KR20180028548A - Sirp-알파 도메인 또는 이의 변이체를 갖는 구조체 - Google Patents

Sirp-알파 도메인 또는 이의 변이체를 갖는 구조체 Download PDF

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KR20180028548A
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로라 데밍
코리 굿맨
뱅 재닛 심
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홍 완
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Abstract

본 발명은 예로서, 세포 (가령, 암 세포 또는 면역계의 세포)를 표적으로 하거나, 표적 세포의 식균작용을 증가시키거나, 면역 세포, 예를 들면, 조절 T-세포를 제거하거나, 암 세포를 사멸시키거나, 개체에서 질환 (가령, 암)을 치료하거나, 또는 이들의 임의의 조합에서 유용한 신호-조절 단백질 α (SIRP-α) 폴리펩티드 및 구조체를 특징으로 한다. 이들 SIRP-α 구조체는 야생형 SIRP-α보다 더욱 높은 친화성으로 CD47에 결합하는 높은 친화성 SIRP-α D1 도메인 또는 이의 변이체를 포함한다. 이들 SIRP-α 폴리펩티드 또는 구조체는 Fc 도메인 단위체, 인간 혈청 알부민 (HSA), 알부민 결합 펩티드, 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 중합체에 융합된 SIRP-α D1 변이체를 포함한다. 본원에서 제공된 조성물은 (i) 신호-조절 단백질 α (SIRP- α) D1 변이체를 포함하는 폴리펩티드 및 (ii) 항체를 포함한다.

Description

SIRP-알파 도메인 또는 이의 변이체를 갖는 구조체
교차 참조
본 출원은 2015년 8월 7일자 제출된 U.S. 특허가출원 번호 62/202,772; 2015년 8월 7일자 제출된 U.S. 특허가출원 번호 62/202,775; 2015년 8월 7일자 제출된 U.S. 특허가출원 번호 62/202,779; 2016년 1월 8일자 제출된 U.S. 특허가출원 번호 62/276,801; 2015년 12월 10일자 제출된 U.S. 특허가출원 번호 62/265,887; 2016년 1월 8일자 제출된 U.S. 특허가출원 번호 62/276,796; 및 2016년 6월 6일자 제출된 U.S. 특허가출원 번호 62/346,414에 우선권을 주장하고, 이들 출원은 각각 본원에서 전체적으로 참조로서 편입된다.
발명의 요약
일정한 구체예에서, 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 80에서 아미노산 돌연변이; 및 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 6, 잔기 27, 잔기 31, 잔기 47, 잔기 53, 잔기 54, 잔기 56, 잔기 66 및 잔기 92로 구성된 군에서 선택되는 잔기에서 최소한 하나의 추가 아미노산 돌연변이를 갖는 SIRP-α D1 도메인을 포함하는 신호-조절 단백질 α (SIRP-α) D1 변이체, 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드가 본원에서 개시된다. 일부 구체예에서, 야생형 SIRP-α D1 도메인은 서열 번호: 1-10 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 도메인은 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 6, 잔기 27, 잔기 31, 잔기 47, 잔기 53, 잔기 54, 잔기 56, 잔기 66 및 잔기 92로 구성된 군에서 선택되는 잔기에서 1개 내지 9개의 추가 아미노산 돌연변이를 포함한다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체는 아미노산 서열, EEELQX1IQPDKSVLVAAGETATLRCTX2TSLX3PVGPIQWFRGAGPGRX4LIYNQX5X6GX7FPRVTTVSDX8TKRNNMDFSIRIGX9ITPADAGTYYCX10KFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS (서열 번호: 49)를 포함하고, 여기서 X1은 V, L, 또는 I이고; X2는 A, I, V, 또는 L이고; X3은 I, F, S, 또는 T이고; X4는 E, V, 또는 L이고; X5는 K 또는 R이고; X6은 E 또는 Q이고; X7은 H, P, 또는 R이고; X8은 L, T, S, 또는 G이고; X9는 A이고; 그리고 X10은 V 또는 I이고; 그리고 여기서 상기 SIRP-α D1 변이체는 서열 번호: 1에 따른 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 최소한 2개의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체는 서열 번호: 78-85 중에서 한 가지에 따른 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체는 아미노산 서열, EEELQX1IQPDKSVLVAAGETATLRCTX2TSLX3PVGPIQWFRGAGPGRX4LIYNQX5X6GX7FPRVTTVSDX8TKRNNMDFSIRIGX9X10X11X12ADAGTYYCX13KFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS (서열 번호: 218)를 포함하고, 여기서 X1은 V, L, 또는 I이고; X2는 A, V, L, 또는 I이고; X3은 I, S, T, 또는 F이고; X4는 E, L, 또는 V이고; X5는 K 또는 R이고; X6은 E 또는 Q이고; X7은 H, R, 또는 P이고; X8은 S, G, L, 또는 T이고; X9는 임의의 아미노산이고; X10은 임의의 아미노산이고; X11은 임의의 아미노산이고; X12는 임의의 아미노산이고; 그리고 X13은 V 또는 I이고; 그리고 여기서 상기 SIRP-α D1 변이체는 서열 번호: 1에 따른 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 최소한 2개의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 구체예에서, X9는 A이다. 일부 구체예에서, X9는 N이다. 일부 구체예에서, X10은 I이다. 일부 구체예에서, X9는 N이고 X10은 P이다. 일부 구체예에서, X9는 N이고 X11은 S, T, 또는 C 이외에 임의의 아미노산이다. 일부 구체예에서, X11은 T이다. 일부 구체예에서, X11은 T 이외에 아미노산이다. 일부 구체예에서, X12는 P이다. 일부 구체예에서, X9는 N이고 X12는 P 이외에 임의의 아미노산이다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체는 아미노산 서열, EEELQX1IQPDKSVLVAAGETATLRCTX2TSLX3PVGPIQWFRGAGPGRX4LIYNQX5X6GX7FPRVTTVSDX8TKRNNMDFSIRIGX9ITX10ADAGTYYCX11KFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS (서열 번호: 219)를 포함하고, 여기서 X1은 V, L, 또는 I이고; X2는 A, V, L, 또는 I이고; X3은 I, S, T, 또는 F이고; X4는 E, L, 또는 V이고; X5는 K 또는 R이고; X6은 E 또는 Q이고; X7은 H, R, 또는 P이고; X8은 S, G, L, 또는 T이고; X9는 N이고; X10은 P 이외에 임의의 아미노산이고; 그리고 X11은 V 또는 I이고; 그리고 여기서 상기 SIRP-α D1 변이체는 서열 번호: 1에 따른 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 최소한 2개의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체는 아미노산 서열, EEELQX1IQPDKSVLVAAGETATLRCTX2TSLX3PVGPIQWFRGAGPGRELIYNQX4EGX5FPRVTTVSDX6TKRNNMDFSIRIGX7ITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS (서열 번호: 52)를 포함하고, 여기서 X1은 V, L, 또는 I이고; X2는 A, I, 또는 L이고; X3은 I, T, S, 또는 F이고; X4는 K 또는 R이고; X5는 H, P, 또는 R이고; X6은 L, T, 또는 G이고; 그리고 X7은 A이고; 그리고 여기서 상기 SIRP-α D1 변이체는 서열 번호: 1에 따른 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 최소한 2개의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 구체예에서, X1은 V 또는 I이고, X2는 A 또는 I이고, X3은 I 또는 F이고, X4는 K 또는 R이고, X5는 H 또는 P이고, X6은 L 또는 T이고, 그리고 X7은 A이다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체는 서열 번호: 1에 따른 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 최소한 3개의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체는 서열 번호: 1에 따른 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 최소한 4개의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체는 서열 번호: 1에 따른 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 최소한 5개의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체는 서열 번호: 1에 따른 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 최소한 6개의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체는 서열 번호: 1에 따른 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 최소한 7개의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 구체예에서, X1은 I이다. 일부 구체예에서, X2는 I이다. 일부 구체예에서, X3은 F이다. 일부 구체예에서, X4는 R이다. 일부 구체예에서, X5는 P이다. 일부 구체예에서, X6은 T이다. 일부 구체예에서, X1, X2, X3, X4, X5 및 X6 각각은 야생형 아미노산이 아니다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체는 서열 번호: 81-85 중에서 한 가지에 따른 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체는 아미노산 서열, EEELQX1IQPDKSVSVAAGESAILHCTX2TSLX3PVGPIQWFRGAGPARELIYNQX4EG X5FPRVTTVSEX6TKRENMDFSISISX7ITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPS (서열 번호: 212)를 포함하고, 여기서 X1은 V, L, 또는 I이고; X2는 V, I, 또는 L이고; X3은 I, T, S, 또는 F이고; X4는 K 또는 R이고; X5는 H, P, 또는 R이고; X6은 S, T, 또는 G이고; 그리고 X7은 A이고; 그리고 여기서 상기 SIRP-α D1 변이체는 서열 번호: 2의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 최소한 2개의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 약 5 x 10 -9 M보다 적은 KD로 인간 CD47에 결합한다. 일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 폴리펩티드의 N 말단 또는 C 말단에 연결된 Fc 도메인 단위체를 더욱 포함하고, 여기서 상기 Fc 도메인 단위체는 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4 Fc 영역이다. 일부 구체예에서, Fc 도메인 단위체는 야생형 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4 Fc 영역에 비하여 최소한 하나의 돌연변이를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 135, 서열 번호: 136, 또는 서열 번호: 137 중에서 한 가지의 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, Fc 도메인 단위체는 (a) 야생형 인간 IgG1에 비하여 다음의 아미노산 치환 중에서 한 가지: T366W, T366S, L368A, Y407V, T366Y, T394W, F405W, Y349T, Y349E, Y349V, L351T, L351H, L351N, L351K, P353S, S354D, D356K, D356R, D356S, E357K, E357R, E357Q, S364A, T366E, L368T, L368Y, L368E, K370E, K370D, K370Q, K392E, K392D, T394N, P395N, P396T, V397T, V397Q, L398T, D399K, D399R, D399N, F405T, F405H, F405R, Y407T, Y407H, Y407I, K409E, K409D, K409T, 또는 K409I; 또는 (b) (i) 인간 IgG1 Fc 영역에 비하여 N297A 돌연변이; (ii) 인간 IgG1 Fc 영역에 비하여 L234A, L235A 및 G237A 돌연변이; (iii) 인간 IgG1 Fc 영역에 비하여 L234A, L235A, G237A 및 N297A 돌연변이; (iv) 인간 IgG2 Fc 영역에 비하여 N297A 돌연변이; (v) 인간 IgG2 Fc 영역에 비하여 A330S 및 P331S 돌연변이; (vi) 인간 IgG2 Fc 영역에 비하여 A330S, P331S 및 N297A 돌연변이; (vii) 인간 IgG4 Fc 영역에 비하여 S228P, E233P, F234V, L235A 및 delG236 돌연변이; 또는 (viii) 인간 IgG4 Fc 영역에 비하여 S228P, E233P, F234V, L235A, delG236 및 N297A 돌연변이를 포함한다. 일부 구체예에서, Fc 도메인 단위체는 (a) 야생형 인간 IgG1에 비하여 다음의 아미노산 치환 중에서 한 가지: T366W, T366S, L368A, Y407V, T366Y, T394W, F405W, Y349T, Y349E, Y349V, L351T, L351H, L351N, L351K, P353S, S354D, D356K, D356R, D356S, E357K, E357R, E357Q, S364A, T366E, L368T, L368Y, L368E, K370E, K370D, K370Q, K392E, K392D, T394N, P395N, P396T, V397T, V397Q, L398T, D399K, D399R, D399N, F405T, F405H, F405R, Y407T, Y407H, Y407I, K409E, K409D, K409T, 또는 K409I를 포함하고; 그리고 (b) Fc 도메인 단위체는 (i) 인간 IgG1 Fc 영역에 비하여 N297A 돌연변이; (ii) 인간 IgG1 Fc 영역에 비하여 L234A, L235A 및 G237A 돌연변이; (iii) 인간 IgG1 Fc 영역에 비하여 L234A, L235A, G237A 및 N297A 돌연변이; (iv) 인간 IgG2 Fc 영역에 비하여 N297A 돌연변이; (v) 인간 IgG2 Fc 영역에 비하여 A330S 및 P331S 돌연변이; (vi) 인간 IgG2 Fc 영역에 비하여 A330S, P331S 및 N297A 돌연변이; (vii) 인간 IgG4 Fc 영역에 비하여 S228P, E233P, F234V, L235A 및 delG236 돌연변이; 또는 (viii) 인간 IgG4 Fc 영역에 비하여 S228P, E233P, F234V, L235A, delG236 및 N297A 돌연변이를 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 야생형 인간 IgG Fc 영역을 갖는 폴리펩티드와 비교하여 식균작용 검정에서 식균작용의 감소를 전시한다. 일부 구체예에서, Fc 도메인 단위체는 두 번째 Fc 도메인 단위체를 포함하는 두 번째 폴리펩티드에 연결되어 Fc 도메인 이합체를 형성한다. 일부 구체예에서, 두 번째 Fc 도메인 단위체는 추가 폴리펩티드에 연결된다. 일부 구체예에서, 추가 폴리펩티드는 항체 가변 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체 가변 도메인은 세포에서 발현된 항원을 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 세포는 암 세포이다. 일부 구체예에서, 항체 가변 도메인은 면역 세포 조절에 관련된 세포 표면 단백질을 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 추가 폴리펩티드는 치료적 단백질을 포함한다. 일부 구체예에서, 치료적 단백질은 사이토킨, 인터류킨, 항원, 스테로이드, 항염증제, 또는 면역조정제이다. 일부 구체예에서, 추가 폴리펩티드는 SIRP-α D1 변이체를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 인간 혈청 알부민 (HSA) (서열 번호: 12)을 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, HSA는 서열 번호: 12에 비하여 C34S 또는 K573P 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 152-159 중에서 한 가지에 따른 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 알부민 결합 펩티드를 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 알부민 결합 펩티드는 아미노산 서열 DICLPRWGCLW (서열 번호: 160)를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 중합체를 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, PEG 중합체는 폴리펩티드 내에 시스테인 치환에 연결된다.
일정한 구체예에서, 다음을 포함하는 폴리펩티드가 본원에서 개시된다: 신호-조절 단백질 α (SIRP-α) D1 변이체, 여기서 상기 SIRP-α D1 변이체는 아미노산 서열, EEX1X2QX3IQPDKX4VX5VAAGEX6X7X8LX9CTX10TSLX11PVGPIQWFRGAGPX12RX13LIYNQX14X15GX16FPRVTTVSX17X18TX19RX20NMDFX21IX22IX23X24ITX25ADAGTYYCX26KX27RKGSPDX28X29EX30KSGAGTELSVRX31KPS (서열 번호: 47)를 포함하고, 여기서 X1은 E, 또는 G이고; X2는 L, I, 또는 V이고; X3은 V, L, 또는 I이고; X4는 S, 또는 F이고; X5는 L, 또는 S이고; X6은 S, 또는 T이고; X7은 A, 또는 V이고; X8은 I, 또는 T이고; X9는 H, R, 또는 L이고; X10은 A, V, I, 또는 L이고; X11은 I, T, S, 또는 F이고; X12는 A, 또는 G이고; X13은 E, V, 또는 L이고; X14는 K, 또는 R이고; X15는 E, 또는 Q이고; X16은 H, P, 또는 R이고; X17은 D, 또는 E이고; X18은 S, L, T, 또는 G이고; X19는 K, 또는 R이고; X20은 E, 또는 N이고; X21은 S, 또는 P이고; X22는 S, 또는 R이고; X23은 S, 또는 G이고; X24는 임의의 아미노산이고; X25는 임의의 아미노산이고; X26은 V, 또는 I이고; X27은 F, L, 또는 V이고; X28은 D 또는 부재하고; X29는 T, 또는 V이고; X30은 F, 또는 V이고; 그리고 X31은 A, 또는 G이고; 그리고 여기서 상기 SIRP-α D1 변이체는 서열 번호: 1 내지 10 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 최소한 2개의 아미노산 치환을 갖고; 그리고 2개의 Fc 도메인 단위체를 갖는 Fc 도메인 이합체를 포함하는 Fc 변이체, 여기서 각 Fc 도메인 단위체는 독립적으로 (i) N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG1 Fc 영역; (ii) L234A, L235A 및 G237A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG1 Fc 영역; (iii) L234A, L235A, G237A 및 N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG1 Fc 영역; (iv) N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG2 Fc 영역; (v) A330S 및 P331S 돌연변이를 포함하는 인간 IgG2 Fc 영역; (vi) A330S, P331S 및 N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG2 Fc 영역; (vii) S228P, E233P, F234V, L235A 및 delG236 돌연변이를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역; 또는 (viii) S228P, E233P, F234V, L235A, delG236 및 N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역. 일부 구체예에서, Fc 도메인 이합체 내에 Fc 도메인 단위체 중에서 한 가지는 L234A, L235A, G237A 및 N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG1 Fc 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 98-104, 107-113, 116-122, 또는 135-137 중에서 한 가지에 따른 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, Fc 변이체는 인간 IgG Fc 영역의 야생형 버전과 비교하여 Fcγ 수용체에 제거된 또는 감소된 결합을 전시한다. 일부 구체예에서, IgG1 또는 IgG2 Fc 변이체는 인간 IgG1 또는 IgG2 Fc 영역의 야생형 버전과 비교하여 CD16a, CD32a, CD32b, CD32c 및 CD64 Fcγ 수용체에 제거된 또는 감소된 결합을 전시한다. 일부 구체예에서, IgG4 Fc 변이체는 인간 IgG4 Fc 영역의 야생형 버전과 비교하여 CD16a 및 CD32b Fcγ 수용체에 제거된 또는 감소된 결합을 전시한다. 일부 구체예에서, IgG1 또는 IgG2 Fc 변이체는 인간 IgG1 또는 IgG2 Fc 융합의 야생형 버전과 비교하여 C1q에 제거된 또는 감소된 결합을 전시한다. 일부 구체예에서, Fc 변이체는 약 5 x 10-6 M보다 큰 KD로 Fcγ 수용체에 결합한다.
일정한 구체예에서, Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드가 본원에서 개시되고, 여기서 상기 Fc 변이체는 2개의 Fc 도메인 단위체를 갖는 Fc 도메인 이합체를 포함하고, 여기서 각 Fc 도메인 단위체는 독립적으로 (i) 돌연변이 L234A, L235A, G237A 및 N297A로 구성되는 인간 IgG1 Fc 영역; (ii) 돌연변이 A330S, P331S 및 N297A로 구성되는 인간 IgG2 Fc 영역; 또는 (iii) 돌연변이 S228P, E233P, F234V, L235A, delG236 및 N297A를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역에서 선택된다. 일부 구체예에서, Fc 도메인 단위체 중에서 최소한 하나는 돌연변이 L234A, L235A, G237A 및 N297A로 구성되는 인간 IgG1 Fc 영역이다. 일부 구체예에서, Fc 도메인 단위체 중에서 최소한 하나는 돌연변이 A330S, P331S 및 N297A로 구성되는 인간 IgG2 Fc 영역이다. 일부 구체예에서, Fc 변이체는 인간 IgG Fc 영역의 야생형 버전과 비교하여 Fcγ 수용체에 제거된 또는 감소된 결합을 전시한다. 일부 구체예에서, Fc 변이체는 인간 IgG Fc 영역의 야생형 버전과 비교하여 CD16a, CD32a, CD32b, CD32c 및 CD64 Fcγ 수용체에 제거된 또는 감소된 결합을 전시한다. 일부 구체예에서, Fc 변이체는 인간 IgG Fc 융합의 야생형 버전과 비교하여 C1q에 제거된 또는 감소된 결합을 전시한다. 일부 구체예에서, Fc 도메인 단위체 중에서 최소한 하나는 돌연변이 S228P, E233P, F234V, L235A, delG236 및 N297A를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역이다. 일부 구체예에서, Fc 변이체는 야생형 인간 IgG4 Fc 영역과 비교하여 Fcγ 수용체에 제거된 또는 감소된 결합을 전시한다. 일부 구체예에서, Fc 변이체는 이의 인간 IgG4 Fc 영역의 야생형 버전과 비교하여 CD16a 및 CD32b Fcγ 수용체에 제거된 또는 감소된 결합을 전시한다. 일부 구체예에서, Fc 변이체는 약 5 x 10-6 M보다 큰 KD로 Fcγ 수용체에 결합한다. 일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 CD47 결합 폴리펩티드를 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, Fc 변이체는 인간 IgG Fc 영역의 야생형 버전과 비교하여 Fcγ 수용체에 제거된 또는 감소된 결합을 전시한다. 일부 구체예에서, CD47 결합 폴리펩티드는 설치류 및 비인간 영장류에서 급성 빈혈을 유발하지 않는다. 일부 구체예에서, CD47 결합 폴리펩티드는 인간에서 급성 빈혈을 유발하지 않는다. 일부 구체예에서, CD47 결합 폴리펩티드는 신호-조절 단백질 α (SIRP-α) 폴리펩티드 또는 이의 단편이다. 일부 구체예에서, SIRP-α 폴리펩티드는 아미노산 서열, EEELQX1IQPDKSVLVAAGETATLRCTX2TSLX3PVGPIQWFRGAGPGRX4LIYNQX5EGX6FPRVTTVSDX7TKRNNMDFSIRIGX8ITPADAGTYYCX9KFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS (서열 번호: 51)를 포함하는 SIRP-α D1 변이체를 포함하고, 여기서 X1은 V 또는 I이고; X2는 A 또는 I이고; X3은 I 또는 F이고; X4는 E 또는 V이고; X5는 K 또는 R이고; X6은 H 또는 P이고; X7은 L 또는 T이고; X8은 N 이외에 임의의 아미노산이고; 그리고 X9는 V 또는 I이다. 일부 구체예에서, SIRP-α 폴리펩티드는 SIRP-α D1 변이체를 포함하고, 여기서 X1은 V 또는 I이고; X2는 A 또는 I이고; X3은 I 또는 F이고; X4는 E이고; X5는 K 또는 R이고; X6은 H 또는 P이고; X7은 L 또는 T이고; X8은 N이 아니고; 그리고 X9는 V이다.
일정한 구체예에서, 다음을 포함하는 폴리펩티드가 본원에서 개시된다: 신호-조절 단백질 α (SIRP-α) D1 변이체, 여기서 상기 SIRP-α D1 변이체는 비자연발생 높은 친화성 SIRP-α D1 도메인이고, 여기서 상기 SIRP-α D1 변이체는 자연발생 D1 도메인의 친화성보다 최소한 10배 큰 친화성으로 인간 CD47에 결합하고; 그리고 Fc 도메인 단위체, 여기서 상기 Fc 도메인 단위체는 두 번째 Fc 도메인 단위체를 포함하는 두 번째 폴리펩티드에 연결되어 Fc 도메인을 형성하고, 여기서 상기 Fc 도메인은 제거된 또는 감소된 작동체 기능을 갖는다. 일부 구체예에서, 비자연발생 높은 친화성 SIRP-α D1 도메인은 잔기 80에서 아미노산 돌연변이를 포함한다.
일정한 구체예에서, 신호-조절 단백질 α (SIRP-α) D1 변이체를 포함하는 폴리펩티드가 본원에서 개시되고, 여기서 상기 SIRP-α D1 변이체는 250 nM보다 적은 KD로 첫 번째 종으로부터 CD47에 결합하고; 그리고 여기서 상기 SIRP-α D1 변이체는 250 nM보다 적은 KD로 두 번째 종으로부터 CD47에 결합하고; 그리고 첫 번째 종으로부터 CD47에 대한 KD 및 두 번째 종으로부터 CD47에 대한 KD는 서로의 100 배 범위 안에 있고; 여기서 첫 번째 종 및 두 번째 종은 인간, 설치류 및 비인간 영장류로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체는 최소한 3가지 상이한 종으로부터 CD47에 결합한다. 일부 구체예에서, 비인간 영장류는 시노몰구스 원숭이이다.
일정한 구체예에서, 다음을 포함하는 폴리펩티드가 본원에서 개시된다: (a) 250 nM보다 적은 KD로 인간 CD47에 결합하는 신호-조절 단백질 α (SIRP-α) D1 도메인; 및 (b) SIRP-α D1 도메인의 N 말단 또는 C 말단에 연결된 Fc 도메인 단위체, 여기서 상기 폴리펩티드는 설치류 및 비인간 영장류에서 급성 빈혈을 유발하지 않는다. 일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 인간 SIRP-α의 비자연발생 변이체이다. 일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드의 생체내 투여는 투여 후 첫 번째 주 동안 50%보다 적게 헤모글로빈 감소를 유발한다. 일부 구체예에서, 인간에서 상기 폴리펩티드의 투여는 투여 후 첫 번째 주 동안 50%보다 적게 헤모글로빈 감소를 유발한다. 일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 최소한 하나의 Fc 변이체를 더욱 포함하고, 여기서 상기 Fc 변이체는 (i) 돌연변이 L234A, L235A, G237A 및 N297A로 구성되는 인간 IgG1 Fc 영역; (ii) 돌연변이 A330S, P331S 및 N297A로 구성되는 인간 IgG2 Fc 영역; 또는 (iii) 돌연변이 S228P, E233P, F234V, L235A, delG236 및 N297A를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역에서 선택된다. 일부 구체예에서, Fc 변이체는 돌연변이 L234A, L235A, G237A 및 N297A로 구성되는 인간 IgG1 Fc 영역이다. 일부 구체예에서, Fc 변이체는 돌연변이 A330S, P331S 및 N297A로 구성되는 인간 IgG2 Fc 영역이다. 일부 구체예에서, Fc 변이체는 돌연변이 S228P, E233P, F234V, L235A, delG236 및 N297A를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역이다.
일정한 구체예에서, 질환 또는 장애를 앓는 개체를 치료하는 방법이 본원에서 개시되고, 상기 방법은 본원에서 개시된 폴리펩티드를 개체에 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 80에서 아미노산 돌연변이; 및 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 6, 잔기 27, 잔기 31, 잔기 47, 잔기 53, 잔기 54, 잔기 56, 잔기 66 및 잔기 92로 구성된 군에서 선택되는 잔기에서 최소한 하나의 추가 아미노산 돌연변이를 갖는 SIRP-α D1 도메인을 포함하는 신호-조절 단백질 α (SIRP-α) D1 변이체, 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 다음을 포함한다: 신호-조절 단백질 α (SIRP-α) D1 변이체, 여기서 상기 SIRP-α D1 변이체는 아미노산 서열, EEX1X2QX3IQPDKX4VX5VAAGEX6X7X8LX9CTX10TSLX11PVGPIQWFRGAGPX12RX13LIYNQX14X15GX16FPRVTTVSX17X18TX19RX20NMDFX21IX22IX23X24ITX25ADAGTYYCX26KX27RKGSPDX28X29EX30KSGAGTELSVRX31KPS (서열 번호: 47)를 포함하고, 여기서 X1은 E, 또는 G이고; X2는 L, I, 또는 V이고; X3은 V, L, 또는 I이고; X4는 S, 또는 F이고; X5는 L, 또는 S이고; X6은 S, 또는 T이고; X7은 A, 또는 V이고; X8은 I, 또는 T이고; X9는 H, R, 또는 L이고; X10은 A, V, I, 또는 L이고; X11은 I, T, S, 또는 F이고; X12는 A, 또는 G이고; X13은 E, V, 또는 L이고; X14는 K, 또는 R이고; X15는 E, 또는 Q이고; X16은 H, P, 또는 R이고; X17은 D, 또는 E이고; X18은 S, L, T, 또는 G이고; X19는 K, 또는 R이고; X20은 E, 또는 N이고; X21은 S, 또는 P이고; X22는 S, 또는 R이고; X23은 S, 또는 G이고; X24는 임의의 아미노산이고; X25는 임의의 아미노산이고; X26은 V, 또는 I이고; X27은 F, L, 또는 V이고; X28은 D 또는 부재하고; X29는 T, 또는 V이고; X30은 F, 또는 V이고; 그리고 X31은 A, 또는 G이고; 그리고 여기서 상기 SIRP-α D1 변이체는 서열 번호: 1 내지 10 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 최소한 2개의 아미노산 치환을 갖고; 그리고 2개의 Fc 도메인 단위체를 갖는 Fc 도메인 이합체를 포함하는 Fc 변이체, 여기서 각 Fc 도메인 단위체는 독립적으로 (i) N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG1 Fc 영역; (ii) L234A, L235A 및 G237A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG1 Fc 영역; (iii) L234A, L235A, G237A 및 N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG1 Fc 영역; (iv) N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG2 Fc 영역; (v) A330S 및 P331S 돌연변이를 포함하는 인간 IgG2 Fc 영역; (vi) A330S, P331S 및 N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG2 Fc 영역; (vii) S228P, E233P, F234V, L235A 및 delG236 돌연변이를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역; 또는 (viii) S228P, E233P, F234V, L235A, delG236 및 N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역. 일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 Fc 변이체를 포함하고, 여기서 상기 Fc 변이체는 2개의 Fc 도메인 단위체를 갖는 Fc 도메인 이합체를 포함하고, 여기서 각 Fc 도메인 단위체는 독립적으로 (i) 돌연변이 L234A, L235A, G237A 및 N297A로 구성되는 인간 IgG1 Fc 영역; (ii) 돌연변이 A330S, P331S 및 N297A로 구성되는 인간 IgG2 Fc 영역; 또는 (iii) 돌연변이 S228P, E233P, F234V, L235A, delG236 및 N297A를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역에서 선택된다. 일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 다음을 포함한다: 신호-조절 단백질 α (SIRP-α) D1 변이체, 여기서 상기 SIRP-α D1 변이체는 비자연발생 높은 친화성 SIRP-α D1 도메인이고, 여기서 상기 SIRP-α D1 변이체는 자연발생 D1 도메인의 친화성보다 최소한 10배 큰 친화성으로 인간 CD47에 결합하고; 그리고 Fc 도메인 단위체, 여기서 상기 Fc 도메인 단위체는 두 번째 Fc 도메인 단위체를 포함하는 두 번째 폴리펩티드에 연결되어 Fc 도메인을 형성하고, 여기서 상기 Fc 도메인은 제거된 또는 감소된 작동체 기능을 갖는다. 일부 구체예에서, 비자연발생 높은 친화성 SIRP-α D1 도메인은 잔기 80에서 아미노산 돌연변이를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 신호-조절 단백질 α (SIRP-α) D1 변이체를 포함하고, 여기서 상기 SIRP-α D1 변이체는 250 nM보다 적은 KD로 첫 번째 종으로부터 CD47에 결합하고; 그리고 여기서 상기 SIRP-α D1 변이체는 250 nM보다 적은 KD로 두 번째 종으로부터 CD47에 결합하고; 그리고 첫 번째 종으로부터 CD47에 대한 KD 및 두 번째 종으로부터 CD47에 대한 KD는 서로의 100 배 범위 안에 있고; 여기서 첫 번째 종 및 두 번째 종은 인간, 설치류 및 비인간 영장류로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 (a) 250 nM보다 적은 KD로 인간 CD47에 결합하는 신호-조절 단백질 α (SIRP-α) D1 도메인; 및 (b) SIRP-α D1 도메인의 N 말단 또는 C 말단에 연결된 Fc 도메인 단위체를 포함하고, 여기서 상기 폴리펩티드는 설치류 및 비인간 영장류에서 급성 빈혈을 유발하지 않는다. 일부 구체예에서, 질환 또는 장애는 암, 자가면역 질환, 또는 염증성 질환이다. 일부 구체예에서, 질환 또는 장애는 암이고, 그리고 상기 암은 고형 종양 암, 혈액암, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 다발성 골수종, 방광암, 췌장암, 자궁경부암, 자궁내막암, 폐암, 기관지암, 간암, 난소암, 결장 및 직장암, 위암, 위암, 담낭암, 위장관 간질성 종양 암, 갑상선암, 두경부암, 구인두암, 식도암, 흑색종, 비흑색종 피부암, 메르켈 세포 암종, 바이러스로 유도된 암, 신경모세포종, 유방암, 전립선암, 신장암, 신장 세포 암, 신우 암, 백혈병, 림프종, 육종, 신경교종, 뇌 종양 및 암종에서 선택된다. 일부 구체예에서, 질환 또는 장애는 자가면역 질환 또는 염증성 질환이고, 그리고 상기 자가면역 질환 또는 염증성 질환은 다발성 경화증, 류마티스성 관절염, 척추관절병증, 전신성 홍반성 루푸스, 항체-매개된 염증성 또는 자가면역 질환, 이식편 대 숙주 질환, 패혈증, 당뇨병, 건선, 죽상경화증, 쇼그렌 증후군, 진행성 전신 경화증, 경피증, 급성 관상 증후군, 허혈성 재관류, 크론병, 자궁내막증, 사구체신염, 중증 근무력증, 특발성 폐섬유증, 천식, 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 혈관염 및 염증성 자가면역 근염에서 선택된다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체는 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는다: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159. 일부 구체예에서, 상기 방법은 최소한 하나의 추가 작용제를 투여하는 것을 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 최소한 하나의 추가 작용제는 항체, 종양 연관된 항원, 또는 비항체 치료제이다. 일부 구체예에서, 최소한 2개의 추가 작용제가 투여된다. 일부 구체예에서, 최소한 2개의 추가 작용제는 2개의 항체를 포함한다. 일부 구체예에서, 최소한 2개의 추가 작용제는 항체 및 종양 연관된 항원을 포함한다. 일부 구체예에서, 최소한 하나의 추가 작용제는 항체이다. 일부 구체예에서, 항체는 인간 IgG1 아이소타입 항체이다. 일부 구체예에서, 항체는 인간 IgG2 아이소타입 항체이다. 일부 구체예에서, 항체는 인간 IgG4 아이소타입 항체이다. 일부 구체예에서, 항체는 항-HER2 항체, 항-CD20 항체, 항-CD19 항체, 항-CS1 항체, 항-CD38 항체, 항-EGFR 항체, 항-PD1 항체, 항-OX40 항체, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CD274 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-CD137 항체, 항-4-1BB 항체, 항-B7-H3 항체, 항-FZD7 항체, 항-CD27 항체, 항-CCR4 항체, 항-CD38 항체, 항-CSF1R 항체, 항-CSF 항체, 항-CD30 항체, 항-BAFF 항체, 항-VEGF 항체, 또는 항-VEGFR2 항체에서 선택된다. 일부 구체예에서, 항체는 항-HER2 항체, 항-CD20 항체, 항-CD19 항체, 항-CS1 항체, 항-CD38 항체, 항-PD-1 항체, 항-RANKL 항체, 또는 항-PD-L1 항체에서 선택된다. 일부 구체예에서, 최소한 하나의 추가 작용제는 최소한 하나의 항체이고, 그리고 상기 항체는 세툭시맙, 네시투무맙, 펨브로리주맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, MEDI0680, MED16469, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MEDI6383, RG7888, 이플리무맙, 트레멜리무맙, 우렐루맙, PF-05082566, 에노블리투주맙, 반틱투맙, 바릴루맙, 모가말리주맙, SAR650984, 다라투무맙, 트라스투주맙, 트라스투주맙 엠탄신, 페르투주맙, 엘로투주맙, 리툭시맙, 오파투무맙, 오비누투주맙, RG7155, FPA008, 파니투무맙, 브렌툭시맙 베도틴, MSB0010718C, 벨리무맙, 베바시주맙, 데노수맙, 파니투무맙, 라무시루맙, 네시투무맙, 니볼루맙, 펨브로리주맙, 아벨루맙, 아테졸리주맙, 더발루맙, MEDI0680, 피딜리주맙, 또는 BMS-93659에서 선택된다. 일부 구체예에서, 항체는 트라스투주맙이다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체는 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는다: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159. 일부 구체예에서, 항체는 리툭시맙이다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체는 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는다: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159. 일부 구체예에서, 항체는 세툭시맙이다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체는 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는다: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159. 일부 구체예에서, 항체는 다라투무맙이다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체는 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는다: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159. 일부 구체예에서, 항체는 벨리무맙이다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체는 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는다: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159. 일부 구체예에서, 항체는 베바시주맙이다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체는 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는다: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159. 일부 구체예에서, 항체는 데노수맙이다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체는 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는다: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159. 일부 구체예에서, 항체는 파니투무맙이다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체는 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는다: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159. 일부 구체예에서, 항체는 라무시루맙이다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체는 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는다: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159. 일부 구체예에서, 항체는 네시투무맙이다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체는 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는다: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159. 일부 구체예에서, 항체는 니볼루맙이다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체는 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는다: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159. 일부 구체예에서, 항체는 펨브로리주맙이다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체는 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는다: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159. 일부 구체예에서, 항체는 아벨루맙이다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체는 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는다: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159. 일부 구체예에서, 항체는 아테졸리주맙이다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체는 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는다: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159. 일부 구체예에서, 항체는 더발루맙이다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체는 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는다: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159. 일부 구체예에서, 항체는 MEDI0680이다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체는 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는다: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159. 일부 구체예에서, 항체는 피딜리주맙이다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체는 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는다: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159. 일부 구체예에서, 항체는 BMS-93659이다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체는 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는다: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159. 일부 구체예에서, 최소한 하나의 추가 작용제는 종양 연관된 항원이고, 그리고 상기 종양 연관된 항원은 면역 반응을 이끌어낸다. 일부 구체예에서, 최소한 하나의 추가 작용제는 항체이고, 그리고 상기 항체는 HLA/펩티드 또는 MHC/펩티드 복합체를 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 항체는 NY-ESO-1/LAGE1, SSX-2, MAGE 패밀리 (MAGE-A3), gp100/pmel17, 멜란-A/MART-1, gp75/TRP1, 티로시나아제, TRP2, CEA, PSA, TAG-72, 미성숙 라미닌 수용체, MOK/RAGE-1, WT-1, Her2/neu, EphA3, SAP-1, BING-4, Ep-CAM, MUC1, PRAME, 서바이빈, 메소텔린, BRCA1/2 (돌연변이된), CDK4, CML66, MART-2, p53 (돌연변이된), Ras (돌연변이된), β-카테닌 (돌연변이된), TGF-βRII (돌연변이된), HPV E6, 또는 E7을 포함하는 HLA/펩티드 또는 MHC/펩티드 복합체를 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 항체는 ESK1, RL1B, Pr20, 또는 3.2G1이다.
도면의 간단한 설명
본 발명의 신규한 특질은 첨부된 청구항에서 구체적으로 진술된다. 본 발명의 특질과 이점의 더욱 충분한 이해는 본 발명의 원리가 활용되는 예시적인 구체예를 진술하는 아래의 상세한 설명, 그리고 첨부 도면을 참조함으로써 획득될 것이다:
도면 1은 첫 번째 Fc 도메인 단위체에 결합된 SIRP-α D1 도메인 또는 이의 변이체를 포함하는 SIRP-α 구조체의 도해인데, 이것은 두 번째 Fc 도메인 단위체와 Fc 도메인을 형성한다;
도면 2는 첫 번째 Fc 도메인 단위체에 결합된 SIRP-α D1 도메인 또는 이의 변이체 및 두 번째 Fc 도메인 단위체에 결합된 항체 가변 도메인을 포함하는 SIRP-α 구조체의 도해인데, 여기서 첫 번째 Fc 도메인 단위체 및 두 번째 Fc 도메인 단위체는 합동하여 Fc 도메인을 형성한다;
도면 3은 첫 번째 Fc 도메인 단위체에 결합된 SIRP-α D1 도메인 또는 이의 변이체 및 두 번째 Fc 도메인 단위체에 결합된 치료적 단백질을 포함하는 SIRP-α 구조체의 도해인데, 여기서 첫 번째 Fc 도메인 단위체 및 두 번째 Fc 도메인 단위체는 합동하여 Fc 도메인을 형성한다;
도면 4a는 노브 (knob) 돌연변이를 갖는 첫 번째 Fc 도메인 단위체에 결합된 SIRP-α D1 도메인 또는 이의 변이체를 포함하는 SIRP-α 구조체의 도해인데, 이것은 홀 (hole) 돌연변이를 갖는 두 번째 Fc 도메인 단위체와 Fc 도메인을 형성하고; 도면 4b는 홀 돌연변이를 갖는 첫 번째 Fc 도메인 단위체에 결합된 SIRP-α D1 도메인 또는 이의 변이체를 포함하는 SIRP-α 구조체의 도해이고, 이것은 노브 돌연변이를 갖는 두 번째 Fc 도메인 단위체와 Fc 도메인을 형성한다;
도면 5a는 Fc 도메인 단위체에 결합된 SIRP-α D1 도메인 또는 이의 변이체를 포함하는 SIRP-α 구조체의 도해이고; 도면 5b는 도면 5a에서 도해된 구조체의 동종이합체인 SIRP-α 구조체의 도해이다;
도면 6은 SIRP-α D1 도메인을 포함하는 단일기능성 및 이중기능성 SIRP-α 구조체에 대한 SPR 결합 데이터를 예시한다;
도면 7은 변하는 농도의 SIRP-α 폴리펩티드 구조체의 존재에서 인간 단핵구-유래된 대식세포에 의한 DLD-1-GFP-루시페라아제 종양 세포의 식균작용을 예시한다;
도면 8은 변하는 농도의 SIRP-α 폴리펩티드 구조체의 존재에서 인간 단핵구-유래된 대식세포에 의한 DLD-1-GFP-루시페라아제 종양 세포의 식균작용을 예시한다;
도면 9는 변하는 농도의 SIRP-α 폴리펩티드 구조체의 존재에서 인간 단핵구-유래된 대식세포에 의한 DLD-1-GFP-루시페라아제 종양 세포의 식균작용을 예시한다;
도면 10은 규정된 기간에 걸쳐 SIRP-α 폴리펩티드의 반감기 안정성을 예시한다;
도면 11은 SIRP-α 폴리펩티드 구조체에 대한 혈구응집 검정 데이터를 예시한다;
도면 12는 SIRP-α 폴리펩티드 구조체 및 항-mPD-L1로 처리된 생쥐 동계 종양 모형의 생존 곡선을 예시한다;
도면 13은 항-mPD-L1과 합동으로 SIRP-α 폴리펩티드 구조체로 처리된 생쥐 동계 종양 모형의 종양 체적 분석을 예시한다;
도면 14는 SIRP-α - Fc 융합에 대한 다양한 농도의 C1q 보체의 결합을 예시한다;
도면 15는 변하는 농도의 SIRP-α 폴리펩티드 구조체의 존재에서 인간 단핵구-유래된 대식세포에 의한 MM1R 세포의 식균작용을 예시한다;
도면 16은 변하는 농도의 SIRP-α 폴리펩티드 구조체의 존재에서 인간 단핵구-유래된 대식세포에 의한 MM1R 세포의 식균작용을 예시한다;
도면 17은 변하는 농도의 SIRP-α 폴리펩티드 구조체의 존재에서 인간 단핵구-유래된 대식세포에 의한 N87 세포의 식균작용을 예시한다;
도면 18은 P83V 돌연변이를 갖는 SIRP-α D1 변이체의 분자량 분석을 예시한다;
도면 19a는 리툭시맙과 함께 또는 이것 없이 다양한 SIRP-α 구조체로 처리된 암의 NOD scid 감마 (NSG) 생쥐 모형에서 인간 GFP-Luc-Raji 림프종 세포의 종양 성장을 예시한다; 도면 19b는 도면 19a에서 설명된 종양의 종양 체적의 산점도를 예시한다; 도면 19c는 도면 19a에서 설명된 처리된 생쥐의 헤모글로빈 값을 예시한다; 그리고
도면 20은 SIRP-α 야생형 IgG1 Fc 구조체 또는 SIRP-α IgG1 Fc 변이체 구조체로 처리된 생쥐로부터 채취된 적혈구 수치를 예시한다.
발명의 상세한 설명
정의
용어 "약" 또는 "대략"은 당업자에 의해 결정될 때 특정 값에 대한 허용되는 오차 범위 이내를 의미하는데, 이것은 상기 값이 어떻게 계측되거나 또는 결정되는 지, 다시 말하면, 계측 시스템의 제한에 부분적으로 의존할 것이다. 가령, "약"은 당해 분야에서 관례에 따라, 1 이내 또는 1보다 큰 표준 편차를 의미할 수 있다. 대안으로, "약"은 소정의 값의 최대 20%, 최대 10%, 최대 5%, 또는 최대 1%의 범위를 의미할 수 있다. 대안으로, 특히, 생물학적 시스템 또는 과정에 대하여, 상기 용어는 값의 1 크기 자릿수 이내, 바람직하게는 5-배 이내, 그리고 더욱 바람직하게는 2-배 이내를 의미할 수 있다. 특정 값이 출원 및 청구항에서 설명되는 경우에, 달리 명시되지 않으면, 특정 값에 대한 허용되는 오차 범위 이내를 의미하는 용어 "약"이 가정되어야 한다.
본원에서 이용된 용어는 단지 특정 구체예를 설명하는 것을 목적으로 하고 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본원에서 이용된 바와 같이, 단수 형태 ("a", "an" 및 "the")는 문맥에서 달리 지시되지 않으면, 복수 형태를 포함하는 것으로 의도된다. 게다가, 용어 "포함하는", "포함한다", "갖는", "갖는다", "함께", 또는 이들의 변이체가 상세한 설명 또는 특허청구범위에서 이용되는 정도까지, 이런 용어는 용어 "포함하는"과 유사한 방식으로 포괄적인 것으로 의도된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "항체"는 무손상 항체; 원하는 생물학적 활성 (가령, 에피토프 결합)을 전시한다면, 항체 단편; 단일클론 항체; 다중클론 항체; 단일특이적 항체; 다중특이적 항체 (가령, 이중특이적 항체); 및 항체-유사 단백질을 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "항체 가변 도메인"은 상보성 결정 영역 (CDRs, 예를 들면, CDR L1, CDR L2, CDR L3, CDR H1, CDR H2 및 CDR H3) 및 프레임워크 영역 (FRs)의 아미노산 서열을 포함하는 항체의 경쇄와 중쇄의 부분을 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "링커"는 2개의 원소, 예를 들면, 단백질 도메인 사이에 연쇄를 지칭한다. 일부 구체예에서, 링커는 공유 결합 또는 스페이서일 수 있다. 용어 "스페이서"는 2개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 도메인 사이에 공간 또는 유연성 (또는 공간 및 유연성 둘 모두)을 제공하기 위해 2개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 도메인 사이에 발생하는 모이어티 (가령, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 중합체) 또는 아미노산 서열 (가령, 1-200개 아미노산 서열)을 지칭한다. 일부 구체예에서, 아미노산 스페이서는 폴리펩티드의 일차 서열의 일부이다 (가령, 폴리펩티드 중추를 거쳐, 이격된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 도메인에 결합된다).
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "치료 효과량"은 질환, 예를 들면, 암, 예를 들면, 고형 종양 또는 혈액암을 앓는 환자를 치료할 때 원하는 치료 효과를 달성하는데 충분하고 효과적인, 본원에서 설명된 폴리펩티드, 예를 들면, SIRP-α D1 도메인 또는 이의 변이체를 갖는 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 내포하는 제약학적 조성물의 양을 지칭한다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드의 치료 효과량은 불리한 부작용을 방지할 것이다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "제약학적 조성물"은 활성 성분뿐만 아니라 부형제 또는 희석제 (또는 부형제 및 희석제 둘 모두)를 포함하고 활성 성분이 적합한 투여 방법에 의해 투여될 수 있게 하는 약용 또는 제약학적 제제를 지칭한다. 일부 구체예에서, 본원에서 개시된 제약학적 조성물은 상기 폴리펩티드와 양립하는 제약학적으로 허용되는 성분을 포함한다. 일부 구체예에서, 제약학적 조성물은 경구 투여를 위한 정제 또는 캡슐 형태이거나 또는 예로서 주사에 의한 정맥내 또는 피하 투여를 위한 수성 형태이다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "개체", "피험자" 및 "환자"는 척추동물, 예를 들면, 포유동물을 지칭하기 위해 교체가능하게 이용된다. 포유동물은 뮤린, 유인원, 인간, 경작용 동물, 스포츠 동물 및 애완동물을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 생체내에서 획득된 또는 시험관내에서 배양된 생물학적 실체의 조직, 세포 및 이들의 자손 또한 포괄된다. 이들 용어 중에서 어느 것도 의학적 전문가의 관리를 수반하지 않는다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "친화성" 또는 "결합 친화성"은 두 분자 사이에 결합 상호작용이 강도를 지칭한다. 일반적으로, 결합 친화성은 분자 및 이의 결합 상대, 예를 들면, 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체 및 CD47 사이에 비공유 상호작용의 총계의 강도를 지칭한다. 달리 지시되지 않으면, 결합 친화성은 결합 쌍의 구성원 사이에 1:1 상호작용을 반영하는 내재성 결합 친화성을 지칭한다. 두 분자 사이에 결합 친화성은 통상적으로 해리 상수 (KD) 또는 연합 상수 (KA)에 의해 설명된다. 서로에 대해 낮은 결합 친화성을 갖는 두 분자는 일반적으로 천천히 결합하고, 쉽게 해리하는 경향이 있고, 그리고 큰 KD를 전시한다. 서로에 대해 높은 친화성을 갖는 두 분자는 일반적으로 쉽게 결합하고, 더욱 길게 결합된 상태로 남아있는 경향이 있고, 그리고 작은 KD를 전시한다. 일부 구체예에서, 2개의 상호작용하는 분자의 KD는 공지된 방법 및 기술, 예를 들면, 표면 플라스몬 공명 (SPR)을 이용하여 결정된다. KD는 k오프(off)/k온(on)의 비율로서 계산될 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "보다 적은 KD"는 수치적으로 더욱 작은 KD 값 및 언급된 KD 값에 비하여 증가하는 결합 친화성을 지칭한다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "보다 큰 KD"는 수치적으로 더욱 큰 KD 값 및 언급된 KD 값에 비하여 감소하는 결합 친화성을 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "급성 빈혈"은 화합물 또는 치료의 투여 후 첫 5 일 동안 30%의 적혈구 질량 또는 헤모글로빈 감소를 지칭한다.
I. 신호-조절 단백질 α (SIRP-α) D1 도메인 및 이의 변이체
일부 구체예에서, 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 80에서 아미노산 돌연변이; 및 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 6, 잔기 27, 잔기 31, 잔기 47, 잔기 53, 잔기 54, 잔기 56, 잔기 66 및 잔기 92로 구성된 군에서 선택되는 잔기에서 최소한 하나의 추가 아미노산 돌연변이를 갖는 SIRP-α D1 도메인을 포함하는 신호-조절 단백질 α (SIRP-α) D1 변이체, 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드가 본원에서 개시된다.
일부 구체예에서, Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드가 또한 본원에서 개시되고, 여기서 상기 Fc 변이체는 2개의 Fc 도메인 단위체를 갖는 Fc 도메인 이합체를 포함하고, 여기서 각 Fc 도메인 단위체는 독립적으로 (i) 돌연변이 L234A, L235A, G237A 및 N297A로 구성되는 인간 IgG1 Fc 영역; (ii) 돌연변이 A330S, P331S 및 N297A로 구성되는 인간 IgG2 Fc 영역; 또는 (iii) 돌연변이 S228P, E233P, F234V, L235A, delG236 및 N297A를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역에서 선택된다.
신호-조절 단백질 α ("SIRP-α" 또는 "SIRP-알파")는 골수 세포의 막에서 폭넓게 발현되는 Ig 상과에 속하는 막경유 당단백질이다. SIRP-α는 체내에서 많은 세포 유형에서 광범위하게 발현되는 단백질, CD47과 상호작용한다. SIRP-α와 CD47의 상호작용은 만약 그렇지 않으면, 면역계에 의해 인식될 수 있는 "자가" 세포의 탐식을 예방한다. 종양 세포에서 높은 CD47 발현은 급성 골수성 백혈병 및 여러 고형 종양 암에서, 생존에 대한 부정적인 예후 인자로서 행동할 수 있는 것으로 관찰되었다.
선천적 SIRP-α는 3개의 고도로 상동성 면역글로불린 (Ig)-유사 세포외 도메인-D1, D2 및 D3을 포함한다. SIRP-α D1 도메인 ("D1 도메인")은 SIRP-α의 막 원위, 세포외 도메인을 지칭하고 CD47에 SIRP-α의 결합을 매개한다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "SIRP-α 폴리펩티드"는 CD47에 결합할 수 있는 임의의 SIRP-α 폴리펩티드 또는 이의 단편을 지칭한다. 야생형 인간 SIRP-α의 최소한 10개 변이체가 있다. 표 1은 이들 10개의 자연발생 야생형 인간 SIRP-α D1 도메인 변이체의 D1 도메인의 아미노산 서열 (서열 번호: 1-10)을 보여준다. 일부 구체예에서, SIRP-α 폴리펩티드는 SIRP-α D1 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, SIRP-α 폴리펩티드는 야생형 D1 도메인, 예를 들면, 서열 번호: 1-10에서 제공된 것들을 포함한다. 일부 구체예에서, SIRP-α 폴리펩티드는 야생형 인간 SIRP-α의 D2 또는 D3 도메인 (또는 D2 및 D3 도메인 둘 모두) (표 3)를 포함한다.
표 1. 야생형 SIRP-α D1 도메인의 서열
서열 번호: 설명 아미노산 서열
1 야생형 D1 도메인 변이체 1 EEELQVIQPDKSVLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKEGHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS
2 야생형 D1 도메인 변이체 2 EEELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPS
3 야생형 D1 도메인 변이체 3 EEELQVIQPDKSVSVAAGESAILLCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPS
4 야생형 D1 도메인 변이체 4 EEGLQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKEGHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS
5 야생형 D1 도메인 변이체 5 EEELQVIQPDKFVLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKEGHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS
6 야생형 D1 도메인 변이체 6 EEELQVIQPDKSVLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKEGHFPRVTTVSDLTKRNNMDFPIRIGNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS
7 야생형 D1 도메인 변이체 7 EEELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRGKPS
8 야생형 D1 도메인 변이체 8 EEELQVIQPDKSVLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPS
9 야생형 D1 도메인 변이체 9 EEELQVIQPDKSVLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKEGHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS
10 야생형 D1 도메인 변이체 10 EEELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPS
11 야생형 pan-D1 도메인 EEX1LQVIQPDKX2VX3VAAGEX4AX5LX6CTX7TSLIPVGPIQWFRGAGPX8RELIYNQKEGHFPRVTTVSX9X10TKRX11NMDFX12IX13IX14NITPADAGTYYCVKFRKGSX15X16DX17EFKSGAGTELSVRX18KPS
서열 번호: 11에 비하여 아미노산 치환 X1은 E 또는 G이고; X2는 S 또는 F이고; X3은 L 또는 S이고; X4는 T 또는 S이고; X5는 T 또는 I이고; X6은 R, H, 또는 L이고; X7은 A 또는 V이고; X8은 G 또는 A이고; X9는 D 또는 E이고; X10은 L 또는 S이고; X11은 N 또는 E 또는 D이고; X12는 S 또는 P이고; X13은 R 또는 S이고; X14는 G 또는 S이고; X15는 P 또는 부재하고; X16은 D 또는 P이고; X17은 V 또는 T이고; 그리고 X18은 A 또는 G
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "높은 친화성 SIRP-α D1 변이체", "높은 친화성 SIRP-α 변이체" 또는 "SIRP-α D1 변이체"는 CD47에 야생형 SIRP-α보다 더욱 높은 친화성을 갖는 SIRP-α D1 도메인 또는 SIRP-α 폴리펩티드의 CD47-결합 부분을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체는 야생형 SIRP-α에 비하여 최소한 하나의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입 (또는 이들의 조합)을 포함한다.
일부 구체예에서, 본원에서 개시된 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체는 SIRP-α D1 도메인 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구체예에서, 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체는 서열 번호: 1-10에서 도시된 야생형 D1 도메인에 비하여 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환, 삽입, 부가 또는 결실을 포함한다. 표 2는 각 SIRP-α D1 도메인 변이체 (서열 번호: 13-22)에서 예시적인 아미노산 치환을 열거한다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 도메인 폴리펩티드 또는 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체는 D1 도메인의 단편을 포함한다. 일부 구체예에서, SIRP-α 폴리펩티드 단편 또는 높은 친화성 SIRP-α 변이체 단편은 길이에서 10개보다 적은 아미노산, 길이에서 약 10개 아미노산, 길이에서 약 20개 아미노산, 길이에서 약 30개 아미노산, 길이에서 약 40개 아미노산, 길이에서 약 50개 아미노산, 길이에서 약 60개 아미노산, 길이에서 약 70개 아미노산, 길이에서 약 80개 아미노산, 길이에서 약 90개 아미노산, 길이에서 약 100개 아미노산, 또는 길이에서 약 100개 보다 많은 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 도메인 단편은 CD47에 결합하는 능력을 유지한다.
일부 구체예에서, 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드는 CD47에 야생형 인간 SIRP-α D1 도메인보다 더욱 높은 결합 친화성으로 결합한다. 일부 구체예에서, 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체는 인간 CD47에 자연발생 D1 도메인의 친화성보다 최소한 1-배 (가령, 최소한 1.5-배, 2-배, 2.5-배, 3-배, 3.5-배, 4-배, 5-배 또는 큰 5-배 이상) 친화성으로 결합한다. 일부 구체예에서, 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체는 인간 CD47에 자연발생 D1 도메인의 친화성보다 최소한 1-배 (가령, 최소한 10배, 100-배, 1000-배 또는 1000-배 이상) 친화성으로 결합한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "최적화된 친화성" 또는 "최적화된 결합 친화성"은 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체 및 CD47을 비롯하여, 본원에서 개시된 폴리펩티드 사이에 결합 상호작용의 최적화된 강도를 지칭한다. 가령, 일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 암 세포 상에서 CD47에 일차적으로 또는 더욱 높은 친화성으로 결합하고, 그리고 비-암 세포 상에서 CD47에 실질적으로 결합하지 않거나 또는 더욱 낮은 친화성으로 결합한다. 일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드 및 CD47 사이에 결합 친화성은 이러한 상호작용이 최대 친화성으로 결합하는 변이체와 비교하여, 임상적으로 유관한 독성을 유발하지 않거나 또는 독성을 감소시키도록 최적화된다. 일부 구체예에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드 및 CD47 사이에 최적화된 결합 친화성을 달성하기 위해, CD47에 최대로 달성가능한 것보다 더욱 낮은 결합 친화성을 갖는, 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체를 포함하는 폴리펩티드가 개발된다. 일부 구체예에서, 본원에서 개시된 높은 친화성 SIRP-α 변이체는 설치류, 비인간 영장류 (NHP) 및 인간 CD47과 교차반응한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "면역원성"은 마치 단백질 (가령, 치료적 단백질)이 외래 항원인 것처럼 숙주에서 면역 반응을 유발하는 이의 성질을 지칭한다. 단백질의 면역원성은 다양한 상이한 방식으로, 예를 들면, 시험관내 T-세포 증식 검정을 통해 시험관내에서 검정될 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "최소 면역원성"은 예로서, 아미노산 치환을 통해, 아미노산 치환이 도입되기 전 (가령, 변형되지 않은 단백질) 면역원성보다 더욱 낮도록 (가령, 최소한 10%, 25%, 50%, 또는 100% 낮도록) 변형된 단백질 (가령, 치료적 단백질)의 면역원성을 지칭한다. 일부 구체예에서, 단백질 (가령, 치료적 단백질)은 최소 면역원성을 갖도록 변형되고, 그리고 이것이 외래 항원임에도 불구하고, 숙주 면역 반응을 전혀 또는 거의 유발하지 않는다.
일부 구체예에서, 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체는 최소 면역원성을 갖는다. 일부 구체예에서, 개체에 투여되는 본 발명의 SIRP-α 폴리펩티드는 SIRP-α D1 변이체의 친화성을 증가시키는 아미노산 변화를 제외하고, 개체의 생물학적 표본에서 SIRP-α 폴리펩티드의 것과 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, 본원에서 개시된 폴리펩티드 변이체는 항-CD47 항체 또는 야생형 SIRP-α와 비교하여 부작용의 위험을 낮춘다. 일부 구체예에서, 본원에서 개시된 폴리펩티드 변이체는 항-CD47 항체 또는 야생형 SIRP-α와 비교하여 빈혈의 위험을 낮춘다. 일부 구체예에서, 본원에서 개시된 폴리펩티드 변이체는 설치류 또는 비인간 영장류 (NHP) 연구에서 급성 빈혈을 유발하지 않는다.
표 2는 각 D1 도메인 서열에 비하여 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체에서 특정한 아미노산 치환을 열거한다. 일부 구체예에서, 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체는 표 2에서 열거된 하나 또는 그 이상 (가령, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개 또는 그 이상)의 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체는 야생형 D1 도메인에 비하여 기껏해야 14개 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체는 야생형 D1 도메인에 비하여 기껏해야 10개 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체는 야생형 D1 도메인에 비하여 기껏해야 7개 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체는 야생형 D1 도메인의 서열에 최소한 90% (가령, 최소한 92%, 95%, 97% 또는 97% 이상)의 아미노산 서열 동일성을 갖는다.
일부 구체예에서, 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체는 2개 또는 그 이상의 야생형 D1 도메인 또는 이들의 변이체의 일부분 (가령, 한 야생형 D1 도메인 또는 이의 변이체의 일부분 및 다른 야생형 D1 도메인 또는 이의 변이체의 일부분)을 포함하는 키메라 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체이다. 일부 구체예에서, 키메라 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체는 야생형 D1 도메인 또는 이들의 변이체의 최소한 2개의 부분 (가령, 3개, 4개, 5개 또는 그 이상의 부분)을 포함하고, 여기서 각 부분은 상이한 야생형 D1 도메인으로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 키메라 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체는 표 2에서 열거된 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환을 더욱 포함한다.
표 2. 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체에서 아미노산 치환
서열 번호: 설명 아미노산 서열
13 D1 도메인 v1 EEEX1QX2IQPDKSVLVAAGETX3TLRCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPGRX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSDX10TX11RNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCX12KX13RKGSPDDVEX14KSGAGTELSVRAKPS
- 서열 번호: 13에 비하여 아미노산 치환 X1=L, I, V; X2=V, L, I; X3=A, V; X4=A, I, L; X5=I, T, S, F; X6=E, V, L; X7=K, R; X8=E, Q; X9=H, P, R; X10=L, T, G; X11=K, R; X12=V, I; X13=F, L, V; X14=F, V
14 D1 도메인 v2 EEEX1QX2IQPDKSVSVAAGESX3ILHCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPARX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSEX10TX11RENMDFSISISNITPADAGTYYCX12KX13RKGSPDTEX14KSGAGTELSVRAKPS
- 서열 번호: 14에 비하여 아미노산 치환 X1=L, I, V; X2=V, L, I; X3=A, V; X4=V, I, L; X5=I, T, S, F; X6=E, V, L; X7=K, R; X8=E, Q; X9=H, P, R; X10=S, T, G; X11=K, R; X12=V, I; X13=F, L, V; X14=F, V
15 D1 도메인 v3 EEEX1QX2IQPDKSVSVAAGESX3ILLCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPARX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSEX10TX11RENMDFSISISNITPADAGTYYCX12KX13RKGSPDTEX14KSGAGTELSVRAKPS
- 서열 번호: 15에 비하여 아미노산 치환 X1=L, I, V; X2=V, L, I; X3=A, V; X4=V, I, L; X5=I, T, S, F; X6=E, V, L; X7=K, R; X8=E, Q; X9=H, P, R; X10=S, T, G; X11=K, R; X12=V, I; X13=F, L, V; X14=F, V
16 D1 도메인 v4 EEGX1QX2IQPDKSVSVAAGESX3ILHCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPGRX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSDX10TX11RNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCX12KX13RKGSPDDVEX14KSGAGTELSVRAKPS
- 서열 번호: 16에 비하여 아미노산 치환 X1=L, I, V; X2=V, L, I; X3=A, V; X4=A, I, L; X5=I, T, S, F; X6=E, V, L; X7=K, R; X8=E, Q; X9=H, P, R; X10=L, T, G; X11=K, R; X12=V, I; X13=F, L, V; X14=F, V
17 D1 도메인 v5 EEEX1QX2IQPDKFVLVAAGETX3TLRCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPGRX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSDX10TX11RNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCX12KX13RKGSPDDVEX14KSGAGTELSVRAKPS
- 서열 번호: 17에 비하여 아미노산 치환 X1=L, I, V; X2=V, L, I; X3=A, V; X4=A, I, L; X5=I, T, S, F; X6=E, V, L; X7=K, R; X8=E, Q; X9=H, P, R; X10=L, T, G; X11=K, R; X12=V, I; X13=F, L, V; X14=F, V
18 D1 도메인 v6 EEEX1QX2IQPDKSVLVAAGETX3TLRCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPGRX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSDX10TX11RNNMDFPIRIGNITPADAGTYYCX12KX13RKGSPDDVEX14KSGAGTELSVRAKPS
- 서열 번호: 18에 비하여 아미노산 치환 X1=L, I, V; X2=V, L, I; X3=A, V; X4=A, I, L; X5=I, T, S, F; X6=E, V, L; X7=K, R; X8=E, Q; X9=H, P, R; X10=L, T, G; X11=K, R; X12=V, I; X13=F, L, V; X14=F, V
19 D1 도메인 v7 EEEX1QX2IQPDKSVSVAAGESX3ILHCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPARX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSEX10TX11RENMDFSISISNITPADAGTYYCX12KX13RKGSPDTEX14KSGAGTELSVRGKPS
- 서열 번호: 19에 비하여 아미노산 치환 X1=L, I, V; X2=V, L, I; X3=A, V; X4=V, I, L; X5=I, T, S, F; X6=E, V, L; X7=K, R; X8=E, Q; X9=H, P, R; X10=S, T, G; X11=K, R; X12=V, I; X13=F, L, V; X14=F, V
20 D1 도메인 v8 EEEX1QX2IQPDKSVLVAAGETX3TLRCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPARX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSEX10TX11RENMDFSISISNITPADAGTYYCX12KX13RKGSPDTEX14KSGAGTELSVRAKPS
- 서열 번호: 20에 비하여 아미노산 치환 X1=L, I, V; X2=V, L, I; X3=A, V; X4=A, I, L; X5=I, T, S, F; X6=E, V, L; X7=K, R; X8=E, Q; X9=H, P, R; X10=S, T, G; X11=K, R; X12=V, I; X13=F, L, V; X14=F, V
21 D1 도메인 v9 EEEX1QX2IQPDKSVLVAAGETX3TLRCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPGRX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSDX10TX11RNNMDFSIRISNITPADAGTYYCX12KX13RKGSPDDVEX14KSGAGTELSVRAKPS
- 서열 번호: 21에 비하여 아미노산 치환 X1=L, I, V; X2=V, L, I; X3=A, V; X4=A, I, L; X5=I, T, S, F; X6=E, V, L; X7=K, R; X8=E, Q; X9=H, P, R; X10=L, T, G; X11=K, R; X12=V, I; X13=F, L, V; X14=F, V
22 D1 도메인 v10 EEEX1QX2IQPDKSVSVAAGESX3ILHCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPARX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSEX10TX11RENMDFSISISNITPADAGTYYCX12KX13RKGSPDTEX14KSGAGTELSVRAKPS
- 서열 번호: 22에 비하여 아미노산 치환 X1=L, I, V; X2=V, L, I; X3=A, V; X4=V, I, L; X5=I, T, S, F; X6=E, V, L; X7=K, R; X8=E, Q; X9=H, P, R; X10=S, T, G; X11=K, R; X12=V, I; X13=F, L, V; X14=F, V
23 Pan D1 도메인 EEX1X2QX3IQPDKX4VX5VAAGEX6X7X8LX9CTX10TSLX11PVGPIQWFRGAGPX12RX13LIYNQX14X15GX16FPRVTTVSX17X18TX19RX20NMDFX21IX22IX23NITPADAGTYYCX24KX25RKGSPDX26X27EX28KSGAGTELSVRX29KPS
- 서열 번호: 23에 비하여 아미노산 치환 X1=E, G; X2=L, I, V; X3=V, L, I; X4=S, F; X5=L, S; X6=S, T; X7=A, V; X8=I, T; X9=H, R; X10=A, V, I, L; X11=I, T, S, F; X12=A, G; X13=E, V, L; X14=K, R; X15=E, Q; X16=H, P, R; X17=D, E; X18=S, L, T, G; X19=K, R; X20=E, D; X21=S, P; X22=S, R; X23=S, G; X24=V, I; X25=F, L, V; X26=D 또는 부재하고; X27=T, V; X28=F, V; 그리고 X29=A, G
일부 구체예에서, 폴리펩티드는 다음의 서열을 갖는 SIRP-α D1 변이체를 포함한다:
EEEX1QX2IQPDKSVLVAAGETX3TLRCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPGRX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSDX10TX11RNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCX12KX13RKGSPDDVEX14KSGAGTELSVRAKPS (서열 번호: 13), 여기서 X1은 L, I, 또는 V이고; X2는 V, L, 또는 I이고; X3은 A 또는 V이고; X4는 A, I, 또는 L이고; X5는 I, T, S, 또는 F이고; X6은 E, V, 또는 L이고; X7은 K 또는 R이고; X8은 E 또는 Q이고; X9는 H, P, 또는 R이고; X10은 L, T, 또는 G이고; X11은 K 또는 R이고; X12는 V 또는 I이고; X13은 F, L, 또는 V이고; 그리고 X14는 F 또는 V이고; 그리고 여기서 상기 변이체는 서열 번호: 1의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 최소한 하나의 아미노산 치환을 갖는다.
일부 구체예에서, 폴리펩티드는 다음의 서열을 갖는 SIRP-α D1 변이체를 포함한다:
EEGX1QX2IQPDKSVSVAAGESX3ILHCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPGRX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSDX10TX11RNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCX12KX13RKGSPDDVEX14KSGAGTELSVRAKPS (서열 번호: 16), 여기서 X1은 L, I, 또는 V이고; X2는 V, L, 또는 I이고; X3은 A 또는 V이고; X4는 A, I, 또는 L이고; X5는 I, T, S, 또는 F이고; X6은 E, V, 또는 L이고; X7은 K 또는 R이고; X8은 E 또는 Q이고; X9는 H, P, 또는 R이고; X10은 L, T, 또는 G이고; X11은 K 또는 R이고; X12는 V 또는 I이고; X13은 F, L, 또는 V이고; 그리고 X14는 F 또는 V이고; 그리고 여기서 상기 변이체는 서열 번호: 4의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 최소한 하나의 아미노산 치환을 갖는다.
일부 구체예에서, 폴리펩티드는 다음의 서열을 갖는 SIRP-α D1 변이체를 포함한다:
EEEX1QX2IQPDKFVLVAAGETX3TLRCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPGRX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSDX10TX11RNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCX12KX13RKGSPDDVEX14KSGAGTELSVRAKPS (서열 번호: 17), 여기서 X1은 L, I, 또는 V이고; X2는 V, L, 또는 I이고; X3은 A 또는 V이고; X4는 A, I, 또는 L이고; X5는 I, T, S, 또는 F이고; X6은 E, V, 또는 L이고; X7은 K 또는 R이고; X8은 E 또는 Q이고; X9는 H, P, 또는 R이고; X10은 L, T, 또는 G이고; X11은 K 또는 R이고; X12는 V 또는 I이고; X13은 F, L, 또는 V이고; 그리고 X14는 F 또는 V이고; 그리고 여기서 상기 변이체는 서열 번호: 5의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 최소한 하나의 아미노산 치환을 갖는다.
일부 구체예에서, 폴리펩티드는 다음의 서열을 갖는 SIRP-α D1 변이체를 포함한다:
EEEX1QX2IQPDKSVLVAAGETX3TLRCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPGRX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSDX10TX11RNNMDFPIRIGNITPADAGTYYCX12KX13RKGSPDDVEX14KSGAGTELSVRAKPS (서열 번호: 18), 여기서 X1은 L, I, 또는 V이고; X2는 V, L, 또는 I이고; X3은 A 또는 V이고; X4는 A, I, 또는 L이고; X5는 I, T, S, 또는 F이고; X6은 E, V, 또는 L이고; X7은 K 또는 R이고; X8은 E 또는 Q이고; X9는 H, P, 또는 R이고; X10은 L, T, 또는 G이고; X11은 K 또는 R이고; X12는 V 또는 I이고; X13은 F, L, 또는 V이고; 그리고 X14는 F 또는 V이고; 그리고 여기서 상기 변이체는 서열 번호: 6의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 최소한 하나의 아미노산 치환을 갖는다.
일부 구체예에서, 폴리펩티드는 다음의 서열을 갖는 SIRP-α D1 변이체를 포함한다:
EEEX1QX2IQPDKSVLVAAGETX3TLRCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPGRX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSDX10TX11RNNMDFSIRISNITPADAGTYYCX12KX13RKGSPDDVEX14KSGAGTELSVRAKPS (서열 번호: 21), 여기서 X1은 L, I, 또는 V이고; X2는 V, L, 또는 I이고; X3은 A 또는 V이고; X4는 A, I, 또는 L이고; X5는 I, T, S, 또는 F이고; X6은 E, V, 또는 L이고; X7은 K 또는 R이고; X8은 E 또는 Q이고; X9는 H, P, 또는 R이고; X10은 L, T, 또는 G이고; X11은 K 또는 R이고; X12는 V 또는 I이고; X13은 F, L, 또는 V이고; 그리고 X14는 F 또는 V이고; 그리고 여기서 상기 변이체는 서열 번호: 9의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 최소한 하나의 아미노산 치환을 갖는다.
전술한 구체예 중에서 한 가지에서, 폴리펩티드는 서열 번호: 13, 16-18 및 21 중에서 한 가지의 서열을 갖는 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체를 포함하고, 여기서 X1은 L, I, 또는 V이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X2는 V, L, 또는 I이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X3은 A 또는 V이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X4는 A, I, 또는 L이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X5는 I, T, S, 또는 F이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X6은 E, V, 또는 L이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X7은 K 또는 R이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X8은 E 또는 Q이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X9는 H, P, 또는 R이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X10은 L, T, 또는 G이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X11은 K 또는 R이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X12는 V 또는 I이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X13은 F, L, V이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X14는 F 또는 V이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 이러한 양상의 폴리펩티드는 서열 번호: 1, 4-6 및 9 중에서 한 가지의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 6개 이내의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 1, 4-6 및 9 중에서 한 가지의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인보다 최소한 10배 큰 결합 친화성으로 CD47에 결합한다. 일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 1, 4-6 및 9 중에서 한 가지의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인보다 최소한 100배 큰 결합 친화성으로 CD47에 결합한다. 일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 1, 4-6 및 9 중에서 한 가지의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인보다 최소한 1000배 큰 결합 친화성으로 CD47에 결합한다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체 폴리펩티드 또는 이의 단편은 1 x 10-8 M보다 적은, 5 x 10-9 M보다 적은, 1 x 10-9 M보다 적은, 5 x 10-10 M보다 적은, 1 x 10-10 M보다 적은 또는 1 x 10-11 M보다 적은 KD로 CD47에 결합한다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체 폴리펩티드 또는 이의 단편은 약 500 nM 및 100 nM 사이, 약 100 nM 및 50 nM 사이, 약 50 nM 및 10 nM 사이, 약 10 nM 및 5 nM 사이, 약 5 nM 및 1 nM 사이, 약 1 nM 및 500 pM 사이, 약 500 pM 및 100 pM 사이, 약 100 pM 및 50 pM 사이, 또는 약 50 pM 및 10 pM 사이의 KD로 CD47에 결합한다.
일부 구체예에서, 폴리펩티드는 다음의 서열을 갖는 SIRP-α D1 변이체를 포함한다:
EEEX1QX2IQPDKSVSVAAGESX3ILHCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPARX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSEX10TX11RENMDFSISISNITPADAGTYYCX12KX13RKGSPDTEX14KSGAGTELSVRAKPS (서열 번호: 14), 여기서 X1은 L, I, 또는 V이고; X2는 V, L, 또는 I이고; X3은 A 또는 V이고; X4는 V, I, 또는 L이고; X5는 I, T, S, 또는 F이고; X6은 E, V, 또는 L이고; X7은 K 또는 R이고; X8은 E 또는 Q이고; X9는 H, P, 또는 R이고; X10은 S, T, 또는 G이고; X11은 K 또는 R이고; X12는 V 또는 I이고; X13은 F, L, 또는 V이고; 그리고 X14는 F 또는 V이고; 그리고 여기서 상기 변이체는 서열 번호: 2의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 최소한 하나의 아미노산 치환을 갖는다.
일부 구체예에서, 폴리펩티드는 다음의 서열을 갖는 SIRP-α D1 변이체를 포함한다:
EEEX1QX2IQPDKSVSVAAGESX3ILLCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPARX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSEX10TX11RENMDFSISISNITPADAGTYYCX12KX13RKGSPDTEX14KSGAGTELSVRAKPS (서열 번호: 15), 여기서 X1은 L, I, 또는 V이고; X2는 V, L, 또는 I이고; X3은 A 또는 V이고; X4는 V, I, 또는 L이고; X5는 I, T, S, 또는 F이고; X6은 E, V, 또는 L이고; X7은 K 또는 R이고; X8은 E 또는 Q이고; X9는 H, P, 또는 R이고; X10은 S, T, 또는 G이고; X11은 K 또는 R이고; X12는 V 또는 I이고; X13은 F, L, 또는 V이고; 그리고 X14는 F 또는 V이고; 그리고 여기서 상기 변이체는 서열 번호: 3의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 최소한 하나의 아미노산 치환을 갖는다.
일부 구체예에서, 폴리펩티드는 다음의 서열을 갖는 SIRP-α D1 변이체를 포함한다:
EEEX1QX2IQPDKSVSVAAGESX3ILHCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPARX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSEX10TX11RENMDFSISISNITPADAGTYYCX12KX13RKGSPDTEX14KSGAGTELSVRGKPS (서열 번호: 19), 여기서 X1은 L, I, 또는 V이고; X2는 V, L, 또는 I이고; X3은 A 또는 V이고; X4는 V, I, 또는 L이고; X5는 I, T, S, 또는 F이고; X6은 E, V, 또는 L이고; X7은 K 또는 R이고; X8은 E 또는 Q이고; X9는 H, P, 또는 R이고; X10은 S, T, 또는 G이고; X11은 K 또는 R이고; X12는 V 또는 I이고; X13은 F, L, 또는 V이고; 그리고 X14는 F 또는 V이고; 그리고 여기서 상기 변이체는 서열 번호: 7의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 최소한 하나의 아미노산 치환을 갖는다.
일부 구체예에서, 폴리펩티드는 다음의 서열을 갖는 SIRP-α D1 변이체를 포함한다:
EEEX1QX2IQPDKSVSVAAGESX3ILHCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPARX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSEX10TX11RENMDFSISISNITPADAGTYYCX12KX13RKGSPDTEX14KSGAGTELSVRAKPS (서열 번호: 22), 여기서 X1은 L, I, 또는 V이고; X2는 V, L, 또는 I이고; X3은 A 또는 V이고; X4는 V, I, 또는 L이고; X5는 I, T, S, 또는 F이고; X6은 E, V, 또는 L이고; X7은 K 또는 R이고; X8은 E 또는 Q이고; X9는 H, P, 또는 R이고; X10은 S, T, 또는 G이고; X11은 K 또는 R이고; X12는 V 또는 I이고; X13은 F, L, 또는 V이고; 그리고 X14는 F 또는 V이고; 그리고 여기서 상기 변이체는 서열 번호: 10의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 최소한 하나의 아미노산 치환을 갖는다.
본 발명의 이러한 양상에서 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 14, 15, 19 및 22 중에서 한 가지의 서열을 갖고, 여기서 X1은 L, I, 또는 V이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X2는 V, L, 또는 I이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X3은 A 또는 V이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X4는 V, I, 또는 L이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X5는 I, T, S, 또는 F이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X6은 E, V, 또는 L이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X7은 K 또는 R이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X8은 E 또는 Q이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X9는 H, P, 또는 R이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X10은 S, T, 또는 G이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X11은 K 또는 R이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X12는 V 또는 I이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X13은 F, L, 또는 V이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X14는 F 또는 V이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 이러한 양상의 폴리펩티드는 서열 번호: 2, 3, 7 및 10 중에서 한 가지의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 6개 이내의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 2, 3, 7 및 10 중에서 한 가지의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인보다 최소한 10배 큰 결합 친화성으로 CD47에 결합한다. 일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 2, 3, 7 및 10 중에서 한 가지의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인보다 최소한 100배 큰 결합 친화성으로 CD47에 결합한다. 일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 2, 3, 7 및 10 중에서 한 가지의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인보다 최소한 1000배 큰 결합 친화성으로 CD47에 결합한다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체 폴리펩티드 또는 이의 단편은 1 x 10-8 M보다 적은, 5 x 10-9 M보다 적은, 1 x 10-9 M보다 적은, 5 x 10-10 M보다 적은, 1 x 10-10 M보다 적은 또는 1 x 10-11 M보다 적은 KD로 CD47에 결합한다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체 폴리펩티드 또는 이의 단편은 약 500 nM 및 100 nM 사이, 약 100 nM 및 50 nM 사이, 약 50 nM 및 10 nM 사이, 약 10 nM 및 5 nM 사이, 약 5 nM 및 1 nM 사이, 약 1 nM 및 500 pM 사이, 약 500 pM 및 100 pM 사이, 약 100 pM 및 50 pM 사이, 또는 약 50 pM 및 10 pM 사이의 KD로 CD47에 결합한다.
일부 구체예에서, 폴리펩티드는 다음의 서열을 갖는 SIRP-α D1 변이체를 포함한다:
EEEX1QX2IQPDKSVLVAAGETX3TLRCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPARX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSEX10TX11RENMDFSISISNITPADAGTYYCX12KX13RKGSPDTEX14KSGAGTELSVRAKPS (서열 번호: 20), 여기서 X1은 L, I, 또는 V이고; X2는 V, L, 또는 I이고; X3은 A 또는 V이고; X4는 A, I, 또는 L이고; X5는 I, T, S, 또는 F이고; X6은 E, V, 또는 L이고; X7은 K 또는 R이고; X8은 E 또는 Q이고; X9는 H, P, 또는 R이고; X10은 S, T, 또는 G이고; X11은 K 또는 R이고; X12는 V 또는 I이고; X13은 F, L, 또는 V이고; 그리고 X14는 F 또는 V이고; 그리고 여기서 상기 변이체는 서열 번호: 8의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 최소한 하나의 아미노산 치환을 갖는다.
일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 20의 서열을 갖고, 여기서 X1은 L, I, 또는 V이다. 본 발명의 이러한 양상에서 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X2는 V, L, 또는 I이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X3은 A 또는 V이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X4는 A, I, 또는 L이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X5는 I, T, S, 또는 F이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X6은 E, V, 또는 L이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X7은 K 또는 R이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X8은 E 또는 Q이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X9는 H이고, P, 또는 R이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X10은 S, T, 또는 G이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X11은 K 또는 R이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X12는 V 또는 I이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X13은 F, L, 또는 V이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X14는 F 또는 V이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 이러한 양상의 폴리펩티드는 서열 번호: 8의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 6개 이내의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 8의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인보다 최소한 10배 큰 결합 친화성으로 CD47에 결합한다. 일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 8의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인보다 최소한 100배 큰 결합 친화성으로 CD47에 결합한다. 일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 8의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인보다 최소한 1000배 큰 결합 친화성으로 CD47에 결합한다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체 폴리펩티드 또는 이의 단편은 1 x 10-8 M보다 적은, 5 x 10-9 M보다 적은, 1 x 10-9 M보다 적은, 5 x 10-10 M보다 적은, 1 x 10-10 M보다 적은 또는 1 x 10-11 M보다 적은 KD로 CD47에 결합한다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체 폴리펩티드 또는 이의 단편은 약 500 nM 및 100 nM 사이, 약 100 nM 및 50 nM 사이, 약 50 nM 및 10 nM 사이, 약 10 nM 및 5 nM 사이, 약 5 nM 및 1 nM 사이, 약 1 nM 및 500 pM 사이, 약 500 pM 및 100 pM 사이, 약 100 pM 및 50 pM 사이, 또는 약 50 pM 및 10 pM 사이의 KD로 CD47에 결합한다.
일부 구체예에서, 폴리펩티드는 다음의 서열을 갖는 SIRP-α D1 변이체를 포함한다:
EEX1X2QX3IQPDKX4VX5VAAGEX6X7X8LX9CTX10TSLX11PVGPIQWFRGAGPX12RX13LIYNQX14X15GX16FPRVTTVSX17X18TX19RX20NMDFX21IX22IX23NITPADAGTYYCX24KX25RKGSPDX26X27EX28KSGAGTELSVRX29KPS (서열 번호: 23), 여기서 X1은 E 또는 G이고; X2는 L, I, 또는 V이고; X3은 V, L, 또는 I이고; X4는 S 또는 F이고; X5는 L 또는 S이고; X6은 S 또는 T이고; X7은 A 또는 V이고; X8은 I 또는 T이고; X9는 H 또는 R이고; X10은 A, V, I, 또는 L이고; X11은 I, T, S, 또는 F이고; X12는 A 또는 G이고; X13은 E, V, 또는 L이고; X14는 K 또는 R이고; X15는 E 또는 Q이고; X16은 H, P, 또는 R이고; X17은 D 또는 E이고; X18은 S, L, T, 또는 G이고; X19는 K 또는 R이고; X20은 E 또는 D이고; X21은 S 또는 P이고; X22는 S 또는 R이고; X23은 S 또는 G이고; X24는 V 또는 I이고; X25는 F, L, V이고; X26은 D 또는 부재하고; X27은 T 또는 V이고; X28은 F 또는 V이고; 그리고 X29는 A 또는 G이고; 그리고 여기서 상기 변이체는 서열 번호: 1-10 중에서 한 가지의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 최소한 하나의 아미노산 치환을 갖는다.
본 발명의 이러한 양상에서 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X2는 L, I, 또는 V이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X3은 V, L, 또는 I이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X4는 S 또는 F이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X5는 L 또는 S이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X6은 S 또는 T이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X7은 A 또는 V이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X8은 I 또는 T이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X9는 H 또는 R이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X10은 A, V, I, 또는 L이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X11은 I, T, S, 또는 F이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X12는 A 또는 G이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X13은 E, V, 또는 L이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X14는 K 또는 R이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X15는 E 또는 Q이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X16은 H, P, 또는 R이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X17은 D 또는 E이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X18은 S, L, T, 또는 G이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X19는 K 또는 R이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X20은 E 또는 D이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X21은 S 또는 P이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X22는 S 또는 R이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X23은 S 또는 G이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X24는 V 또는 I이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X25는 F, L, V이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X26은 D 또는 부재한다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X27은 T 또는 V이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X28은 F 또는 V이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X29는 A 또는 G이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 이러한 양상의 폴리펩티드는 서열 번호: 1-10 중에서 한 가지의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 6개 이내의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 1-10 중에서 한 가지의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인보다 최소한 10배 큰 결합 친화성으로 CD47에 결합한다. 일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 1-10 중에서 한 가지의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인보다 최소한 100배 큰 결합 친화성으로 CD47에 결합한다. 일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 1-10 중에서 한 가지의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인보다 최소한 1000배 큰 결합 친화성으로 CD47에 결합한다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체 폴리펩티드 또는 이의 단편은 1 x 10-8 M보다 적은, 5 x 10-9 M보다 적은, 1 x 10-9 M보다 적은, 5 x 10-10 M보다 적은, 1 x 10-10 M보다 적은 또는 1 x 10-11 M보다 적은 KD로 CD47에 결합한다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체 폴리펩티드 또는 이의 단편은 약 500 nM 및 100 nM 사이, 약 100 nM 및 50 nM 사이, 약 50 nM 및 10 nM 사이, 약 10 nM 및 5 nM 사이, 약 5 nM 및 1 nM 사이, 약 1 nM 및 500 pM 사이, 약 500 pM 및 100 pM 사이, 약 100 pM 및 50 pM 사이, 또는 약 50 pM 및 10 pM 사이의 KD로 CD47에 결합한다.
일부 구체예에서, 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드는 표 3에서 보여지는 바와 같은 야생형 인간 SIRP-α의 서열 번호: 24의 서열을 갖는 D2 도메인, 서열 번호: 25의 서열을 갖는 D3 도메인, 또는 서열 번호: 24의 서열을 갖는 D2 도메인 및 서열 번호: 25의 서열을 갖는 D3 도메인을 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체는 D2 도메인의 단편 또는 변이체 또는 D3 도메인의 단편 또는 변이체를 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체는 D2 도메인의 단편 또는 변이체 및 D3 도메인의 단편 또는 변이체를 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체는 링커에 의하여 D2 또는 D3 도메인에 연결된다. 일부 구체예에서, 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체는 링커에 의하여 D2 및 D3 도메인에 연결된다.
표 3. SIRP-α D2 및 D3 도메인의 아미노산 서열
서열 번호: 설명 아미노산 서열
24 SIRP-α D2 도메인 APVVSGPAARATPQHTVSFTCESHGFSPRDITLKWFKNGNELSDFQTNVDPVGESVSYSIHSTAKVVLTREDVHSQVICEVAHVTLQGDPLRGTANLSETIR
25 SIRP-α D3 도메인 VPPTLEVTQQPVRAENQVNVTCQVRKFYPQRLQLTWLENGNVSRTETASTVTENKDGTYNWMSWLLVNVSAHRDDVKLTCQVEHDGQPAVSKSHDLKVS
일부 구체예에서, 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드의 약동학적 성질을 향상시키기 위해, 예를 들면, 혈청 반감기를 증가시키기 위해, Fc 도메인 단위체, 인간 혈청 알부민 (HSA) 또는 이의 변이체, 혈청-결합 단백질 또는 펩티드, 또는 유기 분자, 예를 들면, 중합체 (가령, PEG 중합체)에 부착된다. 일부 구체예에서, 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체는 이합체화할 수 없는 Fc 도메인 단위체에 부착된다. 일부 구체예에서, Fc 도메인 단위체, HSA 단백질, 혈청-결합 단백질 또는 펩티드, 그리고 유기 분자, 예를 들면, PEG는 본원에서 설명된 폴리펩티드의 혈청 반감기를 증가시키는데 역할을 한다. 일부 구체예에서, 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드는 표 4에서 도시된 서열 번호: 26-36 중에서 한 가지의 서열을 포함하지 않는다.
표 4.
서열 번호: 아미노산 서열
26 EEELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTITSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQREGHFPRVTTVSETTRRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEVKSGAGTELSVRAKPS
27 EEEVQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTLTSLIPVGPIQWFRGAGPARVLIYNQRQGHFPRVTTVSEGTRRENMDFSISISNITPADAGTYYCIKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPS
28 EEEVQIIQPDKSVSVAAGESVILHCTITSLTPVGPIQWFRGAGPARLLIYNQREGPFPRVTTVSETTRRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKLRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPS
29 EEELQIIQPDKSVSVAAGESAILHCTITSLSPVGPIQWFRGAGPARVLIYNQRQGPFPRVTTVSEGTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCIKLRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPS
30 EEEIQVIQPDKSVSVAAGESVIIHCTVTSLFPVGPIQWFRGAGPARVLIYNQRQGRFPRVTTVSEGTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKVRKGSPDTEVKSGAGTELSVRAKPS
31 EEEVQIIQPDKSVSVAAGESIILHCTVTSLFPVGPIQWFRGAGPARVLIYNQREGRFPRVTTVSEGTRRENMDFSISISNITPADAGTYYCIKLRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPS
32 EEEVQLIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLFPVGPIQWFRGAGPARVLIYNQREGPFPRVTTVSEGTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCIKFRKGSPDTEVKSGAGTELSVRAKPS
33 EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRVLIYNQRQGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCIKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS
34 EEELQIIQPDKSVSVAAGESAILHCTITSLFPVGPIQWFRGAGPARLLIYNQRQGPFPRVTTVSETTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPS
35 EEEVQIIQPDKSVSVAAGESAILHCTITSLFPVGPIQWFRGAGPARVLIYNQKQGPFPRVTTISETTRRENMDFSISISNITPADAGTYYCIKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPS
36 EEELQIIQPDKSVSVAAGESAILHCTITSLTPVGPIQWFRGAGPARVLIYNQRQGPFPRVTTVSEGTRRENMDFSISISNITPADAGTYYCIKFRKGSPDTEVKSGAGTELSVRAKPS
일부 구체예에서, 본원에서 설명된 폴리펩티드 및 폴리펩티드 구조체는 결합 검정, 예를 들면, 면역 검정을 위해 시험관내에서 활용된다. 가령, 일부 구체예에서, 본원에서 설명된 폴리펩티드 및 폴리펩티드 구조체는 액체상에서 활용되거나 또는 고체상 담체에 결합된다. 일부 구체예에서, 면역검정에 활용되는 폴리펩티드는 다양한 방식으로 검출가능하게 표지화된다.
일부 구체예에서, 본원에서 설명된 폴리펩티드 및 폴리펩티드 구조체는 다양한 담체에 결합되고, 그리고 특이적 항원 발현 세포의 존재를 검출하는데 이용된다. 담체의 실례는 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 아밀라아제, 자연 및 변형된 셀룰로오스, 폴리아크릴아미드, 아가로오스 및 자철석을 포함한다. 담체의 본성은 가용성 또는 불용성일 수 있다.
다양한 상이한 표지 및 표지화 방법이 알려져 있다. 표지의 실례는 효소, 방사성 동위원소, 형광 화합물, 콜로이드성 금속, 화학발광 화합물 및 생물발광 화합물을 포함한다. 표지를 본원에서 개시된 폴리펩티드에 결합하기 위한 다양한 기술이 가용하다.
일부 구체예에서, 폴리펩티드는 저분자량 합텐에 연계된다. 이들 합텐은 이후, 두 번째 반응물에 의하여 특이적으로 검출된다. 가령, 일부 구체예에서, 합텐 비오틴이 아비딘과 함께 이용되거나, 또는 합텐 디니트로페놀, 피리독살 또는 플루오레세인이 특정한 항합텐 항체 (가령, 각각 항-디니트로페놀 항체, 항-피리독살 항체 및 항-플루오레세인 항체)로 검출된다.
II. 변경된 글리코실화를 갖는 높은 친화성 SIRP-α D1 도메인
일부 구체예에서, 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 80에서 아미노산 돌연변이; 및 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 6, 잔기 27, 잔기 31, 잔기 47, 잔기 53, 잔기 54, 잔기 56, 잔기 66 및 잔기 92로 구성된 군에서 선택되는 잔기에서 최소한 하나의 추가 아미노산 돌연변이를 갖는 SIRP-α D1 도메인을 포함하는 신호-조절 단백질 α (SIRP-α) D1 변이체, 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드가 본원에서 개시된다.
일부 구체예에서, Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드가 또한 본원에서 개시되고, 여기서 상기 Fc 변이체는 2개의 Fc 도메인 단위체를 갖는 Fc 도메인 이합체를 포함하고, 여기서 각 Fc 도메인 단위체는 독립적으로 (i) 돌연변이 L234A, L235A, G237A 및 N297A로 구성되는 인간 IgG1 Fc 영역; (ii) 돌연변이 A330S, P331S 및 N297A로 구성되는 인간 IgG2 Fc 영역; 또는 (iii) 돌연변이 S228P, E233P, F234V, L235A, delG236 및 N297A를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역에서 선택된다.
일부 구체예에서, 본원에서 개시된 조성물에서 폴리펩티드는 감소된 또는 최소 글리코실화를 갖는 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체를 포함한다. 10개의 야생형 인간 SIRP-α 단백질 (표 1에서 서열 번호: 1-10) 각각의 D1 도메인은 서열 N80ITP 내에 아미노산 N80에서 단일 잠재적 N-연결된 글리코실화 부위를 내포한다. 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 SIRP-α D1 도메인의 발현은 16 kDa (비글리코실화된)의 주요 띠 및 엔도 Hf에 의해 제거된 더욱 높은 분자량의 마이너 띠를 유발한다. 엔도 Hf는 엔도글리코시다아제 H 및 말토오스 결합 단백질의 재조합 단백질 융합이다. 엔도 Hf는 N-연결된 당단백질로부터 높은 만노오스 및 일부 하이브리드 올리고당류의 키토비오제 코어 내부를 개열한다. 이것은 아미노산 위치 83에서 프롤린이 글리코실화의 효율을 감소시킬 수 있고, 상이한 정도의 글리코실화 및 이런 이유로, 이질성을 갖는 단백질을 야기한다는 것을 암시한다. 약물 개발 동안, 이질성은 공정 개발에서 어려움을 발생시킬 수 있다. 이런 이유로, 높은 친화성 SIPR-α D1 변이체의 균질하고, 비글리코실화된 형태를 산출하는 가능성을 조사하기 위해, 일부 구체예에서, SIPR-α D1 변이체의 아미노산 N80은 Ala로 돌연변이된다. 일부 구체예에서, 비글리코실화된, 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체를 만들기 위해, 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체 내에 아미노산 N80은 임의의 자연발생 및 비자연발생 아미노산을 비롯한 임의의 아미노산, 예를 들면, N80A 및 N80Q에 의해 대체된다. 일부 구체예에서, 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체는 N80A 돌연변이 및 최소한 1개의 추가 돌연변이 (가령, 최소한 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 추가 돌연변이 또는 그 이상)를 포함한다. 일부 구체예에서, 추가 돌연변이는 CD47 결합 부위 내에 있다. 일부 구체예에서, 추가 돌연변이는 D1 도메인의 소수성 코어 내에 있다.
일부 구체예에서, 본원에서 개시된 조성물에서 폴리펩티드는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 증가된 글리코실화를 갖는 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체를 포함한다. 최종 산물의 균질성을 증가시키는 다른 옵션은 아미노산 N80에서 글리코실화의 효율을 증강하고, 그리고 야생형에 비하여 증가된 글리코실화를 갖는 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체를 산출하는 것이다. 일부 구체예에서, 서열 NITP83 내에 아미노산 P83은 아미노산 N80에서 글리코실화의 정도에 영향을 준다. 일부 구체예에서, P83을 임의의 아미노산으로 변화시키는 것은 N80에서 글리코실화의 효율을 증가시킨다. 일부 구체예에서, 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체 내에 아미노산 P83은 자연발생 및 비자연발생 아미노산을 비롯한 임의의 아미노산, 예를 들면, P83V, P83A, P83I 및 P83L에 의해 대체된다. 일부 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 예로서, 세포주 (가령, 유전적으로 가공된 효모 또는 포유류 숙주)의 유전공학 또는 세포 배양 조건의 변경, 예를 들면, 키푸넨신의 첨가에 의해, 또는 자연적으로 비-글리코실화 숙주, 예를 들면, 원핵생물 (대장균 (E. coli) 등)을 이용함으로써, 이런 세포에 의해 발현되는 단백질을 글리코실화하지 않도록 최적화된 세포에서 발현된다.
표 5는 각 D1 도메인 변이체 서열에 비하여 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체에서 특정한 아미노산 치환을 열거한다. 일부 구체예에서, 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체는 표 5에서 열거된 하나 또는 그 이상 (가령, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개 또는 그 이상)의 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체는 글리코실화되지 않거나 또는 최소한으로 글리코실화된다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체는 완전히 글리코실화되거나 또는 거의 완전히 글리코실화된다. 일부 구체예에서, 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체는 야생형 D1 도메인에 비하여 기껏해야 14개 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체는 야생형 D1 도메인에 비하여 기껏해야 10개 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체는 야생형 D1 도메인에 비하여 기껏해야 7개 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체는 야생형 D1 도메인의 서열에 최소한 90% (가령, 최소한 92%, 95%, 97% 또는 97% 이상)의 아미노산 서열 동일성을 갖는다.
일부 구체예에서, 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체는 2개 또는 그 이상의 야생형 D1 도메인 또는 이들의 변이체의 일부분 (가령, 한 야생형 D1 도메인 또는 이의 변이체의 일부분 및 다른 야생형 D1 도메인 또는 이의 변이체의 일부분)을 포함하는 키메라 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체이다. 일부 구체예에서, 키메라 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체는 야생형 D1 도메인 또는 이들의 변이체의 최소한 2개의 부분 (가령, 3개, 4개, 5개 또는 그 이상의 부분)을 포함하고, 여기서 각 부분은 상이한 야생형 D1 도메인으로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 키메라 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체는 표 5에서 열거된 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환을 더욱 포함한다.
표 5. 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체에서 아미노산 치환
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
일부 구체예에서, 폴리펩티드는 다음의 서열을 갖는 SIRP-α D1 변이체를 포함한다:
EEEX1QX2IQPDKSVLVAAGETX3TLRCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPGRX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSDX10TX11RNNMDFSIRIGX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDDVEX16KSGAGTELSVRAKPS (서열 번호: 37), 여기서 X1은 L, I, 또는 V이고; X2는 V, L, 또는 I이고; X3은 A 또는 V이고; X4는 A, I, 또는 L이고; X5는 I, T, S, 또는 F이고; X6은 E, V, 또는 L이고; X7은 K 또는 R이고; X8은 E 또는 Q이고; X9는 H, P, 또는 R이고; X10은 L, T, 또는 G이고; X11은 K 또는 R이고; X12는 N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; X13은 P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; X14는 V 또는 I이고; X15는 F, L, 또는 V이고; 그리고 X16은 F 또는 V이고; 그리고 여기서 상기 변이체는 서열 번호: 1의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 최소한 하나의 아미노산 치환을 갖는다.
일부 구체예에서, 폴리펩티드는 다음의 서열을 갖는 SIRP-α D1 변이체를 포함한다:
EEGX1QX2IQPDKSVSVAAGESX3ILHCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPGRX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSDX10TX11RNNMDFSIRIGX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDDVEX16KSGAGTELSVRAKPS (서열 번호: 40), 여기서 X1은 L, I, 또는 V이고; X2는 V, L, 또는 I이고; X3은 A 또는 V이고; X4는 A, I, 또는 L이고; X5는 I, T, S, 또는 F이고; X6은 E, V, 또는 L이고; X7은 K 또는 R이고; X8은 E 또는 Q이고; X9는 H, P, 또는 R이고; X10은 L, T, 또는 G이고; X11은 K 또는 R이고; X12는 N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; X13은 P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; X14는 V 또는 I이고; X15는 F, L, 또는 V이고; 그리고 X16은 F 또는 V이고; 그리고 여기서 상기 변이체는 서열 번호: 4의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 최소한 하나의 아미노산 치환을 갖는다.
일부 구체예에서, 폴리펩티드는 다음의 서열을 갖는 SIRP-α D1 변이체를 포함한다:
EEEX1QX2IQPDKFVLVAAGETX3TLRCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPGRX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSDX10TX11RNNMDFSIRIGX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDDVEX16KSGAGTELSVRAKPS (서열 번호: 41), 여기서 X1은 L, I, 또는 V이고; X2는 V, L, 또는 I이고; X3은 A 또는 V이고; X4는 A, I, 또는 L이고; X5는 I, T, S, 또는 F이고; X6은 E, V, 또는 L이고; X7은 K 또는 R이고; X8은 E 또는 Q이고; X9는 H, P, 또는 R이고; X10은 L, T, 또는 G이고; X11은 K 또는 R이고; X12는 N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; X13은 P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; X14는 V 또는 I이고; X15는 F, L, 또는 V이고; 그리고 X16은 F 또는 V이고; 그리고 여기서 상기 변이체는 서열 번호: 5의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 최소한 하나의 아미노산 치환을 갖는다.
일부 구체예에서, 폴리펩티드는 다음의 서열을 갖는 SIRP-α D1 변이체를 포함한다:
EEEX1QX2IQPDKSVLVAAGETX3TLRCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPGRX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSDX10TX11RNNMDFPIRIGX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDDVEX16KSGAGTELSVRAKPS (서열 번호: 42), 그리고 여기서 X1은 L, I, 또는 V이고; X2는 V, L, 또는 I이고; X3은 A 또는 V이고; X4는 A, I, 또는 L이고; X5는 I, T, S, 또는 F이고; X6은 E, V, 또는 L이고; X7은 K 또는 R이고; X8은 E 또는 Q이고; X9는 H, P, 또는 R이고; X10은 L, T, 또는 G이고; X11은 K 또는 R이고; X12는 N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; X13은 P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; X14는 V 또는 I이고; X15는 F, L, 또는 V이고; 그리고 X16은 F 또는 V이고; 그리고 여기서 상기 변이체는 서열 번호: 6의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 최소한 하나의 아미노산 치환을 갖는다.
일부 구체예에서, 폴리펩티드는 다음의 서열을 갖는 SIRP-α D1 변이체를 포함한다:
EEEX1QX2IQPDKSVLVAAGETX3TLRCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPGRX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSDX10TX11RNNMDFSIRISX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDDVEX16KSGAGTELSVRAKPS (서열 번호: 45), 그리고 여기서 X1은 L, I, 또는 V이고; X2는 V, L, 또는 I이고; X3은 A 또는 V이고; X4는 A, I, 또는 L이고; X5는 I, T, S, 또는 F이고; X6은 E, V, 또는 L이고; X7은 K 또는 R이고; X8은 E 또는 Q이고; X9는 H, P, 또는 R이고; X10은 L, T, 또는 G이고; X11은 K 또는 R이고; X12는 N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; X13은 P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; X14는 V 또는 I이고; X15는 F, L, 또는 V이고; 그리고 X16은 F 또는 V이고; 그리고 여기서 상기 변이체는 서열 번호: 9의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 최소한 하나의 아미노산 치환을 갖는다.
본 발명의 이러한 양상에서 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, 폴리펩티드는 서열 번호: 37, 40-42 및 45 중에서 한 가지의 서열을 갖는 SIRP-α D1 변이체를 포함하고, 여기서 X1은 L, I, 또는 V이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X2는 V, L, 또는 I이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X3은 A 또는 V이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X4는 A, I, 또는 L이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X5는 I, T, S, 또는 F이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X6은 E, V, 또는 L이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X7은 K 또는 R이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X8은 E 또는 Q이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X9는 H, P, 또는 R이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X10은 L, T, 또는 G이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X11은 K 또는 R이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X12는 N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X13은 P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X14는 V 또는 I이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X15는 F, L, V이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X16은 F 또는 V이다.
일부 구체예에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드는 서열 번호: 1, 4-6 및 9 중에서 한 가지의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 10개 이내의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드는 서열 번호: 1, 4-6 및 9 중에서 한 가지의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 7개 이내의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 1, 4-6 및 9 중에서 한 가지의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인보다 최소한 10배 큰 결합 친화성으로 CD47에 결합한다. 일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 1, 4-6 및 9 중에서 한 가지의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인보다 최소한 100배 큰 결합 친화성으로 CD47에 결합한다. 일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 1, 4-6 및 9 중에서 한 가지의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인보다 최소한 1000배 큰 결합 친화성으로 CD47에 결합한다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체 폴리펩티드 또는 이의 단편은 1 x 10-8 M보다 적은, 5 x 10-9 M보다 적은, 1 x 10-9 M보다 적은, 5 x 10-10 M보다 적은, 1 x 10-10 M보다 적은 또는 1 x 10-11 M보다 적은 KD로 CD47에 결합한다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체 폴리펩티드 또는 이의 단편은 약 500 nM 및 100 nM 사이, 약 100 nM 및 50 nM 사이, 약 50 nM 및 10 nM 사이, 약 10 nM 및 5 nM 사이, 약 5 nM 및 1 nM 사이, 약 1 nM 및 500 pM 사이, 약 500 pM 및 100 pM 사이, 약 100 pM 및 50 pM 사이, 또는 약 50 pM 및 10 pM 사이의 KD로 CD47에 결합한다.
일부 구체예에서, 폴리펩티드는 다음의 서열을 갖는 SIRP-α D1 변이체를 포함한다:
EEEX1QX2IQPDKSVSVAAGESX3ILHCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPARX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSEX10TX11RENMDFSISISX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDTEX16KSGAGTELSVRAKPS (서열 번호: 38), 여기서 X1은 L, I, 또는 V이고; X2는 V, L, 또는 I이고; X3은 A 또는 V이고; X4는 V, I, 또는 L이고; X5는 I, T, S, 또는 F이고; X6은 E, V, 또는 L이고; X7은 K 또는 R이고; X8은 E 또는 Q이고; X9는 H, P, 또는 R이고; X10은 S, T, 또는 G이고; X11은 K 또는 R이고; X12는 N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; X13은 P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; X14는 V 또는 I이고; X15는 F, L, 또는 V이고; 그리고 X16은 F 또는 V이고; 그리고 여기서 상기 변이체는 서열 번호: 2의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 최소한 하나의 아미노산 치환을 갖는다.
일부 구체예에서, 폴리펩티드는 다음의 서열을 갖는 SIRP-α D1 변이체를 포함한다:
EEEX1QX2IQPDKSVSVAAGESX3ILLCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPARX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSEX10TX11RENMDFSISISX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDTEX16KSGAGTELSVRAKPS (서열 번호: 39), 여기서 X1은 L, I, 또는 V이고; X2는 V, L, 또는 I이고; X3은 A 또는 V이고; X4는 V, I, 또는 L이고; X5는 I, T, S, 또는 F이고; X6은 E, V, 또는 L이고; X7은 K 또는 R이고; X8은 E 또는 Q이고; X9는 H, P, 또는 R이고; X10은 S, T, 또는 G이고; X11은 K 또는 R이고; X12는 N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; X13은 P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; X14는 V 또는 I이고; X15는 F, L, 또는 V이고; 그리고 X16은 F 또는 V이고; 그리고 여기서 상기 변이체는 서열 번호: 3의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 최소한 하나의 아미노산 치환을 갖는다.
일부 구체예에서, 폴리펩티드는 다음의 서열을 갖는 SIRP-α D1 변이체를 포함한다:
EEEX1QX2IQPDKSVSVAAGESX3ILHCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPARX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSEX10TX11RENMDFSISISX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDTEX16KSGAGTELSVRGKPS (서열 번호: 43), 여기서 X1은 L, I, 또는 V이고; X2는 V, L, 또는 I이고; X3은 A 또는 V이고; X4는 V, I, 또는 L이고; X5는 I, T, S, 또는 F이고; X6은 E, V, 또는 L이고; X7은 K 또는 R이고; X8은 E 또는 Q이고; X9는 H, P, 또는 R이고; X10은 S, T, 또는 G이고; X11은 K 또는 R이고; X12는 N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; X13은 P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; X14는 V 또는 I이고; X15는 F, L, 또는 V이고; 그리고 X16은 F 또는 V이고; 그리고 여기서 상기 변이체는 서열 번호: 7의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 최소한 하나의 아미노산 치환을 갖는다.
일부 구체예에서, 폴리펩티드는 다음의 서열을 갖는 SIRP-α D1 변이체를 포함한다:
EEEX1QX2IQPDKSVSVAAGESX3ILHCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPARX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSEX10TX11RENMDFSISISX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDTEX16KSGAGTELSVRAKPS (서열 번호: 46), 여기서 X1은 L, I, 또는 V이고; X2는 V, L, 또는 I이고; X3은 A 또는 V이고; X4는 V, I, 또는 L이고; X5는 I, T, S, 또는 F이고; X6은 E, V, 또는 L이고; X7은 K 또는 R이고; X8은 E 또는 Q이고; X9는 H, P, 또는 R이고; X10은 S, T, 또는 G이고; X11은 K 또는 R이고; X12는 N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; X13은 P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; X14는 V 또는 I이고; X15는 F, L, 또는 V이고; 그리고 X16은 F 또는 V이고; 그리고 여기서 상기 변이체는 서열 번호: 10의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 최소한 하나의 아미노산 치환을 갖는다.
본 발명의 이러한 양상에서 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, 폴리펩티드는 서열 번호: 38, 39, 43 및 46 중에서 한 가지의 서열을 갖는 SIRP-α D1 변이체를 포함하고, 여기서 X1은 L, I, 또는 V이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X2는 V, L, 또는 I이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X3은 A 또는 V이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X4는 V, I, 또는 L이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X5는 I, T, S, 또는 F이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X6은 E, V, 또는 L이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X7은 K 또는 R이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X8은 E 또는 Q이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X9는 H, P, 또는 R이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X10은 S, T, 또는 G이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X11은 K 또는 R이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X12는 N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X13은 P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X14는 V 또는 I이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X15는 F, L, 또는 V이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X16은 F 또는 V이다.
일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 2, 3, 7 및 10 중에서 한 가지의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 10개 이내의 아미노산 치환을 갖는 SIRP-α D1 변이체를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 2, 3, 7 및 10 중에서 한 가지의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 7개 이내의 아미노산 치환을 갖는 SIRP-α D1 변이체를 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 2, 3, 7 및 10 중에서 한 가지의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인보다 최소한 10배 큰 결합 친화성으로 CD47에 결합한다. 일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 2, 3, 7 및 10 중에서 한 가지의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인보다 최소한 100배 큰 결합 친화성으로 CD47에 결합한다. 일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 2, 3, 7 및 10 중에서 한 가지의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인보다 최소한 1000배 큰 결합 친화성으로 CD47에 결합한다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체 폴리펩티드 또는 이의 단편은 1 x 10-8 M보다 적은, 5 x 10-9 M보다 적은, 1 x 10-9 M보다 적은, 5 x 10-10 M보다 적은, 1 x 10-10 M보다 적은 또는 1 x 10-11 M보다 적은 KD로 CD47에 결합한다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체 폴리펩티드 또는 이의 단편은 약 500 nM 및 100 nM 사이, 약 100 nM 및 50 nM 사이, 약 50 nM 및 10 nM 사이, 약 10 nM 및 5 nM 사이, 약 5 nM 및 1 nM 사이, 약 1 nM 및 500 pM 사이, 약 500 pM 및 100 pM 사이, 약 100 pM 및 50 pM 사이, 또는 약 50 pM 및 10 pM 사이의 KD로 CD47에 결합한다.
일부 구체예에서, 폴리펩티드는 다음의 서열을 갖는 SIRP-α D1 변이체를 포함한다:
EEEX1QX2IQPDKSVLVAAGETX3TLRCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPARX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSEX10TX11RENMDFSISISX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDTEX16KSGAGTELSVRAKPS (서열 번호: 44), 여기서 X1은 L, I, 또는 V이고; X2는 V, L, 또는 I이고; X3은 A 또는 V이고; X4는 A, I, 또는 L이고; X5는 I, T, S, 또는 F이고; X6은 E, V, 또는 L이고; X7은 K 또는 R이고; X8은 E 또는 Q이고; X9는 H, P, 또는 R이고; X10은 S, T, 또는 G이고; X11은 K 또는 R이고; X12는 N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; X13은 P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; X14는 V 또는 I이고; X15는 F, L, 또는 V이고; 그리고 X16은 F 또는 V이고; 그리고 여기서 상기 변이체는 서열 번호: 8의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 최소한 하나의 아미노산 치환을 갖는다.
일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 44의 서열을 갖고, 여기서 X1은 L, I, 또는 V이다. 본 발명의 이러한 양상에서 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X2는 V, L, 또는 I이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X3은 A 또는 V이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X4는 A, I, 또는 L이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X5는 I, T, S, 또는 F이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X6은 E, V, 또는 L이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X7은 K 또는 R이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X8은 E 또는 Q이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X9는 H, P, 또는 R이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X10은 S, T, 또는 G이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X11은 K 또는 R이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X12는 N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X13은 P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X14는 V 또는 I이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X15는 F, L, 또는 V이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X16은 F 또는 V이다.
일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 8의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 10개 이내의 아미노산 치환을 갖는 SIRP-α D1 변이체를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 8의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 7개 이내의 아미노산 치환을 갖는 SIRP-α D1 변이체를 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 8의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인보다 최소한 10배 큰 결합 친화성으로 CD47에 결합한다. 일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 8의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인보다 최소한 100배 큰 결합 친화성으로 CD47에 결합한다. 일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 8의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인보다 최소한 1000배 큰 결합 친화성으로 CD47에 결합한다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체 폴리펩티드 또는 이의 단편은 1 x 10-8 M보다 적은, 5 x 10-9 M보다 적은, 1 x 10-9 M보다 적은, 5 x 10-10 M보다 적은, 1 x 10-10 M보다 적은 또는 1 x 10-11 M보다 적은 KD로 CD47에 결합한다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체 폴리펩티드 또는 이의 단편은 약 500 nM 및 100 nM 사이, 약 100 nM 및 50 nM 사이, 약 50 nM 및 10 nM 사이, 약 10 nM 및 5 nM 사이, 약 5 nM 및 1 nM 사이, 약 1 nM 및 500 pM 사이, 약 500 pM 및 100 pM 사이, 약 100 pM 및 50 pM 사이, 또는 약 50 pM 및 10 pM 사이의 KD로 CD47에 결합한다.
다른 양상에서, 본 발명은 다음의 서열을 갖는 SIRP-α D1 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 특징으로 한다:
EEX1X2QX3IQPDKX4VX5VAAGEX6X7X8LX9CTX10TSLX11PVGPIQWFRGAGPX12RX13LIYNQX14X15GX16FPRVTTVSX17X18TX19RX20NMDFX21IX22IX23X24ITX25ADAGTYYCX26KX27RKGSPDX28X29EX30KSGAGTELSVRX31KPS (서열 번호: 47), 여기서 X1은 E 또는 G이고; X2는 L, I, 또는 V이고; X3은 V, L, 또는 I이고; X4는 S 또는 F이고; X5는 L 또는 S이고; X6은 S 또는 T이고; X7은 A 또는 V이고; X8은 I 또는 T이고; X9는 H, R, 또는 L이고; X10은 A, V, I, 또는 L이고; X11은 I, T, S, 또는 F이고; X12는 A 또는 G이고; X13은 E, V, 또는 L이고; X14는 K 또는 R이고; X15는 E 또는 Q이고; X16은 H, P, 또는 R이고; X17은 D 또는 E이고; X18은 S, L, T, 또는 G이고; X19는 K 또는 R이고; X20은 E 또는 N이고; X21은 S 또는 P이고; X22는 S 또는 R이고; X23은 S 또는 G이고; X24는 임의의 아미노산이고; X25는 임의의 아미노산이고; X26은 V 또는 I이고; X27은 F, L, V이고; X28은 D 또는 부재하고; X29는 T 또는 V이고; X30은 F 또는 V이고; 그리고 X31은 A 또는 G이고; 그리고 여기서 상기 변이체는 서열 번호: 1-10 중에서 한 가지의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 최소한 하나의 아미노산 치환을 갖는다.
일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 47의 서열을 갖고, 여기서 X1은 E 또는 G이다. 본 발명의 이러한 양상에서 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X2는 L, I, 또는 V이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X3은 V, L, 또는 I이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X4는 S 또는 F이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X5는 L 또는 S이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X6은 S 또는 T이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X7은 A 또는 V이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X8은 I 또는 T이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X9는 H, R, 또는 L이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X10은 A, V, I, 또는 L이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X11은 I, T, S, 또는 F이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X12는 A 또는 G이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X13은 E, V, 또는 L이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X14는 K 또는 R이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X15는 E 또는 Q이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X16은 H, P, 또는 R이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X17은 D 또는 E이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X18은 S, L, T, 또는 G이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X19는 K 또는 R이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X20은 E 또는 N이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X21은 S 또는 P이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X22는 S 또는 R이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X23은 S 또는 G이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X24는 N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X25는 P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X26은 V 또는 I이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X27은 F, L, V이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X28은 D 또는 부재한다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X29는 T 또는 V이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X30은 F 또는 V이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X31은 A 또는 G이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 이러한 양상의 폴리펩티드는 서열 번호: 1-10 중에서 한 가지의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 10개 이내의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 이러한 양상의 폴리펩티드는 서열 번호: 1-10 중에서 한 가지의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 7개 이내의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 1-10 중에서 한 가지의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인보다 최소한 10배 큰 결합 친화성으로 CD47에 결합한다. 일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 1-10 중에서 한 가지의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인보다 최소한 100배 큰 결합 친화성으로 CD47에 결합한다. 일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 1-10 중에서 한 가지의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인보다 최소한 1000배 큰 결합 친화성으로 CD47에 결합한다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체 폴리펩티드 또는 이의 단편은 1 x 10-8 M보다 적은, 5 x 10-9 M보다 적은, 1 x 10-9 M보다 적은, 5 x 10-10 M보다 적은, 1 x 10-10 M보다 적은 또는 1 x 10-11 M보다 적은 KD로 CD47에 결합한다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체 폴리펩티드 또는 이의 단편은 약 500 nM 및 100 nM 사이, 약 100 nM 및 50 nM 사이, 약 50 nM 및 10 nM 사이, 약 10 nM 및 5 nM 사이, 약 5 nM 및 1 nM 사이, 약 1 nM 및 500 pM 사이, 약 500 pM 및 100 pM 사이, 약 100 pM 및 50 pM 사이, 또는 약 50 pM 및 10 pM 사이의 KD로 CD47에 결합한다.
일부 구체예에서, 폴리펩티드는 다음의 서열을 갖는 SIRP-α D1 변이체:
EEELQX1IQPDKSVX2VAAGEX3AX4LX5CTX6TSLX7PVGPIQWFRGAGPX8RX9LIYNQX10X11GX12FPRVTTVSX13X14TKRX15NMDFSIX16IX17X18ITPADAGTYYCX19KFRKGX20X21X22DX23EFKSGAGTELSVRAKPS (서열 번호: 48), 여기서 X1은 V 또는 I이고; X2는 L 또는 S이고; X3은 T 또는 S이고; X4는 T 또는 I이고; X5는 R 또는 H이고; X6은 A, V, 또는 I이고; X7은 I, R, Y, K 또는 F이고; X8은 G 또는 A이고; X9는 E 또는 V이고; X10은 K 또는 R이고; X11은 E, D 또는 Q이고; X12는 H 또는 P이고; X13은 D 또는 E이고; X14는 S, L 또는 T이고; X15는 N 또는 E이고; X16은 R 또는 S이고; X17은 G 또는 S이고; X18은 N 또는 A이고; X19는 V 또는 I이고; X20은 S, I 또는 M이고; X21은 P 또는 부재하고; X22는 D 또는 P이고; 그리고 X23은 V 또는 T이고, 또는 이의 단편을 포함한다.
다른 양상에서, 본 발명은 다음의 서열을 갖는 SIRP-α D1 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 특징으로 한다:
EEELQX1IQPDKSVLVAAGETATLRCTX2TSLX3PVGPIQWFRGAGPGRX4LIYNQX5X6GX7FPRVTTVSDX8TKRNNMDFSIRIGX9ITPADAGTYYCX10KFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS (서열 번호: 49), 여기서 X1은 V, L, 또는 I이고; X2는 A, I, V, 또는 L이고; X3은 I, F, S, 또는 T이고; X4는 E, V, 또는 L이고; X5는 K 또는 R이고; X6은 E 또는 Q이고; X7은 H, P, 또는 R이고; X8은 L, T, S, 또는 G이고; X9는 A이고; 그리고 X10은 V 또는 I이고; 그리고 여기서 상기 변이체는 서열 번호: 1의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 최소한 하나의 아미노산 치환을 갖는다.
일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 49의 서열을 갖고, 여기서 X1은 V, L 또는 I이다. 본 발명의 이러한 양상에서 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X2는 A, I, V, 또는 L이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X3은 I, F, S, 또는 T이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X4는 E, V, 또는 L이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X5는 K 또는 R이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X6은 E 또는 Q이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X7은 H, P, 또는 R이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X8은 L, T, S 또는 G이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X9는 A이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X10은 V 또는 I이다.
일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 49에 최소한 85% 서열 동일성 (가령, 최소한 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 높은 친화성 SIRP-α D1 도메인을 갖고, 여기서 X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X9 및 X10 각각은 야생형 아미노산이 아니다.
일부 구체예에서, 본 발명의 이러한 양상의 폴리펩티드는 서열 번호: 1의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 10개 이내의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 이러한 양상의 폴리펩티드는 서열 번호: 1의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 7개 이내의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 1의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인보다 최소한 10배 큰 결합 친화성으로 CD47에 결합한다. 일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 1의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인보다 최소한 100배 큰 결합 친화성으로 CD47에 결합한다. 일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 1의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인보다 최소한 1000배 큰 결합 친화성으로 CD47에 결합한다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체 폴리펩티드 또는 이의 단편은 1 x 10-8 M보다 적은, 5 x 10-9 M보다 적은, 1 x 10-9 M보다 적은, 5 x 10-10 M보다 적은, 1 x 10-10 M보다 적은 또는 1 x 10-11 M보다 적은 KD로 CD47에 결합한다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체 폴리펩티드 또는 이의 단편은 약 500 nM 및 100 nM 사이, 약 100 nM 및 50 nM 사이, 약 50 nM 및 10 nM 사이, 약 10 nM 및 5 nM 사이, 약 5 nM 및 1 nM 사이, 약 1 nM 및 500 pM 사이, 약 500 pM 및 100 pM 사이, 약 100 pM 및 50 pM 사이, 또는 약 50 pM 및 10 pM 사이의 KD로 CD47에 결합한다.
다른 양상에서, 본 발명은 다음의 서열을 갖는 SIRP-α D1 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 특징으로 한다:
EEELQX1IQPDKSVSVAAGESAILHCTX2TSLX3PVGPIQWFRGAGPARX4LIYNQX5X6GX7FPRVTTVSEX8TKRENMDFSISISX9ITPADAGTYYCX10KFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPS, (서열 번호: 50), 여기서 X1은 V 또는 I이고; X2는 V 또는 I이고; X3은 I 또는 F이고; X4는 E 또는 V이고; X5는 K 또는 R이고; X6은 E 또는 Q이고; X7은 H 또는 P이고; X8은 S 또는 T이고; X9는 N 또는 A이고; 그리고 X10 V 또는 I이고; 그리고 여기서 상기 변이체는 서열 번호: 2의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 최소한 하나의 아미노산 치환을 갖는다.
일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 50의 서열을 갖고, 여기서 X1은 V 또는 I이다. 본 발명의 이러한 양상에서 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X2는 V 또는 I이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X3은 I 또는 F이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X4는 E 또는 V이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X5는 K 또는 R이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X6은 E 또는 Q이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X7은 H 또는 P이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X8은 S 또는 R이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X9는 N 또는 A이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X10은 V 또는 I이다.
일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 50에 최소한 85% 서열 동일성 (가령, 최소한 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 높은 친화성 SIRP-α D1 도메인을 갖고, 여기서 X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X9 및 X10 각각은 야생형 아미노산이 아니다.
일부 구체예에서, 본 발명의 이러한 양상의 폴리펩티드는 서열 번호: 2의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 10개 이내의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 이러한 양상의 폴리펩티드는 서열 번호: 2의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 7개 이내의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 2의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인보다 최소한 10배 큰 결합 친화성으로 CD47에 결합한다. 일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 2의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인보다 최소한 100배 큰 결합 친화성으로 CD47에 결합한다. 일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 2의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인보다 최소한 1000배 큰 결합 친화성으로 CD47에 결합한다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체 폴리펩티드 또는 이의 단편은 1 x 10-8 M보다 적은, 5 x 10-9 M보다 적은, 1 x 10-9 M보다 적은, 5 x 10-10 M보다 적은, 1 x 10-10 M보다 적은 또는 1 x 10-11 M보다 적은 KD로 CD47에 결합한다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체 폴리펩티드 또는 이의 단편은 약 500 nM 및 100 nM 사이, 약 100 nM 및 50 nM 사이, 약 50 nM 및 10 nM 사이, 약 10 nM 및 5 nM 사이, 약 5 nM 및 1 nM 사이, 약 1 nM 및 500 pM 사이, 약 500 pM 및 100 pM 사이, 약 100 pM 및 50 pM 사이, 또는 약 50 pM 및 10 pM 사이의 KD로 CD47에 결합한다.
다른 양상에서, 본 발명은 다음의 서열을 갖는 SIRP-α D1 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 특징으로 한다:
EEELQX1IQPDKSVLVAAGETATLRCTX2TSLX3PVGPIQWFRGAGPGRX4LIYNQX5EGX6FPRVTTVSDX7TKRNNMDFSIRIGX8ITPADAGTYYCX9KFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS (서열 번호: 51), 여기서 X1은 V 또는 I이고; X2는 A 또는 I이고; X3은 I 또는 F이고; X4는 E 또는 V이고; X5는 K 또는 R이고; X6은 H 또는 P이고; X7은 L 또는 T이고; X8은 N 이외에 임의의 아미노산이고; 그리고 X9는 V 또는 I이고; 그리고 여기서 상기 변이체는 서열 번호: 1의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 최소한 하나의 아미노산 치환을 갖는다.
일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 51의 서열을 갖고, 여기서 X1은 V 또는 I이다. 본 발명의 이러한 양상에서 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X2는 A 또는 I이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X3은 I 또는 F이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X4는 E 또는 V이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X5는 K 또는 R이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X6은 H 또는 P이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X7은 L 또는 T이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X8은 N 또는 A이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X9는 V 또는 I이다. 일부 구체예에서, X4는 V가 아니다.
일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 51의 서열을 갖고, 여기서 X8은 A이다. 본 발명의 이러한 양상에서 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X8은 A이고 X1은 V 또는 I이다. 본 발명의 이러한 양상에서 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X8은 A이고 X2는 A 또는 I이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X8은 A이고 X3은 I 또는 F이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X8은 A이고 X4는 E 또는 V이다. 일부 구체예에서, X4는 V가 아니다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X8은 A이고 X5는 K 또는 R이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X8은 A이고 X6은 H 또는 P이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X8은 A이고 X7은 A 또는 V이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X8은 A이고 X9는 V 또는 I이다.
일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 51의 서열을 갖고, 여기서 X8은 A이다. 본 발명의 이러한 양상에서 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X8은 이고 X1은 I이다. 본 발명의 이러한 양상에서 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X8은 A이고 X2는 I이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X8은 A이고 X3은 F이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X8은 A이고 X4는 V이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X8은 A이고 X5는 R이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X8은 A이고 X6은 P이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X8은 A이고 X7은 T이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X8은 A이고 X9는 I이다.
일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 51에 최소한 85% 서열 동일성 (가령, 최소한 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 높은 친화성 SIRP-α D1 도메인을 갖고, 여기서 X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8 및 X9 각각은 야생형 아미노산이 아니다.
일부 구체예에서, 본 발명의 이러한 양상의 폴리펩티드는 서열 번호: 1의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 10개 이내의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 이러한 양상의 폴리펩티드는 서열 번호: 1의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 7개 이내의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 1의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인보다 최소한 10배 큰 결합 친화성으로 CD47에 결합한다. 일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 1의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인보다 최소한 100배 큰 결합 친화성으로 CD47에 결합한다. 일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 1의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인보다 최소한 1000배 큰 결합 친화성으로 CD47에 결합한다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체 폴리펩티드 또는 이의 단편은 1 x 10-8 M보다 적은, 5 x 10-9 M보다 적은, 1 x 10-9 M보다 적은, 5 x 10-10 M보다 적은, 1 x 10-10 M보다 적은 또는 1 x 10-11 M보다 적은 KD로 CD47에 결합한다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체 폴리펩티드 또는 이의 단편은 약 500 nM 및 100 nM 사이, 약 100 nM 및 50 nM 사이, 약 50 nM 및 10 nM 사이, 약 10 nM 및 5 nM 사이, 약 5 nM 및 1 nM 사이, 약 1 nM 및 500 pM 사이, 약 500 pM 및 100 pM 사이, 약 100 pM 및 50 pM 사이, 또는 약 50 pM 및 10 pM 사이의 KD로 CD47에 결합한다.
다른 양상에서, 본 발명은 다음의 서열을 갖는 SIRP-α D1 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 특징으로 한다:
EEELQX1IQPDKSVLVAAGETATLRCTX2TSLX3PVGPIQWFRGAGPGRELIYNQX4EGX5FPRVTTVSDX6TKRNNMDFSIRIGX7ITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS (서열 번호: 52), 여기서 X1은 V, L, 또는 I이고; X2는 A, I, 또는 L이고; X3은 I, T, S, 또는 F이고; X4는 K 또는 R이고; X5는 H, P, 또는 R이고; X6은 L, T, 또는 G이고; X7은 N 또는 A이고; 그리고 여기서 상기 변이체는 서열 번호: 1에 따른 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 최소한 하나의 아미노산 치환을 갖는다.
일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 52의 서열을 갖고, 여기서 X1은 V, L, 또는 I이다. 본 발명의 이러한 양상에서 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X2는 A, I, 또는 L이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X3은 I, T, S, 또는 F이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X4는 K 또는 R이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X5는 H 또는 P이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X6은 L, T, 또는 G이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X7은 N 또는 A이다.
일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 52의 서열을 갖고, 여기서 X1은 V 또는 I이다. 본 발명의 이러한 양상에서 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X2는 A 또는 I이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X3은 I 또는 F이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X4는 K 또는 R이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X5는 H 또는 P이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X6은 L 또는 T이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X7은 N 또는 A이다.
일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 52의 서열을 갖고, 여기서 X7은 A이다. 본 발명의 이러한 양상에서 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X7은 A이고 X1은 V 또는 I이다. 본 발명의 이러한 양상에서 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X7은 A이고 X2는 A 또는 I이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X7은 A이고 X3은 I 또는 F이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X7은 A이고 X4는 K 또는 R이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X7은 A이고 X5는 H 또는 P이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X7은 A이고 X6은 L 또는 T이다.
일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 52의 서열을 갖고, 여기서 X7은 A이다. 본 발명의 이러한 양상에서 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X7은 A이고 X1은 I이다. 본 발명의 이러한 양상에서 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X7은 A이고 X2는 I이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X7은 A이고 X3은 F이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X7은 A이고 X4는 R이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X7은 A이고 X5는 P이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X7은 A이고 X6은 T이다.
일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 52에 최소한 85% 서열 동일성 (가령, 최소한 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 높은 친화성 SIRP-α D1 도메인을 갖고, 여기서 X1, X2, X3, X4, X5, X6 및 X7 각각은 야생형 아미노산이 아니다.
일부 구체예에서, 본 발명의 이러한 양상의 폴리펩티드는 서열 번호: 1의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 10개 이내의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 이러한 양상의 폴리펩티드는 서열 번호: 1의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 7개 이내의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 1의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인보다 최소한 10배 큰 결합 친화성으로 CD47에 결합한다. 일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 1의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인보다 최소한 100배 큰 결합 친화성으로 CD47에 결합한다. 일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 1의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인보다 최소한 1000배 큰 결합 친화성으로 CD47에 결합한다. 일부 구체예에서, 단편은 길이에서 10개보다 적은 아미노산, 길이에서 약 10개 아미노산, 길이에서 약 20개 아미노산, 길이에서 약 30개 아미노산, 길이에서 약 40개 아미노산, 길이에서 약 50개 아미노산, 길이에서 약 60개 아미노산, 길이에서 약 70개 아미노산, 길이에서 약 80개 아미노산, 길이에서 약 90개 아미노산, 길이에서 약 100개 아미노산, 또는 길이에서 약 100개 보다 많은 아미노산의 폴리펩티드를 포함한다. 단편은 CD47에 결합하는 능력을 유지한다. 바람직하게는, SIRP-α D1 변이체 폴리펩티드 및 이들의 단편은 SIRP-α 폴리펩티드가 CD47에 결합하는 것보다 더욱 높은 친화성으로 CD47에 결합한다. 가령, 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체 폴리펩티드 또는 이의 단편은 1 x 10-8 M보다 적은, 5 x 10-9 M보다 적은, 1 x 10-9 M보다 적은, 5 x 10-10 M보다 적은, 1 x 10-10 M보다 적은 또는 1 x 10-11 M보다 적은 KD로 CD47에 결합한다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체 폴리펩티드 또는 이의 단편은 약 500 nM 및 100 nM 사이, 약 100 nM 및 50 nM 사이, 약 50 nM 및 10 nM 사이, 약 10 nM 및 5 nM 사이, 약 5 nM 및 1 nM 사이, 약 1 nM 및 500 pM 사이, 약 500 pM 및 100 pM 사이, 약 100 pM 및 50 pM 사이, 또는 약 50 pM 및 10 pM 사이의 KD로 CD47에 결합한다.
다른 양상에서, 본 발명은 다음의 서열을 갖는 SIRP-α D1 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 특징으로 한다:
EEELQX1IQPDKSVSVAAGESAILHCTX2TSLX3PVGPIQWFRGAGPARELIYNQX4EGX5FPRVTTVSEX6TKRENMDFSISISX7ITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPS (서열 번호: 212), 여기서 X1은 V, L, 또는 I이고; X2는 V, I, 또는 L이고; X3은 I, T, S, 또는 F이고; X4는 K 또는 R이고; X5는 H, P, 또는 R이고; X6은 S, T, 또는 G이고; X7은 A이고; 그리고 여기서 상기 변이체는 서열 번호: 2의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 최소한 하나의 아미노산 치환을 갖는다.
일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 212의 서열을 갖고, 여기서 X1은 V, L, 또는 I이다. 본 발명의 이러한 양상에서 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X2는 V, I, 또는 L이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X3은 I, T, S, 또는 F이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X4는 K 또는 R이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X5는 H이고 또는 P이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X6은 S, T, 또는 G이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X7은 A이다.
일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 212의 서열을 갖고, 여기서 X1은 V 또는 I이다. 본 발명의 이러한 양상에서 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X2는 V 또는 I이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X3은 I 또는 F이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X4는 K 또는 R이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X5는 H 또는 P이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X6은 S 또는 T이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X7은 A이다.
일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 212의 서열을 갖고, 여기서 X7은 A이다. 본 발명의 이러한 양상에서 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X7은 A이고 X1은 V 또는 I이다. 본 발명의 이러한 양상에서 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X7은 A이고 X2는 V 또는 I이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X7은 A이고 X3은 I 또는 F이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X7은 A이고 X4는 K 또는 R이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X7은 A이고 X5는 H 또는 P이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X7은 A이고 X6은 S 또는 T이다.
일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 212의 서열을 갖고, 여기서 X7은 A이다. 본 발명의 이러한 양상에서 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X7은 A이고 X1은 I이다. 본 발명의 이러한 양상에서 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X7은 A이고 X2는 I이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X7은 A이고 X3은 F이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X7은 A이고 X4는 R이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X7은 A이고 X5는 P이다. 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X7은 A이고 X6은 T이다.
일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 212에 최소한 85% 서열 동일성 (가령, 최소한 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 높은 친화성 SIRP-α D1 도메인을 갖고, 여기서 X1, X2, X3, X4, X5, X6 및 X7 각각은 야생형 아미노산이 아니다.
일부 구체예에서, 본 발명의 이러한 양상의 폴리펩티드는 서열 번호: 2의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 10개 이내의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 이러한 양상의 폴리펩티드는 서열 번호: 2의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 7개 이내의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 2의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인보다 최소한 10배 큰 결합 친화성으로 CD47에 결합한다. 일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 2의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인보다 최소한 100배 큰 결합 친화성으로 CD47에 결합한다. 일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 2의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인보다 최소한 1000배 큰 결합 친화성으로 CD47에 결합한다. 일부 구체예에서, 단편은 길이에서 10개보다 적은 아미노산, 길이에서 약 10개 아미노산, 길이에서 약 20개 아미노산, 길이에서 약 30개 아미노산, 길이에서 약 40개 아미노산, 길이에서 약 50개 아미노산, 길이에서 약 60개 아미노산, 길이에서 약 70개 아미노산, 길이에서 약 80개 아미노산, 길이에서 약 90개 아미노산, 길이에서 약 100개 아미노산, 또는 길이에서 약 100개 보다 많은 아미노산의 폴리펩티드를 포함한다. 단편은 CD47에 결합하는 능력을 유지한다. 바람직하게는, SIRP-α D1 변이체 폴리펩티드 및 이들의 단편은 SIRP-α 폴리펩티드가 CD47에 결합하는 것보다 더욱 높은 친화성으로 CD47에 결합한다. 가령, 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체 폴리펩티드 또는 이의 단편은 1 x 10-8 M보다 적은, 5 x 10-9 M보다 적은, 1 x 10-9 M보다 적은, 5 x 10-10 M보다 적은, 1 x 10-10 M보다 적은 또는 1 x 10-11 M보다 적은 KD로 CD47에 결합한다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체 폴리펩티드 또는 이의 단편은 약 500 nM 및 100 nM 사이, 약 100 nM 및 50 nM 사이, 약 50 nM 및 10 nM 사이, 약 10 nM 및 5 nM 사이, 약 5 nM 및 1 nM 사이, 약 1 nM 및 500 pM 사이, 약 500 pM 및 100 pM 사이, 약 100 pM 및 50 pM 사이, 또는 약 50 pM 및 10 pM 사이의 KD로 CD47에 결합한다.
일부 구체예에서, 다음에 따른 서열을 갖는 SIRP-α D1 변이체를 포함하는 폴리펩티드가 본원에서 설명된다: EEELQX1IQPDKSVLVAAGETATLRCTX2TSLX3PVGPIQWFRGAGPGRX4LIYNQX5X6GX7FPRVTTVSDX8TKRNNMDFSIRIGX9X10X11X12ADAGTYYCX13KFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS (서열 번호: 218), 여기서 X1은 V, L, 또는 I이고; X2는 A, V, L, 또는 I이고; X3은 I, S, T, 또는 F이고; X4는 E, L, 또는 V이고; X5는 K 또는 R이고; X6은 E 또는 Q이고; X7은 H, R, 또는 P이고; X8은 S,G, L, 또는 T이고; X9는 임의의 아미노산이고; X10은 임의의 아미노산이고; X11은 임의의 아미노산이고; X12는 임의의 아미노산이고; 및 X13은 V 또는 I이고; 그리고 여기서 상기 SIRP-α D1 변이체는 서열 번호: 1에 따른 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 최소한 2개의 아미노산 치환을 갖는다.
일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 212의 서열을 갖고, 여기서 X9는 A이다. 본 발명의 이러한 양상에서 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X9는 N이다. 본 발명의 이러한 양상에서 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X10은 I이다. 본 발명의 이러한 양상에서 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X9는 N이고 X10은 P이다. 본 발명의 이러한 양상에서 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X9는 N이고 X11은 S, T, 또는 C 이외에 임의의 아미노산이다. 본 발명의 이러한 양상에서 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X11은 T이다. 본 발명의 이러한 양상에서 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X11은 T 이외에 아미노산이다. 본 발명의 이러한 양상에서 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X12는 P이다. 본 발명의 이러한 양상에서 전술한 구체예 중에서 한 가지에서, X9는 N이고 X12는 P 이외에 임의의 아미노산이다.
일부 구체예에서, 다음에 따른 서열을 갖는 SIRP-α D1 변이체를 포함하는 폴리펩티드가 본원에서 설명된다: EEELQX1IQPDKSVLVAAGETATLRCTX2TSLX3PVGPIQWFRGAGPGRX4LIYNQX5X6GX7FPRVTTVSDX8TKRNNMDFSIRIGX9ITX10ADAGTYYCX11KFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS (서열 번호: 219), 여기서 X1은 V, L, 또는 I이고; X2는 A, V, L, 또는 I이고; X3은 I, S, T, 또는 F이고; X4는 E, L, 또는 V이고; X5는 K 또는 R이고; X6은 E 또는 Q이고; X7은 H, R, 또는 P이고; X8은 S, G, L, 또는 T이고; X9는 N이고; X10은 P 이외에 임의의 아미노산이고; 그리고 X11은 V 또는 I이고; 그리고 여기서 상기 SIRP-α D1 변이체는 서열 번호: 1에 따른 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 최소한 2개의 아미노산 치환을 갖는다.
본 발명의 다른 양상에서, 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 갖는 SIRP-α D1 변이체 폴리펩티드, 또는 이의 단편을 포함하는 조성물이 본원에서 개시된다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체 폴리펩티드 또는 이의 단편은 SIRP-α 폴리펩티드가 CD47에 결합하는 친화성과 비교하여 더욱 높은 친화성으로 CD47에 결합한다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체 폴리펩티드는 1 x 10-8M보다 적은, 또는 1 x 10-9M보다 적은, 1 x 10-10M보다 적은 또는 1 x 10-11M보다 적은 KD로 CD47에 결합한다. 일부 구체예에서, 전술한 SIRP-α D1 변이체 폴리펩티드는 두 번째 폴리펩티드에 부착되거나 또는 융합된다. 일부 구체예에서, 두 번째 폴리펩티드는 제한 없이, Fc 폴리펩티드, Fc 변이체, HSA 폴리펩티드, 알부민 펩티드, PEG 중합체 또는 이들의 단편을 포함한다.
전술한 내용으로 한정됨 없이, 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체 폴리펩티드는 표 6에서 도시된 서열 번호: 53-87 및 213 중에서 한 가지에서 선택된다.
표 6. SIRP-α 변이체 폴리펩티드
서열 번호: 아미노산 서열
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83 EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQREGPFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRIGAITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS
84 EEELQVIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQREGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGAITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS
85 EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQREGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGAITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS
86 EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRVLIYNQRQGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCIKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS
87 EEELQVIQPDKSVLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKEGHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS
213 EEELQVIQPDKSVLVAAGETATLRCTATSLFPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQRQGPFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRIGNITVADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS
일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 표 6에서 제공된 임의의 변이체에 최소한 85% 서열 동일성 (가령, 최소한 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 높은 친화성 SIRP-α D1 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 표 6에서 서열 번호: 80, 81 또는 85에 최소한 85% 서열 동일성 (가령, 최소한 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 높은 친화성 SIRP-α D1 도메인을 포함한다.
III. Fc 도메인 변이체 및 융합 구조체
일부 구체예에서, 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 80에서 아미노산 돌연변이; 및 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 6, 잔기 27, 잔기 31, 잔기 47, 잔기 53, 잔기 54, 잔기 56, 잔기 66 및 잔기 92로 구성된 군에서 선택되는 잔기에서 최소한 하나의 추가 아미노산 돌연변이를 갖는 SIRP-α D1 도메인을 포함하는 신호-조절 단백질 α (SIRP-α) D1 변이체, 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드가 본원에서 개시된다.
일부 구체예에서, Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드가 또한 본원에서 개시되고, 여기서 상기 Fc 변이체는 2개의 Fc 도메인 단위체를 갖는 Fc 도메인 이합체를 포함하고, 여기서 각 Fc 도메인 단위체는 독립적으로 (i) 돌연변이 L234A, L235A, G237A 및 N297A로 구성되는 인간 IgG1 Fc 영역; (ii) 돌연변이 A330S, P331S 및 N297A로 구성되는 인간 IgG2 Fc 영역; 또는 (iii) 돌연변이 S228P, E233P, F234V, L235A, delG236 및 N297A를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역에서 선택된다.
세포 표면 항원을 표적으로 하는 항체는 면역 세포 상에서 Fc 수용체 (FcR) 포용과 연관되는 면역자극성 및 작동체 기능을 촉발할 수 있다. IgG (감마 수용체), IgE (에타 수용체), IgA (알파 수용체) 및 IgM (뮤 수용체)을 비롯하여, 특정 부류의 항체에 특이적인 다수의 Fc 수용체가 있다. 세포 표면 상에서 Fc 수용체에 Fc 영역의 결합은 항체-코팅된 입자의 식균작용 (항체-의존성 세포-매개된 식균작용, 또는 ADCP), 면역 복합체의 소실, 킬러 세포에 의한 항체-코팅된 세포의 용해 (항체 의존성 세포 매개된 세포독성, 또는 ADCC), 염증성 매개인자의 방출, 태반 전달, 그리고 면역글로불린 생산의 제어를 비롯한 다수의 생물학적 반응을 촉발할 수 있다. 추가적으로, 항체에 보체의 C1 성분의 결합은 보체계를 활성화시킬 수 있다. 보체의 활성화는 세포 병원체의 용해에 중요할 수 있다. 하지만, 보체의 활성화는 또한, 염증 반응을 자극할 수 있고, 그리고 또한, 자가면역 과민성 또는 다른 면역학적 장애 에 관련될 수 있다. 일정한 Fc 수용체에 결합하는 감소된 또는 제거된 능력을 갖는 변이체 Fc 영역은 국부 세포 또는 조직을 손상시키거나 또는 파괴하지 않으면서 리간드 기능을 표적으로 하거나, 활성화하거나, 또는 중화함으로써 작용하는 치료 항체 및 Fc-융합 폴리펩티드 구조체를 개발하는데 유용하다.
일부 구체예에서, SIRP-α D1 폴리펩티드 구조체는 제거된 또는 감소된 작동체 기능을 갖는 Fc 도메인을 형성하는 Fc 도메인 단위체에 연결된 비자연발생 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체를 포함한다.
일부 구체예에서, Fc 도메인 단위체는 두 번째와 세 번째 항체 불변 도메인 (가령, CH2 및 CH3)을 포함하는 폴리펩티드 사슬을 지칭한다. 일부 구체예에서, Fc 도메인 단위체는 또한, 힌지 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, Fc 도메인 단위체는 IgG, IgE, IgM, IgA 및 IgD를 비롯한 임의의 면역글로불린 항체 아이소타입이다. 추가적으로, 일부 구체예에서, Fc 도메인 단위체는 임의의 IgG 아형 (가령, IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG2c, IgG3 및 IgG4)이다. 일부 구체예에서, Fc 도메인 단위체는 Fc 도메인 및 Fc 수용체 사이의 상호작용을 변경하는, 야생형 Fc 도메인 단위체 서열로부터 많게는 10개의 변화 (가령, 1-10, 1-8, 1-6, 1-4 아미노산 치환, 부가 또는 삽입, 결실, 또는 이들의 조합)를 포함한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "Fc 도메인"은 2개의 Fc 도메인 단위체의 이합체를 지칭한다. 야생형 Fc 도메인에서, 2개의 Fc 도메인 단위체는 2개의 CH3 항체 불변 도메인 사이의 상호작용뿐만 아니라 2개의 이합체화된 Fc 도메인 단위체의 힌지 도메인 사이에 형성되는 하나 또는 그 이상의 이황화 결합에 의해 이합체화한다. 일부 구체예에서, Fc 도메인, 대표적으로 "죽은 Fc 도메인"은 작동체 기능을 결여하도록 돌연변이된다. 일부 구체예에서, Fc 도메인 내에 각각의 Fc 도메인 단위체는 Fc 도메인 및 Fc 수용체, 예를 들면, Fcγ 수용체 (FcγR), Fcα 수용체 (FcαR) 또는 Fcε (FcεR) 사이에 상호작용 또는 결합을 감소시키는, CH2 항체 불변 도메인 내에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체 (가령, 표 2, 5 및 6에서 설명된 변이체 중에서 한 가지)는 면역글로불린의 Fc 도메인 단위체 또는 Fc 도메인 단위체의 단편에 융합된다. 일부 구체예에서, 면역글로불린의 Fc 도메인 단위체 또는 Fc 도메인 단위체의 단편은 다른 Fc 도메인 단위체와 Fc 도메인을 형성할 수 있다. 일부 구체예에서, 면역글로불린의 Fc 도메인 단위체 또는 Fc 도메인 단위체의 단편은 다른 Fc 도메인 단위체와 Fc 도메인을 형성할 수 없다. 일부 구체예에서, Fc 도메인 단위체 또는 Fc 도메인의 단편은 폴리펩티드의 혈청 반감기를 증가시키기 위해 본 발명의 폴리펩티드에 융합된다. 일부 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드에 융합된 Fc 도메인 단위체 또는 Fc 도메인 단위체의 단편은 두 번째 Fc 도메인 단위체와 이합체화하여, Fc 수용체에 결합하는 Fc 도메인을 형성하거나, 또는 대안으로, Fc 도메인 단위체는 Fc 수용체에 결합한다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드의 혈청 반감기를 증가시키기 위해 상기 폴리펩티드에 융합된 Fc 도메인 또는 Fc 도메인의 단편은 어떤 면역계-관련된 반응도 유도하지 않는다.
일부 구체예에서, 본원에서 제공된 SIRP-α 폴리펩티드 또는 구조체는 첫 번째 Fc 도메인 단위체에 결합된 SIRP-α D1 도메인 또는 이의 변이체 및 두 번째 Fc 도메인 단위체에 결합된 항체 가변 도메인을 포함하고, 여기서 첫 번째와 두 번째 Fc 도메인 단위체는 합동하여 Fc 도메인 (가령, 이형이합체성 Fc 도메인)을 형성한다. Fc 도메인은 면역글로불린의 C 말단에서 발견되는 단백질 구조이다. Fc 도메인은 CH3 항체 불변 도메인 사이의 상호작용에 의해 이합체화되는 2개의 Fc 도메인 단위체를 포함한다. 야생형 Fc 도메인은 Fc 수용체, 예를 들면, FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa, FcγRIIIb 및 FcγRIV에 결합하는 최소 구조를 형성한다.
Fc 도메인은 항체를 이의 표적에 결합시키는데 직접적으로 관련되지 않지만, 다양한 작동체 기능, 예를 들면, 항체-의존성 세포 독성에서 항체의 참여에 관련될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 SIRP-α 폴리펩티드 또는 구조체 내에 Fc 도메인은 감소된 작동체 기능, 예를 들면, 감소된 항체 의존성 세포 매개된 세포독성 (ADCC), 감소된 보체-의존성 세포용해 (CDC), 감소된 항체-의존성 세포-매개된 식균작용 (ADCP), 또는 이들의 임의의 조합을 야기하는 아미노산 치환, 부가 또는 삽입, 결실, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 SIRP-α 폴리펩티드 또는 구조체는 인간 Fc 수용체에 감소된 결합 (가령, 최소 결합 또는 결합의 부재) 및 보체 단백질 C1q에 감소된 결합 (가령, 최소 결합 또는 결합의 부재)에 의해 특징화된다. 일부 구체예에서, 본 발명의 SIRP-α 구조체는 인간 FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIIB, FcγRIIIB, 또는 이들의 임의의 조합, 그리고 C1q에 감소된 결합 (가령, 최소 결합 또는 결합의 부재)에 의해 특징화된다. 항체-의존성 작동체 기능, 예를 들면, ADCC, CDC, ADCP, 또는 이들의 임의의 조합을 변경하거나 또는 감소시키기 위해, 일부 구체예에서, 본 발명의 SIRP-α 구조체에서 Fc 도메인은 IgG 부류이고, 그리고 E233, L234, L235, G236, G237, D265, D270, N297, E318, K320, K322, A327, A330, P331, 또는 P329 (Kabat의 EU 지수 (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))에 따른 넘버링)에서 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 본원에서 설명된 비선천적 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 구조체는 선천적 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 구조체와 비교하여 Fcγ 수용체 CD16a, CD32a, CD32b, CD32c 및 CD64 중에서 최소한 하나에 감소된 또는 제거된 결합을 전시한다. 일부 경우에, 본원에서 설명된 폴리펩티드 구조체는 CD16a, CD32a, CD32b, CD32c 및 CD64 Fcγ 수용체에 감소된 또는 제거된 결합을 전시한다.
CDC는 보체 연쇄반응이 항체 Fc에 보체 성분 C1q 결합에 의해 활성화되는 세포독성의 형태를 지칭한다. 일부 구체예에서, 본원에서 설명된 비선천적 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 구조체는 야생형 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 구조체와 비교하여 C1q 결합에서 최소한 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 감소를 전시한다. 일부 경우에, 본원에서 설명된 바와 같은 비선천적 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 구조체는 야생형 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 구조체와 비교하여 감소된 CDC를 전시한다. 일부 구체예에서, 본원에서 설명된 바와 같은 비선천적 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 구조체는 야생형 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 구조체와 비교하여, CDC에서 최소한 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 감소를 전시한다. 일부 경우에, 본원에서 설명된 바와 같은 비자연 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드 구조체는 야생형 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 구조체와 비교하여 미미한 CDC를 전시한다.
일부 구체예에서, 본원에서 Fc 변이체는 야생형 서열에 비하여 최소한으로 글리코실화되거나 또는 감소된 글리코실화를 갖는다. 일부 구체예에서, 데글리코실화는 N297A의 돌연변이로, 또는 N297을 N이 아닌 임의의 아미노산으로 돌연변이시킴으로써 달성된다. 일부 구체예에서, 데글리코실화는 모티프 N-Xaa1-Xaa2-Xaa3을 파괴함으로써 달성되는데, 여기서 N = 아스파라긴; Xaa1 = P (프롤린)를 제외한 임의의 아미노산; Xaa2 = T (트레오닌), S (세린) 또는 C (시스테인); 및 Xaa3 = P (프롤린)를 제외한 임의의 아미노산이다. 한 구체예에서, N-Xaa1-Xaa2-Xaa3 모티프는 Kabat et al., 1991에 따라 지정될 때 잔기 297-300을 지칭한다. 일부 구체예에서, N, Xaa1, Xaa2, 또는 Xaa3 중에서 임의의 한 가지 또는 그 이상에 돌연변이는 Fc 변이체의 데글리코실화를 유발한다.
일부 구체예에서, 항체 IgG 불변 영역의 변이체 (가령, Fc 변이체)는 Fcγ 수용체에 특이적으로 결합하는 감소된 능력을 소유하거나 또는 식균작용을 유도하는 감소된 능력을 갖는다. 일부 구체예에서, 항체 IgG 불변 영역의 변이체 (가령, Fc 변이체)는 Fcγ 수용체에 특이적으로 결합하는 감소된 능력을 소유하고 식균작용을 유도하는 감소된 능력을 갖는다. 가령, 일부 구체예에서, Fc 도메인, 대표적으로 "죽은" Fc 도메인은 작동체 기능을 결여하도록 돌연변이된다. 가령, 일부 구체예에서, Fc 도메인은 Fc 도메인 및 Fcγ 수용체 사이의 상호작용을 최소화하는 것으로 알려져 있는 특정한 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, Fc 도메인 단위체는 IgG1 항체로부터 유래되고, 그리고 아미노산 치환 L234A, L235A, G237A 및 N297A (Kabat et al., 1991에 따른 EU 넘버링 시스템에 따라 지정될 때) 중에서 하나 또는 그 이상을 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 추가 돌연변이가 이런 IgG1 Fc 변이체 내에 포함된다. 인간 IgG1 Fc 변이체에 대한 이런 추가 돌연변이의 무제한적 실례는 E318A 및 K322A를 포함한다. 일부 경우에, 인간 IgG1 Fc 변이체는 야생형 인간 IgG1 서열과 비교하여 전체로서 최대 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 또는 4개 또는 더욱 적은 돌연변이를 갖는다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 추가 결실이 이런 IgG1 Fc 변이체 내에 포함된다. 가령, 일부 구체예에서, 표 7에서 서열 번호: 88에서 제공된 Fc IgG1 중쇄 불변 영역의 C 말단 리신은 예로서, 폴리펩티드가 세균 또는 포유류 세포에서 생산될 때 상기 폴리펩티드의 균질성을 증가시키기 위해 결실된다. 일부 경우에, 인간 IgG1 Fc 변이체는 야생형 인간 IgG1 서열과 비교하여 전체로서 최대 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 또는 4개 또는 더욱 적은 결실을 갖는다. 일부 구체예에서, IgG1 Fc 변이체는 서열 번호: 135, 서열 번호: 136, 또는 서열 번호: 137 중에서 한 가지에 따른 아미노산 서열을 갖는다.
일부 구체예에서, Fc 도메인 단위체는 IgG2 또는 IgG4 항체로부터 유래되고, 그리고 아미노산 치환 A330S, P331S, 또는 A330S 및 P331S 둘 모두를 포함한다. 전술한 아미노산 위치는 Kabat, et al. (1991)에 따라 규정된다. 아미노산 잔기의 Kabat 넘버링은 항체의 서열과 "표준" Kabat 넘버링된 서열의 상동성의 영역에서 정렬에 의해 소정의 항체에 대해 결정될 수 있다. 일부 구체예에서, Fc 변이체는 A330S, P331S 및 N297A 아미노산 치환 (Kabat, et al. (1991)에 따른 EU 넘버링 시스템에 따라 지정될 때) 중에서 하나 또는 그 이상을 포함하는 인간 IgG2 Fc 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 추가 돌연변이가 이런 IgG2 Fc 변이체 내에 포함된다. 인간 IgG2 Fc 변이체에 대한 이런 추가 돌연변이의 무제한적 실례는 V234A, G237A, P238S, V309L 및 H268A (Kabat et al. (1991)에 따른 EU 넘버링 시스템에 따라 지정될 때)를 포함한다. 일부 경우에, 인간 IgG2 Fc 변이체는 야생형 인간 IgG2 서열과 비교하여 전체로서 최대 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3개 또는 더욱 적은 돌연변이를 갖는다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 추가 결실이 이런 IgG2 Fc 변이체 내에 포함된다. 가령, 일부 구체예에서, 표 7에서 서열 번호: 89에서 제공된 Fc IgG2 중쇄 불변 영역의 C 말단 리신은 예로서, 폴리펩티드가 세균 또는 포유류 세포에서 생산될 때 상기 폴리펩티드의 균질성을 증가시키기 위해 결실된다. 일부 경우에, 인간 IgG2 Fc 변이체는 야생형 인간 IgG2 서열과 비교하여 전체로서 최대 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 또는 4개 또는 더욱 적은 결실을 갖는다.
Fc 변이체가 IgG4 Fc 변이체일 때, 일부 구체예에서, 이런 Fc 변이체는 S228P 돌연변이를 포함한다 (Kabat, et al. (1991)에 따라 지정될 때). 일부 경우에, 인간 IgG4 Fc 변이체는 야생형 인간 IgG4 서열과 비교하여 전체로서 최대 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 돌연변이(들)를 갖는다.
일부 구체예에서, Fc 변이체는 IgG1 Fc 영역의 돌연변이 L234A, L235A, G237A 또는 N297A 중에서 최소한 하나 또는 IgG2 Fc 영역의 돌연변이 A330S, P331S 또는 N297A 중에서 최소한 하나를 포함한다. 일부 구체예에서, Fc 변이체는 IgG1 Fc 영역의 돌연변이 L234A, L235A, G237A 또는 N297A 중에서 최소한 2개 또는 IgG2 Fc 영역의 돌연변이 A330S, P331S 또는 N297A 중에서 최소한 2개를 포함한다. 일부 구체예에서, Fc 변이체는 IgG1 Fc 영역의 돌연변이 L234A, L235A, G237A 또는 N297A 중에서 최소한 3개를 포함하거나 또는 IgG2 Fc 영역의 돌연변이 A330S, P331S 및 N297A로 구성된다. 일부 구체예에서, Fc 변이체는 돌연변이 L234A, L235A, G237A 및 N297A로 구성된다.
일부 구체예에서, Fc 변이체는 야생형 인간 IgG Fc 영역과 비교하여 개체의 Fc 수용체에 감소된 결합을 전시한다. 일부 구체예에서, Fc 변이체는 야생형 인간 IgG Fc 영역과 비교하여 개체의 Fc 수용체에 제거된 결합을 전시한다. 일부 구체예에서, Fc 변이체는 야생형 인간 IgG Fc 영역과 비교하여 식균작용의 감소를 전시한다. 일부 구체예에서, Fc 변이체는 야생형 인간 IgG Fc 영역과 비교하여 제거된 식균작용을 전시한다.
서열 번호: 88 및 서열 번호: 89는 Fc IgG1 및 IgG2 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 제공한다. 일부 구체예에서, Fc 변이체는 표 7에서 보여지는 바와 같은 서열 번호: 90-95의 임의의 변이체이다.
표 7. Fc 변이체의 아미노산 서열
서열 번호: 아미노산 서열
88 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
89 STKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
90 DKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
91 DKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
92 VECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFASTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
93 VECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFASTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
94 ERKSSVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFASTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
95 ERKSSVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFASTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
본원에서 ADCC로서 또한 지칭되는 항체 의존성 세포 매개된 세포독성은 일정한 세포독성 세포 (가령, 자연 킬러 (NK) 세포 및 호중구) 상에 존재하는 Fc 수용체 (FcRs) 위에 결합된 분비된 Ig가 이들 세포독성 작동체 세포가 항원-보유 표적 세포에 특이적으로 결합하고, 그리고 차후에, 표적 세포를 사멸시킬 수 있게 하는 세포독성의 한 형태를 지칭한다. 본원에서 ADCP로서 또한 지칭되는 항체-의존성 세포-매개된 식균작용은 일정한 포식 세포 (가령, 대식세포) 상에 존재하는 Fc 수용체 (FcRs) 위에 결합된 분비된 Ig가 이들 식균 작동체 세포가 항원-보유 표적 세포에 특이적으로 결합하고, 그리고 차후에, 표적 세포를 집어삼키고 소화할 수 있게 하는 세포독성의 한 형태를 지칭한다. 표적 세포의 표면에 지향된 리간드-특이적 높은 친화성 IgG 항체는 세포독성 또는 포식 세포를 자극할 수 있고 이런 사멸에 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에서 설명된 바와 같은 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드 구조체는 야생형 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 구조체와 비교하여 감소된 ADCC 또는 ADCP를 전시한다. 일부 구체예에서, 본원에서 설명된 바와 같은 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드 구조체는 야생형 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 구조체와 비교하여 ADCC 또는 ADCP에서 최소한 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 감소를 전시한다. 일부 구체예에서, 본원에서 설명된 바와 같은 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드 구조체는 야생형 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 구조체와 비교하여 제거된 ADCC 또는 ADCP를 전시한다.
본원에서 CDC로서 또한 지칭되는 보체-지향된 세포독성은 보체 연쇄반응이 항체 Fc에 보체 성분 C1q 결합에 의해 활성화되는 세포독성의 한 형태를 지칭한다. 일부 구체예에서, 본원에서 설명된 바와 같은 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드 구조체는 야생형 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 구조체와 비교하여 C1q 결합에서 최소한 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 감소를 전시한다. 일부 경우에, 본원에서 설명된 바와 같은 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드 구조체는 야생형 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 구조체와 비교하여 감소된 CDC를 전시한다. 일부 구체예에서, 본원에서 설명된 바와 같은 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드 구조체는 야생형 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 구조체와 비교하여 CDC에서 최소한 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 감소를 전시한다. 일부 경우에, 본원에서 설명된 바와 같은 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드 구조체는 야생형 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 구조체와 비교하여 미미한 CDC를 전시한다.
본원에서 Fc 변이체는 야생형 인간 IgG Fc 영역과 비교하여 Fcγ 수용체에 감소된 결합을 전시하는 것들을 포함한다. 가령, 일부 구체예에서, Fc 변이체는 실시예에서 설명된 바와 같이, Fcγ 수용체에 대해 야생형 인간 IgG Fc 영역에 의해 전시된 결합보다 적은, Fcγ 수용체에 대한 결합을 전시한다. 일부 경우에, Fc 변이체는 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (완전히 제거된 작동체 기능)의 인자로 Fcγ 수용체에 감소된 결합을 갖는다. 일부 구체예에서, 감소된 결합은 임의의 하나 또는 그 이상의 Fcγ 수용체, 예를 들면, CD16a, CD32a, CD32b, CD32c, 또는 CD64에 대한 것이다.
일부 경우에, 본원에서 개시된 Fc 변이체는 이의 야생형 인간 IgG Fc 영역과 비교하여 식균작용의 감소를 전시한다. 이런 Fc 변이체는 이의 야생형 인간 IgG Fc 영역과 비교하여 식균작용에서 감소를 전시하는데, 여기서 식균작용 활성의 감소는 예로서, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 인자에 의한다. 일부 경우에, Fc 변이체는 야생형 인간 IgG Fc 영역과 비교하여 제거된 식균작용을 전시한다.
일부 구체예에서, 본원에서 개시된 Fc 변이체는 하나 또는 그 이상의 융합 상대에 연계된다. 일부 경우에, 융합 상대는 치료적 모이어티이다. 일부 경우에, 융합 상대는 발현된 단백질의 표적화, 정제, 선별검사, 전시 등을 할 수 있도록 선별된다. 일부 구체예에서, 융합 상대는 또한, Fc 수용체에 결합의 정도 또는 식균작용 감소의 정도에 영향을 준다. 본원에서 설명된 바와 같이, 일부 구체예에서, Fc 변이체가 융합 상대에 연계될 때, 이것은 아래에 설명된 바와 같은 폴리펩티드 구조체를 형성한다.
일부 구체예에서, 융합 상대는 링커 서열을 거쳐 Fc 변이체 서열에 연결된다. 일부 구체예에서, 비록 더욱 긴 링커 또한 활용되긴 하지만, 링커 서열은 일반적으로, 적은 숫자의 아미노산, 예를 들면, 10개보다 적은 아미노산을 포함한다. 일부 경우에, 링커는 10, 9, 8, 7, 6, 또는 5개 아미노산보다 적은 또는 더욱 짧은 길이를 갖는다. 일부 경우에, 링커는 최소한 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 또는 35개 아미노산 또는 그 이상의 길이를 갖는다. 임의선택적으로, 일부 구체예에서, 개열가능한 링커가 이용된다.
일부 구체예에서, 융합 상대는 Fc 변이체 단백질 및 임의의 연관된 융합 상대를 원하는 세포 위치로 또는 세포외 배지로 지향시키는 표적화 또는 신호 서열이다. 일부 구체예에서, 일정한 신호전달 서열은 단백질이 성장 배지 내로 분비되거나, 또는 원형질막주위 공간 내로 분비되거나, 세포의 내막 및 외막 사이에 위치되도록 표적화시킨다. 일부 구체예에서, 융합 상대는 정제 또는 선별검사를 할 수 있게 하는 펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 서열이다. 이런 융합 상대는 폴리히스티딘 태그 (His-태그) (가령, His6 및 His10) 또는 고정된 금속 친화성 크로마토그래피 (IMAC) 시스템용으로 다른 태그 (가령, Ni+2 친화성 칼럼), GST 융합, MBP 융합, Strep-태그, 세균 효소 BirA에 대한 BSP 비오티닐화 표적 서열, 그리고 항체에 의해 표적화되는 에피토프 태그 (가령, c-myc 태그, flag-태그 등)를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
일부 구체예에서, 이런 태그는 정제, 선별검사, 또는 둘 모두에 유용하다. 가령, 일부 구체예에서, Fc 변이체는 His-태그를 이용하여 이것을 Ni+2 친화성 칼럼에 고정시킴으로써 정제되고, 그리고 이후, 정제 후 동일한 His-태그가 항체를 Ni+2 코팅된 평판에 고정시켜 ELISA 또는 본원의 다른 곳에서 설명된 바와 같은 다른 결합 검정을 수행하는데 이용된다. 일부 구체예에서, 융합 상대는 본원에서 설명된 바와 같은 Fc 변이체를 선별검사하는 선별 방법의 이용을 할 수 있게 한다.
다양한 선별 방법을 실시할 수 있게 하는 다양한 융합 상대가 가용하다. 가령, Fc 변이체 라이브러리의 구성원을 유전자 III 단백질에 융합함으로써, 파지 전시가 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 융합 상대는 Fc 변이체가 표지화될 수 있도록 한다. 대안으로, 일부 구체예에서, 융합 상대는 발현 벡터 상에 특정한 서열에 결합하고, 융합 상대 및 연관된 Fc 변이체가 이들을 인코딩하는 핵산과 공유적으로 또는 비공유적으로 연결될 수 있게 한다.
일부 구체예에서, 융합 상대가 치료적 모이어티일 때, 상기 치료적 모이어티는 예로서, 펩티드, 단백질, 항체, siRNA, 또는 소형 분자이다. 본 발명의 Fc 변이체에 연계되는 치료 항체의 무제한적 실례는 CD47을 인식하는 항체를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 본 발명의 Fc 변이체에 연계되는 치료적 폴리펩티드의 무제한적 실례는 SIRP-α 폴리펩티드를 비롯한 CD47 결합 폴리펩티드를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 이런 경우에, CD47 결합 폴리펩티드는 본 발명의 Fc 변이체에 부착되거나 또는 융합된다. CD47 결합 폴리펩티드의 실례는 항-CD47 항체 또는 이들의 단편, 그리고 CD47의 리간드, 예를 들면, SIRP-α 또는 이의 단편을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. CD47 결합 폴리펩티드의 추가 실례는 SIRP-α의 자연발생 형태뿐만 아니라 이들의 돌연변이체를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
일부 구체예에서, Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드가 본원에서 개시되고, 여기서 상기 Fc 변이체는 2개의 Fc 도메인 단위체를 갖는 Fc 도메인 이합체를 포함하고, 여기서 각 Fc 도메인 단위체는 독립적으로 (i) 돌연변이 L234A, L235A, G237A 및 N297A로 구성되는 인간 IgG1 Fc 영역; (ii) 돌연변이 A330S, P331S 및 N297A로 구성되는 인간 IgG2 Fc 영역; 또는 (iii) 돌연변이 S228P, E233P, F234V, L235A, delG236 및 N297A를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역에서 선택된다. 일부 구체예에서, Fc 도메인 단위체는 동일하다 (다시 말하면, 동종이합체이다). 일부 구체예에서, Fc 도메인 단위체는 상이하다 (다시 말하면, 이형이합체이다). 일부 구체예에서, Fc 도메인 이합체에서 Fc 도메인 단위체 중에서 최소한 하나는 돌연변이 L234A, L235A, G237A 및 N297A로 구성되는 인간 IgG1 Fc 영역이다. 일부 구체예에서, Fc 도메인 이합체에서 Fc 도메인 단위체 중에서 최소한 하나는 돌연변이 A330S, P331S 및 N297A로 구성되는 인간 IgG2 Fc 영역이다. 일부 구체예에서, Fc 변이체는 인간 IgG Fc 영역의 야생형 버전과 비교하여 Fcγ 수용체에 제거된 또는 감소된 결합을 전시한다. 일부 구체예에서, Fc 변이체는 인간 IgG Fc 영역의 야생형 버전과 비교하여 CD16a, CD32a, CD32b, CD32c 및 CD64 Fcγ 수용체에 제거된 또는 감소된 결합을 전시한다. 일부 구체예에서, Fc 변이체는 인간 IgG Fc 융합의 야생형 버전과 비교하여 C1q에 제거된 또는 감소된 결합을 전시한다. 일부 구체예에서, Fc 도메인 단위체에서 Fc 도메인 단위체 중에서 최소한 하나는 돌연변이 S228P, E233P, F234V, L235A, delG236 및 N297A를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역이다. 일부 구체예에서, Fc 변이체는 야생형 인간 IgG4 Fc 영역과 비교하여 Fcγ 수용체에 제거된 또는 감소된 결합을 전시한다. 일부 구체예에서, Fc 변이체는 이의 인간 IgG4 Fc 영역의 야생형 버전과 비교하여 CD16a 및 CD32b Fcγ 수용체에 제거된 또는 감소된 결합을 전시한다. 일부 구체예에서, Fc 변이체는 약 5 x 10-6 M보다 큰 KD로 Fcγ 수용체에 결합한다.
일부 구체예에서, Fc 변이체는 CD47 결합 폴리펩티드를 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, Fc 변이체는 인간 IgG Fc 영역의 야생형 버전과 비교하여 Fcγ 수용체에 제거된 또는 감소된 결합을 전시한다. 일부 구체예에서, CD47 결합 폴리펩티드는 설치류 및 비인간 영장류에서 급성 빈혈을 유발하지 않는다. 일부 구체예에서, CD47 결합 폴리펩티드는 인간에서 급성 빈혈을 유발하지 않는다.
일부 구체예에서, CD47 결합 폴리펩티드는 신호-조절 단백질 α (SIRP-α) 폴리펩티드 또는 이의 단편이다. 일부 구체예에서, SIRP-α 폴리펩티드는 아미노산 서열, EEELQX1IQPDKSVLVAAGETATLRCTX2TSLX3PVGPIQWFRGAGPGRX4LIYNQX5EGX6FPRVTTVSDX7TKRNNMDFSIRIGX8ITPADAGTYYCX9KFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS (서열 번호: 51)을 포함하는 SIRP-α D1 변이체를 포함하고, 여기서 X1은 V 또는 I이고; X2는 A 또는 I이고; X3은 I 또는 F이고; X4는 E 또는 V이고; X5는 K 또는 R이고; X6은 H 또는 P이고; X7은 L 또는 T이고; X8은 N 이외에 임의의 아미노산이고; 그리고 X9는 V 또는 I이다. 일부 구체예에서, SIRP-α 폴리펩티드는 SIRP-α D1 변이체를 포함하고, 여기서 X1은 V 또는 I이고; X2는 A 또는 I이고; X3은 I 또는 F이고; X4는 E이고; X5는 K 또는 R이고; X6은 H 또는 P이고; X7은 L 또는 T이고; X8은 N이 아니고; 그리고 X9는 V이다.
일부 구체예에서, 다음을 포함하는 폴리펩티드가 본원에서 개시된다: SIRP-α D1 변이체, 여기서 상기 SIRP-α D1 변이체는 비자연발생 높은 친화성 SIRP-α D1 도메인이고, 여기서 상기 SIRP-α D1 변이체는 자연발생 D1 도메인의 친화성보다 최소한 10배 큰 친화성으로 인간 CD47에 결합하고; 그리고 Fc 도메인 단위체, 여기서 상기 Fc 도메인 단위체는 두 번째 Fc 도메인 단위체를 포함하는 두 번째 폴리펩티드에 연결되어 Fc 도메인을 형성하고, 여기서 상기 Fc 도메인은 제거된 또는 감소된 작동체 기능을 갖는다. 일부 구체예에서, 비자연발생 높은 친화성 SIRP-α D1 도메인은 잔기 80에서 아미노산 돌연변이를 포함한다.
일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체가 본원에서 개시되고, 여기서 상기 SIRP-α D1 변이체는 250 nM보다 적은 KD로 첫 번째 종으로부터 CD47에 결합하고; 그리고 여기서 상기 SIRP-α D1 변이체는 250 nM보다 적은 KD로 두 번째 종으로부터 CD47에 결합하고; 그리고 첫 번째 종으로부터 CD47에 대한 KD 및 두 번째 종으로부터 CD47에 대한 KD는 서로의 100 배 범위 안에 있고; 여기서 첫 번째 종 및 두 번째 종은 인간, 설치류 및 비인간 영장류로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체는 최소한 3가지 상이한 종으로부터 CD47에 결합한다. 일부 구체예에서, 비인간 영장류는 시노몰구스 원숭이이다.
일부 구체예에서, (a) 250 nM보다 적은 KD로 인간 CD47에 결합하는 SIRP-α D1 도메인; 및 (b) SIRP-α D1 도메인의 N 말단 또는 C 말단에 연결된 Fc 도메인 단위체를 포함하는 폴리펩티드가 본원에서 개시되고, 여기서 상기 폴리펩티드는 설치류 및 비인간 영장류에서 급성 빈혈을 유발하지 않는다. 일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 인간 SIRP-α의 비자연발생 변이체이다. 일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드의 생체내 투여는 투여 후 첫 번째 주 동안 50%보다 적게 헤모글로빈 감소를 유발한다. 일부 구체예에서, 인간에서 상기 폴리펩티드의 투여는 투여 후 첫 번째 주 동안 50%보다 적게 헤모글로빈 감소를 유발한다. 일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 최소한 하나의 Fc 변이체를 더욱 포함하고, 여기서 상기 Fc 변이체는 (i) 돌연변이 L234A, L235A, G237A 및 N297A로 구성되는 인간 IgG1 Fc 영역; (ii) 돌연변이 A330S, P331S 및 N297A로 구성되는 인간 IgG2 Fc 영역; 또는 (iii) 돌연변이 S228P, E233P, F234V, L235A, delG236 및 N297A를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역에서 선택되는 Fc 도메인 단위체를 포함한다. 일부 구체예에서, Fc 도메인 단위체는 돌연변이 L234A, L235A, G237A 및 N297A로 구성되는 인간 IgG1 Fc 영역이다. 일부 구체예에서, Fc 도메인 단위체는 돌연변이 A330S, P331S 및 N297A로 구성되는 인간 IgG2 Fc 영역이다.
본 발명의 SIRP-α 구조체는 C 말단이 전통적인 유전자 또는 화학적 수단, 예를 들면, 화학적 접합을 이용하여 링커에 의하여 Fc 도메인 단위체의 N 말단에 결합된 SIRP-α 도메인 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구체예에서, 링커 (가령, 스페이서)는 폴리펩티드 및 Fc 도메인 단위체 사이에 삽입된다. 일부 구체예에서, 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드는 이합체를 형성할 수 없는 Fc 도메인 단위체에 융합된다. 일부 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 다른 Fc 도메인 단위체와 이합체, 예를 들면, 이형이합체를 형성할 수 있는 Fc 도메인 단위체에 융합된다. 일부 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 Fc 도메인 단위체에 융합되고, 그리고 이러한 융합 단백질은 동종이합체를 형성한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 첫 번째 Fc 도메인 단위체에 융합되고, 그리고 상이한 단백질 또는 펩티드 (가령, 항체 가변 영역)는 두 번째 Fc 도메인 단위체에 융합된다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 도메인 또는 이의 변이체는 첫 번째 Fc 도메인 단위체에 연결되고, 그리고 치료적 단백질 (가령, 사이토킨, 인터류킨, 항원, 스테로이드, 항염증제, 또는 면역조정제)은 두 번째 Fc 도메인 단위체에 연결된다. 일부 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 Fc 도메인 단위체는 이형이합체를 형성한다.
전술한 것으로의 제한 없이, 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체 폴리펩티드 (가령, 표 2, 5 및 6에서 설명된 변이체 중에서 한 가지)는 Fc 폴리펩티드 또는 Fc 변이체 폴리펩티드, 예를 들면, Fc 도메인 단위체에 융합된다. SIRP-α D1 변이체 폴리펩티드 및 융합된 Fc 변이체 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드의 실례는 표 8에서 도시된 서열 번호: 96-137, 214 및 216을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
표 8. Fc 변이체에 융합된 SIRP-α D1 변이체를 포함하는 폴리펩티드
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 표 8에서 제공된 임의의 변이체에 최소한 85% 서열 동일성 (가령, 최소한 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 높은 친화성 SIRP-α D1 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 표 8에서 서열 번호: 98-104, 107-113, 116-122, 또는 135-137에 최소한 85% 서열 동일성 (가령, 최소한 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 높은 친화성 SIRP-α D1 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 다음을 포함한다: (a) 신호-조절 단백질 α (SIRP-α) D1 변이체, 여기서 상기 SIRP-α D1 변이체는 아미노산 서열, EEX1X2QX3IQPDKX4VX5VAAGEX6X7X8LX9CTX10TSLX11PVGPIQWFRGAGPX12RX13LIYNQX14X15GX16FPRVTTVSX17X18TX19RX20NMDFX21IX22IX23X24ITX25ADAGTYYCX26KX27RKGSPDX28X29EX30KSGAGTELSVRX31KPS (서열 번호: 47)을 포함하고, 여기서 X1은 E, 또는 G이고; X2는 L, I, 또는 V이고; X3은 V, L, 또는 I이고; X4는 S, 또는 F이고; X5는 L, 또는 S이고; X6은 S, 또는 T이고; X7은 A, 또는 V이고; X8은 I, 또는 T이고; X9는 H, R, 또는 L이고; X10은 A, V, I, 또는 L이고; X11은 I, T, S, 또는 F이고; X12는 A, 또는 G이고; X13은 E, V, 또는 L이고; X14는 K, 또는 R이고; X15는 E, 또는 Q이고; X16은 H, P, 또는 R이고; X17은 D, 또는 E이고; X18은 S, L, T, 또는 G이고; X19는 K, 또는 R이고; X20은 E, 또는 N이고; X21은 S, 또는 P이고; X22는 S, 또는 R이고; X23은 S, 또는 G이고; X24는 임의의 아미노산이고; X25는 임의의 아미노산이고; X26은 V, 또는 I이고; X27은 F, L, 또는 V이고; X28은 D 또는 부재하고; X29는 T, 또는 V이고; X30은 F, 또는 V이고; 그리고 X31은 A, 또는 G이고; 그리고 여기서 상기 SIRP-α D1 변이체는 서열 번호: 1 내지 10 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 최소한 2개의 아미노산 치환을 갖고; 그리고 (b) 2개의 Fc 도메인 단위체를 갖는 Fc 도메인 이합체를 포함하는 Fc 변이체, 여기서 각 Fc 도메인 단위체는 독립적으로 (i) N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG1 Fc 영역; (ii) L234A, L235A 및 G237A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG1 Fc 영역; (iii) L234A, L235A, G237A 및 N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG1 Fc 영역; (iv) N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG2 Fc 영역; (v) A330S 및 P331S 돌연변이를 포함하는 인간 IgG2 Fc 영역; (vi) A330S, P331S 및 N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG2 Fc 영역; (vii) S228P, E233P, F234V, L235A 및 delG236 돌연변이를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역; 또는 (viii) S228P, E233P, F234V, L235A, delG236 및 N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역이다.
일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 다음을 포함한다: SIRP-α D1 변이체, 여기서 상기 SIRP-α D1 변이체는 서열 번호: 47에 따른 아미노산 서열을 포함하고; 2개의 Fc 도메인 단위체를 갖는 Fc 도메인 이합체를 포함하는 Fc 변이체, 여기서 상기 Fc 도메인 이합체에서 Fc 도메인 단위체 중에서 하나는 L234A, L235A, G237A 및 N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG1 Fc 영역을 포함한다.
Fc 도메인 단위체의 이합체화
일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체 폴리펩티드 (가령, 표 2, 5 및 6에서 설명된 변이체 중에서 한 가지)는 N 말단에서 또는 C 말단에서 첫 번째 Fc 도메인 단위체에 융합된다. 일부 구체예에서, 첫 번째 Fc 도메인 단위체는 Fc 도메인 또는 이합체를 형성할 수 없다. 일부 구체예에서, 첫 번째 Fc 도메인 단위체는 두 번째 Fc 도메인 단위체와 합동되어 Fc 도메인 또는 이합체를 형성한다. 일부 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 Fc 도메인 단위체는 첫 번째와 두 번째 도메인 단위체 사이에 이형이합체화를 증진하는 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, Fc 도메인 내에 2개의 Fc 도메인 단위체 각각은 이들 두 단위체의 이형이합체화를 증진하는 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, SIRP-α 구조체는 예로서, 첫 번째 Fc 도메인 단위체에 융합된 SIRP-α D1 변이체 폴리펩티드를 포함하는 첫 번째 아단위 및 두 번째 Fc 도메인 단위체를 포함하는 두 번째 아단위 (가령, SIRP-α D1 변이체 폴리펩티드 또는 임의의 다른 폴리펩티드가 없는)로부터 형성된다. 일부 구체예에서, 구조체는 Fc 도메인에 연결된 단일 SIRP-α D1 변이체 폴리펩티드를 갖는다 (가령, 단일 팔). 일부 구체예에서, 구조체는 Fc 도메인에 연결된 2개의 SIRP-α D1 변이체 폴리펩티드를 갖는다 (가령, 이중 팔). 일부 구체예에서, 약 500 nM의 KD를 갖는 SIRP-α D1 변이체가 이중 팔 구조체에서 특히 유용하다. 일부 구체예에서, 약 50 nM의 KD를 갖는 SIRP-α D1 변이체가 이중 팔 구조체에서 특히 유용하다. 일부 구체예에서, 약 5 nM의 KD를 갖는 SIRP-α D1 변이체가 이중 팔 구조체 및 단일 팔 구조체에서 유용하다. 일부 구체예에서, 약 500 pM의 KD를 갖는 SIRP-α D1 변이체가 이중 팔 구조체 및 단일 팔 구조체에서 유용하다. 일부 구체예에서, 약 100 pM의 KD를 갖는 SIRP-α D1 변이체가 이중 팔 구조체 및 단일 팔 구조체에서 유용하다. 일부 구체예에서, 약 50 pM의 KD를 갖는 SIRP-α D1 변이체가 이중 팔 구조체 및 단일 팔 구조체에서 유용하다. 일부 구체예에서, 약 10 pM의 KD를 갖는 SIRP-α D1 변이체가 이중 팔 구조체 및 단일 팔 구조체에서 유용하다.
일부 구체예에서, Fc 도메인 단위체의 이형이합체화는 2개의 Fc 도메인 단위체 내에 상이하지만 양립하는 치환, 예를 들면, "노브-인투-홀" 잔기 쌍 및 전하 잔기 쌍을 도입함으로써 증진된다. 노브 및 홀 상호작용은 이형이합체 형성을 선호하고, 반면 노브-노브 및 홀-홀 상호작용은 입체 충돌 및 우호적인 상호작용의 결실로 인해 동종이합체 형성을 방해한다. 홀은 단백질 내에 본래 아미노산이 더욱 작은 측쇄 용적을 갖는 상이한 아미노산으로 대체될 때 창출되는 빈 공간을 지칭한다. 노브는 단백질 내에 본래 아미노산이 더욱 큰 측쇄 용적을 갖는 상이한 아미노산으로 대체될 때 창출되는 범프를 지칭한다. 가령, 일부 구체예에서, 대체되는 아미노산은 Fc 도메인 단위체의 CH3 항체 불변 도메인 내에 있고 2개 Fc 도메인 단위체의 이합체화에 관련된다. 일부 구체예에서, 한쪽 CH3 항체 불변 도메인 내에 홀은 노브 및 홀 아미노산이 2개 Fc 도메인 단위체의 이형이합체화를 증진하거나 또는 선호하도록 하는 행동을 하도록, 다른 CH3 항체 불변 도메인 내에 노브를 수용하도록 창출된다. 일부 구체예에서, 한쪽 CH3 항체 불변 도메인 내에 홀은 다른 CH3 항체 불변 도메인 내에 본래 아미노산을 더욱 우수하게 수용하도록 창출된다. 일부 구체예에서, 한쪽 CH3 항체 불변 도메인 내에 노브는 다른 CH3 항체 불변 도메인 내에 본래 아미노산과 추가 상호작용을 형성하도록 창출된다.
일부 구체예에서, 홀은 더욱 큰 측쇄를 갖는 아미노산, 예를 들면, 티로신 또는 트립토판을 더욱 작은 측쇄를 갖는 아미노산, 예를 들면, 알라닌, 발린, 또는 트레오닌으로 대체함으로써 구축된다 (가령, CH3 항체 불변 도메인에서 Y407V 돌연변이). 유사하게, 일부 구체예에서, 노브는 더욱 작은 측쇄를 갖는 아미노산을 더욱 큰 측쇄를 갖는 아미노산으로 대체함으로써 구축된다 (가령, CH3 항체 불변 도메인에서 T366W 돌연변이). 일부 구체예에서, 한쪽 Fc 도메인 단위체는 노브 돌연변이 T366W를 포함하고, 그리고 다른 Fc 도메인 단위체는 홀 돌연변이 T366S, L358A 및 Y407V를 포함한다. 일부 구체예에서, 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드는 원치 않는 노브-노브 동종이합체 형성을 제한하기 위해, 노브 돌연변이 T366W를 포함하는 Fc 도메인 단위체에 융합된다. 노브-인투-홀 아미노산 쌍의 실례는 제한 없이, 표 9에 포함되고, 그리고 노브-인투-홀 Fc 변이체 및 SIRP-α - Fc 융합의 실례는 표 10에서 제공된다.
표 9. 노브-인투-홀 아미노산 쌍
Fc 도메인 단위체 1 Y407T Y407A F405A T394S T366S
L358A
Y407V		 T394W
Y407T		 T394S
Y407A		 T366W
T394S
Fc 도메인 단위체 2 T366Y T366W T394W F405W T366W T366Y
F405A		 T366W
F405W		 F405W
Y407A
표 10. Fc 변이체 및 SIRP-α - Fc 융합의 실례
서열 번호: 아미노산 서열
138 EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRVLIYNQRQGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGAITPADAGTYYCIKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
139 DKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
140 EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRVLIYNQRQGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGAITPADAGTYYCIKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
141 DKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
142 EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQREGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGAITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
143 EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQREGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGAITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
145 EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQREGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGAITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSEKTHTCPECPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCEVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
146 EEELQVIQPDKSVLVAAGETATLRCTATSLFPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQRQGPFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
147 DKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
148 EEELQVIQPDKSVLVAAGETATLRCTATSLFPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQRQGPFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
149 DKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
노브-인투-홀 전략에 더하여, 일부 구체예에서, 정전 스티어링 또한, Fc 도메인 단위체의 이합체화를 제어하는데 이용된다. 정전 스티어링은 고차 단백질 분자의 형성을 제어하기 위해, 펩티드, 단백질 도메인 및 단백질 내에서 반대로 하전된 아미노산 사이에 우호적인 정전 상호작용의 활용을 지칭한다. 특히, 정전 스티어링을 이용하여 Fc 도메인 단위체의 이합체화를 제어하기 위해, CH3-CH3 인터페이스를 구성하는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기는 상호작용이 도입된 비전하 아미노산에 따라, 정전으로 우호적이거나 또는 불리하게 되도록, 양성으로 또는 음성으로 하전된 아미노산 잔기로 대체된다. 일부 구체예에서, 인터페이스 내에 양성으로 하전된 아미노산, 예를 들면, 리신, 아르기닌, 또는 히스티딘은 음성으로 하전된 아미노산, 예를 들면, 아스파르트산 또는 글루타민산으로 대체된다. 일부 구체예에서, 인터페이스 내에 음성으로 하전된 아미노산은 양성으로 하전된 아미노산으로 대체된다. 일부 구체예에서, 하전된 아미노산은 상호작용하는 CH3 항체 불변 도메인 중에서 하나, 또는 둘 모두에 도입된다. 일부 구체예에서, 2개의 Fc 도메인 단위체의 상호작용 CH3 항체 불변 도메인에 하전된 아미노산을 도입하는 것은 하전된 아미노산 사이의 상호작용으로부터 발생하는 정전 스티어링 효과에 의해 제어될 때, Fc 도메인 단위체의 이형이합체의 선택적 형성을 증진한다. 정전 스티어링 아미노산 쌍의 실례는 제한 없이, 표 11에 포함된다.
표 11. 정전 스티어링 아미노산 쌍
Fc 도메인 단위체 1 K409D K409D K409E K409E K392D K392D K392E K392E K409D
K392D		 K370E
K409D
K439E
Fc 도메인 단위체 2 D399K D399R D399K D399R D399K D399R D399K D399R D399K
D356K		 D356K E357K
D399K
특히, 이중특이적 항체를 작제하는 맥락에서, Fc 도메인 단위체의 이형이합체화를 제어하는데 이용되는 다른 방법이 가용하다.
일부 구체예에서, 첫 번째 Fc 도메인 단위체 및 두 번째 Fc 도메인 단위체는 각각, 인간 IgG1의 서열에 비하여, 다음의 아미노산 치환 중에서 하나 또는 그 이상을 포함한다: T366W, T366S, L368A, Y407V, T366Y, T394W, F405W, Y349T, Y349E, Y349V, L351T, L351H, L351N, L351K, P353S, S354D, D356K, D356R, D356S, E357K, E357R, E357Q, S364A, T366E, L368T, L368Y, L368E, K370E, K370D, K370Q, K392E, K392D, T394N, P395N, P396T, V397T, V397Q, L398T, D399K, D399R, D399N, F405T, F405H, F405R, Y407T, Y407H, Y407I, K409E, K409D, K409T 및 K409I.
일부 구체예에서, Fc 도메인 단위체는 (a) 야생형 인간 IgG1에 비하여 다음의 아미노산 치환 중에서 한 가지: T366W, T366S, L368A, Y407V, T366Y, T394W, F405W, Y349T, Y349E, Y349V, L351T, L351H, L351N, L351K, P353S, S354D, D356K, D356R, D356S, E357K, E357R, E357Q, S364A, T366E, L368T, L368Y, L368E, K370E, K370D, K370Q, K392E, K392D, T394N, P395N, P396T, V397T, V397Q, L398T, D399K, D399R, D399N, F405T, F405H, F405R, Y407T, Y407H, Y407I, K409E, K409D, K409T, 또는 K409I; 또는 (b) (i) 인간 IgG1 Fc 영역에 비하여 N297A 돌연변이; (ii) 인간 IgG1 Fc 영역에 비하여 L234A, L235A 및 G237A 돌연변이; (iii) 인간 IgG1 Fc 영역에 비하여 L234A, L235A, G237A 및 N297A 돌연변이; (iv) 인간 IgG2 Fc 영역에 비하여 N297A 돌연변이; (v) 인간 IgG2 Fc 영역에 비하여 A330S 및 P331S 돌연변이; (vi) 인간 IgG2 Fc 영역에 비하여 A330S, P331S 및 N297A 돌연변이; (vii) 인간 IgG4 Fc 영역에 비하여 S228P, E233P, F234V, L235A 및 delG236 돌연변이; 또는 (viii) 인간 IgG4 Fc 영역에 비하여 S228P, E233P, F234V, L235A, delG236 및 N297A 돌연변이를 포함한다. 일부 구체예에서, Fc 도메인 단위체는 (a) 야생형 인간 IgG1에 비하여 다음의 아미노산 치환 중에서 한 가지: T366W, T366S, L368A, Y407V, T366Y, T394W, F405W, Y349T, Y349E, Y349V, L351T, L351H, L351N, L351K, P353S, S354D, D356K, D356R, D356S, E357K, E357R, E357Q, S364A, T366E, L368T, L368Y, L368E, K370E, K370D, K370Q, K392E, K392D, T394N, P395N, P396T, V397T, V397Q, L398T, D399K, D399R, D399N, F405T, F405H, F405R, Y407T, Y407H, Y407I, K409E, K409D, K409T, 또는 K409I를 포함하고; 그리고 (b) (i) 인간 IgG1 Fc 영역에 비하여 N297A 돌연변이; (ii) 인간 IgG1 Fc 영역에 비하여 L234A, L235A 및 G237A 돌연변이; (iii) 인간 IgG1 Fc 영역에 비하여 L234A, L235A, G237A 및 N297A 돌연변이; (iv) 인간 IgG2 Fc 영역에 비하여 N297A 돌연변이; (v) 인간 IgG2 Fc 영역에 비하여 A330S 및 P331S 돌연변이; (vi) 인간 IgG2 Fc 영역에 비하여 A330S, P331S 및 N297A 돌연변이; (vii) 인간 IgG4 Fc 영역에 비하여 S228P, E233P, F234V, L235A 및 delG236 돌연변이; 또는 (viii) 인간 IgG4 Fc 영역에 비하여 S228P, E233P, F234V, L235A, delG236 및 N297A 돌연변이를 더욱 포함한다.
일부 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 Fc 도메인 단위체는 상이한 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, 첫 번째 Fc 도메인 단위체는 T366W를 포함한다. 일부 구체예에서, 두 번째 Fc 도메인 단위체는 T366S, L368A 및 Y407V를 포함한다. 일부 구체예에서, 첫 번째 Fc 도메인 단위체는 D399K를 포함한다. 일부 구체예에서, 두 번째 Fc 도메인 단위체는 K409D를 포함한다.
IV. 혈청 알부민
일부 구체예에서, 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 80에서 아미노산 돌연변이; 및 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 6, 잔기 27, 잔기 31, 잔기 47, 잔기 53, 잔기 54, 잔기 56, 잔기 66 및 잔기 92로 구성된 군에서 선택되는 잔기에서 최소한 하나의 추가 아미노산 돌연변이를 갖는 SIRP-α D1 도메인을 포함하는 신호-조절 단백질 α (SIRP-α) D1 변이체, 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드가 본원에서 개시된다.
일부 구체예에서, Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드가 또한 본원에서 개시되고, 여기서 상기 Fc 변이체는 2개의 Fc 도메인 단위체를 갖는 Fc 도메인 이합체를 포함하고, 여기서 각 Fc 도메인 단위체는 독립적으로 (i) 돌연변이 L234A, L235A, G237A 및 N297A로 구성되는 인간 IgG1 Fc 영역; (ii) 돌연변이 A330S, P331S 및 N297A로 구성되는 인간 IgG2 Fc 영역; 또는 (iii) 돌연변이 S228P, E233P, F234V, L235A, delG236 및 N297A를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역에서 선택된다.
혈청 알부민에 융합은 단백질 약제의 약물동력학을 향상시킬 수 있고, 그리고 일부 구체예에서, 본원에서 설명된 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드는 혈청 알부민과 연결된다.
혈청 알부민은 포유동물의 혈액에서 풍부한 구상 단백질이다. 혈청 알부민은 간에서 생산되고 혈청 단백질의 약 절반을 구성할 수 있다. 이것은 단위체성이고 혈액에서 가용성이다. 혈청 알부민의 가장 결정적인 기능 중에서 일부는 체내에서 호르몬, 지방산 및 기타 단백질을 수송하고, pH를 완충하고, 그리고 혈관 및 신체 조직 사이에 체액의 적절한 분포를 위해 필요한 삼투압을 유지하는 것을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 혈청 알부민은 인간 혈청 알부민 (HSA)이다. 일부 구체예에서, HSA는 본 발명의 폴리펩티드의 혈청 반감기를 증가시키기 위해 상기 폴리펩티드의 C 말단에 연결된다. 일부 구체예에서, HSA의 N 말단은 본 발명의 폴리펩티드의 C 말단에 연결된다. 일부 구체예에서, HSA는 직접적으로 또는 링커를 통해, 상기 폴리펩티드의 C 말단에 연결된다. 일부 구체예에서, HSA는 직접적으로 또는 링커를 통해, 상기 폴리펩티드의 N 말단에 연결된다.
일부 구체예에서, 인간 혈청 알부민은 표 12에서 보여지는 바와 같은 UniProt 식별 번호: P02768의 아미노산 (aa) 25-609의 서열 (서열 번호: 12)을 포함한다. 일부 구체예에서, 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체 (가령, 표 2, 5 및 6에서 설명된 임의의 SIRP-α D1 변이체)에 결합된 HSA는 UniProt 식별 번호: P02768의 서열의 아미노산 25-609 (서열 번호: 12)를 포함한다. 일부 구체예에서, HSA는 서열 번호: 12에 비하여, C34S 또는 K573P 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, HSA는 서열 번호: 12에 비하여, C34S 및 K573P 치환을 포함한다.
표 12. HSA의 서열
서열 번호: 설명 아미노산 서열
12 UniProt 식별 번호: P02768, AA 25-609 DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
일부 구체예에서, 혈청 알부민은 본 발명의 폴리펩티드에 유전적으로 융합되거나 또는 화학적 수단, 예를 들면, 화학적 접합을 통해 폴리펩티드에 결합된다. 일부 구체예에서, 스페이서는 폴리펩티드 및 HSA 사이에 삽입된다. 스페이서의 일부 실례는 본원의 다른 곳에서 상세하게 설명된다. 일부 구체예에서, 스페이서는 A 또는 AAAL이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드에서 HSA의 융합은 폴리펩티드의 연장된 체류뿐만 아니라 반감기에서 증가를 야기한다.
SIRP-α D1 변이체 폴리펩티드 및 융합된 HSA를 포함하는 폴리펩티드는 표 13에서 제공된 서열 번호: 150-159를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
표 13. HSA에 융합된 SIRP-α 변이체를 포함하는 폴리펩티드
서열 번호: 아미노산 서열
150 EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRVLIYNQRQGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCIKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
151 EEELQVIQPDKSVLVAAGETATLRCTATSLFPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQRQGPFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
152 EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRVLIYNQRQGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGAITPADAGTYYCIKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
153 EEELQVIQPDKSVLVAAGETATLRCTATSLFPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQRQGPFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRIGAITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
154 EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRVLIYNQREGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGAITPADAGTYYCIKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
155 EEELQVIQPDKSVLVAAGETATLRCTATSLFPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQREGPFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRIGAITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
156 EEELQVIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQREGPFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRIGAITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
157 EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQREGPFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRIGAITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
158 EEELQVIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQREGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGAITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
159 EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQREGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGAITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 표 13에서 제공된 임의의 변이체에 최소한 85% 서열 동일성 (가령, 최소한 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 높은 친화성 SIRP-α D1 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 표 13에서 서열 번호: 154, 155 및 159에 최소한 85% 서열 동일성 (가령, 최소한 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 높은 친화성 SIRP-α D1 도메인을 포함한다.
V. 알부민 결합 펩티드
일부 구체예에서, 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 80에서 아미노산 돌연변이; 및 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 6, 잔기 27, 잔기 31, 잔기 47, 잔기 53, 잔기 54, 잔기 56, 잔기 66 및 잔기 92로 구성된 군에서 선택되는 잔기에서 최소한 하나의 추가 아미노산 돌연변이를 갖는 SIRP-α D1 도메인을 포함하는 신호-조절 단백질 α (SIRP-α) D1 변이체, 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드가 본원에서 개시된다.
일부 구체예에서, Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드가 또한 본원에서 개시되고, 여기서 상기 Fc 변이체는 2개의 Fc 도메인 단위체를 갖는 Fc 도메인 이합체를 포함하고, 여기서 각 Fc 도메인 단위체는 독립적으로 (i) 돌연변이 L234A, L235A, G237A 및 N297A로 구성되는 인간 IgG1 Fc 영역; (ii) 돌연변이 A330S, P331S 및 N297A로 구성되는 인간 IgG2 Fc 영역; 또는 (iii) 돌연변이 S228P, E233P, F234V, L235A, delG236 및 N297A를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역에서 선택된다.
혈청 단백질에 결합은 단백질 약제의 약물동력학을 향상시킬 수 있고, 그리고 특히, 일부 구체예에서, 본원에서 설명된 폴리펩티드는 혈청 단백질-결합 펩티드 또는 단백질과 융합된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "알부민 결합 펩티드"는 혈청 알부민 단백질에 대한 친화성을 갖고 상기 단백질에 결합하는데 기능하는 약 12개 내지 16개 아미노산의 아미노산 서열을 지칭한다. 일부 구체예에서, 알부민 결합 펩티드는 인간, 생쥐, 또는 쥐로부터 기원한다.
일부 구체예에서, 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체 (가령, 표 2, 5 및 6에서 제공된 임의의 변이체)를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드의 반감기를 증가시키기 위해, 혈청 알부민에 결합 활성을 전시하는 알부민 결합 펩티드에 융합된다. 여기에서 설명된 방법 및 조성물에서 이용될 수 있는 다양한 알부민 결합 펩티드가 가용하다. 일부 구체예에서, 알부민 결합 펩티드는 서열 DICLPRWGCLW (서열 번호: 160)를 포함한다. 일부 구체예에서, 알부민 결합 펩티드는 본 발명의 폴리펩티드에 유전적으로 융합되거나 또는 화학적 수단, 예를 들면, 화학적 접합을 통해 폴리펩티드에 부착된다.
일부 구체예에서, 융합 단백질의 추가 구조적 및 공간적 유연성을 허용하기 위해, 링커 (가령, 스페이서)가 상기 폴리펩티드 및 알부민 결합 펩티드 사이에 삽입된다. 특정한 링커 (가령, 스페이서) 및 이들의 아미노산 서열은 본원에서 더욱 상세하게 설명된다. 일부 구체예에서, 알부민 결합 펩티드는 본 발명의 폴리펩티드의 N- 또는 C 말단에 융합된다. 한 가지 실례에서, 알부민 결합 펩티드의 N 말단이 펩티드 결합을 통해 본 발명의 폴리펩티드의 C 말단에 직접적으로 융합된다. 다른 실례에서, 알부민 결합 펩티드의 C 말단이 펩티드 결합을 통해 본 발명의 폴리펩티드의 N 말단에 직접적으로 융합된다. 일부 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드에 알부민 결합 펩티드의 융합은 혈청 알부민에 이의 결합을 통해 상기 폴리펩티드의 연장된 체류를 야기한다.
VI. 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 중합체
일부 구체예에서, 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 80에서 아미노산 돌연변이; 및 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 6, 잔기 27, 잔기 31, 잔기 47, 잔기 53, 잔기 54, 잔기 56, 잔기 66 및 잔기 92로 구성된 군에서 선택되는 잔기에서 최소한 하나의 추가 아미노산 돌연변이를 갖는 SIRP-α D1 도메인을 포함하는 신호-조절 단백질 α (SIRP-α) D1 변이체, 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드가 본원에서 개시된다.
일부 구체예에서, Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드가 또한 본원에서 개시되고, 여기서 상기 Fc 변이체는 2개의 Fc 도메인 단위체를 갖는 Fc 도메인 이합체를 포함하고, 여기서 각 Fc 도메인 단위체는 독립적으로 (i) 돌연변이 L234A, L235A, G237A 및 N297A로 구성되는 인간 IgG1 Fc 영역; (ii) 돌연변이 A330S, P331S 및 N297A로 구성되는 인간 IgG2 Fc 영역; 또는 (iii) 돌연변이 S228P, E233P, F234V, L235A, delG236 및 N297A를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역에서 선택된다.
일부 구체예에서, 높은 친화성 SIRP-α D1 도메인 (가령, 표 2, 5 및 6에서 제공된 임의의 변이체)을 포함하는 폴리펩티드는 중합체 (가령, 폴리에틸렌 글리콜, PEG)에 융합된다. 일부 구체예에서, 단백질 약제에 중합체의 부착은 상기 단백질 약제를 숙주의 면역계로부터 "감춘다". 이에 더하여, 일부 구체예에서, 일정한 중합체, 예를 들면, 친수성 중합체는 소수성 단백질 및 약물에 물 용해도를 제공한다. 가령, 일부 구체예에서, 이런 중합체는 PEG, 폴리시알산 사슬 및 PAS 사슬 분자를 포함한다. 일부 구체예에서, 중합체, 예를 들면, PEG는 폴리펩티드 내에 시스테인 치환 또는 부가에 공유 부착된다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드 내에 시스테인 치환은 표 2, 5 및 6에서 제공된 서열 중에서 한 가지의 서열에 비하여, I7C, A16C, S20C, T20C, A45C, G45C, G79C, S79C, 또는 A84C이다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드 내에 시스테인 잔기의 부가는 펩티드 합성, 유전자 변형, 분자 클로닝, 또는 이들의 임의의 조합을 이용하여 도입된다. 일부 구체예에서, 중합체, 예를 들면, PEG는 시스테인-말레이미드 접합을 이용하여 시스테인 잔기에 부착된다. 일부 구체예에서, 중합체, 예를 들면, PEG는 전통적인 화학적 방법, 예를 들면, 화학적 접합을 이용하여, N- 또는 C 말단에서 또는 내부 위치에서, 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체를 포함하는 폴리펩티드에 공유 부착된다.
VII. 이중특이적 구조체
일부 구체예에서, 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 80에서 아미노산 돌연변이; 및 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 6, 잔기 27, 잔기 31, 잔기 47, 잔기 53, 잔기 54, 잔기 56, 잔기 66 및 잔기 92로 구성된 군에서 선택되는 잔기에서 최소한 하나의 추가 아미노산 돌연변이를 갖는 SIRP-α D1 도메인을 포함하는 신호-조절 단백질 α (SIRP-α) D1 변이체, 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드가 본원에서 개시된다.
일부 구체예에서, Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드가 또한 본원에서 개시되고, 여기서 상기 Fc 변이체는 2개의 Fc 도메인 단위체를 갖는 Fc 도메인 이합체를 포함하고, 여기서 각 Fc 도메인 단위체는 독립적으로 (i) 돌연변이 L234A, L235A, G237A 및 N297A로 구성되는 인간 IgG1 Fc 영역; (ii) 돌연변이 A330S, P331S 및 N297A로 구성되는 인간 IgG2 Fc 영역; 또는 (iii) 돌연변이 S228P, E233P, F234V, L235A, delG236 및 N297A를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역에서 선택된다.
일부 구체예에서, 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체 (가령, 표 2, 5 및 6에서 제공된 변이체 중에서 한 가지)를 갖는 폴리펩티드는 이중특이적 구조체를 포함한다. 이중특이적 구조체는 2개의 표적-상호작용 도메인을 갖는 구조체를 지칭한다. 일부 구체예에서, 이중특이적 구조체는 Fc 도메인 및 2개의 표적-상호작용 도메인: (1) SIRP-α D1 도메인 또는 이의 변이체 (가령, 표 2, 5 및 6에서 제공된 변이체 중에서 한 가지) 및 (2) 항체 가변 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 이중특이적 구조체는 첫 번째 폴리펩티드 및 두 번째 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 첫 번째 폴리펩티드는 화학식 A-L-B를 갖고, 여기서 A는 SIRP-α D1 도메인 또는 이의 변이체를 포함하고, L은 링커이고, 그리고 B는 첫 번째 Fc 도메인 단위체를 포함한다. 일부 구체예에서, 두 번째 폴리펩티드는 화학식 A'-L'-B'를 갖고, 여기서 A'는 항체 가변 도메인을 포함하고, L'은 링커이고; 그리고 B'는 두 번째 Fc 도메인 단위체를 포함한다. 일부 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 폴리펩티드의 배향정위는 각각, B-L-A 및 B'-L'-A'이다. 일부 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 Fc 도메인 단위체는 합동되어 이중특이적 구조체 내에 Fc 도메인을 형성한다. 일부 구체예에서, 이중특이적 구조체는 임의의 면역글로불린 항체 아이소타입 (가령, IgG, IgE, IgM, IgA 및 IgD)이다. SIRP-α D1 도메인의 변이체는 야생형 인간 SIRP-α의 D1 도메인 및 야생형 D1 도메인에 비하여 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환 (가령, 표 2, 5 및 6에서 설명된 바와 같은 임의의 SIRP-α D1 변이체)을 포함한다. 일부 구체예에서, SIRP-α D1 변이체는 야생형 인간 SIRP-α D1 도메인보다 더욱 높은 결합 친화성으로 CD47에 결합한다. 일부 구체예에서, 이중특이적 구조체에서 항체 가변 도메인은 세포 항원 (가령, 암 세포 상에 세포 항원)을 표적으로 한다.
항체 가변 도메인은 상보성 결정 영역 (CDRs, 예를 들면, CDR L1, CDR L2, CDR L3, CDR H1, CDR H2 및 CDR H3) 및 프레임워크 영역 (FRs)의 아미노산 서열을 포함하는 항체의 경쇄와 중쇄의 부분을 지칭한다. 항체의 가변 도메인은 특이적 항원에 결합하는 능력을 항체에 부여할 수 있다. 많은 상이한 항체 가변 도메인 분자가 작제될 수 있다. 일부 구체예에서, 이용되는 항체 가변 도메인 분자는 단일 사슬 Fv를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
일부 구체예에서, 이중특이적 구조체에서 항체 가변 도메인은 세포 항원 (가령, 암 세포 상에 또는 면역 세포 상에 세포 항원)을 표적으로 한다. 일부 단백질은 비-암 세포에서보다 암 세포에서 더욱 높은 수준으로 발현된다. 가령, 암 항원은 암 세포에 의해 우선적으로 발현되는 단백질이고 (가령, 이것은 비-암 세포 상에서보다 암 세포 상에서 더욱 높은 수준으로 발현된다), 그리고 일부 경우에 이것은 오로지 암 세포에 의해서만 발현된다. 일부 구체예에서, 높은 친화성 SIRP-α 도메인 또는 이의 변이체와 Fc 도메인을 형성하는 항체 가변 도메인에 의해 표적화되는 단백질, 예를 들면, 암 세포에 의해 발현된 단백질은 다음을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다: 5T4, AGS-16, ALK1, ANG-2, B7-H3, B7-H4, c-fms, c-Met, CA6, CD123, CD19, CD20, CD22, EpCAM, CD30, CD32b, CD33, CD37, CD38, CD40, CD52, CD70, CD74, CD79b, CD98, CEA, CEACAM5, CLDN18.2, CLDN6, CS1, CXCR4, DLL-4, EGFR, EGP-1, ENPP3, EphA3, ETBR, FGFR2, 섬유결합소, FR-알파, GCC, GD2, 글리피칸-3, GPNMB, HER-2, HER3, HLA-DR, ICAM-1, IGF-1R, IL-3R, LIV-1, 메소텔린, MUC16, MUC1, NaPi2b, 넥틴-4, Notch 2, Notch 1, PD-L1, PD-L2, PDGFR-a, PS, PSMA, SLTRK6, STEAP1, TEM1 , VEGFR, CD25, CD27L, DKK-1, 또는 CSF-1R. 일부 구체예에서, 이중특이적 구조체에서 항체 가변 도메인은 인간 단백질에 결합하도록 가공되지 않는다.
일부 구체예에서, 이중특이적 구조체의 Fc 도메인 내에 첫 번째와 두 번째 Fc 도메인 단위체 각각은 첫 번째와 두 번째 Fc 도메인 단위체의 이형이합체화를 증진하는 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환을 포함한다. Fc 도메인 단위체의 이형이합체화를 증진하는 방법은 본원에서 더욱 상세하게 설명된다 (가령, 노브-인투-홀 전략 및 정전 스티어링 전략을 참조한다).
일부 구체예에서, 이중특이적 구조체의 Fc 도메인, 대표적으로 "죽은 Fc 도메인"은 하나 또는 그 이상의 작동체 기능을 결여하도록 돌연변이된다. 일부 구체예에서, 이중특이적 구조체의 Fc 도메인은 IgG1 항체로부터 유래되고, 그리고 Fc 도메인 및 Fcγ 수용체 사이에 상호작용 또는 결합을 감소시키기 위해, 서열 번호: 161 (표 14)의 서열에 비하여 아미노산 치환 L14A, L15A 및 G17A를 포함한다. 일부 구체예에서, Fc 도메인 단위체는 IgG1 항체로부터 유래되고, 그리고 아미노산 치환 L234A, L235A, G237A 및 N297A (Kabat et al., 1991에 따른 EU 넘버링 시스템에 따라 지정될 때) 중에서 하나 또는 그 이상을 포함한다. 일부 구체예에서, 본원에서 설명된 Fc 변이체는 최소한으로 글리코실화되거나 또는 감소된 글리코실화를 갖는다. 일부 구체예에서, 데글리코실화는 N297A의 돌연변이로, 또는 N297을 N이 아닌 임의의 아미노산 (Kabat, et al. (1991)에 따른 EU 넘버링 시스템에 따라 지정될 때)으로 돌연변이시킴으로써 달성된다. 일부 구체예에서, 이중특이적 구조체는 이것이 상이한 세포 유형에 의해 발현된 단백질 (가령, 수용체, 예를 들면, Fc 수용체)에 우선적 결합을 갖도록 설계된다. 여러 연구는 항체의 힌지, 불변 도메인 (가령, CH2 및 CH3 불변 도메인), 또는 힌지 및 불변 도메인에서 아미노산 치환이 상이한 유형의 세포 (가령, 조절 T-세포 및 작동체 T-세포)에서 발현된 특정한 수용체 (가령, Fc 수용체)를 향한 항체의 결합 친화성을 효율적으로 변경할 수 있다는 것을 증명하였다. 아미노산 치환 A111S 및 P112S (서열 번호: 162에 비하여, 표 14)를 갖는 IgG2는 야생형 IgG2와 비교하여 FcγRIIIa 131 H에 대한 유의미하게 감소된 결합을 전시한다. 일부 구체예에서, 본원에서 Fc 변이체는 최소한으로 글리코실화되거나 또는 감소된 글리코실화를 갖는다. 일부 구체예에서, 데글리코실화는 N297A의 돌연변이로, 또는 N297을 N이 아닌 임의의 아미노산 (Kabat, et al. (1991)에 따른 EU 넘버링 시스템에 따라 지정될 때)으로 돌연변이시킴으로써 달성된다. 일부 구체예에서, 이중특이적 구조체는 IgG2 또는 IgG4 하위부류의 Fc 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, IgG2 하위부류의 Fc 도메인을 포함하는 이중특이적 구조체는 서열 번호: 162 (표 14)에 비하여 아미노산 치환 A111S 및 P112S를 포함한다. 일부 구체예에서, Fc 변이체는 A330S, P331S 및 N297A 아미노산 치환 (Kabat, et al. (1991)에 따른 EU 넘버링 시스템에 따라 지정될 때) 중에서 하나 또는 그 이상을 포함하는 인간 IgG2 Fc 서열을 포함한다.
표 14. IgG 아미노산 서열
서열 번호: 아미노산 서열
161 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
162 ERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
링커 및 두 번째 Fc 도메인 단위체에 의하여 첫 번째 Fc 도메인 단위체에 결합된, SIRP-α D1 도메인을 포함하는 SIRP-α 구조체 또는 이의 변이체의 실례가 도면 1에서 도시되는데, 여기서 첫 번째와 두 번째 Fc 도메인 단위체는 합동되어 Fc 도메인을 형성한다. 일부 구체예에서, 두 번째 Fc 단위체에 부착된 단백질 또는 항체 가변 도메인이 없다. 일부 구체예에서, SIRP-α 구조체는 링커에 의하여 첫 번째 Fc 도메인 단위체에 결합된 SIRP-α D1 도메인 또는 이의 변이체 및 링커에 의하여 두 번째 Fc 도메인 단위체에 결합된 항체 가변 도메인을 포함하고, 여기서 첫 번째와 두 번째 Fc 도메인 단위체는 합동되어 Fc 도메인을 형성한다 (도면 2에서 보여 지는 바와 같이). 일부 구체예에서, SIRP-α 구조체는 링커에 의하여 첫 번째 Fc 도메인 단위체에 결합된 SIRP-α D1 도메인 또는 이의 변이체 및 링커에 의하여 두 번째 Fc 도메인 단위체에 결합된 치료적 단백질 (가령, 사이토킨, 인터류킨, 항원, 스테로이드, 항염증제, 또는 면역조정제)을 포함하고, 여기서 첫 번째와 두 번째 Fc 도메인 단위체는 합동되어 Fc 도메인을 형성한다 (도면 3에서 보여 지는 바와 같이). 일부 구체예에서, 앞서 설명된 SIRP-α 구조체 (가령, 도면 1-3에서 보여 지는 바와 같이 SIRP-α 구조체)의 Fc 도메인 내에 2개의 Fc 도메인 단위체 각각은 이들 두 단위체의 이형이합체화를 증진하는 아미노산 치환을 포함한다. 상이한 전략 (가령, 노브-인투-홀 전략, 정전 스티어링 전략) 및 2개의 Fc 도메인 단위체의 이형이합체화를 증진하는 Fc 도메인 아미노산 치환은 본원에서 상세하게 설명된다. 가령, 도면 4a는 원치 않는 노브-노브 동종이합체 형성을 제한하기 위해, 노브 돌연변이, 예를 들면, T366W를 포함하는 Fc 도메인 단위체에 결합된 SIRP-α D1 도메인 또는 이의 변이체를 갖는 SIRP-α 구조체를 도해한다. 도면 4b는 홀 돌연변이, 예를 들면, T366S, L358A 및 Y407V를 포함하는 Fc 도메인 단위체에 결합된 SIRP-α D1 도메인 또는 이의 변이체를 갖는 SIRP-α 구조체를 도해한다. 일부 구체예에서, 유사한 Fc 도메인 이형이합체화 전략이 도면 2 및 3에서 설명된 구조체에서 Fc 도메인에 적용된다. 일부 구체예에서, SIRP-α 구조체는 Fc 도메인 단위체에 결합된 SIRP-α D1 도메인 또는 이의 변이체의 융합 단백질을 포함한다 (도면 5a에서 보여 지는 바와 같이). 일부 구체예에서, 이러한 융합 단백질은 동종이합체를 형성한다 (도면 5b에서 보여 지는 바와 같이).
융합 상대와 연계된 본 발명의 Fc 변이체는 바람직하게는, 선천적 또는 야생형 (비-돌연변이된) 항체 Fc 영역을 포함하는 유사한 폴리펩티드 구조체와 비교하여 Fcγ 수용체 CD16a, CD32a, CD32b, CD32c 및 CD64 중에서 최소한 하나에 감소된 또는 제거된 결합을 전시한다. 일부 경우에, 본원에서 설명된 Fc 변이체 또는 융합 상대는 CD16a, CD32a, CD32b, CD32c 및 CD64 Fcγ 수용체에 감소된 또는 제거된 결합을 전시한다.
일부 구체예에서, 융합 상대와 연계된 본 발명의 Fc 변이체는 선천적 또는 야생형 (비-돌연변이된) Fc 영역을 포함하는 유사한 폴리펩티드 구조체와 비교하여 보체 성분 C1q 및 CDC에 대한 감소된 결합을 전시한다. 일부 경우에, Fc 변이체는 야생형 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 구조체와 비교하여 C1q 결합에서 최소한 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 감소를 전시한다. 일부 경우에, Fc 변이체는 선천적 또는 야생형 (비-돌연변이된) Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 구조체와 비교하여 감소된 CDC를 전시한다. 일부 구체예에서, Fc 변이체는 야생형 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 구조체와 비교하여 CDC에서 최소한 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 감소를 전시한다.
VIII. 링커
일부 구체예에서, 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 80에서 아미노산 돌연변이; 및 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 6, 잔기 27, 잔기 31, 잔기 47, 잔기 53, 잔기 54, 잔기 56, 잔기 66 및 잔기 92로 구성된 군에서 선택되는 잔기에서 최소한 하나의 추가 아미노산 돌연변이를 갖는 SIRP-α D1 도메인을 포함하는 신호-조절 단백질 α (SIRP-α) D1 변이체, 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드가 본원에서 개시된다.
일부 구체예에서, Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드가 또한 본원에서 개시되고, 여기서 상기 Fc 변이체는 2개의 Fc 도메인 단위체를 갖는 Fc 도메인 이합체를 포함하고, 여기서 각 Fc 도메인 단위체는 독립적으로 (i) 돌연변이 L234A, L235A, G237A 및 N297A로 구성되는 인간 IgG1 Fc 영역; (ii) 돌연변이 A330S, P331S 및 N297A로 구성되는 인간 IgG2 Fc 영역; 또는 (iii) 돌연변이 S228P, E233P, F234V, L235A, delG236 및 N297A를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역에서 선택된다.
본 발명에서, 링커는 폴리펩티드 또는 단백질 도메인 또는 연관된 비단백질 모이어티 사이에 연쇄 또는 결합을 설명하는데 이용된다. 일부 구체예에서, 링커는 Fc 도메인 단위체, 알부민 결합 펩티드, 또는 HSA 및 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체 사이에 연쇄 또는 결합이다. 일부 구체예에서, 링커는 2개의 폴리펩티드가 탠덤 시리즈로 서로에 연결되도록, SIRP-α D1 변이체의 C 말단 및 Fc 도메인 단위체, 알부민 결합 펩티드 또는 HSA의 N 말단을 연결한다.
일부 구체예에서, 링커는 단순한 공유 결합, 예를 들면, 펩티드 결합, 합성 중합체, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 중합체, 또는 화학 반응, 예를 들면, 화학적 접합으로부터 창출된 임의의 종류의 결합이다. 링커가 펩티드 결합일 때, 일부 구체예에서, 한쪽 단백질 도메인의 C 말단에서 카르복실산 기는 축합 반응에서 다른 단백질 도메인의 N 말단에서 아미노 기와 반응하여 펩티드 결합을 형성한다. 일부 구체예에서, 펩티드 결합은 전통적인 유기화학 반응을 통해 합성 수단으로부터, 또는 숙주 세포로부터 자연 생산에 의해 형성되는데, 여기서 탠덤 시리즈로 양쪽 단백질 (가령, Fc 도메인 단위체 및 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체)의 DNA 서열을 인코딩하는 핵산 분자는 숙주 세포 내에 필요한 분자 기계 (가령, DNA 중합효소 및 리보솜)에 의해 양쪽 단백질을 인코딩하는 인접한 폴리펩티드로 직접적으로 전사되고 번역될 수 있다.
링커가 합성 중합체 (가령, PEG 중합체)일 때, 일부 구체예에서, 중합체는 각 단부에서 반응성 화학적 기능기로 기능화되어, 두 단백질의 연결 단부에서 말단 아미노산과 반응한다.
링커 (전술한 펩티드 결합 제외)가 화학 반응으로부터 만들어질 때, 일부 구체예에서, 화학적 기능기 (가령, 아민, 카르복실산, 에스테르, 아지드, 또는 다른 기능기)가 한쪽 단백질의 C 말단 및 다른 단백질의 N 말단에 각각 합성적으로 부착된다. 일부 구체예에서, 이들 두 기능기는 이후, 합성 화학 수단을 통해 반응하여 화학 결합을 형성하고, 따라서 이들 두 단백질을 함께 연결한다.
스페이서
본 발명에서, 일부 구체예에서, Fc 도메인 단위체, 알부민 결합 펩티드 또는 HSA 및 본 발명의 폴리펩티드 사이에 링커는 약 1-200개 아미노산을 포함하는 아미노산 스페이서이다. 적합한 펩티드 스페이서는 유연한 아미노산 잔기, 예를 들면, 글리신 및 세린을 내포하는 펩티드 링커를 포함한다. 링커 서열의 실례는 표 15에서 제공된다. 일부 구체예에서, 스페이서는 GS, GG, GGS, GGG, GGGGS (서열 번호: 163), GGSG (서열 번호: 164), 또는 SGGG (서열 번호: 165)의 모티프, 예를 들면, 복수 또는 반복 모티프를 내포한다. 일부 구체예에서, 스페이서는 GS의 모티프를 포함하는 2 내지 12개 아미노산, 예를 들면, GS, GSGS (서열 번호: 166), GSGSGS (서열 번호: 167), GSGSGSGS (서열 번호: 168), GSGSGSGSGS (서열 번호: 169), 또는 GSGSGSGSGSGS (서열 번호: 170)를 내포한다. 일부 구체예에서, 스페이서는 GGS의 모티프를 포함하는 3 내지 12개 아미노산, 예를 들면, GGS, GGSGGS (서열 번호: 171), GGSGGSGGS (서열 번호: 172) 및 GGSGGSGGSGGS (서열 번호: 173)를 내포한다. 일부 구체예에서, 스페이서는 GGSG (서열 번호: 164)의 모티프를 포함하는 4 내지 12개 아미노산, 예를 들면, GGSG (서열 번호: 164), GGSGGGSG (서열 번호: 174), 또는 GGSGGGSGGGSG (서열 번호: 175)를 내포한다. 일부 구체예에서, 스페이서는 GGGGS (서열 번호: 163)의 모티프, 예를 들면, GGGGSGGGGSGGGGS (서열 번호: 176)를 내포한다. 일부 구체예에서, 스페이서는 글리신 및 세린 이외에 아미노산, 예를 들면, AAS (서열 번호: 177), AAAL (서열 번호: 178), AAAK (서열 번호: 179), AAAR (서열 번호: 180), EGKSSGSGSESKST (서열 번호: 181), GSAGSAAGSGEF (서열 번호: 182), AEAAAKEAAAKA (서열 번호: 183), KESGSVSSEQLAQFRSLD (서열 번호: 184), GGGGAGGGG (서열 번호: 185), GENLYFQSGG (서열 번호: 186), SACYCELS (서열 번호: 187), RSIAT (서열 번호: 188), RPACKIPNDLKQKVMNH (서열 번호: 189), GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG (서열 번호: 190), AAANSSIDLISVPVDSR (서열 번호: 191), 또는 GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS (서열 번호: 192)를 내포한다.
일부 구체예에서, 스페이서는 EAAAK (서열 번호: 193)의 모티프, 예를 들면, 복수 또는 반복 모티프를 내포한다. 일부 구체예에서, 스페이서는 프롤린-풍부한 서열, 예를 들면, (XP)n (여기서 X는 임의의 아미노산 (가령, A, K, 또는 E)이고 n은 1-5이다) 및 PAPAP(서열 번호: 194)의 모티프, 예를 들면, 복수 또는 반복 모티프를 내포한다.
표 15. 링커 서열
서열 번호: 아미노산 서열
163 GGGGS
164 GGSG
165 SGGG
166 GSGS
167 GSGSGS
168 GSGSGSGS
169 GSGSGSGSGS
170 GSGSGSGSGSGS
171 GGSGGS
172 GGSGGSGGS
173 GGSGGSGGSGGS
174 GGSGGGSG
175 GGSGGGSGGGSG
176 GGGGSGGGGSGGGGS
177 AAS
178 AAAL
179 AAAK
180 AAAR
181 EGKSSGSGSESKST
182 GSAGSAAGSGEF
183 AEAAAKEAAAKA
184 KESGSVSSEQLAQFRSLD
185 GGGGAGGGG
186 GENLYFQSGG
187 SACYCELS
188 RSIAT
189 RPACKIPNDLKQKVMNH
190 GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG
191 AAANSSIDLISVPVDSR
192 GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS
193 EAAAK
194 PAPAP
일부 구체예에서, 이용되는 펩티드 스페이서 및 아미노산의 길이는 관련된 2개의 단백질 및 최종 단백질 융합 폴리펩티드에서 요망되는 유연성의 정도에 따라 조정된다. 일부 구체예에서, 스페이서의 길이는 적절한 단백질 접힘을 담보하고 응집체 형성을 방지하도록 조정된다. 일부 구체예에서, 스페이서, 예를 들면, HSA 및 본원에서 개시된 폴리펩티드 사이에 스페이서는 A 또는 AAAL (서열 번호: 178)이다.
IX. 벡터, 숙주 세포 및 단백질 생산
일부 구체예에서, 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 80에서 아미노산 돌연변이; 및 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 6, 잔기 27, 잔기 31, 잔기 47, 잔기 53, 잔기 54, 잔기 56, 잔기 66 및 잔기 92로 구성된 군에서 선택되는 잔기에서 최소한 하나의 추가 아미노산 돌연변이를 갖는 SIRP-α D1 도메인을 포함하는 신호-조절 단백질 α (SIRP-α) D1 변이체, 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드가 본원에서 개시된다.
일부 구체예에서, Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드가 또한 본원에서 개시되고, 여기서 상기 Fc 변이체는 2개의 Fc 도메인 단위체를 갖는 Fc 도메인 이합체를 포함하고, 여기서 각 Fc 도메인 단위체는 독립적으로 (i) 돌연변이 L234A, L235A, G237A 및 N297A로 구성되는 인간 IgG1 Fc 영역; (ii) 돌연변이 A330S, P331S 및 N297A로 구성되는 인간 IgG2 Fc 영역; 또는 (iii) 돌연변이 S228P, E233P, F234V, L235A, delG236 및 N297A를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역에서 선택된다.
일부 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 숙주 세포로부터 생산된다. 숙주 세포는 필요한 세포 성분, 예를 들면, 상응하는 핵산으로부터 본원에서 설명된 폴리펩티드 및 융합 폴리펩티드를 발현하는데 필요한 소기관을 포함하는 운반체를 지칭한다. 일부 구체예에서, 핵산은 형질전환, 형질감염, 전기천공, 인산칼슘 침전, 직접적인 현미주입, 감염 등에 의해 숙주 세포 내로 도입되는 핵산 벡터 내에 포함된다. 일부 구체예에서, 핵산 벡터의 선택은 이용되는 숙주 세포에 의존한다. 일부 구체예에서, 숙주 세포는 원핵 (가령, 세균) 또는 진핵 (가령, 포유류) 기원이다.
일부 구체예에서, 폴리펩티드, 예를 들면, SIRP-α D1 변이체 (가령, 표 2, 5 및 6에서 제공된 임의의 변이체) 및 융합 상대, 예를 들면, Fc 변이체, HSA 및 알부민 결합 펩티드를 포함하는 폴리펩티드 구조체는 폴리펩티드 구조체의 발현을 유도하거나 또는 유발하는 적절한 조건 하에 핵산, 바람직하게는 폴리펩티드 구조체 (가령, Fc 변이체, 링커 및 융합 상대)를 인코딩하는 핵산을 내포하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양함으로써 생산된다. 일부 구체예에서, 발현에 적절한 조건은 선택된 발현 벡터 및 숙주 세포에 따라 변한다. 일부 구체예에서, 포유류 세포, 세균, 곤충 세포 및 효모를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 매우 다양한 적절한 숙주 세포가 이용된다. 가령, 본 발명에서 용도를 발견하는 다양한 세포주는 American Type Culture Collection으로부터 가용한 ATCC® 세포주 카탈로그에서 설명된다. 일부 구체예에서, 본 발명의 Fc 변이체는 세포주의 유전공학 또는 세포 배양 조건의 변경, 예를 들면, 키푸넨신의 첨가에 의해, 또는 자연적으로 비-글리코실화 숙주, 예를 들면, 원핵생물 (대장균 (E. coli) 등)을 이용함으로써, 세포에 의해 발현되는 단백질을 글리코실화하지 않도록 최적화된 세포에서 발현되고, 그리고 일부 경우에, Fc에서 글리코실화 서열의 변경이 필요하지 않다.
핵산 벡터 작제 및 숙주 세포
본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열은 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 이들 방법은 올리고뉴클레오티드-매개된 (또는 특정 부위) 돌연변이유발 및 PCR 돌연변이유발을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 일부 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자는 표준 기술, 예를 들면, 유전자 합성을 이용하여 획득된다. 대안으로, 야생형 SIRP-α D1 도메인을 인코딩하는 핵산 분자는 표준 기술, 예를 들면, QuikChangeTM 돌연변이유발을 이용하여 특정한 아미노산 치환을 포함하도록 돌연변이된다. 일부 경우에, 핵산 분자는 뉴클레오티드 합성장치 또는 PCR 기술을 이용하여 합성된다.
일부 구체예에서, 폴리펩티드 구조체, 예를 들면, SIRP-α D1 변이체 (가령, 표 2, 5 및 6에서 제공된 임의의 변이체) 및 융합 상대, 예를 들면, Fc 변이체, HSA 및 알부민 결합 펩티드를 포함하는 폴리펩티드 구조체를 인코딩하는 핵산은 상기 단백질을 발현하기 위해 발현 벡터 내로 통합된다. 다양한 발현 벡터가 단백질 발현에 활용될 수 있다. 발현 벡터는 자기 복제, 염색체외 벡터 또는 숙주 유전체 내로 통합되는 벡터를 포함할 수 있다. 벡터는 또한, 다양한 성분 또는 요소를 포함할 수 있다. 가령, 일부 구체예에서, 벡터 성분은 전사 및 번역 조절 서열, 예를 들면, 프로모터 서열, 리보솜 결합 부위, 신호 서열, 전사 시작 및 종결 서열, 번역 시작 및 종결 서열, 3' 및 5' 비번역 영역 (UTRs), 그리고 인핸서 또는 활성인자 서열; 복제 기점; 선별 마커 유전자; 그리고 관심되는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열 및 전사 종결 서열을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 일부 구체예에서, 발현 벡터는 제어 또는 조절 서열, 선별가능 마커, 임의의 융합 상대, 추가 요소, 또는 이들의 임의의 조합과 작동가능하게 연결된 단백질을 포함한다. 용어 "작동가능하게 연결된"은 핵산이 다른 핵산 서열 서열과 기능적 관계로 배치된다는 것을 의미한다. 일반적으로, 이들 발현 벡터는 Fc 변이체를 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 전사 및 번역 조절 핵산을 포함하고, 그리고 단백질을 발현하는데 이용되는 숙주 세포에 전형적으로 적합하다. 선별 유전자 또는 마커, 예를 들면, 하지만 제한 없이, 항생제 내성 유전자 또는 형광 단백질 유전자가 예로서, 항생제 또는 형광 발현에 의해 발현 벡터를 내포하는 숙주 세포를 선별하는데 이용될 수 있다. 다양한 선별 유전자가 가용하다.
일부 구체예에서, 벡터의 성분 또는 요소는 발현 벡터가 숙주 세포 유형과 양립하도록 최적화된다. 본 발명에서 용도를 발견하는 발현 벡터는 포유류 세포, 세균, 곤충 세포, 효모에서, 그리고 시험관내 시스템에서 단백질 발현을 할 수 있게 하는 것들을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
일부 구체예에서, 포유류 세포가 본 발명의 폴리펩티드를 생산하기 위한 숙주 세포로서 이용된다. 포유류 세포 유형의 실례는 인간 배아 신장 (HEK) (가령, HEK293, HEK 293F), 중국 햄스터 난소 (CHO), HeLa, COS, PC3, Vero, MC3T3, NS0, Sp2/0, VERY, BHK, MDCK, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20, T47D, NS0 (임의의 면역글로불린 사슬을 내생적으로 생산하지 않는 뮤린 골수종 세포주), CRL7O3O, 그리고 HsS78Bst 세포를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 일부 구체예에서, 대장균 (E. coli) 세포가 본 발명의 폴리펩티드를 생산하기 위한 숙주 세포로서 이용된다. 대장균 (E. coli) 균주의 실례는 대장균 (E. coli) 294 (ATCC® 31,446), 대장균 (E. coli) λ 1776 (ATCC® 31,537, 대장균 (E. coli) BL21 (DE3) (ATCC® BAA-1025), 그리고 대장균 (E. coli) RV308 (ATCC® 31,608)을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
상이한 숙주 세포는 단백질 산물의 번역후 처리 및 변형 (가령, 글리코실화)을 위한 특징적이고 특이적인 기전을 갖는다. 일부 구체예에서, 적절한 세포주 또는 숙주 시스템은 발현되는 폴리펩티드의 정확한 변형 및 처리를 담보하도록 선택된다. 일단 벡터가 단백질 생산을 위해 숙주 세포 내로 도입되면, 숙주 세포는 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선별하거나, 또는 원하는 서열을 인코딩하는 유전자를 증폭하기 위해 적합하게 변형된 전통적인 영양 배지에서 배양된다.
일부 구체예에서, 폴리펩티드 구조체, 예를 들면, SIRP-α D1 변이체 (가령, 표 2, 5 및 6에서 제공된 임의의 변이체) 및 융합 상대, 예를 들면, Fc 변이체, HSA 및 알부민 결합 펩티드를 포함하는 폴리펩티드 구조체는 이들 발현 구조체가 바이러스, 예를 들면, 레트로바이러스 또는 아데노바이러스를 이용하여 포유류 세포 내로 도입되는 시스템을 비롯하여, 포유류 발현 시스템에서 발현된다. 일부 구체예에서, 인간, 생쥐, 쥐, 햄스터, 또는 영장류 세포가 활용된다. 적합한 세포는 또한, Jurkat T 세포, NIH3T3, CHO, COS 및 293 세포를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 공지된 연구 세포를 포함한다. 대안으로, 일부 구체예에서, 단백질은 세균 세포에서 발현된다. 세균 발현 시스템은 당해 분야에서 널리 공지되고, 그리고 대장균 (Escherichia coli, E. coli), 바실루스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 스트렙토코쿠스 크레모리스 (Streptococcus cremoris) 및 스트렙토코쿠스 리비단스 (Streptococcus lividans)를 포함한다. 일부 경우에, Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드 구조체는 곤충 세포, 예를 들면, 하지만 제한 없이 Sf9 및 Sf21 세포 또는 효모 세포, 예를 들면, 하지만 제한 없이 속 사카로미세스 (Saccharomyces), 피치아 (Pichia), 클루이베로미세스 (Kluyveromyces), 한세눌라 (Hansenula) 및 야로위아 (Yarrowia)로부터 생물체에서 생산된다. 일부 경우에, Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드 구조체는 무세포 번역 시스템을 이용하여 시험관내에서 발현된다. 원핵 (가령, 대장균 (E. coli)) 및 진핵 (가령, 맥아, 토끼 망상적혈구) 세포 둘 모두로부터 유래된 시험관내 번역 시스템이 가용하고, 그리고 일부 구체예에서, 관심되는 단백질의 발현 수준 및 기능적 성질에 근거하여 선택된다. 가령, 당업자에 의해 인지되는 바와 같이, 일부 전시 기술, 예를 들면, 리보솜 전시의 경우에 시험관내 번역이 필요하다. 이에 더하여, 일부 구체예에서, Fc 변이체는 화학적 합성 방법, 예를 들면, 하지만 제한 없이, 액체상 펩티드 합성 및 고체상 펩티드 합성에 의해 생산된다. 비-글리코실화 시스템, 예를 들면, 세균성 추출물을 이용한 시험관내 전사의 경우에, Fc는 심지어 자연 글리코실화 부위의 존재에서도 글리코실화되지 않을 것이고, 그리고 이런 이유로, Fc의 비활성화가 동등하게 획득될 것이다.
일부 구체예에서, 폴리펩티드 구조체는 자연발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 비자연 아미노산, 아미노산 유사체, 아미노산 모방체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 자연적으로 인코딩된 아미노산은 일반적으로, 20개 공통 아미노산 (알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루타민산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 그리고 발린) 및 피롤리신과 셀레노시스테인을 지칭한다. 아미노산 유사체는 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 예를 들면, 수소에 결합된 탄소, 카르복실 기, 아미노 기, 그리고 R 기를 갖는 화합물, 예를 들면, 호모세린, 노르류신, 메티오닌 술폭시드, 메티오닌 메틸 술포늄을 지칭한다. 일부 구체예에서, 이런 유사체는 변형된 R 기 (가령, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 중추를 갖지만, 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 일반적으로 유지한다.
단백질 생산, 회수 및 정제
일부 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드를 생산하는데 이용되는 숙주 세포는 선별된 숙주 세포를 배양하는데 적합한 배지에서 성장된다. 포유류 숙주 세포에 적합한 배지의 실례는 최소 필수 배지 (MEM), Dulbecco의 변형된 Eagle 배지 (DMEM), Expi293™ 발현 배지, 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충된 DMEM, 그리고 RPMI-1640을 포함한다. 세균 숙주 세포에 적합한 배지의 실례는 루리아 액체배지 (LB) 플러스 필요한 보충물, 예를 들면, 선별 작용제, 예를 들면, 암피실린을 포함한다. 일부 구체예에서, 숙주 세포는 적합한 온도, 예를 들면, 약 20 ℃ 내지 약 39 ℃, 예를 들면, 약 25 ℃ 내지 약 37 ℃, 바람직하게는 37 ℃, 그리고 CO2 수준, 예를 들면, 약 5% 내지 10%에서 배양된다. 일부 구체예에서, 배지의 pH는 주로 숙주 생명체에 따라, 약 pH 6.8 내지 pH 7.4, 예를 들면, pH 7.0이다. 유도성 프로모터가 발현 벡터에서 이용되면, 단백질 발현은 상기 프로모터의 활성화에 적합한 조건 하에 유도될 수 있다.
일부 구체예에서, 단백질 회수는 예로서, 삼투압 충격, 초음파처리, 또는 용해에 의해 숙주 세포를 파괴하는 것을 수반한다. 일단 세포가 파괴되면, 세포 조직파편은 원심분리 또는 여과에 의해 제거된다. 단백질은 이후, 더욱 정제될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 단백질 정제의 다양한 방법에 의해, 예를 들면, 크로마토그래피 (가령, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 및 크기-배제 칼럼 크로마토그래피), 원심분리, 차별적 용해도에 의해, 또는 단백질의 정제를 위한 임의의 다른 표준 기술에 의해 정제된다. 가령, 일부 구체예에서, 단백질은 친화성 칼럼, 예를 들면, 단백질 A 칼럼 (가령, POROS 단백질 A 크로마토그래피)을 적절하게 선별하고 이들을 크로마토그래피 칼럼 (가령, POROS HS-50 양이온 교환 크로마토그래피), 여과, 한외여과, 탈염 및 투석 절차와 합동함으로써 단리되고 정제된다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 정제를 용이하게 하기 위해 마커 서열, 예를 들면, 펩티드에 접합된다. 마커 아미노산 서열의 실례는 헥사-히스티딘 펩티드 (His6-태그)인데, 이것은 니켈-기능화된 아가로오스 친화성 칼럼에 마이크로몰 친화성으로 결합할 수 있다. 대안으로서, 인플루엔자 적혈구응집소 단백질로부터 유래된 에피토프에 상응하는 적혈구응집소 "HA" 태그가 이용될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드, 예를 들면, SIRP-α D1 변이체 (가령, 표 2, 5 및 6에서 제공된 임의의 변이체) 및 융합 상대, 예를 들면, Fc 변이체, HSA 및 알부민 결합 펩티드를 포함하는 폴리펩티드 구조체는 예로서, 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자를 내포하는 벡터, 예를 들면, 바이러스 벡터 (가령, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터 (가령, 우두 바이러스 벡터, 예를 들면, 변형된 우두 앙카라 (MVA)), 아데노 연관된 바이러스 벡터 및 알파바이러스 벡터)를 투여함으로써, 유전자 요법의 맥락에서 개체 (가령, 인간)의 세포에 의해 생산된다. 벡터는 일단 개체의 세포 내에 있게 되면 (가령, 형질전환, 형질감염, 전기천공, 인산칼슘 침전, 직접적인 현미주입, 감염 등에 의해), 본원에서 개시된 폴리펩티드의 발현에 이용될 수 있다. 일부 경우에, 폴리펩티드는 세포로부터 분비된다. 일부 구체예에서, 질환 또는 장애의 치료가 원하는 결과이면, 추가 조치가 필요하지 않다. 일부 구체예에서, 단백질의 수집이 요망되면, 혈액은 개체로부터 수집되고, 단백질은 다양한 방법에 의해 혈액으로부터 정제된다.
X. 제약학적 조성물 및 제조물
일부 구체예에서, 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 80에서 아미노산 돌연변이; 및 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 6, 잔기 27, 잔기 31, 잔기 47, 잔기 53, 잔기 54, 잔기 56, 잔기 66 및 잔기 92로 구성된 군에서 선택되는 잔기에서 최소한 하나의 추가 아미노산 돌연변이를 갖는 SIRP-α D1 도메인을 포함하는 신호-조절 단백질 α (SIRP-α) D1 변이체, 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드가 본원에서 개시된다.
일부 구체예에서, Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드가 또한 본원에서 개시되고, 여기서 상기 Fc 변이체는 2개의 Fc 도메인 단위체를 갖는 Fc 도메인 이합체를 포함하고, 여기서 각 Fc 도메인 단위체는 독립적으로 (i) 돌연변이 L234A, L235A, G237A 및 N297A로 구성되는 인간 IgG1 Fc 영역; (ii) 돌연변이 A330S, P331S 및 N297A로 구성되는 인간 IgG2 Fc 영역; 또는 (iii) 돌연변이 S228P, E233P, F234V, L235A, delG236 및 N297A를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역에서 선택된다.
본 발명은 본원에서 설명된 폴리펩티드, 예를 들면, 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체를 갖는 폴리펩티드를 포함하는 제약학적 조성물을 특징으로 한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 제약학적 조성물은 본 발명의 폴리펩티드를 치료적 단백질로서 포함한다. 일부 구체예에서, 본원에서 설명된 폴리펩티드를 포함하는 본 발명의 제약학적 조성물은 치료 동안 다른 작용제 또는 조성물 (가령, 치료적 작용제, 생물제제, 소형 분자, 또는 이들의 임의의 조합)과 합동으로 이용된다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 추가 치료적으로 활성제, 예를 들면, 예로서 소형 분자, 화학적 화합물 또는 생물학적 화합물, 예를 들면, 치료적 활성을 갖는 siRNA, 짧은 폴리펩티드 및 항체를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 임의선택적으로, 본원에서 설명된 폴리펩티드의 제약학적 조성물에서 조제된다. 일부 구체예에서, 본원에서 설명된 폴리펩티드 구조체의 제제는 원하는 정도의 순도를 갖는 본원에서 설명된 폴리펩티드 구조체를 동결건조된 제제 또는 수성 용액의 형태에서 임의선택적, 제약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정제와 혼합함으로써 저장용으로 제조된다. 일부 구체예에서, 본 발명의 제약학적 조성물은 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자 (DNA 또는 RNA, 예를 들면, mRNA), 또는 이런 핵산 분자를 내포하는 벡터를 포함한다.
제약학적 조성물에서 허용되는 담체, 부형제 또는 안정제는 바람직하게는, 투여되는 용량 및 농도에서 수용자에게 비독성이다. 일부 구체예에서, 허용되는 담체, 부형제 및 안정제는 완충액, 예를 들면, 인산염, 구연산염, HEPES, TAE 및 다른 유기 산; 항산화제, 예를 들면, 아스코르빈산 및 메티오닌; 보존제 (가령, 헥사메토늄 염화물; 옥타데실디메틸벤질 염화암모늄; 벤잘코늄 염화물, 벤제토늄 염화물; 페놀, 부틸 오르벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예를 들면, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (가령, 약 10개보다 적은 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들면, 인간 혈청 알부민, 젤라틴, 덱스트란 및 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들면, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들면, 글리신, 글루타민, 히스티딘 및 리신; 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물, 예를 들면, 글루코오스, 만노오스, 수크로오스 및 소르비톨; 킬레이트화제, 예를 들면, EDTA 당, 예를 들면, 수크로오스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 감미료 및 다른 풍미제; 충전제, 예를 들면, 미정질 셀룰로오스, 락토오스, 옥수수 및 다른 전분; 결합 작용제; 첨가제; 착색제; 염-형성 반대 이온, 예를 들면, 나트륨; 금속 착물 (가령, Zn-단백질 복합체); 비이온성 계면활성제, 예를 들면, TWEEN™, PLURONICS™ 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG); 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 구체예에서, 본원에서 설명된 폴리펩티드를 포함하는 제약학적 조성물은 수용성 형태이다, 예를 들면, 산 및 염기 부가염 둘 모두를 포함하는 것으로 의미되는 제약학적으로 허용되는 염으로서 존재한다. 용어 "제약학적으로 허용되는 산 부가염"은 무기 산, 예를 들면, 염화수소산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등, 그리고 유기 산, 예를 들면, 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 옥살산, 말레산, 말론산, 숙신산, 푸마르산, 주석산, 구연산, 벤조산, 신남산, 만델산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 살리실산 등으로 형성된, 유리 염기의 생물학적 유용성을 유지하고 달리 바람직하지 않은 상태가 아닌 염을 지칭한다. 용어 "제약학적으로 허용되는 염기 부가염"은 무기 염기, 예를 들면, 나트륨, 칼륨, 리튬, 암모늄, 칼슘, 마그네슘, 철, 아연, 구리, 망간, 알루미늄 염 등으로부터 유래된 것들을 포함한다. 암모늄, 칼륨, 나트륨, 칼슘 및 마그네슘 염이 특히 바람직하다. 제약학적으로 허용되는 유기 비독성 염기로부터 유래된 염은 일차, 이차와 삼차 아민, 자연발생 치환된 아민을 비롯한 치환된 아민, 환상 아민 및 염기성 이온 교환 수지, 예를 들면, 이소프로필아민, 트리메틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 트리프로필아민 및 에탄올아민의 염을 포함한다. 생체내 투여에 이용되는 제제는 바람직하게는 무균이다. 이것은 무균 여과 막을 통한 여과 또는 다른 방법에 의해 쉽게 달성될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 제약학적 조성물은 주사가능 제제의 형태에서 비경구 투여된다. 일부 구체예에서, 주사용 제약학적 조성물은 무균 용액 또는 임의의 제약학적으로 허용되는 액체를 운반제로서 이용하여 조제된다. 제약학적으로 허용되는 운반제는 무균수, 생리 식염수, 그리고 세포 배양 배지 (가령, Dulbecco의 변형된 Eagle 배지 (DMEM), α-변형된 Eagles 배지 (α-MEM) 및 F-12 배지)를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 다양한 조제 방법이 가용하다.
일부 구체예에서, 본원에서 설명된 폴리펩티드는 면역리포솜으로서 조제된다. 리포솜은 포유동물에 치료적 작용제의 전달에 유용한 다양한 유형의 지질, 인지질 또는 계면활성제를 포함하는 작은 소포이다. 항체 또는 Fc 융합을 내포하는 리포솜은 당해 분야에서 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 일부 구체예에서, 리포솜의 성분은 생물학적 막의 지질 배열과 유사한 이중층 구성에서 배열된다. 일부 구체예에서, 리포솜은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화된 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 이용한 역상 증발 방법에 의해 산출된다. 일부 구체예에서, 리포솜은 규정된 구멍 크기의 필터를 통해 압출되어 원하는 직경을 갖는 리포솜이 산출된다. 일부 구체예에서, 화학요법 작용제 또는 다른 치료적으로 활성제는 임의선택적으로, 리포솜 내에 내포된다.
일부 구체예에서, 본원에서 설명된 폴리펩티드 구조체 및 다른 치료적으로 활성제는 액적형성 기술, 계면 중합화 (가령, 히드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐, 또는 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐을 이용하여), 콜로이드성 약물 전달 시스템 (가령, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로유제, 나노입자 및 나노캡슐), 그리고 마크로유제를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 방법에 의해 제조된 마이크로캡슐 내에 포획된다.
일부 구체예에서, 지속된 방출 제조물이 제조된다. 지속된 방출 제조물의 적합한 실례는 고체 소수성 중합체의 반투성 매트릭스를 포함하는데, 이들 매트릭스는 성형된 물품, 예를 들면, 필름, 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지속된 방출 매트릭스의 실례는 폴리에스테르, 하이드로겔 (가령, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락티드, L-글루탐산 및 감마 에틸-L-글루타민산염의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세트산염, 분해성 젖산-글리콜산 공중합체, 예를 들면, LUPRON DEPOT™ (이것은 젖산-글리콜산 공중합체 및 류프롤라이드 아세트산염으로 구성된 주사가능 마이크로스피어이다), 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산, 그리고 ProLease® (Alkermes로부터 상업적으로 가용) (이것은 폴리-DL-락티드-코-글리콜리드 (PLG)의 매트릭스 내로 통합된 원하는 생리활성 분자로 구성된 마이크로스피어-기초된 전달 시스템이다)를 포함한다. 일부 지속된 방출 제제는 수 개월, 예를 들면, 1 내지 6개 개월에 걸쳐 분자의 방출을 할 수 있게 하고, 반면 다른 제제는 더욱 짧은 기간, 예를 들면, 수일 내지 수주 동안 본 발명의 제약학적 조성물을 방출한다.
일부 구체예에서, 제약학적 제제 내에 본원에서 설명된 폴리펩티드의 농도는 약 0.1 내지 100 중량 %의 범위에서 변한다. 일부 경우에, 본원에서 설명된 폴리펩티드의 농도는 0.003 내지 1.0 몰의 범위 안에 있다. 일부 경우에, 제약학적 제제 내에 상기 폴리펩티드의 농도는 약 5 mg/mL 내지 약 50 mg/mL (가령, 약 10 mg/mL 내지 약 40 mg/mL 또는 약 20 mg/mL 내지 약 30 mg/mL)의 범위에서 변한다. 일부 구체예에서, 환자를 치료하기 위해, 본원에서 설명된 폴리펩티드의 치료적으로 유효 용량이 투여된다. 용어 "치료적으로 유효 용량"은 이것의 투여가 의도되는 효과를 산출하는 용량을 지칭한다. 정확한 용량은 치료의 목적에 의존할 것이다. 일부 구체예에서, 용량은 0.01 내지 100 mg/kg 체중 또는 그 이상, 예를 들면, 0.1, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 mg/kg 체중의 범위에서 변한다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드 구조체 분해, 전신 대 국부 전달 및 새로운 프로테아제 합성의 속도뿐만 아니라 연령, 체중, 전반적인 건강, 성별, 식이, 투여 시간, 약물 상호작용 및 질환의 심각도를 고려하여 조정이 필요하다.
일부 구체예에서, 본원에서 설명된 조성물 및 제제는 치료가 필요한 개체에 투여된다. 일부 구체예에서, 이런 투여는 생체내에서 실행된다. 일부 구체예에서, 이런 투여는 탈체에서 실행된다. 일부 구체예에서, 본원에서 설명된 폴리펩티드를 포함하는 제약학적 조성물의 투여는 경구, 피하, 정맥내, 비내, 귀내, 경피, 국소 (가령, 겔, 고약, 로션, 크림 등), 복강내, 근육내, 폐내 (가령, Aradigm으로부터 상업적으로 가용한 AERx® 흡입성 기술, 또는 Inhale Therapeutics로부터 상업적으로 가용한 Inhance™ 폐 전달 시스템), 질, 비경구, 직장, 또는 안구내를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다양한 방식으로 행위된다. 일부 구체예에서, 제약학적 조성물은 도입의 방식에 따라 조제된다.
일부 구체예에서, 유전자 요법용 제약학적 조성물은 허용되는 희석제 내에 있거나, 또는 유전자 전달 수송체가 임베드되는 느린 방출 매트릭스를 포함한다. 일부 구체예에서, 생체내 유전자 전달 수송체로서 이용되는 벡터는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터 (가령, 우두 바이러스 벡터, 예를 들면, 변형된 우두 앙카라), 아데노 연관된 바이러스 벡터 및 알파바이러스 벡터를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
XI. 루트, 용량 및 투여
일부 구체예에서, 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 80에서 아미노산 돌연변이; 및 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 6, 잔기 27, 잔기 31, 잔기 47, 잔기 53, 잔기 54, 잔기 56, 잔기 66 및 잔기 92로 구성된 군에서 선택되는 잔기에서 최소한 하나의 추가 아미노산 돌연변이를 갖는 SIRP-α D1 도메인을 포함하는 신호-조절 단백질 α (SIRP-α) D1 변이체, 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드가 본원에서 개시된다.
일부 구체예에서, Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드가 또한 본원에서 개시되고, 여기서 상기 Fc 변이체는 2개의 Fc 도메인 단위체를 갖는 Fc 도메인 이합체를 포함하고, 여기서 각 Fc 도메인 단위체는 독립적으로 (i) 돌연변이 L234A, L235A, G237A 및 N297A로 구성되는 인간 IgG1 Fc 영역; (ii) 돌연변이 A330S, P331S 및 N297A로 구성되는 인간 IgG2 Fc 영역; 또는 (iii) 돌연변이 S228P, E233P, F234V, L235A, delG236 및 N297A를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역에서 선택된다.
일부 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드를 치료적 단백질로서 포함하는 제약학적 조성물은 예로서, 정맥내 투여, 비경구 투여, 피하 투여, 근육내 투여, 동맥내 투여, 척수강내 투여, 또는 복강내 투여용으로 조제된다. 일부 구체예에서, 제약학적 조성물은 경구, 비강, 스프레이, 에어로졸, 직장, 또는 질 투여용으로 조제되거나, 또는 이를 통해 투여된다. 주사가능 제제의 경우에, 다양한 효과적인 제약학적 담체가 가용하다.
일부 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자 또는 이런 핵산 분자를 내포하는 벡터를 포함하는 제약학적 조성물은 유전자 전달에 의하여 투여된다. 유전자 전달의 다양한 방법이 가용하다. 일부 구체예에서, 생체내 유전자 전달 및 발현에 이용되는 벡터는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터 (가령, 우두 바이러스 벡터, 예를 들면, 변형된 우두 앙카라 (MVA)), 아데노 연관된 바이러스 벡터 및 알파바이러스 벡터를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 일부 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 mRNA 분자는 개체에 직접적으로 투여된다.
본 발명의 제약학적 조성물의 용량은 투여 루트, 치료되는 질환 및 개체의 신체 특징, 예를 들면, 연령, 체중, 전반적인 건강을 비롯한 인자에 의존한다. 일부 구체예에서, 단일 용량 내에 내포된 본 발명의 폴리펩티드의 양은 유의미한 독성을 유도하지 않으면서 질환을 효과적으로 예방하거나, 지연시키거나, 또는 치료하는 양이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 제약학적 조성물은 0.01 내지 500 mg/kg (가령, 0.01, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 또는 500 mg/kg) 및 더욱 특정한 구체예에서, 약 0.1 내지 약 50 mg/kg 및 더욱 특정한 구체예에서, 약 1 내지 약 30 mg/kg의 범위에서 변하는 본 발명의 폴리펩티드의 용량을 포함한다. 일부 구체예에서, 용량은 질환의 정도 및 개체의 상이한 파라미터에 따라서 의사에 의해 조정된다.
일부 구체예에서, 치료적 작용제 및 본원에서 설명된 폴리펩티드의 독성은 예로서, LD50 (개체군의 50%에 치명적인 용량) 또는 LD100 (개체군의 100%에 치명적인 용량)을 결정함으로써, 세포 배양액 또는 실험 동물에서 표준 제약학적 절차에 의해 결정된다. 일부 구체예에서, 이들 세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 획득된 데이터는 인간에서 이용 시에 독성이 아닌 용량 범위를 작성하는데 이용된다. 본원에서 설명된 단백질의 용량은 바람직하게는, 독성이 거의 또는 전혀 없이 유효 용량을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다. 일부 구체예에서, 용량은 이용된 약형 및 활용된 투여 루트에 따라, 이러한 범위 내에서 변한다. 일부 구체예에서, 정확한 제제, 투여 루트 및 용량은 환자의 상태에 비추어 개별 의사에 의해 선택된다.
일부 구체예에서, 제약학적 조성물은 투약 제제와 양립하는 방식으로, 그리고 질환 또는 장애의 증상의 향상 또는 교정을 유발하는데 치료적으로 효과적인 양에서 투여된다. 일부 구체예에서, 제약학적 조성물은 다양한 약형, 예를 들면, 정맥내 약형, 피하 약형 및 경구 약형 (가령, 섭취가능한 용액, 약물 방출 캡슐)에서 투여된다. 일반적으로, 치료적 단백질은 0.1-100 mg/kg, 예를 들면, 1-50 mg/kg에서 투약된다. 일부 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 제약학적 조성물은 예로서, 1회 또는 그 이상 (가령, 1-10 회 또는 그 이상) 매일, 주 1회, 월 1회, 연 2회, 연 1회, 또는 의학적으로 필요할 때마다 치료가 필요한 개체에 투여된다. 용량은 단일 또는 복수 투약 섭생에서 제공될 수 있다. 일부 구체예에서, 투여 사이에 시간은 의학적 상태가 향상됨에 따라서 감소하거나, 또는 환자의 건강이 감퇴함에 따라서 증가한다.
XII. 치료 방법
일부 구체예에서, 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 80에서 아미노산 돌연변이; 및 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 6, 잔기 27, 잔기 31, 잔기 47, 잔기 53, 잔기 54, 잔기 56, 잔기 66 및 잔기 92로 구성된 군에서 선택되는 잔기에서 최소한 하나의 추가 아미노산 돌연변이를 갖는 SIRP-α D1 도메인을 포함하는 신호-조절 단백질 α (SIRP-α) D1 변이체, 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드가 본원에서 개시된다.
일부 구체예에서, Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드가 또한 본원에서 개시되고, 여기서 상기 Fc 변이체는 2개의 Fc 도메인 단위체를 갖는 Fc 도메인 이합체를 포함하고, 여기서 각 Fc 도메인 단위체는 독립적으로 (i) 돌연변이 L234A, L235A, G237A 및 N297A로 구성되는 인간 IgG1 Fc 영역; (ii) 돌연변이 A330S, P331S 및 N297A로 구성되는 인간 IgG2 Fc 영역; 또는 (iii) 돌연변이 S228P, E233P, F234V, L235A, delG236 및 N297A를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역에서 선택된다.
일부 구체예에서, 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 80에서 아미노산 돌연변이; 및 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 6, 잔기 27, 잔기 31, 잔기 47, 잔기 53, 잔기 54, 잔기 56, 잔기 66 및 잔기 92로 구성된 군에서 선택되는 잔기에서 최소한 하나의 추가 아미노산 돌연변이를 갖는 SIRP-α D1 도메인을 포함하는 신호-조절 단백질 α (SIRP-α) D1 변이체, 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는 치료 방법이 본원에서 더욱 개시된다.
일부 구체예에서, 본 발명은 SIRP-α 또는 CD47 활성과 연관된 질환 및 장애, 예를 들면, 암 및 면역 질환 (가령, 자가면역 질환 및 염증성 질환)으로 고통받고 있는 환자를 치료하는데 이용되는 제약학적 조성물 및 치료 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 본원에서 설명된 폴리펩티드는 개체에서 표적 세포 (가령, 암 세포)의 식균작용을 증가시키는 방법에서 개체에 투여된다. 일부 구체예에서, 이들 폴리펩티드는 개체에서 암 세포를 사멸시키는 방법에서 개체에 투여된다. 일부 구체예에서, 이들 폴리펩티드는 개체에서 조절 T-세포를 제거하는 방법에서 개체에 투여된다. 일부 구체예에서, 본원에서 설명된 폴리펩티드는 개체에서 조혈 줄기 세포 이식을 증가시키는 방법에서 개체에 투여되고, 여기서 상기 방법은 개체에서 SIRP-α 및 CD47 사이의 상호작용을 조정하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 본원에서 설명된 폴리펩티드는 개체에서 면역 반응을 변경하는 (가령, 면역 반응을 억제하는) 방법에서 개체에 투여된다. 일부 구체예에서, 전술한 방법은 질환을 치료하기 위한 다른 방법과 연계된다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드 (가령, SIRP-α D1 변이체) 및 두 번째 치료적 작용제의 조합이 본원에서 개시된다. 일부 구체예에서, 조합은 폴리펩티드 (가령, SIRP-α D1 변이체) 및 두 번째 치료적 작용제를 포함하고, 여기서 두 번째 치료적 작용제는 항체이다. 일부 구체예에서, 조합은 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 80에서 아미노산 돌연변이; 및 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 6, 잔기 27, 잔기 31, 잔기 47, 잔기 53, 잔기 54, 잔기 56, 잔기 66 및 잔기 92로 구성된 군에서 선택되는 잔기에서 최소한 하나의 추가 아미노산 돌연변이를 갖는 SIRP-α D1 도메인을 포함하는 SIRP-α D1 변이체, 또는 이의 단편; 및 항체를 포함한다. 일부 구체예에서, 조합은 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는 폴리펩티드: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159; 및 항체를 포함한다.
일부 구체예에서, 전술한 방법은 질환을 치료하기 위한 전략으로 이용되고, 여기서 폴리펩티드의 투여는 치료 옵션이다. 전술한 것의 무제한적 실례는 항체 또는 단백질 단편의 이용을 포함한다. 가령, 일부 구체예에서, 항체 또는 단백질 단편은 본원에서 개시된 Fc 변이체 폴리펩티드와 합동으로 투여된다. 일부 구체예에서, 본원에서 개시된 폴리펩티드 구조체는 다른 작용제의 식균작용을 향상시키는데 이용된다.
치료 방법은 질환 (가령, 암)을 앓는 개체에 (i) SIRP-α D1 변이체를 포함하는 폴리펩티드 및 임의선택적으로 (ii) 항체를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 개체에서 질환 (가령, 암)을 치료하기 전, 개체에서 SIRP-α의 아미노산 서열(들)이 예로서, SIRP-α 유전자를 인코딩하는 2개의 대립형질 각각으로부터 결정된다. 이러한 치료 방법에서, 개체로부터 생물학적 표본에서 SIRP-α 폴리펩티드의 아미노산 서열(들)이 먼저 결정된다. 개체는 이후, 본 발명의 폴리펩티드의 치료 효과량이 투여된다. 일부 구체예에서, 투여되는 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체는 CD47에 대한 SIRP-α 폴리펩티드의 친화성을 증가시키는 아미노산 변화의 도입을 제외하고, 개체의 생물학적 표본에서 SIRP-α 폴리펩티드의 것과 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 상기 폴리펩티드에서 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체는 바람직하게는, 상기 폴리펩티드가 투여된 후, 개체에서 최소 면역원성을 갖는다.
일부 구체예에서, 항체가 본원에서 개시된 폴리펩티드에 더하여 투여된다. 일부 구체예에서, 항체는 폴리펩티드와 공동투여된다. 일부 구체예에서, 항체는 예로서, 폴리펩티드 및 항체 둘 모두를 갖는 제약학적 조성물에서 동시에 투여된다. 대안으로, 항체는 폴리펩티드의 투여 전후에 투여된다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드 및 항체는 실제적으로 동시에 투여되고 (가령, 서로의 1 주, 6, 5, 4, 3, 2, 1 일, 12, 6, 3, 2, 1 시간 이내에, 또는 실제적으로 동시에), 그 이후에 항체가 단독으로 투여된다. 일부 구체예에서, 항체가 먼저 투여되고, 그 이후에 폴리펩티드 및 항체가 실제적으로 동시에 (다시 말하면, 서로의 1 주, 6, 5, 4, 3, 2, 1 일, 12, 6, 3, 2, 1 시간 이내에, 또는 실제적으로 동시에) 투여된다.
본원에서 개시된 조성물 또는 방법에서 공동투여되거나 또는 제공되는 항체는 세포, 예를 들면, 암 세포 또는 면역계의 세포, 예를 들면, T-세포 (가령, 조절 T-세포)를 표적으로 항체를 지칭한다. 항체는 임의의 면역글로불린 항체 아이소타입, 예를 들면, IgG, IgE, IgM, IgA, 또는 IgD일 수 있다. 일부 구체예에서, 항체는 인간 IgG1 아이소타입 항체이다. 일부 구체예에서, 항체는 인간 IgG2 아이소타입 항체이다. 일부 구체예에서, 항체는 인간 IgG4 아이소타입 항체이다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미에서 이용되고, 그리고 원하는 활성을 전시하기만 하면, 단일클론 항체, 다중클론 항체, 다중특이적 항체 (가령, 이중특이적 항체), 항체 단편 및 항체-유사 단백질을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다양한 항체 구조를 포괄한다. "항체 단편"은 무손상 항체의 부분, 바람직하게는, 무손상 항체의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 실례는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편, 디아바디, 선형 항체, 단일 사슬 항체 분자, 그리고 다중특이적 항체를 포함한다. 단일클론 항체는 실제적으로 균질한 항체의 개체군으로부터 획득된 항체를 지칭한다, 예를 들면, 개체군 내에 개별 항체는 미량으로 존재할 수 있는 가능한 자연발생 돌연변이를 제외하고, 동일한 일차 서열을 갖는다. 단일클론 항체는 고도로 특이적이고 단일 항원성 부위 (가령, 암 항원 상에 에피토프)를 향해 지향될 수 있다. 상이한 에피토프에 대해 지향된 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 다중클론 항체 제조물과 대조적으로, 각 단일클론 항체는 일반적으로, 항원 상에서 단일 에피토프에 대해 지향된다. 수식어 "단일클론"은 항체의 실제적으로 균질한 개체군으로부터 획득되는 것으로서 항체의 특징을 지시하고, 그리고 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되지 않는다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물에서 항체는 항체-의존성 세포 식균작용 (ADCP) 또는 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC)을 유발한다. 이런 전략을 이용하여 치료되는 질환의 무제한적 실례는 암, 예를 들면, 혈액암, 예를 들면, 백혈병 (가령, 급성 골수성 백혈병); 면역 질환 (가령, 개체의 손상된 또는 축소된 면역 반응을 증강하거나, 또는 대안으로 개체의 과다활성 면역 반응을 제한하기 위해); 및 병원성 감염을 포함한다.
일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법은 본원에서 설명된 폴리펩티드 (가령, SIRP-a D1 변이체) 및 암 항원을 표적으로 하는 항체를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 항체-유사 단백질에 의해 표적화된 암 항원은 표면 상에서 인간 백혈구 항원 (HLA) 클래스 I 분자와 복합으로 세포내 종양-연관된 항원 (TAAs)으로부터 유래된 노출된 펩티드 (MHC/펩티드 복합체로서 또한 알려져 있음)이다. 이런 암 항원, 예를 들면, 본 발명의 조성물에서 항체 또는 항-신체-유사 단백질에 의해 표적화되는, 암 세포의 표면 상에서 노출된 HLA 분자와 복합으로 펩티드의 무제한적 실례는 다음을 포함한다: NY-ESO-1/LAGE1, SSX-2, MAGE 패밀리 (MAGE-A3), gp100/pmel17, 멜란-A/MART-1, gp75/TRP1, 티로시나아제, TRP2, CEA, PSA, TAG-72, 미성숙 라미닌 수용체, MOK/RAGE-1, WT-1, Her2/neu, EphA3, SAP-1, BING-4, Ep-CAM, MUC1, PRAME, 서바이빈, 메소텔린, BRCA1/2 (돌연변이된), CDK4, CML66, MART-2, p53 (돌연변이된), Ras (돌연변이된), β-카테닌 (돌연변이된), TGF-βRII (돌연변이된), HPV E6, E7. 이런 항체의 실례는 ESK1 (WT-1), RL1B (Her2-E75), Pr20 (PRAME) 및 3.2G1 (hCGβ)을 포함한다.
일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법은 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 80에서 아미노산 돌연변이; 및 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 6, 잔기 27, 잔기 31, 잔기 47, 잔기 53, 잔기 54, 잔기 56, 잔기 66 및 잔기 92로 구성된 군에서 선택되는 잔기에서 최소한 하나의 추가 아미노산 돌연변이를 갖는 SIRP-α D1 도메인을 포함하는 SIRP-α D1 변이체, 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드; 그리고 암 항원을 표적으로 하는 항체를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법은 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 80에서 아미노산 돌연변이; 및 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 6, 잔기 27, 잔기 31, 잔기 47, 잔기 53, 잔기 54, 잔기 56, 잔기 66 및 잔기 92로 구성된 군에서 선택되는 잔기에서 최소한 하나의 추가 아미노산 돌연변이를 갖는 SIRP-α D1 도메인을 포함하는 SIRP-α D1 변이체, 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드; 그리고 NY-ESO-1/LAGE1, SSX-2, MAGE 패밀리 (MAGE-A3), gp100/pmel17, 멜란-A/MART-1, gp75/TRP1, 티로시나아제, TRP2, CEA, PSA, TAG-72, 미성숙 라미닌 수용체, MOK/RAGE-1, WT-1, Her2/neu, EphA3, SAP-1, BING-4, Ep-CAM, MUC1, PRAME, 서바이빈, 메소텔린, BRCA1/2 (돌연변이된), CDK4, CML66, MART-2, p53 (돌연변이된), Ras (돌연변이된), β-카테닌 (돌연변이된), TGF-βRII (돌연변이된), HPV E6, E7을 표적으로 하는 항체를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법은 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 80에서 아미노산 돌연변이; 및 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 6, 잔기 27, 잔기 31, 잔기 47, 잔기 53, 잔기 54, 잔기 56, 잔기 66 및 잔기 92로 구성된 군에서 선택되는 잔기에서 최소한 하나의 추가 아미노산 돌연변이를 갖는 SIRP-α D1 도메인을 포함하는 SIRP-α D1 변이체, 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드; 그리고 항체를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 항체는 ESK1 (WT-1), RL1B (Her2-E75), Pr20 (PRAME) 및 3.2G1 (hCGβ)이다.
일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법은 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는 폴리펩티드: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159; 및 암 항원을 표적으로 하는 항체를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법은 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는 폴리펩티드: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159; 및 NY-ESO-1/LAGE1, SSX-2, MAGE 패밀리 (MAGE-A3), gp100/pmel17, 멜란-A/MART-1, gp75/TRP1, 티로시나아제, TRP2, CEA, PSA, TAG-72, 미성숙 라미닌 수용체, MOK/RAGE-1, WT-1, Her2/neu, EphA3, SAP-1, BING-4, Ep-CAM, MUC1, PRAME, 서바이빈, 메소텔린, BRCA1/2 (돌연변이된), CDK4, CML66, MART-2, p53 (돌연변이된), Ras (돌연변이된), β-카테닌 (돌연변이된), TGF-βRII (돌연변이된), HPV E6, E7을 표적으로 하는 항체를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법은 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는 폴리펩티드: 서열 번호: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159; 및 항체를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 항체는 ESK1 (WT-1), RL1B (Her2-E75), Pr20 (PRAME) 및 3.2G1 (hCGβ)이다.
일부 구체예에서, 항체는 예로서, 암 세포에 의해 발현된 단백질에 결합함으로써 암 세포를 표적으로 한다. 일부 단백질은 비-암 세포에서보다 암 세포에서 더욱 높은 수준으로 발현된다. 가령, 암 항원은 암 세포에 의해 우선적으로 발현되는 단백질이고 (가령, 이것은 비-암 세포 상에서보다 암 세포 상에서 더욱 높은 수준으로 발현된다), 그리고 일부 경우에 이것은 오로지 암 세포에 의해서만 발현된다. 본 발명의 조성물에서 항체에 의해 표적화되는 단백질, 예를 들면, 암 세포에 의해 발현되는 단백질의 무제한적 실례는 다음을 포함한다: 4-1BB, 5T4, AGS-16, ALK1, ANG-2, B7-H3, B7-H4, c-fms, c-Met, CA6, CCR4, CD123, CD19, CD20, CD22, CD27, EpCAM, CD30, CD32b, CD33, CD37, CD38, CD40, CD52, CD70, CD74, CD79b, CD98, CEA, CEACAM5, CLDN18.2, CLDN6, CS1, CTLA-4, CXCR4, DLL-4, EGFR, EGP-1, ENPP3, EphA3, ETBR, FGFR2, 섬유결합소, FR-알파, 프리즐드 수용체, GCC, GD2, 글리피칸-3, GPNMB, HER-2, HER3, HLA-DR, ICAM-1, IGF-1 R, IL-3R, LAG-3, LIV-1, 메소텔린, MUC16, MUC1, NaPi2b, 넥틴-4, Notch 2, Notch 1, OX40, PD-1, PD-L1, PD-L2, PDGFR-α, PS, PSMA, SLTRK6, STEAP1, TEM1, VEGFR, CD25, CD27L, DKK-1, CSF-1 R, 또는 이들의 임의의 조합. 일부 구체예에서, 본원에서 설명된 폴리펩티드는 체크포인트 저해제, 예를 들면, CTLA-4의 항체 저해제 (가령, 이플리무맙, 트레멜리무맙), PD-1의 항체 저해제 (가령, 니볼루맙, 피딜리주맙, 펨브로리주맙으로서 또한 알려져 있는 MK3475, BMS936559 및 MPDL3280A), 그리고 LAG-3의 항체 저해제 (가령, BMS986016)와 합동으로 투여된다.
일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법은 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 80에서 아미노산 돌연변이; 및 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 6, 잔기 27, 잔기 31, 잔기 47, 잔기 53, 잔기 54, 잔기 56, 잔기 66 및 잔기 92로 구성된 군에서 선택되는 잔기에서 최소한 하나의 추가 아미노산 돌연변이를 갖는 SIRP-α D1 도메인을 포함하는 SIRP-α D1 변이체, 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드; 그리고 암 세포에 의해 발현된 단백질을 표적으로 하는 항체를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법은 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 80에서 아미노산 돌연변이; 및 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 6, 잔기 27, 잔기 31, 잔기 47, 잔기 53, 잔기 54, 잔기 56, 잔기 66 및 잔기 92로 구성된 군에서 선택되는 잔기에서 최소한 하나의 추가 아미노산 돌연변이를 갖는 SIRP-α D1 도메인을 포함하는 SIRP-α D1 변이체, 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드; 그리고 4-1BB, 5T4, AGS-16, ALK1, ANG-2, B7-H3, B7-H4, c-fms, c-Met, CA6, CCR4, CD123, CD19, CD20, CD22, CD27, EpCAM, CD30, CD32b, CD33, CD37, CD38, CD40, CD52, CD70, CD74, CD79b, CD98, CEA, CEACAM5, CLDN18.2, CLDN6, CS1, CTLA-4, CXCR4, DLL-4, EGFR, EGP-1, ENPP3, EphA3, ETBR, FGFR2, 섬유결합소, FR-알파, 프리즐드 수용체, GCC, GD2, 글리피칸-3, GPNMB, HER-2, HER3, HLA-DR, ICAM-1, IGF-1 R, IL-3R, LIV-1, 메소텔린, MUC16, MUC1, NaPi2b, 넥틴-4, Notch 2, Notch 1, OX40, PD-1, PD-L1, PD-L2, PDGFR-α, PS, PSMA, SLTRK6, STEAP1, TEM1, VEGFR, CD25, CD27L, DKK-1, CSF-1 R, 또는 이들의 임의의 조합을 표적으로 하는 항체를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법은 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 80에서 아미노산 돌연변이; 및 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 6, 잔기 27, 잔기 31, 잔기 47, 잔기 53, 잔기 54, 잔기 56, 잔기 66 및 잔기 92로 구성된 군에서 선택되는 잔기에서 최소한 하나의 추가 아미노산 돌연변이를 갖는 SIRP-α D1 도메인을 포함하는 SIRP-α D1 변이체, 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드; 그리고 항체를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 항체는 CTLA-4의 항체 저해제 (가령, 이플리무맙, 트레멜리무맙), PD-1의 항체 저해제 (가령, 니볼루맙, 피딜리주맙, 펨브로리주맙으로서 또한 알려져 있는 MK3475, BMS936559 및 MPDL3280A), 또는 LAG-3의 항체 저해제 (가령, BMS986016)이다.
일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법은 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는 폴리펩티드: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159; 및 암 세포에 의해 발현된 단백질을 표적으로 하는 항체를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법은 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는 폴리펩티드: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159; 및 4-1BB, 5T4, AGS-16, ALK1, ANG-2, B7-H3, B7-H4, c-fms, c-Met, CA6, CCR4, CD123, CD19, CD20, CD22, CD27, EpCAM, CD30, CD32b, CD33, CD37, CD38, CD40, CD52, CD70, CD74, CD79b, CD98, CEA, CEACAM5, CLDN18.2, CLDN6, CS1, CTLA-4, CXCR4, DLL-4, EGFR, EGP-1, ENPP3, EphA3, ETBR, FGFR2, 섬유결합소, FR-알파, 프리즐드 수용체, GCC, GD2, 글리피칸-3, GPNMB, HER-2, HER3, HLA-DR, ICAM-1, IGF-1 R, IL-3R, LAG-3, LIV-1, 메소텔린, MUC16, MUC1, NaPi2b, 넥틴-4, Notch 2, Notch 1, OX40, PD-1, PD-L1, PD-L2, PDGFR-α, PS, PSMA, SLTRK6, STEAP1, TEM1, VEGFR, CD25, CD27L, DKK-1, CSF-1 R, 또는 이들의 임의의 조합을 표적으로 하는 항체를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법은 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는 폴리펩티드: 서열 번호: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159; 및 항체를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 항체는 CTLA-4의 항체 저해제 (가령, 이플리무맙, 트레멜리무맙), PD-1의 항체 저해제 (가령, 니볼루맙, 피딜리주맙, 펨브로리주맙으로서 또한 알려져 있는 MK3475, BMS936559 및 MPDL3280A), 또는 LAG-3의 항체 저해제 (가령, BMS986016)이다.
일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법은 본원에서 설명된 폴리펩티드 (가령, SIRP-a D1 변이체) 및 면역-종양학 항체를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물에서 이용되는 항체는 다음을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다: 세툭시맙, 네시투무맙, 펨브로리주맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, MEDI0680, MED16469, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MEDI6383, RG7888, 이플리무맙, 트레멜리무맙, 우렐루맙, PF-05082566, 에노블리투주맙, 반틱투맙, 바릴루맙, 모가말리주맙, SAR650984, 다라투무맙, 트라스투주맙, 트라스투주맙 엠탄신, 페르투주맙, 엘로투주맙, 리툭시맙, 오파투무맙, 오비누투주맙, RG7155, FPA008, 파니투무맙, 브렌툭시맙 베도틴, MSB0010718C, 벨리무맙, 베바시주맙, 데노수맙, 파니투무맙, 라무시루맙, 네시투무맙, 니볼루맙, 펨브로리주맙, 아벨루맙, 아테졸리주맙, 더발루맙, MEDI0680, 피딜리주맙, 또는 BMS-93659, 항-HER2 항체, 항-CD20 항체, 항-CD19 항체, 항-CS1 항체, 항-CD38 항체, 항-EGFR 항체, 항-PD1 항체, 항-RANKL 항체, 항-OX40 항체, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CD274 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-CD137 항체, 항-4-1BB 항체, 항-B7-H3 항체, 항-FZD7 항체, 항-CD27 항체, 항-CCR4 항체, 항-CD38 항체, 항-CSF1R 항체, 항-CSF 항체, 항-CD30 항체, 항-BAFF 항체, 항-VEGF 항체, 또는 항-VEGFR2 항체. 일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법은 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 80에서 아미노산 돌연변이; 및 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 6, 잔기 27, 잔기 31, 잔기 47, 잔기 53, 잔기 54, 잔기 56, 잔기 66 및 잔기 92로 구성된 군에서 선택되는 잔기에서 최소한 하나의 추가 아미노산 돌연변이를 갖는 SIRP-α D1 도메인을 포함하는 SIRP-α D1 변이체, 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드; 그리고 항체를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 항체는 항-HER2 항체, 항-CD20 항체, 항-CD19 항체, 항-CS1 항체, 항-CD38 항체, 항-EGFR 항체, 항-PD1 항체, 항-RANKL 항체, 항-OX40 항체, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CD274 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-CD137 항체, 항-4-1BB 항체, 항-B7-H3 항체, 항-FZD7 항체, 항-CD27 항체, 항-CCR4 항체, 항-CD38 항체, 항-CSF1R 항체, 항-CSF 항체, 항-CD30 항체, 항-BAFF 항체, 항-VEGF 항체, 또는 항-VEGFR2 항체이다. 일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법은 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 80에서 아미노산 돌연변이; 및 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 6, 잔기 27, 잔기 31, 잔기 47, 잔기 53, 잔기 54, 잔기 56, 잔기 66 및 잔기 92로 구성된 군에서 선택되는 잔기에서 최소한 하나의 추가 아미노산 돌연변이를 갖는 SIRP-α D1 도메인을 포함하는 SIRP-α D1 변이체, 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드; 그리고 항체를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 항체는 세툭시맙, 네시투무맙, 펨브로리주맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, MEDI0680, MED16469, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MEDI6383, RG7888, 이플리무맙, 트레멜리무맙, 우렐루맙, PF-05082566, 에노블리투주맙, 반틱투맙, 바릴루맙, 모가말리주맙, SAR650984, 다라투무맙, 트라스투주맙, 트라스투주맙 엠탄신, 페르투주맙, 엘로투주맙, 리툭시맙, 오파투무맙, 오비누투주맙, RG7155, FPA008, 파니투무맙, 브렌툭시맙 베도틴, MSB0010718C, 벨리무맙, 베바시주맙, 데노수맙, 파니투무맙, 라무시루맙, 네시투무맙, 니볼루맙, 펨브로리주맙, 아벨루맙, 아테졸리주맙, 더발루맙, MEDI0680, 피딜리주맙, 또는 BMS-93659이다.
일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법은 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 80에서 아미노산 돌연변이; 및 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 6, 잔기 27, 잔기 31, 잔기 47, 잔기 53, 잔기 54, 잔기 56, 잔기 66 및 잔기 92로 구성된 군에서 선택되는 잔기에서 최소한 하나의 추가 아미노산 돌연변이를 갖는 SIRP-α D1 도메인을 포함하는 SIRP-α D1 변이체, 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드; 그리고 항체를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 항체는 트라스투주맙이다.
일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법은 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 80에서 아미노산 돌연변이; 및 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 6, 잔기 27, 잔기 31, 잔기 47, 잔기 53, 잔기 54, 잔기 56, 잔기 66 및 잔기 92로 구성된 군에서 선택되는 잔기에서 최소한 하나의 추가 아미노산 돌연변이를 갖는 SIRP-α D1 도메인을 포함하는 SIRP-α D1 변이체, 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드; 그리고 항체를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 항체는 리툭시맙이다.
일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법은 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 80에서 아미노산 돌연변이; 및 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 6, 잔기 27, 잔기 31, 잔기 47, 잔기 53, 잔기 54, 잔기 56, 잔기 66 및 잔기 92로 구성된 군에서 선택되는 잔기에서 최소한 하나의 추가 아미노산 돌연변이를 갖는 SIRP-α D1 도메인을 포함하는 SIRP-α D1 변이체, 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드; 그리고 항체를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 항체는 세툭시맙이다.
일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법은 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 80에서 아미노산 돌연변이; 및 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 6, 잔기 27, 잔기 31, 잔기 47, 잔기 53, 잔기 54, 잔기 56, 잔기 66 및 잔기 92로 구성된 군에서 선택되는 잔기에서 최소한 하나의 추가 아미노산 돌연변이를 갖는 SIRP-α D1 도메인을 포함하는 SIRP-α D1 변이체, 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드; 그리고 항체를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 항체는 다라투무맙이다.
일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법은 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 80에서 아미노산 돌연변이; 및 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 6, 잔기 27, 잔기 31, 잔기 47, 잔기 53, 잔기 54, 잔기 56, 잔기 66 및 잔기 92로 구성된 군에서 선택되는 잔기에서 최소한 하나의 추가 아미노산 돌연변이를 갖는 SIRP-α D1 도메인을 포함하는 SIRP-α D1 변이체, 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드; 그리고 항체를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 항체는 벨리무맙이다.
일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법은 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 80에서 아미노산 돌연변이; 및 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 6, 잔기 27, 잔기 31, 잔기 47, 잔기 53, 잔기 54, 잔기 56, 잔기 66 및 잔기 92로 구성된 군에서 선택되는 잔기에서 최소한 하나의 추가 아미노산 돌연변이를 갖는 SIRP-α D1 도메인을 포함하는 SIRP-α D1 변이체, 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드; 그리고 항체를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 항체는 베바시주맙이다.
일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법은 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 80에서 아미노산 돌연변이; 및 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 6, 잔기 27, 잔기 31, 잔기 47, 잔기 53, 잔기 54, 잔기 56, 잔기 66 및 잔기 92로 구성된 군에서 선택되는 잔기에서 최소한 하나의 추가 아미노산 돌연변이를 갖는 SIRP-α D1 도메인을 포함하는 SIRP-α D1 변이체, 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드; 그리고 항체를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 항체는 데노수맙이다.
일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법은 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 80에서 아미노산 돌연변이; 및 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 6, 잔기 27, 잔기 31, 잔기 47, 잔기 53, 잔기 54, 잔기 56, 잔기 66 및 잔기 92로 구성된 군에서 선택되는 잔기에서 최소한 하나의 추가 아미노산 돌연변이를 갖는 SIRP-α D1 도메인을 포함하는 SIRP-α D1 변이체, 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드; 그리고 항체를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 항체는 판티무맙이다.
일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법은 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 80에서 아미노산 돌연변이; 및 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 6, 잔기 27, 잔기 31, 잔기 47, 잔기 53, 잔기 54, 잔기 56, 잔기 66 및 잔기 92로 구성된 군에서 선택되는 잔기에서 최소한 하나의 추가 아미노산 돌연변이를 갖는 SIRP-α D1 도메인을 포함하는 SIRP-α D1 변이체, 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드; 그리고 항체를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 항체는 라무시루맙이다.
일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법은 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 80에서 아미노산 돌연변이; 및 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 6, 잔기 27, 잔기 31, 잔기 47, 잔기 53, 잔기 54, 잔기 56, 잔기 66 및 잔기 92로 구성된 군에서 선택되는 잔기에서 최소한 하나의 추가 아미노산 돌연변이를 갖는 SIRP-α D1 도메인을 포함하는 SIRP-α D1 변이체, 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드; 그리고 항체를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 항체는 네시투무맙이다.
일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법은 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 80에서 아미노산 돌연변이; 및 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 6, 잔기 27, 잔기 31, 잔기 47, 잔기 53, 잔기 54, 잔기 56, 잔기 66 및 잔기 92로 구성된 군에서 선택되는 잔기에서 최소한 하나의 추가 아미노산 돌연변이를 갖는 SIRP-α D1 도메인을 포함하는 SIRP-α D1 변이체, 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드; 그리고 항체를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 항체는 니볼루맙이다.
일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법은 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 80에서 아미노산 돌연변이; 및 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 6, 잔기 27, 잔기 31, 잔기 47, 잔기 53, 잔기 54, 잔기 56, 잔기 66 및 잔기 92로 구성된 군에서 선택되는 잔기에서 최소한 하나의 추가 아미노산 돌연변이를 갖는 SIRP-α D1 도메인을 포함하는 SIRP-α D1 변이체, 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드; 그리고 항체를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 항체는 펨브로리주맙이다.
일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법은 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 80에서 아미노산 돌연변이; 및 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 6, 잔기 27, 잔기 31, 잔기 47, 잔기 53, 잔기 54, 잔기 56, 잔기 66 및 잔기 92로 구성된 군에서 선택되는 잔기에서 최소한 하나의 추가 아미노산 돌연변이를 갖는 SIRP-α D1 도메인을 포함하는 SIRP-α D1 변이체, 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드; 그리고 항체를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 항체는 아벨루맙이다.
일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법은 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 80에서 아미노산 돌연변이; 및 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 6, 잔기 27, 잔기 31, 잔기 47, 잔기 53, 잔기 54, 잔기 56, 잔기 66 및 잔기 92로 구성된 군에서 선택되는 잔기에서 최소한 하나의 추가 아미노산 돌연변이를 갖는 SIRP-α D1 도메인을 포함하는 SIRP-α D1 변이체, 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드; 그리고 항체를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 항체는 아테졸리주맙이다.
일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법은 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 80에서 아미노산 돌연변이; 및 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 6, 잔기 27, 잔기 31, 잔기 47, 잔기 53, 잔기 54, 잔기 56, 잔기 66 및 잔기 92로 구성된 군에서 선택되는 잔기에서 최소한 하나의 추가 아미노산 돌연변이를 갖는 SIRP-α D1 도메인을 포함하는 SIRP-α D1 변이체, 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드; 그리고 항체를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 항체는 더발루맙이다.
일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법은 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 80에서 아미노산 돌연변이; 및 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 6, 잔기 27, 잔기 31, 잔기 47, 잔기 53, 잔기 54, 잔기 56, 잔기 66 및 잔기 92로 구성된 군에서 선택되는 잔기에서 최소한 하나의 추가 아미노산 돌연변이를 갖는 SIRP-α D1 도메인을 포함하는 SIRP-α D1 변이체, 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드; 그리고 항체를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 항체는 MEDI0680이다.
일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법은 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 80에서 아미노산 돌연변이; 및 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 6, 잔기 27, 잔기 31, 잔기 47, 잔기 53, 잔기 54, 잔기 56, 잔기 66 및 잔기 92로 구성된 군에서 선택되는 잔기에서 최소한 하나의 추가 아미노산 돌연변이를 갖는 SIRP-α D1 도메인을 포함하는 SIRP-α D1 변이체, 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드; 그리고 항체를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 항체는 피딜리주맙이다.
일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법은 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 80에서 아미노산 돌연변이; 및 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 6, 잔기 27, 잔기 31, 잔기 47, 잔기 53, 잔기 54, 잔기 56, 잔기 66 및 잔기 92로 구성된 군에서 선택되는 잔기에서 최소한 하나의 추가 아미노산 돌연변이를 갖는 SIRP-α D1 도메인을 포함하는 SIRP-α D1 변이체, 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드; 그리고 항체를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 항체는 BMS-93659이다.
일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법은 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는 폴리펩티드: 서열 번호: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159; 및 항체를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 항체는 항-HER2 항체, 항-CD20 항체, 항-CD19 항체, 항-CS1 항체, 항-CD38 항체, 항-EGFR 항체, 항-PD1 항체, 항-RANKL 항체, 항-OX40 항체, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CD274 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-CD137 항체, 항-4-1BB 항체, 항-B7-H3 항체, 항-FZD7 항체, 항-CD27 항체, 항-CCR4 항체, 항-CD38 항체, 항-CSF1R 항체, 항-CSF 항체, 항-CD30 항체, 항-BAFF 항체, 항-VEGF 항체, 또는 항-VEGFR2 항체이다. 일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법은 다음의 서열 번호에 따른 서열을 갖는 폴리펩티드: 서열 번호: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159; 및 항체를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 항체는 세툭시맙, 네시투무맙, 펨브로리주맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, MEDI0680, MED16469, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MEDI6383, RG7888, 이플리무맙, 트레멜리무맙, 우렐루맙, PF-05082566, 에노블리투주맙, 반틱투맙, 바릴루맙, 모가말리주맙, SAR650984, 다라투무맙, 트라스투주맙, 트라스투주맙 엠탄신, 페르투주맙, 엘로투주맙, 리툭시맙, 오파투무맙, 오비누투주맙, RG7155, FPA008, 파니투무맙, 브렌툭시맙 베도틴, MSB0010718C, 벨리무맙, 베바시주맙, 데노수맙, 파니투무맙, 라무시루맙, 네시투무맙, 니볼루맙, 펨브로리주맙, 아벨루맙, 아테졸리주맙, 더발루맙, MEDI0680, 피딜리주맙, 또는 BMS-93659이다.
일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법은 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는 폴리펩티드: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159; 및 항체를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 항체는 트라스투주맙이다.
일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법은 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는 폴리펩티드: 서열 번호 7, 서열 번호 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159; 및 항체를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 항체는 리툭시맙이다.
일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법은 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는 폴리펩티드: 서열 번호: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159; 및 항체를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 항체는 세툭시맙이다.
일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법은 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는 폴리펩티드: 서열 번호: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159; 및 항체를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 항체는 다라투무맙이다.
일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법은 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는 폴리펩티드: 서열 번호: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159; 및 항체를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 항체는 벨리무맙이다.
일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법은 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는 폴리펩티드: 서열 번호: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159; 및 항체를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 항체는 베바시주맙이다.
일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법은 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는 폴리펩티드: 서열 번호: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159; 및 항체를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 항체는 데노수맙이다.
일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법은 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는 폴리펩티드: 서열 번호: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159; 및 항체를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 항체는 판티무맙이다.
일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법은 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는 폴리펩티드: 서열 번호: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159; 및 항체를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 항체는 라무시루맙이다.
일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법은 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는 폴리펩티드: 서열 번호: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159; 및 항체를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 항체는 네시투무맙이다.
일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법은 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는 폴리펩티드: 서열 번호: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159; 및 항체를 투여하는 것을 니볼루맙이다.
일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법은 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는 폴리펩티드: 서열 번호: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159; 및 항체를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 항체는 펨브로리주맙이다.
일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법은 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는 폴리펩티드: 서열 번호: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159; 및 항체를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 항체는 아벨루맙이다.
일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법은 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는 폴리펩티드: 서열 번호: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159; 및 항체를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 항체는 아테졸리주맙이다.
일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법은 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는 폴리펩티드: 서열 번호: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159; 및 항체를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 항체는 더발루맙이다.
일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법은 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는 폴리펩티드: 서열 번호: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159; 및 항체를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 항체는 MEDI0680이다.
일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법은 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는 폴리펩티드: 서열 번호: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159; 및 항체를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 항체는 피딜리주맙이다.
일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법은 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는 폴리펩티드: 서열 번호: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159; 및 항체를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 항체는 BMS-93659이다.
일부 구체예에서, 본원에서 개시된 폴리펩티드는 리툭시맙의 항종양 활성을 증강한다. 일부 구체예에서, 본원에서 개시된 폴리펩티드는 Raji-NSG 이종이식 모형에서 리툭시맙의 항종양 활성을 증강한다. 일부 구체예에서, 본원에서 개시된 폴리펩티드는 비인간 영장류 (NHP)에서 리툭시맙-매개된 B-세포 고갈을 증강한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드 및 제약학적 조성물은 다양한 암 요법에서 이용된다. 본 발명에 따른 치료에 순응하는 암은 고형 종양 암, 혈액암, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 다발성 골수종, 방광암, 췌장암, 자궁경부암, 자궁내막암, 폐암, 기관지암, 간암, 난소암, 결장 및 직장암, 위암, 위암, 담낭암, 위장관 간질성 종양 암, 갑상선암, 두경부암, 구인두암, 식도암, 흑색종, 비흑색종 피부암, 메르켈 세포 암종, 바이러스로 유도된 암, 신경모세포종, 유방암, 전립선암, 신장암, 신장 세포 암, 신우 암, 백혈병, 림프종, 육종, 신경교종, 뇌 종양, 그리고 암종을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 일부 구체예에서, 본 발명에 따른 치료에 순응하는 암성 질환은 전이성 암을 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명에 따른 치료에 순응하는 암은 고형 종양 또는 혈액암이다.
일부 구체예에서, 항체는 면역계의 세포에 의해 발현된 단백질에 결합함으로써, 면역계의 세포, 예를 들면, T-세포, 예를 들면, 조절 T-세포를 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법은 본원에서 설명된 폴리펩티드 (가령, SIRP-a D1 변이체) 및 면역계의 세포를 표적으로 하는 항체를 투여하는 것을 포함한다. 면역계의 세포에 의해 발현되는 단백질의 실례는 41BB, CD40, CD40L, CD163, CD206, CTLA4, PD1, TIM-3, BTLA, VISTA, LAG-3, CD28, OX40, GITR, CD137, CD27, HVEM, CCR4, CD25, CD103, KIrg1, Nrp1, CD278, Gpr83, TIGIT, CD154, CD160, 그리고 PD1H를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 일부 구체예에서, 항체는 이것이 면역계의 다른 세포와 비교하여, T-세포 (가령, 조절 T-세포)에 의해 발현되는 단백질 (가령, 수용체)에 우선적으로 결합하도록 설계된다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물에서 항체는 IgG1, IgG2 또는 IgG4 하위부류의 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 개체에서 면역 반응을 변경하는 것을 포함한다. 이들 방법은 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체를 포함하는 폴리펩티드 및 항체를 개체에 투여하고, 따라서 개체에서 면역 반응을 변경하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 면역 반응을 변경하는 것은 면역 반응을 억제하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드 및 제약학적 조성물은 면역 질환을 치료하기 위한 다양한 요법에서 이용된다. 본 발명에 따른 치료에 순응하는 자가면역 질환 및 염증성 질환은 다발성 경화증, 류마티스성 관절염, 척추관절병증, 전신성 홍반성 루푸스, 항체-매개된 염증성 또는 자가면역 질환, 이식편 대 숙주 질환, 패혈증, 당뇨병, 건선, 죽상경화증, 쇼그렌 증후군, 진행성 전신 경화증, 경피증, 급성 관상 증후군, 허혈성 재관류, 크론병, 자궁내막증, 사구체신염, 중증 근무력증, 특발성 폐섬유증, 천식, 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 혈관염, 그리고 염증성 자가면역 근염을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
일부 구체예에서, 폴리펩티드를 세포에 전달하는 것은 상기 세포를 본원에서 설명된 조성물 중에서 하나 또는 그 이상과 접촉시키는 것을 수반한다.
이런 치료 옵션에 대한 유효 용량은 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리학적 상태, 환자가 인간 또는 동물인지의 여부, 투여된 다른 약제, 그리고 치료가 예방적 또는 치료적인지의 여부를 비롯한 많은 상이한 인자에 따라 변한다. 일부 구체예에서, 환자는 인간이지만, 비인간 포유동물, 예를 들면, 반려 동물, 예를 들면, 개, 고양이, 말 등, 실험실 포유동물, 예를 들면, 토끼, 생쥐, 쥐 등, 기타 등등 역시 치료된다. 일부 구체예에서, 치료 용량은 안전성 및 효력을 최적화하도록 적정된다.
일부 구체예에서, 치료적 용량은 약 0.0001 내지 100 mg/kg, 더욱 통상적으로 0.01 내지 30 mg/kg 숙주 체중의 범위에서 변한다. 일부 구체예에서, 예로서, 용량은 1 mg/kg 체중 또는 30 mg/kg 체중이거나 또는 1-30 mg/kg의 범위 내에 있다. 일부 구체예에서, 예시적인 치료 섭생은 주 1회 또는 2 주마다 1회 또는 월 1회 또는 3 내지 6 개월마다 1회 투여를 수반한다. 일부 구체예에서, 본원에서 설명된 치료적 작용제 및 폴리펩티드 구조체는 복수 경우에서 투여된다. 일부 구체예에서, 단일 용량 사이에 간격은 주 1회, 월 1회 또는 연 1회이다. 일부 구체예에서, 간격은 또한, 환자에서 치료적 실체의 혈액 수준을 계측함으로써 지시된 바와 같이 불규칙하다. 대안으로, 본원에서 설명된 치료적 작용제 또는 폴리펩티드 구조체는 지속된 방출 제제로서 투여되는데, 이러한 사례에서 덜 빈번한 투여가 가능하다. 일부 구체예에서, 용량 및 빈도는 환자에서 폴리펩티드의 반감기에 따라 변한다.
예방적 적용에서, 일부 구체예에서, 상대적으로 저용량이 긴 기간에 걸쳐 상대적으로 드문 간격에서 투여된다. 일부 구체예에서, 환자는 그들의 여생 동안 치료를 계속 제공받는다. 다른 치료적 적용에서, 질환의 진행이 감소되거나 또는 종결될 때까지, 그리고 바람직하게는, 환자가 질환의 증상의 부분적인 또는 완전한 개선을 보여줄 때까지, 상대적으로 짧은 간격에서 상대적으로 고용량이 필요하다. 그 후에, 일부 구체예에서, 특허물이 예방적 체제로서 투여된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "치료", "치료하는" 등은 효과를 획득하는 목적으로, 작용제를 투여하거나, 또는 절차를 실행하는 것을 지칭한다. 일부 구체예에서, 효과는 질환 또는 이의 증상을 완전하게 또는 부분적으로 예방하는 면에서 예방적이다. 일부 구체예에서, 효과는 질환 또는 질환의 증상에 대한 부분적인 또는 완전한 구제에 영향을 주는 면에서 치료적이다.
XIII. 키트
일부 구체예에서, 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 80에서 아미노산 돌연변이; 및 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 6, 잔기 27, 잔기 31, 잔기 47, 잔기 53, 잔기 54, 잔기 56, 잔기 66 및 잔기 92로 구성된 군에서 선택되는 잔기에서 최소한 하나의 추가 아미노산 돌연변이를 갖는 SIRP-α D1 도메인을 포함하는 신호-조절 단백질 α (SIRP-α) D1 변이체, 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드가 본원에서 개시된다.
일부 구체예에서, Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드가 또한 본원에서 개시되고, 여기서 상기 Fc 변이체는 2개의 Fc 도메인 단위체를 갖는 Fc 도메인 이합체를 포함하고, 여기서 각 Fc 도메인 단위체는 독립적으로 (i) 돌연변이 L234A, L235A, G237A 및 N297A로 구성되는 인간 IgG1 Fc 영역; (ii) 돌연변이 A330S, P331S 및 N297A로 구성되는 인간 IgG2 Fc 영역; 또는 (iii) 돌연변이 S228P, E233P, F234V, L235A, delG236 및 N297A를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역에서 선택된다.
본원에서 설명된 폴리펩티드 및 이들의 사용설명서를 포함하는 키트 역시 제공된다. 임의선택적으로, 이들 키트는 최소한 하나의 추가 시약을 더욱 포함할 수 있다. 무제한적 실례로서, 화학요법 작용제 또는 항종양 항체가 최소한 하나의 추가 작용제로서 역할을 할 수 있었다. 일부 구체예에서, 키트는 키트의 내용물의 의도된 용도를 지시하는 표지를 포함한다. 용어 표지는 키트 상에 또는 키트와 함께 공급되거나, 또는 만약 그렇지 않으면 키트에 동반되는 임의의 서면, 또는 기록된 자료를 포함한다.
일부 구체예에서, 키트는 (i) 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체를 포함하는 폴리펩티드; 임의선택적으로 (ii) 항체; 및 (iii) (i) 및 (ii) (제공되면)를 질환을 앓는 개체에 투여하기 위한 사용설명서를 포함한다. 일부 구체예에서, 키트는 (i) 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체를 포함하는 폴리펩티드; 및 (ii) (i)를 항체, 예를 들면, 키트에서 제공되지 않는 항체와 함께, 질환을 앓는 개체에 투여하기 위한 사용설명서를 포함한다. 일부 구체예에서, 키트는 (i) 항체; 및 (ii) (i)를 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체를 포함하는 폴리펩티드와 함께, 질환을 앓는 개체에 투여하기 위한 사용설명서를 포함한다.
일부 구체예에서, 키트는 암, 예를 들면, 고형 종양 암, 혈액암, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 다발성 골수종, 방광암, 췌장암, 자궁경부암, 자궁내막암, 폐암, 기관지암, 간암, 난소암, 결장 및 직장암, 위암, 위암, 담낭암, 위장관 간질성 종양 암, 갑상선암, 두경부암, 구인두암, 식도암, 흑색종, 비흑색종 피부암, 메르켈 세포 암종, 바이러스로 유도된 암, 신경모세포종, 유방암, 전립선암, 신장암, 신장 세포 암, 신우 암, 백혈병, 림프종, 육종, 신경교종, 뇌 종양, 암종, 또는 이들의 임의의 조합을 앓는 개체를 치료하는데 이용된다. 일부 구체예에서, 키트는 고형 종양 암 또는 혈액암을 앓는 개체를 치료하는데 이용된다.
일부 구체예에서, 키트는 면역 질환을 앓는 개체를 치료하는데 이용된다. 일부 구체예에서, 면역 질환은 자가면역 질환 또는 염증성 질환, 예를 들면, 다발성 경화증, 류마티스성 관절염, 척추관절병증, 전신성 홍반성 루푸스, 항체-매개된 염증성 또는 자가면역 질환, 이식편 대 숙주 질환, 패혈증, 당뇨병, 건선, 죽상경화증, 쇼그렌 증후군, 진행성 전신 경화증, 경피증, 급성 관상 증후군, 허혈성 재관류, 크론병, 자궁내막증, 사구체신염, 중증 근무력증, 특발성 폐섬유증, 천식, 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 혈관염 및 염증성 자가면역 근염이다.
실시예
실시예 1 - SIRP-α D1 변이체 폴리펩티드
본 발명의 폴리펩티드 산출
높은 친화성 SIRP-α D1 변이체를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드는 전통적인 분자 클로닝 및 단백질 발현 기술을 이용하여 산출된다. 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 SIRP-α D1 변이체에서 가능한 아미노산 치환은 표 2 및 5에서 열거된다. 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자는 널리 공지된 분자생물학 기술을 이용하여 세균 또는 포유류 세포에서 발현을 위해 최적화된 벡터 내로 클로닝된다. 단백질 발현의 유도 후, 세포는 수집되고, 그리고 발현된 폴리펩티드는 친화성 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 세포 배양 상층액으로부터 정제된다. 정제된 폴리펩티드는 이후, 예상된 크기의 단백질 띠의 존재를 확증하기 위해, SDS-PAGE, 그 이후에 쿠마시 블루 염색에 의해 분석된다.
정제된 폴리펩티드는 당해 분야에서 가용한 기술, 예를 들면, 파지 전시, 효모 전시, 표면 플라스몬 공명 (SPR), 신틸레이션 근접 검정, ELISA, ORIGEN 면역검정 (IGEN), 형광 퀀칭, 형광 전달, 또는 임의의 적합한 생물학적 검정을 이용하여 CD47에 결합에 대해 선별검사된다. 원하는 폴리펩티드는 야생형 SIRP-α보다 CD47, 예를 들면, 인간 CD47에 더욱 높은 친화성으로 결합한다.
SIRP-α D1 변이체 폴리펩티드의 결합 친화성
일련의 실험에서, 야생형 SIRP-α D1 도메인 및 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체의 폴리펩티드가 전통적인 분자 클로닝 및 단백질 발현 기술을 이용하여 산출되었다. 인간 CD47에 결합은 아래와 같이 SPR을 이용하여 결정되었다: 간단히, 야생형 SIRP-α 및 SIRP-α D1 변이체 폴리펩티드 변이체에 인간 CD47 (R and D Systems, 카탈로그 번호 4670-CD 또는 단위체성 세포외 도메인으로서 인하우스 생산된, ECD)의 결합은 작업 완충액으로서 0.01% Tween-20 (PBST)으로 보충된 인산염 완충된 식염수 (PBS, pH 7.4)를 이용하여 Biacore T100 기기 (GE Healthcare) 또는 Proteon XPR36 (Bio-rad, Hercules, CA)에서 분석되었다. 200 내지 1000 RU의 리간드가 제조업체의 권고에 따라, 표준 아민 연계에 의해 Biacore 칩 CM4 센서 또는 Proteon GLC 칩 상에 10 mM 아세트산나트륨 완충액 (pH 4.5)에서 고정되었다. 여러 농도의, 예를 들면, 최소한 0.1x 내지 10x KD 값의 범위에서 변하는 피분석물 (또는 SIRP-α D1 변이체 폴리펩티드)은 유속 100 μL/분에서 2 분 동안 주입되고, 그 이후에 10 분의 해리 시간이 뒤따랐다. 각 피분석물 주입 후, 표면은 30 초 동안 주입된 Pierce IgG 용리 완충액 (Life Technologies, 카탈로그 번호 21004) 및 4 M NaCl의 2:1 혼합물을 이용하여 재생되었다. 표면의 완전한 재생은 기준선 분석에 의해, 그리고 실험의 시작 및 종결 시점에서 동일한 피분석물을 주입함으로써 확증되었다. 모든 센서그램은 참조 표면 및 완충액 주입을 이용하여 이중-참조되고 1:1 랭뮤어에 적합되었다. 피분석물은 일차적으로 Fc가 없는 단위체성, CD47 ECD 또는 SIRP-α이었다. 칩 상에서 리간드는 단위체성 또는 Fc 융합일 수 있다. 결합 데이터는 표 16에서 제공된다. 모든 SPR 검정은 25 ℃에서 수행되었다.
표 16. SIRP-α 변이체 폴리펩티드 및 연관된 KD 값
서열 번호: 인간 CD47
K D (M)
2 0.5 x 10-6
53 4.5 x 10-10
54 2.7 x 10-9
55 6.2 x 10-10
56 2.0 x 10-10
57 3.6 x 10-10
58 1.6 x 10-10
59 1.4 x 10-8
60 3.8 x 10-10
61 3.8 x 10-10
62 1.3 x 10-10
63 8.9 x 10-11
64 5.45 x 10-9
65 8.00 x 10-10
66 4.70 x 10-10
67 2.06 x 10-10
68 2.51 x 10-10
69 2.40 x 10-9
71 4.94 x 10-9
72 7.38 x 10-10
73 4.48 x 10-10
74 2.76 x 10-10
75 1.33 x 10-9
76 7.41 x 10-9
77 1.14 x 10-10
78 1.44 x 10-11
79 2.17 x 10-10
80 4.72 x 10-11
85 1.19 x 10-10
위치 54에서 글루타민산염 또는 아스파르트산염 잔기를 갖는 것은 생쥐 CD47에 SIRP-α D1 변이체 폴리펩티드의 결합을 향상시키는 것으로 또한 결정되었다. 무제한적 실례로서, 아래의 표 17에서 확인된 SIRP-α D1 변이체 폴리펩티드는 생쥐 CD47에 높은 친화성 결합을 보여준다. 여러 SIRP-α D1 변이체 폴리펩티드의 인간 CD47에 대한 결합 친화성은 앞서 설명된 바와 같은 SPR을 이용하여 생쥐 CD47에 대한 결합 친화성과 비교되었는데, 생쥐 CD47 단백질이 적절한 경우에 인간 CD47 대신에 이용되었다. 결과는 표 18에서 제시된다.
표 17. 생쥐 CD47에 향상된 결합을 갖는 SIRP-α 변이체 폴리펩티드 서열
서열 번호: 아미노산 서열
195 EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTMTSLFPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQREGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGAITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS
196 EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLKPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQREGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGAITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS
197 EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLRPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQREGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGAITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS
198 EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLYPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQREGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGAITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS
199 EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQRDGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGAITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS
200 EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQREGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGAITPADAGTYYCVKFRKGIPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS
201 EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQREGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGAITPADAGTYYCVKFRKGMPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS
202 EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQREGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGAITPADAGTYYCVKFRKGSPDVEFKSGAGTELSVRAKPS
203 EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQREGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGAITPADAGTYYCVKFRKGSSEPDVEFKSGAGTELSVRAKPS
204 EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLRPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQRDGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGAITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS
205 EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLRPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQREGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGAITPADAGTYYCVKFRKGIPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS
206 EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLRPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQRDGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGAITPADAGTYYCVKFRKGIPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS
207 EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLYPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQRDGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGAITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS
208 EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLYPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQREGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGAITPADAGTYYCVKFRKGIPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS
209 EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLYPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQRDGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGAITPADAGTYYCVKFRKGIPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS
210 EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQRDGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGAITPADAGTYYCVKFRKGIPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS
표 18. 인간 및 생쥐 CD47에 SIRP-α 변이체 폴리펩티드의 결합
서열 번호: K D (M) - 인간 K D (M) - 생쥐
96 1.04 x 10-11 3.32 x 10-8
97 1.55 x 10-9 >100 nM
100 2.69 x 10-9 6.32 x 10-8
104 9.19 x 10-11 8.04 x 10-9
86 1.44 x 10-11 4.30 x 10-8
85 8.23 x 10-11 1.14 x 10-8
204 3.49 x 10-09 5.21 x 10-9
206 5.26 x 10-09 3.33 x 10-9
209 4.46 x 10-09 4.11 x 10-9
210 6.79 x 10-09 6.01 x 10-9
일정한 SIRP-α D1 변이체 폴리펩티드 내에 존재하는 부분적인 글리코실화를 최소화하거나 또는 제거할 수 있는 N80A 돌연변이는 이런 돌연변이를 내포하는 SIRP-α D1 변이체 폴리펩티드와 연관된 균질성을 증가시키는 기능적 유익성을 부여하는 것으로 또한 결정되었다. SIRP- α 변이체 폴리펩티드가 대장균 (E. coli)에서 발현될 때, 포유류 시스템과 비교하여 대장균 (E. coli)에서 글리코실화 시스템의 결여로 인해 N80의 글리코실화는 발생하지 않을 것이다. 표 19는 대장균 (E. coli) 및 인간 CD47에서 생산된 SIRP-α D1 변이체 폴리펩티드 사이에 효과적인 결합이 여전히 발생할 수 있다는 것을 보여주고, 따라서 데글리코실화가 SIRP-α D1 변이체가 CD47에 여전히 결합할 수 있는 결합 친화성에 영향을 주지 않는다는 것을 증명한다. N80A 돌연변이에 더하여, 데글리코실화는 N80을 N이 아닌 임의의 아미노산으로 돌연변이시킴으로써 또는 모티프 N-Xaa1-Xaa2 (여기서 N = 아스파라긴; Xaa1 = P (프롤린)를 제외한 임의의 아미노산; Xaa2 = T (트레오닌), S (세린) 또는 C (시스테인))를 교란함으로써 달성될 수 있는데, 여기서 상기 모티프는 SIRP-α D1 변이체 폴리펩티드의 잔기 80-82를 지칭한다. P83을 발린 또는 P가 아닌 다른 잔기로 돌연변이시킴으로써, N80에서 증가된 글리코실화가 일어날 수 있고, 그리고 균질하게 글리코실화된 SIRP-α D1 변이체 폴리펩티드가 산출될 수 있다.
아미노산 P83은 또한, 글리코실화의 정도에 영향을 줄 수 있다. P83을 임의의 아미노산으로 변화시키는 것은 N80에서 글리코실화의 효율을 증가시킬 수 있다. 위치 83에서 발린 (V)을 갖는 SIRP-α D1 변이체 (서열 번호: 213)가 HEK293FS 포유류 세포에서 발현되었다. 발현된 단백질의 크기는 위치 83에서 야생형 아미노산 잔기 (가령, 프롤린, P)를 갖는 SIRP-α D1 변이체 (서열 번호: 71)와 비교되었다. 단백질 겔에서 발현된 단백질의 분자량 분석 (도면 18)은 P83V 돌연변이를 갖는 변이체 (서열 번호: 213, 레인 2)가 위치 83에서 돌연변이되지 않는 변이체 (레인 1)와 비교하여 더욱 높은 분자량 (가령, ~22 kDa)을 갖는다는 것을 보여준다. 도면 18에서 보여 지는 바와 같이, 잔기 83이 Val로 돌연변이될 때, 포유류 세포 숙주에서 발현된 SIRP-α 변이체 폴리펩티드는 일차적으로, 더욱 높은 분자량 (~22kDa)에서 분자인데, 이것은 N80에서 글리코실화에 대한 효율이 증가될 수 있다는 것을 지시한다.
표 19. 다양한 글리코실화 프로필을 갖는 SIRP-α 변이체 폴리펩티드 서열에 대한 대표적인 결합 데이터
서열 번호: K D (M) 발현 시스템
53 4.5 x 10-10 대장균 (E. coli)
58 1.6 x 10-10 대장균 (E. coli)
60 3.8 x 10-10 대장균 (E. coli)
63 8.9 x 10-11 대장균 (E. coli)
55 6.2 x 10-10 대장균 (E. coli)
62 1.3 x 10-10 대장균 (E. coli)
57 3.6 x 10-10 대장균 (E. coli)
56 2.0 x 10-10 대장균 (E. coli)
61 3.8 x 10-10 대장균 (E. coli)
54 2.7 x 10-9 대장균 (E. coli)
59 1.4 x 10-8 대장균 (E. coli)
2 0.5 x 10-6 대장균 (E. coli)
53 5.2 x 10-10 포유류 세포
77 1.14 x 10-10 포유류 세포
74 2.76 x 10-10 포유류 세포
73 4.48 x 10-10 포유류 세포
72 7.38 x 10-10 포유류 세포
75 1.33 x 10-9 포유류 세포
71 4.94 x 10-9 포유류 세포
76 7.41 x 10-9 포유류 세포
실시예 2 - 단일 팔 및 이중특이적 SIRP-α 폴리펩티드의 산출
CD47 및 항원, 예를 들면, EGFR 둘 모두에 결합하는, (i) SIRP-α - Fc 융합 단백질 및 (ii) 폴리펩티드, 예를 들면, 항원 결합 도메인에 융합된 Fc 도메인 단위체의 이형이합체를 포함하는 구조체의 능력은 본 실시예에서 앞서 설명된 바와 같은 SPR에 의해 결정되었다. 이형이합체를 형성하기 위한 Fc 융합 단백질은 표 20에서 제공된다. 3개의 단일기능성 (가령, 하나의 표적에 결합) SIRP-α - Fc 융합이 시험되었다. 이들 융합 단백질은 도면 6a에서 A, B, C로서 묘사된다. 첫 번째 단일기능성 SIRP-α - Fc 융합 ("A")은 서열 번호: 136의 동종이합체이었다. 두 번째와 세 번째 단일기능성 SIRP-α - Fc 융합은 이것에 융합된 추가 폴리펩티드 없이, (i) SIRP-α - Fc 융합 및 (ii) Fc 도메인 단위체의 이형이합체이었다. 이들은 도면 4a 및 4b에서 묘사된 노브 & 홀 돌연변이 가공 전략을 이용하여 산출되었다. 한 단일기능성 SIRP-α - Fc 융합 ("B")은 서열 번호: 139 (Fc 변이체) 및 서열 번호: 142 (SIRP-α - Fc 융합)의 이형이합체화로부터 형성되었다. 다른 단일기능성 SIRP-α - Fc 융합 ("C")은 서열 번호: 139 (Fc 변이체) 및 서열 번호: 138 (SIRP-α Fc 융합)의 이형이합체화로부터 형성되었다. 이중기능성 (가령, 2개의 표적에 결합) SIRP-α - Fc 융합 ("D")은 서열 번호: 127 (SIRP-α Fc 융합) 및 서열 번호: 144 (Fc 변이체에 연결된 어비툭스의 항원 결합 영역)의 이형이합체화로부터 형성되었다. 서열 번호: 220은 어비툭스 항체의 경쇄를 나타낸다.
표 20. 이형이합체를 형성하기 위한 Fc 융합 단백질의 아미노산 서열
서열 번호: 아미노산 서열
138 EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRVLIYNQRQGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGAITPADAGTYYCIKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
139 DKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
142 EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQREGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGAITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
144 QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCRKTHTCPRCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
220 DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
217
EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQREGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGAITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSEKTHTCPECPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCEVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
간단히 말하면, CD47은 앞서 설명된 바와 같은 아민 화학에 의해 Proteon GLC 칩 위에 고정되었다. 첫 번째 주입에서, 피분석물 (가령, A, B, C, D 및 어비툭스)은 100 nM에서 60 s 동안 PBST에서 30 uL/분으로 주입되었고, 그리고 CD47 표면에 결합은 SPR에 의해 결정되었다. 두 번째 주입에서 100 nM EGFR-ECD (HEK293 세포에서 생산된 표피 성장 인자 수용체 세포외 도메인)가 주입되었고, 그리고 CD47-결합된 피분석물에 EGFR-ECD의 결합이 계측되었다. 어비툭스는 칩 상에서 CD47에 결합하지 않았고, 그리고 이런 이유로, 이것은 도면 6b에서 "어비툭스"로 표지화된 곡선에 의해 보여지고 도면 6a에서 도해된 바와 같이, 두 번째 주입에서 EGFR에 결합할 수 없었다. SIRP-α - Fc 융합 (가령, A, B 및 C)은 도면 6b에서 도해된 "A", "B" 및 "C"로 표지화된 곡선에 의해 보여지고 도면 6a에서 도해된 바와 같이, 두 번째 주입에서 CD47에 결합하지만 EGFR에 결합하지 않았다. 단위체성 단백질, 또는 하나의 SIRP-α D1 도메인을 갖는 단백질 (가령, B 및 C)은 "B" 및 "C"로 표지화된 곡선에 의해 보여 지는 바와 같이 칩 상에서 가용한 동일한 CD47 부위에 결합된 더욱 많은 양의 분자로 인해 이합체성 단백질 (가령, A)보다 더욱 높은 공명 단위이었는데, 이것은 고정된 CD47에 결합 및 EGFR-ECD에 미미한 결합 (가령, 단일기능성)을 지시하였다. 이형이합체성 SIRP-α - 어비툭스-Fc는 칩 상에서 CD47에 결합하였고, 그리고 또한, 도면 6b에서 "D"로 표지화된 곡선에 의해 보여 지는 바와 같이 두 번째 주입에서 EGFR-ECD에 결합할 수 있었는데, 이것은 고정된 CD47에 결합 및 EGFR-ECD의 결합 (가령, 이중기능성)을 지시하였다.
실시예 3 - 생쥐에서 CD47에 높은 결합 친화성을 갖는 폴리펩티드의 시험
다양한 암, 예를 들면, 고형 종양 및 혈액암의 유전적으로 가공된 생쥐 모형이 CD47에 대한 본 발명의 폴리펩티드의 결합을 시험하는데 이용된다. 본 발명의 폴리펩티드는 생쥐에 주입되고, 상기 생쥐는 상기 폴리펩티드 및 CD47의 복합체의 존재를 검출하기 위해 추후 시점에서 절개된다. SIRP-α 또는 CD47에 특이적인 항체가 검출에서 이용된다.
실시예 4 - 면역원성에 대한 폴리펩티드의 시험
높은 친화성 SIRP-α D1 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 면역원성 검정에서 시험된다. 이들 폴리펩티드는 T-세포 증식 검정에서 인실리코 및 시험관내 둘 모두에서 시험되는데, 이들 중에서 일부는 상업적으로 가용하다. 시험관내 T-세포 증식 검정에서 최소 면역원성 반응을 유발하고 CD47에 대해 야생형 SIRP-α보다 더욱 큰 결합 친화성을 전시하는 폴리펩티드는 추가 개발을 위해 선별된다.
실시예 5 - 생체내 독성에 대한 폴리펩티드의 시험
CD47에 대해 야생형 SIRP-α보다 다양한 정도의 증가된 결합 친화성을 전시하는 상이한 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체를 포함하는 상이한 폴리펩티드는 생물체에서 독성에 대한 상이한 결합 친화성의 효과를 검정하기 위해 동물 암 모형 (가령, 생쥐 암 모형) 내로 주입된다. 비인간 영장류 (NHP) 또한, 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체를 시험하는데 이용될 수 있는데, 그 이유는 비인간 영장류 (NHP) CD47 및 생쥐 CD47에 대한 교차반응성의 수준이 상이할 수 있기 때문이다.
실시예 6 - Fc 변이체의 Fcγ 수용체 결합
표적 기능을 조정하는 능력에 더하여, 치료적 단일클론 항체 및 Fc 내포 융합 단백질은 또한, 2가지 일차 면역 작동체 기전: 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC) 및 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 이끌어낼 수 있다. ADCC는 활성화 Fcγ 수용체에 Fc 영역 결합에 의해 매개되고, 그리고 본원에서 설명된 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드 구조체는 Fcγ 수용체 결합에 대해 시험되었다. 아래의 표 21에서 보여 지는 바와 같이, 이들 폴리펩티드 구조체는 상응하는 야생형 IgG Fc와 비교하여 하나 또는 그 이상의 Fcγ 수용체에 감소된 결합을 보였다. IgG1에 대하여, IgG1 Fc의 돌연변이 L234A, L235A, G237A 및 N297A는 야생형 IgG1, 또는 이들 돌연변이 중에서 하나 또는 그 이상을 결여하는 구조체와 비교하여, Fcγ 수용체 CD16a, CD32a, CD32b, CD32c 및 CD64에 결합의 심각한 상실을 유발하였다. 따라서, 비당화 또는 데글리코실화 돌연변이 N297A와 함께 돌연변이 L234A, L235A, G237A (가령, IgG1 AAA)는 연구된 Fcγ 수용체에 결합의 완전한 상실을 유발한다. Fcγ 수용체 결합이 식균작용에 중요한 것으로 알려져 있기 때문에, 돌연변이 L234A, L235A, G237A 및 N297A는 Fc 변이체를 포함하는 구조체의 식균작용의 감소를 유발할 수 있다.
다음의 재료와 방법이 본 실시예에서 이용되었다. Fc 변이체 구조체에 인간 Fcγ 수용체 RI (CD64), RIIA (CD32a), RIIB/C (CD32b/c) 및 RIIIA (CD16a) (R&D Systems, 각각 카탈로그 번호 1257-FC-050, 1330-CD-050, 1875-CD-050 및 4325-FC-050)의 결합은 작업 완충액으로서 0.01% Tween-20으로 보충된 인산염 완충된 식염수 (PBS, pH 7.4)를 이용하여 ProteOn XPR36 기기 (Bio-Rad, Hercules, CA)에서 분석되었다. 거의 400 공명 단위 (RU)의 최소한으로 비오틴화된 Fc 구조체가 아비딘-뉴트라비딘 상호작용에 의해 NLC 센서 칩 (Bio-rad, Hercules, CA)의 흐름 셀 위에 고정되었다. 비오티닐화는 Pierce EZ-Link 술포-NHS- LC-LC-비오틴 및 동몰 비율의 링커:단백질을 이용하여 제조업체의 사용설명서에 따라서 수행되었다. 피분석물 (hFcγR)은 0, 61, 185, 555, 1666 및 5000 nM의 공칭 농도에서 "원-샷 (one-shot)" 동력학 방식으로 주입되었다. 연관 및 해리 시간은 각각 90s 및 600s 동안 모니터링되었다. 각 주입 후, 표면은 Pierce IgG 용리 완충액 (Life Technologies, 카탈로그 번호 21004) 및 4 M NaCl의 2:1 v/v 혼합물을 이용하여 재생되었다. 표면의 완전한 재생은 실험의 시작 및 종결 시점에서 Fc 변이체를 주입함으로써 확증되었다. 바이오센서 데이터는 반응 스팟 데이터 (고정된 단백질)로부터 인터스팟 데이터 (고정된 단백질을 내포하지 않음)를 감산하고, 그리고 이후, 피분석물 주입의 반응으로부터 완충액 "블랭크" 피분석물 주입의 반응을 감산함으로써 이중-참조되었다. 이중- 참조된 데이터는 단순한 결합 등온선을 이용한 평형 분석에 적합되었다. KD,app . hFcγRI에 강한 결합을 갖는 Fc 분자의 경우에, 데이터는 또한, 단순한 랭뮤어 모형에 전체적으로 적합되었고, 그리고 KD,app 값은 겉보기 동력학 속도 상수 (KD app = kd,app/ka,app)의 비율로부터 계산되었다.
표 21에서 보여 지는 바와 같이, IgG2 Fc 영역의 돌연변이 A330S, P331S 및 N297A는 야생형 IgG 또는 이들 돌연변이를 결여하는 구조체와 비교하여, Fcγ 수용체 CD16a, CD32a, CD32b, CD32c 및 CD64에 결합의 심각한 상실을 유발하였다. 따라서, 비당화 또는 데글리코실화 돌연변이 N297A와 함께 돌연변이 A330S 및 P331S는 연구된 Fcγ 수용체에 결합의 완전한 상실을 유발하였다. Fcγ 수용체 결합이 식균작용에 중요한 것으로 알려져 있기 때문에, 돌연변이 A330S, P331S 및 N297A는 Fc 변이체의 식균작용에서 감소를 야기할 것으로 예측된다. IgG4 및 다양한 돌연변이에 대한 결합 데이터 역시 제공된다.
표 21. Fc 변이체에 Fcγ 수용체 결합에 대한 결합 데이터 (KD).
FC 설명 CD16a CD32a CD32b/c CD64
IgG1 370 nM 400 nM 2000 nM 0.004 nM
IgG1_AAA - 2300 nM - 8000 nM
IgG1_N297A - - - 150 nM
IgG1_AAA_N297A - - - -
IgG2 - 420 nM - 700 nM
IgG2_A330S, P331S - 390 nM - 900 nM
IgG2_N297A - - - -
IgG2_A330S, P331S,N297A - - - -
IgG4 4100 nM 720 nM 710 nM 1 nM
IgG4_S228P 3000 nM 810 nM 850 nM 1 nM
IgG4_S228P, L235E 2400 nM 1200 nM 1100 nM 60 nM
IgG4_S228P, E233P, F234V, L235A, delG236 - 1600 nM - 2100 nM
결합의 부재는 "-"에 의해 표시된다
실시예 7 - Fc 변이체의 C1q 결합 결정
보체 의존성 세포독성 (CDC)은 보체 단백질 C1q 및 보체 연쇄반응의 활성화에 의해 매개된다. 다양한 SIRP-α Fc 구조체에 다양한 농도의 C1q 보체의 결합은 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 결정되었다. SIRP-α Fc 융합은 PBS pH 7.4에서 5 μg/mL로 제조되고, 그리고 4℃에서 하룻밤 동안 Nunc Immulon 4HBX ELISA 96 웰 평판 (50 μL/웰을 이용)의 복제 웰을 코팅하는데 이용되었다. 다음 날, 평판은 세척 완충액 (PBS 및 0.05% Tween-20)으로 5회 세척되고, 그리고 실온에서 1 시간 동안 200 μL/웰의 차단 완충액 (PBS 및 0.5% BSA)과 함께 배양되었다. 평판은 5회 세척되고, 그리고 검정 완충액 (PBS, 0.5% BSA, 0.05% Tween-20, 0.25% CHAPS, 5mM EDTA 및 0.35% NaCl)에서 0, 0.13, 0.41, 1.23, 3.7, 11.1, 33.3, 100 μg/mL C1q와 함께 실온에서 2 시간 동안 배양되었다. 평판은 세척되고, 그리고 검정 완충액에서 2.0 μg/mL에서 50μl/웰 HRP 접합된 양-항인간-C1q와 함께 1 시간 동안 배양되었다. 평판은 5회 세척되고, 그리고 TMB (1-단계 Ultra TMB-ELISA, Thermo Sci. 카탈로그# 34028)와 함께 ~10 분 동안 배양되었다. 최종적으로, 50μL/웰 Pierce/Thermo Sci. 정지액 (0.16M 황산, 카탈로그. # N600)이 첨가되었고, 그리고 평판은 570 nm 참조에서 450 nm 흡광도에서 판독되었다. SIRP-α - Fc 융합을 결여하는 웰은 평판에 C1q 또는 HRP-접합된 검출 항체의 비특이적 결합을 제어하기 위해 운용되었다. C1q를 결여하는 웰은 SIRP-α - Fc 융합에 또는 평판에 HRP-접합된 검출 항체의 비특이적 결합을 제어하기 위해 운용되었다.
도면 14에서 보여 지는 바와 같이, 야생형 IgG1 (서열 번호: 123) 및 야생형 IgG2 (서열 번호: 126) 둘 모두 용량 의존성 방식으로 C1q에 결합하였다. 반대로, IgG1 변이체 IgG1_AAA (서열 번호: 124); IgG1_N297A (서열 번호: 125); 및 IgG1_AAA_N297A (서열 번호: 96)는 유의미하게 감소되고 최소한으로 검출가능한 C1q 결합 활성을 보였다. 유사하게, IgG2 변이체 IgG2_ A330S, P331S (서열 번호: 127); IgG2_N297A (서열 번호: 128); 및 IgG2_N297A, A330S, P331S (서열 번호: 129) 또한 유의미하게 감소되고 최소한으로 검출가능한 C1q 결합 활성을 보였다. IgG1 및 IgG2 변이체의 이러한 감소되고 최소한으로 검출가능한 C1q 결합 활성은 C1q에 결합하지 않는 야생형 IgG4 (서열 번호: 130)에 필적하였다.
실시예 8 - 야생형 Fc 및 Fc 변이체의 생산
본원에서 설명된 방법을 이용하고, 그리고 본 발명의 구체예에 따라서, 표 7의 야생형 Fc 폴리펩티드 및 Fc 변이체가 생산되었다.
실시예 9 - SIRP-α 변이체 및 Fc 변이체 폴리펩티드의 생산
본원에서 설명된 방법을 이용하고, 그리고 본 발명의 구체예에 따라서, 다음의 SIRP-α D1 변이체-Fc 변이체 폴리펩티드가 아래의 표 22에서 보여 지는 바와 같이 생산되었다. 인간 CD47에 결합은 실시예 1에서 설명된 바와 같은 방법론에 의해 결정되었다.
표 22. SIRP-α 변이체 Fc 변이체 폴리펩티드의 CD47 결합 친화성.
서열 번호: K D (M)
96 3.51 x 10-11
97 1.09 x 10-9
98 8.73 x 10-11
99 8.95 x 10-10
100 1.79 x 10-9
101 8.90 x 10-10
102 3.79 x 10-10
103 2.56 x 10-10
104 9.19 x 10-11
105 3.16 x 10-11
106 8.11 x 10-10
107 2.19 x 10-11
108 4.78 x 10-10
109 2.15 x 10-9
110 6.53 x 10-10
111 3.15 x 10-10
112 2.22 x 10-10
113 1.32 x 10-10
114 3.43 x 10-11
115 4.98 x 10-10
135 3.46 x 10-9
136 1.19 x 10-10
실시예 10 - SIRP-α - Fc 변이체의 식균작용
식균작용의 정량적 계측을 획득하기 위해, 식균작용 검정이 활용되었는데, 여기서 일차 인간 대식세포 및 GFP+ 또는 CFSE-표지화된 종양 세포가 본원에서 설명된 Fc 변이체 폴리펩티드 구조체와 공동배양되었다. 다음의 재료와 방법이 이용되었다:
종양 세포주의 배양
DLD-1-GFP-루시페라아제 세포, MM1R 및 N87은 10 % 열-비활성화된 소 태아 혈청 (Gibco), 1 % 페니실린/스트렙토마이신 (Gibco) 및 1 % 글루타맥스 (Gibco)로 보충된 RPMI (Gibco)를 포함하는 성장 배지에서 유지되었다. DLD-1-GFP-루시페라아제 및 N87 세포는 유착성 단층으로서 성장되었고, 그리고 MM1R 세포는 현탁 상태에서 성장되었다.
인간 단핵구-유래된 대식세포의 파생 및 배양
전혈 백혈구연층은 인산염 완충된 식염수 (PBS, Gibco)로 1:2 희석되었다. 희석된 혈액은 2개 튜브로 분할되고 20 ml 피콜-파크 플러스 (GE Healthcare)로 기저가 이루어졌다. 튜브는 400 x g에서 30 분 동안 원심분리되었다. 말초혈 단핵 세포 (PBMCs)는 인터페이스로부터 수집되고, 40 ml PBS의 첨가에 의해 2회 세척되고, 100 x g에서 10 분 동안 원심분리되고, 그리고 FACS 완충액 (0.5 % 소 혈청 알부민 (Gibco)을 포함하는 PBS)에서 재현탁되었다. CD14+ 단핵구는 제조업체의 프로토콜에 따라서 단핵구 단리 키트 II (Miltenyi Biotec) 및 LS 칼럼 (Miltenyi Biotec)을 이용한 음성 선별에 의해 정제되었다. CD14+ 단핵구는 10 % 인간 AB 혈청 (Corning), 1 % 페니실린/스트렙토마이신 및 1% 글루타맥스로 보충된 IMDM (Gibco)으로 구성된 25 ml 분화 배지에서 접시당 10 백만 세포에서 15 cm 조직 배양 평판 (Corning) 내로 파종되었다. 세포는 7 내지 10 일 동안 배양되었다.
시험관내 식균작용 검정
DLD-1-GFP-루시페라아제 및 N87 세포는 20 ml PBS로 2회 세척함으로써 배양 평판으로부터 분리되고, 그리고 37℃에서 10 분 동안 10 ml TrypLE Select (Gibco)에서 배양되었다. 세포는 세포 스크래퍼 (Corning)로 이전되고, 원심분리되고, PBS에서 세척되고, IMDM에서 재현탁되었다. MM1R 및 N87 세포는 제조업체의 사용설명서에 따라서 Celltrace CFSE 세포 증식 키트 (Thermo Fisher)로 표지화되고 IMDM에서 재현탁되었다. 대식세포는 20 ml PBS로 2회 세척함으로써 배양 평판으로부터 분리되고, 그리고 37℃에서 20 분 동안 10 ml TrypLE Select에서 배양되었다. 세포는 세포 스크래퍼 (Corning)로 이전되고, PBS에서 세척되고, IMDM에서 재현탁되었다.
식균작용 검정은 100,000 DLD-1 GFP 루시페라아제, MM1R 또는 N87 세포, 1000 nM로부터 64 pM으로 SIRP-α - Fc 변이체의 5-배 연속 희석액, 그리고 1 μg/ml에서 세툭시맙 (Absolute Antibody), 다라투무맙 또는 동일한 아이소타입 (Southern Biotech)의 대조 항체를 내포하는 초저 부착 U-바닥 96 웰 평판 (Corning)에서 조립되었다. 평판은 5 퍼센트 이산화탄소를 포함하는 가습된 인큐베이터에서 37℃에서 30 분 동안 전배양되고, 이후 50,000 대식세포가 첨가되었다. 평판은 5 퍼센트 이산화탄소를 포함하는 가습된 인큐베이터에서 37℃에서 2 시간 동안 배양되었다. 세포는 400 x g에서 5 분 동안 원심분리에 의해 펠렛화되고 250 μl FACS 완충액에서 세척되었다. 대식세포는 10 μl 인간 FcR 차단 시약 (Miltenyi Biotec), 0.5 μl 항-CD33 BV421 (Biolegend) 및 0.5 μl 항-CD206 APC-Cy7 (Biolegend)을 내포하는 50 μl FACS 완충액에서 15 분 동안 얼음 위에서 염색되었다. 세포는 200 μl FACS 완충액에서 세척되고, 250 μl PBS에서 세척되고, 그리고 PBS에서 1:1000 희석된 50 μl 고정가능 생존력 염료 eFluor 506 (ebioscience)에서 30 분 동안 얼음 위에서 염색되었다. 세포는 250 μl FACS 완충액에서 2회 세척되고 75 μl Cytofix (BD Biosciences)에서 얼음 위에서 30 분 동안 고정되었다. 세포는 175 μl FACS 완충액에서 세척되고 75 μl FACS 완충액에서 재현탁되었다. 세포는 FACS Canto II (BD Biosciences)에서 분석되었고, 차후 데이터 분석은 Flowjo 10.7 (Treestar)에 의해 이루어졌다. 사멸 세포는 e506-음성 개체군에서 게이팅에 의해 배제되었다. 종양 세포를 식균한 대식세포는 CD33, CD206 및 GFP 또는 CFSE에 대해 양성인 세포로서 확인되었다. 개별 Fc 변이체에 융합된 SIRP-α D1 도메인 변이체를 포함하는 5개 폴리펩티드 구조체는 시험관내 식균작용에 대해 시험되었다:
1) (서열 번호: 105)
EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRVLIYNQRQGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCIKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFASTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
2) (서열 번호: 127)
EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRVLIYNQRQGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCIKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
3) (서열 번호: 96)
EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRVLIYNQRQGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCIKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
4) (서열 번호: 124)
EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRVLIYNQRQGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCIKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
5) (서열 번호: 134)
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결과
도면 7은 서열 번호: 105 (Fc 변이체 IgG2_A330S, P331S, N297A) 및 서열 번호: 127 (Fc 변이체 IgG2_A330S, P331S)의 존재에서 인간 단핵구-유래된 대식세포에 의한 DLD-1-GFP-루시페라아제 종양 세포의 식균작용을 도해한다. 특히, 도면 7은 서열 번호: 105 (Fc 변이체 IgG2_A330S, P331S, N297A) (대조 항체 IgG1,k의 존재 또는 부재에서)가 식균작용 검정에서 단일 작용제로서 제거된 식균작용을 갖지만, 이것이 세툭시맙 (CTX) 식균작용 (서열 번호: 105 + CTX)을 증가시킬 수 있다는 것을 보여준다. 대조적으로, Fc 변이체 IgG2_A330S, P331S를 포함하는 폴리펩티드 (서열 번호: 127 + IgG1,k)는 단일 작용제로서 계측가능한 식균작용 활성을 갖는다. 종양 세포를 식균하고 GFP+인 대식세포의 퍼센트는 y 축에서 표시된다 (도면 7). 서열 번호: 105 및 서열 번호: 127의 부가로부터 CD47 결합 부위의 농도는 x 축에서 표시된다. DLD-1-GFP-루시페라아제 세포 및 대식세포는 지정된 농도의 서열 번호: 105, 서열 번호: 107 및 CTX (1ug/mL) 및 대조 항체 (IgG1, k)와 함께 배양되었다. 세포는 또한, PBS 플러스 세툭시맙 (PBS + CTX로 표지화된 라인) 또는 PBS 플러스 동일한 아이소타입의 대조 항체 (PBS + IgG1k로 표지화된 라인)와 함께 배양되었다.
도면 8은 서열 번호: 96 (Fc 변이체 IgG1 L234A, L235A, G237A, N297A) 및 서열 번호: 124 (Fc 변이체 IgG1 L234A, L235A, G237A)의 존재에서 인간 단핵구-유래된 대식세포에 의한 DLD-1-GFP-루시페라아제 종양 세포의 식균작용을 도해한다. 특히, 도면 8은 Fc 변이체 IgG1 L234A, L235A, G237A, N297A(서열 번호: 96) 및 Fc 변이체 IgG1 L234A, L235A, G237A (서열 번호: 124)가 식균작용 검정에서 단일 작용제로서 제거된 식균작용을 갖는다는 것을 보여준다. 이들은 각각, 서열 번호 96 + IgG1, k 및 서열 번호: 124 + IgG1,k로 표지화된 라인에 의해 대표된다. 흥미롭게도, 폴리펩티드 서열 번호: 96 및 서열 번호: 124 둘 모두 종양 특이적 항체, CTX의 식균작용을 증가시켰다. 도면 8에서 보여 지는 바와 같이, 종양 세포를 식균하고 GFP+인 대식세포의 퍼센트는 y 축에서 표시된다. 서열 번호: 96 및 서열 번호: 124의 부가로부터 CD47 결합 부위의 농도는 x 축에서 표시된다. DLD-1-GFP-루시페라아제 세포 및 대식세포는 1 μg/mL에서 CTX 및 지정된 농도의 서열 번호: 96 (서열 번호: 96 + CTX로 표지화된 라인) 또는 서열 번호: 124 (서열 번호: 124 + CTX로 표지화된 라인)와 함께 배양되었다. 식균작용 시에 세툭시맙의 비특이적 효과를 확인하기 위해, 세포는 세툭시맙과 동일한 아이소타입의 대조 항체 및 지정된 농도의 서열 번호: 96 (서열 번호: 96 + IgG1,k로 표지화된 라인) 또는 서열 번호: 124 (서열 번호: 124 + IgG1,k로 표지화된 라인)와 함께 배양되었다. 세포는 또한, PBS 플러스 세툭시맙 (PBS + CTX로 표지화된 라인) 또는 PBS 플러스 동일한 아이소타입의 대조 항체 (PBS + IgG1k로 표지화된 라인)와 함께 배양되었다.
도면 9는 서열 번호: 134 (Fc 변이체 IgG4_S228P)의 존재에서 인간 단핵구-유래된 대식세포에 의한 DLD-1-GFP-루시페라아제 종양 세포의 식균작용을 도해한다. 특히, 도면 9는 서열 번호: 134 구조체가 시험관내 식균작용에서 단일 작용제로서 상당한 식균작용 활성을 갖는다는 것을 보여준다. 도면 9에서 보여 지는 바와 같이, 종양 세포를 식균하고 GFP+인 대식세포의 퍼센트는 y 축에서 표시된다. 서열 번호: 134의 부가로부터 CD47 결합 부위의 농도는 x 축에서 표시된다. DLD-1-GFP-루시페라아제 세포 및 대식세포는 지정된 농도의 서열 번호: 134 (서열 번호: 134 + 배지로 표지화된 라인)와 함께 배양되었다. 세포는 또한, 대조 항체 (IgG1, k; 흑색 사각형)와 함께 배양되었다.
실시예 11 - SIRP-α 변이체 및 HSA 폴리펩티드의 생산
추가적으로, 본원에서 설명된 방법을 이용하고, 그리고 본 발명의 구체예에 따라서, SIRP-α D1 변이체 폴리펩티드는 아래의 표 23에서 보여 지는 바와 같이, HSA 폴리펩티드에 융합에 의해 발현되었다. 인간 CD47에 결합은 실시예 1에서 설명된 바와 같은 방법론에 의해 결정되었다.
표 23. HSA 폴리펩티드에 융합된 SIRP-α 변이체의 CD47 결합 친화성
서열 번호: K D (M)
150 4.53 x 10-10
151 5.54 x 10-9
152 2.78 x 10-10
153 4.24 x 10-9
154 2.35 x 10-10
155 1.11 x 10-8
157 2.15 x 10-9
158 1.09 x 10-9
159 7.6 x 10-10
실시예 12 - SIRP-α 변이체 폴리펩티드와 연관된 연장된 반감기
표 24 및 도면 10에서 보여 지는 바와 같이, Fc 및 HSA 융합을 포함하는 SIRP-α D1 변이체 폴리펩티드는 SIRP-α D1 변이체 단독과 비교하여 연장된 반감기를 가질 수 있다. 가령, 서열 번호: 104에 의해 대표되는, Fc에 융합된 SIRP-α D1 변이체 폴리펩티드 및 서열 번호: 159에 의해 대표되는, HSA에 융합된 SIRP-α D1 변이체 폴리펩티드는 서열 번호: 85에 의해 대표되는, Fc 또는 HSA에 융합되지 않는 SIRP-α D1 변이체 폴리펩티드에 비하여 증가된 반감기를 갖는다. 반감기 연장은 FcRn에 결합하는, Fc 및 HSA에 융합된 SIRP-α D1 변이체 폴리펩티드의 능력에 기인할 수 있는데, 이것은 연장된 순환성과 연관될 수 있다.
표 24. SIRP-α 변이체 폴리펩티드로 단일 용량 치료에 대한 반감기 계측
서열 번호: 복용량 반감기 (시간)
104 10 mg/kg 41.10
159 10 mg/kg 24.54
85 10 mg/kg 8.20
본 실시예에서 이용된 방법론은 다음과 같다. 간단히 말하면, 거의 25 그램의 무게가 나가는 CD-1 수컷 생쥐는 Harlan Labs로부터 획득되고, 그리고 서열 번호: 104, 서열 번호: 159 및 서열 번호: 85에 의해 대표되는 화합물의 단일 용량 PK 연구에 이용되었다. 각 화합물은 5 mg/mL의 작업 용량에서 조제되었다. 용량의 용적은 각 생쥐의 중량에 근거하여 조정되어, 각 생쥐가 1, 3 및 10 mg/kg에서 투약되도록 담보하였다. 이들 화합물은 생쥐 꼬리 정맥을 통해 정맥내 투여되었다. 3마리 생쥐는 각 시점 동안 각 화합물에 대해 각 용량 수준에서 투약되었다. 투약 후, 생쥐는 다음의 8 시점: 0.25, 1, 4, 8, 24, 48, 72 및 120 시간에서 채혈되었다. 500 μL의 전혈이 안와 출혈에 의해 마이크로테이너 튜브 내로 수집되었다. 전혈 표본은 혈청 분리를 허용하기 위해 30 분 동안 안정되었다. 표본은 이후, 4 ℃에서 1000의 RCF에서 10 분 동안 원심분리되었다. 혈청은 이후, 처리의 40 분 이내에 0.5 mL 튜브로 이전되고 분석 때까지 동결 유지되었다.
서열 번호: 104에 대한 데이터는 인간 Fc ELISA 프로토콜을 이용하여 획득되었다. 간단히 말하면, Immulon 4HBX ELISA 96 웰 평판은 1x 항원 코팅 완충액 (ImmunoChemistry Technologies, 카탈로그# 6248)에서 실온에서 하룻밤 동안 2 μg/ml, 100 μl/웰의 정제된 CD47로 코팅되었다 (Thermo Scientific 카탈로그#3855). 웰은 1x TBST (Tris-완충된 식염수 + 0.05% Tween-20) (Thermo Scientific 20x, 카탈로그# 28360)를 이용하여 200 - 300 μL/웰로 5 회 세척되었다. 웰은 PBS에서 200 μL/웰 7.5% BSA (GIBCO, 카탈로그# 15260-037)로 1-2 시간 동안 차단되었다. 웰은 200-300 μL/웰 1x TBST로 5회 세척되었다. 50 μL/웰 표준 곡선, 품질 대조 (QCs) 및 TBS에서 1:4 희석된 정상적인 CD1 생쥐 혈청에서 희석된 미지의 표본이 첨가되었다. 표준 곡선, QCs 및 미지의 표본은 실온에서 1 시간 동안 배양되었다. 표준 곡선에 대한 농도는 다음과 같았다: 0.2500 μg/mL; 0.1250 μg/mL; 0.0625 μg/mL; 0.0313 μg/mL; 0.0156 μg/mL; 0.0078 μg/mL; 0.0039 μg/mL; 0.0020 μg/mL; 0.0010 μg/mL; 0.0005 μg/mL; 0.00025 μg/mL; 및 0.00000 μg/mL. 품질 대조 (QCs)는 동결되고 분취되었고, 그리고 검정이 잘 진행되도록 담보하기 위한 대조로서 역할을 하는 표준 곡선의 선형 곡선에서 "높은", "중간" 및 "낮은" 농도에서 표준 곡선 단백질은 다음과 같았다: QC 높음 = 0.125 μg/ml; QC 중간 = 0.016 μg/ml; 및 QC 낮음 = 0.004 μg/ml.
이후, 웰은 200-300 μL/웰 1x TBST로 5회 세척되었다. 1x TBST + 1% BSA 내로 희석된 50 μL/웰의 0.25 ug/mL Abbexa 염소 항인간 IgG Fc 다중클론 항체 (11.6 mg/mL 스톡, Abbexa 카탈로그# abx023511)가 첨가되고 실온에서 1 시간 동안 배양되었다. 평판은 200-300 μL/웰 1x TBST로 5회 세척되었다. TBST + 1% BSA 내로 희석된 50 μL/웰의 0.125 μg/mL ZyMax / Invitrogen 토끼 항염소 IgG - HRP 접합 (Thermo Scientific, 카탈로그# 81-1620)이 첨가되고 실온에서 1 시간 동안 배양되었다. 웰은 200-300 μL/웰 1x TBST로 6회 세척되었다. 다음의 단계 및 시약이 실온에서 실행되었다. 0 μL/웰의 실온 1-단계 Ultra TMB - ELISA (Thermo Scientific 카탈로그# 34028)가 첨가되고, 그리고 발색 현상이 충분할 때까지 실온에서 2-5 분 동안 배양되었다. 50μL/웰의 실온 정지액 (0.16M 황산, Thermo Scientific 카탈로그# N600)이 즉시 첨가되고 충분히 혼합되었다. 평판은 O.D. 450 및 O.D. 570에서 분광광도계에서 즉시 판독되었다. O.D. 570 판독은 O.D. 450 판독으로부터 감산된 배경 시도이었다. Molecular Devices SoftMax Pro 또는 Graph Pad Prism과 같은 소프트웨어 프로그램을 이용하여, 표준 곡선 값은 4 파라미터 적합 곡선을 이용하여 플롯팅되었고, 그리고 미지의 표본의 농도는 상기 소프트웨어를 이용하여 상기 표준 곡선으로부터 내삽되었다.
서열 번호: 85에 대한 데이터는 His Tag ELISA 프로토콜을 이용하여 획득되었다. Immulon 4HBX ELISA 96 웰 평판 (Thermo Scientific 카탈로그#3855)은 1x 항원 코팅 완충액 (ImmunoChemistry Technologies, 카탈로그# 6248)에서 실온에서 하룻밤 동안 2 μg/mL, 100 μL/웰의 정제된 CD47로 코팅되었다. 웰은 1x TBST (Tris-완충된 식염수 + 0.05% Tween-20) (Thermo Scientific 20x, 카탈로그# 28360)를 이용하여 200 - 300 μL/웰로 5 회 세척되었다. 웰은 PBS에서 200 μL/웰 7.5% BSA (GIBCO, 카탈로그# 15260-037)로 1-2 시간 동안 차단되었다. 웰은 200-300 μL/웰 1x TBST로 5회 세척되었다. 50 μL/웰 표준 곡선, 품질 대조 (QCs) 및 TBS에서 1:4 희석된 정상적인 CD1 생쥐 혈청에서 희석된 미지의 표본이 첨가되었다. 표준 곡선, QCs 및 미지의 표본은 실온에서 1 시간 동안 배양되었다. 표준 곡선 농도는 다음과 같았다: 0.12500 μg/mL; 0.06250 μg/mL; 0.03125 μg/mL; 0.01563 μg/mL; 0.00781 μg/mL; 0.00391 μg/mL; 0.00195 μg/mL; 0.00098 μg/mL; 및 0.00000 μg/mL. 품질 대조 (QCs)는 동결되고 분취되었고, 그리고 검정이 잘 진행되도록 담보하기 위한 대조로서 역할을 하는 표준 곡선의 선형 곡선에서 "높은", "중간" 및 "낮은" 농도에서 표준 곡선 단백질은 다음과 같았다: QC 높음 = 0.02 μg/ml; QC 중간 = 0.01 μg/ml; 및 QC 낮음 = 0.005 μg/ml.
그 후에, 웰은 200-300 μL/웰 1x TBST로 5회 세척되었다. TBST + 1% BSA 내로 희석된 50 μL/웰의 0.2 μg/mL Abcam 토끼 항-6x His Tag -HRP 접합된 다중클론 항체 (1mg/mL 스톡, abcam 카탈로그# ab1187)가 첨가되고 실온에서 1 시간 동안 배양되었다. 평판은 200-300 μL/웰 1x TBST로 6회 세척되었다. 그 후에, 다음의 단계 및 작용제가 실온에서 실행되었다. 50 μL/웰의 실온 1-단계 Ultra TMB - ELISA (Thermo Scientific 카탈로그# 34028)가 첨가되고, 그리고 발색 현상이 충분할 때까지 실온에서 3-5 분 동안 배양되었다. 50μL/웰의 실온 정지액 (0.16M 황산, Thermo Scientific 카탈로그# N600)이 즉시 첨가되고 충분히 혼합되었다. 평판은 O.D. 450 및 O.D. 570에서 분광광도계에서 즉시 판독되었다. O.D. 570 판독은 O.D. 450 판독으로부터 감산된 배경 시도이었다. Molecular Devices SoftMax Pro 또는 Graph Pad Prism과 같은 소프트웨어 프로그램을 이용하여, 표준 곡선 값은 4 파라미터 적합 곡선을 이용하여 플롯팅되었고, 그리고 미지의 표본의 농도는 상기 소프트웨어를 이용하여 상기 표준 곡선으로부터 내삽되었다.
서열 번호: 159에 대한 데이터는 HSA ELISA 프로토콜을 이용하여 획득되었다. Immulon 4HBX ELISA 96 웰 평판 (Thermo Scientific 카탈로그#3855)은 1x 항원 코팅 완충액 (ImmunoChemistry Technologies, 카탈로그# 6248)에서 실온에서 하룻밤 동안 2 μg/ml, 100 μl/웰의 정제된 CD47로 코팅되었다. 웰은 1x TBST (Tris-완충된 식염수 + 0.05% Tween-20) (Thermo Scientific 20x, 카탈로그# 28360)를 이용하여 200 - 300 μL/웰로 5 회 세척되었다. 웰은 200 μL/웰 Li-Cor Odyssey 차단 완충액 (TBS) (Li-Cor, 카탈로그# 927-50000)으로 2 시간 동안 차단되었고, 그리고 알부민을 내포하는 차단 완충액은 이용되지 않았다. 웰은 200-300 μL/웰 1x TBST로 5회 세척되었다. 50 μL/웰 표준 곡선, 품질 대조 (QCs) 및 TBS에서 1:4 희석된 정상적인 CD1 생쥐 혈청에서 희석된 미지의 표본이 첨가되었다. 표준 곡선, QCs 및 미지의 표본은 실온에서 1 시간 동안 배양되었다.
표준 곡선 농도는 다음과 같았다: 3.20 μg/ml; 1.60 μg/ml; 0.80 μg/ml; 0.40 μg/ml; 0.20 μg/ml; 0.10 μg/ml; 0.05 μg/ml; 0.025 μg/ml; 및 0.00 μg/ml. 품질 대조 (QCs)는 동결되고 분취되고, 그리고 검정이 잘 진행되도록 담보하기 위한 대조로서 역할을 하는 표준 곡선의 선형 부분에서 "높은", "중간" 및 "낮은" 농도에서 표준 곡선 단백질은 다음과 같았다: QC 높음 = 0.6 μg/ml; QC 중간 = 0.3 μg/ml; QC 낮음 = 0.15 μg/ml, 그리고 QC 낮음 = 0.01μg/ml.
그 후에, 웰은 200-300 μL/웰 1x TBST로 5회 세척되었다. 1x TBST 내로 희석된 50 μL/웰의 1 μg/ml Thermo Scientific/Pierce 토끼 항-HSA-HRP 접합 (Thermo Scientific 카탈로그# PA1-26887)이 첨가되고 실온에서 1 시간 동안 배양되었다. 평판은 200-300 μL/웰 1x TBST로 6회 세척되었다. 그 후에, 다음의 단계 및 시약이 실온에서 실행되었다. 50 μL/웰의 실온 1-단계 Ultra TMB - ELISA 기질 (Thermo Scientific 카탈로그# 34028)이 첨가되고, 그리고 발색 현상이 충분할 때까지 실온에서 3-5 분 동안 배양되었다. 50μl/웰의 실온 TMB 정지액 (0.16M 황산 용액, Thermo Scientific 카탈로그# N600)이 첨가되고 충분히 혼합되었다. 평판은 O.D. 450 및 O.D. 570에서 분광광도계에서 즉시 판독되었다. O.D. 570 판독은 O.D. 450 판독으로부터 감산된 배경 시도이었다. Molecular Devices SoftMax Pro 또는 Graph Pad Prism과 같은 소프트웨어 프로그램을 이용하여, 표준 곡선 값은 4 파라미터 적합 곡선을 이용하여 플롯팅되었고, 그리고 미지의 표본의 농도는 상기 소프트웨어를 이용하여 상기 표준 곡선으로부터 내삽되었다.
실시예 13 - SIRP-α 변이체 폴리펩티드에 의해 증명된 감소된 적혈구응집
도면 11에서 보여 지는 바와 같이, SIRP-α D1 변이체 폴리펩티드는 감소된 또는 제거된 적혈구응집을 보였다. 구체적으로, 적혈구응집이 발생할 때, 양성 대조 B6H12에 대해 보여 지는 바와 같이, 확산된 적변이 적색 반점 대신에 존재한다. 도면 11에서 시험된 SIRP-α D1 변이체 폴리펩티드의 경우에, 적혈구응집의 감소 또는 제거가 있었다.
본 실시예에서 이용된 방법론은 다음과 같았다: 인간 전혈 백혈구연층은 Stanford University Blood Center로부터 수령되고 인산염 완충된 식염수 (PBS, Gibco)로 1:2 희석되었다. 희석된 혈액은 2개 튜브로 분할되고 20 ml 피콜-파크 플러스 (GE Healthcare)로 기저가 이루어졌다. 튜브는 400 x g에서 30 분 동안 원심분리되었다. 상층액은 제거되었고, 그리고 적혈구 펠렛은 30 mL의 PBS의 첨가에 의해 2회 세척되고 3500 RPM에서 원심분리되었다. 그 후에, 혈구응집 검정이 아래와 같이 실행되었다: 인간 적혈구는 PBS에서 희석되고 75 μL의 용적에서 웰마다 4 백만 세포에서 96 웰 폴리스티렌 평판 (Corning)으로 이전되었다. 지정된 단백질의 5-배 연속 희석액이 1000 nM로부터 0.488 nM까지의 최종 농도로, 75 μL PBS의 용적에서 웰에 첨가되었다. 음성 대조로서, PBS 단독이 웰의 한쪽 열에 첨가되었다. 적혈구는 웰의 아래쪽에 가라앉고, 작고 충분히 규정된 펠렛을 형성한다. 양성 대조로서, 세포는 항-CD47 항체 B6H12 (ebioscience)로 처리되었다. 이러한 항체는 큰 미만성 세포 펠렛의 형성에 의해 지시된 바와 같이, 8 및 63 nM 사이의 농도에서 적혈구응집을 유발하였다. 시험된 구조체 중에서, IgG2-기초된 폴리펩티드 (서열 번호: 109 및 서열 번호: 113)는 4 및 8 nM에서 약한 적혈구응집을 유발하였다. 모든 다른 폴리펩티드 구조체 (IgG1-기초된 및 HSA-기초된)의 경우에 적혈구응집이 관찰되지 않았다.
실시예 14 - 생쥐 동계 종양 모형에서 서열 번호: 211의 항종양 활성
Charles River Laboratory로부터 획득된 C57BL/6 생쥐 (7- 내지 10-주령 암컷 동물)가 이용되었다. 생쥐 결장 선암종 세포주 MC38은 동결된 스톡으로부터 회수되고, 그리고 10% 소 태아 혈청, 페니실린-스트렙토마이신 및 L-글루타민을 내포하는 RPMI 1640에서 성장되었다. 세포는 스핀다운되고, 그리고 첨가제 없이 혈청 없는 배지에서 2E+07 세포/mL의 농도에서 재현탁되었다. -7 일자 (다시 말하면, 예상된 스테이징 일자로부터 7 일전)에, 생쥐는 생쥐마다 인산염 완충된 식염수 (PBS)에서 100 μL (2.0 x 106 세포)의 새로 제조된 MC38을 왼쪽 옆구리 내로 피하 주입함으로써 이식되었다. 종양이 거의 50 mm3의 평균 체적에 도달할 때, 확립된 종양 및 중간 체중을 갖는 50마리 동물은 5가지 치료군 (군 1-5, 각각 n=10 생쥐)으로 무작위화되었다. 1 일자에 시작하여, 군 1 내지 5의 생쥐는 각각, 운반제 (PBS), 항-mPD-L1 (클론 10F.9G2, 200 μg), 서열 번호: 211 (200 μg), 항-mPD-L1 (200 μg) + 서열 번호: 211 (100 μg), 또는 항-mPD-L1 (200 μg) + 서열 번호: 211 (200 μg)로 처리되었다. 용량은 1, 4 및 7 일자에 0.05 mL/생쥐의 복강내 (IP) 주사에 의해 투여되었다.
서열 번호: 211은 서열 번호: 206을 Fc 도메인 단위체에 유전적으로 융합함으로써 산출되었다. 서열 번호: 206은 생쥐 CD47에 결합을 향상시키는 것으로 밝혀진 돌연변이를 내포한다. 결합 데이터는 표 18에서 제시된다.
서열 번호: 211
EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLRPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQRDGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGAITPADAGTYYCVKFRKGIPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
임상적 관찰 결과 및 체중이 42 일까지 연구 내내 모니터링되었다. 종양 크기가 주 2회 계측되었고, 그리고 연구 완결 시점에, 직각 마이너 (너비, W 및 높이, H) 및 메이저 (길이, L) 치수가 마이크로캘리퍼 (Mitutoyo, Aurora, Illinois)를 이용하여 계측되었다. 종양 체적 (mm3)이 타원체 구체의 체적에 대한 공식 (L x W x H / 2)을 이용하여 계산되었다. 연구 동물은 개별 동물에서 종양 체적이 2,500 mm3을 초과할 때 (또는 이것에 근접할 때), 연구 동안 인도적인 희생에 종속되었다. 42 일자까지 연구에 남아있는 동물의 숫자는 생존 분석에 이용되었다.
종양은 5개 군 모두에서 다양한 정도까지 성장하였다. 운반제 또는 서열 번호: 211 (200 μg) (각각, 군 1 및 3)이 투약된 생쥐 사이에서, 희생은 4번째 주 동안 (25 일자부터) 시작되었고, 그리고 이들 군에서 모든 동물은 5번째 주의 종결 시점 (35 일자)에 죽었다. 항-mPD-L1 (단독으로 또는 서열 번호: 211와 합동으로; 군 2, 4 및 5)이 투약된 생쥐 사이에서, 희생은 5번째 주 동안 (29 일자 또는 32 일자부터) 시작되었지만, 이들 동물의 부분집합 (40-70%)은 예정된 연구 종결 시점 (42 일자)까지 생존하였다. 도면 12는 연구 기간 동안 각 치료군에 대한 생존 곡선을 보여준다. 수치적으로, 항-mPD-L1 플러스 200 μg 서열 번호: 211 치료군은 가장 높은 숫자의 생존 동물을 가졌고, 항-mPD-L1 플러스 100 μg 서열 번호: 211 치료군 및 항-mPD-L1 단독 군이 그 뒤를 이었는데, 각각 42 일자에 10 마리 중에서 7 마리 (70%), 10마리 중에서 5 마리 (50%) 및 10마리 중에서 4 마리 (40%) 생쥐가 남아있었다 (표 25). 중앙 생존은 운반제 (군 1) 및 서열 번호: 211 단독 (군 3) 치료의 경우에 각각 29 및 30.5 일이었다. 중앙 생존은 항-mPD-L1 단독 (군 2) 및 항-PD-L1 플러스 100 μg 서열 번호: 211 (군 4) 치료의 경우에 42 일까지 증가하였다. 항-mPD-L1 플러스 200 μg 서열 번호: 211 치료 (군 5)에 대한 중앙 생존은 결정되지 않았는데, 그 이유는 50%보다 많은 동물이 연구의 종결 시점 (42 일자)에서 남아있었기 때문이다.
표 25. 동물 생존 데이터.
지시된 일자에 살아있는 동물의 숫자
군 치료 (3 IP 투약 - 1, 4 및 7 일자에) 1 4 7 11 14 18 22 25 29 32 35 39 42
1 PBS 10 10 10 10 10 10 10 6 1 0 0 0 0
2 항-mPD-L1 (200 μg) 10 10 10 10 10 10 10 10 9 9 7 5 4
3 서열 번호: 211 (200 μg) 10 10 10 10 10 10 10 9 5 1 0 0 0
4 항-mPD-L1 (200 μg)
+ 서열 번호: 211 (100ug)		 10 10 10 10 10 10 10 10 10 9 7 6 5
5 항-mPD-L1 (200ug)
+ 서열 번호: 211 (200 μg)		 10 10 10 10 10 10 10 10 9 9 8 7 7
종양은 운반제 치료된 군에서 급속한 성장을 전시하였는데, 이것은 효과적인 치료의 부재에서 진행성 종양 성장을 지시하였다. 200 μg 서열 번호: 211의 투약 (군 3)은 운반제 투약과 비교하여, 간헐적 시점 (7 및 14 일자, 미가공 및 정규화된 종양 체적 둘 모두에 대해)에서만 종양 성장의 유의미한 약화를 산출하였다. 단독으로, 또는 서열 번호: 211과 합동으로 200 μg 항-mPD-L1의 투약 (군 2, 4 및 5)은 운반제 투약과 비교하여, 4 또는 7 일자부터 종양 성장의 유의미한 약화 (각각, 미가공 또는 정규화된 종양 체적에 대해)를 제공하였다 (도면 13 및 표 26). 항-mPD-L1 섭생에 서열 번호: 211의 추가 (군 2 대 4 또는 군 2 대 5)는 항-mPD-L1 치료 단독에 비하여 추가적인 종양 성장 저해를 산출하였다. 종양 성장 저해 (%TGI)를 비롯하여, 22 일자 종양 체적이 표 26에서 제공된다. 22 일자가 비교에 이용되는데, 그 이유는 상기 일자가 모든 동물이 여전히 살아있는 마지막 시점이기 때문이다. 1 일자와 대비하여 22 일자에 종양 성장 저해 (% TGI)는 항-mPD-L1 플러스 200 μg 서열 번호: 211 군, 항-mPD-L1 플러스 100 μg 서열 번호: 211 군 및 항-mPD-L1 단독 군 각각에 대해 83%, 81% 및 77%이었다 (표 26).
표 26. 종양 체적 분석
Figure pct00007
실시예 15 - 암을 치료하기 위한 복합 요법의 최적화
높은 친화성 SIRP-α D1 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 다양한 암, 예를 들면, 고형 종양 및 혈액암의 생쥐 모형을 치료하기 위해 체크포인트 저해제와 공동투여된다. 암은 면역계에 의해 인식될 수 있고, 그리고 일부 상황 하에, 면역계는 종양을 제거하는데 관련될 수 있다. 동시저해성 분자, 예를 들면, CTLA-4, PD-1 및 LAG-3의 차단은 종양에 대항하여 T-세포 반응을 증폭하는데 관련될 수 있다. 본원에서 설명된 폴리펩티드는 체크포인트 저해제, 예를 들면, CTLA-4의 항체 저해제 (가령, 이플리무맙, 트레멜리무맙), PD-1의 항체 저해제 (니볼루맙, 피딜리주맙, 펨브로리주맙으로서 또한 알려져 있는 MK3475, BMS936559 및 MPDL3280A), 그리고 LAG-3의 항체 저해제 (가령, BMS986016)와 합동으로 투여된다.
BALB/c 생쥐 (가령, 림프종 모형)에서 확립된 A20 종양은 CTLA-4의 항체 저해제 및 본원에서 제공된 IgG Fc 변이체에 융합된 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체 (가령, SIRP-α 구조체)로 치료된다. 1 일자에 시작하여, 생쥐는 운반제 (PBS), 트레멜리무맙 (200 μg) + SIRP-α 구조체 (100 μg), 또는 트레멜리무맙 (200 μg) + SIRP-α 구조체 (200 μg)로 치료된다. 용량은 1, 4 및 7 일자에 0.05 mL/생쥐의 복강내 (IP) 주사에 의해 투여된다. 복합 요법에 대한 종양 반응은 종양 체적을 계측함으로써 매일 결정된다. 4 일자에, 복합 요법으로 치료된 생쥐의 종양 체적이 유의미한 향상을 보이지 않으면, 트레멜리무맙은 이플리무맙으로 대체된다. 유사하게, 7 일자에, 복합 요법으로 치료된 생쥐의 종양 체적이 유의미한 향상을 보이지 않으면, 트레멜리무맙은 이플리무맙으로 대체된다. 트레멜리무맙 및 이플리무맙이 동일한 체크포인트 단백질을 표적으로 하긴 하지만, 이들은 그들의 상이한 Fc 영역으로 인해 상이한 치료 효력 및 SIRP-α 구조체와의 상이한 상승 효과를 가질 것으로 예상된다. 트레멜리무맙은 보체를 고정시키는데 더욱 효과적일 수 있는 IgG2 항체이고, 반면 이플리무맙은 활성화된 T-세포의 제거를 예방하는데 유용할 수 있는 IgG1 항체이다.
실시예 16 - 상피 마커를 발현하는 암을 치료하는 방법
IgG Fc 변이체에 융합된 SIRP-α 폴리펩티드 구조체, 예를 들면, 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체 (가령, 표 2, 5 및 6에서 제공된 임의의 변이체)는 상피 세포 마커를 발현하는 암을 치료하기 위해 투여된다. 예로서, SIRP-α D1 구조체에 의한 CD47 신호전달의 차단으로부터 발생하는 증가된 식균작용은 대식세포의 존재에 의존할 수 있다. 이런 이유로, 암 세포에서 또는 암 세포 상에서 발현되는 상피 마커를 표적으로 하는 항체와 합동으로 SIRP-α D1 폴리펩티드 구조체의 투여는 피부 말초에서 대식세포의 낮은 존재비로 인한 부작용, 예를 들면, 상피 세포의 식균작용의 위험을 감소시키면서 암을 치료하는데 이용된다.
상피 마커, 예를 들면, EGFR 또는 EpCAM을 발현하는 암의 생쥐 모형은 상기 상피 마커를 표적으로 하는 항체, 예를 들면, 항-EGFR 항체 또는 항-EpCAM 항체와 합동으로 SIRP-α 구조체가 투여된다. 상피 마커를 표적으로 하는 항체는 암성 세포 및 비암성 세포, 예를 들면, 피부 말초에서 비암성 세포 둘 모두를 인식할 수 있다. 하지만, 피부 말초에서 비암성 세포는 피부에 근접한 대식세포의 낮은 존재비로 인해 식균작용에 감수성이 아닐 것으로 예상된다.
실시예 17 - 단일 팔 SIRP-α - Fc 융합에 의한 식균작용
단일 SIRP-α 분자 (가령, 단일 팔 분자)를 갖는 SIRP-α - Fc 융합에 의해 유도된 식균작용의 정량적 계측 (도면 1, 4a 및 4b에서 묘사됨)을 획득하기 위해, 상이한 세포 유형 MM1R 및 N87 세포로 식균작용 검정이 실시예 8에서 설명된 바와 같은 방법을 이용하여 수행되었다.
6개 단일 팔 구조체가 시험관내 식균작용에 대해 시험되었다. 이들 단일-팔 구조체는 노브 & 홀 전략을 이용하여 산출된다. 서열 번호: 136의 동종이합체 SIRP-α Fc 융합은 이중 팔 비교 (대조)로서 이용되었다. 첫 번째 단일-팔 SIRP-α Fc 융합 (가령, A)은 서열 번호: 139 (Fc 변이체) 및 서열 번호: 138 (SIRP-α Fc 융합)의 이형이합체로부터 형성되었다. 두 번째 단일-팔 SIRP-α Fc 융합 (가령, B)은 서열 번호: 141 (Fc 변이체) 및 서열 번호: 140 (SIRP-α Fc 융합)의 이형이합체로부터 형성되었다. 세 번째 단일-팔 SIRP-α Fc 융합 (가령, C)은 서열 번호: 139 (Fc 변이체) 및 서열 번호: 142 (SIRP-α Fc 융합)의 이형이합체로부터 형성되었다. 네 번째 단일-팔 SIRP-α Fc 융합 (가령, D)은 서열 번호: 141 (Fc 변이체) 및 서열 번호: 143 (SIRP-α Fc 융합)의 이형이합체로부터 형성되었다. 다섯 번째 단일-팔 SIRP-α Fc 융합 (가령, E)은 서열 번호: 147 (Fc 변이체) 및 서열 번호: 146 (SIRP-α Fc 융합)의 이형이합체로부터 형성되었다. 여섯 번째 단일-팔 SIRP-α Fc 융합 (가령, F)은 서열 번호: 149 (Fc 변이체) 및 서열 번호: 148 (SIRP-α Fc 융합)의 이형이합체로부터 형성되었다. 단위체로서 시험될 때 SIRP-α 단일-팔의 CD47 결합 친화성 (KD)은 다음과 같다: ~10pM (A,B), ~100pM (C, D) 및 ~5nM (E, F). 이들 서열은 아래의 표 27에서 제공된다.
표 27. 이형이합체의 작제를 위한 SIRPα - Fc 융합의 아미노산 서열
서열 번호: 아미노산 서열
138 EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRVLIYNQRQGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGAITPADAGTYYCIKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
139 DKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
140 EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRVLIYNQRQGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGAITPADAGTYYCIKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
141 DKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
142 EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQREGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGAITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
143 EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQREGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGAITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
146 EEELQVIQPDKSVLVAAGETATLRCTATSLFPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQRQGPFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
147 DKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
148 EEELQVIQPDKSVLVAAGETATLRCTATSLFPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQRQGPFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
149 DKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
도면 15-17은 비극성, 인간 단핵구-유래된 대식세포에 의한 다발성 골수종 라인 1R (MM1R) 및 위 암종 라인 N87의 식균작용을 도해한다. "+" 및 "-"는 도면 15-16에서 각각, 다라투무맙 (Dara)의 첨가 또는 부재를 표시한다. 도면 17에서, "+" 및 "-"는 각각, 헤르셉틴/트라스투주맙 (Her)의 첨가 및 부재를 표시한다.
도면 15는 대조 항체 (IgG1,k)의 존재에서 구조체 A를 도해한다, 가령, "A-"는 단일 작용제로서 제거된 식균작용을 갖지만, 이것은 다라투무맙 (Dara) 식균작용을 증가시킬 수 있다 (가령, "A+"). 유사하게, 대조 항체 (IgG1,k)의 존재에서 구조체 B, 예를 들면, "B-"는 단일 작용제로서 제거된 식균작용을 갖지만, 이것은 다라투무맙 (Dara) 식균작용을 증가시킬 수 있다 (가령, "B+"). MM1R을 식균하고 CFSE+인 대식세포의 퍼센트는 y 축에서 표시된다. 구조체 A, B, 또는 대조 구조체의 부가로부터 CD47 결합 부위의 농도는 x 축에서 표시된다. 식균작용의 수준은 대조 구조체 (이것은 이중-팔 SIRP-α이다)에 필적한다. 항-CD47 항체, 예를 들면, B6H12 (100 nM)와 함께 배양으로부터 발생하는 식균작용의 수준은 Dara와 함께 배양에 필적한다 (가령, PBS+). 보여 지는 바와 같이, 단일 팔 SIRP-α - Fc 융합은 이중 팔 SIRP-α - Fc 융합에 필적하게 Dara 식균작용을 증가시킬 수 있다.
도면 16은 대조 항체 (IgG1,k)의 존재에서 구조체 C를 도해한다, 가령, "C-"는 식균작용 검정에서 단일 작용제로서 제거된 식균작용을 갖지만, 이것은 다라투무맙 (Dara) 식균작용을 증가시킬 수 있다 (가령, "C+"). 유사하게, 대조 항체 (IgG1,k)의 존재에서 구조체 D, 예를 들면, "D-"는 식균작용 검정에서 단일 작용제로서 제거된 식균작용을 갖지만, 이것은 다라투무맙 (Dara) 식균작용을 증가시킬 수 있다 (가령, "D+"). MM1R을 식균하고 CFSE+인 대식세포의 퍼센트는 y 축에서 표시된다. 구조체 C, D, 또는 대조 구조체의 부가로부터 CD47 결합 부위의 농도는 x 축에서 표시된다. 식균작용의 수준은 대조 구조체 (이것은 이중-팔 SIRP-α이다)에 필적한다. 항-CD47 항체, 예를 들면, B6H12 (100 nM)와 함께 배양으로부터 발생하는 식균작용의 수준은 Dara와 함께 배양에 필적한다 (가령, PBS+). 보여 지는 바와 같이, 단일 팔 SIRP-α - Fc 융합은 이중 팔 SIRP-α - Fc 융합에 필적하게 Dara 식균작용을 증가시킬 수 있다. 보여 지는 바와 같이, 단일 팔 SIRP-α - Fc 융합은 이중 팔 SIRP-α - Fc 융합에 필적하게 Dara 식균작용을 증가시킬 수 있다.
도면 17은 상기 실례와 유사하게 수행된, 낮은 친화성 단일-팔 SIRP-α 구조체 (E, F)의 존재에서 식균작용을 도해한다. 보여 지는 바와 같이, 헤르셉틴과 합동으로 이들 낮은 친화성 단일-팔 SIRP-α 구조체 (E, F)는 N87 세포에 대한 헤르셉틴 단독 (PBS+)에 필적하는 식균작용을 보여주었다. 이런 이유로, CD47에 대한 5nM 친화성은 단일-팔 SIRP-α-Fc 융합이 헤르셉틴과 합동으로 시험관내 식균작용을 더욱 증강하기에는 충분하지 않다.
실시예 17 - 높은 친화성 SIRP-α D1 변이체의 교차반응성
높은 친화성 SIRP-α D1 변이체의 폴리펩티드는 앞서 설명된 바와 같이 산출되었다. 인간, 생쥐 및 쥐 CD47에 결합은 실시예 1에서 설명된 바와 같이, Biacore T100 기기 (GE Healthcare) 및 Proteon XPR36 (Bio-rad, Hercules, CA)에 의해 계측될 때 SPR을 이용하여 결정되었다. 서열 번호: 215는 인간, 생쥐 또는 쥐 CD47에 결합하지 않고 음성 대조로서 활용된 가공된 SIRP-α D1 변이체이다.
표 28. 높은 친화성 SIRP-α 변이체에 대한 대표적인 교차종 CD47 결합 친화성
K D (M)
서열 번호: 인간 생쥐 쥐
85 2.03x10-10 2.16 x 10-9 1.96 x 10-8
198 1.55 x 10-10 1.41 x 10-9 9.88 x 10-9
199 1.26 x 10-9 1.25 x 10-9 1.07 x 10-8
200 3.04 x 10-10 1.17 x 10-9 1.42 x 10-8
204 6.53 x 10-10 4.48 x 10-10 3.42 x 10-9
205 2.48 x 10-10 5.69 x 10-10 4.28 x 10-9
206 9.67 x 10-10 2.88 x 10-10 1.49 x 10-9
207 1.04 x 10-9 8.80 x 10-10 5.90 x 10-9
208 2.19 x 10-10 8.32 x 10-10 5.17 x 10-9
209 1.01 x 10-9 3.71 x 10-10 2.26 x 10-9
210 1.65 x 10-9 6.12 x 10-10 4.59 x 10-9
136 1.3904 x 10-10 1.1407 x 10-8 6.43 x 10-9
214 2.00 x 10-9 6.30 x 10-8 8.00 x 10-8
215 비결합 비결합 비결합
서열 번호: 215:
EEELQVIQPDKSVLVAAGETATLRCTATSLIPRGPIQWFRGAGPGRELIYNRKEGHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
실시예 18 - 생쥐 이종이식 종양 모형에서 높은 친화성 SIRP-α 구조체의 항종양 활성
면역결핍 NOD scid 감마 (NSG) 생쥐 (NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl /SzJ; 50 암컷, 플러스 스퀘어스)는 6- 내지 10-주령 동물로서 구입되었다. 인간 림프종 세포주 GFP-Luc-Raji 세포는 10% 소 태아 혈청, 페니실린, 스트렙토마이신 및 L-글루타민을 내포하는 RPMI 1640에서 성장되었다. 세포는 이후, 스핀다운되고, 첨가제 없이 혈청 없는 배지에서 1.0 x 107 세포/mL의 농도에서 재현탁되고, 그리고 Matrigel™ (Trevigen, Gaithersburg, MD)과 1:1 합동되었다. -11 일자 (다시 말하면, 예상된 스테이징 일자로부터 11 일전)에, 생쥐는 생쥐마다 200 μL (1.0 x 106 세포)의 새로 제조된 GFP-Luc-Raji:매트리겔 혼합물을 왼쪽 옆구리 내로 피하 주입함으로써 이식되었다. 종양이 거의 55 mm3의 평균 체적에 도달할 때, 확립된 종양 및 중간 체중을 갖는 50마리 동물은 5가지 치료군 (군 1-5, 각각 n=10 생쥐)으로 무작위화되었다. 1 일자에 시작하여, 군 1 내지 5는 각각, (1) 서열 번호: 215 [10 mg/kg (mpk), 3x/주]; (2) 서열 번호: 104 (10 mpk, 3x/주); (3) 리툭시맙 (5 mpk, 2x/주) + 서열 번호: 100 (10 mpk, 3x/주); (4) 리툭시맙 (5 mpk, 2x/주) + 서열 번호: 104 (10 mpk, 3x/주); 또는 (5) 리툭시맙 (5 mpk, 2x/주) + 서열 번호: 215 (10 mpk, 3x/주)로 치료되었다. 용량은 0.05 mL/생쥐에서 복강내 (IP) 주사에 의해 투여되었다. 모든 동물의 경우에, 용량은 스테이징 일자에 시작하여 총 31 일 (1-31 일자) 동안 계속 투여되었다.
임상적 관찰 결과는 하루 2회 (아침 및 저녁) 기록되었다. 추가 조사 결과는 관찰된 대로 기록되었다. 체중은 전자 저울 (Ohaus SCOUT® PRO)을 이용하여 주 3회 계측되었다. 종양 크기는 직각 마이너 (너비, W 및 높이, H) 및 메이저 (길이, L) 치수를 계측하기 위해, 마이크로캘리퍼 (Mitutoyo, Aurora, Illinois)를 이용하여 주 3회 및 연구 완결 시점에서 계측되었다. 종양 체적 (mm3)은 타원체 구체의 체적에 대한 공식 (L x W x H / 2)을 이용하여 계산되었다. 혈액 표본은 1 일자 (기준선; 군 배정에 앞서)에 20마리 동물로부터, 그리고 8 일자 (1 주차) 및 31 일자 (종결 시점)에 모든 동물로부터 뽑혀졌다. 혈액 검체는 채혈의 개별 일자에서 전체 혈구 계산 (CBCs)을 위해 제출되었다.
서열 번호: 215의 SIRP-α 구조체는 CD47에 대한 계측가능한 결합을 전시하지 않는다 (표 28을 참조한다). 서열 번호: 215-투약된 군 (군 1)에서 종양은 동일한 모형의 PBS 운반제 군에서 관찰된 종양 (데이터 제시되지 않음)과 유사하게, 31 일자까지 선형으로 성장하였다 (도면 19a). 이러한 관찰 결과는 효과적인 치료의 부재에서 진행성 종양 성장을 증명한다.
군 1과 5 (리툭시맙이 있거나 또는 없는 서열 번호: 215) 사이에 및 군 2와 4 (리툭시맙이 있거나 또는 없는 서열 번호: 104) 사이에 비교는 이들 조합 치료가 미가공 값 (9 일자로부터) 및 정규화된 값 (7 일자로부터) 둘 모두로서, 종양 체적의 유의미한 약화를 산출했다는 것을 드러낸다. 16 일까지, 군 3 (서열 번호: 100 + 리툭시맙) 및 군 4 (서열 번호: 104 + 리툭시맙)에서 대다수의 생쥐는 검출가능한 종양을 더 이상 품지 않았다; 이들 2가지 조합 치료는 유사한 효력을 보여주었다. 대조적으로, 종양 성장은 18 일자부터 군 5 (서열 번호: 215 + 리툭시맙)의 동물에서 회복하는 것으로 보였다. 연구 기간에 걸쳐 5개 군 모두의 종양 체적 (평균 +/- SEM 및 개별 산점도)은 각각, 도면 19a 및 도면 19b에서 제시된다.
전체 혈구 계산 (CBC) 값 (적혈구, 헤모글로빈, 헤마토크리트, 혈소판 등)은 투약전 (1 일자), 투약 후 1 주 (9 일자) 및 투약 후 4 주 (31 일자)에 계측되었다. 파라미터는 5개 군 사이에서 1 주차 또는 4 주차에 유의미하게 상이하지 않았다. 헤모글로빈 (HGB) 값은 도면 19c에서 도해된다. 이들 결과는 높은 친화성 SIRPα 구조체가 암의 생체내 생쥐 모형에서 종양 성장을 효과적으로 약화시키고 리툭시맙과 협력 작용할 수 있다는 것을 증명한다. 게다가, 항-CD47 기초된 항체 치료와 대조적으로, 높은 친화성 SIRPα 구조체로 치료된 어떤 시험 군에서도 빈혈의 급성 에피소드가 관찰되지 않았다.
실시예 19: SIRP-α Fc 변이체 구조체는 감소된 적혈구 독성을 전시한다
적혈구 상실은 CD47을 표적으로 할 때 우려 사항이다. 적혈구 독성에 대한 SIRP-α Fc 변이체 구조체의 효과를 조사하기 위해, 생쥐는 야생형 IgG1 Fc 구조체 (서열 번호: 216), 또는 IgG1 돌연변이 L234A, L235A, G237A 및 N297A (IgG1_AAA_N297A)를 갖는 IgG1 Fc 변이체 구조체 (서열 번호:96)를 내포하는 높은 친화성 SIRP-α 변이체 구조체로 치료되었다. 생쥐는 6마리의 5개 군에 배정되고, 그리고 (1) PBS; (2) 10 mg/kg 서열 번호: 216 (야생형 IgG1 Fc); (3) 30 mg/kg 서열 번호: 216; (4) 10 mg/kg 서열 번호: 96 (IgG1_AAA_N297A); 또는 (5) 30 mg/kg 서열 번호: 96으로 1 일자 및 7 일자에 치료되었다 (도면 20에서 실선 화살표를 참조한다). 기준선 전체 혈구 계산 (CBC) 계측은 -7 일자에 모든 동물로부터 및 1 일자에 6마리 동물 중에서 3마리로부터 획득되었다. 채혈 (도면 20을 참조한다)은 주당 허용된 채혈의 양을 초과하지 않기 위해, 각 군으로부터 3마리 생쥐 사이에서 교대로 이루어졌다. 도면 20에서 증명된 바와 같이, SIRP-α D1 변이체 구조체를 내포하는 야생형 IgG1로 치료는 적혈구 수치에서 용량 의존성 감소를 유발하였다. 반대로, SIRP-α D1 변이체 구조체를 내포하는 IgG1_AAA_N297A로 치료는 PBS 치료된 대조군과 유사한 적혈구 수치를 유발하였다.
본 발명의 바람직한 구체예가 본원에서 도시되고 설명되긴 했지만, 이런 구체예가 단지 실례로서 제공된다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 다양한 변이, 변화와 치환이 본 발명으로부터 벗어나지 않으면서 당업자에게 발생할 것이다. 본원에서 설명된 발명의 구체예에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는데 이용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 다음 청구항은 발명의 범위를 규정하고, 그리고 이들 청구항의 범위 내에 방법과 구조 및 이들의 등가물이 그것에 의해 커버되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> ALEXO THERAPEUTICS INC. <120> CONSTRUCTS HAVING A SIRP-ALPHA DOMAIN OR VARIANT THEREOF <130> 75797-20004.40 <150> US 62/202,772 <151> 2015-08-07 <150> US 62/202,775 <151> 2015-08-07 <150> US 62/202,779 <151> 2015-08-07 <150> US 62/265,887 <151> 2015-12-10 <150> US 62/276,801 <151> 2016-01-08 <150> US 62/276,796 <151> 2016-01-08 <150> US 62/346,414 <151> 2016-06-06 <160> 223 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu 100 105 110 Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser 115 <210> 2 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Ile Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Glu Ser Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser 100 105 110 Val Arg Ala Lys Pro Ser 115 <210> 3 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu Leu Cys Thr Val Thr Ser Leu Ile Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Glu Ser Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser 100 105 110 Val Arg Ala Lys Pro Ser 115 <210> 4 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Glu Glu Gly Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu 100 105 110 Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser 115 <210> 5 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Phe Val Leu Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu 100 105 110 Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser 115 <210> 6 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Pro Ile Arg Ile Gly Asn 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu 100 105 110 Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser 115 <210> 7 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Ile Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Glu Ser Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser 100 105 110 Val Arg Gly Lys Pro Ser 115 <210> 8 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Glu Ser Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser 100 105 110 Val Arg Ala Lys Pro Ser 115 <210> 9 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Ser Asn 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu 100 105 110 Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser 115 <210> 10 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Ile Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Glu Ser Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser 100 105 110 Val Arg Ala Lys Pro Ser 115 <210> 11 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> E or G <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> S or F <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> L or S <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> T or S <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> T or I <220> <221> MOD_RES <222> (24)..(24) <223> R or H or L <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> A or V <220> <221> MOD_RES <222> (45)..(45) <223> G or A <220> <221> MOD_RES <222> (65)..(65) <223> D or E <220> <221> MOD_RES <222> (66)..(66) <223> L or S <220> <221> MOD_RES <222> (70)..(70) <223> N or E or D <220> <221> MOD_RES <222> (75)..(75) <223> S or P <220> <221> MOD_RES <222> (77)..(77) <223> R or S <220> <221> MOD_RES <222> (79)..(79) <223> G or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (99)..(99) <223> May or may not be present <220> <221> MOD_RES <222> (100)..(100) <223> D or P <220> <221> MOD_RES <222> (102)..(102) <223> V or T <220> <221> MOD_RES <222> (116)..(116) <223> A or G <400> 11 Glu Glu Xaa Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Xaa Val Xaa Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Xaa Ala Xaa Leu Xaa Cys Thr Xaa Thr Ser Leu Ile Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Xaa Arg Glu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Xaa Xaa Thr Lys Arg Xaa Asn Met Asp Phe Xaa Ile Xaa Ile Xaa Asn 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Xaa Asp Xaa Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu 100 105 110 Ser Val Arg Xaa Lys Pro Ser 115 <210> 12 <211> 585 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu 1 5 10 15 Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln 20 25 30 Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu 35 40 45 Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys 50 55 60 Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu 65 70 75 80 Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro 85 90 95 Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu 100 105 110 Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His 115 120 125 Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg 130 135 140 Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg 145 150 155 160 Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala 165 170 175 Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser 180 185 190 Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser 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Gly Ser Pro Asp Thr Glu Xaa Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser 100 105 110 Val Arg Ala Lys Pro Ser 115 <210> 23 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> E or G <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> L or I or V <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> V or L or I <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> S or F <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> L or S <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> S or T <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> A or V <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> I or T <220> <221> MOD_RES <222> (24)..(24) <223> H or R <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> A or V or I or L <220> <221> MOD_RES <222> (31)..(31) <223> I or T or S or F <220> <221> MOD_RES <222> (45)..(45) <223> A or G <220> <221> MOD_RES <222> (47)..(47) <223> E or V or L <220> <221> MOD_RES <222> (53)..(53) <223> K or R <220> <221> MOD_RES <222> (54)..(54) <223> E or Q <220> <221> MOD_RES <222> (56)..(56) <223> H or P or R <220> <221> MOD_RES <222> (65)..(65) <223> D or E <220> <221> MOD_RES <222> (66)..(66) <223> S or L or T or G <220> <221> MOD_RES <222> (68)..(68) <223> K or R <220> <221> MOD_RES <222> (70)..(70) <223> E or D <220> <221> MOD_RES <222> (75)..(75) <223> S or P <220> <221> MOD_RES <222> (77)..(77) <223> S or R <220> <221> MOD_RES <222> (79)..(79) <223> S or G <220> <221> MOD_RES <222> (92)..(92) <223> V or I <220> <221> MOD_RES <222> (94)..(94) <223> F or L or V <220> <221> MOD_RES <222> (101)..(101) <223> May or may not be present <220> <221> MOD_RES <222> (102)..(102) <223> T or V <220> <221> MOD_RES <222> (104)..(104) <223> F or V <220> <221> MOD_RES <222> (116)..(116) <223> A or G <400> 23 Glu Glu Xaa Xaa Gln Xaa Ile Gln Pro Asp Lys Xaa Val Xaa Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Cys Thr Xaa Thr Ser Leu Xaa Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Xaa Arg Xaa Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln 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Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> E or G <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> L or I or V <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> V or L or I <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> S or F <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> L or S <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> S or T <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> A or V <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> I or T <220> <221> MOD_RES <222> (24)..(24) <223> H or R or L <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> A or V or I or L <220> <221> MOD_RES <222> (31)..(31) <223> I or T or S or F <220> <221> MOD_RES <222> (45)..(45) <223> A or G <220> <221> MOD_RES <222> (47)..(47) <223> E or V or L <220> <221> MOD_RES <222> (53)..(53) <223> K or R <220> <221> MOD_RES <222> (54)..(54) <223> E or Q <220> <221> MOD_RES <222> (56)..(56) <223> H or P or R <220> <221> MOD_RES <222> (65)..(65) <223> D or E <220> <221> MOD_RES <222> (66)..(66) <223> S or L or T or G <220> <221> MOD_RES <222> 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Sequence: Synthetic polypeptide <400> 65 Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Phe Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Arg Glu Gly Pro Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Glu Ser Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser 100 105 110 Val Arg Ala Lys Pro Ser 115 <210> 66 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 66 Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Ile Thr Ser Leu Phe Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Arg Glu Gly Pro Phe Pro Arg Val Thr Thr Val 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<220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 68 Glu Glu Glu Leu Gln Ile Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Ile Thr Ser Leu Phe Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Arg Glu Gly Pro Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Glu Ser Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser 100 105 110 Val Arg Ala Lys Pro Ser 115 <210> 69 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 69 Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Ile Thr Ser Leu Ile Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Arg 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Synthetic peptide <400> 167 Gly Ser Gly Ser Gly Ser 1 5 <210> 168 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 168 Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser 1 5 <210> 169 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 169 Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser 1 5 10 <210> 170 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 170 Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser 1 5 10 <210> 171 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 171 Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 <210> 172 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 172 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 <210> 173 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 173 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 174 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 174 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 <210> 175 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 175 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 <210> 176 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 176 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 177 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 177 Ala Ala Ser 1 <210> 178 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 178 Ala Ala Ala Leu 1 <210> 179 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial 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Synthetic polypeptide <400> 205 Glu Glu Glu Leu Gln Ile Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ile Thr Ser Leu Arg Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Arg Glu Gly Pro Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Asp Thr Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Ala 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ile Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu 100 105 110 Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser 115 <210> 206 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 206 Glu Glu Glu Leu Gln Ile Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ile Thr Ser Leu Arg Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Arg Asp Gly Pro Phe Pro Arg Val Thr Thr Val 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 208 Glu Glu Glu Leu Gln Ile Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ile Thr Ser Leu Tyr Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Arg Glu Gly Pro Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Asp Thr Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Ala 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ile Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu 100 105 110 Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser 115 <210> 209 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 209 Glu Glu Glu Leu Gln Ile Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ile Thr Ser Leu Tyr Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu 35 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MOD_RES <222> (27)..(27) <223> V or I or L <220> <221> MOD_RES <222> (31)..(31) <223> I or T or S or F <220> <221> MOD_RES <222> (53)..(53) <223> K or R <220> <221> MOD_RES <222> (56)..(56) <223> H or P or R <220> <221> MOD_RES <222> (66)..(66) <223> S or T or G <220> <221> MOD_RES <222> (80)..(80) <223> A <400> 212 Glu Glu Glu Leu Gln Xaa Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Xaa Thr Ser Leu Xaa Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Xaa Glu Gly Xaa Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Glu Xaa Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Xaa 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser 100 105 110 Val Arg Ala Lys Pro Ser 115 <210> 213 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 213 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Synthetic polypeptide <400> 217 Glu Glu Glu Leu Gln Ile Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ile Thr Ser Leu Phe Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Arg Glu Gly Pro Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Asp Thr Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Ala 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu 100 105 110 Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Glu Lys Thr His Thr Cys Pro Glu Cys 115 120 125 Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 130 135 140 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 145 150 155 160 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 165 170 175 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 180 185 190 Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 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35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Xaa Xaa Gly Xaa Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Asp Xaa Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn 65 70 75 80 Ile Thr Xaa Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Xaa Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu 100 105 110 Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser 115 <210> 220 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 220 Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn 20 25 30 Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 221 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> V or L or I <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> V or I or L <220> <221> MOD_RES <222> (31)..(31) <223> I or T or S or F <220> <221> MOD_RES <222> (53)..(53) <223> K or R <220> <221> MOD_RES <222> (56)..(56) <223> H or P or R <220> <221> MOD_RES <222> (66)..(66) <223> S or T or G <220> <221> MOD_RES <222> (80)..(80) <223> N or A <400> 221 Glu Glu Glu Leu Gln Xaa Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Xaa Thr Ser Leu Xaa Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Xaa Glu Gly Xaa Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Glu Xaa Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Xaa 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser 100 105 110 Val Arg Ala Lys Pro Ser 115 <210> 222 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag <400> 222 His His His His His His 1 5 <210> 223 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 10xHis tag <400> 223 His His His His His His His His His His 1 5 10

Claims (156)

  1. 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 80에서 아미노산 돌연변이; 및 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 6, 잔기 27, 잔기 31, 잔기 47, 잔기 53, 잔기 54, 잔기 56, 잔기 66 및 잔기 92로 구성된 군에서 선택되는 잔기에서 최소한 하나의 추가 아미노산 돌연변이를 갖는 SIRP-α D1 도메인을 포함하는 신호-조절 단백질 α (SIRP-α) D1 변이체, 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드.
  2. 청구항 1에 있어서, 야생형 SIRP-α D1 도메인은 서열 번호: 1-10 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  3. 청구항 1에 있어서, SIRP-α D1 도메인은 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 잔기 6, 잔기 27, 잔기 31, 잔기 47, 잔기 53, 잔기 54, 잔기 56, 잔기 66 및 잔기 92로 구성된 군에서 선택되는 잔기에서 1개 내지 9개의 추가 아미노산 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  4. 청구항 1에 있어서, SIRP-α D1 변이체는 아미노산 서열,
    EEELQX1IQPDKSVLVAAGETATLRCTX2TSLX3PVGPIQWFRGAGPGRX4LIYNQX5X6GX7FPRVTTVSDX8TKRNNMDFSIRIGX9ITPADAGTYYCX10KFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS (서열 번호: 49)를 포함하고, 여기서 X1은 V, L, 또는 I이고; X2는 A, I, V, 또는 L이고; X3은 I, F, S, 또는 T이고; X4는 E, V, 또는 L이고; X5는 K 또는 R이고; X6은 E 또는 Q이고; X7은 H, P, 또는 R이고; X8은 L, T, S, 또는 G이고; X9는 A이고; 그리고 X10은 V 또는 I이고; 그리고 여기서 상기 SIRP-α D1 변이체는 서열 번호: 1에 따른 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 최소한 2개의 아미노산 치환을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  5. 청구항 4에 있어서, SIRP-α D1 변이체는 서열 번호: 78-85 중에서 한 가지에 따른 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  6. 청구항 1에 있어서, SIRP-α D1 변이체는 아미노산 서열,
    EEELQX1IQPDKSVLVAAGETATLRCTX2TSLX3PVGPIQWFRGAGPGRX4LIYNQX5X6GX7FPRVTTVSDX8TKRNNMDFSIRIGX9X10X11X12ADAGTYYCX13KFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS (서열 번호: 218)를 포함하고, 여기서 X1은 V, L, 또는 I이고; X2는 A, V, L, 또는 I이고; X3은 I, S, T, 또는 F이고; X4는 E, L, 또는 V이고; X5는 K 또는 R이고; X6은 E 또는 Q이고; X7은 H, R, 또는 P이고; X8은 S, G, L, 또는 T이고; X9는 임의의 아미노산이고; X10은 임의의 아미노산이고; X11은 임의의 아미노산이고; X12는 임의의 아미노산이고; 그리고 X13은 V 또는 I이고; 그리고 여기서 상기 SIRP-α D1 변이체는 서열 번호: 1에 따른 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 최소한 2개의 아미노산 치환을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  7. 청구항 6에 있어서, X9는 A인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  8. 청구항 6에 있어서, X9는 N인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  9. 청구항 6에 있어서, X10은 I인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  10. 청구항 6에 있어서, X9는 N이고 X10은 P인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  11. 청구항 6에 있어서, X9는 N이고 X11은 S, T, 또는 C 이외에 임의의 아미노산인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  12. 청구항 6에 있어서, X11은 T인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  13. 청구항 6에 있어서, X11은 T 이외의 아미노산인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  14. 청구항 6에 있어서, X12는 P인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  15. 청구항 6에 있어서, X9는 N이고 X12는 P 이외에 임의의 아미노산인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  16. 청구항 1에 있어서, SIRP-α D1 변이체는 아미노산 서열,
    EEELQX1IQPDKSVLVAAGETATLRCTX2TSLX3PVGPIQWFRGAGPGRX4LIYNQX5X6GX7FPRVTTVSDX8TKRNNMDFSIRIGX9ITX10ADAGTYYCX11KFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS (서열 번호: 219)를 포함하고, 여기서 X1은 V, L, 또는 I이고; X2는 A, V, L, 또는 I이고; X3은 I, S, T, 또는 F이고; X4는 E, L, 또는 V이고; X5는 K 또는 R이고; X6은 E 또는 Q이고; X7은 H, R, 또는 P이고; X8은 S, G, L, 또는 T이고; X9는 N이고; X10은 P 이외에 임의의 아미노산이고; 그리고 X11은 V 또는 I이고; 그리고 여기서 상기 SIRP-α D1 변이체는 서열 번호: 1에 따른 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 최소한 2개의 아미노산 치환을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  17. 청구항 1에 있어서, SIRP-α D1 변이체는 아미노산 서열,
    EEELQX1IQPDKSVLVAAGETATLRCTX2TSLX3PVGPIQWFRGAGPGRELIYNQX4EGX5FPRVTTVSDX6TKRNNMDFSIRIGX7ITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS (서열 번호: 52)를 포함하고, 여기서 X1은 V, L, 또는 I이고; X2는 A, I, 또는 L이고; X3은 I, T, S, 또는 F이고; X4는 K 또는 R이고; X5는 H, P, 또는 R이고; X6은 L, T, 또는 G이고; 그리고 X7은 A이고; 그리고 여기서 상기 SIRP-α D1 변이체는 서열 번호: 1에 따른 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 최소한 2개의 아미노산 치환을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  18. 청구항 17에 있어서, X1은 V 또는 I이고, X2는 A 또는 I이고, X3은 I 또는 F이고, X4는 K 또는 R이고, X5는 H 또는 P이고, X6은 L 또는 T이고, 그리고 X7은 A인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  19. 청구항 17에 있어서, SIRP-α D1 변이체는 서열 번호: 1에 따른 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 최소한 3개의 아미노산 치환을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  20. 청구항 17에 있어서, SIRP-α D1 변이체는 서열 번호: 1에 따른 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 최소한 4개의 아미노산 치환을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  21. 청구항 17에 있어서, SIRP-α D1 변이체는 서열 번호: 1에 따른 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 최소한 5개의 아미노산 치환을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  22. 청구항 17에 있어서, SIRP-α D1 변이체는 서열 번호: 1에 따른 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 최소한 6개의 아미노산 치환을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  23. 청구항 17에 있어서, SIRP-α D1 변이체는 서열 번호: 1에 따른 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 최소한 7개의 아미노산 치환을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  24. 청구항 17에 있어서, X1은 I인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  25. 청구항 17에 있어서, X2는 I인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  26. 청구항 17에 있어서, X3은 F인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  27. 청구항 17에 있어서, X4는 R인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  28. 청구항 17에 있어서, X5는 P인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  29. 청구항 17에 있어서, X6은 T인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  30. 청구항 17에 있어서, X1, X2, X3, X4, X5 및 X6 각각은 야생형 아미노산이 아닌 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  31. 청구항 17에 있어서, SIRP-α D1 변이체는 서열 번호: 81-85 중에서 한 가지에 따른 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  32. 청구항 1에 있어서, SIRP-α D1 변이체는 아미노산 서열,
    EEELQX1IQPDKSVSVAAGESAILHCTX2TSLX3PVGPIQWFRGAGPARELIYNQX4EG X5FPRVTTVSEX6TKRENMDFSISISX7ITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPS (서열 번호: 212)를 포함하고, 여기서 X1은 V, L, 또는 I이고; X2는 V, I, 또는 L이고; X3은 I, T, S, 또는 F이고; X4는 K 또는 R이고; X5는 H, P, 또는 R이고; X6은 S, T, 또는 G이고; 그리고 X7은 A이고; 그리고 여기서 상기 SIRP-α D1 변이체는 서열 번호: 2의 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 최소한 2개의 아미노산 치환을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  33. 청구항 1에 있어서, 폴리펩티드는 약 5 x 10 -9 M보다 적은 KD로 인간 CD47에 결합하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  34. 청구항 1에 있어서, 폴리펩티드의 N 말단 또는 C 말단에 연결된 Fc 도메인 단위체를 더욱 포함하고, 여기서 상기 Fc 도메인 단위체는 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4 Fc 영역인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  35. 청구항 34에 있어서, Fc 도메인 단위체는 야생형 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4 Fc 영역에 비하여 최소한 하나의 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  36. 청구항 35에 있어서, 폴리펩티드는 서열 번호: 135, 서열 번호: 136, 또는 서열 번호: 137 중에서 한 가지의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  37. 청구항 35에 있어서, Fc 도메인 단위체는 (a) 야생형 인간 IgG1에 비하여 다음의 아미노산 치환 중에서 한 가지: T366W, T366S, L368A, Y407V, T366Y, T394W, F405W, Y349T, Y349E, Y349V, L351T, L351H, L351N, L351K, P353S, S354D, D356K, D356R, D356S, E357K, E357R, E357Q, S364A, T366E, L368T, L368Y, L368E, K370E, K370D, K370Q, K392E, K392D, T394N, P395N, P396T, V397T, V397Q, L398T, D399K, D399R, D399N, F405T, F405H, F405R, Y407T, Y407H, Y407I, K409E, K409D, K409T, 또는 K409I; 또는
    (b) (i) 인간 IgG1 Fc 영역에 비하여 N297A 돌연변이; (ii) 인간 IgG1 Fc 영역에 비하여 L234A, L235A 및 G237A 돌연변이; (iii) 인간 IgG1 Fc 영역에 비하여 L234A, L235A, G237A 및 N297A 돌연변이; (iv) 인간 IgG2 Fc 영역에 비하여 N297A 돌연변이; (v) 인간 IgG2 Fc 영역에 비하여 A330S 및 P331S 돌연변이; (vi) 인간 IgG2 Fc 영역에 비하여 A330S, P331S 및 N297A 돌연변이; (vii) 인간 IgG4 Fc 영역에 비하여 S228P, E233P, F234V, L235A 및 delG236 돌연변이; 또는 (viii) 인간 IgG4 Fc 영역에 비하여 S228P, E233P, F234V, L235A, delG236 및 N297A 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  38. 청구항 35에 있어서, 폴리펩티드는 야생형 인간 IgG Fc 영역을 갖는 폴리펩티드와 비교하여 식균작용 검정에서 식균작용의 감소를 전시하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  39. 청구항 35에 있어서, Fc 도메인 단위체는 두 번째 Fc 도메인 단위체를 포함하는 두 번째 폴리펩티드에 연결되어 Fc 도메인 이합체를 형성하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  40. 청구항 39에 있어서, 두 번째 Fc 도메인 단위체는 추가 폴리펩티드에 연결되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  41. 청구항 40에 있어서, 추가 폴리펩티드는 항체 가변 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  42. 청구항 41에 있어서, 항체 가변 도메인은 세포에서 발현된 항원을 표적으로 하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  43. 청구항 42에 있어서, 세포는 암 세포인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  44. 청구항 43에 있어서, 항체 가변 도메인은 면역 세포 조절에 관련된 세포 표면 단백질을 표적으로 하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  45. 청구항 40에 있어서, 추가 폴리펩티드는 치료적 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  46. 청구항 45에 있어서, 치료적 단백질은 사이토킨, 인터류킨, 항원, 스테로이드, 항염증제, 또는 면역조정제인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  47. 청구항 45에 있어서, 추가 폴리펩티드는 SIRP-α D1 변이체를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  48. 청구항 1에 있어서, 인간 혈청 알부민 (HSA) (서열 번호: 12)을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  49. 청구항 48에 있어서, HSA는 서열 번호: 12에 비하여 C34S 또는 K573P 아미노산 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  50. 청구항 48에 있어서, 폴리펩티드는 서열 번호: 152-159 중에서 한 가지에 따른 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  51. 청구항 1에 있어서, 알부민 결합 펩티드를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  52. 청구항 51에 있어서, 알부민 결합 펩티드는 아미노산 서열 DICLPRWGCLW (서열 번호: 160)를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  53. 청구항 1에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 중합체를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  54. 청구항 53에 있어서, PEG 중합체는 폴리펩티드 내에 시스테인 치환에 연결되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  55. 다음을 포함하는 폴리펩티드:
    (a) 신호-조절 단백질 α (SIRP-α) D1 변이체, 여기서 상기 SIRP-α D1 변이체는 아미노산 서열,
    EEX1X2QX3IQPDKX4VX5VAAGEX6X7X8LX9CTX10TSLX11PVGPIQWFRGAGPX12RX13LIYNQX14X15GX16FPRVTTVSX17X18TX19RX20NMDFX21IX22IX23X24ITX25ADAGTYYCX26KX27RKGSPDX28X29EX30KSGAGTELSVRX31KPS (서열 번호: 47)를 포함하고, 여기서 X1은 E 또는 G이고; X2는 L, I, 또는 V이고; X3은 V, L, 또는 I이고; X4는 S 또는 F이고; X5는 L 또는 S이고; X6은 S 또는 T이고; X7은 A 또는 V이고; X8은 I 또는 T이고; X9는 H, R, 또는 L이고; X10은 A, V, I, 또는 L이고; X11은 I, T, S, 또는 F이고; X12는 A 또는 G이고; X13은 E, V, 또는 L이고; X14는 K 또는 R이고; X15는 E 또는 Q이고; X16은 H, P, 또는 R이고; X17은 D 또는 E이고; X18은 S, L, T, 또는 G이고; X19는 K 또는 R이고; X20은 E 또는 N이고; X21은 S 또는 P이고; X22는 S 또는 R이고; X23은 S 또는 G이고; X24는 임의의 아미노산이고; X25는 임의의 아미노산이고; X26은 V 또는 I이고; X27은 F, L 또는 V이고; X28은 D 또는 부재하고; X29는 T 또는 V이고; X30은 F 또는 V이고; 그리고 X31은 A 또는 G이고; 그리고 여기서 상기 SIRP-α D1 변이체는 서열 번호: 1 내지 10 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는 야생형 SIRP-α D1 도메인에 비하여 최소한 2개의 아미노산 치환을 갖고; 그리고
    (b) 2개의 Fc 도메인 단위체를 갖는 Fc 도메인 이합체를 포함하는 Fc 변이체, 여기서 각 Fc 도메인 단위체는 독립적으로 (i) N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG1 Fc 영역; (ii) L234A, L235A 및 G237A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG1 Fc 영역; (iii) L234A, L235A, G237A 및 N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG1 Fc 영역; (iv) N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG2 Fc 영역; (v) A330S 및 P331S 돌연변이를 포함하는 인간 IgG2 Fc 영역; (vi) A330S, P331S 및 N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG2 Fc 영역; (vii) S228P, E233P, F234V, L235A 및 delG236 돌연변이를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역; 또는 (viii) S228P, E233P, F234V, L235A, delG236 및 N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  56. 청구항 55에 있어서, Fc 도메인 이합체 내에 Fc 도메인 단위체 중에서 한 가지는 L234A, L235A, G237A 및 N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG1 Fc 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  57. 청구항 55에 있어서, 폴리펩티드는 서열 번호: 98-104, 107-113, 116-122, 또는 135-137 중에서 한 가지에 따른 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  58. 청구항 55에 있어서, Fc 변이체는 인간 IgG Fc 영역의 야생형 버전과 비교하여 Fcγ 수용체에 제거된 또는 감소된 결합을 전시하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  59. 청구항 55에 있어서, IgG1 또는 IgG2 Fc 변이체는 인간 IgG1 또는 IgG2 Fc 영역의 야생형 버전과 비교하여 CD16a, CD32a, CD32b, CD32c 및 CD64 Fcγ 수용체에 제거된 또는 감소된 결합을 전시하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  60. 청구항 55에 있어서, IgG4 Fc 변이체는 인간 IgG4 Fc 영역의 야생형 버전과 비교하여 CD16a 및 CD32b Fcγ 수용체에 제거된 또는 감소된 결합을 전시하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  61. 청구항 55에 있어서, IgG1 또는 IgG2 Fc 변이체는 인간 IgG1 또는 IgG2 Fc 융합의 야생형 버전과 비교하여 C1q에 제거된 또는 감소된 결합을 전시하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  62. 청구항 55에 있어서, Fc 변이체는 약 5 x 10-6 M보다 큰 KD로 Fcγ 수용체에 결합하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  63. Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드, 여기서 상기 Fc 변이체는 2개의 Fc 도메인 단위체를 갖는 Fc 도메인 이합체를 포함하고, 여기서 각 Fc 도메인 단위체는 독립적으로 (i) 돌연변이 L234A, L235A, G237A 및 N297A로 구성되는 인간 IgG1 Fc 영역; (ii) 돌연변이 A330S, P331S 및 N297A로 구성되는 인간 IgG2 Fc 영역; 또는 (iii) 돌연변이 S228P, E233P, F234V, L235A, delG236 및 N297A를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역에서 선택됨.
  64. 청구항 63에 있어서, 2개의 Fc 도메인 단위체는 동일한 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  65. 청구항 63에 있어서, Fc 도메인 단위체 중에서 최소한 하나는 돌연변이 L234A, L235A, G237A 및 N297A로 구성되는 인간 IgG1 Fc 영역인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  66. 청구항 63에 있어서, Fc 도메인 단위체 중에서 최소한 하나는 돌연변이 A330S, P331S 및 N297A로 구성되는 인간 IgG2 Fc 영역인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  67. 청구항 63에 있어서, Fc 변이체는 인간 IgG Fc 영역의 야생형 버전과 비교하여 Fcγ 수용체에 제거된 또는 감소된 결합을 전시하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  68. 청구항 67에 있어서, Fc 변이체는 인간 IgG Fc 영역의 야생형 버전과 비교하여 CD16a, CD32a, CD32b, CD32c 및 CD64 Fcγ 수용체에 제거된 또는 감소된 결합을 전시하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  69. 청구항 63에 있어서, Fc 변이체는 인간 IgG Fc 융합의 야생형 버전과 비교하여 C1q에 제거된 또는 감소된 결합을 전시하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  70. 청구항 63에 있어서, Fc 도메인 단위체 중에서 최소한 하나는 돌연변이 S228P, E233P, F234V, L235A, delG236 및 N297A를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  71. 청구항 70에 있어서, Fc 변이체는 야생형 인간 IgG4 Fc 영역과 비교하여 Fcγ 수용체에 제거된 또는 감소된 결합을 전시하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  72. 청구항 71에 있어서, Fc 변이체는 이의 인간 IgG4 Fc 영역의 야생형 버전과 비교하여 CD16a 및 CD32b Fcγ 수용체에 제거된 또는 감소된 결합을 전시하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  73. 청구항 63에 있어서, Fc 변이체는 약 5 x 10-6 M보다 큰 KD로 Fcγ 수용체에 결합하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  74. 청구항 63에 있어서, CD47 결합 폴리펩티드를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  75. 청구항 74에 있어서, Fc 변이체는 인간 IgG Fc 영역의 야생형 버전과 비교하여 Fcγ 수용체에 제거된 또는 감소된 결합을 전시하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  76. 청구항 74에 있어서, CD47 결합 폴리펩티드는 설치류 및 비인간 영장류에서 급성 빈혈을 유발하지 않는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  77. 청구항 74에 있어서, CD47 결합 폴리펩티드는 인간에서 급성 빈혈을 유발하지 않는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  78. 청구항 74에 있어서, CD47 결합 폴리펩티드는 신호-조절 단백질 α (SIRP-α) 폴리펩티드 또는 이의 단편인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  79. 청구항 78에 있어서, SIRP-α 폴리펩티드는 다음의 아미노산 서열을 포함하는 SIRP-α D1 변이체를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드:
    EEELQX1IQPDKSVLVAAGETATLRCTX2TSLX3PVGPIQWFRGAGPGRX4LIYNQX5EGX6FPRVTTVSDX7TKRNNMDFSIRIGX8ITPADAGTYYCX9KFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS (서열 번호: 51), 여기서 X1은 V 또는 I이고; X2는 A 또는 I이고; X3은 I 또는 F이고; X4는 E 또는 V이고; X5는 K 또는 R이고; X6은 H 또는 P이고; X7은 L 또는 T이고; X8은 N 이외에 임의의 아미노산이고; 그리고 X9는 V 또는 I임.
  80. 청구항 79에 있어서, SIRP-α 폴리펩티드는 SIRP-α D1 변이체를 포함하고, 여기서 X1은 V 또는 I이고; X2는 A 또는 I이고; X3은 I 또는 F이고; X4는 E이고; X5는 K 또는 R이고; X6은 H 또는 P이고; X7은 L 또는 T이고; X8은 N이 아니고; 그리고 X9는 V인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  81. 다음을 포함하는 폴리펩티드: 신호-조절 단백질 α (SIRP-α) D1 변이체, 여기서 상기 SIRP-α D1 변이체는 비자연발생 높은 친화성 SIRP-α D1 도메인이고, 여기서 상기 SIRP-α D1 변이체는 인간 CD47에 결합하는 자연발생 SIRP-α D1 도메인의 친화성보다 최소한 10배 큰 친화성으로 인간 CD47에 결합하고; 그리고 Fc 도메인 단위체, 여기서 상기 Fc 도메인 단위체는 두 번째 Fc 도메인 단위체를 포함하는 두 번째 폴리펩티드에 연결되어 Fc 도메인을 형성하고, 여기서 상기 Fc 도메인은 제거된 또는 감소된 작동체 기능 및 제거된 또는 감소된 C1q 결합을 가짐.
  82. 청구항 81에 있어서, 비자연발생 높은 친화성 SIRP-α D1 도메인은 잔기 80에서 아미노산 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  83. 신호-조절 단백질 α (SIRP-α) D1 변이체를 포함하는 폴리펩티드, 여기서 상기 SIRP-α D1 변이체는 250 nM보다 적은 KD로 첫 번째 종으로부터 CD47에 결합하고; 그리고 여기서 상기 SIRP-α D1 변이체는 250 nM보다 적은 KD로 두 번째 종으로부터 CD47에 결합하고; 그리고 첫 번째 종으로부터 CD47에 대한 KD 및 두 번째 종으로부터 CD47에 대한 KD는 서로의 100 배 범위 안에 있고; 여기서 첫 번째 종 및 두 번째 종은 인간, 설치류 및 비인간 영장류로 구성된 군에서 선택됨.
  84. 청구항 83에 있어서, SIRP-α D1 변이체는 최소한 3가지 상이한 종으로부터 CD47에 결합하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  85. 청구항 83에 있어서, 비인간 영장류는 시노몰구스 원숭이인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  86. 다음을 포함하는 폴리펩티드: (a) 250 nM보다 적은 KD로 인간 CD47에 결합하는 신호-조절 단백질 α (SIRP-α) D1 도메인; 및 (b) SIRP-α D1 도메인의 N 말단 또는 C 말단에 연결된 Fc 도메인 단위체, 여기서 상기 폴리펩티드는 설치류 및 비인간 영장류에서 급성 빈혈을 유발하지 않음.
  87. 청구항 86에 있어서, 폴리펩티드는 인간 SIRP-α D1 도메인의 비자연발생 변이체인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  88. 청구항 86에 있어서, 폴리펩티드의 생체내 투여는 투여 후 첫 번째 주 동안 50%보다 적게 헤모글로빈 감소를 유발하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  89. 청구항 86에 있어서, 인간에서 폴리펩티드의 투여는 투여 후 첫 번째 주 동안 50%보다 적게 헤모글로빈 감소를 유발하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  90. 청구항 83에 있어서, 최소한 하나의 Fc 변이체를 더욱 포함하고, 여기서 상기 Fc 변이체는 (i) 돌연변이 L234A, L235A, G237A 및 N297A로 구성되는 인간 IgG1 Fc 영역; (ii) 돌연변이 A330S, P331S 및 N297A로 구성되는 인간 IgG2 Fc 영역; 또는 (iii) 돌연변이 S228P, E233P, F234V, L235A, delG236 및 N297A를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역에서 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  91. 청구항 90에 있어서, Fc 변이체는 돌연변이 L234A, L235A, G237A 및 N297A로 구성되는 인간 IgG1 Fc 영역인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  92. 청구항 90에 있어서, Fc 변이체는 돌연변이 A330S, P331S 및 N297A로 구성되는 인간 IgG2 Fc 영역인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  93. 청구항 90에 있어서, Fc 변이체는 돌연변이 S228P, E233P, F234V, L235A, delG236 및 N297A를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  94. 질환 또는 장애를 앓는 개체를 치료하는 방법에 있어서, 상기 방법은 청구항 1 내지 93 중에서 어느 한 항의 폴리펩티드를 상기 개체에 투여하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  95. 청구항 94에 있어서, 질환 또는 장애는 암, 자가면역 질환, 또는 염증성 질환인 것을 특징으로 하는 방법.
  96. 청구항 94에 있어서, 질환 또는 장애는 암이고, 그리고 상기 암은 고형 종양 암, 혈액암, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 다발성 골수종, 방광암, 췌장암, 자궁경부암, 자궁내막암, 폐암, 기관지암, 간암, 난소암, 결장 및 직장암, 위암, 위암, 담낭암, 위장관 간질성 종양 암, 갑상선암, 두경부암, 구인두암, 식도암, 흑색종, 비흑색종 피부암, 메르켈 세포 암종, 바이러스로 유도된 암, 신경모세포종, 유방암, 전립선암, 신장암, 신장 세포 암, 신우 암, 백혈병, 림프종, 육종, 신경교종, 뇌 종양 및 암종에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  97. 청구항 94에 있어서, 질환 또는 장애는 자가면역 질환 또는 염증성 질환이고, 그리고 상기 자가면역 질환 또는 염증성 질환은 다발성 경화증, 류마티스성 관절염, 척추관절병증, 전신성 홍반성 루푸스, 항체-매개된 염증성 또는 자가면역 질환, 이식편 대 숙주 질환, 패혈증, 당뇨병, 건선, 죽상경화증, 쇼그렌 증후군, 진행성 전신 경화증, 경피증, 급성 관상 증후군, 허혈성 재관류, 크론병, 자궁내막증, 사구체신염, 중증 근무력증, 특발성 폐섬유증, 천식, 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 혈관염 및 염증성 자가면역 근염에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  98. 청구항 94에 있어서, SIRP-α D1 변이체는 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159.
  99. 청구항 98에 있어서, 최소한 하나의 추가 작용제의 투여를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  100. 청구항 99에 있어서, 최소한 하나의 추가 작용제는 항체, 종양 연관된 항원, 또는 비항체 치료제인 것을 특징으로 하는 방법.
  101. 청구항 100에 있어서, 최소한 2개의 추가 작용제가 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  102. 청구항 101에 있어서, 최소한 2개의 추가 작용제는 2개의 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  103. 청구항 101에 있어서, 최소한 2개의 추가 작용제는 항체 및 종양 연관된 항원을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  104. 청구항 100에 있어서, 최소한 하나의 추가 작용제는 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  105. 청구항 104에 있어서, 항체는 인간 IgG1 아이소타입 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  106. 청구항 104에 있어서, 항체는 인간 IgG2 아이소타입 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  107. 청구항 104에 있어서, 항체는 인간 IgG4 아이소타입 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  108. 청구항 104에 있어서, 항체는 항-HER2 항체, 항-CD20 항체, 항-CD19 항체, 항-CS1 항체, 항-CD38 항체, 항-EGFR 항체, 항-PD1 항체, 항-OX40 항체, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-RANKL 항체, 항-CD274 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-CD137 항체, 항-4-1BB 항체, 항-B7-H3 항체, 항-FZD7 항체, 항-CD27 항체, 항-CCR4 항체, 항-CD38 항체, 항-CSF1R 항체, 항-CSF 항체, 항-CD30 항체, 항-BAFF 항체, 항-VEGF 항체, 또는 항-VEGFR2 항체에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  109. 청구항 108에 있어서, 항체는 항-HER2 항체, 항-CD20 항체, 항-CD19 항체, 항-CS1 항체, 항-CD38 항체, 항-PD-1 항체, 항-RANKL 항체, 또는 항-PD-L1 항체에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  110. 청구항 104에 있어서, 최소한 하나의 추가 작용제는 최소한 하나의 항체이고, 그리고 상기 항체는 세툭시맙, 네시투무맙, 펨브로리주맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, MEDI0680, MED16469, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MEDI6383, RG7888, 이플리무맙, 트레멜리무맙, 우렐루맙, PF-05082566, 에노블리투주맙, 반틱투맙, 바릴루맙, 모가말리주맙, SAR650984, 다라투무맙, 트라스투주맙, 트라스투주맙 엠탄신, 페르투주맙, 엘로투주맙, 리툭시맙, 오파투무맙, 오비누투주맙, RG7155, FPA008, 파니투무맙, 브렌툭시맙 베도틴, MSB0010718C, 벨리무맙, 베바시주맙, 데노수맙, 파니투무맙, 라무시루맙, 네시투무맙, 니볼루맙, 펨브로리주맙, 아벨루맙, 아테졸리주맙, 더발루맙, MEDI0680, 피딜리주맙, 또는 BMS-93659에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  111. 청구항 110에 있어서, 항체는 트라스투주맙인 것을 특징으로 하는 방법.
  112. 청구항 111에 있어서, SIRP-α D1 변이체는 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159.
  113. 청구항 110에 있어서, 항체는 리툭시맙인 것을 특징으로 하는 방법.
  114. 청구항 113에 있어서, SIRP-α D1 변이체는 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159.
  115. 청구항 110에 있어서, 항체는 세툭시맙인 것을 특징으로 하는 방법.
  116. 청구항 115에 있어서, SIRP-α D1 변이체는 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159.
  117. 청구항 110에 있어서, 항체는 다라투무맙인 것을 특징으로 하는 방법.
  118. 청구항 117에 있어서, SIRP-α D1 변이체는 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159.
  119. 청구항 110에 있어서, 항체는 벨리무맙인 것을 특징으로 하는 방법.
  120. 청구항 119에 있어서, SIRP-α D1 변이체는 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159.
  121. 청구항 110에 있어서, 항체는 베바시주맙인 것을 특징으로 하는 방법.
  122. 청구항 121에 있어서, SIRP-α D1 변이체는 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159.
  123. 청구항 110에 있어서, 항체는 데노수맙인 것을 특징으로 하는 방법.
  124. 청구항 123에 있어서, SIRP-α D1 변이체는 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159.
  125. 청구항 110에 있어서, 항체는 판티무맙인 것을 특징으로 하는 방법.
  126. 청구항 125에 있어서, SIRP-α D1 변이체는 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159.
  127. 청구항 110에 있어서, 항체는 라무시루맙인 것을 특징으로 하는 방법.
  128. 청구항 127에 있어서, SIRP-α D1 변이체는 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159.
  129. 청구항 110에 있어서, 항체는 네시투무맙인 것을 특징으로 하는 방법.
  130. 청구항 129에 있어서, SIRP-α D1 변이체는 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159.
  131. 청구항 110에 있어서, 항체는 니볼루맙인 것을 특징으로 하는 방법.
  132. 청구항 131에 있어서, SIRP-α D1 변이체는 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159.
  133. 청구항 110에 있어서, 항체는 펨브로리주맙인 것을 특징으로 하는 방법.
  134. 청구항 133에 있어서, SIRP-α D1 변이체는 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159.
  135. 청구항 110에 있어서, 항체는 아벨루맙인 것을 특징으로 하는 방법.
  136. 청구항 135에 있어서, SIRP-α D1 변이체는 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159.
  137. 청구항 110에 있어서, 항체는 아테졸리주맙인 것을 특징으로 하는 방법.
  138. 청구항 137에 있어서, SIRP-α D1 변이체는 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159.
  139. 청구항 110에 있어서, 항체는 더발루맙인 것을 특징으로 하는 방법.
  140. 청구항 139에 있어서, SIRP-α D1 변이체는 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159.
  141. 청구항 110에 있어서, 항체는 MEDI0680인 것을 특징으로 하는 방법.
  142. 청구항 141에 있어서, SIRP-α D1 변이체는 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159.
  143. 청구항 110에 있어서, 항체는 피딜리주맙인 것을 특징으로 하는 방법.
  144. 청구항 143에 있어서, SIRP-α D1 변이체는 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159.
  145. 청구항 110에 있어서, 항체는 BMS-93659인 것을 특징으로 하는 방법.
  146. 청구항 145에 있어서, SIRP-α D1 변이체는 다음의 서열 번호 중에서 한 가지에 따른 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137 또는 152-159.
  147. 청구항 110에 있어서, 최소한 하나의 추가 작용제는 종양 연관된 항원이고, 그리고 상기 종양 연관된 항원은 면역 반응을 이끌어내는 것을 특징으로 하는 방법.
  148. 청구항 110에 있어서, 최소한 하나의 추가 작용제는 항체이고, 그리고 상기 항체는 HLA/펩티드 또는 MHC/펩티드 복합체를 표적으로 하는 것을 특징으로 하는 방법.
  149. 청구항 148에 있어서, 항체는 NY-ESO-1/LAGE1, SSX-2, MAGE 패밀리 (MAGE-A3), gp100/pmel17, 멜란-A/MART-1, gp75/TRP1, 티로시나아제, TRP2, CEA, PSA, TAG-72, 미성숙 라미닌 수용체, MOK/RAGE-1, WT-1, Her2/neu, EphA3, SAP-1, BING-4, Ep-CAM, MUC1, PRAME, 서바이빈, 메소텔린, BRCA1/2 (돌연변이된), CDK4, CML66, MART-2, p53 (돌연변이된), Ras (돌연변이된), β-카테닌 (돌연변이된), TGF-βRII (돌연변이된), HPV E6, 또는 E7을 포함하는 HLA/펩티드 또는 MHC/펩티드 복합체를 표적으로 하는 것을 특징으로 하는 방법.
  150. 청구항 149에 있어서, 항체는 ESK1, RL1B, Pr20, 또는 3.2G1인 것을 특징으로 하는 방법.
  151. 청구항 1에 있어서, 암의 치료에서 이용되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  152. 청구항 1에 있어서, 자가면역 질환의 치료에서 이용되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  153. 청구항 1에 있어서, 염증성 질환의 치료에서 이용되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  154. 암의 치료를 위한 약제의 제조에서 청구항 1의 폴리펩티드의 용도.
  155. 자가면역 질환의 치료를 위한 약제의 제조에서 청구항 1의 폴리펩티드의 용도.
  156. 염증성 질환의 치료를 위한 약제의 제조에서 청구항 1의 폴리펩티드의 용도.
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