TW201945395A

TW201945395A - 抗‐hla‐g抗體及其用途

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Publication number: TW201945395A
Application number: TW108113360A
Authority: TW
Inventors: 史蒂芬丹格爾; 舍貝斯俊芬; 詹斯費雪; 安德魯斯辛茲; 克勞蒂亞柯斯騰費德; 史蒂芬克勞斯特曼; 喬治莫嫩肯; 喬治蒂芬泰勒; 莎賓霍夫司; 亞歷山大布喬茲克; 梅荷麥傑提
Original assignee: 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司
Priority date: 2018-04-18
Filing date: 2019-04-17
Publication date: 2019-12-01
Also published as: CL2020002540A1; WO2019202040A1; KR102608672B1; US20210147553A1; MX2020010951A; AU2019254596A1; BR112020020588A2; IL277308A; AR114789A1; CO2020012347A2; SG11202009695QA; JP7186239B2; KR20210005080A; CN112004831B; EP3781593A1; JP2021521791A; CA3094895A1; ZA202006066B; MA52284A; CN112004831A

Abstract

本發明係關於抗-HLA-G抗體及其使用方法。

Description

抗‐HLA‐G抗體及其用途

本發明係關於抗-HLA-G抗體、其製備、調配物及其使用方法。

人類主要組織相容性複合物I類(6) (亦稱為人類白血球抗原G (HLA-G))係人類中由HLA-G基因編碼之蛋白質。HLA-G屬HLA非經典I類重鏈同種同源物。此I類分子係由重鏈及輕鏈(β-2微球蛋白)組成之異二聚體。重鏈錨定於膜中，但亦可脫落/分泌。
• 重鏈由以下三個結構域組成：α 1、α 2及α 3。α 1及α 2結構域形成側接兩個α螺旋之肽結合凹槽。小肽(大約9聚體)可結合至類似於其他MHC I蛋白之此凹槽。
• 第二鏈係結合至類似於其他MHC I蛋白之重鏈之β 2微球蛋白。

對於HLA-G而言，存在7個同種型，3個呈分泌形式且4個呈膜結合形式(如圖1中所示意性展示)。

HLA-G可形成功能活性複合寡聚結構(Kuroki, K等人，Eur J Immunol. 37 (2007) 1727-1729)。在兩個HLA-G分子之Cys 42之間形成二硫化物連接之二聚體。(Shiroishi M等人，J Biol Chem 281 (2006) 10439-10447。三聚體及四聚體複合物亦已闡述於(例如)以下文獻中：Kuroki, K等人，Eur J Immunol. 37 (2007) 1727-1729；Allan D.S.等人，J Immunol Methods. 268 (2002) 43-50及T Gonen-Gross等人，J Immunol 171 (2003)1343-1351)。

HLA-G主要表現於胎盤中之細胞滋養層上。若干腫瘤(包含胰臟、乳房、皮膚、結腸直腸、胃及卵巢之腫瘤)表現HLA-G (Lin, A.等人，Mol Med. 21 (2015) 782-791；Amiot, L.等人，Cell Mol Life Sci. 68 (2011) 417-431)。亦已報導，該表現與諸如發炎性疾病、GvHD及癌症等病理學病狀有關。已報導，HLA-G與較差癌症預後有關。腫瘤細胞藉由經由HLA-G表現誘導免疫耐受性/抑制來逃避宿主免疫監督。

HLA-G與其他MHC I分子共有高同源性(＞98%)，由此難以生成與其他MHC I分子無交叉反應性之真正HLA-G特異性抗體。

先前已闡述某些以不同方式與HLA-G相互作用之抗體：Tissue Antigens, 55 (2000) 510-518係關於單株抗體(例如87G及MEM-G/9)；Neoplasma 50 (2003) 331-338係關於某些識別完整HLA-G寡聚複合物(例如87G及MEM-G9)以及HLA-G自由重鏈 (例如4H84、MEM-G/1及MEM-G/2)之單株抗體；Hum Immunol. 64 (2003) 315-326係關於若干針對表現HLA-G之JEG3腫瘤細胞進行測試之抗體(例如排他性地與天然HLA-G1分子反應之MEM-G/09及-G/13。MEM-G/01識別(類似於4H84 mAb)所有同種型之變性HLA-G重鏈，而MEM-G/04選擇性識別變性HLA-G1、-G2及-G5同種型；Wiendl等人，Brain 2003 176-85係關於不同單株HLA-G抗體(例如87G、4H84、MEM-G/9)。

上述公開案報導結合至人類HLA-G或人類HLA-G/ß2M MHC複合物之抗體。然而，因HLA家族之高多型性及高同源性，大部分抗體缺乏真正特異性HLA-G結合性質且通常亦與其他HLA家族成員(呈MHC/ß2M複合物形式或呈其ß2M自由形式)結合或交叉反應，或其僅僅並不抑制HLA-G ß2M MHC複合物與其受體ILT2及/或ILT4之結合(且視為非拮抗性抗體)。

因此，需要生成及/或選擇經進一步改良具有受體抑制性質之真正HLA-G特異性抗體。

在一態樣中，本發明提供結合至人類HLA-G且抑制ILT2結合至JEG-3細胞(ATCC HTB36)上之HLAG且恢復與JEG-3細胞一起共培養之單核球之HLA-G特異性抑制之TNFα釋放的抗體。

本發明之一實施例係結合至人類HLA-G之經分離抗體(在一實施例中，該抗體結合至包括SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合物)，其中該抗體包括
A) (a) VH結構域，其包括：(i)包括SEQ ID NO:1之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包括SEQ ID NO:2之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii)包括選自SEQ ID NO:3之胺基酸序列之HVR-H3；及(b) VL結構域，其包括：(i)包括SEQ ID NO:4之胺基酸序列之HVR-L1；(ii)包括SEQ ID NO:5之胺基酸序列之HVR-L2，及(iii)包括SEQ ID NO:6之胺基酸序列之HVR-L3；或
B) (a) VH結構域，其包括：(i)包括SEQ ID NO:9之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包括SEQ ID NO:10之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii)包括選自SEQ ID NO:11之胺基酸序列之HVR-H3；及(b) VL結構域，其包括：(i)包括SEQ ID NO:12之胺基酸序列之HVR-L1；(ii)包括SEQ ID NO:13之胺基酸序列之HVR-L2，及(iii)包括SEQ ID NO:14之胺基酸序列之HVR-L3；或
C) (a) VH結構域，其包括：(i)包括SEQ ID NO:17之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包括SEQ ID NO:18之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii)包括選自SEQ ID NO:19之胺基酸序列之HVR-H3；及(b) VL結構域，其包括：(i)包括SEQ ID NO:20之胺基酸序列之HVR-L1；(ii)包括SEQ ID NO:21之胺基酸序列之HVR-L2，及(iii)包括SEQ ID NO:22之胺基酸序列之HVR-L3；或
D) (a) VH結構域，其包括：(i)包括SEQ ID NO:25之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包括SEQ ID NO:26之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii)包括選自SEQ ID NO:27之胺基酸序列之HVR-H3；及(b) VL結構域，其包括：(i)包括SEQ ID NO:28之胺基酸序列之HVR-L1；(ii)包括SEQ ID NO:29之胺基酸序列之HVR-L2，及(iii)包括SEQ ID NO:30之胺基酸序列之HVR-L3。

本發明之一實施例係結合至人類HLA-G之經分離抗體(在一實施例中，該抗體結合至包括SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合物)，其中該抗體
A)
i) 包括SEQ ID NO:7之VH序列及SEQ ID NO:8之VL序列；
ii) 或包括i)下抗體之VH及VL之人類化變體；或
B)
i) 包括SEQ ID NO:15之VH序列及SEQ ID NO:16之VL序列；
ii) 或包括i)下抗體之VH及VL之人類化變體；或
C)
i) 包括SEQ ID NO:23之VH序列及SEQ ID NO:24之VL序列；
ii) 或包括i)下抗體之VH及VL之人類化變體；或
D)
i) 包括SEQ ID NO:31之VH序列及SEQ ID NO:32之VL序列；
ii) 或包括i)下抗體之VH及VL之人類化變體。

在一實施例中，本文所闡述之抗-HLA-G抗體
a) 並不與包括SEQ ID NO:44之經修飾人類HLA-G ß2M MHC I複合物交叉反應；及/或
b) 並不與包括SEQ ID NO:39及SEQ ID NO: 37之人類HLA-A2 ß2M MHC I複合物交叉反應；及/或
c) 並不與包括SEQ ID NO:45之小鼠H2Kd ß2M MHC I複合物交叉反應；及/或
d) 並不與包括SEQ ID NO:47之大鼠RT1A ß2M MHC I複合物交叉反應；及/或
e) 抑制ILT2結合至單體HLA-G ß2M MHC I複合物(包括SEQ ID NO: 43)；及/或
f) 將ILT2與三聚體HLA-G ß2M MHC I複合物(包括SEQ ID NO: 43)之結合抑制50%以上(在一實施例中60%以上) (與無抗體之結合相比) (參見實例4b)；及/或
g) 將ILT2與單體及/或二聚體及/或三聚體HLA-G ß2M MHC I複合物(包括SEQ ID NO: 43)之結合抑制50%以上(在一實施例中80%以上) (與無抗體之結合相比) (參見實例4b)；及/或
h) 抑制ILT2結合至JEG3細胞(ATCC編號HTB36)上之HLA-G (50%以上(在一實施例中80%以上)) (與無抗體之結合相比) (參見實例6)；及/或
i) 結合至JEG3細胞(ATCC編號HTB36)上之HLA-G (參見實例5)，且抑制ILT2結合至JEG3細胞(ATCC編號HTB36)上之HLA-G (50%以上(在一實施例中80%以上)) (與無抗體之結合相比) (參見實例6)；及/或
j) 將CD8a與HLAG之結合抑制80%以上(與無抗體之結合相比) (例如參見實例4c)。

在一實施例中，抗-HLA-G抗體係IgG1同型。

在一實施例中，抗-HLA-G抗體係具有突變L234A、L235A及P329G (根據Kabat之EU索引編號)之IgG1同型。

在一較佳實施例中，抗-HLA-G抗體抑制ILT2結合至單體HLA-G ß2M MHC I複合物。

在一實施例中，本發明之抗-HLA-G抗體係單株抗體。

在一實施例中，本發明之抗-HLA-G抗體係人類、人類化或嵌合抗體。

在一實施例中，本發明之抗-HLA-G抗體係結合至HLA-G之抗體片段。

在一實施例中，本發明之抗-HLA-G抗體係Fab片段。

本發明提供編碼如前述技術方案中任一項之抗體之經分離核酸。

本發明提供包括該核酸之宿主細胞。

本發明提供產生抗體之方法，其包括培養該宿主細胞以便產生抗體。

本發明提供該產生抗體之方法，其進一步包括自宿主細胞回收抗體。

本發明提供包括本文所闡述之抗體及醫藥上可接受之載劑之醫藥調配物。

本發明提供本文所闡述之抗體作為藥劑之用途。

本發明提供用於治療癌症之本文所闡述之抗體。

本發明提供本文所闡述之抗體用於製造藥劑之用途。在一實施例中，該醫藥係用於治療癌症。

本發明提供治療患有癌症之個體之方法，其包括向個體投與有效量之本文所闡述之抗體。

本發明使用定製嵌合抗原及/或嚴格篩選分析來鑑別諸多候選者中之HLA-G特異性抗體(避免與其他MHC I類複合物分子交叉反應且同時選擇HLA-G受體(例如ILT2)阻斷抗體)，該等HLA-G特異性抗體在表現HLA-G之JEG-3細胞及單核球之共培養物中展示HLA-G特異性誘導(恢復)TNFα。可使用本文所闡述之該等篩選方法來選擇新抗-HLA-G抗體。該等抗體展示高度有價值之性質，如強烈抑制ILT2結合至表現於JEG3細胞上之HLA-G或抑制ILT2結合至單體及/或二聚體及/或三聚體HLA-G ß2M MHC I複合物。

本發明提供具有以下特徵之抗體：其特異性結合至人類HLA-G，抑制ILT2結合至HLAG，且恢復HLA-G特異性抑制之免疫反應，恢復與HLA-G表現細胞(例如JEG-3細胞)一起共培養之單核球之脂多醣(LPS)誘導之TNFα產生/分泌。可與具有HLA-G敲除之JEG-3細胞相比來評估HLA-G表現細胞(如JEG-3細胞)對單核球之真正HLA-G特異性免疫抑制之恢復。

因此，與未經處理之共培養JEG-3細胞相比，本發明抗體恢復表現HLA-G之JEG-3細胞及單核球之經脂多醣(LPS)刺激之共培養物中之HLAG特異性TNFα釋放(未處理細胞視為0%陰性參考；僅單核球之培養物視為100%陽性參考，其中TNFα分泌並不受任何HLA-G /IL-T2特異性效應抑制(參見實例7))。

另外，該等抗體具有高度特異性且並不展示與HLA-A MHC I複合物或來自小鼠或大鼠起源之MHC I複合物之交叉反應性。

在用於本文中時，術語「HLA-G」、「人類HLA-G」係指HLA-G人類主要組織相容性複合物I類G，亦稱為人類白血球抗原G (HLA-G) (實例性SEQ ID NO: 35)。通常，HLA-G與β2微球蛋白(B2M或β2m)一起形成MHC I類複合物。在一實施例中，HLA-G係指HLA-G及β2微球蛋白之MHC I類複合物。

如本文中所使用，「結合至人類HLA-G (binding to human HLA-G)之抗體」、「特異性結合至人類HLA-G之抗體」、「結合至人類HLA-G (that binds to human HLA-G)之抗體」或「抗-HLA-G抗體」係指以5.0 × 10^-8 mol/l或更低之K_D 值(在一實施例中K_D 值為1.0 × 10^-9 mol/l或更低，在一實施例中K_D 值為5.0 × 10^-8 mol/l至1.0 × 10^-13 mol/l)之結合親和力特異性結合至人類HLA-G抗原或其細胞外結構域(ECD)之抗體。在一實施例中，抗體結合至包括SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合物)。

利用標準結合分析(例如表面電漿共振技術(BIAcore®, GE-Healthcare Uppsala, Sweden))使用(例如)包括HLA-G細胞外結構域(例如呈其天然3維結構形式)之構築體來測定結合親和力。在一實施例中，利用標準結合分析使用包括含有SEQ ID NO: 43之MHC I類複合物之實例性可溶性HLA-G來測定結合親和力。

HLA-G具有規則MHC I摺疊且由以下兩條鏈組成：鏈1由三個結構域：α 1、α 2及α 3組成。α 1及α 2結構域形成側接兩個α螺旋之肽結合凹槽。小肽(大約9聚體)可結合至類似於其他MHCI蛋白之此凹槽。鏈2係各種其他MHCI蛋白所共有之β 2微球蛋白。

HLA-G可形成功能活性複合寡聚結構(Kuroki, K等人，Eur J Immunol. 37 (2007) 1727–1729)。在兩個HLA-G分子之Cys 42之間形成二硫化物連接之二聚體。(Shiroishi M等人，J Biol Chem 281 (2006) 10439-10447。三聚體及四聚體複合物亦已闡述於(例如)以下文獻中：Kuroki, K等人，Eur J Immunol. 37 (2007) 1727-1729；Allan D.S.等人，J Immunol Methods. 268 (2002) 43-50及T Gonen-Gross等人，J Immunol 171 (2003)1343-1351)。不同於大部分其他MHC I類分子，HLA-G具有若干游離半胱胺酸殘基。Boyson等人，Proc Nat Acad Sci USA, 99: 16180 (2002)報導，HLA-G5之重組可溶性形式可與分子間Cys42-Cys42二硫鍵形成二硫化物連接之二聚體。另外，HLA-G1之膜結合形式亦可在內源性表現HLA-G之Jeg3細胞系之細胞表面上形成二硫化物連接之二聚體。HLA-G1及HLA-G5之二硫化物連接之二聚體形式亦已發現於滋養層細胞之細胞表面上(Apps, R., Tissue Antigens, 68:359 (2006))。

對於HLA-G而言，存在7個同種型，3個呈分泌形式且4個呈膜結合形式(如圖1中所示意性展示)。HLA-G之最重要功能同種型包含與b2-微球蛋白締合之HLA-G1及HLA-G5。然而，該等同種型之致耐受性免疫學效應係不同的且取決於配體形式(單體、二聚體)及配體-受體相互作用之親和力。

可使用標準分子生物學技術產生HLA-G蛋白。業內已知HLA-G同種型之核酸序列。例如參見基因庫登錄號AY359818。

HLA-G異構體形式促進經由ILT、尤其ILT2、ILT4或其組合之信號轉導。

ILT：ILT代表涉及調控免疫細胞活化且控制免疫細胞功能之活化及抑制受體之Ig類型(Borges, L.等人，Curr Top Microbial Immunol, 244:123-136 (1999))。ILT分類成三個群：(i)抑制型，其含有基於細胞質免疫受體酪胺酸之抑制基序(ITIM)且轉導抑制信號(ILT2、ILT3、ILT4、ILT5及LIR8)；(ii)活化型，其在跨膜結構域中含有短細胞質尾部及帶電胺基酸殘基(ILT1、ILT7、ILT8及LIR6α)且遞送活化信號穿過Fc受體之相關公共γ鏈之基於細胞質免疫受體酪胺酸之活化基序(ITAM)；及(iii)缺乏跨膜結構域之可溶性分子ILT6。諸多最新研究已突出顯示ILT對抗原呈遞細胞(APC)之表面之免疫調節作用。ILT2、ILT3及ILT4受體(最具特徵之免疫抑制受體)主要表現於骨髓樣及類漿細胞DC上。藉由將不成熟DC暴露於已知免疫抑制因子(包含IL-10、維他命D3或抑制性CD8 T細胞)來上調ILT3及ILT4 (Chang, C. C.等人，Nat Immunol, 3:237-243 (2002))。ILT在DC上之表現由發炎性刺激物、細胞介素及生長因子嚴格控制，且在DC活化後有所下調(Ju, X. S.等人，Gene, 331:159-164 (2004))。ILT2及ILT4受體之表現由組織蛋白乙醯化高度調控，此有助於排他性地嚴格控制骨髓樣細胞譜系中之基因表現(Nakajima, H., J Immunol, 171:6611-6620 (2003))。

抑制受體ILT2及ILT4之咬合改變了單核球之細胞介素及趨化介素分泌/釋放特徵且可抑制Fc受體信號傳導(Colonna, M.等人，J Leukoc Biol, 66:375-381 (1999))。ILT3在DC上作用及功能已由Suciu-Foca小組精確闡述(Suciu-Foca, N., Int Immunopharmacol, 5:7-11 (2005))。儘管ILT3之配體未知，但ILT4已知結合至HLA I類分子(HLA-A、HLA-B、HLA-C及HLA-G)之第三結構域，從而與CD8競爭結合MHC I類(Shiroishi, M., Proc Natl Acad Sci USA, 100:8856-8861 (2003))。若干抑制性ILT受體之優先配體係HLA-G。HLA-G在母胎耐受性及腫瘤細胞逃避免疫識別及破壞之機制中發揮潛在作用(Hunt, J. S.等人，Faseb J, 19:681-693 (2005))。最可能的是，藉由HLA-G-ILT相互作用來調控DC功能係DC生物學中之重要路徑。已測得，在經HLA-G處理且經同種異體T細胞刺激時，高度表現ILT2及ILT4受體之人類單核球源DC仍維持穩定致耐受性樣表型(CD80低、CD86低、HLA-DR低)且可能誘導T細胞無反應性(Ristich, V.等人，Eur J Immunol, 35:1133-1142 (2005))。此外，HLA-G與高度表現ILT2及ILT4受體之DC之相互作用會下調若干涉及MHC II類呈遞路徑之基因。由專職性APC大量表現之溶酶體硫醇還原酶：IFN-γ可誘導溶酶體硫醇還原酶(GILT)在經HLA-G修飾之DC中大大減少。經引發CD4+ T細胞之譜系可受GILT之DC表現影響，此乃因在靶向基因破壞之後缺乏GILT之動物中之活體內T細胞對所選抗原的反應有所減小(Marie, M.等人，Science, 294:1361-1365 (2001))。DC上之HLA-G/ILT相互作用會干擾MHC II類分子之組裝及至細胞表面之傳輸，此可使得結構異常之MHC II類分子之有效呈遞或表現變小經測定，HLA-G顯著降低不變鏈(CD74)、HLA-DMA及HLA-DMB基因在高度表現ILT抑制受體之人類單核球源DC上之轉錄(Ristich, V.等人，Eur J Immunol 35:1133-1142 (2005))。

HLA-G之另一受體係KIR2DL4，此乃因KIR2DL4結合至表現HLA-G之細胞(US2003232051；Cantoni, C.等人，Eur J Immunol 28 (1998) 1980；Rajagopalan, S.及E. O. Long. [出版更正呈現於J Exp Med 191 (2000) 2027中] J Exp Med 189 (1999) 1093；Ponte, M.等人，PNAS USA 96 (1999) 5674)。KIR2DL4 (亦稱為2DL4)係KIR家族成員(亦稱為CD158d)，其與活化受體及抑制受體共有結構特徵(Selvakumar, A.等人，Tissue Antigens 48 (1996) 285)。2DL4具有細胞質ITIM (暗示抑制性功能)，且在跨膜區中具有帶正電之胺基酸(活化KIR之典型特徵)。不同於其他選殖分佈之KIR，2DL4係由所有NK細胞轉錄(Valiante, N. M.等人，Immunity 7 (1997) 739；Cantoni, C.等人，Eur J Immunol 28 (1998) 1980；Rajagopalan, S.及E. O. Long. [出版更正呈現於J Exp Med 191 (2000) 2027中] J Exp Med 189 (1999) 1093)。

HLA-G亦展示在細胞毒性T細胞上與CD8相互作用(Sanders等人，J. Exp. Med., 1991)且誘導活化CD8陽性細胞毒性T細胞中之CD95介導之細胞凋亡(Fournel等人，J. Immun., 2000)。細胞毒性T細胞之此消除機制已報導為懷孕、發炎性疾病及癌症中之免疫逃避及耐受性誘導之機制之一(Amodio G.等人，Tissue Antigens, 2014)。

如本文中所使用，「不與以下各項交叉反應」或「不特異性結合」之抗-HLA-G抗體係指實質上並不結合至該等反抗原中之任一者之抗-HLA-G抗體：包括SEQ ID NO:44之經修飾人類HLA-G ß2M MHC I複合物；包括SEQ ID NO:45之小鼠H2Kd ß2M MHC I複合物；包括SEQ ID NO:47之大鼠RT1A ß2M MHC I複合物；包括SEQ ID NO:39及SEQ ID NO: 37之人類HLA-A2 ß2M MHC I複合物。在一實施例中，「不與以下各項交叉反應」或「不特異性結合」之抗-HLA-G抗體係指僅展示以K_D 值為5.0 × 10^-6 mol/l或更高之結合親和力之非特異性結合(直至不再可檢測到結合親和力)的抗-HLA-G抗體：包括SEQ ID NO:44之經修飾人類HLA-G ß2M MHC I複合物；包括SEQ ID NO:45之小鼠H2Kd ß2M MHC I複合物；包括SEQ ID NO:47之大鼠RT1A ß2M MHC I複合物；及/或包括SEQ ID NO:39及SEQ ID NO: 37之人類HLA-A2 ß2M MHC I複合物。利用標準結合分析(例如表面電漿共振技術(BIAcore®, GE-Healthcare Uppsala, Sweden))使用各別抗原來測定結合親和力：包括SEQ ID NO:44之經修飾人類HLA-G ß2M MHC I複合物；包括SEQ ID NO:45之小鼠H2Kd ß2M MHC I複合物；包括SEQ ID NO:47之大鼠RT1A ß2M MHC I複合物；及/或包括SEQ ID NO:39及SEQ ID NO: 37之人類HLA-A2 ß2M MHC I複合物。分析設置以及抗原之構築/製備闡述於實例中。

術語「抑制ILT2結合至JEG-3細胞(ATCC HTB36)上之HLAG」係指在如(例如)在實例6中所闡述之分析中抑制重組ILT2之結合相互作用。

術語「恢復HLA-G特異性抑制之免疫反應(restoration of HLA-G specific suppressed immune response或restore HLA-G specific suppressed immune response)」係指恢復與HLA-G表現細胞、尤其JEG-3細胞一起共培養之單核球之脂多醣(LPS)誘導之TNFα產生。因此，與未經處理之共培養JEG-3細胞相比，本發明抗體恢復表現HLA-G之JEG-3細胞(ATCC HTB36)及單核球之經脂多醣(LPS)刺激之共培養物中之TNFα的HLAG特異性釋放(未處理共培養物視為0%陰性參考；僅單核球之培養物視為100%陽性參考，其中TNFα分泌並不受任何HLA-G /IL-T2特異性效應抑制(參見實例7))。在此上下文中，「HLA-G特異性抑制之免疫反應」係指由JEG-3細胞上之HLA-G表現所致之單核球之免疫抑制。與之相比，本發明之抗-HLA-G抗體不能恢復與具有HLA-G敲除之JEG3細胞一起共培養之單核球之免疫反應。因其他商業抗-HLA-G能夠誘導與具有HLA-G敲除之JEG3細胞一起共培養之單核球之TNFα，故存在由該等抗體引起之非HLA-G特異性TNFα釋放。

出於本文目的，「受體人類框架」係包括源自人類免疫球蛋白框架或人類共有框架之輕鏈可變結構域(VL)框架或重鏈可變結構域(VH)框架之胺基酸序列之框架，如下文所定義。「源自」人類免疫球蛋白框架或人類共有框架之受體人類框架可包括其相同胺基酸序列，或其可含有胺基酸序列變化。在一些實施例中，胺基酸變化之數量為10或更小、9或更小、8或更小、7或更小、6或更小、5或更小、4或更小、3或更小或2或更小。在一些實施例中，VL受體人類框架之序列與VL人類免疫球蛋白框架序列或人類共有框架序列一致。所獲得抗體HLAG-0031之人類化變體之較佳VH受體人類框架係HUMAN_IGHV1-3。所獲得抗體HLAG-0031之人類化變體較佳之VL受體人類框架係HUMAN_IGKV1-17 (V-結構域，其中在位置R46F具有一個額外回復突變，Kabat編號)。

術語「抗體」在本文中係以最廣泛意義使用且涵蓋各種抗體結構，包含(但不限於)單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段，只要其展現期望抗原結合活性即可。

「抗體片段」係指除完整抗體外之分子，其包括完整抗體中結合完整抗體所結合之抗原的一部分。抗體片段之實例包含(但不限於) Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')₂ 、雙特異性抗體、直鏈抗體、單鏈抗體分子(例如scFv)及自抗體片段形成之多特異性抗體。

「結合至相同表位之抗體」 (作為參考抗體)係指在競爭分析中將參考抗體與其抗原之結合阻斷50%或更高的抗體，且相反地，參考抗體在競爭分析中將該抗體與其抗原之結合阻斷50%或更高。本文提供實例性競爭分析。

術語「嵌合」抗體係指重鏈及/或輕鏈之一部分源自特定來源或物種、而重鏈及/或輕鏈之其餘部分源自不同來源或物種的抗體。

抗體之「種類」係指其重鏈所具有之恆定結構域或恆定區之類型。存在5大類抗體：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且該等種類中之若干種可進一步分成子類(同型)，例如IgG₁ 、IgG₂ 、IgG₃ 、IgG₄ 、IgA₁ 及IgA₂ 。對應於不同種類之免疫球蛋白之重鏈恆定結構域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。

如本文中所使用，術語「細胞毒性劑」係指抑制或阻止細胞功能及/或引起細胞死亡或破壞之物質。細胞毒性劑包含(但不限於)放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu之放射性同位素)；化學治療劑或藥物(例如胺甲蝶呤(methotrexate)、阿黴素(adriamicin)、長春花生物鹼(vinca alkaloid) (長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、依託泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法侖(melphalan)、絲裂黴素C (mitomycin C)、瘤克寧(chlorambucil)、道諾黴素(daunorubicin)或其他嵌入劑)；生長抑制劑；酶及其片段，例如溶核酶；抗生素；毒素，例如來自細菌、真菌、植物或動物來源之小分子毒素或酶促活性毒素，包含其片段及/或變體；及下文所揭示之各種抗腫瘤劑或抗癌劑。

藥劑(例如醫藥調配物)之「有效量」係指在所需時間段內以所需劑量有效地達成期望治療或預防結果之量。

術語「Fc區」在本文中用於定義免疫球蛋白重鏈之含有恆定區之至少一部分的C末端區域。該術語包含天然序列Fc區及變體Fc區。在一實施例中，人類IgG重鏈Fc區自Cys226或自Pro230延伸至重鏈之羧基末端。然而，Fc區之C-末端離胺酸(Lys447)或C-末端甘胺酸(Gly446)及C-末端離胺酸(Lys447)可存在或可不存在。在一實施例中，如本文所闡述之抗-HLA-G抗體係IgG1同型且包括SEQ ID NO: 53或SEQ ID NO: 54之恆定重鏈結構域。在一實施例中，其另外包括C-末端甘胺酸(Gly446)。在一實施例中，其另外包括C-末端甘胺酸(Gly446)及C-末端離胺酸(Lys447)。在一實施例中，如本文所闡述之抗- HLA-G抗體係IgG4同型且包括SEQ ID NO: 55之恆定重鏈結構域。在一實施例中，其另外包括C-末端甘胺酸(Gly446)。在一實施例中，其另外包括C-末端甘胺酸(Gly446)及C-末端離胺酸(Lys447)。除非在本文中另外指出，否則Fc區或恆定區中胺基酸殘基之編號係根據亦稱為EU索引之EU編號系統，如Kabat, E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，國立衛生研究院(National Institutes of Health), Bethesda, MD (1991), NIH公開案91-3242中所闡述。

「框架」或「FR」係指除超變區(HVR)殘基外之可變結構域殘基。可變結構域之FR通常由4個FR結構域：FR1、FR2、FR3及FR4組成。因此，HVR及FR序列通常出現於VH (或VL)中之下列序列中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。

術語「全長抗體」、「完整抗體」及「全抗體」在本文中可互換使用，且係指具有實質上與天然抗體結構類似之結構或具有含有如本文所定義Fc區之重鏈的抗體。

術語「宿主細胞」、「宿主細胞系」及「宿主細胞培養物」可互換使用且係指向其中引入外源核酸之細胞，包含該等細胞之子代。宿主細胞包含「轉化體」及「經轉化細胞」，其包含原代經轉化細胞及源自其之子代(與傳代次數無關)。子代之核酸含量可與親代細胞並不完全相同，而是可含有突變。本文包含如經篩選或選擇用於原始經轉化細胞中之具有相同功能或生物活性的突變體子代。

「人類抗體」係具有對應於如下抗體之胺基酸序列的胺基酸序列者：其係由人類或人類細胞產生或源自利用人類抗體譜或其他編碼人類抗體之序列之非人類來源。此人類抗體之定義明確排除包括非人類抗原結合殘基之人類化抗體。

「人類共有框架」係表示在選擇人類免疫球蛋白VL或VH框架序列中最普遍存在之胺基酸殘基之框架。通常，人類免疫球蛋白VL或VH序列係來自可變結構域序列之亞組。通常，序列亞組係如Kabat, E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Bethesda MD (1991)，NIH公開案91-3242，第1-3卷中之亞組。在一實施例中，對於VL而言，亞組係如Kabat等人(見上文)中之亞組κI。在一實施例中，對於VH而言，該亞組係如Kabat等人(見上文)中之III亞組。

「人類化」抗體係指包含來自非人類HVR之胺基酸殘基及來自人類FR之胺基酸殘基的嵌合抗體。在某些實施例中，人類化抗體將包括實質上全部之至少一個及通常兩個可變結構域，其中全部或實質上全部之HVR (例如CDR)對應於非人類之彼等HVR，且全部或實質上全部之FR對應於人類抗體之彼等FR。人類化抗體視情況可包括源自人類抗體之抗體恆定區域的至少一部分。抗體之「人類化形式」 (例如非人類抗體)係指已經受人類化之抗體。

如本文中所使用，術語「超變區」或「HVR」係指抗體可變結構域之序列超變之區域(「互補決定區」或「CDR」)及/或形成結構上定義之環(「超變環」)及/或含有抗原接觸殘基(「抗原接觸點」)之各區域。通常，抗體包括6個HVR：3個在VH中(H1、H2、H3)，且3個在VL中(L1、L2、L3)。本文之實例性HVR包含：
(a) 在以下胺基酸殘基處出現之超變環：26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)及96-101 (H3) (Chothia及Lesk,J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))；
(b) 在以下胺基酸殘基處出現之CDR：24-34 (L1)、50-56 (L2)、89-97 (L3)、31-35b (H1)、50-65 (H2)及95-102 (H3) (Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest ，第5版，Public Health Service，國立衛生研究院，Bethesda, MD (1991))；
(c) 抗原接觸點，其出現於胺基酸殘基27c-36 (L1)、46-55 (L2)、89-96 (L3)、30-35b (H1)、47-58 (H2)及93-101 (H3)處(MacCallum等人，J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996))；及
(d) (a)、(b)及/或(c)之組合，包含HVR胺基酸殘基24-34 (L1)、50-56 (L2)、89-97 (L3)、31-35 (H1)、50-63 (H2)及95-102 (H3)。

除非另外指示，否則可變結構域中之HVR殘基及其他殘基(例如FR殘基)在本文中係根據Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest ，第5版，Public Health Service，國立衛生研究院，Bethesda, MD (1991)編號。

「免疫偶聯物」係偶聯至一或多個異源分子(包含(但不限於)細胞毒性劑)之抗體。

「個體(individual或subject)」係哺乳動物。哺乳動物包含(但不限於)家養動物(例如母牛、綿羊、貓、狗及馬)、靈長類動物(例如人類及非人類靈長類動物，例如猴)、兔及齧齒類動物(例如小鼠及大鼠)。在某些實施例中，個體(individual或subject)係人類。

「經分離」抗體係已與其天然環境中之組分分離者。在一些實施例中，將抗體純化至大於95%或99%之純度，如藉由例如電泳(例如SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或層析(例如離子交換或反相HPLC)所測定。關於評價抗體純度之方法之綜述，例如參見Flatman, S.等人，J. Chromatogr. B 848 (2007) 79-87。

「經分離」核酸係指已與其天然環境中之組分分離之核酸分子。經分離核酸包含通常含有核酸分子之細胞中所含的核酸分子，但該核酸分子存在於染色體外或存在於與其天然染色體位置不同之染色體位置處。

「編碼抗-HLA-G抗體之經分離核酸」係指編碼抗體重鏈及輕鏈(或其片段)之一或多個核酸分子，包含單一載體或單獨載體中之該(等)核酸分子及存在於宿主細胞中一或多個位置處之該(等)核酸分子。

本文所用之術語「單株抗體」係指自實質上同源抗體群體獲得之抗體，亦即，構成該群體之個別抗體一致及/或結合相同表位，可能之變體抗體除外，例如含有天然突變或在產生單株抗體製劑期間產生，該等變體通常以較小量存在。與通常包含針對不同決定簇(表位)之不同抗體之多株抗體製劑相比，單株抗體製劑之每一單株抗體針對抗原上之單一決定簇。因此，修飾語「單株」指示如自抗體之實質上同源之群體獲得之抗體特徵，且不應解釋為需要藉由任一特定方法產生抗體。舉例而言，擬用於本發明之單株抗體可藉由多種技術製得，包含(但不限於)雜交瘤方法、重組DNA方法、噬菌體顯示方法及利用含有所有或一部分人類免疫球蛋白基因座之轉基因動物之方法，該等方法及用於製備單株抗體之其他實例性方法闡述於本文中。

「天然抗體」係指具有不同結構之天然免疫球蛋白分子。舉例而言，天然IgG抗體係約150,000道爾頓(dalton)之異四聚體醣蛋白，其由二硫鍵鍵結之兩條相同輕鏈及兩條相同重鏈組成。自N末端至C末端，每一重鏈具有可變區(VH)，亦稱為可變重結構域或重鏈可變結構域，隨後為三個恆定結構域(CH1、CH2及CH3)。類似地，自N末端至C末端，每一輕鏈具有可變區(VL)，亦稱為可變輕結構域或輕鏈可變結構域，隨後為恆定輕(CL)結構域。基於抗體恆定結構域之胺基酸序列，可將該抗體之輕鏈指派為兩種類型中之一者，稱為卡帕(κ)及拉姆達(λ)。

術語「包裝插頁」用於係指通常包含於治療產品之商業包裝內之說明書，其含有關於適應症、用法、劑量、投與、組合療法、禁忌及/或關於治療產品之使用之警告的資訊。

就參考肽序列而言，「胺基酸序列一致性百分比(%)」定義為在比對序列並引入空位(視需要)以達到最大序列一致性百分比後候選序列中與參考肽序列中之胺基酸殘基一致之胺基酸殘基的百分比，且不將任何保守取代視為序列一致性之一部分。出於測定胺基酸序列一致性百分比之目的，可以熟習此項技術者所熟知之各種方式來達成比對，例如使用可公開獲得之電腦軟體，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可確定用於比對序列之合適參數，包含在所比較序列之全長範圍內達成最大比對所需之任何算法。然而，出於本文目的，使用序列對比電腦程式ALIGN-2來生成胺基酸序列一致性%之值。ALIGN-2序列對比電腦程式係由Genentech, Inc.設計，且原始碼已與使用者文件一起編入美國版權局，Washington D.C., 20559中，其中其以美國版權註冊號TXU510087註冊。ALIGN-2程式可自Genentech, Inc.，South San Francisco, California公開獲得，或可自源代碼進行編譯。ALIGN-2程式應經編譯在UNIX操作系統(包含數位UNIX V4.0D)上使用。所有序列對比參數皆由ALIGN-2程式設定且不變化。

在採用ALIGN-2進行胺基酸序列對比之情形下，給定胺基酸序列A相對於(to)、與(with)或對(against)給定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性%(或者可表達為相對於、與或對給定胺基酸序列B具有或包括一定胺基酸序列一致性%之給定胺基酸序列A)計算如下：
100 ×分數X/Y
其中X係在A與B之程式比對中由序列比對程式ALIGN-2評定為一致性匹配之胺基酸殘基數，且其中Y係B中胺基酸殘基之總數。應瞭解，若胺基酸序列A之長度不等於胺基酸序列B之長度，則A相對於B之胺基酸序列一致性%將不等於B相對於A之胺基酸序列一致性%。除非另外明確說明，否則本文所用之所有胺基酸序列一致性%的值皆係根據前面緊接段落中所闡述使用ALIGN-2電腦程式獲得。

術語「醫藥調配物」係指如下製劑：其所呈現形式允許其中所含活性成分之生物活性有效，且不含對將投與該調配物之個體具有不可接受毒性的額外組分。

「醫藥上可接受之載劑」係指醫藥調配物中除活性成分外之對個體無毒之成分。醫藥上可接受之載劑包含(但不限於)緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。

如本文中所使用，「治療(treatment)」 (及其語法變化形式，例如「治療(treat)」或「治療(treating)」)係指嘗試改變所治療個體之自然病程之臨床干預，且可出於預防目的或在臨床病理學病程期間實施。治療之期望效應包含(但不限於)預防疾病發生或復發、減輕症狀、減弱疾病之任何直接或間接病理結果、預防轉移、降低疾病進展速率、改善或緩和疾病狀態及緩解或改良預後。在一些實施例中，使用本發明抗體來延遲疾病發生或減緩疾病進展。

術語「可變區」或「可變結構域」係指抗體重鏈或輕鏈中參與抗體與抗原結合之結構域。天然抗體之重鏈及輕鏈之可變結構域(分別為VH及VL)通常具有類似結構，其中各結構域包含4個保守框架區(FR)及三個超變區(HVR)。(例如參見Kindt等人，Kuby Immunology，第6版，W.H. Freeman及Co., N.Y. (2007)，第91頁)單一VH或VL結構域可足以賦予抗原結合特異性。另外，結合特定抗原之抗體可使用來自結合該抗原之抗體之VH或VL結構域分離以分別篩選互補VL或VH結構域之庫。例如參見Portolano, S.等人，J. Immunol. 150 (1993) 880-887；Clackson, T.等人，Nature 352 (1991) 624-628)。

如本文中所使用，術語「載體」係指能夠轉運與其連接之另一核酸的核酸分子。該術語包含呈自複製核酸結構之載體以及納入引入其之宿主細胞基因體中的載體。某些載體能夠引導與其可操作地連接之核酸的表現。該等載體在本文中稱為「表現載體」。

I.組合物及方法在一態樣中，本發明部分地係基於如下發現：本發明之所選抗-HLA-G抗體以高特異性結合至HLA-G之某些表位(與其他物種及人類HLA-A共有序列無交叉反應性)，且能夠特異性抑制ILT2及或ILT4結合至HLA-G。其抑制(例如) ILT2結合至HLA-G且在適當刺激時藉由增加免疫調節細胞介素(如TNFα)之釋放來特異性恢復HLA-G介導之免疫抑制，且對HLAG敲除細胞並不展示效應。

在某些實施例中，提供結合至HLA-G之抗體。本發明抗體可(例如)用於診斷或治療癌症。

A.實例性抗-HLA-G抗體在一態樣中，本發明提供一種(經分離)抗體，其結合至人類HLA-G (抗-HLA-G抗體)並抑制ILT2結合至JEG-3細胞(ATCC HTB36)上之HLAG，且恢復與JEG-3細胞(ATCC HTB36)一起共培養之單核球之HLA-G特異性抑制之免疫反應(例如經抑制腫瘤壞死因子(TNF) α釋放)。因此，與未經處理之共培養JEG-3細胞相比，本發明抗體恢復表現HLA-G之JEG-3細胞(ATCC HTB36)及單核球之經脂多醣(LPS)刺激之共培養物中之TNFα的HLAG特異性釋放(未處理共培養物可視為0%陰性參考；僅單核球之培養物可視為100%陽性參考，其中TNFα分泌並不由任何HLA-G /IL-T2特異性效應抑制((參見實例7)。與之相比，本發明抗體不能恢復與具有HLA-G敲除之JEG3細胞一起共培養之單核球之免疫反應。

本發明之一實施例係結合至人類HLA-G之(經分離)抗體(在一實施例中，該抗體結合至包括SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合物)，其中該抗體包括
A) (a) HVR-H1，其包括SEQ ID NO:1之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包括SEQ ID NO:2之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包括SEQ ID NO:3之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包括SEQ ID NO:4之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包括SEQ ID NO:5之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包括SEQ ID NO:6之胺基酸序列；或
B) (a) HVR-H1，其包括SEQ ID NO:9之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包括SEQ ID NO:10之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包括SEQ ID NO:11之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包括SEQ ID NO:12之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包括SEQ ID NO:13之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包括SEQ ID NO:14之胺基酸序列；或
C) (a) HVR-H1，其包括SEQ ID NO:17之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包括SEQ ID NO:18之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包括SEQ ID NO:19之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包括SEQ ID NO:20之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包括SEQ ID NO:21之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包括SEQ ID NO:22之胺基酸序列；或
D) (a) HVR-H1，其包括SEQ ID NO:25之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包括SEQ ID NO:26之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包括SEQ ID NO:27之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包括SEQ ID NO:28之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包括SEQ ID NO:29之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包括SEQ ID NO:30之胺基酸序列。

本發明之一實施例係結合至人類HLA-G之(經分離)抗體(在一實施例中，該抗體結合至包括SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合物)，其中該抗體包括
A) (a) VH結構域，其包括：(i)包括SEQ ID NO:1之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包括SEQ ID NO:2之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii)包括選自SEQ ID NO:3之胺基酸序列之HVR-H3；及(b) VL結構域，其包括：(i)包括SEQ ID NO:4之胺基酸序列之HVR-L1；(ii)包括SEQ ID NO:5之胺基酸序列之HVR-L2，及(iii)包括SEQ ID NO:6之胺基酸序列之HVR-L3；或
B) (a) VH結構域，其包括：(i)包括SEQ ID NO:9之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包括SEQ ID NO:10之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii)包括選自SEQ ID NO:11之胺基酸序列之HVR-H3；及(b) VL結構域，其包括：(i)包括SEQ ID NO:12之胺基酸序列之HVR-L1；(ii)包括SEQ ID NO:13之胺基酸序列之HVR-L2，及(iii)包括SEQ ID NO:14之胺基酸序列之HVR-L3；或
C) (a) VH結構域，其包括：(i)包括SEQ ID NO:17之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包括SEQ ID NO:18之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii)包括選自SEQ ID NO:19之胺基酸序列之HVR-H3；及(b) VL結構域，其包括：(i)包括SEQ ID NO:20之胺基酸序列之HVR-L1；(ii)包括SEQ ID NO:21之胺基酸序列之HVR-L2，及(iii)包括SEQ ID NO:22之胺基酸序列之HVR-L3；或
D) (a) VH結構域，其包括：(i)包括SEQ ID NO:25之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包括SEQ ID NO:26之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii)包括選自SEQ ID NO:27之胺基酸序列之HVR-H3；及(b) VL結構域，其包括：(i)包括SEQ ID NO:28之胺基酸序列之HVR-L1；(ii)包括SEQ ID NO:29之胺基酸序列之HVR-L2，及(iii)包括SEQ ID NO:30之胺基酸序列之HVR-L3。

本發明之一實施例係結合至人類HLA-G之經分離抗體(在一實施例中，該抗體結合至包括SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合物)，其中該抗體
A)
i) 包括SEQ ID NO:7之VH序列及SEQ ID NO:8之VL序列；
ii) 或包括i)下抗體之VH及VL之人類化變體；或
iii) 包括SEQ ID NO:33之VH序列及SEQ ID NO:34之VL序列；或
B)
i) 包括SEQ ID NO:15之VH序列及SEQ ID NO:16之VL序列；或
C)
i) 包括SEQ ID NO:23之VH序列及SEQ ID NO:24之VL序列；或
D)
i) 包括SEQ ID NO:31之VH序列及SEQ ID NO:32之VL序列。

本發明之一實施例係結合至人類HLA-G之(經分離)抗體(在一實施例中，該抗體結合至包括SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合物)，其中該抗體包括
(a) HVR-H1，其包括SEQ ID NO:1之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包括SEQ ID NO:2之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包括SEQ ID NO:3之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包括SEQ ID NO:4之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包括SEQ ID NO:5之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包括SEQ ID NO:6之胺基酸序列。

本發明之一實施例係結合至人類HLA-G之(經分離)抗體(在一實施例中，該抗體結合至包括SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合物)，其中該抗體包括
(a) HVR-H1，其包括SEQ ID NO:9之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包括SEQ ID NO:10之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包括SEQ ID NO:11之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包括SEQ ID NO:12之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包括SEQ ID NO:13之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包括SEQ ID NO:14之胺基酸序列。

本發明之一實施例係結合至人類HLA-G之(經分離)抗體(在一實施例中，該抗體結合至包括SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合物)，其中該抗體包括
(a) HVR-H1，其包括SEQ ID NO:17之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包括SEQ ID NO:18之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包括SEQ ID NO:19之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包括SEQ ID NO:20之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包括SEQ ID NO:21之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包括SEQ ID NO:22之胺基酸序列。

本發明之一實施例係結合至人類HLA-G之(經分離)抗體(在一實施例中，該抗體結合至包括SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合物)，其中該抗體包括
(a) HVR-H1，其包括SEQ ID NO:25之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包括SEQ ID NO:26之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包括SEQ ID NO:27之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包括SEQ ID NO:28之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包括SEQ ID NO:29之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包括SEQ ID NO:30之胺基酸序列。

本發明之一實施例係結合至人類HLA-G之(經分離)抗體(在一實施例中，該抗體結合至包括SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合物)，其中該抗體包括
i) SEQ ID NO:7之VH序列及SEQ ID NO:8之VL序列；
ii) 或i)下抗體之VH及VL之人類化變體。

本發明之一實施例係結合至人類HLA-G之(經分離)抗體(在一實施例中，該抗體結合至包括SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合物)，其中該抗體包括
i) SEQ ID NO:33之VH序列及SEQ ID NO:34之VL序列。

本發明之一實施例係結合至人類HLA-G之(經分離)抗體(在一實施例中，該抗體結合至包括SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合物)，其中該抗體包括
SEQ ID NO:15之VH序列及SEQ ID NO:16之VL序列。

本發明之一實施例係結合至人類HLA-G之(經分離)抗體(在一實施例中，該抗體結合至包括SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合物)，其中該抗體包括
SEQ ID NO:23之VH序列及SEQ ID NO:24之VL序列。

本發明之一實施例係結合至人類HLA-G之(經分離)抗體(在一實施例中，該抗體結合至包括SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合物)，其中該抗體包括
SEQ ID NO:31之VH序列及SEQ ID NO:32之VL序列。

本發明之一實施例係結合至人類HLA-G之(經分離)抗體(在一實施例中，該抗體結合至包括SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合物)，其中該抗體包括
A) (a) VH結構域，其包括(i)包括SEQ ID NO:1之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包括SEQ ID NO:2之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii)包括SEQ ID NO:3之胺基酸序列之HVR-H3；且其中VH結構域包括與SEQ ID NO: 33之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (在一較佳實施例中98%或99%或100%)序列一致性之胺基酸序列；及(b) VL結構域，其包括(i)包括SEQ ID NO:4之胺基酸序列之HVR-L1；(ii)包括SEQ ID NO:5之胺基酸序列之HVR-L2，及(iii)包括SEQ ID NO:6之胺基酸序列之HVR-L3；且其中VL結構域包括與SEQ ID NO: 34之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (在一較佳實施例中98%或99%或100%)序列一致性之胺基酸序列；或
B) (a) VH結構域，其包括(i)包括SEQ ID NO:9之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包括SEQ ID NO:10之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii)包括選自SEQ ID NO:11之胺基酸序列之HVR-H3；且其中VH結構域包括與SEQ ID NO: 15之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (在一較佳實施例中98%或99%或100%)序列一致性之胺基酸序列；及(b) VL結構域，其包括(i)包括SEQ ID NO:12之胺基酸序列之HVR-L1；(ii)包括SEQ ID NO:13之胺基酸序列之HVR-L2，及(iii)包括SEQ ID NO:14之胺基酸序列之HVR-L3；且其中VL結構域包括與SEQ ID NO: 16之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (在一較佳實施例中98%或99%或100%)序列一致性之胺基酸序列；或
C) (a) VH結構域，其包括(i)包括SEQ ID NO:17之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包括SEQ ID NO:18之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii)包括選自SEQ ID NO:19之胺基酸序列之HVR-H3；且其中VH結構域包括與SEQ ID NO: 23之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (在一較佳實施例中98%或99%或100%)序列一致性之胺基酸序列；及(b) VL結構域，其包括(i)包括SEQ ID NO:20之胺基酸序列之HVR-L1；(ii)包括SEQ ID NO:21之胺基酸序列之HVR-L2，及(iii)包括SEQ ID NO:22之胺基酸序列之HVR-L3；且其中VL結構域包括與SEQ ID NO: 14之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (在一較佳實施例中98%或99%或100%)序列一致性之胺基酸序列；或
D) (a) VH結構域，其包括(i)包括SEQ ID NO:25之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包括SEQ ID NO:26之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii)包括選自SEQ ID NO:27之胺基酸序列之HVR-H3；且其中VH結構域包括與SEQ ID NO: 31之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (在一較佳實施例中98%或99%或100%)序列一致性之胺基酸序列；及(b) VL結構域，其包括(i)包括SEQ ID NO:28之胺基酸序列之HVR-L1；(ii)包括SEQ ID NO:29之胺基酸序列之HVR-L2，及(iii)包括SEQ ID NO:30之胺基酸序列之HVR-L3；且其中VL結構域包括與SEQ ID NO: 32之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (在一較佳實施例中98%或99%或100%)序列一致性之胺基酸序列。

本發明之一實施例係結合至人類HLA-G之(經分離)抗體(在一實施例中，該抗體結合至包括SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合物)，其中該抗體包括
(a) VH結構域，其包括：(i)包括SEQ ID NO:1之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包括SEQ ID NO:2之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii)包括SEQ ID NO:3之胺基酸序列之HVR-H3；及(b) VL結構域，其包括：(i)包括SEQ ID NO:4之胺基酸序列之HVR-L1；(ii)包括SEQ ID NO:5之胺基酸序列之HVR-L2，及(iii)包括SEQ ID NO:6之胺基酸序列之HVR-L3；且
其中該抗體以與包括SEQ ID NO:33之VH序列及SEQ ID NO:34之VL序列之抗體實質上相同(在一實施例中結合親和力之KD值小至多10倍，在一實施例中結合親和力之KD值小至多5倍)之結合親和力結合至包括SEQ ID NO: 43的HLA-G ß2M MHC I複合物(如在表面電漿共振分析中所測定)。

本發明之一實施例係結合至人類HLA-G之(經分離)抗體(在一實施例中，該抗體結合至包括SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合物)，其中該抗體包括
(a) VH結構域，其包括(i)包括SEQ ID NO:1之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包括SEQ ID NO:2之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii)包括SEQ ID NO:3之胺基酸序列之HVR-H3；且其中VH結構域包括與SEQ ID NO: 33之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (在一較佳實施例中98%或99%或100%)序列一致性之胺基酸序列；及(b) VL結構域，其包括(i)包括SEQ ID NO:4之胺基酸序列之HVR-L1；(ii)包括SEQ ID NO:5之胺基酸序列之HVR-L2，及(iii)包括SEQ ID NO:6之胺基酸序列之HVR-L3；且其中VL結構域包括與SEQ ID NO: 34之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (在一較佳實施例中98%或99%或100%)序列一致性之胺基酸序列；
且其中該抗體以與包括SEQ ID NO:33之VH序列及SEQ ID NO:34之VL序列之抗體實質上相同(在一實施例中結合親和力之KD值小至多10倍，在一實施例中結合親和力之KD值小至多5倍)之結合親和力結合至包括SEQ ID NO: 43的HLA-G ß2M MHC I複合物(如在表面電漿共振分析中所測定)；及或
其中該抗體之特徵獨立地在於下列性質：抗-HLA-G抗體
a) 並不與包括SEQ ID NO:44之經修飾人類HLA-G ß2M MHC I複合物交叉反應；及/或
b) 並不與包括SEQ ID NO:39及SEQ ID NO: 37之人類HLA-A2 ß2M MHC I複合物交叉反應；及/或
c) 並不與包括SEQ ID NO:45之小鼠H2Kd ß2M MHC I複合物交叉反應；及/或
d) 並不與包括SEQ ID NO:47之大鼠RT1A ß2M MHC I複合物交叉反應；及/或
e) 抑制ILT2結合至單體HLA-G ß2M MHC I複合物(包括SEQ ID NO: 43)；及/或
f) 將ILT2與三聚體HLA-G ß2M MHC I複合物(包括SEQ ID NO: 43)之結合抑制50%以上(在一實施例中60%以上) (與無抗體之結合相比) (參見實例4b)；及/或
g) 將ILT2與單體及/或二聚體及/或三聚體HLA-G ß2M MHC I複合物(包括SEQ ID NO: 43)之結合抑制50%以上(在一實施例中80%以上) (與無抗體之結合相比) (參見實例4b)；及/或
h) 抑制ILT2結合至JEG3細胞(ATCC編號HTB36)上之HLA-G (50%以上(在一實施例中80%以上)) (與無抗體之結合相比) (參見實例6)；及/或
i) 結合至JEG3細胞(ATCC編號HTB36)上之HLA-G (參見實例5)，且抑制ILT2結合至JEG3細胞(ATCC編號HTB36)上之HLA-G (50%以上(在一實施例中80%以上)) (與無抗體之結合相比) (參見實例6)；及/或
j) 將CD8a與HLAG之結合抑制80%以上(與無抗體之結合相比) (例如參見實例4c)；及/或
k)恢復與JEG-3細胞(ATCC HTB36)一起共培養之單核球之HLA-G特異性抑制之免疫反應(例如經抑制腫瘤壞死因子(TNF) α釋放)。

本發明之一個實施例係結合至人類HLA-G之(經分離)抗體(在一個實施例中，該抗體結合至包括SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合物)，其中該抗體與包括SEQ ID NO:33之VH序列及SEQ ID NO:34之VL序列之抗體結合至相同表位。

本發明之一個實施例係結合至人類HLA-G之(經分離)抗體(在一個實施例中，該抗體結合至包括SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合物)，其中該抗體包括
(a) VH結構域，其包括：(i)包括SEQ ID NO:9之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包括SEQ ID NO:10之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii)包括SEQ ID NO:11之胺基酸序列之HVR-H3；及(b) VL結構域，其包括：(i)包括SEQ ID NO:12之胺基酸序列之HVR-L1；(ii)包括SEQ ID NO:13之胺基酸序列之HVR-L2，及(iii)包括SEQ ID NO:14之胺基酸序列之HVR-L3；且
其中該抗體結合至包括SEQ ID NO: 43的HLA-G ß2M MHC I複合物之結合親和力與包括SEQ ID NO:15之VH序列及SEQ ID NO:16之VL序列之抗體實質上相同(在一個實施例中結合親和力之KD值相比減小最多10倍，在一個實施例中結合親和力之KD值相比減小最多5倍)(如在表面電漿共振分析中所測定)。

本發明之一個實施例係結合至人類HLA-G之(經分離)抗體(在一個實施例中該抗體結合至包括SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合物)，其中該抗體包括
(a) VH結構域，其包括(i)包括SEQ ID NO:9之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包括SEQ ID NO:10之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii)包括SEQ ID NO:11之胺基酸序列之HVR-H3；且其中VH結構域包括與SEQ ID NO: 15之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (在一個較佳實施例中98%或99%或100%)序列一致性之胺基酸序列；及(b) VL結構域，其包括(i)包括SEQ ID NO:12之胺基酸序列之HVR-L1；(ii)包括SEQ ID NO:13之胺基酸序列之HVR-L2，及(iii)包括SEQ ID NO:14之胺基酸序列之HVR-L3；且其中VL結構域包括與SEQ ID NO: 16之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (在一個較佳實施例中98%或99%或100%)序列一致性之胺基酸序列；
且其中該抗體結合至包括SEQ ID NO: 43的HLA-G ß2M MHC I複合物之結合親和力與包括SEQ ID NO:15之VH序列及SEQ ID NO:16之VL序列之抗體實質上相同(在一個實施例中結合親和力之KD值相比減小最多10倍，在一個實施例中結合親和力之KD值相比減小最多5倍)(如在表面電漿共振分析中所測定)；及/或
其中該抗體之特徵獨立地在於下列性質：抗-HLA-G抗體
a) 並不與包括SEQ ID NO:44之經修飾人類HLA-G ß2M MHC I複合物交叉反應；及/或
b) 並不與包括SEQ ID NO:39及SEQ ID NO: 37之人類HLA-A2 ß2M MHC I複合物交叉反應；及/或
c) 並不與包括SEQ ID NO:45之小鼠H2Kd ß2M MHC I複合物交叉反應；及/或
d) 並不與包括SEQ ID NO:47之大鼠RT1A ß2M MHC I複合物交叉反應；及/或
e) 抑制ILT2結合至單體HLA-G ß2M MHC I複合物(包括SEQ ID NO: 43)；及/或
f) 將ILT2與三聚體HLA-G ß2M MHC I複合物(包括SEQ ID NO: 43)之結合抑制50%以上(在一實施例中60%以上) (與無抗體之結合相比) (參見實例4b)；及/或
g) 將ILT2與單體及/或二聚體及/或三聚體HLA-G ß2M MHC I複合物(包括SEQ ID NO: 43)之結合抑制50%以上(在一實施例中80%以上) (與無抗體之結合相比) (參見實例4b)；及/或
h) 抑制ILT2結合至JEG3細胞(ATCC編號HTB36)上之HLA-G (50%以上(在一實施例中80%以上)) (與無抗體之結合相比) (參見實例6)；及/或
i) 結合至JEG3細胞(ATCC編號HTB36)上之HLA-G (參見實例5)，且抑制ILT2結合至JEG3細胞(ATCC編號HTB36)上之HLA-G (50%以上(在一實施例中80%以上)) (與無抗體之結合相比) (參見實例6)；及/或
j) 將CD8a與HLAG之結合抑制80%以上(與無抗體之結合相比) (例如參見實例4c)；及/或
k) 恢復與JEG-3細胞(ATCC HTB36)一起共培養之單核球之HLA-G特異性抑制之免疫反應(例如經抑制腫瘤壞死因子(TNF) α釋放)。

本發明之一實施例係結合至人類HLA-G之經(經分離)抗體(在一實施例中，該抗體結合至包括SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合物)，其中該抗體與包括SEQ ID NO:15之VH序列及SEQ ID NO:16之VL序列之抗體結合至相同表位。

本發明之一實施例係結合至人類HLA-G之(經分離)抗體(在一實施例中，該抗體結合至包括SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合物)，其中該抗體包括
(a) VH結構域，其包括：(i)包括SEQ ID NO:17之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包括SEQ ID NO:18之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii)包括SEQ ID NO:19之胺基酸序列之HVR-H3；及(b) VL結構域，其包括：(i)包括SEQ ID NO:20之胺基酸序列之HVR-L1；(ii)包括SEQ ID NO:21之胺基酸序列之HVR-L2，及(iii)包括SEQ ID NO:22之胺基酸序列之HVR-L3；且
其中該抗體以與包括SEQ ID NO:23之VH序列及SEQ ID NO:24之VL序列之抗體實質上相同(在一實施例中結合親和力之KD值小至多10倍，在一實施例中結合親和力之KD值小至多5倍)之結合親和力結合至包括SEQ ID NO: 43的HLA-G ß2M MHC I複合物(如在表面電漿共振分析中所測定)。

本發明之一實施例係結合至人類HLA-G之(經分離)抗體(在一實施例中，該抗體結合至包括SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合物)，其中該抗體包括
(a) VH結構域，其包括(i)包括SEQ ID NO:17之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包括SEQ ID NO:18之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii)包括SEQ ID NO:19之胺基酸序列之HVR-H3；且其中VH結構域包括與SEQ ID NO: 23之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (在一較佳實施例中98%或99%或100%)序列一致性之胺基酸序列；及(b) VL結構域，其包括(i)包括SEQ ID NO:20之胺基酸序列之HVR-L1；(ii)包括SEQ ID NO:21之胺基酸序列之HVR-L2，及(iii)包括SEQ ID NO:22之胺基酸序列之HVR-L3；且其中VL結構域包括與SEQ ID NO: 24之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (在一較佳實施例中98%或99%或100%)序列一致性之胺基酸序列；
且其中該抗體以與包括SEQ ID NO:23之VH序列及SEQ ID NO:24之VL序列之抗體實質上相同(在一實施例中結合親和力之KD值小至多10倍，在一實施例中結合親和力之KD值小至多5倍)之結合親和力結合至包括SEQ ID NO: 43的HLA-G ß2M MHC I複合物(如在表面電漿共振分析中所測定)；及/或
其中該抗體之特徵獨立地在於下列性質：抗-HLA-G抗體
a) 並不與包括SEQ ID NO:44之經修飾人類HLA-G ß2M MHC I複合物交叉反應；及/或
b) 並不與包括SEQ ID NO:39及SEQ ID NO: 37之人類HLA-A2 ß2M MHC I複合物交叉反應；及/或
c) 並不與包括SEQ ID NO:45之小鼠H2Kd ß2M MHC I複合物交叉反應；及/或
e) 並不與包括SEQ ID NO:47之大鼠RT1A ß2M MHC I複合物交叉反應；及/或
f) 抑制ILT2結合至單體HLA-G ß2M MHC I複合物(包括SEQ ID NO: 43)；及/或
g) 將ILT2與三聚體HLA-G ß2M MHC I複合物(包括SEQ ID NO: 43)之結合抑制50%以上(在一實施例中60%以上) (與無抗體之結合相比) (參見實例4b)；及/或
h) 將ILT2與單體及/或二聚體及/或三聚體HLA-G ß2M MHC I複合物(包括SEQ ID NO: 43)之結合抑制50%以上(在一實施例中80%以上) (與無抗體之結合相比) (參見實例4b)；及/或
i) 抑制ILT2結合至JEG3細胞(ATCC編號HTB36)上之HLA-G (50%以上(在一實施例中80%以上)) (與無抗體之結合相比) (參見實例6)；及/或
j) 結合至JEG3細胞(ATCC編號HTB36)上之HLA-G (參見實例5)，且抑制ILT2結合至JEG3細胞(ATCC編號HTB36)上之HLA-G (50%以上(在一實施例中80%以上)) (與無抗體之結合相比) (參見實例6)；及/或
k) 將CD8a與HLAG之結合抑制80%以上(與無抗體之結合相比) (例如參見實例4c)；及/或
l) 恢復與JEG-3細胞(ATCC HTB36)一起共培養之單核球之HLA-G特異性抑制之免疫反應(例如經抑制腫瘤壞死因子(TNF) α釋放)。

本發明之一實施例係結合至人類HLA-G之經(經分離)抗體(在一實施例中，該抗體結合至包括SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合物)，其中該抗體與包括SEQ ID NO:23之VH序列及SEQ ID NO:24之VL序列之抗體結合至相同表位。

本發明之一實施例係結合至人類HLA-G之(經分離)抗體(在一實施例中，該抗體結合至包括SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合物)，其中該抗體包括
(a) VH結構域，其包括：(i)包括SEQ ID NO:25之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包括SEQ ID NO:26之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii)包括SEQ ID NO:27之胺基酸序列之HVR-H3；及(b) VL結構域，其包括：(i)包括SEQ ID NO:28之胺基酸序列之HVR-L1；(ii)包括SEQ ID NO:29之胺基酸序列之HVR-L2，及(iii)包括SEQ ID NO:30之胺基酸序列之HVR-L3；且
其中該抗體以與包括SEQ ID NO:31之VH序列及SEQ ID NO:32之VL序列之抗體實質上相同(在一實施例中結合親和力之KD值小至多10倍，在一實施例中結合親和力之KD值小至多5倍)之結合親和力結合至包括SEQ ID NO: 43的HLA-G ß2M MHC I複合物(如在表面電漿共振分析中所測定)。

本發明之一實施例係結合至人類HLA-G之(經分離)抗體(在一實施例中，該抗體結合至包括SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合物)，其中該抗體包括
(a) VH結構域，其包括(i)包括SEQ ID NO:25之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包括SEQ ID NO:26之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii)包括SEQ ID NO:27之胺基酸序列之HVR-H3；且其中VH結構域包括與SEQ ID NO: 31之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (在一較佳實施例中98%或99%或100%)序列一致性之胺基酸序列；及(b) VL結構域，其包括(i)包括SEQ ID NO:28之胺基酸序列之HVR-L1；(ii)包括SEQ ID NO:29之胺基酸序列之HVR-L2，及(iii)包括SEQ ID NO:30之胺基酸序列之HVR-L3；且其中VL結構域包括與SEQ ID NO: 32之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (在一較佳實施例中98%或99%或100%)序列一致性之胺基酸序列；
且其中該抗體以與包括SEQ ID NO:31之VH序列及SEQ ID NO:32之VL序列之抗體實質上相同(在一實施例中結合親和力之KD值小至多10倍，在一實施例中結合親和力之KD值小至多5倍)之結合親和力結合至包括SEQ ID NO: 43的HLA-G ß2M MHC I複合物(如在表面電漿共振分析中所測定)；及或
其中該抗體之特徵獨立地在於下列性質：抗-HLA-G抗體
a) 並不與包括SEQ ID NO:44之經修飾人類HLA-G ß2M MHC I複合物交叉反應；及/或
b) 並不與包括SEQ ID NO:39及SEQ ID NO: 37之人類HLA-A2 ß2M MHC I複合物交叉反應；及/或
c) 並不與包括SEQ ID NO:45之小鼠H2Kd ß2M MHC I複合物交叉反應；及/或
d) 並不與包括SEQ ID NO:47之大鼠RT1A ß2M MHC I複合物交叉反應；及/或
e) 抑制ILT2結合至單體HLA-G ß2M MHC I複合物(包括SEQ ID NO: 43)；及/或
f) 將ILT2與三聚體HLA-G ß2M MHC I複合物(包括SEQ ID NO: 43)之結合抑制50%以上(在一實施例中60%以上) (與無抗體之結合相比) (參見實例4b)；及/或
g) 將ILT2與單體及/或二聚體及/或三聚體HLA-G ß2M MHC I複合物(包括SEQ ID NO: 43)之結合抑制50%以上(在一實施例中80%以上) (與無抗體之結合相比) (參見實例4b)；及/或
h) 抑制ILT2結合至JEG3細胞(ATCC編號HTB36)上之HLA-G (50%以上(在一實施例中80%以上)) (與無抗體之結合相比) (參見實例6)；及/或
i) 結合至JEG3細胞(ATCC編號HTB36)上之HLA-G (參見實例5)，且抑制ILT2結合至JEG3細胞(ATCC編號HTB36)上之HLA-G (50%以上(在一實施例中80%以上)) (與無抗體之結合相比) (參見實例6)；及/或
j) 將CD8a與HLAG之結合抑制80%以上(與無抗體之結合相比) (例如參見實例4c)；及/或
k) 恢復與JEG-3細胞(ATCC HTB36)一起共培養之單核球之HLA-G特異性抑制之免疫反應(例如經抑制腫瘤壞死因子(TNF) α釋放)。

本發明之一實施例係結合至人類HLA-G之經(經分離)抗體(在一實施例中，該抗體結合至包括SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合物)，其中該抗體與包括SEQ ID NO:31之VH序列及SEQ ID NO:32之VL序列之抗體結合至相同表位。

在本發明之一實施例中，抗體係IgG1同型。在本發明之一實施例中，抗體係具有突變L234A、L235A及P329G (根據Kabat之EU索引編號)之IgG1同型。

在另一態樣中，上文任一實施例之抗--HLA-G抗體可單獨或組合納入任一特徵，如下文在第1-7部分中所闡述：

1.抗體親和力在某些實施例中，本文所提供抗體之解離常數KD為≤ 1μM、≤ 100 nM、≤ 10 nM、≤ 1 nM、≤ 0.1 nM、≤ 0.01 nM或≤ 0.001 nM (例如10^-8 M或更小，例如10^-8 M至10^-13 M，例如10^-9 M至10^-13 M)。

在一較佳實施例中，使用表面電漿共振分析使用BIACORE^® )在25℃下利用約10個反應單位(RU)下之經固定抗原CM5晶片來量測KD。簡言之，根據供應商說明書使用N-乙基-N’-(3-二甲基胺基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)來活化羧甲基化之葡聚糖生物感測器晶片(CM5，BIACORE, Inc.)。使用10 mM乙酸鈉(pH 4.8)將抗原稀釋至5 μg/ml (約0.2 μM)，然後以5 μl/分鐘之流速注射以達成約10反應單位(RU)之偶合蛋白。在注射抗原後，注射1 M乙醇胺以阻斷未反應之基團。對於動力學量測，在25℃下以約25 μl/min之流速注射Fab於含有0.05%聚山梨醇酯20 (TWEEN-20^TM )表面活性劑之PBS (PBST)中之兩倍連續稀釋液(0.78 nM至500 nM)。締合速率(k_締合或ka)及解離速率(k_解離或kd)係使用簡單一對一蘭格繆爾結合模型(Langmuir binding model) (BIACORE^® 評估軟體3.2版)藉由同時擬合結合及解離感測圖來計算。以比率kd/ka (k_解離 /k_締合 )之形式來計算平衡解離常數KD。例如參見Chen Y.等人，J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881。若藉由上述表面電漿共振分析測得之上速率超過10⁶ M^-1 S^-1 ，則締合速率可藉由使用螢光猝滅技術進行測定，該技術在25℃下於增加濃度之抗原存在下量測於PBS (pH 7.2)中之20 nM抗抗原抗體(Fab形式)之螢光發射強度的增加或降低(激發波長= 295 nm；發射波長= 340 nm，16 nm帶通)，如於分光光度計中所量測，例如帶有攪拌比色杯之停流裝備之分光光度計(Aviv Instruments)或8000-系列SLM- AMINCO^TM 分光光度計(ThermoSpectronic)。

2. 抗體片段在某些實施例中，本文所提供之抗體係抗體片段。抗體片段包含(但不限於) Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)₂ 、Fv及scFv片段及下文所闡述之其他片段。關於某些抗體片段之綜述，可參見Hudson等人，Nat. Med. 9 (2003) 129-134。關於scFv片段之綜述，可例如參見Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore (編輯)，Springer-Verlag, New York (1994), pp. 269-315；亦參見WO 93/16185及美國專利第5,571,894號及第5,587,458號。關於包括補救受體結合表位殘基且具有延長之活體內半衰期之Fab及F(ab')₂ 片段之論述，參見美國專利第5,869,046號。

雙價抗體係具有兩個抗原結合位點之可為二價或雙特異性之抗體片段。例如參見EP 0 404 097；WO 1993/01161；Hudson, P.J.等人，Nat. Med. 9 (2003) 129-134；及Holliger, P.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448。三價抗體及四價抗體亦闡述於Hudson, P.J.等人，Nat. Med. 9 (20039 129-134)中。

單一結構域抗體係包括抗體中重鏈可變結構域之全部或一部分或輕鏈可變結構域之全部或一部分的抗體片段。在某些實施例中，單一結構域抗體係人類單一結構域抗體(Domantis, Inc., Waltham, MA；例如參見美國專利第6,248,516 B1號)。

可藉由各種技術來製備抗體片段，包含(但不限於)蛋白水解消化完整抗體以及藉由重組宿主細胞(例如大腸桿菌(E. coli )或噬菌體)來產生，如本文所闡述。

3. 嵌合及人類化抗體在某些實施例中，本文所提供抗體係嵌合抗體。某些嵌合抗體闡述於(例如)美國專利第4,816,567號；及Morrison, S.L.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 (1984) 6851-6855)中。在一實例中，嵌合抗體包括非人類可變區(例如源自小鼠、大鼠、倉鼠、兔或非人類靈長類動物(例如猴子)之可變區)及人類恆定區。在另一實例中，嵌合抗體係種類或亞類已自親代抗體發生變化之「種類轉換」抗體。嵌合抗體包含其抗原結合片段。

在某些實施例中，嵌合抗體係人類化抗體。通常，將非人類抗體人類化以降低對人類之免疫原性，同時保留親代非人類抗體之特異性及親和力。通常，人類化抗體包括一或多個可變結構域，其中HVR (例如CDR) (或其部分)係源自非人類抗體，且FR (或其部分)係源自人類抗體序列。人類化抗體視情況亦將包括人類恆定區之至少一部分。在一些實施例中，人類化抗體中之一些FR殘基經來自非人類抗體(例如產生HVR殘基之抗體)之相應殘基取代以(例如)恢復或改良抗體特異性或親和力。

人類化抗體及其製備方法綜述於(例如) Almagro, J.C.及Fransson J.，Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633中，且進一步闡述於(例如)以下文獻中：Riechmann, I.等人，Nature 332 (1988) 323-329；Queen, C.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033；美國專利第5,821,337號、第7,527,791號、第6,982,321號及第7,087,409號；Kashmiri, S.V.等人，Methods 36 (2005) 25-34 (闡述SDR (a-CDR)接枝)；Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498 (闡述「表面重塑」)；Dall’Acqua, W.F.等人，Methods 36 (2005) 43-60 (闡述「FR改組」)；及Osbourn, J.等人，Methods 36 (2005) 61-68及Klimka, A.等人，Br. J. Cancer, 83 (2000) 252-260 (闡述FR改組之「導向選擇」方式)。

可用於人類化之人類框架區包含(但不限於)：使用「最佳擬合」方法選擇之框架區(例如參見Sims, M.J.等人，J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308)；源自具有輕鏈或重鏈可變區之特定亞組之人類抗體之共有序列的框架區(例如參見Carter, P.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289；及Presta, L.G.等人，J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632)；人類成熟(體細胞突變)框架區或人類種系框架區(例如參見Almagro, J.C.及Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633)；及源自篩選用FR庫之框架區(例如參見Baca, M.等人，J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684及Rosok, M.J.等人，J. Biol. Chem. 271 (19969 22611-22618)。

4. 人類抗體在某些實施例中，本文所提供抗體係人類抗體。可使用業內已知之各種技術來產生人類抗體。人類抗體通常闡述於van Dijk及van de Winkel, J.G. Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374及Lonberg, N., Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 450-459中。

可藉由向轉基因動物投與免疫原來製備人類抗體，該轉基因動物已經改良以產生完整人類抗體或具有因應於抗原性攻擊之人類可變區的完整抗體。該等動物通常含有人類免疫球蛋白基因座之全部或一部分，該等基因座代替內源性免疫球蛋白基因座，或存在於染色體外或隨機整合至動物染色體中。在該等轉基因小鼠中，內源性免疫球蛋白基因座通常已不活化。關於自轉基因動物獲得人類抗體之方法的綜述，參見Lonberg, N., Nat. Biotech. 23 (2005) 1117-1125。例如亦參見美國專利第6,075,181號及第6,150,584號，其闡述XENOMOUSE^TM 技術；美國專利第5,770,429號，其闡述H_U M_AB ®技術；美國專利第7,041,870號，其闡述K-M MOUSE®技術；及美國專利申請公開案第US 2007/0061900號，其闡述V_ELOCI M_OUSE ®技術。可進一步(例如)藉由與不同人類恆定區組合來修飾由該等動物產生之完整抗體的人類可變區。

人類抗體亦可藉由基於雜交瘤之方法來製備。已闡述用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類異源骨髓瘤細胞系。(例如參見Kozbor, D., J. Immunol. 133 (1984) 3001-3005；Brodeur, B.R.等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York (1987), pp.51-63；及Boerner, P.等人，J. Immunol. 147 (1991) 86-95)。經由人類B細胞雜交瘤技術生成之人類抗體亦闡述於Li, J.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006) 3557-3562中。其他方法包含闡述於(例如)美國專利第7,189,826號(闡述自雜交瘤細胞系產生單株人類IgM抗體)及Ni, J., Xiandai Mianyixue 26 (2006) 265-268 (闡述人類-人類雜交瘤)中者。人類雜交瘤技術(三體瘤(Trioma)技術)亦闡述於Vollmers, H.P.及Brandlein, S., Histology and Histopathology 20 (2005) 927-937及Vollmers, H.P.及Brandlein, S., Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27 (2005) 185-191中。

人類抗體亦可藉由分離選自人類源性噬菌體顯示庫之Fv純系可變結構域序列來生成。隨後，該等可變結構域序列可與期望之人類恆定結構域組合。自抗體庫選擇人類抗體之技術闡述於下文中。

5. 庫源性抗體可藉由自組合庫篩選具有一或多種期望活性之抗體來分離本發明抗體。舉例而言，業內已知用於產生噬菌體顯示庫及自該等庫篩選具有期望結合特性之抗體的眾多種方法。該等方法綜述於(例如) Hoogenboom, H.R.等人，Methods in Molecular Biology 178 (2001) 1-37中且進一步闡述於(例如)以下文獻中：McCafferty, J.等人，Nature 348 (1990) 552-554；Clackson, T.等人，Nature 352 (1991) 624-628；Marks, J.D.等人，J. Mol. Biol. 222 (1992) 581-597；Marks, J.D.及Bradbury, A., Methods in Molecular Biology 248 (2003) 161-175；Sidhu, S.S.等人，J. Mol. Biol. 338 (2004)299-310；Lee, C.V.等人，J. Mol. Biol. 340 (2004) 1073-1093；Fellouse, F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 12467-12472；及Lee, C.V.等人，J. Immunol. Methods 284 (2004)119-132。

在某些噬菌體顯示方法中，藉由聚合酶鏈反應(PCR)單獨選殖VH及VL基因譜且在噬菌體庫中隨機重組，然後可針對結合抗原之噬菌體篩選該等噬菌體庫，如Winter, G.等人，Ann. Rev. Immunol. 12 (1994) 433-455中所闡述。噬菌體通常展示抗體片段，如單鏈Fv (scFv)片段或如Fab片段。來自免疫化源之庫可向免疫原提供高親和力抗體而無需構築雜交瘤。或者，可對天然譜進行選殖(例如自人類)以不經任何免疫即提供針對眾多種非自體抗原亦及自體抗原之抗體之單一來源，如Griffiths, A.D.等人，EMBO J. 12 (1993) 725-734中所闡述。最後，亦可藉由以下方式合成製備天然庫：自幹細胞選殖未重排V-基因區段，且使用含有隨機序列之PCR引子編碼高可變CDR3區並完成活體外重排，如Hoogenboom, H.R.及Winter, G., J. Mol. Biol.227 (1992) 381-388中所闡述。闡述人類抗體噬菌體庫之專利公開案包括(例如)：美國專利第5,750,373號及美國專利公開案第2005/0079574號、第2005/0119455號、第2005/0266000號、第2007/0117126號、第2007/0160598號、第2007/0237764號、第2007/0292936號及第2009/0002360號。

在本文中將自人類抗體庫分離之抗體或抗體片段視為人類抗體或人類抗體片段。

6. 多特異性抗體在某些實施例中，本文所提供之抗體係多特異性抗體，例如雙特異性抗體。多特異性抗體係對至少兩個不同位點具有結合特異性之單株抗體。在某些實施例中，結合特異性中之一者係關於HLA-G且另一者係關於任一其他抗原。雙特異性抗體可以全長抗體或抗體片段形式來製備。

製備多特異性抗體之技術包含(但不限於)重組共表現兩個具有不同特異性之免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(參見Milstein, C.及Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540、WO 93/08829及Traunecker, A.等人，EMBO J. 10 (1991) 3655-3659)及「隆凸與孔洞(knob-in-hole)」改造(例如參見美國專利第5,731,168號)。亦可藉由以下方式來製備多特異性抗體：改造靜電轉向效應(electrostatic steering effect)用於製備抗體Fc-異源二聚體分子(WO 2009/089004)；使兩個或兩個以上抗體或片段交聯(例如參見美國專利第4,676,980號，及Brennan, M.等人，Science 229 (1985) 81-83)；使用白胺酸拉鍊以產生雙特異性抗體(例如參見Kostelny, S.A.等人，J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553)；使用「二價抗體」技術用於製備雙特異性抗體片段(例如參見Holliger, P.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448)；及使用單鏈Fv (sFv)二聚體(例如參見Gruber, M等人，J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374)；及製備三特異性抗體(如(例如) Tutt, A.等人，J. Immunol. 147 (1991) 60-69中所闡述)。

本文亦包含經改造以具有三個或更多個功能抗原結合位點之抗體(包含「章魚抗體」) (例如參見US 2006/0025576)。

本文之抗體或片段亦包含含有結合至HLA-G以及另一不同抗原之抗原結合位點的「雙重作用之FAb」或「DAF」 (例如參見US 2008/0069820)。

本文中之抗體或片段亦包含以下文獻中所述之多特異性抗體：WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253、WO 2009/ 080254、WO 2010/112193、WO 2010/115589、WO 2010/136172、WO 2010/145792及WO 2010/145793、WO2011/117330、WO2012/025525、WO2012/025530、WO2013/026835、WO2013/026831、WO2013/164325或WO 2013/174873。

7. 抗體變體在某些實施例中，涵蓋本文提供抗體之胺基酸序列變體。舉例而言，可能期望改良抗體之結合親和力及/或其他生物學性質。抗體之胺基酸序列變體可藉由向編碼抗體之核苷酸序列中引入適當修飾或藉由肽合成來製備。該等修飾包含(例如)抗體胺基酸序列內殘基之缺失及/或插入及/或取代。可實施缺失、插入及取代之任一組合以獲得最終構築體，條件係最終構築體具有期望特性，例如抗原結合性。

a)取代、插入及缺失變體在某些實施例中，提供具有一或多個胺基酸取代之抗體變體。用於取代突變誘發之所關注位點包含HVR及FR。實例性變化提供於表1之「實例性取代」標題下，且如下文參照胺基酸側鏈種類進一步所闡述。保守取代展示於表1中之「較佳取代」標題下。可將胺基酸取代引入所關注抗體及經篩選具有期望活性之產物中，該期望活性係(例如)保留/改良之抗原結合、降低之免疫原性或經改良之ADCC或CDC。
表1

可根據常見側鏈性質將胺基酸分組：
(1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)鹼性：His、Lys、Arg；
(5)影響鏈取向之殘基：Gly、Pro；
(6)芳香族殘基：Trp、Tyr、Phe。

非保守性取代使得需要將該等種類之一種之成員與另一種類交換。

一種取代變體類型涉及取代親代抗體(例如人類化或人類抗體)之一或多個超變區殘基。通常，選擇用於進一步研究之所得變體相對於親代抗體在某些生物學性質(例如增加之親和力、降低之免疫原性)中具有修飾(例如改良)及/或實質上保留親代抗體之某些生物學性質。取代變體實例係親和力成熟抗體，其可便利地(例如)使用基於噬菌體顯示之親和力成熟技術(例如闡述於本文中者)生成。簡言之，使一或多個HVR殘基突變且於噬菌體上展示變體抗體並篩選特定生物學活性(例如結合親和力)。

可在HVR作改變(例如取代)，以(例如)改良抗體親和力。該等改變可在HVR 「熱點」(亦即，由在體細胞成熟過程期間發生高頻突變之密碼子編碼的殘基) (例如參見Chowdhury, P.S., Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196)及/或SDR (a-CDR)中進行，其中測試所得變體VH或VL之結合親和力。藉由自二級庫構築並再選擇之親和力成熟已闡述於(例如) Hoogenboom, H.R.等人之Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37中。在親和力成熟之一些實施例中，藉由各種方法中之任一者(例如易錯PCR、鏈改組或寡核苷酸主導的誘變)，將多樣性引入針對成熟所選擇之可變基因中。隨後建立二級庫。隨後篩選庫，以鑑別具有期望親和力之任一抗體變體。引入多樣性之另一方法涉及HVR主導之方法，其中將若干HVR殘基(例如一次4至6個殘基)隨機化。可專一性鑑別(例如使用丙胺酸掃描誘變或建模)參與抗原結合之HVR殘基。特定而言，通常以CDR-H3及CDR-L3為目標。

在某些實施例中，取代、插入或缺失可發生於一或多個HVR內，只要該等變化不會實質上降低抗體結合抗原之能力即可。舉例而言，可對HVR作出不會實質上降低結合親和力之保守改變(例如本文所提供之保守取代)。該等改變可位於HVR 「熱點」或SDR外部。在上文所提供之變體VH及VL序列之某些實施例中，每一HVR未經改變，或含有不超過一個、兩個或三個胺基酸取代。

一種用於鑑別抗體上可作為誘變目標之殘基或區域的有用方法稱為「丙胺酸掃描誘變」，如由Cunningham, B.C.及Wells, J.A., Science, 244 (1989) 1081-1085所闡述。在此方法中，已鑑別殘基或目標殘基群(例如帶電殘基，例如arg、asp、his、lys及glu)，並由中性或帶負電之胺基酸(例如丙胺酸或多丙胺酸)代替以確定是否影響抗體與抗原之相互作用。可在對初始取代顯示功能敏感性之胺基酸位置處引入其他取代。或者或另外，使用抗原-抗體複合物之晶體結構以鑑別抗體與抗原間之接觸點。可靶向該等接觸殘基及相鄰殘基作為取代候選物或將其消除。可篩選變體以確定其是否含有期望特性。

胺基酸序列插入包含胺基-及/或羧基末端融合物(長度在一個殘基至含有上百或更多殘基之多肽範圍內)以及單個或多個胺基酸殘基之序列內插入。末端插入之實例包含具有N-末端甲硫胺醯基殘基之抗體。抗體分子之其他插入變體包含抗體N端或C端與酶(例如用於ADEPT)或延長抗體血清半衰期之多肽之融合物。

b) Fc區變體在某些實施例中，可將一或多個胺基酸修飾引入本文所提供抗體之Fc區中，藉此產生Fc區變體。Fc區變體可包括人類Fc區序列(例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)，該序列在一或多個胺基酸位置包括胺基酸修飾(例如取代)。

具有降低之效應功能之抗體包含具有Fc區殘基238、265、269、270、297、327及329中之一或多者的取代者(美國專利第6,737,056號)。該等Fc突變體包含在胺基酸位置265、269、270、297及327中之兩者或更多者處具有取代之Fc突變體，包含在殘基265及297處經丙胺酸取代之所謂的「DANA」 Fc突變體(美國專利第7,332,581號)。

闡述具有經改良或降低之FcR結合的某些抗體變體。(例如參見美國專利第6,737,056號、WO 2004/056312及Shields, R.L.等人，J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604)。

在本發明之一實施例中，該抗體係具有突變L234A及L235A或具有突變L234A、L235A及P329G之IgG1。在另一實施例中，或係具有突變S228P及L235E或S228P、L235E或及P329G之IgG4 (根據Kabat等人之EU索引編號，Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，國立衛生研究院，Bethesda, MD, 1991)。

具有延長之半衰期及改良之與新生兒Fc受體(FcRn，其負責將母體IgG轉移至胎兒中，Guyer, R.L.等人，J. Immunol. 117 (1976) 587-593及Kim, J.K.等人，J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434)之結合之抗體闡述於US 2005/0014934中。彼等抗體包括具有一或多個改良Fc區與FcRn之結合之取代之Fc區。該等Fc變體包含在以下Fc區殘基之一或多者處具有取代者：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如取代Fc區殘基434(美國專利第7,371,826號)。

關於Fc區變體之其他實例，亦參見Duncan, A.R.及Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740；US 5,648,260；US 5,624,821；及WO 94/29351。

c)經半胱胺酸改造之抗體變體在某些實施例中，可能期望產生經半胱胺酸改造之抗體，例如「硫代MAb」，其中抗體之一或多個殘基經半胱胺酸殘基取代。在特定實施例中，經取代殘基係在抗體之可及位點處出現。藉由使用半胱胺酸取代彼等殘基，反應性硫醇基團藉此位於抗體之可及位點處且可用於使抗體偶聯至其他部分(例如藥物部分或連接體-藥物部分)以產生免疫偶聯物，如本文進一步所闡述。在某些實施例中，下列殘基中之任一者或多者可經半胱胺酸取代：輕鏈之V205 (Kabat編號)、重鏈之A118 (EU編號)及重鏈Fc區之S400 (EU編號)。經半胱胺酸改造之抗體可如(例如)美國專利第7,521,541號中所闡述來生成。

d)抗體衍生物在某些實施例中，可進一步修飾本文所提供抗體以含有業內已知且易於獲得之額外非蛋白質性部分。適於衍生抗體之部分包含(但不限於)水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包含(但不限於)聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇之共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯啶酮、聚-1,3-二氧戊環、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)及葡聚糖或聚(n-乙烯基基吡咯啶酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯化之多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛可因其在水中之穩定性而有利於製造。聚合物可具有任何分子量，且可具支鏈或不具支鏈。附接至抗體之聚合物的數量可有所變化，且若附接一個以上之聚合物，則其可為相同或不同分子。通常，用於衍生之聚合物之數量及/或類型可基於包含(但不限於)以下在內之考慮因素來確定：擬改良抗體之特定性質或功能、抗體衍生物是否將用於界定條件下之療法等。

在另一實施例中，提供抗體與非蛋白質性部分之偶聯物，其可藉由曝光於輻射來選擇性加熱。在一實施例中，非蛋白性部分係碳奈米管(Kam, N.W.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605)。輻射可具有任一波長，且包含(但不限於)如下波長：其不會危害正常細胞，但將非蛋白質性部分加熱至可將毗鄰抗體-非蛋白質性部分之細胞殺滅的溫度。

B. 重組方法及組合物可使用重組方法及組合物來產生抗體，例如如美國專利第4,816,567號中所闡述。在一實施例中，提供本文所闡述之編碼抗-HLA-G抗體之經分離核酸。此核酸可編碼構成抗體VL之胺基酸序列及/或構成抗體VH之胺基酸序列(例如抗體之輕鏈及/或重鏈)。在其他實施例中，提供一或多個包括此核酸之載體(例如表現載體)。在另一實施例中，提供包括此核酸之宿主細胞。在一該實施例中，宿主細胞包括以下物質(例如已經該等物質轉化)：(1)包括編碼構成抗體VL之胺基酸序列及構成抗體VH之胺基酸序列之核酸的載體，或(2)包括編碼構成抗體VL之胺基酸序列之核酸的第一載體，及包括編碼構成抗體VH之胺基酸序列之核酸的第二載體。在一實施例中，宿主細胞係真核細胞，如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、HEK293細胞或淋巴樣細胞(例如Y0、NS0、Sp20細胞)。在一實施例中，提供製備抗-HLA-G抗體之方法，其中該方法包括在適於表現抗體之條件下培養包括編碼如上文所提供抗體之核酸的宿主細胞，及視情況自宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收抗體。

對於抗-HLA-G抗體之重組產生，分離(例如)如上文所闡述之編碼抗體之核酸並將其插入一或多個載體中以供進一步選殖及/或在宿主細胞中表現。此核酸可使用習用程序容易地分離並測序(例如藉由使用能與編碼抗體之重鏈及輕鏈之基因特異性結合的寡核苷酸探針)。

用於選殖或表現編碼抗體之載體之適宜宿主細胞包含本文所闡述之原核或真核細胞。舉例而言，抗體可在細菌中產生，尤其在無需醣基化及Fc效應功能時。關於抗體片段及多肽在細菌中之表現，例如參見US 5,648,237、US 5,789,199及US 5,840,523。(亦參見Charlton, K.A.，Methods in Molecular Biology，第248卷，Lo, B.K.C. (編輯), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254，其闡述抗體片段在大腸桿菌中之表現)。在表現之後，可自細菌細胞漿液以可溶性部分形式分離抗體且可進一步純化。

除原核生物外，真核微生物(例如絲狀真菌或酵母菌)亦係用於編碼抗體之載體之適宜選殖或表現宿主，包含醣基化途徑已「人類化」從而產生具有部分或完全人類醣基化模式之抗體的真菌及酵母菌菌株。參見Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414；及Li, H.等人，Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215。

用於表現醣基化抗體之適宜宿主細胞亦源自多細胞生物體(無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包含植物及昆蟲細胞。已鑑別多種桿狀病毒株可與昆蟲細胞聯合使用，尤其用於轉染草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda )細胞。

亦可利用植物細胞培養物作為宿主。例如參見美國專利第5,959,177號、第6,040,498號、第6,420,548號、第7,125,978號及第6,417,429號(闡述用於在轉基因植物中產生抗體之PLANTIBODIES^TM 技術)。

亦可使用脊椎動物細胞作為宿主。舉例而言，可使用適於懸浮液生長之哺乳動物細胞系。有用哺乳動物宿主細胞系之其他實例係藉由SV40轉化之猴腎臟CV1細胞系(COS-7)；人類胚胎腎臟細胞系(293或293細胞，如Graham, F.L.等人，J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74中所闡述)；幼倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠賽特利(sertoli)細胞(TM4細胞，如(例如) Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252中所闡述)；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人類子宮頸癌細胞(HELA)；犬腎細胞(MDCK)；水牛鼠肝細胞(buffalo rat liver cell) (BRL 3A)；人類肺細胞(W138)；人類肝細胞(Hep G2)；小鼠乳房腫瘤(MMT 060562)；TRI細胞，如(例如) Mather, J.P.等人，Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68中所闡述；MRC 5細胞；及FS4細胞。其他可用哺乳動物宿主細胞系包含中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包含DHFR^- CHO細胞(Urlaub, G.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220)；及骨髓瘤細胞系，例如Y0、NS0及Sp2/0。關於某些適於抗體產生之哺乳動物宿主細胞系之綜述，例如參見Yazaki, P.及Wu, A.M., Methods in Molecular Biology，第248卷，Lo, B.K.C. (編輯)，Humana Press, Totowa, NJ (2004)，第255-268頁。

C.分析可藉由業內已知之各種分析來鑑別本文所提供之抗-HLA-G抗體、篩選或表徵其物理/化學性質及/或生物活性。

1. 結合分析及其他分析在一態樣中，舉例而言，藉由已知方法(例如ELISA、西方印漬等)測試本發明抗體之抗原結合活性。

在另一態樣中，可使用競爭分析來鑑別與HLA-G-0031 (包括SEQ ID NO:7之VH序列及SEQ ID NO:8之VL序列)競爭結合至HLA-G之抗體。本發明之一實施例係與包括SEQ ID NO:7中VH序列之所有3個HVR及SEQ ID NO:8中VL序列之所有3個HVR之抗-HLA-G抗體競爭結合至人類HLA-G的抗體。在某些實施例中，此一競爭抗體結合至藉由抗-HLA-G抗體HLA-G-0031結合之相同表位(例如線性或構形表位)。在一實施例中，提供與包括SEQ ID NO:7之VH序列及SEQ ID NO:8之VL序列之抗體結合至HLA-G上之相同表位的抗-HLA-G抗體。在另一態樣中，可使用競爭分析來鑑別與HLA-G-0090 (包括SEQ ID NO:31之VH序列及SEQ ID NO:32之VL序列)競爭結合至HLA-G之抗體。本發明之一實施例係與包括所有SEQ ID NO:31中VH序列之3個HVR及SEQ ID NO:32中VL序列之所有3個HVR之抗-HLA-G抗體競爭結合至人類HLA-G的抗體。在某些實施例中，此一競爭抗體結合至藉由抗-HLA-G抗體HLA-G-0090結合之相同表位(例如線性或構形表位)。在一實施例中，提供與包括SEQ ID NO:31之VH序列及SEQ ID NO:32之VL序列之抗體結合至HLA-G上之相同表位的抗-HLA-G抗體。定位抗體結合表位之詳細實例性方法提供於Morris, G.E. (編輯), Epitope Mapping Protocols, Methods in Molecular Biology，第66卷，Humana Press, Totowa, NJ (1996)中。

在實例性競爭分析中，在包括結合至HLA-G之第一經標記抗體(例如抗- HLA-G抗體HLA-G-0031或HLA-G-0090)及第二未標記抗體(測試其與第一抗體競爭結合至HLA-G之能力)之溶液中培育經固定HLA-G。第二抗體可存在於雜交瘤上清液中。作為對照，在包括第一經標記抗體但不包括第二未標記抗體之溶液中培育經固定HLA-G。在允許第一抗體與HLA-G結合之條件下培育之後，去除過量未結合抗體，並量測與經固定HLA-G結合之標記的量。若與經固定HLA-G締合之標記之量在測試試樣中相對於對照試樣顯著降低，則此指示第二抗體與第一抗體競爭結合HLA-G。參見Harlow, E.及Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual，第14章，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1988)。關於另一實例性競爭分析，參見實例2 (表位定位ELISA/結合競爭分析)。

2. 活性分析在一態樣中，提供分析以鑑別具有生物活性之抗-HLA-G抗體。生物活性可包含(例如)增強不同免疫細胞(包含T細胞)之活化及/或增殖之能力。舉例而言，其增強免疫調節性細胞介素(例如干擾素-γ (IFN-γ)及/或腫瘤壞死因子α (TNFα))之釋放。增強或可增強之其他免疫調節性細胞介素係(例如)結合至不同細胞類型之IL1ß、IL6、IL12、顆粒酶B等。亦提供在活體內及/或活體外具有此生物活性之抗體。

在某些實施例中，如(例如)下文實例中所闡述來測試本發明抗體之該生物活性。

D.免疫偶聯物(僅癌症或針對靶進行修飾) 本發明亦提供包括偶聯至一或多種細胞毒性劑之本文抗-HLA-G抗體的免疫偶聯物，該等細胞毒性劑係(例如)化學治療劑或藥物、生長抑制劑、毒素(例如蛋白質毒素、細菌、真菌、植物或動物起源之酶促活性毒素或其片段)或放射性同位素。

在一實施例中，免疫偶聯物係抗體-藥物偶聯物(ADC)，其中抗體偶聯至一或多種藥物，該等藥物包含(但不限於)類美登素(maytansinoid) (參見US 5,208,020、US 5,416,064及EP 0 425 235 B1)；奧裡斯他汀(auristatin)，例如單甲基奧裡斯他汀藥物部分DE及DF (MMAE及MMAF) (參見US 5,635,483、US 5,780,588及US 7,498,298)；多拉司他汀(dolastatin)；卡奇黴素(calicheamicin)或其衍生物(參見US 5,712,374、US 5,714,586、US 5,739,116、US 5,767,285、US 5,770,701、US 5,770,710、US 5,773,001及US 5,877,296；Hinman, L.M.等人，Cancer Res. 53 (1993) 3336-3342；及Lode, H.N.等人，Cancer Res. 58 (1998) 2925-2928)；蒽環抗生素，例如道諾黴素或多柔比星(參見Kratz, F.等人，Curr. Med. Chem. 13 (2006) 477-523；Jeffrey, S.C.等人，Bioorg. Med. Chem. Lett. 16 (2006) 358-362；Torgov, M.Y.等人，Bioconjug. Chem. 16 (2005) 717-721；Nagy, A.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 829-834；Dubowchik, G.M.等人，Bioorg. & Med. Chem. Letters 12 (2002) 1529-1532；King, H.D.等人，J. Med. Chem. 45 (20029 4336-4343；及美國專利第6,630,579號)；胺甲蝶呤；長春地辛(vindesine)；紫杉烷(taxane)，例如多西他賽(docetaxel)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、拉羅他塞(larotaxel)、特西他塞(tesetaxel)及歐他紫杉烷(ortataxel)；單端孢黴烯(trichothecene)；及CC1065。

在另一實施例中，免疫偶聯物包括與酶促活性毒素或其片段偶聯之本文所闡述抗體，該酶促活性毒素或其片段包含(但不限於)白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、α-八疊球菌、油桐(Aleurites fordii)蛋白質、石竹素蛋白質、美洲商陸(Phytolaca americana)蛋白質(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、瀉果素、巴豆毒素、皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹毒素、絲裂吉菌素(mitogellin)、侷限麴菌素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、依諾黴素(enomycin)及單端孢黴烯族毒素(tricothecene)。

在另一實施例中，免疫偶聯物包括偶聯至放射性原子以形成放射性偶聯物之本文所闡述抗體。眾多種放射性同位素可用於產生放射性偶聯物。實例包含At²¹¹ 、I¹³¹ 、I¹²⁵ 、Y⁹⁰ 、Re¹⁸⁶ 、Re¹⁸⁸ 、Sm¹⁵³ 、Bi²¹² 、P³² 、Pb²¹² 及Lu之放射性同位素。在偶聯物用於檢測時，其可包括用於閃爍法研究之放射性原子，例如TC^99m 或I¹²³ ；或用於核磁共振(NMR)成像(亦稱為磁共振成像，MRI)之自旋標記，例如碘-123 (再次)、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。

抗體與細胞毒性劑之偶聯物可使用多種雙功能蛋白質偶合劑製得，例如3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀醯亞胺酯(SPDP)、4-(N-馬來醯亞胺甲基)環己烷-1-甲酸琥珀醯亞胺酯(SMCC)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、亞胺基酯之雙功能衍生物(例如己二醯亞胺二甲酯HCl)、活性酯(例如辛二酸二琥珀醯亞胺酯)、醛(例如戊二醛)、雙-疊氮基化合物(例如雙(對-重氮苯甲醯基)己二胺)、雙-重氮衍生物(例如雙-(對-重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(例如甲苯2,6-二異氰酸酯)及雙-活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。舉例而言，蓖麻毒素免疫毒素可如Vitetta, E.S.等人，Science 238 (1987) 1098-1104中所闡述來製備。經碳-14-標記之1-異硫氰酸苄基-3-甲基二伸乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)係用於偶聯放射性核苷酸與抗體之實例性螯合劑。參見WO 94/11026。連接體可為促進細胞毒性藥物在細胞內釋放之「可裂解連接體」。舉例而言，可使用酸不穩定性連接體、肽酶敏感性連接體、光不穩定性連接體、二甲基連接體或含有二硫化物之連接體(Chari, R.V.等人，CancerRes. 52 (1992) 127-131；美國專利第5,208,020號)。

本文之免疫偶聯物或ADC明確地涵蓋(但不限於)該等使用以下交聯劑試劑製備之偶聯物：包含(但不限於) BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、硫代-EMCS、硫代-GMBS、硫代-KMUS、硫代-MBS、硫代-SIAB、硫代-SMCC及硫代-SMPB以及SVSB ((4-乙烯基碸)苯甲酸琥珀醯亞胺酯)，以上試劑可自市面購得(例如購自Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A)。

E.用於診斷及檢測之方法及組合物在某些實施例中，本文所提供抗-HLA-G抗體中之任一者皆可用於檢測生物試樣中HLA-G之存在。本文所用之術語「檢測」涵蓋定量或定性檢測。在某些實施例中，生物試樣包括細胞或組織，例如免疫細胞或T細胞浸潤物及或腫瘤細胞。

在一實施例中，提供用於診斷或檢測方法中之抗-HLA-G抗體。在另一態樣中，提供檢測生物試樣中之HLA-G之存在之方法。在某些實施例中，該方法包括使生物試樣與如本文所闡述之抗-HLA-G抗體在允許抗-HLA-G抗體結合至HLA-G之條件下接觸，及檢測在抗-HLA-G抗體與HLA-G之間是否形成複合物。該方法可為活體外或活體內方法。在一實施例中，使用抗-HLA-G抗體來選擇適於使用抗-HLA-G抗體之療法的個體，例如其中HLA-G係用於選擇患者之生物標記物。

在某些實施例中，提供經標記之抗-HLA-G抗體。標記包含(但不限於)直接檢測之標記或部分(例如螢光標記、發色標記、電子緻密標記、化學發光標記及放射性標記)以及經由(例如)酶反應或分子相互作用間接檢測之部分(例如酶或配體)。實例性標記包含(但不限於)放射性同位素³² P、¹⁴ C、¹²⁵ I、³ H及¹³¹ I、螢光團(例如稀土螯合物或螢光黃及其衍生物)、玫瑰紅及其衍生物、丹醯、傘形酮、螢光素酶(例如螢火蟲螢光素酶及細菌螢光素酶)(美國專利第4,737,456號)、螢光素、2,3-二氫酞嗪二酮、辣根過氧化物酶(HRP)、鹼性磷酸酶、貝他-半乳糖苷酶、葡萄糖澱粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)、雜環氧化酶(例如尿酸酶及黃嘌呤氧化酶，其與諸如HRP、乳過氧化物酶或微過氧化物酶等採用過氧化氫來氧化染料前體之酶偶聯)、生物素/抗生物素蛋白、自旋標記、噬菌體標記、穩定自由基及諸如此類。

F.醫藥調配物如本文所闡述之抗-HLA-G抗體之醫藥調配物係藉由混合具有期望純度之該抗體與一或多種醫藥上可接受之可選載劑(Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol, A. (編輯) (1980))以凍乾之調配物或水溶液形式製得。醫藥上可接受之載劑通常在所用劑量及濃度下對受體無毒，且包含(但不限於)：緩衝劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包含抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基苄基氯化銨；六甲氯銨；氯化苄烷銨；氯化苄甲乙氧銨；酚類、丁醇或苄醇；對羥基苯甲酸烷基酯，例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，例如聚(乙烯基吡咯啶酮)；胺基酸，例如甘胺酸、麩胺醯胺、天門冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單糖、二糖及其他碳水化合物，包含葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽相對離子，例如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子型表面活性劑，例如聚乙二醇(PEG)。本文之實例性醫藥上可接受之載劑進一步包含間質性藥物分散劑，例如可溶性中性活性透明質酸酶醣蛋白(sHASEGP)，例如人類可溶性PH-20透明質酸酶醣蛋白，例如rhuPH20 (HYLENEX^® , Baxter International, Inc.)。某些實例性sHASEGP及使用方法(包含rhuPH20)闡述於美國專利公開案第2005/0260186號及第2006/0104968號中。在一態樣中，將sHASEGP與一或多種其他糖胺多糖酶(例如軟骨素酶)組合。

實例性凍乾抗體調配物闡述於美國專利第6,267,958號中。水性抗體調配物包含闡述於美國專利第6,171,586號及WO 2006/044908中者，後一些調配物包含組胺酸-乙酸鹽緩衝液。

本文之調配物亦可視需要含有一種以上用於所治療之特定適應症之活性成分，較佳為具有不會對彼此造成不利影響之補充活性者。舉例而言，可期望進一步提供該等成分。該等活性成分適宜地以有效地用於預期目的之量以組合形式存在。

活性成分亦可分別裝入藉由(例如)凝聚技術或藉由界面聚合製備之微膠囊(例如羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)中、膠質藥物遞送系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米顆粒及奈米膠囊)或粗滴乳液中。該等技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol, A. (編輯) (1980)中。

可製備持續釋放型製劑。持續釋放製劑之適宜實例包含含有抗體之固體疏水聚合物之半透性基質，該等基質呈成形物件之形式，例如膜或微膠囊。

擬用於活體內投與之調配物通常為無菌的。無菌性可藉由(例如)經由無菌過濾膜進行過濾來容易地達成。

G.治療方法及組合物本文所提供之任一抗-HLA-G抗體(或抗原結合蛋白)可用於治療方法中。

在一態樣中，提供用作藥劑之抗-HLA-G抗體。在其他態樣中，提供用於治療癌症之抗-HLA-G抗體。在某些實施例中，提供用於治療方法中之抗-HLA-G抗體。在某些實施例中，本發明提供用於治療患有癌症之個體之方法之抗-HLA-G抗體，該方法包括向個體投與有效量之抗-HLA-G抗體。

在其他實施例中，本發明提供用作免疫調節劑/直接或間接誘導免疫細胞之增殖、活化(例如藉由釋放諸如TNFα (TNFa)及IFNγ (IFNg)等免疫刺激性細胞介素或進一步募集免疫細胞)之抗-HLA-G抗體。在某些實施例中，本發明提供用於在個體中免疫調節/直接或間接誘導免疫細胞之增殖、活化(例如藉由釋放諸如TNFa及IFNγ等免疫刺激性細胞介素或進一步募集免疫細胞)之方法中的抗-HLA-G抗體，其包括向個體投與有效抗-HLA-G抗體以用於免疫調節/或直接或間接誘導免疫細胞之增殖、活化(例如藉由釋放諸如TNFa及IFNγ等免疫刺激性細胞介素或進一步募集免疫細胞)。

在其他實施例中，本發明提供用作免疫刺激劑/或刺激腫瘤壞死因子α (TNFα)釋放之抗-HLA-G抗體。在某些實施例中，本發明提供用於在個體中免疫調節/直接或間接誘導免疫細胞之增殖、活化(例如藉由釋放諸如TNFa及IFNg等免疫刺激性細胞介素或進一步募集免疫細胞)之方法中的抗-HLA-G抗體，其包括向個體投與有效抗-HLA-G抗體以用於免疫調節/直接或間接誘導免疫細胞之增殖、活化(例如藉由釋放諸如TNFa及IFNg等免疫刺激性細胞介素或進一步募集免疫細胞)。

在其他實施例中 ， 本發明提供用於抑制腫瘤 (腫瘤細胞)中之免疫抑制之抗-HLA-G 抗體。在其他實施例中，本發明提供用於恢復之HLA-G特異性抑制之免疫反應(例如免疫細胞之細胞介素釋放(例如單核球之TNFα釋放)之抗-HLA-G抗體。

上述實施例中之任一者之「個體」較佳係人類。在另一態樣中，本發明提供抗-HLA-G抗體在製造或製備醫藥中之用途。在一實施例中，該醫藥係用於治療癌症。在另一實施例中，該醫藥用於治療癌症之方法中，該方法包括向患有癌症之個體投與有效量之醫藥。在另一實施例中，該藥劑係用於誘導癌細胞之細胞調介之裂解。在另一實施例中，該藥劑係用於在患有癌症之個體中誘導癌細胞之細胞調介之裂解之方法中，該方法包括向個體投與有效量之藥劑以誘導癌細胞中之細胞凋亡/或抑制癌細胞增殖。上文實施例中之任一者之「個體」可為人類。

在另一態樣中，本發明提供治療癌症之方法。在一實施例中，該方法包括向患有癌症之個體投與有效量之抗-HLA-G。上文實施例中之任一者之「個體」可為人類。

在另一態樣中，本發明提供誘導患有癌症之個體中癌細胞之細胞調介之裂解的方法。在一實施例中，該方法包括向個體投與有效量之抗-HLA-G以誘導患有癌症之個體中癌細胞之細胞調介之裂解。在一實施例中，「個體」係人類。

在另一態樣中，本發明提供醫藥調配物，其包括本文所提供抗-HLA-G抗體中之任一者以供(例如)用於上述治療方法中之任一者中。在一實施例中，醫藥調配物包括本文所提供任一抗-HLA-G抗體及醫藥上可接受之載劑。

本發明抗體(及任一額外治療劑)可藉由任何適宜方式投與，包含非經腸、肺內及鼻內以及(若期望用於局部治療)病灶內投與。非經腸輸注包含肌內、靜脈內、動脈內、腹膜腔內或皮下投與。可藉由任一適宜途徑、例如藉由注射、例如靜脈內或皮下注射進行投藥，此部分地取決於投與係短期投與抑或長期投與。本文涵蓋各種投藥方案，包含(但不限於)在各個時間點單次或多次投與、濃注投與及脈衝輸注。

本發明抗體應以符合良好醫療實踐之方式調配、投用及投與。在此上下文中需考慮之因素包含所治療之特定病症、所治療之特定哺乳動物、個體患者之臨床狀況、病因、醫藥之遞送位點、投與方法、投與時間安排及從業醫師所知之其他因素。抗體無需但視情況與一或多種當前用於預防或治療所論述病症之藥劑一起調配。該等其他藥劑之有效量端視調配物中所存在抗體之量、病症或治療之類型及上文所討論之其他因素而定。該等藥劑通常係以相同劑量及使用如本文所闡述之投與途徑或約1%至99%之本文所闡述之劑量或以任一劑量及藉由任一在經驗上/臨床上確定為適當之途徑來使用。

對於疾病之預防或治療而言，本發明抗體之合適劑量(在單獨使用或與一或多種其他額外治療劑組合使用時)應端視擬治療疾病之類型、抗體類型、疾病之嚴重程度及病程、投與抗體係用於預防目的抑或治療目的、先前療法、患者之臨床病史及對抗體之反應以及主治醫師之判斷而定。將抗體適宜地一次性或經一系列治療投與患者。端視疾病之類型及嚴重程度，不論(例如)藉由一或多次分開投與抑或藉由連續輸注來投與，約1 µg/kg至15 mg/kg (例如0.5 mg/kg至10 mg/kg)抗體可為投與患者之初始候選劑量。端視上述因素而定，一個典型日劑量可介於約1 µg/kg至100 mg/kg之間或更高。對於經若干天或更長時間重複投與而言，端視病狀而定，治療通常持續至對疾病症狀之期望抑制出現為止。抗體之一種實例性劑量介於約0.05 mg/kg至約10 mg/kg之間。因此，可向患者投與一或多個約0.5 mg/kg、2.0 mg/kg、4.0 mg/kg或10 mg/kg (或其任一組合)之劑量。該等劑量可間歇性投與，例如每週或每三週(例如應使得患者接受約二至約二十或(例如)約六個劑量之抗體)。可投與初始較高負載劑量，隨後投與一或多個較低劑量。實例性投藥方案包括投與約4 mg/kg抗體之初始負荷劑量，隨後投與約2 mg/kg抗體之週維持劑量。然而，可使用其他劑量方案。此療法之進展可容易地藉由習用技術及分析來監測。

應理解，可使用本發明之免疫偶聯物代替抗-HLA-G抗體或與抗-HLA-G抗體一起來實施任一上述調配物或治療方法。

II.製品在本發明之另一態樣中，提供含有可用於治療、預防及/或診斷上述病症物質之製品。該製品包括容器及於該容器上或伴隨之標籤或包裝插頁。適宜容器包含例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。該等容器可由諸如玻璃或塑膠等多種材料形成。該容器裝有組合物，其自身或與另一組合物組合可有效治療、預防及/或診斷病狀，且該容器可具有一個無菌出入口(例如該容器可為靜脈溶液袋或具有一個可由皮下注射針刺穿之塞子的小瓶)。該組合物中之至少一種活性劑係本發明抗體。標籤或包裝插頁指示該組合物用於治療所選病狀。此外，該製品可包括(a)含有組合物之第一容器，其中該組合物包括本發明抗體；及(b)含有組合物之第二容器，其中該組合物包括另一細胞毒性劑或治療劑。本發明此實施例中之製品可進一步包括指示組合物可用於治療特定病狀之包裝插頁。或者，或另外，該製品可進一步包括第二(或第三)容器包括醫藥上可接受之緩衝劑，例如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)及右旋糖溶液。其可進一步包含自商業及使用者角度期望之其他材料，包含其他緩衝劑、稀釋劑、濾器、針及注射器。

提供以下實例及圖以幫助理解本發明，本發明之實際範圍述於隨附申請專利範圍中。應理解，可在不背離本發明精神下修改所述程序。

胺基酸序列之闡述抗-HLAG抗體(可變區及超變區(HVR))：
SEQ ID NO: 1 重鏈HVR-H1，HLA-G-0031
SEQ ID NO: 2 重鏈HVR-H2，HLA-G-0031
SEQ ID NO: 3 重鏈HVR-H3，HLA-G-0031
SEQ ID NO: 4 輕鏈HVR-L1，HLA-G-0031
SEQ ID NO: 5 輕鏈HVR-L2，HLA-G-0031
SEQ ID NO: 6 輕鏈HVR-L3，HLA-G-0031
SEQ ID NO: 7 重鏈可變結構域VH，HLA-G-0031
SEQ ID NO: 8 輕鏈可變結構域VL，HLA-G-0031
SEQ ID NO: 9 重鏈HVR-H1，HLA-G-0039
SEQ ID NO: 10 重鏈HVR-H2，HLA-G-0039
SEQ ID NO: 11 重鏈HVR-H3，HLA-G-0039
SEQ ID NO: 12 輕鏈HVR-L1，HLA-G-0039
SEQ ID NO: 13 輕鏈HVR-L2，HLA-G-0039
SEQ ID NO: 14 輕鏈HVR-L3，HLA-G-0039
SEQ ID NO: 15 重鏈可變結構域VH，HLA-G-0039
SEQ ID NO: 16 輕鏈可變結構域VL，HLA-G-0039
SEQ ID NO: 17 重鏈HVR-H1，HLA-G-0041
SEQ ID NO: 18 重鏈HVR-H2，HLA-G-0041
SEQ ID NO: 19 重鏈HVR-H3，HLA-G-0041
SEQ ID NO: 20 輕鏈HVR-L1，HLA-G-0041
SEQ ID NO: 21 輕鏈HVR-L2，HLA-G-0041
SEQ ID NO: 22 輕鏈HVR-L3，HLA-G-0041
SEQ ID NO: 23 重鏈可變結構域VH，HLA-G-0041
SEQ ID NO: 24 輕鏈可變結構域VL，HLA-G-0041
SEQ ID NO: 25 重鏈HVR-H1，HLA-G-0090
SEQ ID NO: 26 重鏈HVR-H2，HLA-G-0090
SEQ ID NO: 27 重鏈HVR-H3，HLA-G-0090
SEQ ID NO: 28 輕鏈HVR-L1，HLA-G-0090
SEQ ID NO: 29 輕鏈HVR-L2，HLA-G-0090
SEQ ID NO: 30 輕鏈HVR-L3，HLA-G-0090
SEQ ID NO: 31 重鏈可變結構域VH，HLA-G-0090
SEQ ID NO: 32 輕鏈可變結構域VL，HLA-G-0090
SEQ ID NO: 33 人類化變體重鏈可變結構域VH，HLA-G-0031-0104 (HLA-G-0104)
SEQ ID NO: 34 人類化變體輕鏈可變結構域VL，HLA-G-0031-0104 (HLA-G-0104)

其他序列
SEQ ID NO: 35: 實例性人類HLA-G
SEQ ID NO: 36: 實例性人類HLA-G細胞外結構域(ECD)
SEQ ID NO: 37: 實例性人類ß2M
SEQ ID NO: 38: 經修飾人類HLA-G (其中HLA-G特異性胺基酸已由HLA-A共有胺基酸代替(=去接枝HLA-G，亦參見圖1) ECD)
SEQ ID NO: 39: 實例性人類HLA-A2
SEQ ID NO: 40: 實例性人類HLA-A2 ECD
SEQ ID NO: 41: 實例性小鼠H2Kd ECD
SEQ ID NO: 42: 實例性大鼠RT1A ECD
SEQ ID NO: 43: 實例性人類HLA-G ß2M MHC I類複合物
SEQ ID NO: 44: 實例性經修飾人類HLA-G ß2M MHC I類複合物(其中HLA-G特異性胺基酸已由HLA-A共有胺基酸代替(=去接枝HLA-G)，亦參見圖1)
SEQ ID NO: 45: 實例性小鼠H2Kd ß2M MHC I類複合物
SEQ ID NO: 46: 實例性人類HLA-G/小鼠H2Kd ß2M MHC I類複合物，其中將人類HLA-G之特異性位置接枝於小鼠H2Kd框架上
SEQ ID NO: 47: 實例性大鼠RT1A ß2M MHC I類複合物
SEQ ID NO: 48: 實例性人類HLA-G/大鼠RT1A ß2M MHC I類複合物，其中將人類HLA-G之特異性位置接枝於大鼠RT1A框架上
SEQ ID NO: 49 連接體及his標籤
SEQ ID NO: 50 肽
SEQ ID NO: 51 人類κ輕鏈恆定區
SEQ ID NO: 52 人類λ輕鏈恆定區
SEQ ID NO: 53 衍生自IgG1之人類重鏈恆定區
SEQ ID NO: 54 衍生自IgG1之具有突變L234A、L235A及P329G之人類重鏈恆定區
SEQ ID NO: 55 衍生自IgG4之人類重鏈恆定區

抗-HLAG抗體之胺基酸序列(加下劃線之可變區及粗體超變區(HVR))： SEQ ID NO: 7：重鏈可變結構域VH，HLA-G-0031: QVKLMQSGAALVKPGTSVKMSCNASGYTFT DYWVS WVKQSHGKRLEWVG EISPNSGASNFDENF KDKATLTVDKSTSTAYMELSRLTSEDSAIYYCTR SSHGSFRWFAY WGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 8：輕鏈可變結構域VL，HLA-G-0031: AIVLNQSPSSIVASQGEKVTITC RASSSVSSNHLH WYQQKPGAFPKFVIY STSQRAS GIPSRFSGSGSGTSYSFTISRVEAEDVATYYC QQGSSNPYT FGAGTKLELK SEQ ID NO: 33：人類化變體重鏈可變結構域VH，HLA-G-0031-0104 (HLA-G-0104):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT DYWVS WVRQAPGQRLEWMG EISPNSGASNFDENF QGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCTR SSHGSFRWFAY WGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 34：人類化變體輕鏈可變結構域VL，HLA-G-0031-0104 (HLA-G-0104):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASSSVSSNHLH WYQQKPGKAPKFLIY STSQRAS GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYC QQGSSNPYT FGQGTKLEIK
SEQ ID NO: 15：重鏈可變結構域VH，HLA-G-0039:
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS SYAMN WVRQAPGKGLEWVS VISGSGVSTYYADSVKG RFTISRDNSRNTLSLQMNSLRAEDTAVYYCAK DGSYNYGYGDYFDY WGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 16：輕鏈可變結構域VL，HLA-G-0039
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC KSSQSVLYSSKNKNYLA WYQQKPGQPPKLFIY WASTRES GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC QQYYNTPRT FGQGTKVEIK
SEQ ID NO: 23：重鏈可變結構域VH，HLA-G-0041:
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS TYGMS WVRQAPGKGLEWVS VISGGGVSTYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNRLRAEDTAVYYCAK DGSYNYGYGDYFDY WGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 24：輕鏈可變結構域VL，HLA-G-0041
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC KSSQNVLYSSNNKNYLA WYQQKPGQPPKLLIY WASTRES GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC QQYYNTPRT FGQGTKVEIK
SEQ ID NO: 31：重鏈可變結構域VH，HLA-G-0090:
QVQLQQSGPGLLKPSQTLSLTCAISGDSVS SNRAAWN WIRQSPSRGLEWLG RTYYRSKWYNDYAVSVQG RITLIPDTSKNQFSLRLNSVTPEDTAVYYCAS VRAVAPFDY WGQGVLVTVSS
SEQ ID NO: 32：輕鏈可變結構域VL，HLA-G-0090
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC KSSQSVLNSSNNKNNLA WYQQQPGQPPKLLIY WASTRES GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYFC QQYYRTPWT FGQGTKVEIK

列示本發明之下列具體實施例： 1. 一種特異性結合至人類HLA之經分離抗體-其中該抗體包括
A) (a) VH結構域，其包括：(i)包括SEQ ID NO:1之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包括SEQ ID NO:2之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii)包括選自SEQ ID NO:3之胺基酸序列之HVR-H3；及(b) VL結構域，其包括：(i)包括SEQ ID NO:4之胺基酸序列之HVR-L1；(ii)包括SEQ ID NO:5之胺基酸序列之HVR-L2，及(iii)包括SEQ ID NO:6之胺基酸序列之HVR-L3；或
B) (a) VH結構域，其包括：(i)包括SEQ ID NO:9之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包括SEQ ID NO:10之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii)包括選自SEQ ID NO:11之胺基酸序列之HVR-H3；及(b) VL結構域，其包括：(i)包括SEQ ID NO:12之胺基酸序列之HVR-L1；(ii)包括SEQ ID NO:13之胺基酸序列之HVR-L2，及(iii)包括SEQ ID NO:14之胺基酸序列之HVR-L3；或
C) (a) VH結構域，其包括：(i)包括SEQ ID NO:17之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包括SEQ ID NO:18之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii)包括選自SEQ ID NO:19之胺基酸序列之HVR-H3；及(b) VL結構域，其包括：(i)包括SEQ ID NO:20之胺基酸序列之HVR-L1；(ii)包括SEQ ID NO:21之胺基酸序列之HVR-L2，及(iii)包括SEQ ID NO:22之胺基酸序列之HVR-L3；或
D) (a) VH結構域，其包括：(i)包括SEQ ID NO:25之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包括SEQ ID NO:26之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii)包括選自SEQ ID NO:27之胺基酸序列之HVR-H3；及(b) VL結構域，其包括：(i)包括SEQ ID NO:28之胺基酸序列之HVR-L1；(ii)包括SEQ ID NO:29之胺基酸序列之HVR-L2，及(iii)包括SEQ ID NO:30之胺基酸序列之HVR-L3。
2. 如實施例1之抗體，其中該抗體包括
A)
i) 包括SEQ ID NO:7之VH序列及SEQ ID NO:8之VL序列；
ii) 或i)下之該抗體之該VH及該VL之人類化變體；或
iii) 包括SEQ ID NO:33之VH序列及SEQ ID NO:34之VL序列；或
B)
包括SEQ ID NO:15之VH序列及SEQ ID NO:16之VL序列；或
C)
包括SEQ ID NO:23之VH序列及SEQ ID NO:24之VL序列；或
D)
包括SEQ ID NO:31之VH序列及SEQ ID NO:32之VL序列。
3. 一種結合至人類HLA-G之經分離抗體，其中該抗體
a)與包括SEQ ID NO:7之VH序列及SEQ ID NO:8之VL序列之抗體結合至相同表位；
或b)與包括SEQ ID NO:31之VH序列及SEQ ID NO:32之VL序列之抗體結合至相同表位。
4. 如實施例1至4中任一項之抗-HLA-G抗體，其中該抗體
a) 並不與包括SEQ ID NO:44之經修飾人類HLA-G ß2M MHC I複合物交叉反應；及/或
b) 並不與包括SEQ ID NO:39及SEQ ID NO: 37之人類HLA-A2 ß2M MHC I複合物交叉反應；及/或
c) 並不與包括SEQ ID NO:45之小鼠H2Kd ß2M MHC I複合物交叉反應；及/或
e) 並不與包括SEQ ID NO:47之大鼠RT1A ß2M MHC I複合物交叉反應；及/或
f) 抑制ILT2結合至單體HLA-G ß2M MHC I複合物(包括SEQ ID NO: 43)；及/或
g) 將ILT2與三聚體HLA-G ß2M MHC I複合物(包括SEQ ID NO: 43)之結合抑制50%以上(在一實施例中60%以上) (與無抗體之結合相比) (參見實例4b)；及/或
h) 將ILT2與單體及/或二聚體及/或三聚體HLA-G ß2M MHC I複合物(包括SEQ ID NO: 43)之結合抑制50%以上(在一實施例中80%以上) (與無抗體之結合相比) (參見實例4b)；及/或
i) 抑制ILT2結合至JEG3細胞(ATCC編號HTB36)上之HLA-G (50%以上(在一實施例中80%以上)) (與無抗體之結合相比) (參見實例6)；及/或
j) 結合至JEG3細胞(ATCC編號HTB36)上之HLA-G (參見實例5)，且抑制ILT2結合至JEG3細胞(ATCC編號HTB36)上之HLA-G (50%以上(在一實施例中80%以上)) (與無抗體之結合相比) (參見實例6)；及/或
k) 將CD8a與HLAG之結合抑制80%以上(與無抗體之結合相比) (例如參見實例4c)；及/或
l) 恢復與JEG-3細胞(ATCC HTB36)一起共培養之單核球之HLA-G特異性抑制之免疫反應(例如經抑制腫瘤壞死因子(TNF) α釋放)。
5. 如前述實施例中任一項之抗體，其中該抗體係IgG1同型。
6. 如實施例5之抗體，其中該抗體係具有突變L234A、L235A及P329G (根據Kabat之EU索引編號)之IgG1同型。
7. 一種經分離核酸，其編碼如前述實施例中任一項之抗體。
8. 一種宿主細胞，其包括如實施例7之核酸。
9. 一種產生抗體之方法，其包括培養如實施例7之宿主細胞以使得產生該抗體。
10. 如實施例9之方法，其進一步包括自該宿主細胞回收該抗體。
11. 一種醫藥調配物，其包括如實施例1至6中任一項之抗體及醫藥上可接受之載劑。
12. 如實施例1至6中任一項之抗體，其用作藥劑。
13. 如實施例1至6中任一項之抗體，其用於治療癌症。
14. 一種如實施例1至6中任一項之抗體之用途，其用於製造藥劑。
15. 如實施例14之用途，其中該醫藥係用於治療癌症。
16. 一種治療患有癌症之個體之方法，其包括向該個體投與有效量之如實施例1至6中任一項之抗體。
17. 一種選擇抗-HLAG抗體(例如如實施例1至6)之方法，其包括下列步驟：
a) 藉由表面電漿共振分析來測定抗-HLAG抗體與包括SEQ ID NO: 43之人類HLA-G ß2M MHC I複合物之結合；
b) 測定該等各別抗-HLAG抗體ILT2與單體及/或二聚體及/或三聚體HLA-G ß2M MHC I複合物之結合之抑制；及
c) 選擇將ILT2與單體HLA-G ß2M MHC I之結合抑制複合物50%以上(在一實施例中80%以上) (與無抗體之結合相比)之抗-HLAG抗體，或選擇將ILT2與單體及/或二聚體及/或三聚體HLA-G ß2M MHC I複合物之結合抑制50%以上(在一實施例中以上70%) (與無抗體之結合相比)之抗-HLAG抗體。
d) 恢復與JEG-3細胞(ATCC HTB36)一起共培養之單核球之HLA-G特異性抑制之免疫反應(例如經抑制腫瘤壞死因子(TNF) α釋放)。
18. 一種選擇抗-HLAG抗體(例如如實施例6)之方法，其包括下列步驟：
a) 在流式細胞術分析(使用螢光活化細胞分選) (FACS分析)中測定抗-HLAG抗體與JEG3細胞((ATCC編號HTB36)之結合。
b) 在流式細胞術分析(使用螢光活化細胞分選) (FACS分析)中測定該等各別抗-HLAG抗體對ILT2與JEG3細胞((ATCC編號HTB36)之結合之抑制；及
c) 選擇結合至JEG3 (ATCC編號HTB36)細胞且與無抗體之結合相比將ILT2與JEG3細胞(ATCC編號HTB36)之結合抑制50%以上(在一實施例中80%以上)之抗-HLAG抗體。

實例
重組 DNA 技術
如以下文獻中所闡述使用標準方法來操縱DNA：Sambrook, J.等人，Molecular cloning：A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989。根據製造商之說明書使用分子生物學試劑。

基因及寡核苷酸合成
在Geneart GmbH (Regensburg, Germany)藉由化學合成製備期望基因區段。將所合成基因片段選殖至大腸桿菌質體中用於繁殖/擴增。藉由DNA測序來驗證亞選殖基因片段之DNA序列。或者，藉由黏接化學合成之寡核苷酸或經由PCR來組裝短的合成DNA片段。由metabion GmbH (Planegg-Martinsried, Germany)製備各別寡核苷酸。

基礎/標準哺乳動物表現質體之說明為表現期望基因/蛋白質(例如全長抗體重鏈、全長抗體輕鏈或MHC I類分子(例如HLA-G)或融合至肽及β-2微球蛋白之MHC I類分子(例如融合至HLA-G結合肽及或β-2微球蛋白之HLA-G))，使用包括下列功能元件之轉錄單元：
- 來自人類巨細胞病毒(P-CMV)之立即早期增強子及啟動子，包含內含子A， - 人類重鏈免疫球蛋白5’-未轉譯區(5’UTR)， - 鼠類免疫球蛋白重鏈信號序列，
- 擬表現基因/蛋白質(例如全長抗體重鏈或MHC I類分子)，及
- 牛生長激素多聚腺苷酸化序列(BGH pA)。

除包含擬表現期望基因之表現單元/盒外，基礎/標準哺乳動物表現質體亦含有
- 來自載體pUC18之複製起點，其容許在大腸桿菌中複製此質體，及 - β-內醯胺酶基因，其在大腸桿菌中產生胺苄青黴素(ampicillin)抗性。

蛋白質測定
藉由使用根據多肽之胺基酸序列計算之莫耳消光係數測定280 nm下之光學密度(OD)來測定經純化多肽的蛋白質濃度。

實例1
用於篩選及反篩選之HLA-G嵌合分子之生成因與其他MHC I分子具有高同源性(＞98%)，故使用HLA-G分子實施免疫化會生成由MHC-I交叉反應性抗體以及真正HLA-G特異性抗體之混合物構成之多株血清。

迄今為止，尚未提供工具來選擇與其他人類MHC-I (例如HLA-A)無交叉反應性之真正HLA-G特異性抗體且進一步選擇具有受體阻斷功能者。

鑑別獨特HLA-G位置與結構一致性及受體相互作用(ILT2/4及KIR2DL4)所需之位置之組合。

然後將人類HLA-G之獨特及近端位置「接枝」於來自不同齧齒類動物物種之MHC I類複合物分子(例如大鼠RT1A及小鼠H2kd)上以生成「嵌合」免疫原/篩選抗原。

針對結合/特異性(且對反抗原分別並無結合/特異性)對所生成抗體實施嚴格篩選。

篩選抗原：
‒ 表示為包括SEQ ID NO: 43之人類HLA-G ß2M MHC複合物之重組HLA-G
‒ 接枝於大鼠RT-1及小鼠H2kd上之HLA-G特異性序列(SEQ ID NO: 46:人類HLA-G/小鼠H2Kd ß2M MHC I類複合物，其中將人類HLA-G之特異性位置接枝於小鼠H2Kd框架上；及SEQ ID NO: 48:人類HLA-G/大鼠RT1A ß2M MHC I類複合物，其中將人類HLA-G之特異性位置接枝於大鼠RT1A框架上)
‒ 天然HLA-G MHC I類複合物表現細胞(例如Jeg3細胞)或人類HLA-G轉染細胞系SKOV3 HLA-G+及PA-TU-8902 HLA-G+

篩選反抗原：
‒ 與不同肽組合之具有其他HLA-A序列(HLA-A2及HLA-G^經 ^HlA-A ^{共有序列去接枝} )之反抗原(MHC I類複合物)) (例如參見SEQ ID NO 40 (HLA-A2)及HLA-G框架上之SEQ ID NO: 44 HLA-A共有序列)
‒ 來自其他物種之反抗原(MHC I類複合物)，例如大鼠RT-1及小鼠H2kd (SEQ ID NO: 45及SEQ ID NO: 47)
‒ 未修飾腫瘤細胞系SKOV3及PA-TU-8902，其特徵在於不存在HLA-G表現。

用於免疫化及篩選 HLA 特異性抗體生成之嵌合 HLA-G 抗原之設計 ( 參見圖 1) ：
用於免疫化野生型(wt)及轉基因大鼠或兔及小鼠等及/或用於篩選分析且攜載HLA-G獨特位置(SEQ ID NO: 48)之嵌合大鼠MHC I分子(RT1-A)之設計：

藉由比對來自IMGT之2579個HLA-A序列、3283個HLA-B序列、2133個HLA-C序列、15個HLA-E序列、22個HLA-F序列及50個HLA-G序列(如在2014年2月6日所獲得)來鑑別HLA-G獨特位置。HLA-G中以小於3個序列組HLA-A、HLA-B及HLA-C + HLA-E + HLA-F組合組中之任一者之序列之1% (幾乎約0%)出現的彼等殘基稱為HLA-G獨特位置。

4個核心HLA-G獨特位置(2個呈α-1形式且2個呈α-3形式)在HLA-G序列組中並不展示多型性且其他HLA基因在該等位置不含HLA-G特異性殘基(1x HLA-A之M100、1x HLA-B之Q103及1x HLA-C之Q103除外)。

將大鼠RT1-A (Rudolph, M.G.等人，J.Mol.Biol. 324: 975-990 (2002)；PDB代碼：1KJM)之晶體結構疊合於人類HLA-G (Clements, C.S.等人，PROC.NATL.ACAD.SCI.USA 102: 3360-3365 (2005)；PDB代碼：1YDP)之晶體結構上。α-鏈及相關β-2-微球蛋白之整體結構係保守的。

在RT1-A結構中藉由序列對比及結構比對來鑑別HLA-G獨特位置。在第一步驟中，鑑別暴露於HLA-G及RT1-A之分子表面上且由此抗體可接近之獨特HLA-G位置。在改造時排除埋入摺疊蛋白內之獨特位置。在第二步驟中，鑑別亦需要交換以製備相應區域「HLA-G樣區域」 (亦即用以生成含有獨特位置之真實HLA-G表位而非生成人工HLA-G/大鼠RT1-A嵌合表位)之結構鄰近之殘基。分析由此選擇用於突變之所有位置以對來自HLA-G之各別殘基進行結構擬合(structural fit)，以避免在突變時分子結構之可能局部擾動。

以類似方式生成用於免疫化及/或用於篩選分析之攜載HLA-G獨特位置(SEQ ID NO: 46)之嵌合小鼠MHC I分子(H2Kd)。

藉由針對用作篩選反抗原之 HLA-A 共有序列 (SEQ ID NO:44) 「 去接枝 」 HLA-G 獨特位置來設計基於 HLA-A 之反抗原
分析人類HLA-G (PDB代碼：1YDP)之晶體結構中之衍生自多序列比對之獨特位置。首先，在改造時排除並不暴露於HLA-G表面上且由此抗體不可接近之位置。第二，分析表面暴露殘基之胺基酸交換之可能性(亦即排除分子結構在相關位置發生突變時之可能局部擾動)。總共14個位置經驗證可用於交換。驗證位置中之胺基酸突變為HLA-A共有序列，該共有序列係衍生自自IMGT下載之2579個HLA-A序列(如在2014年2月6日所獲得)之多序列比對。

可溶性經典及非經典 MHC I 類分子之表現質體之生成
重組MHC I類基因編碼N-末端延伸之融合分子，該融合分子由已知由各別MHC I類分子結合之肽、β-2微球蛋白及各別MHC I類分子組成。

除可溶性MHC I類分子表現盒外，用於瞬時表現可溶性MHC I類分子之表現質體亦包括來自載體pUC18之複製起點(其容許在大腸桿菌中複製此質體)及β-內醯胺酶基因(其在大腸桿菌中賦予胺苄西林抗性)。

可溶性MHC I類分子之轉錄單元包括下列功能元件：
- 來自人類巨細胞病毒(P-CMV)之立即早期增強子及啟動子，包含內含子A，
- 人類重鏈免疫球蛋白5’-未轉譯區(5’UTR)，
- 鼠類免疫球蛋白重鏈信號序列，
- N-末端截短之編碼金黃色葡萄球菌(S. aureus)分選酶A之核酸，及
- 牛生長激素多聚腺苷酸化序列(BGH pA)。

衍生自各種物種之成熟可溶性MHC I類分子之胺基酸序列係：
SEQ ID NO: 43: 實例性人類HLA-G ß2M MHC I類複合物
SEQ ID NO: 44: 實例性經修飾人類HLA-G ß2M MHC I類複合物(其中HLA-G特異性胺基酸已由HLA共有胺基酸代替(=去接枝HLA-G，亦參見圖1)
SEQ ID NO: 45: 實例性小鼠H2Kd ß2M MHC I類複合物
SEQ ID NO: 46: 實例性人類HLA-G/小鼠H2Kd ß2M MHC複合物，其中將人類HLA-G之特異性位置接枝於小鼠H2Kd框架上
SEQ ID NO: 47: 實例性大鼠RT1A ß2M MHC I類複合物
SEQ ID NO: 48: 實例性人類HLA-G/大鼠RT1A ß2M MHC複合物，其中將人類HLA-G之特異性位置接枝於大鼠RT1A框架上

對於用於篩選之實例性HLA-A2 ß2M MHC I類複合物而言，使用下列組分且在大腸桿菌中表現複合物並純化。

MHCI複合物HLA-A2 / b2M (SEQ ID NO 40及37) (皆具有額外N-末端甲硫胺酸) + VLDFAPPGA肽(SEQ ID NO: 50) +連接體及his標籤(SEQ ID NO: 49)

實例2
免疫化活動

A)小鼠及大鼠之免疫化
a. 嵌合蛋白(針對非特異性MHC-I/HLA之耐受性及獨特HLA-G位置之方向)

使用自Charles River Laboratories International, Inc.獲得之Balb/C小鼠進行免疫化。根據附錄A 「動物適應與護理導則(Guidelines for accommodation and care of animals)」將動物飼養於AAALACi認證之動物設施中。所有動物免疫化方案及實驗皆由上巴伐利亞政府(Government of Upper Bavaria)批准(許可編號55.2-1-54-2531-19-10及55.2-1-54-2532-51-11)且根據德國動物福利法(German Animal Welfare Act)及歐洲議會及理事會指令2010/63 (Directive 2010/63 of the European Parliament and Council)來實施。

在4週過程中，使用嵌合H2Kd/HLA-G分子(SEQ ID NO: 46 (「HLA-G-0006」))對6-8週齡Balb/C小鼠(n=5)實施5輪免疫化。在每一次免疫之前，使用氧及異氟醚之氣體混合物將小鼠麻醉。在第一次免疫中，將溶於20 mM His/HisCl、140 mM NaCl (pH 6.0)中之15 µg蛋白質與等體積CFA (BD Difco, 263810號)混合並沿小鼠背部經皮下(s.c.)投與鄰近引流淋巴結之6個部位，其中兩個部位位於頸背處且兩個部位位於腹股溝及小腿之兩側。將另一15 µg乳化於RIBI佐劑(Sigma-Aldrich, S6322號)中之蛋白質沿腹部投與6個並置部位，其中各兩個部位位於腋窩、腹股溝及大腿之兩側。在第7 (10 µg)、14 (5 µg)、21 (5 µg)及28 (5 µg)天以類似方式追加免疫之遞減抗原劑量，但全程改用RIBI佐劑且僅沿腹部給予。在最後一次免疫之後三天，對小鼠實施安樂死且無菌分離雙側膕、淺表腹股溝、腋窩及鰓淋巴結並備用於雜交瘤生成。在第三次免疫及第五次免疫之後，藉由ELISA測試血清之重組人類HLA-G及免疫原特異性總IgG抗體產生。

在3個月過程中，使用嵌合H2Kd/HLA-G分子(HLA-G-0006)對另一組6-8週齡Balb/C小鼠(n=5)實施三次免疫化。在第一次免疫中，將溶於20 mM His/HisCl、140 mM NaCl (pH 6.0)中之100 µg蛋白質與等體積CFA (BD Difco, 263810號)混合並經腹膜內(i.p.)投與。在第28及56天以類似方式追加免疫，只是使用不完全弗羅因德氏佐劑(incompletes Freund`s adjuvant) (IFA，來自BD Difco，DIFC263910號)。在最後一次免疫之後4至5週，使小鼠經靜脈內(i.v.)接受大約25µg於無菌PBS中之免疫原且在72h後無菌收穫脾並備用於雜交瘤生成。在第三次免疫之後，藉由ELISA測試血清之重組人類HLA-G (SEQ ID NO: 43 (「HLA-G-0003」))及免疫原特異性嵌合H2Kd/HLA-G分子(SEQ ID NO: 46 (「HLA-G-0006」))且使用具有共有HLA-A特異性位置之「去接枝」人類HLA-G (SEQ ID NO: 44 (「HLA-G-0007」))及鼠類H2kd蛋白(SEQ ID NO: 45 「HLA-G-0009」))總IgG抗體產生進行反篩選。

b. wt HLA-G蛋白
使用自Charles River Laboratories International, Inc.獲得之CD大鼠進行免疫化。根據附錄A 「動物適應與護理導則」將動物飼養於AAALACi認證之動物設施中。所有動物免疫化方案及實驗皆由上巴伐利亞政府批准(許可編號55.2-1-54-2532-51-11)且根據德國動物福利法及歐洲議會及理事會指令2010/63來實施。

在4個月過程中，使用重組人類HLA-G蛋白(SEQ ID NO: 43 (「HLA-G-0003」))對6-8週齡CD大鼠(n=4)實施4次免疫化。在第一次免疫中，將溶於20 mM His/HisCl、140 mM NaCl (pH 6.0)中之100 µg蛋白質與等體積CFA (BD Difco, 263810號)混合並經腹膜內投與。在第28、56及84天以類似方式追加免疫，但全程改用不完全弗羅因德氏佐劑(IFA，來自BD Difco，DIFC263910號)。在最後一次免疫之後三至四週，使大鼠經靜脈內接受大約75µg於無菌PBS中之免疫原且在72h後無菌收穫脾並備用於雜交瘤生成。在第三次免疫及第四次免疫之後，藉由ELISA測試血清之重組HLA-G (SEQ ID NO: 43 (「HLA-G-0003」))特異性IgG1、IgG1a、IgG2b及IgG2c抗體產生且使用具有共有HLA-A特異性位置之「去接枝」人類HLA-G (SEQ ID NO: 44 (「HLA-G-0007」))進行反篩選。

c. JEG3細胞(ATCC編號HTB36) (天然表現HLA-G)
使用自Charles River Laboratories International, Inc.獲得之CD大鼠進行免疫化。根據附錄A 「動物適應與護理導則」將動物飼養於AAALACi認證之動物設施中。所有動物免疫化方案及實驗皆由上巴伐利亞政府批准(許可編號AZ. 55.2-1-54- 2531-83-13)且根據德國動物福利法及歐洲議會及理事會指令2010/63來實施。

在5 (組A)至7 (組B)個月之過程中，分別使用JEG-3細胞(ATCC HTB36)對兩組6-8週齡CD大鼠(n=2)實施5 (A)或7 (B)次免疫化。在第一次免疫中，將1×10^7個溶於無菌PBS中之細胞與等體積CFA (BD Difco, 263810號)混合並經腹膜內投與。在第28、56、84、112、140 (僅B)及168 (僅B)天以類似方式給予A及B追加免疫，但全程改用不完全弗羅因德氏佐劑(IFA，來自BD Difco, DIFC263910號)。在最後一次免疫之後三週，使大鼠經靜脈內接受100µg於無菌PBS中之重組人類HLA-G蛋白(SEQ ID NO: 43 (「HLA-G-0003」))；且在72h後，無菌收穫脾並備用於雜交瘤生成。在第三、第五及第七次免疫之後，分別藉由ELISA測試血清之重組HLA-G (SEQ ID NO: 43 (「HLA-G-0003」))特異性IgG1、IgG1a、IgG2b及IgG2c抗體產生-特異性IgG1、IgG2a、IgG2b及IgG2c抗體產生且使用具有共有HLA-A特異性位置之「去接枝」人類HLA-G (SEQ ID NO: 44 (「HLA-G-0007」))進行反篩選。

d. JEG3/DNA IMS (用於追加效應)
使用自Charles River Laboratories International, Inc.獲得之CD大鼠進行免疫化。根據附錄A 「動物適應與護理導則」將動物飼養於AAALACi認證之動物設施中。所有動物免疫化方案及實驗皆由上巴伐利亞政府批准(許可編號AZ. 55.2-1-54- 2531-83-13)且根據德國動物福利法及歐洲議會及理事會指令2010/63來實施。

在三個月過程中，使6-8週齡CD大鼠(n=5)以交替方案接受基於質體DNA及細胞之免疫化。分別使用編碼呈單鏈分子形式之人類HLA-G之質體DNA HLA-G-0030 (p17747)以及表現HLA-G之天然JEG-3細胞(ATCC HTB36)以用於此目的。

在第一次免疫中，使用異氟醚將動物麻醉且使用100μg於無菌H₂ O中之質體DNA經皮內(i.d.)實施免疫，該質體DNA係施加至經剃毛背部中鄰近動物尾部之一個斑點。在經皮內施加之後，使用下列參數在ECM 830電穿孔系統(BTX Harvard Apparatus)上將斑點電穿孔：兩次1000V/cm，各0.1ms，間隔125ms；隨後4次287.5V/cm，各10ms，亦間隔125ms。在第二次免疫中，在第14天，使動物接受1×10^7個溶於無菌PBS中之細胞，該等細胞與等體積CFA (BD Difco, 263810號)混合且在生成穩定乳液之後經腹膜內投與。在第28 (DNA)、42 (細胞)、56 (DNA)、70 (細胞)天以類似方式追加免疫，但全程改用不完全弗羅因德氏佐劑(IFA，來自BD Difco, DIFC263910號)進行細胞免疫化。在最後一次免疫之後四週，使大鼠經靜脈內接受100µg於無菌PBS中之可溶性重組人類HLA-G MHC I類蛋白(SEQ ID NO: 43 (「HLA-G-0003」))；且在72h後，無菌收穫脾並備用於雜交瘤生成。在第三、第五及第六次免疫之後，分別藉由ELISA測試血清之可溶性重組人類HLA-G MHC I類蛋白(SEQ ID NO: 43 (「HLA-G-0003」))特異性IgG1、IgG2a、IgG2b及IgG2c抗體產生且使用具有共有HLA-A特異性位置之「去接枝」人類HLA-G (SEQ ID NO: 44 (「HLA-G-0007」))進行反篩選。

在所有免疫化策略中，誘導高度多反應性體液免疫反應，從而識別HLA-G以及用於反篩選之蛋白質(例如重組「去接枝」人類HLA-G、嵌合H2Kd/HLA-G分子或相關人類HLA-A2分子)，如以ELISA形式使用來自免疫化動物之多株血清所分析(未展示數據)。

B)人類化OMNIRAT line 7大鼠之免疫化
自Open Monoclonal Technology, Inc. (2747 Ross Road, Palo Alto, CA 94303, USA)配對OmniRat Line 7大鼠且自Charles River Laboratories International, Inc.育種並獲得。根據附錄A 「動物適應與護理導則」將動物飼養於AAALACi認證之動物設施中。所有動物免疫化方案及實驗皆由上巴伐利亞政府批准(許可編號55.2-1-54-2532-51-11及55.2-1-54- 2531-83-13)且根據德國動物福利法及歐洲議會及理事會指令2010/63來實施。

在4個月過程中，使用重組嵌合HLA-G蛋白(SEQ ID NO: 48 (「HLA-G-0011」))對6-8週齡OmniRat Line 7大鼠(n=4)實施4次免疫化。在第一次免疫中，將溶於20 mM His/HisCl、140 mM NaCl (pH 6.0)中之100 µg蛋白質與等體積CFA (BD Difco, 263810號)混合並經腹膜內投與。在第28、56及84天以類似方式追加免疫，但全程改用不完全弗羅因德氏佐劑(IFA，來自BD Difco，DIFC263910號)。在最後一次免疫之後三至四週，使大鼠接受於無菌PBS中之大約50µg免疫原(靜脈內)及25 µg免疫原(腹膜腔內)且在72h後無菌收穫脾並備用於雜交瘤生成。在第三次免疫及第四次免疫之後，藉由ELISA測試血清之重組HLA-G (SEQ ID NO: 48 (「HLA-G-0011」))特異性IgG1、IgG2a、IgG2b及IgG2c抗體產生且使用具有共有HLA-A特異性位置之「去接枝」人類HLA-G (SEQ ID NO: 44 (「HLA-G-0007」))進行反篩選。

或者，在三個月過程中，使6-8週齡OmniRat Line 7大鼠(n=5)以交替方案接受基於質體DNA及細胞之免疫化。分別使用編碼呈單鏈分子形式之人類HLA-G (人類HLA-G MHC I類蛋白(SEQ ID NO: 43 (「HLA-G-0003」))之質體DNA以及天然表現HLA-G之JEG-3細胞(ATCC HTB36)以用於此目的。

在第一次免疫化中，使用異氟醚將動物麻醉且使用含100μg質體DNA之無菌H₂ O經皮內(i.d.)免疫接種，其係施加至鄰近動物尾部之已剃毛背部上一個位點。在經皮內施加之後，使用下列參數，在ECM 830電穿孔系統(BTX Harvard Apparatus)上在該位點進行電穿孔：兩次1000V/cm，各0.1ms，間隔125ms；隨後4次287.5V/cm，各10ms，亦間隔125ms。在第14天第二次免疫化時，使動物接受1×10^7個溶於無菌PBS中之細胞，該等細胞與等體積CFA (BD Difco, 263810號)混合，且在生成穩定乳液之後經腹膜內投與。在第28 (DNA)、42 (細胞)、56 (DNA)、70 (細胞)天以類似方式追加免疫，但全程改用不完全弗羅因德氏佐劑(IFA，來自BD Difco, DIFC263910號)進行細胞免疫化。在最後一次免疫之後四週，使大鼠經靜脈內接受含100µg可溶性重組人類HLA-G MHC I類蛋白(SEQ ID NO: 43 (「HLA-G-0003」))之無菌PBS；且在72h後，無菌收集脾，並準備用於產生雜交瘤。在第三、第五及第六次免疫之後，分別藉由ELISA測試血清之可溶性重組人類HLA-G MHC I類蛋白(SEQ ID NO: 43 (「HLA-G-0003」))特異性IgG1、IgG2a、IgG2b及IgG2c抗體產量，且使用具有共有HLA-A特異性位置之「去接枝」人類HLA-G (SEQ ID NO: 44 (「HLA-G-0007」))進行反篩選。

在所有免疫策略中，誘導高度多反應性體液免疫反應，從而識別HLA-G以及用於反篩選之蛋白質(例如重組「去接枝」人類HLA-G、嵌合H2Kd/HLA-G分子或相關人類HLA-A2分子)，如：以ELISA形式，使用來自免疫動物之多株血清所分析(未展示數據)。

所獲得抗體
使用上述方法，獲得特異性結合至人類抗-HLA-G之下列抗體：來自CD大鼠之大鼠HLA-G 0031、來自人類化大鼠之人類HLAG 0039、HLA-G 0041及HLA-G 0090。

如下列實例中所闡述來測定所獲得抗-HLA-G特異性抗體之結合性質及生物活性且與已知參考抗體進行比較。使用HVR以及VH受體人類框架HUMAN_IGHV1-3及VL受體人類框架HUMAN_IGKV1-17 (V-結構域，其中在位置R46F具有一個額外回復突變，Kabat編號)將抗體HLA-G-0031人類化。

為在人類化HLAG結合劑HLAG-0031期間鑑別適宜人類受體框架，使用兩種方法之組合。一方面，採取經典方式，亦即搜尋與親代抗體具有高序列同源性之受體框架且隨後將CDR區電腦接枝於此受體框架上。判斷所鑑別框架與親代抗體之每一胺基酸差異對結合劑之結構完整性之影響且在適當時考慮朝向親代序列之回復突變。

另一方面，使用WO 2016/062734中所闡述之電腦工具來預測人類化形式之VH結構域及VL結構域朝向彼此之定向。在所有可能人類種系組合上針對CDR之實際接枝物實施此步驟。將結果與親代結合劑之VH VL結構域定向進行比較以選擇幾何結構接近起始抗體之框架組合。

抗-HLAG抗體抗體(可變區之SEQ ID No及超變區(HVR))：

實例3
A)抗HLA-G抗體與可溶性人類HLA-G、具有HLA-A特異性序列之可溶性去接枝人類HLA-G、人類HLA-A2及大鼠/小鼠H2-Kd之結合

針對與人類HLA-G、嵌合HLA-G、去接枝HLA-G、HLA-A2及大鼠/小鼠H2-Kd之結合性質來篩選自免疫化獲得之抗體。各別分析闡述於下文中。為測試人類HLA-G，使用單體以及二聚體及三聚體形式(參見下文之製備)。

人類 HLA-G MHC I 類蛋白之二聚合 / 三聚合
在室溫下，使用ÄKTA-FPLC以0.2ml/min之流速將含有加His標籤之單體可溶性人類HLA-G MHC I類蛋白(SEQ ID NO: 23)之上清液過夜加載於含有5 ml Ni-Sepharose之HisTrap HP管柱(GE Healthcare 17-5248-02號)上。然後使用含有0.5M咪唑之2% DPBS (Merck 8.14223.025號)洗滌管柱直至達到基線為止。然後使用於含有0.5M咪唑之2% DPBS中之10mM DTT平衡管柱並在室溫下培育30 min。使用PBS/10mM咪唑自管柱洗滌掉DTT且以含有0.5mM咪唑之2 - 100% DPBS之梯度洗脫蛋白質。在使用Amicon-Ultra 15 M /Ultracel 10K濃縮洗脫液之後，將蛋白質在室溫下培育24小時，隨後在4℃下培育48小時以容許二聚合/多聚合。然後使用SEC in Superdex 200 HiLoad 16/60 (GE Healthcare 17-5175-01號)分離二聚體及三聚體並使用0.5M NaOH過夜洗滌。使用PBS平衡管柱，隨後使用10mg/ml BSA予以飽和。然後收集二聚體(餾分A9)及三聚體(餾分A8)，等分並儲存於-80℃下直至進一步使用。

人類 wt HLA-G 結合 ELISA
使用25 µl/孔之生物素化人類wt HLA-G以250 ng/ml之濃度塗覆經鏈黴抗生物素蛋白塗覆之板(Nunc, MicroCoat 11974998001號)並在4℃下培育過夜。在洗滌(3×90 µl/孔，使用PBST緩衝液)之後，添加25 µl抗-HLA-G試樣(OSEP緩衝液中之1:3稀釋液)或參考抗體(G233, Thermo/Pierce MA1-19449號，500 ng/ml)並在室溫下培育1h。在洗滌(3×90 µl/孔，使用PBST緩衝液)之後，添加25µl/孔之山羊-抗-小鼠H+L-POD (Biorad 170-6561號，1:2000於OSEP中)或驢-抗-兔IgG POD (GE NA9340V號，1:5000於OSE中)並在室溫下於振盪器上培育1 h。為檢測大鼠IgG，添加山羊-抗-大鼠IgG1-POD (Bethyl A110-106P號)、山羊-抗-大鼠IgG2a-POD (Bethyl A110-109P號)及山羊-抗-大鼠IgG2b-POD (Bethyl A110-111P號)之混合物(1:10000於OSEP中)並在室溫下於振盪器上培育1 h。在洗滌(6×90 µl/孔，使用PBST緩衝液)之後，添加25 µl/孔之TMB受質(Roche, 11835033001)並培育直至OD 2-3。在Tecan Safire 2儀器上於370/492 nm下實施量測。

具有 HLA-A 特異性序列之人類去接枝 HLA-G 之結合 ELISA
使用25 µl/孔之生物素化人類去接枝HLA-G以250 ng/ml之濃度塗覆經鏈黴抗生物素蛋白塗覆之板(Nunc, MicroCoat 11974998001號)並在4℃下培育過夜。在洗滌(3×90 µl/孔，使用PBST緩衝液)之後，添加25 µl抗-HLA-G試樣(OSEP緩衝液中之1:3稀釋液)或大鼠血清(OSEP中之1:600稀釋液)並在室溫下培育1h。在洗滌(3×90 µl/孔，使用PBST緩衝液)之後，添加25 µl/孔之山羊-抗-大鼠IgG1-POD (Bethyl A110-106P號)、山羊-抗-大鼠IgG2a-POD (Bethyl A110-109P號)及山羊-抗-大鼠IgG2b-POD (Bethyl A110-111P號)之混合物(1:10000於OSEP中)並在室溫下於振盪器上培育1 h。在洗滌(6×90 µl/孔，使用PBST緩衝液)之後，添加25 µl/孔之TMB受質(Roche, 11835033001)並培育直至OD 2-3。在Tecan Safire 2儀器上於370/492 nm下實施量測。

大鼠 MHC I (RT1-A) 結合 ELISA
使用25 µl/孔之生物素化大鼠MHC I (RT1-A)以250 ng/ml之濃度塗覆經鏈黴抗生物素蛋白塗覆之板(Nunc, MicroCoat 11974998001號)並在4℃下培育過夜。在洗滌(3×90 µl/孔，使用PBST緩衝液)之後，添加25 µl抗-HLA-G試樣(OSEP緩衝液中之1:3稀釋液)或大鼠血清(OSEP中之1:600稀釋液)並在室溫下培育1h。在洗滌(3×90 µl/孔，使用PBST緩衝液)之後，添加25 µl/孔之山羊-抗-大鼠IgG1-POD (Bethyl A110-106P號)、山羊-抗-大鼠IgG2a-POD (Bethyl A110-109P號)及山羊-抗-大鼠IgG2b-POD (Bethyl A110-111P號)之混合物(1:10000於OSEP中)並在室溫下於振盪器上培育1 h。在洗滌(6×90 µl/孔，使用PBST緩衝液)之後，添加25 µl/孔之TMB受質(Roche, 11835033001)並培育直至OD 2-3。在Tecan Safire 2儀器上於370/492 nm下實施量測。

HLA-A2 結合 ELISA
使用25 µl/孔之生物素化人類wt HLA-A2以250 ng/ml之濃度塗覆經鏈黴抗生物素蛋白塗覆之板(Nunc, MicroCoat 11974998001號)並在4℃下培育過夜。在洗滌(3×90 µl/孔，使用PBST緩衝液)之後，添加25 µl抗-HLA-G試樣(OSEP緩衝液中之1:3稀釋液)或大鼠血清(OSEP中之1:600稀釋液)並在室溫下培育1h。在洗滌(3×90 µl/孔，使用PBST緩衝液)之後，添加25 µl/孔之山羊-抗-大鼠IgG1-POD (Bethyl A110-106P號)、山羊-抗-大鼠IgG2a-POD (Bethyl A110-109P號)及山羊-抗-大鼠IgG2b-POD (Bethyl A110-111P號)之混合物(1:10000於OSEP中)並在室溫下於振盪器上培育1 h。在洗滌(6×90 µl/孔，使用PBST緩衝液)之後，添加25 µl/孔之TMB受質(Roche, 11835033001)並培育直至OD 2-3。在Tecan Safire 2儀器上於370/492 nm下實施量測。

抗 -HLA-G 抗體之結合動力學
藉由表面電漿共振使用BIACORE T200儀器(GE Healthcare)來探究抗-HLA-G抗體與人類HLA-G、人類去接枝HLA-G及人類HLA-A2之結合動力學。在25℃下使用PBS緩衝液(pH 7.4 + 0.05% Tween20)作為運行緩衝液且使用PBS緩衝液(+ 0.1% BSA)作為稀釋緩衝液來實施所有實驗。在pH 5.0下，藉由使用由GE Healthcare供應之胺偶合套組將抗-人類Fc (JIR009-005-098, Jackson)或抗-大鼠Fc (JIR112-005-071, Jackson)或抗小鼠Fc (JIR115-005-071, Jackson)抗體固定於Series S CM5感測器晶片(GE Healthcare)上。將抗-HLA-G抗體捕獲於表面上以得到50 - 200 RU之捕獲反應。將HLA-G分子在30 µl/min下以2.5 nM至最高800 nM之濃度(2×1:2及4×1:3稀釋系列)經180 s注射於表面上(締合期)。藉由使用運行緩衝液洗滌來監測解離期300 -600 sec。藉由注射H3PO4 (0.85%) 60 + 30秒(對於抗-人類Fc捕獲抗體)、pH1.5甘胺酸60秒及pH2.0甘胺酸60秒(對於抗-大鼠Fc捕獲抗體)、H3PO4 (0.85%) 80 + 60秒(對於抗小鼠Fc捕獲抗體)來再生表面。藉由扣除自模擬表面獲得之反應來校正本體折射率差異。扣除空白注射(雙重參照)。使用BIA評估軟體將導出曲線擬合至1:1蘭格繆爾結合模型。

抗 -HLA-G 抗體之交叉阻斷
藉由表面電漿共振使用BIACORE T200或B4000儀器(GE Healthcare)來探究結合至人類HLA-G之抗-HLA-G抗體之交叉阻斷實驗。在25℃下使用PBS緩衝液(pH 7.4 + 0.05% Tween20)作為運行緩衝液來實施所有實驗。

根據提供商之方案將抗-人類Fab (GE-Healthcare, 28-9583-25)抗體固定於Series S CM5感測器晶片(GE Healthcare)上以自含有人類Ck結構域之OMT大鼠捕獲抗體。以15 µg/ml之濃度捕獲抗-HLA-G抗體70s。以500或1000 nM之濃度注射(30µl/min) Wt HLA-G 60秒。然後以30µg/ml之濃度注射Wt大鼠-抗體90秒。藉由使用運行緩衝液洗滌來監測解離期60或240 sec。藉由注射pH 1.5甘胺酸60秒且額外穩定90 sec時段來再生表面。

在另一分析設置中，根據提供商之方案將抗-人類Fab (GE-Healthcare, 28-9583-25)抗體固定於Series S CM5感測器晶片(GE Healthcare)上以自含有人類Ck結構域之OMT大鼠捕獲抗體。以30 µg/ml之濃度捕獲抗-HLA-G抗體90s。藉由以500 µg/ml之濃度及30 µl/min之流速注射人類IgG (JIR009-000-003) 4 × 120 sec.來阻斷捕獲抗體上之未佔用結合位點。以500 nM之濃度注射(30µl/min) Wt HLA-G 90秒。然後以30µg/ml之濃度注射來自OMT大鼠之第二抗體(人類Ck結構域) 90秒。藉由使用運行緩衝液洗滌來監測解離期240 sec。藉由注射pH 1.5甘胺酸60秒且額外穩定90 sec時段來再生表面。
表格： HLA-G 抗體與呈單體、二聚體及三聚體形式之重組可溶性 HLA-G MHC 1 類複合物之結合 (ELISA)

上表匯總衍生自wt蛋白質IMS之不同大鼠抗-人類HLA-G單株抗體之結合。展示與重組wt單體、二聚體及三聚體HLA-G蛋白之各別結合之相對EC50值[ng/ml]，如藉由ELISA所評價。藉由將生物素化wt HLA-G抗原塗覆至鏈黴抗生物素蛋白板來設定ELISA。在培育及洗滌步驟之後，使各別抗體以10 - 0 µg之濃度範圍(1:2稀釋步驟)進行結合。藉由抗-Fc-抗體-POD偶聯物檢測結合抗體。自所得結合曲線在生成半最大信號之抗體濃度下測定EC50值。在非生物素化HLA-G二聚體及三聚體抗原之情形下，藉由隨機塗覆於分析板上來實施固定。

HLA-G wt 對 HLA-G 去接枝物結合 ELISA ：

上表匯總衍生自wt以及OMT大鼠之wt蛋白質IMS之不同大鼠抗-人類HLA-G單株抗體之結合。展示與重組wt單體HLA-G蛋白或所謂的去接枝HLA-G (HLA-G主鏈上之HLA-A共有序列)蛋白之各別結合相對EC50值[ng/ml]及最大OD，如藉由ELISA所評價。藉由將生物素化wt HLA-G或共有抗原塗覆至鏈黴抗生物素蛋白板來設定ELISA。在培育及洗滌步驟之後，使各別抗體以10 - 0 µg之濃度範圍(1:2稀釋步驟)進行結合。藉由抗-Fc-抗體-POD偶聯物檢測結合抗體。自所得結合曲線在生成半最大信號之抗體濃度下測定EC50值。

HLA-G wt 對 HLA-G 去接枝物結合 - 表面電漿共振
HLA-G 抗體與重組 HLA-G (SEQ ID NO :43) 及對照經修飾人類 HLA-G ß2M MHC I 類複合物 ( 其中 HLA-G 特異性胺基酸已由 HLA-A 共有胺基酸代替 (= 去接枝 HLA-G SEQ ID NO: 44:) 之結合親和力 ( 「 - 」 指示無可檢測結合 )

上表匯總針對wt及去接枝HLA-G之抗體親和力及t1/2值，如藉由表面電漿共振(Biacore)分析所評價。藉由表面電漿共振使用BIACORE T200儀器(GE Healthcare)來探究抗-HLA-G抗體與人類HLA-G及人類去接枝HLA-G之結合動力學。在25℃下使用PBS緩衝液(pH 7.4 + 0.05% Tween20)作為運行緩衝液且使用PBS緩衝液(+ 0.1% BSA)作為稀釋緩衝液來實施所有實驗。在pH 5.0下，藉由使用由GE Healthcare供應之胺偶合套組將抗-人類Fc (JIR009-005-098, Jackson)或抗-大鼠Fc (JIR112-005-071, Jackson)或抗小鼠Fc (JIR115-005-071, Jackson)抗體固定於Series S CM5感測器晶片(GE Healthcare)上。將抗-HLA-G抗體捕獲於表面上以得到50 - 200 RU之捕獲反應。將非生物素化HLA-G分子在30 µl/min下以2.5 nM至最高800 nM之濃度(2×1:2及4×1:3稀釋系列)經180 s注射於表面上(締合期)。藉由使用運行緩衝液洗滌來監測解離期300 -600 sec。藉由注射H3PO4 (0.85%) 60 + 30秒(對於抗-人類Fc捕獲抗體)、pH1.5甘胺酸60秒及pH2.0甘胺酸60秒(對於抗-大鼠Fc捕獲抗體)、H3PO4 (0.85%) 80 + 60秒(對於抗小鼠Fc捕獲抗體)來再生表面。藉由扣除自模擬表面獲得之反應來校正本體折射率差異。扣除空白注射(雙重參照)。使用BIA評估軟體將導出曲線擬合至1:1蘭格繆爾結合模型(在上表中，-指示不能檢測到結合)。

在另一實驗中 ， 將下列參考抗體( 自不同商業供應商獲得) 與單體人類HLA-G MHC I (SEQ ID NO: 43 ( 「HLA-G-0003 」)) 及具有共有HLA-A 特異性位置之 「 去接枝 」 人類HLA-G (SEQ ID NO: 44 ( 「HLA-G-0007 」)) 之結合進行比較:
MEM/G9 、 87G 、 G233 、 2A12 、 4H84 、 5A6G7 、 6D463 、 9-1F10 、 MEM-G/1 、 MEM-G/11 、 MEM-G/2 及 MEM-G/4 ( 「 - 」 指示無可檢測結合 ) 。

有趣的是，大部分所量測抗體不對單體人類HLA-G MHC I (SEQ ID NO: 43 (「HLA-G-0003」))展示任何特異性結合，亦包含抗體87G。如文獻中所闡述與寡聚形式之HLA-G之結合可為親合力驅動性，此乃因寡聚形式之結合位點有所增加。

僅結合親和力KD值為7.7E^-09 M之抗體MEM/G9、KD值為2.0E^-08 M之抗體G233及結合親和力KD值為1.2E^-08 M之MEM-G/11展示結合至單體wt人類HLA-G MHC I複合物。然而，該等抗體MEM-G/11中之一者亦與HLA-G去接枝物上之HLA-A共有序列展示一定結合/交叉反應性(SEQ ID NO:44)。另外，另一抗體(MEM/G9)亦與HLA-G去接枝物上之HLA-A共有序列(SEQ ID NO:44)展示較強非特異性結合。

實例4
a) 受體結合抑制(與單聚體-、二聚體-及三聚體HLA-G): ILT-2及ILT-4阻斷ELISA

使用25 µl/孔之生物素化人類wt HLA-G以500-1000 ng/ml之濃度塗覆經鏈黴抗生物素蛋白塗覆之板(Nunc, MicroCoat 11974998001號)並在4℃下培育過夜。在洗滌(3×90 µl/孔，使用PBST緩衝液)之後，以遞減濃度(始於10或3 µg/ml)添加25 µl抗-HLA-G試樣，然後以1:3或 1:2步驟稀釋並在室溫下培育1h。在洗滌(3×90 µl/孔，使用PBST緩衝液)之後，以200 ng/ml之濃度添加25µl/孔加c-myc標籤之重組ILT-2受體並在室溫下培育1 h。在洗滌(3×90 µl/孔，使用PBST緩衝液)之後，添加25 µl/孔山羊-抗-c-myc-POD (Bethyl A190-104P號，1:7000，於PBST + 0.5% BSA中)或抗人類FcgPOD (JIR, 109-036-098, 1:8000，於PBST + 0.5% BSA中)並在室溫下於振盪器上培育1 h。在洗滌(3×90 µl/孔，使用PBST緩衝液)之後，添加25 µl/孔之TMB受質(Roche, 11835033001)並培育直至OD 2-3。在Tecan Safire 2儀器上於370/492 nm下實施量測。
上表匯總以3 µg/ml濃度結合至HLA-G之不同抗體相對於未阻斷HLA-G:受體相互作用之ILT-2及ILT-4阻斷程度。在單獨實驗中測試HLA-G-0090之ILT2阻斷，未評價ILT4阻斷。

b) 使用不同分析設置之抗 -HLA-G 抗體之 ILT2 及 ILT4 結合抑制性質之生物化學對比
藉由將加Fc標籤之ILT2及ILT4分別塗覆至Maxisorp微量滴定板上來設定ELISA。在培育及洗滌步驟之後，以100nM之濃度添加各別抗體。向孔中添加加His標籤之可溶性單體、二聚體或三聚體HLA-G。在培育及洗滌步驟之後，藉由抗-His-抗體-POD偶聯物檢測所結合受體。計算與自含有ILT2/4 + HLA-G (單-、二-或三聚體)且不含抗HLA-G或ILT2/4抗體之孔所獲得之值相比之抑制百分比(%) (100%結合= 0%抑制)。
上表匯總所闡述HLAG抗體在110nM之濃度下(*在44nM之濃度下測試HLAG-0090)對重組HLA-G蛋白(單體及寡聚物)與其受體ILT2及ILT4之間之相互作用的阻斷，如藉由ELISA所評價。展示HLA-G/受體相互作用(關於ILT2及ILT4)之抑制%。較不明顯之ILT4抑制取決於此受體之主要ß2M依賴性相互作用。

圖4a及b中之條形圖展示與市售抗體相比由所闡述抗-HLA-G抗體達成之抑制%。市售HLA-G抗體87G、MEM/G09及G233並不與所闡述抗體同等有效地阻斷HLA-G / ILT2或ILT4相互作用。另外，在一些情形下，市售抗體可導致在結合時HLA-G與ILT2或ILT4之結合增加。

c) 藉由抗 -HLAG 抗體抑制 CD8a 與 HLAG 之結合
使用30µl/孔之阻斷溶液阻斷經鏈黴抗生物素蛋白塗覆之384孔板。藉由將5%聚乙烯醇(PVA, Sigma P8136號)及8%聚乙烯基吡咯啶酮(PVP, Sigma PVP360號)以1:10稀釋於Starting block T20 (Thermo Scientific 37543號)中來製備阻斷溶液，其中將3.5 ml PVA + 3.5 ml PVP添加至35 ml Starting block T20中。將30µl稀釋於阻斷溶液中之生物素化HLAG (3µg/ml)添加至每一孔中並在室溫下於振盪器上培育1小時。使用100µl含有0.1% Tween-20 (Merck 8.22184.500號)之PBS (PAN Biotech P04-36500號)將孔洗滌3次。然後使用30µl稀釋於阻斷緩衝液中之抗-HLAG抗體一式三份將孔在室溫下於振盪器上培育1小時且然後使用100µl含有0.1% Tween-20之PBS洗滌3次。在阻斷溶液(1.25µg/ml)中稀釋重組CD8a (Sino Biological 10980-H08H號，重構並在4℃下儲存1週)，且將30µl添加至所有孔中並在室溫下於振盪器上培育2小時。使用100µl含有0.1% Tween-20之PBS將孔洗滌3次。在3%牛血清白蛋白部分V (Roche 10735086001號)/ PBS 0.2% Tween20中稀釋HRP偶聯之多株抗-CD8a大鼠IgG抗體(USBiological 033547-HRP號)且將30µl此稀釋液添加至每一孔中。然後將板在室溫下於振盪器上培育1小時並使用100µl含有0.1% Tween-20之PBS洗滌3次。然後向每一孔中添加30µl TMB受質(BM-Blue，可溶性HRP受質，Roche 11484281001號)，隨後在室溫下於振盪器上培育25分鐘。然後藉由向每一孔中添加25µl硫酸來停止反應且在讀板儀中於450 nM下量測吸光度。藉由自平均結合值減去平均背景值來計算CD8a與HLAG之特異性結合。CD8與HLAG在不存在抗體下之總結合可視為100%結合或0%抑制。

圖4c中之條形圖展示與市售抗體相比由所闡述抗-HLA-G抗體達成之抑制%。與此設置中之所闡述抗體相比，市售HLA-G抗體87G並不阻斷HLA-G / CD8a相互作用，而MEM/G09及G233部分地抑制HLAG與CD8a之相互作用。

實例5
抗HLA-G抗體與細胞之結合
a) 細胞表面HLA-G結合ELISA

將25 µl/孔之JEG3細胞(天然表現HLA-G，20000個細胞/孔)、Skov-3細胞或在細胞表面上表現重組HLA-G之Skov-3細胞(10000個細胞/孔)接種至經組織培養物處理之384孔板(Corning, 3701)上並在37℃下培育過夜。第二天，添加12.5 µl抗-HLA-G試樣(1:3之最終稀釋液)並在4℃下培育2h。藉由添加50 µl/孔之戊二醛直至最終濃度為0.05% (Sigma目錄號：G5882；批號：056K5318)來固定細胞。在洗滌(3×90 µl/孔，使用PBST緩衝液)之後，添加25µl/孔之山羊-抗-小鼠H+L-POD (Biorad 170-6561號，1:2000於OSEP中)或驢-抗-兔IgG POD (GE NA9340V號，1:5000於OSE中)並在室溫下於振盪器上培育1 h。為檢測大鼠IgG，添加山羊-抗-大鼠IgG1-POD (Bethyl A110-106P號)、山羊-抗-大鼠IgG2a-POD (Bethyl A110-109P號)及山羊-抗-大鼠IgG2b-POD (Bethyl A110-111P號)之混合物(1:10000於OSEP中)並在室溫下於振盪器上培育1 h。在洗滌(4×90 µl/孔，使用PBST緩衝液)之後，添加25 µl/孔之TMB受質(Roche, 11835033001)並培育直至OD 2-3。在Tecan Safire 2儀器上於370/492 nm下實施量測。

上表匯總不同大鼠抗-人類HLA-G單株抗體與表現於不同細胞及細胞系上之HLA-G之結合，如藉由FACS分析所評價。闡述與表現HLA-G之天然JEG3腫瘤細胞或Skov3或PA-TU-8902轉染物及各別親代、未轉染細胞之結合。

b) HLA-G 抗體與表現於細胞上之天然或重組 HLA-G 之結合 ( 如藉由 FACS 分析所評價 )
在流式細胞術分析中，使用抗HLA-G mAb在4℃下將細胞染色。簡言之，將25µl/孔之每一細胞懸浮液(5×10⁴ 個細胞/孔)轉移至聚丙烯96孔V形底板中並在5℃下於冰箱中預冷凍10 min。將抗-HLA-G試樣在染色緩衝液中稀釋至80µg/ml之2倍起始濃度。對抗體實施4倍連續稀釋且將25µl/孔之抗體溶液添加至所製備細胞中並在5℃下培育1h。使用200µl/孔染色緩衝液將細胞洗滌兩次並在300g下離心3min。對於檢測而言，將螢光標記之抗-物種抗體(偶聯至Alexa 488之山羊抗大鼠IgG (H+L), Life technologies A11006號；或山羊抗小鼠IgG (H+L), Life technologies A11001號)或偶聯至Alexa 488之山羊抗-人類IgG (H+L), Life technologies A11013號)在染色緩衝液中稀釋至20µg/ml且將細胞糰粒再懸浮於50µl/孔檢測抗體中。在5℃下培育1小時之後，使用染色緩衝液將細胞再次洗滌兩次，再懸浮於70µl染色緩衝液中並在FACS Canto II上量測。

在圖4之FACS疊加圖中給出抗-HLA-G抗體HLA-G 0031、HLAG 0039、HLA-G 0041及HLA-G 0090之實例性FACS染色：
實例6
抗HLA-G抗體抑制/調節ILT2與表現於JEG3細胞上之HLA-G之結合
在分析中，使用ILT2-Fc融合蛋白(對照=無抑制)將JEG3細胞(ATCC HTB36)染色，且與或不與不同抗-HLA-G抗體一起預培育。對於與抗-HLA-G抗體一起預培育而言，將25µl/孔之細胞懸浮液轉移至聚丙烯96孔V形底板中並在4℃下預冷凍10min。將抗HLA-G抗體或參考抗體(G233、MEM-G/9或87G)在染色緩衝液中稀釋至80µg/ml之2倍濃度且將25µl/孔之抗體溶液添加至所製備細胞中並在5℃下培育1h。使用200µl/孔染色緩衝液將細胞洗滌兩次並在300g下離心3min且最後再懸浮於25µl/孔染色緩衝液中。

人類ILT2-Fc嵌合蛋白(RD 2017-T2-050號)與a)與抗HLA-G mAb預培育之JEG3細胞或b)未處理JEG3細胞(作為參考)之檢測測定如下：簡言之，將ILT2-Fc或對照人類IgG (Jackson-Immuno-Research 009-000-003號)在染色緩衝液中稀釋至20µg/ml (ILT2)之2倍濃度且將25µl/孔之ILT2-Fc蛋白溶液添加至所製備細胞中並在5℃下培育2h。使用200µl/孔染色緩衝液將細胞再次洗滌兩次。使用經螢光標記之抗人類IgG Fc-γ特異性抗體(F(ab')₂片段山羊抗-人類IgG，Fcγ片段特異性-FITC，Jackson-Immuno-Research 109-096-008號)以10µg/ml之稀釋度於染色緩衝液中檢測人類ILT2-Fc蛋白。將細胞糰粒再懸浮於50µl/孔檢測抗體中。在5℃下培育1小時之後，使用染色緩衝液將細胞洗滌兩次，再懸浮於70µl中並在FACS Canto II上量測以測定ILT2與JEG 3細胞。之結合

作為對照，藉由使用抗-物種抗體(偶聯至Alexa 488之山羊抗-大鼠IgG (H+L)，(Life technologies A11006號)；或山羊-抗小鼠IgG (H+L)-Alexa 488, (Life technologies, A11001號)在10µg/ml之濃度下檢測結合至JEG-3預培育細胞之抗-HLA-G抗體。

圖5中之圖形展示不同HLA-G抗體改良重組ILT2與天然表現於JEG3腫瘤細胞上之HLA-G之相互作用及結合的各別能力。

下表匯總來自實驗之結果。抗-HLA-G抗體與JEG3細胞之結合繪示為+ =弱結合- +++=強結合。抗-HLA-G抗體能夠抑制/阻斷或增加ILT2與表現HLA-G之JEG3細胞之結合。在最後一欄中，展示/量化重組ILT2與細胞之結合或其抑制/阻斷(將在不存在抗-HLA-G抗體下之ILT2-Fc染色設定為100%結合(0%抑制)，負值指示結合甚至增加；低於5%之染色信號差異不顯著且歸類為無效應)：

實例7
單核球細胞介素恢復分析(在HLA-G調介之抑制之後)
使用HLA-G表現細胞與單核球之下列共培養分析在功能上表徵不同大鼠抗-人類HLA-G單株抗體。自健康供體之血液分離周邊人類單核球。簡言之，將血液收集於含有抗凝血劑之管中並以1:2稀釋於PBS中。為分離末梢血單核細胞(PBMC)，將30ml混合物轉移至含有預填充分離培養基之每一Leucosep管中。在12min離心(1200×g，不停止)之後收集PBMC特異性帶，使用PBS洗滌三次並在300×g下離心10min。最後，將細胞糰粒再懸浮於來自Miltenyi之MACS緩衝液中且經由磁分離使用來自Miltenyi之人類單核球分離套組II (130-091-153號)根據製造商說明書自PBMC分離人類單核球(負向選擇)。將經分離單核球以5×10e5個細胞/ml之密度再懸浮於一級細胞培養基(RPMI 1640, PAN P04-17500號，補充有以下物質：10% FCS，Gibco 10500號；2mM L-麩醯胺酸，Sigma G7513號；1mM丙酮酸鈉，Gibco 11360號；MEM非必需胺基酸，Gibco 11140號；0.1mM 2-巰基乙醇，Gibco 31350號；MEM維他命，Gibco 11120號；青黴素(penicillin)/鏈黴素(streptomycin)，Gibco 15140號)中。藉由流式細胞術監測CD14⁺ CD16⁺ 細胞富集且分析細胞之ILT2及ILT4表現。對於富集單核球與HLA-G-表現細胞之共培養分析而言，在分析前一天，將JEG-3細胞( (ATCC HTB36)以8×10e3個細胞/孔接種至96孔平底組織培養板中之100µl JEG-3培養基(含有EBSS及L-麩醯胺酸之MEM Eagle，PAN P04-00509號，補充有以下物質：10% FCS, Gibco 10500號；1mM丙酮酸鈉，Gibco 11360號；MEM非必需胺基酸，Gibco 11140號)中以在分析當天形成鋪滿層。。在一些實驗中，使用JEG-3 HLAG敲除細胞系並如上文所闡述與JEG-3 wt細胞一般進行接種。將黏附JEG-3細胞與抗HLA-G抗體之4倍連續稀釋液在一級細胞培養基中一起預培育。因此，去除來自黏附JEG-3細胞之上清液且添加50µl/孔之所製備抗體溶液並在37℃及5% CO2下於加濕氣氛中培育1h。將人類單核球以2,5×10e4個人類單核球/孔添加至50µl一級細胞培養基中之與抗HLA-G抗體預培育之JEG-3細胞中且將共培養物在37℃及5% CO2下於加濕氣氛中培育過夜(大約18-20小時)。第二天，使用50ng/ml LPS實施LPS刺激7h且然後收穫共培養物之上清液。使用來自eBioscience之Human TNF alpha ELISA Ready-SET-Go!® (88-7346-88號)測定共培養上清液之TNFα濃度。

下表匯總給定HLA-G抗體在不同抗體特性下針對特定供體之功能特性。
表格： 功能抗 -HLA-G 抗體能夠恢復 HLA-G 特異性抑制之免疫反應 ， 亦即恢復與 HLA-G 表現細胞共培養之單核球之 LPS 誘導之 TNFa 產生： 功能抗 -HLA-G 抗體之 TNF 釋放 ( 恢復 ) 百分比 (%)

功能抗-HLA-G抗體能夠誘導(恢復抑制)免疫反應，亦即恢復與HLA-G表現細胞共培養之單核球之LPS誘導之TNFa產生(對於HLAG特異性TNF誘導之陰性對照而言，使用HLAG敲除細胞系來區分抗體展示無TNF誘導(真正HLA-G特異性)抑或在敲除細胞系上展示TNF誘導(其不為HLAG特異性)。

使用下列條件計算抗-HLA-G抗體之TNF誘導%值：JEG3細胞及單核球之未處理共培養物= 0%，僅單核球培養物(無HLA-G誘導之抑制) = 100%。

自上表顯而易見，本發明抗體能夠誘導與表現HLA-G之JEG-3細胞一起共培養之單核球中之TNFα釋放，而其不能誘導與具有HLA-G敲除之JEG-3細胞一起共培養之單核球中之TNFα釋放。

自表格顯而易見，參考抗體並無真正HLA-G特異性，此乃因其亦在HLA-G敲除細胞系中誘導強TNFα釋放。

端視供體(下文之不同供體)，TNF釋放(恢復)百分比(%)有所變化。

圖 1 ： HLA-G之不同同種型

圖 2 ：圖 2A ：具有與ß2M締合之分子之HLA-G示意圖示

圖 2B ：與某些受體締合之HLA-G分子：HLA-G結構與給定受體(例如ILT4及KIR2DL1)之複合物。ILT4結構(PDB代碼：2DYP)。自PDB代碼1IM9 (KIR2DL1: HLA-Cw4複合物結構)獲取KIR2DL1結構且藉由疊加HLA-Cw4及HLA-G結構來定位於HLA-G上。受體係以絲帶圖示來展示，HLA-G係以分子表面圖示來展示。在其他HLA同種同源物中獨特或保守之HLA-G殘基分別呈白色及灰色。獨特表面殘基由嵌合反抗原中之HLA共有序列代替。

圖 3 ：抑制(或刺激) HLA-G與ILT2及ILT4以及CD8之相互作用/結合之HLA-G抗體：

圖 3A ：ILT2抑制

圖 3B ：ILT4抑制

圖 3C ：CD8抑制

圖 4 ：使用HLA-G抗體之JEG3 (天然表現HLA-G之細胞)、SKOV-3細胞(野生型(wt)對HLAG轉染細胞(HLAG+))及PA-TU-8902細胞(野生型(wt)對HLAG轉染細胞(HLAG+))上之HLA-G細胞表面表現之流式細胞術分析：

圖 4A ： HLA-G-0031 (0031號)；圖 4B ： HLA-G-0039 (0039號)；圖 4C ： HLA-G-0041 (0041號) ；圖 4D ： HLA-G-0090 (0090號)

圖 5 ：圖 5A ：抗-HLA-G抗體(0031、0039、0041及0090)阻斷/調節人類ILT2 Fc嵌合體與表現於JEG3細胞上之HLA-G之相互作用：

藉由使用偶聯至Alexa488之抗大鼠IgG二級抗體來評價新穎抗-HLA-G抗體對細胞表面HLA-G之染色(上列 )。以FACS直方圖形式展示經單獨二級抗體染色之細胞(灰色虛線)及經抗-HLA-G抗體染色之細胞(黑色實線)。在下部列 中，繪示與經單獨二級抗體染色之細胞(灰色虛線)相比，結合至JEG3細胞上之HLA-G之人類ILT2-Fc (黑色虛線)。可看到使用HLA-G抗體預培育JEG3細胞對ILT2 Fc嵌合體結合之影響(黑色實線)：HLA-G-0031及HLA-G-0090展示幾乎完全抑制ILT2-Fc嵌合體與JEG3細胞之結合。有趣的是，兩種抗體0039及0041甚至增加ILT2:fc與細胞之結合。

圖 5B ：商業/參考抗-HLA-G抗體對ILT2 Fc嵌合體與JEG3細胞上之HLA-G之結合之影響：

藉由使用偶聯至Alexa488之物種特異性二級抗體(上列 )來評價商業/參考抗-HLA-G抗體對細胞表面HLA-G之染色。以FACS直方圖形式展示經單獨二級抗體染色之細胞(灰色虛線)及經抗-HLA-G抗體染色之細胞(黑色實線)。在下部列 中，繪示與經單獨二級抗體染色之細胞(灰色虛線)相比，結合至JEG3細胞上之HLA-G之人類ILT2 Fc嵌合體(黑色虛線)。可看到使用參考抗體預培育JEG3細胞對ILT2 Fc嵌合體結合之影響(黑色實線)。並無測試參考抗體可阻斷ILT2 Fc嵌合體與JEG3細胞上之細胞表面HLA-G之相互作用。

圖 6 ：在不同供體上評價之使用抑制性抗-HLA-G抗體阻斷HLA-G對恢復TNFα產生之影響。

圖 6A ：在代表性單核球供體上評估之抗-HLAG抗體HLA-G-0031 (0031號)、HLA-G-0039 (0039號)及HLA-G-0041 (0041號)。

圖 6B ：在不同單核球供體上評估之抗-HLAG抗體HLA-G-0090 (0090號)]。

圖 6C ：wt JEG-3細胞及經敲低變體中之HLAG表現之西方印漬(Western blot)分析。

Claims

一種經分離之抗體，其結合至人類HLA-G；且抑制ILT2結合至JEG-3細胞(ATCC HTB36)上之HLAG，並恢復與JEG-3細胞一起共培養之單核球之HLA-G特異性抑制之TNFα釋放。
一種結合至人類HLA-G之經分離之抗體，其中該抗體包括 A) (a) VH結構域，其包括：(i)包括SEQ ID NO:1之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包括SEQ ID NO:2之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii)包括選自SEQ ID NO:3之胺基酸序列之HVR-H3；及(b) VL結構域，其包括：(i)包括SEQ ID NO:4之胺基酸序列之HVR-L1；(ii)包括SEQ ID NO:5之胺基酸序列之HVR-L2，及(iii)包括SEQ ID NO:6之胺基酸序列之HVR-L3；或 B) (a) VH結構域，其包括：(i)包括SEQ ID NO:9之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包括SEQ ID NO:10之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii)包括選自SEQ ID NO:11之胺基酸序列之HVR-H3；及(b) VL結構域，其包括：(i)包括SEQ ID NO:12之胺基酸序列之HVR-L1；(ii)包括SEQ ID NO:13之胺基酸序列之HVR-L2，及(iii)包括SEQ ID NO:14之胺基酸序列之HVR-L3；或 C) (a) VH結構域，其包括：(i)包括SEQ ID NO:17之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包括SEQ ID NO:18之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii)包括選自SEQ ID NO:19之胺基酸序列之HVR-H3；及(b) VL結構域，其包括：(i)包括SEQ ID NO:20之胺基酸序列之HVR-L1；(ii)包括SEQ ID NO:21之胺基酸序列之HVR-L2，及(iii)包括SEQ ID NO:22之胺基酸序列之HVR-L3；或 D) (a) VH結構域，其包括：(i)包括SEQ ID NO:25之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包括SEQ ID NO:26之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii)包括選自SEQ ID NO:27之胺基酸序列之HVR-H3；及(b) VL結構域，其包括：(i)包括SEQ ID NO:28之胺基酸序列之HVR-L1；(ii)包括SEQ ID NO:29之胺基酸序列之HVR-L2，及(iii)包括SEQ ID NO:30之胺基酸序列之HVR-L3。
如請求項2之抗體，其中該抗體包括 A) iv) 包括SEQ ID NO:7之VH序列及SEQ ID NO:8之VL序列； v) 或i)之抗體之VH及VL之人類化變體；或 vi) 包括SEQ ID NO:33之VH序列及SEQ ID NO:34之VL序列；或 B) 包括SEQ ID NO:15之VH序列及SEQ ID NO:16之VL序列；或 C) 包括SEQ ID NO:23之VH序列及SEQ ID NO:24之VL序列；或 D) 包括SEQ ID NO:31之VH序列及SEQ ID NO:32之VL序列。
一種結合至人類HLA-G之經分離之抗體，其中該抗體 a)與包括SEQ ID NO:7之VH序列及SEQ ID NO:8之VL序列之抗體結合至相同表位(epitope)；或b)與包括SEQ ID NO:31之VH序列及SEQ ID NO:32之VL序列之抗體結合至相同表位。
如請求項1至4中任一項之抗-HLA-G抗體，其中該抗體 a) 不與包括SEQ ID NO:44之經修飾人類HLA-G ß2M MHC I複合物交叉反應；及/或 b) 不與包括SEQ ID NO:39及SEQ ID NO: 37之人類HLA-A2 ß2M MHC I複合物交叉反應；及/或 c) 不與包括SEQ ID NO:45之小鼠H2Kd ß2M MHC I複合物交叉反應；及/或 d) 不與包括SEQ ID NO:47之大鼠RT1A ß2M MHC I複合物交叉反應；及/或 e) 抑制ILT2結合至單體HLA-G ß2M MHC I複合物；及/或 f) 抑制ILT2結合至三聚體HLA-G ß2M MHC I複合物；及/或 g) 對ILT2與單體及/或二聚體及/或三聚體HLA-G ß2M MHC I複合物之結合抑制50%以上；及/或 h) 抑制ILT2結合至JEG3細胞(ATCC編號HTB36)；及/或 i) 結合至JEG3細胞(ATCC編號HTB36)上之HLA-G，且抑制ILT2結合至JEG3細胞(ATCC編號HTB36)上之HLA-G；及/或 j) 對CD8a與HLAG之結合抑制80%以上。
如請求項1至4中任一項之抗體，其中該抗體係IgG1同型(isotype)。
如請求項6之抗體，其中該抗體係具有突變L234A、L235A及P329G (根據Kabat之EU索引編號)之IgG1同型。
一種經分離之核酸，其編碼如請求項1至4中任一項之抗體。
一種宿主細胞，其包括如請求項8之核酸。
一種產生抗體之方法，其包括培養如請求項8之宿主細胞，以產生該抗體。
如請求項10之方法，其進一步包括自該宿主細胞回收該抗體。
一種醫藥調配物，其包括如請求項1至7中任一項之抗體及醫藥上可接受之載劑。
如請求項1至4中任一項之抗體，其用作藥劑。
如請求項1至4中任一項之抗體，其用於治療癌症。
一種如請求項1至7中任一項之抗體之用途，其用於製造藥劑。