특이적 프로모터일 수 있다. 프로모터 이외에 다른 전사 조절 요소, 예를 들면, 인핸서, 작동기, 억제인자 및 전사 종료 신호가 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 결합되어 세포-특이적 전사를 유도할 수 있다. 적합한 프로모터 및 다른 전사 조절 영역들이 본원에 개시되어 있다. 다양한 전사 조절 영역들이 당해 분야에 숙련된 자에게 공지되어 있다. 이들로는, 제한하지 않고, 척추동물 세포에서 작용하는 전사 조절 영역, 예를 들면, 사이토메갈로바이러스(예를 들면, 인트론-A와 함께, 즉시 초기 프로모터), 유인원 바이러스 40(예를 들면, 초기 프로모터) 및 레트로바이러스(예를 들면, 라우스(Rous) 육종 바이러스)로부터의 프로모터 및 인핸서 단편(이로 한정되지는 않는다)이 포함된다. 다른 전사 조절 영역으로는 액틴, 열충격 단백질, 소 성장 호르몬 및 토끼 a-글로빈과 같은 척추동물 유전자로부터 유도된 것들, 및 진핵 세포에서 유전자 발현을 조절할 수 있는 다른 서열이 포함된다. 또 다른 적합한 전사 조절 영역으로는 조직-특이적 프로모터 및 인핸서, 및 유도성 프로모터(예를 들면, 테트라사이클린 유도성 프로모터)가 포함된다. 유사하게, 다양한 번역 조절 요소들이 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자에게 공지되어 있다. 이들로는 리보솜 결합 부위, 번역 개시 및 종료 코돈, 및 바이러스 시스템으로부터 유도된 요소들(특히, CITE 서열로도 지칭되는 내부 리보솜 유입 부위 또는 IRES)이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 발현 카세트는 또한 복제 기점 및/또는 염색체 통합 요소, 예를 들어, 레트로바이러스의 긴 말단 반복서열(LTR), 또는 아데노-결합 바이러스(AAV) 역 말단 반복서열(ITR)과 같은 다른 특징들을 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 핵산 암호화 영역은, 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드의 분비를 유도하는 분비 또는 신호 펩티드를 암호화하는 추가의 암호화 영역과 결합될 수 있다. 예를 들면, 융합물의 분비를 목적하는 경우, 신호 서열을 암호화하는 DNA는 본 발명의 융합 단백질 또는 그의 단편을 암호화하는 핵산의 상류에 위치할 수 있다. 신호 가설에 따르면, 포유동물 세포에 의해 분비된 단백질은, 조면 소포체를 가로질러 성장 단백질 쇄의 확산이 개시되자마자 성숙 단백질로부터 절단되는 신호 펩티드 또는 분비 리더 서열을 갖는다. 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자라면, 척추동물 세포에 의해 분비된 폴리펩티드는 일반적으로 폴리펩티드의 N-말단에 융합된 신호 펩티드를 가지며, 상기 신호 펩티드는 번역된 폴리펩티드로부터 절단되어 분비된 또는 "성숙한" 형태의 폴리펩티드를 생성함을 인지할 것이다. 특정 실시양태에서, 천연 신호 펩티드, 예를 들면, 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 신호 펩티드, 또는 그와 작동가능하게 결합된 폴리펩티드의 분비를 유도하는 능력을 보유하는 상기 서열의 기능성 유도체가 사용된다. 다르게는, 이종 포유동물 신호 펩티드 또는 그의 기능성 유도체가 사용될 수도 있다. 예를 들면, 야생형 리더 서열은 인간 조직 플라스미노겐 활성화제(TPA) 또는 마우스 β-글루쿠로니다제의 리더 서열로 치환될 수 있다. 예시적인 분비 신호 펩티드의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 각각 서열번호 39 내지 47에 나타내었다.
후속의 정제를 촉진하거나(예를 들면, 히스티딘 태그) 융합 단백질의 표지화를 돕기 위해 사용될 수 있는 짧은 단백질 서열을 암호화하는 DNA는 융합 단백질(단편) 암호화 폴리뉴클레오티드 내에 또는 그의 말단에 포함될 수 있다.
추가 실시양태에서, 본 발명의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 하나 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 상기 폴리뉴클레오티드 및 벡터는 폴리뉴클레오티드 및 벡터 각각과 관련하여 본원에 기술된 임의의 특징들을 단독으로 또는 조합하여 혼입될 수 있다. 상기 일 실시양태에서, 숙주 세포는 본 발명의 융합 단백질(의 일부)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함한다(예를 들면, 상기 벡터로 형질전환 또는 형질감염되었다). 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "숙주 세포"는 본 발명의 융합 단백질 또는 그의 단편을 생성하도록 조작될 수 있는 임의의 종류의 세포 시스템을 말한다. 융합 단백질을 복제하고 그의 발현을 지지하기에 적합한 숙주 세포는 당해 분야에 공지되어 있다. 상기 세포는 특정한 발현 벡터로 적절하게 형질감염 또는 형질도입될 수 있으며, 대규모 발효조에 접종하여 임상 용도로 충분한 양의 융합 단백질을 수득하기 위해 대량의 벡터 함유 세포를 성장시킬 수 있다. 적합한 숙주 세포로는 원핵 미생물, 예를 들면, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 또는 다양한 진핵 세포, 예를 들면, 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO), 곤충 세포 등이 포함된다. 예를 들면, 폴리펩티드는 특히 글리코실화가 필요하지 않은 경우 세균에서 생성될 수 있다. 발현 후에, 폴리펩티드는 가용성 분획중 세균 세포 페이스트로부터 단리될 수 있고, 추가 정제될 수 있다. 원핵생물 이외에, 글리코실화 경로가 "인간화"되어 부분적으로 또는 완전히 인간 글리코실화 패턴으로 폴리펩티드의 생성을 야기하는 진균류 및 효모 균주를 포함하여, 사상 진균류 또는 효모와 같은 진핵 미생물이 폴리펩티드-암호화 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다(문헌[Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414(2004); and Li et al., Nat Biotech 24, 210-215(2006)] 참조). (글리코실화) 폴리펩티드의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포성 유기체(무척추동물 및 척추동물)로부터 유도된다. 무척추동물 세포의 예로는 식물 및 곤충 세포가 포함된다. 특히 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해, 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 많은 바큘로바이러스 균주가 확인되었다. 식물 세포 배양물도 또한 숙주로 사용될 수 있다(예를 들면, (유전자전이 식물에서 항체를 생성하기 위한 플랜티바디즈(PLANTIBODIES: 등록상표) 기술을 설명하고 있는) 미국 특허 제 5,959,177 호, 제 6,040,498 호, 제 6,420,548 호, 제 7,125,978 호 및 제 6,417,429 호 참조). 척추동물 세포도 또한 숙주로 사용될 수 있다. 예를 들면, 현탁액 중에서 성장하도록 적응된 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40(COS-7)에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주; 인간 배아 신장 세포주(예를 들면, 문헌[Graham et al., J Gen Virol 36, 59(1977)]에 기술된 바와 같은 293 또는 293T 세포), 베이비 햄스터 신장 세포(BHK), 마우스 세르톨리(sertoli) 세포(예를 들면, 문헌[Mather, Biol Reprod 23, 243-251(1980)]에 기술된 바와 같은 TM4 세포), 원숭이 신장 세포(CV1), 아프리카 초록 원숭이 신장 세포(VERO-76), 인간 자궁경부암 세포(HELA), 개 신장 세포(MDCK), 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A), 인간 폐 세포(W138), 인간 간 세포(Hep G2), 마우스 유선 종양 세포(MMT 060562), TRI 세포(예를 들면, 문헌[Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68(1982)]에 기술된 바와 같음), MRC 5 세포 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주로는 dhfr_ CHO 세포를 비롯한 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포(문헌[Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216(1980)]); 및 YO, NS0, P3X63 및 Sp2/0과 같은 골수종 세포주가 포함된다. 단백질 생성에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해서는, 예를 들면, 문헌[Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248(B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268(2003)]을 참조한다. 숙주 세포로는 배양된 세포, 몇 가지만 예를 들면, 포유동물 배양된 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 세균 세포 및 식물 세포뿐 아니라, 유전자전이 동물, 유전자전이 식물 또는 배양된 식물 또는 동물 조직 내에 포함된 세포가 포함된다. 일 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵 세포, 바람직하게는 포유동물 세포, 예를 들면, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 인간 배아 신장(HEK) 세포 또는 림프종 세포(예를 들면, Y0, NS0, Sp20 세포)이다.
상기 시스템에서 외래 유전자를 발현하기 위한 표준 기술이 당해 분야에 공지되어 있다. 면역글로불린의 중쇄 또는 경쇄를 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 세포는, 발현된 생성물이 중쇄 및 경쇄 둘 다를 갖는 면역글로불린이도록 면역글로불린 쇄 중 나머지 쇄를 또한 발현하기 위해 조작될 수 있다.
일 실시양태에서, 융합 단백질의 발현에 적합한 조건하에서, 본원에 제공된 바와 같은 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 배양하고, 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 융합 단백질을 회수하는 것을 포함하는, 본 발명에 따른 융합 단백질의 생성 방법이 제공된다.
본 발명의 융합 단백질에서, 성분들(면역글로불린 분자 및 IL-2 분자)은 서로에 유전적으로 융합된다. 융합 단백질은, 그 성분들이 서로에 직접적으로 또는 연결기 서열을 통해 간접적으로 융합되도록 설계될 수 있다. 연결기의 조성 및 길이는 당해 분야에 공지된 방법에 따라 측정될 수 있으며, 효능에 대해 시험될 수 있다. 바람직한 경우, 융합 단백질의 개별 성분들을 분리하도록 절단 부위를 혼입시키기 위해 추가의 서열, 예를 들면, 엔도펩티다아제 인식 서열이 또한 포함될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 융합 단백질은 적어도 항원에 결합할 수 있는 면역글로불린 가변 영역을 포함한다. 가변 영역은 천연 또는 비-천연 항체 및 그의 단편의 일부를 형성할 수 있고, 이로부터 유도될 수 있다. 다클론성 항체 및 단클론성 항체를 생성하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들면, 문헌[Harlow and Lane, "Antibodies, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)] 참조). 비-천연 항체는 고상-펩티드 합성을 이용하여 구축될 수 있거나, 재조합적으로 생성될 수 있거나(예를 들면, 미국 특허 제 4,186,567 호에 기술된 바와 같이), 또는 예를 들면, 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 포함하는 조합 라이브러리를 스크리닝함으로써(예를 들면, 맥카퍼티(McCafferty)의 미국 특허 제 5,969,108 호 참조) 생성될 수 있다.
임의의 동물 종의 면역글로불린을 본 발명에 사용할 수 있다. 본 발명에 유용한 비-제한적 면역글로불린은 뮤린, 영장류 또는 인간 기원일 수 있다. 융합 단백질이 인간에 사용하기 위한 것인 경우, 면역글로불린의 불변 영역이 인간으로부터 유도된 면역글로불린의 키메라 형태를 사용할 수 있다. 면역글로불린의 인간화 또는 완전 인간 형태는 또한 당해 분야에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다(예를 들면, 윈터(Winter)의 미국 특허 제 5,565,332 호 참조). 인간화는, (a) 비인간(예를 들면, 기증자 항체) CDR의 인간(예를 들면, 수용자 항체) 프레임워크, 및 핵심(critical) 프레임워크 잔기(예를 들면, 우수한 항원 결합 친화도 또는 항체 기능을 유지하는데 중요한 것들)를 갖거나 갖지 않는 불변 영역 상으로의 그래프팅, (b) 비인간 특이성-결정 영역(SDR 또는 a-CDR; 항체-항원 상호작용에 결정적인 잔기)의 인간 프레임워크 및 불변 영역 상으로의 그래프팅, 또는 (c) 전체 비인간 가변 도메인을 이식하되, 표면 잔기의 치환에 의해 인간-유사 구획으로 이들을 "클로킹(cloaking)"하는 것을 포함하지만 이로 한정되지는 않는 다양한 방법들에 의해 달성될 수 있다. 인간화 항체 및 그의 제조 방법은, 예를 들면, 문헌[Almagro and Fransson, Front Biosci 13, 1619-1633(2008)]에 개관되어 있으며, 예를 들면, 다음 문헌들에 더 기술되어 있다: 문헌[Riechmann et al., Nature 332, 323-329(1988); Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033(1989)]; 미국 특허 제 5,821,337 호, 제 7,527,791 호, 제 6,982,321 호 및 제 7,087,409 호; 문헌[Jones et al., Nature 321, 522-525(1986)]; [Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855(1984)]; [Morrison and Oi, Adv Immunol 44, 65-92(1988)]; [Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536(1988)]; [Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217(1994)]; [Kashmiri et al., Methods 36, 25-34(2005)(SDR(a-CDR) 그래프팅을 기술하고 있음)]; [Padlan, Mol Immunol 28, 489-498(1991)("표면처리(resurfacing)"를 기술하고 있음)]; [Dall'Acqua et al., Methods 36, 43-60(2005)("FR 셔플링"을 기술하고 있음)]; 및 [Osbourn et al., Methods 36, 61-68(2005)] 및 [Klimka et al., Br J Cancer 83, 252-260(2000)(FR 셔플링에 대한 "유도 선택" 접근방법을 기술하고 있음)]. 본 발명에 따른 특정한 면역글로불린은 인간 면역글로불린이다. 인간 항체 및 인간 가변 영역은 당해 분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 문헌[van Dijk and van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-374(2001)] 및 [Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459(2008)]에 기술되어 있다. 인간 가변 영역은 하이브리도마 방법에 의해 제조된 인간 단클론성 항체의 일부를 형성할 수 있으며, 이로부터 유도될 수 있다(예를 들면, 문헌[Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)] 참조). 인간 항체 및 인간 가변 영역은 또한, 항원 자극에 반응하여 비손상 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 갖는 비손상 항체를 생성하도록 변형된 유전자전이 동물에 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다(예를 들면, 문헌[Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125(2005)] 참조). 인간 항체 및 인간 가변 영역은 또한 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 영역 서열을 단리시킴으로써 생성될 수 있다(예를 들면, 문헌[Hoogenboom et al., Methods in Molecular Biology 178, 1-37(O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)]; 및 [MaCafferty et al., Nature 348, 552-554; Clackson et al., Nature 352, 624-628(1991)] 참조). 파지는 전형적으로 단일쇄 Fv(scFv) 단편으로서 또는 Fab 단편으로서 항체 단편을 나타낸다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 융합 단백질에 포함되는 면역글로불린은, 예를 들면, 본원에 그 전체가 참고로 인용된 PCT 공개공보 WO 2012/020006 호(친화도 증진(affinity maturation)에 관한 실시예 참조) 또는 미국 특허출원 공개공보 제 2004/0132066 호에 개시된 방법에 따라 증대된 결합 친화도를 갖도록 조작된다. 특이적 항원 결정인자에 결합하는 본 발명의 융합 단백질의 능력은, 효소-결합 면역흡착 분석법(ELISA) 또는 당해 분야의 기술을 가진 자에게 친숙한 다른 기술, 예를 들면, 표면 플라즈몬 공명 기술[Liljeblad, et al., Glyco J 17, 323-329(2000)] 및 통상적인 결합 분석법[Heeley, Endocr Res 28, 217-229(2002)]을 통해 측정될 수 있다. 경쟁 분석법을 이용하여, 특정 항원에 대한 결합에 대해 기준 항체와 경쟁하는 항체를 확인할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 경쟁 항체는 기준 항체에 의해 결합되는 동일 에피토프(예를 들면, 선형 또는 입체형태 에피토프)에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프를 지도화하기 위한 상세한 예시적인 방법은 문헌[Morris, "Epitope Mapping Protocols", Methods in Molecular Biology vol. 66(인간 Press, Totowa, NJ)(1996)]에 제공되어 있다. 대표적인 경쟁 분석법에서는, 항원에 결합하는 제 1 표지화 항체 및 항원에 대한 결합에 대해 제 1 항체와 경쟁하는 그의 능력에 대해 시험되는 제 2의 비표지화 항체를 포함하는 용액 중에서 고정화된 항원을 배양한다. 상기 제 2 항체는 하이브리도마 상청액 중에 존재할 수 있다. 대조군으로, 제 1 표지화 항체는 포함하지만 제 2 비표지화 항체는 포함하지 않는 용액 중에서 고정화 항체를 배양한다. 제 1 항체의 항원에 대한 결합을 허용하는 조건하에서 배양한 후, 과잉 미결합 항체를 제거하고, 고정화 항원과 결합된 표지의 양을 측정한다. 고정화 항원과 결합된 표지의 양이 대조군 샘플에 비해 시험 샘플에서 실질적으로 감소된다면, 그것은 제 2 항체가 항원에 결합하기 위한 제 1 항체와 경쟁하는 것을 시사한다(문헌[Harlow and Lane(1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch. 14(Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)] 참조).
본원에 기술된 바와 같이 제조된 융합 단백질은 당해 분야에 공지된 기술, 예를 들면, 고성능 액체 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 전기영동, 친화 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 등에 의해 정제될 수 있다. 특정한 단백질을 정제하기 위해 사용되는 실제 조건은, 부분적으로, 순전하(net charge), 소수성, 친수성 등과 같은 요인들에 따라 달라질 것이며, 당해 분야에 기술을 가진 자에게 명백할 것이다. 친화 크로마토그래피 정제의 경우, 융합 단백질을 결합하는 항체, 리간드, 수용체 또는 항원을 사용할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 융합 단백질의 친화 크로마토그래피 정제를 위해, 단백질 A 또는 단백질 G를 갖는 매트릭스를 사용할 수 있다. 순차적 단백질 A 또는 G 친화 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 필수적으로 실시예에 기술된 바와 같이 융합 단백질을 단리할 수 있다. 융합 단백질의 순도는 겔 전기영동, 고압 액체 크로마토그래피 등을 포함하여 다양한 널리 공지된 임의의 분석 방법에 의해 측정할 수 있다. 예를 들면, 실시예에 기술된 바와 같이 발현된 융합 단백질은, 환원 빛 비환원 SDS-PAGE에 의해 입증되듯이 비손상되고 적절히 구성된 것으로 나타났다(예를 들면, 도 4 참조).
조성물, 제형 및 투여 경로
추가 양상에서, 본 발명은, 예를 들면, 임의의 하기 치료 방법에 사용하기 위한, 본원에 제공된 임의의 융합 단백질을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 일 실시양태에서, 약학 조성물은 본원에 제공된 임의의 융합 단백질 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 약학 조성물은 본원에 제공된 임의의 융합 단백질, 및 예를 들면, 하기 기술하는 바와 같은 하나 이상의 추가의 치료제를 포함한다.
또한, (a) 본 발명에 따른 융합 단백질을 수득하고, (b) 상기 융합 단백질을 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체와 함께 제형화시킴으로써 융합 단백질의 제제가 생체내 투여를 위해 제형화되는 것을 포함하는, 생체내 투여에 적합한 형태로 본 발명의 융합 단백질을 제조하는 방법이 제공된다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체에 용해 또는 분산된 하나 이상의 융합 단백질을 치료 효과량을 포함한다. "약학적으로 또는 약리학적으로 허용되는"이란 어구는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 일반적으로 무독성인, 즉, 예를 들면, 인간과 같은 동물에 적절하게 투여될 때, 해롭거나, 알레르기성이거나 다른 부적당한 반응을 일으키지 않는 분자 물질 및 조성물을 말한다. 하나 이상의 융합 단백질 및 임의적으로 추가의 활성 성분을 함유하는 약학 조성물의 제제는, 본원에 참고로 인용된 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company(1990)]에 예시된 바와 같이, 본 개시내용에 비추어, 당해 분야에 기술을 가진 자에게 공지되어 있을 것이다. 또한, 동물(예를 들면, 인간) 투여의 경우, 제제들은 생물 표준에 대한 FDA 사무국 또는 다른 국가에서 상응하는 기관에 의해 요구되는 바와 같은 멸균성, 발열원성, 일반 안전성 및 순도 표준을 충족시켜야 함을 이해할 것이다. 바람직한 조성물은 동결건조된 제형 또는 수용액이다. 본원에서 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용되는 담체"는 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자에게 공지될 수 있는 바와 같이, 임의의 및 모든 용매, 완충제, 분산 매질, 코팅제, 계면활성제, 산화방지제, 방부제(예를 들면, 항균제, 항진균제), 등장화제, 흡수 지연제, 염, 단백질, 약물, 약물 안정화제, 중합체, 겔, 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 향미제, 염료, 상기 유사 물질 및 그의 조합들을 포함한다(예를 들면, 본원에 참고로 인용된 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329] 참조). 임의의 통상적인 담체가 활성 성분과 비상용성인 경우를 제외하고, 치료 또는 약학 조성물에 상기 활성성분의 사용이 고려된다.
조성물은, 고체, 액체 또는 에어로졸 형태로 투여되는지 여부, 및 주사와 같은 투여 경로를 위해 멸균되어야 하는지 여부에 따라서 다양한 유형의 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 융합 단백질(및 임의의 추가 치료제)는 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자에게 공지된 바와 같은 임의의 방법 또는 상기 방법의 임의의 조합에 의해 투여될 수 있다(예를 들면, 본원에 참고로 인용된 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company (1990)] 참조). 비경구 투여, 특히 정맥내 주사가 본 발명의 융합 단백질과 같은 폴리펩티드 분자를 투여하기 위해 가장 일반적으로 사용된다.
비경구 조성물로는 주사, 예를 들면, 피하, 피내, 병변내, 정맥내, 동맥내, 근육내, 기관지내 또는 복강내 주사에 의해 투여하기 위해 설계된 것들이 포함된다. 주사의 경우, 본 발명의 융합 단백질은 수용액 중에, 바람직하게는 생리학적으로 상용성인 완충제, 예를 들어, 행크스(Hanks) 용액, 링거(Ringer) 용액 또는 생리적 식염수 완충액 중에 제형화될 수 있다. 상기 용액은 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 함유할 수 있다. 다르게는, 융합 단백질은 사용전에, 적당한 비히클, 예를 들면, 멸균 발열원-비함유수로 조성되기 위한 분말 형태일 수 있다. 멸균 주사액은 본 발명의 융합 단백질을, 필요에 따라, 하기에 열거된 다양한 다른 성분들과 함께 적절한 용매에 필요량으로 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균성은, 예를 들면, 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 다양한 멸균된 활성 성분들을 기본 분산 매질 및/또는 다른 성분들을 함유하는 멸균 비히클 내에 혼입시켜 제조된다. 멸균 주사액, 현탁액 또는 유화액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 사전에 멸균-여과된 액체 매질로부터 활성 성분과 임의의 추가의 바람직한 성분들의 분말을 제공하는 진공-건조 또는 동결-건조 기술이다. 액체 매질은 필요한 경우 적절히 완충되어야 하며, 액체 희석제는 주사 전에 충분한 식염수 또는 글루코스로 먼저 등장성이 되어야 한다. 조성물은 제조 및 저장 조건하에서 안정해야 하며, 세균 및 진균류와 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 내독소 오염은 안전한 수준에서, 예를 들면, 0.5 ng/mg 단백질 미만으로 최소한으로 유지되어야 함을 인지할 것이다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체로는 다음이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다: 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌을 비롯한 산화방지제; 방부제(예를 들면, 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레솔); 저분자량(약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들면, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들면, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들면, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 모노사카라이드, 다이사카라이드, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 다른 탄수화물; 킬레이트화제, 예를 들면, EDTA; 당, 예를 들면, 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 상대-이온, 예를 들면, 나트륨; 금속 착체(예를 들면, Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜(PEG). 수성 주사용 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 화합물, 예를 들면, 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 소르비톨, 덱스트란 등을 함유할 수 있다. 임의적으로, 현탁액은 또한 적당한 안정화제, 또는 화합물의 용해도를 증가시켜 고농축 용액을 제조하는 약제를 함유할 수 있다. 추가적으로, 활성 화합물의 현탁액은 적절하게 유성 주사 현탁액으로 제조될 수 있다. 적당한 친유성 용매 또는 비히클로는 지방 오일, 예를 들면, 호마유 또는 합성 지방산 에스터, 예를 들어, 에틸 클리에이트 또는 트라이글리세리드 또는 리포솜이 포함된다.
본 발명의 융합 단백질을 포함하는 약학 조성물은 통상적인 혼합, 용해, 유화, 캡슐화, 봉입 또는 동결건조 공정에 의해 제조될 수 있다. 약학 조성물은, 단백질을 약학적으로 사용될 수 있는 제제로 가공하는 것을 촉진하는 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제를 사용하여 통상적인 방법으로 제형화될 수 있다. 적절한 제형은 선택된 투여 경로에 따라 달라진다.
융합 단백질은 유리 산 또는 염기, 중성 또는 염 형태로 조성물 중에 배합될 수 있다. 약학적으로 허용되는 염은 유리 산 또는 염기의 생물 활성을 실질적으로 유지하는 염이다. 이들로는 산 부가염, 예를 들면, 단백질성 조성물의 유리 아미노기에 의해 생성된 염, 또는 예를 들면, 염산 또는 인산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산 또는 만델산과 같은 유기산에 의해 생성된 염이 포함된다. 유리 카복실기에 의해 생성된 염도 또한, 예를 들면, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 철 수산화물과 같은 무기 염기; 또는 이소프로필아민, 트라이메틸아민, 히스티딘 또는 프로카인과 같은 유기 염기로부터 유도될 수 있다. 약학적 염은 상응하는 유리 염기 형태보다 수성 및 다른 양성자성 용매에 더 가용성인 경향이 있다.
치료 방법 및 조성물
본원에 제공된 임의의 융합 단백질은 치료 방법에 사용될 수 있다.
치료 방법에 사용하기 위해, 본 발명의 융합 단백질은 우수한 의료 관행에 따른 방식으로 제형화되고 조제되고 투여된다. 이와 관련하여 고려될 요인으로는 치료되는 특정 질환, 치료되는 특정 포유동물, 개별 환자의 임상 상태, 질환의 원인, 약제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정, 및 의사에게 공지되어 있는 기타 요인들이 포함된다.
일 양상에서, 약제로 사용하기 위한 본 발명의 융합 단백질이 제공된다. 추가 양상에서, 질환을 치료하는데 사용하기 위한 본 발명의 융합 단백질이 제공된다. 특정 실시양태에서, 치료 방법에 사용하기 위한 본 발명의 융합 단백질이 제공된다. 일 실시양태에서, 본 발명은 그를 필요로 하는 개체에서 질환의 치료에 사용하기 위한 본원에 기술된 바와 같은 융합 단백질을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은, 개체에게 치료 효과량의 융합 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 질환을 갖는 개체를 치료하는 방법에 사용하기 위한 융합 단백질을 제공한다. 특정 실시양태에서, 치료될 질환은 자가면역 질환이다. 대표적인 자가면역 질환으로는 제 1형 당뇨병, 건선, 천식, 류마티스성 관절염, 염증성 장 질환, 크론병, 궤양성 대장염, 전신 홍반성 루푸스(SLE) 및 다발성 경화증이 포함된다. 일 실시양태에서, 상기 질환은 이식 거부 또는 이식편-대-숙주 질환이다. 특정 실시양태에서, 상기 질환은 제 1형 당뇨병, 염증성 장 질환, 크론병, 궤양성 대장염, SLE 및 다발성 경화증으로 이루어진 군에서 선택된다. 보다 특정한 실시양태에서, 상기 질환은 제 1형 당뇨병이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 상기 질환은 염증성 장 질환이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 상기 질환은 다발성 경화증이다. 추가 실시양태에서, 상기 질환은 천식, 폐섬유증 또는 폐쇄성 폐질환이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 질환은 심혈관 질환, 특히 아테롬성경화증 및 급성 관동맥 증후군이다. 추가 실시양태에서, 상기 질환은 알레르기 질환, 특히 음식 알레르기이다. 일 실시양태에서, 상기 방법은 또한 개체에게 치료 효과량의 하나 이상의 추가 치료제, 예를 들면, 치료될 질환이 자가면역 질환인 경우 면역억제제를 투여하는 것을 포함한다. 임의의 상기 실시양태들에 따른 "개체"는 포유동물, 바람직하게는 인간이다.
추가 양상에서, 본 발명은 질환의 치료를 필요로 하는 개체에서 상기 질환의 치료를 위한 약제를 제조하는데 있어서 본 발명의 융합 단백질의 용도를 제공한다. 일 실시양태에서, 상기 약제는 질환을 갖는 개체에게 약제를 치료 효과량으로 투여하는 것을 포함하는, 질환의 치료 방법에 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 치료될 질환은 자가면역 질환이다. 일 실시양태에서, 상기 질환은 이식 거부 또는 이식편-대-숙주 질환이다. 특정 실시양태에서, 상기 질환은 제 1형 당뇨병, 염증성 장 질환, 크론병, 궤양성 대장염, SLE 및 다발성 경화증으로 이루어진 군에서 선택된다. 보다 특정한 실시양태에서, 상기 질환은 제 1형 당뇨병이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 상기 질환은 염증성 장 질환이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 상기 질환은 다발성 경화증이다. 추가 실시양태에서, 상기 질환은 천식, 폐섬유증 또는 폐쇄성 폐질환이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 질환은 심혈관 질환, 특히 아테롬성경화증 및 급성 관동맥 증후군이다. 추가 실시양태에서, 상기 질환은 알레르기 질환, 특히 음식 알레르기이다. 일 실시양태에서, 상기 방법은 또한 개체에게 치료 효과량의 하나 이상의 추가 치료제, 예를 들면, 치료될 질환이 자가면역 질환인 경우 면역억제제를 투여하는 것을 포함한다. 임의의 상기 실시양태들에 따른 "개체"는 포유동물, 바람직하게는 인간이다.
다른 양상에서, 본 발명은 개체에게 본 발명의 융합 단백질을 치료 효과량으로 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체에서 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 융합 단백질을 약학적으로 허용되는 형태로 포함하는 조성물을 상기 개체에게 투여한다. 특정 실시양태에서, 치료될 질환은 자가면역 질환이다. 일 실시양태에서, 상기 질환은 이식 거부 또는 이식편-대-숙주 질환이다. 특정 실시양태에서, 상기 질환은 제 1형 당뇨병, 염증성 장 질환, 크론병, 궤양성 대장염, SLE 및 다발성 경화증으로 이루어진 군에서 선택된다. 보다 특정한 실시양태에서, 상기 질환은 제 1형 당뇨병이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 질환은 염증성 장 질환이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 상기 질환은 다발성 경화증이다. 다른 실시양태에서, 상기 질환은 천식, 폐섬유증 또는 폐쇄성 폐질환이다. 추가 실시양태에서, 상기 질환은 알레르기 질환, 특히 음식 알레르기이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 질환은 심혈관 질환, 특히 아테롬성경화증 및 급성 관동맥 증후군이다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 또한 개체에게 치료 효과량의 하나 이상의 추가 치료제, 예를 들면, 치료될 질환이 자가면역 질환인 경우 면역억제제를 투여하는 것을 포함한다. 임의의 상기 실시양태들에 따른 "개체"는 포유동물, 바람직하게는 인간이다.
일부 실시양태에서, 효과량의 본 발명의 융합 단백질을 세포에 투여한다. 다른 실시양태에서, 치료 효과량의 본 발명의 융합 단백질을 질환 치료를 위해 개체에게 투여한다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 융합 단백질의 적절한 투여량(단독으로 또는 하나 이상의 다른 추가의 치료제와 함께 사용될 때)은 치료될 질환의 유형, 투여 경로, 환자의 체중, 융합 단백질의 유형, 질환의 중증도 및 과정, 융합 단백질이 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 이전 또는 병행 치료 개입, 환자의 병력 및 융합 단백질에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 따라 달라질 것이다. 투여를 책임지는 의사는 어떠한 경우에도 조성물 중 활성 성분(들)의 농도 및 개별 대상체에 적절한 용량(들)을 결정할 것이다. 다양한 시점에 걸친 단일 또는 다중 투여, 볼루스(bolus) 투여 및 펄스 주사을 포함하나 이로 한정되지는 않는 다양한 투여 일정이 본원에서 고려된다.
융합 단백질은 환자에게 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 적절히 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라서, 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg(예를 들면, 0.1 내지 10 mg/kg)의 융합 단백질이, 예를 들면, 하나 이상의 별개 투여에 의해서든 또는 연속 주사에 의해서든, 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 전형적인 일일 투여량은 상기 언급한 요인들에 따라서 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 이상의 범위일 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복 투여의 경우, 상태에 따라서, 치료는 일반적으로 질환 증상의 목적하는 억제가 일어날 때까지 지속된다. 융합 단백질의 일 대표적인 투여량은 약 0.005 내지 약 10 mg/kg의 범위 이내일 수 있다. 다른 비-제한 예로서, 용량은 또한 투여당, 약 1 ㎍/kg 체중, 약 5 ㎍/kg 체중, 약 10 ㎍/kg 체중, 약 50 ㎍/kg 체중, 약 100 ㎍/kg 체중, 약 200 ㎍/kg 체중, 약 350 ㎍/kg 체중, 약 500 ㎍/kg 체중, 약 1 mg/kg 체중, 약 5 mg/kg 체중, 약 10 mg/kg 체중, 약 50 mg/kg 체중, 약 100 mg/kg 체중, 약 200 mg/kg 체중, 약 350 mg/kg 체중, 약 500 mg/kg 체중 내지 약 1000 mg/kg 체중 이상, 및 그 안에서 유도될 수 있는 임의의 범위를 포함할 수 있다. 본원에 열거된 숫자로부터 유도될 수 있는 범위의 비-제한 예로, 전술한 숫자에 기초하여, 약 5 내지 약 100 mg/kg 체중, 약 5 ㎍/kg 체중 내지 약 500 mg/kg 체중 등의 범위로 투여될 수 있다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 5.0 mg/kg 또는 10 mg/kg(또는 그의 임의의 조합) 중 하나 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 상기 용량은 간헐적으로, 예를 들면, 매주, 또는 3주마다 투여될 수 있다(예를 들면, 환자가 약 2 내지 약 20개, 또는 예를 들면, 약 6개 용량의 융합 단백질을 투여받도록). 초기의 보다 높은 부하 용량에 이어서, 하나 이상의 저-용량이 투여될 수 있다. 그러나, 다른 투여량 요법도 유용할 수 있다. 상기 치료의 진전은 통상적인 기술 및 분석법에 의해 용이하게 모니터링된다.
본 발명의 융합 단백질은 일반적으로 의도한 목적을 달성하기에 효과적인 양으로 사용된다. 질환 상태를 치료 또는 예방하기 위한 용도로, 본 발명의 융합 단백질, 또는 그의 약학 조성물은 치료 효과량으로 투여되거나 적용된다. 치료 효과량의 결정은, 특히 본원에 제공된 상세한 개시내용에 비추어, 당해 분야에 숙련된 자의 능력에 속한다.
전신 투여의 경우, 치료 효과적인 용량은 초기에 세포 배양 분석과 같은 시험관내 분석으로부터 평가될 수 있다. 이어서, 세포 배양물에서 측정할 때 IC50을 포함하는 순환 농도 범위를 달성하기 위한 용량이 동물 모델에서 제형화될 수 있다. 상기 정보를 이용하여 인간에서 유용한 용량을 보다 정확하게 결정할 수 있다.
초기 투여량은 또한 당해 분야에 널리 공지된 기술을 사용하여, 생체내 데이터, 예를 들면, 동물 모델로부터 평가될 수 있다. 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자라면 동물 데이터를 기준으로 인간에 대한 투여를 용이하게 최적화할 수 있다.
투여량 및 간격은 치료 효과를 유지하기에 충분한 융합 단백질의 혈장 수준을 제공하기 위해 개별적으로 조정될 수 있다. 주사에 의한 투여를 위한 통상의 환자 투여량은 약 0.1 내지 50 mg/kg/일, 전형적으로 약 0.5 내지 1 mg/kg/일의 범위이다. 치료 효과적인 혈장 수준은 매일 다중 용량을 투여함으로써 달성될 수 있다. 혈장내 수준은, 예를 들면, HPLC로 측정될 수 있다.
국소 투여 또는 선택적 흡수의 경우, 융합 단백질의 효과적인 국소 농도는 혈장 농도와 관련되지 않을 수도 있다. 당해 분야에 기술을 가진 자는 과도한 실험없이 치료 효과적인 국소 투여량을 최적화할 수 있을 것이다.
본원에 기술된 융합 단백질의 치료 효과적 용량은 일반적으로 실질적인 독성을 야기하지 않고 치료 이점을 제공할 것이다. 융합 단백질의 독성 및 치료 효능은 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 약학 절차에 의해 측정될 수 있다. 세포 배양물 분석 및 동물 연구를 이용하여 LD50(한 개체군의 50%에 치명적인 용량) 및 ED50(한 개체군의 50%에서 치료 효과적인 용량)을 측정할 수 있다. 독성과 치료 효과 사이의 용량 비는 치료 지수로서, 비 LD50/ED50으로 나타낼 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 융합 단백질이 바람직하다. 일 실시양태에서, 본 발명에 따른 융합 단백질은 높은 치료 지수를 나타낸다. 세포 배양물 분석 및 동물 연구에서 수득된 데이터를 인간에 사용하기에 적합한 범위의 투여량을 제형화하는데 사용할 수 있다. 상기 투여량은 바람직하게는 독성을 거의 또는 전혀 갖지 않는 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 든다. 상기 투여량은 다양한 요인들, 예를 들면, 사용되는 투여 형태, 사용되는 투여 경로, 대상체의 상태 등에 따라 상기 범위내에서 달라질 수 있다. 정확한 제형, 투여 경로 및 투여량은 환자의 상태에 비추어 개별 의사에 의해 선택될 수 있다(예를 들면, 본원에 전체로 참고로 인용된 문헌[Fingl et al., 1975, in: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1, p. 1] 참조).
본 발명의 융합 단백질로 치료된 환자의 주치의는 독성, 장기 기능부전 등으로 인해 투여를 어떻게 및 언제 종료하거나, 중단하거나 조정할지를 알 것이다. 반대로, 주치의는 또한 임상 반응이 적절하지 않은 경우(방해하는 독성), 치료를 더 높은 수준으로 조정하는 것을 알 것이다. 당해 질환의 관리에서 투여되는 용량의 규모는 치료될 질환의 중증도에 따라, 투여 경로 등에 따라 달라질 것이다. 상태의 중증도는, 예를 들면, 부분적으로 표준 진단 평가 방법에 의해 평가될 수 있다. 또한, 용량 및 아마도 용량 빈도가 또한 개별 환자의 연령, 체중 및 반응에 따라 달라질 것이다.
다른 약제 및 치료
본 발명의 융합 단백질은 치료시 하나 이상의 다른 약제와 함께 투여될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 융합 단백질은 하나 이상의 추가의 치료제와 함께 동시-투여될 수 있다. 용어 "치료제"는 상기 치료를 필요로 하는 개체에서 증상 또는 질환을 치료하기 위해 투여되는 임의의 약제를 포함한다. 상기 추가의 치료제는 치료되는 특정 징후에 적합한 임의의 활성 성분들, 바람직하게는 서로 불리하게 영향을 미치지 않는 상호보완적 활성을 갖는 성분들을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 면역억제제이다.
상기 다른 약제들은 의도한 목적에 효과적인 양으로 함께 적절히 존재한다. 상기 다른 약제들의 효과량은 사용되는 융합 단백질의 양, 질환 또는 치료 유형, 및 상기 논의한 기타 요인들에 따라 달라진다. 융합 단백질은 일반적으로 본원에 기술된 바와 동일한 투여량으로 및 투여 경로로 사용되거나, 본원에 기술된 투여량의 약 1 내지 99%로, 또는 실험적으로/임상적으로 적절한 것으로 측정된 임의의 투여량 및 임의의 경로로 사용된다.
상기 언급한 상기 병용 치료는 복합 투여(2개 이상의 치료제가 동일하거나 별개의 조성물에 포함되는 경우) 및 별도의 투여를 포함하며, 별도의 투여의 경우, 본 발명의 융합 단백질의 투여는 추가의 치료제 및/또는 보조제의 투여 전에, 투여와 동시에, 및/또는 투여 후에 일어날 수 있다.
제품
본 발명의 또 다른 양상에서, 전술한 질환의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제품이 제공된다. 상기 제품은 용기, 및 상기 용기 상에 또는 그에 부착된 표지 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기로는, 예를 들면, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 주머니 등이 포함된다. 상기 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 제조될 수 있다. 상기 용기는 조성물을 단독으로 또는 질병의 치료, 예방 및/또는 진단에 효과적인 또 다른 조성물과 함께 포함하며, 멸균 진입 입구를 가질 수 있다(예를 들면, 용기는 피하 주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 스토퍼(stopper)를 갖는 정맥내 용액 주머니 또는 바이알일 수 있다). 조성물 중 하나 이상의 활성제는 본 발명의 융합 단백질이다. 표지 또는 패키지 삽입물은 조성물이 선택된 질병을 치료하기 위해 사용되는 것을 나타낸다. 또한, 제품은 (a) 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 조성물이 그 안에 함유된 제 1 용기; 및 (b) 추가의 치료제를 포함하는 조성물이 그 안에 함유된 제 2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 실시양태에서의 제품은 조성물이 특정 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있음을 나타내는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 제품은 약학적으로 허용되는 완충제, 예를 들면, 주사용 정균수(BWFI), 포스페이트-완충 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제 2(또는 제 3)의 용기를 또한 포함할 수 있다. 상기 제품은 다른 완충제, 희석제, 충전제, 바늘 및 주사기를 포함하여, 상업적 및 사용자의 관점에서 바람직한 다른 물질을 또한 포함할 수 있다.
실시예
다음은 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예이다. 상기에 제공된 일반적인 설명을 고려하여, 다양한 다른 실시양태들이 실행될 수 있는 것으로 이해된다.
재조합 DNA 기술
표준 방법을 이용하여 문헌[Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989]에 기술된 바와 같이 DNA를 조작하였다. 분자 생물 시약은 제조사의 지시에 따라 사용하였다. 인간 면역글로불린 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오티드 서열에 관한 일반 정보는 문헌[Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242]에 제공되어 있다.
DNA 서열분석
DNA 서열은 이중 가닥 서열분석에 의해 결정하였다.
유전자 합성
필요한 경우, 목적하는 유전자 절편을 적절한 주형을 사용하여 PCR에 의해 생성하거나, 자동화된 유전자 합성에 의해 합성 올리고뉴클레오티드 및 PCR 산물로부터 제네아트 아게(Geneart AG)(독일 레겐스부르크)에 의해 합성하였다. 정확한 유전자 서열을 이용할 수 없는 경우, 가장 근사한 동족체로부터의 서열을 기준으로 올리고뉴클레오티드 프라이머를 설계하고, 적절한 조직에서 유래한 RNA로부터 RT-PCR에 의해 유전자를 단리하였다. 단일 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위에 인접한 유전자 절편을 표준 클로닝/서열화 벡터 내에 클로닝하였다. 플라스미드 DNA를 형질전환된 세균으로부터 정제하고 UV 분광법으로 농도를 측정하였다. 서브클로닝된 유전자 단편의 DNA 서열은 DNA 서열분석으로 확인하였다. 각각의 발현 벡터내에 서브클로닝시키기 위해 적당한 제한효소 부위를 갖는 유전자 절편을 설계하였다. 모든 구축물은 진핵 세포에서의 분비를 위해 단백질을 표적화하는 리더 펩티드를 암호화하는 5'-말단 DNA 서열을 갖도록 설계되었다. 서열번호 39 내지 47은 대표적인 리더 펩티드 및 그를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
IL-2R βγ 서브유닛-Fc 융합물 및 IL-2R α 서브유닛 Fc 융합물의 제조
IL-2 수용체 결합 친화도를 연구하기 위해, 이종이량체성 IL-2 수용체의 발현을 가능하게 하는 도구를 제작하였다. IL-2 수용체의 β-서브유닛을, "놉-인투-홀" 기술을 사용하여 이종이량체화(Fc(홀))[서열번호 21 및 22(인간), 서열번호 27 및 28(마우스) 및 서열번호 33 및 34(시노몰구스) 참조]되도록 조작된 Fc 분자에 융합시켰다[Merchant Et al., Nat. Biotech. 16, 677-681(1998)]. 이어서, IL-2 수용체의 γ-서브유닛을 Fc(놉) 변이체[서열번호 23 및 24(인간), 서열번호 29 및 30(마우스) 및 서열번호 35 및 36(시노몰구스) 참조]에 융합시키고, 이것을 Fc(홀)과 이종이량체화시켰다. 이어서, 상기 이종이량체 Fc-융합 단백질을 IL-2/IL-2 수용체 상호작용을 분석하기 위한 기질로 사용하였다. IL-2R α-서브유닛은 AcTev 절단 부위 및 Avi His 표지를 갖는 단량체 쇄로서 발현시켰다[서열번호 25 및 26(인간), 서열번호 31 및 32(마우스) 및 서열번호 37 및 38(시노몰구스)]. 각각의 IL-2R 서브유닛들을, IL-2R βγ 서브유닛 구축물에 대해 혈청의 존재하에 및 α-서브유닛 구축물에 대해 혈청의 부재하에 HEK EBNA 293 세포에서 일시적으로 발현시켰다. IL-2R βγ 서브유닛 구축물은 단백질 A(지이 헬쓰케어) 상에서 정제한 후 크기 배제 크로마토그래피(지이 헬쓰케어, 슈퍼덱스 200)로 정제하였다. IL-2R α-서브유닛은 NiNTA 컬럼(퀴아젠(Qiagen)) 상에서 His 태그를 통해 정제한 후 크기 배제 크로마토그래피(지이 헬쓰케어, 슈퍼덱스 75)로 정제하였다. 다양한 수용체 구축물들의 아미노산 및 상응하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 21 내지 38에 나타내었다.
융합 단백질의 생성
유전자 합성 및/또는 통상적인 분자 생물학 기술에 의해 DNA 서열을 생성하고, MPSV 프로모터의 조절하에 각각 EBV OriP 서열을 갖는 포유동물 발현 벡터내에 합성 폴리A 부위의 상류에 서브클로닝시켰다. 하기 실시예에서 적용된 바와 같은 융합 단백질은, 지수적으로 성장하는 HEK293-EBNA 세포를 칼슘 포스페이트-형질감염을 이용하여 포유동물 발현 벡터로 동시-형질감염시킴으로써 제조하였다. 다르게는, 현탁액 중에서 성장하는 HEK293 세포를 폴리에틸렌이민(PEI)에 의해 각각의 발현 벡터로 형질감염시켰다. 다르게는, 안정하게 형질감염된 CHO 세포 풀(pool) 또는 CHO 세포 클론을 무혈청 배지에서 제조에 사용하였다. 이어서, 융합 단백질을 상청액으로부터 정제하였다. 간략하게, 융합 단백질은 20 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트(pH 7.5)에서 평형화시킨 단백질 A(하이트랩 프롯A(HiTrap ProtA), 지이 헬쓰케어)를 사용한 한 단계의 친화 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 상청액을 부하한 후, 컬럼을 먼저 20 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트(pH 7.5)로 세척하고 이어서 13.3 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트, 500 mM 나트륨 클로라이드(pH 5.45)로 세척하였다. 융합 단백질을 20 mM 나트륨 시트레이트, 100 mM 나트륨 클로라이드, 100 mM 글리신(pH 3) 또는 10 mM 나트륨 시트레이트(pH 3.0)로 용출시켰다. 분획들을 0.5 M Na2HPO4(pH 8.0)로 중화시키고(1:100) 취합하고, 최종 제형화 완충액(20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl, pH 6.0) 중에서 크기 배제 크로마토그래피(하이로드(HiLoad) 16/60 슈퍼덱스 200, 지이 헬쓰케어 또는 하이로드 26/60 슈퍼덱스 200, 지이 헬쓰케어)로 정제하였다. 정제된 단백질 샘플의 단백질 농도는, 아미노산 서열을 기준으로 계산된 몰 흡광 계수를 사용하여, 280 nm에서 흡광도(OD)를 측정함으로써 결정하였다. 분자량은 또한 아미노산 서열에 기초하여 측정하였다. 융합 단백질의 순도 및 분자량은 환원제(5 mM 1,4-다이티오트레이톨)의 존재 및 부재하에 SDS-PAGE로 분석하였으며, 쿠마시 블루(Coomassie blue)(심플블루(SimpleBlue: 등록상표) 세이프스테인(SafeStain), 인비트로겐)로 염색하였다. 뉴페이지(등록상표) 프리-캐스트(Pre-Cast) 겔 시스템(인비트로겐)을 제조사의 지시에 따라 사용하였다(4 내지 20% 트리스-글리신 겔 또는 3 내지 12% 비스-트리스). 다르게는, 분자들의 순도 및 분자량은, 칼리퍼 랩칩 GXII 시스템(칼리퍼 라이프사이언스(Caliper Lifescience))을 제조사의 설명에 따라 사용하여, 환원제의 존재 및 부재하에 CE-SES 분석에 의해 분석하였다. 융합 단백질 샘플의 응집체 함량은 25℃에서 2 mM MOPS, 150 mM NaCl, 0.02% NaN3(pH 7.3) 런닝 완충액 중에서 슈퍼덱스 200 10/300GL 분석용 크기 배제 컬럼(지이 헬쓰케어)을 이용하여 분석하였다. 다르게는, 항체 샘플의 응집체 함량은 25℃에서 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-아르기닌 모노하이드로클로라이드, 0.02%(w/v) NaN3(pH 6.7) 런닝 완충액 중에서 TSK겔 G3000 SW XL 분석용 크기 배제 컬럼(토소(Tosoh))을 이용하여 분석하였다.
DP47GS IgG-IL-2, DP47GS IgG-(IL-2)2, DP47GS IgG-IL-2 N88D, DP47GS IgG-(IL-2 N88D)2 및 DP47GS IgG-(IL-2 E95A)2 구축물의 정제 및 특성화 결과는 도 1, 2, 3, 4 및 5에 각각 나타내었다.
IL-2 수용체에 대한 친화도
융합 단백질의 친화도는 하기의 조건하에서 재조합 IL-2R βγ 이종이량체를 사용하여 인간, 뮤린 및 시노몰구스 IL-2R βγ 이종이량체에 대해 비아코어 T200(지이 헬쓰케어)에서 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 측정하였다: 리간드: SA 칩 상에 고정화된 비오틴화된 인간, 뮤린 및 시노몰구스 IL-2R β 놉 γ 홀 이종이량체(고정화 수준은 각각 194, 114 및 116 RU이었다), 분석물: DP47GS IgG-IL-2(서열번호 13, 15 및 19 참조), DP47GS IgG-(IL-2)2(서열번호 17 및 19 참조), DP47GS IgG-IL-2 N88D(서열번호 15, 19 및 48 참조), DP47GS IgG-(IL-2 N88D)2(서열번호 19 및 50 참조) 및 DP47GS IgG-(IL-2 E95A)2(서열번호 19 및 52 참조), 온도: 25℃, 완충액: HBS-EP, 분석물 농도: 100 nM 내지 1.2 nM(1:3 희석), 유속: 30 ㎕/분, 결합: 120 초, 해리: 2개의 최고 농도에 대하여 600 초 및 최저 농도에 대하여 120 초, 재생: 60 초 3M MgCl2, 적합화: 1:1 랭뮤어 결합 모델, RI≠0, Rmax=로칼. 친화도는 동적 속도 상수 Kon 및 Koff에 기초하여 측정하였다. 융합 단백질의 친화도는 또한 하기의 조건하에서 재조합 단량체성 IL-2R α 서브유닛을 사용하여 인간, 뮤린 및 시노몰구스 IL-2R α-서브유닛에 대해 측정하였다: 리간드: 아민 커플링을 통해 CM5 칩 상에 고정화된 인간, 뮤린 및 시노몰구스 IL-2R α-서브유닛(고정화 수준은 각각 240, 245 및 220 RU이었다), 분석물: DP47GS IgG-IL-2(서열번호 13, 15, 및 19 참조), DP47GS IgG-(IL-2)2(서열번호 17 및 19 참조), DP47GS IgG-IL-2 N88D(서열번호 15, 19 및 48 참조), DP47GS IgG-(IL-2 N88D)2(서열번호 19 및 50 참조) 및 DP47GS IgG-(IL-2 E95A)2(서열번호 19 및 52 참조), 온도: 25℃, 완충액: HBS-EP, 분석물 농도: 300 nM 내지 0.41 nM(1:3 희석), 유속: 30 ㎕/분, 결합: 120 초, 해리: 180 초, 재생: 60 초 동안 10 mM 글리신(pH 1.5). 친화도는 정상 상태 분석에 의해 측정하였다.
IL-2R βγ 이종이량체에 대한 동적 및 IL-2R α-서브유닛에 대한 정상 상태에 기초한 친화도 측정의 결과를 표 1에 나타내었다.
IL-2R βγ 또는 IL-2R α에 대한 융합 단백질의 결합
KD(nM) Hu IL-2R βγ Cy IL-2R βγ Mu IL-2R βγ Hu IL-2 Rα Cy IL-2 Rα Mu IL-2 Rα
DP47GS IgG-IL-2 0.15 0.60 0.85 51 81 112
DP47GS IgG-(IL-2)2 0.11 0.17 0.37 20 31 26
DP47GS IgG-IL-2
N88D		 0.93 1.3 2.4 18 31 48
DP47GS IgG-(IL-2 N88D)2 0.24 0.57 2.1 22 30 25
DP47GS IgG-(IL-2 E95A)2 0.16 0.29 0.36 24 32 26
인간 DP47GS IgG-IL-2 융합물 및 이의 돌연변이체는 3개의 상이한 인간 IL-2 수용체 쇄 α, β 및 γ에 결합할 뿐만 아니라 친화도가 평균적으로 후자의 2개 종에 대하여 약간 낮은 경향일 수 있을지라도 시노몰구스 원숭이 및 마우스의 각각의 수용체 쇄에 결합한다. 인간 및 시노몰구스 α 쇄에 대한 이러한 사이노카인 융합의 친화도는 뮤린 α 쇄와 필적할만하고, 이는 오직 하나의 사이토카인 부분을 전달하는 분자에 대하여 관찰된 인간 α 쇄와 비교하여 약 2배 상이한 친화도를 갖는다. 2개 사이토카인 부분을 갖는 분자의 경우, 아마도 결합활성으로 인해, 이러한 차이는 존재하지 않는다. α 쇄에 대한 DP47GS IgG-IL-2 및 DP47GS IgG-IL-2 N88D의 친화도는 이론상 N88D 돌연변이가 α 쇄와의 계면에 영향을 미치지 않아야 하는 것과 동일하여야 한다. N88은 IL-2 수용체 β 쇄와의 계면에 위치되고, D에 대한 돌연변이생성은 IL-2R βγ의 모든 3개 종에 대한 DP47GS IgG-IL-2 및 DP47GS IgG-IL-2 N88D의 결합과 비교하여 관찰될 수 있는 친화도의 감소를 야기한다(각각 0.15 nM, 0.60 nM 및 0.85 nM 대 0.93 nM, 1.3 nM 및 2.4 nM). 2개의 돌연변이된 IL-2 사이토카인을 적어도 인간 IL-2R βγ 쪽으로 전달하는 DP47GS IgG-(IL-2 N88D)2의 경우, 아마도 결합활성으로 인해 이 차이는 덜 두드러진다. DP47GS IgG-(IL-2)2 및 DP47GS IgG-(IL-2 E95A)2는 IL-2R βγ의 모든 3개 종에 결합시 매우 유사한 결합활성을 보인다. 또한, E95가 IL-2 수용체 β 쇄와의 계면에 위치될지라도, A에 대한 돌연변이 생성은 적어도 이러한 돌연변이체 중 2개가 IgG와 융합될 경우 결합활성에서 유의미한 감소를 야기하지 않는다.면역 세포 상에서의 IL-2 수용체의 발현
고-친화도 삼량체 IL-2 수용체는 α(IL-2RA, CD25), β(IL-2RB, CD122) 및 γ(IL-2RG, CD132) 쇄로 이루어지며, 약 10 pM의 KD를 갖는다. CD25 단독은 IL-2에 대해 단지 낮은 친화도(KD 약 10 nM)를 갖는다. IL-2RA의 부재하에 일부 세포 유형에서 발현되는 IL-2RB/IL-2RG 이량체는 또한 중간 친화도(KD 약 1 nM)로 IL-2에 결합한다. IL-2 수용체를 통한 신호전달은 IL-2RB 및 IL-2RG 쇄에 의해 매개된다. 결정 구조 분석으로부터, IL-2RA는 IL-2RB 또는 IL-2RG와 접촉하는 것으로 보이지 않는다. 삼량체성 수용체의 동시 작동성의 근거는 CD25가 IL-2RB 및 IL-2RG에 제시하기 위해 세포 표면에서 IL-2를 포획할 때의 엔트로피 감소이거나, 다르게는, IL-2 입체형태에서 CD25-유도된 변화가 발생함으로써 복합체를 안정화시키는 것임이 제시되었다. FOXP3+ 조절 CD4+ T 세포에서, 수용체의 β 및 γ 쇄에 비해 큰 화학양론적 과량의 IL-2RA가 존재하여, α 쇄의 이량체, 또는 심지어 더 큰 복합체가 IL-2의 결합을 보조한다는 가설을 뒷받침한다. 한 세포상의 CD25는, 고-친화도 IL-2 수용체를 구성하는 3개 쇄 중에서의 독특한 관계가 두드러지는 고-친화도 세포내 상호작용하에 또 다른 세포 상의 IL-2RB/IL-2RG 이량체에 IL-2를 제공할 수 있다는 증거가 존재한다.
CD4+ Treg 아형, NK 세포 아형 및 NKT 세포 상에서 뿐 아니라, CD4+ 및 CD8+ 통상의 T 세포 아형 상에서의 CD25(IL-2RA) 및 CD122(IL-2RB) 발현을 FACS에 의해 측정하였다(도 6 및 7). CD4+ Treg 아형, NKT 세포 및 NK 세포를 규정하기 위해 세포 표면 마커를 사용하였다(도 6). CD25 및 CD122에 대한 염색을 최적화하기 위해, 세포내 FoxP3 염색을 수행하지 않았다. 간략하게, 건강한 자원자에 의해 채혈된 150 ㎕의 혈액을 사용하여, 형광성 항체를 암실에서 실온에서 45분 동안 항온처리하였다(처음 및 20분 후 볼텍싱). 적혈구 세포를 BD 용해 완충액(BD FACS 용해액, 349202)으로 9분 동안 용해시키고, 잔류 세포를 세척하고(2 ml의 PBS + 0.1% BSA) 고정시켰다(1% PFA). 세포를 LSRFortessa(상표) 세포 분석기(벡톤 디킨슨(Becton Dickinson)) 상에서 분석하고 데이터는 플로우조(FlowJo) 소프트웨어(트리스타(TreeStar))를 사용하여 분석하였다. Treg 아형은 TCRαβ-FITC(IP26, 바이오리젠드(BioLegend)), CD4-알렉사 플루오르(Alexa Fluor: 등록상표) 700(RPA-T4, 바이오리젠드), CD127-PE/CY7(ebioRDR5, 이바이오사이언스(Ebioscience)), CD45RA-퍼시픽 블루(Pacific Blue)(HI100, 바이오리젠드), CD25-APC(2A3, M-A251, 비디 바이오사이언시즈) 및 CD122-PE(TU27, 바이오리젠드)에 특이적인 항체를 사용하여 확인하였다. NK 및 NKT 세포는 별도의 관에서 TCRαβ-FITC, CD4-알렉사 플루오르(등록상표) 700, CD8-PE/CY7(HTT8a, 바이오리젠드), CD56-퍼시픽 블루(HCD56, 바이오리젠드), CD25-APC 및 CD122-PE에 특이적인 항체로 염색하였다. FSC/SSC를 기반으로 하는 림프구를 게이팅(gating)하고 이중선을 배제시킨 후, 미접촉 Treg는 TCRαβ+CD4+CD127-CD25+CD45RA+로 확인되고, 기억 Treg는 TCRαβ+CD4+CD127-CD25+CD45RA-로 확인되고, 활성화 Treg는 TCRαβ+CD4+CD127-CD25highCD45RA-로 확인되었다. NK 세포는 TCRαβ-CD56-/dim으로 확인되고, 활성화 NK 세포는 TCRαβ-CD56bright로 확인되었다. NKT 세포는 TCRαβ+CD56+으로 확인되었다. CD25 및 CD122 각각에 대한 배경 형광을 평가하기 위해 APC 및 PE에 접합된 이소타입 대조군(IC)을 사용하였다.
유사하게, 미접촉 및 통상의 기억 CD4+ T 세포(도 7A 및 7B), 통상의 기억 CD8+ T 세포 및 CD45RA+ CD8 T 세포(미접촉 및 TEMRA 아형의 조합; TEMRA는 CD45RA를 발현하기 위해 복귀된 효과기 기억 세포를 말한다)(도 7C 및 7D)를 규정하기 위해 세포 표면 마커를 사용하였다. 염색 및 분석을 전술한 바와 같이 수행하였다. CD4+ Treg를 특성화하기 위해 전술한 바와 동일한 관를 사용하여, CD4+ 통상적 미접촉 T 세포는 TCRαβ+CD4+CD127+CD25-/+CD45RA+로 확인되고, CD4+ 통상의 기억 T 세포는 TCRαβ+CD4+CD127+CD25-/+CD45RA-로 확인되었다. CD8 T 세포는 TCRαβ-FITC, CD8-알렉사 플루오르(등록상표) 700(HTT8a, 바이오리젠드), CD28-PE/CY7(CD28.2, 바이오리젠드), CD45RA-퍼시픽 블루, CD25-APC 및 CD122-PE를 사용하여 규정하였다. CD8+ 기억 T 세포는 TCRαβ+CD8+CD45RA-로 확인되었다. CD8+ 미접촉 및 TEMRA 세포는 TCRαβ+CD8+CD45RA+로 확인되었다. CD28 마커는 하기에 기술된 pSTAT5a 분석에 포함되지 않았기 때문에 CD8+ 미접촉 T 세포를 CD8+ TEMRA T 세포와 구별하기 위해 CD28을 사용하지 않았다(도 8 참조). 일부 시험에서(도 15), 추가의 아형은 다음과 같이 규정된다: 중추 기억 CD4+ T 세포(TCRαβ+CD4+CD56-FOXP3-CD45RA-CD127+CD25-/+), 효과기 기억 CD4+ T 세포(TCRαβ+CD4+CD56-FOXP3-CD45RA-CD127-CD25-/+), 중추 기억 CD8+ T 세포(TCRαβ+CD8+CD56-FOXP3-CD45RA-CD127+CD25-/+), 효과기 기억 CD8+ T 세포(TCRαβ+CD8+CD56-FOXP3-CD45RA-CD127-CD25-/+), 및 TEMRA CD8+ 세포(TCRαβ+CD8+CD56-FOXP3-CD45RA+CD127-CD25-/+).
도 6 및 7에서, 인간 말초혈 중 T 세포, NK 세포 및 NKT 세포의 아형들에 대한 IL-2RA 및 IL-2RB의 세포-특이적 발현을 나타내었다(IL-2RG는 다수의 사이토카인 수용체와 협력하기 때문에 조혈 세포상에서 본질적으로 편재적인 발현을 갖는다). 최고 수준의 IL-2RA는 3개의 조절 CD4+ T 세포(Treg) 집단, 즉, 미접촉(CD45RA+, CD25+), 기억(CD45RA-, CD25+) 및 활성화(CD45RA-, CD25hi) 세포 집단에 존재한다(도 6A). 평균적으로, 통상의 기억 CD4+ T 세포는 Treg보다 CD25를 약 10배 미만의 발현시킨다(도 7A). 미접촉 CD4+ T 세포 상에서의 CD25의 발현은 기증자들에 따라 상당히 달라지지만 기억 CD4+ T 세포상에서 관찰된 것보다 항상 낮다(도 7A). NK, NKT 및 CD8 T 세포 상에서 CD25의 발현은 CD56bright NK 세포를 제외하고 매우 낮거나 검출불가능하다(도 6C 및 7C). CD56bright NK 및 CD56+ NK 세포는, NKT 세포를 비롯한, 임의의 T 세포 아형들보다 약 10배 초과의 최고 수준의 IL-2RB(도 6D)를 발현시킨다(도 6B, 6D, 7B, 7D).
인간 말초혈 세포 아형에서 pSTAT5a의 유도
삼량체성 IL-2R의 IL-2-유도된 올리고머화 후, IL-2RB 및 IL-2RG 각각의 세포내 도메인과 관련되는 JAK1 및 JAK3 세포질 단백질 티로신 키나제가 활성화된다. 이들 키나제들은 STAT5a 및 STAT5b에 대한 도킹(docking) 부위로 작용하는 특정 IL-2RB 티로신 잔기를 인산화시키고, 이어서 상기 STAT5a 및 STAT5b가 인산화된다. 여러 신호전달 경로의 IL-2-유도된 활성화는 결국 IL-2/IL-2R 경로와 관련된 다양한 기능에 기여하는 표적 유전자들의 전사를 야기한다. 다양한 세포 유형들이 상이한 수준의 IL-2 수용체 IL-2RA 및 IL-2RB 분자를 발현하기 때문에(도 6 및 7), 고-친화도 및 중간 친화도 수용체의 다양한 조합들에 의해 매개된 IL-2에 대한 통합된 신호전달 반응을 이해하기 위해, 다색성 유동 세포분석기에 의해 개별 세포내에서의 pSTAT5a 수준을 측정하였다.
STAT5a 인산화의 유도시 다양한 용량의 DP47GS IgG-IL-2, DP47GS IgG-(IL-2)2, DP47GS IgG-(IL-2 E95A)2, DP47GS IgG-IL-2 N88D 및 DP47GS IgG-(IL-2 N88D)2의 효과를 인간 CD4+ Treg 아형, 미접촉 및 통상의 기억 CD4+ T 세포, 통상의 기억 CD8+ T 세포, CD45RA+ CD8 T 세포, NKT 세포 및 NK 세포에서 평가하였다(도 8 내지 14, 및 표 2 및 3). 모든 아형은 각각의 용량에 대해 단일 관에서 특성화하였다. 간략하게, 건강한 인간 성인 자원자로부터의 혈액을 헤파린화 관에 수집하였다. 다양한 농도의 DP47GS IgG-IL-2 융합 단백질을 500 ㎕의 혈액에 첨가하고, 37℃에서 배양하였다. 30 분 후에 예열된 용해/고정 완충액(벡톤 디킨슨 #558049)을 사용하여 37℃에서 10 분 동안 혈액을 용해시키고 고정시키고, 0.2% BSA를 함유하는 PBS로 2회 세척한 후, -20℃ 예냉시킨 메탄올(시그마, 바이오테크 등급 #494437)로 얼음 위에서 20 분 동안 투과화시켰다. 이어서, 세포를 0.2% BSA를 함유하는 PBS로 4회 광범위하게 세척한 후, 상이한 림프구 및 NK 세포 부집단 및 pSTAT5a 상태를 구별하기 위해 형광성 항체의 패널을 사용하여 FACS 염색을 수행하였다. 사용된 항체들은 항-CD4-알렉사 플루오르(등록상표) 700(클론 RPA-T4), CD3-PerCP/Cy5.5(UCHT1), CD45RA-PE/Cy7(HI100), CD8-브릴리언트 바이올렛(Brilliant Violet) 605(RPA-T8), CD56-브릴리언트 바이올렛 421(HCD56), FOXP3-PE(259D)(모두 바이오레전드 제품), CD25-APC(클론 M-A251 및 2A3) 및 pSTAT5a-알렉사 플루오르(등록상표) 488(pY694)(벡톤 디킨슨)이었다. 샘플들은 LSRFortessa(상표) 세포 분석기(벡톤 디킨슨)를 사용하여 수득하였고, 데이터는 플로우조 소프트웨어(플로우조 엘엘씨(FlowJo, LLC))를 사용하여 분석하였다. 림프구 상에 게이팅하고 이중선을 배제한 후, Treg는 CD3+CD4+FOXP3+로 규정되고, CD45-FOXP3hi(활성화 Treg), CD3+CD4+CD45RA-FOXP3+(기억 Treg) 및 CD3+CD4+CD45+FOXP3+(미접촉 Treg)로 세분되었다. 통상의 CD4+ T 세포는 CD3+CD4+CD45RA+(미접촉) 및 CD3+CD4+CD45RA-(기억)로 규정되었다. CD8 T 세포는 CD3+CD8+CD45RA-(기억) 및 CD3+CD8+CD45RA+로 규정되었다. NKT 세포는 CD3+CD56+으로 규정되고, NK 세포는 CD3-CD56bright(활성화 NK 세포) 또는 CD3-CD56+(NK 세포)로 규정되었다. 모든 용량에서 모든 세포 아형 중에서 세포내 pSTAT5a 수준을 정량화하였다.
도 8은 각각 다른 날에 시험한 3명의 개별적 기증자로부터의 인간 말초혈 중에서 T 세포, NK 세포 및 NKT 세포에 대한 DP47GS IgG-IL-2 면역접합물의 용량 반응을 나타낸 것이다. DP47GS IgG-IL-2에 대한 반응성의 등급은 3명의 기증자 모두에서 동일하였으며, 재조합 인간 IL-2(프로류킨(등록상표))를 사용하였을 때 관찰된 바와 동일하였다(데이터 나타내지 않음). 3개 Treg 집단, 활성화(CD45RA-CD25hi), 기억(CD45RA-CD25+), 및 미접촉(CD45RA+CD25+) 집단은 모두 DP47GS IgG-IL-2의 0.1 ng/ml 농도에서 pSTAT5a 수준을 증가시킨 반면, 다른 세포 집단은 pSTAT5a에서의 검출가능한 증가를 야기하기 위해 1 ng/ml(CD56bright NK 및 기억 CD4+ T 세포) 또는 10 내지 100 ng/ml(기억 CD8+ T 세포, CD56+ NK 세포, 미접촉 CD4+ T 세포, NKT 세포 및 CD45RA+ CD8 T 세포)보다 더 큰 DP47 IgG-IL-2를 필요로 하였다. DP47GS IgG-IL-2에 대해 고 민감성을 나타내는 Treg 집단에 의한 보다 상세한 용량 반응에 대해서는 또한 도 11을 참조한다. T 세포 아형 상에서의 IL-2RB 발현에 비해 중간 수준의 CD56을 갖는 NK 세포상에서의 IL-2RB의 높은 발현(도 6D)은 Treg-유사 IL-2 민감성을 허용하기에는 충분하지 않다. 전체적으로, 활성화, 기억 및 미접촉 Treg 아형들은 DP47GS IgG-IL-2에 대해 최대 민감성을 나타내는 반면, CD56bright NK 세포 및 CD4+ 통상의 기억 T 효과기 세포는 20 내지 50배 덜 민감하였다. pSTAT5a 증가에 대해 분석된 다른 세포 아형들 중에서, CD8+ 기억 T 효과기 세포, CD4+ 미접촉 T 효과기 세포, NKT 세포, "휴지" NK 세포(양성, CD56에 대해 빛나는 염색하지 않음) 및 CD8+ 미접촉 T 효과기 + CD45RA+ 기억 세포가 IgG-IL-2 면역접합물에 대해 비교적 둔감하였다.
도 9는 각각 다른 날에 시험한 5명의 개별적 기증자로부터의 인간 말초혈 중에서 T 세포, NK 세포 및 NKT 세포에 대한 DP47GS IgG-(IL-2)2의 용량 반응을 나타낸 것이다. DP47GS IgG-IL-2에 대해 관찰된 바와 같이(도 8), 3개의 Treg 아형이 DP47GS IgG-(IL-2)2 유도된 pSTAT5a에 가장 민감한 세포였으며(도 9 및 11), 5명의 기증자 모두에서 다른 세포 아형에 대해 유사한 등급의 용량 반응이 확인되었다.
DP47GS IgG-IL-2와 DP47GS IgG-(IL-2)2를 더 용이하게 비교하기 위해, pSTAT5a 값을 표준화시켰다(도 10). MFI 값을 표준화하기 위해, 각각의 게이팅된 아형에 특이적인 비자극 pSTAT5a MFI 값을 상기 세포 아형들에 대한 모든 자극 MFI 값에서 감하였다. 수득된 값은 용량 반응에서 상기 아형에 의해 수득된 최고 pSTAT5a MFI 값으로 나누었다. 상기 아형에 대해 관찰된 최대 pSTAT5a MFI의 50%에 도달하는데 필요한 IL-2 융합 단백질의 양을 기준으로 EC50을 평가하였다. 도 10에서 나타낸 바와 같이, DP47GS IgG-(IL2)2 면역접합물은, 아마도 고- 친화도 IL-2 수용체에 대한 면역접합물의 증가된 결합활성의 결과로서, CD25를 구성적으로 발현하는 세포에서 pSTAT5a의 보다 효과적인 유도를 야기하였다. pSTAT5a 활성화에 대한 EC50은 DP47GS IgG-(IL-2)2를 DP47GS IgG-IL-2와 직접 비교할 때 Treg에서 5 내지 9배 더 낮은 것으로 관찰되었다. 표 2는 상이한 세포 아형에서 DP47GS IgG-IL-2 대 DP47GS IgG-(IL-2)2에 의한 pSTAT5a 활성화에 대한 대표적인 EC50 값 및 배수-차이를 요약한 것이다.
상이한 세포 아형에서 DP47GS IgG-IL-2 대 DP47GS IgG-(IL-2)2에 의한 pSTAT5a 활성화에 대한 EC50 값 및 배수 차이
T 세포 IgG-IL-2 IgG-(IL-2)2 배수 변화
활성화 Treg 0.10 ng/mL 0.020 ng/mL 5
기억 Treg 0.22 ng/mL 0.033 ng/mL 7
미접촉 Treg 0.20 ng/mL 0.023 ng/mL 9
CD56bright NK 2.0 ng/mL 0.63 ng/mL 3
CD4 기억 T 효과 5 ng/mL 0.7 ng/mL 7
NK 세포 35 ng/mL 10 ng/mL 4
매우 제한적인 농도에서도, DP47GS IgG-(IL-2)2는 DP47GS IgG-IL-2에 비해 더 높은 수준의 pSTAT5a를 야기하였다(도 11). 이 실험에서, 3명의 건강한 자원자로부터의 혈액을 같은 날에 IL-2의 제한적 농도에서 DP47 IgG-IL-2 및 DP47 IgG-(IL-2)2의 2배 적정에 대한 반응에 대해 개별적으로 시험하였다. 도 11의 그래프는 3명의 기증자에 대한 pSTAT5a MFI의 평균±SD를 나타낸다. 개별적으로 시험한 3개의 Treg 아형(도 11B 내지 D) 이외에, 전체 CD3+CD4+FoxP3+ Treg에서의 pSTAT5a를 평가하기 위해 게이트(gate)를 적용하였다(도 11A). 결과는 명백하게, IgG 분자당 IL-2의 단지 2배의 증가에도 불구하고 Treg의 DP47GS IgG-(IL-2)2 활성화에 대한 효능에 5 내지 10배 증가를 나타낸다. 다색성 유동 세포분석을 상기 기재된 바와 같이 수행하였다(도 8 참조).CD4+ 통상의 기억 T 효과기 세포는 또한 DP47GS IgG-IL-2에 비해 더 낮은 (7배) 농도의 DP47GS IgG-(IL-2)2에 반응하였다. DP47GS IgG-(IL-2)2를 DP47 IgG-IL-2와 비교할 때 EC50 값은 CD56bright NK 세포 및 CD56+ NK 세포에 대해 더 낮았지만, 상기 저하는 각각 단지 3배 및 4배였다. 이것은 IL-2 매개 신호전달에 대해 중간 친화도 IL-2 수용체에 대한 상기 세포들의 의존에 기인하는 듯하다. Treg 대 NK 세포에 대한 ED50에서의 차등적 변화는 Treg 활성화에 대한 선택성을 여러배 증가시킨다.
도 12는 상이한 날에 각각 시험된 3개의 개별적인 기증자로부터의 인간 말초혈의 T 세포, NK 세포 및 NKT 세포에서 DP47GS IgG-(IL-2E95A)2의 용량 반응을 나타낸다. IL-2E95A 분자가 고안되고 IL-2R βγ 결합 활성을 감소하는 것으로 예견되었지만 실제로 야생형 IL-2에서와 같이 IL-2R βγ 수용체에 대하여 유사한 결합 특성을 나타낸다. DP47GS IgG-(IL-2E95A)2에 대한 반응성의 등급은 모든 3개 기증자에서 동일하고, 야생형 IL-2 면역접합물 DP47GS IgG-(IL-2)2를 갖는 동일한 기증자에서 관찰된 바와 동일하다. 모든 3개 Treg 집단, 활성화(CD45RA-CD25hi), 기억(CD45RA-CD25+), 및 미접촉(CD45RA+CD25+)은 DP47GS IgG-(IL-2E95A)2의 0.1 ng/ml 미만의 농도에서 pSTAT5a 수준이 증가되는 반면, 다른 세포 집단은 pSTAT5a에서 검출가능한 증가를 생성하기 위해 1 ng/ml(CD56bright NK 및 CD4+ 통상의 기억 T 효과기 세포) 또는 10 내지 100 ng/ml(기억 CD8+ T 세포, CD56+ NK 세포, 미접촉 CD4+ T 세포, NKT 세포 및 CD45RA+CD8+ T 세포)의 DP47 IgG-(IL-2E95A)2를 필요로 한다. T 세포 아형에서 IL-2RB 발현과 비교하여 중간 수준의 CD56(도 6D)을 갖는 NK 세포에서 IL-2RB의 높은 발현은 Treg-유사 IL-2 민감성을 허용하기에 충분하지 않다는 것이 주목할만하다. 전체적으로, 활성화, 기억 및 미접촉 Treg 아형들은 DP47GS IgG-(IL-2E95A)2에 대해 최대 민감성을 나타내는 반면, CD56bright NK 세포 및 CD4+ 통상의 기억 T 효과기 세포는 20 내지 50배 덜 민감하였다. pSTAT5a를 증가에 대해 분석된 다른 세포 아형들 중에서, CD8+ 기억 T 효과기 세포, CD4+ 미접촉 T 효과기 세포, NKT 세포, "휴지" NK 세포(양성, CD56에 대하여 밝게 염색되지 않음), 및 CD8+ CD45RA+ 미접촉 T 효과기 세포는 IgG-(IL-2E95A)2 면역접합물에 비교적 둔감하였다.
도 13은 각각 다른 날에 시험된 5명의 개별적인 기증자로부터의 인간 말초혈 중에서 T 세포, NK 세포 및 NKT 세포에 대한 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2의 용량 반응을 나타낸 것이다. IL-2N88D 분자는 IL2R βγ 결합 활성을 감소시키기 위해 고안되었고, E95A 점 돌연변이와 달리, 이는 비아코어(Biacore) 분석에 의해 IL2R βγ에 대하여 6.2배 적은 결합 친화도를 갖는다(표 1, KD 0.15 nM 대 0.93 nM). 현재까지 모든 IL-2 면역접합물에 대하여 관찰된 바와 같이, 3개 Treg 아형은 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2에 의한 pSTAT5a 활성화에 대해 가장 민감한 세포이고, 유사한 등급의 용량 반응은 모든 5명 기증자의 다른 세포 아형에 대해 밝혀졌다. DP47GS IgG-(IL-2N88D)2로 자극되는 경우, CD4+ 기억 T 효과기 세포에 대한 반응성이 결여됨이 특히 주목할만하고, 1000 ng/ml의 용량에서 조차도, 이는 중요한 자가면역 세포 집단을 자극하는 영향이 적었다.
상기 예에서, 독특하게 고안된 IL-2 단일 점 돌연변이, N88D는 목적한 세포 집단, CD4+ 기억 T 효과기 세포 모두에서 자극 활성을 극적으로 감소시키면서 신규하고 개선된 치료 개체에 대하여 요구된 Treg 자극 효과를 유지한다.
E95A 및 N88D IL-2 점 돌연변이 면역접합물을 갖는 야생형 IL-2 DP47GS IgG-(IL-2)2와 비교하여, pSTAT5a 값은 시험되는 세포 유형 각각에 대하여 서로에 대해 플롯팅된다(도 14). DPS47GS IgG-(IL-2E95A)2는 중첩가능한 용량 반응 곡선을 갖는 인간 세포 집단을 각각 자극하는 이의 야생형 대응물 DP47GS IgG-(IL-2)2와 동일한 활성을 나타낸다. 반대로, 감소된 IL2R βγ 결합 분자, DP47GS IgG-IL-2N88D 및 DP47GS IgG-(IL-2N88D2)2는 CD4+ 기억 T 효과기 세포에서 적은 효과를 갖고 2가 접합물 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2만이 상이한 Treg 집단에서 유의미한 자극 활성을 보유한다.
도 15의 결과는 추가 10명의 인간 혈액 기증자로부터 수집된 전혈 pSTAT5a 반응을 나타낸다. 별도의 일에, 각각의 기증자를 넓은 (= 6 로그) 역가 범위의 DP47GS IgG-(IL-2)2 및 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2와 비교하여 시험하였다. DP47GS IgG-(IL-2)2로 이전에 보여진 바와 같이(도 9), 기억 Treg 및 미접촉 Treg는 DP47GS IgG-(IL-2)2 및 pSTAT5a 유도된 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2에 가장 민감한 세포인 반면(도 15A, B); 각각의 융합 단백질은 활성화의 변곡점뿐만 아니라 활성화를 위한 최대 용량에 대해 요구되는 농도에서 상이한 최대 pSTAT5a 반응을 자극한다. 세포 아형으로서 제시된 CD56bright NK 세포는 야생형 IL-2 융합 단백질과 비교하여 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2에 대한 Treg보다 덜 민감하고(도 15C); 활성화의 변곡점은 더 높고, 이 경우 시험된 가장 많은 용량(5000 ng/ml)에서 조차도 최대 효과를 달성할 수 없다. DP47GS IgG-(IL-2)2와 달리, NK 세포는 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2에 반응하지 않는다(도 15D). 중추 기억 CD4+ T 세포(도 15E) 및 효과기 기억 CD4+ T 세포(도 15F) 둘 다는 DP47GS IgG-(IL-2)2보다 1000배 더 높은 활성화의 변곡점을 갖는 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2에 비교적 덜 반응하고 시험된 최대 용량(5000 ng/ml)에서 부분적인 반응만을 유도한다. DP47GS IgG-(IL-2)2는 활성화의 변화 정도를 유도하는 반면, DP47GS IgG-(IL-2N88D)2는 하기 아형에서 영향을 미치지 않는다: 미접촉 CD4+ T 세포(도 15G), 중추 기억 CD8+ T 세포(도 15H), 효과기 기억 CD8+ T 세포(도 15I), 미접촉 CD8+ T 세포(도 15J), 효과기 기억 CD45RA+CD8+ T 세포(도 15K), NKT 세포(도 15L) 및 CD3+CD4-CD8-CD56- T 세포(도 15M).
EC50 값은 표 3에 나타내고 세포 아형에 대go 관찰된 최대 pSTAT5a 반응의 50%를 달성하는데 요구되는 IL-2 융합 단백질의 양에 기초한다. 이의 야생형 IL-2 대응물 DP47GS IgG-(IL-2)2와 유사한 DP47GS IgG-(IL-2E95A)2는 잠재적으로 고-친화도 IL-2 수용체에 대한 이의 증가된 결합활성의 결과로서 고-친화도 수용체 CD25(IL2Rα)를 본질적으로 발현하는 세포인 Treg에서 pSTAT5a의 가장 강력한 유도를 생성한다. DP47GS IgG-(IL-2E95A)2 및 DP47GS IgG-(IL-2)2에 대한 용량 반응은 중첩가능하다. Treg에서 pSTAT5a 활성화에 대한 EC50은 1가 DP47GS IgG-IL-2와 비교하여 DP47GS IgG-(IL-2E95A)2 및 DP47GS IgG-(IL-2)2로 6 내지 7배 적다. 유사하게, Treg 활성화에 대한 EC50은 2가 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2와 비교하여 1가 DP47GS IgG-IL-2로 7 내지 10배 적다. 마지막으로, Treg 활성화에 대한 EC50은 2가 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2와 비교하여 2가 DP47GS IgG-(IL-2)2로 36 내지 61배 적다.
DP47GS IgG-(IL-2N88D)2가 자가면역 질환을 치료하는 가장 유의미한 면역 장점은 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2가 Treg 활성화 대 CD4+ 기억 T 효과기 세포(>320배 내지 >500배)에 대하여 갖는 특이성의 극적인 차이를 입증하는 표 3에 잘 예시된다. 이와 비교하여, Treg 대 CD4+ 기억 T 효과기 세포에 대한 특이성의 차이는 DP47GS IgG-(IL-2)2(13 내지 14배) 및 DP47GS IgG-IL-2(10 내지 16배)에 대하여 실질적으로 적다.
상이한 세포 아형에서 DP47GS IgG-(IL-2E95A)2, DP47GS IgG-IL-2, 및 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2에 의한 pSTAT5a 활성화에 대한 EC50 값 및 배수 특이성 차이
　
인간 세포 아형		 IgG-IL-2
ED50(pM)		 IgG-(IL-2)2
ED50(pM) 		IgG-(IL-2N88D)2
ED50(pM)
기억 Treg 2.2 0.31 11.4
미접촉 Treg 1.8 0.29 17.7
CD4+ 기억 T 효과기 29 4 >5700
배수 특이성 :
기억 Treg 대 CD4+ 기억 Teff
미접촉 Treg 대 CD4+ 기억 Teff
10
16
13
14
>500
>320
생체내 인간 NK 세포 및 CD8 + T 세포에서 IL-2 융합 단백질의 상이한 효과신선한 인간 말초혈 단핵 세포(PBMC)를 IL-2, NK 세포 및 CD8+ T 세포의 생존 및 성장에 호의적으로 공지된 조건을 제외하고 추가 자극 없이 시험관내 배양하였다. 인간 NK 세포를 검출가능한 CD56을 거의 발현하지 않거나 전혀 발현하지 않는 것(CD56-/dim으로 명명됨) 및 높은 수준의 CD56을 발현하는 "활성화" 아형(CD56bright로 명명됨)으로 세분할 수 있고; 혈액 중 대부분의 NK 세포는 CD56bright로서 분류된 소수 집단을 갖는 CD56-/dim 이다. CD56bright인 "활성화" NK 세포는 CD56 발현이 부족한(즉, CD56-/dim) NK 세포의 전구체라고 생각된다. 6일 후, 시험관내에서 DP47GS IgG-(IL-2)2 및 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2(각각 0, 5, 50 및 500 ng/ml에서) 차이를 NK CD56-/dim 세포, NK CD56bright 세포 및 CD8+ T 세포의 성장 및 생존시 검출하였다. 세포 수의 유의미한 차이는 CD56bright 세포에서(101 x 103 대 38 x 103의 평균, p<0.005)(도 16A) 및 또한 CD8+ T 세포에서(13.6 x 103 세포 대 2.5 x 103 세포의 평균, p<0.0001)(도 16B) 가장 큰 증가를 자극하는 DP47GS IgG-(IL-2)2로의 자극 사이에 보여졌다.
인간화된 마우스에서 IL-2 융합 단백질의 효과
인간화된 마우스를 면역약화된 숙주로서 약하게 조사된 신생 NOD.Prkdc scid IL2rg null (NSG) 마우스를 사용하고 이들을 IP 주사된 인간 태아 간 CD34+ 줄기 세포를 이식하여 구축하였다. 8 내지 10 주령에, 각각의 마우스로부터의 혈액을 시험하여 인간 이식이 발생하였음을 확인하였다. 프로류킨 및 DP47GS IgG-(IL-2)2를 비교하여, 생체내 영향을 미치는 1차 세포가 NK 세포 및 Treg임을 밝혔고; 이후 DP47GS IgG-(IL-2)2 처리하여 NK 세포와 비례하여 더 크게 반응하는 NK 세포를 갖는 Treg 둘 다에서 실질적으로 증가하였다. 프로류킨의 생체내 효과는 유사하지만 군 내에서 NK 세포 및 Treg에서 효과는 덜 지속적이고 DP47GS IgG-(IL-2)2와 비교하여 증가 정도는 감소하였다. 인간화된 마우스는 또한 IL-2 융합 단백질의 생체내 효과를 구별할 수 있다. 야생형 DP47GS IgG-(IL-2)2는, DP47GS IgG-(IL-2N88D)2가 NK 세포(도 17B)에서 효과가 없는 동안 Treg(도 17A) 및 NK 세포(도 17B) 둘 다에서 증가하였지만 야생형 IgG-(IL-2)2 보다 유의미하게 더 큰 정도로 Treg에서 증가하였다(도 17A).
인간화 NSG 마우스의 장기간 결과는 중량 손실 및 다중계 장기 부전을 초래하는 인간 이종 이식 대 숙주 반응으로 인해 더 짧은 생존 시간을 나타낸다. 비히클을 주당 2회 투여하는 것은 효과가 없고 치료 개시 후 36일의 평균 생존을 초래하였다(도 18). 비히클과 유사하게, DP47GS IgG-(IL-2N88D)2로 치료는 37일의 평균 생존을 초래하였다. 그에 반해, DP47GS IgG-(IL-2)2로 주당 2회 치료하는 것은 이 군의 평균 생존 시간을 21일로 단축시켰다(도 18, DP47GS IgG-(IL-2N88D)2와 비교하여 p<0.0037).
이식 대 숙주 반응의 소정된 심각도가 각각의 마우스에 대한 생존 부분의 끝에 영향을 주는 경우(중량 손실 ≥ 15%), 인간 세포 조성물은 혈액 중에 평가된다. 생명을 위협하는 이식 대 숙주 반응 진행 중에, 치료 팔에서의 두드러진 차이는 혈액 중 Treg, NK 세포 및 CD8+ T 세포의 최종 조성물에서 보여졌다(도 19). 비히클 처리된 마우스에서, 인간 Treg는 혈액 중 약 3%의 인간 CD45+ 세포로 구성된 총 인간 CD45+ 세포 및 NK 및 CD8+ T 세포를 1% 미만 차지한다. DP47GS IgG-(IL-2N88D)2로 처리는 NK 및 CD8+ T 세포를 각각 2% 및 5%까지 증가시키는 반면, Treg는 6%까지 증가시킨다. 그에 반해, 야생형 DP47GS IgG-(IL-2)2 처리는 NK 세포 및 CD8+ T 세포의 분획을 총 인간 CD45+ 세포의 30%까지 증가시키고 Treg는 3.5%까지 증가시키고, 아마도 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 처리된 마우스와 비교하여 이 군에서 생존 시간의 유의미한 감소를 입증할 수 있다.
시노몰구스 말초혈 세포 아형에서 pSTAT5a의 유도
인간 말초혈에서 관찰된 바와 같이, IL-2(프로류킨(등록상표))로 자극된 시노몰구스 말초혈 중 Treg 아형에서 pSTAT5a의 선택적이고 유사한 용량-의존적 유도가 존재한다(데이터는 나타내지 않음). 3개의 Treg 아형에서 pSTAT5a를 유도하는 DP47GS IgG-(IL-2)2 및 DP47GS IgG-IL-2의 능력을 직접 비교했을 때, pSTAT5a의 최대 수준의 50%에 이르기 위해 DP47GS IgG-IL-2보다 2 내지 8배 더 적은 DP47GS IgG-(IL-2)2가 필요하였다. 표 4는 상이한 시노몰구스 Treg 아형에서 DP47GS IgG-IL-2 대 DP47GS IgG-(IL-2)2에 의한 pSTAT5a 활성화에 대한 EC50 값을 요약한 것으로, 결과는 인간 말초혈에서 나타난 바와 두드러지게 유사하다(표 3).
인간 전혈과 유사하게, 정상적인 건강한 시노몰구스 원숭이로부터의 전혈 중에서 조절 T 세포 아형 및 통상의 T 세포를 확인하기 위해 세포 표면 및 세포내 마커를 사용하였다. 혈액 샘플을 같은 날에 3마리의 건강한 시노몰구스 원숭이로부터 나트륨 헤파린 관에 수집하고, 다양한 농도의 DP47GS IgG-IL-2 또는 DP47GS IgG-(IL-2)2를 500 ㎕의 혈액에 첨가하고 37℃에서 배양하였다. 37℃에서 10 분 후에, 예열된 BD 용해/고정 완충액(비디 바이오사이언시즈)을 사용하여 샘플을 용해시키고 고정시켰다. 세척 후에, 세포를 얼음 위에서 30 분 동안 1 ml 메탄올로 투과화시켰다. 샘플을 3회 세척하고, 4℃에서 1 시간 동안 FOXP3-알렉사 플루오르(등록상표) 647(클론: 259D, 바이오리젠드), CD4-V500(클론: L200, 비디 바이오사이언시즈), CD45RA-V450(클론: 5H9, 비디 바이오사이언시즈), CD25-PE(클론: 4E3, e바이오사이언스), pSTAT5a-알렉사 플루오르(등록상표) 488(클론: 47, 비디 바이오사이언시즈), 및 Ki-67-PerCP-Cy5.5(클론: B56, 비디 바이오사이언시즈)의 패널로 염색시켰다. 모든 샘플은 LSRFortessa(상표) 세포 분석기(벡톤 디킨슨)로 수득하였으며, 이어서 플로우조 소프트웨어(플로우조 엘엘씨)로 분석하였다.
시노몰구스 말초혈 Treg 아형에서 DP47GS IgG-IL-2 및 DP47GS IgG-(IL-2)2에 반응하여 pSTAT5a의 유도
T 세포 IgG-IL-2 IgG-(IL-2) 2 배수 변화
활성화 Treg 0.07 ng/mL 0.02 ng/mL 4
기억 Treg 0.21 ng/mL 0.025 ng/mL 8
미접촉 Treg 0.04 ng/mL 0.02 ng/mL 2
추가 실험에서, 인간 혈액을 사용하는 pSTAT5a 분석과 유사하게, 정상적인 건강한 성인 시노몰구스 원숭이로부터 갓 헤파린화된 혈액을 비히클 대조군으로서 PBS, DP47GS IgG-(IL-2)2 및 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2로 시험관내 자극하고, Treg 아형 및 통상의 CD4+ 기억 T 효과기 세포에서 STAT5a 인산화의 효과를 입증하였다. 20 ng/mL 자극 용량을 1 ng/mL 이하에서 최대 인간 Treg 반응 및 상기 용량 범위에서 통상의 CD4+ 기억 T 효과기 세포의 거의 최대 반응에 기초하여 선택하였다(도 9에 야기됨).실험 조건은 상기 기재된 바와 같았다. 혈액 샘플을 건강한 3마리 시노몰구스 원숭이(기증자 C1, C2, C3)로부터 같은 날 나트륨 헤파린 관에 수집하고, 20 ng/mL의 DP47GS IgG-(IL-2)2 또는 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2를 혈액(500 ㎕)에 가하고 용해 및 분석 전에 37℃에서 20 분 동안 항온처리하였다.
분석을 위해 시노몰구스 CD4+CD25+ Treg를 미접촉(FOXP3+CD45RA+), 기억(FOXP3+CD45RA-), 및 활성화(FOXP3hiCD45RA-) 아형으로 나눈 유동 세포계측 게이팅 전략을 도 20A에 나타내었다. 인간에서와 같이, 각각의 기증자로부터 CD4+CD25+FOXP3+ Treg의 3개 아형은 높은 수준의 고-친화도 IL-2 수용체 CD25를 발현하였다(도 20B). 20 ng/mL의 DP47GS IgG-(IL-2)2 및 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 둘 다로 시험관내 자극 후, 모든 3개 기증자로부터의 Treg는 유의미한 STAT5a 인산화를 생성하였다(도 20C). 인간과 유사하게, 시노몰구스 활성화 및 기억 Treg는 미접촉 Treg와 비교하여 pSTAT5a 유도에 대한 큰 가능성을 나타내었다.
Treg 만큼 민감하지 않으면서, 인간 통상의 CD4+ 기억 T 효과기 세포는 활성화의 바이오마커로서 pSTAT5a를 사용하여 DP47GS IgG-(IL-2)2에 대하여 20 ng/mL의 평가된 ED90을 갖는 IL-2로 자극될 수 있다(도 14). 통상의 시노몰구스 CD4+ 기억 T 효과기 세포는 유사하게 CD25-인 대부분의 세포 및 CD25+인 더 작은 아형을 갖는 CD4+FOXP3-CD45RA- 세포로서 혈액에서 확인될 수 있다(도 21A). 전체 집단으로서 취해지는 경우, 모든 3명의 기증자로부터의 시노몰구스 기억 Teff 세포는, 20 ng/mL DP47GS IgG-(IL-2)2에 대한 반응은 pSTAT5a에서 증가하는 반면, 20 ng/mL DP47GS IgG-(IL-2N88D)2는 pSTAT5a에서 거의 효과가 없거나(cyno 2) 전혀 효과가 없다(cyno 1 및 3)(도 21B). 기억 Teff 세포가 CD25- 및 CD25+ 아형으로 추가 세분되는 경우, DP47GS IgG-(IL-2)2에 대한 반응은 주로 CD25+ 아형 중에 존재하고(도 21D) CD25- 아형에서는 거의 반응하지 않는 것으로 밝혀졌다(도 21C). 그에 반해, DP47GS IgG-(IL-2N88D)2는 CD25- 기억 Teff 세포에서 효과가 없고(도 21C) CD25+ 아형에서 70 내지 80% 적은 자극 활성을 갖는다(도 21D).
추가 연구는 신선한 정상 시노몰구스 혈액 중에서 상이한 T 세포 아형, 즉, 활성화, 미접촉, 및 기억 Treg 및 CD4+ 기억 T 효과기 세포에서 pSTAT5a를 자극하는 이들의 능력에 대한 용량 반응 방식으로 DP47GS IgG-(IL-2)2 및 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2의 농도 변화를 직접 비교하였다. DP47GS IgG-(IL-2)2 및 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 둘 다는 용량 의존적 방식으로 각각의 Treg 아형에서 2가 IL-2N88D 융합 단백질보다 약 10배 더 강하게 야생형 2가 IL-2 융합 단백질을 자극하였다(도 22A 내지 C). 그에 반해, CD4+ 기억 T 효과기 세포가 유도를 위해 평가되는 경우, 2개 분자 사이에 극적인 차이가 보여졌다(도 22D). DP47GS IgG-(IL-2)2는 300 ng/mL에서 EC90을 갖는 것으로 나타난 반면, DP47GS IgG-(IL-2N88D)2는 사실상 고 용량에서 효과가 없었다. 시노몰구스 pSTAT5a 자극에 대한 EC50 값뿐만 아니라 Treg 대 CD4+ 기억 T 효과기 세포를 자극하기 위한 상대적인 배수 특이성을 표 5에 나타내었다. 시노몰구스 전혈에서 이러한 결과는 인간 전혈(도 14 및 표 3)을 사용한 결과와 상당히 유사하고 시노몰구스에서의 연구는 인간 임상 목적을 위해 높은 예측 값을 가질 수 있음을 시사한다.
시노몰구스 T 세포 아형에서 DP47GS IgG-(IL-2)2 및 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2에 의한 pSTAT5a 활성화에 대한 EC50 값 및 배수 특이성 차이
Cyno Treg IgG-(IL-2) 2 (ng/mL) IgG-(IL-2 N88D) 2
(ng/mL)
활성화 Treg 0.1 0.7
기억 Treg 0.1 1.1
미접촉 Treg 0.06 0.8
CD4+ 기억 T 효과기 1.2 >1,000
배수 특이성 :
활성화 Treg 대 CD4+ 기억 Teff
기억 Treg 대 CD4+ 기억 Teff
미접촉 Treg 대 CD4+ 기억 Teff		 　
12
12
20		 　
>1,400
>900
>1,200
마우스의 약동학 특성마우스에서 작용성 연구를 수행하기 전에, 야생형 및 N88D 1가 및 2가 IL-2 면역접합물의 약동학(PK) 특성을 NOD, NOD.scid, 및 NOD.scid.Il2rα -/- 마우스에서 평가하였다(도 23).
NOD 및 NOD.scid 마우스(n=3)를 0.5% 마우스 혈청을 함유하는 PBS 중 DP47GS IgG-IL-2 또는 DP47GS IgG-(IL-2)2를 마우스당 0.3 mg/kg 정맥내(i.v.) 주사하고, 주사 후 2 분 내지 168 시간의 범위로 다양한 시간에 채혈하였다(도 23A). IL-2를 포획하기 위해 마우스 항-인간 IL-2 mAb(비디 파밍겐(BD Pharmingen), #555051, 클론 5344.111)로 코팅한 96-웰 플레이트를 사용하여 마우스 혈청 샘플에서 인간 IL-2를 평가하였다. 이어서, 비오틴 처리된 마우스 항-인간 IL-2 mAb(비디 파밍겐, #555040, 클론 B33-2)를 사용하여 인간 IL-2를 검출하였다. IL-2 결합을 시각화하고 유로퓸-공액결합된 스트렙타비딘을 사용하여 정량화하였다. 처음 24 시간에 걸쳐서 NOD 및 NOD.scid 마우스 둘 다에서 DP47GS IgG-(IL-2)2는 DP47GS IgG-IL-2보다 더욱 빠르게 제거되었다. 48 시간까지 각각의 혈청 수준의 농도는 유사하였고, 72 시간에 모두 검출 한도 미만이었다. IL-2 검출 한도는 0.05 ng/mL이었고 점선으로 나타내었다. 놀랍게도 적응성 면역 시스템이 없는 마우스에서 1가 및 2가 IgG-IL-2 면역접합물 둘 다의 빠른 제거는 비-조혈 IL-2 구획 또는 "싱크(sink)"가 마우스에 존재함을 시사하고, IL-2 면역접합물의 생체내 빠른 제거를 구동할 수 있다.
상기 이론을 시험하기 위해, 본 발명자들은 또한 고-친화도 IL-2 수용체인 IL2Rα(CD25)가 결핍된 NOD.scid 마우스, 즉, NOD.scid.Il2rα -/- 마우스에서 PK 연구를 수행하였다(도 23B). NOD.scid. Il2rα -/- 마우스에서, DP47GS IgG-(IL-2)2는 3배 더 높은 용량(0.3 mg/kg)으로 주어짐에도 불구하고, 0.1 mg/kg DP47GS IgG-IL-2 및 0.1 mg/kg DP47GS IgG-(IL-2N88D)2보다 처음 24 내지 48 시간에 걸쳐서 더욱 빠르게 제거되었다. 그러나, 48 시간 후, 각각의 접합물의 혈액 수준은 6일 까지 혈액에서 용이하게 검출가능한 IL-2를 갖는 느린 꾸준한 제거 단계를 나타내었다. 흥미롭게도 이러한 고-친화도 IL-2 수용체 결핍 마우스에서, DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 분자는 IgG-IL-2보다 약간 더 빠른 초기 24 시간 분포 상을 갖지만 그 후에 시험된 마지막 시간인 6일 까지 야생형 1가 면역접합물와 유사한 제거 단계를 나타내었다. DP47GS IgG-(IL-2N88D)2에 대한 이러한 데이타는 특히 NOD.scid.Il2rα -/- 마우스에서 pK 결과가 비인간 영장류에서 PK 결과를 밀접하게 예측하는 것과 같기 때문에 관련된다.
IL-2로 처리 후 마우스 Treg에서 FOXP3 및 CD25 증가
생체내 FoxP3+ Treg를 자극하기 위한 인간 IL-2의 상이한 분자 형태 및 배열의 능력을 비교하기 위해, 마우스에 비히클, 프로류킨(재조합 인간 IL-2), DP47GS IgG-IL-2, DP47GS IgG-(IL-2)2, 또는 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2를 피하 주사하고, 24 시간 중 이전에 결정된 최적 시간에 세포 표면 CD25 및 세포내 FOXP3의 발현시 변화를 Treg에서 평가하였다(도 24). 건강한 어린 BALB/c 마우스(n=3/처리군, n=4/비히클 코호트)에 프로류킨(20,000 또는 100,000 IU/마우스), DP47GS IgG-IL-2(60, 300 또는 1500 IU/마우스), DP47GS IgG-(IL-2)2(60, 300 또는 1500 IU/마우스), 또는 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2(60, 300 또는 1500 IU/마우스)를 피하 주사하였다. 투여량을 0.5% 멸균 여과된 마우스 혈청을 함유하는 멸균 PBS(pH 7.2; 100 ㎕)로 구성된 비히클에 전달하였다. 24 시간 후, 마우스를 안락사시키고 비장을 절단하였다. L-15 배지(1 ml) 중에 비장세포의 단일 세포 현탁액을 생성하고 추가 가공까지 얼음에서 저장하였다. 단일 세포 현탁액의 여과된 분취액(40 ㎕)을 FACS 관에 옮기고 FACS 완충액(2 ml; 600 x g, 5분)으로 세척하였다. 이어서, 샘플을 세포 표면 항원에 대하여 하기 형광색소-공액결합된 항체로 항온처리하였다: CD4(클론 RM4-5, 형광색소 A700), CD25(eBio7D4, Af488), CD44(IM7, e605), CD62L(MEL-14, PE), ICOS(C398.4A, PE/Cy7), CD103(2E7, APC). 염색을 4℃에서 30 분 동안 FACS 완충액(PBS pH 7.2 + 0.2% BSA)(100 ㎕) 중에서 수행하였다. 세포 표면 염색 후, 샘플을 세포내 염색(이바이오사이언스(eBioscience) 세포내 염색 프로토콜에 따라) 전에 FACS 완충액(4 ml; 600 x g, 5분)으로 세척하였다. 간단히, 샘플을 고정/완충액(이바이오사이언스 #00-5521)(200 ㎕) 중에 현탁하고 4℃에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 1x 완충액(이바이오사이언스 #00-8333)(1 m)을 샘플에 첨가한 후 FACS 완충액(3 ml)을 첨가하고 세척하였다(600 x g, 5분). 세포내 항원, Ki-67(B56, PerCP Cy5.5) 및 FOXP3(FJK-16S, e450)을 4℃에서 1 시간 동안 1x 완충액(100 ㎕) 중에서 염색하였다. FACS 완충액(600 x g, 5분; 4 ml x 2)으로 세척하고 데이타를 비디 포르테사(BD Fortessa: 상표) 분석기에서 수득하고, 플로우조 소프트웨어(플로우조 엘엘씨)를 사용하여 분석하였다. Treg를 림프구 게이트 내에 일중항으로부터 CD4+FOXP3+로 정의하고; 이 집단으로부터, CD25 및 FOXP3 평균 형광 강도(MFI)를 모든 샘플에 대하여 계산하였다.
도 24에 나타낸 바와 같이, 3개의 IL-2 면역접합물은 마우스 Treg에서 CD25(도 24A) 및 FoxP3(도 24B)의 발현을 자극하는 힘이 동등하고 60, 300 및 1500 IU/마우스 용량의 범위에 걸쳐 지속적인 용량 의존적 반응을 나타내었다. 모든 경우에, 1500 IU의 각각의 면역접합물(흑색 막대)는 100,000 IU의 프로류킨(흑색 막대) 보다 유의미하게 더욱 효과적이었다. 대부분의 경우에, 300 IU의 면역접합물(진흑색 막대)는 100,000 IU의 프로류킨과 동일하였고, 60 IU의 면역접합물(연회색 막대)는 20,000 IU의 프로류킨(연회색 막대)과 동일하였다. 모든 처리군에서, 데이타는 평균±SD로 나타내었다.
시노몰구스 원숭이의 약동학 특성
비인간 영장류에서 작용성 연구를 수행하기 전에, 건강한 성인 생물-미접촉 시노몰구스 원숭이에서 IL-2 면역접합물의 약동학(PK) 특성을 평가하였다(도 25). 원숭이(n=2/용량)에게 0.5% 시노몰구스 혈청을 함유하는 PBS 중 멸균한 DP47GS IgG-IL-2 또는 DP47GS IgG-(IL-2)2의 짧은 볼루스를 정맥내(i.v.) 주사하고, 주사 후 30 분 내지 72 시간 범위의 다양한 시간에 채혈하였다. 인간 IL-2를 포획하기 위해 마우스 항-인간 IL-2 mAb(비디 파밍겐, 카탈로그 번호 555051, 클론 5344.111)로 코팅된 96-웰 플레이트를 사용하여 시노몰구스 혈청 샘플에서 인간 IL-2를 평가하였다. 이어서, 인간 IL-2를 비오틴 처리된 마우스 항-인간 IL-2 mAb(비디 파밍겐, 카탈로그 번호 555040, 클론 B33-2)를 사용하여 검출하였다. IL-2 결합을 시각화하고 유로퓸-공액결합된 스트렙타비딘을 사용하여 정량화하였다. 분석시 시노몰구스 혈청을 사용하는 검출 수준은 0.05 ng/mL의 IL-2(도 25에서 점선임)였다. 처리 전에 취해진 시노몰구스 혈청은 검출가능한 IL-2가 없다(따라서, 0.05 ng/mL 미만).
모든 용량의 DP47GS IgG-IL-2(도 25A) 및 DP47GS IgG-(IL-2)2(도 25B)로 i.v. 주사 후 30 분 내지 48 시간 동안 시노몰구스 혈청 중에서 IL-2를 검출하였다. 72 시간까지, IL-2의 혈청 수준은 10 및 25 ㎍/kg의 DP47GS IgG-IL-2 또는 DP47GS IgG-(IL-2)2로 처리된 모든 동물에 대하여 검출 한도 미만(0.05 ng/mL, 점선)이었다. 100 ㎍/kg의 DP47GS IgG-IL-2의 투여 후, 검출가능한 혈청 IL-2는 여전히 72 시간에 존재하였다.
시노몰구스 원숭이에서 Treg 수의 유도
생체내에서 DP47GS IgG-IL-2로 처리된 시노몰구스 동물은 Treg의 절대 수에서의 용량-의존적 증가뿐 아니라 투여 7일후 기준치 이상의 배수 증가를 나타내었다(각각 도 26A 및 26B). 3 내지 6년 범위 연령의 2가지 성별 모두의 정상적인 건강한 시노몰구스 원숭이를 모든 시험에 이용하였으며, 동물은 1회 이상 이용하지 않았다. 마취하에, 다양한 용량의 DP47GS IgG-IL-2(n=4-6) 또는 비히클(n=3)을 측면 등쪽에 SC 주사하였다. DP47GS IgG-IL-2의 개별 용량은 체중을 기준으로 하였으며, 0.5% 멸균 정상 시노몰구스 혈청을 함유하는 멸균 PBS(pH 7.2)의 비히클 중에 주사용으로 제형화하였다. 혈액 샘플을 처리 후 다양한 시점에서 수집하고, 아드비아 자동 혈액 분석기(Advia Automated Hematology Analyser) 및 상기에서 상술한(표 4에 대한 실험 절차) 세포 표면 및 세포내 마커를 사용하여 혈액학적 변화(CBC 및 백혈구백분율(Differential))에 대해 시험하였다. 처리 7일 후에 전혈 CD4+CD25+FOXP3+ 조절 T 세포에서의 변화를 전혈 mm3 당 절대 세포수(도 26A) 및 Treg에서의 배수 변화(도 26B)로서 도 26에 나타내었다; 모든 데이터는 평균±SD로 나타낸다. 25 ㎍/kg 및 36 ㎍/kg DP47GS IgG-IL-2의 보다 고 용량에서, 각각 거의 3배(111 내지 255%의 범위, n=6) 및 4배(110 내지 470%의 범위, n=6)의 평균 Treg 증가가 관찰되었다. DP47GS IgG-IL-2의 SC 용량(12, 6 및 2 ㎍/kg)의 추가의 감소는 Treg 수 및 배수 변화에 상응하게 감소되는 변화를 계속 야기하였다. 이론에 결부시키고자 하는 것이 아니라, 12 ㎍/kg DP47GS IgG-IL2 용량하에 Treg에서의 약 2배 증가(67 내지 133%의 범위, n=6)는 일부 자가면역 및 염증성 질환에 대한 Treg에서 바람직한 증가를 나타낼 수 있다. 인간에서 Treg 수에 큰 변화(혈액 mm3 당 20 내지 90 Treg; CD4+ T 세포의 4 내지 10%)가 있으며, 개체내에서 IL-2에 의해 유도된 Treg의 증가는 기능 억제에 전체적인 증가를 야기할 것이라고 평가하는 것은 타당하다.
보다 저-용량의 DP47GS IgG-IL-2를 평가하였을 때(2 내지 6 ㎍/kg), DP47GS IgG-IL-2 투여에 이은 Treg의 변화를 검출하기 위한 최적 시간을 확인하기 위해 더 자주 혈액 샘플을 수집하였다(도 27). Treg에서의 변화는 7일에 나타났지만, 그보다 이른 제 4일에 발생된 최대 자극이 보다 고-용량의 DP47GS IgG-IL-2 하에 측정되었다(7일, 도 26).
프로류킨(등록상표) 및 DP47GS IgG-IL-2는, Treg 및 다른 IL-2 반응 세포에서 pSTAT5a를 자극하기 위해 사용된 IL-2 활성의 단위로 직접 비교할 때, 시험관내 인간 및 시노몰구스 전혈 분석에서 필적하였다. 인간에서 프로류킨(등록상표)의 알려진 짧은 반감기를 이용하여, 시노몰구스 원숭이에서 생체내 Treg 유도 및 활성화를 평가하기 위한 단일 용량 연구를 수행하였다. 프로류킨(등록상표)은 절대 수 및 pSTAT5a 활성화에서의 배수 변화로 측정된 Treg의 용량 및 시간 의존적 변화를 야기하였다. Treg 수에서의 증가는 근소하였지만(도 28A: 10 내지 40%), Treg pSTAT5a에서의 프로류킨-유도된 증가는 처리 하루 후에 상당하였으며 용량 의존적이지만(도 28B) 생체내 짧은 지속 기강은 2일 내지 3일에 정상으로 돌아왔다.
시노몰구스 원숭이에서 생체내 Treg의 증가를 유도하는 DP47GS IgG-IL-2의 능력을 프로류킨(등록상표)의 상기 능력과 비교한 것이 도 29에 나와 있다. 정상적인 건강한 시노몰구스 원숭이(n=5의 군)를 저-용량의 DP47GS IgG-IL-2 또는 고-용량의 프로류킨(등록상표)으로 처리하고, 10일에 조절 T 세포의 변화를 시험하였다. 0일 및 7일에, DP47 IgG-IL-2를 16,800 IU/kg(도 26에 나타낸 12 ㎍/kg 용량)의 용량으로 SC 투여하였다. 프로류킨(등록상표)이 제 1형 당뇨병 환자에게 투여되고(4.5 x 106 IU/사람, 3회/주) Treg를 증가시키는 것으로 나타난 공개된 연구 및 도 28에서의 단일 용량 데이터에 근거하여, 프로류킨(등록상표)을 각각 200,000 IU/kg(4.5 x 106 IU/사람의 시노몰구스 등가량)에서 총 5개 용량에 대해 주 3회(M, W, F) SC 투여하였다. 결과는 도 29에 혈액 mm3 당 총 Treg의 변화(도 29A), Treg 수에서의 배수 증가(도 29B), 및 Treg 대 통상의 CD4+ FOXP3- 세포의 비의 변화(도 29C)에 대해 평균±SD로 나타내었다.
10일의 기간 동안 거의 30배 더 낮은 DP47GS IgG-IL-2 활성이 투여되었지만, DP47GS IgG-IL-2는 프로류킨(등록상표)보다 Treg 수에 더 큰 증가를 유도하였다(도 29A, p=0.06). 기준치 이상의 Treg 수의 배수 증가(도 29B) 및 통상의 CD4 T 세포에 비해 Treg의 증가(도 12C)도 또한 프로류킨(등록상표)에 비해 DP47GS IgG-IL-2가 투여된 원숭이에서 더 컸다(각각 p=0.0011 및 p=0.016). 인간에서, CD4+ 조절 T 세포(통상적으로 FOXP3+로 및 표면 마커의 조합으로 규정됨) 대 비-조절 CD4 T 세포(통상적 또는 효과기 세포로 지칭됨)의 비도 시간 경과에 따른 환자에서의 Treg의 기능 수준을 규정하기 위해 종종 사용된다.
저-용량 DP47GS IgG-IL-2 처리에 대한 시노몰구스 말초혈 세포 아형의 생체내 반응
저-용량 IL-2 처리의 생체내 세포 특이성은 중요한 파라미터이다. 시노몰구스 원숭이 또는 마우스에게 투여 후 다양한 시점에서 채혈한 혈액중 pSTAT5a 수준을 생체외에서 측정함으로써, DP47GS IgG-IL-2 또는 프로류킨(등록상표)에 의해 유도된 생체내 세포 활성화가 민감하게 모니터링될 수 있는지를 측정하였다. 시험관내에서 모니터링될 수 있는 모든 세포 집단의 생체내 반응(도 8 내지 10)은 또한 생체외에서도 시험될 수 있다.
단일 저-용량의 DP47GS IgG-IL-2(12 ㎍/kg)를 건강한 시노몰구스 원숭이(n=5)에게 생체내 투여한지 1일 및 3일 후에, 전혈을 수집하고 전술한 바와 같이(표 4에 대한 시험 절차) STAT5a 인산화에 대해 시험하였다. 각각의 원숭이를 처리 전 0일에 채혈하고, STAT5a 인산화의 양을 측정하고 처리 후 배수 변화를 평가하기 위해 개별적으로 사용하였다. 1일 및 3일에 Treg에서 pSTAT5a의 배수 변화는 도 30A에, 통상의 CD4+ CD45RA- 기억 T 효과기 세포에서 pSTAT5a의 배수 변화는 도 30B에, 그리고 통상의 CD4+ CD45RA+ 미접촉 T 효과기 세포에서 pSTAT5a의 배수 변화는 도 30C에 나타내었다. 결과는 단일 저-용량(12 ㎍/kg)의 DP47GS IgG-IL-2 투여한지 1일 및 3일 후에 수득된 시노몰구스 혈액이 기억 및 미접촉 CD4+ T 세포에 비해 Treg 세포에서 선택적인 pSTAT5a 증가를 나타내었음을 명확하게 보여준다(도 30A 내지 C). 단일 저-용량 DP47GS IgG-IL-2는 지속적인 생체내 Treg 활성화 상태를 야기하는데 있어서 단일 고-용량 프로류킨(등록상표)(도 28B)보다 명백하게 우수하였다.
Treg 활성화의 생체내 바이오마커로서 STAT5a의 인산화를 이용하는 초기 연구는, 단일 용량 프로류킨(등록상표)(도 28B) 하에 1일에만, 및 저-용량(12 ㎍/kg) DP47GS IgG-IL-2(도 30A) 하에 1일 및 3일에 최대 pSTAT5a를 나타내었다. 추가의 샘플링 시점과 결부된 DP47GS IgG-IL-2의 추가의 적정은 생체내 pSTAT5a 신호가 7일에 정상으로 다시 떨어지기 전 4일 동안 유지될 수 있음을 보여주었다(도 31A, 31B). 2 ㎍/kg(31A, n=4) 및 6 ㎍/kg(31B, n=6) 용량 둘 다에 대한 pSTAT5a 신호의 MFI(평균 형광 강도)는 최대보다 낮은 pSTAT5a 신호전달이 발생했음을 시사하였다(도 33B 참조). 상기 매우 저-용량의 DP47GS IgG-IL-2도 Treg의 지속적인 생체내 신호전달을 제공하였으며, 프로류킨(등록상표)보다 우수하였다(도 28B). 상기 결과들은, 매우 낮은 수준의 장기지속 IL-2, 즉 DP47GS IgG-IL-2가 생체내에서 연장된 시간 동안 Treg를 자극하여 주된 자가-관용을 회복하고 질환 결과를 개선하기 위해 필요한 치료 횟수를 감소시킬 수 있지만 프로류킨(등록상표)은 그렇지 않다는 본 발명의 평가를 뒷받침한다. 저-용량 IL-2 처리 후 말초혈 중 Treg 세포의 증가는 세포의 실제적인 증가보다는 체내 세포의 분포의 변화를 반영할 수 있다. 생체내 Treg 증가가 IL-2 처리에 의한 세포 분열의 유도로 인해 적어도 부분적인 것임을 입증하기 위해, 증식 Ki-67의 세포내 마커를 평가하였다. Ki-67은 G1, S, G2, 및 유사분열동안 핵에서 검출될 수 있지만 세포 주기의 G0 단계에 있는 휴지 세포에는 부재하는 단백질이다. 전술한 2 및 6 ㎍/kg DP47GS IgG-IL-2로 처리된(도 31) 시노몰구스 원숭이도 또한 생체내 증식의 정도를 평가하기 위해 기술된 바와 같은 (표 4에 대한 실험 절차) 세포내 마커 Ki-67의 생체외 변화에 대해 모니터링하였다. 0일에 세포 주기에 있는 세포(Ki-67+)의 비율을 처리 후 1일 내지 11일에 세포 Ki-67+의 비율과 비교하였다. Ki-67+ Treg는 도 32A에 나타내었고, 통상의 CD4+ CDRA45- 기억 T 효과기 세포는 도 32B에, 통상의 CD4+ CD45RA+ 미접촉 T 효과기 세포는 도 32C에 나타내었다. 단일 저-용량의 DP47GS IgG-IL-2(6 ㎍/kg)를 투여하고 1일 내지 7일 후에 수득된 시노몰구스 혈액 세포는 통상의 CD4+ 미접촉 T 효과기 세포에 비해 Treg에서 선택적인 Ki-67 증가를 나타내었다(도 32A 대 32C). 미접촉 T 효과기 세포와 달리, DP47GS IgG-IL-2(6 ㎍/kg)는 통상의 기억 CD4+ T 효과기 세포의 증식을 자극할 수 있었다(도 32B). DP47GS IgG-IL-2의 최저 용량(2 ㎍/kg)에서는, 6 ㎍/kg 용량에 비해 세포 주기로의 최소 활성화 및 증식이 나타났다.
인간 및 시노몰구스 전혈 분석에서, 2가 DP47GS IgG-(IL-2)2의 시험관내 활성은 전체적으로 1가 DP47GS IgG-IL-2보다 Treg에 대해 약 6배 더 효과적이었다(표 2 및 4). 따라서, 시노몰구스 원숭이에게 첫번째 용량은 시험된 DP47GS IgG-IL-2의 최고 용량(36 ㎍/kg)보다 6배 더 낮았다. 6 ㎍/kg(n=4)으로 투여된 DP47GS IgG-(IL-2)2는 치료 14일 후 상기 정상으로 잘 남아있는 순환 Treg의 큰 증가(도 33A), 제 1주에 정상으로 복귀된 Treg에서 상당하고 지연된 pSTAT5a(도 33B), 및 Treg 수에 거의 3배 증가(도 33C)를 야기하였다. DP47GS IgG-IL-2에 의해 유도된 배수 변화(도 26으로부터, 개방된 막대)를 6 ㎍/kg 용량의 2가 DP47GS IgG-(IL-2)2(짙은색 막대)(도 33D)와 비교하였다. 인간 및 시노몰구스 전혈 분석과 유사하게, DP47GS IgG-(IL-2)2는 IgG 분자당 IL-2에 2배 증가 이상의 향상된 생체내 효능을 나타내었다.
매우 낮은 용량(2 및 0.7 ㎍/kg)에서의 그의 생체내 효과를 평가하기 위해 또 다른 용량의 2가 DP47GS IgG-(IL-2)2를 시노몰구스 원숭이에게 투여하였다(도 34). 2 ㎍/kg은 중간정도의 배수 변화(평균 46%, 20 내지 70%의 범위, n=8)를 야기한 반면, 0.7 ㎍/kg 용량은 T 세포 수에 거의 효과를 나타내지 않았다(16%의 평균 증가, n=3)(도 34A). 저-용량은 둘 다, Teff/mem 세포 pSTAT5a에는 거의 영향을 미치지 않으면서(도 34C, 각각 n=3), Treg에서의 pSTAT5a를 자극하였다(도 34B, 각각 n=3).
시노몰구스 원숭이에서 1가 및 2가 야생형 IL-2 융합 단백질 치료의 매우 중요한 효과 및 Treg를 증가시키는 그 능력은 도 35에 나타내었다. 장기지속 IgG-IL-2의 2가지 형태 모두, 활성화의 바이오마커로서 및 상기 도면에서 순환 Treg의 수에서의 배수 증가로서 생체내 pSTAT5a가 뒤따를 수 있는 Treg의 유효한 유도제이다. IgG의 C-말단에서 IL-2 분자를 2중화함으로써 증대된 효능을 갖는 DP47GS IgG-(IL-2)2는 DP47GS IgG-IL-2에 비해 용량 의존적 우수성을 가질 수 있다.
시노몰구스 T 세포 아형에서 FOXP3 및 CTLA-4의 DNA 탈메틸화
작용적으로 활성인 Treg는 면역억제 사이토카인 CTLA-4, IL-10 및 TGFb를 생성할 수 있고 전사 인자 FOXP3의 안정한 발현을 필요로 한다. 인간 및 시노몰구스 Treg에서 FOXP3의 발현은 FOXP3 유전자 자리 내에 Treg 특이적 탈메틸화 영역(TSDR)에서 10개 CpG DNA 메틸화 부위의 탈메틸화에 따른다. 유사하게, CTLA-4의 발현 및 생성은 인간 및 시노몰구스 CTLA-4 유전자 자리에서 7개 CpG DNA 메틸화 부위의 탈메틸화에 따른다. 따라서, 본 발명자들은 혈액 중에서 Treg의 수를 유의미하게 증가시키는 것으로 보여진 용량 및 시간으로 주어진 DP47GS IgG-IL-2(n=4, 25 ㎍/kg s.c.) 및 DP47GS IgG-(IL-2)2(n=4, 6 ㎍/kg s.c.)로 처리 전 및 처리 후 다양한 CD4+ T 세포 아형에서 FOXP3 및 CTLA-4 둘 다의 탈메틸 상태를 평가하였다. 생물 미접촉 성인 수컷 시노몰구스 원숭이만이 연구에 사용되고 이들의 중량은 9.1 내지 10.9 kg 범위이었다. 초기 기초 혈액을 수집하고 3 주 후 치료제를 투여하고 치료후 혈액을 4 내지 5일 후에 수집하였다. 헤파린 처리된 혈액(30 mL)으로부터 PBMC를 FACSAria(상표)(벡톤 디킨슨)를 사용하여 Treg(CD4+CD25+CD127low), 기억 T 효과기(CD4+CD45RA-), 미접촉 T 효과기(CD4+CD45RA+), 및 CD4+CD25-CD127- 세포를 비롯한 관련된 CD4+ 아형으로 분류하였다.
분류된 세포 아형을 100,000 세포의 분취액으로 냉동시키고 -80℃에서 건조 펠렛으로 저장하여 모든 샘플을 함께 가공하도록 하였다. 세포 펠렛을 녹이고 DNA를 추출하고 제조자의 지시에 따라 에피텍트 패스트 라이즈 올 키트(Epitect Fast Lyse All kit)(퀴아젠)을 사용하여 단일 단계에서 바이설파이트 처리하였다. 바이설파이트 DNA(2 ㎕ 중 5 ng)를 10 ㎕ 멀티플렉스(Multiplex) PCR 키트(퀴아젠), 6 ㎕ 물, 0.5 ㎕ FOXP3 정방향 프라이머 tgtaaaacgacggccagtTTTAGAAGTTGTATGGGGGATGTT(서열번호 54), 0.5 ㎕ FOXP3 역방향 프라이머 caggaaacagctatgaccAAAATATCTACCCTCTTCTCTTCCTC(서열번호 55), 0.5 ㎕ CTLA-4 정방향 프라이머 tgtaaaacgacggccagtGGGTTTGGTTATGAAGGAGTA TGA(서열번호 56) 및 0.5 ㎕ CTLA-4 역방향 프라이머 caggaaacagctatgaccTTCACT TAATTTCCACTAAAAATACCC(서열번호 57)를 함유하는 20 ㎕ 제 1 회전 듀플렉스 PCR에 사용하였다. 제 1 회전 PCR 주기는 15분 동안 95℃, 이후 30 초 동안 95℃, 90 초 동안 60℃ 및 60 초 동안 72℃ 20 주기 후, 72℃에서 10 분이었다. PCR 생성물을 제조자의 지시에 따라 암퓨어(AMPure) XP 비드(벡톤 코울터(Becton Coulter))를 사용하여 정제하고, 물(20 ㎕)에 용리하였다. 제 2 회전 PCR을 멀티플렉스 PCR 키트(퀴아젠)(7.5 ㎕), 제 1 회전 PCR 생성물(6.5 ㎕) 및 인덱스 프라이머(1 ㎕)를 함유하는 PCR(15 ㎕)을 통해 각각의 샘플의 출발시 독특한 인덱스 서열을 첨가하여 제 2 회전 PCR을 수행하였다. 제 2 회전 PCR 주기 조건은 15분 동안 95℃, 이후 30초 동안 95℃, 90초 동안 54℃ 및 60초 동안 72℃ 7 주기 후, 72℃ 5분이었다. 상기 PCR 생성물을 암퓨어 XP 비드를 사용하여 정제하고 물(15 ㎕)에 용리하고, 4 ㎕를 시마주 멀티엔에이(Shimadzu MultiNA)에 사용하여 PCR 생성물의 양을 정량화하였다. 각각의 샘플의 동일한 몰 농도를 풀링하여 카파 일루미나 라이브러리(Kapa Illumina library) 정량 키트를 사용하여 정량화된 시퀀싱 라이브러리를 제조하였다. 라이브러리는 v3 시약 및 2 x 300 bp 쌍 엔드 런(end run)을 갖는 일루미나(Illumina) MiSeq를 사용하여 시퀀싱하였다. 시퀀싱된 데이타를 맞춤형 파이톤 스크립트(bespoke python script)를 사용하여 역다중화하고 큐타데프트(Cutadapt) 프로그램을 사용하여 시퀀싱 어댑터를 제거하였다. 정방향 및 역방향 판독을 플래시(FLASH)를 사용하여 융합하고 각각의 메틸화 부위의 서열을 추출하였다.
시노몰구스 원숭이를 DP47GS IgG-IL-2 및 DP47GS IgG-(IL-2)2 둘 다로 처리하는 것은 동일한 처리 프로토콜을 사용하여 이전에 보여진 것과 유사하게 모든 처리된 동물의 혈액 중에서 Treg의 실질적으로 증가된 수를 유도하였다(도 33 및 35). 중요하게는, DP47GS IgG-IL-2 및 DP47GS IgG-(IL-2)2 둘 다로 처리 후 Treg에서 신속하고 두드러진 증가는 FOXP3(도 36, 상부 패널) 또는 CTLA-4(도 36, 하부 패널)의 탈메틸화 상태에 악영향을 주지 않거나 감소시켰다. 유사한 결과가 2개 분자에 대하여 보여졌고, DP47GS IgG-(IL-2)2의 데이타는 도 36에 나타내었다. FOXP3 및 CTLA-4 둘 다의 탈메틸화 상태가 처리에 의해 악영향을 받지 않고 감소되지 않는다는 것은 절대 수가 실질적으로 증가함에도 불구하고 모든 Treg가 이들의 천연 성숙 작용성 면역억제 표현형을 유지한다는 것을 나타낸다. 비인간 영장류에서 야기된 이러한 Treg FOXP3 및 CTLA-4 탈메틸화는 인간에서 저-용량의 오래 지속되는 IgG-(IL-2)2-유사 분자로의 처리가 인간 자가면역 질환뿐만 아니라 다른 만성 면역-매개된 만성 염증성 질환에 존재하는 면역조절 불균형을 정정하는 완전 작용성 성숙 Treg의 수를 증가시킬 수 있어야 함을 시사한다.
시노몰구스 원숭이에서 DP47GS IgG-(IL-2N88D) 2 의 약동학
DP47GS IgG-(IL-2N88D)2의 PK 특성은 생물 미접촉 시노몰구스 원숭이에서 평가하였다(도 37). 원숭이(n=2/용량)에게 0.5% 시노몰구스 혈청을 함유하는 PBS 중 30 또는 100 ㎍/kg의 멸균한 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2로 정맥내(i.v.) 및 피하(s.c.) 주사하고 주사 후 30분 내지 14일 범위의 다양한 시간에 채혈하였다. 이전에 기재된 바와 같인 시노몰구스 혈장 샘플에서 인간 IL-2를 평가하였다. 분석시 시노몰구스 혈장을 사용하는 검출의 수준은 0.05 ng/mL의 IL-2이었다. 처리 전에 취해진 시노몰구스 혈장은 검출가능한 IL-2를 갖지 않는다(따라서, 0.05 ng/mL 미만).
혈액 수준이 48 내지 72시간에만 검출될 수 있는 야생형 융합 단백질의 PK(도 25)와는 달리, DP47GS IgG-(IL-2N88D)2를 i.v.(도 37A) 및 s.c.(도 37B) 투여 경로로 14일을 나타내는 모든 시점에서 모든 동물로부터의 시노몰구스 혈장에서 검출하였다. 혈장 수준은 처음 2일 내지 3일 동안 비례하는 용량이고 야생형 IL-2 융합 분자와 비교하여 연장된 반감기를 나타내었다.
생체내 IL-2 노출의 바이오마커로서, 가용성 CD25(sCD25, IL-2RA)의 혈장 수준을 측정하였다(도 37C). 시노몰구스 sCD25와 교차 반응하는 것으로 공지된 인간 sCD25에 대한 단클론 항체 시약을 결합된 sCD25를 검출하기 위해 Eu++-공액결합된 스트렙타비딘을 사용하여 포획(MAB623, 알앤디 시스템스) 및 비오틴 처리된 검출(BAF223, 알앤디 시스템스) 항체를 사용하는 샌드위치 면역분석에 사용하였다. DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 투여 후 sCD25에서의 증가는 용량 의존적이고 1일 내지 7일 사이에 존재하고 8일에 정상 수준으로 돌아간다.
DP47GS IgG-(IL-2N88D) 2 를 갖는 시노몰구스 원숭이에서 Treg의 유도
야생형 DP47GS IgG-IL-2 및 DP47GS IgG-(IL-2)2로 생체내 처리된 시노몰구스에서 이전에 기재된 시험은 인간 전혈 분석에서 이의 시험관내 활성을 반사하는 Treg의 절대 수(각각 도 26 및 33)에서 2 내지 4배의 용량 의존적 증가, 즉, 6 내지 9배의 시험관내 차이를 나타낸다(표 2 및 3). 인간 전혈에서 시험관내 효능의 손실과 함께(표 3), 30 및 100 mg/kg의 생체내 용량이 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2에 대하여 선택되었다. 이전 시험과 유사하게, DP47GS IgG-(IL-2N88D)2를 체중에 기초하여 개별 용량으로 i.v. 또는 s.c. 경로로 주사하고, 0.5% 멸균 정상 시노몰구스 혈청을 함유하는 멸균 PBS(pH 7.2)의 비히클 중에 주사를 위해 제형화하였다(주사 용량 및 경로 당 n=2). 혈액 샘플을 처리 전(-4일 및 -5일), 처리 직전(0일) 및 처리 후 다양한 시간(1일 내지 14일)에 수집하고, 혈액 변화(CBC 및 차이) 뿐만 아니라 이전에 기재된 세포 표면 및 세포내 마커에 대하여 시험하였다.
총 CD4+ Treg, CD4+ 기억 Treg, CD4+ 미접촉 Treg 및 CD8+ FOXP3+ Treg에서의 증가는 혈액의 절대 세포 수/ml(도 38A 및 38B)로서 또는 총 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 %(도 38C 및 38D)로서 시간 의존적 반응을 나타낸다.
100 ㎍/kg의 총 CD4+ Treg의 수는 90,000/ml에서 810,000/ml까지(9배) 및 총 CD4+ T 세포의 4.2%에서 26%까지(6.2배) 증가하였고, 14 일에 여전히 증가하였다. 30 ㎍/kg의 총 CD4+ Treg는 62,000/ml에서 447,000/ml까지(7.2배) 및 총 CD4+ 세포의 4.5%에서 16.7%까지(3.7배) 증가하였다.
100 ㎍/kg의 기억 Treg의 수는 42,000/ml에서 536,000/ml까지(12.8배) 및 총 CD4+ T 세포의 2%에서 17.4%까지(8.7배) 증가하였다. 30 ㎍/kg의 기억 Treg는 51,000/ml에서 280,000/ml까지(5.5배) 및 총 CD4+ T 세포의 2.3%에서 10.5%까지(4.6배) 증가하였다.
100 ㎍/kg의 미접촉 Treg의 수는 35,000/ml에서 272,000/ml까지(7.8배) 및 총 CD4+ T 세포의 2%에서 8.6%까지(4.3배) 증가하였다. 30 ㎍/kg의 미접촉 Treg는 46,000/ml에서 166,000/ml까지(3.6배) 및 총 CD4+ T 세포의 2.2%에서 6.2%까지(2.8배) 증가하였다.
100 ㎍/kg의 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2를 투여한 후, CD8+FOXP3+ Treg는 희귀 세포 유형으로부터 16,000/ml에서 183,000/ml까지(11.4배) 및 총 CD8+ T 세포의 0.7%에서 7.8%까지(11.1배) 증가하였다. 30 ㎍/kg의 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2에서, 총 CD8+ Treg는 17,000/ml에서 101,000/ml까지(5.9배) 및 총 CD8+ T 세포의 0.5%에서 4.3%까지(8.6배) 증가하였다. 100 ㎍/kg 또는 30 ㎍/kg의 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 처리 후 CD4+ 기억 Teff 세포에서 처리-관련된 증가는 없고(도 39A); 사실 백분율은 그 때 CD4+ Treg에서 크게 증가하는 가능성으로 인해 4일에 감소하였다. CD4+CD25hi 기억 Teff 세포는 30 ㎍/kg의 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2로 처리 후 변하지 않았지만 4 일에 1.6배 상승하였고 7 내지 10 일에 기준선으로 돌아간다(도 39B).
DP47GS IgG-(IL-2N88D) 2 를 갖는 시노몰구스에서 pSTAT5a, CD25 및 Ki-67의 유도
이전에 기재된 바와 같이, IL-2 처리의 생체내 세포 특이성은 주요 파라미터이고, 본 발명자들은 투여 후 다양한 시간에 취해진 혈액 중에서 생체외 pSTAT5a, 세포 표면 CD25 및 세포내 Ki-67을 측정함으로써 생체내 세포 아형 활성호를 모니터할 수 있음을 입증하였다.
도 40A 및 40B에서의 결과는 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2로 처리 후 우선적인 pSTAT5a 유도 및 CD4+ 및 CD8+ Treg의 연장된 pSTAT5a 신호 반응을 나타내고; 최대 반응은 100 ㎍/kg 및 30 ㎍/kg 둘 다에 의해 1일에서 4일까지 유지되고, 7일에 기준선으로 돌아갔다. CD4+CD25hi 기억 Teff는 1일에 최대 절반 반응으로 반응하고 4일에 정상으로 돌아갔다. 시험된 모든 다른 세포 유형은 처리 후 pSTAT5a를 거의 유도하지 않거나 전혀 유도하지 않음을 나타낸다.
세포 표면 CD25에서의 증가는 IL-2 활성화의 결과이고, 생체내 활성화의 민감한 바이오마커이다. 100 ㎍/kg 및 30 ㎍/kg의 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2로 처리한 직후, CD25는 CD4+ 기억 및 미접촉 Treg 뿐만 아니라 CD8+ FOXP3+ Treg에서 우선적으로 증가하였다(도 41A 및 41B). CD4+ 기억 및 미접촉 Treg의 CD25 반응은 4일에 최고조에 달하고 7일에 기준선으로 돌아가는 반면, CD8+ FOXP3+ Treg에서 CD25 상승은 10일 내지 14일 동안 지속되었다.
야생형 IL-2 융합 단백질로의 실험에서, 본 발명은 Ki-67이 생체내에서 급증하기 시작하는 세포에 대한 민감한 세포내 마커이고 시노몰구스 원숭이에서 IL-유도된 활성화에 대한 민감한 바이오마커임을 나타내었다. 100 ㎍/kg의 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2에 대한 반응은 CD4+ 및 CD8+ Treg의 80 내지 90%가 Ki-67+가 되는 반면(도 42A), 30 ㎍/kg의 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2로 처리 후 60 내지 90%가 Ki-67+가 됨을 나타내었다(도 42B). 나타낸 바와 같이, 처리된 다른 세포 아형은 Treg에 비해 덜 반응성이었다.
신규하게 조작된 IL-2 분자를 사용하여 증가하는 Treg 수의 두번째 생체내 효과를 포획하기 위해, 모든 시노몰구스 용량을 분자량에 상관없이 직접 비교할 수 있도록 pmoles/kg으로 전환하였고, 용량 의존적 반응을 총 CD4+ T 세포의 %를 CD4+ Treg에서 최대 증가에 따라 직접 비교하였다(도 43). 야생형 융합 단백질과 비교하여 시험관내 효능의 손실에도 불구하고, DP47GS IgG-(IL-2N88D)2는 아마도 부분적으로 i.v. 및 s.c. 투여 후 전신 노출시 이의 증가로 인하여 시노몰구스 Treg에서 예상치 못한 큰 증가를 유도하였다.
생체내 IL-2 투여의 결과로서 호산구증가증
인간에서 프로류킨(등록상표)은 1 x 106 내지 4.5 x 106 IU/사람의 용량으로 매일 투여될 때 호산구증가증을 자극한다. 시노몰구스 원숭이에서, 고-용량의 프로류킨(등록상표) 또는 226 pmole/kg의 단일 용량의 DP47GS IgG-IL-2로 반복 처리한 후 상기 동물의 100%에서 호산구증가증에 유사한 증가가 나타났다(도 44). 도 44의 결과는 호산구 수가 정상적이었는지 또는 상승하였는지와 무관하게, 시험된 모든 동물(콜로니 기저선은 시험 전 동물을 위해 취하였다: n = 44 및 n = 30) 및 다양한 IL-2 처리 군(n = 5 내지 9)에 대하여 나타낸다. 프로류킨의 효과와는 두드러지게 대조적으로, DP47GS IgG-IL-2의 효과는 170 및 570 pmole/kg의 생체내 용량(각각 30 및 100 mg/kg)에서 DP47GS IgG-(IL-2N88D)2를 갖는 산호성백혈구에서 효과가 사실상 결핍되었다. DP47GS IgG-(IL-2N88D)2에 의한 전신 호산구증가증을 유도하는 이러한 결핍은 이러한 상이한 처리에 의해 유도된 Treg 확대 정도에 비추어 두드러진다(도 43과 비교함).
DP47GS IgG-IL-2에 의한 생체내 처리는 마우스에서 면역 반응을 억제한다
이전의 연구에서, 4000 IU DP47GS IgG-IL-2 용량이 생체내에서 마우스 FOXP3+ 조절 T 세포를 활성화시킴을 관찰하였으며; 이어서, 상기 용량을 사용하여 마우스에서 통상적인 T 의존적 면역 반응, 즉, 지연형 과민증(도 45) 및 IgG 항-KLH 반응(도 46)을 억제하는 그의 능력을 평가하였다.
NOD 마우스 및 C57BL/6 마우스(n=7)를 양 적혈구 세포(srbc)로 IV로 면역접종시키고, 3일 후에 한쪽 뒷발에 srbc 볼루스로 항원자극하여 지연형 과민증(DTH) 반응을 유도하였다. 항원자극 1일 후에, 마우스를 CO2로 안락사시키고 발을 절제하고 계량하였다. DTH 반응의 크기는 비-면역접종 마우스와 비교한 발 중량의 변화로 나타낸다(Δ 발중량). srbc 면역접종 3일 전 및 당일에 DP47GS IgG-IL-2를 마우스 당 4000 IU로 SC 주사하였으며, 비히클은 멸균 PBS(pH 7.2)이었다. 통계학적 유의성은 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism)에서 만-휘트니 시험으로부터 유도되었다.
양 적혈구 세포 면역접종 3일 전 및 당일에 DP47GS IgG-IL-2 투여는 NOD 마우스에서 양 혈액 세포 항원자극에 대한 이어지는 지연형 과민증 반응을 51%만큼 억제하였고(도 45A; p=0.0023), C57BL/6 마우스에서는 38%만큼 억제하였다(도 45B; p=0.002). 양성 대조군 면역억제제로서 마우스 CTLA-4-Ig는 DP47GS IgG-IL-2과 유사한 수준으로 DTH 반응을 억제하였다.
DP47GS IgG-IL-2는 또한 C57BL/6(78% 억제, p=0.0007, 도 46A) 및 NOD(67% 억제, p=0.004, 도 46B) 마우스에서 KLH-특이적 IgG 반응을 억제할 수 있었다. 상기 실험을 위해, 건강한 어린 C57BL/6 마우스(n=7 내지 10) 및 NOD 마우스(n=13 내지 14)를 100 ㎍의 인간 백신 등급 KLH로 보조제 없이 제조사(스텔라(Stellar)가 권장하는 대로 IP에 면역접종시켰다. DP47GS IgG-IL-2 처리는 면역접종 당일에 개시된, 마우스당 4000 IU를 사용한 1회(NOD) 또는 2회(C57BL/6) 약한 SC 처리로 이루어졌다. 면역접종 후 7일(NOD) 및 21일(C57BL/6)째에 혈액을 수집하고 혈청 KLH-특이적 IgG 반응을 ELISA로 측정하였다.
생체내에서 면역 반응을 억제하는 DP47GS IgG-IL-2의 능력은 저-용량 IL-2에 의해 유도된 조절 T 세포 활성화가 면역 반응의 감소를 매개하는 기능성 조절 T 세포를 생성한다는 가설을 뒷받침한다.
상기 본 발명은 이해를 명확히 하기 위해 예시 및 실시예로 다소 상세하게 기술되었지만, 이러한 예시 및 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다. 본원에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시내용들은 명확히 전체가 참고로 인용된다.
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1380 cctgcctcaa gttctacaaa gaaaacacag ctacaactgg agcatttact gctggattta 1440 cagatgattt tgaatggaat taataattac aagaatccca aactcaccag gatgctcaca 1500 tttaagtttt acatgcccaa gaaggccaca gaactgaaac atcttcagtg tctagaagaa 1560 gaactcaaac ctctggagga agtgctaaat ttagctcaaa gcaaaaactt tcacttaaga 1620 cccagggact taatcagcaa tatcaacgta atagttctgc cactaaaggg atctgaaaca 1680 acattcatgt gtgaatatgc tgatgagaca gcaaccattg tagaatttct gaacagatgg 1740 attacctttg cccaaagcat catctcaaca ctgact 1776 <210> 54 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FOXP3 forward primer <400> 54 tgtaaaacga cggccagttt tagaagttgt atgggggatg tt 42 <210> 55 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FOXP3 reverse primer <400> 55 caggaaacag ctatgaccaa aatatctacc ctcttctctt cctc 44 <210> 56 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTLA-4 forward primer <400> 56 tgtaaaacga cggccagtgg gtttggttat gaaggagtat ga 42 <210> 57 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTLA-4 reverse 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ccaaactcac caggatgctc 120 acatttaagt tttacatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa 180 gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatttagctc aaagcaaaaa ctttcactta 240 agacccaggg acttaatcag cgatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa 300 acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 360 tggattacct ttgcccaaag catcatctca acactgact 399 <210> 60 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-2 N88D <400> 60 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asp Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 61 <211> 399 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-2 N88D <400> 61 gcacctactt caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctggat 60 ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc 120 acatttaagt tttacatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa 180 gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatttagctc aaagcaaaaa ctttcactta 240 agacccaggg acttaatcag cgatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa 300 acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 360 tggattacct tttgtcaaag catcatctca acactgact 399 <210> 62 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-2 N88D C125A <400> 62 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asp Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 63 <211> 399 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-2 N88D C125A <400> 63 gcacctactt caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctggat 60 ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc 120 acatttaagt tttacatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa 180 gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatttagctc aaagcaaaaa ctttcactta 240 agacccaggg acttaatcag cgatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa 300 acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 360 tggattacct ttgcccaaag catcatctca acactgact 399 <210> 64 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-2 N88D T3A <400> 64 Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asp Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 65 <211> 399 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-2 N88D T3A <400> 65 gcacctgcct caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctggat 60 ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc 120 acatttaagt tttacatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa 180 gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatttagctc aaagcaaaaa ctttcactta 240 agacccaggg acttaatcag cgatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa 300 acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 360 tggattacct tttgtcaaag catcatctca acactgact 399 <210> 66 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> (G4S)3 linker <400> 66 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15

Claims (27)

  1. (i) 항원에 특이적으로 결합할 수 없는 면역글로불린 분자, 및 (ii) 아미노산 치환을 포함하는 2개의 돌연변이체 IL-2 분자를 포함하는 융합 단백질로서,
    상기 아미노산 치환은 인간 IL-2(서열번호 1)의 N88D이고,
    상기 IL-2분자가 천연적으로 발생하는 천연 IL-2에 비해 IL-2 수용체에 결합하는 IL-2 분자의 결합 친화도(binding affinity)를 변경하지 않는 아미노산 치환을 추가로 포함하는, 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 IL-2 분자가 인간 IL-2의 잔기 125에 상응하는 위치에 아미노산 돌연변이를 포함하는 융합 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 아미노산 치환이 C125A인 융합 단백질.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-2 분자가 인간 IL-2(서열번호 1)의 잔기 3에 상응하는 위치에서 IL-2의 O-글리코실화 부위를 제거하는 아미노산 치환을 추가로 포함하는 융합 단백질.
  5. 제4항에 있어서, 인간 IL-2의 잔기 3에 상응하는 위치에서 IL-2의 O-글리코실화 부위를 제거하는 상기 아미노산 치환이 T3A, T3G, T3Q, T3E, T3N, T3D, T3R, T3K 및 T3P로 이루어진 군으로부터 선택되는 융합 단백질.
  6. 제5항에 있어서, 인간 IL-2(서열번호 1)의 잔기 3에 상응하는 위치에서 IL-2의 O-글리코실화 부위를 제거하는 아미노산 치환이 T3A인 융합 단백질.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돌연변이체 IL-2 분자가 인간 IL-2 분자인 융합 단백질.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-2 분자는 서열번호 58, 서열번호 60, 서열번호 62 및 서열번호 64로 이루어진 군에서 선택되는 서열, 특히 서열번호 58인 서열을 포함하는 융합 단백질.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-2 분자가 각각 그의 N-말단 아미노산에서, 상기 면역글로불린 분자의 하나의 면역글로불린 중쇄 중 C-말단 아미노산에 융합된 융합 단백질.
  10. 제10항에 있어서, 상기 IL-2 분자가 각각 그의 N-말단 아미노산에서, 펩티드 연결기(peptide linker)를 통해, 상기 면역글로불린 분자의 하나의 면역글로불린 중쇄 중 C-말단 아미노산에 융합된 융합 단백질.
  11. 제항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-2 분자가 펩티드 연결기를 통해 상기 면역글로불린 분자에 각각 융합되는 융합 단백질.
  12. 제11항에 있어서, 상기 펩티드 연결기가 10개 이상, 특히 15개 이상의 아미노산을 포함하는 융합 단백질.
  13. 제12항에 있어서, 상기 펩티드 연결기가 아미노산 서열 (G4S)3(서열번호 66)을 포함하는 융합 단백질.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  15. 제14항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로서, 특히 발현 벡터인 벡터.
  16. 제14항의 폴리뉴클레오티드 또는 제15항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  17. (i) 제16항의 숙주 세포를 융합 단백질의 발현에 적합한 조건하에서 배양하는 단계; 및
    (ii) 융합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 아미노산 치환을 포함하는 2개의 돌연변이체 IL-2 분자, 및 면역글로불린 분자를 포함하는 융합 단백질의 제조 방법으로서,
    상기 아미노산 치환은 인간 IL-2(서열번호 1)의 N88D이고,
    상기 IL-2 분자가 천연적으로 발생하는 천연 IL-2에 비해 IL-2 수용체에 결합하는 상기 IL-2 분자의 결합 친화도(binding affinity)를 변경하지 않는 아미노산 치환을 추가로 포함하는, 방법.
  18. 제17항의 방법에 의하여 제조된 융합 단백질.
  19. 제1항 내지 제13항 및 제18항 중 어느 한 항의 융합 단백질 및 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 약학 조성물.
  20. 약제로서 사용하기 위한, 제1항 내지 제13항 및 제18항 중 어느 한 항의 융합 단백질 또는 제19항의 약학 조성물.
  21. 자가면역 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 제1항 내지 제13항 및 제18항 중 어느 한 항의 융합 단백질 또는 제19항의 약학 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 상기 자가면역질환이 제1형 당뇨병, 전신 홍반성 루푸스, 염증성 장 질환, 크론병, 궤양성 대장염 및 다발성 경화증으로 이루어진 군에서 선택되는 융합 단백질 또는 약학 조성물.
  23. 이식 거부 또는 이식편-대-숙주 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 제1항 내지 제13항 및 제18항 중 어느 한 항의 융합 단백질 또는 제19항의 약학 조성물.
  24. 시험관내 조절 T 세포의 선택적 활성화에 사용하기 위한 제1항 내지 제13항 및 제18항 중 어느 한 항의 융합 단백질.
  25. 제24항에 있어서, 상기 활성화가 조절 T 세포의 증식 유도 및/또는 조절 T 세포의 IL-2 수용체 신호전달의 유도를 포함하는 융합 단백질.
  26. 조절 T 세포를 제1항 내지 제13항 및 제18항 중 어느 한 항의 융합 단백질과 접촉시키는 단계를 포함하는, 시험관내 조절 T 세포의 선택적 활성화 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 활성화가 조절 T 세포의 증식의 유도 및/또는 조절 T 세포에서 IL-2 수용체 신호전달의 유도를 포함하는, 시험관내 조절 T 세포의 선택적 활성화 방법.
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