UA120847C2 - Злитий білок інтерлейкіну-2 і його застосування - Google Patents

Злитий білок інтерлейкіну-2 і його застосування Download PDF

Info

Publication number
UA120847C2
UA120847C2 UAA201609263A UAA201609263A UA120847C2 UA 120847 C2 UA120847 C2 UA 120847C2 UA A201609263 A UAA201609263 A UA A201609263A UA A201609263 A UAA201609263 A UA A201609263A UA 120847 C2 UA120847 C2 UA 120847C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
cells
fusion protein
specified
amino acid
receptor
Prior art date
Application number
UAA201609263A
Other languages
English (en)
Inventor
Крістіан Кляйн
Кристиан КЛЯЙН
Пабло Умана
Еккехард Мьосснер
Эккехард Мёсснер
Ральф Хоссе
Ральф Хоссэ
Лоренс Бернард Петерсон
Лінда Вікер
Линда Викер
Original Assignee
Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг filed Critical Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг
Publication of UA120847C2 publication Critical patent/UA120847C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2013—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C12N5/0637—Immunosuppressive T lymphocytes, e.g. regulatory T cells or Treg
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Винахід стосується злитого білка, що містить (І) молекулу імуноглобуліну, яка не має здатності специфічно зв'язуватися з антигеном, і (ІІ) дві мутантні молекули інтерлейкіну-2 (IL-2), які містять амінокислотну мутацію, яка знижує афінність мутантної молекули IL-2 до рецептора 1L-2, який має проміжну афінність, у порівнянні з молекулою IL-2 дикого типу, полінуклеотиду, що його кодує, вектора, клітини-зазяїна, способу одержання, фармацевтичної композиції та способу вибіркової активації регуляторних Т-клітин in vitro або in vivo.

Description

Галузь техніки, до якої відноситься винахід
Даний винахід в цілому відноситься до злитих білків імуноглобулінів і інтерлейкіну-2 (ІІ -2).
Більш конкретно, винахід відноситься до злитих білків імуноглобулінів і мутантного ІІ--2, які мають покращенні властивості з точки зору застосування як терапевтичних засобів, наприклад, при лікуванні аутоїмунних захворювань та імуноопосередкованих запальних захворювань.
Окрім того, даний винахід відноситься до полінуклеотидів, що кодують зазначені злиті білки, і до векторів і клітин-хазяїв, що містять зазначені полінуклеотиди. Винахід відноситься також до способів одержання злитих білків, що запропоновані у винаході, і до способів їх застосування для лікування захворювання.
Передумови створення винаходу
Регуляторні Т-клітини (Тгед-клітини) представляють собою специфічні субпопуляції Т- лімфоцитів, які мають вирішальне значення для підтримання аутотолерантності. Ці бра-бор25г"- клітини, що мають супресорну функцію, можуть відрізнятися від ефекторних Т- клітин внутрішньоклітинною експресією фактора транскрипції ЕОХРЗ, а також інших клітинних маркерів, таких як СО1279, СТІ А-4-, АР, СО39:, РО-1", САКЕР тощо. ГОХРЗ має вирішальне значення для диференціювання й функції Тгед, і дефіцит і мутації гена ЕОХРЗ, як це має місце у 5сийу- мишей (миші, гемізиготні за Х-зчепленою мутацією, яка призводить до лімфопроліферативних захворювань), і у пацієнтів зі зчепленим з Х-хромосомою синдромом імунної дисрегуляції, поліендокринопатії, ентеропатії (ІРЕХ), приводять до порушення аутотолерантності й розвитку аутоїмунних захворювань в результаті дефіциту або відсутності функції Тгед.
З дефіцитом Тгед-клітин або функції Тгед корелюють аутоімунні відповіді, які проявляються у вигляді діабету типу 1, системного червоного вовчака (ЗІ Е), розсіяного склерозу й багатьох інших захворювань. Дані, одержані на тваринних моделях, підтвердили гіпотезу про те, що виникненню зазначених аутоїмунних відповідей сприяє порушення здатності Тгед-клітин контролювати деструктивну аутоїмунну відповідь, в значному ступені внаслідок впливів аутореактивних ефекторних СО4--Т-клітин пам'яті. Діабет типу 1 представляє собою аутоіїмунне захворювання, яке виникає після деструкції основної частини р-клітин, які продукують інсулін в підшлунковій залозі. Частота виникнення діабету 1 типу складає «0,3 95 у популяції жителів
Зо США і його зустрічальність продовжує зростати в США, Європі й, зокрема, в Скандинавії (приблизно 1 95), і очікується, що протягом наступних 20 років число випадків захворювання збільшиться вдвічі.
Цитокін 1-2 грає основну роль в активації й функції як Тгед-клітин, так і ефекторних Т-клітин (Тет). Дефіцит вироблення ІІ -2 або зниження чутливості до нього приводить головним чином до зниження функції Тгед і підвищенню імовірності проявлення аутоімунітету. Оскільки Тгед-клітини конститутивно експресують більш високі рівні високоафінного рецептора ІІ--2 у порівнянні з Тей- клітинами, то низькі дози І--2 підтримують головним чином Тгед-, а не Тей-клітини.
З урахуванням того, що ІІ -2 впливає, насамперед, на активацію Ттгед іп міїго й іп ммо, можна припускати, що терапія на основі застосовного в низьких дозах 1-2, який характеризується тривалим часом життя, повинна з високою ймовірністю мати сприятливий вплив на аутоімунні захворювання. В кінці 2013 року було розпочате подвійне сліпе плацебо-контрольоване клінічне випробування ІІ--2 (РгоЇІешкіпе, рекомбінантний людський І1І--2) на 200 пацієнтах з діабетом типу 1. У сучасних клінічних дослідженнях продемонстровано, що щоденне застосування пролейкіну в низьких дозах полегшувало деякі ознаки й симптоми хронічної реакції ""трансплантат-проти- хазяїна" (СУМНО) й індукованого вірусом гепатиту С васкуліту (Когеїйй та ін., Мем Епої У Мей 365, 2011, сс. 2055-2066, Заадоцп та ін., Мем/ Епді 9 Мей 365, 2011, сс. 2067-2077). В обох дослідженнях встановлено, що низькі дози РгоїеиКіп? індукували Тгтед і підвищували співвідношення Тгед:Тей. Однак фармакокінетичні (ФК) властивості РгоїеиКіп? виявились незадовільними, що не дозволяло оптимальним чином підтримувати низькі постійні рівні І -2 в організмі людини. Інші вивчені в клінічних дослідженнях методи передбачали розмноження
Тгед-клітин конкретного індивідуума ех мімо з наступною реінфузією, але цей підхід виявився не дуже вдалим через проблеми з контролем якості.
Таким чином, новий терапевтичний підхід, який відновлює опосередковану природними регуляторними Т-клітинами (Тгед) домінанту імунну толерантність і суттєво мінімізувати будь-які стимулювальні впливи на ефекторні СО4--Т-клітини пам'яті, може в значному ступені підвищувати можливість лікування пацієнтів, що страждають на аутоімунні захворювання, такими як діабет типу 1, розсіяний склероз, системний червоний вовчак, хвороба Крона, а також іншими аутоїмунними захворюваннями і прозапальними захворюваннями, які мають імунну основу, такими як хронічна реакція "трансплантат-проти-хазяїна", астма, легеневий фіброз, 60 хронічне обструктивне захворювання легенів, серцево-судинними хворобами, такими як атеросклероз і гострий коронарний синдром, і реакція відторгнення трансплантату, як солідного органу, так і кісткового мозку.
У УМО 2009/135615 описано застосування вже відомого мутеїну 1-2 (1-2 М888, ВАУ50-4798, описаного в УМО 1999/60128) для терапії або профілактики аутоїмунного захворювання.
Встановлено, що мутеїн ІІ -2 має більш високу активність відносно Тгед-клітин у порівнянні з ІІ -2 дикого типу, при цьому він має слабкий вплив на СО8--Т-клітини і МК-клітини. Не описані злиті білки, які містять мутеїн ЇЇ -2.
У МО 2010/85495 описані варіанти 1І-2, які вибірково стимулюють активність Тгед-клітин у порівнянні з нерегуляторними Т-клітинами, призначеними для лікування запальних порушень.
Описані варіанти 1-2 містять комбінацію восьми або більшої кількості амінокислотних замін, які впливають на зв'язування з різними субодиницями рецептора І1І--2.
Злиті білки, які містять 1-2, відповідно до даного винаходу активують переважно людські й нелюдські Тгед-клітини, зсуваючи баланс у бік більш високого співвідношення Тгед:Теї, і знижують аутоіїмунну відповідь. Вони мають тривалий період життя, що дозволяє застосовувати зручні схеми дозування, і у них відсутні ефекторні функції, що знижує потенційні побічні дії й негативний вплив на ефективність.
Коротке викладення суті винаходу
Одним з об'єктів винаходу є злитий білок, що містить (І) молекулу імуноглобуліну, і (ІІ) дві мутантні молекули інтерлейкіну-2 (ІІ--2), які містять амінокислотну мутацію, яка знижує афінність мутантної молекули 1-2 до Ес-рецептора, що має проміжну афінність у порівнянні з молекулою
ІЇ-2 дикого типу.
В одному з варіантів здійснення винаходу зазначена молекула імуноглобуліну представляє собою молекулу імуноглобуліну Ідс-класу, насамперед молекулу імуноглобуліну Ідс:-підкласу.
В одному з варіантів здійснення винаходу зазначена молекула імуноглобуліну представляє собою молекулу людського імуноглобуліну. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначена молекула імуноглобуліну має здатність специфічно зв'язуватися з антигеном. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначена молекула імуноглобуліну представляє собою моноклональне антитіло. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначена молекула імуноглобуліну не має здатність до специфічного зв'язування з антигеном. В одному з варіантів
Зо здійснення винаходу зазначена молекула імуноглобуліну містить послідовність варіабельної області важкого ланцюга, основою якого є послідовність людської зародкової лінії Мп3-23. В конкретному варіанті здійснення винаходу зазначена молекула імуноглобуліну містить послідовність варіабельної області важкого ланцюга 5ЕО ІО МО: 9. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначена молекула імуноглобуліну містить послідовність варіабельної області легкого ланцюга, основою якого є послідовність людської зародкової лінії МК3-20. В конкретному варіанті здійснення винаходу зазначена молекула імуноглобуліну містить послідовність варіабельної області легкого ланцюга ЗЕО ІО МО: 11. В ще більш конкретному варіанті здійснення винаходу зазначена молекула імуноглобуліну містить послідовність варіабельної області важкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО: 9 їі послідовність варіабельної області легкого ланцюга 5ЕО ІО МО: 11. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначена молекула імуноглобуліну не має здатності до специфічного зв'язування з антигеном і містить послідовність варіабельної області важкого ланцюга, основою якого є послідовність людської зародкової лінії МА3-23, і містить послідовність варіабельної області легкого ланцюга, основою якого є послідовність людської зародкової лінії МКЗ3-20.
В одному з варіантів здійснення винаходу зазначена молекула імуноглобуліну містить модифікацію, яка знижує афінність зв'язування молекули імуноглобуліну з Ес-рецептором у порівнянні з відповідною молекулою імуноглобуліну без зазначеної модифікації. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначений Ес-рецептор представляє собою Есу-рецептор, насамперед, людський Есу-рецептор. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначений Ес- рецептор представляє собою активувальний Ес-рецептор. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначений Ес-рецептор вибирають з групи, що містить ЕсукШа (СО16ба), Есукі (СО64), ЕсукКІа (С032) і ЕсоКІ (СО89). В конкретному варіанті здійснення винаходу зазначений
Ес-рецептор представляє собою ЕсугкІШа, насамперед, людський Есук Ша. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначена модифікація знижує ефекторну функцію молекули імуноглобуліну. В конкретному варіанті здійснення винаходу зазначена ефекторна функція представляє собою антитіло-зумовлену клітиннозалежну цитотоксичність (АОСС). В одному з варіантів здійснення винаходу зазначена модифікація знаходиться в Ес-області, насамперед, в
СНгег-області зазначеної молекули імуноглобуліну. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначена молекула імуноглобуліну містить амінокислотну заміну в положенні 329 (ЕБО- бо нумерація) важких ланцюгів імуноглобуліну. В конкретному варіанті здійснення винаходу зазначена амінокислотна заміна представляє собою РЗ3290. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначена молекула імуноглобуліну містить амінокислотні заміни в положеннях 234 і 235 (Би-нумерація) важких ланцюгів імуноглобуліну. В конкретному варіанті здійснення винаходу зазначені амінокислотні заміни представляють собою І 234А і І 235А (ГАГА). В одному з варіантів здійснення винаходу зазначена молекула імуноглобуліну містить амінокислотні заміни в положеннях 234, 235 і 329 (ЕО-нумерація) важких ланцюгів імуноглобуліну. В конкретному варіанті здійснення винаходу зазначена молекула імуноглобуліну містить амінокислотні заміни І 234А, І 235А і РЗ3290 (ЕО-нумерація) у важких ланцюгах імуноглобуліну.
В одному з варіантів здійснення винаходу зазначені мутантні молекули 1/-2 містять амінокислотну мутацію в положенні, що відповідає залишку 88 людського 1-2 (ЗЕО ІО МО: 1). В одному з варіантів здійснення винаходу зазначена амінокислотна мутація представляє собою амінокислотну заміну. В конкретному варіанті здійснення винаходу зазначена амінокислотна заміна представляє собою М880. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначені молекули
І -2 додатково містять амінокислотну мутацію, яка не змінює афінність зв'язування зазначених молекул 1І--2 з рецептором 1-2 у порівнянні з наявними в природних умовах нативним 1І--2. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначені молекули 1-2 містять амінокислотну мутацію в положенні, яке відповідає залишку 125 людського ІЇ/-2. В більш конкретному варіанті здійснення винаходу зазначена амінокислотна мутація представляє собою амінокислотну заміну С125А. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначена мутантна молекула ІІ -2 додатково містить амінокислотну мутацію, яка елімінує сайт О-глікозилювання 1-2 в положенні, що відповідає залишку З людського ІІ -2. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначена амінокислотна мутація, яка елімінує сайт О-глікозилювання ІЇ/-2 в положенні, що відповідає залишку З людського ІІ -2 представляє собою амінокислотну заміну, вибрану з групи ТЗА, ТЗО,
ТЗО, ТЗЕ, ТЗМ, ТЗ30, ТЗЕ, ТЗК їі ТЗР. В конкретному варіанті здійснення винаходу амінокислотна мутація, яка елімінує сайт О-глікозилювання ІЇ/-2 в положенні, що відповідає залишку З людського 1-2, представляє собою ТЗА. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначені мутантні молекули 1-2 представляють собою молекули людського 1-2. В конкретному варіанті здійснення винаходу зазначені мутантні молекули 1-2 містять послідовність, вибрану з групи
ЗЕО ІЮ МО: 58, 5ЕО ІЮ МО: 60, 5ЕО ІЮО МО: 62 і БЕО ІО МО: 64, насамперед послідовність ЗЕО
Зо ІО МО: 58. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначені мутантні молекули 1-2 мають послідовність, вибрану з групи ЗЕО ІЮО МО: 58, 5ЕО ІО МО: 60, 5ЕО ІЮО МО: 62 і 5ЕО ІЮО МО: 64, насамперед послідовність 5ЕО ІЮ МО: 58. В одному з варіантів здійснення винаходу кожна із зазначених мутантних молекул І/-2 злита на своїй М-кінцевій амінокислоті з С-кінцневою амінокислотою одного з імуноглобулінових важких ланцюгів зазначеної молекули імуноглобуліну, необов'язково через пептидний лінкер. В одному з варіантів здійснення винаходу кожна із зазначених мутантних молекул І/-2 злита із зазначеною молекулою імуноглобуліну через пептидний лінкер. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначений пептидний лінкер містить щонайменше 10, насамперед щонайменше 15 амінокислот. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначений пептидний лінкер містить амінокислотну послідовність (45)з (ЗЕО І МО: 66).
В конкретному варіанті здійснення винаходу, зазначений злитий білок містить поліпептидні послідовності БЕО ІЮ МО: 19 ії 560 ІЮО МО: 50. В конкретному варіанті здійснення винаходу зазначений злитий білок містить легкий ланцюг імуноглобуліну, що має 5ЕО ІЮ МО: 19, і злитий поліпептид: важкий ланцюг імуноглобуліну-ІЇ-2, що має 5ЗЕО ІЮ МО: 50. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначений злитий білок практично складається з молекули імуноглобуліну, двох мутантних молекул інтерлейкіну-2 (1-2), що містять амінокислотну мутацію, яка знижує афінність мутантної молекули 1-2 до рецептора 1-2, який має проміжну афінність у порівнянні з молекулою 1І/-2 дикого типу, і необов'язково один або декілька пептидних лінкерів. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначений злитий білок практично складається з двох легких ланцюгів імуноглобуліну, що мають ЗЕО ІЮО МО: 19, і двох злитих поліпептидів: важкий ланцюг імуноглобуліну-ІЇ -2, що мають 5ЕО ІЮ МО: 50.
В одному з варіантів здійснення винаходу зазначений злитий білок вибірково активує регуляторні Т-клітини. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначений злитий білок вибірково активує регуляторні Т-клітини у порівнянні з ефекторними Т-клітинами, насамперед з канонічними СО4--Т-клітинами і СО8-:-Т-клітинами. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначений злитий білок вибірково активує регуляторні Т-клітини у порівнянні з канонічними браз-Т-клітинами пам'яті. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначений злитий білок активує регуляторні Т-клітини щонайменше в 10 разів, щонайменше в 100 разів або щонайменше в 1000 разів в більшому ступені, ніж канонічні СЮО4--Т-клітини пам'яті. В одному з бо варіантів здійснення винаходу зазначену активацію визначають шляхом вимірювання рівнів фосфорилювання внутрішньоклітинного ЗТАТ, насамперед ЗТАТ5. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначене вимірювання рівнів фосфорилювання внутрішньоклітинного
ЗТАТ здійснюють за допомогою аналізу методом проточної цитометрії.
У винаході також запропонований полінуклеотид, що кодує злитий білок, відповідно до винаходу. Окрім того, запропонований вектор, насамперед експресійний вектор, що містить полінуклеотид, відповідно до винаходу. Наступним об'єктом винаходу є клітина-хазяїн, що містить полінуклеотид або вектор, відповідно до винаходу. У винаході також запропонований спосіб одержання злитого білка згідно з винаходом, який полягає в тому, що здійснюють стадії, на яких (І) культивують клітину-хазяїна, запропоновану у винаході, в умовах, придатних для експресії злитого білка, і (ІЇ) виділяють злитий білок. Запропонований також злитий білок, що містить (І) молекулу імуноглобуліну і (І) дві молекули інтерлейкіну-2 (І/-2), які містять амінокислотну мутацію, яка знижує афінність мутантної молекули 1-2 до рецептора 1І-2, який має проміжну афінність у порівнянні з молекулою ІЇ/-2 дикого типу, одержаний зазначеним способом.
Одним з об'єктів винаходу є фармацевтична композиція, що містить злитий білок, відповідно до винаходу, і фармацевтично прийнятний носій. Винахід відноситься також до злитого білка або фармацевтичної композиції, запропонованого/запропонованої у винаході, для застосування як лікарського засобу, і до застосування для лікування або профілактики аутоімунного захворювання, зокрема, діабету типу 1, розсіяного склерозу (М5), системного червоного вовчака (ЗЕ), запального захворювання кишечника, хвороби Крона або неспецифічного виразкового коліту, більш конкретно діабету типу 1 або реакції "трансплантат-проти-хазяїна" або відторгнення трансплантату. Також запропоновано застосування злитого білка, згідно з винаходом, для приготування лікарського засобу, призначеного для лікування захворювання в індивідуума, який цього потребує, і спосіб лікування захворювання в індивідуума, який полягає в тому, що зазначеному індивідууму в терапевтично ефективній кількості вводять композицію, яка містить злитий білок, відповідно до винаходу, в фармацевтично прийнятній формі. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначене захворювання представляє собою аутоімунне захворювання. В більш конкретному варіанті здійснення винаходу зазначене аутоімунне захворювання представляє собою діабет типу 1, розсіяний склероз (М5), системний червоний
Зо вовчак (5ІЕ), запальне захворювання кишечника, хворобу Крона або неспецифічний виразковий коліт. В ще більш конкретному варіанті здійснення винаходу зазначене аутоімунне захворювання представляє собою діабет типу 1. В іншому варіанті здійснення винаходу зазначене захворювання представляє собою відторгнення трансплантату або реакцію "трансплантат-проти-хазяїна". В одному з варіантів здійснення винаходу зазначений індивідуум представляє собою ссавця, насамперед людину.
Запропонований також злитий білок, відповідно до винаходу, призначений для застосування для вибіркової активації регуляторних Т-клітин іп мйго або іп мімо. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначена активація охоплює індукцію проліферації регуляторних Т-клітин і/або індукцію передачі сигналів через ІІ-2-рецептор, насамперед фосфорилювання 5ТАТЬ, в регуляторних Т-клітинах. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначене застосування представляє собою застосування іп міїго, і зазначений злитий білок застосовують в концентрації приблизно 10 нг/мл або менше, насамперед приблизно 1 нг/мл або менше. В іншому варіанті здійснення винаходу зазначене застосування представляє собою застосування іп мімо, і зазначений злитий білок застосовують в дозі приблизно 100 мкг/кг ваги тіла або менше, насамперед приблизно 25 мкг/кг ваги тіла або менше, більш конкретно приблизно 10 мкг/кг ваги тіла або менше.
У винаході запропонований також спосіб вибіркової активації регуляторних Т-клітин іп міго або іп мімо, який полягає в тому, що приводять у контакт зазначені регуляторні Т-клітини зі злитим білком, запропонованим у винаході. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначена активація охоплює індукцію проліферації регуляторних Т-клітин і/або індукцію передачі сигналів через ІЇ-2-рецептор, насамперед фосфорилювання 5ТАТЬ, в регуляторних Т- клітинах. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначений спосіб представляє собою спосіб іп міго, і зазначений злитий білок застосовують в концентрації приблизно 10 нг/мл або менше, насамперед приблизно 1 нг/мл або менше. В іншому варіанті здійснення винаходу зазначений спосіб представляє собою спосіб іп мімо, і зазначений злитий білок застосовують в дозі приблизно 100 мкг/кг ваги тіла або менше, насамперед приблизно 25 мкг/кг ваги тіла або менше, більш конкретно приблизно 10 мкг/кг ваги тіла або менше.
Короткий опис креслень
На кресленнях показано: 60 на фіг. 1 - результати очистки злитого білка ОР47С5 Ід(с-ІІ -2 (див. зЗЕО ІЮ МО: 13, 15, 19).
(А) Профіль елюції, одержаний на стадії афінної хроматографії на білку А. (Б) Профіль елюції, одержаний на стадії гель-фільтрації. Вихід 4 мг/л. (В) Результати аналітичного капілярного електрофорезу в присутності ДСН (система Саїрег) кінцевого продукту. Були виявлені наступні смуги: невідновлювальні умови: 7,5 96 площі відповідає 111 кДа, 92,5 95 площі відповідає 174 кДа; відновлювальні умови: 23,6 9о площі відповідає 29 кДа, 23,5 96 площі відповідає 67 кДа, 52,9 96 площі відповідає 82 кДа. Продукт містив приблизно 7,595 "половинного Ід". (Г)
Результати аналітичної гель-фільтрації кінцевого продукту на колонці Т5Кає! (3000 5УУ ХІ. (вміст мономерів: 91 Об); на фіг. 2 - результати очистки злитого білка ОР47Са5 Іда-(ІІ -2)2 (див. БЕО ІЮО МО: 17, 19). (А)
Профіль елюції, одержаний на стадії афінної хроматографії на білку А. (Б) Профіль елюції, одержаний на стадії гель-фільтрації. Вихід 13 мг/л. (В) Результати аналітичного капілярного електрофорезу в присутності ДСН (система Саїрег) кінцевого продукту. Були виявлені наступні смуги: невідновлювальні умови: 2,3 956 площі відповідає 172,5 кДа, 97,7 906 площі відповідає 185 кДа; відновлювальні умови: 18,3 95 площі відповідає 27,3 кДа, 0,6 95 площі відповідає 29,2 кДа, 81,1 95 площі відповідає 78,3 кДа. (Г) Результати аналітичної гель-фільтрації кінцевого продукту на колонці Супердекс 200 (вміст мономерів: 100 Ор); на фіг. З - результати очистки злитого білка ОР47С5 Іда-ІІ -2 М880 (див. ЗЕО ІЮ МО: 15, 19, 48). (А) Профіль елюції, одержаний на стадії афінної хроматографії на білку А. (Б) Профіль елюції, одержаний на стадії гель-фільтрації. Вихід 23,7 мг/л. Зібрані фракції виділені рамкою. (В) Результати аналітичного капілярного електрофорезу в присутності ДСН (система Саїрег) кінцевого продукту. Були виявлені наступні основні смуги: невідновлювальні умови: 100 9о площі відповідає 167,0 кДа; відновлювальні умови: 31,5 96 площі відповідає 28,6 кДа, 31,7 95 площі відповідає 63,5 кДа, 35,3 95 площі відповідає 77,5 кДа. (Г) Результати аналітичної гель- фільтрації кінцевого продукту на колонці Т5Кадеї 53000 5МУ ХІ. (вміст мономерів 97,3 Об); на фіг. 4 - результати очистки злитого білка ОРА7О5 Іда-(І-2 М880)2 (див. ЗЕО ІЮО МО: 19 і 50). (А) Профіль елюції, одержаний на стадії афінної хроматографії на білку А. (Б) Профіль елюції, одержаний на стадії гель-фільтрації. Вихід 32,9 мг/л. Зібрані фракції виділені рамкою. (В) Результати аналітичного капілярного електрофорезу в присутності ДСН (система Саїірег) кінцевого продукту. Були виявлені наступні основні смуги: невідновлювальні умови: 20,7 Фо площі відповідає 180,4 кДа, 78,0 956 площі відповідає 184,0 кДа; відновлювальні умови: 16,2 95 площі відповідає 27,3 кДа, 82,7 95 площі відповідає 76,0 кДа. (Г) Результати аналітичної гель- фільтрації кінцевого продукту на колонці Т5Кадеї! 53000 5МУ ХГ. (вміст мономерів 98,3 Об); на фіг. 5 - результати очистки злитого білка ОР4А7С5 Іда-(І/-2 Е9БА)» (див. 5ЕО ІЮО МО: 19 і 52). (А) Профіль елюції, одержаний на стадії афінної хроматографії на білку А. (Б) Профіль елюції, одержаний на стадії гель-фільтрації. Вихід 8,0 мг/л. Зібрані фракції виділені рамкою. (В)
Результати аналітичного капілярного електрофорезу в присутності ДСН (система Саїрег) кінцевого продукту. Були виявлені наступні основні смуги: невідновлювальні умови: 10,3 Фо площі відповідає 166,0 кДа, 61,4 95 площі відповідає 175,5 кДа, 28,2 95 площі відповідає 181,2 кДа; відновлювальні умови: 16,0 95 площі відповідає 26,1 кДа, 83,1 95 площі відповідає 75,0 кДа. (Г) Результати аналітичної гель-фільтрації кінцевого продукту на колонці Т5Кає! (3000 БУМ ХІ. (вміст мономерів 100 9); на фіг. 6 - дані про експресію СО25 (1 -2КА) і СО122 (1-28) на субпопуляціях СЮО4--Тгед, субпопуляціях МК-клітин і МКТ-клітинах. Для визначення субпопуляцій СО4--Тгед, МКТ-клітин і
МК-клітин застосовували маркери клітинної поверхні. Для оптимізації забарвлювання СО25 і
СО0122 не здійснювали внутрішньоклітинне ЕГОХРЗ-забарвлювання. (А, Б) Три популяції регуляторних СО4--Т-клітин (Тгед): наївні (СО45КА:, 0025; пунктирна лінія), клітини пам'яті (С045ВА, СО25:; суцільна лінія) і активовані (СО45КА", СО25"; штрихова лінія). (В, 7) МКтТ (пунктирна лінія), СО5ббепот МК-клітини (штрихова лінія), СОБбіпіегтеаіає МК-клітини (суцільна лінія). Сірим кольором позначені результати для контролю ізотипу (ІС); на фіг. 7 - дані про експресію СО25 (ІІ -2КА) і СО122 (1-28) на СО4-- і СО8:-субпопуляціях канонічних Т-клітин. Застосовували маркери клітинної поверхні для визначення наївних (С045ВА"; пунктирна лінія) і канонічних СО4--Т-клітин пам'яті (СО45КА"; суцільна лінія) (А, Б), канонічних СО8--Т-клітин пам'яті (СО45КА"; суцільна лінія) і СО45КА:-С0О8-Т-клітин (комбінація субпопуляцій наївних клітин і ТЕМКА; ТЕМКА означає ефекторні клітини пам'яті, переспрямовані на експресію СО45КА; пунктирна лінія) (В, Г). Сірим кольором позначені результати для контроля ізотипу (ІС); на фіг. 8 - дані про індукцію раТАТ5а в субпопуляціях людських клітин периферійної крові у відповідь на обробку ОР47О5 Ідс-ІЇ-2. Для трьох різних донорів (С4-Сб) оцінювали в різні моменти часу впливу різних доз ОРА7О5 Ід0-ІЇ-2 на індукцію фосфорилювання 5ТАТза. бо Представлені результати для наступних субпопуляцій СО4--Тгед: активовані, клітини пам'яті і наївні Тгед; канонічні ефекторні СО4--Т-клітини пам'яті; СОБ5бепо"МК-клітини; ефекторні СЮО89-Т- клітини пам'яті; наївні ефекторні СО4--Т-клітини; МК-клітини; МКТ-клітини; і наївні ефекторні
СО8-Т-клітини - СО45ВА"-клітини пам'яті; на фіг. 9 - дані про індукцію раТАТ5а в субпопуляціях людських клітин периферійної крові в відповідь на обробку ОР4А7О5 ІдО-(ІЇ -2)2. Для п'яти різних донорів (М1, М2, С4-Сб6) оцінювали в різні моменти часу впливу різних доз імунокон'югата ОР4755 Ід0-(І/-2)2 на індукцію фосфорилювання 5ТАТ5а. Представлені результати для наступних субпопуляцій СО4--Тгтєд: активовані, клітини пам'яті і наївні Тгед; канонічні ефекторні СО4--Т-клітини пам'яті; СОБбегот.
МК-клітини; ефекторні СО8--Т-клітини пам'яті; наївні ефекторні СО4--Т-клітини;. МК-клітини;
МКТ-клітини; і наївні ефекторні СО8--Т-клітини - СО45КА"-клітини пам'яті; на фіг. 10 - дані про індукцію реТАтТ5а в субпопуляціях людських клітин периферійної крові: порівняння ОРА4А7СО5 Ід-ІІ -2 і ОР47О5 ІдО-(ІІ -2)». Результати, одержані для кожної субпопуляції клітин, стандартизували відносно максимального виявленого впливу на кожну субпопуляцію і приблизні величини ЕСзо для Тгед представлені в таблиці 2. (А) стандартизовані результати для ОРА7О5 ІдДО-ІЇІ -2, (Б) стандартизовані результати для ОРА7О5 ІДО-(ІІ -2)2; на фіг. 11 - деталізована порівняльна оцінка чутливості до ОР47О5 Ідс-ІІ -2 і ОРА7О5 Ідб- (І/-2)2 субпопуляції Тгед трьох донорів. На графіках представлені середні значення - СКО величин МРЇ (середня інтенсивність флуоресценції) реТАТ5а для трьох донорів. (А) загальна кількість СОЗ3», СО4, ГохР3:-Тгед, (Б) активовані Тгед, (В) Тгед пам'яті, (Г) наївні Тгед; на фіг. 12 - дані про індукцію роТАТ5а в субпопуляціях людських клітин периферійної крові в відповідь на обробку ОР4А7О5 ІдС-(ІЇ-2 Е95А)». Для трьох різних донорів (С4-Сб) оцінювали в різні моменти часу впливу різних доз ОР475 ІдО-(1Ї-2 Е95А)2 на індукцію фосфорилювання
ЗТАТ5а. Представлені результати для наступних субпопуляцій СО4--Тгед: активовані, клітини пам'яті і наївні Тгед; канонічні ефекторні СО4--Т-клітини пам'яті; СО5бепот-МК-клітини; ефекторні
СО8:-Т-клітини пам'яті; наївні ефекторні СО4--Т-клітини; МК-клітини; МКТ-клітини; і наївні ефекторні СО8-С045ВА--Т-клітини; на фіг. 13 - дані про індукцію реТАТ5а в субпопуляціях людських клітин периферійної крові в відповідь на обробку ОР47О5 ІдО-(ІЇ-2 М880)». Для п'яти різних донорів (С4, С5, Сб, М1, М2) оцінювали в різні моменти часу впливу різних доз ОР4705 ІдС-(1-2 М880)2 на індукцію
Зо фосфорилювання 5ТАТ5а. Представлені результати для наступних субпопуляцій СО4--Ттєд: активовані, клітини пам'яті і наївні Тгед; канонічні ефекторні СО4--Т-клітини пам'яті; СОБбегот.
МК-клітини; ефекторні СО8:-Т-клітини пам'яті; наївні ефекторні СО4--Т-клітини;. МК-клітини;
МКТ-клітини; і наївні ефекторні СО8-С045ВА--Т-клітини; на фіг. 14 - дані про індукцію рЗТАТ5а в субпопуляціях людських клітин периферійної крові: порівняння ОРА47О5 ІдС-ІЇ-2, ОРА7Оа5 Іда-(І-2)2, ОРА7а5 ІдО-( -2Е95А)», ОРАТа5 Іда-( 2
М880)2 ії ОРА7О5 ІдС-ІІ -2М4880. Представлені результати для субпопуляцій СО4--Тгтед (А-В): активованих (А), клітин пам'яті (В) і наївних (Б) Тгед; канонічних ефекторних СО4--Т-клітин пам'яті (7); СОБ5бепаМК-клітин (Д); на фіг. 15 - дані про індукцію роТАТ5а в субпопуляціях людських клітин периферійної крові в відповідь на обробку обома кон'югатами, і ОРА7О5 ІдО-(ІІЇ -2М880)2 і ОРА7О5 ІдО-(ІІ -2)». Для десяти різних донорів оцінювали в різні дні впливу ОРА7О5 ІдО-(ІІ -24880)» і ОР47О5 ІдО-(ІІ -2)2 у широкому діапазоні доз (26 Ід) на індукцію фосфорилювання ЗТАТ5ба. Представлені результати для наступних субпопуляцій клітин: (А) Тгед пам'яті, (Б) наївні Тгед, (В) СО5бепт-МК- клітини, (Г) все МК-клітини, (Д) центральні СО4--Т-клітини пам'яті, (ЕЕ) ефекторні СО4--Т-клітини пам'яті, (Ж) наївні СО4--Т-клітини, (3) центральні СО8--Т-клітини пам'яті, (І) ефекторні СО8--Т- клітини пам'яті, (ДО) наївні СО8--Т-клітини, (Л) Тетга (КА--Тей-клітини пам'яті| СО8--Т-клітини, (М) МКТ-клітини і (Нн) 203-004 С08С056-Т-клітини. Все результати представлені у вигляді середніх значень х СОС (стандартна помилка середнього) (п-10 донорів); на фіг. 16 - порівняння впливів іп міго ОРА7ОЗ Ідс-(ІІ-2М880)2 і ОРА7О5 ІдС-(ІІ-2)2 на людські МК-клітини і СО8--Т-клітини. РВМС з організму здорових донорів (п-10) культивували з щільністю 5х105 клітин/лунку планшетів з О-подібним дном в присутності 50 нг/мл ОРА7О5 ІдС- (І -2мМ880)2 (незафарбовані символи) або ОРА7О5 ІдС-(ІІ-2)2 (зафарбовані сірим кольором символи) протягом 6 днів, після чого кількісно оцінювали число клітин за допомогою проточної цитометрії. Впливу на МК-клітини кількісно оцінювали на СО56бсіт- і СОБбелаМК-клітинах (А).
Впливу на СО8:-Т-клітини проілюстровані на панелі (Б). Результати представлені у вигляді медіанних значень ж міжквартильний інтервал, статистичні відмінності визначали із застосуванням О-критерію Манна-Уітні; на фіг. 17 - порівняння впливів іп мімо ОР47О5 Ідб-(І-2М880)2 і ОРА7О5 ІдС-(ІІ-2)2 на несучих стовбурові СЮОЗ34--клітини гуманізованих мишей. Через 10-12 тижнів після приживлення бо трансплантованих стовбурових СОЗ34--клітин мишей обробляли двічі на тиждень наповнювачем
(ОР47О5 Ід, без 1-2), ОР4А7са5 Ід(с-(/-2М880)2 або ОР47О5 ІдО-(ІЇ-2)». Максимальне збільшення кількостей людських Тгед і МК-клітин в крові було виявлено після 3 обробок, результати представлені на панелі (А) для Тгед і на панелі (Б) для МК-клітин). Результати представлені у вигляді медіанних значень х міжквартильний інтервал; наповнювач (п-21), о- (1. -2М880)» (п-22) і ІдО-(ІІ -2)» (п-24); на фіг. 18 - порівняння впливів іп мімо ОР475 ІдС-(ІЇ-2М880)» і ОР4А7О5 ІдО-(ІІ-2)». на виживання несучих стовбурові СЮО34--клітини гуманізованих мишей. Через 10-12 тижнів після приживлення трансплантованих стовбурових СО34--клітин мишей обробляли двічі на тиждень наповнювачем (ОР47О5 ІдС, без І--2), ОР47а5 Іда-(ІІ -2М880)2 або ОР4А7О5 ІдО-(ІІ -2)2» до тих пор, поки серйозність реакції людський ксенотрансплантат проти хазяїна не досягала заздалегідь визначеного рівня (втрата ваги 21595), що потребує виключення тварин з дослідження. Результати представлені на графіках у вигляді кривих виживаності Каплана-
Мейєра, збудованих за допомогою програми сСгарпРай Ргіхт для наповнювача (п-7), ОР47УО5
Ідса-(01 2880)» (п-12) і ОРА7О5 ІдО-( -2)» (п-13); на фіг. 19 - порівняння впливів іп мімо ОР47О5 Ідсо-(ІІ -гм880)»2 і ОРА7О5 ІдО-(ІІ -2)» на Тгед,
МК-клітини і СО8:-Т-клітини в організмі несучих стовбурові СОЗ34--клітини гуманізованих мишей.
Через 10-12 тижнів після приживлення трансплантованих стовбурових СО34--клітин мишей обробляли двічі на тиждень наповнювачем (ОР47О5 ІдС, без ІІ -2), ОРА7О5 Іда-(І -2М880)» або
ОРА7а5 Іда-(П/-2)2 до тих пір, поки серйозність реакції людський ксенотрансплантат проти хазяїна не достигала заздалегідь визначеного рівня (втрата ваги 21595), що потребує виключення тварин з дослідження, після чого проводили аналіз крові відносно індивідуальних субпопуляцій людських клітин. Результати оцінки кількості людських Тгед, МК-клітин і СО8-- клітин в крові представлені у вигляді 956 відносно кількості людських СО45:-клітин. Результати представлені у вигляді середніх значень 5 СОС для наповнювача (п-б), ОР47О5 Іда-(ІІ- 2М880)2 (п-9) або ОР47О5 ІдОС-(ІІ -2)»2 (п-9); на фіг. 20 - результати оцінки індукції реТАТ5а Ттгед в крові мавп циномолгус у відповідь на рРАТа5 Іда-(І-2)2 і ОРА7О5 ІдС-( -2М880)». Для трьох здорових донорів (С1-С3) одночасно оцінювали впливи максимальної дози (20 нг/мл) ОР47О5 ІдО-(ІІ-2)2 і ОРА7О5 ІдО-(1І -2М880)2 на індукцію фосфорилювання ЗТАТ5а в Ттгед. (А) Ідентифікацію субпопуляцій СО4-0025:-Ттев:
Зо наївних Тгед (СО45БВА"ГОХРЗ"), Тгед пам'яті (СО45БА ГОХРЗ) і активованих (СО45ВАРОХРЗГ) здійснювали за допомогою метода проточної цитометрії із застосуванням стратегії, основаної на застосуванні дискримінаційного вікна для РОХРЗ (у-ось) і СО45КА (х-ось). На панелі (Б) представлені дані про рівень забарвлювання поверхні СО25:-клітин в субпопуляціях Тгед до стимуляції. На панелі (В) представлені реТАТ5а-відповіді для субпопуляцій СО4-С025:-Ттед: субпопуляцій активованих клітин, клітин пам'яті і наївних клітин для кожної з трьох мавп циномолгус (С1-С3); на фіг. 21 - дані об активації роеТАТ5а канонічних ефекторних СО4--Т-клітин пам'яті в крові мавп циномолгус в відповідь на обробку ОРА47О5 Ідс-(І-2)2 або ОРА7О5 ІдОб-(ІІ -2М880)».
Індукцію реТАТба в канонічних ефекторних СО4--Т-клітинах пам'яті аналізували з використанням тих самих стимульованих (20 нг/мл) зразків крові трьох мавп-донорів, зазначених в описі до фіг. 11. (А) результати ідентифікації канонічних ефекторних СО4ГОХРЗ:
Сра45ВА- Т-клітин пам'яті, яку здійснювали за допомогою метода проточної цитометрії із застосуванням стратегії, основаної на застосуванні дискримінаційного вікна для СЮО45КА по у- осі і СбО25 по х-осі. На панелі (Б) представлені реТАТ5а-відповіді для всіх ефекторних
СрАРОХРЗСО45ВА- Т-клітин пам'яті. На панелі (В) представлені роТАтТ5а-відповіді для ефекторних Т-клітин пам'яті, які являлись також СО25-клітинами. На панелі (Г) представлені роТАтТ»5а-відповіді для ефекторних Т-клітин пам'яті, які являлись також СО25:-клітинами; на фіг. 22 - дані про індукцію роТАТ5а в субпопуляціях Т-клітин периферійної крові мавп циномолгус в відповідь на обробку ОРА7О5 Ідос-(І-2)2 і ОРА7О5З ІдС-(І-2М880)». Для двох здорових дорослих донорів оцінювали впливу різних доз (0,03-300 нг/мл) ОР47О5 ІдО-(ІЇ -2)» і рРАТа5 Іда-( -2М880)2 на індукцію фосфорилювання 5ТАТ5а. Представлені результати для наступних субпопуляцій СО4--Ттєд (А-В): активовані (А), клітини пам'яті (В) і наївні (Б) Тгед і канонічні ефекторні СО4--Т-клітини пам'яті (Г). Для обох мавп були одержані схожі результати і для ілюстрації впливів ОР47О5 ІдО-(ІЇ-2)2 ії ОР47О5 ІдО-(ІІ-2М880)2 наведені результати для одного донора; на фіг. 23 - одержані на мишах дані, які свідчать про те, що ОРА7О5 Ідо-ІІ-2 мав більш високі фармакокінетичні (ФК) характеристики у порівнянні з ОР47О5 ІдО-(ІІ-2)2, у той час як характеристики ОР47О5 ІдО-(ІЇ-2М880)2 находились на проміжному рівні. (А) дані для МОО:- і
МОО.зсіа-мишей, яким вводили шляхом внутрішньовенної ін'єкції (і.м.) 0,3 мг/кг ОР4А7О5 ІдС-1І -2 60 або 0,3 мг/кг ОРА7О5 Ідо-(ІЇ-2)2. (Б) дані для МОЮ. 5сій. І. 2Ка-мишей, яким вводили і.м. 0,1 мг/кг ОРА7О5З Ідб-І-2, 0,3 мг/кг ОРА7С5 Ідаш-(П-2)2 або 0,1 мг/кг ОРА7О5 Ід-(ІІЇ-2М880)».
Людський 1-2 оцінювали у зразках сироватки в зазначені моменти часу за допомогою аналізу на основі захоплення з використанням МАт; на фіг. 24 - дані, що свідчать про те, що рівні й СО25, й ГохРЗ3 підвищуються в мишиних
Тгед після обробки РгоїеикіпУ, ОРА7а5 ІдО-ІІ-2, ОРАТОа5 Іда-(П -2)2 ії ОРАТО5 ІдО-(ІІ -2М880)».
ВАЇ В/с-мишей обробляли Ргоїеикіп? (20000 і 100000 МЕ/мишу, п-3), ОРА7О5 ІдО-ІІ -2, ОР47О5
Ідс-(-2)2 або ОР4А7О5 ІдбС-(-2М880)2 (60, 300 або 1500 МЕ/мишу, п-3), оброблених наповнювачем мишей включали як нестимульовані контролі (п-:4). Через 24 год. після обробки оцінювали рівні СО25 і РОХРЗ в Тгед селезінки. Для всіх чотирьох молекул, що містять 1-2 були виявлені залежні від дози вимірювання рівнів СО25 на клітинної поверхні (А) і залежні від дози вимірювання рівнів внутрішньоклітинного БохРЗ (Б). Дані представлені у вигляді середніх значень - СКО, чорні стовпчики відповідають найбільшій застосовній дозі, а сірі стовпчики відповідають найбільш низькій дозі; на фіг. 25 - результати оцінки ФК-характеристик ОР47О5 ІдС-ІІ-2 ії ОР47О5 ІдО-(ІІ -2)2 в організмі здорових дорослих "біологічно наївних" мавп циномолгус. (А): дані для тварин, яким вводили внутрішньовенно (і.м.) ЮОР4705 ІдО-І/-2 у вигляді короткочасної болюсної ін'єкції в дозах 10, 25 і 100 мкг/кг (п-2 на дозу). (Б): дані для тварин, яким впорскували і.м. ОР47О5 ІдО- (П-2)» у вигляді короткочасної болюсної ін'єкції в дозах 10 і 25 мкг/кг (п-2 на дозу). Людський ЇЇ - 2 оцінювали в зразках сироватки в зазначені моменти часу за допомогою аналізу на основі захоплення з використанням МАт; на фіг. 26 - дані, що свідчать про те, що ОР47О5 ІдС-1/2 має залежну від дози дію на мавп циномолгус, збільшуючи кількість регуляторних Т-клітин. Вимірювання кількості регуляторних браиСр2гбгОХРЗ:-Т-клітин (Тгед) в цільній крові в день 7 після обробки представлені у вигляді (А) абсолютної кількості Тгед-клітин на мм3 цільної крові і (Б) кратності вимірювання кількості
Тгед-клітин. Все дані представлені у вигляді середніх значень - СКО. Незабарвлені стовпчики: рРА?Та5 Іда-ІІ -2 (п-6б); затінені стовпчики: наповнювач (п-3); на фіг. 27 - залежності впливів від часу і низьких доз ОР47О5 ІдС-ІІ -2 на рівні Тгед-клітин в організмі мавп циномолгус. (А) вимірювання в залежності від часу кратності збільшення рівнів
Тгед-клітин після введення ОР47С5 ІдС-ІЇ-2 в дозі 2 або б мкг/кг (п-4 і 6 відповідно). (Б)
Зо вимірювання в залежності від часу абсолютних кількостей Тгед-клітин в крові після введення
ОРА7Оа5 Ід0-І-2 в дозі 2 або 6 мкг/кг (п-4 і 6 відповідно). Все дані представлені у вигляді середніх значень - СКО; на фіг. 28 - дані, що свідчать про те, що введення одноразової дози пролейкіну стимулює короткочасну залежну від дози Тгед-відповідь у мавп циномолгус. (А) вимірювання кількостей
Тгед-клітин в периферійної крові після однократного введення пролейкіну в дозі від 3х107 до
З3х105 МЕ/кг. (Б) вимірювання рівнів роТтАТ5а Тгед після однократного введення пролейкіну в дозі від 3х107 до 3х107 МЕ/кг. Дані представлені у вигляді середніх значень - СКО; на фіг. 29 - дані, що свідчать про те, що низька доза ОР47О5 ІдС-ІІ -2 є більш ефективною, ніж висока доза РгоЇешикКіп? з точки зору індукції Тгед у мавп циномолгус. Нормальних здорових мавп циномолгус (групи по п-5) обробляли ОР47О5 ІдО-ІІ-2 в низькій дозі або пролейкіном у високій дозі і аналізували вимірювання кількості регуляторних Т-клітин в день 10. У дні 0 і 7, вводили ОРА4А7О5 ІдС-ІЇ-2 в дозі 16800 МЕ/кг (12 мкг/кг). Обробку пролейкіном (200000 МЕ/кг) здійснювали С З рази на тиждень (МУУЕ), вводячи загалом 5 доз. Результати представлені у вигляді середніх значень - СКО для (А) вимірювання загальної кількості Тгед-клітин на мм3 крові, (Б) кратності вимірювання кількості Тгед-клітин, і (В) вимірювання відношення кількості
Тгед до кількості канонічних СО4-РОХРЗ-Кклітин. Незабарвлені стовпчики відповідають обробці
І -2, а затінені стовпчики відповідають обробці наповнювачем як контроля; на фіг. 30 - дані, що свідчать про те, що рівень фосфорильованого 5ТАТЬ в цільній крові, одержані ех мімо, є чутливим біомаркером активації за допомогою ОР47О5 ІдС-ІЇ-2 Тгед-клітин іп мімо. Через один і три дні після введення іп мімо одноразової низької дози ОР47О5 Ідо-ІІ -2 (12 мкг/кг) здоровим мавпам циномолгус (п-5), збирали зразки цільної крові й відразу же без стимуляції аналізували відносно фосфорильованого ЗТАТ5 (роТАТ5а). У кожної мавпи брали кров у день 0 перед обробкою, вимірювали кількість роТАТ5ба (затінені стовпчики) й індивідуальні результати застосовували для оцінки кратності вимірювання після обробки (незабарвлені стовпчики). Представлені: (А) кратність вимірювання роТАтТ5а в Тгед-клітинах в дні 1 і 3, (Б) кратність вимірювання рівнів реТАТ5а в канонічних СО4-С0045-Т-клітинах пам'яті, і (В) кратність вимірювання 5ТАтТ5а в наївних Т-клітинах. Дані представлені у вигляді середніх значень - СКО; на фіг. 31 - дані, що свідчать про те, що рівень фосфорильованого 5ТАТЬ в цільній крові, бо одержаний ех мімо, є чутливим біомаркером активації Тгед-клітин іп мімо за допомогою ОР4765
Ідс2-І/-2 при його застосуванні в низькій дозі. Через один-сім днів після введення іп мімо одноразової низької дози ЮОР47О5 ІдС-ІЇ-2 здоровим мавпам циномолгус, збирали зразки цільної крові і відразу же без стимуляції аналізували відносно фосфорильованого 5ТАТЬ (р5ТАТ5а). У кожної мавпи брали кров у день 0 перед обробкою для визначення нестимульованих рівнів реТАТ5а і проводили порівняння з ними для визначення змін рівнів рЗтТАТ5а після обробки. (А) Рівні реТАТ5а Тгед-клітин до і після обробки ОР47О5 ІдО-1І -2 в дозі 2 мкг/кг (п--4). (Б) Рівні ретТАТ5а Тгед-клітин до і після обробки ОР47О5 ІдС-ІІ -2 в дозі 6 мкг/кг (п-6). Дані представлені у вигляді середніх значень - СКО; на фіг. 32 - дані, що свідчать про те, що рівень Кі-67 в цільній крові мавп циномолгус, одержаний ех мімо, є маркером індукованої ОРА7О5 ІдО-ІІ-2 проліферації Т-клітин іп мімо. Для мавп циномолгус, оброблених ОР47О5 Ідс-ІІ/-2 в дозах 2 і 6 мкг/кг як зазначено в описі до фіг. 14, здійснювали також ех мімо моніторинг змін рівнів внутрішньоклітинного маркера Кі-67 для оцінки ступеню проліферації іп мімо. Здійснювали кількісну оцінку проценту клітин, що знаходяться в нормальному стаціонарному стані в клітинному циклі (Кі-67") в день 0 перед обробкою і потім здійснювали щоденно моніторинг протягом наступних 7-11 днів. Представлені: (А) 95 Кі-67" для Тгєд-клітин, (Б) Кі-67" для канонічних СО4-09045-Т-клітин пам'яті/ефекторних Т- клітин і (В) бо Кі-67" для наївних СО4-СО45ВА"-Т-клітин. Дані представлені у вигляді середніх значень - СКО; на фіг. 33 - залежності від часу і низької дози впливів ОР47О5 Ідо-(ІІ -2)2 на рівні Тгед в організмі наївних здорових мавп циномолгус. (А) залежність від часу вимірювання абсолютних кількостей Тгед після введення 6 мкг/кг ОР47 Ідос-(ІІ -2)». (Б) залежність від часу змін реТАТ5ба
Тгед-клітин після обробки, (В) залежність від часу змін кратності збільшення Тгед-клітин і (Г) порівняння кратності змін кількості Тгед-клітин у оброблених ОР4705 1ІдО-И-2 мавп (незабарвлені стовпчики, 2-36 мкг/кг) і оброблених ОР47О5 ІдО-(ІІ -2)» мавп (затінений стовпчик, 6 мкг/кг). Все дані представлені у вигляді середніх значень - СКО (п--4-6); на фіг. 34 - залежності від часу і дози впливів ОР4А75 Ідс-(ІІ-2)2 при його застосуванні в дуже низьких дозах на рівні Тгед в організмі наївних здорових мавп циномолгус. (А) залежність від часу змін кратності збільшення Тгед після введення ОРА7О5 Ідо-(ІІ -2)2 в дозі 0,7 і 2 мкг/кг, (Б) залежність від часу змін реТАТ5а Тгед-клітин, виміряних в день 0 перед обробкою і в дні 1-4
Зо після обробки, (В) залежність від часу змін рТАТ5а Теп/пет-клітин. Все дані представлені у вигляді середніх значень - СКО (п-З для 0,7 мкг/мл і п-8 для 2 мкг/кг); на фіг. 35 - порівняння залежностей від дози впливів ОР47(05 ІдО-ІІ -2 ії ОРА7О5 ІДО-(ІІ -2)2 і їх здатності збільшувати кількість Тгед в цільній крові мавп циномолгус. Все дані представлені у вигляді середніх значень - СКО (п--3-6); на фіг. 36 - результати застосування технології секвенування наступного покоління (МОБ) застосовували для аналізу специфічного для субпопуляції Т-клітин деметилювання ДНК фактору транскрипції ЕОХРЗ й імуносупресорної молекули СТІ А-4. Аналізували зразки крові дорослих біологічно наївних мавп циномолгус до і після обробки оптимальною дозою ОР47У5
Ідс-11-2 (25 мкг/кг, п-4) і ОРА7О5 ІдО-(І -2)» (6 мкг/кг, п-4). Субпопуляції СО4--Т-клітин виділяли за допомогою ВО РАСБАгіа з РВМС цільної крові і застосовували по 100000 клітин на субпопуляцію для генспецифічного деметилювання ДНК. Для обох обробок були одержані схожі результати, і дані, одержані на оброблених ОР47О5 ІдО-(ІІЇ -2)2 мавпах представлені для ЕОХРЗ на верхній панелі і для СТІ А-4 на нижній панелі (п-4, середнє значення х СКО); на фіг. 37 - результати оцінки ФК-характеристик ОР475 Ідс-(1-2М880)2 в організмі нормальних здорових біологічно наївних мавп циномолгус. (А) результати, одержані для рРА7а5 Іда-( -2М880)2, який вводили внутрішньовенно (ім) шляхом короткочасної болюсної ін'єкції в дозах 30 і 100 мкг/кг (п-2 на дозу). (Б) результати, одержані для ОРА7О5 Ід-(ІІ - 2М880)2, який вводили шляхом підшкірної ін'єкції (5с) в об'ємі 0,2 мл в бічну область спини в дозах 30 і 100 мкг/кг (п-2 на дозу). Людський ІЇ-2 оцінювали в зразках плазми в зазначені моменти часу за допомогою аналізу захоплення, основаного на застосуванні моноклонального антитіла. (В) Як біомаркера експозиції І/-2 проводили вимірювання розчинного СО25 в плазмі після ін'єкції ІдО-(І-2М880)2 в дозах 30 і 100 мкг/кг; рівні 50025 циномолгус вимірювали за допомогою аналізу захоплення на основі МАт до людського 52025, відносно якого відомо, що воно вступає в перехресну реакцію з 50025 циномолгус. Результати представлені у вигляді середніх значень хх СОС (п:-4); на фіг. 38 - залежності від часу і дози впливів іп мімо ОР4А7О5 Ідс-(ІІ-2М880)2 на Тгед в організмі наївних здорових мавп циномолгус. Представлені залежності від часу змін абсолютної кількості (х105/мл крові) загальних Тгед, СО4--Тгед пам'яті, наївних СО4--Тгтед і СО8ГОХРІЗ:-
Тгед після ін'єкції (А) 100 мкг/кг ОРА7 Ідс-(ІІ-2М880)2 або (Б) 30 мкг/кг ОР47 Ідо-(ІІ -2М880)». 60 Представлені залежності від часу змін Тгед у вигляді 96 від СО4-- або СО8:-Т-клітин для загальних Тгед, СО4--Тгед пам'яті, наївних СО4--Тгед і СО8ГОХРЗ:-Тгед після ін'єкції 100 мкг/кг рРА7 Іда-( -2М880)2 (В) або 30 мкг/кг ОРА7 Ідв-(ІІ-2М880)» (Г). Результати представлені у вигляді середніх значень ж СОС (п-4); на фіг. 39 - залежності від часу і дози впливів іп мімо ОРА7О5 Ід0-(І -2М880)» на лімфоцити в організмі наївних здорових мавп циномолгус. Вимірювання в залежності від часу ефекторних
Сбраз-Т-клітин пам'яті представлені у вигляді 96 від загальної кількості СО4--Т-клітин. після ін'єкції 100 мкг/кг ОР47 Ід-(ІЇ -2М880)2 або 30 мкг/кг ОРА7 Ідо-(ІІ -2М880)2 (А). Вимірювання в залежності від часу ефекторних СО4-СО25"-Т-клітин пам'яті представлені у вигляді 95 від кількості ефекторних СО4--Т-клітин пам'яті після ін'єкції 100 мкг/кг ОРА7 Ідб-(ІІ -2М880)» або 30 мкг/кг ОРА7 1до-(-2М880)2 (Б). Результати представлені у вигляді середніх значень - СОС (п-4); на фіг. 40 - дані, що свідчать про те, що рівень роТАтТЗа в цільній крові, одержаний ех мімо, є чутливим біомаркером активації І/-2 іп мімо. Через 1-11 днів після введення іп мімо одноразової дози ОРА4А7О5 ІдО-(ІЇ -2М880)2 мавпам циномолгус збирали зразки цільної крові і відразу же без стимуляції аналізували відносно реТАТ5а. У кожної мавпи брали зразки крові в день 0 перед обробкою для визначення нестимульованих рівнів реТАтТЗа, які порівнювали для визначення змін рівнів рОТАТ5ба після обробки. (АХ реТАТ5ба (МЕЇ, максимальна середня інтенсивність флуоресценції) до і після обробки 100 мкг/кг ОРА7О5 ІдС-(ІЇ-2М880)2, п-4. (Б) рзЗТАТ5а до і після обробки 30 мкг/кг ОР4А7О5 ІдО-(І -2М880)», п-4. Дані представлені у вигляді середніх значень - СОС для зазначених субпопуляцій клітин; на фіг. 41 - одержані ех мімо дані, що свідчать про те, що забарвлювання СО25 на поверхні клітин в цільній крові є чутливим біомаркером активації І/-2 іп мімо. Через 1-14 днів після введення іп мімо одноразової дози ОР47О5 ІдС-(ІІ -2М4880)2 мавпам циномолгус збирали зразки цільної крові і відразу же без стимуляції аналізували відносно СО25 на поверхні зазначених типів клітин. У кожної мавпи брали зразки крові в день 0 перед обробкою для визначення нестимульованих рівнів СО25, з якими проводили порівняння для визначення змін рівнів СО25 після обробки. (А) забарвлювання СО25 (максимальна МЕїЇ, середня інтенсивність флуоресценції) до і після обробки 100 мкг/кг ОРА7О5 Ідс-(ІІ-2М880)2, п--4. (Б) забарвлювання
СО025 до і після обробки 30 мкг/кг ОРА7О5 Ідо-(ІІ-2М880)2, п-4. Дані представлені у вигляді
Зо середніх значень - СОС для зазначених субпопуляцій клітин; на фіг. 42 - одержані ех мімо дані, що свідчать про те, що забарвлювання внутрішньоклітинного Кі-67 в цільній крові є чутливим біомаркером проліферації клітин після активації 1-2 іп мімо. Через 1-14 днів після введення іп мімо одноразової дози ОР47О5 Ідо-(І - 21880)2 мавпам циномолгус збирали зразки цільної крові і відразу же без стимуляції аналізували відносно внутрішньоклітинного Кі-67 в зазначених типах клітин. У кожної мавпи брали зразки крові в день 0 перед обробкою для визначення нестимульованих рівнів Кі-675- клітин, з якими проводили порівняння для визначення змін 95 Кі-67--клітин після обробки. (А) забарвлювання Кі-67 (95 від Кі-67--клітин) до і після обробки 100 мкг/кг ОР47О5 Ід(с-(ІІ -2М880)», п-4. (Б) забарвлювання Кі-67 (95 від Кі-67--клітин) до і після обробки 30 мкг/кг ОР47О5 Ідсо-(ІІ - 2М880)2, п-4. Результати представлені у вигляді середніх значень - СОС для зазначених субпопуляцій клітин; на фіг. 43 - підсумкове порівняння впливів іп мімо І--2 на Тгед циномолгус. Представлено максимальне збільшення загальних Тгед у вигляді 95 від СО4--Т-клітин для пролейкіну, Ідо-1Ї -2,
Іда-(П-2)2 і Ід0-(11-2М880)2; для цілей порівняння все дози іп мімо виражені в пмолях/кг.
Пролейкін вводили З рази на тиждень (ММУУЕ (понеділок/середа/п'ятниця)) протягом 2 тижнів, а які містять ІЇ/-2 злиті білюи вводили у вигляді одноразової ін'єкції. Результати представлені у вигляді середніх значень - СОС; пролейкін (п-5), Ідс-ІЇ-2 (п-6), Іда-(І-2)2 (п-6) і Іде-(ІІ- 2880)» (п-4); на фіг. 44 - дані, що свідчать про те, що 1-2 в високих дозах індукує еозинофілію у мавп циномолгус. Здійснювали моніторинг вимірювання кількості еозинофілів в крові при проведенні всіх тестів, як з використанням пролейкіну, так й імунокон'югатів ІЇ/-2. Еозинофілія була виявлена в період з 7 по 14 день після обробки пролейкіном у високій дозі (2х105 МЕ/кг, З рази на тиждень протягом 2 тижнів) або високими дозами ОРА7О5 Ідб-ІІ-2, але не ОРА7О5 ІдО-(ІІ - 2)2 або ОРА7О5 ІдО-(І-2М880)2. Вихідні кількості еозинофілів, позначені незабарвленими кружками, показані на графіку в положенні, що відповідає дозі ІЇ -2, рівній 0, їх визначали двічі, один разів при тестуванні молекули ІІ -2 дикого типу і один разів при тестуванні ОР47О5 ІдО-(ІІ - 2М880)». Дані представлені у вигляді середніх значень - СКО; на фіг. 45 - дані, що свідчать про те, що обробка іп мімо ОР47О5 Ідб-ІІ-2 пригнічує у мишей гіперчутливість уповільненого типу, індуковану еритроцитами баранів (ОТН). Все дані 60 представлені для індивідуальних мишей, оброблених наповнювачем (відповідь 100 9с), ІДа-ІЇ -2
(4000 МЕ/мишу) або мишиним СТІ А-4-Ід як позитивного контролю (200 мкг/мишу). (А) результати для МОЮ-мишей і (Б) для С57ВІ /Х4-мишей. Величини ОТН-відповідей в день чотири представлені у вигляді вимірювання маси лапи у порівнянні з неімунізованими мишами (А маси лапи). Дані представлені у вигляді середніх значень - СКО; на фіг. 46 - Дані, що свідчать про те, що обробка іп мімо ОР47О5 ІдО-ІІ -2 (4000 МЕ/мишу) пригнічує відповіді у вигляді мишачого антитіла Ідс-класу на КІН у (А) С57ВІ /Х-мишей через 21 день після імунізації і (Бу у МОО-мишей через сім днів після імунізації. Дані представлені у вигляді середніх значень - СКО.
Докладний опис винаходу
Визначення
Поняття, застосовні в даному описі, мають значення, загальноприйнятні в даній галузі, якщо нижче спеціально не зазначено інше.
В контексті даного опису поняття "злитий білок" відноситься до злитої молекули поліпептиду, яка містить молекулу імуноглобуліну і молекулу 1-2, де компоненти злитого білка зчеплені один з іншим за допомогою пептидних зв'язків або безпосередньо, або через пептидні лінкери. Слід відзначити, що індивідуальні пептидні ланцюги компонента злитого білка, що представляє собою імуноглобулін, можуть бути зв'язані нековалентно, наприклад, за допомогою дисульфідних зв'язків.
Поняття "злиті" відноситься до компонентів, які зчеплені пептидними зв'язками або безпосередньо, або за допомогою одного або декількох пептидних лінкерів.
Поняття "специфічне зв'язування" означає, що зв'язування є вибірковим відносно антигену і його можна відрізняти від небажаних або неспецифічних взаємодій. Здатність імуноглобуліну зв'язуватися зі специфічним антигеном можна визначати або за допомогою твердофазного імуноферментного аналізу (ЕГІ5БА), або за допомогою інших методик, відомих спеціалісту в даній галузі, наприклад, за допомогою метода поверхневого плазмонного резонансу (ЗРК) (здійснюючи аналіз за допомогою пристрою ВіАсоге) (І ЩШебіай та ін., Сіусо У 17, 2000, сс. 323- 329) і традиційних аналізів зв'язування (Нееїеу, Епаосг Кез 28, 2002, сс. 217-229). В одному з варіантів здійснення винаходу ступінь зв'язування імуноглобуліну з невідповідним білком складає менше приблизно 1095 від зв'язування імуноглобуліну з антигеном, при оцінці, наприклад, за допомогою ЗРК. В деяких варіантах здійснення винаходу імуноглобулін, який зв'язується з антигеном, характеризується константою дисоціації (Ко), що складає х 1мкМ, - 1О0ОнМ, х 1ОНМ, х НМ, х ОО 1НМ, х 001нМ або х0,001нМ (наприклад, 109М або менше, наприклад, від 109М до 10-7ЗМ, наприклад, від 109М до 10-9М).
Поняття "афінність" або "афінність зв'язування" відноситься до сумарної сили всіх нековалентних взаємозв'язків між індивідуальним сайтом зв'язування молекули (наприклад, антитіла) і її партнером зі зв'язування (наприклад, антигеном). Якщо не зазначене інше, то в контексті даного опису поняття "афінність зв'язування" відноситься до властивої компонентам зв'язувальної пари (наприклад, антитіла і антигену) афінності зв'язування, що відображає взаємодію за типом 1:1. Афінність молекули Х до її партнера М можна, як правило, характеризувати за допомогою константи дисоціації (Ко), яка представляє собою відношення констант швидкості реакції дисоціації і асоціації (Кок і Коп відповідно). Так, еквівалентні афінності можуть відповідати різним константам швидкості, якщо співвідношення констант швидкості залишається таким самим. Афінність можна оцінювати загальноприйнятними методами, відомими в даній галузі включаючи представлені в даному описі. Конкретним методом вимірювання афінності є поверхневий плазмонний резонанс (5РЕ).
Поняття "знижене зв'язування", наприклад, знижене зв'язування з Ес-рецептором або рецептором 1-2, відноситься до зниження афінності відповідної взаємодії, при оцінюванні, наприклад, за допомогою ЗРК. Слід зауважити, що поняття охоплює також зниження афінності до нуля (або нижче межі виявлення аналітичного метода), тобто повну відсутність взаємодії. навпаки, поняття "підвищене зв'язування" відноситься до підвищення афінності зв'язування для відповідної взаємодії.
В контексті даного опису поняття "антигенна детермінанта" є синонімом поняття "антиген" і відноситься до сайту (наприклад, ділянки, що складається з суміжних амінокислот, або конформаційної конфігурації, що складається з різних областей несуміжних амінокислот) на поліпептидній макромолекулі, з якою зв'язується антитіло з утворенням комплексу антитіло- антиген. Придатні антигенні детермінанти можна виявити, наприклад, на поверхні клітин, молекул, що знаходяться у вільному стані в сироватці крові і/або у позаклітинному матриксі (ЕСМ).
В контексті даного опису поняття "одноланцюгова" відноситься до молекули, яка містить 60 амінокислотні мономери, лінійно зчеплені пептидними зв'язками.
В контексті даного опису поняття "антитіло" застосовують в його найбільш широкому сенсі й відноситься до різних структур антитіл, включаючи (але, не обмежуючись тільки ними) моноклональні антитіла, поліклональні антитіла, мультиспецифічні антитіла (наприклад, біспецифічні антитіла) і фрагменти антитіл, за умови, що вони мають потрібну антигензв'язувальну активність.
Поняття "фрагмент антитіла" відноситься до молекули, відмінної від інтактного антитіла, яка містить частину інтактного антитіла, яка зв'язується з антигеном, з яким зв'язується інтактне антитіло. Прикладами фрагментів антитіл є (але, не обмежуючись тільки ними) Ем, Раб, Раб",
Еар-5Н, Каб)», димерні антитіла (діабоді), лінійні антитіла, молекули одноланцюгових антитіл (наприклад, 5сЕм) і однодоменні антитіла.
Поняття "молекула імуноглобуліну" відноситься до білка, який має структуру антитіла, яке зустрічається в природних умовах. Наприклад, імуноглобуліни класу ЇдДо представляють собою гетеротетрамерні глікопротеїни з молекулярною масою приблизно 150000 Да, що складаються із двох легких ланцюгів і двох важких ланцюгів, зв'язаних дисульфідними мостиками. В напрямку від М-кінця до С-кінця кожний важкий ланцюг містить варіабельну область (МН), яку називають також варіабельним важким доменом або варіабельним доменом важкого ланцюга, за якою розташовані три константні домени (СНІ, СНО та СНЗ), які називають також константною областю важкого ланцюга. Аналогічно до вказаного, в напрямку від М- кінця до С- кінця кожний легкий ланцюг містить варіабельну область (МН), яку називають також варіабельним важким доменом або варіабельним доменом важкого ланцюга, за якою розташовані три константні домени (СНІ, СН2 і СНЗ), які називають також константною областю важкого ланцюга. Аналогічно до цього, в напрямку від М- кінця до С-кінця кожний легкий ланцюг імуноглобуліну містить варіабельну область (МІ), яку називають також варіабельним легким доменом або варіабельним доменом легкого ланцюга, за яким розташований константний домен легкого ланцюга (СІ), який називають також константною областю легкого ланцюга. Важкий ланцюг імуноглобуліну може відноситься до одного з п'яти класів, позначених як «а (ІА), б (140), є (9Е), у (940) або нн (І9М), деякі з яких додатково підрозділяють на підкласи, наприклад, у: (Ідс), У2 (ІДдС2), уз (ІДСіз), Уг (Са), оч (ІА) і а» (ІдАх).
Легкий ланцюг імуноглобуліну може відноситься до одного з двох типів, позначених як каппа (к) і лямбда (Х), на основі амінокислотної послідовності її константного домена. Імуноглобулін, як правило, складається з двох молекул Раб і Ес-домена, які з'єднані через шарнірну область імуноглобуліну.
В контексті даного опису поняття "Гар-фрагмент" відноситься до фрагменту імуноглобуліну, що містить Мі-домен і константний домен легкого ланцюга (СІ) і МН-домен і перший константний домен (СНІ) важкого ланцюга.
Поняття "клас" антитіла або імуноглобуліну відноситься до типу константного домена або константної області, який/яка міститься в його важкому ланцюзі. Існує п'ять основних класів імуноглобулінів: ІА, дО, ІДЕ, до і ІдМ, а деякі з них можна додатково підрозділяти на підкласи (ізотипи), наприклад, дес, ІдС2, Ідсіз, ІДС, ІДАї і ІдА». Константні домени важких ланцюгів, що відповідають різним класам імуноглобулінів, позначають як а, б, є, у і и відповідно.
Поняття "варіабельна область" або "варіабельний домен" відноситься до домену важкого або легкого ланцюга імуноглобуліну або антитіла, який бере участь у зв'язуванні імуноглобуліну або антитіла з антигеном. Однак імуноглобулін, що входить в злитий білок, що запропонований в даному винаході, може містити варіабельні області, які не зумовлюють антигензв'язувальну специфічність. Варіабельні домени важкого ланцюга і легкого ланцюга (МН і МІ. відповідно) імуноглобуліну або антитіла, як правило, мають схожі структури, при цьому кожний домен містить чотири консервативних каркасних ділянки (ЕК) і три гіперваріабельних ділянки (НУК) (див., наприклад, Кіпаї та ін., Кибу Іттипо/оду, 6б-ое вид., вид-во М/.Н. Егеетап апа Со., 2007, з. 91). Для забезпечення специфічності зв'язування антигену може бути достатньо одного МН- або
МІ -домена.
Поняття "гіперваріабельна ділянка" або "НМА" в контексті даного опису відноситься до кожної з ділянок варіабельного домена імуноглобуліну або антитіла, послідовності яких є гіперваріабельною, і/або які утворюють структури у вигляді петель ("гіперваріабельні петлі"). Як правило, нативні чотирьохланцюгові антитіла містять шість НМЕ; три в МН (НІ, Н2, НУ) і три в
МІ. (І, 12, 13). НУК, як правило, містять амінокислотні залишки з гіперваріабельних петель іМабо з "визначальних комплементарність ділянок" (СОМ), останні відрізняються найбільш вираженою варіабельністю послідовності (або беруть участь в розпізнаванні антигенів.
Наведені як приклади гіперваріабельні петлі охоплюють амінокислотні залишки 26-32 (І 1), 50- 52 (12), 91-96 (І 3), 26-32 (НІ), 53-55 (Н2) і 96-101 (НЗ) (Спотіа і І ез5К, 9. Мої. Віої. 196, 1987, сс. 60 901-917). Наведені як приклади СОК (СОБК-І1, СОВ-12, СОВ-І 3, СОВ-НІ, СОВ-Н2 ї СОБ-НЗ)
охоплюють амінокислотні залишки 24-34 І 1, 50-56 12, 89-97 І 3, 31-358 НІ, 50-65 Н2 і 95-102 НЗ (Кабаї та ін., зедиепсе5 ої Ргоївіп5 ої Іттипоїодіса! Іпіегеб5ії, 5-е вид., вид-во Рибіїс Неапй
Зегмісе, Маїйопаї! Іпзійшез ої Неайй, Веїйпезаа, МО, 1991). Окрім СОК'І, присутнього в УН, СОК, як правило, містять амінокислотні залишки, які утворюють гіперваріабельні петлі. СОК містять також "визначальні специфічність залишки" або "БОР", які представляють собою залишки, які контактують з антигеном. ЗО знаходяться всередині областей СОР, позначених як скорочені-
СОР або а-СОК. Наведені як приклади а-СОВ (а-СОВ-11, а-СОВ-1І2, а-СОВ-13, а-СОВ-НІ, а-
СОВ-Н2 ї а-СОВ-НЗ) охоплюють амінокислотні залишки 31-34 І 1, 50-55 12, 89-96 І 3, 31-358 НІ, 50-58 Н2 ї 95-102 НЗ (див. АІтадго і Егапе55оп, Егопі. Віозсі. 13, 2008, сс. 1619-1633). Якщо не зазначено інше, то залишки в НУК й інші залишки у варіабельному домені (наприклад, залишки в ЕК) в контексті даного опису нумерують згідно з Кеботом зі співавторами, вище (позначають як "нумерація Кебота").
Поняття "каркасна ділянка" або "РК" відноситься до залишків варіабельних доменів, що відрізняються від залишків гіперваріабельної ділянки (НМА). ЕК варіабельного домена, як правило, представлені чотирма ЕК-доменами: ЕК, ЕК2, ЕКЗ їі ЕК4. Таким чином, послідовності
НМР і ЕЕ, як правило, розташовані в МН (або МІ) в наступному порядку: ЕК1-Н1(І 1)-ЕН2-НаІ(І2)-
Енпз-НЗ(І-3)-еНа. "Людський імуноглобулін" представляє собою імуноглобулін, який має амінокислотну послідовність, що відповідає послідовності імуноглобуліну, який продукується в організмі людини або в людській клітині, або походить з нелюдського джерела, який застосовує спектри людських імуноглобулінів або інші кодувальні людський імуноглобулін послідовності. Із зазначеного визначення людського імуноглобуліну спеціально виключений гуманізований імуноглобулін, що містить нелюдські антигензв'язувальні залишки.
В контексті даного опису поняття "моноклональне антитіло" відноситься до антитіла, одержаного з популяції практично гомогенних антитіл, тобто індивідуальні антитіла, які входять в популяцію є ідентичними і/або зв'язуються з одним і тим самим епітопом, за виключенням можливих варіантів антитіл, які, наприклад, містять наявні в природних умовах мутації або мутації що виникають в процесі одержання препарату моноклональних антитіл, зазначені варіанти, як правило, присутні в мінорних кількостях. На противагу до препаратів поліклональних антитіл, які, як правило, охоплюють різні антитіла, мішенню яких є різні детермінанти (епітопи), мішенню кожного моноклонального антитілу з препарату моноклональних антитіл є одна детермінанта на антигене. Таким чином, прикметник "моноклональний" відноситься до характеристики антитіла, яка вказує на одержання з практично гомогенної популяції антитіл, і його не слід розглядати як вимогу, яка обмежує одержання антитіла за допомогою будь-якого конкретного метода. Наприклад, моноклональні антитіла, призначені для застосування згідно з даним винаходом, можна одержувати різними методиками, включаючи (але, не обмежуючись тільки ними) метод гібридом, методи рекомбінантної ДНК, методи фагового дисплея і методи, що охоплюють застосування трансгенних тварин, що містять весь локус людського імуноглобуліну або його частину, зазначені методи й інші, наведені як приклад, методи створення моноклональних антитіл представлені в даному описі.
В контексті даного опису поняття "Рс-домен" або "Ес-область" застосовують для визначення
С-кінцевої області важкого ланцюга імуноглобуліну, яка містить щонайменше частину константної області. Під поняття підпадають Ес-області, які мають нативну послідовність і варіанти Ес-областей. Ес-область дос містить СН2-домен Ідс і СНЗ-домен до. "СН2-домен" Ес- області людського Ід, як правило, простягається від амінокислотного залишку, розташованого приблизно в положенні 231, до амінокислотного залишку, розташованого приблизно в положенні 340. В одному з варіантів здійснення винаходу до СН2г-домену приєднаний вуглеводний ланцюг. В контексті даного опису СН2-домен може представляти собою СН2- домен, що має нативну послідовність або варіант СН2-домена. "СНЗ-домен" містить сегмент із залишків С-кінцевих відносно СН2-домена в Ес-області (тобто, починаючи з амінокислотного залишку, розташованого приблизно в положенні 341, до амінокислотного залишку, розташованого приблизно в положенні 447 Ід). В контексті даного опису СНЗ-ділянка може представляти собою що має нативну послідовність СНЗ-домен або варіант СНЗ-домена (наприклад, СНЗ-домен з інтродукованою "випуклістю" ("виступ") в одному ланцюзі й відповідною інтродукованою "порожниною" ("западина") в іншому ланцюзі; див. ШО Мо 5821333, спеціально включений в даний опис як посилання). Зазначені варіанти СНЗ-доменів можна застосовувати для посилення гетеродимеризації двох неідентичних важких ланцюгів імуноглобуліну, відповідно до зазначеного в даному описі методу. В одному з варіантів бо здійснення винаходу Ес-область важкого ланцюга людського до простягається від Суз226 або від Рго230 до карбоксильного кінця важкого ланцюга. Однак С-кінцевий лізин (ІГуз447) Ес- області може або бути присутнім, або може бути відсутнім. Якщо в даному описі спеціально не зазначено інше, то нумерацію амінокислотних залишків в Ес-області або константної області здійснювали відповідно до системи нумерації ЕМ, яку називають також ЕО-індексом, описаної у
Кабаї та ін., зедцепсеб5 ої Ргоївіп5 ої Іттипоїодіса! Іпіегеб5і, 5-е вид., вид-во Рибіїс Неакп
Зегмісе, Маїййопаї Іпзійшез ої Неайй, Веїпезаа, МО, 1991.
Поняття "ефекторні функції" відноситься до видів біологічної активності, притаманних Ес- області імуноглобуліну, які варіюються залежно від ізотипу імуноглобуліну. Прикладами ефекторних функцій імуноглобулінів є: здатність зв'язуватися з Сід і комплементзалежна цитотоксичність (СОС), здатність зв'язуватися з Есо-рецептором, антитіло-зумовлена клітиннозалежна цитотоксичність (А0СС), антитіло-зумовлений клітиннозалежний фагоцитоз (АОСР), секреція цитокінів, опосередковане імунним комплексом поглинання антигену антигенпрезентувальними клітинами, знижувальна регуляція рецепторів клітинної поверхні (наприклад, В-клітинного рецептора); і активація В-клітин. "Активувальний Ес-рецептор" представляє собою Ес-рецептор, який після взаємодії з Ес- областю імуноглобуліну викликає процес передачі сигналів, які стимулюють несучу рецептор клітину відносно здійснення ефекторних функцій. Активувальні Ес-рецептори охоплюють
ЕсукШа (СО16ба), ЕсукІ (СО64), ЕсуКІПа (СО32) і ЕсоКІ (2089). Конкретним активувальним Ес- рецептором є людський ЕсукІПШа (див. ОпіРгої, реєстраційний Мо РО8637 (версія 141)).
В контексті даного опису поняття "інтерлейкін-2" або "І/-2", якщо не зазначено інше, відноситься до будь-якого нативного ІЇ--2 з будь-якої застосовної як джерело хребетної тварини, включаючи ссавців, таких як примати (наприклад, людина) і гризуни (наприклад, миші й щури).
Під поняття підпадає непроцесований І!--2, а також будь-яка форма 1-2, одержана в результаті процесингу в клітині. Під поняття підпадають також наявні в природних умовах варіанти І/--2, наприклад, сплайсингові варіанти або алельні варіанти. Наведена як приклад амінокислотна послідовність людського ІЇ/-2 представлена в 5ЕО ІЮ МО: 1. Непроцесований людський 1-2 додатково містить розташований на М-кінці сигнальний пептид, який складається з 20 амінокислот, який відсутній в зрілій молекулі 1-2.
Під "нативним ІІ -2", який позначають також як "1-2 дикого типу", мають на увазі наявний в
Зо природних умовах 1-2. Послідовність молекули нативного людського 1-2 представлена в ЗЕО
ІО МО: 1. Для цілей даного винаходу під поняття дикий тип підпадають також форми 1-2, які містять одну або декілька амінокислотних мутацій, які не змінюють зв'язування з рецептором І-- 2 у порівнянні з наявним в природних умовах нативним 1-2, наприклад, заміну цистеїну в положенні, що відповідає залишку 125 людського ІІ--2, на аланін. В деяких варіантах здійснення винаходу 1-2 дикого типу для цілей даного винаходу містить амінокислотну заміну С125А (див.
ЗЕО ІЮО МО: 3).
В контексті даного опису поняття "СО25" або «а-субодиниця рецептора 1-2", якщо не зазначено інше, відноситься до будь-якої нативної форми СО25 з будь-якої застосовної як джерело хребетної тварини, включаючи ссавців, таких як примати (наприклад, людина) і гризуни (наприклад, миші й щури). Під це поняття підпадає "повнорозмірна" непроцесована форма СО25, а також будь-яка форма СО25, одержана в результаті процесингу в клітині. Під поняття підпадають також наявні в природних умовах варіанти СО25, наприклад, сплайсингові варіанти або алельні варіанти. В деяких варіантах здійснення винаходу СО25 представляє собою людську форму СО25. Як приклад амінокислотна послідовність людської форми СО25 (з сигнальною послідовністю, Амі-міткою і Ніб-міткою) представлена в ЗЕО ІЮО МО: 25.
В контексті даного опису поняття "високоафінний рецептор 1/-2" відноситься до гетеротримерної форми рецептора 1-2, що складається з рецепторної у-субодиниці (яка відома також як загальна у-субодиниця цитокінового рецептора, ус, або СО132), рецепторної рД- субодиниці (відомої також як СО122 або р70) і рецепторної са-субодиниці (відомої також як СО25 або р55). На противагу цьому, поняття "рецептор 1-2 з проміжною афінністю" або рецептор ЇЇ - 2Ву відноситься до рецептору 1-2, який охоплює тільки у-субодиницю і ВД-субодиницю, але не містить а-субодиниці (див., наприклад, огляд Оіе|пісгак і Казрглак, Мей Зсі Мопії 14, 2008,
ВА179-189). Амінокислотні послідовності людських СО122 і СО132 (злитих з Ес-областю за допомогою Нів-мітки), які служать як приклади, представлені в ЗЕО ІЮО МО: 21 і 23 відповідно.
Під "регуляторною Т-клітиною" або "Тгед-клітиною" мають на увазі спеціалізований тип бОраз-Т-клітини, яка може пригнічувати відповіді інших Т-клітин (ефекторних Т-клітин). Тгед- клітини відрізняються здатністю експресувати а-субодиницю рецептора 1-2 (С0О25) і фактор транскрипції тогкпеай рох РЗ (РОХРЗ) (Закадиспі, Аппи Кем Іттипої 22, 2004, со. 531-562), і вони грають вирішальну роль в індукції і підтриманні периферійної аутотолерантності до бо антигенів, включаючи ті антигени, які експресуються пухлинами.
Під "канонічними СО4--Т-клітинами" мають на увазі СО4--Т-клітини, відмінні від регуляторних Т-клітин. канонічні СО4--Т-клітини пам'яті відрізняються тем, що вони експресують ср4, СО3, але не експресують ЕОХРЗ. "канонічні СО4--Т-клітини пам'яті" представляють собою субпопуляцію канонічних СО4--Т-клітин, які додатково відрізняються тем, що не експресують
СОр45КА на відміну від "канонічних наївних СО4--Т-клітин", які експресують СО45КА.
Під "вибірковою активацією Тгед-клітин" мають на увазі активацію Тгед-клітин практично без супутньої активації інших субпопуляцій Т-клітин (таких як СО4--Т-клітини-хелпери, цитотоксичні
СО8:-Т-клітини, МК-Т-клітини) або природні клітини-кілери (МК)). Методи ідентифікації та розрізняння цих типів клітин описані в прикладах. Активація може охоплювати індукцію передачі сигналів через І-2-рецептор (що вимірюють, наприклад, шляхом оцінки фосфорильованого
ЗТАТ5а), індукцію проліферації (що вимірюють, наприклад, шляхом оцінки Кі-67) і/або активацію, яка підвищує регуляцію експресії маркерів (таких, наприклад, як СО25).
Поняття "пептидний лінкер" відноситься до пептиду, що містить одну або декілька амінокислот, як правило, приблизно 2-20 амінокислот. Пептидні лінкери відомі в даній галузі й зазначені в даному описі. Прийнятні неімуногенні пептидні лінкери охоплюють, наприклад, пептидні лінкери ((545)п, (ЗС14)л або б4(5С4)п. "п" звичайно означає число від 1 до 10, як правило, від2 до 4.
Поняття "модифікація" відноситься до будь-якої маніпуляції, яка торкається пептидного каркасу (наприклад, амінокислотну послідовність), або до пост-трансляційних модифікацій (наприклад, глікозилювання) поліпептиду.
Поняття "модифікація по типу "Кпоб-іпіо-поІе»(забезпечення взаємодії по типу "виступ в западину") відноситься до модифікації в поверхні розділу між двома важкими ланцюгами імуноглобуліну в СНЗ-домені, при якій І) в СНЗ-домене одного важкого ланцюга амінокислотний залишок замінюють на амінокислотний залишок, що має більший об'єм бічного ланцюга, створюючи тем самим випуклість ("виступ") на поверхні розділу в СНЗ-домені одного важкого ланцюга, яка може поміщатися в порожнину ("западину") в поверхні розділу СНЗ-домена іншого важкого ланцюга, і ІЇ) в СНЗ-домені іншого важкого ланцюга амінокислотний залишок замінюють на амінокислотний залишок, що має менший об'єм бічного ланцюга, створюючи тим самим порожнину ("западину") в поверхні розділу другого СНЗ-домену, в яку може поміщатися
Зо випуклість ("виступ") на поверхні розділу першого СНЗ-домену. В одному з варіантів здійснення винаходу "модифікація Кпоб-іпіо-поїе" охоплює амінокислотну заміну Т36бУМ і необов'язково амінокислотну заміну 5354С в одному з важких ланцюгів антитіла й амінокислотні заміни Т3665,
Ї368А, у407М і необов'язково У349С в іншому одному з важких ланцюгів антитіла. Технологія "Кпоб-іпіо-поЇе" описана, наприклад, в ОБ Мо 5731168; 05 Мо 7695936; у Кіддугау та ін., Ргої Епа 9, 1996, сс. 617-621 і у Сагпег, У Іттипої Меїйп 248, 2001, сс. 7-15. Як правило, метод полягає в тому, що інтродукують випуклість ("виступ") на поверхню розділу першого поліпептиду і відповідну порожнину ("западину") в поверхні розділу другого поліпептиду, так, щоб випуклість могла поміщатися в порожнину, полегшуючи утворення гетеродимера та перешкоджаючи утворенню гомодимера. Випуклості створюють шляхом заміни амінокислот з невеликими бічними ланцюгами на поверхні розділу першого поліпептиду на амінокислоти з більш крупними бічними ланцюгами (наприклад, тирозин або триптофан). Компенсувальні порожнини ідентичного або подібного розміру, ніж випуклості, створюють в поверхні розділу другого поліпептиду шляхом заміни амінокислот з крупними бічними ланцюгами на амінокислоти з бічними ланцюгами меншого розміру (наприклад, аланін або треонін). Інтродукція двох залишків цистеїну в положенні 5354 та У349 відповідно, призводить до утворення дисульфідного мостика між двома важкими ланцюгами антитіла в Ес-області, яке додатково стабілізує димер (Сапег,
Ітітипої Меїпоаз» 248, 2001, со. 7-15).
Амінокислотна "заміна" означає заміну в поліпептиді одної амінокислоти на іншу амінокислоту. В одному з варіантів здійснення винаходу амінокислоту замінюють на іншу амінокислоту, що має схожі структурні й/або хімічні властивості, наприклад, здійснюють консервативні амінокислотні заміни. "Консервативні" амінокислотні заміни можна здійснювати на основі схожості в полярності, полярності, заряді, розчинності, гідрофобній, гідрофільній та/або амфіпатічній структурі залишків. Наприклад, до неполярних (гідрофобних) амінокислот відносяться аланін, лейцин, ізолейцин, валін, пролін, фенілаланін, триптофан та метіонін; до полярних нейтральних амінокислот відносяться гліцин, серин, треонін, цистеїн, тирозин, аспарагін та глутамін; до позитивно заряджених (основних) амінокислот відносяться аргінін, лізин та гістидин; та до негативно заряджених (кислотних) амінокислот відносяться аспарагінова кислота та глутамінова кислота. Неконсервативні заміни повинні призводити до обміну представника одного з цих класів на представника іншого класу. Наприклад, амінокислотні бо заміни можуть призводити також до заміни однієї амінокислоти на іншу амінокислоту, що має інші структурні та/або хімічні властивості, наприклад, заміну амінокислоти з однієї групи (наприклад, полярну) на іншу амінокислоту з іншої групи (наприклад, основну). Амінокислотні заміни можна створювати, використовуючи генетичні або хімічні методи, добре відомі в даній галузі. Генетичні методи можуть охоплювати сайтспрямований мутагенез, ПЛР, синтез генів тощо. Мають на увазі що можна використовувати методи зміни групи бічного ланцюга амінокислоти за допомогою методів, відмінних від методів генетичної інженерії, таких як хімічна модифікація. В контексті даного опису можна застосовувати різні позначення однієї та тієї ж самої амінокислотної заміни. Наприклад, заміну проліну в положенні 329 важкого ланцюга імуноглобуліну на гліцин можна позначати як 3290, (3329, Озго, РЗ290 або Рго32901у. "Процент (95) ідентичності амінокислотної послідовності" відносно поліпептидної референс- послідовності визначають як процент амінокислотних залишків в послідовності-кандидаті, які ідентичні амінокислотним залишкам в поліпептидній референс-послідовності, після вирівнювання послідовностей та інтродукції при необхідності прогалин для досягнення максимального відсотку ідентичності послідовностей, та при цьому будь-які консервативні заміни не враховують при оцінюванні ідентичності послідовностей. Порівняльний аналіз для визначення процента ідентичності амінокислотних послідовностей можна здійснювати різними шляхами, які знаходяться в компетенції спеціаліста в даній галузі, наприклад, з використанням публічно доступних комп'ютерних програм, таких як програма ВІ А5Т, ВІ АБТ-2, АГІОМ або
Медаїїдп (ОМАЗТАК). Спеціалісти в даній галузі можуть визначати відповідні параметри для вирівнювання послідовностей, включаючи будь-які алгоритми, необхідні для досягнення максимального вирівнювання по всій довжині порівнюваних послідовностей. Однак для цілей даного винаходу величину бо ідентичності амінокислотних послідовностей одержують з використанням призначеної для порівняння послідовностей комп'ютерної програми АСІСМ-2.
Призначена для порівняння послідовностей комп'ютерна програма АГІСМ-2 розроблена фірмою
Сепепіесі, Іпс., і вихідний код поміщений на зберігання разом з документацією для користувача в 0.5. Соругідпі ОПісе, Умазпіпдіоп О0.С., 20559, де він зареєстрований під реєстраційним номером ИШ.5. Соругідйї Кедівігайоп Мо ТХИ510087. Програма АГІСМ-2 представляє собою публічно доступну програму фірми Сепепіесі, Іпс., Південний Сан-Франциско, шт. Каліфорнія, або її можна компілювати з вихідного коду. Програму АГІОМ-2 можна компілювати для
Зо застосування в операційній системі ОМІХ, включаючи цифрову версію ОМІХ М4.00. В програмі
АЦОМ-2 всі параметри для порівняння послідовностей є заданими і не повинні змінюватися. В ситуаціях, коли АГІСМ-2 застосовують для порівняння амінокислотних послідовностей, 90 ідентичності амінокислотних послідовностей для дано амінокислотної послідовності А відносно або у порівнянні з даною амінокислотної послідовністю Б (що іншими словами можна позначати як те, що дана амінокислотна послідовність А має або відрізняється визначеним 95 ідентичності амінокислотної послідовності відносно або у порівнянні з даною амінокислотною послідовністю
Б), розраховують наступним чином: 100хчастка Х/У, де Х означає кількість амінокислотних залишків, оцінених програмою порівняльного аналізу послідовностей АЇЇСМ-2 як ідентичні збіги при порівняльному аналізі послідовностей А і Б за допомогою зазначеної програми, і де У означає загальну кількість амінокислотних залишків в Б.
Повинно бути очевидним, що, коли довжина амінокислотної послідовності А не дорівнює довжині амінокислотної послідовності Б, то 95 ідентичності амінокислотної послідовності А відносно амінокислотної послідовності Б не повинний бути рівним 95 ідентичності амінокислотної послідовності Б відносно амінокислотної послідовності А. Якщо спеціально не зазначено інше, то в контексті даного опису все величини 95 ідентичності амінокислотних послідовностей одержують відповідно до процедури, описаної в останньому з попередніх параграфів, за допомогою комп'ютерної програми АГІСМ-2.
Поняття "полінуклеотид" або "нуклеїнова кислота", яке застосовують взаємозаміно в контексті даного опису, відноситься до полімерів нуклеотидів будь-якої довжини й охоплює ДНК і РНК. Нуклеотиди можуть представляти собою дезоксирибонуклеотиди, рибонуклеотиди, модифіковані нуклеотиди або основи й/або їх аналоги, або будь-який субстрат, який можна включати в полімер за допомогою ДНК- або РНК-полімераз або за допомогою реакції синтезу.
Полінуклеотид може містити модифіковані нуклеотиди, такі як метильовані нуклеотиди та їх аналоги. В послідовності нуклеотидів можуть бути присутніми сполуки, що не відносять до нуклеотидів. Полінуклеотид може містити модифікаціюй(і), створену(ї) після синтезу, таку(і) як кон'югація з міткою.
Під нуклеїновою кислотою або полінуклеотидом, що має нуклеотидну послідовність, яка, наприклад, на 95 95 "ідентична" нуклеотидній референс-послідовності, що запропонована в 60 даному винаході, мають на увазі нуклеотидну послідовність полінуклеотиду, ідентичну референс-послідовності за виключенням того, що полінуклеотидна послідовність може охоплювати аж до 5 точкових мутацій на кожні 100 нуклеотидів нуклеотидної референс- послідовності. Іншими словами, для одержання полінуклеотиду, що має нуклеотидну послідовність, яка ідентична щонайменше на 95 95 нуклеотидній референс-послідовності, аж до 595 нуклеотидів в референс-послідовності можна вилучати шляхом делеції або заміняти на інший нуклеотид, або аж до 5 95 нуклеотидів від загальної кількості нуклеотидів в референс- послідовності можна вбудовувати в референс-послідовність. Ці вимірювання референс- послідовності можуть мати місце в положеннях на 5- або 3'-кінці нуклеотидної референс- послідовності або в іншому положенні між цими кінцевими положеннями, і їх вбудовують або індивідуально між залишками в референс-послідовності, або їх вбудовують в референс- послідовність у вигляді однієї або декількох суміжних груп. На практиці рішення питання про те, чи є ідентичною конкретна полінуклеотидна послідовність щонайменше на 80 95, 85 95, 90 Об, 95 95, 96 95, 97 Уо, 98 95 або 9995 нуклеотидної послідовності, що запропонована в даному винаході, можна вирішити, як правило, з використанням відомих комп'ютерних програм, наприклад, зазначених вище для поліпептидів (наприклад, АГІОМ-2).
В контексті даного опису поняття "вектор" відноситься до молекули нуклеїнової кислоти, яка має здатність збільшувати кількість іншої нуклеїнової кислоти, з якою вона пов'язана. Поняття охоплює вектор у вигляді здатної до самореплікації структури нуклеїнової кислоти, а також вектор, включений в геном клітини-хазяїна, в яку він інтродукований. Деякі вектори мають здатність забезпечувати експресію нуклеїнових кислот, з якими вони функціонально зв'язані. В контексті даного опису зазначені вектори позначають як "експресійні вектори".
В контексті даного опису поняття "клітина-хазяїн", "лінія клітин-хазяїв" і "культура клітин- хазяїв" застосовують взаємозаміно, і вони відносяться до клітин, в які інтродукована екзогенна нуклеїнова кислота, включаючи потомство зазначених клітин. Клітини-хазяї охоплюють "трансформанти" і "трансформовані клітини", які охоплюють первинні трансформовані клітини, а також виведене з них потомство, незалежно від кількості пересівів. Потомство може не бути строго ідентичним батьківській клітині за складом нуклеїнових кислот, а може нести мутації. Під дане поняття підпадає мутантне потомство, яке має таку ж саму функцію або біологічну активність, що і відібрана шляхом скринінгу або селекції вихідна трансформована клітина.
Зо Клітина-хазяїн представляє собою будь-який тип клітинної системи, яку можна застосовувати для створення злитих білків, запропонованих у даному винаході. Клітини-хазяї охоплюють (але, не обмежуючись тільки ними) вирощувані клітини, наприклад, вирощувані клітини ссавців, такі як СНО-клітини, ВНК-клітини, М5О-клітини, ЗР2/О-клітини, ХО-клітини мієломи, РЗ х 63-клітини мишачої мієломи, РЕК-клітини, РЕК.Сб-клітини або клітини гібридоми, клітини дріжджів, клітини комах і клітини рослин, але також клітини, що знаходяться в трансгенній тварині, трансгенній рослині або вирощуваній тканині рослині або тварини.
Поняття "ефективна кількість" агенту відноситься до кількості, необхідної для досягнення фізіологічного вимірювання в клітині або тканини, в яку його вводять. "Терапевтично ефективна кількість" агенту, наприклад, фармацевтичної композиції, означає кількість, ефективну в дозах і протягом періодів часу, необхідних для досягнення потрібного терапевтичного або профілактичного результату. Агент в терапевтично ефективній кількості, наприклад, елімінує, знижує, уповільнює, мінімізує або попереджає небажані дії захворювання. "Індивідуум" або "суб'єкт" представляє собою ссавця. Ссавці представляють собою (але, не обмежуючись тільки ними) свійських тварин (наприклад, корови, вівці, кішки, собаки і коні), приматів (наприклад, люди і примати окрім людини, такі як мартишки), кроликів і гризунів (наприклад, миші і щури). Переважно індивідуум або суб'єкт представляє собою людину.
Поняття "фармацевтична композиція" відноситься до препарату, який знаходиться в такій формі, в якій він забезпечує біологічну активність діючої речовини, яка входить до його складу, яка повинна мати ефективність, і яка не містить додаткових компонентів, які мають неприйнятну токсичність для індивідуума, якому слід вводити композицію. "Фармацевтично прийнятний носій" відноситься до інгредієнта в фармацевтичній композиції, що відрізняється від діючої речовини, який є нетоксичним для індивідуума. Фармацевтично прийнятні носії охоплюють (але, не обмежуючись тільки ними) буфер, ексципієнт, стабілізатор або консервант.
В контексті даного опису поняття "лікування" (і його граматичні варіації, такі як "лікувати" або "процес лікування") відноситься до клінічного втручання з метою вимірювання природного перебігу хвороби в індивідуума, який підлягає лікуванню, і його можна здійснювати або для профілактики або в процесі розвитку клінічної патології. Необхідними діями лікування є (але, не обмежуючись тільки ними) попередження виникнення або рецидиву хвороби, полегшення 60 симптомів, зменшення будь-яких прямих або непрямих патологічних наслідків хвороби,
попередження метастазів, зниження швидкості розвитку хвороби, полегшення або тимчасове послаблення хворобливого стану і ремісія або покращення прогнозу. В деяких варіантах здійснення винаходу антитіла, запропоновані у винаході, застосовують для затримки розвитку хвороби або уповільнення прогресування хвороби.
Поняття "аутоїмунне захворювання" відноситься до незлоякісного захворювання або порушення, що виникає у власних тканинах пацієнта й спрямованого проти власних тканини.
Приклади аутоїмунних захворювань або порушень включають (але, не обмежуючись тільки ними) запальні відповіді, такі як шкіряні запальні захворювання, включаючи псоріаз і дерматит (наприклад, атопічний дерматит); відповіді, асоційовані з запальними захворюваннями кишкового тракту (такі як хвороба Крона і неспецифічний виразковий коліт); дерматит; алергійні стани, такі як екзема і астма; ревматоїдний артрит; системний червоний вовчак (51 Е) (включаючи (але, не обмежуючись тільки ними) вовчаковий нефрит, шкіряний вовчак); цукровий діабет (наприклад, цукровий діабет типу 1 або інсулінозалежний цукровий діабет); розсіяний склероз і юнацький діабет.
Злиті білки, запропоновані у винаході
У винаході запропоновані нові злиті білки імуноглобулін-ІІ -2, які мають найбільш переважні властивості для застосування в терапевтичних методах, представлених в даному описі.
Першим об'єктом даного винаходу є злитий білок, що містить (І) молекулу імуноглобуліну і (І) дві мутантні молекули інтерлейкіну-2 (І/-2), що мають амінокислотну мутацію, яка знижує афінність мутантної молекули 1І--2 до рецептора ІІ--2, який має проміжну афінність у порівнянні з молекулою 1-2 дикого типу.
В одному з варіантів здійснення винаходу зазначений злитий білок практично складається з молекули імуноглобуліну, двох мутантних молекул інтерлейкіну-2 (1-2), що мають амінокислотну мутацію, знижує афінність мутантної молекули 1-2 до рецептора 1-2, який має проміжну афінність у порівнянні з молекулою ІЇ-2 дикого типу, і необов'язково одного або декількох пептидних лінкерів.
Як продемонстровано в розділі "Приклади", несподіваним чином було встановлено, що злитий білок, що містить дві молекули //-2, має суттєво більш високу ефективність і селективність відносно активації регуляторних Т-клітин у порівнянні з відповідним злитим
Зо білком, що містять одну молекулу 1-2. Окрім того, тільки злитий білок, що містить дві (на відміну від який містить тільки одну) мутантні молекули ІЇ/-2 зі зниженою здатність до зв'язування з рецептором 1-2, який має проміжну афінність, зберігає значну стимулювальну активність відносно регуляторних Т-клітин.
В одному з варіантів здійснення винаходу зазначена молекула імуноглобуліну представляє собою молекулу імуноглобуліну Ідо-класу, насамперед молекулу імуноглобуліну Ідс:-підкласу.
В одному з варіантів здійснення винаходу зазначена молекула імуноглобуліну представляє собою людську молекулу імуноглобуліну, тобто вона містить повністю людські варіабельні й константні області. Наведена як приклад послідовність константної області людського досі представлена в ЗЕО ІОЮ МО: 8. Молекула імуноглобуліну ІдО-класу містить (І) дві легкие ланцюги імуноглобуліну, кожна з яких містить у напрямку від М- до С-кінця варіабельний домен легкого ланцюга (МІ) і константний домен легкого ланцюга (СІ), і (ІІ) два важкі ланцюги імуноглобуліну, кожний з яких містить у напрямку від М-кінця до С-кінця варіабельний домен важкого ланцюга (МН), константний домен 1 важкого ланцюга (СНІ), шарнірну область імуноглобуліну, СН2- домен і СНЗ-домен. Два останніх домени утворюють частину Ро-області молекули імуноглобуліну. Два важкі ланцюги димеризовані в Ес-області.
В одному з варіантів злитого білка, згідно з винаходом, кожна із зазначених двох молекул мутантного І/-2 злита на своїй М-кінцевій амінокислоті з С-кіндцевою амінокислотою одного з імуноглобулінових важких ланцюгів зазначеної молекули імуноглобуліну, необов'язково через пептидний лінкер. Злиття двох (ідентичних) молекул 1-2 з важкими ланцюгами імуноглобуліну полегшує одержання злитого білка, дозволяючи уникати утворення небажаних побічних продуктів і дозволяючи усувати необхідність в модифікаціях, які посилюють гетеродимеризацію неідентичних важких ланцюгів, таких як модифікація "Кпоб-іпіо-поїе".
В деяких варіантах злитого білка, згідно з винаходом, зазначені дві мутантні молекули 1-2 злити із зазначеною молекулою імуноглобуліну через пептидний лінкер. В одному з варіантів здійснення винаходу кожна із зазначених двох мутантних молекул 1-2 злита із зазначеною молекулою імуноглобуліну через пептидний лінкер. В одному з варіантів здійснення винаходу кожна із зазначених двох мутантних молекул 1-2 злита на своїй М-кінцевій амінокислоті з С- кінцевою амінокислотою одного з імуноглобулінових важких ланцюгів зазначеної молекули імуноглобуліну через пептидний лінкер. В одному з варіантів здійснення винаходу кожна із бо зазначених мутантних молекул ІЇ-2 злита із зазначеною молекулою імуноглобуліну через пептидний лінкер, що має ідентичну амінокислотну послідовність. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначений пептидний лінкер містить щонайменше 10 амінокислот. В конкретному варіанті здійснення винаходу зазначений пептидний лінкер містить щонайменше 15 амінокислот. Не прив'язуючись до конкретної теорії, можна вважати, що пептидний лінкер такої довжини може забезпечувати гнучкість для оптимального зв'язування мутантних молекул
І -2 з рецептором 1-2, насамперед з високоафінним (гетеротримерним) рецептором 1-2. В конкретному варіанті здійснення винаходу зазначений пептидний лінкер містить 15 амінокислот.
В ще більш конкретному варіанті здійснення винаходу зазначений пептидний лінкер містить амінокислотну послідовність (545)з (ЗЕО ІЮ МО: 66). В одному з варіантів здійснення винаходу зазначений пептидний лінкер має довжину 15 амінокислот. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначений пептидний лінкер має амінокислотну послідовність (545)з (ЗЕО ІЮ МО: 66).
В одному з варіантів здійснення винаходу зазначений пептидний лінкер складається з 15 амінокислот. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначений пептидний лінкер складається з амінокислотної послідовності (545)з (ЗЕО ІО МО: 66).
Злиття молекул 1-2 з молекулою імуноглобуліну забезпечує сприятливі фармакокінетичні властивості, включаючи тривалий час напівжиття в сироватці (внаслідок рециркуляції через зв'язування з ЕсКп і завдяки тому, що молекулярний розмір в достатньому ступені перевищує пороговий для ниркової фільтрації), у порівнянні з вільним (незлитим) 1//-2. Окрім того, присутність молекули імуноглобуліну може полегшувати також очистку злитих білків, наприклад, з використанням афінної хроматографії на білку А. Важно зауважити, що, як продемонстровано в розділі "Приклади", злитий білок, що містить дві мутантні молекули ІЇ-2 з пониженою афінністю до зв'язування з рецептором 1І--2, який має проміжну афінність, має більш тривалий час напівжиття в сироватці, ніж відповідний злитий білок, що містить дві молекули 1-2 дикого типу. Злиття з молекулою імуноглобуліну, тобто з наявним в природних умовах типом молекули, може також мінімізувати токсичність злитого білл«а шляхом утворення антитіл до лікарського засобу.
Хоча присутність молекули імуноглобуліну, насамперед Ес-області молекули імуноглобуліну, має сприятливий вплив на фармакокінетичні характеристики злитого білка, вона може призводити в той самий час до небажаного спрямованого впливу злитого білка на клітини,
Зо що експресують Ес-рецептори, а не на переважні клітини, які несуть рецептор 1-2. Окрім того, втягнення Ес-рецепторів може приводити до вивільнення (прозапальних) цитокінів і небажаної активації різних імунних клітин, що відрізняються від регуляторних Т-клітин. З цієї причини зазначена молекула імуноглобуліну, яка входить у злитий білок, відповідно до винаходу, містить модифікацію, яка знижує афінність зв'язування молекули імуноглобуліну з Ес-рецептором у порівнянні з відповідною молекулою імуноглобуліну без зазначеної модифікації. В конкретному варіанті здійснення винаходу зазначений Ес-рецептор представляє собою Есу-рецептор, насамперед, людський Есу-рецептор. Афінність зв'язування з Ес-рецепторами можна легко визначати, наприклад, за допомогою ЕГІЗА або поверхневого плазмонного резонансу (ЗРК), застосовуючи стандартний інструментарій, такий як пристрій ВіАсоге (фірма СЕ Неайсаге), а самі Ес-рецептори можна одержувати за допомогою рекомбінантної експресії. Конкретний ілюстративний і наведений як приклад варіант вимірювання афінності зв'язування описаний нижче. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу афінність зв'язування з Ес- рецептором вимірюють за допомогою поверхневого плазмонного резонансу, застосовуючи пристрій ВІАСОКЕФ Т100 (фірма СЕ Неакйрсаге), при 259С використовуючи ліганд (Ес- рецептор), іммобілізований на СМ5-чипах. В цілому, метод полягав у наступному: біосенсорні чипи з карбоксиметильованого декстрану (СМ5, фірма СЕ Неайвсаге) активували за допомогою гідрохлориду М-етил-М'-(З3-диметиламінопропілукарбодиїіміду (ЕЮС) і М-гідроксисукциніміду (МН) відповідно до інструкцій виробника. Рекомбінантний ліганд розводили 10мММ ацетатом натрію, рН 5,5 до концентрації 0,5-30 мкг/мл перед ін'єкцією зі швидкістю потоку 10 мкл/хв. для досягнення рівня зв'язування злитого білка, що відповідає приблизно 100-5000 одиниць відповіді (КО). Після ін'єкції ліганда ін'єкували 1М етаноламін для блокади непрореагованих груп. Для кінетичних вимірювань ін'єкували трьох-п'ятикратні серійні розведення антитіла (діапазон від «0,01 до ЗООнНМ) в буфері НВЗ-ЕР-- (фірма СЕ Неасаге, 10ММ НЕРЕЗ, 150МмМ масі, ЗмМ ЕДТК, 0,05 95 сурфактанту Р20, рН 7,4) при 252С зі швидкістю потоку приблизно 30- 50 мкл/хв. Швидкість реакції асоціації (Копг) і реакції дисоціації (Ко) розраховували з використанням простої моделі зв'язування Ленгмюра 1:1 (програма оцінки ВІАСОКЕФ Т100, версія 1.1.1) шляхом одночасної апроксимації сенсограм асоціації і дисоціації. Константу рівноваги реакції дисоціації (Ко) розраховували у вигляді відношення Конй/Коп (див., наприклад,
Спеп та ін., У Мої Віо! 293, 1999, сс. 865-881). Альтернативно до цього, афінність зв'язування 60 антитіл з Ес-рецепторами можна оцінювати, застосовуючи клітинні лінії, які, як відомо,
експресують конкретні Ес-рецептори, наприклад, МК-клітини, що експресують ЕсуПШа-рецептор.
В одному з варіантів здійснення винаходу модифікація охоплює одну або декілька амінокислотних мутацій, які знижують афінність зв'язування імуноглобуліну з Ес-рецептором. В одному з варіантів здійснення винаходу амінокислотна мутація представляє собою амінокислотну заміну. Як правило, одна або декілька однакових амінокислотних мутацій присутні в кожному з двох важких ланцюгів імуноглобуліну. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначена амінокислотна мутація знижує афінність зв'язування імуноглобуліну з Ес- рецептором щонайменше в 2 рази, щонайменше в 5 разів або щонайменше в 10 разів. У варіантах здійснення винаходу, в яких було присутніми більше однієї амінокислотної мутації, що знижує афінність зв'язування імуноглобуліну з Ес-рецептором, комбінація цих амінокислотних мутацій могла знижувати афінність зв'язування імуноглобуліну з Ес-рецептором щонайменше в 10 разів, щонайменше в 20 разів або навіть щонайменше в 50 разів. В одному з варіантів здійснення винаходу для зазначеної молекули імуноглобуліну характерно менше 20 95, переважно менше 1095, більш переважно менше 595 від афінності зв'язування з Ес- рецептором, характерної для відповідної молекули імуноглобуліну без зазначеної модифікації.
В одному з варіантів здійснення винаходу зазначений Ес-рецептор представляє собою активувальний Ес-рецептор. В конкретному варіанті здійснення винаходу зазначений Ес- рецептор вибирають з групи, що містить ЕсукШа (СО16ба), ЕсукІ (СО64), ЕсукКПа (СО32) і ЕсагіІ (С0О89). В конкретному варіанті здійснення винаходу Ес-рецептор представляє собою Есу- рецептор, більш конкретно рецептор ЕсукКШа, Есук!І або ЕсукІПа. Переважно знижується афінність зв'язування з кожним з цих рецепторів. У ще більш конкретному варіанті здійснення винаходу зазначений Ес-рецептор представляє собою ЕсуПа, насамперед, людський ЕсуПіа.
Згідно з деякими варіантам здійснення винаходу знижується також афінність зв'язування з компонентом системи комплементу, зокрема, афінність зв'язування з С1д. Згідно з одним з варіантів здійснення винаходу не знижується афінність зв'язування з неонатальним Ес- рецептором (ЕБсКп). Практично таке же саме зв'язування з ЕсКп, тобто зберігання афінності зв'язування молекули імуноглобуліну із зазначеним рецептором, досягають, коли молекула імуноглобуліну характеризується афінність зв'язування з ЕсКп, що складає більш ніж приблизно 7095 від афінності зв'язування з ЕРсКп немодифікованої форми молекули імуноглобуліну.
Зо Молекули імуноглобуліну, що входять у злиті білки, запропоновані у винаході, можуть характеризуватися афінністю, що складає більш ніж приблизно 8095 і навіть більше ніж приблизно 90 95 від зазначеної афінності.
В одному з варіантів здійснення винаходу зазначена модифікація, яка знижує афінність зв'язування молекули імуноглобуліну з Ес-рецептором, знаходиться в Ес-області, насамперед, в
СНг-області, молекули імуноглобуліну. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначена молекула імуноглобуліну містить амінокислотну заміну в положенні 329 (ЕО-нумерація) важких ланцюгів імуноглобуліну. В більш конкретному варіанті здійснення винаходу зазначена амінокислотна заміна представляє собою РЗ29А або РЗ3290, насамперед РЗ32906. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначена молекула імуноглобуліну містить амінокислотні заміни в положеннях 234 і 235 (ЕО-нумерація) важких ланцюгів імуноглобуліну. В конкретному варіанті здійснення винаходу зазначені амінокислотні заміни представляють собою 1234А і 1235А (ГАГА). В одному з варіантів здійснення винаходу зазначена молекула імуноглобуліну містить амінокислотну заміну в положенні 329 (ЕО-нумерація) важких ланцюгів антитіла і додаткову амінокислотну заміну в положенні, вибраному з положень 228, 233, 234, 235, 297 і 331 важких ланцюгів імуноглобуліну. В більш конкретному варіанті здійснення винаходу додаткова амінокислотна заміна представляє собою 5228Р, Е2ЗЗР, І 234А, І1235А, І1235Е, М297А, М2970 або РЗ3315. У переважному варіанті здійснення винаходу зазначена молекула імуноглобуліну містить амінокислотні заміни в положеннях РЗ29, І 234 і 1235 (БО-нумерація) важких ланцюгів імуноглобуліну. У більш переважному варіанті здійснення винаходу зазначена молекула імуноглобуліну містить амінокислотні заміни І 234А, 1235А і РЗ296 (ГАГА РЗ3296) у важких ланцюгах імуноглобуліну. Зазначена комбінація амінокислотних замін найбільш ефективно елімінує зв'язування Есу-рецептора з людським імуноглобуліном ІдбС-класу, що описано в публікації РСТ УМО 2012/130831, яка повністю включена в даний опис як посилання. В публікації
РСТ УМО 2012/130831 описані також методи одержання зазначеного модифікованого імуноглобуліну і методи визначення його властивостей, таких як зв'язування Ес-рецептора або ефекторні функції.
Імуноглобуліни, які містять модифікації у важких ланцюгах імуноглобуліну, можна одержувати шляхом амінокислотної делеції, заміни, інсерції або модифікації, застосовуючи генетичні або хімічні методи, добре відомі в даній галузі. Генетичні методи можуть 60 представляти собою сайтспрямований мутагенез кодувальної послідовності ДНК, ПЛР, синтез генів тощо. Правильні нуклеотидні заміни можна підтверджувати, наприклад, секвенуванням.
Імуноглобуліни або антитіла, які містять модифікації, які знижують зв'язування з Ес- рецептором, як правило, мають знижені ефекторні функції, насамперед зниженою АОСС, у порівнянні з відповідними немодифікованими імуноглобулінами або антитілами. Так, в одному з варіантів здійснення винаходу зазначена модифікація, яка знижує афінність зв'язування молекули імуноглобуліну з Ес-рецептором, знижує ефекторну функцію молекули імуноглобуліну. В конкретному варіанті здійснення винаходу зазначена ефекторна функція представляє собою антитіло-зумовлену клітиннозалежну цитотоксичність (АОСС). В одному з варіантів здійснення винаходу АЮОСС знижується до рівня, що складає менше 20 95 від АОСС, індукованої відповідною молекулою імуноглобуліну без зазначеної модифікації. Ефекторну функцію імуноглобуліну або антитіла можна оцінювати за допомогою методів, відомих в даній галузі. Приклади аналізів іп міго для оцінки АЮСсС-активності молекули, яка представляє інтерес, описані в ОБ Мо 5500362; у Неїївігот та ін., Ргос Маї! Асай 5сі О5А 83, 1986, сс. 7059- 7063 ї Неїйїбігот та ін., Ргос Май Асай Зсі ОБА 82, 1985, сс. 1499-1502; 05 Мо 5821337; у
Вгиддетапп та ін., У Ехр Мей 166, 1987, сс. 1351-1361. Альтернативно до цього, можна застосовувати методи аналізи, не основані на вимірюванні радіоактивності (див., наприклад, нерадіоактивний аналіз цитотоксичності АСТІТМ для проточної цитометрії (фірма
СеПТесппоїоду, Іпс. Маунтин-В'ю шт. Каліфорнія); і нерадіоактивний аналіз цитотоксичності
Суютох 962 (фірма Рготеда, Медисон, шт. Вісконсин)). Цінними ефекторними клітинами для таких аналізів є мононуклеарні клітини периферійної крові (РВМС) і природні клітини-кілери (МК). В альтернативному або додатковому варіанті АЮСсС-активність відповідної молекули можна оцінювати іп мімо, наприклад, на тваринній моделі, наприклад, описаній у Сіупез та ін.,
Ргос Май Асай сі ОБА 95, 1998, сс. 652-656. В деяких варіантах здійснення винаходу знижується також зв'язування молекули імуноглобуліну з компонентом системи комплементу, зокрема, з С1д. Таким чином, можна знижувати також комплементзалежну цитотоксичність (СОС). Аналізи зв'язування С1д4 можна здійснювати для вирішення питання про те, чи має імуноглобулін здатність зв'язуватися з С1д і, відповідно, чи має він СОС-активність (див., наприклад, аналіз зв'язування Ст14 і СЗс за допомогою ЕГІ5А, описаний в М/О 2006/029879 ії УМО 2005/100402). Для аналізу активації комплементу можна здійснювати СОС-аналіз (див., наприклад, Са77апо-запіого та ін., У Іттипої Меїйоаз 202, 1996, з.163; Стадд та ін., Віоса 101, 2003, сс. 1045-1052 і Стадд і СІеппіє, Віоса 103, 2004, сс. 2738-2743).
Окрім молекул імуноглобуліну, описаних вище і в публікації РСТ МО 2012/130831, імуноглобуліни зі зниженою здатністю зв'язуватися з Ес-рецептором і/або зниженою ефекторною функцією охоплюють також імуноглобуліни із заміною в Ес-області одного або декількох залишків 238, 265, 269, 270, 297, 327 і 329 (005 Мо 6737056). Зазначені Ес-мутанти охоплюють Ес-мутантів із замінами в двох або більшій кількості амінокислотних положень 265, 269, 270, 297 і 327, включаючи так званий Ес-мутант "САМА" із заміною залишків 265 і 297 на аланін (05 Мо 7332581).
Імуноглобуліни ІдСб4-підкласу мають знижену афінність зв'язування з Ес-рецепторами і зниженими ефекторними функціями у порівнянні з Ідс(і-імуноглобулінами. Таким чином, в деяких варіантах здійснення винаходу зазначена молекула імуноглобуліну, яка входить у злитий білок, відповідно до винаходу, представляє собою імуноглобулін Ідса-підкласу, насамперед людський імуноглобулін ІдбСа4-підкласу. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначений імуноглобулін Ідб4-підкласу містить амінокислотні заміни в Ес-області в положенні 5228 (БО-нумерація), зокрема, амінокислотну заміну 5228Р. Для додаткового зниження його афінності зв'язування з Ес-рецептором і/або його ефекторної функції в одному з варіантів здійснення винаходу зазначений імуноглобулін ІдбС4-підкласу містить амінокислотну заміну в положенні 235 (ЕО-нумерація), зокрема, амінокислотну заміну /235Е. В іншому варіанті здійснення винаходу зазначений імуноглобулін ІдбС4-підкласу містить амінокислотну заміну в положенні РЗ29 (ЕО-нумерація), зокрема, амінокислотну заміну РЗ3290. В конкретному варіанті здійснення винаходу зазначений імуноглобулін Ідб4-підкласу містить амінокислотні заміни в положеннях 5228, 1235 і РЗ29 (ЕО-нумерація), зокрема, амінокислотні заміни 5228Р, 1235Е і
РЗ290. Такі модифіковані імуноглобуліни ІдС.-підкласу і їх здатності зв'язуватися з Есу- рецепторами описані в публікації РСТ УМО 2012/130831, повністю включеній в даний опис як посилання.
В одному з варіантів здійснення винаходу зазначена молекула імуноглобуліну має здатність специфічно зв'язуватися з антигеном. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначена молекула імуноглобуліну представляє собою моноклональне антитіло. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначена молекула імуноглобуліну не має здатність специфічно бо зв'язуватися з антигеном, насамперед не має здатність специфічно зв'язуватися з людським антигеном. Відсутність здатності до специфічному зв'язування зазначеної молекули імуноглобуліну з антигеном (тобто відсутність будь-якого зв'язування, яке можна відрізнити від неспецифічної взаємодії) можна визначати, наприклад, за допомогою ЕГІЗА або поверхнево плазмонного резонансу, зазначеного в даному описі. Зазначена молекула імуноглобуліну є найбільш цінною, наприклад, для подовження часу напівжиття в сироватці злитого білка, для якого не потрібний спрямований вплив на конкретну тканину.
В одному з варіантів здійснення винаходу зазначена молекула імуноглобуліну містить послідовність варіабельної області важкого ланцюга, основою якого є послідовність людської зародкової лінії Мп3-23. В конкретному варіанті здійснення винаходу зазначена молекула імуноглобуліну містить послідовність варіабельної області важкого ланцюга, яка щонайменше на 95 9, 96 95, 97 У, 98 90, 99 90 або 100 95 ідентична послідовності зЗЕО ІЮ МО: 9. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначена молекула імуноглобуліну містить послідовність варіабельної області легкого ланцюга, основою якого є послідовність людської зародкової лінії
МКЗ3-20. В конкретному варіанті здійснення винаходу зазначена молекула імуноглобуліну містить послідовність варіабельної області легкого ланцюга, яка щонайменше на 95 95, 96 95, 97 9, 98 Фо, 99 95 або 100 95 ідентична послідовності ЗЕО ІЮО МО: 11. В ще більш конкретному варіанті здійснення винаходу зазначена молекула імуноглобуліну містить послідовність варіабельної області важкого ланцюга ЗЕО ІЮО МО: 9 і послідовність варіабельної області легкого ланцюга
ЗЕО ІЮО МО: 11. Молекули імуноглобулінів, які містять зазначені послідовності варіабельних областей, не мають здатність специфічно зв'язуватися з антигеном, насамперед людським антигеном. У них відсутня здатність зв'язуватися зі здоровими тканинами, а також РВМС, вони не мають множинної реактивності і для них не характерно неспецифічне накопичення іп мімо за даними візуалізації (дані не представлені). Послідовності варіабельних областей повністю основані на послідовностях людських зародкових ліній за виключенням того, що в СОКЗ важкого ланцюга інтродукована послідовність (350 для створення незв'язувального імуноглобуліну.
В одному з варіантів здійснення винаходу зазначені мутантні молекули 1/-2 містять амінокислотну мутацію в положенні, що відповідає залишку 88 людського ІІ -2 (ЗЕО ІО МО: 1). В одному з варіантів здійснення винаходу зазначена амінокислотна мутація представляє собою
Зо амінокислотну заміну. В більш конкретному варіанті здійснення винаходу зазначена амінокислотну заміну вибирають з групи М880, М88Е, М88І ії М880. В конкретному варіанті здійснення винаходу зазначена амінокислотна заміна представляє собою М880. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначені мутантні молекули 1-2 представляють собою людські молекули 1-2. В конкретному варіанті здійснення винаходу зазначені мутантні молекули 1-2 містять послідовність ЗЕО ІЮ МО: 60 (1-2 М880). В одному з варіантів здійснення винаходу зазначені мутантні молекули І/Ї/-2 містять тільки одну амінокислотну мутацію, яка знижує афінність мутантної молекули 1-2 до рецептора ІІ -2, який має проміжну афінність у порівнянні з молекулою ІЇ-2 дикого типу. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначені мутантні молекули 1-2 не містять амінокислотну мутацію, яка змінює афінність мутантної молекули 1-2 до високоафінного рецептора ІЇ/-2 у порівнянні з молекулою ІЇ/-2 дикого типу. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначені мутантні молекули 1-2 містять тільки одну амінокислотну мутацію, яка змінює афінність мутантної молекули ІЇ/-2 до рецептору 1-2 у порівнянні з молекулою 1-2 дикого типу.
В одному з варіантів здійснення винаходу зазначені мутантні молекули І/-2 додатково містять амінокислотну заміну в положенні, що відповідає залишку 125 людського 1-2. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначена амінокислотна заміна представляє собою С125А. В конкретному варіанті здійснення винаходу зазначені мутантні молекули 1-2 містять послідовність 562 ІЮ МО: 62 (1-2 М880 з амінокислотною заміною С125А). В альтернативному варіанті цистеїн в положенні 125 можна заміняти на іншу нейтральну амінокислоту, таку як
БО серин, треонін або валін, одержуючи С1255 1-2, С125Т 1/-2 або С125М 1І-2 відповідно, як описано в ОШ.5. Мо 4518584. Як зазначено в цьому патенті, можна також виключати М-кінцевий залишок аланіну в І/-2, одержуючи в результаті такі мутанти, як де5-АТї С1255 або де5-А1
С125А. Альтернативно або додатково молекула ІЇ-2 може охоплювати мутацію, в результаті якої метіонін, який, як правило, присутній в природних умовах в положенні 104 людського ІІ -2 дикого типу, замінений на нейтральну амінокислоту, таку як аланін (див. О.5. Мо 5206344). Такі модифікації в людському 1-2 можуть надавати додаткові переваги, такі як підвищена експресія або стабільність.
Мутантні молекули ІЇ/-2, що входять у злитий білок, відповідно до винаходу, можуть представляти собою також неглікозильовані молекули 1-2. Наприклад, елімінація сайту О- бо глікозилювання в молекулі ІЇ-2 дозволяє одержувати більш гомогенний продукт при експресії злитого білка в клітинах ссавців, таких як клітини СНО або НЕК. Так, в деяких варіантах здійснення винаходу мутантні молекули 1-2 додатково містять модифікацію, яка елімінує сайт
О-глікозилювання І//-2 в положенні, що відповідає залишку З людського ІЇ-2. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначена модифікація, яка елімінує сайт О-глікозилювання 1-2 в положенні, що відповідає залишку З людського 1-2, представляє собою амінокислотну заміну.
Прикладами амінокислотних замін є ТЗА, ТЗ, Т3О, ТЗЕ, ТЗМ, Т30О, ТЗК, ТЗК їі ТЗР. В конкретному варіанті здійснення винаходу зазначена модифікація представляє собою амінокислотну заміну ТЗА. В конкретному варіанті здійснення винаходу зазначені мутантні молекули ІІ -2 містять послідовність ХЕО ІЮ МО: 64 (1-2 ТЗА М880).
В конкретному варіанті здійснення винаходу мутантні молекули 1-2 містять амінокислотні заміни ТЗА, М880 і С125А. В конкретному варіанті здійснення винаходу зазначені мутантні молекули 1-2 містять послідовність зЗЕО ІЮ МО: 58 (ІІ -2 ТЗА М880 С1255А).
В одному з варіантів здійснення винаходу зв'язування злитого білка, згідно з винаходом, з рецептором І/-28у знижують щонайменше в 1,5 рази, переважно щонайменше в 2 рази або щонайменше в З рази у порівнянні зо зв'язуванням відповідного злитого білка, який містить дві молекули ІЇ-2 дикого типу, з рецептором І/-2Ву. В одному з варіантів здійснення винаходу злитий білок, відповідно до винаходу, зв'язується з рецептором ІІ -28Ву з константою афінності (Ко), яка перевищує щонайменше в 2 рази величину Ко відповідного злитого білка який містить дві молекули 1-2 дикого типу, за даними вимірювань методом 5РЕК при 2520. В конкретному варіанті здійснення винаходу зазначений рецептор І/-28у представляє собою людський зазначений рецептор І/-2Ву. В одному з варіантів здійснення винаходу зв'язування злитого білка, згідно з винаходом, з рецептором 1-24 приблизно дорівнює зв'язуванню відповідного злитого білка, який містить дві молекули ІЇ/-2 дикого типу, з рецептором І/-24. В одному з варіантів здійснення винаходу злитий білок, відповідно до винаходу, зв'язується рецептором І-- 2а з константою афінності (Ко), яка приблизно дорівнює величині Ко відповідного злитого білка який містить дві молекули 1-2 дикого типу, за даними вимірювань методом ЗРЕ при 2520. В конкретному варіанті здійснення винаходу зазначений рецептор ІЇ/-24 представляє собою людський рецептор 1І/-242. Метод оцінки афінності зв'язування з рецептором ІІ/-2ву або рецептором І--24 за допомогою 5РЕ представлений в даному описі. Згідно з одним з варіантів
Зо здійснення винаходу афінність зв'язування (Ко) вимірюють за допомогою поверхневого плазмонного резонансу, застосовуючи пристрій ВІАСОКЕФ Т100 (фірма СЕ Неайсаге), при 2590 із застосуванням рецепторів 1-2, іммобілізованих на СМ5-чипах або сенсибілізованих стрептавідином чипах. Константу афінності (Ко) розраховують у вигляді відношення Кой/Коп (див., наприклад, Спеп та ін., У Мої Віої! 293, 1999, сс. 865-881).
Конкретним об'єктом винаходу є злитий білок, що містить (І) молекулу імуноглобуліну Їдс1- підкласу, яка містить амінокислотні заміни Г234А, 1235А і РЗ296 (ЕО-нумерація) у важких ланцюгах імуноглобуліну, і (І) дві мутантні молекули інтерлейкіну-2 (І/-2), які містять амінокислотну заміну М88О, кожна з яких злита на М-кінцевій амінокислоті з С-кінцевою амінокислотою одного з важких ланцюгів імуноглобуліну через пептидний лінкер. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначена молекула імуноглобуліну і зазначені молекули 1-2 є людськими. В конкретному варіанті здійснення винаходу зазначена молекула імуноглобуліну містить послідовність варіабельної області важкого ланцюга 5ЕО ІЮО МО: 9 ї послідовність варіабельної області легкого ланцюга ЗЕО ІЮ МО: 11. В іншому конкретному варіанті здійснення винаходу, кожна із зазначених молекул 1-2 містить амінокислотну послідовність 560 І МО: 58.
В іншому варіанті здійснення винаходу зазначений пептидний лінкер містить амінокислотну послідовність (бЗ45)з3 (ЗЕО ІЮ МО: 66). В ще більш конкретному варіанті здійснення винаходу зазначений злитий білок містить поліпептидну послідовність, ідентичну щонайменше приблизно на 80 95, 85 95, 90 95, 95 95, 96 95, 97 95, 98 95, 99 95 або 100 95 послідовності ЗЕО ІЮ МО: 50, ї поліпептидну послідовність, ідентичну щонайменше приблизно на 80 95, 85 95, 90 Фо, 95 95, 96 бо, 97 Фо, 98 о, 99 95 або 100 95 послідовності ФЕО ІЮО МО: 19.
Як продемонстровано в прикладах, злитий білок, відповідно до винаходу, вибірково активує регуляторні Т-клітин (тобто практично без супутньої активації інших субпопуляцій Т-клітин і/або природних клітин-кілерів (МК-клітин). Так, один з об'єктів винаходу відноситься до злитого білка, що містить молекулу імуноглобуліну і дві мутантні молекули 1-2, де зазначений злитий білок вибірково активує регуляторні Т-клітини у порівнянні з ефекторними Т-клітинами і МК-клітинами, насамперед у порівнянні з канонічними СО4--Т-клітинами, СО8--Т-клітинами і МК-клітинами. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначений злитий білок активує регуляторні Т-клітини щонайменше в 10 разів, щонайменше в 100 разів або щонайменше в 1000 разів в більшому ступені, ніж ефекторні Т-клітини і МК-клітини. В одному з варіантів здійснення винаходу бо зазначений злитий білок вибірково активує регуляторні Т-клітини у порівнянні з канонічними браз-Т-клітинами пам'яті. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначений злитий білок активує регуляторні Т-клітини щонайменше в 10 разів, щонайменше в 100 разів або щонайменше в 1000 разів в більшому ступені, ніж канонічні СЮО4--Т-клітини пам'яті. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначену активацію визначають шляхом вимірювання рівнів фосфорилювання внутрішньоклітинного З5ТАТ, насамперед ЗТАТ5. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначене вимірювання рівнів фосфорилювання внутрішньоклітинного
ЗТАТ здійснюють за допомогою проточного цитометричного аналізу. В одному з варіантів здійснення винаходу величина ЕСзо для зазначеного злитого білка, яка характеризує індукцію передачі сигналу рецептора //-2 в регуляторних Т-клітинах, щонайменше в 10 разів, щонайменше в 100 разів або щонайменше в 1000 разів менше, ніж величина ЕСбо, яка характеризує індукцію передачі сигналу рецептора 1І--2 в ефекторних Т-клітинах і МК-клітинах. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначена індукція передачі сигналу рецептора 1-2 представляє собою індукцію фосфорилювання 5ТАТ. В одному з варіантів здійснення винаходу величина ЕСво, яка характеризує індукцію передачі сигналу рецептора 1-2 в регуляторних Т- клітинах, щонайменше в 10 разів, щонайменше в 100 разів або щонайменше в 1000 разів менше, ніж величина ЕСво, яка характеризує індукцію передачі сигналу рецептора 1-2 в канонічних СО4--Т-клітинах пам'яті В одному з варіантів здійснення винаходу зазначена індукція передачі сигналу рецептора 1-2 представляє собою індукцію фосфорилювання 5ТАТ.
В іншому об'єкті винаходу запропонований злитий білок насамперед для застосування з метою вибіркової активації регуляторних Т-клітин іп мійго або іп ммо. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначене застосування полягає в тому, що приводять в контакт регуляторні Т-клітини з зазначеним злитим білком іп міго або іп мімо. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначене застосування додатково полягає в тому, що приводять в контакт інші (що відрізняються від регуляторних) Т-клітини з зазначеним злитим білком. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначене застосування представляє собою застосування іп міїго, і зазначений злитий білок застосовують в концентрації приблизно 10 нг/мл або менше, переважно приблизно 1 нг/мл або менше. В іншому варіанті здійснення винаходу зазначене застосування представляє собою застосування іп мімо, і зазначений злитий білок застосовують в дозі, що складає приблизно 100 мкг/кг ваги тіла або менше, насамперед приблизно 25 мкг/кг
Зо ваги тіла або менше, більш переважно приблизно 10 мкг/кг ваги тіла або менше (де поняття "вага тіла" відноситься до ваги тіла індивідуума, якому вводять злитий білок).
Винахід відноситься також до способу вибіркової активації регуляторних Т-клітин іп міго або іп мімо, який полягає в тому, що приводять до контакт зазначені регуляторні Т-клітини зі злитим білком, запропонованим у винаході. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначений спосіб додатково полягає в тому, що приводять в контакт інші (що відрізняються від регуляторних) Т-клітини з зазначеним злитим білком. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначена активація охоплює індукцію проліферації і/або індукцію передачі сигналів через ІЇ--2- рецептор. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначений спосіб представляє собою спосіб іп міго, і зазначений злитий білок застосовують в концентрації приблизно 10 нг/мл або менше, зокрема, приблизно 1 нг/мл або менше. В іншому варіанті здійснення винаходу зазначений спосіб представляє собою спосіб іп мімо, і зазначений злитий білок застосовують в дозі приблизно 100 мкг/кг ваги тіла або менше, переважно приблизно 25 мкг/кг ваги тіла або менше, більш переважно приблизно 10 мкг/кг ваги тіла або менше (де поняття "вага тіла" відноситься до ваги тіла індивідуума, якому вводять злитий білок).
В деяких варіантах злитого білка, застосування або способу, описаних в попередніх параграфах, зазначена активація охоплює індукцію проліферації регуляторних Т-клітин і/або індукцію передачі сигналів через ІІ -2-рецептор в регуляторних Т-клітинах. Індукцію проліферації можна виміряти, наприклад, шляхом визначення внутрішньоклітинного маркера проліферації Кі- 67 згідно з методом, описаним в прикладах. В одному з варіантів здійснення винаходу проліферація регуляторних Т-клітин, активованих злитим білком, запропонованим у винаході, підвищується щонайменше приблизно в 1,5 рази, щонайменше приблизно в 2 рази або щонайменше приблизно в З разів у порівнянні з проліферацією неактивованих регуляторних Т- клітин. В одному з варіантів здійснення винаходу проліферація інших (які відрізняються від регуляторних) Т-клітин і/або МК-клітин, що контактують зі злитим білком, запропонованим у винаході, підвищується менше ніж приблизно в 1,5 рази, менше ніж приблизно в 1,2 рази або менше ніж приблизно в 1,1 рази у порівнянні з проліферацією відповідних клітин, які не мали контакту з зазначеним злитим білком. Індукцію передачі сигналів через ІІ-2-рецептор можна виміряти, наприклад, шляхом визначення фосфорильованого ЗТАТ5 відповідно до методу, описаного в прикладах. В одному з варіантів здійснення винаходу, передача сигналів через 1-2 бо рецептор в регуляторних Т-клітинах, активованих злитим білком, запропонованим у винаході,
підвищується щонайменше приблизно в 1,5 рази, щонайменше приблизно в 2 рази, щонайменше приблизно в З рази або щонайменше приблизно в 5 разів у порівнянні з передачею сигналів через І -2-рецептор в неактивованих регуляторних Т-клітинах. В одному з варіантів здійснення винаходу передача сигналів через ІІ -2-рецептор в інших (які відрізняються від регуляторних) Т-клітинах і/або МК-клітинах, які контактують зі злитим білком, запропонованим у винаході, підвищується менше ніж приблизно в 1,5 рази або менше ніж приблизно в 1,2 рази, або менше ніж приблизно в 1,1 рази у порівнянні з передаче. сигналів через ІІ-2-рецептор в відповідних клітинах, які не мали контакту з зазначеним злитим білком.
Полінуклеотиди
Винахід відноситься також до полінуклеотидів, що кодують злитий білок, зазначений в даному описі, або його фрагмент.
Полінуклеотиди, запропоновані у винаході, охоплюють полінуклеотиди, послідовність яких щонайменше приблизно на 80 95, 85 9», 90 9», 95 Фо, 96 9», 97 Уо, 98 ФУ, 99 95 або 100 95 ідентична послідовностям, представленим в ЗЕО ІЮ МО: 10, 12, 20, 51, 59, 61, 63 ї 65, включаючи їх функціональні фрагменти або варіанти.
Полінуклеотиди, які кодують злиті білки, запропоновані у винаході, можна експресувати у вигляді індивідуального полінуклеотиду, який кодує повний злитий білок, або у вигляді декількох (наприклад, двох або більшої кількості) полінуклеотидів, для яких характерна сумісна експресія.
Поліпептиди, які кодуються полінуклеотидами, які сумісно експресуються, можуть бути зв'язані за допомогою, наприклад, дисульфідних мостиків або інших засобів, з утворенням функціонального злитого білка. Наприклад, область, що містить легкий ланцюг імуноглобуліну, може кодуватися полінуклеотидом, відмінним від полінуклеотиду, що кодує область, яка містить важкий ланцюг імуноглобуліну. При сумісній експресії поліпептиди важкого ланцюга повинні бути асоційовані з поліпептидами легкого ланцюга з утворенням імуноглобуліну.
Одним з варіантів здійснення даного винаходу є полінуклеотид, що кодує злитий білок, який містить молекулу імуноглобуліну і дві молекули ІЇ/-2, або його фрагмент, де полінуклеотид містить послідовність, яка кодує послідовність варіабельної області, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 9 або 11. Іншим варіантом здійснення даного винаходу є полінуклеотид, що кодує злитий білок, який містить молекулу імуноглобуліну і дві молекули 1-2, або його фрагмент, де полінуклеотид містить послідовність, яка кодує поліпептидну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 19 або 50. Іншим варіантом здійснення винаходу є полінуклеотид, що кодує злитий білок, який містить молекулу імуноглобуліну і дві молекули ІЇ/-2, або його фрагмент, де полінуклеотид містить послідовність, яка щонайменше приблизно на 80 95, 85 95, 90 90, 95 95, 96 95, 97 Уо, 98 95 або 99 95 ідентична нуклеотидній послідовності, представленої в 5ЕО ІЮО МО 10, 12, 20, 51, 59, 61, 63 або 65. Іншим варіантом здійснення винаходу є полінуклеотид, що кодує злитий білок, який містить молекулу імуноглобуліну і дві молекули ІЇ/-2, або його фрагмент, де полінуклеотид містить нуклеотидну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО 10, 12, 20, 51, 59, 61, 63 або 65.
Іншим варіантом здійснення винаходу є полінуклеотид, що кодує злитий білок, який містить молекулу імуноглобуліну і дві молекули ІЇ/-2, або його фрагмент, де полінуклеотид містить послідовність, яка кодує послідовність варіабельної області, яка щонайменше приблизно на 80 9, 85 95, 90 95, 95 Фо, 96 9», 97 90, 98 95 або 99 95 ідентична амінокислотної послідовності ЗЕО
ІО МО: 9 або 11. Іншим варіантом здійснення винаходу є полінуклеотид, що кодує злитий білок, який містить молекулу імуноглобуліну і дві молекули 1-2, або його фрагмент, де полінуклеотид містить послідовність, що кодує поліпептидну послідовність, яка щонайменше на 80 95, 85 95, 90 оо, 95 95, 96 95, 97 95, 98 95 або 99 95 ідентична амінокислотної послідовності 5ЕО ІЮ МО: 19 або 50. Винахід відноситься до полінуклеотиду, що кодує злитий білок, який містить молекулу імуноглобуліну і дві молекули 1-2, або його фрагмент, де полінуклеотид містить послідовність, що кодує послідовності варіабельних областей 5ЕО ІЮ МО: 9 або 11 з консервативними амінокислотними замінами. Винахід відноситься також до полінуклеотиду, що кодує злитий білок, який містить молекулу імуноглобуліну і дві молекули І/-2, або його фрагмент, де полінуклеотид містить послідовність, що кодує поліпептидні послідовності ФЕО ІЮ МО: 19 або 50 з консервативними амінокислотними замінами.
В деяких варіантах здійснення винаходу полінуклеотид або нуклеїнова кислота представляє собою ДНК. В інших варіантах здійснення винаходу полінуклеотид, що запропонований в даному винаході, представляє собою РНК, наприклад, в формі матричної РНК (мРНК). РНК, запропонована в даному винаході, може бути одноланцюговою або дволанцюговою.
Методи рекомбінації
Злиті білки, запропоновані у винаході можна одержувати, наприклад, шляхом твердофазного пептидного синтезу (наприклад, твердофазного синтезу Мерифілда) або 60 методами рекомбінації. Для рекомбінантного одержання один або декілька полінуклеотидів, які кодують злитий білок (фрагмент), наприклад, описаний вище, виділяють і вбудовують в один або декілька векторів для подальшого клонування і/або експресії в клітині-хазяїні. Зазначений полінуклеотид легко виділяти і секвенувати за допомогою загальноприйнятих процедур. Одним з варіантів здійснення винаходу є вектор, переважно експресійний вектор, що містить один або декілька полінуклеотидів, що запропоновані у винаході. Методи, добре відомі спеціалістам в даній галузі, можна застосовувати для конструювання експресійних векторів, що містять що кодує послідовність злитого білка (фрагмента) наряду з прийнятними сигналами, які контролюють транскрипцію/трансляцію. Ці методи охоплюють технології рекомбінантної ДНК іп міо, методи синтезу і іп мімо рекомбінації/генетичної рекомбінації (див., наприклад, методи, описані у Мапіаї5 та ін., Мапіаїз та ін., МоІесшаг СіІопіпу А Гарогаюгу Мапиаї, вид-во Соїа 5ргіпд
Нагбог І арогаїогу, М.У., 1989; ії А!йзибеї та ін., Си!игтепі РгоїосоЇ5 іп МоїІесшціаг Віоіоду, вид-во
Стеепе Рибіїзпіпу Авзосіаїєз апа УМПеу Іпівгзсієпсе, М.У., 1989). Експресійний вектор може представляти собою частину плазміди, вірусу або може представляти собою фрагмент нуклеїнової кислоти. Експресійний вектор охоплює касету експресії, в якій полінуклеотид, що кодує злитий білок (фрагмент) (тобто що кодує область), клонують із забезпеченням функціонального зв'язку з промотором і/або іншими елементами, які контролюють транскрипцію або трансляцію. В контексті даного опису "область, яка кодує" представляє собою частину нуклеїнової кислоти, яка складається з кодонів, які транслюють в амінокислоти. Хоча "стоп- кодон" (ТАС, ТОА або ТАА) не транслюється в амінокислоту, то він, у випадку його присутності, може розглядатися як частина кодувальної області, однак будь-які фланкувальні послідовності, наприклад, промотори, сайти зв'язування рибосом, термінатори транскрипції, інтрони, 5'- їі 3'- нетрансльовані області тощо, не є частиною кодувальної області. Дві або більша кількість областей які кодують може бути присутньою в індивідуальній полінуклеотидній конструкції, наприклад, індивідуальному векторі, або в різних полінуклеотидних конструкціях, наприклад, в різних векторах. Окрім того, будь-який вектор може містити одну область, що кодує або може містити дві або більшу кількість областей, які кодують, наприклад, вектор, що запропонований в даному винаході, може кодувати один або декілька поліпептидів, які пост- або котранляційно розділюються на кінцеві білюии шляхом протеолітичного розщеплення. Окрім того, вектор, полінуклеотид або нуклеїнова кислота, запропонований/запропонована у винаході, може
Зо кодувати гетерологічні кодувальні області, або злиті, або не злиті з першим або другим полінуклеотидом, який кодує злитий білок (фрагмент), відповідно до винаходу, їх або варіанти або похідні. Гетерологічні кодувальні області охоплюють (але, не обмежуючись тільки ними) спеціалізовані елементи або мотиви, такі як секреторний сигнальний пептид або гетерологічний функціональний домен. Функціональний зв'язок має місце, коли кодувальна область генного продукту, наприклад поліпептиду, асоційована з однією або декількома регуляторними послідовностями таким чином, щоб експресія генного продукту знаходилась під впливом або контролем регуляторної(их) послідовності(ей). Два ДНК-фрагмента (таких як кодувальна область поліпептиду і асоційований з нею промотор) є "функціонально зв'язаними", якщо індукція промоторної функції приводить до транскрипції мРНК, яка кодує потрібний генний продукт, і якщо природа зв'язку між двома ДНК-фрагментами не впливає на здатність регулювальних експресію послідовностей спрямовувати експресію генного продукту, або не впливає на здатність ДНК-матриці до транскрипції. Таким чином, промоторна область повинна бути функціонально зв'язана з нуклеїновою кислотою, яка кодує поліпептид, якщо промотор має здатність здійснювати транскрипцію нуклеїнової кислоти. Промотор може представляти собою специфічний для клітини промотор, який забезпечує значну транскрипцію ДНК тільки в попередньо відібраних клітинах. Інші контролювальні транскрипцію елементи, окрім промотора, наприклад, енхансери, оператори, репресори і сигнали термінації транскрипції, можна функціонально зв'язувати з полінуклеотидом для забезпечення специфічної для клітини транскрипції. Прийнятні промотори й інші контролювальні транскрипцію області представлені в даному описі. Спеціалістам в даній галузі відомо широка різноманітність контролювальних транскрипцію областей. Вони охоплюють (але, не обмежуючись тільки ними) контролювальні транскрипцію області, які функціонують в клітинах хребетних тварин, такі як (але, не обмежуючись тільки ними) сегменти промоторів і енхансерів з цитомегаловірусів (наприклад, негайно-ранній промотор в поєднання з інтроном -А), мавпячого вірусу 40 (наприклад, ранній промотор) і ретровірусів (таких як вірус саркоми Рауса). Інші контролювальні транскрипцію області охоплюють області, виведені з генів хребетних тварин, таких як ген актину, білка теплового шоку, бичачого гормону росту й кролячого р-глобіну, а також інші послідовності, які можуть контролювати експресію генів в еукаріотичних клітинах. Додаткові прийнятні контролювальні транскрипцію області охоплюють тканиноспецифічні промотори і енхансери, а бо також індуцибельні промотори (наприклад, промотори, індуковані тетрацикліном). Аналогічно до цього, звичайним спеціалістам в даній галузі відомо широка різноманітність контролювальних трансляцію елементів. Вони охоплюють (але, не обмежуючись тільки ними) сайти зв'язування рибосом, кодони ініціації трансляції і термінувальні кодони й елементи, виведені з вірусних систем (зокрема, внутрішній сайт зв'язування (посадки) рибосом або ІКЕ5, який позначають також як СІТЕ-послідовність). Касета експресії може охоплювати також інші характерні структури, такі як сайт ініціації реплікації і/або інтегровані в хромосому елементи, такі як довгі кінцеві повтори (ТЕ) ретровірусів, або інвертовані кінцеві повтори (ІТК) аденоасоційованого вірусу (АДАМ).
Кодувальні області полінуклеотиду і нуклеїнової кислоти, запропоновані в даному винаході, можуть бути асоційовані з додатковими кодувальними областями, які кодують секреторні або сигнальні пептиди, які спрямовують секрецію поліпептиду, який кодується полінуклеотидом, запропонованим в даному винаході. Наприклад, якщо потрібні секреція злитого білка, то ДНК, яка кодує сигнальну послідовність, можна поміщати проти ходу транскрипції відносно нуклеїнової кислоти, яка кодує злитий білок, відповідно до винаходу, або його фрагмент.
Відповідно до гіпотези, яка стосується сигналів, білки, які секретуються клітинами ссавців, мають сигнальний пептид або секреторну лідерну послідовність, який/яка відщеплюється від зрілого білка після ініціації експорту збільшуваного білкового ланцюга через шорсткуватий ендоплазматичний ретикулум. Звичайним спеціалістам в даній галузі повинно бути очевидним, що поліпептиди, які секретуються клітинами хребетних тварин, як правило, мають сигнальний пептид, злитий з М-кінцем поліпептиду, який відщеплюється від трансльовуваного поліпептиду з утворенням секретованої або "зрілої"! форми поліпептиду. В деяких варіантах здійснення винаходу застосовують нативний сигнальний пептид, наприклад, сигнальний пептид важкого ланцюга або легкого ланцюга імуноглобуліну або функціональне похідне зазначеної послідовності, яке зберігає здатність забезпечувати секрецію поліпептиду, функціонально зв'язаного з ним. Альтернативно до цього, можна застосовувати гетерологічний сигнальний пептид ссавців або його функціональне похідне. Наприклад, лідерну послідовність дикого типу можна заміняти на лідерну послідовність людського тканинного активатора плазміногену (ТРА) або мишачої Д-глюкуронідази. Приклади амінокислотних і полінуклеотидних послідовностей секреторних сигнальних пептидів представлені в ЗЕО ІЮ МО: 39-47.
Зо ДНК, що кодує коротку білкову послідовність, яку можна застосовувати для полегшення подальшої очистки (наприклад, гістидинову мітку), або призначену для мічення злитого білка, можна включати всередину або на кінці полінуклеотиду, що кодує злитий білок (фрагмент).
Додатковим варіантом здійснення винаходу є клітина-хазяїн, що містить один або декілька полінуклеотидів, що запропоновані у винаході. Деякими варіантами здійснення винаходу є клітина-хазяїн, що містить один або декілька векторів, що запропоновані у винаході.
Полінуклеотиди і вектори можуть мати будь-які особливості, індивідуально або в поєднанні, зазначеними в даному описі стосовно полінуклеотидів і векторів відповідно. В одному з таких варіантів здійснення винаходу клітина-хазяїн містить вектор (наприклад, трансформована або трансфектована ним), що містять полінуклеотид, який кодує злитий білок (частина злитого білка), згідно з винаходом. В контексті даного опису поняття "клітина-хазяїн" відноситься до будь-якого типу клітинної системи, яку можна конструювати для одержання злитих білків, що запропоновані у винаході, або їх фрагментів. Клітини-хазяї, придатні для реплікації й для підтримання експресії злитих білків, добре відомі в даній галузі. Такі клітини можна трансфектувати або трансдукувати відповідним чином конкретним експресійним вектором і можна вирощувати більшу кількість клітин, які містять вектор з метою внесення в ферментери для великомасштабних процесів одержання злитого білка в достатніх для клінічних застосувань кількостях. Прийнятними клітинами-хазяями є прокаріотичні мікроорганізми, такі як Е. сої, або різні еукаріотичні клітини, такі як клітини яєчника китайського хом'ячка (СНО), клітини комах або т.п. Наприклад, поліпептиди можна одержувати в бактеріях, насамперед в тих випадках, коли відсутня потреба в глікозилюванні. Після експресії поліпептид можна виділяти з пасти бактеріальних клітин в розчинній фракції і можна додатково очищувати. Окрім прокаріот, як хазяїв для клонування або експресії векторів, які кодують поліпептид, можна застосовувати еукаріотичні мікроорганізми, такі як нитчасті гриби або дріжджі, включаючи штами грибів і дріжджів, шляхи глікозилювання яких були "гуманізовані", що дозволяє одержувати поліпептид з частково або повністю людської схемою глікозилювання (див. сегпдго55, Маї. Віоїесі. 22, 2004, со. 1409-1414 і її та ін., Маї. Віоїесп. 24, 2006, сс. 210-215). Клітини-хазяї, які можна застосовувати для експресії (глікозильованих) поліпептидів, одержують також з багатоклітинних організмів (безхребетних і хребетних тварин). Прикладами клітин безхребетних є клітини комах, а також можна застосовувати клітини рослин. Були виявлені багаточисельні бакуловірусні 60 штами й відповідні придатні для них як хазяї клітини комах, насамперед для трансфекції клітин
Зродорієга идірегда. Як хазяї можна застосовувати також культури рослинних клітин (див., наприклад, 5 МоМо 5959177, 6040498, 6420548, 7125978 і 6417429 (опис технології
РІ АМТІВОСІЕВ"М для одержання антитіл в трансгенних рослинах). Як хазяї можна застосовувати також клітини хребетних тварин. Наприклад, можна застосовувати клітинні лінії ссавців, які адаптовані до росту в суспензії. Іншими прикладами прийнятних ліній клітин-хазяїв ссавців є лінія клітин нирки мавпи СМ1, трансформована за допомогою 540 (СО5-7); лінія клітин нирки ембріону людини (293 або клітини лінії 293, субклоновані з метою вирощування в суспензійній культурі, сгапат та ін., у). Сеп. Мігої., 36, 1977, з. 59); клітини нирки дитинча хом'яка (ВНК); клітини Сертолі миші (ТМА4-клітини, описані, наприклад, у Маїнег, Віої. Кергод., 23, 1980, со. 243-251); клітини нирки мавпи (СМ1); клітини нирки африканської зеленої мартишки (МЕКО- 76,); клітини карциноми шийки матки людини (НЕГА); клітини нирки собаки (МОСК); клітини печінки бичачого щура (ВК. ЗА); клітини легені людини (М/138); клітини печінки людини (Нер 02); клітини пухлини молочної залози миші (ММТ 060562); клітини ТК, описані, наприклад, у
Маег та ін., АппаЇ5 М.У. Асад. зЗсі., 383, 1982, сс. 44-68); клітини МКС 5 і клітини Е54. ІншШИМИ цінними лініями клітин-хазяїв ссавців є клітини яєчника китайського хом'ячка (СНО), включаючи
ОНЕК-СНО-клітини (пацб та ін., Ргос. Май. Асад. сі. ОБА, 77, 1980, з. 4216); і клітинні лінії мієломи, такі як МО, МБО і 5р2/0. Огляд конкретних ліній клітин-хазяїв ссавців, які можна застосовувати для виробництва білка, див., наприклад, у УаакКі і УМи, в: Меїпод іп МоїІесшаг
Віоіоду під ред. В.К.С. Го, вид-во Нитапа Ргев55, Тоїоула, МУ, т. 248, 2003, сс. 255-268. Клітини- хазяї охоплюють вирощувані клітини, наприклад, вирощувані клітини ссавців, клітини дріжджів, клітини комах, клітини бактерій і клітини рослин (але не обмежуючись тільки ними), а також клітини, які знаходяться в організмі трансгенної тварини, трансгенної рослини або вирощуваної рослинної або тваринної тканини. В одному з варіантів здійснення винаходу клітина-хазяїн представляє собою еукаріотичну клітину, переважно клітину ссавці, таку як клітина яєчника китайського хом'ячка (СНО), клітину нирки людського ембріону (НЕК) або лимфоїидну клітину (наприклад, клітину МО, МБО, 5р20).
В даній галузі відомі стандартні технології для експресії сторонніх генів в цих системах.
Клітини, що експресують поліпептид, який містить або важкий, або легкий ланцюг імуноглобуліну, можна конструювати таким чином, щоб в них відбувалась експресія також інших
Зо ланцюгів імуноглобуліну, так, щоб продукт, який експресується, представляв собою імуноглобулін, який містить як важкий, так і легкий ланцюг.
Одним з варіантів здійснення винаходу є спосіб одержання злитого білка, згідно з винаходом, де спосіб полягає в тому, що культивують клітину-хазяїна, яка містить полінуклеотид, який кодує злитий білок, представлений в даному описі, в умовах, придатних для експресії злитого білка, і виділяють злитий білок з клітини-хазяїна (або культурального середовища клітини-хазяїна).
В злитих білках, що запропоновані у винаході, компоненти (молекула імуноглобуліну і молекула 1-2) генетично зливають один з іншим. Злиті білли можна створювати так, щоб їх компоненти зливати один з іншим безпосередньо або опосередковано через лінкерну послідовність. Склад і довжину лінкера можна визначати за допомогою методів, добре відомих в даній галузі, і можна оцінювати його ефективність. Додаткові послідовності можна охоплювати також в сайт розщеплення для розділення при необхідності індивідуальних компонентів злитого білка, наприклад, розпізнавану ендопептидазою послідовність.
В деяких варіантах здійснення винаходу злиті білки, запропоновані у винаході, містять щонайменше варіабельну область імуноглобуліну, яка має здатність зв'язуватися з антигеном.
Варіабельні області можуть утворювати частину наявних в природних умовах або не наявних в природних умовах антитіл або їх фрагментів або можуть походити з них. Методи одержання поліклональних антитіл і моноклональних антитіл добре відомі в даній галузі (див., наприклад,
Напож апа Гапе, "Апіібодіє5: а І арогаїогу Мапиаї!", вид-во Соїа ргіпуд Нагброг І абогафогу, 1988).
Не наявні в природних умовах антитіла можна створювати за допомогою твердофазного пептидного синтезу, можна одержувати за допомогою методів рекомбінації (наприклад, описаних в Ш5 Мо 4186567) або можна одержувати, наприклад, шляхом скринінгу комбінаторних бібліотек, що містять варіабельні області важких ланцюгів і варіабельні області легких ланцюгів (див., наприклад, ОЗ Мо 5969108 на ім'я МесСапйегіу).
Згідно з винаходом можна застосовувати будь-які види імуноглобулінів тваринного походження. Приклади імуноглобулінів, які можна застосовувати згідно з даним винаходом, охоплюють (але, не обмежуючись тільки ними) імуноглобуліни мишей, приматів або людини.
Якщо злитий білок призначений для застосування на людині, то можна застосовувати хімерну форму імуноглобуліну, в якій константні області імуноглобуліну одержують з людського бо антитіла. Гуманізовану або повністю людську форму імуноглобуліну можна одержувати також за допомогою методів, добре відомих в даній галузі (див., наприклад, 5 Мо 5565332 на ім'я
МУММіпіег). Для здійснення гуманізації можна застосовувати різні методи, такі як (але, не обмежуючись тільки ними) (а) трансплантація нелюдських (наприклад, з антитіла-донора) СОМ в людський (наприклад, антитіло-реципієнт) каркасна ділянка і константні області, які зберігають або не зберігають залишки каркасної ділянки, які мають вирішальне значення (наприклад, залишки, важливі для зберігання гарної антигензв'язувальної афінності або функцій антитіла), (б) трансплантація тільки нелюдських визначальних специфічність ділянок (ОК або а-СОВ; залишки мають вирішальне значення для взаємодії антитіло-антиген) в людську каркасну ділянку і константні області, або (в) трансплантація повністю нелюдських варіабельних доменів і їх "маскування" сегментом, який нагадує людський шляхом заміни поверхневих залишків. Огляд гуманізованих антитіл і методів їх одержання див., наприклад, у АІтадго і Егапозоп, Егопі Віозсі 13, 12008, сс. 1619-1633, і они описани також, наприклад, у Кіесптапп та ін., Маїиге 332, 1988, сс. 323-329; Оцееп та ін., Ргос Маї! Асай Зсі ОА 86, 1989, сс. 10029-10033; 0.5. МоМо 5821337, 7527791, 6982321 і 7087409; допез та ін., Майшиге 321, 1986, сс. 522-525; Моітізоп та ін., Ргос Маї!
Асай 5сі 81, 1984, сс. 6851-6855; Моїтізоп і ОЇ, Адм Іттипої 44, 1988, сс. 65-92; Метпоеуеп та ін., зЗсіепсе 239, 1988, сс. 1534-1536; Радіап, Моїес Іттип 313), 1994, сс.169-217; Казптігі та ін.,
Меїпод» 36, 2005, сс. 25-34) (опис трансплантації ЗОЄ (а-СОР)); Радіап, Мої Іттипої! 28, 1991, сс. 489-498 (опис "повторного покриття"); БаІгАсдпа та ін., Мешйоа5 36, 2005, сс. 43-60 (описані "перестановки ЕК") і О5роишгп та ін., Меїйпоаз5 36, 2005, сс. 61-68, і Кіїтка та ін., Вг У Сапсег 83, 2000, сс. 252-260 (опис підходу на основі "цілеспрямованої селекції" для перестановки ЕК).
Переважні імуноглобуліни, запропоновані у винаході, представляють собою людські імуноглобуліни. Людські антитіла і людські варіабельні області можна одержувати за допомогою різних методик, відомих в даній галузі. Людські антитіла описані в цілому у мап бік і мап де
Уміпкеї, Сигг Оріп Рпаптасої 5, 2001, сс. 368-374 і Ії опрегу, Сигг Оріп Іттипої 20, 2008, сс. 450- 459. Людські варіабельні області можуть утворювати частину людських моноклональних антитіл або можуть бути одержані з них за допомогою методу гібридом (див., наприклад, МопосіопаЇ
Апіїбоду Ргодисіп Тесппіднез5 апа Арріїсайоп5, вид-во Магсе! Оеккег, Іпс., Мем МогК, 1987, сс. 51-63). Людські антитіла і людські варіабельні області можна одержувати також шляхом введення імуногена трансгенній тварині, яку модифіковано таким чином, що може продукувати інтактні людські антитіла або інтактні антитіла з людськими варіабельними областями у відповідь на контрольне зараження антигеном (див., наприклад, І опрегоу, Маї Віоїесп 23, 2005, сс. 1117-1125). Людські антитіла й людські варіабельні області можна створювати також шляхом виділення послідовностей варіабельних областей Ему-клону, відібраних з людських фагових дисплейних бібліотек (див., наприклад, Ноодепроот та ін. в: Меїйоа5 іп МоїІесшіаг Віоіоду, під ред. О'Вгіеєп та ін., вид-во Нитап Ргез5, Тоїоуа, МУ, 178, 2001, сс. 1-37); і МесСайепу та ін.,
Майшге 348, сс. 552-554; СІаскз5оп та ін., Майиге 352, 1991, сс. 624-628). Фаг, як правило, експонує фрагменти антитіл або у вигляді одноланцюгових Еу- (5сЕм)-фрагментів, або у вигляді Еаб- фрагментів.
В деяких варіантах здійснення винаходу імуноглобуліни, що входять у злиті білки, запропоновані в даному винаході, створюють так, щоб вони мали підвищену афінність зв'язування, наприклад, за допомогою методів, описаних в публікації РСТ УМО 2011/020783 (див. приклади, що стосуються дозрівання афінності) або публікації заявки на патент США Мо 2004/0132066, повний зміст яких включено в даний опис як посилання. Здатність злитих білків, що запропоновані у винаході, зв'язуватися зі специфічною антигенною детермінантою можна оцінювати кількісно або за допомогою твердофазного імуноферментного аналізу (ЕГІ5А), або іншими методиками, відомими спеціалісту в даній галузі, наприклад, за допомогою метода поверхневого плазмонного резонансу (ІГіШеріадй та ін., сСіусо 9 17, 2000, сс. 323-329), і традиційних аналізів зв'язування (Нееєїеу, Епдосг Кез 28, 2002, сс. 217-229). Аналізи в умовах конкуренції можна застосовувати для ідентифікації антитіла, яке конкурує з референс-антитілом за зв'язування з конкретним антигеном. В деяких варіантах здійснення винаходу зазначене антитіло, яке конкурує зв'язується 3 тим самим епітопом (наприклад, лінійним або конформаційним епітопом), з яким зв'язується референс-антитіло. Докладня, наведені як приклади, методи картирування епітопу, з яким зв'язується антитіло, представлені у Могтів, "Ерйоре Марріпуд Ргоїосої5" в: Мештоавз іп МоїІесшіаг Віоіоду, вид-во Нитапа Ргез55, Тоїоуа, МУ, т. 66, 1996. При здійсненні наведеного як приклад аналізу в умовах конкуренції іммобілізований антиген інкубують в розчині, який містить перше мічене антитіло, яке зв'язується з антигеном, і друге немічене антитіло, яке підлягає тестуванню відносно його здатності конкурувати з першим антитілом за зв'язування з антигеном. Друге антитіло може бути присутнім в супернатанті гібридоми. Як контроль іммобілізований антиген інкубують в розчині, що містить перше мічене бо антитіло, але не друге немічене антитіло що містить. Після інкубації в умовах, що забезпечують зв'язування першого антитіла з антигеном, надлишок незв'язаного антитіла видаляють і оцінюють кількість мітки, асоційованої з іммобілізованим антигеном. Якщо кількість мітки, асоційованої з іммобілізованим антигеном, суттєво знижена у зразку для тестування у порівнянні з контрольним зразком, то це свідчить про те, що друге антитіло конкурує з першим антитілом за зв'язування з антигеном (див. Нагіому і І апе. Апіїбодіє5: А І арогаїогу Мапиаї, вид-во
Соа 5ргіпд Нагбог І арогафогу, Соїд 5ргіпд Нагбог, МУ, гл. 14, 1988).
Злиті білки, одержані за допомогою представлених в даному описі методів, можна очищати з використанням відомих в даній галузі методик, таких як рідинна хроматографія високого розділення, іонообмінна хроматографія, гель-електрофорез, афінна хроматографія, гель- фільтрація тощо. Фактичні умови, застосовні для очистки конкретного білка, залежать, зокрема, від таких факторів, як чистий заряд, гідрофобність, гідрофільність тощо, і вони повинні бути очевидними спеціалісту в даній галузі Для очистки антитіла за допомогою афінної хроматографії можна застосовувати ліганд, рецептор або антиген, з яким зв'язується злитий білок. Для очистки, наприклад, за допомогою афінної хроматографії злитих білків, що запропоновані у винаході, можна застосовувати матрикс з білком А або білком б. Наприклад, послідовне застосування афінної хроматографії на білку А або с і гель-фільтрації можна застосовувати для виділення злитого білка, практично відповідно до методу, описаного в розділі "Приклади". Чистоту злитих білків можна визначати за допомогою будь-якого з широкої різноманітності добре відомих аналітичних методів, включаючи гель-електрофорез, рідинну хроматографію високого тиску тощо. Наприклад, встановлено, що злиті білки, які експресували відповідно до описаним в розділі "Приклади" методам, є інтактними і правильно зібраними, що продемонстровано за допомогою ДСН-ПААГ у відновлювальних і невідновлювальних умовах (див., наприклад, фіг. 4).
Композиції, препаративні форми і шляхи введення
Наступним об'єктом винаходу є фармацевтичні композиції, які містять будь-який з злитих білків, представлених в даному описі, наприклад, призначення для застосування у будь-якому із зазначених нижче терапевтичних способів. В одному з варіантів здійснення винаходу фармацевтична композиція містить будь-який із злитих білків, представлених в даному описі, і фармацевтично прийнятний носій. В іншому варіанті здійснення винаходу фармацевтична композиція містить будь-який з злитих білків, представлених в даному описі, і щонайменше один додатковий терапевтичний засіб, наприклад, зазначений нижче.
Окрім того, представлений спосіб одержання злитого білка, згідно з винаходом, в формі, придатній для введення іп мімо, який полягає в тому, що (а) одержують злитий білок, відповідно до винаходу, і (б) поєднують в препаративній формі злитий білок щонайменше з одним фармацевтично прийнятним носієм, де приготовлений препарат злитого білка є придатним для застосування іп мімо.
Фармацевтичні композиції, запропоновані в даному винаході, містять в терапевтично ефективній кількості один або декілька злитих білків, який(ї) розчинений(і) або диспергований|і) у фармацевтично прийнятному носії. Поняття "фармацевтично або фармакологічно прийнятний" відноситься до молекулярних субстанцій і композицій, які, в цілому, є нетоксичними для реципієнтів в застосовних дозах і концентраціях, тобто не викликають шкідливі, алергійні або інші небажані реакції при відповідному введенні тварині, такій, наприклад, як людина.
Приготовлення фармацевтичної композиції, яка містить щонайменше один злитий білок і необов'язково додаткову діючу речовину, повинно бути очевидним спеціалістам в даній галузі в світлі даного опису, наприклад, з довідника Кетіпдіоп'є Рпагтасецшііса! бсіепсев, 18-е вид., вид- во Маск Ргіпіпд Сотрапу, 1990, включеного в даний опис як посилання. Окрім того, очевидно, що препарати, призначення для введення тварині (наприклад, людині), повинні задовольняти вимоги стандартів стерильності, пірогенності й загальної безпеки й чистоти, розроблених відділенням біологічних стандартів ЕСА (Управління контролю харчових продуктів і лікарських засобів) або відповідним уповноваженим органом інших країн. Переважними композиціями є ліофілізовані препаративні форми або водні розчини. В контексті даного опису "фармацевтично прийнятний носій" охоплює будь-які й всі розчинники, буфери, дисперсійні середовища, покриття, поверхнево-активні речовини, антиоксиданти, консерванти (наприклад, антибактеріальні агенти, протигрибкові агенти), агенти для надання ізотонічності, агенти, які уповільнюють абсорбцію, солі, білки, лікарські засоби, стабілізатори лікарських засобів, полімери, гелі, зв'язувальні речовини, ексципієнти, розпушувачі, замащувачі, підсолоджувальні речовини, коригенти, барвники і подібні матеріали і їх комбінації, які повинні бути відомі звичайному спеціалісту в даній галузі (див., наприклад, довідник Кептіпдіоп'є Рпаптасешіісаї осієпсе5, 18-ое вид., вид-во Маск Ргіпіпд Сотрапу, 1990, сс. 1289-1329, включений в даний бо опис як посилання). Будь-який загальноприйнятний носій, якщо тільки він є сумісним з діючою
Зо речовиною, можна застосовувати в терапевтичних або фармацевтичних композиціях.
Композиція може містити різні типи носіїв залежно від того, чи вводять її в твердій, рідкій або аерозольній формі, і від того, чи повинна вона бути стерильною, як у випадку застосування таких шляхів введення, як ін'єкція. Злиті білки, запропоновані в даному винаході (і додатковий терапевтичний засіб), можна вводити за допомогою будь-якого метода або будь-який комбінації методів, відомих звичайному спеціалісту в даній галузі (див., наприклад, довідник Кетіпдіоп'5
Рпагтасешііса! бсієпсез5, 18-е вид., вид-во Маск Ргіпіпуд Сотрапу, 1990, включений в даний опис як посилання). Для введення поліпептидних молекул, таких як злиті білки, запропоновані у винаході, найбільш часто застосовують парентеральне введення, насамперед, внутрішньовенну ін'єкцію.
Парентеральні композиції охоплюють композиції, створені для введення шляхом ін'єкції, наприклад, підшкірної, внутрішньошкірної всередину ушкодження, внутрішньовенної, внутрішньоартеріальної, внутрішньом'язової, підоболонкової або внутрішньочеревної ін'єкції.
Для ін'єкції злиті білки, запропоновані у винаході, можна охоплювати в препаративні форми у вигляді водних розчинів, переважно у фізіологічно сумісних буферах, таких як розчин Хенкса, розчин Рінгера або фізіологічний соляний буфер. Розчин може містити агенти, призначені для одержання препаративної форми, такі як суспендувальні, стабілізувальні і/або диспергувальні агенти. Альтернативно до цього, злиті біли можуть находиться в порошкоподібній формі, призначеній для відновлення перед застосуванням прийнятним наповнювачем, наприклад, стерильною водою, яка не містить пірогенів. Стерильні розчини для ін'єкцій готують шляхом включення злитих білків, що запропоновані у винаході, в потрібній кількості у відповідний розчинник при необхідності в поєднанні з різними іншими інгредієнтами, перерахованими нижче. Стерильність можна легко забезпечувати, наприклад, шляхом фільтрації через стерильні фільтрувальні мембрани. Як правило, дисперсії одержують шляхом включення різних стерилізованих діючих речовин в стерильний наповнювач, який містить основне дисперсійне середовище і/або інші інгредієнти. У випадку стерильних порошків для одержання стерильних розчинів для ін'єкцій, суспензій або емульсій переважними методами одержання є вакуумна сушка або сушка виморожуванням, які дозволяють одержувати порошок діючої речовини в поєднанні з будь-яким додатковим потрібних інгредієнтом з попередньо стерилізованим
Зо фільтрацією рідким середовищем. При необхідності рідке середовище перед застосуванням повинно бути відповідним чином забуферене і рідкому розріджувачу спочатку надана ізотонічність за допомогою достатньої кількості соляного розчину або глюкози. Композиція повинна бути стабільною в умовах приготування і зберігання і захищена від забруднювальної дії мікроорганізмів, таких як бактерії і гриби. Прийнято підтримувати забруднення ендотоксинами на мінімальному безпечному рівні, наприклад, менше 0,5 нг/мг білка. Придатні фармацевтично прийнятні носії охоплюють (але, не обмежуючись тільки ними): буфери, такі як фосфатний, цитратний і буфери на основі інших органічних кислот; антиоксиданти, включаючи аскорбінову кислоту і метіонін; консерванти (такі як октадецилдиметилбензиламмонійхлорид; гексаметонійхлорид; бензалконійхлорид; бензетонійхлорид; фенол, бутиловий або бензиловий спирт; алкілпарабени, такі як метил- або пропілпарабен; катехол, резорцинол; циклогексанол; 3- пентанол і мета-крезол); низькомолекулярні (які містять менше приблизно 10 залишків) поліпептиди; білки, такі як сироватковий альбумін, желатин або імуноглобуліни; гідрофільні полімери, такі як полівінілпіролідон; амінокислоти, такі як гліцин, глутамін, аспарагін, гістидин, аргінін або лізин; моносахариди, дисахариди й інші вуглеводи, включаючи глюкозу, маннозу або декстрини; хелатувальні агенти, такі як ЕДТК; цукри, такі як сахароза, манніт, трегалоза або сорбіт; солеутворюючі протиїіони, такі як натрій; комплекси з металами (наприклад, комплекси 2 п-білок); і/або неіоногенні поверхнево-активні речовини, такі як поліетиленгліколь (ПЕГ). Водні суспензії для ін'єкцій можуть містити сполуки, які підвищують в'язкість суспензії, такі як натрієва сіль карбоксиметилцелюлози, сорбіт, декстран або т.п. Необов'язково суспензія може містити також стабілізатори або агенти, які підвищують розчинність сполук, що дозволяє одержувати висококонцентровані розчини. Окрім того, суспензії діючих речовин можна одержувати у вигляді відповідних масляних призначених для ін'єкції суспензій. Прийнятні ліпофільні розчинники або наповнювачі охоплюють жирні нелеткі олії, такі як кунжутна олія, або синтетичні ефіри жирних кислот, такі як етилолеати або тригліцериди, або ліпосоми.
Фармацевтичні композиції, які містять злиті білки, запропоновані у винаході, можна готувати за допомогою загальноприйнятних процесів змішування, розчинення, емульгування, капсулювання, захоплення або ліофілізації. Фармацевтичні композиції можна включати в препаративні форми за допомогою загальноприйнятного метода з використанням одного або декількох фізіологічно прийнятних носіїв, розріджувачів, ексципієнтів або допоміжних речовин, бо які полегшують процесування білків, з одержанням препаратів, які можна застосовувати в фармацевтичних цілях. Відповідна форма залежить від вибраного способу введення.
Злиті білюи можна охоплювати в композиції у вигляді вільної кислоти або вільної основи, в нейтральній формі або у формі солі.
Фармацевтично прийнятні солі представляють собою солі, які практично зберігають біологічну активність вільної кислоти або вільної основи. Вони охоплюють кислотно-адитивні солі, наприклад, солі, утворені з вільними аміногрупами білкової композиції, або утворені з неорганічними кислотами, такими, наприклад, як соляна або фосфорна кислота, або з органічними кислотами, такими як оцтова, щавлева, винна або мигдальна кислота. Солі, утворені з вільними карбоксильними групами, можна одержувати також з неорганічних основ, таких, наприклад, як гідроксиди натрію, калію, амонію, кальцію або заліза; або таких органічних основ як ізопропіламін, триметиламин, гістидин або прокаїн. Фармацевтичні солі мають тенденцію до більш високої розчинності у водних й інших протонних розчинниках у порівнянні з відповідними формами у вигляді вільних основ.
Способи і композиції для терапевтичного застосування
Будь-які злиті білки, представлені в даному описі, можна застосовувати в терапевтичних способах.
Для застосування в терапевтичних способах злиті білки, запропоновані у винаході, можна охоплювати в склад препаративних форм, дозувати і вводити у відповідності з належною клінічною практикою. Фактори, які розглядають в цьому контексті охоплюють конкретне порушення, яке підлягає лікуванню, конкретного ссавця, який підлягає лікуванню, клінічний стан конкретного пацієнта, причину порушення, область введення агенту, метод введення, схему введення й інші фактори, відомі медикам-практикам.
Одним з об'єктів винаходу є злиті білки, запропоновані у винаході, призначення для застосування як лікарського засобу. наступними об'єктами винаходу є злиті білки, запропоновані у винаході, призначення для застосування для лікування захворювання. Деякими варіантами здійснення винаходу є злиті білки, запропоновані у винаході, призначення для застосування в способі лікування. Одним з варіантів здійснення винаходу є злитий білок, представлений в даному описі, призначений для застосування при лікуванні захворювання в індивідуума, який цього потребує. Деякими варіантами здійснення винаходу є злитий білок,
Зо призначений для застосування в способі лікування індивідуума, який має захворювання, що полягає в тому, що вводять індивідууму в терапевтично ефективній кількості злитий білок. В деяких варіантах здійснення винаходу захворювання, що підлягає лікуванню, представляє собою аутоїмунне захворювання. Прикладами аутоїмунних захворювань є діабет типу 1, псоріаз, астма, ревматоїдний артрит, запальне захворювання кишечника, хворобу Крона, неспецифічний виразковий коліт, системний червоний вовчак (5 Е) і розсіяний склероз. В одному з варіантів здійснення винаходу захворювання представляє собою відторгнення трансплантату або реакцію "трансплантат-проти-хазяїна". В конкретному варіанті здійснення винаходу захворювання вибирають з групи, що містить діабет типу 1, запальне захворювання кишечника, хворобу Крона, неспецифічний виразковий коліт, 5І Е і розсіяний склероз. В більш конкретному варіанті здійснення винаходу захворювання представляє собою діабет типу 1. В іншому конкретному варіанті здійснення винаходу захворювання представляє собою запальне захворювання кишечника. В іншому конкретному варіанті здійснення винаходу захворювання представляє собою розсіяний склероз. В інших варіантах здійснення винаходу захворювання представляє собою астму, легеневий фіброз або обструктивне захворювання легенів. В наступних варіантах здійснення винаходу захворювання представляє собою серцево-судинне захворювання, насамперед атеросклероз і гострий коронарний синдром. В інших варіантах здійснення винаходу захворювання представляє собою алергійний стан, насамперед алергію на харчові продукти. В деяких варіантах здійснення винаходу спосіб полягає також в тому, що вводять індивідууму в терапевтично ефективній кількості щонайменше один додатковий терапевтичний засіб, наприклад, імунодепресант, якщо захворювання, що підлягає лікуванню, представляє собою аутоіїмунне захворювання. "Індивідуум" в контексті будь-якого з зазначених вище варіантів здійснення винаходу представляє собою ссавця, переважно людину.
Наступним об'єктом винаходу є застосування злитого білка, згідно з винаходом, для виробництва або приготування лікарського засобу, який призначений для лікування захворювання в індивідуума, який цього потребує. В одному з варіантів здійснення винаходу лікарський засіб призначений для застосування в способі лікування захворювання, що полягає в тому, що вводять індивідууму, який має захворювання, в терапевтично ефективній кількості лікарський засіб. В деяких варіантах здійснення винаходу захворювання, що підлягає лікуванню, представляє собою аутоїмунне захворювання. В одному з варіантів здійснення винаходу бо захворювання представляє собою відторгнення трансплантату або реакцію "трансплантат-
проти-хазяїна". В конкретному варіанті здійснення винаходу захворювання вибирають з групи, що містить діабет типу 1, запальне захворювання кишечника, хворобу Крона, неспецифічний виразковий коліт, 5І Е і розсіяний склероз. В більш конкретному варіанті здійснення винаходу захворювання представляє собою діабет типу 1. В іншому конкретному варіанті здійснення винаходу захворювання представляє собою запальне захворювання кишечника. В іншому конкретному варіанті здійснення винаходу захворювання представляє собою розсіяний склероз.
В інших варіантах здійснення винаходу захворювання представляє собою астму, легеневий фіброз або обструктивне захворювання легенів. В інших варіантах здійснення винаходу захворювання представляє собою алергійний стан, насамперед алергію на харчові продукти. В наступних варіантах здійснення винаходу захворювання представляє собою серцево-судинне захворювання, насамперед атеросклероз і гострий коронарний синдром. В деяких варіантах здійснення винаходу спосіб додатково полягає в тому, що вводять індивідууму в терапевтично ефективній кількості щонайменше один додатковий терапевтичний засіб, наприклад, імунодепресант, якщо захворювання представляє собою аутоїмунне захворювання. "Індивідуум" в контексті будь-якого з зазначених вище варіантів здійснення винаходу може представляти собою ссавця, переважно людину.
Наступним об'єктом винаходу є спосіб лікування захворювання в індивідуума, який полягає в тому, що зазначеному індивідууму в терапевтично ефективній кількості вводять злитий білок, відповідно до винаходу. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначеному індивідууму вводять композицію, яка містить злитий білок, відповідно до винаходу, в фармацевтично прийнятній формі. В деяких варіантах здійснення винаходу захворювання, що підлягає лікуванню, представляє собою аутоїмунне захворювання. В одному з варіантів здійснення винаходу захворювання представляє собою відторгнення трансплантату або реакцію "трансплантат-проти-хазяїна". В конкретному варіанті здійснення винаходу захворювання вибирають з групи, що містить діабет типу 1, запальне захворювання кишечника, хворобу
Крона, неспецифічний виразковий коліт, 5 Е і розсіяний склероз. В більш конкретному варіанті здійснення винаходу захворювання представляє собою діабет типу 1. В іншому конкретному варіанті здійснення винаходу захворювання представляє собою запальне захворювання кишечника. В іншому конкретному варіанті здійснення винаходу захворювання представляє
Зо собою розсіяний склероз. В інших варіантах здійснення винаходу захворювання представляє собою астму, легеневий фіброз або обструктивне захворювання легенів. В інших варіантах здійснення винаходу захворювання представляє собою алергійний стан, насамперед алергію на харчові продукти. В наступних варіантах здійснення винаходу захворювання представляє собою серцево-судинне захворювання, насамперед атеросклероз і гострий коронарний синдром. В деяких варіантах здійснення винаходу спосіб додатково полягає в тому, що вводять індивідууму в терапевтично ефективній кількості щонайменше один додатковий терапевтичний засіб, наприклад, імунодепресант, якщо захворювання представляє собою аутоїмунне захворювання. "Індивідуум" в контексті будь-якого з зазначених вище варіантів здійснення винаходу може представляти собою ссавця, переважно людину.
В деяких варіантах здійснення винаходу злиті білки, запропоновані у винаході, в ефективній кількості вводять в клітину. В інших варіантах здійснення винаходу злиті білки, запропоновані у винаході, вводять в терапевтично ефективній кількості індивідууму для лікування захворювання.
Для попередження або лікування захворювання відповідна доза злитого білка, згідно з винаходом (при його застосуванні індивідуально або в поєднанні з одним або декількома іншими додатковими терапевтичними засобами), повинна залежати від типу захворювання, який підлягає лікуванню, шляху введення, ваги тіла пацієнта, типу злитого білка, серйозності й перебігу захворювання, від того, чи вводять злитий білок в профілактичних або терапевтичних цілях, попередніх або здійснюваних одночасно терапевтичних утручань, історії хвороби пацієнта і відповіді на злитий білок і припису лікаря. Спеціаліст-практик, який відповідає за введення, у будь-якому випадку, повинний визначати концентрацію діючої(їх) речовини(в) в композиції ії відповідної дози(доз) для конкретного індивідуума. Різні схеми введення доз охоплюють (але, не обмежуючись тільки ними) одноразове введення або декілька введень в різні моменти часу, болюсне введення і пульсувальну інфузію.
Злитий білок можна вводити пацієнту у вигляді однієї обробки або серій обробок. В залежності від типу і серйозності захворювання доза злитого білка, що складає приблизно від 1 мкг/кг до 15 мг/кг (наприклад, 0,1-10 мг/кг), може представляти собою початкову можливу дозу для введення пацієнту, наприклад, з використанням одного або декількох індивідуальних введень або за допомогою безперервної інфузії. Типова добова доза може складати від бо приблизно 1 мкг/кг до 100 мг/кг або більш в залежності від зазначених вище факторів. Для повторних введень протягом декількох днів або більш тривалого періоду в залежності від стану лікування, як правило, повинно тривати до досягнення потрібного пригнічення наявних симптомів захворювання. Як приклад, доза злитого білка може складати від приблизно 0,005 до приблизно 10 мг/кг. В іншому прикладе (але, не обмежуючись тільки зазначеним) доза на одно введення може складати від приблизно 1, приблизно 5, приблизно 10, приблизно 50, приблизно 100, приблизно 200, приблизно 350, приблизно 500 мкг/кг ваги тіла, приблизно 1, приблизно 5, приблизно 10, приблизно 50, приблизно 100, приблизно 200, приблизно 350, приблизно 500 до приблизно 1000 мг/кг/ваги тіла або більш, і находиться в будь-якому зазначеному діапазоні. Як приклади (але, не обмежуючись тільки ними) зазначеного діапазону, можна вводити від приблизно 5 до приблизно 100 мг/кг ваги тіла, від приблизно 5 мкг/кг ваги тіла до приблизно 500 мг/кг ваги тіла тощо з урахуванням зазначених вище рівнів доз. Так, пацієнту можна вводити одну або декілька доз, що складають приблизно 0,5, 2,0, 5,0 або 10 мг/кг (або любую їх комбінацію). Зазначені дози можна вводити переривчасто, наприклад, кожного тижня або кожні три тижні (наприклад, таким чином, щоб пацієнт одержував від приблизно двох до приблизно двадцяти або, наприклад, приблизно шість доз злитого білка). Можна вводити початкову більш високу ударну дозу, після якої застосовувати одну або декілька більш низьких доз. Однак можна застосовувати інші схеми введення доз. Успіх такої терапії легко оцінювати за допомогою загальноприйнятних методик і аналізів.
Злиті білки, запропоновані у винаході, як правило, слід застосовувати в кількості, ефективній для досягнення поставленої мети. При застосуванні для лікування або попередження хворобливого стану злиті білки, запропоновані у винаході, або їх фармацевтичні композиції, вводять або застосовують в терапевтично ефективній кількості. Визначення терапевтично ефективної кількості знаходиться в компетенції спеціалістів в даній галузі, насамперед в світлі представленого докладного опису винаходу.
Для системного введення терапевтично ефективну дозу можна спочатку визначати за допомогою аналізів іп міїго, наприклад, аналізів з використанням клітинних культур. Потім дозу можна охоплювати в форму для вивчення на тваринних моделях для досягнення концентрації в кровотоці, яка знаходиться в діапазоні, що охоплює значення ІСво, визначене на клітинній культурі. Зазначену інформацію можна застосовувати для більш точного визначення доз, які
Зо можна застосовувати на людях.
Початкові дози можна оцінювати також, виходячи з даних, одержаних іп мімо, наприклад, на тваринних моделях, застосовуючи методики, добре відомі в даній галузі. Звичайний спеціаліст в даній галузі легко може оптимізувати застосування на людях на основі даних, одержаних на тваринах.
Рівень доз й інтервал можна регулювати індивідуально для одержання рівнів в плазмі злитих білків, які є достатніми для підтримання терапевтичного дії. Звичайні дози, призначення для введення пацієнту шляхом ін'єкції, складають від приблизно 0,1 до 50 мг/кг/день, як правило, від приблизно 0,5 до 1 мг/кг/ день. Для досягнення терапевтично ефективних рівнів в плазмі можна вводити декілька доз кожного дні. Рівні в плазмі можна оцінювати, наприклад, за допомогою ЖХВР.
У випадках місцевого застосування або вибіркового поглинання ефективна місцева концентрація злитого білка може не відповідати концентрації в плазмі. Спеціаліст в даній галузі може оптимізувати терапевтично ефективні місцеві дози без проведення надлишкових експериментів.
Застосування в терапевтично ефективній дозі злитих білків, представлених в даному описі, повинно, як правило, забезпечувати терапевтичну користь, не викликаючи суттєву токсичність.
Токсичність і терапевтичну ефективність злитого білка можна визначати за допомогою стандартних фармацевтичних процедур на культурах клітин або експериментальних тварин.
Аналізи на клітинних культурах і опити на тваринах можна застосовувати для визначення значень І Охо (доза, смертельна для 50 95 популяції) і ЕОзо (доза, терапевтично ефективна для 5095 популяції). Співвідношення доз, що характеризують токсичні й терапевтичні дії, позначають як терапевтичний індекс, який можна виражати у вигляді відношення ІЮО5о0/ЕЮбво.
Злиті білкию, що мають високі терапевтичні індекси, є переважними. В одному з варіантів здійснення винаходу злитий білок, що запропонований в даному винаході, характеризується високим терапевтичним індексом. Дані, одержані в аналізах з використанням клітинних культур і в експериментах на тваринах, можна застосовувати для визначення діапазону доз, які можна застосовувати на людях. Доза знаходиться переважно в діапазоні концентрацій в кровотоці, які охоплюють ЕЮ»во, що мають невисоку токсичність або не мають токсичності. Доза може варіюватися в даному діапазоні в залежності від різних факторів, наприклад, від застосовної бо лікарської форми, застосовного шляху введення, стану індивідуума і т.п. Точну препаративну форму, шліх введення і дозу може вибирати індивідуально лікар в залежності від стану пацієнта (див., наприклад, Ріпоі! та ін., в: Те РІПаптасоїодіса! Вазі5 ої Тпегарешісв5, гл. 1, 1975, 3. 1, публікація повністю включена в даний опис як посилання).
Для лікаря пацієнтів, яким вводять злиті білки, запропоновані у винаході, повинно бути очевидно, як і коли завершувати, робити перерву або регулювати введення з причин токсичності, дисфункції органів і т.п. Ї, навпаки, для лікаря повинно бути очевидним, як регулювати лікування в бік застосування більш високих доз, якщо клінічний відповідь є неадекватним (уникаючи токсичності). Величина дози для введення при лікуванні відповідного порушення повинна варіюватися в залежності від серйозності стану, який підлягає лікуванню, шляху введення і т.п. Серйозність стану можна, наприклад, оцінювати серед іншого за допомогою стандартних прогностичних методів оцінки. Окрім того, доза і передбачувана частота введення дози повинна також варіюватися в залежності від віку, ваги тіла і відповіді індивідуального пацієнта.
Інші засоби і варіанти лікування
Злиті білки, запропоновані у винаході, при лікуванні можна вводити в поєднанні з одним або декількома іншими засобами. Наприклад, злитий білок, відповідно до винаходу, можна вводити сумісно щонайменше з одним додатковим терапевтичним засобом. Поняття "терапевтичний засіб" охоплює будь-який засіб, який вводять для лікування симптому або захворювання в індивідуума, який потребує такого лікування. Зазначений додатковий терапевтичний засіб може представляти собою будь-які діючі речовини, які можна застосовувати при конкретному показанні, що підлягає лікуванню, переважно з додатковими видами активності, які не мають негативної дії одна на іншу. В деяких варіантах здійснення винаходу додатковий терапевтичний засіб представляє собою імунодепресант.
Зазначені інші засоби можуть бути присутніми в комбінації в кількостях, ефективних для зазначених цілей. Ефективна кількість зазначених інших засобів залежить від кількості застосовного злитого білка, типу порушення або лікування, і інших зазначених вище факторів.
Злиті білки, як правило, застосовують в таких самих дозах і з використанням шляхів введення, зазначених в даному описі, або в дозах, що складають приблизно від 1 до 99 95 від зазначених в даному описі доз, або в будь-який дозі і з використанням будь-якого шляху введення, які відповідно до емпіричних/клінічних даних розглядають як прийнятні.
Зазначені вище комбіновані терапії передбачають сумісне введення (коли два або більшу кількість терапевтичних засобів включають в одну і ту ж саму або в окремі композиції) і роздільне введення, у цьому випадку введення злитого білка, згідно з винаходом, можна здійснювати до, одночасно і/або після введення додаткового терапевтичного засобу і/або ад'юванту.
Вироби
Іншим об'єктом винаходу є виріб, який містить продукти, застосовні для лікування, попередження і/або діагностування зазначених вище порушень. Виріб представляє собою контейнер і етикетку або листівку-вкладиш в упаковку, яка розміщена на контейнері або додається до нього. Прийнятними контейнерами є, наприклад банки, пухирці, шприці, пакети для внутрішньовенного (ім) розчину тощо. Контейнери можна виготовляти з різних матеріалів, таких як скло або пластмаса. Контейнер містить композицію, яка сама по себе або в поєднанні з іншою композицією є ефективною для лікування, попередження і/або діагностування стану, і може мати стерильний порт доступу (наприклад, контейнер може представляти собою пакет для внутрішньовенного розчину або пляшечку, оснащену пробкою, яку можна проколювати за допомогою голки для підшкірних ін'єкцій). Щонайменше одна діюча речовина в композиції представляє собою злитий білок, відповідно до винаходу. На етикетці або листівці-вкладиші в упаковку зазначено, що композицію застосовують для лікування вибраного стану. Окрім того, виріб може охоплювати (а) перший контейнер з наявною в ньому композицією, де композиція містить злитий білок, відповідно до винаходу; і (б) другий контейнер з наявною в ньому композицією, де композиція містить додатковий терапевтичний засіб. Відповідно до цього варіанту здійснення винаходу виріб може містити листівку-вкладиш в упаковку, яка містить інформацію про те, що композиції можна застосовувати для лікування конкретного стану. В альтернативному або додатковому варіанті виріб може охоплювати також другий (або третій) контейнер з фармацевтично прийнятним буфером, таким як бактеріостатична вода для ін'єкцій (БСВІ), забуферений фосфатом фізіологічний розчин, розчин Рінгера і розчин декстрози. Окрім того, він може охоплювати інші продукти, необхідні з комерційної точки зору і з точки зору споживача, зокрема, інші буфери, розріджувачі, фільтри, голки і шприці.
Приклади бо Нижче представлені приклади способів і композицій, що запропоновані у винаході. Як повинно бути очевидно, можна здійснювати на практиці різні інші варіанти здійснення винаходу з урахуванням представленого вище опису винаходу в цілому.
Методи рекомбінантної ДНК
Для маніпуляцій з ДНК застосовували стандартні методи, описані у ЗатбгоокК .. та ін.,
Моїесшіаг сіопіпд: А Іабогаїогу тапиа!; вид-во Соїд Зргіпуд Нагбог І арогаїогу Ргезв5, Соїд 5ргіпд
Нагрог, Мем/ МогкК, 1989. Реагенти для молекулярної біології застосовували відповідно до інструкцій виробників. Загальну інформацію, яка стосується нуклеотидних послідовностей легких і важких ланцюгів людських імуноглобулінів, див. у: Кабраї Е.А. та ін., Зедцепсе5 ої
Ргоївїпв ої Іттипоіодісаї Іпіегеві, 5-ое вид., вид-во МІН, публікація Мо 91-3242, 1991.
Секвенування ДНК
Послідовності ДНК визначали за допомогою секвенування двох ланцюгів.
Синтез генів
Потрібні сегменти генів або створювали за допомогою ПЛР з використанням відповідних матриць, або синтезували на фірмі Сепеагй АС (Регенсбург, Німеччина) з синтетичних олігонуклеотидів і ПЛР-продуктів шляхом автоматичного синтезу генів. В випадках, коли точна генна послідовність не була доступною, створювали олігонуклеотидні праймери на основі послідовностей найближчих гомологів і гени виділяли за допомогою ОТ-ПЛР з РНК, одержаної з відповідної тканини. Сегменти генів, фланковані одиничними сайтами, розпізнаваними рестриктазами (ендонуклеазами), клонували в стандартних векторах для клонування/секвенування. Плазмідну ДНК очищали з трансформованих бактерій і визначали концентрацію за допомогою Уф-спектроскопії. Послідовність ДНК субклонованих фрагментів генів підтверджували ДНК-секвенуванням. Створювали сегменти генів з потрібними сайтами рестрикції, які дозволяють субклонувати їх у відповідних експресійних векторах. Всі конструкції створювали з 5'-кіндцевою послідовністю ДНК, що кодує лідерний пептид, який спрямовує секрецію білків в еукаріотичних клітинах. В БЕО ІЮ МО: 39-47 представлені приклади лідерних пептидів і полінуклеотидних послідовностей, які кодують їх.
Одержання злиття Ву-субодиниця ІІ -2В-Ес і злиття а-субодиниця ІІ -28-Ес
Для вивчення афінності зв'язування рецептора 1-2 створювали "Інструмент", який дозволяє експресувати гетеродимерний рецептор 1-2. В-Субодиницю рецептора 1//-2 зливали з
Зо молекулою Ес, яку створювали таким чином, щоб вона мала здатність до гетеродимеризації (Ес(западина")) (див. ЗЕО ІЮО МО: 21 і 22 (людські), БЕО ІО МО: 27 і 28 (мишачі) і ЗЕО ІО МО: 33 і 34 (мавп циномолгус)), застосовуючи технологію "Кпоб5-іпіо-поїевз" (Мегспапі та ін., Маї Віотесп. 16, 1998, сс. 677-68). Потім у-субодиницю рецептора 1-2 зливали з варіантом Ес("виступ") (див.
ЗБО ІЮ МО: 23 і 24 (людські), БО ІО МО: 29 і 30 (мишачі) і 5ЕБЕО ІЮО МО: 35 і 36 (мавп циномолгус)), гетеродимеризованим з Ес("западина"). Потім зазначений злитий білок, що містить гетеродимерний Ес застосовували як субстрат для аналізу взаємодії ІІ -2/І -2-рецептор. а-Субодиницю ІІ -2К експресували у вигляді мономерного ланцюга, що несе сайт розщеплення
АстТем і Амі Ніб-метку (ЗЕО ІО МО: 25 і 26 (людські), зЕО ІЮО МО: 31 і 32 (мишачі) і ЗЕО ІЮ МО: 37 і 38 (мавп циномолгус)). Відповідні субодиниці ІІ -2Е короткочасно експресували в клітинах НЕК
ЕВМА 293 з сироваткою у випадку конструкції Ву-субодиниці ІЇ-2Е і без сироватки у випадку конструкції а-субодиниці. Конструкцію Ву-субодиниці І/-2К очищали на білку А (фірма СЕ
Неапйсаге) з наступною гель-фільтрацією (фірма СЕ Неайпсаге, Супердекс 200). а-Субодиницю
І--2К очищали з використанням Ніз-мітки на колонці МІМТА (фірма Оіадеп) з наступною гель- фільтрацією (фірма СЕ Неаййсаге, Супердекс 75). Амінокислотні й відповідні нуклеотидні послідовності різних конструкцій рецепторів представлені в 5ЕО ІЮ МО: 21-38.
Одержання злитих білків
Послідовності ДНК створювали шляхом генного синтезу і/або класичних методів молекулярної біології і субклонували в експресійних векторах ссавців під контролем промотора
МРБЗМ і проти хода транскрипції відносно синтетичного сайту полі-А, кожний вектор ніс послідовність ОгіР ЕВМ. Злиті білки, які застосовували в описаних нижче прикладах, одержували шляхом контрансфекції клітин ліні НЕК293-ЕВМА, що знаходяться на експоненціальній фазі росту, експресійними векторами ссавців, застосовуючи опосередковану фосфатом кальцію трансфекцію. Альтернативно до цього, НЕК293-клітини, що ростуть в суспензії трансфектували відповідними експресійними векторами з використанням поліетилеіміну (ПЕ). Альтернативно до цього, для одержання білків в безсироватковому середовищі застосовували пули стабільно трансфектованих СНО-клітин або клони СНО-клітин.
Потім злиті білки очищали з супернатанту. В цілому, метод полягав в наступному: злиті білки очищали з використанням однієї стадії афінної хроматографії на білку А (НіТтар РгоїА, фірма
СЕ Неайвсаге), урівноважували з використанням 20мМ фосфату натрію, 20мМ цитрату натрію, бо рН 7,5. Після внесення супернатанту колонку спочатку промивали 20мМ фосфатом натрію,
20мМ цитратом натрію, рН 7,5, а потім промивали 13,3мМ фосфатом натрію, 20мМ цитратом натрію, 500мМ хлоридом натрію, рН 5,45. Злитий білок елюювали за допомогою 20мМ цитрату натрію, 100мМ хлориду натрію, 100мМ гліцину, рН З або 10мМ цитрату натрію, рН 3,0. Фракції нейтралізували 0,5М МагНРО», рН 8,0 (1:10), поєднували і очищали гель-фільтрацією (НіїЇ оай 16/60 Супердекс 200, фірма СЕ Неайсаге або Ні оай 26/60 Супердекс 200, фірма СЕ
Неайсаге) в кінцевому буфері для продукту, що мав наступний склад: 25мМ гістидин, 140мМ
Масі, рН 6,0. Концентрацію білка в очищених зразках білків визначали, вимірюючи оптичну густину (ОГ) при 280 нм, застосовуючи коефіцієнт молярної екстинції, розрахований на основі амінокислотної послідовності. Молекулярну масу визначали також на основі амінокислотної послідовності. Чистоту і молекулярну масу злитих білків аналізували за допомогою ДСН-ПААГ в присутності відновлювача (5мМ 1,4-дитіотреїтол)у або без нього і забарвлювали кумасі діамантовим блакитним (5ЗітріеВісе "мМ Заїезіаїіп, фірма Іпмийгодеп). Гелевую систему МИРАСЕ?
Рге-Саві (фірма Іпмйгодеп) застосовували відповідно до інструкцій виробника (4-20 95 Трис- гліцинові гелі або 3-12 95 Бис-Трис). Альтернативно до цього, чистоту і молекулярну масу молекул аналізували за допомогою КЕ-ДСН в присутності відновлювача або без нього, застосовуючи систему Саїїрег Гарспір СОХІЇ (фірма Саїїрег Гезсіепсе) відповідно до інструкцій виробника. Вміст агрегатів в зразках злитих білків аналізували з використанням колонки для аналітичної гель-фільтрації з Супердекс 200 10/30005Ї (фірма СЕ Неакрсаге) в рухомому буфері, що містить 2иМ МОР5, 150мМ масі, 0,02 95 МаМз»з, рН 7,3, при 2520. Альтернативно до цього, вміст агрегатів в зразках антитіл аналізували з використанням колонки для аналітичної гель-фільтрації ТЗКоде! 53000 ЗМУ ХІІ (фірма То5зой) в рухомому буфері, що містить 25мММ
КаНРО», 125мМ Масі, 200мМ моногідрохлорид ГІ -аргініну, 0,02 95 (мас./об.) МаМ», рН 6,7, при 2596.
Результати очистки і характеризації конструкцій ОРА7О5 Ідб-ІЇ-2, ОР4А7С5 Іда-(ПІ-2)», рРА7а5 Ідс-І -2 М880, ОРА7О5 Іда-(1-2 М880)2 і ОРА7О5 Ід0-(11-2 Е95А)2 представлені на фіг. 1, 2, 3, 4 і 5 відповідно.
Афінність до І-2-рецепторам
Афінність злитих білків визначали за допомогою поверхневого плазмонного резонансу (РЕ) на пристрої Віасоге 1200 (фірма СЕ Неайсаге) для гетеродимера людського, мишачого і
Зо мавпячого (циномолгус) І/-22 Ву, застосовуючи рекомбінантний гетеродимер ІЇ/-2К Ву в наступних умовах: ліганди: гетеродимер, що містить людський, мишачий і мавпячий ІІ 2-К, що містить В-субодиницю, що містить "виступ", у-субодиницю, що містить "западину", іммобілізований на 5ЗА-чипі (з рівнями іммобілізації 194, 114 ії 116 КИ відповідно), аналіт: рРА?Та5 Ід0-ІІ-2 (див. БЕО ІЮ МО: 13, 15 ї 19), ОР47О5 ІдС-(ІІ -2)2 (див. ЗЕО ІЮО МО: 17 і 19), рРА?Та5 ІдО-ІІ -2 М880 (див. ЗЕО ІЮ МО: 15, 19 і 48), ОРА7Оа5 Ідс-(1 -2 М880)2 (див. 5ЕО ІО МО: 19 їі 50) і ОРА7СО5 ІдО-(ІЇ -2 Е9БА)» (див. ЗЕО ІО МО: 19 і 52), температура: 2593; буфер: НВЗ-ЕР; концентрація аналіту: від 100 до 1,2нМ (розведення 1:3); швидкість потоку 30 мкл/хв; асоціація: 120 з, дисоціація: 600 з для 2 найбільших концентрацій і 120 з для більш низьких концентрацій, регенерація: 60 при застосуванні ЗМ МаосІі»г; апроксимація: ленгмюрівська модель зв'язування: 171, КІЖ20, Ктах - локальне. Афінності визначали на основі кінетичних констант швидкостей Коп і
Кон. Афінність злитих білків визначали також для а-субодиниці людського, мишачого і мавпячого (циномолгус) І--2Е, застосовуючи рекомбінантну мономерну а-субодиницю 1-2 в наступних умовах: ліганди: а-субодиниця людського, мишачого і мавпячого (циномолгус) 1-28, іммобілізована на СМ5-чипі шляхом амінного поєднання (рівні іммобілізації відповідали 240, 245 і 220 КШ відповідно), аналіти: ОР47О5 ІдС-ІІ -2 (див. БЕО ІЮО МО: 13, 15 і 193, ОР4А7О5 ІдО-(ІІ -2)2 (див. ЗЕО ІЮ МО: 17 і 19), ОРА7О5 ІдС-1ІІ -2 М880 (див. ЗЕО ІЮ МО: 15, 19 і 48), ОР47О5 ІдО-(І - 2 М880)2 (див. БЕО ІЮО МО: 19 ї 50) ї ОР47О5 ІдС-(11-2 Е95А)» (див. ЕС ІЮО МО: 19 ї 52), температура: 259С; буфер: НВ5З-ЕР; концентрація аналіту від 300 до 0,41нМ (розведення 1:3); швидкість потоку 30 мкл/хв; асоціація: 120 з; дисоціація: 180 з; регенерація: 10мМ гліцин, рН 1,5 протягом 60 з. Афінності визначали шляхом аналізу стаціонарного стану.
Результати оцінки афінності на основі кінетичних характеристик для гетеродимера ІІ -2К Ву і характеристик в стаціонарному стані для «-субодиниці І--2Е представлені в таблиці 1.
Таблиця 1
Зв'язування злитих білків з ІІ -2К Ву і І-2кК а
ОРАТОБІДЯЬ 2 | 015 | 060 | 085 | 51 | 81 | Юющ 72
Злиті людський ОРА7О5 да -- ІІ -2 і їх мутанти зв'язуються не тільки з З різними ланцюгами а, В ї у людського рецептора 1-2, але також і з відповідними ланцюгами рецептора мавпи циномолгус і миші, хоча для останніх двох видів в середньому виявлена тенденція до трохи більш низької афінності зв'язування. Афінності зазначених злиття цитокіну з с-ланцюгами людини і мавпи циномолгус були порівняними, а афінність до мишачого са-ланцюга відрізнялась - у 2 рази від афінності до людського а-ланцюга, виявленої для молекул, несучих тільки один цитокіновий компонент. Для молекул, що несуть два цитокінових компонента, зазначена різниця не мала місце, ймовірно, внаслідок авідності. Афінності ОР47О5 ІдО-ІЇ-2 і ОР47О5 ІдО-ІІ-2
М880 до а-ланцюгів теоретично повинні бути однаковими, оскільки мутація М88О не повинна впливати на поверхню розділу з «-ланцюгом. М88 локалізований на поверхні розділу з ВД- ланцюгом рецептора ІЇ-2 і його зміна в результаті мутації на ЮО приводило до зниження афінності, що можна виявити при порівнянні зв'язування ОР47О5 ІдС-ІІ-2 ії ОРА7О5 Ідб-ІІ -2
М880 з 1 -2К Ду всіх трьох видів (0,15нМ, 0,бОнМ і 0,85нМ у порівнянні з 0,9З3нНМ, 1,ЗнМ і 2.4нмМ відповідно). У випадку ЮОРА7О5 ІдО-(/-2 М880)2, що несе два мутантних цитокіни І/-2, зазначена різниця, щонайменше відносно людського ІЇ-2К Ву, являлось менше вираженим, найбільш ймовірно внаслідок авідності. ОР47Сс5 Ідас-(-2)2 і ОР4А7О5 Ід0-(11-2 Е9Б5А)» характеризувались дуже схожими авідностями зв'язування з ІІ -2К Ву всіх трьох видів. Хоча Е95 також локалізований на поверхні розділу з В-ланцюгом рецептора 1І-2, його зміна в результаті мутації на А, щонайменше в том випадку, коли два зазначених мутанти злиті з Ідс, не приводило до значного зниження авідності.
Експресія ІІ -2-рецепторів на імунних клітинах
Високоафінний тримерний ІІ -2-рецептор складається з с- (І -2КА, СО25), р- (І -28В, СО122) і у- «(С-28а, СО132)-ланцюгів і має величину Ко «10пМ. СО25 індивідуально має тільки незначну афінність (Ко «1ОнМ) відносно 1-2. Димер І--2АВ/ЛІ-2КО, який експресується на деяких типах клітин за відсутності ІЇ-2КА, також зв'язується з ІІ -2, але з проміжною афінністю (Ко «ТнМ).
Передача сигналів через ІЇ-2-рецептор опосередковується ІГ-28В- і ІЇ-2ВАВСі-ланцюгами. За даними кристалографічного структурного аналізу І--2КА, ймовірно, не контактує ані з І -288,
Зо ані з І. -2КО. Висловлена гіпотеза о том, що основою узгодженої дії в тримерному рецепторі є зниження ентропії, коли СО25 "захоплює" ІІ -2 на клітинної поверхні для презентації І--2ЕВ і 1/-- 2КОо, або, альтернативно до цього, має місце індукована СО25 зміна конформації 1-2, що стабілізує комплекс. В регуляторних ЕБОХРЗ:-ОСО04--Т-клітинах має місце значний стехіометричний надлишок І-2КА у порівнянні з ІД- і у-/ланцюгами рецептора, що підтверджує гіпотезу про те, що димери або навіть більш великі комплекси, що охоплюють а-ланцюг, сприяють зв'язуванню 1-2. Встановлено також, що СО25 на одній клітині може презентувати ЇЇ - 2 димерам 1І/-2АВ/І-2КО на іншій клітині, при цьому має місце високоафінна міжклітинна взаємодія, яка підкреслює унікальний взаємозв'язок між трьома ланцюгами, з яких складається високоафінний ІІ -2-рецептор.
Експресію СО25 (ІІ -2КА) і СО122 (1-28) на субпопуляціях СО4--Тгед, субпопуляціях МК- клітин і на МКТ-клітинах, а також на субпопуляціях канонічних СО4» -і СО8:-Т-клітин визначали за допомогою ГАС5 (фіг. б і 7). Маркери клітинної поверхні застосовували для визначення субпопуляцій СО4--Тгед, МКТ-клітин і МК-клітин (фіг. 6). Для оптимізації забарвлювання з метою виявлення СО25 і СО122 не здійснювали внутрішньоклітинне забарвлювання для виявлення
ЕохР3. В цілому, метод полягав в наступному: застосовуючи 150 мкл крові здорового донора, флуоресцентні антитіла інкубували протягом 45 хв при кімнатній температурі в темноті (здійснюючи струшування на початку і через 20 хв). Еритроцити лізували в ВО-буфері для лізису (лізуючий розчин ВО БАС5, 349202) протягом 9 хв і решту клітини промивали (2 мл ЗФР 0,1 95 БСА) і фіксували (1 96 параформальдегіду (ПФА)). Клітини аналізували за допомогою клітинного аналізатора І 5КРопезза (фірма Весіоп ОіскКіпзоп) і для аналізу даних застосовували програму Біоуо (фірма Тгеевіаг). Субпопуляції Тгед ідентифікували за допомогою антитіл, специфічних відносно ТОКарВ-ФИТЦ (ІР2б, фірма ВіоЇ едепа), СО4-АІеха БРійог 700 (АРА-ТА4, фірма ВіоІ едепа), СО127-РЕ/СУ7 (еріоКОК5, фірма ЕБіозсіепсе), СО45КА-Расіїйс Вішйе (НІТОО, фірма ВіоЇ едепа), СО25-АРС (2АЗ3, М-А251, фірма ВО Віозсіепсе5) і СО122-РЕ (Т027, фірма
ВіоЇ едепа). МК- ії МКТ-клітини забарвлювали в окремій пробірці за допомогою антитіл, специфічних відносно ТСКоарф-ФИТЦ, СО4-Аієха БРійог 700, СО8-РЕ/СУ7 (НТТва, фірма
ВіоЇ еєдепа), СО56-Расіїс Вісе (НСО5б, фірма Віої едепа) СО25-АРС і СО122-РЕ. Після установки дискримінаційного вікна на лімфоцити на основі ЕЗС/55С і виключення дублетів наївні Тгед ідентифікували як ТСКар- 00400127 0025-0045ВА", Тгед пам'яті ідентифікували як ТСКар-б04-001270025:0045В8А,, а активовані Тгед ідентифікували як ТСКаф 00400127: бОгбБтенраБАА. МК-клітини ідентифікували як ТСРорВ-СО56:, а активовані МК-клітини ідентифікували як ТСКорфСОБбелом МКТ-клітини ідентифікували як ТСРарСО56:. Контролі ізотипів (ІС), кон'юговані з АРС (алофікоціанін) і РЕ (фікоеритрин), застосовували для оцінки фонового рівня флуоресценції для СО25 і СО122 відповідно.
Аналогічно до вищезазначеного, маркери клітинної поверхні застосовували для виявлення наївних і канонічних СО4--Т-клітин пам'яті (фіг. 4А і 4Б), канонічних СО8--Т-клітин пам'яті і
Ср45ВА-С08-Т-клітин (комбінація субпопуляцій наївних клітин і ТЕМКА (ТЕМКА означає ефекторні клітини пам'яті, переспрямовані на експресію СО45КА) (фіг. 7В і 7Г). Забарвлювання і аналіз здійснювали відповідно до описаному вище методу. Застосовуючи ту же пробірку, яку застосовували для характеризації СО4--Тгед, ідентифікували канонічні наївні СЮО4--Т-клітини як
ТтСкКоав бра Ср127-0025-0045АА:, і ідентифікували канонічні СО4--Т-клітини пам'яті як
ТтСкКов- бра Срі1276025-0045ВА. СО8-Т-клітини визначали, застосовуючи ТСКар-ФИТЦ,
СО8-АІеха Ріпог 700 (НТТва, фірма Віої едепа), СО28-РЕ/СУ7 (СО028.2, фірма Віої едепа),
СО45ВАА-Расіїїс Вішє, СО25-АРС і СО122-РЕ. СО8:-Т-клітини пам'яті ідентифікували як
ТСкКоарСО08С045ВА. Наївні СО8:-Т-клітини і клітини ТЕМКА ідентифікували як
ТСкКар«Сбр8СраБвВА". С028 не застосовували для того, щоб відрізняти наївні СО8--Т-клітини від СО8--ТЕМВА-Т-клітин, оскільки маркер СО28 не був включений в описаний нижче аналіз роТАтТ5а (див. фіг. 8).
В деяких тестах (фіг. 15) визначали наступні додаткові субпопуляції: центральні СО4--Т-
Зо клітини пам'яті (ТСВар"с04-С2056 " ГОХРЗСО45ВАСО127и00257), ефекторні СО4--Т-клітини пам'яті (ТСвар"с04-С056 ГОХРЗС045ВАСО127 00257), центральні СО8:-Т-клітини пам'яті (ТСвариС08и2056" ГЄОХРЗС045ААСО12700257), ефекторні СО8:-Т-клітини пам'яті (ТСвариС08и2056" ГЄОХРЗС045ААСО127002573 і СО8:-клітини ТЕМЕА (ТСКар-Сб08-2056-
ЕОХРЗСО45ВАСО0127 0025).
На фіг. 6 ії 7 представлені дані про специфічну для клітин експресії ІІ -2КА ії ІС-2КВ для субпопуляцій Т-клітин, МК-клітин і МК-Т-клітин в людської периферійної крові (І--2КО практично повсюдно експресується на гематопоетичних клітинах, так як він взаємодіє з більшою кількістю цитокінових рецепторів). Найбільш високий рівень І--2КА був присутнім на трьох популяціях регуляторних СО4--Т-клітин (Тгед): наївні клітини (СО45КАСО25), клітини пам'яті (СО45ЕА:
СО257) і активовані клітини (СО45ВАСО25") (фіг. бА). В середньому канонічні СО4--Т-клітини пам'яті експресували приблизно в 10-разів менше СО25, ніж Тгед (фіг. 7А). Експресія СО25 на наївних СО4--Т-клітинах значно варіювалась у різних донорів, але во всіх випадках виявилась нижче, ніж виявлена на СО4--Т-клітинах пам'яті (фіг. 7А). Експресія СО25 на МК, МКТ ї СО8-Т- клітинах виявилась дуже низькою і не піддавалась виявленню за виключенням СОБ5бегпот-МК- клітин (фіг. 68 і 78). СОБ5бепо"т.МК- ї Є0О56:-МК-клітини експресували найбільш високий рівень ІЇ-- 2ЕВ (фіг. 6Г), приблизно в 10 разів більш високий у порівнянні з любими іншими субпопуляціями
Т-клітин, включаючи МКТ-клітини (фіг. 6Б, 6Г, 7Б, 7Г).
Індукція роеТАтТ»5а в субпопуляціях клітин людської периферійної крові
Після індукованої І--2 олігомеризації тримерного ІС-2К цитоплазматичні протеїнтирозинкінази УАКІ1 і УЗАКЗ, які асоційовані з внутрішньоклітинними доменами 1І--2КВ і І-- 2КО відповідно, становились активованими. Ці кінази фосфорилюють визначені залишки тирозину в І -2КВ, які діють як сайти "причалювання" для ЗТАТ»5а і ЗТАТЬББ, які в свою чергу фосфорилюються. Індукована 1-2 активація декількох шляхів передачі сигналів, насамкінець, приводить до транскрипції генів-мішеней, які беруть участь в різних функціях, асоційованих з ІЇ-- 2ЛІ-2А-шляхом. Оскільки різні типи клітин експресують різні рівні молекул 1 -2КА і ІС-2в8в рецептора 1-2 (фіг.б і 7), то для розуміння інтегрованої сигнальної відповіді на 1-2, опосередкованої різними комбінаціями рецепторів з високою і проміжною афінністю, при створенні винаходу вимірювали рівні рОТАТба в індивідуальних клітинах за допомогою поліхроматичної проточної цитометрії. 60 Вплив різних доз ОР4А7О5 ІдС-ІІ-2, ОРА7а5 Ідса-( -2)», ОРА7С5 Іда-( -2Е95А)2, ОРА7Оа5
Ідса-І/-2М880 і ОРА7О5 Ід0б-(1-2М880)2 на індукцію фосфорилювання 5ТАТ5ба оцінювали з використанням субпопуляцій людських СО4--Тгед, наївних і канонічних СО4--Т-клітин пам'яті, канонічних СО8--Т-клітин пам'яті, СО45КА"СОВ8-Т-клітин, МКТ-клітин і МК-клітин (фіг. 8 і 14 і таблици 2 і 3). Всі субпопуляції характеризували в одній пробірці для кожної дози. В цілому, метод полягав в наступному: збирали зразки крові дорослих здорових добровольців в гепаринізовані пробірки. Додавали в різних концентраціях злиті білою ОР475 ІдС-ІІ-2 до 500 мкл крові і інкубували при 379С. Через 30 хв кров лізували і фіксували, застосовуючи попередньо нагрітий буфер для лізису/фіксації (фірма Весіоп РісКіпбзоп, Мо 558049), протягом 10 хв 37"С, промивали двічі ЗФР, що містять 0,2 95 БСА, і потім підвищували проникність клітин за допомогою попередньо охолодженого до -202С метанолу (фірма Зідта, чистота, придатна для застосування для біотехнології (Віоїесп дгаде), Мо 494437) протягом 20 хв на льоді. Потім клітини інтенсивно промивали чотири рази ЗФР, що містять 0,2 95 БСА, після чого здійснювали
ЕАС5-забарвлювання, застосовуючи панель флуоресцентних антитіл, дозволяючих відрізняти один від іншого різні субпопуляції лімфоцитів і МК-клітин і статус ретТАтТ5а. Застосовні антитіла представляли собою анти-СО4-Аіеха Бішог 700 (клон КРА-Т4), СОЗ-РегСР/Су5.5 (ОСНТІ),
СО45ВА-РЕ/Су7 (НІТ00), СО8-ВийШіапі Міоїєї 605 (АРА-Т8), СОБ56-ВгийШШапі Міоієї 421 (НСОББб),
ЕОХРЗ-РЕ (2590) (все від фірми ВіоЇ едепа), СО25-АРС (клони М-А251 і 2АЗ) ії реТАТ5а-АІеха
РіІног 488 (руб94) (фірма Весіоп бісКіп5оп). Зразки досліджували за допомогою аналізатора клітин ГЗКРогіезза (фірма Весіоп ОісКіпзоп) і дані аналізували за допомогою програми Ріодо (фірма Тгеезіаг). Після установки дискримінаційного вікна на лімфоцити і виключення дублетів
Тгед визначали як СО3-СОАРОХРЗ: ії підрозділлли на СО45-РОХРЗ" (активовані Тгед), сбр3:браСра45вВАГОХРЗ: (Тгед пам'яті) і СО3-004и0045ГОХРЗ: (наївні Тгед). канонічні СО4--
Т-клітини ідентифікували як СО3-СрАСраБвА: (наївні) і СО3-СрАСрА5ВА: (клітини пам'яті).
СО8-Т-клітини визначали як СО3-С208-2045ВА (клітини пам'яті) і СО3-Сб08:0045ВА:. МКТт- клітини ідентифікували як СО3-СО56: а МК-клітини визначали як СОЗ-СО56бго" (активовані МК- клітини) або СО3ЗСО56 (МК-клітини). Внутрішньоклітинні рівні реТАТ5а кількісно оцінювали у всіх субпопуляціях клітин при всіх дозах.
На фіг. 8 представлені відповіді Т-клітин, МК-клітин і МК Т-клітин в людської периферійної крові трьох донорів в залежності від дози імунокон'югату ОР4705 ІдС-І1-2, кожні з яких
Зо тестували в різні дні. Ієрархія відповіді на ОРА7О5 ІдО-ІІЇ-2 виявилась однаковою в крові трьох донорів і такою самою, яка була виявлена при застосуванні рекомбінантного людського 1-2 (РгоієшКіпУ) (дані не представлені). У всіх трьох популяціях Тгед, тобто в активованих клітинах (С045ВА", Ср25"), клітинах пам'яті (СО45КА", СО255) і наївних клітинах (СО45КА", СО257), рівні роТАТ»5а зростали при застосуванні ОР4А7О5 ІдО-ІІ -2 в концентрації 0,1 нг/мл, у той час як для інших клітинних популяцій була необхідною концентрація ОР47 ІдС-1ІІ -2, або яка перевищувала 1 нг/мл (СО5бео" МК ії С04--Т-клітин пам'яті), або яка складала 10-100 нг/мл (СО8--Т-клітини пам'яті, СО56:-МК-клітини, наївні СО4--Т-клітини, МКТ-клітини і СО45КА:СОВ8-Т-клітини), для того, щоб викликати підвищення рівнів реТАТ5ба, які піддаються виявленню. На фіг. 11 представлені більш докладно відповіді популяцій Тгед в залежності від дози, які демонструють їх високу чутливість до ОР47О5 ІдО-ІІ -2. Слід зауважити, що високий рівень експресії ІІ -2КВ на
МК-клітинах в поєднанні з помірними рівнями експресії СО56б (фіг. 6Г) у порівнянні з рівнем експресії І -2ЕВ на субпопуляціях Т-клітин є недостатнім для того, щоб проявляти аналогічну
Тгед-клітинам чутливість до 1ІІ/-2. В цілому, встановлено, що субпопуляції активованих, клітин пам'яті і наївних Тгед мали саму високі чутливість до ОРА7О5 Ідс-ІІ -2, при цьому СОБбегоМ" МК- клітини і канонічні ефекторні СО4--Т-клітини пам'яті виявились в 20-50 разів менше чутливими.
З інших проаналізованих відносно збільшення рівня роТАТ5ба субпопуляцій клітин ефекторні
СО8:-Т-клітини пам'яті, ефекторні наївні СО4--Т-клітини, МКТ-клітини, "спокійні" МК-клітини (позитивні, що не дають яскраве забарвлювання відносно СО56б) і наївні ефекторні СО8:5-Т- клітини - СО45КА"-клітини пам'яті виявились відносно нечутливими до імунокон'югату Ідо-1Ї -2.
На фіг. 9 представлені відповіді Т-клітин, МК-клітин і МК Т-клітин в людської периферійної крові п'яти донорів залежно від дози імунокон'югату ОР47О5 ІдО-(ІЇ -2)2, кожні з яких тестували в різні дні. Аналогічно тому, що було встановлено для ОРА7О5 ІдС-ІЇІ -2 (фіг. 8), три субпопуляції
Тгед представляли собою клітини, найбільш чутливі до індукції роТтАТ5а під дією ОР47О5 Ідс- (І -2)2 (фіг. 9 і 11), ії схожі ієрархічні відповіді в залежності від дози виявлені для інших клітинних субпопуляцій у всіх п'яти донорів.
Для більш простого порівняння ЮР475 Ідс-Ї-2 і ОРА7О5 ІдС-(ІПІ-2)2 рівні раТАТ5а стандартизували (фіг. 10). Для стандартизації величин МЕ! величини МЕЇ для ретАТ5а нестимульованих клітин, специфічні для кожної наявної в дискримінаційному вікні субпопуляції, вичитали з величин МРЇ для всіх стимульованих варіантів в зазначеній клітинній субпопуляції. бо Одержані величини ділили на найбільш високу величину МЕ! рЗТАТ5ба, одержану для зазначеної субпопуляції у відповідь на дозу. Визначали величини ЕСбзо на основі кількості який містить 1-2 злитого білка, потрібного для досягнення величини МРІЇ реТАТ5а, що складає 50 95 від максимальної, виявленої для даної субпопуляції. Як продемонстровано на фіг. 10, імунокон'югат ОРА7О5 ІдС-(12)2 викликав більш сильну індукцію рОТАТ5ба в клітинах, які конститутивно експресують СО25, можливо, в результаті підвищеної авідності імунокон'югату до високоафінного І -2-рецептору. Встановлено, що величина ЕСбхо, яка характеризує активацію роТАТтТ5а, в Тгед виявилась в 5-9 разів нижче для ОР47О5 Ідо-(ІЇ-2)2 у порівнянні з ОР4765
Іда-І/-2 при безпосередньому порівнянні. В таблиці 2 узагальнені репрезентативні величини
ЕСрво і кратність відмінностей активації реТАТ5а при застосуванні ОР47О5 Ід0б-ІІ -2 у порівнянні з ОР47О5 ІдО-(ІІ -2)2 в різних субпопуляціях клітин.
Таблиця 2
Величини Есово і кратність відмінностей в активації реТАтТ»5а при застосуванні рРА7Та5 Іда-ІІ -2 в порівнянні з ОРА7О5З ІдО-(ІІ -2)2 в різних клітинних субпопуляціях . Кратність (Наївна Ттед-клтина.ї 0/7 бобну/мл | бб23н/мл | 89 2
Навіть при дуже незначних концентраціях ОР4А7О5 ІдБ-(ІІ-2)2 індукував більш високі рівні роТАТ5а у порівнянні з ОРА7О5 ІдС-ІІ -2 (фіг. 11). В цьому експерименті кров трьох здорових донорів тестували індивідуально в один і той самий день відносно відповідей на титрування з використанням 2-кратних розведень ОР47 Ідс-ІЇ-2 ії ОР47 Ідо-(І/-2)2, що приводило до одержання обмежувальних концентрацій ІЇ/-2. На графіках на фіг. 11 представлені середні значення - СКО величин МЕЇ реТАтТ5а для трьох донорів. Окрім трьох вивчених індивідуально субпопуляцій Тгед (фіг. 11Б-Г), застосовували дискримінаційний аналіз для оцінки роТАТ5а во всіх СО3-СО4РохРУЗ:-Тгед-клітинах (фіг. 11А). Результати чітко продемонстрували в 5-10 разів більш високу ефективність ОР47О5 Ідо-(ІІ-2)2 відносно активації Тгед-клітин, не зважаючи на підвищення тільки в 2 рази кількості ІЇ-2 на молекулу дО. Поліхроматичну проточну цитометрію здійснювали відповідно до описаного вище метода (див. фіг. 8).
Канонічні СО4--Т-клітини пам'яті реагували також на більш низькі (в 7-разів) концентрації
ОРАТОа5 ІдС-(П-2)2 у порівнянні з ОРА7О5 ІдС-ІЇ-2. Хоча величини ЕСво виявились більш низькими для СО5бепот"-МК-клітин і СО56:-МК-клітин при порівнянні ОР4А7О5 ІдОС-(ІІ -2)2 з ОРА7
Іда-І/-2, мало місце зниження тільки в 3- і 4 рази відповідно. Це, ймовірно, пов'язано з тим, що дія цих клітин відносно опосередкованої ІІ -2 передачі сигналів зв'язано з ІЇ-2-рецептором, що має проміжну афінність. Цей диференціальний зсув величин ЕЮОвхо для Тгед-клітин відносно МК-
Зо клітин в декілька разів перевищує перевагу відносно активації Тгед-клітин.
На фіг. 12 представлена відповідь Т-клітин, МК-клітин і МК-Т-клітин в людської периферійної крові кожного з трьох донорів в залежності від дози ОРА7О5 Ідс-(ІЇ-2Е95А)», кожні з яких тестували в різні дні. Молекулу І--2Е95А створювали так, щоб вона повинна була знижувати активність зв'язування з ІІ -2КВДВу, однак було встановлено, що вона в дійсності мала властивості зв'язування з рецептором І--2КВДу, схожими з властивостями ІІ -2 дикого типу. Ієрархія відповіді на ОРА7О5 ІдО-(ІІЇ-2Е95А)» виявилась однаковою в крові трьох донорів і такою самою, яка була виявлена при застосуванні який містить І--2 дикого типу імунокон'югату ОР47О5 Ідсо-(ІІ-2) в крові цих же донорів. У всіх трьох популяціях Тгед-клітин, тобто активованих клітин (СО45БА:
СбО25"), клітин пам'яті (СО45КАСО257) і наївних клітин (С0О45ВАСО257), рівні ретТАТ5а зростали при застосуванні ОР47О5 ІдО-(ІЇ-2Е95А)» в концентрації 0,1 нг/мл, у той час як для інших клітинних популяцій була необхідною концентрація ОРА7О5 Ідсос-(ІІ-2Е95А)», або 1 нг/мл (СОБ5белот МК ї СО4--Т-клітин пам'яті), або яка складає 10-100 нг/мл (СО8--Т-клітини пам'яті,
СО56:-МК-клітини, наївні СО4--Т-клітини, МКТ-клітини і СО45КАСОВ8-Т-клітини), для того, щоб викликати підвищення рівнів ретТАт?За, які піддаються виявленню. Важно зауважити, що високий рівень експресії І -2КВ на МК-клітинах з проміжними рівнями СО56 (фіг. 6Г) у порівнянні з експресією ІЇ/-22В на субпопуляції Т-клітин був недостатнім для забезпечення схожої з Тгед чутливості до ІЇ-2. В цілому було встановлено, що субпопуляції активованих, клітин пам'яті і наївних Тгед характеризувались найбільшою чутливістю до ОРА7О5 Ідос-(І-2Е95А)», у той час як СОБ5бело"т.МК-клітини і канонічні ефекторні СЮО4--Т-клітини пам'яті були в 20-50 разів менше чутливими. Серед інших субпопуляцій клітин, які аналізували відносно підвищення роТАтТЗ5а, ефекторні СО8--Т-клітини пам'яті, наївні ефекторні СО4--Т-клітини, МКТ-клітини, "спокійні" МК- клітини (СО56б-позитивні не яскраво забарвлені) і наївні ефекторні СО8--СО45ВА:-Т-клітини виявились відносно нечутливими до імунокон'югату ІдО-(ІЇ -2Е95А)».
На фіг. 13 представлена відповідь Т-клітин, МК-клітин і МК-Т-клітин в людської периферійної крові кожного з п'яти донорів в залежності від дози ОР4А75 ІдС-(1/-2 М880)2, кожні з яких тестували в різні дні. Молекулу І/-2М880 створювали для зниження афінності зв'язування з
І 2еВу і, на відміну від молекули, що має точкову мутацію Е95А, вона мала в 6,2 рази меншу афінність зв'язування з І/2ЕКВу за даними Віасоге-аналізу (таблиця 1, Ко-0,15нМ у порівнянні з 0,93нНМ). Як встановлено при створенні даного винаходу, для всіх трьох імунокон'югатів, три субпопуляції Тгед представляли собою клітини, найбільш чутливі до активації роеТтАтТ5а з використанням ОРА7О5 ІдО-(ІЇ -2М880)», і схожі за ієрархією залежності відповіді від дози були виявлені для інших субпопуляцій клітин всіх п'яти донорів. Важно зауважити на відсутності чутливості у ефекторних СО4--Т-клітин пам'яті при стимуляції за допомогою ОР475 ІдО-(І - 2М880)2; навіть при дозах 1000 нг/мл кон'югат мав слабкий стимулювальний вплив на цю важливу з точки зору аутоіїмунітету популяцію клітин.
Як продемонстровано в даному прикладі, унікальна створена точкова мутація 1-2, М880, різко знижувала стимулювальну активність потрібної популяції клітин, а саме, всіх ефекторних браг-Т-клітин пам'яті, зберігаючи при цьому стимулювальний вплив відносно Тгед-клітин, які потрібні для нового і покращеного терапевтичного засобу.
Для порівняння який містить ІЇ-2 дикого типу ОР47О5 ІдС-(ІІ-2)2 з імунокон'югатами, що містять І/-2 з точковими мутаціями Е95А і М880, накладали один на іншого графіки величин роЗТАТтТ»5а для кожного з протестованих типів клітин (фіг. 14). Встановлено, що ОРБ547О5 ІдО-(ІІ - 2ЕЗ9ЗБА)» мав такою самою активністю, що і його аналог дикого типу, ОРА7О5 ІдО-(ІІ-2)», відносно стимуляції кожної з популяцій людських клітин, це характеризувалось тим, що криві залежності відповіді від дози можна було поєднати. На відміну від цього, молекули зі зниженою здатністю до зв'язування з І 2ЕВу, а саме, ОР4А7О5 ІдС-ІІ -24880 і ОРА7О5 ІдО-(ІІ -2М8802)»2,
Зо мали слабкий вплив на ефекторні СО4--Т-клітини пам'яті й тільки двовалентний кон'югат рРАТа5 Іда-( -2М880)2 зберігав значну стимулювальну активність відносно різних популяцій
Тгед-клітин.
На фіг. 15 представлені результати аналізу відповідей у вигляді рівнів РТАТ5а в зразках цільної крові, взятих у додаткових десяти донорів крові. Для кожного донора проводили тестування в різні дні шляхом порівняння впливів ОР4705 ІдО-(ІІ -2)2 і ОРА7О5 ІдО-(ІІЇ -2М880)», для чого здійснювали титрування в широкому діапазоні (26 І0д). Як було продемонстровано раніше для ОРА7О5 ІдО-(І -2)2 (фіг. 9), Ттед-клітини пам'яті та наївні Тгед-клітини представляли собою клітини, найбільш чутливі до індукованого ОРА7О5З Ідо-(ІІ-2)» і ОРА7О5 ІдО-( 2880)» рЗтТАТ5а (фіг. 15А, Б); при цьому, хоча кожний злитий білок дозволяв стимулювати максимальні роТАтТ»5а-відповіді, вони розрізнювались концентраціями, необхідними для досягнення точки зламу на кривій активації, а також максимальною дозою, необхідною для активації. СО5бепон-
МК-клітини представляли собою субпопуляцію клітин, менше чутливу до ЮРА7О5 Ідсос-(ІЇ- 2М880)2, у порівнянні з Тгед-клітинами, ніж до злитих білків, що містять ІЇ-2 дикого типу (фіг. 158); точка зламу на кривій активації була вище і в цьому випадку ніколи не досягався максимальний ефект, навіть при застосуванні найбільшої протестованої дози (5000 нг/мл). МК- клітини, на відміну від ОРА7О5 Ідс-(ІЇ-2)», були нечутливими до ОР47О5 ІдО-(ІІ-2М880)2 (фіг. 15Г). Як центральні СО4--Т-клітини пам'яті (фіг. 15Д), так і ефекторні СО4--Т-клітини пам'яті (фіг. 15Е), були відносно нечутливими до ОРА7О5 Ідсос-(ІЇ-2М880)2, для них точка зламу на кривій активації була в 1000 разів більш високою, ніж для ОРА7О5 ІдС-(ІІ-2)», й індукувались тільки часткові відповіді при застосуванні найбільшої протестованої дози (5000 нг/мл). У той час як ОР47О5 ІдО-(ІІ -2)» індукував активацію в різного ступеню, ОР47О5 ІдО-(ІЇ -2гМ880)»2 не мав впливу на наступні субпопуляції клітин: наївні СО4--Т-клітини (фіг. 15Ж), СО8:-Т-клітини центральної пам'яті (фіг. 153), ефекторні СО8:-Т-клітини пам'яті (фіг. 15И), наївні СО8--Т-клітини (фіг. 15К), ефекторні СО45КАСО8:-Т-клітини пам'яті (фіг. 15Л), МКТ-клітини (фіг. 15М) і бр3брасСрвсо056-Т-клітини (фіг. 15Н).
В таблиці З представлені величини ЕСзо, одержані на основі кількості злитих білків, що містять 1-2, необхідної для досягнення 50 95 від максимальної роТАтТ5а-відповіді, виявленої для субпопуляції клітин, яка розглядається. ОРА7О5 Ідс-(ІІ-2Е95А)», подібно до його аналога, рРАТа5 Іда-(ІІ -2)2, що містить ІІ -2 дикого типу, викликав найбільш сильну індукцію реТАТ5а в бо Тгед, тобто клітинах, які конститутивно експресують високоафінний рецептор СО25 (І1І/2Ка),
ймовірно, внаслідок його більш високої авідності до високоафінного рецептору ІІ -2. Залежності відповіді від дози для ОРА7О5 ІдО-(ІІ-2Е95А)» і ОРА4А7О5 ІдО-(ІЇ -2)2 виявились конгруентними.
Величина ЕСбо, яка характеризує активацію реТАТ5а в Тгед-клітинах, була в 6-7 разів менше при застосуванні ОР47О5 ІдО-(ІЇ-2Е95А)» і ОР47О5 ІдО-(ІЇ-2)2 у порівнянні з одновалентним рРА?Та5 Іда-ІІ-2. Аналогічно до цього, величина ЕСбзо, яка характеризує активацію Тгед-клітин, була в 7-10 разів менше при застосуванні одновалентного ОР475 ІдО-ІЇ-2 у порівнянні з двовалентним ОР47О5 Ідо-(ІІЇ-2М880)2. І, насамкінець, величина ЕСво, яка характеризує активацію Тгед-клітин, була в 36-61 разів менше при застосуванні двовалентного ОР475 Ідо- (І-2)2 у порівнянні з двовалентним ОРА4А7О5 Ідо-(ІІ -2М880)».
Найбільш важливу з імунологічної точки зору перевагу ОР47О5 Ідс-(ІІ/-2М880)2 при лікуванні аутоїмунних порушень краще за все проілюстровано в таблиці 3, з якої видно дуже велику різницю в специфічності, яку мав ОР4А7О5 Ідо-(ІІ -2гм880)2 відносно активації Тгед-клітин у порівнянні з активацією ефекторних СО4--клітин (вона складає від »320 разів до »500 разів).
Для порівняння, різниця в специфічності відносно Тгед-клітин у порівнянні з ефекторними СО4--
Т-клітинами пам'яті суттєво менше для ОРА7О5 ІдО-(ІІ-2)2 (вона складає від 13 до 14 разів) і рРА?ТОа5 Іда-ІІ -2 (вона складає від 10 до 16 разів).
Таблиця З
Величини ЕсСово і кратність відмінностей в специфічності відносно активації реТАТ5а при застосуванні ОР4А7О5 Іда-(ІІ -2Е95А)», ОРА7а5 Іда-1І -2 ії ОРА7ОЗ Ід0Б-(І -2М880)2 в різних субпопуляціях клітин
КЛ ТИ
Кратність розрізнення в специфічності:
Тгед-клітини памяті у порівнянні з СО4--Тей- 10 13 5500 клітинами пам'яті . . 16 14 »320 наївні Тгед-клітини у порівнянні з СО4--Тей- клітинами пам'яті
Різні впливи злитих білків, які містять 1-2, на людські МК-клітини і СО8--Т-клітини іп міго
Свіжовиділені людські мононуклеарні клітини периферійної крові (РВМС) культивували іп міго без будь-якої додаткової стимуляції, яка відрізняється від ІЇ/-2, тобто в умовах, які, як відомо, є сприятливими для виживання й росту МК-клітин і СО8--Т-клітин. Людські МК-клітини можна підрозділяти на клітини, які експресують в малих або кількостях, які не піддаються виявленню СО5б (позначені як СО56-9т) і "активовану" субпопуляцію клітин, які характеризуються високими рівнями експресії СО56 (позначені як СО56бго")3; більшість МК- клітин в крові представляють собою СО56-9т-клітини, меншість класифікують як СО5бегон- клітини. Вважають, що "активовані" МК-клітини, які представляють собою СО5боетм, є попередниками МК-клітин, які не експресують СО5б (тобто СО56-9т), Після культивування протягом шести днів іп міго в присутності ОР4А7О5 ІдО-(ІІ -2)» і ОР47О5 ІдО-(ІІ -2М880)»2 (кожний
Зо в концентрації 0, 5, 50 і 500 нг/мл) були виявлені відмінності в рості й здатності до виживання між СО56- ат-клітинами, МК СО56бегой-Т-клітинами і СО8:-Т-клітинами. Значні розрізнення в кількості клітин були виявлені при обробці зазначеними стимулами, при цьому ОР47О5 ІдО-(ІЇ - 2)г стимулював найбільше збільшення кількості СО5ббгпоп-Т-клітин (медіана складала 101х103 у порівнянні з 38х103, р«0,005) (фіг. 16А) і також СО8:-Т-клітин (медіана складала 13,6х103 клітин у порівнянні з 2,5х103 клітин, р«0,0001) (фіг. 165).
Впливу що містять ІІ--2 злитих білків на гуманізованих мишей
Гуманізованих мишей створювали, застосовуючи опромінених невеликою дозою випромінювання новонароджених МООЮ.Ргкасзсія || дудпч! (М5С)-мишей як хазяїна з порушеним імунітетом, яким трансплантували стовбурові СО34--клітини печінки людського ембріону шляхом ІР-ін'єкції. Зразки крові, взяті з організму кожної миші у віці 8-10 тижнів, тестували для підтвердження того, що відбулось приживлення людського трансплантату. В результаті порівняння впливів пролейкіну і ОР475 ІдО-(ІЇ-2)2 при створенні винаходу було встановлено, що основними клітинами, на які вони впливали іп мімо, були МК-клітини і Тгед-клітини; після обробки ОРА47О5 ІдО-(ІІ -2)2 мало місце суттєве збільшення як МК-клітин, так і Тгед-клітин, при цьому пропорціональна відповідь МК-клітин була вище. Впливи пролейкіну були схожими, але впливи на МК-клітини і Тгед-клітини в межах групи були менше збіжними і ступінь збільшення був менше, ніж у випадку обробки ОР47О5 ІдО-(ІЇ -2)2». Злиті білки, які містять 1-2 мали різні впливу іп мімо в організмі гуманізованих мишей. ОР475 ІдС-(ІІЇ-2)2 дикого типу приводив до збільшення кількості як Тгед- (фіг. 17А), так і МК-клітин (фіг. 17Б), у той час як ОР47О5 Ідо-(ІІ - 2М880)2 не мав впливу на МК-клітини (фіг. 17Б), але збільшував кількість Тгед-клітин в значно більшому ступені (фіг. 17А), ніж ІЧО-(ІЇ -2)» дикого типу.
Насідком гуманізації МЗбС-мишей з точки зору довгострокової перспективи є їх більш короткий час виживання, зумовлений тем, що реакція "людський ксенотрансплантат проти хазяїна" приводить до втрати ваги і мультисистемної поліорганної недостатності. Введення наповнювача двічі на тиждень не мало впливу і в цьому випадку медіанна здатність до виживання складала 36 днів після початку обробки (фіг. 18). Обробка ОР47О5 ІдО-(ІІ -2М880)2 приводила до медіанної здатності до виживання, схожої зв здатністю до виживання при обробці наповнювачем, і складала 37 днів. На відміну від цього, обробка ОРА7О5 Ідс-(ІЇ -2)2 двічі на тиждень скорочувала медіанну здатність до виживання в цій групі до 21 дні (фіг. 18, р«0,0037 у порівнянні з ОРА7О5 ІдО-(ІІ -2М880)2).
Коли реакція "трансплантат проти хазяїна" досягала заздалегідь визначеного ступеню серйозності, яка потребує припинення прижиттєвого випробування для кожної миші (втрата ваги 215 95), проводили оцінку состава людських клітин в крові. В момент часу, коли наступав загрозливий життю рівень реакції ""рансплантат проти хазяїна", були виявлені дуже сильні розрізнення між групами обробки в кінцевому складі Тгед, МК-клітин і СО8:-Т-клітин в крові (фіг. 19). У мишей, оброблених наповнювачем, кількість людських Тгед складала менше 1 95 від загальної кількості людських СО45--клітин, а кількість МК- ії СО8:-Т-клітин складала -- З 95 від кількості людських СЮО45--клітин в крові. Обробка ОР47О5 ІдО-(ІЇ -2М880)»2 збільшувала кількість
МК- ї СО8--Т-клітин до 2 95 і 5 95 відповідно, у той час як кількість Тгед зростала до 6 95. На відміну від цього, обробка ОР47О5 Ідс-(ІЇ-2)2 дикого типу збільшувала пропорцію МК-клітин і
СО8:-Т-клітин до 30 95 від загальної кількості людських СО45:-клітин і Тгед до 3,595, що, ймовірно, пояснює значне зниження часу виживання в цій групі у порівнянні з мишами, обробленими ОРА7О5 ІдО-(ІІ -2М880)».
Зо Індукція ртТАТ»5а в субпопуляціях клітин периферійної крові мавп циномолгус
Так само, як і в людській периферійній крові, має місце переважна і яка характеризується схожою залежністю від дози індукція Р2ТАТ5а в субпопуляціях Тгед в периферійній крові мавп циномолгус, стимульованої ІЇ-2 (пролейкін) (дані не представлені). При безпосередньому порівнянні здатності ОРА7ОЗ5 Ідс-(П-2)2 і ОРА7ОЗ Ід0-І-2 індукувати рЗТАТба в трьох субпопуляціях Тгед була потрібна в 2-8 разів більш низька концентрація ОР47О5 ІдО-(ІЇ -2)2 для досягнення рівня реТАТ5а, що складає 50 95 від максимального, ніж концентрація ОР47О5 ІдО-
І/-2. В таблиці 4 узагальнені величини ЕСво, що характеризують активацію реТАТ5ба за допомогою ОРА4А7О5 ІдС-ІІ -2 в порівнянні з ОРА7О5 ІдС-(ІІ -2)2 в різних субпопуляціях Тгед мавп циномолгус, одержані результати виявились в дуже більшому ступені схожими з результатами, одержаними при дослідженні людської периферійної крові (таблиця 3).
Так же, як і у випадку цільної крові людини, застосовували маркери клітинної поверхні і внутрішньоклітинні маркери для ідентифікації субпопуляцій регуляторних Т-клітин і канонічних
Т-клітин в цільній крові здорових мавп циномолгус. Зразки крові збирали в один і той самий день у трьох здорових мавп циномолгус в які містять гепарин натрію пробірки і додавали в різних концентраціях ОРА7О5 ІдС-ІІ -2 або ОРА7О5 ІдО-(ІІ -2)» до 500 мкл крові і інкубували при 372С. Після витримування протягом 10 хв при 372С зразки лізували і фіксували за допомогою попередньо нагрітого ВО-буфера для лізису/фіксації (фірма ВО Віозсіепсе5). Після промивки підвищували проникність клітин за допомогою 1 мл метанолу протягом 30 хв на льоді. Зразки промивали тричі і забарвлювали, застосовуючи панель ЕОХРЗ-АІеха Рішо!? 647 (клон: 2590, фірма Віо едепа), СО4-М500 (клон: 200, фірма ВО Віозсіеєпсез), СО45КА-М450 (клон: 5НО, фірма ВО Віозсіепсе5), СО25-РЕ (клон: 4ЕЗ, фірма еВіозсіепсе), реТАТ5а-АІеха Ріо? 488 (клон: 47, фірма ВО Віозсіепсе5) і Кі-67-РегбР-Суб5.5 (клон: В5б, фірма ВО Віозсіепсев), протягом 1 год. при 42С. Все зразки досліджували за допомогою аналізатора клітин І ЗКЕогпезза (фірма Весюп біскКіпзоп) і дані аналізували за допомогою програми Біоуло (Ріоулуо, ПІ ОС).
Таблиця 4
Індукція реТАтТ5а в субпопуляціях Тгед в периферійної крові мавп циномолгус в відповідь на обробку ОР47О5 ІдС-1ІІ -2 і ОРА7О5 ІдО-(ІІ -2)2 . Кратність (Ттед-клітинапам'яті | бо1нуимл / боб25нмл | --: 8
В іншому експерименті аналогічно аналізам реТАТ5ба, проведеним з використанням людської крові, здійснювали стимуляцію іп мійго свіжо гепаринізованої крові нормальних здорових мавп циномолгус за допомогою наповнювача, а саме ЗФР, як контроля, ОР47О5 ІдО- (1-2)2 ї ОРА7О5 1Ід0-(11-2М880)», і вивчали впливи на фосфорилювання 5ТАТ5а в субпопуляціях Тгед і канонічних ефекторних СО4--Т-клітин пам'яті. Для стимуляції була вибрана доза 20 нг/мл на основі того, що максимальні відповіді людських Тгед мали місце при х 1 нг/мл, і того, що в цьому діапазоні доз мали місце близкі до максимальних відповіді канонічних ефекторних СО4--Т-клітин (результати представлені на фіг. 9).
Умови експерименту були тими самими, що й описані вище. Зразки крові збирали того ж самого дні у трьох здорових мавп циномолгус (донори С1, С2, С3) в пробірки з гепарином натрію, додавали по 20 нг/мл ОРА7О5 ІдС-(ІІ -2)2 або ОРА47СО5 ІдО-(ІІ -2М4880)»: до 500 мкл крові і інкубували при 372С протягом 20 хв перед здійсненням лізису і проведенням аналізу.
Стратегія установки дискримінаційних вікон для розділення СО4-Сб025:-Тгтед мавп циномолгус на субпопуляції наївних (ГОХРЗ3"СО45ВА") клітин, клітин пам'яті (ЕОХРЗ3"СО45ВА) і активованих (ЕОХРЗ"СО45ВАУ клітин проілюстрована на фіг. 20А. Як і у випадку людських клітин, три субпопуляції СО4-СОр25гОХРЗ:-Тгтед кожного донора експресували високі рівні високоафінного рецептора І/-2 СО025 (фіг. 20Б). Після стимуляції іп мйго за допомогою як рРА7а5 Іда-(П -2)», так ії ОР47О5 ІдС-(ІІ-2М880)2, в концентрації 20 нг/мл в Тгед всіх трьох донорів відбувалось значне фосфорилювання 5ТАТтТ»5а (фіг. 20В). Так само, як і людські клітини, активовані Тгед-клітини і Тгед-клітини пам'яті мавп циномолгус мали більш високий потенціал відносно індукції ретТАтТ5а у порівнянні з наївними Тгед-клітинами.
Людські канонічні ефекторні СО4--Т-клітини, хоча вони і не мали такої самої чутливості, що і
Тгед-клітини, могли стимулюватися 1-2, при застосуванні рзаТАТ5ба як біомаркера активації оцінки показали, що для ЮРА7О5 ІдС-(/-2)2 величина ЕЮго складала 20 нг/мл (фіг. 14).
Канонічні ефекторні СО4--Т-клітини пам'яті мавп циномолгус в крові також можна ідентифікувати як СО4"РОХРЗСО45ВА клітини, при цьому більша частина клітин представляла собою СО25-клітини, а менша субпопуляція представляла собою СО25:-клітини (фіг. 21А).
Зо Якщо розглядати всю популяцію, то Тей-клітини пам'яті мавп циномолгус всіх трьох донорів давали відповідь на ОР475 ІдО-(І/-2)2 в концентрації 20 нг/мл, викликаючи підвищення рЗТАТ5БА, у той час як обробка ОР47О5 Ідс-(ІІ-2М880)2 в концентрації 20 нг/мл визивала слабий відповідь (супо 2) або не визивала відповіді (супо5 1 і 3) у вигляді рОТАТ5а (фіг. 21Б).
Коли Тей-клітини пам'яті додатково підрозділлли на СО25- і СО25:-субпопуляції, то було встановлено, що відповідь на ОР475 Ідш-(/-2)2 в основному був зумовлений СО253- субпопуляцією (фіг. 21Г), тоді як СО25-субпопуляція давала слабку відповідь (фіг. 218). На відміну від цього, ОРА7а5 Ід(а-(ІІ -2М880)2 не мав впливу на СО25-Тей-клітини пам'яті (фіг. 218) і мав на 70-80 95 меншу стимулювальну активність відносно СО25:-субпопуляції (фіг. 2101).
Були проведені додаткові дослідження на свіжозібраній крові нормальних мавп циномолгус, в яких безпосередньо порівнювали взяті в різних концентраціях ОР47О5 ІдО-(ІІ-2)2 і ОР47О5
Ідса-(1.-2М880)2 для оцінки їх здатності стимулювати в залежності від дози роТАТ5а в різних субпопуляціях Т-клітин, а саме, в активованих, наївних і Тгед-клітин пам'яті і ефекторних СО4--
Т-клітинах пам'яті. Як ОРА7О5 ІдО-(ІІЇ-2)2, так і ОРА7О5 ІдО-(ІЇ -2М880)2, стимулювати Тгед- клітини в залежності від дози, при цьому двовалентний що містить 1І--2 дикого типу злитий білок виявився -- в 10 разів більш ефективним, ніж двовалентний що містить ІІ-2М880 злитий білок, для кожної з субпопуляцій Тгед (фіг. 22А-В). На відміну від цього, було виявлено дуже сильне розрізнення між двома молекулами при оцінці ефекторних СО4--Т-клітин пам'яті відносно індукції реТтАтТ5а (фіг. 22Г). ОРАТО5 ІдДО-(ІІ -2)2 характеризувався величиною ЕСово -- 300 нг/мл, у той час як ОРА7О5 ІдС-(11/-2М880)2 фактично не мав впливу при зазначеній високій дозі.
Величини ЕсСбо, які характеризують стимуляцію реТАТ5а у мавп циномолгус, представлені в таблиці 5, в якій представлені також кратності відносних специфічностей стосовно стимуляції
Тгед-клітин у порівнянні з ефекторними СО4--Т-клітинами пам'яті. Ці результати, одержані для цільної крові мавп циномолгус, дуже схожі з результатами, одержаними з використанням цільної крові людини (фіг. 14 і таблиця 3), і свідчать про те, що результати досліджень на мавпах циномолгус можуть мати більшу прогностичну цінність для клінічних випробувань на людях.
Таблиця 5
Величини ЕсСозо і кратність відмінностей в специфічності відносно активації реТАТ5ба за допомогою ОРА7О5 ІдО-(ІІ -2)» і ОРА7О5 ІдО-(І -2М880)» в субпопуляціях
Т-клітин мавп циномолгус . Ідс-(1--2)2 Ідс-(1-2 М880)2 наївні Ттед-клтини.д 77777111 11111171171006 | 777708
Кратність розрізнення в специфічності: активовані Тгедз у порівнянні з СО4--Тей- 12 »1,400 клітинами пам'яті клітинами пам'яті клітинами пам'яті
Оцінка фармакокінетичних властивостей на мишах
Перед початком функціональних досліджень на мишах проводили оцінку фармакокінетичних (ФК) властивостей одновалентних і двовалентних імунокон'югатів, що містять 1-2 дикого типу і
І--2 з мутацією М880, на МОО-, МОО.зсіа- і МОО.зсій.П2го--мишах (фіг. 23).
МОЮ- ї МОЮО.5сід-мишам (п-3) вводили шляхом внутрішньовенної (і.м.) ін'єкції по 0,3 мг/кг ваги тілапл мишу ОРА7О5 ІдС-І-2 або ОРА47О5 ІдО-(ІЇ-2)2 в ЗФР, що містить 0,5 95 мишачої сироватки і брали зразки крові в різні моменти часу протягом періоду від 2 хв до 168 год. після ін'єкції (фіг. 23А). Людський 1-2 оцінювали в мишачій сироватці з використанням мишачого МАт до людського 1-2 (фірма ВО РПагтіпдеп, Ме 555051, клон 5344.111), яким сенсибілізували 96- лункові планшети для захоплення 1//-2. Потім проводили виявлення людського 1-2 з використанням біотінільованого мишачого МАт до людського 1-2 (фірма ВО РІагтіпдеп, Мо 555040, клон В33-2). Зв'язування 1-2 візуалізували і кількісно оцінювали з використанням кон'югованого з європієм стрептавідину. Протягом перших 24 год. кліренс ОР4А7О5 Ідо-(П -2)2 відбувався набагато швидше, ніж ОРА7О5 Ідбо-1ІІ -2, як у випадку МОО-, так і у випадку МОЮ. 5сіа- мишей. Через 48 год. концентрації кожного аналіту в сироватці находились на схожому рівні, а через 72 год. всі вони були нижче межі виявлення. Межа виявлення ІІ -2 дорівнювала 0,05 нг/мл і вона позначена на графіке пунктирною лінією. Несподівано швидкий кліренс як одновалентних, так і двовалентних імунокон'югатів Ідо-ІІЇ-2 в організмі мишей, що не мають адаптивної імунної системи, дозволяє припустити, що у мишей існує негематопоетичний компартмент для ІІ -2 або "злив" і він може керувати швидким кліренсом іп мімо імунокон'югатів, які містять 1-2.
Для перевірки цієї гіпотези при створенні винаходу були проведені ФК-дослідження на
Зо МОО.зсід-мишах, у яких був відсутній також високоафінний рецептор ІІ -2, І. 2Ра (СО25), тобто на МОО.зсіа.П2го-мишах (фіг. 23Б). В організмі МОО.зсій. П2га"-мишей кліренс ОРА7О5 ІдО-Ї - 2)», не зважаючи на введену в три рази більш високу дозу (0,3 мг/кг), відбувався протягом перших 24-48 год. більш швидко, ніж кліренс введеного в дозі 0,1 мг/кг ОРА4А7О5 ІдС-ІІ -2 і введеного в дозі 0,1 мг/кг ОРА7Оа5 Іда-(ІЇ -2М880)». Однак через 48 год. рівні кожного кон'югату в крові переходили в фазу повільної стаціонарної елімінації, при цьому 1-2 знаходився в крові на легко виявлюваному рівні протягом періоду часу аж до 6 днів. Важно зауважити, що в організмі зазначених позбавлених високоафінного рецептора І/-2 мишей початкова 24-часовая фаза розподілу молекули ОР47О5 ІдС-(ІІ -2М880)2 відбувалась небагато більш швидко, ніж Ідо-ІІ -2, однак після цього мала місце фаза елімінації, схожа з фазою елімінації одновалентного імунокон'югату, яка протягом періоду часу аж до 6 днів, тобто до останнього моменту часу, коли проводили їх аналіз. Зазначені дані для ЮОР47О5 Ідс-(/-2М880)2 є особливо важливими,
оскільки результати ФК-аналізу для МОЮ.зсіа.П2га-мишей, ймовірно, дозволяють з гарною точність прогнозувати результати ФК-аналізу для приматів окрім людини.
Підвищення ГОХРЗ і СО25 в мишиних Ттгед після обробки 1-2
Для порівняння здатностей різних молекулярних форматів і конфігурацій людського 1-2 стимулювати РохР3--Тгед-клітини іп мімо мишам вводили шляхом підшкірної ін'єкції наповнювач, пролейкін (рекомбінантний людський 1-2), ОР4А7а5 Іда-І-2, ОРАТИ Іда-(ІІ-2)2 або ОР47О5
Ідса-(1.-2М880)» і проводили оцінку Тгед з точки зору змін експресії СО25 на клітинної поверхні і внутрішньоклітинного ЕОХРЗ через заздалегідь визначений як оптимального проміжок часу, що складав 24 год. (фіг.24). Молодим здоровим мишам лінії ВАЇВ/с (п-З/групу обробки, п-4/наповнювач як контрольної групи) ін'єкували підшкірно або пролейкін (20000 або 100000
МЕ/мишу), ОР47О5 ІдС-ІЇ -2 (60, 300 або 1500 МЕ/мишу), ОРА7О5 ІдО-(ІЇ -2)2 (60, 300 або 1500
МЕ/мишу) або ОР4А7О5 ІдС-(-2М880)2 (60, 300 або 1500 МЕ/мишу). Дози вводили в наповнювачі, який представляв собою 100 мкл стерильного ЗФР, рН 7,2, що містив 0,595 стерилізованої фільтрацією мишачої сироватки. Через 24 год. мишей умертвляти і у них виймали селезінку. Одержували суспензію одиничних клітин селезінки в 1 мл середовища І -15 і зберігали на льоді до подальшої обробки. Аліквоту (40 мкл) профільтрованої суспензії одиничних клітин переносили в пробірки для здійснення РАС5 і промивали 2 мл ЕАС5З-буфера (600 х д, 5 хв). Потім зразки інкубували з кон'юЮюгованими з флуорохромом антитілами до антигенам клітинної поверхні: СО4 (клон ЕМ4-5, флуорохром А700), С0р25 (еВіо704, АГ488),
СбО44 (ІМ7, ебо5), СОб2І (МЕЇ-14, РЕ), ІСО5 (С398.4А, РЕ/Су7) СО103 (2Е7, АРО).
Забарвлювання здійснювали протягом 30 хв при 4 "С в 100 мкл РАС5-буфера (ЗФР, рн 7,2--0,2 95 БСА). Після забарвлювання клітинної поверхні зразки промивали 4 мл ЕАСЗ-буфера (600 х д, 5 хв) перед здійсненням внутрішньоклітинного забарвлювання (відповідно до протоколу внутрішньоклітинного забарвлювання фірми еВіозсіепсе). В цілому, метод полягав в наступному: зразки ресуспендували в 200 мкл буфера для фіксації/підвищення проникності (фірма еВіозсіепсе, Мо 00-5521) і інкубували протягом 1 год. при 42С. В зразки додавали 1 мл 1 х буфера для підвищення проникності (фірма еВіозсіепсе, Мо 00-8333) перед додаванням З мл
ЕАС5-буфера і здійсненням промивки (600 х д, 5 хв). Внутрішньоклітинні антигени Кі-67 (В56,
РегсР Суб5.5) і РЕОХРЗ (БОК-165, е450) забарвлювали в 100 мкл 1 х буфера для підвищення
Зо проникності протягом 1 год. при 42С. Зразки промивали 4 мл ЕАС5З-буфера (600 х 4д, двічі по 5 хв) і дані одержували за допомогою аналізатора ВО ЕРогіезза і аналізували за допомогою програми ЕРіоулдо (фірма Тгее Заг Іпс.). Тгед ідентифікували як СО4х, РОХРЗ: в синглетах в лімфоцитарному вікні; для всіх зразків в цій популяції розраховували середню інтенсивність флуоресценції (МЕ), виявлену для СО25 і ЕОХРЗ.
Як продемонстровано на фіг. 24, три імунокон'югата, що містять І/-2 мали однакову ефективність відносно стимуляції експресії СО25 (фіг. 24А) і ГохР3З (фіг. 24Б) в мишиних Тгед і характеризувались узгоджувальними залежностями відповіді від дози в діапазоні доз, що охоплює дози 60, 300 і 1500 МЕ/мишу. У кожному випадку доза 1500 МЕ кожного імунокон'югату (чорні стовпчики) була значимо більш ефективна, ніж 100000 МЕ пролейкіну (чорні стовпчики). В більшості випадків 300 МЕ імунокон'югатів (темно-сірі стовпчики) були еквівалентні 100000 МЕ пролейкіну, а 60 МЕ імунокон'югатів (світло-сірі стовпчики) були еквівалентні 20000 МЕ пролейкіну (світло-сірі стовпчики). Для всіх груп обробок дані представлені у вигляді середнього значення - СКО.
Оцінка фармакокінетичних властивостей на мавпах циномолгус
Перед початком функціональних досліджень на приматах окрім людини оцінювали фармакокінетичні (ФК) властивості імунокон'югатів, що містять ІЇ-2 на біологічно наївних здорових дорослих мавпах циномолгус (фіг. 25). Мавпам (п-2/дозу) вводили внутрішньовенно (і.м.) у вигляді короткочасної болюсної ін'єкції стерильний ОР47О5 ІдС-1ІІ -2 або ОР47О5 ІдО-(ІІ - 2)2 в ЗФР, що містить 0,5 95 сироватки мавп циномолгус і брали зразки крові в різні моменти часу протягом періоду часу з 30 хв до 72 год. після ін'єкції. Людський 1-2 оцінювали в зразках сироватки мавп циномолгус з використанням мишачого МАт до людського ІЇ/-2 (фірма ВО
РПапгтіпдеп, каталожний номер 555051, клон 5344.111) для сенсибілізації 96б-лункових планшетів для захоплення людського ІЇ-2. Потім проводили виявлення людського 1/Ї/-2 з використанням біотінільованого мишачого МАт до людського ІЇ/-2 (фірма ВО РвВагтіпдеп, каталожний номер 555040, клон В33-2 Зв'язування 1І-2 візуалізували і кількісно оцінювали з використанням кон'югованого з європієм стрептавідину. Межа виявлення 1-2 з використанням сироватки мавп циномолгус дорівнювала 0,05 нг/мл (позначена на графіках пунктирною лінією).
У зразках сироватки мавп циномолгус, взятих перед обробкою, ІЇ/-2 не був виявлений (відповідно, його рівень був « 0,05 нг/мл). бо Виявлення 1-2 в сироватці мавп циномолгус проводили в період з 30 хв до 48 год. після і.м.-
ін'єкції для всіх доз ОР47О5 Ідо-ІІ-2 (фіг. 25А) і ОР47О5 ІдО-(ІІ -2)2 (фіг. 25Б). Через 72 год. рівні І--2 в сироватці находились нижче межі виявлення (0,05 нг/мл, пунктирна лінія) для всіх тварин, оброблених 10 і 25 мкг/кг ОРА7О5 Ід6-1-2 або ОРА7О5 ІдО-(ІІЇ-2)2. Після обробки рРА?7а5 ІдС-І/-2 в дозі 100 мкг/кг виявлюваний рівень ІЇ-2 в сироватці все ще був присутнім через 72 год.
Індукція збільшення кількості Тгтед-клітин у мавп циномолгус
У мавп циномолгус, оброблених іп ммо ЮР47О5 Ідс-0И-2, мало місце збільшення в залежності від дози абсолютної кількості Тгед-клітин, а також його кратне збільшення у порівнянні з вихідним рівнем через 7 днів після дозування (фіг. 26А і 26Б відповідно). У всіх експериментах застосовували нормальних здорових мавп циномолгус віком від З до б років обох статей, при цьому жодна тварину не використовували більше одного разу. Під анестезією здійснювали 5С ін'єкцію в бічну область спини ОР4А7О5 ІдО-ІІ-2 (п-4-6) або наповнювача (п--3) в різних дозах. Індивідуальні дози ОРА7(О5 ІдС-ІІ -2 розраховували на основі ваги тіла і готували для ін'єкції в наповнювачі, який являв собою стерильний ЗФР, рН 7.2, що містить 0,595 стерильної нормальної сироватки мавп циномолгус. Зразки крові збирали в різні моменти часу і аналізували для визначення гематологічних змін (загальний аналіз крові (СВС) і диференційований підрахунок лейкоцитів)р за допомогою автоматичного гематологічного аналізатора фірми Ааміа, а також маркерів клітинної поверхні і внутрішньоклітинних маркерів, докладно описаних вище (див. описані експериментальних процедур для таблиці 4). Дані про зміну регуляторних СО4-Сб025РОХРЗ-Т-клітин в цільній крові в день 7 після обробки представлені на фіг. 26 у вигляді абсолютної кількості клітин на мм3 цільної крові (фіг. 26А) і кратності вимірювання кількості Тгед-клітин (фіг. 26Б); все дані представлені у вигляді середнього значення - СКО. При більш високих дозах ОР47О5 ІдС-ІІ -2, що складали 25 мкг/кг і 36 мкг/кг, було встановлено, що кількість Тгед-клітин збільшувалось в середньому приблизно в
З рази (діапазон 111-25595, п-б) і в 4 рази (діапазон 110-470 95, п-б) відповідно. При подальшому зниженні введеної 5С дози ЮОР47(05 ІдО-І/-2 (12, 6 і 2 мкг/кг) продовжував викликати відповідним чином зменшені вимірювання кількості Тгед-клітин і кратності його вимірювання. Не прив'язуючись до будь-якої теорії, можна вважати, що «2-кратне збільшення кількості Тгед-клітин (що знаходиться в діапазоні 67-133 956, п-б) при введенні дози 12 мкг/кг
Зо рРА?7а5 Іда-ІІ/2 може представляти собою потрібне збільшення кількості Тгед-клітин у випадку деяких аутоїмунних і запальних захворювань. Кількість Тгед-клітин у людей варіюється в широких межах (20-90 Ттед-клітин на мм? крові; від 4 до 1095 СО42-Т-клітин) і логічно припустити, що збільшення кількості Тгед-клітин, індуковане 1Ї/-2 в організмі індивідуума, повинно приводити до загального підвищення функціональної супресії.
При оцінюванні більш низьких доз ОРА7О5 Ідо-ІІ-2 (2-6 мкг/кг) зразки крові збирали більш часто для ідентифікації оптимальних моментів часу для виявлення змін кількості Тгед-клітин після введення ОР47О5 Ідс-ІІ -2 (фіг. 27). Хоча вимірювання кількості Тгед-клітин спостерігали протягом 7 днів, максимальна стимуляція мала місце в день 4, тобто раніше, ніж це мало місце при обробці більш високими дозами ОР47О5 ІдС-1І -2 (день 7, фіг. 26).
Пролейкін і ОР47О5 ІдО-ІІ-2 малу порівняну дію іп міїго при аналізі цільної крові людини і мавп циномолгус, коли безпосередньо порівнювали кількість одиниць ІІ -2-активності, потрібну для стимуляції реТАтТЗа в Тгед-клітинах і інших чутливих до 1-2 клітинах (дані не представлені).
Маючи у розпорядженні дані про короткий час напівжиття пролейкіну в організмі людини, проводили дослідження на мавпах циномолгус з використанням однієї дози для оцінки іп мімо індукції і активації Тгед-клітин. Пролейкін викликав залежну від дози і часу зміну кількості Тгед- клітин, яку оцінювали за кратністю вимірювання абсолютних кількостей, а також за активацією рзЗТАТЗ5а. У той час як збільшення кількості Тгед-клітин було номінальним (фіг. 28А: 10-40 Об), індуковане за допомогою РгоЇеиКіп? підвищення роОТАТ5ба в Тгед-клітинах було значним і залежало від дози через один день після обробки (фіг. 28Б), але мало невелику тривалість іп мімо і рівень роТАтТ5а повертався до норми через 2-3 дні.
Порівняння здатності ОР4А7(5 ІдС-ІІ-2 і пролейкіну індукувати збільшення кількості Тгед- клітин іп мімо у мавп циномолгус представлено на фіг. 29. Нормальних здорових мавп циномолгус (по п-5 в групі) обробляли низькими дозами ОРА4А7О5 Ідс-ІІ -2 або високими дозами пролейкіну і аналізували вимірювання регуляторних Т-клітин в день 10. В дні 0 ії 7 вводили 5С
ОБРА? ІдО-І/-2 в дозі 16800 МЕ/кг (результати для дози 12 мкг/кг представлені на фіг. 26). На основі опублікованих даних досліджень, в яких пролейкін вводили пацієнтам з діабетом типу 1 (4,5х1056 МЕ/ндивідуума, З рази на тиждень) і в яких було продемонстровано, що він приводить до збільшення кількості Тгед-клітин, і даних, одержаних при введенні однократних доз, які представлені на фіг. 28, пролейкін вводили 5С З рази на тиждень (М/ЛЛ/Е), здійснюючи 60 введення загалом 5 доз по 200000 МЕ/кг кожна (доза для мавп циномолгус, еквівалентна
4,5х106 МЕ/індивідуума). Результати представлені на фіг. 29 у вигляді середніх значень - СКО для вимірювання загальної кількості Тгед-клітин на мм3 крові (фіг. 29А), кратності збільшення кількості Тгед-клітин (фіг. 29Б) і вимірювання співвідношення між Тгед-клітинами і канонічними
СрАРОХРЗ-клітинами (фіг. 298).
Хоча протягом 10-денного періоду було введено кількість ОР4А7О5 ІдС-ІІЇ -2, що має майже в 30 разів меншу активність, ОР4А7О5 ІдС-ІІ -2 індукував більше збільшення кількості Тгед-клітин, ніж пролейкін (фіг. 29А, р-0,06). Кратність збільшення кількостей Тгед-клітин у порівнянні з вихідним рівнем (фіг. 29Б) і збільшення кількості Тгед-клітин у порівнянні з канонічними СО4-Т- клітинами (фіг. 298) також були більш значними (р-0,0011 ії р-0,016 відповідно) у мавп, яким вводили ЮОР4755 ІдО-І-2, у порівнянні з мавпами, яким вводили пролейкін. Для людей співвідношення між регуляторними СО4--Т-клітинами (звичайно їх визначають як БОХРЗ:- клітини і за допомогою комбінації маркерів клітинної поверхні) і не-регуляторними СО4-Т- клітинами (які позначають як канонічні або ефекторні клітини) часто застосовують для визначення функціональних рівнів Тгед-клітин в організмі пацієнтів зі спливанням часу.
Відповіді іп мімо субпопуляцій клітин периферійної крові мавп циномолгус на обробку низької дозою ОРА7О5 ІдО-ІІ -2
Клітинна специфічність іп мімо І--2 при обробці в низькій дозі представляє собою параметр, що має вирішальне значення. При створенні винаходу було встановлено, що можна здійснювати високочутливий моніторинг клітинної активації іп мімо, індукований ОРА7О5 Ідо-ІІ -2 або пролейкіном, шляхом вимірювання рівнів реТАТ5а ех мімо в зразках крові, взятих в різні моменти часу після введення доз мавпам циномолгус або мишам. Відповіді іп мімо всіх популяцій клітин, моніторинг яких можна здійснювати іп міїго (фіг. 8-10), можна аналізувати також ех мімо.
Через 1 ї З дні після введення іп мімо однієї дози ОРА7О5 ІдС-ІІ-2 (12 мкг/кг) здоровим мавпам циномолгус (п-5) збирали зразки цільної крові і аналізували відносно фосфорилювання
ЗТАТ»5а як описано вище (див. описані експериментальних процедур для таблиці 4). У кожної мавпи брали зразок крові в день 0 перед обробкою і вимірювали рівень фосфорилювання
ЗТАТ»5а, який застосовували індивідуально для оцінки кратності змін після обробки. Кратність вимірювання реТАТба в Тгед-клітинах в дні 1 і З представлена на фіг. ЗОА, кратність
Зо вимірювання роТАтТ»5а в канонічних ефекторних СО4-СО45ВА-Т-клітинах пам'яті представлена на фіг. ЗОБ, а кратність вимірювання роТАтТ5а в канонічних наївних ефекторних СО4-С045ВА-
Т-клітинах представлена на фіг. ЗОВ. Результати переконливо свідчать про те, що в крові мавп циномолгус, взятій через один і три дні після введення однієї низької дози (12 мкг/кг) ОРА7О5
Іда-1/-2, мало місце переважне підвищення реоТАтТ5а в Тгед-клітинах у порівнянні з Т-клітинами пам'яті і наївними СО4--Т-клітинами (фіг. ЗОА-В)О. Очевидно, що одноразова низька доза рРА7а5 Ід0-І/-2 була більш ефективною, ніж одноразова висока доза пролейкіну (фіг. 28Б) відносно викликання тривалого стану активації іп мімо Тгед-клітин.
В перших дослідженнях, в яких фосфорилювання ЗТАТ5а застосовували як біомаркер іп мімо активації Тгед-клітин, максимальний рівень роТАТ5ба був виявлений тільки в день 1 при обробці однієї дозою пролейкіну (фіг. 28Б) і в дні 1 ї З при обробці низької дозою (12 мкг/кг)
ОРА7С5 Ід0-П-2 (фіг. ЗОА). Додаткове титрування ОР47О5 1/дС-Й-2 в поєднанні з використанням зразків, взятих у додаткові моменти часу, продемонструвало, що рзТАтТ5а- сигнали іп мімо могли підтримуватися протягом 4 днів, перш ніж вони знижувались знову до нормального рівня через 7 днів (фіг. ЗА, З1Б). Величини МР (середня інтенсивність флуоресценції) реТАТ5а-сигналів, виміряні як для дози 2 мкг/кг (З1А, п-4), так і для дози 6 мкг/кг (31Б, п-б), свідчать про те, що в цих випадках роТАТ5а-сигнали були менше максимальних (див. фіг. З33Б). Навіть зазначені дуже низькі дози ОР4755 /Ідо-0І-2 забезпечували іп мімо тривалі сигнали від Тгед-клітин, що перевищують сигнали, одержані після обробки пролейкіном (фіг. 28Б). Ці результати підтверджують висунуту при створенні винаходу гіпотезу про те, що дуже низькі рівні ІІ -2, який має тривалий час життя, тобто ОР4А7О5 ІдО-ІІ -2, але не пролейкіну, можуть стимулювати Тгед-клітини протягом тривалих періодів часу іп мімо, тим самим дозволяючи зменшувати частоту обробок, необхідних для відновлення домінантної аутотолерантності й покращення наслідків захворювання. Збільшення кількості Тгед-клітин в периферійної крові після обробки низькою дозою ІІ-2 може відображати зміна в розподілі клітин в організмі, а не дійсне збільшення кількості клітин. Для того, щоб встановити, що збільшення
Тгед-клітин іп ммо щонайменше частково зумовлено індукцією клітинного поділу при обробці ЇЇ - 2, проводили оцінку внутрішньоклітинного маркера проліферації Кі-67. Кі-67 представляє собою білок, який можна виявляти в ядрах на фазах с, 5, Сі» і мітозу, але який відсутній в спокійних клітинах, що знаходяться на фазі Со клітинного циклу. Для мавп циномолгус, оброблених 2 і 6 бо мкг/кг ОР47О5 ІдС-ІІ-2, як описано вище (фіг. 31), здійснювали також моніторинг змін ех мімо рівнів внутрішньоклітинного маркера Кі-67 як описано вище (див. описані експериментальних процедур для таблиці 4) для оцінки ступеню проліферації іп мімо. Процент клітин, що знаходиться на фазах клітинного циклу (Кі-67") в день 0 порівнювали з процентом Кі-677-клітин в період з 1 по 11 день після обробки. Дані для Кі-67"- Тгед-клітин представлені на фіг. 32А, для канонічних ефекторних СОА«СОВА45-Т-клітин пам'яті представлені на фіг. 32Б, а для канонічних наївних ефекторних СО4-СО45ВА"-Т-клітин представлені на фіг. 328. Встановлено, що в клітинах крові мавп циномолгус, зібраних через 1-7 днів після введення однієї низької дози рРєРА7Оа5 Ідс-І/-2 (6 мкг/кг") мало місце переважне підвищення рівня Кі-67 в Тгед-клітинах у порівнянні з рівнями в канонічних наївних ефекторних СО4--Т-клітинах (див. порівняння фіг. З2А з 328). ОР47О5 Ід0-І1-2 (б мкг/кг) мав здатність стимулювати проліферацію канонічних ефекторних СО4--Т-клітин пам'яті (фіг. 32Б) на відміну від наївних ефекторних Т-клітин. При обробці мінімальної дозою ОРА7О5 Ідо-ІЇ-2 (2 мкг/кг) мала місце мінімальна активація клітинного циклу і проліферація у порівнянні з дозою 6 мкг/кг.
При аналізах цільної крові людини і мавп циномолгус було встановлено, що активність іп міго двовалентного ОР47С5 ІдС-(ІІ -2)2 відносно Тгед-клітин в цілому була приблизно в 6 разів більш сильною, ніж одновалентного ОР47О5 ІдС-ІЇ -2 (таблиці 2 і 4). Тому перша доза для мавп циномолгус була в 6 разів менше найбільшої протестованої дози ОР47О5 Ідсе-ІІ-2 (36 мкг/кг). рРА7а5 Ідаш-(П -2)2 після введення в дозі б мкг/кг (п-4) викликав великі вимірювання Тгед- клітин, присутніх в кровотоці (фіг. ЗЗА), які зберігались значно довше звичайних 14 днів після обробки, значні й тривалі рівні реТАТба в Тгед-клітинах, які повертались до нормальних величин через 1 тиждень (фіг. З33Б), і майже 3-кратне збільшення кількості Тгед-клітин (фіг. 33В).
Кратність змін, індукованих ОР47О5 Ідс-ІІ -2 (див. фіг. 26, незабарвлені стовпчики) порівнювали зі змінами після обробки дозою 6 мкг/кг двовалентного ОРА7О5 Ідо-(ІЇ -2)2 (затінений стовпчик) (фіг. 33Г). Аналогічно до того, що було встановлено при аналізі цільної крові людини і мавп циномолгус, ЮОР4А7О5 ІдО-(/-2)2 мав підвищеної ефективністю іп мімо, яка перевищувала (очікуване) 2-кратноеє збільшення, яке відповідає кількості молекул 1ІІ--2 на молекулу до.
Мавпам циномолгус вводили додаткові дози двовалентного ОР47О5 Ідо-(ІІ-2)2 для оцінки його впливів іп мімо при дуже низьких дозах (2 і 0,7 мкг/кг) (фіг. 34). У той час як доза 2 мкг/кг визивала помірні кратності змін (в середньому 46 95, діапазон від 20 до 70 95, п-8), доза 0,7 мкг/кг мала слабкий вплив на кількості Т-клітин (середня величина збільшення 16 95, п-3) (фіг. 34А). Обе низькі дози стимулювати підвищення роТАт»5а в Тгед-клітинах (фіг. 34Б, п-З3 для кожної дози), маючи при цьому слабкий вплив на роТАТ5а Тей-/ тет-клітин (фіг. 348, п-3 для кожної дози).
Повні впливи терапії з використанням одновалентного і двовалентного злитого білка, який містить І/-2 дикого типу і його здатність збільшувати кількість Тгед-клітин у мавп циномолгус представлені на фіг. 35. Обидві форми ІдО-І/-2, який має тривалий час життя є сильними індукторами Тгед-клітин, що можна оцінювати іп мімо, застосовуючи роТАТ5ба як біомаркер активації, і, як представлено на відповідному кресленні, приводять до кратного збільшення кількостей присутніх в кровотоці Тгед-клітин. ОР47О5 ІдО-(І/-2)», що має підвищену ефективність, зумовлену подвійною кількістю молекул 1Ї/-2 на С-кінці (дб, мав більш сильну залежність від дози у порівнянні з ОРА7(О5 Ідо-ІЇ -2.
Деметилювання ДНК ЕГОХРЗ і СТІ А-4 в субпопуляціях Т-клітин мавп циномолгус
Функціонально активні Тгед-клітини мають здатність продукувати імуносупресорні цитокіни
СТІ А-4, 1-10 ї ТОЕВД і потребують стабільну експресію фактору транскрипції РОХРЗ. Експресія
ЕОХРЗ в Тгед-клітинах людини і мавп циномолгус залежить від деметилювання десяти Сро- сайтів метилювання ДНК в специфічній для Тгед деметильованій області (Т5ОК) в локусі
ЕОХРЗ. Аналогічно до цього, експресія й вироблення СТІ А-4 залежить від деметилювання семи
Сра-сайтів метилювання ДНК в локусе СТІ А-4 людини і мавп циномолгус. Тому при створенні винаходу проводили оцінку статусу деметилювання як ЕБОХРЗ, так і СТІ А-4 в різних субпопуляціях СО4--Т-клітин до і після обробки ОР47О5 ІдС-ІІ -2 (п-4, 25 мкг/кг 5.с.) і ОР47О5
Ідс-(П-2)2 (п-4, б мкг/кг 5.с.), які вводили в тих дозах і в ті моменти часу, які, як було встановлено раніше, значно збільшували кількість Тгед-клітин в крові. В експерименті застосовували тільки біологічно наївних дорослих самців мавп циномолгус вагою від 9,1 до 10,9 кг. Обробки проводили через З тижні після першого вихідного збору зразків крові й збору зразків крові через 4-5 днів після обробки. РВМС з 30 мл гепаринізованої крові розділяли за допомогою
ЕАС5АГа"м (фірма Весіоп ОіскКіпзоп) на відповідні субпопуляції СО4--клітин, включаючи Тгед- клітини (С04-0025:00127м), ефекторні Т-клітини пам'яті (СО4-С045ВАУ, наївні ефекторні Т- клітини (СО4-С045ВА) і СрА-Ср2гБ Ср127--клітини.
Відсортовані субпопуляції клітин заморожували у вигляді аліквот по 100000 клітин і 60 зберігали у вигляді сухого дебрису при -809С для того, щоб проводить обробку одночасно для 5О0 всіх зразків. Здійснювали відтавання клітинних дебрисів і екстракцію ДНК, і проводили одностадійну обробку бісульфітом з використанням набору Еріїесії Раві І узе АЇІЇ (фірма Оіадеп) відповідно до інструкцій виробника. Застосовували по 5 нг (в 2 мкл) обробленої бісульфітом
ДНК в 20 мкл суміші для першого циклу ПЛР для дуплексу, яка містить 10 мкл суміші з набору для мультиплексної ПЛР (фірма Оіадеп), б мкл води, 0,5 мкл прямого праймеру для ЕОХРЗ
Щіаааасдасддссаай! П"'ІТАСААСТТОТАТООООССАТОСТТІ (5БО ІЮ МО: 54), 0,5 мкл зворотного праймеру для ЕОХРЗ саддааасадсіаїцдассйа АААТАТСТАСССТСТТСТСТТОСТС (5ЕО ІО МО: 55), 0,5 мкл прямого праймеру для СТІ А-4 ідіаааасдасддссаа: ст тасСТттАТаААСаИадатТА Тад (ЗЕБЕО ІО МО: 56) і 0,5 мкл зворотного праймеру для СТІ А-4 саддааасадсіашассТттсАСТ
ТААТТТССАСТАААААТАССС (5ЕО ІО МО: 57). Перший цикл циклічної ПЛР проводили при 9520 протягом 15 хв, потім 20 циклів при 9523 протягом 30 з, при 602С протягом 90 з і при 72 протягом 60 з, потім протягом 10 хв при 722. ПЛР-продукт очищали з використанням гранул
АМРиге ХР (фірма Весіоп СошцНег) відповідно до інструкцій виробника і елюювали в 20 мкл води.
Здійснювали другий цикл ПЛР, в якому додавали унікальну індексну послідовність до початку кожного зразку, використовуючи 15 мкл суміші для ПЛР, яка містить 7,5 мкл суміші для мультиплексної ПЛР (фірма Оіадеп), 6,5 мкл продукту, одержаного в першому циклі ПЛР, і 1 мкл індексного праймеру. Умови здійснення циклів другого циклу ПЛР були наступними: 95960 протягом 15 хв, потім 7 циклів при 952 протягом 30 з, при 542С протягом 90 з і при 72С протягом 60 з, потім 5 хв при 7220. ПЛР-продукти очищали з використанням гранул АМРиге ХР і елюювали в 15 мкл води, і 4 мкл застосовували для кількісної оцінки кількості ПЛР-продукту з використанням пристрою 5пітайдли МийіМА. Об'єднували однакові молярні концентрації кожного зразку, створюючи бібліотеку для секвенування, яку кількісно оцінювали з використанням набора для кількісної оцінки бібліотек Кара Шитіпа. Бібліотеку секвенували за допомогою набора Питіпа МібЗед з використанням реагентів м3 і здійснювали прогони для прочитання спарених кінцевих фрагментів 2 х 300 пар основ. Демультиплексування здійснювали за допомогою текстового драйвера БезроКе руїШоп і застосовували програму Сшадарі для видалення адаптерів для секвенування. Прочитані прямі й зворотні послідовності зливали з використанням ЕГАФЗН і виділяли послідовність кожного сайту метилювання.
Обробка мавп циномолгус як ОРА7С5 Іда-ІІ-2, так і ОР4А7О5 ІдО-(ІІ -2)2 індукувала значне
Зо збільшення кількості Тгед-клітин в крові всіх оброблених тварин аналогічно тому, що було встановлено раніше з використанням такого ж самого протоколу обробки (фіг. 33 ї фіг. 35).
Важливо зауважити, що швидке й різке збільшення Тгед-клітин після обробки як ОР4А7О5 ІдС-1Ї - 2, так і ОРА7О5 ІдС-(І1-2)2, не приводило до негативного впливу або зниження статусу деметилювання БОХРЗ (фіг. 36, верхня панель) або СТІ А-4 (фіг. 36, нижня панель). Схожі результати були одержані для обох молекул, дані для ОРА7О5 Ідо-(ІІЇ-2)2 представлені на фіг. 36. Той факт, що обробка не мала негативного впливу і не знижувала статус деметилювання як РОХРЗ, так і СТІ А-4, свідчить про те, що всі Тгед-клітини зберігали свій природній зрілий імуносупресорний фенотип, незважаючи на значне збільшення абсолютних кількостей. Одержані на приматах окрім людини результати оцінки деметилювання ЕОХРЗ і
СТІ А-4 в Тгед-клітинах дозволяють припустити, що обробка людини низькими дозами, що мають тривалий час життя Ідс-(ІІЇ-2)--подібними молекулами може дозволити збільшувати кількості повністю функціональних зрілих Тгед-клітин, що, в свою чергу, повинно коректувати імунорегуляторні дисбаланси при аутоїмунних захворюваннях людини, а також при інших хронічних імуноопосередкованих запальних захворюваннях.
Фармакокінетичні характеристики ОР47О5 Ідс-(ІІ -2М880)» в організмі мавп циномолгус
ФК-характеристики ОРА7О5 1Ідо-(ІЇ-2М880)2 оцінювали на біологічно наївних мавпах циномолгус (фіг. 37). Мавпам (п-2/дозу) вводили шляхом внутрішньовенної (ім) і підшкірної (5с) ін'єкції в дозі 30 або 100 мкг/кг стерильний ОР47О5 ІдС-(ІІ-2М880)2 в ЗФР, що містить 0,5 95 сироватки мавп циномолгус, і брали зразки крові в різні моменти часу в період з 30 хв до 14 днів після ін'єкції. Оцінку людського 1ІІ--2 в зразках плазми мавп циномолгус проводили відповідно до описаному вище методу. Межа виявлення І//-2 в аналізе з використанням плазми мавп циномолгус складала 0,05 нг/мл. В зразках плазми мавп циномолгус, взятих до обробки, рівень
І/-2 не піддавався виявленню (тобто був « 0,05 нг/мл).
На відміну від ФК злитих білків дикого типу (фіг. 25), коли їх рівні в крові можна було виявити тільки через 48-72 год., ОРА7О5З ІдО-(ІЇ-2М880)2 був виявлений в плазмі всіх включених в експеримент мавп циномолгус у всі моменти часу аж до дні 14 при застосуванні ім- (фіг. 37А) і 5с- (фіг. 37Б) шляхів введення. Протягом перших двох-трьох днів рівні в плазмі були пропорційні дозі і білки характеризувались більш тривалим часом напівжиття у порівнянні зі злитими молекулами, що містять 1І--2 дикого типу. бо Були проведені вимірювання рівнів розчинного СО25 (50025, ІІ -2КА) в плазмі (фіг. 37В),
який розглядають як біомаркер експозиції ІІ--2 іп мімо. Як реагенти застосовували моноклональні антитіла до людського 52025, які, як відомо, вступають в перехресну реакцію з 50025 мавп циномолгус, в сендвіч-імуноаналізі з використанням захоплювального (МАВб23, фірма КУО
Зузіет5) і біотінільованого ідентифікувального (ВАБ223, фірма КеО бБузвіетв5) антитіл, застосовуючи кон'югований з Ей стрептавідин для виявлення зв'язаного 50025. Підвищення рівнів 50025 після введення ОР47О5 ІдО-(ІІ -2М880)» залежало від дози і мало місце в період з 1 по 7 день, після чого вони повертались до нормальних рівнів в день 8.
Індукція Тгед-клітин у мавп циномолгус за допомогою ОРА7О5 ІдО-(ІІ -2М4880)2
В описаних раніше експериментах на мавпах циномолгус, яких обробляли іп мімо ОР47О05
Ідса-І/-2 ії ОРА7О5 Ідс-(ІІ-2)2 дикого типу, було виявлено залежне від дози збільшення в 2-4 рази абсолютної кількості Тгед-клітин (фіг. 26 і 33 відповідно), що відображало їх активності іп міго, виявлені в аналізах цільної крові людини, а саме, 6-9-кратні розрізнення іп міїго (таблиці 2 і 3). З урахуванням втрати їх ефективності іп міго в людській цільній крові (таблиця 3), як дози
ОРА7ТОа5 ІдС-(1-2М880)2 іп мімо були вибрані 30 ії 100 мкг/кг. Так же, як і в попередніх експериментах, ін'єкцію ОР4А7О5 ІдО-(ІІ -2М880)2 здійснювали ім- або 5с-шляхом, розраховуючи індивідуальні дози з урахуванням ваги тіла, і білок готували для ін'єкції в наповнювачі, що являв собою стерильний ЗФР, рН 7,2, що містить 0,595 стерильної нормальної сироватки мавп циномолгус (п-2 на дозу і путь ін'єкції). Зразки крові брали до обробки (в дні -4 і -5), відразу після обробки (день 0) і в різні моменти часу після обробки (дні 1-14) і аналізували відносно гематологічних змін (загальний аналіз крові (СВС) і диференційований підрахунок лейкоцитів), а також маркерів клітинної поверхні й внутрішньоклітинних маркерів, описаних вище.
Збільшення загальної кількості СО4-Тгтєед-клітин, СО4--Ттед-клітин пам'яті, наївних СО4--
Тгед-клітин і СО8ГОХРЗ:-Тгед-клітин представлені у вигляді залежних від дози відповідей або у вигляді абсолютної кількості клітин/мл крові (фіг. ЗВА і З8Б), або у вигляді 95 від загальної кількості СО4-- або СЮО8:-Т-клітин (фіг. 388 і 38Г).
Загальна кількість СО4--Тгтед-клітин збільшувалась після введення 100 мкг/кг з 90000/мл до 810000/мл (в 9 разів) і з 4,2 95 до 26 95 від загальної кількості СО4--Т-клітин (в 6,2 рази) і все ще залишалась на підвищеному рівні в день 14. Після введення 30 мкг/кг загальна кількість СО4--
Тгед-клітин збільшувалась з 62000/мл до 447000/мл (в 7,2 рази) і з 4,5 95 до 16,7 95 від загальної
Зо кількості СО4--клітин (в 3,7 рази).
Кількість Тгед-клітин пам'яті зростала при введенні 100 мкг/кг з 42000/мл до 536000/мл (в 12,8 разів) із 2 95 до 17,4 95 від загальної кількості СО4--Т-клітин (в 8,7 разів). При введенні 30 мкг/кг кількість Тгед-клітин пам'яті збільшувалось з 51000/мл до 280000/мл (в 5,5 разів) і з 2,3 90 до 10,5 95 від загальної кількості СО4--Т-клітин (в 4,6 рази).
Кількість наївних Тгед-клітин зростала при введенні 100 мкг/кг з 35000/мл до 272000/мл (в 7,8 рази) і з 2 95 до 8,6 95 від загальної кількості СО4--Т-клітин (в 4,3 рази). При введенні 30 мкг/кг кількість наївних Тгед-клітин збільшувалось з 46000/мл до 166000/мл (в 3,6 рази) і з 2,2 95 до 6,2 95 від загальної кількості СЮО4--Т-клітин (в 2,8 разів).
Після введення 100 мкг/кг ОР47О5 ІдФ-(ІІ-2М880)»2, кількість СО8РОХРЗ:-Тгед-клітин збільшувалась від рівня, відповідного рідкому типу клітин, 16000/мл до 183000/мл (в 11,4 рази) і від 0,7 9о до 7,895 від загальної кількості СО8--Т-клітин (в 11,1 рази). При введенні дози
ОРА7Са5 Ідс-(01-2М880)2, що складає 30 мкг/кг, загальна кількість СО8:-Тгед-клітин збільшувалась з 17000/мл до 101000/мл (в 5,9 рази) і з 0,5 95 до 4,3 95 від загальної кількості
СО8:-Т-клітин (в 8,6 рази). Не було виявлено зв'язаних з обробкою збільшень кількості СО45-
Теп-клітин пам'яті після введення 100 мкг/кг або 30 мкг/кг ОР47О5 Ід0-(ІЇ -2М880)» (фіг. З9А); в дійсності проценти знижувались в день 4, ймовірно, внаслідок більшого збільшення кількості бОра--Тгед-клітин в цей момент часу. Кількість СО4-СО25"-Тей-клітин пам'яті залишалась без вимірювання після введення 30 мкг/кг ОР47О5 Ід(о-(ІЇ -2М880)»2, але була підвищеною в 1,6 рази в день 4, після чого поверталось до вихідного рівня в дні 7-10 (фіг. 39Б).
Індукція рТАТ5а, СО25 і Кі-67 у мавп циномолгус з використанням ОРА7О5 Ід-(ІІ -2М880)»2
Як зазначено вище, клітинна специфічність іп мімо обробки з використанням 1-2 представляє собою параметр, що має вирішальне значення, і при створенні винаходу було продемонстровано, що можна здійснювати моніторинг активації субпопуляції клітин іп мімо шляхом вимірювання ех мімо ретТАТба, рівнів СО25 на клітинної поверхні й внутрішньоклітинного Кі-67 в зразках крові, взятих в різні моменти часу після введення дози.
Результати, представлені на фіг. 40А і 40Б, демонструють, що після обробки за допомогою рРА7а5 Ідс-(/ -2М880)2 мали місце переважна індукція роТАТ5а і пролонгування відповіді у вигляді сигналів реТАТ5а в СО4-- і СО8:-Тгед-клітинах; максимальні відповіді підтримувались протягом періоду часу з дні 1 по день 4 як при введенні дози 100 мкг/кг, так і дози 30 мкг/кг, і 60 повертались до вихідного рівня через 7 днів. Відповіді СО4-С025"-Тей-клітин пам'яті складали
«« половину від максимальних рівнів відповідей в день 1 і повертались до вихідного рівня в день 4. Для всіх інших протестованих типів клітин після обробки була виявлена слабка індукція роЗТАТтТ5а або вона взагалі не мала місце.
Збільшення рівнів СО25 на клітинної поверхні є наслідком активації ІІ--2 і представляє собою
Чутливий біомаркер активації іп мімо. Невдовзі після обробки ОР4А7О5 ІдС-(ІІ -2М880)», як в дозі 100 мкг/кг, так і в дозі 30 мкг/кг, рівень СО25 переважно зростав в СО4-"клітинах пам'яті і наївних
Тгед-клітинах, а також в СО8"РОХРЗ:-Тгед-клітинах (фіг. 4ТА, 41Б). СО25-відповіді СО4- клітин пам'яті і наївних Тгед-клітин досягали пика в день 4 і повертались до вихідного рівня через 7 днів, у той час як підвищені рівні СО25 в СО8ГОХРЗ:-Тгед-клітинах зберігались протягом 10-14 днів.
В експериментах з використанням що містять 1-2 дикого типу злитих білків при створенні винаходу було продемонстровано, що Кі-67 представляє собою чутливий внутрішньоклітинний маркер для клітин, у яких почалась проліферація іп мімо, і він виявився чутливим біомаркером індукованої 1ІІ--2 активації у мавп циномолгус. При аналізі відповідей на 100 мкг/кг ОРА7О5З Ідб- (/-2М880)2 було встановлено, що 80-9095 С0О4:- і СО8:-Ттед-клітин становились Кі-67- позитивними (Кі-677) (фіг. 42А), у той час як після обробки дозою 30 мкг/кг Кі-67-позитивними становились 60-90 95 клітин (фіг. 42Б). Було встановлено, що інші протестовані субпопуляції клітин були менше чутливими у порівнянні з Тгед-клітинами.
Для попереднього вивчення іп мімо впливів нових сконструйованих молекул 1-2 на збільшення кількості Тгед-клітин всі дози для мавп циномолгус виражали в пмолях/кг, що позволяло здійснювати безпосередні порівняння незалежно від молекулярної маси; залежності відповідей від дози порівнювали за типов "голова-до голови" для максимальних збільшень кількості СО4--Тгтед-клітин у вигляді бо від загальної кількості СО4--Т-клітин (фіг. 43)... Не зважаючи на втрату ефективності іп мйго у порівнянні зі злитими білками дикого типу, несподівано було встановлено, що ЮРА47О5 ІдС-(І/-2М880)2 індукував більше збільшення кількості Тгед-клітин у мавп циномолгус, ймовірно, внаслідок збільшення його системної експозиції як після ім-, так і після 5с-введення.
Еозинофілія, яка виникає внаслідок введення І! -2 іп мімо
Ргоїешкіп? у людей стимулює еозинофілію при щоденному застосуванні в дозах від 1х105 до
Зо 4,5х106 МЕ/індивідуума. У мавп циномолгус виявлено схоже збільшення кількості еозинофілів у 100 95 тварин після повторної обробки високою дозою пролейкіну або однократними дозами рРА?Та5 ІдсО-ІІ -2, що складають 226 пмолей/кг (фіг. 44). На фіг. 44 представлені результати для кожної протестованої тварини (вихідні рівні для колоній були одержані для тварин перед тестуванням: (п-44 і п-30) і для різних груп обробки (п-5-6) не залежно від того чи була кількість еозинофілів нормальною або підвищеною. Різким контрастом з впливами пролейкіну і рРА7а5 Ід0-І/-2 була фактична відсутність впливу на еозинофіли ОРА7О5 Ідб-( -2М880)» іп мімо при його застосуванні в дозах 170 ії 570 пмолей/кг (30 ї 100 мкг/кг відповідно). Зазначена відсутність індукції системної еозинофілії при обробці ОР4755 ІдбС-(/-2М880)2 є дуже важливою, приймаючи до уваги ступінь експансії Тгед, індукованої зазначеними різними обробками (порівняння представлено на фіг. 43).
Обробка іп мімо з використанням ОР47О5 Ідс-ІІ -2 пригнічує імунні відповіді у мишей
В попередніх дослідженнях було встановлено, що ОР4755 І|дО-0-2 в дозі 4000 МЕ активував мишачі регуляторні ЕОХРЗ--Т-клітини іп мімо; далі цю дозу застосовували для оцінки його здатності пригнічувати класичні залежні від Т-клітин імунні відповіді у мишей, тобто реакцію гіперчутливості уповільненого типу (фіг. 45) і Ідо-відповідь на КІН (фіг. 46).
МОЮ-мишей і С57ВІ/бЄ-мишей (п-7) імунізували шляхом ІМ-ін'єкції баранячими еритроцитами (5гбрс) і здійснювали контрольне зараження через З дні, застосовуючи болюсну ін'єкцію 5грс, в одну задню лапу для індукції реакції гіперчутливості уповільненого типу (ОТН).
Через один день після контрольного зараження мишей умертвляли обробкою Со», відрізали лапи і зважували. Величина ОТН-відповіді представлена у вигляді вимірювання ваги лап у порівнянні з неімунізованими мишами (А ваги лап). ОРА7О5 ІдОС-ІІ -2 вводили С в дозі 4000 МЕ на мишу за З дні до імунізації і в день імунізації 5гбс і наповнювачем, який представляв собою стерильний ЗФР, рН 7,2. Статистичну значимість визначали за допомогою критерію Манна-Уітні з використанням програми сСгарпРаа Ргізт.
Обробка ОРА7О5 Ід0-ІИ-2 за З дні до і в день імунізації баранячими еритроцитами пригнічувала подальшу реакцію гіперчутливості уповільненого типу на контрольне зараження баранячими еритроцитами на 51 95 у МОЮ-мишей (фіг. 45А; р-0,0023) і на 38 95 у С57ВІ /6- мишей (фіг. 45Б; р-0,002). Застосовний як позитивний контроль імунодепресант мишачий
СТІ А-4-Ід інгібував ОТН-реакцію в такому ж самому ступені, що й ОР47О5 Ід-1І -2. 60 рРА7а5 Іда-ІЇ-2 також мав здатність пригнічувати КІ Н-специфічні Ідс-відповіді у мишей ліній С57ВІ/6 (інгібування на 78 95, р-0,0007, фіг. 46А) ії МОЮ (інгібування на 67 95, р-0,004, фіг. 46Б). В цьому експерименті здорових молодих мишей С57ВІ/6 (п-:7-10) ї МОЮ (п-13-14) імунізували шляхом ІР-ін'єкції за допомогою 100 мкг людської вакцини, яка містить чистий КІН без ад'юванта, відповідно до рекомендацій виробника (фірма 5геїЇІПаг). Обробка ОР47О5 ІдО-ІІ -2 включала 1 (МОЮ) або 2 (С57ВІ /6) щотижневі ЗС-обробки 4000 МЕ на мишу в день імунізації.
Через 7 днів (МОБ) і 21 день (С57ВІ/6) після імунізації одержували зразки крові й визначали рівні в сироватці КІ Н-специфічних Ідо-відповідей за допомогою ЕГІЗА.
Здатність ОР47О5 ІдБ-ІІ -2 подавляти імунні відповіді іп мімо підтверджує гіпотезу про те, що активація регуляторних Т-клітин, яка індукується низькою дозою 1-2, приводить до утворення функціональних регуляторних Т-клітин, що опосередковує зниження імунної відповіді.
Хоча представлений вище винахід описаний достатньо докладно з метою ілюстрації і прикладу для більш ясного і кращого розуміння, опис і приклади не слід розглядати як обмежувальні обсяг винаходу. Опис всіх патентів і наукової літератури, процитованих в даному описі, спеціально повністю включені в нього як посилання.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«1105 Ф.Хоффманн-Ля Рош АГ «120» ЗЛИТІ БІЛКИ ІНТЕРЛЕЙКІНУ-2, І ЇХ ЗАСТОСУВАННЯ «1305 31142 «1505 ув 61/936564 «1515 2014-02-06 «1605 66 «1705 РагбепсІп версія 3.5
Зо «2105 1 «2115» 133 «2125 РВТ «213» Ното 5арієпь «4005 1
Аза Рго ТПг Бек бек бек ТПг пу5 пуб ТПг біп Геї сіп Іеч біц Нів 1 5 10 15
Теч Геч Гей Ар Геч сіп Меє І1їе Іечп АБп біу Іїе Авп Авп Тукг ГПув 20 25 30
Авп оРго пуб Геї ТПг Агу Меє Тецп ТБПг Рпе Пув Рре Тугє Меє Рго Гуз 35 40 45
Туз Аза ТПг бі Геч Ппу5 Ніб Тез біп Суз Теч біц біц січ Геч Гуз 6о 50 Рго Геч Сі Сіц Ма1ї Гечш Авп їец Аїа Сіп бек Пув Авп Ріе Нів Іеч 65 70 75 80
Агуд Рго Агуд АБр Геї І1е бек АБп Іїе Авп Уаі Іїе Уаії Іеч січ Іеч 85 90 95 55
Туз біу бек біц ТпПг Тпг Рбе Меє Су5 біп Туг Аїа АвБр бій ТПпг Аза 100 105 110
ТПг І1ї1е Маії бії Рбе Іїец Абхп Агуд Тер Іїе Тс Роре Су5 біп бек Іе 60 115 120 125
І1е бек Тс Ге ТПг 130 65 «2105 2 «2115» 399
«2125 ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» людський І1-2 дикого типу «4005 2 чсасссасеєс саадсєсвсас ааадааааса садссасаас Єдчадсасєс ассдсєдчає бо
Єбасадаєда ССЕєдааєдд ааєсааєсаає Сасаадаасс ссааасєсас саддасдсесс 120 асасєсаадс сСеєсасасусс саадааддсс асадчаасєда аасаєсєсса десдессадаа 180 чаачаассса аасссссуда чдаадсусса аасссадссс ааадсааааа сеЕссєсасеса 240 ачасссадчдуд ассєаасса саасаєсаас десаасадеЕсс єдчдаассааа дадаєссдаа 300 асаасаєсса СудсуЧсЄЧдааса єдссЧдаєдад асадсаасса Єсусбадааєс Єссдаасада 360
Єддасстассє СЕсСдссааад саєсаєсєса асасеєдасе 399 «2105 З «2115 133 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» людський І1-2 дикого типу (С125А)
Зо «4005 З
Аза Рго ТПг Бек бек бек ТПг пу5 пуб ТПг біп Геї сіп Іеч біц Нів 1 5 10 15
Печ печп Гпецп Авр Ге Сіп Месє Іїе Гей АвБп біу Іїе Авп Авп Тук Пув 20 25 Зо
Авп оРго пуб Геї ТПг Агу Меє Тецп ТБПг Рпе Пув Рре Тугє Меє Рго Гуз 35 40 45
Туз Аза ТПг бі Геч Ппу5 Ніб Тез біп Суз Теч біц біц січ Геч Гуз 50 55 бо
Рго Геч бі сі Маї Іечп АБп їец Аза сіп бек пуб АБп Роре Ні Іеч 65 7о 75 8о0
Агуд Рго Агуд АБр Геї І1е бек АБп Іїе Авп Уаі Іїе Уаії Іеч січ Іеч 85 90 935
Пув біу бек бі Тпг ТБс Рбе Меє Сув Сіц Туг Аза АБр біц Тіг А1а 100 105 110
ТПг І1ї1е УМаії бії Рбе Іїец Абхп Агуд Тер Іїе Тс Рре Азїа біп бек Іе 115 120 125
І1е бБег ТПг Іеч Тс 130 «2105 4 (516) «2115 399 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «220» 65 «223» людський І11-2 дикого типу (С125А) (1) «4005 4 чЧсЕсСссасасє сссссадсас саадаааасс садссссадс Єддаасасєсс сссдсєсдчає бо сеЕдсадаєда єсссдаасдд саєсєсаасаас басаадаасс ссаадсєдас ссддаєдсед 120 асссєсєсаадс Сссасасусс саадааддсс ассчадсєда аасаєсєсдса дсдсссддадаа 180 чаччаассуда адсссссучда ачаддсдсеєд аасссддссс адЕссаадаа сЕЄСсСсасстд 240 аддссссудуддщ ассєдасєссс саасассаас деЕЧчассуєдс єЄддаасєдаа доададссссддад 300 асаассеЕсса СдеЕдсдадса сдссудасудад асадссасса Єсдєддаасєє ссеЕдаасс9ду 360 бддаєссасссє ссудсссадес саєсаєсьсс асссеєдасс 399 «2105 15 «2115 399 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «223» людський І1-2 дикого типу (С125А) (2) «4005 15 чсасссасеєс саадсєсвсас ааадааааса садссасаас Єдчадсасєс ассдсєдчає бо
Єбасадаєда ССЕєдааєдд ааєсааєсаає Сасаадаасс ссааасєсас саддасдсесс 120 асасєсаадс сСеєсасасусс саадааддсс асадчаасєда аасаєсєсса десдессадаа 180 чаачаассса аасссссуда чдаадсусса аасссадссс ааадсааааа сеЕссєсасеса 240
Зо ачасссадчдуд ассєаасса саасаєсаас десаасадеЕсс єдчдаассааа дадаєссдаа 300 асаасаєсса СудсуЧсЄЧдааса єдссЧдаєдад асадсаасса Єсусбадааєс Єссдаасада 360
Єддасстассє седсссааад саєсаєсєса асасєдасе 399 «2105 6 «2115 399 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «223» людський І1-2 дикого типу ІІ-2 (С125А) (3) «4005 6
ЧсЕСсСссасва дсадсеєссас саадаааасс садссссадс Єддаасасєсє дссдсєдчає бо сеЕдсадаєда єсссдаасдд саєсєсаасаас басаадаасс ссаадсєдас ссддаєдсед 120 ассєссааде Ссрасаєдсс саадааддсс ассдаасєда аасаєссдса дедсссддаа 180 чаччаассуда адсссссучда ачаддсдсеєд аасссддссс ададсаадаа сеЕсссассод 240 аддсссадчду ассєдасєса саасассаас деЕдЧчаєсєсуєдс єЄддаасєдаа доадсадсдад 300 асаассеєсса сСдсдсдадса суссудасуа асадссасса Есудсдчдааєс сссдаассо 360 бддаєссассє ссудсссадад саєсаєсадс асссеєдаса 399 бо «2105 7 «2115 399 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність 65 «220» «223» 11-2 дикого типу І1-2 (С125А) (4) «4005 7 чсасссасеєс саадсєсвсас ааадааааса садссасаас Єдчадсасєс ассдсєдчає бо
Есасачаєча СЕСсСєЧдааєду ааєсааєаас сСасаадаасс ссааасеєсас садчаєдесесс 120 асасстааде СсСвбасаєдсс саадааддсс асадаасєда аасаєссєса дедЕСсСадаа 180 чаачаассса аасссссуда чдаадсусса аасссадссс ааадсааааа сеЕссєсасеса 240 ачасссадчдуд ассєаасса саасаєсаас десаасадеЕсс єдчдаассааа дадаєссдаа 300 асаасаєсса СудсуЧсЄЧдааса єдссЧдаєдад асадсаасса Єсусбадааєс Єссдаасада 360 бддаєсвассє сбдсссааад саєсаєсєса асасеєдасе 399 «2105 8 «2115 227 «2125 РЕТ «213» Ното 5арієпь «4005 8
Авр пуб ТПЕ Ні ТБ о Сув Ргро Рго Суб Рго Аїа Рго січ Іеч Іеєч С1Уу 1 5 10 15 б1іу Рго бек Маії Робе Гей Робе Рго Рго Пув Рго Пув Авр ТПг ТГеч Меє 20 25 Зо
І1їе Бек Аку ТП Рко біч Уа! ТБг Суб Уа1і! Уа1і Уа1і АБр Уаї бек Нів
Зо біч Авр Ркго біц Уа1і Ппубв Роре АБп Тр Туг Уаі Авр сіу Уа1і січ МУаї бо
Нів АБп Азїа Гуз Тпг пуб Рго Агуд бій бій біп Тук АБп бек Тс Тусг 35 65 7о 75 8о0
Агуд Уа1ї Уа1ї Бек Маії Іеч ТБг Уаії Гей Ніб сіп Абвр Тер Геї АБп б1Уу 85 90 935 40 цпув бій Тук Ппув Сув Ппуз Маії бек АБп Гуз Аїа ІТеч Рго Аїа Рго І1е 100 105 110 біч пувз Тбг Іїе Бек Ппув Аїа Гуз біу біп Рго Акуд бій Рго сіп Уаї 115 120 125 45
Тук ТП Гей Рго Рго бек Агуд Авр бі Геї Тс Гуз АБп о біп Уаї 5бег 130 135 140
Теч ТП Суб Пец Уа1ї Ппув сіу Роре Тук Рго бек АвБр Іїе Аїа Уа1ї сій 50 145 150 155 160
Тер бі бек АБп біу біп Рго бій Абп Аб5п Туг Пуб5 Тс Тс Рго Рго 165 170 175 55 Уаії ІГечп Авр бек Авр біу бек Рібе Рібе Гей Туг бек Гув Теч ТПг Уаї 180 185 190
Авр ПувБ Бек Агуд Тер біп біп біу АбБп Уаі Рре бек Суб Бек МУаі1! Меє 195 200 205 60
Нів сі Аза Іеч Нів АвБп Ніб Тук ТПг сіп Ппув бек ІГеч бег Іеч бег 210 215 220
Рго сіу Пув 65 225 «2105 19 «2115 115
«2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» ррРа47ов, УН «4005 12 біч Уаії сбіп Пец Ге сі бек біу біу біу ІТеч Уаі сіп Рго сіу с1у 1 5 10 15
Ззек Геч Акуд Тез бек Сув Аза Аза бек сіу Рпе ТПг Ріре бег бек Туг 20 25 Зо
А1їа Меє бег Тер Уаі Акуд Сіп Азїа Рго с1іу Пув С1у їеч Січ Тгр Уаї 35 40 45 зек Аїа І1ї1е бек біу бек біу біу бек ТПг Туг Туг Аїа АБр бек Уаї 50 55 бо
Туз біу Акуд Рпе ТПг Іїе Бек Агу АБр АБп о бег Гу5 Ап ТпПг Геч Туг 65 7о 75 8о0
Теч біп Меє Ап бек Геї Агу Аза бі АвБр ТБ Аза Уа1і Тук Тук Сув 85 90 935
Аа Ппув сіу Бек біу Рре АвБр Туг Тер біу біп сіу Тбг Геч Уа1і ТБг 100 105 110
Уаї Вег бег 115 «2105 10 «2115 345 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «223» рРА1705, УН «4005 10 чачачаєдсаасє СуУосєдчадсс єдоадоадЧдаддс сЄєдадсасадс ссддадоадЕС ссєдадасесс бо
Есссудсдса сссссудасє сассеЕсвсадс адссаєдсса Єдадссддудє ссдссадаесє 120 ссадддаадд ддссддадеЕд ддеЕсссадсеЕ ассадсддеа деЕддеЕддсад сасавбастсас 180 чсачасєссу СЄдаадддссу дсЕссассаєс Сссададаса ассссаадаа сасдсєдесає 240 сЕдсадаєда асадсссдад адссдаддас асуддссудсбає аєвсасєдсдс даааддсадс 300 ччаєсєдасе ассддддсса аддаасссвд дЕсассуєсє сдаде 345 «2105 11 «2115 108 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 бо «223» рРА7ОВ8, У, «4005 11 біч Іїе Уаії Гей ТПг сіп Бек Рго біу Тбг Те бек Гец бек Рго с1у 65 1 5 10 15 біч Акуд Аза Тбг Гей бек Сув Агу Азїа бек біп бек Уаії бек Бек бБег 20 25 Зо
Тук Геї Аїа Ткр Тук біп біп пуб Рго сіу біп Аза Рго Агу Іеч Гец 35 40 45
І1е Туг б1у Аїа бБег бек Акуд Аїа ТПг біу Іїе Рго АвБр Агу Ріе 5ег 50 55 бо біу бек біу бек сіу ТПг АБр Роре ТПг ІТечп ТБПг І1їе бег Агкд Геч сій 65 7о 75 8о0
Рго бій АБр Рпре Аїа Уа1! Туг Тук СувБ біп сбіп Туєк біу бек бег Рго 85 90 935
Теч ТП Рпе сіу сіп сіу Тс Гуз Уаї бічЧ Іїе Був 100 105 «2105 12 «2115 324 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «223» рР1705, МІ, «4005 12 чаааєсуєддс сСаасудсадсс єссаддсасс сЕдЕСЕСсвєдЕ ссссадддадда аададссасс бо сЕСЕСЕсдса дддссадсса дадеЕдеЕсадс адсадсвтасс сбадссєддсба ссадсадааа 120 ссЕддссадд сЕсссаддсє ссеєсаєсрає ддадсассса дсадддссас Еддсаєссса 180 часаддеєсса дчеЕдчдсадедч асссудчдаса дасеєссассс єсассаєса садчасєддад 240 ссєдаадасє єсдсадедса свсассдессад садсаєддбеа дсесассдсе дасдеЕссддадес 300
З5 саддддасса аадєддааає сааа 324 «2105 13 «2115 592 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» рР4-7б5, НС(ЕС «виступ», РЗ329б ГАГА) -1І12 «4005 13 біч Уаії сбіп Пец Ге сі бек біу біу біу ІТеч Уаі сіп Рго сіу с1у 1 5 10 15
Ззек Геч Акуд Тез бек Сув Аза Аза бек сіу Рпе ТПг Ріре бег бек Туг 20 25 Зо
Аа Меє Бек Тгр Маі Аку біп Аза Рго сіу пуб сіу Гезч біч Тгрр Уаї 35 40 45 зек Аїа І1ї1е бек біу бек біу біу бек ТПг Туг Туг Аїа АБр бек Уаї 50 55 бо 60 цпув б1іу Агу Рбе ТПг І1їе 5ег Агу АБр АБп бег Гув Ап ТПг Геч Туг 65 7о 75 8о0
Теч біп Меє Ап бек Геї Агу Аза бі АвБр ТБ Аза Уа1і Тук Тук Сув 85 90 935 65
Аа Ппув сіу Бек біу Рре АвБр Туг Тер біу біп сіу Тбг Геч Уа1і ТБг 100 105 110
Уаї бек бек Аза бек ТПг ПпувБ сіу Рго бек Ма! Робе Рго Гей Аза Рго 115 120 125
Зек Бек Пув бек ТПг бек біу біу ТПг Аїа Аза Геч сіу Су5 Іеч Уаї 130 135 140
Туз АБр о Тук Рпе Рго сії Рго УМаі ТПг Уаї б5ег Тгр А5п бег сіу Аза 145 150 155 160
Теч ТЬг бек біу УМа1ї Нів ТПг Рре Рго Аїа Ма1ї Іїеч Сіп бег бег С1У 165 170 175
Теч Тук бек Гей бек Бек Уа1і УМа1і! ТПг Уаї Рго бек бек бек Геч Сс1Уу 180 185 190
ТЕ біп ТБ Тук Іїе Суб Авп Уаі Авп Нів пуб Рго бек АБп о ТПкг Був 195 200 205
Уаї АБр Гуз пув Уаії бій Рго Ппубв Бек Суб АБр Гу5 ТПг Нібв Трг Сув 210 215 220
Рго Рго Суб Рго Аїа Рго бі Аза Аза сіу сіу Рго Бек МУМаі1і Роіе Іеч 225 230 235 240
Рпе Рго Рго Пув Рго Пув Авр ТПг Гей Меє Іїе бек Агу ТПг Рго сій 245 250 255
Уаї ТЕ Сув Уаії Уаї Уаї Авр Уа1і Бек Нібв бій АвБр Ргко біч Уаї Пув 260 265 270
Зо
Рпе Абвп Тгр Тук Маі АБр біу Уаі біц Уаі Ніб Ап Аза Пу5 ТіПг Гуз 275 280 285
Рго Акд бі бі біп Тук АБп о бег ТПг Туг Акуд Уа1і Уаі1ї бек Уаї Іеч 290 295 300
ТПгЕ Маї Іеч Ні біп Абвр Тер Геч Ап сіу Ппув бі Тук Гув Сув Гуз 305 310 315 320
Уаї бек Авп Ппув Аїа їеч Сіу Аїа Рго І1їе сій Пув ТПг І1їе бег Гуз 325 330 335
Аза пув сіу біп Рго Аку біч Ргко біп Уа! Тук ТП Геї Рго Ркго Сув 340 345 350
Агуд Авр січ Геч ТБ Гуз АБп обіп Уаії бек Геч Тер Суб Геч Уаї Гуз 355 360 365 біу Рпе Тук Рго бек Ар Іїе Аїа Уаі біч Тср біц бег АвБп сіу сіп 370 375 З8о
Рго біц АБп АБп о Тук Гув Тбг ТБЕ Рго Рго Уаі Геї АБр 5ег АБр б1Уу 385 390 395 400 век Ріпе РіПе Гей Туг бек Пув Теч ТПг Уаії Авр Пуз бек Агу Тгр сіп 405 410 415 біп бі1у Авп Уа1! Ррпе бБег Сув бек Ма! Меєсє Ні біц Аза Гей Нібв Ап 420 425 430 60
Нів Тук ТП біп Гувз бек Гей бек Геч бек Рго біу біу сбіу с1у .Ш1Уу 435 440 445 бек сіу сіу сіу біу бек біу біу біу сіу бек Аза Рго ТПг бек б5ег 65 450 455 460
Бек ТПЕ Ппув Пув ТПг біп Теч біп гейш сі Ніє Геч Геч ІГеч АБр Іеч 465 470 475 480 біп Меє Іїе Гей Азп сіу І1їе АБп АБп Тук Гув АБп о Рго пуб Геч ТПг 485 490 495
Акуд Меє Гей ТПг Рбе Пув Ріпе Туг Меє Рго Ппуз Пув Аїа ТПг січ Гей 500 505 510
Туз Ні Гей біп Сув Геї січ бі біч Теч Пу5з Рго Геч січ січ МУаї 515 520 525
Теч АБп Гей Аїа сіп Бек Пув АБп о Роре Ніз Те Агу Рго Агуд Авр Гей 530 535 540
І1їе Бек АБп І1їе АБп Уа! Іїе Уаі гейш сі Ге Ппув сіу бек бій ТЕбг 545 550 555 560
ТПЕ Рре Меє Суз біч Туг Аза Авр сій ТПг Аїа ТПг І1їе Уаії біч Рре 565 570 575
Теч Авп Агуд Тер І1е ТБс Рре Аїа Сіп бег Іїе І1е бек ТіПг Іеч Тс 580 585 590 «2105 14 «2115 1776 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «223» рР4-17б5, НС(ЕС «западина», РЗ329б ТАТА) -1І12
Зо «4005 14 чачачаєдсаасє СуУосєдчадсс єдоадоадЧдаддс сЄєдадсасадс ссддадоадЕС ссєдадасесс бо
Есссудсдса сссссудасє сассеЕсвсадс адссаєдсса Єдадссддудє ссдссадаесє 120 ссадддаадд ддссддадеЕд ддеЕсссадсеЕ ассадсддеа деЕддеЕддсад сасавбастсас 180 чсачасєссу СЄдаадддссу дсЕссассаєс Сссададаса ассссаадаа сасдсєдесає 240 сЕдсадаєда асадсссдад адссдаддас асуддссудсбає аєвсасєдсдс даааддсадс 300 ччасєсЧдасс ассудудддсса адчаасссвєд деЕсассуєсєЕ сдадедссадд сассааддуас 360 ссаєсудЕсСеЕ Ессссседдс асссоссеєсс аададсассо седддддсас адсддсссед 420 чассдсссду сСсаадчдасса ссєссссудаа ссудсєдасуд ЄДдЕСЧдЄддаа сЕСсаддсусс 480 сЕдассадсд дсдедсасас сЕссссуддсеЕ деЕсСсврасаде ссесаддасе стасесссес 540 адсадсдєдд Єдассдєдсс сЕссадсадс Ссдддсассс адасссасає ссдсаас9аєд 60 ааєсасаадс ссадсаасас саадчдсдудчдас аадааадеєсу адсссаааєс Єсдєдасааа ббо асєЕсасасасє дсссассуєЄд сссадсассо даадсєдсад ддадчЧассуєс адсссессесс 720
Есссссссаа аасссааудда сасссссаєд аєсЕсссуда ссссеєдадудс сасасдсуєд 780 чЧчеЧдЧдєдчасу СЄдадссасуа адасссєда дЕСаадсеєса асеєддсасуає дадасддсуєд 840 60 чаддсєдсаса асбдссаадас ааадссдсудд даддадсадс асаасадсас дсассєдед 900
ЧеЕсадсуєсс СсассуєЄєссеє дсассаддас Єддссєдаасу дсаадчадеа саадсдсаад 960
ЧдЕссссааса аадсссссуд судсссссаєс дачдаааасса єсЕССсСааадс сааадддсад 1020 65 ссссдадаас сасаддедбта сасссєдссс ссаєсдссдад аєдадсєдас саадаассад 1080 чЧЕсадссєдЕ ддсдсссдудє саааддсеєс баєсссадсу асаєсуссудє даадеддадад 1140 адсаасуддудс адссудачаа саасвєасаа ассасусссс ссуєдсєдчда сЕссдасудес 1200
ЄссЕссееєсс сссасадсаа дсесассудєд дасаададса ддасддсадса ддаддаасдес 1260 рЕСсСЕСаєдсє ссуєдаєдса Єдаддсеєсвд сасаассассо асасудсадаа дадссесьсс 1320 сЕДЕСЕСсССсСд дЕддсддсдуа аддссссодда ддсуддаддЕс седдаддсдддд аддсессдса 1380 ссрасесєсаа деЕєСвасааа даааасаса ссасаасеєдд адсаєєсасеЕ дсеєдчаєєста 1440 садаєдаєєсє єдааєдудаає сСааєаассас аадааєссса аасссассад даєдсессаса 1500 рЕсаадсьссє асаєдсссаа дааддссаса даасеєдааас аєсєссачсд сссадаадаа 1550 чаасссааас сесбддадда адедссааає Єсбадсєсааа дсааааасес сСсасссаада 1620 сссадддасе бааєсадсаа сассаасуєа асадсєсвдч аассааадуд асссдаааса 1680 асаєссаєде дедаасаєдс єдаєдадаса дсаассасєєд Садаасєсссє даасадаєд 1740 аєсассссєсу сссааадсає саєсєсааса сєдасе 1776 «2105 15 «2115 445 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205
Зо «223» рРА7о5, НС(Ес «западина», РЗ29С ІАГА) «4005 15 біч Уаії сбіп Пец Ге сі бек біу біу біу ІТеч Уаі сіп Рго сіу с1у 1 5 10 15
Ззек Геч Акуд Тез бек Сув Аза Аза бек сіу Рпе ТПг Ріре бег бек Туг 20 25 Зо
А1їа Меє бег Тер Уаі Акуд Сіп Азїа Рго с1іу Пув С1у їеч Січ Тгр Уаї 35 40 45 зек Аїа І1ї1е бек біу бек біу біу бек ТПг Туг Туг Аїа АБр бек Уаї 50 55 бо
Туз біу Акуд Рпе ТПг Іїе Бек Агу АБр АБп о бег Гу5 Ап ТпПг Геч Туг 65 7о 75 8о0
Теч біп Меє Ап бек Геї Агу Аза бі АвБр ТБ Аза Уа1і Тук Тук Сув 85 90 95
Аа Ппув сіу Бек біу Рре АвБр Туг Тер біу біп сіу Тбг Геч Уа1і ТБг 100 105 110
Уаї бек бБег Аїа бек ТПг Ппув Сіу Рго бек Ма1і Рре Рго Іеч Аїа Рго 115 120 125
Зек Бек Пув бек ТПг бек біу біу ТПг Аїа Аза Геч сіу Су5 Іеч Уаї 130 135 140 60
Туз АБр о Тук Рпе Рго сії Рго УМаі ТПг Уаї б5ег Тгр А5п бег сіу Аза 145 150 155 160
Теч ТрПг бек сіу Уа1і Нібв ТПг Роре Рго Аїа Уа! Гей сСіп бек Бек сб1Уу 65 165 170 175
Теч Тук бек Гей бек Бек Уа1і УМа1і! ТПг Уаї Рго бек бек бек Геч Сс1Уу 180 185 190
ТЕ біп ТБ Тук Іїе Суб Авп Уаі Авп Нів пуб Рго бек АБп о ТПкг Був 195 200 205
Уа1 Авр Пув Ппув Маї бій Рго Ппуз Бек Сув Авр Пубв ТПг Нів ТПг Сув 210 215 220
Рго Рго Суб Рго Аїа Рго бі Аза Аза сіу сіу Рго Бек МУМаі1і Роіе Іеч 225 230 235 240
Рпе Ркго Рго пуб Рго Гу5з АБр ТПг Гей Меє Іїе Бек Агу ТПг Рго січ 245 250 255
Уаї ТЕ Сув Уаії Уаї Уаї Авр Уа1і Бек Нібв бій АвБр Ргко біч Уаї Пув 260 265 270
Рпе Абвп Тгр Тук Маі АБр біу Уаі біц Уаі Ніб Ап Аза Пу5 ТіПг Гуз 275 280 285
Рго Акд сії Січ біп Туг Авп бег Трг Тує Агу Ма1 Уаї бек Уаї Іеч 290 295 108)
ТПгЕ Маї Іеч Ні біп Абвр Тер Геч Ап сіу Ппув бі Тук Гув Сув Гуз 305 310 315 320
Уаї Бек АБп Гуз Аза Ге сіу Аза Рго Іїе сії Гу5 Тбг І1е бек Пув 325 330 335
Аза ПпувБ сіу біп Рго Аку бі Ргко біп Уаї Суб ТпПг Геї Рго Рго 5ег
Зо 340 345 350
Агуд Авр о біч Геч ТБ Гуз АБп обіп Уаії бек Геч бек Сув Аїа Уаї Гуз 355 360 365 с1у Рпе Туг Рго бек АБвр І1їе Аїа Уаі Сі Тгр Сі бек Ап с1у сіп 370 375 380
Рго біц АБп АБп о Тук Гув Тбг ТБЕ Рго Рго Уаі Геї АБр 5ег АБр б1Уу 385 390 395 400
Зек Рпе Рбе Геч МУМаі! бек Гув Ге ТБПг Уаі! Авр Пубв бБег Агу Тер біп 405 410 415 біп бі1у Авп Уа1! Ррпе бБег Сув бек Ма! Меєсє Ні біц Аза Гей Нібв Ап 420 425 430
Нів Тук ТП біп Гувз бек Гей бек Геч Бек Рго біу Гуз 435 440 445 «2105 16 «2115» 1335 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» рР4-17б5, НС(ЕСсС «западина», РЗ3290б ГАГА) «4005 16 чачачаєдсаасє СуУосєдчадсс єдоадоадЧдаддс сЄєдадсасадс ссддадоадЕС ссєдадасесс бо 60
Есссудсдса сссссудасє сассеЕсвсадс адссаєдсса Єдадссддудє ссдссадаесє 120 ссадддаадд ддссддадеЕд ддеЕсссадсеЕ ассадсддеа деЕддеЕддсад сасавбастсас 180 65 дсадасєссд Єдаадддссуд дессассасєс сСссададаса ассссаадаа сасдсєднтає 240 сеЕдсадаєда асадссєдад адссдаддас асддссдбає аєсасєдбдс даааддсадс 300 ччасєсЧдасс ассудудддсса адчаасссвєд деЕсассуєсєЕ сдадедссадд сассааддуас 360 сссЕССЯДЕДдДЕ ЕСсСссссвєддс ссссадсадс аададсасса дсддсддсас адссудсеЕсвд 420 чЧасЕдсссда Єсааддасса сесссссудад сссудєдассу ЄдеЕсссддаа садсуддадсс 480 сЕдасссссуд дсдедсасас сеЕсссссдес деЕдсєдсада дЕсєсЕддссеЕ дсасадссвд 540 адсадсуєдуд Ссассуєдсес ЕсСссадсадс сеЕдддсассс адасссасає сеєдсаасуєд 60 аассасаадс ссадсаасас сааддєеддас аачааддсєдуа адсссаадад седсдасааа бо асєЕсасасасє дсссассуєЄд сссадсассо даадсєдсад ддадчЧассуєс адсссессесс 720
БЕсСсссссаа аасссаадда сасссеєсаєд ассеЕсссуда ссссєдаддЕ сасасдс9аєд 780 чЧчеЧдЧдєдчасу СЄдадссасуа адасссєда дЕСаадсеєса асеєддсасуає дадасддсуєд 840 чаччдєдсаєа аєдссаадас ааадссусуд дЧадчадсадеЕ асаасадсас деассєдесд 900
ЧеЕсадсуєсс СсассуєЄєссеє дсассаддас Єддссєдаасу дсаадчадеа саадсдсаад 960
ЧдЕссссааса аадсссссуд судсссссаєс дачдаааасса єсЕССсСааадс сааадддсад 1020 ссссдадаас сасаддсдед сасссєдссс ссассссуддад аєдадсєдас саадаассад 1080 чЧЕсадссеєсЕ сдбсдсдсауде саааддсеєс баєсссадсу асаєсуссудє даадеддадад 1140 адсаасуддудс адссудачаа саасвєасаа ассасусссс ссуєдсєдчда сЕссдасудес 1200
Зо
ЄссЕссесеєсс ссуєЄдадсаа дсеЕсассудєд дасаададса ддасддсадса ддаддаасдес 1260 рЕСсСЕСаєдсє ссуєдаєдса Єдаддсеєсвд сасаассассо асасудсадаа дадссесьсс 1320 сЕдЕсєссуду деааа 1335 «2105 17 «2115 592 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» рР1і705, НС (Ес же, РЗ29б ГАТА)-ІІ2 «4005 17 біч Уаії сбіп Пец Ге сі бек біу біу біу ІТеч Уаі сіп Рго сіу с1у 1 5 10 15 век Геч Агуд Гей бег Сув Аза Аїа бек біу Рпе ТП Роре бек бБег Туг 20 25 Зо
Аа Меє Бек Тгр Маі Аку біп Аза Рго сіу пуб сіу Гезч біч Тгрр Уаї 35 40 45 зек Аїа І1ї1е бек біу бек біу біу бек ТПг Туг Туг Аїа АБр бек Уаї 50 55 бо
Туз біу Акуд Рпе ТПг Іїе Бек Агу АБр АБп о бег Гу5 Ап ТпПг Геч Туг 60 65 7о 75 8о0
Теч біп Меє Ап бек Геї Агу Аза бі АвБр ТБ Аза Уа1і Тук Тук Сув 85 90 935 65 Аза пув сі1у бек б1іу Рре Авр Туг Тер сС1у Сіп сС1іу Трг Іеч Уа1 Тіг 100 105 110
Уаї бек бек Аза бек ТПг ПпувБ сіу Рго бек Ма! Робе Рго Гей Аза Рго
115 120 125
Зек Бек Пув бек ТПг бек біу біу ТПг Аїа Аза Геч сіу Су5 Іеч Уаї 130 135 140
Туз АБр о Тук Рпе Рго сії Рго УМаі ТПг Уаї б5ег Тгр А5п бег сіу Аза 145 150 155 160
Теч ТрПг бек сіу Уа1і Нібв ТПг Роре Рго Аїа Уа! Гей сСіп бек Бек сб1Уу 165 170 175
Теч Тук бек Гей бек Бек Уа1і УМа1і! ТПг Уаї Рго бек бек бек Геч Сс1Уу 180 185 190
Таг біп Трг Тує І1е Сув Авп о Уа1і Авп Нів Куб Рго бБег Авп ТіПг Гув 195 200 205
Уаї АБр Гуз пув Уаії бій Рго Ппубв Бек Суб АБр Гу5 ТПг Нібв Трг Сув 210 215 220
Рго Рго Суб Рго Аїа Рго бі Аза Аза сіу сіу Рго Бек МУМаі1і Роіе Іеч 225 230 235 240
Рпе Ркго Рго пуб Рго Гу5з АБр ТПг Гей Меє Іїе Бек Агу ТПг Рго січ 245 250 255
Уаї ТЕ Сув Уаії Уаї Уаї Авр Уа1і Бек Нібв бій АвБр Ргко біч Уаї Пув 260 265 270
Рпе Авп Тер Тугк Маі Авр сСіу Уаі бі Уаї Нів Ап Аїа Пув ТіПг Був 275 280 285
Рго Акд бі бі біп Тук АБп о бег ТПг Туг Акуд Уа1і Уаі1ї бек Уаї Іеч 290 295 300
З5
ТПгЕ Маї Іеч Ні біп Абвр Тер Геч Ап сіу Ппув бі Тук Гув Сув Гуз 305 310 315 320
Уаї Бек АБп Гуз Аза Ге сіу Аза Рго Іїе сії Гу5 Тбг І1е бек Пув 325 330 335
Аза ПпувБ сіу біп Рго Аку бі Ргко біп Уаі! Тук ТПг Геї Рго Ркго 5ег 340 345 350
Агкуд АБр бій Гей Тпг о Ппув Авзп біп Уаї бек Ппечп ТК Суз Геч Уаї Гуз 355 360 365 біу Рпе Тук Рго бек Ар Іїе Аїа Уаі біч Тср біц бег АвБп сіу сіп 370 375 З8о
Рго біц АБп АБп о Тук Гув Тбг ТБЕ Рго Рго Уаі Геї АБр 5ег АБр б1Уу 385 390 395 400
Бек Рпе Рбе Геч Тук бек Гув Ге ТПг Уаі! Авр Пубв бБег Агу Тер біп 405 410 415 біп бі1у Авп Уа1! Ррпе бБег Сув бек Ма! Меєсє Ні біц Аза Гей Нібв Ап 420 425 430 60 Нів Туг Трг Сіп пуб бБег Геч бек їец бег Рго Сі1у Сіу с1у С1у С1У 435 440 445 бек сіу сіу сіу біу бек біу біу біу сіу бек Аза Рго ТПг бек б5ег 450 455 460 65
Бек ТПЕ Ппув Пув ТПг біп Теч біп гейш сі Ніє Геч Геч ІГеч АБр Іеч 465 470 475 480 біп Меє Іїе Гей Азп сіу І1їе АБп АБп Тук Гув АБп о Рго пуб Геч ТПг 485 490 495
Акуд Меє Ггеч Тс Ре Гуз Рбе Тук Меє Рго пуб пуб Аїа ТіПг січ Іеч 500 505 510
Туз Ні Гей біп Сув Геї січ бі біч Теч Пу5з Рго Геч січ січ МУаї 515 520 525
Пес Авп Геп Аза біп бек Ппуз АБп Рпе Нів ІТеч Агкуд Рго Агу Авр Гей 530 535 540
І1їе Бек АБп І1їе АБп Уа! Іїе Уаі гейш сі Ге Ппув сіу бек бій ТЕбг 545 550 555 560
ТПЕ Рре Меє Суз біч Туг Аза Авр сій ТПг Аїа ТПг І1їе Уаії біч Рре 565 570 575
Теч АБп Агуд Тер Іїе Тбг Рре Аїа біп бек Іїе І1е бек ТПпг Ге ТПг 580 585 590 «2105 18 «2115 1776 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «223» рР1і705, НС (Ес же, РЗ29б ГАТА)-ІІ2
Зо «4005 18 чачачаєдсаасє СуУосєдчадсс єдоадоадЧдаддс сЄєдадсасадс ссддадоадЕС ссєдадасесс бо
Есссудсдса сссссудасє сассеЕсвсадс адссаєдсса Єдадссддудє ссдссадаесє 120 ссаддчдаадуд доассддадеЕд ддЕСсСЕСсадсеЕ аєсадеддна дЕддсддсад сасасбассас 180 чсачасєссу СЄдаадддссу дсЕссассаєс Сссададаса ассссаадаа сасдсєдесає 240 сеЕдсадаєда асадссєдад адссдаддас асддссдбає аєсасєдбдс даааддсадс 300 ччасєсЧдасс ассудудддсса адчаасссвєд деЕсассуєсєЕ сдадедссадд сассааддуас 360 ссаєсудЕсСеЕ Ессссседдс асссоссеєсс аададсассо седддддсас адсддсссед 420 чЧасЕдсссда Єсааддасса сесссссудаа ссддєдасудд ЄдесудєЄддаа сссаддсдсес 480 сЕдассадсд дсдедсасас сЕссссуддсеЕ деЕсСсврасаде ссесаддасе стасесссес 540 адсадсуєЄду СЄдассуєдсес ссссадсадс сЄєдддсассс адасссасає сеєдсаасуєд 60 ааєсасаадс ссадсаасас саадчдсдудчдас аадааадеєсу адсссаааєс Єсдєдасааа ббо асєЕсасасасє дсссассуєЄд сссадсассо даадсєдсад ддадчЧассуєс адсссессесс 720
БЕсСсссссаа аасссаадда сасссеєсаєд ассеЕсссуда ссссєдаддЕ сасасдс9аєд 780 чЧчеЧдЧдєдчасу СЄдадссасуа адасссєда дЕСаадсеєса асеєддсасуає дадасддсуєд 840 чаччдєдсаєа аєдссаадас ааадссусуд дЧадчадсадеЕ асаасадсас деассєдесд 900 бо
ЧеЕсадсуєсс СсассуєЄєссеє дсассаддас Єддссєдаасу дсаадчадеа саадсдсаад 960
ЧдЕссссааса аадсссссуд судсссссаєс дачдаааасса єсЕССсСааадс сааадддсад 1020 65 ссссдадаас сасаддсдба сасссєдссс ссассссуддад аєдадсєдас саадаассад 1080 чЧЕсадссєда сссдсссдуЄє саааддсеєс баєсссадсу асаєсуссудє даадеддадад 1140 6б адсаасуддудс адссудачаа саасвєасаа ассасусссс ссуєдсєдчда сЕссдасудес 1200
ЄссЕссееєсс сссасадсаа дсесассудєд дасаададса ддасддсадса ддаддаасдес 1260
СЕСсСЕСаєсдсеЕ ссуєдаєдса єЄдаддсеєсьд сасаассасо асасдсадаа дадссЕсьсс 1320 сЕДЕСЕСсССсСд дЕддсддсдуа аддссссодда ддсуддаддЕс седдаддсдддд аддсессдса 1380 ссрасеєєсаа деЕссврасааа даааасаса ссасаасєудч адсаєєвсасе дсеєдчаєєсва 1440 садаєдаєєсє єдааєдудаає сСааєаассас аадааєссса аасссассад даєдсессаса 1500 рЕсаадсьссє асаєдсссаа дааддссаса даасеєдааас аєсєссачсд сссадаадаа 1550 чаасссааас сессддадда адедссааає Есадсєсааа дсааааасес Ссасстєаада 1620 сссадддасе бааєсадсаа сассаасуєа асадсєсвдч аассааадуд асссдаааса 1680 асаєссаєде дчедаасаєдс Єдаєдадаса дсаассаєє сСадаасєсссє даасадаєд 1740 аєсассссєсу сссааадсає саєсєсааса сєдасе 1776 «2105 19 «2115 215 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» РР4А.7С5, С
Зо «4005 19 біч Іїе Уаії Гей ТПг сіп Бек Рго біу Тбг Те бек Гец бек Рго с1у 1 5 10 15
З5 біч Акуд Аза Тбг Гей бек Сув Агу Азїа бек біп бек Уаії бек Бек бБег 20 25 Зо
Тук Геї Аїа Ткр Тук біп біп пуб Рго сіу біп Аза Рго Агу Іеч Гец 35 40 45
Іїе Тук сі1іу А1їа бек бек Агу Аїа ТПг сіу Іїе Рго АБр Аку Рое б5ег 50 55 бо сіу бЗек Сі1іу Бек сС1іу ТБг Авр Рре Тс їец ТПг І1е бек Агд Іеч Січ 65 7о 75 8о0
Рго бій АБр Рпре Аїа Уа1! Туг Тук СувБ біп сбіп Туєк біу бек бег Рго 85 90 935
Теч ТП Рпе сіу сіп сіу Тбг Ппув Маї біч Іїе Гуз Аку ТПг Уа1і Аза 100 105 110
Аза Рго Бек УМаі Роре І1їе Робе Рго Рго бек Авр січ біп Геч Пув б5ег 115 120 125 біу Тс Аза бек Уа1і Уаї Суб Геї ІГеп АБп АБп Рре Туг Рго Агкд сій 130 135 140 60 Аза пув Маї Сіп Тер пув УМаі1і Авр Авп А1їа їеч Сбіп бег Сіу Авп бег 145 150 155 160 біп біц бек Уаі ТП сій біп АвБр бек Гу5з АБр бек ТПг Тугк бек Гей 165 170 175 65
Бек Бек ТПг Геї ТПг Теч бек Ппуз Аза Авр Тук січ пуб Нів Гуз Уаї 180 185 190
Тук Аїа Сув біч Уа! Трг Ніб сіп сіу Геї бек бек Рго Уаі! ТрПкгЕ Гуз 195 200 205
Бек Рпе АБп Акуд біу біч Сув 210 215 «2105 20 «2115 645 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «223» рР1і7с5, С «4005 20 чаааєсуєддс сСаасудсадсс єссаддсасс сЕдЕСЕСсвєдЕ ссссадддадда аададссасс бо сЕСЕСЕсдса дддссадсса дадеЕдеЕсадс адсадсвтасс сбадссєддсба ссадсадааа 120 ссЕддссадд сЕсссаддсє ссеєсаєсрає ддадсассса дсадддссас Еддсаєссса 180 часаддеєсса дчеЕдчдсадедч асссудчдаса дасеєссассс єсассаєса садчасєддад 240 ссєдаадасє єсдсадедса свсассдессад садсаєддбеа дсесассдсе дасдеЕссддадес 300 саддддасса аадсддааасє сааасдсбасуд деЕддсЕдсас сассеєдеЕсье саєсьєєссссд 360 ссаєсєдаєд адсадсєдаа асєсєддаасє дсссЕсЕдеЕвуд єдЕДдссеЕдсеЕ дааєсаасьсс 420 баєсссадад аддссааадс асадсддаад дсддасаасуд сссЕсСсааєс ддадеаасьсс 480 саддададсд Есасададса ддасадсаад дасадсассс асадссссад садсассстд 540 асудсєдадса аадсадасса судадааасас ааадсссасу ссЕдсдаадс сасссаєсад 60 чассЕєдадсс судсссуєЄсас ааададсссєс аасадчадачач адесде 645 «2105 21 «2115» 466 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» злитий білок людський ІІ1-2В8-бета-Ес(«западина») «4005 21
Меє АБр Мес Агку Уаі Рго Аїа сіп Геї ІГеч біу Теч Іїеч Гец Геч Тгр 1 5 10 15
Рпе Рго сіу Аїа Аку Суз Аза Уаі Авп сіу ТПг Бек біп Рре Тс Сув 20 25 Зо
Рпе Туг АБп бек Агу Аза АБп о І1е бек Суб Уаі Тер Бек біп АБр б1Уу 35 40 45
Аза Геч сбіп АБр ТП бек Сув біп Уаі Ні Аза Тер Рго АБр Агу Агд 50 55 бо 60 Агкуд Тер АБп обіп ТБг Суб бій Течй Тей Рго Уаії бек біп Аза бек Тгр 65 7о 75 8о0
Аа Суб АвБп Геї І1їе Іеч Сбіу Аза Рго Авр бек біп Пуб5 Геї Тс Тс 85 90 935 65
Уаї АБр Іїе Уа! Трг Гей Акуд Уа1і Іезч Суб Агку біч біу Уаії Агдщ Тер 100 105 110
Агуд Уа1і Меє Аїа І1ї1е біп АБр Рбе пуб Рго Рпе сії АвБп Геч Агу Іеч 115 120 125
Меє Аза Рго Іїе бек Гей біп Уаі Уа1і Нібв5 УМаїі біп ТБг Ніб5 Агкуд Сув 130 135 140
АБп о І1їе Бек Тер сії І1їе бек біп Аза бек Нібє Туг Ррое сії Агуд Нів 145 150 155 160
Теч бі Рпе бі Аїа Агу ТПгоТей бек Рго біу Нів Тпйг Тгр січ січ 165 170 175
Аза Рго Геч Геї ТПг Іеч Гуз біп Ппуз біп бій Тер Іїе Суб Іееч б1Ч 180 185 190
ТПЕ Геї ТПг Рго АБр Тс біп Тук бі Рбе сіп УМаі Аку Уаї КТу5 Рго 195 200 205
Теч біп сбіу бі Рпе ТПг Тбг Теср бек Рго Тгр бек біп Рго Геч Аза 210 215 220
Рпе Аку Тс Гпуб5 Ргро Аїа Аза Гей сіу пуб АБр ТПг біу Аїа біп Ар 225 230 235 240
Пув ТЕ Нів Тпг о Сув Рго Рго Сув Рго Аїа Рго Сі Іїеч Іеєч С1у С1У 245 250 255
Рго Бек Ма1і Роре Те Робе Рго Рго пуб Рго Пубв АБр ТПг Іечп Меє Те 260 265 270
Зо
Бек Акуд ТПг Ркго біп Ма! ТБг Сув Уаії Уа1і Уа1і Авр Уаі1ї бек Нів січ 275 280 285
Авр Рго бі Маї Ппуб5 Роре АБп о Тгр Тук Уаі Авр сіу Уа1і січ Уаї Нів 290 295 300
АБп Аза Ппуб5 ТПг Гпуб5 Ргро Агу бі бід біп Тук Абзп бБег ТПг Туг Агд 305 310 315 320
Уаї Уаї Бек Маї Іїечш Тпг Ма1ї Ге Нів біп Авр Тгр їеч Ап сС1у Гуз 325 330 335 біч Тук Ппув Сув пуб Уа1ї Бек АБп Гуз Аза Тез Рго Аїа Рго Іїе сій 340 345 350
Туз ТП Іїе бек ПувБ Аза Ппув біу біп Рго Акуд бі Рго біп Уа1ї! Сув 355 360 365
ТПЕ Геї Ркго Рго бек Агуд Авр бі Геч Тс Ппуб5 АБп обіп Уа! бек Гец 370 375 З8о зек Сув Аїа Ма1ії Гуз біу Рпе Тукг Рго Бек Ар Іїе Аїа Уаї січ Тгр 385 390 395 400 сій бек Авп біу Сіп Рго біц Авп Авп о Туг ГПув Тс ТБ Рго Ркго Уаї 405 410 415
Теч АБр бек Авр сіу Бек Рібе Робе ІГеч Ма! бек Гув Гец ТПг Уаі1і Авр 420 425 430 60
Туз бек Агуд Тер біп біп сбіу АБп Уа! Рібе бек Суб бек Уа1і Меє Ні 435 440 445 біч Азїа Гецп Ніб Авп Нібв Туг ТПг біп ув бек Тец бек Гей бек Рго 65 450 455 460 сіу Гуз 465
«2105 22 «2115 1401 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «223» злитий білок людський ІІ1-2В8-бета-Ес(«западина») «4005 22 асудчасасєчда дддЕСсСссудс Есадсссстд ддсссссвдхнс єдессссдуЄс сссаддсдесс бо адчсдсдсЧчу Єдчаасуддсас єЕСсСсссадсеєс асаєдссеєсе асаасссуда адссаасаєс 120
ЄсссдЕдссЕ ддадссаада ЄддддсЕссд саддасассс ссбдссааде ссаєдссеє9ду 180 ссддасадас ддсддаєддаа ссааассєудеЕ дадсеєдсссс ссудєЕдадеса адсаєссс9ду 240 чЧсессдсаасс Єдаєссссуд адссссадасє ссссадааас Єдассасадс Єдасаєсуєс 300 "7 асссєдадчу СдсЕдЕдссу ЄчадчдЧчЧчЕд счаєдчачдчу Єчасддссає ссаддасеЕєс 360 аадсссЕсву адаасссєсу ссеєдасуддсс сссасссссс єссаадеЕсдс ссасуєддад 420 асссасадає дсаасаєаад ссбдддааасс Ссссаадссс сссассасссє Єдааадасас 480 сЕддадссєсд аддсссддас дссбдесссса ддссасассо доаоададдаддс сссссідсед 540 асЕсєсаадс адаадсадчча асучасєссус сеєдчачасус Єсассссада сасссадсає 60 щ чадсеєссаду Сдсуддуаєсаа дсссссдсаа додсчдадсєса сасссдчдад сссссддадс ббо садссссвєдда ссеЕссадаас ааадсссдса дсссЕсддча аддасассдда адсеєсаддас 720 аааасєсаса саєдсссасс дедсссадса ссЕдаасеєсс єЄдддаддадасс десадесьсс 780 сЕСЕсСсСсссс саааасссаа ддасасссос асдаєсеєссс ддчдассссєда ддеЕсасаєдс 840 чЧчеЧЧаєдЧасЧдУа асуєдадсса саацчасссо даддссаадеЕ Єсаассдудєа сдсддасуадес 900 " чсЧдчвадчдсдс аєаасуссаа дчасааачссу сддчадчдадс адсасаасад сассбассає 960 чЧчЕддесадсу ЄссесассуЄє ссеЕдсассад дасєддссєда аєддсааудда деасаадедс 1020 ааддссЕсса асааадсссс сссадссссс ассдадаааа ссаєссссаа адссааадду 1080 садссссдад аассасаддс дедсасссод сссссаєссс доадаєдадсе дассаадаас 1140 саддеЕсадсс ЕсЕСсСдЕдсудс адссаааддс Єсссаєссса дсдасаєсдс сдєдчадеЧчу 1200 " чачачсааєуд дадсадссуда даасаассас аадассасус сЕсссуєдсе ддассссдас 1260
ЧасЕСсСЕЕсСЕ сссесудбдад саадсесасс дЕддасаада дсаддсддса дсаддддаас 1320 дЕСЕССсСсСсСає дссссуєЄдає дсаєдаддсеЕ сеєдсасаасс ассасасуса даададссес 1380
Єссседесес сддадсаааєд а 1401 «2105 23 (516) «2115 492 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 65 «223» злитий білок людський ІІ1-2В-гама-Ес(«виступ») «4005 23
Меє Іеч Гу5з Рго бек Пец Рго Рпе ТПг бБег Геч Іеч Рібе Іеч Сіп Гец 1 5 10 15
Рго Геч Геч сіу Маї біу Теч АбБп ТПг ТпПг Іїе Геї ТПг Рго АБп б1Уу 20 25 Зо
АБп обі Ар Тс Тс Аза АБр Рбе Рпе Гей ТПг ТПпг Меє Рго Тс АБр 35 40 45 бек Геч бек УМаї1ї Бек Трпг Тез Рго еп Рго Сіц Ма1! Сіп Сув Рре Уаї 5о0 ів) бо
Рпе Абп Уаї бі Тук Месб Абп Суб ТПг Тер Абп бБег бек бек біцЧ Рго 65 70 75 80 біп Рко ТБПг Авп о Гечп Тбг Геч Ні Тук Ткрр Тук Пубв Авп бБег Авр АБпП 85 90 95
Авр Пув Уа1і сіп пув5 Суб бек Нів Тукг Гей Рпе бек бі сії І1е ТЕбг 100 105 110
Бек сбіу Сув біп Теч біп Гуз Ппув біц Іїе Ні Геч Тук біп Тбйг Ре 115 120 125
Уаї Уаї1ї біп Ге Сбіп Авр Рго Акуд бі Рго Агд Агуд Сіп Аза ТПг сСіп 130 135 140
Меє Іеч Гуз Теч біп Азп Гец Уаі Іїе Рго Тгр Азїа Рго бічЧ Ап Гец 145 150 155 160
Зо
ТПЕ Геч Нів Гувз Теч бек біц бек біп Геї сії Геї АБп Тгр АБп о Авп 165 170 175
Агуд Рпе Геї АБп Нів Суб5 Теч біч Ніб Пец Уаі! сіп Туг Агкуд Тс АБр 180 185 190
Тер АБр Нів бек Тгр ТП бі біп бек Уа1і АБр Туг Аку Нівз ТУув5 Ре 195 200 205 век Ппеч Рго бек Уаі Авр біу біп Пув Агу Тук ТПг Рре Агуд Уаї Агд 210 215 220 век Акуд Робе АБп о Рго ІТеч Суб біу бек Аїа сіп Ніб Тер бек біч Тгр 225 230 235 240
Бек Нів Рго І1їе Нів Тгр біу бек Авп ТПг Бек Пуб5 бій АБп Рго Ре 245 250 255
Теч Рпе Аза Гей сіц Аза сіу Аїа біп АБр Гу5 ТПг Ніб Тпг Суб Рго 260 265 270
Рго Суб Рго Аїа Рго біч їецш Пец сіу сіу Рго Бек Маі! Рібе Іеч Ре 275 280 285
Рго Рго Пув Рго Пув Авр ТПг Пеп Меє Іїе бек Агу ТПг Рго бій Уаї 290 295 300
ТПг Сув Маїії МУМаї Уаї АвБр Уаї бек НівБ сії АБр Ркго біп МУаї їУув5 Ре 305 310 315 320 60
АвБп Тер Тук Уаі АБр біу Маії біч Уаі Ніб5 АвБп Аза Пуб5 ТПг пув Рего 325 330 335
Агуд бій бій біп Тук АБп о бек Тбг Туг Агуд Уа1! Уа1ї Бек Уаї Іеч ТЕбг 65 340 345 350
Уаї Іеч Нібз біп Авр Тер Гечп Аб5п сіу Ппув бі Тук Гув Суб Пув Уаї 355 360 365
Бек АвБп пув Аїа Іеїп Рго Аза Рго Іїе сії Ппу5 ТПг І1е бек Туз Аїа 370 375 380 пув б1іу біп Рго Агу бій Рго біп УМаї Туг Тпг Течй Рго Рго Су5з Агд 385 390 395 400
Авр січ Геч Тс губ АБп обіп Уаі! бек Гечп Тер Суб Геч Уаї Гуз б1У 405 410 415
Рпе Туг Рго бек АБр Іїе Аїа Уаі сій Тер бій Бек АБп біу біп Рго 420 425 430 біч АвБп о Авп о Тук пуб Тбг ТБ Рго Рго Уаії Іеч Авр бег Авр сіу бБег 435 440 445
Рпе Рпе Геч Тугк бек Гувз ТГеч ТБПг Уаі Авр ПувБ бБег Агуд Тгр біп сбіп 450 455 460 сі1у Авп Уа1ї Рре бек Сув бБег УМаї Меє Нів сі Аїа Геч Нів Авп Нів 465 470 475 480
Тук Тс біп Гуз бек Теч бек Гей бек Рго сіу Пув 485 490 «2105 24 «2115 1479 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність
Зо «2205 «223» злитий білок людський ІІ1-2В-гама-Ес(«виступ») «4005 24 асдессдаадс саєсастасс асссасассс сссеЕсСаєеєсс єдсадссдсс ссеЕдссддада бо чЧчеЧдодЧчдоассЧда асасуасаає ЄсєЧдасуссс аасудудаасу аадасассас адсеЕдчасеєсс 120
Есссеєдасса сеаєдсссас Єдасесссеєс адсудєєссса ссссдсесссе сссададаєє 180 садЕДдЕСЕсдд єЕДдЕсСаяааєсдеЕ сдадсасаєд ааєсдсасес ддаасадсад сеЕСсєбдадссс 240 садсстасса ассссасссс дсаєсасєсддач басаадаасс сддасааєда бааадесссад 300 аадсдсадсс асстасстасс сеСсєЧдаадаа ассассеєссу дссєдЕСадеє дсааааааад 360 чачаєссасс Сссассааас асєсусєдес садссссадуд асссасудда асссаддада 420 саддссасас адасдссааа ассдсадаає ссддЕдасєсс сссдддсЕсСс ададаасста 480 асасеєссаса аасєдаєда ассссадсва даассдаасеє ддаасааса аєсссеєдаас 540 сасЕдеЕсєдда адсассєддс дсадсассдуда асєдасєддад ассасадссд дассдаасаа 60
ЕсадсддасеЕ асадасаєаа чЧчЕссСЕсссссд ссрадсдедда асдддсадаа асдссасасу ббо гЕсСЕСУЧЯсСУЧЄєСсС ддадссуссє ЄаасссасеєЕс Єдсддаадсу сссадсасєвєд чадеєдааєду 720 адссасссаа Сссасєдудчуду чадсаавасс Ссаааадача асссЕсеєссеє дЯдЕсСєдсаєсд 780 бо чаадссудад сЕсаддасаа аасссасаса Сдсссассує дсссадсасс Єдаасеєсссд 840 чачачЧчассуєЄ садеЕсСЕсссяЕ ссЕєсссссса ааасссаауд асасссеєсає дЧаєсєссссс9ад 900 65 ассссЕдадд Ссасаєсдсудє ддаєддвЕддас дсдадссасу аадасссєда ддЕсаадеЕсс 960 аассддбєасу Сдчдасуддсудє дчаддсдсасє аасудссаада сааадссусу дчаддадсад 1020 басаасадса судсассуєдЕ ддеЕсадсдес сеЕсассуєсс бдсассадда седдсеєдаає 1080 часаадчадс асаадєдсаа ддЕсСЕСсССсаас ааадсссеєсс садсссссає сдадаааасс 1140 аєссссааад ссааадддса дссссдадаа ссасаддедс асасссеєдсс сссасдсс9дд 1200 чаєсдадсєда ссаадаасса ддеЕсадссвєд ЕддЕдсссду ссаааддсес свраєсссадс 1260 часаєсудссу СдчдадчдеЕдуада чачсааєдучуд садссудада асаассасаа дассасдссєе 1320 сссуєдсєдуд асессудасуув сеЕсссеєсесс сеЕссасадса адсссассує ддасаададс 1380 аддеЕддсадс аддддаасує сеЕєсЕСаєдс Ессуєдаєдс аєдаддсссо дсасаассас 1440 басасусада ададсссссс ссеЕдеЕсеєссУ дудеаааєда 1479 «2105 25 «2115 219 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» альфа-субодиниця людського ІІ-2БВ ї- Ауі-мітка ї- Нів-мітка «4005 25
Меє бі1у Текр бек Сув Іїе Іїе Гечш Ррбе Геї Уаі Аза Тбйг Аза ТЕ с01Уу 1 5 10 15
Уаї Нів Бек біш Тез Сув Авр Авр Авр Рго Рго Сі І1е Рго Нів А1їа 20 25 Зо
ТЕ Рбе гу5 Аза Месє Аза Тук пуб сі сіу Тіг Меє Іеч АБп Сувз сІі1ц
З5
Сув ув Акуд біу Рбе Аку Агу І1е Куб бек біу бек Пец Тук Меє Гей бо
Сув ТПЕ біу Авп бек Берг Нів бек бек Тгр АБр АвБп о біп СувБ сіп Сув 40 65 7о 75 8о0
ТПг Бек бек Аїа ТПг Агу АБп Тс Тпг пуб біп Маї Тс Рго біп Рго 85 90 935 45 січ біз біп Був січ Агу Губ Тс Тс біц Меє Сіп бек Рго Меє сіп 100 105 110
Рго Уаі АБр біп Аза бек Те Рго сіу Нів Суб Агку бій Рго Рго Рго 115 120 125 50
Тер бії АБп бі Аза ТБ бі Агуд Іїе Тує Нібв Роре Уа! Уаі! с1у сіп 130 135 140
Меє Маї Тук Тук біп Субв5 Уаі сіп сіу Ту Аку Аїа Іеч Ніз5 Акдуд с01у 55 145 150 155 160
Рго Аїа сії бек Маїії Сув Пув Меє Трг Нів сіу пуб ТПг Агу Теср ТБс 165 170 175 60 Сіп Рго Сіп їеч І1е Сув ТПг сіу Уаі Авр бі Сіп їеч Туг Рре сіп 180 185 190 біу біу бек біу Гей Аб5п АБр І1їе Рпое біш Аза біп Пуз Іїе сі Тгр 195 200 205 65
Ні сі Аза Агку Аза Ніб5 Нів Нів Ні Нів Нів 210 215
«2105 26 «2115 660 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «223» альфа-субодиниця людського ІІ-2БВ ї- Ауі-мітка ї- Нів-мітка «4005 26 аєсддавчаєдда дсеЕдсаєсасє ссеЕСсЕСсССссд дсадсаасад ссассддеєдЕ дсаєсссдад бо сЕСЕдеЕдасуд асбдасссудсс ададаєссса сасудссасає ссааадссає ддссгасаад 120 чаадчаасса СудсєЧдаассу Єдааєдсаад ачаддЕсссс дсадаасааа аадсдададеса 180 сЕСТаваєдс ЕСЕдвасадуд ааассссадс сасесудєссо дддасаасса асдесесааєсдс 240 асаадсєсвєд ссасссудаа сасаасчааа саадсдасас сссаасссда адаасадааа 300
Чаааддаааа ссасадааасє дсааадесса асдсадссад Єддассаадс дадсссєсса 360
Ччаєсасєдса додадаассеєсс ассаєдуддаа аасудаадсса сачачачаає Свсаєсасеєсс 420 чЧчЕЧаєдоадоас ачаєдучаєєса єсассадсудс деЕССсСадудчає асадддсеєсс асасададає 480 ссбдсєдада дсдЕссдсаа аасдасссас дддаадасаа ддеддассса дссссадсес 540 асасудсаса дчЕДдЕСЧчасда асадеЕсасас сеєссаддудсу дсЕсаддссо даасдасаєс 60 бЕсудаддссс адаадаєсда дсддсасудад дсЕСЧдадссс ассассаєса ссаєсаседа ббо «2105 27 «2115 473 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» злитий білок мишачий І1-2В-бета-Ес(«западина») «4005 27
Меє АБр Мес Агку Уаі Рго Аїа сіп Геї ІГеч біу Теч Іїеч Гец Геч Тгр 1 5 10 15
Рпе Рго Гей Гей Іеч Іїеч Тер Рпе Рго біу Аїа Агу Суз Аїа Уаї Гуз 20 25 Зо
АвБп оСув Бек Нів Геч бічп Сув Рпе Туг Авп бек Агуд Аза АБп Уа1ї! 5ег 35 40 45
Сув Меє Тер бек Ні сіїп сії Аза Іечп АБп Уа! ТрПг Тпг Сув Нів Уаї 50 55 бо
Нів Аїа Гпув5 бек АБп Тец Агуд Ніб Тер АбБп о Гпуб5 Тс Сув біч Теч Торг 65 7о 75 8о0
Теч Уаі Акуд сбіп Аза Бек Тер Аїа Суб АБп Теч Ії1е Гец сіу бек Роіе 85 90 935 60 Рго бій бек біп бек Теч ТПг бек Уаії Авр Гей Гей АБр І1е Ап Уаї 100 105 110
Уаї Сув Тер бічЧ біц пуб с1іу Тер Аку Аку Маї їу5 ТБг Суб Авр Робе 115 120 125 65
Нів Ркго Роре АвБр АБп Тец Акуд Гей Уаі! Аза Рго Нів бек Іеч біп Уаї 130 135 140
Теч Ні І1їе Авр ТПг сіп Акуд Суб АБп о І1е бег Тгр Пуб Уа1і бек сіп 145 150 155 160
Уаї бек Нів Туг Іїе біц Рго Тук Геї сії Рое біц Аза Агу Агуд Агд 165 170 175
Теч Геч сіу Нів бек Тер сії АБр Аза бек Уа! Гец бек Геч ПпувБ сіп 180 185 190
Агуд біп Сбіп Тер Тез Рре Іеєш Сіц Меє Тїеп І1е Рго бег Тис бег Туг 195 200 205 біч Уаі біп Уаі Акуд Уаі пу5 Аїа біп Агку АБп АБп Тс с1іу Тпг Тер 210 215 220
Бек Рго Тер бек біп Рго їецп ТПг Рпе Агуд ТПг Агу Рго Аза АБр Рго 225 230 235 240
Меє Гуз біч біу Аїа сбіп Авр Пуб5 ТП Ніб ТБЕ Суб Рго Рго Сув Рго 245 250 255
Аза Рго сії Геї ІГеч біу біу Рго бек Уа! Рпе Геї Роре Рго Рго Гуз 260 265 270
Рго Пув Авр ТіПг Теч Меє І1їе бБег Акуд Тпг Рго біц Уаі1ії Тіг Сув Уаї 275 280 285
Уаї Маїії АБвр Уаї бек Ніб бій Авр Рго сії Маї Гуз Робе АБп Тгр Туг 290 295 300
Зо
Уаї АБр біу Уаії біц Уаї Нів А5п Аза Пуб5 ТП Гуз Рго Агу бі сі 305 310 315 320 біп Тук Авп бек ТПг Туг Акуд УМаії Уаї бек Уаі Гей ТПг Уаі1ї Геч Нів 325 330 335 біп Абр Тер Гей Авзп сіу Ппув бі Тук Гуз Суб пуб Уа1! Бек АвБп Гув 340 345 350
А1їа Ттеч Рго Аїа Рго І1їе Січ Пув ТПг І1е бек Пув Аїа Кув Сі1у сіп 355 360 365
Рго Акуд бій Ркго біп Маї Суб ТБПг Гей Рго Рго Бек Агуд АБр січ Іеч 370 375 З8о
ТПЕ пуб АБп обіп Уа! бек Гей бек СувБ Аза Уа1і Ппув5 біу Рое Туг Рго 385 390 395 400 век АвБр Іїе Аїа Уаі біп Тср біц бек АвБп сіу сбіп Рго сії АБп АБп 405 410 415
Тук пуб ТП ТБЕ Рго Рго Уаі Гей Авр бБег АБр біу бек Ропе Ріе Гец 420 425 430
Уаї бек пуб Геч Тип Уаї Авр Пув бек Агуд Тер Сіп Сіп с1іу Авп Уаї 435 440 445
Рпе Бек Сув бек Маі Меє Ніб5 біц Аза Гецш Ніб А5п Нів Тугє ТПг біп 450 455 460 60
Туз бек Пец бек Геч Бек Рго біу Гуз 465 470 «2105 28 65 «2115 1422 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність
«223» злитий білок мишачий І1-2В-бета-Ес(«западина») «4005 28 аєсддасаєда дддЕссссдс Єсадсесссд ддссссстдс ЄдсЕСЕдуаєЕ сесссссссод бо сЕДСЕСсСсдЯдЕ ЕСсСссаддбдс саддєдесдса деЕдааааасс деЕссссаєсеє єдаасдсьсс 120 басаасєсаа дадссааєдеЕ ссссєдсаєд Сддадссає аачаддсєсс дааєдессаса 180 асссдссасу Сссасудссаа дссдаассвєд сдасассуда асаааассєд Єдчадсєаасе 240 сЕєсдДсдаддс аддсаєсстіуд ддссєдсаас седаєссссу ддеЕсдеЕсссс ададесссад 300
ЄсассдассеЕ ссдєддасссї ссеЕєЄдасаса ааєдсддеЕдЕ дссдддаадча дааддвЕє9д 360 сдсадддеаа адасссдсда сеЕсСссаєсссс ЕсСЕєДдасаасс сСЕСЯДсССсСЄдЯдЕ ддессссесає 420
ЕсссеЕссаа СЕСЕєДСсСасає єЄдасассса ачаєдеааса єЄаадссдчдаа ддссссссад 480
ЧЕСсСссСссасс асаєсудаасс асасєсудаа СЕсЧдаддссс дсадасуєсє сссдуддссас 540 адссдуаЧачу аєдсаєссує асєаадссеЕс аадсадчачас адсадсудсес сЕЄСсСЄсвєдодад 60 асдссдассс ссадсасссс асаєдаддсєс саддсдаддд Єсааадсєса асдааасаає ббо ассудчассс дчдадсссссд дадссадссс сеЕдасссєсс ддасааддсс адсадасссс 720 асчдаачдчачду чадсссадда саааасеєсас асаєдсссас суєдсссадс ассеєдаасесс 780
Зо сЕддддддас судеЕсадеЕсес ссосссссссс о ссаааассса аддасасссє саєдаєсьсс 840 сдадасссссд аддссасаєд сдсддЕддсд дасдедадсс асдаадассс єдаддеЕсаад 900 бЕєСсаасєдде асдєддасдд сдеддчадудсєд саєбаасдсса адасааадсс дсддададдад 960 садсасааса дсасдбассу ЄдсддЕсадс деЕссссассу ЕссЄдсасса дчдасеєддадсед 1020 ааєдадсаачу адсасаачдсу сааддссссс аасааадссс Єсссадссссо саєсєсддадааа 1080 ассаєсєсса аадссаааду дсадссссуда даассасадд ЄдЕдсасссє дсссссаєсс 1140 судддаєдадс Єдассаадаа ссаддесадс сеЕсесдбсдсуд садесаааддрз сеЕЕсваєссс 1200 адсуасаєсєсуд ссдєЕддадсд ддададсаає дддсадссдудар адаасаасса саадассасду 1260 ссЕССсССсСудбЄдс Єддасеєссда суддсесссЕсс сєЕсСсссуєЄда дсаадсеєсас сдєддасаадч 1320 адсадчдєддс адсаддддаа сдеЕсЕєсеЕса єдсєЕссуєда бСдсаєдаддс Єссдсасаас 1380 сассасасудс адаададссє сеЕСссЕдЕсСЕ ссудудєааає да 1422 «2105 29 «2115 500 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» злитий білок мишачий ІІ-2В-гама-Ес(«виступ») бо «4005 29
Меє АБр Мес Агку Уаі Рго Аїа сіп Геї ІГеч біу Теч Іїеч Гец Геч Тгр 1 5 10 15 65
Рпе Ркго Гечш Геч Іеч Іечп Тср Ропе Рго сіу Аїа Агкуд Суб Тгр бек 5ег 20 25 Зо
Туз УМаії Пец Меє бек Бек Аза АБп біп АБр Іїе Гуз Аза Ар Ге Ше 35 40 45
Пес ТПг бек ТК Аїа Рго бі Нів Гей бБег Аїа Ркго ТПг Геч Рго Гей 50 55 бо
Рго біц УМаії сіп Су5 Робе Уаі! Рбе Абхп Іїе сій Тує Меє АБп Суб ТЕГ 65 70 75 80
Тгр АБп о бег бег бек бій Рго біп Аїа ТПг АБп Гей ТПг Гей Нів Туг 85 90 95
Агуд Тук пуб УМа1ї бек АБр АБп АБп Тс Рре сіп січ Сув бек Нів Туг 100 105 110
Теч Рпе бек пуб бій Іїе ТПг бек біу Су5 біп Іїе біп пуб бій Авр 115 120 125
Іїе сіп Геч Тук біп ТБ Рбе Уа! Уаї сіп Гей сбіп АБр Рго біп Гуз 130 135 140
Рго біп Агуд Аку Аїа Уаї біп пуб Гецп А5п Геї біп АБп Те Уаї Іе 145 150 155 160
Рго Агуд Аїа Рго бій Авп Течй Трг Гей бек Авп Гей бек бі бек сіп 165 170 175
Теч біч Гей Агуд Тер пуб Бек Агу Ні Іїе їу5 біц Акуд Суб Геч сіп 180 185 190
Зо
Тук Геч Маі біп Туг Агу бБег Авп Агуд Абр Агуд беє Тер ТВг біч Гец 195 200 205
Іїе Уа1і АБп Нібв бій Ргро Агку Рре бек Гей Рго Бек Уаі АБр січ Іеч 210 215 220
Туз Агуд Тує Тбпг Рбе Акуд Уаі Агку бек Агу Туг АбБп Рго Іїе Сув с1УуУ 225 230 235 240 зек Бек біп біп Тер бек Пув Тер бек біп Рго Уаі Ніз Тер с1у 5ег 245 250 255
Нів Тс Маї бі біч Абп Рго бек Гесп Рбе Аїа Іез біцп Аза с1у Аїа 260 265 270 біп АвБр пуб Тс Ніб Тк Сув Рго Рго Сув Рго Аїа Рго бій Геч Гей 275 280 285 біу біу Ркго бек Уа1і Рбе Геї Робе Рго Рго Гу5 Рго Пуб Авр ТпПг Гей 290 295 300
Меє І1їе бек Агу ТБПг Ркго біц Уа1і Тбг Суб Маї Уаїії Уаї АБр Уаі1ї 5ег 305 310 315 320
Нів біц Авр Рго Січ Ма1 Ппув Рре Авп Тер Тує УМаі1і Авр сі1у Уа1 Ссіц 325 330 335
Уаї Нібв АБп Аза пу5 ТПг пуб Рго Акуд бій біз біп Тук АБп бек Тр 340 345 350 60
Тук Аку Маі Уаї бек Уаі Гей ТпПг Уаї Гечп Ніб біп АБр Тгр Іеч Авп 355 360 365 сбіу пув біЧ Тук Ппув Сув Ппув Ма1ії бек АБп Гуз Аза Гей Рго Азїа Рго 65 370 375 З8о
Іїе сії Ппув ТПг І1їе бек Гуз Аїа Ппу5 сіу біп Рго Агкуд бій Рго біп 385 390 395 400
Уаї Тук ТБЕ Ге Рго Рго СубБ Агкуд АБр біч Теч ТБг Гу5 Ап біп Уаї! 405 410 415 век Геч Тер Суб ІГеч Уаі! Ппув біу Рпе Тугк Рго бек АБр Ії1Іе Аїа Уаї 420 425 430 біч Тер біц бек Авп сіу біп Рго бій АБп АБп Туг Муз ТПг Тпг Рего 435 440 445
Рго Уаі Геї АБр бек Авр біу бек Рпе Рпе Гей Туг Бек Пув Іеч Тс 450 455 460
Уаї АБр Гуз бек Агу Тер біп сбіп сбі1іу АБп Уаі! Рібе бек Субв бек Уаї1! 465 470 475 480
Меє Нібв біч Аза Гецп Ніб Авп Нібв Туг ТПг біп губ бек ІТеч бек Гец 485 490 495 бек Рго сС1у ув 500 «2105 30 «2115 1503 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «223» злитий білок мишачий ІІ-2В-гама-Ес(«виступ»)
Зо «4005 30 асудчасасєчда дддЕССсСссудс Есадсссстуд ддсссссвдс є9дссссудЕс сссссЕССЄ бо сЕДСЕСсСсддЕ ЕСсСссаддбдс саддєдесєдоа адесссаадда ЄссеЕсаєсдес садсдсдаає 120 чаачасаєса аадссдЧаєсеє даєсссдасс Єссасадссс сєдаасассс садесдссссєе 180 асЕСсєдсссс сЕССададуде ЄсадсЕдссеЕс дедеЕссааса садчадсасає дааєсдсасе 240 бддаасадса деЕєссдадсс Єсаддсаасс аассссасудс Єдсассаєад дсасааддса 300
ЕсєЧдасааса асасаєссса дчдадеЕдсадс сассасєссдеє єсеЕсСсааадца даєссасессссес 360 чассдссада Сасааааада ачасасєсса сЕСвассада саєсєдеЕсдс ссадсессад 420 часссссада аассссадад дсчдадсєдвта садаадсвєаа асссасадаа ЄссвєдеЕЧаєсс 480 ссасдддсессєс садаааассо аасасєсадс ааєсєдадед аассссадсеЕ ададссдада 540 бддаааадса дасасаєсаа адаасдссєдЕ Ссасаасасс єЄддЕдсадса ссддадсаас 60 ачачасєсдаа дссдчдасуда асєаасаусд аассаєдаас ссадасєссеєс ссдсссадес ббо чсчдчасчадс Сдааасудса сасаєсєсуд дЕсСсудчадсес дсесаєаассс аасссдєсода 720 адЕссссаас адсудчадеаа асудчдадссад сссдсссасе дддчдаЧадсса Сасеєдвадад 780 чачаасссЕс сссєдЕсвєдс ассдчаадсс дчадсєсаду асаааассса сасасдссса 840 60 ссудєдсссад сассєдаасе ссеЕдддддда ссуссадсесе СссссеЕвсссс сссаааассс 900 аадчдасассс Ссаєдасєссс ссудассссо даддссасає дсосдЧчєдаєЄ дчвасчєдадс 960 сасудаадасс сєдаддеєсаа дчеЕссаасєд басудсддасуд дсдбддадде дсаєааєдсесс 1020 65 аачасааадс суусуудудчдадчда дсадеєасаас адсасусасс деЕдсддеЕсад судсссесасс 1080
ЧЕссЕдсасс адчасєддсЕ даасуддсаа чЧчадеасаає дсааддесес саасааадсс 1140 сеЕсссадссс ссаєсдадаа аассаєсьсс ааадссааад ддсадссссу адаассасад 1200 чЧдЕдбасассс бдсссссаєбд ссудддаєдад сєдассаада ассаддесад сседеддедс 1260 сеЕддЕсааад дсЕЕєсваєсс садсудасаєс дссудсєддадеЕ дддададсаа Єдддсадссуу 1320 чадаасаасє асаадассас дссеЕсссудбєд сєЕддасессу асудсесєссьс сеЕсссеЕСТтас 1380 адсаадсєса ссудеддасаа дадсаддєдд садсаддудча асудбесесссеєс агдсесссоаєд 1440 аєдсаєдаду сеЕсбдсасаа ссасврасасуд садаададсс СсеЕсссвдеЕс сссдддауаєааа 1500 да 1503 «2105 31 «2115 213 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» альфа субодиниця мишачого ІІ-2БФВ ї Ауі-мітка - Нів-мітка «4005 31
Меє бі1у Текр бек Сув Іїе Іїе Гечш Ррбе Геї Уаі Аза Тбйг Аза ТЕ с01Уу 1 5 10 15
Уаї Нів б5ек біч Пец Суб Геч Туг АБр Рго Рго біц Уаі Рго Ап Аза
Зо 20 25 Зо
ТПЕ Рре Гуз Аза Тез бек Тук Пув Ап сіу ТіПг І1їе Іеч АБп Су5 біц 35 Сув Ппув Агу біу Робе Агу Агу Гей Гуз бій Теч Уаії Туг Меє Агу Сув 5о0 ів) бо
Теч біу Авп бек Тер бБег Бек АБп о Сув біп Суб ТрПг бег Авп бек Нів 65 70 75 80 40
Авр Пув Бек Агуд пуб біп Уаі! ТБг Аза сіп Ге сії Нів сіп Гуз січ 85 90 95 біп біп ТБЕ Тбг Тбг Абвр оМеє сіп Гуз Рго Тбг біп бек Меє Ні сіп 45 100 105 110 біч АвБп Гей ТпПг сіу Нів Сув Аку бій Ргро Рго Рго Тер Пув Нів сій 115 120 125
Авр бБег Ппув Агу І1е Туг Нів Рпе Ма1! Сі СсС1іу біп бег Уа1ї Нів Туг 130 135 140 біч Суб Іїе Рго сіу Тугк Пув Аїа Іеп біп Агуд біу Рго Аїа Іїе 5Бег 145 150 155 160
Іїе Суб Ппув Меє Гуз Сув біу пуб ТПг сіу Тер ТПг біп Рго біп Іеч 165 170 175
ТЕ Сув Маі АБр бічЧ біп Гей Тук Рпе сіп сіу біу бек біу Теч Авп (516) 180 185 190
АБр Іїе Рпе сії Азїа біп Гуз Іїе біц Тер Ніб5 сії Аїа Агу Аза Ні 195 200 205 65 Нів Нів Нів Нів Нів 210 «2105 32
«2115 642 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» альфа-субодиниця мишачого ІІ-2БФВ ї Ауі-мітка - Нів-мітка «4005 32 асчачаєдча дссдсаєсає ссЕсСЕсссвєд дсадсаасад ссассуддсудс дсаєсссдаа бо сСЕДЕДЕСЕДЕ асдасссасс сдаддеЕсссс ааєдссасає Єсааадсссє сеЕсСстасаад 120 аасудсасса Сссвєааассуд Єдааєдсаа ачаддчеЕсеєсс даадасвсааа дчааасеєдуаєс 180 багасдсусє дсеЕєаддааа сссссддадс адсаасєдсс адсдсассад саасєсссає 240 часаааєсуа дааадсааде басадсєсаа сссСудаасасс адааададса асааассаса 300 асачасасус адаадссаас асадеЕсваєд сассаадача асссвєасадд Єсассдсад 360 чадссассеєс сЕсСуддаааса Єдаацчаєссс аачачааєсє ассаєсєсуає ддааддасад 420 адЕдеєссасс асчадедває єссуддасас ааддсеЕстас адачаддсесс Єдсваєсадс 480 аєссдсаада СЄдаадсдєдд даааасдддд Сддасссадс сссадсеєсас асдедссдас 540 чаасадеєсає аєсеєссаддад суддсЕсадудс сЕЧдаасуаса єсЕссЧдаддс ссадаадаєс 60 чадеддсасу аддсссдадс Єсассассає сассаєсасе да 642
Зо «2105 33 «2115 480 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» злитий білок ІІ-2В (циномолгус)-Ес(і«виступ») в Ауі-мітка «4005 33
Меє бі1у Текр бек Сув Іїе Іїе Гечш Ррбе Геї Уаі Аза Тбйг Аза ТЕ с01Уу 1 5 10 15
Уаї Ні 5ек Аза Уаі! Авп сіу ТПг Бек Акуд Рбе ТПг Сувз Ропе Туг Авп 20 25 Зо век Акуд Аїа АБп І1е бек Сув Уаі! Тер бек біп АбБр сіу Аїа Іеч сіп 35 40 45
АБвр ТПг бек Сув біп Уаі Ні Аза Тер Рго Авр Агу Агу Агу Тер АвБп 50 55 бо біп ТЕ Суб біц Геп Гей Рго Уаії бек біп Аїа бег Тер Аїа Суб АБп 65 7о 75 8о0
Теч Іїе Пец сіу ТПг Рго АвБр бек біп Гуз Теч Тбйг Аза Уаі АвБр Ше 85 90 935
Уаї Тк Іеч Аку Уаії Меє Суб Акуд сії сбі1у Маі Агку Тгр Акуд Меє Меє (516) 100 105 110
Аза Іїе сбіп АБр Роре Гуз Рго Рпе біц Азп Гей Агд Геч Меє Аза Рго 115 120 125 65 І1їе бБег Те Сіп Ма1ї Уаї Нів Уаї сій ТБг Нів Агуд Сув Авп І1е 5бег 130 135 140
Тер пув І1їе бек біп Аза бек Нів Тук Ррбе сії Агу Ні5 Іеч біч Ре
145 150 155 160 біч Азїа Аку Тбг Гей бек Рго біу Ні ТБг Тгср біц біц Аза Рго Гей 165 170 175
Меє ТЕ Іеч Гуз біп пуб біп бій Тер І1їе Суб Іеч бічш Тбг Іеч Торг 180 185 190
Рго АБр ТПг біп Тук бі Рбе біп Уаі Акуд Уаі Пуб5 Рго Іезч біп с1Уу 195 200 205 біч Рпе Трг Тс Тер бБег Рго Тгр бек біп Рго Гец Аїа Рпе Агд ТПг 210 215 220
Пув Рго Аїа Аїа ІТеч Сіу Пув Авр Тпйг С1у Аїа Сіп АБр Був Тіг Нів 225 230 235 240
ТПЕ Сув Рго Рго Сув Рго Аза Рго бі Геч Геї сіу сбіу Рго бек Уаї 245 250 255
Рпе Геч Рбе Рго Ркго Гу5з Рго пуб Ар ТПг Геп Меє І1їе б5ег Агу ТЕГ 260 265 270
Рго біц УМа1і Тс Суб УМаї Уаї Уаії Авр Уаі! бек Нів сії АБр Рго січ 275 280 285
Уаї Гпув Робе АБп Тер Тук Уаі Авр сіу УМаі сії Маї Нібз АБп Аза Гув 290 295 300
Так пуб Рго Акуд Січ бі Сіп Туг Авп бег Тпг Туг Агуд Уаї Уаї бег 305 310 315 320
Уаї Іеч ТБгЕ Уаї Ге Ніб сбіп Авр Тер Геї АБп біу Гувз біч Тук ГПув 325 330 335
З5
Сув пув Уаії бек Авп пуб Аїа Геї Рго Аїа Рго Іїе біц пуб ТП Ше 340 345 350 зек пув Аїа Ппу5 біу біп Рго Акуд бі Рго сбіп УМаї Тугє ТБг Іеч Рго 355 360 365
Рго Сув Агуд АБр біп Теч Тйг Гуз Авп о біп Уа1ї! Бек Геї Тгр Сув5 Іеч 370 375 З8о
Уаї цЦув б1у Рре Тує Рго Бег Авр Іїе Аза Ма1 Сі Тгр біц бег Авп 385 390 395 400 біу біп Ркго біц Абвп Абп о Туг Пуб5 Тс ТБг Ргро Рго Уаії Гей Авр бБег 405 410 415
Авр сіу Бек Ріре Робе Те Тук бек Ппув Пец ТпПг Уаі Авр Гпу5 б5ег Агд 420 425 430
Тер біп біп біу АБп Уаі Рре бек Суб Бек Уаії Меє Ні5 Січ Аїа Гец 435 440 445
Нів АБп о Нів Тук Тйг біп пуб бек Геч бБег Геч бек Рго біу Ппув бег 450 455 460 60 сіу біу Печ Авп Авр Іїе Рпе сіш Аїа Сіп Гу5 І1е Січ Тгр Нів Січ 465 470 475 480 «2105 34 «2115 1443 65 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «2205
«223» злитий білок ІІ-2В-бета (циномолгус)-Ес(і«виступ») В Ауі-мітка «4005 34 асччдчаєдча дссдсасєсає ссЕСЕСсСсССсСвд деадсааса ссассудсдс дсаєсссодсд бо й ЧсЕсаасудса сЕсСсссудсє сасаєдссеєс сСасаасссуа дадссаасасє сЕССЄДдесдеЕс 120
Едчдадссаачдч аєдддЧдсЕсЕ дсадчасасс Сссєдссаад Єссасудсссд дссудасада 180 сддасдуаєЄдда ассааассєд Єдадсєдсес ссєдЕДдадес аадсаєсссуд ддссеЕдсаас 240 сЕдаєссєсуд даассссада сЕСсСЕсадааа ссбдассдсад Єддасаєсудє сасссєдаду 300 чЕЧчаєдеЕдсс дЕЧааччачуУає дчсчаєдчадчча аєчасєддсса Єссаддасес сааасссюєєсес 360 " чачаасссєс дссєдасуддс ссссассссс сессаадссу Єссасуєдуда дасссасада 420
Едсаасасаа дссдчдаааає сссссаадсс Єсссассасеє єЄсудааадаса сссддадесес 480 чаддсссуда сдсєдесссс аддссасасс Сддададдадд ссссссеєдає дасссссаад 540 садаадсадд ааєддаєсьуд сссбддадасуд сесассссад асасссадса єдадесєссад 60 чЧчедсоддЧдсєса адсссссудса аддсчадсєс асасссудуда дсссссддад ссадссссвд ббо 7 чЧсесссєсадда сааадссєдс адссссєдуд аадчдасассу дадсєсадда саааасссас 720 асасудсссас судсдсссадс асссдаасеєс сєдддддуачЧас суєЄсадеЕсьс ссессвссес 780 ссаааассса аддасасссє саєдаєсссс сддасссстд аддссасаєу содєдаєдаєд 840 часуєдадсс асаацассс Єдаддсєсаа СЕСаассудє асчєдчасч счасдчадучєд 900 сасааєдсса адасааадсс дсддададдад садсасааса дсасдсассд єДдЕддЕсадс 960 з ЧдЕссссассу Єссбдсасса ддасєддсвд ааєддсаада адсасааеьуд сааддесьсс 1020 аасааадссс Есссадсссс сассудадааа ассаєсєсса аадссааадд дсадссссда 1080
Чаассасадд Єдбасасссс дсссссаєсдс сдддаєдадс Єдассаадаа ссаддссадс 1140 сЕдЕддЕдсс ЕддЕсааад сеЕсссаєссс адсдасаєсу ссудєддададед ддададсаає 1200 чадсадссууд адаасаасса саадассасу ссссссуєдс єЄддассссуда судсесссесс 1260 з рЕсссссаса дсаадсссас судбддасаад адсаддеддс адсаддддаа судесеєсеса 1320 бдсЕссудєЄда сдсаєдаддс Есеєдсасаас сасбасасус адаададссє сеЕСсСстдесяе 1380 ссудддбааає ссуддаддссЕ даасдасаєс ЕЕєСЧдаддссс адаадаєсда абддсасдад 1440 да 1443 «2105 35 «2115 489 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 10) «223» злитий білок ІІ/-2В-гама (циномолгус)-Ес(«западина») «4005 35
Меє бі1у Текр бек Сув Іїе Іїе Гечш Ррбе Геї Уаі Аза Тбйг Аза ТЕ с01Уу 65 1 5 10 15
Уаї Нів бек Ге Абп ТПг ТпПг Іїе Геї ТПг Рго АБп о біу АвБп бій Авр 20 25 Зо
Аза ТПпг ТК АвБр о Роре Роре Теч ТПг бек Меє Рго ТПг АБвБр бек Іеч 5ег 35 40 45
Уа1ї бек ТПг Ппеп Рго Ппеп Рго бі Маії сбіп Сув Рбе Уаі! Рре Азп Уаї 5о0 ів) бо біч Тук Меє Авп Суб ТПг Тер АБп о бек бек бек біц Рго біп Рго ТПг 65 70 75 80
АвБп оГеч Тбг Геч Нів Тук Ткр Тук МПубв Авп бБег АБр АБп АБр Туз Уаї 85 90 95 біп Гуз Сув бек Нів Туг Геї Роре бек бічЧ біц І1їе ТПг бек сіу Сув 100 105 110 біп Теч біп Пув пуб сії Іїе Ні Іеч Тук біп ТБ Рре Уа1і Уа1ї сіп 115 120 125
Теч біп Авр Рго Акуд Січ Рго Акуд Агуд біп Аїа Тпг Сіп Меє Теч Гуз 130 135 140
Теч біп Абзп Гец Уаі Іїе Рго Тгр Азїа Рго біц АвБп Гей ТпПг Геч Агд 145 150 155 160
Тув ТГеч бек біц бек біп Геї біп Ге АБп Тгр Абп Авзп Агуд Робе Гей 165 170 175
АвБп о Нів Суб Геч бі Ні Теч Уа! біп Туг Акуд ТПг АБр Тгр АБр Нів
Зо 180 185 190
Бек Тер Тс біп біп бек Уаі Авр Туг Акуд Нів Пув Роре бек Іеч Рго 195 200 205 бЗек Ма1 Авр С1у біп Пув Агу Туг Трг Рре Агуд Ма1і Аку бек Агд Рре 210 215 220
АвБп оРго Геч Сув сіу бек Аїа біп Ніб5 Тер бек бій Тер бБегк Нів Рго 225 230 235 240
Іїе Нів Тгр біу бек АБп бек бек пуб бі АБп Рго Роре Іеп Рое Аїа 245 250 255
Теч бі Аза сіу Аза сіп АвБр Пуб5 ТПг Нів Тбг Суб Рго Рго Сув Рго 260 265 270
Аза Рго сії Геї ІГеч біу біу Рго бек Уа! Рпе Геї Роре Рго Рго Гуз 275 280 285
Рго Пув Авр ТіПг Теч Меє І1їе бБег Акуд Тпг Рго біц Уаі1ії Тіг Сув Уаї 290 295 300
Уаї Маїії АБвр Уаї бек Ніб бій Авр Рго сії Маї Гуз Робе АБп Тгр Туг 305 310 315 320
Уаї АБр біу Уаії біц Уаї Нів А5п Аза Пуб5 ТП Гуз Рго Агу бі сі 325 330 335 біп Тук Авп бек ТПг Туг Акуд УМаії Уаї бек Уаі Гей ТПг Уаі1ї Геч Нів (516) 340 345 350 біп Абр Тер Гей Авзп сіу Ппув бі Тук Гуз Суб пуб Уа1! Бек АвБп Гув 355 360 365 65 Аза Ітеч сі1у Аїа Рго І1їе Січ Пув ТПг І1е бек Пув Аїа Кув Сі1у сіп 370 375 З8о
Рго Акуд бій Ркго біп Маї Суб ТБПг Гей Рго Рго Бек Агуд АБр січ Іеч
385 390 395 400
ТПЕ пуб АБп обіп Уа! бек Гей бек СувБ Аза Уа1і Ппув5 біу Рое Туг Рго 405 410 415 век АвБр Іїе Аїа Уаі біп Тср біц бек АвБп сіу сбіп Рго сії АБп АБп 420 425 430
Тук пуб ТП ТБЕ Рго Рго Уаі Гей Авр бБег АБр біу бек Ропе Ріе Гец 435 440 445
Уаї бек Гув ТГеч Тр Уа1ї Авр Пув Бек Агу Тер біп біп біу Авп Уаї! 450 455 460
Рпе бег Сув бек Ма1 Меє Нів Сіц Аїа Тез Нів Авп Нів Тугє ТПг сіп 465 470 475 480
Туз бек Пец бек Геч Бек Рго біу Гуз 485 «2105 36 «2115 1470 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «223» злитий білок ІІ/-2В-гама (циномолгус)-Ес(«западина») «4005 36 аєсддавчаєдда дсеЕдсаєсасє ссеЕСсЕСсССссд дсадсаасад ссассддеЕдеє дсаєссссод бо аасасуасаа СЕСсСЕєЧдасусс саасудддчдаас даадасусса саасеєдасеЕс сЕсссвєдасс 120
Есвсаєдссса сеєдасеєсссеє садсусеєссс ассссдсессс єсссададудс Єсадесуєвессе 180
ЧЕдсеєсааєд Ссудадбєасає даасєдсасо сСддаасадса дсЕСєДдадсс ссадсстсасс 240 аассєсасеєс СЄдсасвтаєсу дсасаачаасє сСсудаєаасу асааадеєсса даадсдсадс 300 сасраєсвтає єсссЕЧдаада ааєсасеЕссе ддссдЕСадеЕ Єдсааааааа ддадаєссас 360 сЕСвассааа сдЯдЕСсСЕдЕсДдДЕ ссадсессад дасссасуддд аасссаддад асаддссаса 420 садаєсдссаа аассдсадаа СссддЕдаєс ссседддсеЕс сддадаассє аасасеєссддс 480 ааасєдадеєд аассссадсеЕ адаассудаас Сддаасааса чЧчаєсссєдаа ссассдсєесу 540 чачсасєсуду Сдсадсассу чассЧчЧассууд дассасадсє ддасєдааса ассадсдчає 60 багадасаса адЕсєсссссс дсесвєадедсд даєддадсада аасуссасас удсЕєсдедеЕс ббо сдвдадссдсЕ Есаасссасс сеЕдеддаадеЕ дсеЕсадсаєс ддадсдаасд дадссассса 720 асссасєдучу дчадсаасад ЄсСсаааача аасссЕсессс єдЕссдсаєсс ддааадссода 780 чЧсЕСсСаддаса ааасссасас асСудсссассу Єдсссадсас ссдаасеєссє доаоадоадддассд 840
ЕсадеЕсеЕссс Сссєсссссс аааасссаа дасасссєса Єдчасєсєсссу дассссєдад 900 60 ЧЕсасаєдсд ЄддЕддЕдда сдедадссас даадасссод аддеєсаадесє саассддеас 960 чсдчдасчддсу СЄдчаддсдса бЄаасуссаа асааадссус дуададчадса деасаасадс 1020 асдбєассуєд сддеЕсадсує ссеЕсассдеєс сЕдсассаду ассддсєдаа Сддсааддад 1080 65
Басаадєсдса аддеЕсЕєссаа сааадсссєс ддсудссссса Єсдадаааас саєссссааа 1140 чдссаааддудс адссссуада ассасадуєд Єдсасссвєдс ссссаєсссу дчаєдадсід 1200 ассаадаасс аддесадссеЕ сеЕсдбдсдса дЕсаааддсс сссаєсссад сдасаєсдсес 1260 чседчвадеЕдчу ачачсааєду дсадссуда аасаассаса адассасусс Єсссуєдсес 1320 часеєЕссудасу дчссссЕссЕЕ ссеЕСсСудЄдадс аадсеєсассу Сддасаадад саддеддсад 1380 саддддаасу ЕсЕЕєСсСЕСсСаєду сЕссудеЕдає саєдаддссс бдсасаасса сбасасдсад 1440 аададссьсе сссеЕдЕсссс ддадеаааєда 1470 «2105 37 «2115 217 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» альфа-субодиниця ІІ-2В (циномолгус) в Ауі-мітка ї- Нів-мітка «4005 37
Меє бі1у Текр бек Сув Іїе Іїе Гечш Ррбе Геї Уаі Аза Тбйг Аза ТЕ с01Уу 1 5 10 15 сій Тїеч Сув Авр Авр Авр Рго Рго Кув І1е Трг Нів Аїа ТПг Рре Гуз 20 25 Зо
Аа Меє Аза Тук Ппу5 бі біу ТБ Меє Гей Авзп Суб січ Сув Гув Агд
Зо біу Рпе Акуд Агуд Іїе Пуб5 бек біу бек Рго Тук Меє Геч Суб ТП с1УуУ 5о0 ів) бо
АвБпобБек Бек Нів бек бек Тгр АБр АБп о біп Суб біп Суб ТПг бек б5ег 35 65 7о 75 80
Аза Аза Акуд АБп о Тс ТБ Гуз біп Уаі Трг Рго сіп Рго січ біч біп 85 90 95 40 пув біз Агуд пуб Тс ТБс бі Меє Сіп бег біп Меє Сіп їеч Аїа Авр 100 105 110 біп Уаії бек Гей Рго сіу Нів Суб Агку біц Рго Рго Рго Тер січ АБп 115 120 125 45 біч Аза Тр бі Агуд Іїе Тує Нібє Рре Уа! Уа! сбіу біп ТпПг Уа1ї Туг 130 135 140
Тук біп Су Маії біп сбіу Туг Агуд Аїа Геї Ніб5 Агу біу Рго Аза сіц 145 150 155 160
Зек Уа1ї Сув Ппув Меє Тбг Нів біу Пу5 ТПг Агуд Тер Тс біп Рго біп 165 170 175
Теч І1е Сув Тпг с1у Січ Ма1ї Авр Сі Сіп Те Туг Рбе Сіп сС1у С1Уу 180 185 190
Бек сіу Геї АБп АБр Іїе Рбе біц Аза сіп пуб Іїе сії Тгр Нів січ 195 200 205 60
Аза Агуд Аза Нібв Ні Нів Нів Нів Ні 210 215 «2105 38 65 «2115 654 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність
«223» альфа-субодиниця ІІ-2В циномолгус в Ауі-мітка - Ніз-мітка «4005 38 аєсддавчаєдда дсеЕдсаєсасє ссеЕСсЕСсССссд дсадсаасад ссассддеєда дсЕССДдЕеЕдас бо чаєдасссус сааааассас асасудссаса сСЕєсааадсса Єддсссасаа ддааддаасс 120 асдсєдаасс деЕЧдчааєдсаа чачаддЕсеєс сдсадааєаа ааадсудддеЕс ассссасаєсд 180 сЕСЕДдДвасад дааассссад ссасссудеЕсс єдддасаасс аасдесесаасд сасаадсссе 240 чсЕдсссуда асасаасааа асаадсудаса ссссаасссуд аадчаасадаа адааадаааа 300 ассасадааа Сдсааадеєса аабдсадссд дсддассаад ЄдадссеЕєсєсс аддеЕсаседс 360 адчдчдаассеєс сассуєдудда ааасудаадсс асадааачаа ЄСсСваєсасеЕс соєсдЧчєдоаЧа 420 садасудЕсеЕ асрассадсд сдессаддда басадддсеєс басасададд ЕссЕдсєдад 480 адсдЕсєдса аааєдассса суддаачаса ачаєддассс адссссадсс сасасдсаса 540 ччаєЧдаадссу асаасадсяє асасєсеєса ддсддсєсад дсссдаасча сассєсєсдад 60 дсссадаада Ссдадсддса сдаддсЕсда дсеєсассасс аєсассаєса ссда 654 «2105 39 «2115 19 «2125 РЕТ
Зо «213» Штучна послідовність «220» «223» лідерна послідовність
З5 «4005 39
Меє АБр Тгср Тйг Тер Агуд Іїе Гечш Рбе Геї Уаі Аза Аїа Аїа ТЕ с01Уу 1 5 10 15
А1з1а Нів 5бег «2105 40 «2115 57 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» лідерна послідовність «4005 40 асудчасєдча сссудчачаає ссЕСЕсСссвєд деЕдудсадса ссасадчадс ссасессс 57 «2105 41 «2115 57 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «220» 10) «223» лідерна послідовність «4005 41 асудчасєдча сссудчадчає ссЕСЕсСссвєд деЕдудсадса ссасадчадс ссасессс 57 65 «2105 42 «2115 22 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність
«223» лідерна послідовність «4005 42
Меє АБр Мес Агку Уаі Рго Аїа сіп Геї ІГеч біу Теч Іїеч Гец Геч Тгр 1 5 10 15
Рпе Рго сС1у Аїа Агд Сув 20 «2105 43 «2115» 66 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «223» лідерна послідовність «4005 43 асудчасасєчда дддЕСсСссудс Есадсссстд ддсссссвдхнс єдессссдуЄс сссаддсдесс бо ачдЧчЕде 66 «2105 44 «2115 19 «212» РВТ «213» Штучна послідовність
Зо «2205 «223» лідерна послідовність «4005 44
З5
Меє бі1у Текр бек Сув Іїе Іїе Гечш Ррбе Геї Уаі Аза Тбйг Аза ТЕ с01Уу 1 5 10 15
Уаї Нів 5екг «2105 45 «2115 57 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «223» лідерна послідовність «4005 45 асчачаєдча дссдсаєсає ссЕСЕСсСсССсвєд десадсаасад ссассудсуєЄ дсаєссс 57 «2105» 46 «2115 57 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «223» лідерна послідовність 60 «4005» 46 асчдчдчсЕдує сссдсаєсає ссЕдеЕсеєсвд дєддсвассу ссасєдчадс дсаєссс 57 «2105 47 65 «2115 57 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність
«223» лідерна послідовність «4005 47 асдддсЕддЕ ссеЕдсаєсає ссЕдсеЕєссд десдссасад ссассддсдЕ дсасессе 57 «2105 48 «2115 592 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» рР4-7б5, НС(ЕС «виступ», РЗ329б ГАГА)-І12 М880 «4005 48 біч Уаії сбіп Пец Ге сі бек біу біу біу ІТеч Уаі сіп Рго сіу с1у 1 5 10 15 век Геч Агуд Гей бег Сув Аза Аїа бек біу Рпе ТП Роре бек бБег Туг 20 25 Зо
Аа Меє Бек Тгр Маі Аку біп Аза Рго сіу пуб сіу Гезч біч Тгрр Уаї 35 40 45 зек Аїа І1ї1е бек біу бек біу біу бек ТПг Туг Туг Аїа АБр бек Уаї 5о0 ів) бо
Туз біу Акуд Рпе ТПг Іїе Бек Агу АБр АБп о бег Гу5 Ап ТпПг Геч Туг 65 7о 75 80
Теч біп Меє Ап бек Геї Агу Аза бі АвБр ТБ Аза Уа1і Тук Тук Сув 85 90 95
Аза пув сі1у бек б1іу Рре Авр Туг Тер сС1у Сіп сС1іу Трг Іеч Уа1 Тіг 100 105 110
Уаї бек бек Аза бек ТПг ПпувБ сіу Рго бек Ма! Робе Рго Гей Аза Рго 115 120 125
Зек Бек Пув бек ТПг бек біу біу ТПг Аїа Аза Геч сіу Су5 Іеч Уаї 130 135 140
Туз АБр о Тук Рпе Рго сії Рго УМаі ТПг Уаї б5ег Тгр А5п бег сіу Аза 145 150 155 160
Теч ТрПг бек сіу Уа1і Нібв ТПг Роре Рго Аїа Уа! Гей сСіп бек Бек сб1Уу 165 170 175
Пес Тугк бек Пе бек бек Маі Уаі Тпг Уа1! Рго бег бБег бек Геп б1У 180 185 190
ТЕ біп ТБ Тук Іїе Суб Авп Уаі Авп Нів пуб Рго бек АБп о ТПкг Був 195 200 205
Уаї АБр Гуз пув Уаії бій Рго Ппубв Бек Суб АБр Гу5 ТПг Нібв Трг Сув 210 215 220
Рго Рго Суб Рго Аїа Рго бі Аза Аза сіу сіу Рго Бек МУМаі1і Роіе Іеч 60 225 230 235 240
Рпе Ркго Рго пуб Рго Гу5з АБр ТПг Гей Меє Іїе Бек Агу ТПг Рго січ 245 250 255 65 Уаї Тис Сув Маї Уа1ї Уаїії Авр Уаі1ї бек Нів бій Авр Рго бі Уаї Гуз 260 265 270
Рпе Абвп Тгр Тук Маі АБр біу Уаі біц Уаі Ніб Ап Аза Пу5 ТіПг Гуз
275 280 285
Рго Акд бі бі біп Тук АБп о бег ТПг Туг Акуд Уа1і Уаі1ї бек Уаї Іеч 290 295 300
ТПгЕ Маї Іеч Ні біп Абвр Тер Геч Ап сіу Ппув бі Тук Гув Сув Гуз 305 310 315 320
Уаї Бек АБп Гуз Аза Ге сіу Аза Рго Іїе сії Гу5 Тбг І1е бек Пув 325 330 335
Аза пув сіу біп Рго Аку біч Ргко біп Уа! Тук ТП Геї Рго Ркго Сув 340 345 350
Агкуд АБр бій Гей Тпг о Ппув Авзп біп Уаї бек ГПечп Тер Суз Геч Уаї Гуз 355 360 365 біу Рпе Тук Рго бек Ар Іїе Аїа Уаі біч Тср біц бег АвБп сіу сіп 370 375 З8о
Рго біц АБп АБп о Тук Гув Тбг ТБЕ Рго Рго Уаі Геї АБр 5ег АБр б1Уу 385 390 395 400
Бек Рпе Рбе Геч Тук бек Гув Ге ТПг Уаі! Авр Пубв бБег Агу Тер біп 405 410 415 біп бі1у Авп Уа1! Ррпе бБег Сув бек Ма! Меєсє Ні біц Аза Гей Нібв Ап 420 425 430
Нів Туг Трг Сіп пуб бБег Геч бек їец бег Рго Сі1у Сіу с1у С1у С1У 435 440 445 бек сіу сіу сіу біу бек біу біу біу сіу бек Аза Рго Аїа бек 5ег 450 455 460
З5
Бек ТПЕ Ппув Пув ТПг біп Теч біп гейш сі Ніє Геч Геч ІГеч АБр Іеч 465 470 475 480 біп Меє Іїе Гей Азп сіу І1їе АБп АБп Тук Гув АБп о Рго пуб Геч ТПг 485 490 495
Акуд Меє Ггеч Тс Ре Гуз Рбе Тук Меє Рго пуб пуб Аїа ТіПг січ Іеч 500 505 510
Пув Нів їеч біп Сув їеч біц сі Січ їеч Пув Рго їеч біч січ Уаї 515 520 525
Теч АБп Гей Аїа сіп Бек Пув АБп о Роре Ніз Те Агу Рго Агуд Авр Гей 530 535 540
І1їе Бек АБр І1їе АБп Уа! Іїе Уаі гейш сі Ге Ппув сіу бек бій ТЕбг 545 550 555 560
ТПЕ Рре Меє Суз біч Туг Аза Авр сій ТПг Аїа ТПг І1їе Уаії біч Рре 565 570 575
Теч АБп Агуд Тер Іїе Тбг Рре Аїа біп бек Іїе І1е бек ТПпг Ге ТПг 580 585 590 бо «210» 49 «2115 1776 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність 65 «220» «223» рР4-7б5, НС(ЕС «виступ», РЗ329б ГАГА)-І12 М880 «4005 49 чачачаєдсаасє СуУосєдчадсс єдоадоадЧдаддс сЄєдадсасадс ссддадоадЕС ссєдадасесс бо
Есссудсдса сссссудасє сассеЕсвсадс адссаєдсса Єдадссддудє ссдссадаесє 120 ссаддчдаадуд доассддадеЕд ддЕСсСЕСсадсеЕ аєсадеддна дЕддсддсад сасасбассас 180 чсачасєссу СЄдаадддссу дсЕссассаєс Сссададаса ассссаадаа сасдсєдесає 240 сеЕдсадаєда асадссєдад адссдаддас асддссдбає аєсасєдбдс даааддсадс 300 т ччасєсЧдасс ассудудддсса адчаасссвєд деЕсассуєсєЕ сдадедссадд сассааддуас 360 ссаєсудЕсСеЕ Ессссседдс асссоссеєсс аададсассо седддддсас адсддсссед 420 чЧасЕдсссда Єсааддасса сесссссудаа ссддєдасудд ЄдесудєЄддаа сссаддсдсес 480 сЕдассадсд дсдедсасас сЕссссуддсеЕ деЕсСсврасаде ссесаддасе стасесссес 540 адсадсуєЄду СЄдассуєдсес ссссадсадс сЄєдддсассс адасссасає сеєдсаасуєд 60 "7 ааєсасаадс ссадсаасас саадчдсдудчдас аадааадеєсу адсссаааєс Єсдєдасааа ббо асєЕсасасасє дсссассуєЄд сссадсассо даадсєдсад ддадчЧассуєс адсссессесс 720
БЕсСсссссаа аасссаадда сасссеєсаєд ассеЕсссуда ссссєдаддЕ сасасдс9аєд 780 чЧчеЧдЧдєдчасу СЄдадссасуа адасссєда дЕСаадсеєса асеєддсасуає дадасддсуєд 840 чаччдєдсаєа аєдссаадас ааадссусуд дЧадчадсадеЕ асаасадсас деассєдесд 900 щ ЧеЕсадсуєсс СсассуєЄєссеє дсассаддас Єддссєдаасу дсаадчадеа саадсдсаад 960
ЧдЕссссааса аадсссссуд судсссссаєс дачдаааасса єсЕССсСааадс сааадддсад 1020 ссссдадаас сасаддсдба сасссєдссс ссасдссуддауд аєдадсєдас саадаассад 1080 чЧЕсадссєдЕ ддсдсссдудє саааддсеєс баєсссадсу асаєсуссудє даадеддадад 1140 адсаасуддудс адссудачаа саасвєасаа ассасусссс ссуєдсєдчда сЕссдасудес 1200 " ЄссЕссееєсс сссасадсаа дсесассудєд дасаададса ддасддсадса ддаддаасдес 1260 рЕСсСЕСаєдсє ссуєдаєдса Єдаддсеєсвд сасаассассо асасудсадаа дадссесьсс 1320 сЕДдЕСєСсСсЯд дЕддсоддсоду аддсеЕссодда ддадсодчаддЕє сєддаддасдуа аддсессдса 1380 ссЕдссЕсаа деЕссврасааа даааасаса ссасаасєудч адсаєєвсасе дсеєдчаєєсва 1440 садаєдаєєсє єдааєдудаає сСааєаассас аадааєссса аасссассад даєдсессаса 1500 " рЕсаадсьссє асаєдсссаа дааддссаса даасеєдааас аєсєссачсд сссадаадаа 1550 чаасссааас сесбддадда адедссааає Єсбадсєсааа дсааааасес сСсасссаада 1620 сссадддасє Єааєсадсчда Сассаасуєа асадсесєсьдд аассааадуд асссдаааса 1680 асаєссаєде дчедаасаєдс Єдаєдадаса дсаассаєє сСадаасєсссє даасадаєд 1740 аєсассссєсу сссааадсає саєсєсааса сєдасе 1776 60 «2105 1550 «2115 592 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність 65 «2205 «223» РР4Аі7С5, НС(ЕС же, РЗ29С ТАТА)-ІІ12 М880
«4005 50 біч Уаії сбіп Пец Ге сі бек біу біу біу ІТеч Уаі сіп Рго сіу с1у 1 5 10 15
Ззек Геч Акуд Тез бек Сув Аза Аза бек сіу Рпе ТПг Ріре бег бек Туг 20 25 Зо
Аа Меє Бек Тгр Маі Аку біп Аза Рго сіу пуб сіу Гезч біч Тгрр Уаї 35 40 45 зек Аїа І1ї1е бек біу бек біу біу бек ТПг Туг Туг Аїа АБр бек Уаї 5о0 ів) бо цпув б1іу Агу Рбе ТПг І1їе 5ег Агу АБр АБп бег Гув Ап ТПг Геч Туг 65 70 75 80
Теч біп Меє Ап бек Геї Агу Аза бі АвБр ТБ Аза Уа1і Тук Тук Сув 85 90 95
Аа Ппув сіу Бек біу Рре АвБр Туг Тер біу біп сіу Тбг Геч Уа1і ТБг 100 105 110
Уаї бек бек Аза бек ТПг ПпувБ сіу Рго бек Ма! Робе Рго Гей Аза Рго 115 120 125
Зек Бек Пув бек ТПг бек біу біу ТПг Аїа Аза Геч сіу Су5 Іеч Уаї 130 135 140
Пув Авр о Тугє Рпе Рго Січ Рго Ма1ї ТиЬг Уаї бег Тер АБп бБег СсС1у А1а 145 150 155 160
Теч ТрПг бек сіу Уа1і Нібв ТПг Роре Рго Аїа Уа! Гей сСіп бек Бек сб1Уу 165 170 175
З5
Теч Тук бек Гей бек Бек Уа1і УМа1і! ТПг Уаї Рго бек бек бек Геч Сс1Уу 180 185 190
ТЕ біп ТБ Тук Іїе Суб Авп Уаі Авп Нів пуб Рго бек АБп о ТПкг Був 195 200 205
Уаї АБр Гуз пув Уаії бій Рго Ппубв Бек Суб АБр Гу5 ТПг Нібв Трг Сув 210 215 220
Рго Рго Сув Рго Аза Рго Січ Аза Аїа сСіу С1іу Рго бег Уа1 Рре Іеч 225 230 235 240
Рпе Ркго Рго пуб Рго Гу5з АБр ТПг Гей Меє Іїе Бек Агу ТПг Рго січ 245 250 255
Уаї ТЕ Сув Уаії Уаї Уаї Авр Уа1і Бек Нібв бій АвБр Ргко біч Уаї Пув 260 265 270
Рпе Абвп Тгр Тук Маі АБр біу Уаі біц Уаі Ніб Ап Аза Пу5 ТіПг Гуз 275 280 285
Рго Акд бі бі біп Тук АБп о бег ТПг Туг Акуд Уа1і Уаі1ї бек Уаї Іеч 290 295 300 60 ТВгЕ Маї Іїеч Нів біп Авр Тер Геш Ап сіу Ппуз бій Тук Ппув Сув Тув 305 310 315 320
Уаї Бек АБп Гуз Аза Ге сіу Аза Рго Іїе сії Гу5 Тбг І1е бек Пув 325 330 335 65
Аза ПпувБ сіу біп Рго Аку бі Ргко біп Уаі! Тук ТПг Геї Рго Ркго 5ег 340 345 350
Агуд Авр о біч Геч ТБ Гуз АБп обіп Уаії бек Геч ТПг Суб Геч Уаї Гуз 355 360 365 біу Рпе Тук Рго бек Ар Іїе Аїа Уаі біч Тср біц бег АвБп сіу сіп 370 375 380
Рго біц АБп АБп о Тук Гув Тбг ТБЕ Рго Рго Уаі Геї АБр 5ег АБр б1Уу 385 390 395 400 век Ріпе РіПе Гей Туг бек Пув Теч ТПг Уаії Авр Пуз бек Агу Тгр сіп 405 410 415 біп бі1у Авп Уа1! Ррпе бБег Сув бек Ма! Меєсє Ні біц Аза Гей Нібв Ап 420 425 430
Нів Тук ТП біп Гувз бек Гей бек Геч бек Рго біу біу сбіу с1у .Ш1Уу 435 440 445 бек сіу сіу сіу біу бек біу біу біу сіу бек Аза Рго Аїа бек 5ег 450 455 460
Бек ТПЕ Ппув Пув ТПг біп Теч біп гейш сі Ніє Геч Геч ІГеч АБр Іеч 465 470 475 480 біп Меє Іїе Пеш АвБп сіу І1їе АвБп АвБп Туг Пув Авп Рго Пув Геч ТіПг 485 490 495
Акуд Меє Ггеч Тс Ре Гуз Рбе Тук Меє Рго пуб пуб Аїа ТіПг січ Іеч 500 505 510
Зо
Туз Ні Гей біп Сув Геї січ бі біч Теч Пу5з Рго Геч січ січ МУаї 515 520 525
Теч АБп Гей Аїа сіп Бек Пув АБп о Роре Ніз Те Агу Рго Агуд Авр Гей 530 535 540
І1їе Бек АБр І1їе АБп Уа! Іїе Уаі гейш сі Ге Ппув сіу бек бій ТЕбг 545 550 555 560
ТаЕ Рпе Меє Сув Січ Туг Аза Авр бі Трг Аїа ТПг І1їе Уаї Січ Рре 565 570 575
Теч АБп Агуд Тер Іїе Тбг Рре Аїа біп бек Іїе І1е бек ТПпг Ге ТПг 580 585 590 «2105 51 «2115 1776 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «223» рР1і7б05, НС(ЕС ме, РЗ29С ТАГА)-І12 М880 «4005 51 чаддаєдсаає ЄдЕєддадес Єдддддаддс Ссддсасадс ссддддоддеЕс ссеЕдадасесс бо
Есссудсдса сссссудасє сассеЕсвсадс адссаєдсса Єдадссддудє ссдссадаесє 120 ссадддаадд ддссддадеЕд ддеЕсссадсеЕ ассадсддеа деЕддеЕддсад сасавбастсас 180 60 чсачасєссу СЄдаадддссу дсЕссассаєс Сссададаса ассссаадаа сасдсєдесає 240 сеЕдсадаєда асадссєдад адссдаддас асддссдбає аєсасєдбдс даааддсадс 300 65 чччдаєсєдасеЕ асєддддсса аддаассссд дссассудЕєсс сдадедссад сассаадддс 360 ссаєсудЕсСеЕ Ессссседдс асссоссеєсс аададсассо седддддсас адсддсссед 420 чассдсссду сСсаадчдасса ссєссссудаа ссудсєдасуд ЄДдЕСЧдЄддаа сЕСсаддсусс 480 сЕдассадсд дсдедсасас сЕссссуддсеЕ деЕсСсврасаде ссесаддасе стасесссес 540 адсадсдєдд Єдассдєдсс сЕссадсадс Ссдддсассс адасссасає ссдсаас9аєд 60 ааєсасаадс ссадсаасас саадчдсдудчдас аадааадеєсу адсссаааєс Єсдєдасааа ббо асєЕсасасасє дсссассуєЄд сссадсассо даадсєдсад ддадчЧассуєс адсссессесс 720 т Есссссссаа аасссааудда сасссссаєд аєсЕсссуда ссссеєдадудс сасасдсуєд 780 чЧчеЧдЧдєдчасу СЄдадссасуа адасссєда дЕСаадсеєса асеєддсасуає дадасддсуєд 840 чаддсєдсаса асбдссаадас ааадссдсудд даддадсадс асаасадсас дсассєдед 900
ЧеЕсадсуєсс СсассуєЄєссеє дсассаддас Єддссєдаасу дсаадчадеа саадсдсаад 960
ЧдЕссссааса аадсссссуд судсссссаєс дачдаааасса єсЕССсСааадс сааадддсад 1020 "7 ссссдадаас сасаддедбта сасссєдссс ссаєсссдад аєдадсєдас саадаассад 1080 чЧЕсадссєда сссдсссдуЄє саааддсеєс баєсссадсу асаєсуссудє даадеддадад 1140 25 адсааєдддс адссуддадаа саассасаад ассасудсссс ссудєдсєдда ссссдасддес 1200
ЄссЕссееєсс сссасадсаа дсесассудєд дасаададса ддасддсадса ддаддаасдес 1260 рЕСсСЕСаєдсє ссуєдаєдса Єдаддсеєсвд сасаассассо асасудсадаа дадссесьсс 1320 щ сЕДЕСЕСсССсСд дЕддсддсдуа аддссссодда ддсуддаддЕс седдаддсдддд аддсессдса 1380 ссЕдссЕсаа деЕссврасааа даааасаса ссасаасєудч адсаєєвсасе дсеєдчаєєсва 1440 35 садаєдаєєє єдааєддаає Сааєаассас аадааєссса аасєсассад даєдсессаса 1500 рЕсаадсьссє асаєдсссаа дааддссаса даасеєдааас аєсєссачсд сссадаадаа 1550 чаасссааас сесбддадда адедссааає Єсбадсєсааа дсааааасес сСсасссаада 1620 " сссадддасе бааєсадсчда бСассаасуєа асадсєсвдч аассааадуд асссдаааса 1680 асаєссаєде дчедаасаєдс Єдаєдадаса дсаассаєє сСадаасєсссє даасадаєд 1740 45 аєсассесєсу сссааадсає саєсєсааса сєдасе 1776 «2105 чф1352 «2115 592 «2125 РЕТ 50 «213» Штучна послідовність «2205 «223» РР4Аі7С5, НС(ЕсС же, РЗ29б ГАТА)-ІІ2 Е95А 55 «4005 52 біч Уаії сбіп Пец Ге сі бек біу біу біу ІТеч Уаі сіп Рго сіу с1у 1 5 10 15 60 век Геч Агуд Гей бег Сув Аза Аїа бек біу Рпе ТП Роре бек бБег Туг
Зо
Аа Меє Бек Тгр Маі Аку біп Аза Рго сіу пуб сіу Гезч біч Тгрр Уаї 65 зек Аїа І1ї1е бек біу бек біу біу бек ТПг Туг Туг Аїа АБр бек Уаї 5о0 ів) бо
Туз біу Акуд Рпе ТПг Іїе Бек Агу АБр АБп о бег Гу5 Ап ТпПг Геч Туг 65 70 75 80
Теч біп Меє Ап бек Геї Агу Аза бі АвБр ТБ Аза Уа1і Тук Тук Сув 85 90 95
Аа Ппув сіу Бек біу Рре АвБр Туг Тер біу біп сіу Тбг Геч Уа1і ТБг 100 105 110
Уаї бек бБег Аїа бек ТПг Ппув Сіу Рго бек Ма1і Рре Рго Іеч Аїа Рго 115 120 125
Зек Бек Пув бек ТПг бек біу біу ТПг Аїа Аза Геч сіу Су5 Іеч Уаї 130 135 140
Туз АБр о Тук Рпе Рго сії Рго УМаі ТПг Уаї б5ег Тгр А5п бег сіу Аза 145 150 155 160
Теч ТрПг бек сіу Уа1і Нібв ТПг Роре Рго Аїа Уа! Гей сСіп бек Бек сб1Уу 165 170 175
Теч Тук бек Гей бек Бек Уа1і УМа1і! ТПг Уаї Рго бек бек бек Геч Сс1Уу 180 185 190
Таг біп Трг Тує І1е Сув Авп о Уа1і Авп Нів Куб Рго бБег Авп ТіПг Гув 195 200 205
Уаї АБр Гуз пув Уаії бій Рго Ппубв Бек Суб АБр Гу5 ТПг Нібв Трг Сув 210 215 220
Зо
Рго Рго Суб Рго Аїа Рго бі Аза Аза сіу сіу Рго Бек МУМаі1і Роіе Іеч 225 230 235 240
Рпе Ркго Рго пуб Рго Гу5з АБр ТПг Гей Меє Іїе Бек Агу ТПг Рго січ 245 250 255
Уаї ТЕ Сув Уаії Уаї Уаї Авр Уа1і Бек Нібв бій АвБр Ргко біч Уаї Пув 260 265 270
Рпе Авп Тер Тугк Маі Авр сСіу Уаі бі Уаї Нів Ап Аїа Пув ТіПг Був 275 280 285
Рго Акд бі бі біп Тук АБп о бег ТПг Туг Акуд Уа1і Уаі1ї бек Уаї Іеч 290 295 300
ТПгЕ Маї Іеч Ні біп Абвр Тер Геч Ап сіу Ппув бі Тук Гув Сув Гуз 305 310 315 320
Уаї Бек АБп Гуз Аза Ге сіу Аза Рго Іїе сії Гу5 Тбг І1е бек Пув 325 330 335
Аза ПпувБ сіу біп Рго Аку бі Ргко біп Уаі! Тук ТПг Геї Рго Ркго 5ег 340 345 350
Агкуд АБр бій Гей Тпг о Ппув Авзп біп Уаї бек Ппечп ТК Суз Геч Уаї Гуз 355 360 365 біу Рпе Тук Рго бек Ар Іїе Аїа Уаі біч Тср біц бег АвБп сіу сіп 370 375 З8о 60
Рго біц АБп АБп о Тук Гув Тбг ТБЕ Рго Рго Уаі Геї АБр 5ег АБр б1Уу 385 390 395 400
Бек Рпе Рбе Геч Тук бек Гув Ге ТПг Уаі! Авр Пубв бБег Агу Тер біп 65 405 410 415 біп бі1у Авп Уа1! Ррпе бБег Сув бек Ма! Меєсє Ні біц Аза Гей Нібв Ап 420 425 430
Нів Тук ТП біп Гувз бек Гей бек Геч бек Рго біу біу сбіу с1у .Ш1Уу 435 440 445 зек біу сбіу біу біу бек біу біу біу біу бек Аїа Рго Аїа бБег 5ег 450 455 460
Бек ТПЕ Ппув Пув ТПг біп Теч біп гейш сі Ніє Геч Геч ІГеч АБр Іеч 465 470 475 480 біп Меє Іїе Гей Азп сіу І1їе АБп АБп Тук Гув АБп о Рго пуб Геч ТПг 485 490 495
Акуд Меє Ггеч Тс Ре Гуз Рбе Тук Меє Рго пуб пуб Аїа ТіПг січ Іеч 500 505 510
Туз Ні Гей біп Сув Геї січ бі біч Теч Пу5з Рго Геч січ січ МУаї 515 520 525
Пес Авп Геп Аза біп бек Ппуз АБп Рпе Нів ІТеч Агкуд Рго Агу Авр Гей 530 535 540
І1їе Бек АБп І1їе АБп Уа! Іїе Уа! Гей Рго Геч пуб сіу бек бій ТЕбг 545 550 555 560
ТПЕ Рре Меє Суз біч Туг Аза Авр сій ТПг Аїа ТПг І1їе Уаії біч Рре 565 570 575
Теч АБп Агуд Тер Іїе Тбг Рре Аїа біп бек Іїе І1е бек ТПпг Ге ТПг
Зо 580 585 590 «2105 53 «2115 1776 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «223» рР1і7б05, НС(ЕсС же, РЗ296б ГАБА)-112 Б95А «4005 53 чачачаєдсаасє СуУосєдчадсс єдоадоадЧдаддс сЄєдадсасадс ссддадоадЕС ссєдадасесс бо
Есссудсдса сссссудасє сассеЕсвсадс адссаєдсса Єдадссддудє ссдссадаесє 120 ссаддчдаадуд доассддадеЕд ддЕСсСЕСсадсеЕ аєсадеддна дЕддсддсад сасасбассас 180 чсачасєссу СЄдаадддссу дсЕссассаєс Сссададаса ассссаадаа сасдсєдесає 240 сеЕдсадаєда асадссєдад адссдаддас асддссдбає аєсасєдбдс даааддсадс 300 ччасєсЧдасс ассудудддсса адчаасссвєд деЕсассуєсєЕ сдадедссадд сассааддуас 360 ссаєсудЕсСеЕ Ессссседдс асссоссеєсс аададсассо седддддсас адсддсссед 420 чЧасЕдсссда Єсааддасса сесссссудаа ссддєдасудд ЄдесудєЄддаа сссаддсдсес 480 сЕдассадсд дсдедсасас сЕссссуддсеЕ деЕсСсврасаде ссесаддасе стасесссес 540 адсадсуєЄду СЄдассуєдсес ссссадсадс сЄєдддсассс адасссасає сеєдсаасуєд 60 бо ааєсасаадс ссадсаасас саадчдсдудчдас аадааадеєсу адсссаааєс Єсдєдасааа ббо асєЕсасасасє дсссассуєЄд сссадсассо даадсєдсад ддадчЧассуєс адсссессесс 720 65 БЕсСсссссаа аасссаадда сасссеєсаєд ассеЕсссуда ссссєдаддЕ сасасдс9аєд 780 чЧчеЧдЧдєдчасу СЄдадссасуа адасссєда дЕСаадсеєса асеєддсасуає дадасддсуєд 840 чаччдєдсаєа аєдссаадас ааадссусуд дЧадчадсадеЕ асаасадсас деассєдесд 900
ЧеЕсадсуєсс СсассуєЄєссеє дсассаддас Єддссєдаасу дсаадчадеа саадсдсаад 960
ЧдЕсЕЄссааса аадсссеєсуддда сдсессссаєсс дадаааасса ЄссСссааадс сааадддсад 1020 ссссдадаас сасаддедбта сасссєдссс ссаєсссдад аєдадсєдас саадаассад 1080 чЧЕсадссєда сссдсссдуЄє саааддсеєс баєсссадсу асаєсуссудє даадеддадад 1140 адсаасуддудс адссудачаа саасвєасаа ассасусссс ссуєдсєдчда сЕссдасудес 1200
ЄссЕссееєсс сссасадсаа дсесассудєд дасаададса ддасддсадса ддаддаасдес 1260
СЕСсСЕСаєсдсеЕ ссуєдаєдса єЄдаддсеєсьд сасаассасо асасдсадаа дадссЕсьсс 1320 сЕДЕСЕСсССсСд дЕддсддсдуа аддссссодда ддсуддаддЕс седдаддсдддд аддсессдса 1380 ссЕдссЕсаа деЕссврасааа даааасаса ссасаасєудч адсаєєвсасе дсеєдчаєєсва 1440 садаєдаєєсє єдааєдудаає сСааєаассас аадааєссса аасссассад даєдсессаса 1500 рЕсаадсьссє асаєдсссаа дааддссаса даасеєдааас аєсєссачсд сссадаадаа 1550 чаасссааас сессддадда адедссааає Есадсєсааа дсааааасес Ссасстєаада 1620 сссадддасе бааєсадсаа сассаасуєа асадесєсвдс сассааадудд асссдаааса 1680 асаєссаєде дчедаасаєдс Єдаєдадаса дсаассаєє сСадаасєсссє даасадаєд 1740
Зо аєсассссєсу сссааадсає саєсєсааса сєдасе 1776 «2105 54 «2115 42 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «223» прямий праймер для ЕКЕОХРЗ «4005 54
Едеаааасча сууддссадеЕсСе єадаадеЕсЧє аєдоадоачЧасо ЄС 42 «2105 55 «2115 44 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «223» зворотний праймер для ЕОХРЗ3 «4005 155 саддааасад ссасдассаа аасасссасс сСссессесьсссєс 44 «2105 56 «2115 42 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність бо «220» «223» прямий праймер для СТІА-4 «4005 55
Едеаааасча суддссадеЕддч ЯЧЕЕсСЧдЧдЕСсСаєс даадччадтеає да 42 65 «2105 57 «2115 45 «2125 ДНК
«213» Штучна послідовність «223» зворотний праймер для СТІА-4 «4005 57 саддааасад ссаєсєдассеєс сасеєсаавесє ссассрааааа бассс 45 «2105 58 «2115 133 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» 11-2 М880 ТЗА С125А «4005 58
Аза Рго Аза Бек бек бек Тйг пу5 Пу5 ТПг біп Геї сіп Іеч біц Нів 1 5 10 15
Теч Геч Гей Ар Геч сіп Меє І1їе Іечп АБп біу Іїе Авп Авп Тукг ГПув 20 25 Зо
АБп оРго Ппув Гей ТПг Акуд Меє їечп ТПг Рпе Ппуз Робе Тук Меє Рго Гуз
Туз Аза ТПг бі Геч Ппу5 Ніб Тез біп Суз Теч біц біц січ Геч Гуз бо
Зо
Рго Геч бі сі Маї Іечп АБп їец Аза сіп бек пуб АБп Роре Ні Іеч 65 7о 75 8о0
Агуд Рго Агуд АБр Геї І1е бек АБр Іїе Авп Уаі Іїе Уаії Іеч січ Іеч 35 85 90 935
Туз біу бек біц ТпПг Тпг Рбе Меє Су5 біп Туг Аїа АвБр бій ТПпг Аза 100 105 110 40 Тис І1е Маї Сі Рбе їеч Авп Агу Тгр І1е ТБ Рбе Аїа Сіп бек І1е 115 120 125
І1е бБег ТПг Іеч Тс 130 45 «2105 59 «2115 399 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність 50 «2205 «223» 11-2 М880 ТЗА С125А «4005 5 55 дсассеЕдссЕ саадсссвас ааадааааса садссасаас Єддадсаєєє аседссддває бо
Есасачаєча СЕСсСєЧдааєду ааєсааєаас сСасаадаасс ссааасеєсас садчаєдесесс 120 асасєсаадс сСеєсасасусс саадааддсс асадчаасєда аасаєсєсса десдессадаа 180 бо чаачаассса аасссссуда чдаадсусса аасссадссс ааадсааааа сеЕссєсасеса 240 ачасссадчуд ассєаасса счасаєсаас десаасадеЕсс єдчдаассааа дадаєссдаа 300 65 асаасаєсса СдЕдсдааса єЄдсєдаєдад асадсаасса ЄСдеадааєє єЄсеЕдаасада 360 бддаєсвассє сбдсссааад саєсаєсєса асасеєдасе 399
«2105 656560 «2115 133 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» 11-2 М880 «4005 60
Аза Рго ТПг Бек бек бек ТПг пу5 пуб ТПг біп Геї сіп Іеч біц Нів 1 5 10 15
Теч Геч Гей Ар Геч сіп Меє І1їе Іечп АБп біу Іїе Авп Авп Тукг ГПув
Зо
Авп оРго пуб Геї ТПг Агу Меє Тецп ТБПг Рпе Пув Рре Тугє Меє Рго Гуз 20 пув Аїа Тпг біз Теч Пув Нів Теч Сіп Суб Те Січ Січ Січ Теч Гуз бо
Рго Геч бі сі Маї Іечп АБп їец Аза сіп бек пуб АБп Роре Ні Іеч 65 7о 75 8о0 25
Агуд Рго Агуд АБр Геї І1е бек АБр Іїе Авп Уаі Іїе Уаії Іеч січ Іеч 85 90 935
Туз біу бек біц ТпПг Тпг Рбе Меє Су5 біп Туг Аїа АвБр бій ТПпг Аза
Зо 100 105 110
ТПг І1ї1е Маії бії Рбе Іїец Абхп Агуд Тер Іїе Тс Роре Су5 біп бек Іе 115 120 125 35 І1ї1е бБег Трг Іеєч Тс 130 «2105 651 «2115 399 40 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «223» 11-2 М880 45 «4005 6561 чсасссасеєс саадсєсвсас ааадааааса садссасаас Єдчадсасєс ассдсєдчає бо
Есасачаєча СЕСсСєЧдааєду ааєсааєаас сСасаадаасс ссааасеєсас садчаєдесесс 120 50 асасєсаадс сСеєсасасусс саадааддсс асадчаасєда аасаєсєсса десдессадаа 180 чаачаассса аасссссуда чдаадсусса аасссадссс ааадсааааа сеЕссєсасеса 240 55 адасссаддд асєєааєсад сдаєаєсаас дсаасадеЕсс єддаассааа дадаєсеєдаа 300 асаасаєсса СудсуЧсЄЧдааса єдссЧдаєдад асадсаасса Єсусбадааєс Єссдаасада 360 бдчдаєсвассеє сеЕсдсесааа саєсаєсєса асасеєдасе 399 60 «2105 652 «2115 133 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність 65 «2205 «223» 11-2 М880 С125А
«4005 562
Аза Рго ТПг Бек бек бек ТПг пу5 пуб ТПг біп Геї сіп Іеч біц Нів 1 5 10 15
Теч Геч Гей Ар Геч сіп Меє І1їе Іечп АБп біу Іїе Авп Авп Тукг ГПув 20 25 Зо
Авп оРго пуб Геї ТПг Агу Меє Тецп ТБПг Рпе Пув Рре Тугє Меє Рго Гуз 35 40 45
Туз Аза ТПг бі Геч Ппу5 Ніб Тез біп Суз Теч біц біц січ Геч Гуз 50 55 бо
Рго Геч Сі Сіц Ма1ї Гечш Авп їец Аїа Сіп бек Пув Авп Ріе Нів Іеч 65 7о 75 8о0
Агуд Рго Агуд АБр Геї І1е бек АБр Іїе Авп Уаі Іїе Уаії Іеч січ Іеч 85 90 935
Туз біу бек біц ТпПг Тпг Рбе Меє Су5 біп Туг Аїа АвБр бій ТПпг Аза 100 105 110
ТПг І1ї1е УМаії бії Рбе Іїец Абхп Агуд Тер Іїе Тс Рре Азїа біп бек Іе 115 120 125
І1е бБег ТПг Іеч Тс 130
Зо «2105» 63 «2115 399 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» 11-2 М880 С125А «4005 63 чсасссасеєс саадсєсвсас ааадааааса садссасаас Єдчадсасєс ассдсєдчає бо
Есасачаєча СЕСсСєЧдааєду ааєсааєаас сСасаадаасс ссааасеєсас садчаєдесесс 120 асасєсаадс сСеєсасасусс саадааддсс асадчаасєда аасаєсєсса десдессадаа 180
Чаадаассса аассссвєдда ддаадедсса аареєсадссс ааадсааааа сЕсеСсСасеса 240 ачасссадчуд ассєаасса счасаєсаас десаасадеЕсс єдчдаассааа дадаєссдаа 300 асаасаєсса СудсуЧсЄЧдааса єдссЧдаєдад асадсаасса Єсусбадааєс Єссдаасада 360 бддаєсвассє сбдсссааад саєсаєсєса асасеєдасе 399 «2105 654 «2115 133 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» 11-2 М880 ТЗА 60 «4005 64
Аза Рго Аза Бек бек бек Тйг пу5 Пу5 ТПг біп Геї сіп Іеч біц Нів 1 5 10 15 65
Теч Геч Гей Ар Геч сіп Меє І1їе Іечп АБп біу Іїе Авп Авп Тукг ГПув 20 25 Зо
Авп оРго пуб Геї ТПг Агу Меє Тецп ТБПг Рпе Пув Рре Тугє Меє Рго Гуз 35 40 45
Туз Аза ТПг бі Геч Ппу5 Ніб Тез біп Суз Теч біц біц січ Геч Гуз 50 55 бо
Рго Геч бі сі Маї Іечп АБп їец Аза сіп бек пуб АБп Роре Ні Іеч 65 70 75 80
Агкуд Рго Агу АБр Гей Іїе бек Авр Іїе Авп Уаі Іїе Уаї Ге січ Гей 85 90 95
Туз біу бек біц ТпПг Тпг Рбе Меє Су5 біп Туг Аїа АвБр бій ТПпг Аза 100 105 110
ТПг І1ї1е Маії бії Рбе Іїец Абхп Агуд Тер Іїе Тс Роре Су5 біп бек Іе 115 120 125
І1е бБег ТПг Іеч Тс 130 «2105 655 «2115 399 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «223» 11-2 М880 ТЗА
Зо «4005 65 чсасссдссс саадсєсвсас ааадааааса садссасаас Єдчадсасєс ассдсєдчає бо
Есасачаєча СЕСсСєЧдааєду ааєсааєаас сСасаадаасс ссааасеєсас садчаєдесесс 120 асасстааде СсСвбасаєдсс саадааддсс асадаасєда аасаєссєса дедЕСсСадаа 180 чаачаассса аасссссуда чдаадсусса аасссадссс ааадсааааа сеЕссєсасеса 240 ачасссадчуд ассєаасса счасаєсаас десаасадеЕсс єдчдаассааа дадаєссдаа 300 асаасаєсса СудсуЧсЄЧдааса єдссЧдаєдад асадсаасса Єсусбадааєс Єссдаасада 360 бдчдаєсвассеє сеЕсдсесааа саєсаєсєса асасеєдасе 399 «2105 66 «2115 15 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «2235» (с45)3 лінкер «4005 66 сіу сі1у сС1у с1іу бек Ссіу сі1у сі1іу сС1у бек сіу сС1у Сі1у с1у бег

Claims (5)

1 5 10 15 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Злитий білок, що містить: (І) молекулу імуноглобуліну, яка не має здатності специфічно зв'язуватися з антигеном, і (ІІ) дві мутантні молекули інтерлейкіну-2 (І/-2), які містять амінокислотну мутацію, яка знижує афінність мутантної молекули 1-2 до рецептора 11-2, який має проміжну афінність, у порівнянні з молекулою 1-2 дикого типу, причому зазначені мутантні 65 молекули 1-2 містять послідовність зЗЕО ІЮ МО: 58.
2. Злитий білок за п. 1, в якому зазначена молекула імуноглобуліну являє собою молекулу імуноглобуліну Ідо-класу, переважно молекулу імуноглобуліну Ідс.-підкласу.
З. Злитий білок за п. 1 або п. 2, в якому зазначена молекула імуноглобуліну являє собою людську молекулу імуноглобуліну.
4. Злитий білок за одним з попередніх пунктів, в якому зазначена молекула імуноглобуліну містить послідовність варіабельної області важкого ланцюга, основою якого є послідовність людської зародкової лінії Мп3-23.
5. Злитий білок за одним з попередніх пунктів, в якому зазначена молекула імуноглобуліну містить послідовність варіабельної області важкого ланцюга ЗЕО ІЮО МО: 9.
б. Злитий білок за одним з попередніх пунктів, в якому зазначена молекула імуноглобуліну містить послідовність варіабельної області легкого ланцюга, основою якого є послідовність людської зародкової лінії МК3-20.
7. Злитий білок за одним з попередніх пунктів, в якому зазначена молекула імуноглобуліну містить послідовність варіабельної області легкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО: 11.
8. Злитий білок за одним з попередніх пунктів, в якому зазначена молекула імуноглобуліну містить модифікацію, яка знижує афінність зв'язування молекули імуноглобуліну з Ес- рецептором у порівнянні з відповідною молекулою імуноглобуліну без зазначеної модифікації.
9. Злитий білок за п. 8, де зазначений Ес-рецептор являє собою Есу-рецептор, зокрема людський Есу-рецептор.
10. Злитий білок за п. 8 або п. 9, де зазначений Ес-рецептор являє собою активуючий Ес- рецептор.
11. Злитий білок за одним з пп. 8-10, де зазначений Ес-рецептор вибраний з групи, яка містить ЕсукШа (СО16а), ЕсукІ (СО64), ЕсумкПа (СО32) і ЕсоКІ (СО89).
12. Злитий білок за одним з пп. 8-11, де зазначений Ес-рецептор являє собою ЕсукШа, насамперед людський ЕсукШа.
13. Злитий білок за одним з попередніх пунктів, в якому зазначена молекула імуноглобуліну містить амінокислотну заміну в положенні 329 (ЕО-нумерація) важких ланцюгів імуноглобуліну.
14. Злитий білок за п. 13, в якому зазначена амінокислотна заміна являє собою Р3296.
15. Злитий білок за одним з попередніх пунктів, в якому зазначена молекула імуноглобуліну містить амінокислотні заміни в положеннях 234 і 235 (ЕО-нумерація) важких ланцюгів імуноглобуліну.
16. Злитий білок за п. 15, в якому зазначені амінокислотні заміни являють собою І 234А і 1235А (ІА А).
17. Злитий білок за одним з попередніх пунктів, в якому зазначена молекула імуноглобуліну містить амінокислотні заміни /234А, 1235А і РЗ29б5 (ЕО-нумерація) у важких ланцюгах імуноглобуліну.
18. Злитий білок за одним з попередніх пунктів, в якому кожна із зазначених мутантних молекул І -2 злита на своїй М-кінцевій амінокислоті з С-кінцевою амінокислотою одного з імуноглобулінових важких ланцюгів зазначеної молекули імуноглобуліну, необов'язково через пептидний лінкер.
19. Злитий білок за одним з попередніх пунктів, в якому кожна із зазначених мутантних молекул І/-2 злита із зазначеною молекулою імуноглобуліну через пептидний лінкер.
20. Злитий білок за п. 19, в якому зазначений пептидний лінкер містить щонайменше 10, зокрема щонайменше 15 амінокислот.
21. Злитий білок за п. 19 або п. 20, в якому зазначений пептидний лінкер містить амінокислотну послідовність (б45)з (ЗЕО ІЮ МО: 66).
22. Злитий білок за одним з попередніх пунктів, де злитий білок містить поліпептидні послідовності зЕО ІЮ МО: 19 і 5ЕО ІЮО МО: 50.
23. Злитий білок за одним з попередніх пунктів, де зазначений злитий білок вибірково активує регуляторні Т-клітини.
24. Полінуклеотид, що кодує злитий білок за одним з попередніх пунктів.
25. Вектор, зокрема експресійний вектор, що містить полінуклеотид за п. 24.
26. Клітина-хазяїн, що містить полінуклеотид за п. 24 або вектор за п. 25.
27. Спосіб одержання злитого білка, який містить молекулу імуноглобуліну і дві мутантні молекули 1-2, які містять амінокислотну мутацію, яка знижує афінність мутантної молекули 1-2 до рецептора 1-2, який має проміжну афінність у порівнянні з молекулою 1-2 дикого типу, що містить стадії, на яких (І) культивують клітину-хазяїна за п. 26 в умовах, придатних для експресії злитого білка, і (ІІ) виділяють злитий білок.
28. Злитий білок, одержаний способом за п. 27.
29. Фармацевтична композиція, що містить злитий білок за одним з пп. 1-23 або п. 28 і фармацевтично прийнятний носій.
30. Злитий білок за одним з пп. 1-23 або п. 28 або фармацевтична композиція за п. 29, призначений/призначена для застосування як лікарського засобу.
31. Злитий білок за одним з пп. 1-23 або п. 28 або фармацевтична композиція за п. 29, призначений/призначена для застосування для лікування або профілактики аутоімунного захворювання.
32. Злитий білок або фармацевтична композиція за п. 31, де зазначене аутоімунне захворювання вибране з групи, що містить діабет типу 1, системний червоний вовчак, запальне захворювання кишечнику, хворобу Крона, неспецифічний виразковий коліт і розсіяний склероз.
33. Злитий білок за одним з пп. 1-23 або п. 28 або фармацевтична композиція за п. 29, призначений/призначена для застосування для лікування або профілактики відторгнення трансплантату або реакції "трансплантат проти хазяїна".
34. Злитий білок за одним з пп. 1-23 або п. 28, призначений для застосування для вибіркової активації регуляторних Т-клітин /л уйго або /л у/уо.
35. Злитий білок за п. 34, в якому зазначена активація охоплює індукцію проліферації регуляторних Т-клітин і/або індукцію передачі сигналів через ІЇ-2-рецептор в регуляторних Т- клітинах.
36. Спосіб вибіркової активації регуляторних Т-клітин /л7 уЛюто або /п у/уо, що містить контактування зазначених регуляторних Т-клітини зі злитим білком за одним з пп. 1-23 або п. 28.
37. Спосіб за п. 36, в якому зазначена активація охоплює індукцію проліферації регуляторних Т- клітин і/або індукцію передачі сигналів через ІЇ-2-рецептор в регуляторних Т-клітинах. и тд зві Б ї ЕК | ЕН ї5а : да Ї 00 ! "Ч Зо ЦК х і ; о нн х 315 За З З же В 2 за В ва 100 я НБЕБІЛНОВЛВ. вилов. тА й я - ще- пеня 2 1 т ще Я: о вання анна Фі й НК А тав ря Б яю г Зп ой МНОЮ Зї50 3200 ЗБ в Я 5 600 900 0800 хв Т та чо зувинях р овосся т во І св та З і вв- нн в І 49- яв щі ов-В: пеня в нн пи нн В 5 їв ї5 за 25 чі хв
Фк.
та. кв як г вдо) 1 чав! | ГА в " -|ч. я ші -| ух . часа тю жк виз ве: ПИ я п п С с зо 7
419. во !
ка . пінні ча ав- Ки з9- НОНННННННННЯ ча
Зв. В : з щЕ І п М ЕЕ ДЕ ЕЕ:
Фак.3
А ! Б в г й: до Е во ! Я р В ! "ш о Я |: опо ї ЕІ «8 і о | || - З 48 56 БО 70.8 ха в ненідшовл. БІДНИХ Г тА ма ни во вин КОКО во ! - депттттття а і ! екв, т ЕХ ру 4 б В ОО 34 08 0охв ка д ЗА ; ве тд лап ! еВ ! ке ! 4о ; Б Ї 5 хі 5 5 ще го: ще вал ща ща ОО або хв Б Г , ісвЕовлі кілнови. тА Кз 8 в 4 З жа- Звогаввввововве щі 48- я
Ав. 80548 08 40 3 4 8 хв
Я. 5 ад НЯ Зйя і 185 Б. гак у: і Шу; ЗК ж Е я ши: Ще ї. Дак -ео ВуК- ПЕ з ві ПОШО. НЕ М: ШИ ШЕ З ха, ШИ З: МГ - ! КО | рі Я 1 55 ЛІ ще г | РОС й ГЕ і ВЕЖ, Се Я (У З ВО Ке -- вв й 11 шви ШИК - нж- педа що ще ще ж їй дно ТІ дю ОПН 14 1 Я за ню Кк й їз нин НЕ з шк що Ро дення їх в: Я вий Е Й іо, і "М КО се ; в'я той и зах пола? зо ше тох а ЖАХ Сага в ех Зк м з Н па й ж до срденяю 18 ЩІ ; | и ії я " М Й Ку. й Е ШО 4 ЧУ -- СПД во ех їв ! шок чКт ГУ Ме ЕЕ Ж шення. МЕТ ДОМ зл Ї Ех ТЕ ВВЕ і і 1 : ге Як ; КОЖ БОНЕ ві ЩО Ж де в - Н є ВО БОМ: і і Е ще ше ши ш ' Щоча Б з рвати 15 1 й ТО і їх нео ЕЕ Й Е і й ій рок ща КО ї і а на ЕХ : ва ср 3 ї х Ки КЗ з, Н Ії, , цу с б я п й ; КЕ. вх Б ха зяврех Я яні печуритереняе в'єї лй за? зо? вола Вод те сСбоавіненАХ Са ех жо ЕХ -- вас пух А В Ен їм і Ь Її шо. й ! п наш, БУ Б і Ї й Ва -р по З ї є В я БМ ге КН ї Ж Рошен й Ж ще Б М 1 В -- Б А да НВ Я Кретов песо рсен піші шин як в'вх за че ча і: У з Сей я вв скеепеКАЕ сша Па -- сбзюномиА в зв г, вх т ТЕМНА ву у ва- 5 т «и й г «Б ік З 5 80- зи в зате АК х ВИНИ 2 ІННИ і їх Кі ОК я МКК Ї й |! в р: ОО Ж ПЕК 5 яв ОО дО я я І Б 1 а Ж Бе ії З зам ВА з ООН і: аб змен ФІН тер вне те вл п вол за? в ви й щей ти Степ екА сте ан рої ще ЖЕ га 2аах 5 Й вне ще Ж дет я ень я ви ж моху ЗМ зн Кай КАЖЕ і с ЗВИК як с: Й жд В вт Е р; ж а дв є лак Ме З «538 я я / и ; в зав І я що ди із х я Яд НН ша - у; я Е се КЕ що ї р Ше «в же и си ж «й Ж оду ав й Ки - їй вах Ки й й, у нс новий такси М аа зЕнв в 7 паннаннйй п 2 закожа : яв 0 зщк ЗО 583 вл я за ява лев --хктиновзнІ Ме -- ви липким им ях зваат ев ---нзївне Ткее М вн ---ефевт СТ МЕ ОТ -клтвлям пам жті як ; є А КЕН КХ з З 2532 ле, оф а --СБЕ МЕ я ЖЖ маш ше. о. Е й іх й. що во -пр ефект. СІЯ -ї-клитнни пло жті ї- Же ос ; В де ИЖКЯ З жа ри -ве- вів. фест. МЕМ - ТК -кллутння. пе зва Я й Ева КОЗУ ж (й иттій --М й шт ре ший кон що з зжі да 5 їй хв о ЗаВщ ЗВЕВЕ вів. афект СЕК 1 клутжнх М Я дохо. с.
Фіг. 8 я щі 2885 ен в ж 5 р чне ком І до НН В й Я -в скТяВОВниНі Пед-клітнни Ттер- а --- наївні Грар-клІпнНи. 8 --- ефект, СТИ Т-клікннм памяті вав адже ва Е! чав ля 3958 ін й СПК клітини зва Ма ой, му хвая Ки - 5 є ан є і ві БАК ор
8. Пе. дей ш ча ой шою й ві Кк Ск що Е Ши «В ВЕ шов 8880 з 35 зе зав кг
Фіг. 9 все ША дев ся пе я ше а щі сорте-- ук зва й - 1 їк що ат р й ана. т Га шини вишня й ГзА ; ся ЕЕ А ще
"А. зов ще р Ши - в. ню й Шк, Ст Ов и Е й Пов й й Ме ПІ р її ЖЕ Бе й рН янь й Кг Ми ЯК і СК нн й Ж и дж ше. ай) шани вай вт зво зад вже ее в ! , ою зо воля ніше - -й зетивовані ЇТеє ЗННЯ се ївні Їхек ва -- наївні ІК їх -БШ- ефект. Її 13 -Т-клотиш пам яті з БЕ я бр тв -- сп їх і й шк: є ї ії рий «В Що і -р ефект. ЗВ -Ї-ялетине пам яті ще ї в с а х з ве ї В як мій -Ве ввів вфеку. СП - К-кліунни Б і г вн мех ще З --КЕК в ЖК В же вий, ой в оса вик Й й с --нюдт вже 82 ло 008 зав ее " В нійнт тлінк. афект. СЕ - К-ззптяни и - УТІК 5К А клітини пам'яті г Я д й х 18 у ефе зе я А; і їх жо ск А Ж ГУ Я К Ки й : 5 вв ге Ми Ку -йо актнновані Іїве в КЕ ГКУ зв . п ; Н а В, -- ЕХревп-клуснни пла яті ря ЩЕ Ся що ст 5 де ж дйся но -- МЕНІ Тек Б води нн щей і) ай - е Р с: ЕЕ Аж -Е- ебйект. й МУ СТ лужне пре ять 5 вв - сек, М вої З ї Я ОО ЗБК й . 2. щ Б р Й -й- наівн. афект. СО -Т-кплетвни м за КЕ се зни Йти що ех З я У Ка Кк Ом 5 "ще ще шо З й Х д й зажівах. ефект. СІВ -Т-клітнни 5 в 3 я ті, Я Я СПЕКА окоотени пом'яту й ій їх й ра ри ш м: и Кк ї ся ЩА 24 Е ББЧЕ» ер 7 вв ЗОН аж ом Я Б Зк з ТЕО-ФІ 7) (нем)
«аг.
зв К й ЕВ ь век зва з» 2885 «Е т - К «о пвх З ї- ; щі ; о ївва К. Б х7 ще Ка Е як Ко рх зва я а" ях у вав є? - ше-ї2ь ок | й зи --е-ніг)3 пасе -в. ща вий --- їа-Н: 3 --т » ввЕет вла ад в Е! Ф.ввяї вв в.з вл з заеа- жкжа в І 8 зва в зве т. БО Е та ре твжа в ж ка КЗ - - ок . я « щі и ще зв Й ва важа «є ЕІ та «7 м є - «є щ 58 й - ше-п2, ев в « -ьндв-вг, дна -8- що-йг річній Ван ча зе а а в.вайї вве вх я в: ваше пфовя 5.88 в.з я нт вгбят Як ОТІ МК са зва св болт: 4 Знищ дами З ! сні ие Шен тега с зв КЕ Ю І я ме Ще Шев ще и м ' - й -й - Я дик ой реа ке ЗЕ в нь 4 - Іа й на Ж пот ве ЛОВ) Я че ре ке рі В / Ши, - р Нв и , вий , Щ зове я ри т Е і, ІЙ дих Б: Ж жк Кв БО і Ї - и Я Ж тя хх й й й ЕЕ й; - пня Й скан не с; Й сій зва Я З й Й. ай й в ххх мо ш оч ке вяї о ва з те ля зве нІЗМА -й зктнВОВані ТОК -й- Прек-юттики паж яв. оси ШАЯУ -оншниІтер й ле зи опфрохетосфК -Ж ефект. СТВ -Т-клутини пам яті - їй ж стен де я зви м -- дар осн пф тонер -сн афект. СТВ -Т-клітини памяті В й денс - ее очко тя й щен дя -д НаБН. знфект. СІК -Т-клетння жо зве я Де ко б Я Е Що оолсе -е МЕТ Й денти нен. ефект. СІЯ ЛИ. С: я і п КА, ї вія я ві 48 тва о звев клини пам вті втйял пк. 3 ск ШИ ст ША ре чи Мені вд зве т що ла М ишнни Й А ме лжее Ж Кл чн в - у я м / я р зах я А ех па заве Як сад КА. Е хі. іх в ше Ж / й одн : вав ро є й я їй ши «Б й й я п Ан тн «3 ж гЗ З і «1 Й няно цВ В
8.83 вл Е! че чав заяв за в 1 че зяЕ з855 заз ув -йо хюетизовині Бе вва по ви-о Й -е , Й ж ин -к- Терхкнітнни поз яті Ус повз Не р : - нанні Т - Ж жен Те я зява ! я р те ЕЕ ей. і Т-кдрУєЕснх "яті зх : ;
ефе. СІМ Т-вл ЕЕЖВЕ яті Жк звав остов, -кК СПО ук 5 ло -вровфект СТВ: Ж астккжн твюв яті ща поса бе сід сні денне в МНЕ -вр НАЇВЕ. ефект СТВ -К-юзтини Є че 5.84 2-4 8 35 зе зв5а На с нгошт -а НКТ д набвн. ефект СПЕКА -Т-
яв. 13 зва - Мі дження Й дна зо Заве У дижени я км У ШЕ сни о зае й й Бк Я пкт тю няр Е А ни - ЕВ «4 й, Й т Я дн се «Ве и вщ с: НІЙ ГИ КК: зв зва кове жГОЖЕ а, ШИЯ сей стивовдні Тер в нс -- кт х вні Те що У: вве ой Шин -й- іквж-клітННИ ПЛЖ ЯТІ я ж й р М -Ф- наївні Пе щ лиж я -я ефект. СПМИ-Т-клітшни памяті є зве й Ж я- дв ра жк кт . я Ка дет -ю СП МК клітини р Ж й я ше І Коди ях одне я Ко Ка вже вл я їв теж о зж8о БОМ
Фе. 13 завач д звввтр дн ен фета вв зд. щі х пу Ж ввзе й т тва нау В Віста е ї; в де шо. не й є Б у; у ко її 8 що и в є оба в Кз ж ж я ві. п п, Б ж «ж пер я е з пови х як жа «885 в ва є шо жБо БВЖЖ а БЕБ-ПЬ-У неї В -- тТЕБ-Ь-ЗЕЗБА Й ЧИ Й Й М ши вна ни. Я ІвС-пЬ-ІМ ЕВ), в ж еле з ЕБЕ ІЗ й -Ж ІЕЄ-ТЕ ІК ВБВ їв Я В Ж ій В. г КО щ вдо яз вав Я Кк Из) Ге й я яко яяЖо зва БЖБ
Фіг. 14 ЗІ КЕ зве д ср 2. ча І де ЕЕ рас: за ще а є Ж. у лави дк я пив рай : и ке і й я М жен З ад С Шин вав й і КІ т вен свя есе вих З й в ей зн г й ин З й ЕЗ ЕТ ва мя вх щ.4 Е 8 защ знав і тЕС-ЯБ-ХЬ, Я ІБС-ПІ-ЗЕФБА), Я зкспь-іх аву, Ж ІСТЬ ЗК ЕВ
Фе. 15 й в ВЕН БО. вол іх 5-х ШИ Гинунен т І г; Гі Бе ї ще те і і - ОО. І; І в і г ї і Як озаее ' ї К-Я 7 / шк З ве х й; У М во / / вве й , -йї- шзласу р, 7 ь- оч В, й щи -- зоз-пі-х ваш, й ше сядь 00 о- очи Мав ж за зай жи ай ож) 5 З о жвя заз заз а за вро чат ню о яде ВАЗ втят Н-АЗ нгебжл ВЕ - 585 ЗЕ Т -- НЯ -л, я Кая у: 0004 -о- ючи з кано)» я : ЖК ж щозвю я ТЯ і со с Гм: у й - Бей -- кі 2 88 В м ва г Ши щй - Бо чи і й г п с зжинний пен р-он в В я я жа т ЯЗ жа ява де че ож вся зе оз оз о же о не БЕ-Я, нтишл ПЗ штжх
Фе. їх д Е ЕІ з ша. 4 Й не ви п яю як - і -ї зн 2 -- вч н-гі, не - 5, і: -- юва-н 2 мав), 8 -п. во-й- з нЕЕт, З ваше. Ки; шо В да її пе й рда -шй ей з чи" шанс дор аа ріс я з за? за яв їв жех за? за? зей ча яке НК фе ЗД же ЯВя ждя
Н.А) ниж ОЗ обмя Ж ЕС -- КЕ. щ-- КО З - -- во з МеВ. ра т. що Бо я? вс: ай про ос ВВ р--сеонерьнньно Го їв я Я здо Яд Яд 02 че ЩО ягєт срег. 15
З н ЗЕ ві , / Ж обі -жо щеня зу у не в -- шо-я- / я -д- С-И л мЕВщ), її в -- яо-пЕ С МЕНЮ. а , іх хх ту а 4 щое -ї х зв -Ш --- а ле сен ос ВВ, р-он и ж сш НИ Е нки ння в ча ча2 0 жо я 85 Нео яд а ж дя яаАЗ вки яд ах де Н-З нпржн Н.З, нгіжя Кк Я
Я. КЕ в я ; п КК: ї М лова ся бен, й м як вет / - -- ве-к а маво), / я 500 с. юс наеюь і В ї Я а І. щ о р Б. 7 я ЗО. й оо рено ся ние се вне пси нс: -К«ФШиничике нн! НІ 02 я 40 обої Яд че чо тп жа 3 зд НИ яв: зв ве Шоломи ПЗ, нтйнл
«г. ІХ М н зав їявЕ М зпав -- -ша-н-2к, ї 5 зв -о пшв-Е 83 я - -- шен. вано, Кй Є -ї- зва-пь-2 наяв, у. з ка ИЙ - ЕК Ж с-Е щі що рд-ї кн ді п в с: сін нини ---оп В Пееяьсярьн ьо ІЗ Я та Фа яв лаб жві жеХ лах зх ві же я чюжї ях! зді Зв7 Зв Ні нимп БАЗ, штат е. ЇВ д Б чек репо 1 се ве я Фа Ше а СО --х Мис УиУ - «КОВІ. ЕК ві Ед х ЧЕ й ЯН 5 іні З со я В єв : Ж У ц г -- ; й з ке я я іо; я о Ж а Я з - ї Ж вх спе срБдеяе сов' «Зог. ЕЕ
А вин МЕ нн Б - МК вх пово -о 338 020201 Е З ; і Е -
х Ж. тк | з в - 628 зе - що а 5 з ве ші т ЯК «5 КЗ їех я ГАЗ сКаАсУ в о езу пк у кі ЕК воно я бро о сан ей й: о вкл «ОН С Кк У КУ мех ще КОКО а Ж Ж ривки ЗК ек З тя - Ж В Бвсся вок тв ж й и, м З Ж . т й "- Ж. века: ект м іх - Й я х напсянвовах в в що БО Е є т й я 23 як ай ся дз - ях Куй я
Фіг. 17 зва -е2-ї7 «аж наДпоевнюнач іш я й - вв ще "т"впт -- івнКБ-іІ-з2МаяВу дк "
Ба . і -яяк іі -йі -2і, Ж " Ж ва Киняняяняя я «і Б Шайя жа щ за ' - Ж Мо ше я 5 25 Не і й а В т 4 24 28 ї5 42 ав дні
Фіг. 18 - МК Тра кстітннх - 5 Як з Су В й ш- ХК клітини я я ще Ст -клітшни Ек ох І Ж ж й ре і ЖЕ ! 1 о ще ЗЕ та Б: . В ПИПИИИНИНИМНИНИИИННИИИ ПИПИМИМИИИИИИИИИИНИНИМИ, ШФИПИМИНИНМИМНИНИИИННИИИ наповнювач з5о-Но ва-щІнЕввІ:
Фіг. 19 й СОЧІ ноут Е : : ве кави я: І : а ке дев ; в Ще 4 КЗ НЕ НАД 1 1 4 сопор-чяИ-ясх содовА змеї В : «ває ря Бен . . . Тек паж яті
- . . . шк стеж. Пеш шаее аква й бухай ЖЖ в то0 зер « «5 Ж вх є х З й аа ЕХ | КУ ща
? щ. з з в і о і ї с г. . ен ш ш шш ш ш з щ щ щ шщ щ шщ щ щ є шщ щ щ шщ щ щ щ що є шт щ щ щі що щі щ що
Як . о о . . . . . . шен щі що що щі щ щ щ щ. -Оозвез . . | і. у | г. г. . - шщ щ щ шщ щ щ щ що Е шщ щ щ щ щ щщщ і. . | і. . і. . . . МИ їш- . ГІ ш . 7 . ш . т о т х т о Г | . те с що се т ЕЕ - - їні Я їх йо що -
І. З Е ї Е й І: : Я Е в: Е Е В В СУ
СУ: ха: ВІН 2 тав Б г ЗжР в І | В Ш со-пі-Ех т ЩЕ : Е ве іївз-ни-ІЕвих ха ол ТЕ и : - х КС ОХ СС І а «й | дон ння ння і Б х | . . й ї ; без дуптюх йжпюх с во я Е Ее сотворив Ж зява г Е ЗЕБЖ в ЕІ Е з ва Ж ве в щ во звав і ЕК й з5ва я свв - х ква . . т се й . . и сх сука дув бжпех як шктнаї суп: шузах аг. 31 ЗБ д я да У Ь х о задо ї / ке і ме ви / я « ошннне ш шн р-н ж кі Є я ТЕ ве ще я Ж ме я г са я ще ЩІ з КН в БІК Кй й кун че є ої «- БОЛТ» в сл в Беб-а. ІМаят Ж: па Ж ше БІВ 500 я В НКУ КЕ нище ген КГ м Ще я в я я Шин нн й т она р рн 506 7 Ж Ж я ї -ш М в як ге іх зязя ; / ; Н із зо я х «я. 4 Й ; З Й - У шо -ю І 7 п-а- КК В й х ки х Й з хех зхох ВВ дров КОТ в Бл Б ча чщ КТ
Фіг. 21 --
й тако, звававч Б хр зна й . Б зно І я ЗО о акт жк -- ше-пох пов Жов етно щи ан Ган пан Е пк, я ІК -й-Ж МЕР ЕК ок ЖЕ 0000007, й є т, : те ран - стан й -а їщо Зяр, - що лі сті пило ЧІ т ї. за З зїва-в-гь ЖОВ Шия т «в в «Сеозве-в)у М Вк СВ е і Івба-ТТ З Я вигуки я ї -е- ІЕО-01. 2» 03 згікг) Ж вх Бе яд Зах 5. в за же а 24 «ж т2 о з28 тає часпісляі у ін єю: слі часпля їн єкці (голі в БЕ твево вза а ЗВЕта - шевв г ї К те а зо в ст; чне ШО К І Т З то. Ка НИ ШИ и они ш ШИ ПИ ПИ ПИШИ що С З с ШО не М Я с ШЕ НИ НИ НИ Вя А Я НИК ПЕ НЕ в МО ТОК ВКи ЩЕ ШИ КК КК ВКи БИШИ чваа ПИ, ИН ПИШИ, ПИШИ, а -ї сі їн я р - З 3 - Со - ї Б ще г ку ій З 8 Ж хо --й в КЕ Ж їй і БУ х щ щ щу КУ й Я зна в, НЕО Б і т хх. З зиску ш-- їх. 25 мжтікг що нава Щоня БУ. З5 зивтіют - Бе шафи ЗУ. МО мектуве а ці Я ше ї у. З вого З " зако ВВ - В те те т й 5 18 "ке 8 Я щ ох ще «4 та р ; З я в --і " Есе К в х У вл Ж 2.1 важ Як .КЯ 2 га Як ТЕ їх КК аз ке текс Ст час (пох «ріг. 25
Е Я : ВЕ . щохк В ЗШ: З за я - г ХХ Ох ' Зх г З ЕК ЕКЗ В в с о о 2 в я2 25000 ЗБ а в ї2 25 ЗЕ вішвЕдь вод ї чо Ін о в ожктожгі відпикноль в одянь бі доза ТРК НО ОЗ Б жетівт!
Фіг. б А в Б пе дою. ж я сш й Чан щ ні НК ай БЕ В Я м х а , с. й овен С й до вла х свя З - бмиіке вої мЕоКЕ Де осям
З В. й 2 й 5 в й й 4 Е В дкішеня вородки КК АХ люзтнхля оброк ГБН Й ЗДОООО Ех й ї5 яю МЕ т50о тах ЗОВ МЕ кг Ж МЕМ жу ле г. мож ож Ж ко їж «кю ЗМ МЕ вх Ж І зн ЗО Ме У 5 ях хе ЗОМ їх зо і ї ще ВЕ МЕ кт ОА КУ Ко 7 ке Шк. «бе 10 Ел кХ щ ; дет й З ес 2 і ММ У йо ОБО ння В і Ка Коен й й шк ни ПЕН УЛ КОЮ В Е й З а Кк В 2 й. я. я др після пробки пусленкатиоє дні слючя ООреоюих праленкунов ЖЕЛЕ ех в - г Е с Ж п й й» 7 ВО о НУ що Б Км що 1. Ех Ї КО меж Бо ква . г)
З о. засн Роецк зва-к- втома? 16500 ЕхЗ ЗНО МЕ зна МмЕхї МИНЮ МЕхІ нізновізьсв день ЇЙ візпожізь в ден 15 Ж ї В Е , ж ж і Ж Я ЖЕ З по Есе Е є ї фах - рових ІБ Ех: ОО МЕ вілновіль вдень ЇЙ Як 29 сі Е 8 хх їх Б я х Ж КЗ «Ж в ШК « Ж й ох Е --к Кк ке ОщеУ М шо я я з в Ж що вй з о я з 5 : х ннітнсзя обрюбкн ів АЗК) дні після зйребю віх 1-2 17 метглют г «В Ж ВЕ -- В х х с х ї х дні шієля збробкчи 2-Х 35 мет кк)
тва ж чея р Е КЗ ак зу Ж З Я КЕ х З х з й Щ- Я 11 шк ! ве што єм. ; ж | 5 ге з т КУ Я Е Ж з 2 з н ні після обробки МІСНІ ПО меті) дні після оброб Бек І-І 11 мкг ща зв тоди 1 СКК р ї з седанйня Б У З Ж -ве КИ ЖГ до й -- жк кг ї У - 28 т в 9 Со їх зо. о -- Й - й і ши хжжж я Х й Е Е 3 їх ж а х я Н Н дя та днк жволя сорока Бак і ня с. що І й зві нісля веровкн ІОАН -2 в 8 в Е: -- бомктоюг жов Ж «ще З мктоюг ж В оз с ІЧ гу Я І 8 ГУ я дав після сіройкив БЕС- Ба
Фе.
шк їзя Б прове В : й Ж в ; -- щО-Б Жов фен й. та3е зі ! моя Е У у ТВ. керОБЕТВЯЯ ця Я що ї-б ЕЕ Ї й» І ; Е сен, І є «ва і їх ї ши КЗ ях / ; и: Ех В: Е доведе : неехо мннн з нн нн о п о в п с те НЕ Ин и ЗИ Не У ЕЕ лнітістя оброб б мвжтют ТЕС-Я СЮ днітеля сбробки б актіюг Ів 131 -2)х Ж В Е ГТ ж «и М-ЕЇЬ Е Ед --- БЗПОВНЕЮВАЧ ЛО ж я ВЕ ЩО ее - м -ш 4 В ї у м й щ Е о я тки Ех КУ Кк З зак В в і ХЕ ЗУ 85 ; дже чаї, ЖЕ . шо Би: ПИ й т ЩЕ . 2 е с з ж 4 5 в їв 33 за 2 Е та їк зе в зн після вбребках й мкг БЕК -я візисвізь кз зазу (в омккокт; : А ВЕЖ я й їм Ше зе М Те, о ШІ Й і і х. ав. з «Ше т «й Е Ж ча я Я Я мати х яз В вавоукя БАК НУ Я Ж З К. а - ї дні лістя піробкая Та їкю 1200 х Б --імигкЕ В -- Е кгкт 5 Знж з В ще БЕН че що щ що їх Ж ри Та ОШеЯ ву я , і. З - що и Е че Е ши ж і. в в 1 ї з 4 в Е: 2 З о ня квас ебнчаєв Хей - 2 дніністя збробнн інС- (Н.Т г. Я т Ж ж з ї т шко ії як -к В 7 -к З ; ше МЕ Я тет пи ЖЕ В: -- юБ-дізь З х х «те ро-В З їз ЕІ КУ З КВ деза шк СВГСТЕСНИитТ й. пі їх тя СТ тей клітвни зад лок В наївні СТЕ ї-юлікнни «І ля" вісля и: М З ЕЕ 57 25 Б що 8 ко й ба леметтлюдания БО КІ ТЕКСТІ оз СО Тейсклікнви памяті Мі пкляцу вехувнЕ СТЕ ЕК -юлітнаи шо після у після пили п ин а ж пн пон «а КО Я БО Во З05 Я вжметклюювання СТІ а Б Как КЕ «тк . з Ж воза --- М жк юю їсте ! « -- Зб мкетвт Б х, то бю їж ЯСЬЗВ мктіюгід» жор, чо М мкліютьу. ме Я Б М ХЕ ; я дв І Я я й - очах Е а Чу, т ІЗ ф я - й ш "Ж. жк ї ни но т : ОО шо оч. й нення Е Вр в. рен тя КЗ п ше шо 8 Е че; та КЗ хо а я й Ж Як ЖЕ тв я Ізу 2 4 Б Ге ча м дн шісля ввезення вант лніпісля вБелення доля В зЕває -- НЕ етюр т, -- рел -2- М хавтлюв Богу жо вобе й 4 Соожеза нт С. че В ї а ЕЗ 8 З дніжнетя велетня доме зу. 3 А з -о все Ткжж-колюватних ск : с з в вх : Ж СВ -Трев-клітвни ам яті. КЗ Гх Я нан КТ Трее-юлікняи а зе я є ї Ко яв Ж. Я У ж СВК КОХРУ -Туек- кліки ЖЕ ние че Б 58 їй х, ке і; жо. : а км аг ПО пе ПВ ЧЕ Ше Ех - М - ДП. Ст же й пиляння Кай н шк я зач и 5
5 . 7 За і нь 5 ве -й все Ггед-колютзаних 8 - -- СЕН -Трехскотплнан п яті а 8.6 що студе х ЕЕ - -Шо ні СВ СБрев-юлітвнх ГЗ Ж шк З й пежосярх ї ж 4 -п. СВЕ'КЕОКРУ «Туєд-юліттвня щ х ВАЄ й я КЗ й й я ях й Е ш- ж вх СД п ї ї- ; КУ ку |: уп печін
В. як ' " пінні ру т та ї зані
В й за -й- все Ттев- клі га Е с -- СПУ. Ттер-клітиния плм'яті и ши Ехо наїві СВ Трер клітин : к за / х ЧА СПЕ РЕОХРУ- Тед клітнин а кеш ж В : Ж у, Ж я її і М з ЖЖ єв ї; нн я м Ще інн МЕ Пн п ДН, ва а ж зни й ІК й у ШКО Йо зо БІ де тірорн, т в т 38 Т ке Е все Трер-куткуввни Ж - стою с СВ -Ттер паз яті ШИ Ї; 7 яхівні СВЯТ Бе Ї - гЗ з 7 й СЕКСУ -Товх А чо / в ї- В ї и Ма ї Я у д, - ви 5 ва пед я ча пиши не в с '
г . 7 за сх ре: Фіг ЗВ ! А х то а Ці міктіют Еш БЕЖ віжв-. Сиюстет шо же зе БІ 7 ча : і дні ї ! ж Б З 5 , і -- Ка метки : Е СУЯ І: йо МОЗ дня пн виих КД й ча ЗБ з | о в В й 7 м ї Ж яті
Фіг. 5 а ж Б. в є зва -- СЕМ Евер влітннин пам'яті ї 150 гак -- СВЕЕРХРІ Трер -клітеняи - /Ї ше" В СПИСТОЮ Той клішня Е тво г) дк . М - СВ Бей клітнин паз яті їх Мвт Базкавни З і СВО еліти Й пенольня се ИЙ ех в п-я А- СБ зелкенях е 7 дні Е зава - СІ Ттев-клітняин пам'яті га -- наївні СТ -Ттер-клітннн Е знає Й ї -- СПЖБРХРЕ-Тгее клітини їх г, тд. -- СВЕСТЮЕМ Тей- клітини т звев Б а ки х зх не Е. щі с -- КС Те воженнви кяаа нок вві М с -- ннївні СПЕ -Тей клітини й А Спу-клі в ; Е; які й пінні чі СЕ -Твез клікння наве жі яка л -анаївни СП Трек юлітння ш р Кк Ши а ЄВЕЕРХВУ Ттед-клітнни шШ запа з М й щ , м в г р ту ВСВЕСВОК Те клітина - КУ Ек ем з с Й є І | сн ве - СВ -Тей золігншнни пла яті жо жор под Сеонайвні СВ -ТеВ клітини се СВ -Т-клітннв пл Бика сеессо РЕК За ДЯ ЕЕ тет з ко з СБ клітнян Б ія -СВЕ-Ттех клітини назг'яті Я -ж наївні СПЕ -Треи-толітвння: вк дня 4 «СЕ ЕЕХРІ Теер-влітннк Ве евав я В й Й 8 рах - СВИСТОК тей клітини
- . ай що б, сті щ .: ях В ЗБК шия й 0 СВІ Тай клітини пам'яті т щ а й, н х Ж я т за Є Вон --навні СЯ - Те клітнни -- БЕ Т влітнян д-р осо сосое р» Кк ДЯ ет т І ні І то ча -- СЕ клітини
А ТКУ - СВІ Тгев-клітннии памяті. до Гл -ф- наївні СІМ -Ттев-клікнни Е Й да - СЕН ЕВЕР Трек влітнин І: Ше ще я СВИСТ Тей клітини Е ІК ИЙ х --- СТО Тей клітник пазмбяті ія В, т в о ую сно -сн наївні СІЯ -Тей клітини
ЕІ. , К н Ь 00 я СВ Тек клітини памяті ! во Ак -йщ- наїннші СІ -Ткев-клітнин Е Ах -- СВЕ'КЕХРІ-Трев клітинна ; що Ак - СВК Тей-кліинии т- і чи 4 - шнй в! Ко ; х - СВ Те клітини памяті ш о й КА -Б- наївні СТІН -Тей клітнии ї їЇ 4 дні Явіг. їх З5 Ж се БЕ «Ше о іб-в-зняво), ТЕ -ж поль-з ЕВ «Ж оївав-ц- шо Е - В й ; штжн ЕНИ і їі НУ є ЕК аа за доза 3-Х сплеск г Х
UAA201609263A 2014-02-06 2015-02-04 Злитий білок інтерлейкіну-2 і його застосування UA120847C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461936564P 2014-02-06 2014-02-06
PCT/EP2015/052312 WO2015118016A1 (en) 2014-02-06 2015-02-04 Interleukin-2 fusion proteins and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA120847C2 true UA120847C2 (uk) 2020-02-25

Family

ID=52669578

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201609263A UA120847C2 (uk) 2014-02-06 2015-02-04 Злитий білок інтерлейкіну-2 і його застосування

Country Status (32)

Country Link
US (1) US11098099B2 (uk)
EP (2) EP3508496A1 (uk)
JP (2) JP6306201B2 (uk)
KR (2) KR102042246B1 (uk)
CN (2) CN105980410B (uk)
AR (1) AR099289A1 (uk)
AU (2) AU2015215001B2 (uk)
BR (1) BR112016018288A2 (uk)
CA (1) CA2931114A1 (uk)
CL (1) CL2016001968A1 (uk)
CR (1) CR20160333A (uk)
DK (1) DK3102595T3 (uk)
EA (2) EA034350B1 (uk)
ES (1) ES2704731T3 (uk)
HR (1) HRP20190028T1 (uk)
HU (1) HUE041530T2 (uk)
IL (1) IL245484B (uk)
LT (1) LT3102595T (uk)
MA (1) MA39250B1 (uk)
MX (2) MX370283B (uk)
NZ (2) NZ760289A (uk)
PE (1) PE20161324A1 (uk)
PH (1) PH12016501406A1 (uk)
PL (1) PL3102595T3 (uk)
PT (1) PT3102595T (uk)
RS (1) RS58149B1 (uk)
SG (1) SG11201606369XA (uk)
SI (1) SI3102595T1 (uk)
TW (1) TWI671318B (uk)
UA (1) UA120847C2 (uk)
WO (1) WO2015118016A1 (uk)
ZA (1) ZA201603262B (uk)

Families Citing this family (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA201892619A1 (ru) 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
US20140044675A1 (en) 2012-08-10 2014-02-13 Roche Glycart Ag Interleukin-2 fusion proteins and uses thereof
MA39250B1 (fr) 2014-02-06 2018-09-28 Hoffmann La Roche Protéines hybrides de l'interleukine-2 et leurs utilisations
GB201403775D0 (en) 2014-03-04 2014-04-16 Kymab Ltd Antibodies, uses & methods
SG11201700629TA (en) 2014-08-11 2017-02-27 Delinia Inc Modified il-2 variants that selectively activate regulatory t cells for the treatment of autoimmune diseases
MD3226843T2 (ro) 2014-12-05 2021-10-31 Aragon Pharmaceuticals Inc Compoziții anticancer
SG11201804259UA (en) 2015-12-04 2018-06-28 Novartis Ag Antibody cytokine engrafted compositions and methods of use for immunoregulation
EP3402499B1 (en) * 2016-01-14 2021-07-21 Intrexon Actobiotics NV Compositions and methods for the treatment of type 1 diabetes
US20170204154A1 (en) 2016-01-20 2017-07-20 Delinia, Inc. Molecules that selectively activate regulatory t cells for the treatment of autoimmune diseases
US9567399B1 (en) 2016-06-20 2017-02-14 Kymab Limited Antibodies and immunocytokines
US10858428B2 (en) 2016-09-28 2020-12-08 Xoma (Us) Llc Antibodies that bind interleukin-2 and uses thereof
WO2018073365A1 (en) 2016-10-19 2018-04-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for producing an immunoconjugate
WO2018083248A1 (en) 2016-11-03 2018-05-11 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses & methods
US11077172B2 (en) * 2016-11-08 2021-08-03 Delinia, Inc. IL-2 variants for the treatment of psoriasis
BR112019011799B1 (pt) * 2016-12-13 2021-12-21 Delinia, Inc Proteína de fusão, proteína dimérica e composição farmacêutica
CA3056630A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Pandion Therapeutics, Inc. Targeted immunotolerance
JOP20190271A1 (ar) 2017-05-24 2019-11-21 Novartis Ag بروتينات مطعّمة بسيتوكين- الجسم المضاد وطرق الاستخدام للاضطرابات المتعلقة بالمناعة
CA3064435A1 (en) 2017-05-24 2018-11-29 Pandion Therapeutics, Inc. Targeted immunotolerance
US20200299349A1 (en) * 2017-11-21 2020-09-24 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Partial agonists of interleukin-2
US10946068B2 (en) 2017-12-06 2021-03-16 Pandion Operations, Inc. IL-2 muteins and uses thereof
US10174091B1 (en) 2017-12-06 2019-01-08 Pandion Therapeutics, Inc. IL-2 muteins
EP3746103A4 (en) * 2017-12-06 2022-03-30 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University PROTEINS ENGINEERED TO INCREASE A CELL'S SENSITIVITY TO IL-2
JP2021506291A (ja) * 2017-12-19 2021-02-22 ゼンコア インコーポレイテッド 改変されたｉｌ−２ ｆｃ融合タンパク質
EP3752178A1 (en) 2018-02-16 2020-12-23 Iltoo Pharma Use of interleukin 2 for treating sjögren's syndrome
MX2020009975A (es) 2018-03-28 2020-10-12 Bristol Myers Squibb Co Proteinas de fusion interleucina-2/receptor alfa de interleucina-2 y metodos de uso.
WO2020007937A1 (en) 2018-07-03 2020-01-09 Iltoo Pharma Use of interleukin-2 for treating systemic sclerosis
EP3818083A2 (en) 2018-07-03 2021-05-12 Elstar Therapeutics, Inc. Anti-tcr antibody molecules and uses thereof
WO2020035482A1 (en) 2018-08-13 2020-02-20 Iltoo Pharma Combination of interleukin-2 with an interleukin 1 inhibitor, conjugates and therapeutic uses thereof
EP3908596A1 (en) * 2019-01-07 2021-11-17 Inhibrx, Inc. Polypeptides comprising modified il-2 polypeptides and uses thereof
CN111944036A (zh) * 2019-05-14 2020-11-17 上海盖浦生物科技有限公司 一种增殖免疫细胞的突变体蛋白
BR112021023345A2 (pt) 2019-05-20 2022-02-01 Pandion Operations Inc Imunotolerância com alvo em madcam
JP2022536347A (ja) * 2019-06-14 2022-08-15 キュージーン インコーポレイテッド 新規インターロイキン－２バリアントおよびその二官能性融合分子
EP3997115A4 (en) * 2019-07-12 2023-11-22 Proviva Therapeutics (Hong Kong) Limited IL-2 COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
US11633488B2 (en) 2020-01-10 2023-04-25 Bright Peak Therapeutics Ag Modified IL-2 polypeptides and uses thereof
KR102653906B1 (ko) 2020-01-14 2024-04-03 신테카인, 인크. 편향된 il2 뮤테인 방법 및 조성물
BR112022015920A2 (pt) 2020-02-13 2022-10-04 Hoffmann La Roche Método para determinar a razão de partículas de aav e uso do tempo de relaxação
EP4122951A1 (en) * 2020-03-19 2023-01-25 Innovent Biologics (Suzhou) Co., Ltd. Interleukin-2 mutant and use thereof
WO2021231773A1 (en) 2020-05-13 2021-11-18 Good Therapeutics, Inc. Compositions of protein complexes and methods of use thereof
CN113912735A (zh) * 2020-07-08 2022-01-11 南京师范大学 多肽二聚体及其用途
KR20230097094A (ko) 2020-10-29 2023-06-30 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 질환의 치료를 위한 융합 단백질
CN112724259B (zh) * 2020-11-16 2022-12-20 天津林达生物科技有限公司 人血清白蛋白与白介素2的融合蛋白及其用途
EP4255923A2 (en) * 2020-12-04 2023-10-11 F. Hoffmann-La Roche AG Ph-dependent mutant interleukin-2 polypeptides
KR20230148413A (ko) 2021-02-24 2023-10-24 에프. 호프만-라 로슈 아게 심층 필터의 재생 및 다회 사용
WO2023057588A1 (en) * 2021-10-06 2023-04-13 Iltoo Pharma Interleukin 2 chimeric constructs with targeting specificy to inflamed tissues
GB202115122D0 (en) * 2021-10-21 2021-12-08 Dualyx Nv Binding molecules targeting IL-2 receptor
WO2024056154A1 (en) 2022-09-12 2024-03-21 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Interleukin-2 for use in treating autism spectrum disorder
CN116041539B (zh) * 2022-10-31 2023-07-21 山东博安生物技术股份有限公司 Il-2突变体免疫缀合物
CN116554356B (zh) * 2023-05-16 2024-01-23 武汉大学 一种hyperIL-15与sCD4及Fc的融合蛋白及其应用

Family Cites Families (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2388385B1 (fr) 1977-04-18 1982-01-08 Hitachi Metals Ltd Piece d'ornement fixee par des aimants permanents
US4518584A (en) 1983-04-15 1985-05-21 Cetus Corporation Human recombinant interleukin-2 muteins
WO1985000817A1 (en) 1983-08-10 1985-02-28 Amgen Microbial expression of interleukin ii
US5206344A (en) 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5650150A (en) 1990-11-09 1997-07-22 Gillies; Stephen D. Recombinant antibody cytokine fusion proteins
JP4124480B2 (ja) 1991-06-14 2008-07-23 ジェネンテック・インコーポレーテッド 免疫グロブリン変異体
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
BR9813365A (pt) 1997-12-05 2004-06-15 Scripps Research Inst Método para produção e humanização de um anticorpo monoclonal de rato
BR9908226A (pt) 1998-02-25 2000-10-24 Lexigen Pharm Corp Melhoramento da meia vida de circulação de proteìnas de fusão com base em anticorpo
US6955807B1 (en) * 1998-05-15 2005-10-18 Bayer Pharmaceuticals Corporation IL-2 selective agonists and antagonists
DZ2788A1 (fr) 1998-05-15 2003-12-01 Bayer Ag Agonistes et antagonistes selectifs à IL-2.
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
WO2001025454A2 (en) 1999-10-04 2001-04-12 Medicago Inc. Method for regulating transcription of foreign genes in the presence of nitrogen
US6962696B1 (en) 1999-10-04 2005-11-08 Vion Pharmaceuticals Inc. Compositions and methods for tumor-targeted delivery of effector molecules
PT1454138E (pt) * 2001-12-04 2012-03-28 Merck Patent Gmbh Imunocitoquinas com seletividade modulada
US7432063B2 (en) 2002-02-14 2008-10-07 Kalobios Pharmaceuticals, Inc. Methods for affinity maturation
WO2005007121A2 (en) 2003-07-18 2005-01-27 Massachusetts Institute Of Technology Mutant interleukin-2(il-2) polypeptides
RU2006135112A (ru) * 2004-03-05 2008-04-10 Чирон Корпорейшн (Us) Тест-система in vitro для прогнозирования устойчивости пациента к терапевтическим средствам
RU2386638C2 (ru) 2004-03-31 2010-04-20 Дженентек, Инк. Гуманизированные анти-тфр-бета-антитела
CA2885854C (en) 2004-04-13 2017-02-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-p-selectin antibodies
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
CA2587572A1 (en) 2004-11-24 2006-06-01 Schering Corporation Dap-10 and uses thereof
EP2038417A2 (en) 2006-07-06 2009-03-25 Merck Patent GmbH Compositions and methods for enhancing the efficacy of il-2 mediated immune responses
AU2008278803A1 (en) 2007-07-25 2009-01-29 Astrazeneca Ab Targeted binging agents directed to KDR and uses thereof - 035
WO2009061853A2 (en) 2007-11-05 2009-05-14 Massachusetts Institute Of Technology Mutant interleukin-2 (il-2) polypeptides
WO2009085462A1 (en) 2007-12-19 2009-07-09 Centocor, Inc. Design and generation of human de novo pix phage display libraries via fusion to pix or pvii, vectors, antibodies and methods
DE102008023820A1 (de) 2008-05-08 2009-11-12 Aicuris Gmbh & Co. Kg Mittel zur Behandlung und/oder Prophylaxe einer Autoimmunerkrankung und zur Bildung von Regulatorischen T-Zellen
CA2749539C (en) * 2009-01-21 2022-07-19 Amgen Inc. Compositions and methods comprising interleukin-2 mutants for treating inflammatory and autoimmune diseases
HUE036077T2 (hu) 2010-08-13 2018-06-28 Roche Glycart Ag Anti-FAP ellenanyagok és alkalmazásukra szolgáló eljárások
CU23923B1 (es) 2010-11-12 2013-07-31 Ct De Inmunología Molecular Polipéptidos derivados de la il-2 con actividad agonista
DK3489255T3 (da) 2011-02-10 2021-08-23 Roche Glycart Ag Muterede interleukin-2-polypeptider
EP2683395B1 (en) 2011-03-11 2018-08-01 Assistance Publique - Hôpitaux de Paris Use of low dose il-2 for treating type 1 diabetes
EP3590965A1 (en) * 2011-03-29 2020-01-08 Roche Glycart AG Antibody fc variants
EA201892619A1 (ru) 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
WO2012178137A1 (en) * 2011-06-24 2012-12-27 Gillies Stephen D Light chain immunoglobulin fusion proteins and methods of use thereof
US20140044675A1 (en) 2012-08-10 2014-02-13 Roche Glycart Ag Interleukin-2 fusion proteins and uses thereof
US9546203B2 (en) 2013-03-14 2017-01-17 Amgen Inc. Aglycosylated Fc-containing polypeptides with cysteine substitutions
MA39250B1 (fr) 2014-02-06 2018-09-28 Hoffmann La Roche Protéines hybrides de l'interleukine-2 et leurs utilisations
MA40094B1 (fr) 2014-08-06 2022-05-31 Univ Miami Protéines de fusion de l'interleukine-2/récepteur alpha de l'interleukine-2 et procédés d'utilisation

Also Published As

Publication number Publication date
SG11201606369XA (en) 2016-09-29
KR20160103134A (ko) 2016-08-31
EP3508496A1 (en) 2019-07-10
WO2015118016A1 (en) 2015-08-13
AU2015215001B2 (en) 2019-08-15
CN105980410A (zh) 2016-09-28
NZ760289A (en) 2023-05-26
MA39250A1 (fr) 2018-03-30
LT3102595T (lt) 2019-01-25
JP2017510551A (ja) 2017-04-13
IL245484B (en) 2019-10-31
AU2019264579A1 (en) 2019-12-05
PE20161324A1 (es) 2016-11-25
CA2931114A1 (en) 2015-08-13
HRP20190028T1 (hr) 2019-02-22
MX2019014695A (es) 2020-02-07
CN105980410B (zh) 2020-02-28
JP2018102312A (ja) 2018-07-05
KR102042246B1 (ko) 2019-11-28
EP3102595B1 (en) 2018-11-07
US11098099B2 (en) 2021-08-24
CR20160333A (es) 2016-09-05
JP6306201B2 (ja) 2018-04-04
MX2016009687A (es) 2017-03-10
SI3102595T1 (sl) 2019-02-28
MA39250B1 (fr) 2018-09-28
DK3102595T3 (en) 2019-02-04
MX370283B (es) 2019-12-09
EP3102595A1 (en) 2016-12-14
AU2015215001A1 (en) 2016-05-19
EA201992609A1 (ru) 2020-03-04
PH12016501406A1 (en) 2016-08-31
HUE041530T2 (hu) 2019-05-28
TW201534625A (zh) 2015-09-16
ZA201603262B (en) 2019-10-30
US20150218260A1 (en) 2015-08-06
AR099289A1 (es) 2016-07-13
EA201691576A1 (ru) 2016-12-30
KR20190126205A (ko) 2019-11-08
PL3102595T3 (pl) 2019-04-30
RS58149B1 (sr) 2019-02-28
BR112016018288A2 (pt) 2017-10-10
CL2016001968A1 (es) 2017-02-24
PT3102595T (pt) 2019-01-11
ES2704731T3 (es) 2019-03-19
CN111423513A (zh) 2020-07-17
NZ719654A (en) 2020-06-26
IL245484A0 (en) 2016-06-30
TWI671318B (zh) 2019-09-11
EA034350B1 (ru) 2020-01-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA120847C2 (uk) Злитий білок інтерлейкіну-2 і його застосування
RU2741105C2 (ru) Антитела и химерные антигенные рецепторы, специфичные к cd19
TWI718118B (zh) 針對ｒｏｒ１之特異性抗體及嵌合抗原受體
CA2884704C (en) Vista modulators for diagnosis and treatment of cancer
EP3126380B1 (en) Chimeric antigen receptor (car) signalling system
CN103608040B (zh) 结合b7‑h1和pd‑1的抗体和其他分子
CN104619722B (zh) 新型vista-ig构建体和vista-ig用于治疗自身免疫性、过敏性和炎性疾病的用途
JP2020169192A (ja) 液性免疫の抑制または増進のための、ｖｉｓｔａアゴニスト及びｖｉｓｔａアンタゴニストの使用
JP2021184731A (ja) Ｃｄ１２７に対する抗体
CN114929278A (zh) 抗ccr8抗体及其用途
CN110461335A (zh) 用于治疗bcma相关癌症和自身免疫性失调的联合疗法
CN108884140A (zh) 修饰的嵌合受体及相关组合物和方法
CN107922471A (zh) 靶向ny‑eso‑1肽/mhc复合物的构建体及其用途
EA013677B1 (ru) Человеческие моноклональные антитела против cd25 и их применение
CN106459201A (zh) 结合人和食蟹猴CD3ε的抗体
CN103380145A (zh) 人类抗-sod1抗体
EA015584B1 (ru) Антитело к cd38 человека и его применение
EA029793B1 (ru) Антитела к ох40 и способы их применения
TW201945395A (zh) 抗‐hla‐g抗體及其用途
JP7328983B2 (ja) 抗ｉｌ－２７抗体及びその使用
US20210221902A1 (en) Cd137 antibodies and pd-1 antagonists and uses thereof
UA123398C2 (uk) Виділене антагоністичне антитіло, яке специфічно зв'язує cd154, та фармацевтична композиція, яка його містить
MX2012006199A (es) Agentes para tratamiento de enfermedad.
US11597778B2 (en) Human monoclonal autoantibodies to ADAMTS13 and uses thereof
US11896619B2 (en) Compositions and methods for immunotherapy of NPM1c-positive cancer