KR102608672B1

KR102608672B1 - 항-hla-g 항체 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102608672B1
Application number: KR1020207033024A
Authority: KR
Inventors: 스테판 뎅글; 제바스티안 펜; 옌스 피셔; 안드레아스 힌츠; 클라우디아 키르스텐파트; 스테판 클로스테르만; 외르크 묄레켄; 게오르크 티펜탈러; 자비네 호베스; 알렉산더 부요체크; 메허 마예티
Original assignee: 에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date: 2018-04-18
Filing date: 2019-04-17
Publication date: 2023-11-30
Also published as: CO2020012347A2; CR20200483A; IL277308A; AU2019254596A1; SG11202009695QA; BR112020020588A2; JP7186239B2; MA52284A; ZA202006066B; MX2020010951A; JP2021521791A; KR20210005080A; CA3094895A1; TW201945395A; AR114789A1; CN112004831A; PE20201419A1; EP3781593A1; CN112004831B; CL2020002540A1

Abstract

본 발명은 항-HLA-G 항체 및 이의 사용 방법에 관한 것이다.

Description

항-HLA-G 항체 및 이의 용도

본 발명은 항-HLA-G 항체, 이의 생산, 제형 및 이의 사용 방법에 관한 것이다.

인간 주요 조직적합성 복합체, 클래스 I, 6(인간 백혈구 항원 G(HLA-G)로도 공지됨)은 인간에서 HLA-G 유전자에 의해 암호화되는 단백질이다. HLA-G는 HLA 비전형적 클래스 I 중쇄 패럴로그(paralogue)에 속한다. 이러한 클래스 I 분자는 중쇄 및 경쇄로 이루어진 이종이량체(베타-2 마이크로 글로불린)이다. 중쇄는 막에 고정되나 탈락/분비될 수도 있다.

· 중쇄는 3개의 도메인으로 이루어진다: 알파 1, 알파 2 및 알파 3. 알파 1 및 알파 2 도메인은 2개의 알파 나선에 의해 플랭킹된 펩티드 결합 홈을 형성한다. 작은 펩티드(약 9-mer)는 다른 MHC I 단백질과 유사한 이러한 홈에 결합할 수 있다.

· 제2 쇄는 다른 MHC I 단백질과 유사한 중쇄에 결합하는 베타 2 마이크로 글로불린이다.

HLA-G의 경우, 7개의 동형, 즉 3개의 분비된 형태 및 4개의 막-결합된 형태가 존재한다(도 1에 개략적으로 도시됨).

HLA-G는 기능적으로 활성인 복합 올리고머성 구조를 형성할 수 있다(문헌[Kuroki, K et al. Eur J Immunol. 37 (2007) 1727-1729]). 다이설파이드-연결된 이량체는 2개의 HLA-G 분자의 Cys 42 사이에 형성된다(문헌[Shiroishi M et al., J Biol Chem 281 (2006) 10439-10447]). 또한, 삼량체 및 사량체 복합체가 예를 들어 문헌[Kuroki, K et al. Eur J Immunol. 37 (2007) 1727-1729], [Allan D.S., et al. J Immunol Methods. 268 (2002) 43-50] 및 [T Gonen-Gross et al., J Immunol 171 (2003)1343-1351]에 기재되어 있다.

HLA-G는 주로 태반의 세포영양막 상에서 발현된다. 여러 종양(췌장, 유방, 피부, 대장, 위 및 난소 종양을 포함함)은 HLA-G를 발현한다(문헌[Lin, A. et al., Mol Med. 21 (2015) 782-791]; [Amiot, L., et al., Cell Mol Life Sci. 68 (2011) 417-431]). 또한, 발현은 병리학적 질환, 예컨대 염증성 질환, GvHD 및 암과 관련된 것으로 보고되었다. HLA-G의 발현은 암에서의 불량한 예후와 관련된 것으로 보고되었다. 종양 세포는 HLA-G 발현을 통해 면역 관용/억제를 유도함으로써 숙주 면역 감시를 벗어난다.

HLA-G는 다른 MHC I 분자와 높은 동종성(>98%)을 공유하고, 따라서 다른 MHC I 분자에 대한 교차반응성을 갖지 않는 엄밀한 HLA-G 특이적 항체를 생산하기 어렵다.

여러 방법으로 HLA-G와 상호작용하는 특정 항체는 이전에 기술되었다: 문헌[Tissue Antigens, 55 (2000) 510-518]은 단클론 항체, 예를 들어 87G 및 MEM-G/9에 관한 것이고; 문헌[Neoplasma 50 (2003) 331-338]은 온전한 HLA-G 올리고머성 복합체(예를 들어 87G 및 MEM-G9) 및 HLA-G 프리 중쇄(예를 들어 4H84, MEM-G/1 및 MEM-G/2) 모두를 인식하는 특정 단클론 항체에 관한 것이다; 문헌[Hum Immunol. 64 (2003) 315-326]은 HLA-G 발현 JEG3 종양 세포에 대해 시험된 여러 항체에 관한 것이다(예를 들어 천연 HLA-G1 분자와 배타적으로 반응하는 MEM-G/09 및 -G/13). MEM-G/01은 (4H84 mAb와 유사하게) 모든 동형의 변성 HLA-G 중쇄를 인식하는 반면에, MEM-G/04는 변성 HLA-G1, -G2 및 -G5 동형을 선택적으로 인식한다; 문헌[Wiendl et al Brain 2003 176-85]은 상이한 단클론 HLA-G 항체, 예를 들어 87G, 4H84, MEM-G/9에 관한 것이다.

상기 문헌은 인간 HLA-G 또는 인간 HLA-G/ß2M MHC 복합체에 결합하는 항체를 보고한다. 그러나, HLA 패밀리의 높은 다형성 및 높은 동종성으로 인해, 대부분의 항체는 엄밀하게 특이적인 HLA-G 결합 특성이 부족하고 흔히 또한 다른 HLA 패밀리 구성원에 결합하거나 이와 교차반응하거나(ß2M과의 MHC 복합체 또는 이의 ß2M-프리 형태로서), 이는 단순히 수용체 ILT2 및/또는ILT4에 대한 HLA-G ß2M MHC 복합체의 결합을 억제하지 않는다(비-길항성 항체로서 간주된다).

따라서, 수용체 억제 특성을 갖는 추가로 개선된 엄밀한 HLA-G 특이적 항체를 생산하고/하거나 선택할 필요가 있다.

한 양태에서, 본 발명은, 인간 HLA-G에 결합하고, JEG-3 세포(ATCC HTB36) 상의 HLAG에 대한 ILT2 결합을 억제하고, HLA-G 특이적인 억제된 TNF 알파 방출을 JEG-3 세포와 공-배양된 단핵구에 의해 회복시키는 항체를 제공한다.

본 발명의 한 실시양태는 인간 HLA-G에 결합하는 단리된 항체이되(한 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 43을 포함하는 HLA-G ß2M MHC I 복합체에 결합함), 상기 항체는 하기를 포함한다:

A) (a) (i) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (iii) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인;

B) (a) (i) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (iii) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인;

C) (a) (i) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (iii) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인; 또는

D) (a) (i) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (iii) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인.

본 발명의 한 실시양태는 인간 HLA-G에 결합하는 단리된 항체이되(한 실시양태에서, 항체는 서열번호 43을 포함하는 HLA-G ß2M MHC I 복합체에 결합함), 상기 항체는

A) i) 서열번호 7의 VH 서열 및 서열번호 8의 VL 서열, 또는

ii) 상기 i)의 항체의 VH 및 VL의 인간화된 변이체를 포함하거나;

B) i) 서열번호 15의 VH 서열 및 서열번호 16의 VL 서열, 또는

C) i) 서열번호 23의 VH 서열 및 서열번호 24의 VL 서열, 또는

D) i) 서열번호 31의 VH 서열 및 서열번호 32의 VL 서열, 또는

ii) 상기 i)의 항체의 VH 및 VL의 인간화된 변이체를 포함한다.

한 실시양태에서, 본원에 기재된 항-HLA-G 항체는

a) 서열번호 44를 포함하는 변형된 인간 HLA-G ß2M MHC I 복합체와 교차반응하지 않고/않거나;

b) 서열번호 39 및 서열번호 37을 포함하는 인간 HLA-A2 ß2M MHC I 복합체와 교차반응하지 않고/않거나;

c) 서열번호 45를 포함하는 마우스 H2Kd ß2M MHC I 복합체와 교차반응하지 않고/않거나;

d) 서열번호 47을 포함하는 래트 RT1A ß2M MHC I 복합체와 교차반응하지 않고/않거나;

e) 단량체성 HLA-G ß2M MHC I 복합체(서열번호 43을 포함함)에 대한 ILT2 결합을 억제하고/하거나;

f) 삼량체성 HLA-G ß2M MHC I 복합체(서열번호 43을 포함함)에 대한 ILT2 결합을 (항체의 부재 하에 결합과 비교하여) 50% 초과만큼(한 실시양태에서 60% 초과만큼) 억제하고/하거나(실시예 4b 참조);

g) 단량체성 및/또는 이량체성 및/또는 삼량체성 HLA-G ß2M MHC I 복합체(서열번호 43을 포함함)에 대한 ILT2 결합을 (항체의 부재 하에 결합과 비교하여) 50% 초과만큼(한 실시양태에서 80% 초과만큼) 억제하고/하거나(실시예 4b 참조);

h) JEG3 세포(ATCC 번호 HTB36)(상의 HLA-G)에 대한 ILT2 결합을 (항체의 부재 하에 결합과 비교하여) (50% 초과만큼(한 실시양태에서 80% 초과만큼)) 억제하고/하거나(실시예 6 참조);

i) JEG3 세포(ATCC 번호 HTB36)(상의 HLA-G)에 결합하고(실시예 5 참조), JEG3 세포(ATCC 번호 HTB36)(상의 HLA-G)에 대한 ILT2 결합을 (항체의 부재 하에 결합과 비교하여) (50% 초과만큼(한 실시양태에서 80% 초과만큼)) 억제하고/하거나(실시예 6 참조);

j) HLAG에 대한 CD8a 결합을 (항체의 부재 하에 결합과 비교하여) 80% 초과만큼 억제한다(예를 들어 실시예 4c 참조).

한 실시양태에서, 항-HLA-G 항체는 IgG1 이소타입의 것이다.

한 실시양태에서, 항-HLA-G 항체는 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G(카밧의 EU 인덱스에 따른 넘버링)를 갖는 IgG1 이소타입의 것이다.

바람직한 한 실시양태에서, 항-HLA-G 항체는 단량체성 HLA-G ß2M MHC I 복합체에 대한 ILT2 결합을 억제한다.

한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항-HLA-G 항체는 단클론 항체이다.

한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항-HLA-G 항체는 인간 항체, 인간화된 항체 또는 키메라 항체이다.

한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항-HLA-G 항체는 HLA-G에 결합하는 항체 단편이다.

한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항-HLA-G 항체는 Fab 단편이다.

본 발명은 이전 청구항 중 어느 하나에 따른 항체를 암호화하는 단리된 핵산을 제공한다.

본 발명은 상기 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.

본 발명은 숙주 세포를 배양하여 항체를 생산하는 단계를 포함하는 항체의 생산 방법을 제공한다.

본 발명은 항체를 숙주 세포로부터 회수하는 단계를 추가로 포함하는, 항체의 생산 방법을 제공한다.

본 발명은 본원에 기재된 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 제형을 제공한다.

본 발명은 약제로서 사용하기 위한 본원에 기재된 항체를 제공한다.

본 발명은 암의 치료에서 사용하기 위한 본원에 기재된 항체를 제공한다.

본 발명은 약제의 제조에서 본원에 기재된 항체의 용도를 제공한다. 한 실시양태에서, 약제는 암의 치료를 위한 것이다.

본 발명은 암을 앓는 개체의 치료 방법을 제공하되, 이는 상기 개체에게 효과량의 본원에 기재된 항체를 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명은 맞춤 키메라 항원 및/또는 스트린젠트 스크리닝 분석을 사용하여(다른 MHC 클래스 I 복합체 분자에 대한 교차반응성을 피하고 동시에 HLA-G 수용체(예컨대 ILT2) 차단 항체를 피하여) 많은 후보 중에서 HLA-G 특이적 항체를 확인하며, 이는 HLA-G를 발현하는 JEG-3 세포 및 단핵구의 공-배양물에서 TNF 알파의 HLA-G 특이적 유도(회복)를 나타낸다. 본원에 기재된 스크리닝 방법에 의해 새로운 항-HLA-G 항체가 선택될 수 있다. 이들 항체는 매우 가치 있는 특성, 예컨대 JEG3 세포 상에 발현된 HLA-G에 대한 ILT2 결합의 강한 억제 또는 단량체성 및/또는 이량체성 및/또는 삼량체성 HLA-G ß2M MHC I 복합체에 대한 ILT2 결합의 억제를 나타낸다.

본 발명은, 인간 HLA-G에 특이적으로 결합하고 HLAG에 대한 ILT2 결합을 억제하고 HLA-G 특이적인 억제된 면역 반응을 회복하는(HLA-G 발현 세포(예를 들어 JEG-3 세포)와의 공-배양물에서 단핵구에 의한 리포폴리사카라이드(LPS)-유도된 TNF알파 생산/분비의 회복) 항체를 제공한다. HLA-G 발현 세포, 예컨대 JEG-3 세포에 의한 단핵구의 엄밀한 HLA-G 특이적 면역 억제의 회복은 HLA-G 녹아웃(knock-out) JEG-3 세포와의 비교에서 평가될 수 있다.

따라서, 본 발명의 항체는, 미처리된 공-배양된 JEG-3 세포와 비교하여, HLA-G를 발현하는 JEG-3 세포 및 단핵구의 리포폴리사카라이드(LPS) 자극된 공-배양물에서 TNF 알파의 HLAG 특이적 방출을 회복한다(미처리된 세포를 0% 음성 기준으로서 취하고; 단핵구 단독 배양물을 100% 양성 기준으로서 취하고, 여기서 TNF 알파 부분은 임의의 HLA-G/IL-T2 특이적 효과에 의해 억제되지 않는다(실시예 7 참조)).

또한, 항체는 고도로 특이적이고 HLA-A MHC I 복합체 또는 마우스 또는 래트 기원의 MHC I 복합체와의 교차반응성을 나타내지 않는다.

도 1: HLA-G의 상이한 동형.
도 2: 도 2a: ß2M와 회합된 분자를 갖는 HLA-G의 개략도.
도 2b: 특정 수용체와 회합된 HLA-G 분자의 구조: 제시된 수용체, 예컨대 ILT4 및 KIR2DL1과의 복합체에서 HLA-G 구조. ILT4 구조(PDB 코드: 2DYP). KIR2DL1 구조는 PDB 코드 1IM9로부터 가져오고(KIR2DL1: HLA-Cw4 복합체 구조) HLA-Cw4 및 HLA-G 구조의 중첩에 의해 HLA-G 상에 위치시켰다. 수용체는 리본 표시로 나타냈고, HLA-G는 분자 표면 표현으로 나타냈다. 고유하거나 다른 HLA 패럴로그에서 보존된 HLA-G 잔기는 각각 백색 및 회색으로 채색하였다. 고유한 표면 잔기는 키메라 대응 항원의 HLA 공통 서열에 의해 대체된다.
도 3: ILT2, ILT4 및 CD8과의 HLA-G 상호작용/결합을 억제하는(또는 자극하는) HLA-G 항체.
도 3a: ILT2 억제; 도 3b: ILT4 억제; 도 3c: CD8 억제.
도 4: JEG3(HLA-G를 자연적으로 발현하는 세포), SKOV-3 세포(야생형(wt) 대 HLAG 형질감염된 세포(HLAG+)) 및 PA-TU-8902 세포(야생형(wt) 대 HLAG 형질감염된 세포(HLAG+)) 상의 HLA-G 항체를 사용한 HLA-G의 세포 표면 발현의 유세포 분석.
도 4a: HLA-G-0031(#0031); 도 4b: HLA-G-0039(#0039); 도 4c: HLA-G-0041(#0041); 도 4d: HLA-G-0090(#0090).
도 5: 도 5a: 항-HLA-G 항체(0031, 0039, 0041 및 0090)는 인간 ILT2 Fc 키메라와 JEG3 세포 상에 발현된 HLA-G의 상호작용을 차단/조절한다.
새로운 항-HLA-G 항체에 의한 세포 표면 HLA-G의 염색을 Alexa488과 접합된 항-래트 IgG 이차 항체를 사용하여 평가하였다(윗줄). FACS 히스토그램에 이차 항체 단독으로 염색된 세포(회색 점선) 및 항-HLA-G 항체로 염색된 세포(흑색 실선)를 나타냈다. 아랫줄에서, 이차 항체 단독으로 염색된 세포(회색 점선)와 비교하여 JEG3 세포 상의 HLA-G에 결합된 인간 ILT2-Fc를 도시하였다(흑색 점선). JEG3 세포를 HLA-G 항체와 함께 예비-배양하는 것의 ILT2 Fc 키메라 결합에 대한 영향을 알 수 있다(흑색 실선): HLA-G-0031 및 HLA-G-0090는 JEG3 세포에 대한 ILT2-Fc 키메라의 결합의 거의 완전한 억제를 나타냈다. 놀랍게도, 2개의 항체 0039 및 0041은 심지어 세포에 대한 ILT2:fc 결합을 증가시킨다.
도 5b: JEG3 세포 상의 HLA-G에 대한 ILT2 Fc 키메라 결합에 대한 상업적/기준 항-HLA-G 항체의 영향.
상업적/기준 항-HLA-G 항체에 의한 세포 표면 HLA-G의 염색을 Alexa488에 접합된 종 특이적 이차 항체를 사용하여 평가하였다(윗줄). FACS 히스토그램에서, 이차 항체 단독으로 염색된 세포(회색 점선) 및 항-HLA-G 항체로 염색된 세포(흑색 실선)를 나타냈다. 아랫줄에서, 이차 항체 단독으로 염색된 세포(회색 점선)와 비교하여, JEG3 세포 상의 HLA-G에 결합된 인간 ILT2 Fc 키메라를 도시하였다(흑색 점선). JEG3 세포를 기준 항체와 함께 예비-배양하는 것의 ILT2 Fc 키메라 결합에 대한 영향을 알 수 있다(흑색 실선). 시험한 기준 항체 중 ILT2 Fc 키메라와 JEG3 세포 상의 세포 표면 HLA-G의 상호작용을 차단할 수 있는 것은 없었다.
도 6: 상이한 공여자에 대해 평가한, 억제성 항-HLA-G 항체에 의한 HLA-G의 봉쇄의 TNFα 생산의 회복에 대한 영향.
도 6a: 대표적인 단핵구 공여자에 대해 평가된 항-HLAG 항체 HLA-G-0031(#0031), HLA-G-0039(#0039) 및 HLA-G-0041(#0041).
도 6b: 상이한 단핵구 공여자에 대해 평가된 항-HLAG 항체 HLA-G-0090(#0090).
도 6c: wt JEG-3 세포 및 녹다운(knock down) 변이체에서 HLAG 발현의 웨스턴 블롯(Western blot) 분석.
도 7: 항-HLA-G/항-CD3 이중특이적 항체(P1AA1185 및 P1AD9924)의 세포 상에 발현된 천연 또는 재조합 HLA-G에 대한 HLA-G TCB 항체의 결합(FACS 분석에 의해 평가됨).
도 8: HLAG TCB 매개된 T 세포 활성화(항-HLA-G/항-CD3 이중특이적 TCB 항체(P1AA1185 및 P1AD9924)).
도 9: T 세포에 의한 HLAG TCB 매개된 IFN 감마 분비(항-HLA-G/항-CD3 이중특이적 TCB 항체 P1AA1185 및 P1AD9924).
도 10: 항-HLA-G/항-CD3 이중특이적 TCB 항체(P1AA1185 및 P1AD9924)에 의한 T 세포 매개된 세포독성/종양 세포 사멸의 유도.
도 11: 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자의 예시적 배열. (A, D) "1+1 CrossMab" 분자의 예시도. (B, E) 대안적 순서의 Crossfab 및 Fab 성분을 갖는("반전됨") "2+1 IgG Crossfab" 분자의 예시도. (C, F) "2+1 IgG Crossfab" 분자의 예시도. (G, K) 대안적 순서의 Crossfab 및 Fab 성분을 갖는("반전됨") "1+1 IgG Crossfab" 분자의 예시도. (H, L) "1+1 IgG Crossfab" 분자의 예시도. (I, M) 2개의 CrossFab를 갖는 "2+1 IgG Crossfab" 분자의 예시도. (J, N) 2개의 CrossFab 및 대안적 순서의 Crossfab 및 Fab 성분을 갖는("반전됨") "2+1 IgG Crossfab" 분자의 예시도. (O, S) "Fab-Crossfab" 분자의 예시도. (P, T) "Crossfab-Fab" 분자의 예시도. (Q, U) "(Fab)2-Crossfab" 분자의 예시도. (R, V) "Crossfab-(Fab)2" 분자의 예시도. (W, Y) "Fab-(Crossfab)2" 분자의 예시도. (X, Z) "(Crossfab)2-Fab" 분자의 예시도. 흑색 점: 이종이량체화를 촉진하는 Fc 도메인의 임의적 변형. ++, --: CH1 및 CL 도메인에 임의적으로 도입된 반대 전하의 아미노산. Crossfab 분자는 VH 및 VL 영역의 교환을 포함하는 것으로서 도시되나, 전하 변형이 CH1 및 CL 도메인에 도입되지 않은 실시양태에서, CH1 및 CL 도메인의 교환을 대안으로 포함할 수 있다.

본원에 사용될 때, 용어 "HLA-G" 또는 "인간 HLA-G"는 인간 백혈구 항원 G(HLA-G)로 공지된 HLA-G 인간 주요 조직적합성 복합체, 클래스 I, G를 지칭한다(예시적 서열번호 35). 전형적으로, HLA-G는 β2 마이크로 글로불린(B2M 또는 β2m)과 함께 MHC 클래스 I 복합체를 형성한다. 한 실시양태에서, HLA-G는 HLA-G 및 β2 마이크로 글로불린의 MHC 클래스 I 복합체를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같이, "인간 HLA-G에 결합하는" 항체, " 인간 HLA-G에 특이적으로 결합하는" 항체 또는 "항-HLA-G 항체"는 5.0 x 10^-8 mol/l 이하의 KD 값, 한 실시양태에서 1.0 x 10^-9 mol/l 이하의 KD 값, 한 실시양태에서 5.0 x 10^-8 내지 1.0 x 10^-13 mol/l의 KD 값의 결합 친화성에 의한 인간 HLA-G 항원 또는 이의 세포외 도메인(ECD)에 특이적으로 결합하는 항체를 지칭한다. 한 실시양태에서, 항체는 서열번호 43을 포함하는 HLA-G ß2M MHC I 복합체에 결합한다.

결합 친화성은 예를 들어 HLA-G 세포외 도메인을 포함하는 구축물(예를 들어 이의 자연 발생 3-차원 구조물)을 사용하여 표준 결합 분석, 예컨대 표면 플라즈몬 공명 기술(비아코어(BIAcore, 등록상표), 지이-헬스케어(GE-Healthcare, 스웨덴 웁살라 소재))에 의해 결정된다. 한 실시양태에서, 결합 친화성은 서열번호 43을 포함하는 MHC 클래스 I 복합체를 포함하는 예시적 가용성 HLA-G를 사용하여 표준 결합 분석에 의해 결정된다.

HLA-G는 통상적 MHC I 폴드(fold)를 가지며, 2개의 쇄로 이루어진다: 쇄 1은 3개의 도메인으로 이루어진다: 알파 1, 알파 2 및 알파 3. 알파 1 및 알파 2 도메인은 2개의 알파 나선에 의해 플랭킹된 펩티드 결합 홈을 형성한다. 작은 펩티드(약 9-mer)는 다른 MHCI 단백질과 유사한 이러한 홈에 결합할 수 있다. 쇄 2는 다양한 다른 MHCI 단백질과 공유되는 베타 2 마이크로 글로불린이다.

HLA-G는 기능적으로 활성인 복합 올리고머성 구조를 형성할 수 있다(문헌[Kuroki, K et al. Eur J Immunol. 37 (2007) 1727-1729]). 다이설파이드-연결된 이량체는 2개의 HLA-G 분자의 Cys 42 사이에 형성된다(문헌[Shiroishi M et al., J Biol Chem 281 (2006) 10439-10447]). 또한, 삼량체 및 사량체 복합체는 예를 들어 문헌[Kuroki, K et al. Eur J Immunol. 37 (2007) 1727-1729], [Allan D.S., et al. J Immunol Methods. 268 (2002) 43-50] 및 [T Gonen-Gross et al., J Immunol 171 (2003)1343-1351]에 기재되어 있다. HLA-G는 대부분의 다른 MHC 클래스 I 분자와는 다르게 여러개의 유리 시스테인 잔기를 갖는다. 문헌[Boyson et al., Proc Nat Acad Sci USA, 99: 16180 (2002)]은, HLA-G5의 재조합 가용성 형태가 분자간 Cys42-Cys42 다이설파이드 결합을 갖는 다이설파이드-연결된 이량체를 형성할 수 있음을 보고하였다. 또한, HLA-G1의 막-결합된 형태는 또한 Jeg3 세포주의 세포 표면 상에 다이설파이드-연결된 이량체를 형성할 수 있고, 이는 HLA-G를 내생적으로 발현한다. HLA-G1 및 HLA-G5의 다이설파이드-연결된 이량체는 또한 영양막 세포의 세포 표면 상에서 발견되었다(문헌[Apps, R., Tissue Antigens, 68:359 (2006)]).

HLA-G의 경우, 7개의 동형, 즉 3개의 분비된 형태 및 4개의 막-결합된 형태가 존재한다(도 1에 개략적으로 도시됨). HLA-G의 가장 중요한 기능적 동형은 b2-마이크로 글로불린-결합된 HLA-G1 및 HLA-G5를 포함한다. 그러나, 이들 동형의 관용원성 면역학적 효과는 상이하고, 리간드의 형태(단량체, 이량체) 및 리간드-수용체 상호작용의 친화성에 의존적이다.

HLA-G 단백질은 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 생산될 수 있다. HLA-G 동형에 대한 핵산 서열은 당분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 유전자 은행 수탁번호 AY359818을 참조한다.

HLA-G 이성질 형태는 ILT, 특히 ILT2, ILT4 또는 이들의 조합을 통해 신호 전달을 촉진한다.

ILT: ILT는 면역 세포 활성화의 조절 및 면역 세포의 기능 제어에 수반되는 활성화 및 억제 수용체의 Ig 유형을 나타낸다(문헌[Borges, L., et al., Curr Top Microbial Immunol, 244:123-136 (1999)]). ILT는 3개의 군으로 분류된다: (i) 세포질 면역 수용체 티로신-기반 억제성 모티프(ITIM)를 함유하고 억제 신호를 전달하는 억제성 ILT(ILT2, ILT3, ILT4, ILT5 및 LIR8); (ii) 막관통 도메인에 짧은 세포질 테일 및 하전된 아미노산 잔기를 함유하고, Fc 수용체의 회합된 공통 감마 쇄의 세포질 면역 수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 통해 활성화 신호를 전달하는 활성화 ILT(ILT1, ILT7, ILT8 및 LIR6알파); 및 (iii) 막관통 도메인이 없는 가용성 분자 ILT6. 많은 최근 연구는 항원 제시 세포(APC)의 표면 상의 ILT에 대한 면역 조절 역할을 강조하였다. 가장 특징적인 면역 억제 수용체인 ILT2, ILT3 및 ILT4 수용체는 주로 골수 및 플라즈마사이토이드 DC 상에서 발현된다. ILT3 및 ILT4는 미성숙 DC를 공지된 면역 억제 인자, 예컨대 IL-10, 비타민 D3 또는 억제 CD8 T 세포에 노출시킴으로써 상향조절된다(문헌[Chang, C. C., et al., Nat Immunol, 3:237-243 (2002)]). DC 상의 ILT의 발현은 염증성 자극제, 시토카인 및 성장 인자에 의해 엄격히 제어되고 DC 활성화에 따라 하향조절된다(문헌[Ju, X. S., et al., Gene, 331:159-164 (2004)]). ILT2 및 ILT4 수용체의 발현은 히스톤 아세틸화에 의해 고도로 조절되고, 이는 골수계 세포에서 배타적으로 엄격히 제어된 유전자 발현에 기여한다(문헌[Nakajima, H., J Immunol, 171:6611-6620 (2003)]).

억제 수용체 ILT2 및 ILT4의 결합은 단핵구의 시토카인 및 케모카인 분비/방출 프로필을 변경하며 Fc 수용체 신호 전달을 억제할 수 있다(문헌[Colonna, M., et al. J Leukoc Biol, 66:375-381 (1999)]). DC 상의 ILT3의 역할 및 기능은 수츄-포카 그룹(Suciu-Foca group)에 의해 이전에 기술되었다(문헌[Suciu-Foca, N., Int Immunopharmacol, 5:7-11 (2005)]). ILT3에 대한 리간드는 미공지되어 있으나, ILT4는 MHC 클래스 I 결합에 대해 CD8과 경쟁하는 HLA 클래스 I 분자(HLA-A, HLA-B, HLA-C 및 HLA-G)의 제3 도메인에 결합하는 것으로 공지되어 있다(문헌[Shiroishi, M., Proc Natl Acad Sci USA, 100:8856-8861 (2003)]). 여러 억제성 ILT 수용체의 우선적 리간드는 HLA-G이다. HLA-G는 모계-태아 관용성에서 및 면역 인식 및 파괴로부터 종양 세포의 도피의 메커니즘에서 잠재적 역할을 한다(문헌[Hunt, J. S., et al., Faseb J, 19:681-693 (2005)]). HLA-G-ILT 상호작용에 의한 DC 기능의 조절은 DC의 생물학에서 중요한 경로일 가능성이 높다. HLA-G에 의해 처리되고 동종이계 T 세포에 의해 자극될 때, ILT2 및 ILT4 수용체를 고도로 발현하는 인간 단핵구-유래된 DC는 T 세포 아네르기를 유도하는 잠재력에 의해 안정한 관용원성-유사 표현형(CD80low, CD86low, HLA-DRlow)을 계속 유지한다는 것이 결정되었다(문헌[Ristich, V., et al., Eur J Immunol, 35:1133-1142 (2005)]). 또한, ILT2 및 ILT4 수용체를 고도로 발현하는 DC와의 HLA-G 상호작용은 MHC 클래스 II 제시 경로에 수반되는 여러 유전자의 하향조절을 야기하였다. 전문 APC에 의해 풍부하게 발현되는 IFN-감마 유도성 리소좀 티올 리덕타제(GILT)는 HLA-G-변형된 DC에서 크게 감소되었다. 항원을 선택하는 생체내 T 세포 반응이 표적화된 유전자 파괴 후에 GILT가 없는 동물에서 감소된 바와 같이, 프라이밍된 CD4+ T 세포의 래퍼토리는 GILT의 DC 발현에 의해 영향을 받을 수 있다(문헌[Marie, M., et al., Science, 294:1361-1365 (2001)]). DC 상의 HLA-G/ILT 상호작용은 MHC 클래스 II 분자의 조립 및 세포 표면으로의 이동에 간섭하며, 이는 구조적으로 비정상적인 MHC 클래스 II 분자의 덜 효율적인 제시 또는 발현을 야기할 수 있다. ILT 억제 수용체를 고도로 발현하는 인간 단핵구-유래된 DC 상에서 불변 쇄(CD74), HLA-DMA 및 HLA-DMB 유전자의 전사를 HLA-G가 현저하게 감소시켰음이 결정되었다(문헌[Ristich, V., et al; Eur J Immunol 35:1133-1142 (2005)]).

HLA-G의 또 다른 수용체는 KIR2DL4인데, 이는 KIR2DL4가 HLA-G를 발현하는 세포에 결합하기 때문이다(US 2003/232051; 문헌[Cantoni, C. et al. Eur J Immunol 28 (1998) 1980]; [Rajagopalan, S. and E. O. Long. [published erratum appears in J Exp Med 191 (2000) 2027] J Exp Med 189 (1999) 1093]; [Ponte, M. et al. PNAS USA 96 (1999) 5674]). KIR2DL4(2DL4로도 지칭됨)는 활성화 및 억제 수용체 모두와 구조적 특징을 공유하는 KIR 패밀리 구성원이다(CD158d로도 지칭됨)(문헌[Selvakumar, A. et al. Tissue Antigens 48 (1996) 285]). 2DL4는 세포질 ITIM을 가지며, 이는 활성화 KIR의 전형적 특징인 억제 기능 및 막관통 영역의 양으로 하전된 아미노산을 시사한다. 다른 클론에 의해 분포된 KIR과는 달리, 2DL4는 모든 NK 세포에 의해 전사된다(문헌[Valiante, N. M. et al. Immunity 7 (1997) 739]; [Cantoni, C. et al. Eur J Immunol 28 (1998) 1980]; [Rajagopalan, S. and E. O. Long. [published erratum appears in J Exp Med 191 (2000) 2027] J Exp Med 189 (1999) 1093]).

또한, HLA-G는, 세포독성 T 세포 상의 CD8과 상호작용하고(문헌[Sanders et al, J. Exp. Med., 1991]) 활성화된 CD8 양성 세포독성 T 세포에서 CD95 매개된 세포자멸을 유도하는 것으로(문헌[Fournel et al, J. Immun., 2000]) 나타났다. 세포독성 T 세포의 제거의 이러한 메커니즘은 임신, 염증성 질환 및 암에서 관용성의 유도의 메커니즘 중 하나에 보고되었다(문헌[Amodio G. et al, Tissue Antigens, 2014]).

본원에 사용된 바와 같이, 서열번호 44를 포함하는 변형된 인간 HLA-G ß2M MHC I 복합체, 서열번호 45를 포함하는 마우스 H2Kd ß2M MHC I 복합체, 서열번호 47을 포함하는 래트 RT1A ß2M MHC I 복합체, 또는 서열번호 39 및 서열번호 37을 포함하는 인간 HLA-A2 ß2M MHC I 복합체와 "교차반응하지 않는 항-HLA-G 항체" 또는 상기에 "특이적으로 결합하지 않는 항-HLA-G 항체"는, 임의의 이들 대응 항원에 실질적으로 결합하지 않는 항-HLA-G 항체를 지칭한다. 한 실시양태에서, 서열번호 44를 포함하는 변형된 인간 HLA-G ß2M MHC I 복합체, 서열번호 45를 포함하는 마우스 H2Kd ß2M MHC I 복합체, 서열번호 47을 포함하는 래트 RT1A ß2M MHC I 복합체 및/또는 서열번호 39 및 서열번호 37을 포함하는 인간 HLA-A2 ß2M MHC I 복합체와 "교차반응하지 않는 항-HLA-G 항체" 또는 상기에 "특이적으로 결합하지 않는 항-HLA-G 항체"는 (결합 친화성이 더 이상 검출되지 않을 때까지) 5.0 x 10^-6 mol/l 이상의 KD 값의 결합 친화성에 의해 단지 비특이적인 결합을 나타내는 항-HLA-G 항체를 지칭한다. 결합 친화성은 표준 결합 분석, 예컨대 표면 플라즈몬 공명 기술(비아코어(등록상표), 지이-헬스케어(스웨덴 웁살라 소재))에 의해 각각의 항원을 사용하여 결정된다: 서열번호 44를 포함하는 변형된 인간 HLA-G ß2M MHC I 복합체, 서열번호 45를 포함하는 마우스 H2Kd ß2M MHC I 복합체, 서열번호 47을 포함하는 래트 RT1A ß2M MHC I 복합체 및/또는 서열번호 39 및 서열번호 37을 포함하는 인간 HLA-A2 ß2M MHC I 복합체. 분석 설비 및 항원의 구축/제조가 실시예에 기재되어 있다.

용어 "JEG-3 세포(ATCC HTB36) 상의 HLAG에 대한 ILT2 결합을 억제하다"는 예를 들어 실시예 6에 기재된 분석에서 재조합 ILT2의 결합 상호작용의 억제를 지칭한다.

용어 "HLA-G 특이적인 억제된 면역 반응의 회복" 또는 "HLA-G 특이적인 억제된 면역 반응을 회복하다"는, HLA-G 발현 세포, 특히 JEG-3 세포와 공-배양된 단핵구에 의한 리포폴리사카라이드(LPS)-유도된 TNF알파 생산의 회복을 지칭한다. 따라서, 본 발명의 항체는 미처리된 공-배양된 JEG-3 세포와 비교하여 HLA-G 발현 JEG-3 세포(ATCC HTB36) 및 단핵구의 리포폴리사카라이드(LPS) 자극된 공-배양물에서 TNF 알파의 HLAG 특이적 방출을 회복시킨다(미처리된 공-배양물을 0% 음성 기준으로서 취하고; 단핵구 단독의 배양물을 100% 양성 기준으로서 취하고, 여기서 TNF 알파 부분은 임의의 HLA-G/IL-T2 특이적 효과에 의해 억제되지 않는다(실시예 7 참조)). 본원에 있어서, "HLA-G 특이적인 억제된 면역 반응"은 JEG-3 세포 상의 HLA-G 발현으로 인한 단핵구의 면역 억제를 지칭한다. 대조적으로, 본 발명의 항-HLA-G 항체는 HLA-G 녹아웃을 갖는 JEG3 세포와 공-배양된 단핵구에 의해 면역 반응을 회복시킬 수 없다. 다른 상업적 항-HLA-G가 HLA-G 녹아웃을 갖는 JEG3 세포와 공-배양된 단핵구에 의해 TNF 알파를 유도할 수 있기 때문에, 이들 항체에 의한 비-HLA-G 특이적 TNF 알파 방출이 존재한다.

본 발명의 목적에서, "수용자 인간 골격"은, 하기에 정의된 바와 같은 인간 면역 글로불린 골격 또는 인간 공통 골격로부터 유래된 경쇄 가변 도메인(VL) 골격 또는 중쇄 가변 도메인(VH) 골격의 아미노산 서열을 포함하는 골격이다. 인간 면역 글로불린 골격 또는 인간 공통 골격으로부터 유래된 수용자 인간 골격은 그의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노산 변화의 수는 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하 또는 2개 이하이다. 일부 실시양태에서, VL 수용자 인간 골격은 VL 인간 면역 글로불린 골격 서열 또는 인간 공통 골격 서열과 서열이 동일하다. 수득한 항체 HLAG-0031의 인간화된 변이체의 경우 바람직한 VH 수용자 인간 골격은 HUMAN_IGHV1-3이다. 수득한 항체 HLAG-0031의 인간화된 변이체의 경우 바람직한 VL 수용자 인간 골격은 HUMAN_IGKV1-17이다(V-도메인, 위치 R46F에서 하나의 추가적 복귀 돌연변이를 가짐, 카밧 넘버링).

본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 단클론 항체, 다클론 항체, 다중특이적 항체(예를 들어 이중특이적 항체) 및 항체 단편(목적하는 항원 결합 활성을 나타내는 한)을 포함하지만 이로 한정되지는 않는 다양한 항체 구조물 포함한다.

"항체 단편"은 온전한 항체가 결합하는 항원과 결합하는 온전한 항체의 일부분을 포함하는 온전한 항체 이외의 다른 분자를 말한다. 항체 단편의 예로는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂; 다이아바디(diabody); 선형 항체; 단일쇄 항체 분자(예를 들어 scFv); 및 항체 단편으로부터 생산된 다중특이적 항체가 포함되나 이로 한정되지는 않는다.

기준 항체와 "동일한 에피토프에 결합하는 항체"는 경쟁 분석에서 이의 항원에 대한 기준 항체의 결합을 50% 이상만큼 차단하는 항체를 지칭하고, 반대로, 기준 항체는 경쟁 분석법에서 이의 항원에 대한 항체의 결합을 50% 이상만큼 차단한다. 예시적인 경쟁 분석이 본원에 제공된다.

용어 "키메라" 항체는, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 공급원 또는 종으로부터 유래되는 반면, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지 부분은 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래되는 항체를 말한다.

항체의 "클래스"는 그 중쇄가 갖는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 말한다. 항체의 5개 주요 클래스: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하며, 이들 중 다수가 서브클래스(이소타입), 예를 들어 IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ 및 IgA₂로 더 분류될 수 있다. 면역 글로불린의 상이한 클래스들에 상응하는 중쇄 불변 도메인들은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다.

본원에 사용된 용어 "세포독성제"는 세포 기능을 억제하거나 방지하고/하거나 세포 사멸 또는 파괴를 야기하는 물질을 지칭한다. 세포독성제는 비제한적으로 방사성 동위원소(예를 들어 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방서성 동위원소); 화학 치료 제제 또는 약물(예를 들어 메토트렉세이트(methotrexate), 아드리아미신(adriamicin), 빈카 알칼로이드(vinca alkaloid)(빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 에토포시드(etoposide)), 독소루비신(doxorubicin), 멜팔란(melphalan), 미토마이신 C(mitomycin C), 클로람부실(chlorambucil), 다우노루비신(daunorubicin) 또는 다른 끼어들기 약물); 성장 억제제; 효소 및 이의 단편, 예컨대 핵산 분해 효소; 항생제; 독소, 예컨대 소분자 독소, 또는 박테리아, 균류, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소(이의 단편 및/또는 변이체를 포함함); 및 하기에 개시되는 다양한 항종양제 또는 항암제를 포함한다.

제제, 예를 들어 약학 제형의 "효과량"은 목적하는 치료 또는 예방 결과를 달성하기 위해 필요한 투여량에서 및 필요한 시간 동안 효과적인 양을 말한다.

본원에서 용어 "Fc 영역"은 불변 영역의 적어도 일부분을 함유하는 면역 글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. 상기 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226 또는 Pro230으로부터 중쇄의 카복시-말단까지 연장된다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 리신(Lys447), 또는 C-말단 글리신(Gly446) 및 C-말단 리신(Lys447)은 존재하지 않거나 존재할 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 항-HLA-G 항체는 IgG1 이소타입의 것이고 서열번호 53 또는 서열번호 54의 불변 중쇄 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 이는 C-말단 글리신(Gly446)을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 이는 C-말단 글리신(Gly446) 및 C-말단 리신(Lys447)을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 항- HLA-G 항체는 IgG4 이소타입의 것이고 서열번호 55의 불변 중쇄 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 이는 C-말단 글리신(Gly446)을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 이는 C-말단 글리신(Gly446) 및 C-말단 리신(Lys447)을 추가로 포함한다. 본원에서 달리 명시되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변 영역의 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌[Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242]에 기재된 EU 인덱스로도 지칭되는 EU 넘버링 체계를 따른다.

"골격" 또는 "FR"은 초가변 영역(HVR) 잔기 이외의 다른 가변 도메인 잔기를 말한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인: FR1, FR2, FR3 및 FR4로 이루어진다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH(또는 VL)에서 하기 순서로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

용어 "전장 항체", "온전한 항체(intact antibody)" 및 "전체 항체(whole antibody)"는 본원에서 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 가지거나 본원에서 정의된 바와 같은 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 언급하기 위해 상호교환적으로 사용된다.

용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되며, 상기 세포의 자손을 포함하여, 외인성 핵산이 도입된 세포를 말한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함하며, 이들은 1차 형질전환된 세포, 및 계대 수에 관계없이 그로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 핵산 함량이 모 세포와 완전히 동일하지 않을 수 있으며, 돌연변이를 함유할 수 있다. 원래 형질전환된 세포에서 스크리닝되거나 선택된 바와 동일한 기능 또는 생물 활성을 갖는 돌연변이 자손이 본 발명에 포함된다.

"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산되거나 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-암호화 서열을 사용하는 비-인간 공급원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체이다. 인간 항체에 대한 상기 정의는 구체적으로 비-인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체는 제외한다.

"인간 공통 골격"은 인간 면역 글로불린 VL 또는 VH 골격 서열의 선택에서 가장 흔히 존재하는 아미노산 잔기를 나타내는 골격이다. 일반적으로, 인간 면역 글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 아군(subgroup)으로부터 이루어진다. 일반적으로, 서열의 상기 아군은 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Bethesda MD (1991), NIH Publication 91-3242, Vols. 1-3]에서와 같은 아군이다. 한 실시양태에서, VL의 경우, 상기 아군은 상기 카밧 등(Kabat et al.)의 문헌에서와 같은 아군 카파 I이다. 한 실시양태에서, VH의 경우, 상기 아군은 상기 카밧 등의 문헌에서와 같은 아군 III이다.

"인간화된" 항체는 비-인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 말한다. 특정 실시양태에서, 인간화된 항체는 1개 이상, 전형적으로는 2개의 가변 도메인의 실질적으로 전부를 포함할 것이며, 여기서 HVR(예를 들어 CDR)의 전부 또는 실질적으로 전부는 비-인간 항체의 HVR에 상응하고, FR의 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 항체의 FR에 상응한다. 인간화된 항체는 임의적으로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부분을 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어 비-인간 항체의 "인간화된 형태"는 인간화가 일어난 항체를 말한다.

본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은 서열에 있어서 초가변성이고/이거나("상보성 결정 영역" 또는 "CDR") 구조적으로 한정된 루프("초가변 루프")를 형성하고/하거나 항원-접촉 잔기("항원 접촉부")를 함유하는 항체 가변 도메인의 영역 각각을 말한다. 일반적으로, 항체는 6개의 HVR(VH에 3개(H1, H2, H3) 및 VL에 3개(L1, L2, L3))을 포함한다. 본원에서 예시적인 HVR은 하기를 포함한다:

(a) 아미노산 잔기 26-32(L1), 50-52(L2), 91-96(L3), 26-32(H1), 53-55(H2) 및 96-101(H3)에 존재하는 초가변 루프(문헌[Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]);

(b) 아미노산 잔기 24-34(L1), 50-56(L2), 89-97(L3), 31-35b(H1), 50-65(H2) 및 95-102(H3)에 존재하는 CDR(문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]);

(c) 아미노산 잔기 27c-36(L1), 46-55(L2), 89-96(L3), 30-35b(H1), 47-58(H2) 및 93-101(H3)에 존재하는 항원 접촉서열(문헌[MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)]); 및

(d) HVR 아미노산 잔기 24-34(L1), 50-56(L2), 89-97(L3), 31-35(H1), 50-63(H2) 및 95-102(H3)를 포함하는, 상기 (a), (b) 및/또는 (c)의 조합.

달리 지시되지 않는 한, HVR 잔기 및 가변 도메인의 기타 잔기(예를 들어 FR 잔기)는 본원에서 문헌[Kabat et al., Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]에 따라 넘버링된다.

"면역 접합체"는 세포독성제를 포함하지만 이로 한정되지는 않는 하나 이상의 이종 분자에 접합된 항체이다.

"개체" 또는 "대상체"는 포유동물이다. 포유동물로는 가축(예를 들어 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류(예를 들어 인간 및 비-인간 영장류, 예를 들어 원숭이), 토끼 및 설치류(예를 들어 마우스 및 래트)가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 개체 또는 대상체는 인간이다.

"단리된" 항체는 그 자연 환경의 성분으로부터 분리된 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는, 예를 들어 전기영동(예를 들어 SDS-PAGE, 등전 초점(IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피(예를 들어 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 측정시, 95% 또는 99%보다 큰 순도로 정제된다. 항체 순도의 평가 방법에 대한 검토를 위해서는, 예를 들어 문헌[Flatman, S. et al., J. Chromatogr. B 848 (2007) 79-87]을 참조한다.

"단리된" 핵산은 그 자연 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 말한다. 단리된 핵산은, 통상적으로 핵산 분자를 함유하는 세포에 함유된 핵산 분자를 포함하지만, 상기 핵산 분자는 염색체외에 또는 그의 천연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.

"항-HLA-G 항체를 암호화하는 단리된 핵산"은, 단일 벡터 또는 별개의 벡터 중의 핵산 분자 및 숙주 세포내 하나 이상의 위치에 존재하는 핵산 분자를 포함하여, 항체 중쇄 및 경쇄(또는 이의 단편)를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자를 말한다.

본원에서 사용된 바와 같이 용어 "단클론 항체"는 실질적으로 동종 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 말하고, 즉 상기 집단을 이루는 개개 항체는, 예를 들어 천연 돌연변이를 함유하거나, 단클론 항체 제제의 제조시 발생하는 가능한 변이체 항체(상기 변이체는 일반적으로 미량으로 존재한다)를 제외하고, 동일하고/하거나, 동일 에피토프에 결합한다. 전형적으로 상이한 결정기(에피토프)에 대해 유도된 상이한 항체를 포함하는 다클론 항체 제제와 대조적으로, 단클론 항체 제제의 각각의 단클론 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 유도된다. 따라서, 수식어 "단클론"은 항체의 실질적으로 동종 집단으로부터 수득된 것으로서의 항체 특성을 가리키며, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 제조를 필요로 하는 것으로 이해해서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 단클론 항체는, 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 인간 면역 글로불린 유전자좌 전체 또는 일부를 함유하는 유전자전이 동물을 사용하는 방법을 포함하지만 이로 한정되지는 않는 다양한 기법들에 의해 제조될 수 있으며, 단클론 항체를 제조하기 위한 상기 방법 및 다른 예시적인 방법들이 본원에 기술되어 있다.

"천연(native) 항체"는 다양한 구조를 갖는 천연 면역 글로불린 분자를 말한다. 예를 들어, 천연 IgG 항체는 다이설파이드-결합된 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 이루어진, 약 150,000 달톤의 이종사량체성 당단백질이다. N-말단으로부터 C-말단까지, 각각의 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 영역(VH)에 이어, 3개의 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N-말단으로부터 C-말단까지, 각각의 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 영역(VL)에 이어, 불변 경쇄(CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄는, 그 불변 도메인의 아미노산 서열에 기반하여, 카파(κ) 및 람다(λ)로 불리는 2개 유형 중 하나로 지정될 수 있다.

용어 "패키지 삽입물"은 치료 제품의 적응증, 사용법, 투여량, 투여법, 병행 치료, 금기사항 및/또는 사용에 관한 경고에 대한 정보를 포함하는, 치료 제품의 상업적 패키지에 통상적으로 포함되는 설명서를 말하기 위해 사용된다.

기준 폴리펩티드 서열과 관련하여 "아미노산 서열 동일성 퍼센트(%)"는, 필요한 경우, 최대 서열 동일성 퍼센트를 달성하기 위해 및 서열 동일성의 부분으로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않고, 서열을 정렬하고 갭(gap)을 도입하고, 참조 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 측정하기 위한 정렬은 당분야의 기술에 속하는 다양한 방법으로, 예를 들어 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN, Megalign(DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 당업자라면 비교되는 서열의 전장에 대한 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본 발명의 목적에 있어서, 아미노산 서열 동일성% 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 산출된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크 인코포레이티드(Genentech, Inc.)에서 개발되었고, 소스 코드는 사용자 문서와 함께 미국 저작권청(미국 워싱턴 디씨 20559 소재)에 제출되었고, 여기서 이는 미국 저작권 등록 번호 TXU510087 하에 등록되었다. ALIGN-2 프로그램은 제넨테크 인코포레이티드(미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코 소재)로부터 공개적으로 입수가능하거나 소스 코드로부터 컴파일링될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 포함하는 UNIX 운영 체계 상에서 사용하기 위해 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되며 변경되지 않는다.

ALIGN-2가 아미노산 서열 비교를 위해 사용되는 경우, 제시된 아미노산 서열 B에 대한 제시된 아미노산 서열 A의 % 아미노산 서열 동일성은(이는 대안적으로 제시된 아미노산 서열 B에 대한 특정 % 아미노산 서열 동일성을 갖거나 포함하는 제시된 아미노산 서열 A로 표현될 수 있다) 하기와 같이 계산된다:

100 × X/Y

상기에서, X는 A 및 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일한 매치로서 기록된 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B의 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, B에 대한 A의 % 아미노산 서열 동일성이 A에 대한 B의 % 아미노산 서열 동일성과 동일하지 않을 것임이 이해된다. 달리 구체적으로 명시되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 % 아미노산 서열 동일성 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 직전 문단에 기재된 바와 같이 수득된다.

용어 "약학 제형"은 에에 함유된 활성 성분의 생물 활성이 효과적이 되게 하기 위한 형태이면서, 제형이 투여될 대상에게 허용될 수 없을 정도로 독성인 추가 성분을 함유하지 않는 제제를 말한다.

"약학적으로 허용되는 담체"는 개체에게 무독성인, 활성 성분 이외의 다른, 약학 제형중의 성분을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 완충제, 부형제, 안정화제 또는 방부제가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "치료"(및 이의 문법적 변형, 예컨대 "치료하다" 또는 "치료하는")는 치료되는 개체의 자연적 과정을 변화시키기 위한 시도의 임상적 개입을 말하며, 예방을 위해 또는 임상 병리 과정 동안 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접 또는 간접적 병리학적 결과의 경감, 전이 방지, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 관해 또는 개선된 예후를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 질환의 진전을 지연시키거나 질환의 진행을 늦추기 위해 사용된다.

용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체를 항원에 결합시키는 데 수반되는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 이때 각각의 도메인은 4개의 보존된 골격 영역(FR) 및 3개의 초가변 영역(HVR)을 포함한다(예를 들어 문헌[Kindt, T.J. et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), page 91] 참조). 단일 VH 또는 VL 도메인이 항원 결합 특이성을 제공하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정 항원에 결합하는 항체는, 상보성 VL 또는 VH 도메인 각각의 라이브러리를 스크리닝하기 위해, 상기 항원에 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리될 수 있다(예를 들어 문헌[Portolano, S. et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887]; [Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628] 참조).

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "벡터"는 연결되는 또 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자가-복제 핵산 구조물로서의 벡터뿐 아니라 이것이 도입된 숙주 세포의 게놈 내에 혼입된 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 이들이 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 유도할 수 있다. 상기 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다.

I. 조성물 및 방법

한 양태에서, 본 발명은, 본 발명의 선택된 항-HLA-G 항체가 HLA-G의 특정 에피토프에 고 친화성에 의해 결합하고(다른 종 및 인간 HLA-A 공통 서열과의 교차반응성 없음), HLA-G에 대한 ILT2 및/또는 ILT4 결합을 특이적으로 억제하는 능력을 갖는다는 사실을 부분적으로 기반으로 한다. 이는 예를 들어 HLA-G에 대한 ILT2 결합을 억제하고, 적절한 자극시 면역 조절성 시토카인, 예컨대 TNF 알파의 증가된 방출에 의해 특이적으로 HLA-G 매기된 면역 억제를 복귀시키고, HLAG 녹아웃 세포에 대한 효과를 나타내지 않는다.

특정 실시양태에서, HLA-G에 결합하는 항체가 제공된다. 본 발명의 항체는 예를 들어 암의 진단 또는 치료에 유용하다.

A. 예시적 항-HLA-G 항체

한 양태에서, 본 발명은, 인간 HLA-G에 결합하고(항-HLA-G 항체), JEG-3 세포(ATCC HTB36) 상의 HLAG에 대한 ILT2 결합을 억제하고, HLA-G 특이적인 억제된 면역 반응(예를 들어 억제된 종양 괴사 인자(TNF) 알파 방출)을 JEG-3 세포(ATCC HTB36)와 공-배양된 단핵구에 의해 회복하는 (단리된) 항체를 제공한다. 따라서, 본 발명의 항체는, 미처리된 공-배양된 JEG-3 세포와 비교하여, HLA-G 발현 JEG-3 세포(ATCC HTB36) 및 단핵구의 리포폴리사카라이드(LPS) 자극된 공-배양물에서 TNF 알파의 HLAG 특이적 방출을 회복한다(미처리된 공-배양물을 0% 음성 개준으로서 취하고; 단핵구 단독의 배양물을 100% 양성 기준으로서 취하고, 여기서 TNF 알파 분비는 임의의 HLA-G/IL-T2 특이적 효과에 의해 억제되지 않는다(실시예 7 참조)). 대조적으로, 본 발명의 항체는 HLA-G 녹아웃 JEG3 세포와 공-배양된 단핵구에 의해 면역을 회복할 수 없다.

본 발명의 한 실시양태는 인간 HLA-G에 결합하는 (단리된) 항체이되(한 실시양태에서, 항체는 서열번호 43을 포함하는 HLA-G ß2M MHC I 복합체에 결합함), 상기 항체는 하기를 포함한다:

A) (a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;

B) (a) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;

C) (a) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는

D) (a) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.

A) i) 서열번호 7의 VH 서열 및 서열번호 8의 VL 서열, 또는

iii) 서열번호 33의 VH 서열 및 서열번호 34의 VL 서열을 포함하거나;

B) i) 서열번호 15의 VH 서열 및 서열번호 16의 VL 서열을 포함하거나;

C) i) 서열번호 23의 VH 서열 및 서열번호 24의 VL 서열을 포함하거나;

D) i) 서열번호 31의 VH 서열 및 서열번호 32의 VL 서열을 포함한다.

(a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.

(a) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.

(a) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.

(a) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.

i) 서열번호 7의 VH 서열 및 서열번호 8의 VL 서열; 또는

ii) 상기 i)의 항체의 VH 및 VL의 인간화된 변이체.

본 발명의 한 실시양태는 인간 HLA-G에 결합하는 (단리된) 항체이되(한 실시양태에서, 항체는 서열번호 43을 포함하는 HLA-G ß2M MHC I 복합체에 결합함), 상기 항체는 i) 서열번호 33의 VH 서열 및 서열번호 34의 VL 서열을 포함한다.

본 발명의 한 실시양태는 인간 HLA-G에 결합하는 (단리된) 항체이되(한 실시양태에서, 항체는 서열번호 43을 포함하는 HLA-G ß2M MHC I 복합체에 결합함), 상기 항체는 서열번호 15의 VH 서열 및 서열번호 16의 VL 서열을 포함한다.

본 발명의 한 실시양태는 인간 HLA-G에 결합하는 (단리된) 항체이되(한 실시양태에서, 항체는 서열번호 43을 포함하는 HLA-G ß2M MHC I 복합체에 결합함), 상기 항체는 서열번호 23의 VH 서열 및 서열번호 24의 VL 서열을 포함한다.

본 발명의 한 실시양태는 인간 HLA-G에 결합하는 (단리된) 항체이되(한 실시양태에서, 항체는 서열번호 43을 포함하는 HLA-G ß2M MHC I 복합체에 결합함), 상기 항체는 서열번호 31의 VH 서열 및 서열번호 32의 VL 서열을 포함한다.

A) (a) (i) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인(여기서, VH 도메인은 서열번호 33의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(바람직한 한 실시양태에서 98%, 99% 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다); 및 (b) (i) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (iii) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인(여기서 VL 도메인은 서열번호 34의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(바람직한 한 실시양태에서 98%, 99% 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다);

B) (a) (i) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인(여기서 VH 도메인은 서열번호 15의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(바람직한 한 실시양태에서 98%, 99% 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다); 및 (b) (i) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (iii) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인(여기서 VL 도메인은 서열번호 16의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(바람직한 한 실시양태에서 98%, 99% 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다);

C) (a) (i) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인(여기서 VH 도메인은 서열번호 23의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(바람직한 한 실시양태에서 98%, 99% 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다); 및 (b) (i) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (iii) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인(여기서 VL 도메인은 서열번호 14의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(바람직한 한 실시양태에서 98%, 99% 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다); 또는

D) (a) (i) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인(여기서 VH 도메인은 서열번호 31의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(바람직한 한 실시양태에서 98%, 99% 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다); 및 (b) (i) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (iii) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인(여기서 VL 도메인은 서열번호 32의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(바람직한 한 실시양태에서 98%, 99% 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다).

본 발명의 한 실시양태는 인간 HLA-G에 결합하는 (단리된) 항체이되(한 실시양태에서, 항체는 서열번호 43을 포함하는 HLA-G ß2M MHC I 복합체에 결합함), 상기 항체는

a) (i) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (iii) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인

을 포함하고;

상기 항체는 (표면 플라즈몬 공명 분석에서 결정시) 서열번호 33의 VH 서열 및 서열번호 34의 VL 서열을 포함하는 항체와 실질적으로 동일한 결합 친화성(한 실시양태에서 상기와 비교하여 최대 10-배 감소된 KD 값의 결합 친화성, 한 실시양태에서 상기와 비교하여 최대 5-배 감소된 KD 값의 결합 친화성)에 의해 서열번호 43을 포함하는 HLA-G ß2M MHC I 복합체에 결합한다.

a) (i) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인(여기서, VH 도메인은 서열번호 33의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(바람직한 한 실시양태에서 98%, 99% 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다); 및 (b) (i) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (iii) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인(여기서 VL 도메인은 서열번호 34의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(바람직한 한 실시양태에서 98%, 99% 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다)

을 포함하고;

상기 항체는 (표면 플라즈몬 공명 분석에서 결정시) 서열번호 33의 VH 서열 및 서열번호 34의 VL 서열을 포함하는 항체와 실질적으로 동일한 결합 친화성(한 실시양태에서 상기와 비교하여 최대 10-배 감소된 KD 값의 결합 친화성, 한 실시양태에서 상기와 비교하여 최대 5-배 감소된 KD 값의 결합 친화성)에 의해 서열번호 43을 포함하는 HLA-G ß2M MHC I 복합체에 결합하고/하거나;

상기 항체는 하기 특성에 의해 독립적으로 특성규명된다: 항-HLA-G 항체는

j) HLAG에 대한 CD8a 결합을 (항체의 부재 하에 결합과 비교하여) 80% 초과만큼 억제하고/하거나(예를 들어 실시예 4c 참조);

k) HLA-G 특이적인 억제된 면역 반응(예를 들어 억제된 종양 괴사 인자(TNF) 알파 방출)을 JEG-3 세포(ATCC HTB36)와 공-배양된 단핵구에 의해 회복한다.

본 발명의 한 실시양태는 인간 HLA-G에 결합하는 (단리된) 항체이되(한 실시양태에서, 항체는 서열번호 43을 포함하는 HLA-G ß2M MHC I 복합체에 결합함), 상기 항체는 서열번호 33의 VH 서열 및 서열번호 34의 VL 서열을 포함하는 항체와 동일한 에피토프에 결합한다.

a) (i) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (iii) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인

을 포함하고;

상기 항체는 (표면 플라즈몬 공명 분석에서 결정시) 서열번호 15의 VH 서열 및 서열번호 16의 VL 서열을 포함하는 항체와 실질적으로 동일한 결합 친화성(한 실시양태에서 상기와 비교하여 최대 10-배 감소된 KD 값의 결합 친화성, 한 실시양태에서 상기와 비교하여 최대 5-배 감소된 KD 값의 결합 친화성)에 의해 서열번호 43을 포함하는 HLA-G ß2M MHC I 복합체에 결합한다.

a) (i) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인(여기서 VH 도메인은 서열번호 15의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(바람직한 한 실시양태에서 98%, 99% 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다); 및 (b) (i) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (iii) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인(여기서 VL 도메인은 서열번호 16의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(바람직한 한 실시양태에서 98%, 99% 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다)

을 포함하고;

상기 항체는 (표면 플라즈몬 공명 분석에서 결정시) 서열번호 15의 VH 서열 및 서열번호 16의 VL 서열을 포함하는 항체와 실질적으로 동일한 결합 친화성(한 실시양태에서 상기와 비교하여 최대 10-배 감소된 KD 값의 결합 친화성, 한 실시양태에서 상기와 비교하여 최대 5-배 감소된 KD 값의 결합 친화성)에 의해 서열번호 43을 포함하는 HLA-G ß2M MHC I 복합체에 결합하고/하거나;

본 발명의 한 실시양태는 인간 HLA-G에 결합하는 (단리된) 항체이되(한 실시양태에서, 항체는 서열번호 43을 포함하는 HLA-G ß2M MHC I 복합체에 결합함), 상기 항체는 서열번호 15의 VH 서열 및 서열번호 16의 VL 서열을 포함하는 항체와 동일한 에피토프에 결합한다.

a) (i) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (iii) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인

을 포함하고;

상기 항체는 (표면 플라즈몬 공명 분석에서 결정시) 서열번호 23의 VH 서열 및 서열번호 24의 VL 서열을 포함하는 항체와 실질적으로 동일한 결합 친화성(한 실시양태에서 상기와 비교하여 최대 10-배 감소된 KD 값의 결합 친화성, 한 실시양태에서 상기와 비교하여 최대 5-배 감소된 KD 값의 결합 친화성)에 의해 서열번호 43을 포함하는 HLA-G ß2M MHC I 복합체에 결합한다.

a) (i) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인(여기서 VH 도메인은 서열번호 23의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(바람직한 한 실시양태에서 98%, 99% 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다); 및 (b) (i) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (iii) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인(여기서 VL 도메인은 서열번호 24의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(바람직한 한 실시양태에서 98%, 99% 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다)

을 포함하고;

상기 항체는 (표면 플라즈몬 공명 분석에서 결정시) 서열번호 23의 VH 서열 및 서열번호 24의 VL 서열을 포함하는 항체와 실질적으로 동일한 결합 친화성(한 실시양태에서 상기와 비교하여 최대 10-배 감소된 KD 값의 결합 친화성, 한 실시양태에서 상기와 비교하여 최대 5-배 감소된 KD 값의 결합 친화성)에 의해 서열번호 43을 포함하는 HLA-G ß2M MHC I 복합체에 결합하고/하거나;

e) 서열번호 47을 포함하는 래트 RT1A ß2M MHC I 복합체와 교차반응하지 않고/않거나;

f) 단량체성 HLA-G ß2M MHC I 복합체(서열번호 43을 포함함)에 대한 ILT2 결합을 억제하고/하거나;

g) 삼량체성 HLA-G ß2M MHC I 복합체(서열번호 43을 포함함)에 대한 ILT2 결합을 (항체의 부재 하에 결합과 비교하여) 50% 초과만큼(한 실시양태에서 60% 초과만큼) 억제하고/하거나(실시예 4b 참조);

h) 단량체성 및/또는 이량체성 및/또는 삼량체성 HLA-G ß2M MHC I 복합체(서열번호 43을 포함함)에 대한 ILT2 결합을 (항체의 부재 하에 결합과 비교하여) 50% 초과만큼(한 실시양태에서 80% 초과만큼) 억제하고/하거나(실시예 4b 참조);

i) JEG3 세포(ATCC 번호 HTB36)(상의 HLA-G)에 대한 ILT2 결합을 (항체의 부재 하에 결합과 비교하여) (50% 초과만큼(한 실시양태에서 80% 초과만큼)) 억제하고/하거나(실시예 6 참조);

j) JEG3 세포(ATCC 번호 HTB36)(상의 HLA-G)에 결합하고(실시예 5 참조), JEG3 세포(ATCC 번호 HTB36)(상의 HLA-G)에 대한 ILT2 결합을 (항체의 부재 하에 결합과 비교하여) (50% 초과만큼(한 실시양태에서 80% 초과만큼)) 억제하고/하거나(실시예 6 참조);

k) HLAG에 대한 CD8a 결합을 (항체의 부재 하에 결합과 비교하여) 80% 초과만큼 억제하고/하거나(예를 들어 실시예 4c 참조);

l) HLA-G 특이적인 억제된 면역 반응(예를 들어 억제된 종양 괴사 인자(TNF) 알파 방출)을 JEG-3 세포(ATCC HTB36)와 공-배양된 단핵구에 의해 회복한다.

본 발명의 한 실시양태는 인간 HLA-G에 결합하는 (단리된) 항체이되(한 실시양태에서, 항체는 서열번호 43을 포함하는 HLA-G ß2M MHC I 복합체에 결합함), 상기 항체는 서열번호 23의 VH 서열 및 서열번호 24의 VL 서열을 포함하는 항체와 동일한 에피토프에 결합한다.

a) (i) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (iii) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인

을 포함하고;

상기 항체는 (표면 플라즈몬 공명 분석에서 결정시) 서열번호 31의 VH 서열 및 서열번호 32의 VL 서열을 포함하는 항체와 실질적으로 동일한 결합 친화성(한 실시양태에서 상기와 비교하여 최대 10-배 감소된 KD 값의 결합 친화성, 한 실시양태에서 상기와 비교하여 최대 5-배 감소된 KD 값의 결합 친화성)에 의해 서열번호 43을 포함하는 HLA-G ß2M MHC I 복합체에 결합한다.

a) (i) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인(여기서 VH 도메인은 서열번호 31의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(바람직한 한 실시양태에서 98%, 99% 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다); 및 (b) (i) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (iii) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인(여기서 VL 도메인은 서열번호 32의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(바람직한 한 실시양태에서 98%, 99% 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다)

을 포함하고;

상기 항체는 (표면 플라즈몬 공명 분석에서 결정시) 서열번호 31의 VH 서열 및 서열번호 32의 VL 서열을 포함하는 항체와 실질적으로 동일한 결합 친화성(한 실시양태에서 상기와 비교하여 최대 10-배 감소된 KD 값의 결합 친화성, 한 실시양태에서 상기와 비교하여 최대 5-배 감소된 KD 값의 결합 친화성)에 의해 서열번호 43을 포함하는 HLA-G ß2M MHC I 복합체에 결합하고/하거나;

본 발명의 한 실시양태는 인간 HLA-G에 결합하는 (단리된) 항체이되(한 실시양태에서, 항체는 서열번호 43을 포함하는 HLA-G ß2M MHC I 복합체에 결합함), 상기 항체는 서열번호 31의 VH 서열 및 서열번호 32의 VL 서열을 포함하는 항체와 동일한 에피토프에 결합한다.

본 발명의 한 실시양태에서, 항체는 IgG1 이소타입의 것이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 항체는 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G(카밧의 EU 인덱스에 따른 넘버링)를 갖는 IgG1 이소타입의 것이다.

추가적 양태에서, 임의의 상기 실시양태에 따른 항-HLA-G 항체는 하기 섹션 1 내지 7에 기재된 바와 같은 임의의 특징을 단독으로 또는 조합으로 포함할 수 있다:

1. 항체 친화성

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 ≤1 μM, ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0.1 nM, ≤0.01 nM 또는 ≤0.001 nM(예를 들어 10^-8 M 이하, 예를 들어 10^-8 내지 10^-13 M, 예를 들어 10^-9 내지 10^-13 M)의 해리 상수(KD)를 갖는다.

하나의 바람직한 실시양태에서, KD는 25℃에서 약 10 반응 단위(RU)에서 고정화된 항원 CM5 칩을 사용하는 비아코어(등록상표)를 사용하여 표면 플라즈몬 공명 분석에 의해 측정된다. 간략히, 카복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩(CM5, 비아코어 인코포레이티드)을 공급자의 지시에 따라 N-에틸-N'-(3-다이메틸아미노프로필)-카보다이이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시석신이미드(NHS)로 활성화시킨다. 항원을 10 mM 나트륨 아세테이트(pH 4.8)로 5 ㎍/ml(약 0.2 μM)로 희석한 후 5 ㎕/분의 유량으로 주입하여 약 10 반응 단위(RU)의 커플링된 단백질을 수득한다. 항원 주입 후에, 1 M 에탄올아민을 주입하여 미반응 기들을 차단한다. 동역학적 측정을 위해, Fab의 2-배 연속 희석물(0.78 nM 내지 500 nM)을 25℃에서 약 25 ㎕/분의 유량으로 0.05% 폴리솔베이트 20(트윈-20(상표)) 계면활성제를 갖는 PBS(PBST)에 주입한다. 결합 속도(k_on 또는 ka) 및 해리 속도(k_off 또는 kd)는 결합 및 해리 센서그램을 동시에 적합화시킴으로써 단순 일-대-일 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델(비아코어(등록상표) 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 사용하여 산출한다. 평형 해리 상수(KD)는 비 k_off/k_on으로서 산출한다(예를 들어 문헌[Chen, Y. et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881] 참조). 상기 표면 플라즈몬 공명 분석에 의해 결합 속도(on-rate)가 10⁶ M^-1s^-1을 초과하는 경우, 결합-속도는 형광 소광 기법을 사용하여 측정할 수 있으며, 상기 기법은 분광계, 예를 들어 정류기(stop-flow) 장착 분광광도계(아비브 인스트루먼츠(Aviv Instruments)) 또는 교반 큐벳을 갖는 8000-시리즈 SLM-AMINCO(상표) 분광광도계(써모스펙트로닉(ThermoSpectronic))에서 측정시, 증가하는 농도의 항원의 존재 하에 PBS(pH 7.2) 중 20 nM 항-항원 항체(Fab 형태)의, 25℃에서의 형광 발광 강도(여기 = 295 nm; 발광 = 340 nm, 16 nm 통과대역(band-pass))의 증가 또는 감소를 측정한다.

2. 항체 단편

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 항체 단편이다. 항체 단편은 비제한적으로 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂, Fv, 및 scFv 단편, 및 하기에 기재되는 기타 단편을 포함한다. 특정 항체 단편에 대한 검토를 위해, 문헌[Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134]을 참조한다. scFv 단편의 검토를 위해, 예를 들어 문헌[Plueckthun, A., In; The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore (eds.), Springer-Verlag, New York (1994), pp. 269-315]을 참조하고; 또한 WO 93/16185; 및 US 5,571,894 및 5,587,458을 참조한다. 회수 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')₂ 단편에 대한 고찰을 위해, US 5,869,046을 참조한다.

다이아바디는 2가이거나 이중특이적일 수 있는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 예를 들어, EP 0 404 097; WO 1993/01161; 문헌[Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134]; 및 [Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448]을 참조한다. 또한, 트라이아바디 및 테트라바디는 문헌[Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (20039 129-134)]에 기술되어 있다.

단일-도메인 항체는 중쇄 가변 도메인 전체 또는 일부, 또는 항체의 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 실시양태에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다(도만티스 인코포레이티드(Domantis, Inc.), 미국 매사추세츠주 월탐 소재); 예를 들어 US 6,248,516 B1 참조).

항체 단편은, 본원에 기재된 바와 같이, 온전한 항체의 단백질 분해성 절단 뿐 아니라, 재조합 숙주 세포(예를 들어 에스케리키아 콜라이(Eschericia coli) 또는 파지)에 의한 생산을 포함하지만 이로 한정되지는 않는 다양한 기법들에 의해 생산될 수 있다.

3. 키메라 항체 및 인간화된 항체

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 키메라 항체이다. 특정한 키메라 항체가, 예를 들어 US 4,816,567; 및 문헌[Morrison, S.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855]에 기술되어 있다. 한 예로, 키메라 항체는 비-인간 가변 영역(예를 들어 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 또는 원숭이와 같은 비-인간 영장류로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 또 다른 예로, 키메라 항체는 클래스 또는 서브클래스가 모 항체로부터 변화된 "클래스 전환된" 항체이다. 키메라 항체는 그의 항원 결합 단편을 포함한다.

특정 실시양태에서, 키메라 항체는 인간화된 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는, 비-인간 모 항체의 특이적 및 친화성을 유지하면서 인간에 대한 면역원성을 감소시키기 위해 인간화된다. 일반적으로, 인간화된 항체는 HVR, 예를 들어 CDR(또는 그의 일부)가 비-인간 항체로부터 유래되고 FR(또는 그의 일부)가 인간 항체 서열로부터 유래된 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화된 항체는 임의적으로 또한 인간 불변 영역의 적어도 일부분을 포함할 것이다. 일부 실시양태에서, 인간화된 항체의 일부 FR 잔기는, 예를 들어 항체 특이성 또는 친화성을 회복시키거나 개선하기 위해 비-인간 항체(예를 들어 HVR 잔기가 유래되는 항체)로부터의 상응하는 잔기로 치환된다.

인간화된 항체 및 이의 생산 방법은, 예를 들어 문헌[Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633]에 개관되어 있고, 예를 들어 문헌[Riechmann, I. et al., Nature 332 (1988) 323-329]; 문헌[Queen, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033]; US 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321 및 7,087,409; 문헌[Kashmiri, S.V. et al., Methods 36 (2005) 25-34](SDR(a-CDR)그라프팅을 기술하고 있음); 문헌[Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498]("재표면화"를 기술하고 있음); 문헌[Dall'Acqua, W.F. et al., Methods 36 (2005) 43-60]("FR 셔플링"을 기술하고 있음); 및 문헌[Osbourn, J. et al., Methods 36 (2005) 61-68] 및 [Klimka, A. et al., Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260](FR 셔플링에 대한 "유도 선택" 접근법을 기술하고 있음)에 더 기술되어 있다.

인간화에 사용될 수 있는 인간 골격 영역으로는 다음이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다: "최적합(best-fit)" 방법을 사용하여 선택된 골격 영역(예를 들어 문헌[Sims, M.J. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308] 참조); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역들의 특정 아군의 인간 항체들의 공통 서열로부터 유래된 골격 영역(예를 들어 문헌[Carter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289]; 및 [Presta, L.G. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632] 참조); 인간 성숙 (체세포 돌연변이된) 골격 영역 또는 인간 생식계열 골격 영역(예를 들어 문헌[Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633] 참조); 및 FR 라이브러리 검색으로부터 유래된 골격 영역(예를 들어 문헌[Baca, M. et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684] 및 [Rosok, M.J. et al., J. Biol. Chem. 271 (19969 22611-22618] 참조).

4. 인간 항체

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 당분야에 공지된 다양한 기법들을 사용하여 생산될 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 문헌[van Dijk, M.A. and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374] 및 [Lonberg, N., Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 450-459]에 기술되어 있다.

인간 항체는, 항원 자극에 대해 온전한 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 갖는 온전한 항체를 생산하도록 변형된 유전자전이 동물에게 면역원을 투여함으로써 생산될 수 있다. 상기와 같은 동물은 전형적으로, 내인성 면역 글로불린 유전자좌를 대체하거나 염색체외에 존재하거나 동물의 염색체내에 무작위로 통합되는 인간 면역 글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유한다. 상기와 같은 유전자전이 마우스에서, 내인성 면역 글로불린 유전자좌는 일반적으로 불활성화시켰다. 유전자전이 동물로부터 인간 항체를 수득하는 방법에 대한 검토를 위해서는, 문헌[Lonberg, N., Nat. Biotech. 23 (2005) 1117-1125]을 참조한다. 또한, 예를 들어 제노마우스(XENOMOUSE, 상표) 기법을 기술하고 있는 US 6,075,181 및 6,150,584; 휴맵(HuMab, 등록상표) 기법을 기술하고 있는 US 5,770,429; K-M 마우스(등록상표) 기법을 기술하고 있는 US 7,041,870; 및 벨로시마우스(VelociMouse, 등록상표) 기법을 기술하고 있는 US 2007/0061900를 참조할 수 있다. 상기와 같은 동물에 의해 생산된 온전한 항체로부터의 인간 가변 영역은, 예를 들어 상이한 인간 불변 영역과 조합시킴으로써 더 변형될 수 있다.

또한, 인간 항체는 하이브리도마-기반 방법에 의해 생산될 수 있다. 인간 단클론 항체의 생산을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 기술되었다(예를 들어 문헌[Kozbor, D., J. Immunol. 133 (1984) 3001-3005]; [Brodeur, B.R. et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York (1987), pp. 51-63]; 및 [Boerner, P. et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95] 참조). 인간 B 세포 하이브리도마 기법에 의해 생산된 인간 항체는 또한 문헌[Li, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006) 3557-3562]에 기술되어 있다. 또 다른 방법으로는, 예를 들어 US 7,189,826(하이브리도마 세포주로부터 단클론 인간 IgM 항체의 생산을 기술하고 있음) 및 문헌[Ni, J., Xiandai Mianyixue 26 (2006) 265-268](인간-인간 하이브리도마를 기술하고 있음)에 기술된 방법들이 포함된다. 인간 하이브리도마 기법(트리오마(Trioma) 기법)은 또한 문헌[Vollmers, H.P. and Brandlein, S., Histology and Histopathology 20 (2005) 927-937] 및 [Vollmers, H.P. and Brandlein, S., Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27 (2005) 185-191]에 기술되어 있다.

인간 항체는 또한 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리함으로써 생산될 수 있다. 상기와 같은 가변 도메인 서열은 이어서 목적하는 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하는 기법은 하기에 기술되어 있다.

5. 라이브러리-유래 항체

본 발명의 항체는 목적하는 활성을 갖는 항체에 대해 조합 라이브러리를 선별함으로써 단리될 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리를 제작하고 목적하는 결합 특성을 갖는 항체에 대해 상기 라이브러리를 선별하기 위한 다양한 방법들이 당분야에서 공지되어 있다. 상기 방법은 예를 들어 문헌[Hoogenboom, H.R. et al., Methods in Molecular Biology 178 (2001) 1-37]에 개관되어 있고, 예를 들어 문헌[McCafferty, J. et al., Nature 348 (1990) 552-554]; [Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628]; [Marks, J.D. et al., J. Mol. Biol. 222 (1992) 581-597]; [Marks, J.D. and Bradbury, A., Methods in Molecular Biology 248 (2003) 161-175]; [Sidhu, S.S. et al., J. Mol. Biol. 338 (2004) 299-310]; [Lee, C.V. et al., J. Mol. Biol. 340 (2004) 1073-1093]; [Fellouse, F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 12467-12472]; 및 [Lee, C.V. et al., J. Immunol. Methods 284 (2004) 119-132]에 추가로 기술되어 있다.

특정한 파지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 따로따로 클로닝되고 파지 라이브러리에서 무작위로 재조합되고, 상기 라이브러리는 이어서 문헌[Winter, G. et al., Ann. Rev. Immunol. 12 (1994) 433-455]에 기술된 바와 같이 항원 결합 파지에 대해 선별될 수 있다. 파지는 전형적으로, 단일쇄 Fv(scFv) 단편으로서든지 또는 Fab 단편으로서든지 항체 단편을 디스플레이한다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 구성할 필요없이 면역원에 대한 고-친화성 항체를 제공한다. 또는, 문헌[Griffiths, A.D. et al., EMBO J. 12 (1993) 725-734]에 기술된 바와 같이, 나이브 레퍼토리를 클로닝하여(예를 들어 인간으로부터), 어떤 면역화도 없는, 광범위한 비-자가 및 또한 자가 항원에 대한 항체들의 단일 공급원을 제공할 수 있다. 마지막으로, 나이브 라이브러리는 또한, 문헌[Hoogenboom, H.R. and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388]에 기술된 바와 같이, 줄기 세포로부터 재배열되지 않은 V-유전자 분절을 클로닝하고, 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용하여 고도로 가변성인 CDR3 영역을 암호화하고 시험관내에서 재배열을 달성함으로써 합성적으로 생산될 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 기술하고 있는 특허 공보로는 예를 들어 US 5,750,373, 및 US 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 및 2009/0002360이 포함된다.

인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본원에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 간주된다.

6. 다중특이적 항체

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 다중특이적 항체, 예를 들어 이중특이적 항체이다. 다중특이적 항체는 2개 이상의 상이한 부위에 대한 결합 특이성을 갖는 단클론 항체이다. 특정 실시양태에서, 결합 특이성 중 하나는 HLA-G에 대한 것이고, 나머지 하나는 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 생산될 수 있다.

다중특이적 항체의 생산 기술은 비제한적으로 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역 글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공-발현(문헌[Milstein, C. and Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540], WO 93/08829 및 문헌[Traunecker, A. et al., EMBO J. 10 (1991) 3655-3659] 참조), 및 "놉-인-홀(knob-in-hole)" 조작(예를 들어 US 5,731,168 참조)을 포함한다. 또한, 다중특이적 항체는 항체 Fc-이종이량체성 분자를 생산하기 위한 정전기적 스티어링 효과를 조작함으로써(WO 2009/089004); 2개 이상의 항체 또는 단편을 교차결합시킴으로써(예를 들어 US 4,676,980, 및 문헌[Brennan, M. et al., Science 229 (1985) 81-83] 참조); 이중특이적 항체를 생산하기 위해 류신 지퍼를 사용함으로써(예를 들어 문헌[Kostelny, S.A. et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553] 참조); 이중특이적 항체 단편을 생산하기 위해 "다이아바디" 기술을 사용함으로써(예를 들어 문헌[Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448] 참조); 단일쇄 Fv(sFv) 이량체를 사용함으로써(예를 들어 문헌[Gruber, M et al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374] 참조); 및 삼중 특이적 항체를 생산함으로써(예를 들어 문헌[Tutt, A. et al., J. Immunol. 147 (1991) 60-69]에 기재됨) 생산될 수 있다.

또한, "옥토퍼스 항체"를 포함하는, 3개 이상의 기능적 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체가 본원에 포함된다(예를 들어 US 2006/0025576 참조).

또한, 본원의 항체 또는 단편은 HLA-G 및 또 다른 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 "이중 작용 Fab" 또는 "DAF"를 포함한다(예를 들어 US 2008/0069820 참조).

또한, 본원의 항체 또는 단편은 WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254, WO 2010/112193, WO 2010/115589, WO 2010/136172, WO 2010/145792, WO 2010/145793, WO 2011/117330, WO 2012/025525, WO 2012/025530, WO 2013/026835, WO 2013/026831, WO 2013/164325 또는 WO 2013/174873에 기재된 다중특이적 항체를 포함한다.

7. 항체 변이체

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체들의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 성질을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는, 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 내에 적절한 변형을 도입함으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 생산될 수 있다. 상기 변형은 예를 들어 항체의 아미노산 서열로부터의 잔기의 결실, 및/또는 상기 서열내로의 잔기의 삽입 및/또는 상기 서열내에서의 잔기의 치환을 포함한다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합을 수행하여 최종 구축물을 수득할 수 있으나, 단, 상기 최종 구축물은 목적하는 특성, 예를 들어 항원 결합 특성을 가져야 한다.

a) 치환, 삽입 및 결실 변이체

특정 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환적 돌연변이 유발을 위한 관심 부위는 HVR 및 FR을 포함한다. 예시적인 변화가 표 1에 "예시적 치환"이란 제목 하에, 및 아미노산 측쇄 부류와 관련하여 하기에서 더 기술하는 바와 같이 제공되어 있다. 보존적 치환을 "바람직한 치환"이란 제목 하에 표 1에 나타내었다. 아미노산 치환은 관심 항체 내에 도입될 수 있으며, 생성물들은 목적하는 활성, 예를 들어 유지/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 선별될 수 있다.

원래 잔기	예시적 치환	바람직한 치환
Ala (A)	Val; Leu; Ile	Val
Arg (R)	Lys; Gln; Asn	Lys
Asn (N)	Gln; His; Asp, Lys; Arg	Gln
Asp (D)	Glu; Asn	Glu
Cys (C)	Ser; Ala	Ser
Gln (Q)	Asn; Glu	Asn
Glu (E)	Asp; Gln	Asp
Gly (G)	Ala	Ala
His (H)	Asn; Gln; Lys; Arg	Arg
Ile (I)	Leu; Val; Met; Ala; Phe; 노르류신	Leu
Leu (L)	노르류신; Ile; Val; Met; Ala; Phe	Ile
Lys (K)	Arg; Gln; Asn	Arg
Met (M)	Leu; Phe; Ile	Leu
Phe (F)	Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr	Tyr
Pro (P)	Ala	Ala
Ser (S)	Thr	Thr
Thr (T)	Val; Ser	Ser
Trp (W)	Tyr; Phe	Tyr
Tyr (Y)	Trp; Phe; Thr; Ser	Phe
Val (V)	Ile; Leu; Met; Phe; Ala; 노르류신	Leu

아미노산은 통상적인 측쇄 성질에 따라 분류될 수 있다:

(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) 산성: Asp, Glu;

(4) 염기성: His, Lys, Arg;

(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;

(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.

비-보존적 치환은 상기 부류 중 하나의 구성원을 또 다른 부류로 교환하는 것을 포함할 것이다.

치환 변이체의 한 유형은 모 항체(예를 들어 인간화된 항체 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환시키는 것을 포함한다. 일반적으로, 추가의 연구를 위해 선택된 생산된 변이체는 모 항체에 비해 특정 생물학적 성질(예를 들어 증가된 친화성, 감소된 면역원성)에서 변경(예를 들어 개선)을 가질 것이고/이거나 모 항체의 특정 생물학적 성질을 실질적으로 유지할 것이다. 예시적인 치환 변이체는 친화성 성숙된 항체로, 상기 항체는, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은 파지-디스플레이 기반 친화성 증진 기법을 사용하여 편리하게 생산될 수 있다. 간략히, 하나 이상의 HVR 잔기가 돌연변이되고 변이 항체들은 파지 상에 디스플레이되고 특정 생물 활성(예를 들어 결합 친화성)에 대해 스크리닝된다.

예를 들어, 항체 친화성을 개선하기 위해, 변경(예를 들어 치환)이 HVR에 수행될 수 있다. 상기 변경은 HVR "핫스팟(hotspot)", 즉 체세포 성숙 과정 동안 높은 빈도로 돌연변이가 일어나는 코돈에 의해 암호화되는 잔기들(예를 들어 문헌[Chowdhury, P.S., Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196)] 참조), 및/또는 SDR(a-CDR)로 이루어질 수 있으며, 이때, 생산된 변이체 VH 또는 VL은 결합 친화성에 대해 시험된다. 2차 라이브러리를 제작하고 그로부터 재선별하는 것에 의한 친화성 성숙은, 예를 들어 문헌[Hoogenboom, H.R. et al. in Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37]에서 기술되었다. 친화성 성숙에 대한 일부 실시양태에서, 다양한 방법들 중 임의의 방법(예를 들어 오류 유발 PCR, 쇄 셔플링 또는 올리고뉴클레오티드 특이적 돌연변이 유발)에 의해 성숙을 위해 선택된 가변 유전자 내에 변화를 도입시킨다. 이어서, 2차 라이브러리를 구축한다. 상기 라이브러리는 이어서 목적하는 친화성을 갖는 임의의 항체 변이체를 확인하기 위해 선별된다. 변화를 도입하는 또 다른 방법은, 여러 HVR 잔기(예를 들어 한번에 4 내지 6개 잔기)가 무작위선정되는 HVR 특이적 접근방법을 포함한다. 항원 결합에 수반되는 HVR 잔기는, 예를 들어 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발 또는 모델링을 사용하여 특이적으로 확인할 수 있다. CDR-H3 및 CDR-L3이 특히 종종 표적화된다.

특정 실시양태에서, 변경이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한 하나 이상의 HVR 내에서 치환, 삽입 또는 결실이 일어날 수 있다. 예를 들어, 결합 친화성을 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경(예를 들어 본원에 제공된 바와 같은 보존적 치환)이 HVR에서 이루어질 수 있다. 상기 변경은 HVR "핫스팟" 또는 SDR 밖에서 일어날 수 있다. 상기에 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 실시양태에서, 각각의 HVR은 변경되지 않거나, 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.

돌연변이 유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역의 확인에 유용한 방법은 문헌[Cunningham, B.C. and Wells, J.A., Science 244 (1989) 1081-1085]에 기술된 바와 같은 "알라닌 스캐닝 돌연변이 유발"로 불린다. 상기 방법에서는, 항체와 항원의 상호작용이 영향을 받는지를 결정하기 위해 표적 잔기들(예를 들어 arg, asp, his, lys 및 glu와 같은 하전된 잔기들)의 잔기 또는 기를 확인하고 중성 또는 음으로 하전된 아미노산(예를 들어 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 치환시킨다. 초기 치환에 대해 기능적 민감성을 나타내는 아미노산 위치에 추가의 치환이 도입될 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 항원-항체 복합체의 결정 구조는 항체와 항원 사이의 접촉점을 확인한다. 상기 접촉 잔기 및 인접 잔기들은 치환 후보로서 표적화되거나 제거될 수 있다. 그들이 목적하는 성질을 보유하는지를 측정하기 위해 변이체들을 선별할 수 있다.

아미노산 서열 삽입은, 길이가 1개 잔기로부터 백개 이상 잔기를 함유하는 폴리펩티드까지 범위의 아미노- 및/또는 카복시-말단 융합뿐 아니라, 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예로는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체가 포함된다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체로는 효소(예를 들어 ADEPT) 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 대한 항체의 N- 또는 C-말단으로의 융합이 포함된다.

b) Fc 영역 변이체

특정 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 변형이 본원에서 제공된 항체의 Fc 영역내에 도입됨으로써 Fc 영역 변이체를 생산할 수 있다. Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에 아미노산 변형(예를 들어 치환)을 포함하는, 인간 Fc 영역 서열(예를 들어 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.

감소된 효과기 기능을 갖는 항체는 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 항체를 포함한다(US 6,737,056). 상기 Fc 돌연변이체로는, 잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 갖는 소위 "DANA" Fc 돌연변이체를 포함하여, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체가 포함된다(US 7,332,581).

FcR에 대해 개선되거나 감소된 결합을 갖는 특정 항체 변이체가 기술되어 있다(예를 들어 US 6,737,056; WO 2004/056312; 및 문헌[Shields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604] 참조).

본 발명의 한 실시양태에서, 이러한 항체는 돌연변이 L234A 및 L235A를 갖거나 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G를 갖는 IgG1이다. 또 다른 실시양태에서, 돌연변이 S228P 및 L235E, 또는 S228P, L235E 및 P329G를 갖는 IgG4이다(카밧 등의 EU 인덱스에 따른 넘버링, 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]).

증가된 반감기 및 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 개선된 결합을 갖는 항체(이는, 태아로의 모 IgG의 전달에 책임이 있음)(문헌[Guyer, R.L. et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593] 및 [Kim, J.K. et al., J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434])는 US 2005/0014934에 기재되어 있다. 이들 항체는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선하는 하나 이상의 치환을 내부에 갖는 Fc 영역을 포함한다. 이러한 Fc 변이체는 Fc 영역 잔기 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434 중 하나 이상에서 치환, 예를 들어 Fc 영역 잔기 434의 치환을 갖는 것을 포함한다(US 7,371,826).

또한, Fc 영역 변이체의 다른 예에 관하여 문헌[Duncan, A.R. and Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740]; US 5,648,260; US 5,624,821; 및 WO 94/29351을 참조한다.

c) 시스테인 조작된 항체 변이체

특정 실시양태에서, 항체의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된, 시스테인 조작된 항체, 예를 들어 "thioMAb"를 생산하는 것이 바람직할 수 있다. 특정 실시양태에서, 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 부위에서 발생한다. 이들 잔기를 시스테인으로 치환함으로써 반응성 티올 기는 항체의 접근가능한 부위에 위치되며 항체를 다른 모이어티, 예컨대 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 접합시켜 본원에 기재된 바와 같은 면역 접합체를 생산하는 데 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 하기 잔기 중 임의의 하나 이상이 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205(카밧 넘버링); 중쇄의 A118(EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400(EU 넘버링). 시스테인 조작된 항체는 예를 들어 US 7,521,541에 기재된 바와 같이 생산될 수 있다.

d) 항체 유도체

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 당분야에 공지되고 용이하게 이용가능한 추가적 비-단백성 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는 비제한적으로 수용성 중합체를 포함한다. 수용성 중합체의 비제한적인 예는 비제한적으로 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-다이옥솔란, 폴리-1,3,6-트라이옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산(단독중합체 또는 랜덤 공중합체) 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올(예를 들어 글리세롤), 폴리비닐 알코올 및 이들의 혼합물을 포함한다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드는 이의 물에서의 안정성으로 인해 제조시 유리할 수 있다. 중합체는 임의의 분자량의 것일 수 있고, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 항체에 부착된 중합체의 수는 변할 수 있고, 하나 초과의 중합체가 부착되는 경우, 이는 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 비제한적으로 개선할 항체의 특정 특성 또는 기능, 항체 유도체가 한정된 조건 하에 치료법에서 사용될 것인지 여부 등을 포함하는 고려사항을 기반으로 결정될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 방사선에 대한 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 항체 및 비-단백성 모이어티의 접합체가 제공된다. 한 실시양태에서, 비-단백성 모이어티는 탄소 나노 튜브이다(문헌[Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605]). 방사선은 임의의 파장의 것일 수 있고, 비제한적으로 정상 세포에 유해하지 않으나, 항체-비-단백성 모이어티에 인접한 세포가 사멸하는 온도로 비-단백성 모이어티를 가열하는 파장을 포함한다.

B. 재조합 방법 및 조성물

항체는 예를 들어 US 4,816,567에 기재된 바와 같이 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 생산될 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 항-HLA-G 항체를 암호화하는 단리된 핵산이 제공된다. 이러한 핵산은 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 VH를 포함하는 아미노산 서열(예를 들어 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)을 암호화할 수 있다. 추가적 실시양태에서, 상기 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터(예를 들어 발현 벡터)가 제공된다. 추가적 실시양태에서, 상기 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 하나의 이러한 실시양태에서, 숙주 세포는 하기를 포함한다(예를 들어 하기에 의해 형질전환된다): (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 제1 벡터, 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 제2 벡터. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵 세포, 예를 들어 차이니즈 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary, CHO) 세포, HEK293 세포 또는 림프구양 세포(예를 들어 Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 한 실시양태에서, 상기 제공된 바와 같은 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 항체의 발현에 적합한 조건 하에 배양하고, 임의적으로 항체를 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 회수하는 것을 포함하는, 항-HLA-G 항체의 생산 방법이 제공된다.

항-HLA-G 항체의 재조합 생산을 위해, 예를 들어 전술한 바와 같은 항체를 암호화하는 핵산을 단리하고, 숙주 세포에서의 추가의 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터 내에 삽입시킨다. 상기 핵산은 통상적인 절차를 사용하여(예를 들어 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리하고 서열 분석할 수 있다.

항체-암호화 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포로는 본원에 기술된 원핵 또는 진핵 세포가 포함된다. 예를 들어, 항체는, 특히 글리코실화 및 Fc 효과기 기능이 필요하지 않은 경우, 세균에서 생산될 수 있다. 세균에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해서는, 예를 들어 US 5,648,237, US 5,789,199 및 US 5,840,523을 참조한다(또한 에스케리키아 콜라이에서 항체 단편의 발현을 기술하고 있는 문헌[Charlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254] 참조). 발현 후에, 항체는 가용성 분획에서 세균 세포 페이스트로부터 단리될 수 있으며 더 정제될 수 있다.

원핵세포 이외에, 글리코실화 경로가 "인간화"되어 부분적으로 또는 완전히 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항체의 생산을 야기하는 진균 및 효모 균주를 포함하여, 사상균 또는 효모와 같은 진핵 미생물도 항체-암호화 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다(문헌[Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414]; 및 문헌[Li, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215] 참조).

글리코실화된 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체(무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예로는 식물 및 곤충 세포가 포함된다. 특히 스포도프테라 프루지페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해, 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 많은 바큘로바이러스 균주가 동정되었다.

식물 세포 배양물도 또한 숙주로 사용될 수 있다. 예를 들어 US 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978 및 4,417,429(유전자전이 식물에서 항체를 생산하기 위한 플랜티바디즈(PLANTIBODIES, 상표) 기법을 기술하고 있음)를 참조한다.

또한, 척추동물 세포가 숙주로 사용될 수 있다. 예를 들어, 현탁액에서 성장하기에 적합한 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7); 인간 배아 신장 세포주(예를 들어 문헌[Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74]에 기술된 바와 같은 293 또는 293 세포); 베이비 햄스터 신장 세포(BHK); 마우스 세르톨리(sertoli) 세포(예를 들어 문헌[Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252]에 기술된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포(CV1); 아프리카 초록 원숭이 신장 세포(VERO-76); 인간 자궁경부암 세포(HELA); 개 신장 세포(MDCK); 버팔로 래트 간세포(BRL 3A); 인간 폐 세포(W138); 인간 간세포(Hep G2); 마우스 유방종양 세포(MMT 060562); 예를 들어 문헌[Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68]에 기술된 바와 같은 TRI 세포; MRC5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주로는 DHFR- CHO 세포(문헌[Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220]를 포함한 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포; 및 골수종 세포주, 예를 들어 Y0, NS0 및 Sp2/0가 포함된다. 항체 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해서는, 예를 들어 문헌[Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C.(ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268]을 참조한다.

C. 분석

본원에 제공된 항-HLA-G 항체는 당분야에 공지된 다양한 분석들에 의해 이의 물리/화학 성질 및/또는 생물 활성을 확인하고, 그에 대해 선별되거나 특성규명될 수 있다.

1. 결합 분석 및 기타 분석

한 양태에서, 본 발명의 항체를 예를 들어 ELISA, 웨스턴 블롯(Western blot) 등과 같은 공지된 방법에 의해 이의 항원 결합 활성에 대해 시험한다.

또 다른 양태에서, 경쟁 분석을 사용하여 HLA-G에 대한 결합에 대해 HLA-G-0031(서열번호 7의 VH 서열 및 서열번호 8의 VL 서열을 포함함)과 경쟁하는 항체를 식별할 수 있다. 본 발명의 한 실시양태는, 인간 HLA-G에 대한 결합에 대해, 서열번호 7의 VH 서열의 3개의 HVR 모두 및 서열번호 8의 VL 서열의 3개의 HVR 모두를 포함하는 항-HLA-G 항체와 경쟁하는 항체이다. 특정 실시양태에서, 이러한 경쟁 항체는 항-HLA-G 항체 HLA-G-0031에 의해 결합된 동일한 에피토프(예를 들어 선형 또는 형태 에피토프)에 결합한다. 한 실시양태에서, HLA-G 상의 동일한 에피토프에 결합하는 항-HLA-G 항체가 서열번호 7의 VH 서열 및 서열번호 8의 VL 서열을 포함하는 항체로서 제공된다. 또 다른 양태에서, 경쟁 분석을 사용하여 HLA-G에 대한 결합에 대해 HLA-G-0090(서열번호 31의 VH 서열 및 서열번호 32의 VL 서열을 포함함)과 경쟁하는 항체를 식별할 수 있다. 본 발명의 한 실시양태는, 인간 HLA-G에 대한 결합에 대해, 서열번호 31의 VH 서열의 3개의 HVR 모두 및 서열번호 32의 VL 서열의 3개의 HVR 모두를 포함하는 항-HLA-G 항체와 경쟁하는 항체이다. 특정 실시양태에서, 이러한 경쟁 항체는 항-HLA-G 항체 HLA-G-0090에 의해 결합된 동일한 에피토프(예를 들어 선형 또는 형태 에피토프)에 결합한다. 한 실시양태에서, HLA-G 상의 동일한 에피토프에 결합하는 항-HLA-G 항체가 서열번호 31의 VH 서열 및 서열번호 32의 VL 서열을 포함하는 항체로서 제공된다. 항체가 결합하는 에피토프를 맵핑하는 상세한 예시적 방법은 문헌[Morris, G.E. (ed.), Epitope Mapping Protocols, In: Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Humana Press, Totowa, NJ (1996)]에 제공된다.

예시적인 경쟁 분석에서는, 고정화된 HLA-G를, HLA-G에 결합하는 제1의 표지된 항체(예를 들어 항-HLA-G 항체 HLA-G-0031 또는 HLA-G-0090) 및 HLA-G에 대한 결합을 두고 상기 제1 항체와 경쟁하는 이의 능력을 시험하는 제2의 표지되지 않은 항체를 포함하는 용액에서 배양한다. 상기 제2 항체는 하이브리도마 상청액 중에 존재할 수 있다. 대조군으로서, 고정화된 HLA-G를, 제1 표지된 항체는 포함하지만 제2의 표지되지 않은 항체를 포함하지 않는 용액에서 배양한다. HLA-G에 대한 제1 항체의 결합을 허용하는 조건하에서 배양한 후, 과량의 미결합 항체를 제거하고, 고정화된 HLA-G와 결합된 표지의 양을 측정한다. 고정화된 HLA-G와 결합된 표지의 양이 대조군 샘플에 비해 검사 샘플에서 실질적으로 감소된다면, 제2 항체가 HLA-G에 대한 결합을 두고 제1 항체와 경쟁함을 시사한다(문헌[Harlow, E. and Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1988)] 참조). 또 다른 예시적 경쟁 분석에 대해 실시예 2(에피토프 맵핑 ELISA/결합 경쟁 분석)를 참조한다.

2. 활성 분석

한 양태에서, 생물 활성을 갖는 항-HLA-G 항체를 식별하기 위한 분석이 제공된다. 생물 활성은 예를 들어 상이한 면역 세포(T 세포를 포함함)의 활성화 및/또는 증식을 증진시키는 능력을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이는 면역 조절성 시토카인(예를 들어 인터페론-감마(IFN-감마) 및/또는 종양 괴사 인자 알파(TNF 알파))의 방출을 증진시킨다. 다른 면역 조절성 시토카인은 예를 들어 예를 들어 상이한 세포 유형에 결합하는 IL1ß, IL6, IL12, 그랜자임 B 등이다. 또한, 이러한 생체내 및/또는 시험관내 생물 활성을 갖는 항체가 제공된다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 항체를 예를 들어 하기 실시예에 기재된 바와 같이 이러한 생물 활성에 대해 시험한다.

D. 면역 접합체(암 단독에 대한 것 또는 표적에 대해 변형됨)

또한, 본 발명은 하나 이상의 세포독성제, 예컨대 화학 치료 제제 또는 약물, 성장 억제제, 독소(예를 들어 단백질 독소, 박테리아, 균류, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소, 또는 이의 단편) 또는 방사성 동위원소에 접합된 항-HLA-G 항체를 포함하는 면역 접합체를 제공한다.

한 실시양태에서, 면역 접합체는, 항체가 하나 이상의 약물(비제한적으로 메이탄시노이드(maytansinoid)(US 5,208,020, US 5,416,064 및 EP 0 425 235 B1 참조); 아우리스타틴(auristatin), 예컨대 모노메틸 아우리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF(MMAE 및 MMAF)(US 5,635,483, US 5,780,588 및 US 7,498,298 참조); 돌라스타틴(dolastatin); 칼리케아미신(calicheamicin) 또는 이의 유도체(US 5,712,374, US 5,714,586, US 5,739,116, US 5,767,285, US 5,770,701, US 5,770,710, US 5,773,001 및 US 5,877,296; 문헌[Hinman, L.M. et al., Cancer Res. 53 (1993) 3336-3342]; 및 [Lode, H.N. et al., Cancer Res. 58 (1998) 2925-2928] 참조); 안트라사이클린(anthracycline), 예컨대 다우노마이신(daunomycin) 또는 독소루비신(문헌[Kratz, F. et al., Curr. Med. Chem. 13 (2006) 477-523]; [Jeffrey, S.C. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 16 (2006) 358-362]; [Torgov, M.Y. et al., Bioconjug. Chem. 16 (2005) 717-721]; [Nagy, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 829-834]; [Dubowchik, G.M. et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12 (2002) 1529-1532]; [King, H.D. et al., J. Med. Chem. 45 (20029 4336-4343)]; 및 US 6,630,579 참조); 메토트렉세이트; 빈데신(vindesine); 탁산(taxane), 예컨대 도세탁셀(docetaxel), 파클리탁셀(paclitaxel), 라로탁셀(larotaxel), 테세탁셀(tesetaxel) 및 오르타탁셀(ortataxel); 트라이코테센(trichothecene); 및 CC1065를 포함함)에 접합된, 항체-약물 접합체(ADC)이다.

또 다른 실시양태에서, 면역 접합체는, 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합성 활성 단편, 외독소 A 쇄(슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa)), 리신(ricin) A 쇄, 아브린(abrin) A 쇄, 모데신(modeccin) A 쇄, 알파-사르신(sarcin), 알레우리테스 포르디(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴(dianthin) 단백질, 피톨라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질(PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신(curcin), 크로틴(crotin), 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌(gelonin), 미토젤린(mitogellin), 리스트릭톡신(restrictocin), 페노마이신(phenomycin), 네오마이신(neomycin) 및 트라이코테센(tricothecene)을 포함하는, 효소적으로 활성인 독소 또는 이의 단편에 접합된 본원에 기재된 항체를 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 면역 접합체는, 방사성 접합체를 형성하는 방사성 원자에 접합된 본원에 기재된 항체를 포함한다. 다양한 방사성 동위원소가 방사성 접합체의 생산에 이용가능하다. 예는 At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², Pb²¹² 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다. 방사성 접합체가 검출을 위해 사용되는 경우, 이는 섬광계수법 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들어 TC^99m 또는 I¹²³, 또는 핵자기 공명(NMR) 이미지화(자기 공명 이미지화(MRI)로도 공지됨)를 위한 스핀 라벨, 예컨대 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.

항체 및 세포독성제의 접합체는 다양한 이작용성 단백질 커플링제, 예컨대 N-석신이미딜-3-(2-피리딜다이티오) 프로피오네이트(SPDP), 석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카복시레이트(SMCC), 이미노티올란(IT), 이미도에스터의 이작용성 유도체(예컨대 다이메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스터(예컨대 다이석신이미딜 수베레이트), 알데하이드(예컨대 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물(예컨대 비스 (p-아지도벤조일) 헥산다이아민), 비스-다이아조늄 유도체(예컨대 비스-(p-다이아조늄벤조일)-에틸렌다이아민), 다이이소시아네이트(예컨대 톨루엔 2,6-다이이소시아네이트) 및 비스-활성 불소 화합물(예컨대 1,5-다이플루오로-2,4-다이니트로벤젠)을 사용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, 리신 면역 독소를 문헌[Vitetta, E.S. et al., Science 238 (1987) 1098-1104]에 기재된 바와 같이 생산할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸다이에틸렌 트라이아민 펜타아세트산(MX-DTPA)은 항체에 대한 방사성 뉴클레오티드의 접합을 위한 예시적 킬레이트제이다. WO 94/11026을 참조한다. 링커는 세포에서 세포독성 약물의 방출을 가능하게 하는 "절단성 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산 불안정 링커, 펩티다제-민감성 링커, 광 불안정 링커, 다이메틸 링커 또는 다이설파이드-함유 링커(문헌[Chari, R.V. et al., Cancer Res. 52 (1992) 127-131]; US 5,208,020)가 사용될 수 있다.

본원에서 면역 접합체 또는 ADC는 비제한적으로 교차결합 시약(비제한적으로 BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC, 설포-SMPB 및 SVSB(석신이미딜-(4-비닐설폰)벤조에이트)(예를 들어 피어스 바이오테크놀로지 인코포레이티드(Pierce Biotechnology, Inc., 미국 일리노이주 락포드 소재)로부터 입수가능)를 포함함)을 사용하여 생산한 접합체를 특별히 고려한다.

E. 진단 및 검출을 위한 방법 및 조성물

특정 실시양태에서, 본원에서 제공된 임의의 항-HLA-G 항체는 생물 샘플에서 HLA-G의 존재를 검출하기에 유용하다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "검출"은 정량적 또는 정성적 검출을 포함한다. 특정 실시양태에서, 생물 샘플은 세포 또는 조직, 예컨대 면역 세포 또는 T 세포 침윤물 및/또는 종양 세포를 포함한다.

한 실시양태에서, 진단 또는 검출 방법에 사용하기 위한 항-HLA-G 항체가 제공된다. 추가의 양태에서, 생물 샘플의 HLA-G의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 HLA-G에 대한 항-HLA-G 항체의 결합을 허용하는 조건 하에 생물 샘플을 본원에서 기술된 바와 같은 항-HLA-G 항체와 접촉시키고, 항-HLA-G 항체와 HLA-G 사이에 복합체가 형성되는지 여부를 검출하는 것을 포함한다. 상기 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 한 실시양태에서, 예를 들어 HLA-G가 환자 선별을 위한 바이오마커인 경우, 항-HLA-G 항체를 사용하여 항-HLA-G 항체를 사용한 치료에 적합한 대상을 선별한다.

특정 실시양태에서, 표지된 항-HLA-G 항체가 제공된다. 표지로는 직접 검출되는 표지 또는 잔기(예를 들어 형광, 발색, 전자-고밀도, 화학발광 및 방사성 표지)뿐 아니라, 예를 들어 효소 반응 또는 분자 상호작용을 통해 간접적으로 검출되는 잔기, 예를 들어 효소 또는 리간드가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 예시적인 표지로는 방사성 동위원소 ³²P, ¹⁴C, ¹²⁵I, ³H 및 ¹³¹I, 형광단, 예를 들어 희토류 킬레이트화물 또는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루시퍼라제, 예를 들어 반딧불이 루시퍼라제 및 세균 루시퍼라제(US 4,737,456), 루시페린, 2,3-다이하이드로프탈라진디온, 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제, 예를 들어 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제 및 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제, HRP, 락토퍼옥시다제 또는 마이크로퍼옥시다제와 같은 염료 전구체를 산화시키기 위해 과산화수소를 사용하는 효소와 커플링된 헤테로사이클릭 옥시다제, 예를 들어 우리카제 및 잔틴 옥시다제, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 유리 라디칼 등이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다.

F. 약학 제형

본원에서 기술된 바와 같은 항-HLA-G 항체의 약학 제형은 목적하는 정도의 순도를 갖는 상기 항체를 하나 이상의 임의적인 약학적으로 허용되는 담체와 혼합함으로써(문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)]), 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로 생산된다. 약학적으로 허용되는 담체는 일반적으로, 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 무독성이며, 하기를 포함하나 이로 한정되지는 않는다: 완충제, 예를 들어 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 산화방지제; 보존제(예를 들어 옥타데실 다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역 글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리(비닐피롤리돈); 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 다이사카라이드, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함한 기타 탄수화물; 킬레이트화제, 예를 들어 EDTA; 당, 예를 들어 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨; 염-생성 상대-이온, 예를 들어 나트륨; 금속 착체(예를 들어 Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG). 본원에서 예시적인 약학적으로 허용되는 담체로는 또한 간질성(intersitial) 약물 분산제, 예를 들어 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질(sHASEGP), 예를 들어 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 예를 들어 rhuPH20(하일레넥스(HYLENEX, 등록상표)(박스터 인터내셔날 인코포레이티드(Baxter International, Inc.))이 포함된다. rhuPH20을 포함하여, 특정한 예시적 sHASEGP 및 사용 방법은 US 2005/0260186 및 2006/0104968에 기술되어 있다. 한 양태에서, sHASEGP는 콘드로이티나제와 같은 하나 이상의 추가의 글리코사미노글리카나제와 혼합된다.

예시적인 동결건조 항체 제형이 US 6,267,958에 기술되어 있다. 수성 항체 제형으로는 US 6,171,586 및 WO 2006/044908에 기술된 것들이 포함되며, 상기 후자의 제형은 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함한다.

본 발명의 제형은 또한 치료되는 특정한 적응증에 필요한 대로 하나 초과의 활성 성분, 바람직하게는 서로 불리하게 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 성분들을 함유할 수 있다. 예를 들어, 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 활성 성분들은 의도한 목적에 효과적인 양으로 함께 적절히 존재한다.

활성 성분은, 예를 들어 코아세르베이션(coacervation) 기법에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로 캡슐에, 예를 들어 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로 캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로 캡슐 각각에, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들어 리포좀, 알부민 마이크로 스피어, 마이크로 유화액, 나노 입자 및 나노 캡슐)에, 또는 마크로 유화액에 봉입될 수 있다. 상기 기법들은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)]에 개시되어 있다.

서방성 제제를 제조할 수 있다. 서방성 제제의 적절한 예로는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되며, 상기 매트릭스는 성형 제품, 예를 들어 필름 또는 마이크로 캡슐의 형태이다.

생체내 투여에 사용될 제형은 일반적으로 멸균성이다. 멸균은, 예를 들어 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다.

G. 치료 방법 및 조성물

본원에 제공된 임의의 항-HLA-G 항체(또는 항원 결합 단백질)가 치료 방법에 사용될 수 있다.

한 양태에서, 약제로 사용하기 위한, 항-HLA-G 항체가 제공된다. 추가의 양태에서, 암을 치료하는 데 사용하기 위한 항-HLA-G 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 치료 방법에 사용하기 위한 항-HLA-G 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 본 발명은, 개체에게 효과량의 항-HLA-G 항체를 투여하는 것을 포함하는, 암을 갖는 개체를 치료하는 방법에 사용하기 위한 항-HLA-G 항체를 제공한다.

추가적 실시양태에서, 본 발명은 면역 조절제로서 사용하기 위해/직접적으로 또는 간접적으로 증식, 면역 세포의 활성화(예를 들어 면역 자극성 시토카인, 예컨대 TNF알파(TNFa) 및 IFN감마(IFNg)의 방출에 의함) 또는 면역 세포의 추가적 모집을 유도하는 항-HLA-G 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 개체에서 면역 조절제로서 사용하기 위한 방법/직접적으로 또는 간접적으로 증식, 면역 세포의 활성화(예를 들어 면역 자극성 시토카인, 예컨대 TNFa 및 IFN감마의 방출에 의함) 또는 면역 세포의 추가적 모집을 유도하는 방법에서 사용하기 위한 항-HLA-G 항체를 제공하되, 이는 상기 개체에게 면역 조절, 또는 증식, 면역 세포의 활성화(예를 들어 면역 자극성 시토카인, 예컨대 TNFa 및 IFN감마의 방출에 의함) 또는 면역 세포의 추가적 모집의 직접적 또는 간접적 유도를 위해 효과량의 항-HLA-G 항체를 투여하는 것을 포함한다.

추가적 실시양태에서, 본 발명은 면역 자극제로서 사용하기 위한/종양 괴사 인자 알파(TNF 알파) 방출을 자극하기 위한 항-HLA-G 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 개체에서 직접적으로 또는 간접적으로 면역 세포의 증식, 활성화(예를 들어 면역 자극성 시토카인, 예컨대 TNFa 및 IFNg의 방출에 의함) 또는 추가적 모집을 유도하기 위한 면역 조절의 방법에서 사용하기 위한 항-HLA-G 항체를 제공하되, 이는 상기 개체에게 직접적으로 또는 간접적으로 면역 세포의 증식, 활성화(예를 들어 면역 자극성 시토카인, 예컨대 TNFa 및 IFNg의 방출에 의함) 또는 추가적 모집을 유도하기 위한 효과량의 면역 조절용 항-HLA-G 항체를 제공하는 것을 포함한다.

추가적 실시양태에서, 본 발명은 종양(종양 세포)에서 면역 억제의 억제에서 사용하기 위한 항-HLA-G 항체를 제공한다. 추가적 실시양태에서, 본 발명은 HLA-G 특이적인 억제된 면역 반응(예를 들어 면역 세포에 의한 시토카인 방출(예를 들어 단핵구에 의한 TNF 알파 방출))의 회복에서 사용하기 위한 항-HLA-G 항체를 제공한다.

임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 바람직하게는 인간이다. 추가의 양태에서, 본 발명은 약제의 생산 또는 제조에 있어서, 항-HLA-G 항체의 용도를 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 약제는 암 치료를 위한 것이다. 추가의 실시양태에서, 상기 약제는, 암을 갖는 개체에게 효과량의 약제를 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한 것이다. 추가의 실시양태에서, 상기 약제는 암 세포의 세포 매개된 용해를 유도하기 위한 것이다. 추가의 실시양태에서, 상기 약제는, 암 세포에서 세포자멸을 유도하거나 암 세포 증식을 억제하기에 효과적인 양의 약제를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 암을 앓고 있는 개체에서 암 세포의 세포 매개된 용해를 유도하는 방법에 사용하기 위한 것이다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.

추가의 양태에서, 본 발명은 암을 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 암을 갖는 개체에게 효과량의 항-HLA-G를 투여하는 것을 포함한다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.

추가의 양태에서, 본 발명은, 암을 앓고 있는 개체에서 암 세포의 세포 매개된 용해를 유도하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은, 암을 앓고 있는 개체에서 암 세포의 세포 매개된 용해를 유도하기에 효과적인 양의 항-HLA-G를 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, "개체"는 인간이다.

추가의 양태에서, 본 발명은, 예를 들어 임의의 상기 치료 방법에 사용하기 위한, 본원에 제공된 임의의 항-HLA-G 항체를 포함하는 약학 제형을 제공한다. 한 실시양태에서, 약학 제형은 본원에 제공된 임의의 항-HLA-G 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다.

본 발명의 항체(및 임의의 추가의 치료제)는 비경구, 폐내 및 비강내, 및 경우에 따라, 국소 치료를 위해 병변내 투여를 포함하여, 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입으로는 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여가 포함된다. 투약은 부분적으로 투여가 단기인지 또는 장기인지 여부에 따라, 임의의 적합한 경로에 의해, 예를 들어 정맥내 또는 피하 주사와 같은 주사에 의할 수 있다. 다양한 시점에 걸친 단일 또는 다중 투여, 볼루스(bolus) 투여 및 펄스 주입을 포함하나 이로 한정되지는 않는 다양한 투약 스케줄이 본원에서 고려된다.

본 발명의 항체는 올바른 의료 행위와 일치하는 방식으로 제형화되고 투약되고 투여된다. 이와 관련하여 고려할 요인들로는 치료할 특정 질환, 치료 받을 특정 포유동물, 개개 환자의 임상적 상태, 질환의 원인, 약제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정 및 의사에게 공지된 기타 요인들이 포함된다. 항체는 문제의 질환을 예방 또는 치료하기 위해 현재 사용되는 하나 이상의 약제와 함께 제형화될 필요는 없지만 임의적으로 함께 제형화된다. 상기 다른 약제의 효과량은 제형에 존재하는 항체의 양, 질환 또는 치료 유형, 및 상기 논의된 다른 요인들에 따라 달라진다. 이들은 일반적으로 본원에 기술된 바와 동일한 투여량으로 본원에 기술된 바와 같은 투여 경로 하에, 또는 본원에 기술된 투여량의 약 1 내지 99%의 양으로, 또는 실험적/임상적으로 적절한 것으로 결정된 임의의 투여량으로 및 임의의 경로에 의해 사용된다.

질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 항체의 적절한 투여량(단독으로 또는 하나 이상의 다른 추가 치료제와 함께 사용될 때)은 치료할 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 항체가 예방 목적으로 투여되는지 아니면 치료 목적으로 투여되는지 여부, 이전의 치료, 항체에 대한 환자의 임상 병력 및 반응, 및 주치의의 재량에 따라 달라질 것이다. 항체는 환자에게 한번에 또는 일련의 치료 과정 동안 적절히 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라서, 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg(예를 들어 0.5 내지 10 mg/kg)의 항체가, 예를 들어 1회 이상의 별도의 투여에 의하든지 또는 연속 주입에 의하든지, 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 한 전형적인 일일 투여량은, 상기 언급한 요인들에 따라서, 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 이상의 범위일 수 있다. 수일 이상동안 반복 투여하기 위해, 병태에 따라서, 치료는 일반적으로 질환 증상의 목적하는 억제가 일어날 때까지 지속된다. 항체의 한 예시적인 투여량은 약 0.05 내지 약 10 mg/kg의 범위이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg(또는 이들의 임의의 조합) 중 하나 이상의 용량을 환자에게 투여할 수 있다. 상기 투여량은 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 3주마다(예를 들어 환자가 약 2 내지 약 20회, 또는 예를 들어 약 6회 투여량의 항체를 투여받도록) 투여될 수 있다. 초기의 보다 높은 투입 용량에 이어, 하나 이상의 보다 낮은 용량이 투여될 수 있다. 예시적인 투약 방법은 약 4 mg/kg의 초기 적재 투여량을 투여한 후에, 약 2 mg/kg의 항체의 주간 유지 투여량을 투여하는 것을 포함한다. 그러나, 다른 투약 방법들도 유용할 수 있다. 상기 치료의 진행은 통상적인 기법 및 분석들에 의해 용이하게 모니터링된다.

임의의 상기 제형 또는 치료 방법은 항-HLA-G 항체 대신에 또는 이에 더하여 본 발명의 면역 접합체를 사용하여 수행될 수 있는 것으로 이해된다.

II. 제품

본 발명의 또 다른 양태에서, 전술한 질환의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제품이 제공된다. 상기 제품은 용기, 및 용기 상에 또는 용기에 부착된 표지 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기로는, 예를 들어 병, 바이알, 주사기, IV 용액 주머니 등이 포함된다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 제조될 수 있다. 용기는 조성물을 단독으로 또는 병태의 치료, 예방 및/또는 진단에 효과적인 또 다른 조성물과 함께 포함하며, 멸균 진입구를 가질 수 있다(예를 들어 상기 용기는 피하 주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 주머니 또는 바이알일 수 있다). 조성물 중 하나 이상의 활성 약제는 본 발명의 항체이다. 표지 또는 패키지 삽입물은 조성물이 선택된 병태를 치료하기 위해 사용되는 것을 지시한다. 또한, 제품은 (a) 본 발명의 항체를 포함하는 조성물이 그 안에 함유된 제1 용기; 및 (b) 추가의 세포독성 약제 또는 그렇지 않으면 치료제를 포함하는 조성물이 그 안에 함유된 제2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 실시양태에서 상기 제품은 조성물이 특정 병태를 치료하기 위해 사용될 수 있음을 나타내는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 다르게는 또는 추가로, 상기 제품은 약학적으로 허용되는 완충제, 예를 들어 주사용 정균수(BWFI), 포스페이트-완충 식염수, 링거(Ringer)액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2(또는 제3)의 용기를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제품은 다른 완충제, 희석제, 충전제, 바늘 및 주사기를 포함하여, 상업적 및 사용자의 관점에서 바람직한 다른 물질들을 추가로 포함할 수 있다.

하기 실시예 및 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되며, 이의 범위는 첨부된 특허청구범위에 제시된다. 변형이 본 발명의 목적을 벗어나지 않고 제시된 절차로 변형이 이루어질 수 있음이 이해된다.

아미노산 서열의 설명

· 항-HLAG 항체(가변 영역 및 초가변 영역(HVR)):

서열번호 1: 중쇄 HVR-H1, HLA-G-0031

서열번호 2: 중쇄 HVR-H2, HLA-G-0031

서열번호 3: 중쇄 HVR-H3, HLA-G-0031

서열번호 4: 경쇄 HVR-L1, HLA-G-0031

서열번호 5: 경쇄 HVR-L2, HLA-G-0031

서열번호 6: 경쇄 HVR-L3, HLA-G-0031

서열번호 7: 중쇄 가변 도메인 VH, HLA-G-0031

서열번호 8: 경쇄 가변 도메인 VL, HLA-G-0031

서열번호 9: 중쇄 HVR-H1, HLA-G-0039

서열번호 10: 중쇄 HVR-H2, HLA-G-0039

서열번호 11: 중쇄 HVR-H3, HLA-G-0039

서열번호 12: 경쇄 HVR-L1, HLA-G-0039

서열번호 13: 경쇄 HVR-L2, HLA-G-0039

서열번호 14: 경쇄 HVR-L3, HLA-G-0039

서열번호 15: 중쇄 가변 도메인 VH, HLA-G-0039

서열번호 16: 경쇄 가변 도메인 VL, HLA-G-0039

서열번호 17: 중쇄 HVR-H1, HLA-G-0041

서열번호 18: 중쇄 HVR-H2, HLA-G-0041

서열번호 19: 중쇄 HVR-H3, HLA-G-0041

서열번호 20: 경쇄 HVR-L1, HLA-G-0041

서열번호 21: 경쇄 HVR-L2, HLA-G-0041

서열번호 22: 경쇄 HVR-L3, HLA-G-0041

서열번호 23: 중쇄 가변 도메인 VH, HLA-G-0041

서열번호 24: 경쇄 가변 도메인 VL, HLA-G-0041

서열번호 25: 중쇄 HVR-H1, HLA-G-0090

서열번호 26: 중쇄 HVR-H2, HLA-G-0090

서열번호 27: 중쇄 HVR-H3, HLA-G-0090

서열번호 28: 경쇄 HVR-L1, HLA-G-0090

서열번호 29: 경쇄 HVR-L2, HLA-G-0090

서열번호 30: 경쇄 HVR-L3, HLA-G-0090

서열번호 31: 중쇄 가변 도메인 VH, HLA-G-0090

서열번호 32: 경쇄 가변 도메인 VL, HLA-G-0090

서열번호 33: 인간화된 변이체 중쇄 가변 도메인 VH, HLA-G-0031-0104 (HLA-G-0104)

서열번호 34: 인간화된 변이체 경쇄 가변 도메인 VL, HLA-G-0031-0104 (HLA-G-0104)

· 추가적 서열:

서열번호 35: 예시적 인간 HLA-G

서열번호 36: 예시적 인간 HLA-G 세포외 도메인(ECD)

서열번호 37: 예시적 인간 ß2M

서열번호 38: 변형된 인간 HLA-G(여기서 HLA-G 특이적 아미노산은 HLA-A 공통 아미노산에 의해 대체됨(= 이식 제거된(degrafted) HLA-G, 또한 도 1 참조)) ECD

서열번호 39: 예시적 인간 HLA-A2

서열번호 40: 예시적 인간 HLA-A2 ECD

서열번호 41: 예시적 마우스 H2Kd ECD

서열번호 42: 예시적 래트 RT1A ECD

서열번호 43: 예시적 인간 HLA-G ß2M MHC 클래스 I 복합체

서열번호 44: 예시적 변형된 인간 HLA-G ß2M MHC 클래스 I 복합체(여기서 HLA-G 특이적 아미노산은 HLA-A 공통 아미노산에 의해 대체됨(= 이식 제거된 HLA-G), 또한 도 1 참조)

서열번호 45: 예시적 마우스 H2Kd ß2M MHC 클래스 I 복합체

서열번호 46: 예시적 인간 HLA-G/ 마우스 H2Kd ß2M MHC 클래스 I 복합체(여기서 인간 HLA-G에 대해 특이적인 위치는 마우스 H2Kd 골격에 이식됨)

서열번호 47: 예시적 래트 RT1A ß2M MHC 클래스 I 복합체

서열번호 48: 예시적 인간 HLA-G/래트 RT1A ß2M MHC 클래스 I 복합체(여기서 인간 HLA-G에 대해 특이적인 위치는 래트 RT1A 골격에 이식됨)

서열번호 49: 링커 및 his-태그

서열번호 50: 펩티드

서열번호 51: 인간 카파 경쇄 불변 영역

서열번호 52: 인간 람다 경쇄 불변 영역

서열번호 53: IgG1로부터 유래된 인간 중쇄 불변 영역

서열번호 54: 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G를 갖는, IgG1로부터 유래된 인간 중쇄 불변 영역

서열번호 55: IgG4로부터 유래된 인간 중쇄 불변 영역

항-HLAG 항체의 아미노산 서열(밑줄 친 가변 영역 및 굵은 글씨의 초가변 영역 (HVR)):

서열번호 7: 중쇄 가변 도메인 VH, HLA-G-0031:

서열번호 8: 경쇄 가변 도메인 VL, HLA-G-0031:

서열번호 33: 인간화된 변이체 중쇄 가변 도메인 VH, HLA-G-0031-0104 (HLA-G-0104):

서열번호 34: 인간화된 변이체 경쇄 가변 도메인 VL, HLA-G-0031-0104 (HLA-G-0104):

서열번호 15: 중쇄 가변 도메인 VH, HLA-G-0039:

서열번호 16: 경쇄 가변 도메인 VL, HLA-G-0039:

서열번호 23: 중쇄 가변 도메인 VH, HLA-G-0041:

서열번호 24: 경쇄 가변 도메인 VL, HLA-G-0041:

서열번호 31: 중쇄 가변 도메인 VH, HLA-G-0090:

서열번호 32: 경쇄 가변 도메인 VL, HLA-G-0090:

하기에 본 발명의 구체적 실시양태가 열거된다:

1. 인간 HLA에 특이적으로 결합하는 단리된 항체로서,

D) (a) (i) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (iii) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인

을 포함하는 항체.

2. A) i) 서열번호 7의 VH 서열 및 서열번호 8의 VL 서열, 또는

B) 서열번호 15의 VH 서열 및 서열번호 16의 VL 서열을 포함하거나;

C) 서열번호 23의 VH 서열 및 서열번호 24의 VL 서열을 포함하거나;

D) 서열번호 31의 VH 서열 및 서열번호 32의 VL 서열을 포함하는, 실시양태 1에 따른 항체.

3. 인간 HLA-G에 결합하는 단리된 항체로서,

a) 서열번호 7의 VH 서열 및 서열번호 8의 VL 서열을 포함하는 항체와 동일한 에피토프에 결합하거나;

b) 서열번호 31의 VH 서열 및 서열번호 32의 VL 서열을 포함하는 항체와 동일한 에피토프에 결합하는, 항체.

4. 항체가

l) HLA-G 특이적인 억제된 면역 반응(예를 들어 억제된 종양 괴사 인자(TNF) 알파 방출)을 JEG-3 세포(ATCC HTB36)와 공-배양된 단핵구에 의해 회복하는,

실시양태 1 내지 4 중 어느 하나에 따른 항-HLA-G 항체.

5. 항체가 IgG1 이소타입의 것인, 이전 실시양태 중 어느 하나에 따른 항체.

6. 항체가 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G(카밧의 EU 인덱스에 따른 넘버링)를 갖는 IgG1 이소타입의것인, 실시양태 5에 따른 항체.

7. 이전 실시양태 중 어느 하나에 따른 항체를 암호화하는 단리된 핵산.

8. 실시양태 7의 핵산을 포함하는 숙주 세포.

9. 실시양태 7의 숙주 세포를 배양하여 항체를 생산하는 단계를 포함하는, 항체의 생산 방법.

10. 항체를 숙주 세포로부터 회수하는 단계를 추가로 포함하는, 실시양태 9의 방법.

11. 실시양태 1 내지 6 중 어느 하나에 따른 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 제형.

12. 약제로서 사용하기 위한 실시양태 1 내지 6 중 어느 하나에 따른 항체.

13. 암의 치료에서 사용하기 위한 실시양태 1 내지 6 중 어느 하나에 따른 항체.

14. 약제의 제조에서 실시양태 1 내지 6 중 어느 하나에 따른 항체의 용도.

15. 약제가 암의 치료를 위한 것인, 실시양태 14의 용도.

16.암을 앓는 개체의 치료 방법으로서, 실시양태 1 내지 6 중 어느 하나에 따른 항체의 효과량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.

17. 항-HLAG 항체(예를 들어 실시양태 1 내지 6 중 어느 하나에 따름)를 선택하는 방법으로서,

a) 표면 플라즈몬 공명 분석에 의해 인간 서열번호 43을 포함하는 HLA-G ß2M MHC I 복합체에 대한 항-HLAG 항체의 결합을 결정하는 단계;

b) 각각의 항-HLAG 항체에 의한 단량체성 및/또는 이량체성 및/또는 삼량체성 HLA-G ß2M MHC I 복합체에 대한 ILT2 결합의 억제를 결정하는 단계;

c) 단량체성 HLA-G ß2M MHC I 복합체에 대한 ILT2 결합을 (항체의 부재 하에 결합과 비교시) 50% 초과만큼(한 실시양태에서 80% 초과만큼) 억제하는 항-HLAG 항체를 선택하는 단계, 또는 단량체성 및/또는 이량체성 및/또는 삼량체성 HLA-G ß2M MHC I 복합체에 대한 ILT2 결합을 (항체의 부재 하에 결합과 비교시) 50% 초과만큼(한 실시양태에서 70% 초과만큼) 억제하는 항-HLAG 항체를 선택하는 단계; 및

d) HLA-G 특이적인 억제된 면역 반응(예를 들어 억제된 종양 괴사 인자(TNF) 알파 방출)을 JEG-3 세포(ATCC HTB36)와 공-배양된 단핵구에 의해 회복하는 단계

를 포함하는, 방법.

18. 항-HLAG 항체(예를 들어 실시양태 6에 따름)를 선택하는 방법으로서,

a) JEG3 세포(ATCC 번호 HTB36)에 대한 항-HLAG 항체의 결합을 유세포 분석법(형광-활성화된 세포 분류(FACS 분석)를 사용함)에서 결정하는 단계;

b) 각각의 항-HLAG 항체 의한 JEG3 세포(ATCC 번호 HTB36)에 대한 ILT2 결합의 억제를 유세포 분석법(형광-활성화된 세포 분류(FACS 분석)를 사용함)에서 결정하는 단계; 및

c) JEG3 세포(ATCC 번호 HTB36)에 결합하고, JEG3 세포(ATCC 번호 HTB36)에 대한 ILT2 결합을 항체의 부재 하에 결합과 비교히 50% 초과만큼(한 실시양태에서 80% 초과만큼) 억제하는 항-HLAG 항체를 선택하는 단계

를 포함하는, 방법.

실시예

재조합 DNA 기술

표준 방법을 사용하여 문헌[Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989]에 기재된 바와 같이 DNA를 처리하였다. 분자 생물학 시약을 제조사의 지시에 따라 사용하였다.

유전자 및 올리고뉴클레오티드 합성

목적하는 유전자 분절을 진아트 게엠베하(Geneart GmbH, 독일 레겐스부르크 소재)에서 화학적 합성에 의해 생산하였다. 합성된 유전자 단편을 증식/증폭을 위해 에스케리키아 콜라이 플라스미드 내로 클로닝하였다. 서브클로닝된 유전자 단편의 DNA 서열을 DNA 서열 분석에 의해 확인하였다. 대안적으로, 짧은 합성 DNA 단편을 합성된 올리고뉴클레오티드를 화학적으로 어닐링함으로써 또는 PCR을 통해 조립하였다. 각각의 각각의 올리고뉴클레오티드를 메타비온 게엠베하(metabion GmbH, 독일 플라네크-마르틴스리드 소재)에서 생산하였다.

기초/표준 포유동물 발현 플라스미드의 설명

목적하는 유전자/단백질(예를 들어 전장 항체 중쇄, 전장 항체 경쇄, 또는 MHC 클래스 I 분자, 예를 들어 HLA-G, 또는 펩티드 및 베타-2 마이크로 글로불린에 융합된 MHC 클래스 I 분자, 예를 들어 HLA-G 결합 펩티드 및/또는 베타-2 마이크로 글로불린에 융합된 HLA-G)의 발현을 위해, 하기 기능 요소를 포함하는 전사 단위를 사용한다:

- 인트론 A를 포함하는 인간 시토메갈로 바이러스(P-CMV)의 전초기 인핸서 및 프로모터,

- 인간 중쇄 면역 글로불린 5'-비해독 영역(5'UTR),

- 뮤린 면역 글로불린 중쇄 신호 서열,

- 발현할 유전자/단백질(예를 들어 전장 항체 중쇄 또는 MHC 클래스 I 분자), 및

- 소 성장 호르몬 아데닐 중합 서열(BGH pA).

발현할 목적하는 유전자를 포함하는 발현 단위/카세트 외에, 기초/표준 포유동물 발현 플라스미드는 하기를 함유한다:

- 에스케리키아 콜라이에서 상기 플라스미드의 복제를 가능하게 하는 벡터 pUC18의 복제 기점, 및

- 에스케리키아 콜라이에서 암피실린 내성을 부여하는 베타-락타마제 유전자.

단백질 결정

정제된 폴리펩티드의 단백질 농도를, 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기반으로 계산된 몰 흡광 계수를 사용하여 280 nm에서 광학 밀도(OD)를 결정함으로써 결정하였다.

실시예 1: 스크리닝 및 카운터 스크리닝을 위한 HLA-G 키메라 분자의 생산

다른 MHC I 분자와의 높은 동종성(>98%)으로 인해, HLA-G 분자에 의한 면역화는 MHC-I 교차반응성 항체 및 엄밀한 HLA-G 특이적 항체의 혼합물로 구성된 다클론 혈청의 생산을 야기한다.

지금까지는 다른 인간 MHC-I(예를 들어 HLA-A)에 대해 교차반응성을 갖지 않는 엄밀한 HLA-G 특이적 항체를 선별하고 수용체 차단 기능을 갖는 것을 추가로 선별하는 도구가 제공되지 않았다.

구조적 적합성 및 수용체 상호작용(ILT2/4 및 KIR2DL4)에 필요한 위치와 조합된 고유한 HLA-G 위치를 확인하였다.

이어서, 인간 HLA-G의 고유하고 근접한 위치를 상이한 설치류 종의 MHC 클래스 I 복합체 분자(예컨대 래트 RT1A 및 마우스 H2kd) 상에 "이식"하여 "키메라" 면역원/스크리닝 항원을 생산하였다.

생산한 항체를 결합/특이성(및 각각 대응 항원에 대한 결합/특이성 없음)에 대해 스트린젠트 스크리닝하였다.

스크리닝 항원:

- 서열번호 43을 포함하는 인간 HLA-G ß2M MHC 복합체로서 발현되는 rec. HLA-G,

- 래트 RT-1 및 마우스 H2kd에 이식된 HLA-G 특이적 서열(서열번호 46: 인간 HLA-G에 대해 특이적인 위치가 마우스 H2Kd 골격에 이식된 인간 HLA-G/마우스 H2Kd ß2M MHC 클래스 I 복합체; 및 서열번호 48: 인간 HLA-G에 대해 특이적인 위치가 래트 RT1A 골격에 이식된 인간 HLA-G/래트 RT1A ß2M MHC 클래스 I 복합체),

- 천연 HLA-G MHC 클래스 I 복합체 발현 세포(예를 들어 Jeg3 세포), 또는 인간 HLA-G 형질감염된 세포주 SKOV3 HLA-G+ 및 PA-TU-8902 HLA-G+.

스크리닝 대응 항원:

- 상이한 펩티드와 조합된 다른 HLA-A 서열(HLA-A2, 및 HlA-A 공통 서열에 의해 이식 제거된 HLA-G)을 갖는 대응 항원(MHC 클래스 I 복합체)(예를 들어 서열번호 40(HLA-A2) 및 서열번호 44(HLA-G 골격 상의 HLA-A 공통 서열) 참조),

- 다른 종, 예컨대 래트 RT-1 및 마우스 H2kd로부터의 대응 항원(MHC 클래스 I 복합체)(서열번호 45 및 서열번호 47),

- HLA-G 발현의 부재를 특징으로 하는, 변형되지 않은 종양 세포주 SKOV3 및 PA-TU-8902.

HLA 특이적 항체의 생산을 위한 면역화 및 스크리닝에서 사용하기 위한 키메라 HLA-G 항원의 설계(도 1 참조)

야생형(wt) 및 형질전환 래트, 토끼 및 마우스 등의 면역화에서 사용하기 위한 및/또는 스크리닝 분석에서 사용하기 위한 HLA-G 고유한 위치를 갖는 키메라 래트 MHC I 분자(RT1-A)(서열번호 48)의 설계:

HLA-G 고유한 위치를 IMGT(2014년 2월 6일에 입수가능)의 2579 HLA-A, 3283 HLA-B, 2133 HLA-C, 15 HLA-E, 22 HLA-F 및 50 HLA-G 서열의 정렬에 의해 확인하였다. 3개의 서열 세트 HLA-A, HLA-B, 및 HLA-C + HLA-E + HLA-F의 조합된 세트 중 임의의 것의 서열의 1% 미만(대부분 약 0%)에서 존재하는 HLA-G의 이들 잔기를 HLA-G 고유 위치로 지칭한다.

4개의 핵심적 HLA-G 고유한 위치(알파-1에서 2개 및 알파-3에서 2개)는 HLA-G 서열의 세트에서 다형성을 나타내지 않고, 다른 HLA 유전자는 이들 위치에서 HLA-G 특이적 잔기를 함유하지 않는다(M100에 대해 1x HLA-A, Q103에 대해 1x HLA-B 및 Q103에 대해 1x HLA-C 제외).

래트 RT1-A의 결정 구조(문헌[Rudolph, M.G. et al. J.Mol.Biol. 324: 975-990 (2002)]; PDB 코드: 1KJM)는 인간 HLA-G의 결정 구조(문헌[Clements, C.S. et al. PROC.NATL.ACAD.SCI.USA 102: 3360-3365 (2005)]; PDB 코드: 1YDP) 상에 겹쳐졌다. 알파-쇄 및 회합된 베타-2-마이크로 글로불린의 전체 구조는 보존된다.

HLA-G 고유 위치를 서열의 비교 및 구조적 정렬에 의해 RT1-A 구조에서 확인하였다. 제1 단계에서, HLA-G 및 RT1-A의 분자 표면 상에 노출되어 항체에 접근가능한 고유한 HLA-G 위치를 확인하였다. 단백질 폴드 내에 매립된 고유 위치를 조작에 대해 배제하였다. 제2 단계에서, 상응하는 영역 "HLA-G-유사부"를 생산하기 위해, 즉 인공물일 수 있는 HLA-G/래트 RT1-A 키메라 에피토프를 생산하기보다는 고유 위치를 함유하는 실제 HLA-G 에피토프를 생산하기 위해 교환이 필요한 구조적으로 근접한 잔기를 확인하였다. 따라서, 돌연변이에 대해 선별된 모든 위치를 돌연변이시 분자 구조의 가능한 국부적 방해를 피하기 위해 HLA-G의 각각의 잔기의 구조적 적합성에 대해 분석하였다.

면역화 및/또는 스크리닝 분석에서 사용하기 위한 HLA-G 고유 위치를 갖는 키메라 마우스 MHC I 분자(H2Kd)(서열번호 46)를 유사하게 생산하였다.

HLA-A 공통 서열로의 HLA-G 고유 위치의 "이식 제거"에 의한, 스크리닝에서 대응 항원으로서 사용하기 위한 HLA-A 기반 대응 항원의 설계(서열번호 44)

다중 서열 정렬로부터 유도한 고유 위치를 인간 HLA-G의 결정 구조(PDB 코드: 1YDP)에서 분석하였다. 먼저, HLA-G 표면에 노출되지 않아 항체에 접근가능하지 않은 위치를 조작에서 배제하였다. 두번째로, 표면 노출된 잔기를 아미노산 교환의 가능성(즉 관련된 위치의 돌연변이시 분자 구조의 가능한 국부적 방해의 배제)에 대해 분석하였다. 전체적으로, 14개의 위치가 교환에 대해 확인되었다. 확인된 위치의 아미노산은, IMGT(2014년 2월 6일에 입수가능)로부터 다운로드된 2579 HLA-A 서열의 다중 서열 정렬로부터 유도된 HLA-A 공통 서열로 돌연변이되었다.

가용성의 전형적 및 비전형적 MHC 클래스 I 분자를 위한 발현 플라스미드의 생산

재조합 MHC 클래스 I 유전자는 각각의 MHC 클래스 I 분자에 의해 결합되는 것으로 공지된 펩티드, 베타-2 마이크로 글로불린, 및 각각의 MHC 클래스 I 분자로 이루어진 N-말단이 확장된 융합 분자를 암호화한다.

가용성 MHC 클래스 I 분자의 일시적 발현을 위한 발현 플라스미드는 가용성 MHC 클래스 I 분자 발현 카세트 외에 벡터 pUC18의 복제 기점(이는 에스케리키아 콜라이에서 이러한 플라스미드의 복제를 가능하게 함), 및 에스케리키아 콜라이에서 암피실린 내성을 부여하는 베타-락타마제 유전자를 포함하였다.

가용성 MHC 클래스 I 분자의 전사 단위는 하기 기능 요소를 포함하였다:

- 인간 중쇄 면역 글로불린 5'-비해독 영역(5'UTR),

- 뮤린 면역 글로불린 중쇄 신호 서열,

- N-말단 절단된 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 소르타제 A 암호화 핵산, 및

- 소 성장 호르몬 아데닐 중합 서열(BGH pA).

다양한 종으로부터 유래된 성숙 가용성 MHC 클래스 I 분자의 아미노산 서열은 하기와 같다:

서열번호 43: 예시적 인간 HLA-G ß2M MHC 클래스 I 복합체

서열번호 44: 예시적 변형된 인간 HLA-G ß2M MHC 클래스 I 복합체(여기서, HLA-G 특이적 아미노산은 HLA 공통 아미노산에 의해 대체됨(= 이식 제거된 HLA-G, 또한 도 1 참조))

서열번호 45: 예시적 마우스 H2Kd ß2M MHC 클래스 I 복합체

서열번호 46: 예시적 인간 HLA-G/ 마우스 H2Kd ß2M MHC 복합체(여기서, 인간 HLA-G에 특이적인 위치는 마우스 H2Kd 골격에 이식됨)

서열번호 47: 예시적 래트 RT1A ß2M MHC 클래스 I 복합체

서열번호 48: 예시적 인간 HLA-G/래트 RT1A ß2M MHC 복합체(여기서, 인간 HLA-G에 특이적인 위치는 래트 RT1A 골격에 이식됨)

스크리닝에 사용된 예시적 HLA-A2 ß2M MHC 클래스 I 복합체에 대하여, 하기 성분이 사용되었고, 복합체는 에스케리키아 콜라이에서 발현되고 정제되었다:

MHCI 복합체 HLA-A2 /b2M(서열번호 40 및 37)(둘 모두 추가적 N-말단 메티오닌을 가짐) + VLDFAPPGA 펩티드(서열번호 50) + 링커 및 his-태그(서열번호 49).

실시예 2: 면역화 캠페인

A) 마우스 및 래트의 면역화

a. 키메라 단백질(비특이적 MHC-I/HLA에 대한 관용 및 고유한 HLA-G 위치로의 유도)

찰스 리버 래보래토리즈 인터네셔널 인코포레이티드(Charles River Laboratories International, Inc.)로부터 입수한 Balb/C 마우스를 면역화를 위해 사용하였다. 동물을 문헌[The Appendix A "Guidelines for accommodation and care of animals"]에 따라 AAALACi 공인된 동물 시설에서 수용하였다. 모든 동물 면역화 프로토콜 및 실험을 북부 바이에른 정부에 의해 승인받았고(허가번호 55.2-1-54-2531-19-10 및 55.2-1-54-2532-51-11), 독일 동물 복지법 및 유럽 의회의 지령 2010/63에 따라 수행하였다.

6 내지 8주령의 Balb/C 마우스(n=5)에게 키메라 H2Kd/HLA-G 분자(서열번호 46("HLA-G-0006"))에 의한 5회의 면역화를 4주 동안 제공하였다. 각각의 면역화 전에, 마우스를 산소 및 이소플루란의 기체 혼합물로 마취시켰다. 제1 면역화를 위해, 20 mM His/HisCl, 140 mM NaCl(pH 6.0)에 용해된 15 μg의 단백질을 동부피의 CFA(BD Difco, #263810)와 혼합하고 마우스의 등을 따라 배출 림프절에 근접한 6개의 부위(목덜미의 2개의 부위 및 사타구니 및 종아리 양쪽에 2개의 부위)에 피하로(s.c.) 투여하였다. RIBI 보조제(Sigma-Aldrich, #S6322)에 용해된 추가적 15 μg의 단백질을 복부를 따라 나란한 6개의 부위(겨드랑이, 사타구니 및 넓적다리 양쪽에 각각 2개의 부위)에 투여하였다. 부스터 면역화의 감소하는 항원 투여량을 RIBI 보조제를 내내 단지 복부를 따라 사용한 것을 제외하고 유사한 방법으로 제7일(10 μg), 제14일(5 μg), 제21일(5 μg) 및 제28일(5 μg)에 제공하였다. 최종 면역화 3일 후에, 마우스를 안락사시키고, 양쪽 슬와, 얕은 사타구니, 겨드랑이 및 아가미 림프절을 무균 단리시키고 하이브리도마 생산을 위해 준비시켰다. 혈청을 제3 및 제5 면역화 후에 ELISA에 의해 재조합 인간 HLA-G 및 면역원 특이적 전체 IgG 항체 생산에 대해 시험하였다.

또 다른 세트의 6 내지 8주령의 Balb/C 마우스(n=5)에게 3개월 동안 키메라 H2Kd/HLA-G 분자(HLA-G-0006)에 의한 3회의 면역화를 제공하였다. 제1 면역화를 위해, 20 mM His/HisCl, 140 mM NaCl(pH 6.0)에 용해된 100 μg 단백질을 동부피의 CFA(BD Difco, #263810)와 혼합하고 복강내로(i.p.) 투여하였다. 부스터 면역화를, 불완전 프로이드 보조제(BD Difco의 IFA, #DIFC263910)를 사용한 것을 제외하고 유사한 방식으로 제28일 및 제56일에 제공하였다. 최종 면역화 4 내지 5주 후에, 마우스에게 멸균 PBS 중의 약 25 μg의 면역원을 정맥내로(i.v.) 제공하고, 72시간 후에, 비장을 무균 채취하고 하이브리도마 생산을 위해 준비시켰다. 혈청을, 제3 면역화 후에 ELISA에 의해, 재조합 인간 HLA-G(서열번호 43("HLA-G-0003")) 및 면역원 특이적 키메라 H2Kd/HLA-G 분자(서열번호 46("HLA-G-0006")) 전체 IgG 항체 생산에 대해 시험하고, 공통 HLA-A 특이적 위치(서열번호 44("HLA-G-0007")) 및 뮤린 H2kd 단백질(서열번호 45 "HLA-G-0009")을 갖는 "이식 제거된" 인간 HLA-G를 사용하여 카운터 스크리닝하였다.

b. wt HLA-G 단백질

찰스 리버 래보래토리즈 인터네셔널 인코포레이티드로부터 입수한 CD 래트를 면역화를 위해 사용하였다. 동물을 문헌[The Appendix A "Guidelines for accommodation and care of animals"]에 따라 AAALACi 공인된 동물 시설에서 수용하였다. 모든 동물 면역화 프로토콜 및 실험을 북부 바이에른 정부에 의해 승인받았고(허가번호 55.2-1-54-2532-51-11), 독일 동물 복지법 및 유럽 의회의 지령 2010/63에 따라 수행하였다.

6 내지 8주령의 CD 래트(n=4)에게 4개월 동안 재조합 인간 HLA-G 단백질(서열번호 43("HLA-G-0003"))에 의한 4회의 면역화를 제공하였다. 제1 면역화를 위해, 20 mM His/HisCl, 140 mM NaCl(pH 6.0)에 용해된 100 μg의 단백질을 동부피의 CFA(BD Difco, #263810)와 혼합하고 복강내로 투여하였다. 부스터 면역화를, 불완전 프로이드 보조제(BD Difco의 IFA, #DIFC263910)를 내내 사용한 것을 제외하고 유사한 방식으로 제28일, 제56일 및 제84일에 제공하였다. 최종 면역화 3 내지 4주 후에, 래트에게 멸균 PBS중의 약 75 μg의 면역원을 i.v. 제공하고; 72시간 후에, 비장을 무균 채취하고 하이브리도마 생산을 위해 준비시켰다. 혈청을 제3 및 제4 면역화 후에 ELISA에 의해 재조합 HLA-G(서열번호 43 ("HLA-G-0003")) 특이적 IgG1, IgG1a, IgG2b 및 IgG2c 항체 생산에 대해 시험하고, 공통 HLA-A 특이적 위치를 갖는 "이식 제거된" 인간 HLA-G(서열번호 44("HLA-G-0007"))를 사용하여 카운터 스크리닝하였다.

c. JEG3 세포(ATCC 번호 HTB36)(HLA-G 자연 발현)

찰스 리버 래보래토리즈 인터네셔널 인코포레이티드로부터 입수한 CD 래트를 면역화를 위해 사용하였다. 동물을 문헌[The Appendix A "Guidelines for accommodation and care of animals"]에 따라 AAALACi 공인된 동물 시설에서 수용하였다. 모든 동물 면역화 프로토콜 및 실험을 북부 바이에른 정부에 의해 승인받았고(허가번호 AZ. 55.2-1-54- 2531-83-13), 독일 동물 복지법 및 유럽 의회의 지령 2010/63에 따라 수행하였다.

6 내지 8주령의 2개의 군의 CD 래트(n=2)에게 각각 5개월(A) 내지 7개월(B) 동안 JEG-3 세포(ATCC HTB36)를 사용하여 5회(군 A) 또는 7회(군 B)의 면역화를 제공하였다. 제1 면역화를 위해, 멸균 PBS에 용해된 1x10^7 세포를 동부피의 CFA(BD Difco, #263810)와 혼합하고 복강내로 투여하였다. 부스터 면역화를, 불완전 프로이드 보조제(BD Difco의 IFA, #DIFC263910)를 내내 사용한 것을 제외하고 유사한 방식으로, A 및 B에게 제28일, 제56일, 제84일, 제112일, 제140일(B 단독) 및 제168일(B 단독)에 제공하였다. 최종 면역화 3주 후에, 래트에게 멸균 PBS 중의 100 μg의 재조합 인간 HLA-G 단백질(서열번호 43("HLA-G-0003"))을 i.v. 제공하고; 72시간 후에, 비장을 무균 채취하고 하이브리도마 생산을 위해 준비시켰다. 혈청을 각각 제3, 제5 및 제7 면역화 후에 ELISA에 의해 재조합 HLA-G(서열번호 43("HLA-G-0003")) 특이적 IgG1, IgG1a, IgG2b 및 IgG2c 항체 생산에 대해 시험하고, 공통 HLA-A 특이적 위치를 갖는 "이식 제거된" 인간 HLA-G(서열번호 44("HLA-G-0007"))를 사용하여 카운터 스크리닝하였다.

d. JEG3/DNA IMS(부스팅 효과)

6 내지 8주령의 CD 래트(n=5)에게 플라스미드 DNA 및 세포-기반 면역화를 교호하는 양생법으로 3개월 동안 제공하였다. 단일 쇄 분자로서 인간 HLA-G를 암호화하는 플라스미드 DNA HLA-G-0030(p17747), 및 자연 HLA-G 발현 JEG-3 세포(ATCC HTB36)를 각각 이러한 목적을 위해 사용하였다.

제1 면역화를 위해, 동물을 이소플루란으로 마취하고 동물의 꼬리에 근접한 털을 깎은 등의 한 스팟에 적용한 멸균 H₂O 중의 100 μg 플라스미드 DNA에 의해 피내로(i.d.) 면역화하였다. i.d. 적용 후에, 스팟을 ECM 830 전기천공 시스템(BTX 하버드 애퍼래터스(BTX Harvard Apparatus)) 상에 하기 파라미터를 사용하여 전기천공시켰다: 125 ms의 간격에 의해 분리된, 각각 0.1 ms의 2회의 1000 V/cm, 이어서 또한 125 ms의 간격에 의해 분리된, 10 ms의 4회의 287.5 V/cm. 제14일에 제2 면역화를 위해, 멸균 PBS에 용해된 1x10^7 세포를 동부피의 CFA(BD Difco, #263810)와 혼합하고, 안정한 유화액의 생산 후에 복강내로 투여하여 동물에게 제공하였다. 부스터 면역화를, 불완전 프로이드 보조제(BD Difco의 IFA, #DIFC263910)를 세포 면역화 내내 사용한 것을 제외하고 유사한 방식으로, 제28일(DNA), 제42일(세포), 제56일(DNA), 제70일(세포)에 제공하였다. 최종 면역화 4주 후에, 래트에게 멸균 PBS 중의 100 μg의 가용성 재조합 인간 HLA-G MHC 클래스 I 단백질(서열번호 43("HLA-G-0003"))을 i.v. 제공하고; 72시간 후에, 비장을 무균 채취하고 하이브리도마 생산을 위해 준비시켰다. 혈청을 제3, 제5 및 제6 면역화 후에 각각 ELISA에 의해 가용성 재조합 인간 HLA-G MHC 클래스 I 단백질(서열번호 43("HLA-G-0003")) 특이적 IgG1, IgG2a, IgG2b 및 IgG2c 항체 생산에 대해 시험하고, 공통 HLA-A 특이적 위치를 갖는 "이식 제거된" 인간 HLA-G(서열번호 44 ("HLA-G-0007"))를 사용하여 카운터 스크리닝하였다.

모든 면역화 전략에서, 면역화된 동물의 다클론 혈청을 사용하여 ELISA 포맷으로 분석된 바와 같이, HLA-G 및 카운터 스크리닝에서 사용되는 단백질(예를 들어 재조합 "이식 제거된" 인간 HLA-G, 키메라 H2Kd/HLA-G 분자 또는 관련된 인간 HLA-A2 분자)을 인식하는, 매우 다반응성인 체액 면역 반응을 유도하였다(데이터는 나타내지 않음).

B) 인간화된 옴니래트 라인(OMNIRAT line) 7 래트의 면역화

오픈 모노클로널 테크놀로지 인코포레이티드(Open Monoclonal Technology, Inc., 미국 캘리포니아주 94303 팔로 알토 로스 로드 2747 소재) 옴니래트 라인 7 래트를 짝을 짓고 사육시키고 찰스 리버 래보래토리즈 인터네셔널 인코포레이티드로부터 입수하였다. 동물을 문헌[The Appendix A "Guidelines for accommodation and care of animals"]에 따라 AAALACi 공인된 동물 시설에서 수용하였다. 모든 동물 면역화 프로토콜 및 실험을 북부 바이에른 정부에 의해 승인받았고(허가번호 55.2-1-54-2532-51-11 및 55.2-1-54- 2531-83-13), 독일 동물 복지법 및 유럽 의회의 지령 2010/63에 따라 수행하였다.

6 내지 8주령의 옴니래트 라인 7 래트(n=4)에게 재조합 키메라 HLA-G 단백질(서열번호 48("HLA-G-0011"))에 의한 4회의 면역화를 4개월 동안 제공하였다. 제1 면역화를 위해, 20 mM His/HisCl, 140 mM NaCl(pH 6.0)에 용해된 100 μg 단백질을 동부피의 CFA(BD Difco, #263810)와 혼합하고 복강내로 투여하였다. 부스터 면역화를, 불완전 프로이드 보조제(BD Difco의 IFA, #DIFC263910)를 내내 사용한 것을 제외하고 유사한 방식으로, 제28일, 제56일 및 제84일에 제공하였다. 최종 면역화 3 내지 4주 후에, 멸균 PBS 중의 약 50 μg의 면역원(i.v.) 및 25 μg의 면역원(i.p.)을 제공하고, 72시간 후에, 비장을 무균 채취하고 하이브리도마 생산을 위해 준비시켰다. 혈청을 제3 및 제4 면역화 후에 ELISA에 의해 재조합 HLA-G(서열번호 48("HLA-G-0011")) 특이적 IgG1, IgG2a, IgG2b 및 IgG2c 항체 생산에 대해 시험하고, 공통 HLA-A 특이적 위치를 갖는 "이식 제거된" 인간 HLA-G(서열번호 44("HLA-G-0007"))를 사용하여 카운터 스크리닝하였다.

대안적으로, 6 내지 8주령의 옴니래트 라인 7 래트(n=5)에게 플라스미드 DNA 및 세포-기반 면역화를 교호하는 양생법으로 3개월 동안 제공하였다. 단일 쇄 분자로서 인간 HLA-G를 암호화하는 플라스미드 DNA(인간 HLA-G MHC 클래스 I 단백질(서열번호 43("HLA-G-0003")) 및 자연 HLA-G 발현 JEG-3 세포(ATCC HTB36)를 각각 이러한 목적을 위해 사용하였다.

제1 면역화를 위해, 동물을 이소플루란으로 마취하고, 동물의 꼬리에 근접한, 털을 깎은 등의 한 스팟에 적용하여 멸균 H₂O 중의 100 μg 플라스미드 DNA에 의해 피내로(i.d.) 면역화하였다. i.d. 적용 후에, 스팟을 ECM 830 전기천공 시스템(BTX 하버드 애퍼래터스) 상에서 하기 파라미터를 사용하여 전기천공시켰다: 125 ms의 간격에 의해 분리된, 각각 0.1 ms의 2회의 1000 V/cm, 이어서 또한 125 ms의 간격에 의해 분리된, 10 ms의 4회의 287.5 V/cm. 제14일에 제2 면역화를 위해, 멸균 PBS에 용해된 1x10^7 세포를 동부피의 CFA(BD Difco, #263810)와 혼합하고, 안정한 유화액의 생산 후에, 복강내로 투여하여 동물에게 제공하였다. 부스터 면역화를, 불완전 프로이드 보조제(BD Difco의 IFA, #DIFC263910)를 세포 면역화 내내 사용한 것을 제외하고 유사한 방식으로, 제28일(DNA), 제42일(세포), 제56일(DNA), 제70일(세포)에 제공하였다. 최종 면역화 4주 후에, 래트에게 멸균 PBS 중의 100 μg의 가용성 재조합 인간 HLA-G MHC 클래스 I 단백질(서열번호 43("HLA-G-0003"))을 i.v. 제공하고; 72시간 후에, 비장을 무균 채취하고 하이브리도마 생산을 위해 준비시켰다. 혈청을, 제3, 제5 및 제6 면역화 후에 각각 ELISA에 의해 가용성 재조합 인간 HLA-G MHC 클래스 I 단백질(서열번호 43("HLA-G-0003")) 특이적 IgG1, IgG2a, IgG2b 및 IgG2c 항체 생산에 대해 시험하고, 공통 HLA-A 특이적 위치를 갖는 "이식 제거된" 인간 HLA-G(서열번호 44("HLA-G-0007"))를 사용하여 카운터 스크리닝하였다.

모든 면역화 전략에서, 면역화된 동물의 다클론 혈청을 사용하여 ELISA 포맷으로 분석된 바와 같이, HLA-G, 및 카운터 스크리닝에 사용한 단백질(예를 들어 재조합 "이식 제거된" 인간 HLA-G, 키메라 H2Kd/HLA-G 분자 또는 관련된 인간 HLA-A2 분자)를 인식하는, 매우 다반응성인 체액 면역 반응을 유도하였다(데이터는 나타내지 않음).

수득한 항체

상기 방법을 사용하여 인간 항-HLA-G에 특이적으로 결합하는 하기 항체를 수득하였다: CD 래트로부터 래트 HLA-G 0031, 인간화된 래트로부터 인간 HLAG 0039, HLA-G 0041 및 HLA-G 0090.

수득한 항-HLA-G 특이적 항체의 결합 특성 및 생물 활성을 하기 실시예에 기재된 바와 같이 결정하고 공지된 기준 항체와 비교하였다. 항체 HLA-G-0031을 이의 HVR 및 VH 수용자 인간 골격 HUMAN_IGHV1-3 및 VL 수용자 인간 골격 HUMAN_IGKV1-17(V-도메인, 위치 R46F에서 하나의 추가적 복귀 돌연변이를 가짐, 카밧 넘버링)을 사용하여 인간화시켰다.

HLAG 바인더 HLAG-0031의 인간화 동안 적합한 인간 수용자 골격의 확인을 위해, 2개의 방법론의 조합을 사용하였다. 한편으로는, 모 항체에 대해 높은 서열 동종성을 갖는 수용자 골격을 탐색한 후에, 상기 수용자 골격에 CDR 영역을 인실리코(in silico) 이식하는 전형적인 접근법을 취하였다. 모 항체에 대한 확인된 골격의 각각의 아미노산 차이를 바인더의 구조적 온전성에 대한 영향에 대해 평가하고, 모 서열로의 복귀 돌연변이를 적절할 때마다 고려하였다.

다른 한편으로는, WO 2016/062734에 기재된 인실리코 도구를 사용하여 서로에 대한 인간화된 버전의 VH 및 VL 도메인의 배향을 예측하였다. 이를 모든 가능한 인간 생식계열 조합에 대한 CDR의 가상 그래프트를 위해 수행하였다. 결과를 출발 항체의 기하구조와 밀접한 골격 조합을 대해 선택하기 위해 모 바인더의 VH VL 도메인 배향에 대해 비교하였다.

실시예 3

A) 가용성 인간 HLA-G, HLA-A 특이적 서열을 갖는 가용성의 이식 제거된 인간 HLA-G, 인간 HLA-A2 및 래트/마우스 H2-Kd에 대한 항-HLA-G 항체의 결합

면역화로부터 수득한 항체를 인간, HLA-G, 키메라, 이식 제거된 HLA-G, HLA-A2 및 래트/마우스 H2-Kd에 대한 결합 특성에 대해 스크리닝하였다. 각각의 분석을 하기에 기재한다. 인간 HLA-G의 시험을 위해, 단량체성, 이량체성 및 삼량체성 형태를 사용하였다(하기 생산 참조).

인간 HLA-G MHC 클래스 I 단백질의 이량체화/삼량체화

단량체성 His 태그된 가용성 인간 HLA-G MHC 클래스 I 단백질(서열번호 23)을 함유하는 상청액을 AKTA-FPLC를 사용하여 0.2 ml/분의 유속으로 밤새 실온에서 5 ml의 Ni-세파로스(Sepharose)를 갖는 HisTrap HP 컬럼(지이 헬스케어 #17-5248-02) 상에 적재하였다. 이어서, 기선에 도달할 때까지, 컬럼을 0.5 M 이미다졸을 함유하는 2% DPBS(메르크(Merck) #8.14223.025)로 세척하였다. 이어서, 컬럼을 0.5 M 이미다졸을 함유하는 2% DPBS에서 10 mM DTT로 평형시키고 30분 동안 실온에서 배양하였다. DTT를 PBS/10 mM 이미다졸에 의해 컬럼으로부터 세척 제거하고, 단백질을 0.5 mM 이미다졸을 갖는 2 내지 100% DPBS의 구배에서 용리하였다. 아미콘-울트라(Amicon-Ultra) 15 M/울트라셀(Ultracel) 10K를 사용하여 용리액을 농축한 후에, 단백질을 24시간 동안 실온에서 배양한 후에, 48시간시간 동안 4℃에서 배양하여 이량체화/다량체화를 가능하게 하였다. 이어서, 이량체 및 삼량체의 분리를 Superdex 200 HiLoad 16/60(지이 헬스케어 #17-5175-01)에서 SEC를 사용하여 수행하고 0.5 M NaOH로 밤새 세척하였다. 컬럼을 PBS로 평형시킨 후에, 10 mg/ml BSA로 포화시켰다. 이어서, 이량체(분획 A9) 및 삼량체(분획 A8)를 수집하고 부분화하고 추가로 사용하기 전에 -80℃에서 저장하였다.

인간 wt HLA-G 결합 ELISA

스트렙타비딘(Streptavidin) 코팅된 플레이트(눈크(Nunc), 마이크로코트(MicroCoat) #11974998001)를 25 μl/웰의 비오티닐화된 인간 wt HLA-G로 250 ng/ml의 농도에서 코팅하고 4℃에서 밤새 배양하였다. 세척한 후에(3x90 μl/웰, PBST-완충제 사용), 25 μl의 항-HLA-G 샘플(OSEP 완충제에 1:3 희석) 또는 기준 항체(G233, Thermo/Pierce #MA1-19449, 500 ng/ml)를 첨가하고, 1시간 동안 RT에서 배양하였다. 세척한 후에(3x90 μl/웰, PBST-완충제 사용), 25 μl/웰의 염소-항-마우스 H+L-POD(Biorad #170-6561, OSEP에서 1:2000) 또는 당나귀-항-토끼 IgG POD(GE #NA9340V, OSE에서 1:5000)를 첨가하고 RT에서 1시간 동안 진탕기 상에서 배양하였다. 래트 IgG의 검출을 위해, 염소-항-래트 IgG1-POD(Bethyl #A110-106P), 염소-항-래트 IgG2a-POD(Bethyl #A110-109P) 및 염소-항-래트 IgG2b-POD(Bethyl #A110-111P)의 혼합물(OSEP에서 1:10000)을 첨가하고 RT에서 1시간 동안 진탕기 상에서 배양하였다. 세척한 후에(6x90 μl/웰, PBST-완충제 사용), 25 μl/웰의 TMB 기질(Roche, 11835033001)을 첨가하고, OD 2 내지 3까지 배양하였다. 측정을 370/492 nm에서 테칸 사파이어 2 기기 상에서 수행하였다.

HLA-A 특이적 서열을 갖는 인간 이식 제거된 HLA-G 결합 ELISA

스트렙타비딘 코팅된 플레이트(눈크, 마이크로코트 #11974998001)를 25 μl/웰의 비오티닐화된 인간 이식 제거된 HLA-G로 250 ng/ml의 농도에서 코팅하고 4℃에서 밤새 배양하였다. 세척한 후에(3x90 μl/웰, PBST-완충제 사용), 25 μl의 항-HLA-G 샘플(OSEP 완충제에서 1:3 희석) 또는 래트 혈청(OSEP에서 1:600 희석)을 첨가하고 1시간 동안 RT에서 배양하였다. 세척한 후에(3x90 μl/웰, PBST-완충제 사용), 25 μl/웰의 염소-항-래트 IgG1-POD(Bethyl #A110-106P), 염소-항-래트 IgG2a-POD(Bethyl #A110-109P) 및 염소-항-래트 IgG2b-POD(Bethyl #A110-111P)의 혼합물(OSEP에서 1:10000)을 첨가하고 RT에서 1시간 동안 진탕기 상에서 배양하였다. 세척한 후에(6x90 μl/웰, PBST-완충제 사용), 25 μl/웰의 TMB 기질(Roche, 11835033001)을 첨가하고, 2 내지 3의 OD까지 배양하였다. 측정을 370/492 nm에서 테칸 사파이어 2 기기 상에서 수행하였다.

래트 MHC I(RT1-A) 결합 ELISA

스트렙타비딘 코팅된 플레이트(눈크, 마이크로코트 #11974998001)를 25 μl/웰의 비오티닐화된 래트 MHC I(RT1-A)로 250 ng/ml의 농도에서 코팅하고 4℃에서 밤새 배양하였다. 세척한 후에(3x90 μl/웰, PBST-완충제 사용), 25 μl의 항-HLA-G 샘플(OSEP 완충제에서 1:3 희석) 또는 래트 혈청(OSEP에서 1:600 희석)을 첨가하고, 1시간 동안 RT에서 배양하였다. 세척한 후에(3x90 μl/웰, PBST-완충제 사용), 25 μl/웰의 염소-항-래트 IgG1-POD(Bethyl #A110-106P), 염소-항-래트 IgG2a-POD(Bethyl #A110-109P) 및 염소-항-래트 IgG2b-POD(Bethyl #A110-111P)의 혼합물(OSEP에서 1:10000)을 첨가하고 RT에서 1시간 동안 진탕기 상에서 배양하였다. 세척한 후에(6x90 μl/웰, PBST-완충제 사용), 25 μl/웰의 TMB 기질(Roche, 11835033001)을 첨가하고, 2 내지 3의 OD까지 배양하였다. 측정을 370/492 nm에서 테칸 사파이어 2 기기 상에서 수행하였다.

HLA-A2 결합 ELISA

스트렙타비딘 코팅된 플레이트(눈크, 마이크로코트 #11974998001)를 25 μl/웰의 비오티닐화된 인간 HLA-A2로 250 ng/ml의 농도에서 코팅하고 4℃에서 밤새 배양하였다. 세척한 후에(3x90 μl/웰, PBST-완충제 사용), 25 μl의 항-HLA-G 샘플(OSEP 완충제에서 1:3 희석) 또는 래트 혈청(OSEP에서 1:600 희석)을 첨가하고, 1시간 동안 RT에서 배양하였다. 세척한 후에(3x90 μl/웰, PBST-완충제 사용), 25 μl/웰의 염소-항-래트 IgG1-POD(Bethyl #A110-106P), 염소-항-래트 IgG2a-POD(Bethyl #A110-109P) 및 염소-항-래트 IgG2b-POD(Bethyl #A110-111P)의 혼합물(OSEP에서 1:10000)을 첨가하고, RT에서 1시간 동안 진탕기 상에서 배양하였다. 세척한 후에(6x90 μl/웰, PBST-완충제 사용), 25 μl/웰의 TMB 기질(Roche, 11835033001)을 첨가하고, 2 내지 3의 OD까지 배양하였다. 측정을 370/492 nm에서 테칸 사파이어 2 기기 상에서 수행하였다.

항-HLA-G 항체의 결합 동역학

인간 HLA-G, 이식 제거된 인간 HLA-G, 및 인간 HLA-A2에 대한 항-HLA-G 항체의 결합 동역학을 비아코어 T200 기기(지이 헬스케어)를 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 조사하였다. 모든 실험을 25℃에서 러닝 완충제로서 PBS 완충제(pH 7.4 + 0.05% 트윈20) 및 희석 완충제로서 PBS 완충제(+ 0.1% BSA)를 사용하여 수행하였다. 항-인간 Fc(JIR009-005-098, Jackson), 항-래트 Fc(JIR112-005-071, Jackson) 또는 항-마우스 Fc(JIR115-005-071, Jackson) 항체를 아민 커플링 키트(지이 헬스케어에서 공급)를 사용하여 pH 5.0에서 시리즈 S CM5 센서 칩(지이 헬스케어) 상에 고정화하였다. 항-HLA-G 항체를 표면 상에 포착하여 50 내지 200 RU의 포착 반응을 야기하였다. HLA-G 분자를 180초 동안 30 μl/분으로 2.5 내지 800 nM의 농도로(2x1:2 및 4x1:3 희석 시리즈) 표면에 주입하였다(결합상). 해리상을 러닝 완충제로 세척함으로써 300 내지 600초 동안 모니터링하였다. 표면을 항-인간 Fc 포착 항체의 경우 60 + 30초 동안 H₃PO₄(0.85%), 항-래트 Fc 포착 항체의 경우 60초 동안 글리신 pH 1.5 및 60초 동안 글리신 pH 2.0, 항-마우스 Fc 포착 항체의 경우 80 + 60초 동안 H₃PO₄(0.85%)로 주입함으로써 재생하였다. 벌크 굴절률 차이를 모크 표면으로부터 수득한 반응을 감함으로써 보정하였다. 블랭크 주입을 감하였다(이중 참조). 유도된 곡선을 BIAevaluation 소프트웨어를 사용하여 1:1 랭뮤어 결합 모델에 피팅하였다.

항-HLA-G 항체의 교차차단

인간 HLA-G에 결합하는 항-HLA-G 항체의 교차차단 실험을 비아코어 T200 또는 B4000 기기(지이 헬스케어)를 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 조사하였다. 모든 실험을, 25℃에서 러닝 완충제로서 PBS 완충제(pH 7.4 + 0.05% 트윈20)를 사용하여 수행하였다.

항-인간 Fab(지이-헬스케어, 28-9583-25) 항체를 공급사의 프로토콜에 따라 시리즈 S CM5 센서 칩(지이 헬스케어) 상에 고정화하여 인간 Ck 도메인을 함유하는 OMT 래트의 항체를 포착하였다. 항-HLA-G 항체를 70초 동안 15 μg/ml의 농도로 포착하였다. Wt HLA-G를 500 또는 1000 nM의 농도에서 60초 동안 주입하였다(30 μl/분). 이어서, Wt 래트-항체를 90초 동안 30 μg/ml의 농도에서 주입하였다. 해리상을 러닝 완충제로 세척함으로써 60 또는 240초 동안 모니터링하였다. 글리신 pH 1.5를 60초 동안 주입하고 90초의 추가적 안정화 기간에 의해 표면을 재생하였다.

또 다른 분석 셋업에서, 항-인간 Fab(지이-헬스케어, 28-9583-25) 항체를 공급사의 프로토콜에 따라 시리즈 S CM5 센서 칩(지이 헬스케어) 상에 고정화하여 인간 Ck 도메인을 함유하는 OMT 래트의 항체를 포착하였다. 항-HLA-G 항체를 90초 동안 30 μg/ml의 농도에서 포착하였다. 포착 항체 상의 비점유 결합 부위를 4 x 120초 500 μg/ml의 농도 및 30 μl/분의 유속으로 인간 IgG(JIR009-000-003)의 주입에 의해 차단하였다. Wt HLA-G를 500 nM의 농도에서 90초 동안 주입하였다(30 μl/분). 이어서, OMT 래트로부터의 제2 항체(인간 Ck 도메인)를 90초 동안 30 μg/ml의 농도에서 주입하였다. 해리상을 러닝 완충제로 세척함으로써 240초 동안 모니터링하였다. 글리신 pH 1.5를 60초 동안 주입하고 90초의 추가적 안정화 기간에 의해 표면을 재생하였다.

상기 표는 wt 단백질 IMS로부터 유래된 상이한 래트 항-인간 HLA-G 단클론 항체의 결합을 요약한다. ELISA에 의해 평가한 rec. wt 단량체성, 이량체성 및 삼량체성 HLA-G 단백질에 대한 각각의 결합의 상대적 EC50 값[ng/ml]을 나타냈다. ELISA를, 비오티닐화된 wt HLA-G 항원을 스트렙다비딘 플레이트에 코팅함으로써 준비하였다. 배양 및 세척 단계 후에, 각각의 항체는 1:2 희석 단계에서 10 내지 0 μg의 농도 범위에서 결합하였다. 결합된 항체의 검출을 항-Fc-항체-POD 접합체에 의해 수행하였다. EC50 값을 반최대치 신호를 생산하는 항체 농도에서 생성된 결합 곡선으로부터 결정하였다. 비-비오티닐화된 HLA-G 이량체 및 삼량체 항원의 경우, 고정화를 분석 플레이트 상에 무작위 코팅함으로써 수행하였다.

이식 제거 HLA-G와 비교한 wt HLA-G 결합 ELISA

상기 표는 wt 및 OMT 래트 모두의 wt 단백질로부터 유래된 상이한 래트 항-인간 HLA-G 단클론 항체의 결합을 요약한다. ELISA에 의해 평가한 rec. wt 단량체성 HLA-G 단백질 또는 소위 이식 제거된 HLA-G(HLA-G 주쇄 상의 HLA-A 공통 서열) 단백질에 대한 각각의 결합의 상대적 EC50 값[ng/ml] 및 최대 OD를 나타냈다. ELISA를 비오티닐화된 wt HLA-G 또는 공통 항원을 스트렙다비딘 플레이트에 코팅함으로써 준비하였다. 배양 및 세척 단계 후에, 각각의 항체는 1:2 희석 단계에서 10 내지 0 μg의 농도 범위에서 결합하였다. 결합된 항체의 검출을 항-Fc-항체-POD 접합체에 의해 수행하였다. EC50 값을 반최대치 신호를 생산하는 항체 농도에서 생성된 결합 곡선으로부터 결정하였다.

이식 제거된 HLA-G와 비교한 wt HLA-G 결합 - 표면 플라즈몬 공명

상기 표는, 표면 플라즈몬 공명(비아코어) 분석으로 평가한 wt 및 이식 제거된 HLA-G에 대한 항체 친화성 및 t1/2 값을 요약한다.

인간 HLA-G 및 이식 제거된 인간 HLA-G에 대한 항-HLA-G 항체의 결합 동역학을 비아코어 T200 기기(지이 헬스케어)를 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 조사하였다. 모든 실험을 25℃에서 러닝 완충제로서 PBS 완충제(pH 7.4 + 0.05% 트윈20) 및 희석 완충제로서 PBS 완충제(+ 0.1% BSA)를 사용하여 수행하였다. 항-인간 Fc(JIR009-005-098, Jackson), 항-래트 Fc(JIR112-005-071, Jackson) 또는 항-마우스 Fc(JIR115-005-071, Jackson) 항체를 아민 커플링 키트(지이 헬스케어에서 공급)를 사용하여 pH 5.0에서 시리즈 S CM5 센서 칩(지이 헬스케어) 상에 고정화하였다. 항-HLA-G 항체를 표면 상에 포착하여 50 내지 200 RU의 포착 반응을 야기하였다. 비-비오티닐화된 HLA-G 분자를 180초 동안 30 μl/분으로 2.5 내지 800 nM의 농도로(2x1:2 및 4x1:3 희석 시리즈) 표면에 주입하였다(결합상). 해리상을 러닝 완충제로 세척함으로써 300 내지 600초 동안 모니터링하였다. 표면을 항-인간 Fc 포착 항체의 경우 60 + 30초 동안 H₃PO₄(0.85%), 항-래트 Fc 포착 항체의 경우 60초 동안 글리신 pH 1.5 및 60초 동안 글리신 pH 2.0, 항-마우스 Fc 포착 항체의 경우 80 + 60초 동안 H₃PO₄(0.85%)로 주입함으로써 재생하였다. 벌크 굴절률 차이를 모크 표면으로부터 수득한 반응을 감함으로써 보정하였다. 블랭크 주입을 감하였다(이중 참조). 유도된 곡선을 BIAevaluation 소프트웨어를 사용하여 1:1 랭뮤어 결합 모델에 피팅하였다(상기 표에서, "-"는 결합이 검출되지 않음을 나타낸다).

흥미롭게도, 항체 87G를 또한 포함하는, 측정한 항체 대부분은 단량체성 인간 HLA-G MHC I(서열번호 43("HLA-G-0003"))에 대한 임의의 특이적 결합을 나타내지 않았다. 문헌에 기재된 바와 같이 HLA-G의 올리고머성 형태에 대한 결합은 올리고머성 형태의 증가된 결합 부위에 기인하여 유도된 결합성일 수 있다.

7.7E^-09 M의 결합 친화성의 KD 값을 갖는 항체 MEM/G9, 2.0E^-08 M의 KD 값을 갖는 항체 G233, 및 1.2E^-08 M의 결합 친화성의 KD 값을 갖는 MEM-G/11 만이 단량체성 wt 인간 HLA-G MHC I 복합체에 대한 결합을 나타냈다. 그러나, 이들 항체 중 하나인 MEM-G/11은 또한 이식 제거된 HLA-G 상의 공통 HLA-A(서열번호 44)에 대한 약간의 결합/교차반응성을 나타냈다. 또한, 또 다른 항체(MEM/G9)가 또한 이식 제거된 HLA-G 상의 공통 HLA-A(서열번호 44)에 대한 강한 비특이적 결합을 나타냈다.

실시예 4

a) 수용체 결합 억제(단량체성, 이량체성 및 삼량체성 HLA-G): ILT-2 및 ILT-4 차단 ELISA

스트렙타비딘 코팅된 플레이트(눈크, 마이크로코트 #11974998001)를 25 μl/웰의 비오티닐화된 인간 wt HLA-G로 500 내지 1000 ng/ml의 농도에서 코팅하고, 4℃에서 밤새 배양하였다. 세척한 후에(3x90 μl/웰, PBST-완충제 사용), 25 μl의 항-HLA-G 샘플을 10 또는 3 μg/ml에서 출발하여 감소하는 농도로 첨가한 후에, 1:3 또는 1:2 단계로 희석하고 1시간 동안 RT에서 배양하였다. 세척한 후에(3x90 μl/웰, PBST-완충제 사용), 25 μl/웰의 c-myc-태그된 재조합 ILT-2 수용체를 200 ng/ml의 농도에서 첨가하고 1시간 동안 실온에서 배양하였다. 세척한 후에(3x90 μl/웰, PBST-완충제 사용), 25 μl/웰의 염소-항-c-myc-POD(Bethyl #A190-104P, PBST + 0.5% BSA에서 1:7000) 또는 항-인간 FcgPOD(JIR, 109-036-098, PBST + 0.5% BSA에서 1:8000)를 첨가하고, RT에서 1시간 동안 진탕기 상에서 배양하였다. 세척한 후에(3x90 μl/웰, PBST-완충제 사용), 25 μl/웰의 TMB 기질(Roche, 11835033001)을 첨가하고, 2 내지 3의 OD까지 배양하였다. 측정을 370/492 nm에서 테칸 사파이어 2 기기 상에서 수행하였다.

상기 표는, 차단되지 않은 HLA-G:수용체 상호작용과 관련한, 3 μg/ml의 농도에서 HLA-G에 결합된 상이한 항체의 ILT-2 및 ILT-4 차단의 정도를 요약한다. HLA-G-0090을 ILT2 봉쇄에 대해 별개의 실험에서 시험하였고, ILT4 차단은 평가하지 않았다.

b) 상이한 분석 셋업을 사용한, ILT2 및 -4 결합 억제 특성에 대한 항-HLA-G 항체의 생화학적 비교

ELISA를 Fc 태그된 ILT2 및 ILT4를 각각 Maxisorp 마이크로 타이터 플레이트에 코팅함으로써 준비하였다. 배양 및 세척 단계 후에, 각각의 항체를 100 nM의 농도에서 첨가하였다. 가용성의 His 태그된 단량체성, 이량체성 또는 삼량체성 HLA-G를 웰에 첨가하였다. 배양 및 세척 단계 후에, 결합된 수용체의 검출을 항-His-항체-POD 접합체에 의해 수행하였다. 억제율(%)을 항-HLA-G 또는 ILT2/4 항체를 사용하지 않은 ILT2/4 + HLA-G(단량체, 이량체 또는 삼량체)를 사용한 웰로부터 수득한 값과 비교하여 계산하였다(100% 결합 = 0% 억제).

상기 표는, ELISA에 의해 평가한, 110 nM의 농도에서(*HLAG-0090는 44 nM의 농도에서 시험하였다) 기재된 HLAG 항체에 의한 rec. HLA-G 단백질(단량체 및 올리고머)과 이의 수용체 ILT2 및 ILT4 사이의 상호작용의 차단을 요약한다. (ILT2 및 ILT4에 대한) HLA-G/수용체 상호작용의 억제율(%)을 나타냈다. 덜 확연한 ILT4 억제가 이의 수용체의 주요 ß2M 의존성 상호작용에 의존적이다.

도 4a 및 4b의 막대 그래프는, 상업적으로 입수가능한 항체와 비교한 기재된 항-HLA-G 항체에 의해 달성된 억제율(%)을 나타낸다. 상업적으로 입수가능한 HLA-G 항체 87G, MEM/G09 및 G233은 기재된 항체 만큼 효율적으로 HLA-G/ILT2 또는 ILT4 상호작용을 차단하지 않는다. 또한, 상업적으로 입수가능한 항체는 일부 경우에 결합시 ILT2 또는 ILT4에 대한 HLA-G의 증가된 결합을 야기한다.

c) 항-HLAG 항체에 의한 HLAG에 대한 CD8a의 결합의 억제

스트렙타비딘 코팅된 384 웰 플레이트를 30 μl/웰의 차단 용액으로 차단하였다. 차단 용액은 3.5 ml의 PVA + 3.5 ml의 PVP를 35 ml의 스타팅 블록(Starting Block) T20에 첨가함으로써 5% 폴리비닐알코올(PVA, Sigma #P8136) 및 8% 폴리비닐피롤리돈(PVP, Sigma #PVP360)을 스타팅 블록 T20(Thermo Scientific #37543)에 1:10 희석함으로써 제조하였다. 차단 용액에 희석된 30 μl의 비오티닐화된 HLAG(3 μg/ml)를 각각에 웰에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 진탕기 상에서 배양하였다. 웰을 0.1% 트윈-20(메르크 #8.22184.500)을 함유하는 100 μl의 PBS(PAN Biotech # P04-36500)로 3회 세척하였다. 이어서, 웰을 차단 완충제에 희석된 30 μl의 항-HLAG 항체와 함께 삼중으로 1시간 동안 실온에서 진탕기 상에서 배양한 후에, 0.1% 트윈-20을 함유하는 100 μl의 PBS로 3회 세척하였다. 재조합 CD8a(Sino Biological #10980-H08H, 1주일 동안 4℃에서 저장시 재구성됨)를 차단 용액에 희석하고(1.25 μg/ml), 30 μl를 모든 웰에 첨가하고 2시간 동안 실온에서 진탕기 상에서 배양하였다. 웰을 0.1% 트윈-20을 함유하는 100 μl의 PBS로 3회 세척하였다. HRP 접합된 다클론 항-CD8a 래트 IgG 항체(USBiological #033547-HRP)를 3% 소 혈청 알부민 분획 V(Roche #10735086001)/PBS 0.2% 트윈20에 희석하고, 이러한 희석물 30 μl를 각각의 웰에 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 1시간 동안 실온에서 진탕기 상에서 배양하고, 0.1% 트윈-20을 함유하는 100 μl의 PBS로 3회 세척하였다. 이어서, 30 μl의 TMB 기질(BM-Blue, 가용성 HRP 기질, Roche #11484281001)을 각각의 웰에 첨가한 후에, 25분 동안 실온에서 진탕기 상에서 배양하였다. 이어서, 25 μl의 황산을 각각의 웰에 첨가함으로써 반응을 정지시키고 450 nM에서 플레이트 리더에서 흡광도를 측정하였다. HLAG에 대한 CD8a의 특이적 결합을 백그라운드 값의 평균을 결합 값의 평균으로부터 감함으로써 계산하였다. 항체의 부재 하에 HLAG에 대한 CD8의 전체 결합은 100% 결합 또는 0% 억제로 간주된다.

도 4c의 막대 그래프는 상업적으로 입수가능한 항체와 비교한 기재된 항-HLA-G 항체에 의해 달성된 억제율(%)을 나타낸다. 상업적으로 입수가능한 HLA-G 항체 87G는 HLA-G/CD8a 상호작용을 차단하지 않고, 여기서 본 셋업에서 기재된 항체와 비교하여 MEM/G09 및 G233이 CD8a와의 HLAG 상호작용을 부분적으로 억제한다.

실시예 5: 세포에 대한 항-HLA-G 항체의 결합

a) 세포-표면 HLA-G 결합 ELISA

25 μl/웰의 JEG3 세포(HLA-G 자연 발현, 20000 세포/웰), Skov-3 세포 또는 세포 표면 상에 재조합 HLA-G를 발현하는 Skov-3 세포(둘 모두 10000 세포/웰)를 조직 배양 처리된 384-웰 플레이트(Corning, 3701) 내로 시딩하고 37℃에서 밤새 배양하였다. 다음날, 12.5 μl의 항-HLA-G 샘플(최종 희석 1:3)을 첨가하고, 2시간 동안 4℃에서 배양하였다. 세포를 50 μl/웰 글루타르알데하이드의 첨가에 의해 0.05%의 최종 농도로 고정하였다(Sigma 카타로그 번호: G5882; 로트 번호: 056K5318). 세척한 후에(3x90 μl/웰, PBST-완충제 사용), 25 μl/웰 염소-항-마우스 H+L-POD(Biorad #170-6561 OSEP에서 1:2000) 또는 당나귀-항-토끼 IgG POD(GE #NA9340V, OSE에서 1:5000)를 첨가하고, RT에서 1시간 동안 진탕기 상에서 배양하였다. 래트 IgG의 검출을 위해, 염소-항-래트 IgG1-POD(Bethyl #A110-106P), 염소-항-래트 IgG2a-POD(Bethyl #A110-109P) 및 염소-항-래트 IgG2b-POD(Bethyl #A110-111P)의 혼합물(OSEP에서 1:10000)을 첨가하고, RT에서 1시간 동안 진탕기 상에서 배양하였다. 세척 후에(4x90 μl/웰, PBST-완충제 사용), 25 μl/웰의 TMB 기질(Roche, 11835033001)을 첨가하고, 2 내지 3의 OD까지 배양하였다. 측정을 370/492 nm에서 테칸 사파이어 2 기기 상에서 수행하였다.

상기 표는, FACS 분석에서 평가한, 상이한 세포 및 세포주 상에 발현된 HLA-G에 대한 상이한 래트 항-인간 HLA-G 단클론 항체의 결합을 요약한다. 자연 HLA-G 발현 JEG3 종양 세포 또는 Skov3 또는 PA-TU-8902 형질감염체 및 각각의 형질감염되지 않은 모 세포에 대한 결합이 기재된다.

b) 세포 상에 발현된 천연 또는 재조합 HLA-G에 대한 HLA-G 항체의 결합(FACS 분석에 의해 평가)

유세포 분석을 위해, 세포를 4℃에서 항-HLA-G mAb로 염색하였다. 간략히, 25 μl/웰의 각각의 세포 현탁액(5x10⁴ 세포/웰)을 폴리프로필렌 96-웰 V-바닥 플레이트로 옮기고 5℃에서 10분 동안 냉장고에서 예비-냉각하였다. 항-HLA-G 샘플을 염색 완충제에 80 μg/ml의 2-배 출발 농도로 희석하였다. 항체의 4-배 연속 희석을 수행하고, 25 μl/웰의 항체 용액을 생산한 세포에 첨가하고 1시간 동안 5℃에서 배양하였다. 세포를 200 μl/웰의 염색 완충제로 2회 세척하고 300g에서 3분 동안 원심분리하였다. 검출을 위해, 형광 표지된 항-종 항체(488에 접합된 염소 항-래트 IgG(H+L), Life technologies # A11006; 또는 염소 항-마우스 IgG(H+L), Life technologies # A11001) 또는 Alexa 488에 접합된 염소 항-인간 IgG(H+L), Life technologies # A11013)를 20 μg/ml로 염색 완충제에 희석하고, 세포 펠릿을 50 μl/웰 검출 항체에 재현탁하였다. 5℃에서 1시간의 배양 후에, 세포를 다시 염색 완충제로 2회 세척하고 70 μl의 염색 완충제에 재현탁하고 FACS Canto II에서 측정하였다.

항-HLA-G 항체 HLA-G 0031, HLAG 0039, HLA-G 0041 및 HLA-G 0090에 대한 예시적 FACS 염색을 도 4의 FACS 오버레이로 제시하였다.

실시예 6: 항-HLA-G 항체는 JEG3 세포 상에 발현된 HLA-G에 대한 ILT2의 결합을 억제한다/조절한다.

분석을 위해, JEG3 세포(ATCC HTB36)를, 상이한 항-HLA-G 항체와의 예비-배양과 함께 또는 예비-배양 없이 ILT2-Fc 융합 단백질(대조군 = 억제 없음)로 염색하였다. 항-HLA-G 항체와의 예비-배양을 위해, 25 μl/웰의 세포 현탁액을 폴리프로필렌 96-웰 V-바닥 플레이트로 옮기고 4℃에서 10분 동안 예비-냉각하였다. 항-HLA-G 항체 또는 기준 항체(G233, MEM-G/9 또는 87G)를 염색 완충제에 80 μg/ml의 2-배 농도로 희석하고, 25 μl/웰의 항체 용액을 생산한 세포에 첨가하고 1시간 동안 5℃에서 배양하였다. 세포를 200 μl/웰의 염색 완충제로 2회 세척하고 300g에서 3분 동안의 원심분리하고 마지막으로 25 μl/웰의 염색 완충제에 재현탁하였다.

a) 항-HLA-G mAb와 함께 예비-배양된 JEG3 세포, 또는 b) 기준으로서 미처리된 JEG3 세포에 대한 인간 ILT2-Fc 키메라 단백질(RD #2017-T2-050)의 검출을 하기와 같이 결정하였다: 간략히, ILT2-Fc 또는 대조군 인간 IgG(Jackson-Immuno-Research # 009-000-003)를 염색 완충제에 20 μg/ml의 2-배 농도로 희석하고(ILT2), 25 μl/웰의 ILT2-Fc 단백질 용액을 생산한 세포에 첨가하고 2시간 동안 5℃에서 배양하였다. 세포를 다시 200 μl/웰의 염색 완충제로 2회 세척하고, 인간 ILT2-Fc단백질을 염색 완충제에서 10 μg/ml의 희석 농도에서 형광 표지된 항-인간 IgG Fc-감마 특이적 항체(F(ab')₂ 단편 염소 항-인간 IgG, Fcγ 단편 특이적-FITC, Jackson-Immuno-Research # 109-096-008)로 검출하였다. 세포 펠릿을 50 μl/웰의 검출 항체에 재현탁하였다. 5℃에서 1시간의 배양 후에, 세포를 염색 완충제로 2회 세척하고 70 μl에 재현탁하고 FACS Canto II에서 측정하여 JEG 3 세포에 대한 ILT2 결합을 결정하였다.

대조군으로서, JEG-3 예비-배양된 세포에 결합된 항-HLA-G 항체를 10 μg/ml의 농도에서 항-종 항체(Alexa 488에 접합된 염소 항-래트 IgG(H+L), (Life technologies # A11006), 또는 염소 항-마우스 IgG(H+L)-Alexa 488, (Life technologies, # A11001))를 사용하여 검출하였다.

도 5의 그래프는, JEG3 종양 세포 상에 자연 발현된 HLA-G에 대한 재조합 ILT2의 상호작용 및 결합을 변형하는 상이한 HLA-G 항체의 각각의 능력을 나타낸다.

하기 표는 실험 결과를 요약한다. JEG3 세포에 대한 항-HLA-G 항체의 결합을 하기와 같이 나타냈다: + = 약한 결합; +++ = 강한 결합. HLA-G 발현 JEG3 세포에 대한 ILT2의 결합을 억제/차단하거나 증가시키는 항-HLA-G 항체의 능력. 마지막 컬럼에서, 세포에 대한 재조합 ILT2의 결합 또는 이의 억제/봉쇄를 나타냈다/정량화하였다(항-HLA-G 항체의 부재 하에 ILT2-Fc의 염색을 100% 결합(=0% 억제)로 설정하고, 음의 값은 증가된 결합을 나타내고; 5% 미만의 염색 신호 차이는 효과 없음으로 분류된 바와 같이 유의미하지 않았다):

실시예 7: 단핵구 시토카인 회복 분석(HLA-G 매개된 억제 후)

단핵구를 사용한 HLA-G 발현 세포의 하기 공-배양 분석을 상이한 래트 항-인간 HLA-G 단클론 항체의 기능적 특성규명을 위해 사용하였다. 말초 인간 단핵구를 건강한 공여자의 혈액으로부터 단리하였다. 간략히, 혈액을 혈액응고 방지제를 함유하는 튜브에 수집하고 PBS에 1:2 희석하였다. 말초혈 단핵 세포(PBMC)를 단리하기 위해, 30 ml의 혼합물을 분리 배지로 예비-충전된 각각의 Leucosep 튜브에 옮겼다. PBMC 특이적 밴드를 12분의 원심분리(1200xg, 제동 없음) 후에 수집하고, PBS로 3회 세척하고 10분 동안 300xg에서 원심분리하였다. 마지막으로, 세포 펠릿을 MACS 완충제(Miltenyi)에 재현탁하고, 인간 단핵구를 인간 단핵구 단리 키트 II(Miltenyi, #130-091-153)를 제조사의 지시에 따라 사용하여(음성 선택) PBMC로부터 자성 분리를 통해 의해 단리하였다. 단리된 단핵구를 일차 세포 배양 배지(RPMI 1640, PAN #P04-17500, 하기로 보충됨: 10% FCS, Gibco #10500; 2 mM L-글루타민, Sigma #G7513; 1 mM 나트륨 피부베이트, Gibco #11360; MEM 비필수 아미노산, Gibco #11140; 0.1 mM 2-머캅토에탄올, Gibco #31350; MEM 비타민, Gibco #11120; 페니실린 스트렙토마이신, Gibco #15140)에 5x10e5 세포/ml의 밀도로 재현탁하였다. CD14⁺ CD16⁺ 세포의 강화를 유세포 분석에 의해 모니터링하고, 세포의 ILT2 및 ILT4 발현을 분석하였다. HLA-G 발현 세포를 사용한 강화된 단핵구의 공-배양을 위해, JEG-3 세포(ATCC HTB36)를 분석 1일 전에 96-웰-평저 조직 배양 플레이트에 8x10e3 세포/웰로 100 μl에서 JEG-3 배양 배지(EBSS 및 L-글루타민을 갖는 MEM Eagle, PAN #P04-00509, 하기로 보충됨: 10% FCS, Gibco #10500; 1 mM 나트륨 피루베이트, Gibco #11360; MEM 비필수 아미노산, Gibco #11140)에 시딩하여 분석 당일에 컨플루언트 층을 형성하였다. 일부 실험에서, JEG-3 HLAG 녹아웃 세포주를 사용하고 상기에 기재된 바와 같이 JEG-3 wt 세포로 시딩하였다. 부착성 JEG-3 세포를 일차 세포 배양 배지에서 항-HLA-G 항체의 4-배 연속 희석물과 함께 예비-배양하였다. 따라서, 부착성 JEG-3 세포의 상청액을 제거하고, 50 μl/웰의 생산한 항체 용액을 첨가하고 37℃ 및 5% CO₂에서 가습된 대기에서 1시간 동안 배양하였다. 인간 단핵구를 50 μl의 일차 세포 배양 배지에서 2.5x10e4 인간 단핵구/웰로 JEG-3 세포와 함께 예비-배양된 항-HLA-G 항체에 첨가하고, 공-배양물을 37℃ 및 5% CO₂에서 가습된 대기에서 밤새(약 18 내지 20시간) 배양하였다. 다음날, 50 ng/ml LPS에 의해 LPS 자극을 7시간 동안 수행하고, 이후 공-배양의 상청액을 채취하였다. 공-배양 상청액의 TNF 알파의 농도를 인간 TNF 알파 ELISA Ready-SET-Go!(등록상표)(이바이오사이언스, #88-7346-88)를 사용하여 결정하였다.

하기 표는 상이한 항체 특성에서 특이적 공여자에 대한 제시된 HLA-G 항체의 기능적 특성규명을 요약한다.

하기 표들은, 기능적 항-HLA-G 항체가 HLA-G 특이적인 억제된 면역 반응을 회복시킬 수 있음(즉 HLA-G 발현 세포를 사용한 공-배양에서 단핵구에 의한 LPS-유도된 TNFa 생산의 회복)을 나타낸다(기능적 항-HLA-G 항체의 TNF 방출률(%)(회복)).

기능적 항-HLA-G 항체는 (억제된) 면역 반응을 유도(회복)할 수 있다(즉 HLA-G 발현 세포를 사용한 공-배양에서 단핵구에 의한 LPS-유도된 TNFa 생산의 회복)(HLAG 특이적 TNF 유도에 대한 음성 대조군의 경우, HLAG 녹아웃 세포주를, 항체가 TNF 유도를 나타내지 않거나(엄밀히 HLA-G 특이적인 것) 녹아웃 세포주 상에서 TNF 유도를 나타내는 지를(HLAG 특이적이지 않음) 구별하는 데 사용하였다).

항-HLA-G 항체의 TNF 유도율(%)의 값을 하기 조건을 사용하여 계산하였다: JEG3 세포 및 단핵구의 미처리된 공-배양 = 0%, 단핵구 단독 배양(HLA-G 유도된 억제 없음) = 100%.

상기 표로부터, 본 발명의 항체가 HLA-G 발현 JEG-3 세포와의 단핵구 공-배양에서 TNF 알파 방출을 유도할 수 있는 반면에, 이는 HLA-G 녹아웃 JEG-3 세포와의 공-배양된 단핵구에서 TNF 알파 방출을 유도할 수 없음이 분명해졌다.

표로부터, 기준 항체가, 이것이 강한 TNF 알파 방출을 또한 HLA-G 녹아웃 세포주에서 유도한 바와 같이, 엄밀히 HLA-G 특이적이지 않다는 것이 분명해졌다.

공여자(하기 상이한 공여자)에 따라, TNF 방출률(%)(회복)은 변한다.

SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Anti-HLA-G antibodies and use thereof <130> P34773-WO <140> PCT/EP2019/060007 <141> 2019-04-17 <150> EP18168011.7 <151> 2018-04-18 <160> 55 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> rat <400> 1 Asp Tyr Trp Val Ser 1 5 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> rat <400> 2 Glu Ile Ser Pro Asn Ser Gly Ala Ser Asn Phe Asp Glu Asn Phe 1 5 10 15 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> rat <400> 3 Ser Ser His Gly Ser Phe Arg Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> rat <400> 4 Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Asn His Leu His 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> rat <400> 5 Ser Thr Ser Gln Arg Ala Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> rat <400> 6 Gln Gln Gly Ser Ser Asn Pro Tyr Thr 1 5 <210> 7 <211> 120 <212> PRT <213> rat <400> 7 Gln Val Lys Leu Met Gln Ser Gly Ala Ala Leu Val Lys Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Asn Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Trp Val Ser Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 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Asn Tyr Gly Tyr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 16 <211> 113 <212> PRT <213> human <400> 16 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Lys Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Phe Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Asn Thr Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 17 <211> 5 <212> PRT <213> human <400> 17 Thr Tyr Gly Met Ser 1 5 <210> 18 <211> 17 <212> PRT <213> human <400> 18 Val Ile Ser Gly Gly Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 19 <211> 14 <212> PRT <213> human <400> 19 Asp Gly Ser Tyr Asn Tyr Gly Tyr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 20 <211> 17 <212> PRT <213> human <400> 20 Lys Ser Ser Gln Asn Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 21 <211> 7 <212> PRT <213> human <400> 21 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> human <400> 22 Gln Gln Tyr Tyr Asn Thr Pro Arg Thr 1 5 <210> 23 <211> 123 <212> PRT <213> human <400> 23 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Ser Gly Gly Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Gly Ser Tyr Asn Tyr Gly Tyr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 24 <211> 113 <212> PRT <213> human <400> 24 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu 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artificial <220> <223> humanized variant light chain variable domain VL, HLA-G-0031-0104 (HLA-G-0104) <400> 34 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30 His Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Phe Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Thr Ser Gln Arg Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Ser Asn Pro 85 90 95 Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 35 <211> 314 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 35 Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Ser Ala Ala Val Ser Arg Pro Gly 1 5 10 15 Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Met Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln 20 25 30 Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ser Ala Cys Pro Arg Met Glu Pro Arg 35 40 45 Ala Pro Trp Val Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Glu Glu Glu Thr 50 55 60 Arg Asn Thr Lys Ala His Ala Gln Thr Asp 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I complex wherein the positions specific for human HLA-G are grafted onto the mouse H2Kd framework <400> 46 Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Gly Cys Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Lys Thr Pro Gln Ile Gln 20 25 30 Val Tyr Ser Arg His Pro Pro Glu Asn Gly Lys Pro Asn Ile Leu Asn 35 40 45 Cys Tyr Val Thr Gln Phe His Pro Pro His Ile Glu Ile Gln Met Leu 50 55 60 Lys Asn Gly Lys Lys Ile Pro Lys Val Glu Met Ser Asp Met Ser Phe 65 70 75 80 Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Ile Leu Ala His Thr Glu Phe Thr Pro 85 90 95 Thr Glu Thr Asp Thr Tyr Ala Cys Arg Val Lys His Asp Ser Met Ala 100 105 110 Glu Pro Lys Thr Val Tyr Trp Asp Arg Asp Met Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Pro His Ser Leu Arg Tyr Phe Val Thr Ala Val Ser Arg Pro Gly Leu 145 150 155 160 Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe 165 170 175 Val Arg Phe Asp Ser Asp Ser Ala Ser Pro Arg Phe Glu Pro Arg Ala 180 185 190 Pro Trp Val Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Glu Glu Gln Thr Gln 195 200 205 Arg Ala Lys Ser Asp Glu Gln Trp Phe Arg Met Ser Leu Gln Thr Ala 210 215 220 Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Ser Ser His Thr Phe Gln Arg 225 230 235 240 Met Phe Gly Cys Asp Leu Gly Ser Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly Tyr 245 250 255 Gln Gln Phe Ala Tyr Asp Gly Arg Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu Asp 260 265 270 Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Leu Ile Thr Lys Arg 275 280 285 Lys Trp Glu Ala Ala Asn Asp Ala Glu Tyr Tyr Arg Ala Tyr Leu Glu 290 295 300 Gly Glu Cys Val Glu Trp Leu His Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Met Leu Gln Arg Thr Asp Ser Pro Lys Ala His Val Thr His His Pro 325 330 335 Val Phe Asp Tyr Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr 340 345 350 Pro Ala Glu Ile Ile Leu Thr Trp Gln Leu Asn Gly Glu Asp Leu Thr 355 360 365 Gln Asp Val Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe 370 375 380 Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Lys Glu Gln Asn Tyr 385 390 395 400 Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Glu Pro Leu Met Leu Arg 405 410 415 Trp Lys Gly Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu 420 425 430 Trp His Glu His His His His His His 435 440 <210> 47 <211> 440 <212> PRT <213> rat <400> 47 Ala Gln Phe Ser Ala Ser Ala Ser Arg Gly Cys Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Lys Thr Pro Gln Ile Gln 20 25 30 Val Tyr Ser Arg His Pro Pro Glu Asn Gly Lys Pro Asn Phe Leu Asn 35 40 45 Cys Tyr Val Ser Gln Phe His Pro Pro Gln Ile Glu Ile Glu Leu Leu 50 55 60 Lys Asn Gly Lys Lys Ile Pro Asn Ile Glu Met Ser Asp Leu Ser Phe 65 70 75 80 Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Ile Leu Ala His Thr Glu Phe Thr Pro 85 90 95 Thr Glu Thr Asp Val Tyr Ala Cys Arg Val Lys His Val Thr Leu Lys 100 105 110 Glu Pro Lys Thr Val Thr Trp Asp Arg Asp Met Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Ser His Ser Leu Arg Tyr Phe Tyr Thr Ala Val Ser Arg Pro Gly Leu 145 150 155 160 Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Glu Phe 165 170 175 Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Glu Asn Pro Arg Met Glu Pro Arg Ala 180 185 190 Arg Trp Met Glu Arg Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Glu Gln Gln Thr Arg 195 200 205 Ile Ala Lys Glu Trp Glu Gln Ile Tyr Arg Val Asp Leu Arg Thr Leu 210 215 220 Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Gly Gly Ser His Thr Ile Gln Glu 225 230 235 240 Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Gly Ser Leu Leu Arg Gly Tyr 245 250 255 Arg Gln Asp Ala Tyr Asp Gly Arg Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu Asp 260 265 270 Leu Lys Thr Trp Thr Ala Ala Asp Phe Ala Ala Gln Ile Thr Arg Asn 275 280 285 Lys Trp Glu Arg Ala Arg Tyr Ala Glu Arg Leu Arg Ala Tyr Leu Glu 290 295 300 Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Ser Arg Tyr Leu Glu Leu Gly Lys Glu 305 310 315 320 Thr Leu Leu Arg Ser Asp Pro Pro Glu Ala His Val Thr Leu His Pro 325 330 335 Arg Pro Glu Gly Asp Val Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr 340 345 350 Pro Ala Asp Ile Thr Leu Thr Trp Gln Leu Asn Gly Glu Asp Leu Thr 355 360 365 Gln Asp Met Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe 370 375 380 Gln Lys Trp Ala Ser Val Val Val Pro Leu Gly Lys Glu Gln Asn Tyr 385 390 395 400 Thr Cys Arg Val Glu His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Ser Gln Arg 405 410 415 Trp Gly Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp 420 425 430 His Glu His His His His His His 435 440 <210> 48 <211> 440 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> exemplary human HLA-G/ rat RT1A ?M MHC class I complex wherein the positions specific for human HLA-G are grafted onto the rat RT1A framework <400> 48 Ala Gln Phe Ser Ala Ser Ala Ser Arg Gly Cys Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Lys Thr Pro Gln Ile Gln 20 25 30 Val Tyr Ser Arg His Pro Pro Glu Asn Gly Lys Pro Asn Phe Leu Asn 35 40 45 Cys Tyr Val Ser Gln Phe His Pro Pro Gln Ile Glu Ile Glu Leu Leu 50 55 60 Lys Asn Gly Lys Lys Ile Pro Asn Ile Glu Met Ser Asp Leu Ser Phe 65 70 75 80 Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Ile Leu Ala His Thr Glu Phe Thr Pro 85 90 95 Thr Glu Thr Asp Val Tyr Ala Cys Arg Val Lys His Val Thr Leu Lys 100 105 110 Glu Pro Lys Thr Val Thr Trp Asp Arg Asp Met Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Ser His Ser Leu Arg Tyr Phe Tyr Thr Ala Val Ser Arg Pro Gly Leu 145 150 155 160 Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Glu Phe 165 170 175 Val Arg Phe Asp Ser Asp Ser Ala Ser Pro Arg Met Glu Pro Arg Ala 180 185 190 Pro Trp Val Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Glu Gln Gln Thr Arg 195 200 205 Ile Ala Lys Glu Trp Glu Gln Ile Tyr Arg Met Asp Leu Gln Thr Leu 210 215 220 Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Ser Ser His Thr Ile Gln Glu 225 230 235 240 Met Tyr Gly Cys Asp Leu Gly Ser Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly Tyr 245 250 255 Arg Gln Asp Ala Tyr Asp Gly Arg Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu Asp 260 265 270 Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Phe Ala Ala Gln Ile Thr Lys Arg 275 280 285 Lys Trp Glu Ala Ala Asn Tyr Ala Glu Arg Leu Arg Ala Tyr Leu Glu 290 295 300 Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu His Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Met Leu Gln Arg Ala Asp Pro Pro Glu Ala His Val Thr His His Pro 325 330 335 Val Phe Asp Tyr Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr 340 345 350 Pro Ala Glu Ile Ile Leu Thr Trp Gln Leu Asn Gly Glu Asp Leu Thr 355 360 365 Gln Asp Val Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe 370 375 380 Gln Lys Trp Ala Ser Val Val Val Pro Ser Gly Lys Glu Gln Asn Tyr 385 390 395 400 Thr Cys Arg Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Met Leu Arg 405 410 415 Trp Gly Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp 420 425 430 His Glu His His His His His His 435 440 <210> 49 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> linker and his-Tag <400> 49 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Leu Asn Asp 1 5 10 15 Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu His His His His His 20 25 30 His <210> 50 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 50 Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala 1 5 <210> 51 <211> 107 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 51 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 52 <211> 105 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 52 Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 1 5 10 15 Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe 20 25 30 Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val 35 40 45 Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys 50 55 60 Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser 65 70 75 80 His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu 85 90 95 Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100 105 <210> 53 <211> 328 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 53 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 325 <210> 54 <211> 328 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 54 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 325 <210> 55 <211> 325 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 55 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu 325

Claims

인간 HLA-G에 결합하고, JEG-3 세포(ATCC HTB36) 상의 HLAG에 대한 ILT2 결합을 억제하고, HLA-G 특이적인 억제된 TNF 알파 방출을 JEG-3 세포와 공-배양된 단핵구에 의해 회복시키는 단리된 항체로서,
A) (a) (i) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (iii) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인;
B) (a) (i) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (iii) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인;
C) (a) (i) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (iii) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인; 또는
D) (a) (i) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (iii) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인
을 포함하는 항체.
제1항에 있어서,
A) i) 서열번호 7의 VH 서열 및 서열번호 8의 VL 서열, 또는
ii) 서열번호 33의 VH 서열 및 서열번호 34의 VL 서열을 포함하거나;
B) 서열번호 15의 VH 서열 및 서열번호 16의 VL 서열을 포함하거나;
C) 서열번호 23의 VH 서열 및 서열번호 24의 VL 서열을 포함하거나;
D) 서열번호 31의 VH 서열 및 서열번호 32의 VL 서열을 포함하는, 항체.
제1항에 있어서,
a) 서열번호 44를 포함하는 변형된 인간 HLA-G ß2M MHC I 복합체와 교차반응하지 않고/않거나;
b) 서열번호 39 및 서열번호 37을 포함하는 인간 HLA-A2 ß2M MHC I 복합체와 교차반응하지 않고/않거나;
c) 서열번호 45를 포함하는 마우스 H2Kd ß2M MHC I 복합체와 교차반응하지 않고/않거나;
d) 서열번호 47을 포함하는 래트 RT1A ß2M MHC I 복합체와 교차반응하지 않고/않거나;
e) 단량체성 HLA-G ß2M MHC I 복합체에 대한 ILT2 결합을 억제하고/하거나;
f) HLA-G ß2M MHC I 복합체에 대한 ILT2 결합을 억제하고/하거나;
g) 단량체성 및/또는 이량체성 및/또는 삼량체성 HLA-G ß2M MHC I 복합체에 대한 ILT2 결합을 50% 초과만큼 억제하고/하거나;
h) JEG3 세포(ATCC 번호 HTB36)에 대한 ILT2 결합을 억제하고/하거나;
i) JEG3 세포(ATCC 번호 HTB36) 상의 HLA-G에 결합하고, JEG3 세포(ATCC 번호 HTB36) 상의 HLA-G에 대한 ILT2 결합을 억제하고/하거나;
j) HLAG에 대한 CD8a 결합을 80% 초과만큼 억제하는, 항-HLA-G 항체.
제1항에 있어서,
IgG1 이소타입의 것인 항체.
제4항에 있어서,
돌연변이 L234A, L235A 및 P329G(카밧의 EU 인덱스에 따른 넘버링)를 갖는 IgG1 이소타입의 것인 항체.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체를 암호화하는 단리된 핵산.
제6항의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
제7항의 숙주 세포를 배양하여 항체를 생산하는 단계를 포함하는, 항체의 생산 방법.
제8항에 있어서,
항체를 숙주 세포로부터 회수하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 암을 치료하기 위한 약학 제형.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
약제로서 사용하기 위한 항체.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
암의 치료에서 사용하기 위한 항체.
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